CZ290471B6

CZ290471B6 - Způsob separace proteinu závislého na vitaminu K od na vitaminu K nezávislých doprovodných proteinů

Info

Publication number: CZ290471B6
Application number: CZ1995539A
Authority: CZ
Inventors: Bernhard Dr. Fischer; Artur Dr. Mitterer; Friedrich Prof. Dorner
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 2002-07-17
Also published as: CZ53995A3; EP0669342A3; DK0669342T3; SK22695A3; US5633350A; ATE205218T1; HUT72844A; JPH07258286A; NO322372B1; HU9500594D0; HU219828B; EP0669342B1; FI950888A0; CA2143510C; ES2161790T3; CA2143510A1; EP0669342A2; FI950888A; NO950733L; DE4406515C1

Abstract

Zp sob separace protein z visl²ch na vitaminu K od doprovodn²ch na vitaminu K nez visl²ch protein pou vaj c aniontovou v²m nnou chromatografii a voliteln afinitn chromatografii. Metoda je zvl t vhodn pro purifikaci faktor II, VII, IX, X i proteinu S, proteinu C a proteinu Z. Pomoc metody jsou z sk ny proteiny z visl na vitaminu K v p°edkl dan 95% istot .\

Description

Způsob separace proteinu závislého na vitaminu K od na vitaminu K nezávislých doprovodných proteinů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu izolace a purifikace proteinů závislých na vitaminu K.

Dosavadní stav techniky

S odhlédnutím od přírodně se vy skytujících proteinů je dnes možné za přispění metod genových technologií produkovat savčí, a zvláště pak lidské, proteiny rekombinantními technikami. Za tímto účelem jsou hostitelské buňky transformovány nebo transfektovány cizí DNA a kultivovány, čímž je v případě hostitelských eukaryotických buněk rekombinantně produkovaný protein uvolňován v rozpustné formě do média buněk [R.G. Werner and W. Berthold, Drug Res. 38, 422-428 (1988)]. Nicméně, poněvadž hostitelské buňky také uvolňují spolu s požadovanými rekombinantními proteiny další nežádoucí proteiny, je nezbytné obohatit a/nebo izolovat požadované proteiny v jednom nebo více krocích. V souvislosti s tím jsou nutné metody, které efektivně a selektivně umožňují izolaci rekombinantních proteinů z buněčného média.

Zpravidla jsou pro purifikaci rekombinantních proteinů užívány fyzikální a chemické vlastnosti proteinů. Takovými vlastnostmi jsou velikost proteinů, přirozený náboj povrchu, jejich hydrofilita a rozpustnost. Doplňkové purifikační metody souvisí s vazbami, jež proteiny tvoří s dalšími molekulami, jako například s protilátkami. Stejné přístupy jsou i pro purifikace proteinů z přirozených zdrojů. Také tyto, jako oddělení stejně se vyskytujících proteinů od zbývajících doprovázejících proteinů, jsou založeny na fyzikálních a chemických vlastnostech proteinů.

Proteiny závislé na vitaminu K. byly doposud purifikovány podle takových metod jako proteinová precipitace, iontová výměnná chromatografie a gelová filtrace [A.L. Bloom and D.P. Thomas, Haemostasis and Thrombosis, Churchill Livingstone, New York (1987)]. B. Dahlbáck [Biochem. J. 209, 837 - 846 (1983)] popsal purifikační metodu pro protein S (PS). Po barium citrátové precipitaci je PS izolován na DEAE-Sephacel. J. Malm et al [Eur. J. Biochem. 187, 737 - 743 (1990)] purifikoval rekombinantní PS (rPS) afinitní chromatografií na monoklonální protilátku. Faktor IX (FalX) byl izolován B. Osterudem a R. Flengsrudem [Biochem. J. 145, 469 - 474 (1975)] barium sulfátovou precipitaci a iontovou výměnnou chromatografií na celulóze. Monoklonální protilátky byly využity H. Kimem et al [Sem. Hematol. 28 Suppl. 6, 15 - 19 (1991)] pro purifikaci FalX.

US 5 055 557 popisuje metodu pro purifikaci a koncentraci proteinů závislých na vitaminu K z plasmy stejně jako pro purifikaci a koncentraci rekombinantně produkovaných proteinů pomocí imunoadsorbentu užitím monoklonální protilátky.

U výše uvedených metod musíme věnovat pozornost faktu, že vlastnosti mnoha proteinů nejsou navzájem dostatečně odlišné, což činí jejich frakcionaci (oddělení) velmi obtížnou. Proto je nezbytné používat kombinace metod a koordinovat purifikační kroky, abychom obdrželi optimálně výhodné rozdíly ve vlastnostech proteinů.

Mnoho proteinů přirozeně se vyskytujících v lidské a živočišné krvi může vázat dvouvazné kationty. Takové proteiny jsou syntetizovány buňkou v procesu závislém na vitaminu K, čímž vznikají místa vážící kationty přeměnou kyseliny glutamové (Glu) na kyselinu τ-karboxyglutamovou (Gla). Tyto místa vážící kationty mohou pak být vysyceny vápenatými ionty (Ca²⁺). Vedle vápenatých iontů jsou tato místa vážící kationty také zpravidla schopna vázat dvouvazné stroncium nebo bárium [B. Fúrie and B.C. Fúrie, Cell 53, 508 - 518 (1988)].

-1 CZ 290471 B6

Mnoho těchto proteinů závislých na vitaminu Kjsou složkami krevní plazmy a hrají důležitou roli v homeostázi. Skupiny kyseliny τ-karboxyglutamové v těchto proteinech závislých na vitaminu Kjsou nalézány v strukturálně homologní N-koncové oblasti Gla [A. Tulinsky, Thromb. Haemost. 66, 16-31 (1991)]. Mezi tyto proteiny vážící vápenaté ionty s homologní Gla oblastí patří mimo jiné i protein S (PS), protein C, faktor IX (FalX), faktor II, faktor VII, faktor X a protein Z.

Jaký je význam vazby vápenatých iontů těchto proteinů konečně ukazuje změna vlastností ve srovnání s proteiny vápník nevážící. Tento rozdíl je využit v EP 363 126 pro purifikaci proteinů. EP 363 126popisuje metodu izolace proteinů závislých na vitaminu K, které byly obdrženy rekombinantně. Dvouvazné kationty jsou úplně odstraněny přidáním chelačních složek do kultivačního média před aktuální izolací proteinu, a tím je protein schopný vazby na iontoměničovou pryskyřici, jako je Mono Q. Dále je protein eluován z aniontového měniče přidáním NaCl a Ca²⁺ iontů. Takto byl obdržen 58 % obohacený produkt (protein C). Nečistoty (42 %) tvoří takové proteiny, které jsou také uvolněny z iontoměniče použitou koncentrací soli (0,15 m). V dalším purifikačním kroku je obdržený proteinový komplex adsorbován na kolonu, v niž je vázána imobilizovaná EDTA, poté je promyt a eluován. Proteiny v eluátu jsou vázány přímo na iontoměniči a eluovány solným gradientem. Po přidání CaCL do eluátu je komplex proteinkation adsorbován na hydrofóbní kolonu a žádaný protein je eluován pufrem z EDTA.

Nevýhodou metody popsané v EP 363 126 je, že mění běžnou konformací proteinů závislých na vitaminu K mnohonásobným odstraňováním z kolon a přidáním vápenatých iontů, které způsobují změny vlastností proteinu [Johanson et al. J. Biol. Chem. 258, 5554-5560 (1993)]; J. Stenflo, J. Biol. Chem. 251, 355-363 (1976)]. V kontrastu s tím, je proces využitelný metodou podle vynálezu, která nemá tyto nevýhody, neboť neobsahuje krok k odstranění dvouvazných kovových iontů, například pomocí chelatonů, během celého purifikačního procesu.

EP 354 354 popisuje způsob obohacení krev srážejících faktorů II, VII, IX a X. Výše jmenované protrombin-komplexní faktory jsou izolovány adsorpcí na matrix nesoucí skupinu d-hydroxylamin, čímž je zvláště faktor IX silně vázán. Nejdříve jsou pomocí iontové síly eluovány faktory II, VII a X. Přidání vápenatých iontů v této metodě nehraje roli.

EP 317 376 popisuje způsob separace faktoru IX, obsaženého ve frakci lidské plazmy. Kryoprecipitát je nejprve chromatograficky předčištěn, pak následuje separace aniontovou výměnnou chromatografií a selektivní eluování pufrem se vzrůstající iontovou silou a nakonec je provedena afinitní chromatografie na Heparin-Sepharóse se selektivní elucí. Tato metoda také nebere v úvahu změnu proteinových vlastností faktoru IX v přítomnosti nebo obsenci vápenatých iontů.

Podstata vynálezu

Cílem předkládaného vynálezu je využitelný způsob separace proteinů závislých na vitaminu K a vážících vápenaté ionty od doprovodných, na vitaminu K nezávislých, proteinů z roztoku bez požadavku nezbytně odstranit vápenaté ionty a možnou denaturaci proteinů s nimi spojenou. Tato metoda, jež se může provádět s obohacenými proteinovými roztoky z přirozených zdrojů a stejně dobře se supematanty buněčných kultur rekombinantního proteinu, je jednoduchá a vede k rychle čistým proteinům závislým na vitaminu K.

Výhodou předkládaného vynálezu je, že původní konformace a stabilita proteinu závislého na vitaminu Kjsou zachovány během purifikace.

Řešení výše uvedeného cíle je dosaženo podle vynálezu pomocí metod popsaných v nárocích 1-16. Vynález také zahrnuje rychle čisté proteiny závislé na vitaminu K izolované pomocí těchto metod.

-2 CZ 290471 B6

Například supematanty buněčných kultur i médium buněčné kultury získané různými cestami, supematanty z tkáňových kultur nebo proteinové roztoky z přirozených zdrojů, které obsahují proteiny závislé na vitaminu K jsou nejdříve chromatografovány přes aniontový měnič metodou podle vynálezu. Specifické odstranění dvouvazných kationtů z proteinového roztoku před chromatografií není nutné oprati metodě popsané v EP 363 126. Dále bylo překvapivě zjištěno, že přidání malého množství vápenatých iontů v nízké koncentraci soli váže na aniontovém měniči proteiny závislé na vitaminu K, přestože neváže proteiny na vitaminu K nezávislé.

V metodě podle vynálezu byl pro separaci proteinů závislých i nezávislých na vitaminu K. použit nový typ aniontového měniče s hyperdifuzními vlastnostmi, například Q-Hyper D^R, Sepracor. Následovala aniontová výměnná chromatografie, a poté afinitní chromatografie tak dlouho, dokud to vyžaduje další proteinová purifikace.

Podle vynálezu je roztok proteinu závislého na vitaminu K obohacován přídatnými proteiny koncentrujícím krokem bez předchozího odstranění dvouvazných kationtů z proteinového roztoku. Následně je roztok filtrován na aniontovém měniči a je volitelně chromatografován přes afinitní kolonu.

Podle výhodného provedení je proteinový koncentrát obohacený v prepurifikačním kroku (první krok) filtrována na aniontovém měniči (druhý krok) a pak je ihned nanesen na afinitní kolonu. Výhodná kombinace se vyznačuje následujícími body:

(a) Roztok obsahující protein závislý na vitaminu Kje kontaktován s aniontovým měničem, čímž se protein závislý na vitaminu K adsorbuje na iontoměnič a následně je eluován vzrůstající koncentrací soli, poté je koncentrace soli v eluátu redukována;

(b) k eluátu z (a) jsou přidány vápenaté ionty a ten je opět nanesen na aniontový měnič za podmínek, při kterých se adsorbují doprovázející proteiny, ne však protein závislý na vitaminu K;

(c) neadsorbovaný protein závislý na vitaminu K. z (b) je adsorbován na afinitní substrát a selektivně eluován.

Výše uvedená výhodná kombinace kroků metody je přesně popsána následovně:

V průběhu prvního kroku, kdy koncentrujeme proteiny, je roztok obsahující rekombinantní nebo přirozené proteiny závislé na vitaminu K nanášen na aniontový měnič. To je provedeno přelitím proteinové směsi přes kolonu. Proteiny závislé na vitaminu K se mimo to vyskytují spolu s doprovodnými proteiny v solném roztoku o nižší koncentraci (minimální koncentrace soli). Za těchto podmínek se protein závislý na vitaminu K váže na aniontový měnič spolu s mnoha dalšími proteiny. Zvyšováním koncentrace soli (iontová síla) jsou proteiny závislé na vitaminu K selektivně uvolňovány z iontoměniče.

Supematanty buněčné kultury zpravidla obsahují barvivo, které indikuje hodnotu pH. Takové barvivo, jako fenolová červeň, kalí čistý proteinový roztok, silně se váže na běžné aniontové měniče jako jsou Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) nebo MacroPrep* (Bio-Rad) a adsorbuje světlo o vlnové délce, při které se určují proteiny, tj. 280 nm. To vede k překážkám v purifikaci proteinů z média buněčné kultury. Proto zde provádíme zlepšení, podle vynálezu byly supematanty buněčné kultury nejdříve filtrovány na aniontovém měniči s hyperdifuzními vlastnostmi (Q-Hyper D^R, Sepracor). Tím bylo dokázáno, že nespecifické vazby barviva fenolové červeně byly redukovány na minimum použitím Q-Hyper D^R jak aniontového měniče. Barvivo je také eluováno z aniontového měniče při koncentraci soli pod minimální koncentraci. V tomto případě mohou být eluované proteiny lépe detekovány během chromatografie. Nadto se zbavíme nežádoucích soupeřících reakcí mezi proteiny a barvivém na iontoměniči.

- J CZ 290471 B6

Následující chromatografie měnící anionty (druhý krok) je založena na faktu, že iontová síla roztoku obsahujícího protein závislý na vitaminu K. je snižována pod hodnotu minimální koncentrace soli dialýzou nebo dilucí s pufrem bez soli a přidáním malého množství vápenatých iontů. Poté je proteinový roztok opět dán na naiontový měnič nebo je přes něj filtrován. Tak bylo překvapivě zjištěno, že proteiny závislé na vitaminu K nejsou vázány na aniontový měnič a doprovodné proteiny nezávislé na vitaminu K adsorbují na substrát. To je důsledek rozdílného náboje proteinů zapříčiněný vazbou vápenatých iontů. Tak obdržíme přesně protein závislý na vitaminu K, očištěný od kontaminujících protein závislý na vitaminu K, očištěný od kontaminujících proteinů předchozího kroku (bez následné potřeby eluce soli).

V mnoha případech proteinové purifikace je kombinace prepurifikačního kroku (první krok) s purifikací na aniontovém měniči (druhý krok) dostatečná. Druhý purifikační krok je většinou účelný, neboť menší část separovaných proteinů závislých na vitaminu K je znečištěna doprovodnými proteiny.

V druhém purifikačním kroku probíhajícím na aniontovém měniči není vázaný protein závislý na vitaminu K. právě díky volbě a vý běru koncentrace soli nižší než je minimální koncentrace soli a přidáním vápenatých iontů.

Využitím schopnosti vázat vápník proteinů závislých na vitaminu K s Gla-oblastí byly tyto separovány od doprovodných proteinů tak, že při určité iontové síle jsou navázány na aniontový měnič pouze doprovodné proteiny, zatímco proteiny závislé na vitaminu K projdou iontoměničem bez navázání. Proto, s odhlédnutím od proteinů závislých na vitaminu K z přirozených zdrojů, je metoda podle vynálezu zvláště vhodná pro purifikaci rekombinantních proteinů závislých na vitaminu K s Gla-oblastí, jako jsou například protein C, faktor IX, faktor II, faktor VII, protein S a protein Z.

Pro výše jmenované kroky 1 a 2 je výhodné použít stejný aniontový měnič. Zvláště dobré výsledky obdržíme, jestliže bude aniontová výměnná chromatografie prováděna na koloně.

V navazující metodě (třetí krok), konkrétně při afinitní chromatografii, probíhá vazby proteinu závislého na vitaminu K na afinitní matrix. V tomto kroku se tyto proteiny adsorbují na afinitní matrix. V tomto případě se spojení prepurifikačního kroku do série s aniontovým měničem ukázala jako zvláště výhodné, protože je ta odstraněno množství znečišťujících proteinů. To podporuje eluci proteinu závislého na vitaminu K z afinitní matrix a umožňuje izolaci požadovaného proteinu o vysoké čistotě.

Metoda podle vynálezu může začlenit krok inaktivace virů, jež je náročný na osobní zručnost, podle předchozích prací, které obsahovaly opracování v roztoku proteinu závislého na vitaminu K fyzikálně-chemickými nebo chemickými metodami. Za těchto okolností je opracování v přítomnosti antivirové substance kombinováno po uvážení s radiací nebo s teplotním krokem. Podle předloženého vynálezu probíhá inaktivace virů před separací proteinů závislých na vitaminu I od doprovodných na vitaminu K nezávislých proteinů.

Metoda podle vynálezu se skládá z kombinací purifikačních kroků 1, 2 a 3, jež mohou být prováděny v různém pořadí. Nicméně krok metody podle nároku 1 je vždy nezbytně nutný.

Následující obrázky 1-12 ukazují purifikační kroky nebo výsledky:

Obr. 1 Purifikace rekombinantního Proteinu S ze supematantu buněčné kultury chromatografii na Q-Heper (předkrok = první krok);

Obr. 2 Purifikace rekombinantního Proteinu S chromatografii na Q-Heper D s přidáním vápenatých iontů (= druhý krok);

-4CZ 290471 B6

Obr. 3 SDS-PAGE gelovou elektroforézou purifikovaný rekombinantní Protein S (A: supematant buněčné kultury; B: purifikovaný rPS);

Obr. 4 Purifikace rFalX chromatografií na Q-Hyper D (první krok);

Obr. 5 Purifikace rFalX chromatografií na Q-Hyper D s přidáním vápenatých iontů (druhý krok);

Obr. 6 SDS-PAGE gelová elektroforéza rFalX (A: supematant buněčné kultury; B: purifikovaný rFalX);

Obr. 7 Purifikace rFalX chromatografií na Heparin-Sefaróze (třetí krok);

Obr. 8 Purifikace rFalX párovou chromatografií Q-Hyper D a Heparin-Sepharosa (druhý a třetí krok);

Obr. 9 SDS-PAGE gelová elektroforéza rFalX, jak byl obdržen v obr. 8;

Obr. 10 Purifikace rFall ze supematantu buněčné kultury chromatografií na Fraktogel^R EMD TMAE 650 (první krok);

Obr. 11 Purifikace rFall chromatografií na Fraktogel^R EMD TMAE 650 (druhý krok);

Obr. 12 Analýza rFall SDS-PAGE gelovou elektroforézou (A: supematant buněčné kultury; B: purifikovaný rFall).

Následující příklady ukazují purifikaci podle vynálezu proteinu S, faktoru IX a faktoru II.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

a) Purifikace rPS aniontovou výměnnou chromatografií.

V následujícím příkladu byl použit kvartémí amino-typ aniontového měniče s hyperdifuzními vlastnostmi Q-Hyper D, Sepracor).

Materiál:

Kolona: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm ^x 4 cm.

Pufr A: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0.

Pufr B: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0 0,18 M NaCl.

Pufr C: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0 0,4 M NaCl.

Pufr D: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0 1 mM NaCl.

Rekombinantní protein (rPS) byl izolován běžnými laboratorními metodami po infekci Věro buněk (buňky ledvin opic) virem Vaccinia pomocí technologie buněčné kultury. Expresní systém Vero/Vaccinia a podmínky buněčné kultivace jsou zevrubně popsány v díle F.G.: Falkner et al, Thormbosis and Haemostasis, 68, 119-124 (1992) a N. Barrett et al, AIDS Res., 5, 1598-171 (1989); F. Domer et al, AIDS Research and Clinical Trials, Marcel Dekker, lne., New York (1990). Exprese rPS probíhá v komerčně dostupném, syntetickém DMEM médiu. Po buněčné kultivaci byl supematant kultury izolován centrifugací a stabilizován syntetickým proteázovým inhibitorem Pefabloc^R SC, Pentapharm, do koncentrace 0,1 mMol/1.

-5CZ 290471 B6

Kolona byla regenerována podle návodu výrobce a ekvilibrována pufrem A. Následovně bylo naneseno 485 ml supernatantu buněčné kultury obsahující rekombinantní protein S na kolonu s průtokem o hodnotě lOml/min. Materiál nenavázaný na kolonu byl odstraněn pufrem A se stejnou rychlostí promývání. Potom byla kolona nejprve eluována pufrem B a následně pufrem C. Poté byla provedena eluce pufrem D. Adsorpce proteinů byla sledována během chromatografie normálním způsobem při 280 nm. Po provedení chromatografie byla stanovena koncentrace byla stanovena koncentrace proteinů podle metody Brodforda (M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976). Obsah proteinu S byl určen komerčním ELISA systémem (Asserachrome Protein S, Boehringer Mannheim) i podle precipitačního testu (Protein S clotting test, Boehringer Mannheim).

Bylo zjištěno, že téměř všechen rPS byl navázán na matrix, rPS byl eluován z aniontového měniče 0,4 M NaCl (pufr C).

Použitím výše jmenovaného aniontového měniče byla bromfenolová červeň, běžně obsažená v médiu buněčné kultury, také eluována z kolony při koncentraci soli o hodnotě 0,18 M, která podstatně podporuje následnou izolaci rPS při 0,4 M NaCl. Toto uspořádání je výhodné ve srovnání s použitím jiných aniontových měničů.

Hlavní a podstatné výsledky purifikace rPS na aniontovém měniči (první krok) jsou sumarizovány v obr. 1 a tabulce 1. Purifikací popsanou v příkladu 1 bylo množství 3 % rPS antigenu k celkovému množství protein média buněčné kultury zvýšeno na 8 % rPS antigenu k proteinům ve frakci 0,4 M NaCl. Specifická aktivita vzrostla 25 ^x.

Tabulka 1

Vzorek	Objem	Protein	Antigenní aktivita proteinu S	Specifická aktivita
(ml)	(mg/ml)	(mU/ml)	(mU/ml)	(U/mg)
Buněčný supematant	485	0,108	137	11	0,1
Nenavázaná Frakce	560	0,05	4	0	0
0,18 M NaCl	60	0,014	4	0	0
0,4 M NaCl	14	0,537	1700	1358	2,5
1 M NaCl	20	0,54	4	0	0

b) Purifikace rPS adsorpcí doprovodných proteinů pomocí aniontové výměnné chromatografie přidáním vápenatých iontů (druhý krok).

Byl použit stejný typ aniontového měniče, jaký byl popsán v l.a).

Materiály:

Kolona: Q-Hyper D, Sepracor; 1 cm x 4 cm.

Přístroj: Pharmacia FPLC LCC-500.

Pufr A: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0:

Pufr B: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 0,15 M NaCl, 10 mM CaCl₂.

Pufr C: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0 1 M NaCl.

Kolona byla regenerována podle instrukcí výrobce a ekvilibrována pufrem B. Rekombinantní protein S, který byl izolován ze supernatantu buněčné kultury jako v příkladu 1, byl naředěn dvakrát pufrem A tak, aby koncentrace NaCl ležela pod hodnotou 0,18 M. Byl přidám CaCl₂o koncentraci 10 mM. Po promíchání byl protein nanesen na kolonu a nenavázaný protein byl odmyt z kolony pufru B. Vázaný protein byl eluován pufrem C. Průběh chromatografie a zjišťování koncentrace proteinů byl stejný jako u příkladu 1.

-6CZ 290471 B6

Výsledky ukazují, že rPS prošel kolonou bez zábrany, zatímco většina dalších proteinů zůstala v koloně. Tyto znečišťující proteiny byly eluovány 1 M NaCl. Zásadní výsledky tohoto pokusu jsou sumarizovány v obr. 2, obr. 3 a tabulce 2.

Purifikací popsanou příkladem l.b) byl antigenní obsah rPS zvýšen 12* v poměru k ostatním proteinům. Specifická aktivita se zvýšila 14*. Denaturační elektroforetická analýza [U.K.Laemmli, Nátuře 227, 680-685 (1970)] ukazuje (Obr. 3), že purifikací podle příkladu l.b) byl izolován rPS ve více než 95 % čistotě.

Tabulka 2

	Objem	Protein	Antigenní aktivita	Specifická
Vzorek			proteinu S	aktivita
	(ml)	(mg/ml)	(mU/ml)	(mU/ml)	(U/mg)
převzat z příkladu 1	34	0,215	680	543	2,5
Nenavázaná Frakce	34	0,014	600	520	37
1,0 M NaCl	10	0,332	83	0	0

Příklad 2

a) Purifikace rFalX aniontovou výměnnou chromatografií

V následujícím příkladu byl použit kvartémí amino-typ aniontového měniče s hyperdifuzními vlastnostmi (Q-Hyper D, Sepracor).

Materiály:

Kolona: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm χ 4 cm.

Přístroj: Pharmacia FPLC LCC-500.

Pufr A: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 5,5.

Pufr B: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 0,18 M NaCl.

Pufr C: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 0,3 M NaCl.

Pufr D: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 1,0 M NaCl.

Rekombinantní Faktor IX (rFalX) byl získán podobným přístupem jako rPS (Příklad l.a).

Kolona byla regenerována podle instrukcí výrobce a ekvilibrována pufrem A. Následně bylo 1997 ml supematantu buněčné kultury obsahujícího rekombinantní Faktor IX naneseno rychlostí 10 ml/min na kolonu. Nenavázaný materiál byl odstraněn z kolony stejně rychlým promýváním pufrem A. Poté byla kolona promyta nejprve pufrem B, pak pufrem C a nakonec pufrem D.

Adsorpce proteinu byla sledována během chromatografie normálním způsobem při 280 nm. Po skončení chromatografie byla koncentrace proteinu zjišťována metodou podle Bradforda (M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976). Obsah faktoru IX byl určován podle komerčního precipitačního testu (Factor IX clotting, Immuno).

Výsledky ukazují, že téměř všechen rFalX byl vázán na aniontový měnič. rFaX byl eluován z aniontového měniče 0,3 M NaCl. Obdobné výsledky byly také obdrženy při použití jiných kvartémích amino-aniontových měničů. Dále použitím Q-Hyper D byla bromfenolová červeň, běžně obsažená v médiu buněčné kultury, také eluována z kolony při koncentraci soli pod hodnotu 0,3 M, která podstatně podporuje následující izolaci rFalX při koncentraci NaCl o hodnotě 0,3 M. Jiné aniontové měniče tyto výhodné vlastnosti nemají.

-7CZ 290471 B6

Zásadní výsledky purifikace rFalX na aniontovém měniči jsou sumarizovány v Obr. 4 a Tabulce 3. Purifikací popsanou příkladem 2. a byl rFalX obohacen 20^x, specifická aktivita byla zvýšena 12x.

Tabulka 3

	Objem	Protein	Aktivita	Specifická
Vzorek			faktoru IX	aktivita
	(ml)	(mg/ml)	(mU/ml)	(U/mg)
Buněčný supematant	1997	0,178	100	0,56
Nenavázaná Frakce	2100	0,091	0	0
0,18 M NaCl	94	0,382	162	0,41
0,3 M NaCl	94	0,300	2099	6,86
1 M NaCl	93	0,09	32	0,35

b) Purifikace rFalX adsorpcí doprovodných proteinů pomocí aniontové výměnné chromatografie s přidáním vápenatých iontů.

Typem užitého aniontového měniče byl Q-Hyper D, jenž byl použit také v příkladu 2.a).

Materiály:

Kolona: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm * 4 cm.

Přístroj: Pharmacia FPLC LCC-500.

Pufr A: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,4.

Pufr B: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 10 mM CaCk

Pufr C: 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,4 1,0 M NaCl.

Kolona byla regenerována podle instrukcí výrobce a ekvilibrována pufrem A. 85 ml rekombinantního faktoru IX, jak byl získán v příkladu 2.a), bylo naředěno 2* pufrem A tak, že 25 koncentrace NaCl byla snížena na 0,15 M. CaCl? byl přidán do koncentrace 10 mM. Následovně byla proteinová směs nanesena a nenavázaný protein byl vymyt z kolony pufrem B. Proteiny navázané na kolonu byly eluovány pufrem C. Průběh chromatografíe byl v souladu s popisem příkladu 2.a). Byly stanoveny koncentrace proteinů a enzymová aktivita.

Výsledky ukazují, že rFalX prošel kolonou bez zábran, zatímco převážná většina znečišťujících proteinů zůstala na koloně. Tyto znečišťující proteiny byly eluovány 1 M NaCl.

Zásadní výsledky jsou shrnuty v Obr. 5, Obr. 6 a Tabulce 4. Purifikací popsanou v příkladu 2.b) byla zvýšena specifická aktivita rFalX 4*. Denaturační elektroforetická analýza podle 35 Leammliho ukázala (Obr. 6), že purifikací popsanou v příkladu 2.b) byl izolován rFalX v čistotě větší než 80 %.

-8CZ 290471 B6

Tabulka 4

Vzorek	Objem	Protein	Aktivita faktoru IX	Specifická aktivita
(ml)	(mg/ml)	(mU/ml)	(U/mg)
převzat z příkladu 2a	170	0,153	1040	6,7
Nenavázaná Frakce	200	0,04	1076	27,5
1 MNaCl	20	0,45	0	0

c) Purifikace rFalX afinitní chromatografií

V následujícím příkladu byl rFalX, získaný stejnou cestou jako v příkladu 2.a) purifikován afinitní chromatografií. Jako afinitní matrix byla použita Heparin-Sepharosa.

Materiál:

Kolona: HiTrap^R Heprin, Pharmacia; 5 ml.

Přístroj: Pharmacia FPLC LCC-500.

Pufr A: 50 mM Tris, 20 mM sodium citrát, pH 7,4.

Pufr B: 50 mM Tris, 20 mM sodium citrát, pH 7,4, 0,15 M NaCl.

Pufr C: 50 mM Tris, 20 mM sodium citrát, pH 7,4 0,3 M NaCl.

Pufr D: 80 mM Tris, 20 mM sodium citrát, pH 7,4 1 M NaCl.

Kolona byla regenerována podle instrukcí výrobce a ekvilibrována pufrem A. 78 ml rFalX získaného v příkladu 2.a), bylo naneseno na kolonu a nenavázaný protein byl vymyt z kolony pufrem A. Dále byla kolona eluována pufrem B, poté pufrem C a nakonec pufrem D. Průběh chromatografie se držel stejného popisu jako v příkladě 2.a); byly stanoveny koncentrace proteinů a enzymová aktivita.

Výsledky ukazují, že rFalX byl zcela navázán na kolonu, a nejprve zní eluován 0,3 M NaCl. Nicméně byly v této byly v této metodě současně eluovány rFalX další proteiny, takže se neoddělí od rFalX. Specifická aktivita rFalX byla metodou v příkladu 2.c) zvýšena pouze 4,5x.

Zásadní výsledky jsou shrnuty v Obr. 7 a Tabulce 5.

Tabulka 5

	Objem	Protein	Aktivita	Specifická
Vzorek			faktoru IX	aktivita
	(ml)	(mg/ml)	(mU/ml)	(U/mg)
převzat z příkladu 2a	78	0,121	788	6,5
Nenavázaná Frakce	90	0,038	0	0
0,15 MNaCl	10	0,10	0	0
0,3 M NaCl	22	0,053	1572	29,6

Příklad 3

Purifikace rFalX přímým párováním aniontové výměnné chromatografie a afinitní chromatografie.

V následujícím příkladu byl rFalX, získaný v příkladu aniontový měnič a poté na afinitní chromatografickou kolonu. Q-Hyper D sloužil jako aniontový měnič; tj. aniontový měnič s hyperdifusními vlastnostmi. Jako afinitní matrix byla použita Heparin - Sepharosa (HiTrap

-9CZ 290471 B6

Heparin, Pharmacia). Q-Hyper D kolona byla připojena v přímé sérii před Heparin - Sepharosovou kolonu. Mezi kolony byla namontována pouze ohebná spojovací trubička (zmenšená na minimum), pokud možno s ventilem.

Materiál:

Kolona 1: Q-Hyper D^R, Sepracor; 2 cm * 4 cm.

Kolona 2: HiTrap^R Heprin, Pharmacia; 5 ml.

Přístroj: Pharmacia FPLC LCC-500.

Pufr A: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4.

Pufr B: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂.

Pufr C: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4 1 M NaCl.

Pufr D: 50 mM Tris, 20 mM sodium citrát, pH 7,4 0,15 M NaCl.

Pufr E: 50 mM Tris, 20 mM sodium citrát, pH 7,4 0,3 M NaCl. Pufr R: 50 mM Tris, 20 mM sodium citrát, pH 7,4 1 M NaCl.

Odtok kolony s aniontovým měničem byl přímo spojen s vtokem afinitní chromatografícké kolony ohebnou spojovací trubičkou tak, že proud kapaliny nejprve prochází kolonou 1 a následně přímo kolonou 2.

Kolony byly regenerovány podle instrukcí výrobce a ekvilibrovány pufrem B. 70 ml rFalX, který byl izolován ze supematantu buněčné kultury, jak je popsáno v příkladu 2.a) byla naředěna 2* pufrem A tak, že koncentrace NaCl byla snížena na 0,15 M. CaCl₂ byl přidán do konečné koncentrace 10 mM. Následně byla proteinová směs převedena přes kolonu 1 (Q-Hyper D) rychlostí 2,5 ml/min a přímo převedena na kolonu 2 (Heparin-Sepharosa). Nenavázaný protein byl vymyt z kolon pufrem B. Poté byla kolona 1 oddělena od afinitní kolony a proud kapaliny byl přímo nanášen na kolonu 2. Analogicky k metodě popsané v příkladu 2.c) byl nenavázaný protein odstraněn zheparinové kolony promytím pufrem D. Následovala eluce heparinové kolony pufrem E. Nakonec byla provedena eluce pufrem F. Podobné výsledky byly získány, když po nanesení vzorku Q-Hyper D kolona nebyla odstraněna od heparinové kolony, ale místo toho byl proud kapaliny pro eluci heparinové kolony veden přímo na heparinovou kolonu spojovacím ventilem.

Proteiny vázané na koloně 1 (Q-Hyper D^R) byly eluovány pufrem C.

Průběh chromatografie byl stejný jako v příkladu 2.a); byly určeny koncentrace proteinů a enzymová aktivita.

Výsledky ukazují, že po nanesení vzorku na zařazenou kolonu Q-Hyper D^R rFalX projde bez zábran a je kompletně adsorbován na heparinovou kolonu umístěnou potom. rFalX byl eluována později 0,3 M NaCl.

Zásadní výsledky jsou shrnuty v Obr. 8, Obr. 9 a Tabulce 6.

Purifikací popsanou v příkladu 3 byl rFalX obohacen 8,4*; specifická aktivita byla zvýšena 8,8*. Denaturační elektroforetická analýza podle Laemmliho ukazuje (Obr. 9), že rFalX je metodou popsanou v příkladu 3 izolovanou ve více než 95 % čistotě.

V příkladu 3 byla purifíkace rFalX prováděna přímou kombinací metod z příkladů 2.a), b) a c), které využívaly stejný počáteční materiál. Nicméně ve srovnání s purifikací v příkladu 2.c) byla dosažena kombinací aniontové výměnné chromatografie a afinitní chromatografie vyššího obohacení a vyšší specifické aktivity. Díky kombinace obou chromatografických metod jsou znečišťující proteiny, které nepříznivě ovlivňují separační proces na afinitním substrátu samozřejmě separovány předem, čímž je dosažena vyšší specifita a selektivita afinitního substrátu.

- 10CZ 290471 B6

Tabulka 6

	Objem	Protein	Aktivita	Specifická
Vzorek			faktoru IX	aktivita
	(ml)	(mg/ml)	(mU/ml)	(U/mg)
převzat z příkladu 2a	148	0,0196	123	6.3
Nenavázaná Frakce	160	0,01	0	0
0,15 M NaCl	32	0,01	0	0
0,3 M NaCl	10	0,019	1041	54,8
1 M NaCl	30	0,015	0	0

Příklad 4

a) Purifikace rFall aniontovou výměnnou chromatografií.

V následujícím příkladu byl použit kvartémí amino-typ aniontového měniče s tykadlovou strukturou (Fraktogel EMD TMAE 650 M, Měrek).

Materiál:

Kolona : Fraktogel EMD TMAE 650 M, Měrek, 1,6 cm ^x 5 cm.

Přístroj: Pharmacia FPLC LCC-500.

Pufr A: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4.

Pufr B: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl.

Pufr C: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl.

Pufr D: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4 1 M NaCl.

Izolace rekombinantního faktoru II byla založena na běžných laboratorních metodách technologie buněčných kultur [Falkner et al, Thrombosis and Haemostasis, 68, 119-124 (1992)].

Exprese rFall probíhala v komerčně dostupném syntetickém médiu DMEM. Bezbuněčný supematant buněčné kultury byl získán centrifugací.

Kolona byla regenerována podle instrukcí výrobce a ekvilibrována pufrem A. Následně bylo 200 ml buněčného supematantu obsahujícího rekombinantní faktor II naneseno na kolonu rychlostí 4 ml/min. Materiál nenavázaný na kolonu by odmyt pufrem A stejnou rychlostí. Následovalo promytí pufrem B a pak pufrem C. Nakonec byla provedena eluce pufrem D. Adsorpce proteinů bylo během chromatografie sledována běžným způsobem při 280 nm. Po chromatografii byla určena koncentrace proteinu podle Bradfordovy metody. Obsah faktoru II byl stanoven s pomocí precipitačního testu (Thrombinzeit, Immuno AG).

Bylo zjištěno, že téměř všechen rFall byl navázán na aniontový měničový gel. rFall byl z aniontového měniče eluován 0,3 M NaCl. Dále, oproti jiným amino-typům aniontových měničů, jako jsou MacroPrep^R (Bio-Rad) nebo Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), byla bromfenolová červeň, běžně obsažená v supematantu buněčné kultury, vždy eluována z kolony koncentrací soli 0,2 M NaCl, která podstatně podporovala následnou izolací rFall 0,3 M NaCl.

Zásadní výsledky purifikace rFall na aniontovém měniči jsou shrnuty v Obr. 10 a Tabulce 7. Purifikací popsanou v příkladu 4 byla specifická aktivita rFall zvýšena 3,5 *.

-11 CZ 290471 B6

Tabulka 7

	Objem	Protein	Aktivita	Specifická
Vzorek			faktoru 11	aktivita
	(ml)	(mg/ml)	(mU/ml)	(U/mg)
buněčné médium	200	0,45	50	0,1
Nenavázaná Frakce	200	0,177	2	0,01
0,2 M NaCl	40	0,4	6	0,015
0,3 M NaCl	45	0,36	150	0,42
0,5 M NaCl	32	0,25	0	0

b) Purifikace rFall adsorpcí doprovodných proteinů aniontovou výměnnou chromatografií s přidáním vápenatých iontů.

Použitým aniontovým měničem byl Fraktogel EMD TMAE 650 M (Měrek).

Materiál:

Kolona: Fraktogel EMD TMAE 650 M, Měrek, 1,6 cm ^x 5 cm.

Přístroj: Pharmacia FPLC LCC-500.

Pufr A: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4.

Pufr B: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM CaCk

PufrC: 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1,0 mMNaCl.

Kolona byla regenerována podle instrukcí výrobce a ekvilibrována pufrem B. Rekombinantní faktor II izolovaný ze supematantu buněčné kultury tak, jak bylo popsáno v příkladu 4.a), byl naředěn 2^X pufrem A tak, že konečná koncentrace NaCl byla menší než 0,2 M. CaCl₂ byl přidán do konečné koncentrace 10 mM. Následně byla proteinová směs nanesena na kolonu a nenavázaný protein byl z kolony vymyt pufrem B. Vázaný protein byl eluován pufrem C.

Průběh chromatografie byl shodný s předcházejícím příkladem a dále byla stanovena koncentrace proteinů. Výsledky ukazují, že rFall prošel kolonou bez překážky, zatímco převážná většina znečišťujících proteinů zůstala na koloně. Tyto proteiny byly poté eluovány 1 M NaCl.

Zásadní výsledky jsou shrnuty v Obr. 11, Obr. 12 a Tabulce 8. Díky purifikaci popsané v příkladu 4.a) a b) vzrostla specifická aktivita rFall 11^χ.

Denaturační elektroforetická analýza podle Leammliho ukazuje (Obr. 9), že purifikaci popsanou v příkladech 4.a) a b) byl izolován rFall s více než 95 % čistotou.

Tabulka 8

Vzorek	Objem	Protein	Aktivita faktoru 11	Specifická aktivita
(ml)	(mg/ml)	(mU/ml)	(U/mg)
převzat z příkladu 4a	80	0,18	75	0,41
Nenavázaná Frakce	80	0,015	75	4,6
1,0 M NaCl	15	0,62	0	0

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob separace proteinu závislého na vitaminu K od doprovodných, na vitaminu K nezávislých proteinů z roztoku obsahujícího proteiny, vyznačující se tím, že se do tohoto roztoku přidají ionty vápníku a roztok obsahující vápník se uvede do styku s aniontovým měničem za podmínek, za kterých se adsorbují doprovodné proteiny, ale nikoli proteiny, závislé

10 na vitaminu K.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok, obsahující proteiny závislé na vitaminu K, se dodatečně uvede do styku s aniontovým měničem za podmínek, ve kterých se protein závislý na vitaminu K. adsorbuje na měnič, promyje, eluuje a případně se iontová koncen-

15 trace eluátu snižuje.
3. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t i m , že neadsorbovaný protein závislý na vitaminu K se adsorbuje na afinitní substrát a selektivně se eluuje.

20
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provádějí kroky způsobů podle nároků 2 a/nebo 3 v libovolné kombinaci a pořadí.
5. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že separační kroky se provádějí se stejným aniontovým měničem, výhodně s pomocí chromatografie.
6. Způsob podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že aniontový měnič má hyperdifuzní vlastnosti.
7. Způsob podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že aniontový měnič má tykadlo30 vitou strukturu.
8. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že koncentrace iontů proteinového roztoku se po eluci sníží na 0,15 až 0,2 M.

35
9. Způsob podle nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že protein závislý na vitaminu

K. se vybere Z FII, FVII, FIX, FX, Proteinu S, Proteinu C a Proteinu Z.
10. Způsob získávání proteinu závislého na vitaminu K, vyznačující se tím, že protein závislý na vitaminu K se získává podle jednoho z nároků 1 až 9.
11. Způsob získávání na vitaminu K. nezávislého doprovodného proteinu, vyznačující se t í m , že doprovodný, na vitaminu K. nezávislý protein se získává podle jednoho z nároků 1 až 9.