JPH07258286A - ビタミンｋ依存性タンパク質の単離および精製方法 - Google Patents

ビタミンｋ依存性タンパク質の単離および精製方法

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JPH07258286A
JPH07258286A JP7064823A JP6482395A JPH07258286A JP H07258286 A JPH07258286 A JP H07258286A JP 7064823 A JP7064823 A JP 7064823A JP 6482395 A JP6482395 A JP 6482395A JP H07258286 A JPH07258286 A JP H07258286A
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buffer
anion exchanger
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Bernhard Dr Fischer
ベルンハルト・フィッシャー
Artur Mitterer
アルツール・ミッテレール
Friedrich Dorner
フライトリッヒ・ドルナー
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Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 カルシウムイオンの除去を必要とせず、かつ
それに伴なうタンパク質の起りうる変性なしに溶液より
非ビタミンＫ依存性随伴タンパク質からビタミンＫ依存
性でカルシウムイオン結合するタンパク質を分離する。 【構成】 ビタミンＫ依存性タンパク質の単離および精
製は、少なくともアニオン交換クロマトグラフィーと場
合によってはアフィニティクロマトグラフィーも利用し
て行なう。 【効果】 この方法は、ファクターII、VII、IX、Ｘの
みならずタンパク質Ｓ、タンパク質Ｃおよびタンパク質
Ｚの精製に特に適している。この方法で、ビタミンＫ依
存性タンパク質は、９５％の純度で得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】天然産タンパク質に加えて、今日では、
遺伝子技術の方法によって、組換え技術により哺乳類の
タンパク質、特にヒトのタンパク質を生産することがで
きる。この目的のために、異質ＤＮＡによって形質転換
またはトランスフェクトされた宿主細胞が培養され、そ
こで真核宿主細胞の場合には、組換え体的に生産された
タンパク質は、可溶型で細胞培地中へ放出される（R.
G. Werner and W. Berthold, Drug Res. 38, 422-428(1
988) ）。しかしながら、宿主細胞はまた所望の組換え
体的に生産されたタンパク質に加えて他のタンパク質類
も細胞培地中へ放出するから、１段またはそれ以上の精
製工程にて所望のタンパク質を濃縮化および／または単
離する必要がある。このことを考慮するなら、細胞培地
から組換えタンパク質の単離を効率的かつ選択的に可能
ならしめる方法が必要である。
【０００２】概して、タンパク質の物理的および化学的
性質は、組換えタンパク質の精製のために使用される。
前記の性質はタンパク質の大きさ、表面の自然電荷、そ
れらの親水性または溶解性である。追加の精製方法は、
例えば抗体のような他の分子との結合に関する。同じ性
質は、天然源からのタンパク質の精製に対して当てはま
る。ここでなおその上、タンパク質の物理的および化学
的性質に基づいて、同じタンパク質の分離が残留随伴タ
ンパク質から生じる。
【０００３】ビタミンＫ依存性タンパク質は、今までの
ところタンパク質の沈殿、イオン交換クロマトグラフィ
ーおよびゲル濾過のような方法によって精製されてきた
（A.L. Bloom and D. P. Thomas, Haemostasis and Thr
ombosis, Churchill Livingstone, New York, 1987)。
B. Dahlbaeck（Biochem. J. 209, 837-846(1983)）は、
タンパク質Ｓ（ＰＳ）の精製方法を記述している。クエ
ン酸バリウム沈殿後、ＰＳはDEAE-Sephacel 上で単離さ
れる。J. Malm 等（Eur. J. Biochem. 187, 737-743(19
90))は、モノクローナル抗体上のアフィニティクロマト
グラフィーにより組換えＰＳ（ｒＰＳ）を精製した。フ
ァクターIX（FaIX）は、B. Osterude and Flengsrud (B
iochem. J. 145, 469-474(1975))により硫酸バリウム沈
殿およびセルロース上のイオン交換クロマトグラフィー
によって単離された。モノクローナル抗体は、H. Kim等
（Sem. Hematol. 28 Suppl. 6, 15-19(1991)）によりFa
IXの精製のために使用された。
【０００４】米国特許第５，０５５，５５７号明細書
は、モノクローナル抗体を使用して免疫吸着によって組
換え体的に生産したタンパク質と同様に血しょうからビ
タミンＫ依存性タンパク質を精製および濃縮する方法を
記載している。
【０００５】上記に名を挙げた方法では、多くのタンパ
ク質の性質は互いに評価可能に相違しなく、このことは
それらの分別をいっそう困難にするということに注意を
払わなければならない。それゆえ、タンパク質の性質の
相違の最高の利益を得るために正確な、相互に対等の精
製工程の組合せを適用する必要がある。
【０００６】ヒトおよび動物の血液中に自然に産する多
くのタンパク質は、２価のカチオンと結合できる。その
ようなタンパク質は、カチオン結合する位置がグルタミ
ン酸（Ｇｌｕ）のガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌ
ａ）への転換により生じる細胞中でビタミンＫ依存性の
方法にて合成される。これらのカチオン結合する位置
は、次いでカルシウムイオン（Ca2+）により飽和され
る。カルシウムイオンのほかに、これらのカチオン結合
する位置はまた、一般的に、２価のストロンチウムまた
はバリウムを結合することもできる（B. Furie and B.
C. Furie, Cell 53,508-518(1988)）。
【０００７】多くのこれらのビタミンＫ依存性タンパク
質は、血液血しょうの成分であり、そしてホメオスタシ
スに重要な役割を演じる。これらのビタミンＫ依存性タ
ンパク質中のγカルボキシグルタミン酸基は、構造的に
均質なＮ−末端Ｇｌａ領域に発見される（A. Tulinsky,
Thromb. Haemost. 66, 16-31(1991))。均質なＧｌａ領
域を有するこれらのカルシウムイオン結合性タンパク質
の中には、ほかにもいろいろあるがその中でも、タンパ
ク質Ｓ（ＰＳ）、タンパク質Ｃ、ファクターIX（FaI
X）、ファクターII、ファクターVII 、ファクターＸお
よびタンパク質Ｚがある。
【０００８】カルシウムイオンの結合の結果として、こ
れらのタンパク質は非カルシウム結合タンパク質と比較
して決定的に変えられた性質を立証する。この相違は、
タンパク質の精製のためにヨーロッパ特許ＥＰ３６３１
２６号明細書で利用されている。ヨーロッパ特許ＥＰ３
６３１２６号明細書は、組換え体的に得られるビタミン
Ｋ依存性タンパク質の単離のための方法を記載してい
る。それにより、２価のカチオンは、実際のタンパク質
単離の前に培地にキレート化剤成分の添加により完全に
除去され、そしてタンパク質はそれによってMono Qのよ
うなイオン交換樹脂に結合することができる。その上、
タンパク質はNaClおよびCa2+イオンの添加によりアニオ
ン交換体から溶離される。それによって、５８％濃縮生
成物（タンパク質Ｃ）が得られた。不純物（４２％）
は、また適用された塩濃度（０．１５Ｍ）でイオン交換
体から放出されるようなタンパク質を構成する。さらに
進んだ精製工程において、得られたタンパク質・カチオ
ン錯体は、その上に固定化ＥＤＴＡが結合されているカ
ラム上に吸着され、洗浄され、そしてそのタンパク質が
溶離される。溶離剤中のタンパク質は配管系統内のイオ
ン交換体に結合され、そして塩勾配を使用して溶離され
る。溶離剤中のCaCl2 の添加後、タンパク質・カチオン
錯体は疎水性カラム上に吸着され、そして所望のタンパ
ク質はＥＤＴＡ緩衝液により溶離される。
【０００９】ヨーロッパ特許ＥＰ３６３１２６号明細書
の短所は、ビタミンＫ依存性タンパク質の広範囲に及ぶ
コンホメーション変化が、多重除去およびタンパク質の
性質の変化を引き起こすカルシウムイオンの添加によっ
て生じることである（Johanson等、J. Biol. Chem. 25
8, 5554-5560(1993) ；J. Stenflo, J. Biol. Chem. 25
1, 355-363(1976))。これと対照をなして、例えばキレ
ート化剤による、２価の金属イオンの除去のための処理
工程が全精製工程の間に必要でないために、これらの短
所を持たない方法が、本発明による方法によって利用で
きる。
【００１０】本発明の利点は、ビタミンＫ依存性タンパ
ク質のもとのコンホメーションと安定性が精製の間じゅ
う保たれることである。
【００１１】ヨーロッパ特許ＥＰ３５４３５４号明細書
は、血液凝固因子II、VII 、IXおよびＸの濃縮のための
方法を記載している。上記の名を挙げたプロトロンビン
−錯体因子は、特にファクターIXが強く結合される、α
ヒドロキシルアミノ基を担持するマトリックス上の吸着
により単離される。イオン強度の機能として、ファクタ
ーII、VII およびＸは前もって溶離される。カルシウム
イオンの添加は、この方法において役割を演じない。
【００１２】ヨーロッパ特許ＥＰ３１７３７６号明細書
は、ファクターIX含有ヒト血しょうフラクションの分離
のための方法を記載している。その方法では、寒冷沈殿
物が先ずクロマトグラフィー的に精製され、次いでイオ
ン強度がますます増大する緩衝液による選択性溶離およ
びアニオン交換クロマトグラフィーによる分離が行なわ
れ、そして最終的に選択性溶離を伴うヘパリン−セファ
ロース上のアフィニティクロマトグラフィーが行なわれ
る。この方法もまた、カルシウムイオンの存在または不
在下のファクターIXの変えられたタンパク質の性質を考
慮していない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、カル
シウムイオンの除去の必要性およびそれに伴うタンパク
質の可能性のある変性を要求することなしに、溶液より
非ビタミンＫ依存性随伴タンパク質からビタミンＫ依存
性でカルシウムイオン結合するタンパク質の分離のため
の方法を利用可能にすることである。天然源からの濃縮
タンパク質溶液のみならず組換えタンパク質生産の細胞
培養上澄み液を使用して行うことができる本発明の方法
は、単純で高純度のビタミンＫ依存性タンパク質に結び
つくべきである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記の目的は、請求項１
〜１６に示す方法により本発明によって解決される。本
発明はまた、これらの方法によって単離された高純度ビ
タミンＫ依存性タンパク質も含む。
【００１５】例えば、細胞培養上澄み液のみならず別の
方法で処理された細胞培地、ビタミンＫ依存性タンパク
質を含む天然源からのタンパク質溶液または組織培養か
らの上澄み液は、先ず本発明による方法においてアニオ
ン交換体上でクロマトグラフィーにかけられる。クロマ
トグラフィー工程前のタンパク質溶液からの２価のカチ
オンの明確な除去は、ヨーロッパ特許ＥＰ３６３１２６
号明細書に記載された方法とは対照をなして必要ではな
い。いくぶん、低塩濃度の少量のカルシウムイオンの添
加により、ビタミンＫ依存性タンパク質の非結合、それ
にもかかわらず非ビタミンＫ依存性タンパク質の結合
が、アニオン交換体上に生じることが驚くべきことに測
定された。最初に、超拡散性を持つ新型のアニオン交換
体、例えばQ-Hyper D(登録商標)(Sepracor社製）が、ビ
タミンＫ依存性タンパク質と非ビタミンＫ依存性タンパ
ク質の分離のための本発明による方法に使用された。ア
ニオン交換クロマトグラフィーは、さらに進んだタンパ
ク質の精製が望まれる限り、次いでアフィニティクロマ
トグラフィーが続けられる。
【００１６】本発明によれば、ビタミンＫ依存性タンパ
ク質溶液は、タンパク質溶液から２価のカチオンの前も
っての除去なしの追加のタンパク質濃縮工程、続いてア
ニオン交換体を通して濾過、そしてまた場合によっては
アフィニティカラム上のクロマトグラフによって濃縮す
ることができる。
【００１７】好ましい代替手段によれば、予備精製工程
（第１工程）で濃縮されたタンパク質濃縮液は、アニオ
ン交換体を通して濾過され（第２工程）次いで直接アフ
ィニティカラムに適用される。好ましい組合せは次のよ
うに述べられる： （ａ）ビタミンＫ依存性タンパク質を含む溶液はアニオ
ン交換体と接触させられ、そこでビタミンＫ依存性タン
パク質は交換体上に吸着され、続いて増大する塩濃度に
よって溶離され、その後溶離剤の塩濃度は減少され； （ｂ）カルシウムイオンが（ａ）からの溶離剤に添加さ
れ、これが再びアニオン交換体と、依然としてビタミン
Ｋ依存性タンパク質でなくて、随伴タンパク質が吸着さ
れる条件下に接触させられ； （ｃ）（ｂ）からの非吸着ビタミンＫ依存性タンパク質
は親和性基体上に吸着されて選択的に溶離される。
【００１８】上記に示された好ましい組合せの方法工程
は、次のように更に綿密に説明される：タンパク質濃縮
工程（第１工程）のために、組換えまたは天然のビタミ
ンＫ依存性タンパク質を含む溶液は、アニオン交換体と
接触させられる。これは単純にカラム上の混合または誘
導により生じうる。その上、ビタミンＫ依存性タンパク
質は、随伴タンパク質と一緒に低濃度（最小塩濃度）の
塩溶液中に発見される。これらの条件下に、ビタミンＫ
依存性タンパク質は多数の他のタンパク質と一緒にアニ
オン交換体上に結合させられる。塩濃度（イオン強度）
を増加することにより、ビタミンＫ依存性タンパク質
は、以後交換体から選択的に解放される。
【００１９】細胞培養上澄み液は、一般的に、ｐＨ状態
を示す染料を含んでいる。フェノールレッドのような、
この染料は、清澄なタンパク質溶液をくもらせ、Q Seph
arose Fast Flow (Pharmacia社製）またはMacro Prep
（登録商標）(Bio-Red社製）のような普通のアニオン交
換体に強く結合し、そしてタンパク質定量の波長、すな
わち２８０nmの光を吸着する。これは細胞培地からのタ
ンパク質の精製の障害を引き起こす。本明細書では改善
するために、本発明に係る細胞培養の上澄み液を、最初
に、超拡散性を有するアニオン交換体（Q-Hyper D(登録
商標）、Sepracor社製）上を濾過させる。それによっ
て、染料フェノールレッドの不明確な結合は、アニオン
交換体としてQ-Hyper D を使用して最小まで減少するこ
とが示された。染料は既に、最小濃度下の塩濃度にてア
ニオン交換体から溶離されている。この方法で、溶離タ
ンパク質はクロマトグラフィーの間により良く検出でき
た。その上、イオン交換体上のタンパク質と染料の間の
妨害性競合反応は、大きな程度まで避けられる。
【００２０】さらに進んだアニオン交換クロマトグラフ
ィー（第２工程）は、ビタミンＫ依存性タンパク質を含
む溶液のイオン強度が、透析または塩を含まない緩衝液
による希釈により最小塩濃度以下の値まで減少させら
れ、そして少量のカルシウムイオンが添加されるという
事実からなる。次いでタンパク質溶液は再びアニオン交
換体と接触させられそして／またはこの交換体を通して
濾過される。それによって、驚くべきことにビタミンＫ
依存性タンパク質はアニオン交換体上に結合されなく
て、非ビタミンＫ依存性随伴タンパク質がその基体上に
吸着することが測定された。これは、Caイオンの結合に
よるタンパク質の相違する電荷の結果である。今や先の
工程の汚染タンパク質から更に精製された、ビタミンＫ
依存性タンパク質が、それによって直接得られる（更に
進んだ塩依存性溶離なしに）。
【００２１】タンパク質精製の多くの場合に、予備精製
工程（第１工程）とアニオン交換体による精製（第２工
程）の組合せは十分である。それにより、第２精製工程
は全て、分離されるビタミンＫ依存性タンパク質が随伴
タンパク質によって少ししか汚染されていなければいな
いほど、ますます効率的である。
【００２２】アニオン交換体による第２の精製工程にお
いては、ビタミンＫ依存性タンパク質は、最小塩濃度の
バンド巾以下のある塩濃度の選択により、そしてカルシ
ウムイオンの添加によりアニオン交換体上に結合されな
い。
【００２３】Ｇｌａ−領域を有するビタミンＫ依存性タ
ンパク質のカルシウム結合性の活用により、これらは、
あるイオン強度で、随伴タンパク質だけはアニオン交換
体に結合されるが、ビタミンＫ依存性タンパク質はそれ
に結合することなくアニオン交換体を通過するというこ
とで随伴タンパク質から分離される。それゆえ、天然源
からのビタミンＫ依存性タンパク質に加えて、本発明に
よる方法は、例えばタンパク質Ｃ、ファクターIX、ファ
クターII、ファクターVII 、タンパク質Ｓおよびタンパ
ク質Ｚのような、Ｇｌａ−領域を有する組換えビタミン
Ｋ依存性タンパク質の精製に特に適している。
【００２４】上記に挙げた工程１および２のために、同
じアニオン交換体を使用することが好ましく、そこでは
アニオン交換クロマトグラフィーがカラム上で起きると
き特に良い結果が得られる。
【００２５】インライン工程（第３工程）、すなわちア
フィニティクロマトグラフィーにおいては、親和性マト
リックス上にビタミンＫ依存性タンパク質の結合が生じ
る。この工程において、ビタミンＫ依存性タンパク質は
親和性マトリックス上に吸着される。この場合には、ア
ニオン交換体に関し直列に接続された再精製工程は、こ
れにより多数の汚染タンパク質が除去されたため特に有
利であることを証明する。これは親和性マトリックスか
らビタミンＫ依存性タンパク質の溶離を助長し、そして
高純度の所望のタンパク質の単離を可能にする。
【００２６】本発明による方法は、物理的−化学的また
は化学的方法による、ビタミンＫ依存性タンパク質溶液
の処理を包含する従来の技術によって当業者に知られて
いるウイルス不活性化工程を包含できる。この目的のた
めに、抗ウイルス物質の存在における、場合によっては
放射線または熱処理と組合せた処理が考えられる。本発
明によれば、ウイルス不活性化は、非ビタミンＫ依存性
随伴タンパク質からビタミンＫ依存性タンパク質の分離
前に起こりうる。
【００２７】本発明による方法は、任意の順序で行ない
うる精製工程１、２および３の組合せからなりうる。し
かしながら、請求項１に記載の方法の工程は、常に必須
のものである。図１〜１２は、精製工程および／または
精製結果を示すものである。
【００２８】
【実施例】次の実施例は、タンパク質Ｓ、ファクターIX
およびファクターIIの本発明による精製を例証する。
【００２９】実施例１ ａ）アニオン交換クロマトグラフィーにるｒＰＳの精製 次の実施例においては、超分散性を有する第四級アミノ
型アニオン交換体（Q-Hyper D 、Sepracor社製）を使用
した。 材料： カラム：Q-Hyper D 、Sepracor；２cm×４cm。 緩衝液Ａ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.0 。 緩衝液Ｂ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.0 、0.18M NaC
l。 緩衝液Ｃ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.0 、0.4M NaCl
。 緩衝液Ｄ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.0 、１mM NaCl
。
【００３０】組換えタンパク質（ｒＰＳ）を、細胞培養
技術によりワクシニアウイルスによってヴェロ細胞（猿
の腎臓細胞）の感染後に、通例の研究室の方法に基づい
て単離した。ヴェロノワクシニア発現系および細胞培養
条件はF. G. Falkner et al, Thrombosis and Haemosta
sis, 69, 119-124(1992) and N. Barrett et al, AIDS
Res., 5, 1598-171(1989); F. Dorner et al, AIDS Res
earch and Clinical Trials,Marcel Dekker, Inc., New
York(1990)に理解できるように記載されている。ｒＰ
Ｓの発現は、市販の合成ＤＭＥＭ媒体にて起こる。細胞
培養後、培養上澄み液を遠心分離により単離して、０．
１ミリモル／ｌまで、合成プロテアーゼ阻害剤Pefabloc
（商標）SC，Pentapharm社製を使用して封じた。
【００３１】カラムは製造業者の使用説明書に対応して
再生し、そして緩衝液Ａを使用して平衡させた。続い
て、組換えタンパク質Ｓを含有する４８５mlの細胞培養
上澄み液を１０ml／分の速度でカラムに適用した。カラ
ムに結合しなかった材料を緩衝液Ａで洗浄して同一流速
で除去した。そのあと、カラムを先ず緩衝液Ｂで続いて
緩衝液Ｃで溶離した。続く溶離が緩衝液Ｄで生じた。タ
ンパク質の吸着が、２８０nmの標準的方法のクロマトグ
ラフィーの間じゅう続いた。クロマトグラフィーの実行
の後、タンパク質の濃度をブラッドホード法（M. Bradf
ord, Anal. Biochem. 72, 248-254(1976))によって測定
した。タンパク質Ｓの含量を市販のＥＬＩＳＡ系（Asse
rachrome Protein S, Boehringer Mannheim 社製）だけ
でなく凝固試験（タンパク質Ｓ凝固試験、Boehringer M
annheim 社）によって測定した。
【００３２】ほとんど全てのｒＰＳがマトリックスに結
合したことがわかった。ｒＰＳは０．４Ｍ NaCl（緩衝
液Ｃ）にてアニオン交換体から溶離した。上記に名を挙
げたアニオン交換体を使用することにより、細胞培地中
に一般に含有されている染料ブロモフェノールレッド
は、０．４M NaClにてｒＰＳの引き続く単離を実質的に
助長する０．１８Ｍの塩濃度でカラムからそれまでに溶
離された。このことは、他のアニオン交換体の使用に比
べて利点を構成する。
【００３３】アニオン交換体上のｒＰＳの精製（第１工
程）の本質的な結果を、図１および表１に要約する。実
施例１に記載した精製により、細胞培地の全タンパク質
に対する３％ｒＰＳ抗原の量は、０．４M NaClフラクシ
ョン中でタンパク質に対する８％ｒＰＳまで増加した。
比活性は２５倍増加した。
【００３４】
【表１】
【００３５】ｂ）カルシウムイオンの添加を伴うアニオ
ン交換クロマトグラフィーによる随伴タンパク質の吸着
によるｒＰＳの精製（第２工程） 同じアニオン交換型を１．ａ）のもとに記載したように
使用した。 材料： カラム：Q-Hyper D 、Sepracor；１cm×４cm。 機器 ：Pharmacia EPLC LCC-500。 緩衝液Ａ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.0 。 緩衝液Ｂ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.0 、0.15M NaC
l、10mM CaCl2。 緩衝液Ｃ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.0 、１M NaCl。
【００３６】カラムを製造業者の使用説明書に対応して
再生して緩衝液Ｂを使用して平衡させた。実施例１．
ａ）に記載したように細胞培養上澄み液から単離された
組換えタンパク質Ｓを、NaClの濃度が０．１８Ｍ以下の
状態にあるように緩衝液Ａによって２．５倍希釈した。
１０mMの濃度を有するCaCl2 を添加した。続いて、タン
パク質混合物をカラムに適用し、末結合タンパク質を緩
衝液Ｂを使用してカラムから洗い出した。結合したタン
パク質は緩衝液Ｃによって溶離した。クロマトグラフィ
ーの進行を実施例１．ａ）に記載したように追跡し、そ
れぞれのタンパク質濃度を測定した。
【００３７】結果は、ｒＰＳは邪魔されずにカラムを通
過したが、一方支配的な大多数の別のタンパク質はカラ
ム上にくっついたままであることを示した。これらの汚
染タンパク質は、次いで１M NaClで溶離した。この実験
の本質的な結合を図２、図３および表２に示す。
【００３８】実施例１．ｂ）に記載した精製によって、
ｒＰＳの抗原含有量は、他のタンパク質との関連におい
て１２倍増加した。比活性は１４倍増加した。変性電気
泳動分析（U. K. Laemmli, Nature 227, 680〜685(197
0))は、実施例１．ｂ）に記載した精製により、ｒＰＳ
が純度９５％以上で単離されたことを証明した（図
３）。
【００３９】
【表２】
【００４０】実施例２ ａ）アニオン交換クロマトグラフィーによるｒFaIXの精
製 次の実施例において、超拡散性を有する第四級アミノ型
アニオン交換体（Q-Hyper D 、Sepracor社製）を使用し
た。 材料： カラム：Q-Hyper D 、Sepracor；２cm×４cm。 機器 ：Pharmacia EPLC LCC-500。 緩衝液Ａ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH5.5 。 緩衝液Ｂ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH5.5 、0.18M NaC
l。 緩衝液Ｃ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH5.5 、0.3M NaCl
。 緩衝液Ｄ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH5.5 、1.0M NaCl
。
【００４１】組換えファクターIX（ｒFIX ）をｒＰＳ
（実施例１．ａ）に対するのと類似した方法で得た。カ
ラムを製造業者の使用説明書に対応して再生して緩衝液
Ａで平衡させた。引き続き、組換えファクターIXを含有
している細胞培養上澄み液１９９７mlを１０ml／分の速
度でカラムに適用した。カラムに結合しなかった材料
を、緩衝液Ａで洗浄して同一流速で除去した。そのあ
と、カラムを先ず緩衝液Ｂで、続いて緩衝液Ｃで洗浄し
た。続いて溶離が緩衝液Ｄによって生じた。
【００４２】タンパク質の吸着を、２８０nmで通例の方
法でクロマトグラフィーの間じゅう追跡した。クロマト
グラフィーの終了後、タンパク質濃度をブラッドホード
法（M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254(197
6））によって測定した。ファクターIXの含量を商業的
凝固試験（ファクターIX凝固、Immuno社）によって定量
した。
【００４３】結果は、ほとんど全てのｒFaIXがアニオン
交換体に結合したことを示した。ｒFaIXは、０．３Ｍ
NaClにてアニオン交換体から溶離した。類似した結果
が、他の第四級アミノアニオン交換体を使用しても得ら
れた。他方、Q-Hyper D を使用することにより、標準的
に細胞培地中に含有されている染料ブロモフェノールレ
ッドは、０．３M NaClでのｒFaIXの引き続く単離を実質
的に助長する０．３Ｍ以下の塩濃度でカラムからそれま
でに溶離されていた。他のアニオン交換体は、この有利
な性質を持っていない。
【００４４】アニオン交換体上のｒFaIXの精製の本質的
な結果を、図４および表３に要約する。実施例２．ａに
記載した精製により、ｒFaIXは２０倍濃縮され、比活性
は１２倍増加した。
【００４５】
【表３】
【００４６】ｂ）カルシウムイオンの添加を伴うアニオ
ン交換クロマトグラフィーによる随伴タンパク質の吸着
によるｒFaIXの精製 実施例２（ａ）で使用したアニオン交換体をそのままア
ニオン交換体として役立つQ-Hyper D を実施例２．ｂ）
にも使用した。 カラム：Q-Hyper D 、Sepracor；２cm×４cm。 機器 ：Pharmacia EPLC LCC-500。 緩衝液Ａ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.4 。 緩衝液Ｂ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.4 、0.15M NaC
l、10mM CaCl2。 緩衝液Ｃ：20mM Bis-Tris ／HCl 、pH7.4 、1.0M NaCl
。
【００４７】カラムを製造業者の使用説明書に対応して
再生して緩衝液Ａで平衡させた。実施例２．ａ）で得た
組換えファクターIXの８５mlを、NaClの濃度が０．１５
Ｍまで減少するような緩衝液Ａで２倍希釈した。CaCl2
を１０mMまで添加した。引き続き、タンパク質混合物を
適用して非結合タンパク質を緩衝液Ａによってカラムか
ら洗い出した。カラム上に結合したタンパク質を緩衝液
Ｃによって溶離した。クロマトグラフィーの進行を実施
例２．ａ）に記載したように追跡した。タンパク質濃度
と酵素活性を測定した。
【００４８】結果は、ｒFaIXはじゃまされずにカラムを
通過したが、一方支配的な大多数の汚染タンパク質がカ
ラム上にくっついたままであることを示した。これらの
汚染タンパク質を次いで１Ｍ NaClで溶離した。
【００４９】本質的な結果を図５、図６および表４に要
約した。実施例２．ｂ）に記載した精製によって、ｒFa
IXの比活性は４倍まで増加した。Laemmli による変性電
気泳動分析は、実施例２．ｂ）に記載した精製により、
ｒFaIXは８０％以上の純度で単離されたことを説明した
（図６）。
【００５０】
【表４】
【００５１】ｃ）アフィニティクロマトグラフィーによ
るｒFaIXの精製 下記のもので、実施例２．ａ）において得たｒFaIXをア
フィニティクロマトグラフィーにより精製した。ヘパリ
ン−セファロースを親和性マトリックスとして使用し
た。 材料： カラム：HiTrapR Heparin、Pharmacia ；５ml。 機器 ：Pharmacia EPLC LCC-500。 緩衝液Ａ：50mM Tris 、20mM sodium citrate 、pH7.4
。 緩衝液Ｂ：50mM Tris 、20mM sodium citrate 、pH7.4
、0.15M NaCl。 緩衝液Ｃ：50mM Tris 、20mM sodium citrate 、pH7.4
、0.3M NaCl 。 緩衝液Ｄ：50mM Tris 、20mM sodium citrate 、pH7.4
、１M NaCl。
【００５２】カラムを製造業者の使用説明書に対応して
再生して緩衝液Ａで平衡させた。実施例２．ａ）で得た
ｒFaIX ７８mlをカラムに適用し、非結合タンパク質を
緩衝液Ａによってカラムから洗い出した。引き続き、カ
ラムを緩衝液Ｂで、その後緩衝液Ｃで溶離した。引き続
く溶離が緩衝液Ｄで生じた。クロマトグラフィーの進行
を実施例２．ａ）に記載したように追跡し、タンパク質
濃度および酵素活性を測定した。
【００５３】結果は、ｒFaIXはカラム上に完全に結合
し、そして最初に０．３Ｍ NaClによってこれから溶離
されることを示した。しかしながら、この方法において
は、別のタンパク質もまたｒFaIXと同時に溶離されてそ
の上ｒFaIXから分離されなかった。比活性またはｒFaIX
は、実施例２．ｃ）で示された方法によっては僅か４．
５倍増加しただけであった。本質的な結果を図７および
表５に要約する。
【００５４】
【表５】
【００５５】実施例３ アニオン交換クロクトグラフィーとアフィニティクロマ
トグラフィーの直接結合によるｒFaIXの精製 次の実施例において、実施例２．ａ）で得たｒFaIXを、
先ずアニオン交換体にその後アフィニティクロマトグラ
フィーに適用するような方法で精製した。Q-Hyper D は
アニオン交換体として役立つ。これは超拡散性を有する
アミノ型のアニオン交換体である。ヘパリン−セファロ
ース（HiTrap（登録商標）ヘパリン、Pharmacia 社製）
を親和性マトリックスとして使用した。Q-Hyper D カラ
ムをヘパリン−セファロースカラムの前に直接直列に取
り付けた。ただ最小に限定されたたわみ管だけを、場合
によっては弁とともに、カラム間に据え付けた。 材料： カラム１：Q-Hyper D R Sepracor；２cm×４cm。 カラム２：HiTrapR Heparin 、Pharmacia ；５ml。 機器 ：pharmacis EPLC Lcc-500。 緩衝液Ａ：20mM Tris ／HCl 、pH7.4 。 緩衝液Ｂ：20mM Tris ／HCl 、pH7.4 、150mM NaCl、10
mM CaCl2。 緩衝液Ｃ：20mM Tris ／HCl 、pH7.4 、1.0M NaCl 。 緩衝液Ｄ：50mM Tris 、20mM sodium citrate 、pH7.4
、0.15M NaCl。 緩衝液Ｅ：50mM Tris 、20mM sodium citrate 、pH7.4
、0.3M NaCl 。 緩衝液Ｆ：50mM Tris 、20mM sodium citrate 、pH7.4
、１M NaCl。
【００５６】アニオン交換体を有するカラムの出口は、
液体の流れが先ずカラム１を流れ抜けその後直接にカラ
ム２を流れ抜けるようなたわみ管の接続によりアフィニ
ティクロマトグラフィーカラムの入口に直接接続され
た。
【００５７】カラムを製造業者の使用説明書に対応して
再生して緩衝液Ｂによって平衡させた。実施例２．ａ）
に記載したように細胞培養上澄み液から単離したｒFaIX
７０mlを、NaClの濃度が０．１５Ｍまで低下するよう
な緩衝液Ａで２倍まで希釈した。CaCl2 を１０mMの濃度
まで添加した。引き続き、タンパク質混合物を２．５ml
／分でカラム１（Q-Hyper D(登録商標）に適用し、直接
カラム２（ヘパリン−セファロース）へ移動させ、そこ
で非結合タンパク質を緩衝液Ｂによってカラム３から洗
い流した。そのあと、カラム１をアフィニティカラムか
ら分離して液体の流れをカラム２に直接適用した。実施
例２．ｃ）に示した方法と同様にして、ヘパリンカラム
から非結合タンパク質を緩衝液Ｄを使用する洗浄により
除去した。ヘパリンカラムの溶離を緩衝液Ｅを使用して
続けた。引き続く溶離を緩衝液Ｆで使用して行った。試
料の適用後、Q-Hyper D(登録商標）カラムがヘパリンカ
ラムから取りはずされなくて代わりに、ヘパリンカラム
の溶離のための液体流が相互に連結された弁によってヘ
パリンカラムに直接導かれたとき、類似の結果を得た。
【００５８】カラム１（Q-Hyper D(登録商標））上に結
合したタンパク質を緩衝液Ｃにより溶離した。クロマト
グラフィーの進行を実施例２ａ）に記載したように追跡
した。タンパク質濃度と酵素活性を測定した。結果は、
挿入されたQ-Hyper D(登録商標）カラムを通った試料の
適用により、ｒFaIXはじゃまされずにこれを通過し、そ
の後に配置されたヘパリンカラムに完全に吸着されるこ
とを示した。ｒFaIXは、０．３M NaClにより後者から溶
離された。本質的な結果を図８、図９および表６に示
す。
【００５９】ｒFaIXは、実施例３に記載した精製により
８．４倍濃縮された。比活性は８．８倍まで増加した。
変性電気泳動分析（Laemmli による）は、ｒFaIXは実施
例３に記載した精製により９５％以上の純度で単離され
ることを示した（図９）。
【００６０】実施例３においては、ｒFaIXの精製は、同
じ出発材料が使用された実施例２．ａ）、ｂ）および
ｃ）の方法の直接的な組合せにより行なった。しかしな
がら、実施例２．ｃ）の精製に比べると、より高い濃縮
とより高い比活性が、アニオン交換クロマトグラフィー
とアフィニティクロマトグラフィーの組合せによって得
られた。両方のクロマトグラフィー法の組合せによっ
て、親和性基体上の分離工程に不都合に影響するような
汚染タンパク質は、明らかにあらかじめ分離され、それ
により親和性基体のより高い特異性および選択性が得ら
れる。
【００６１】
【表６】
【００６２】実施例４ アニオン交換クロマトグラフィーによるｒFaIIの精製 次の実施例においては、触手構造を有する第四級アミノ
型アニオン交換体（Fraktogel EMD TMAE 650M, Merck社
製）を使用した。 材料 カラム：Fraktogel EMD TMAE 650M, Merck；1.6cm ×５
cm。 機器 ：Pharmacia EPLC LCC-500 system 。 緩衝液Ａ：50mM Tris ／HCl 、pH7.4 。 緩衝液Ｂ：50mM Tris ／HCl 、pH7.4 、200mM NaCl。 緩衝液Ｃ：50mM Tris ／HCl 、pH7.4 、300mM NaCl。 緩衝液Ｄ：50mM Tris ／HCl 、pH7.4 、１M NaCl。
【００６３】組換えファクターIIを、細胞培養技術の通
例の研究室の方法に基づいて単離した（Falkner 等、Th
rombosis and Haemostasis, 68, 119 〜124(1992) ）。
ｒFaIIの発現が市販の合成ＤＭＥＭ媒体にて続いて生じ
た。細胞を含まない培養上澄み液を遠心分離によって得
た。
【００６４】カラムを製造業者の使用説明書に対応して
再生させて緩衝液Ａによって平衡させた。続いて、組換
えファクターIIを含有する細胞培養上澄み液２００ml
を、４ml／分の速度でカラムに適用した。カラムに結合
しなかった材料を同じ流速で緩衝液Ａを使用する洗浄に
より除去した。その後、カラムを先ず緩衝液Ｂで続いて
緩衝液Ｃで洗浄した。次いで、溶離を緩衝液Ｄを使用し
て続けた。タンパク質の吸着をクロマトグラフィーの間
じゅう２８０nmにて通例の方法にて追跡した。クロマト
グラフィーの後、タンパク質濃度をブラッドホード法に
よって測定した。ファクターIIの含量を凝固試験（Thro
mbinzeit、Immuno AG 社製) によって測定した。
【００６５】ほとんど全ｒFaIIがアニオン交換ゲル上に
結合したことがわかった。ｒFaIIを０．３M NaClにより
アニオン交換体から溶離した。その上、例えばMacro Pr
ep（登録商標)(Bio-Rad 社製）またはQ-Sepharose Fast
Flow （登録商標)(Pharmacia 社製）のような他のアミ
ノ型アニオン交換と対照的に、一般的に細胞培養上澄み
液中に含有されている染料、ブロモフェノール レッド
は、０．２M NaClの塩濃度でカラムからすでに除去さ
れ、０．３M NaClでのｒFaIIの引き続く単離を実質的に
助長した。
【００６６】アニオン交換体上のｒFaIIの精製の本質的
な結果を、図１０および表７に要約する。実施例４に記
載した精製により、ｒFaIIの比活性は３．５倍まで増加
した。
【００６７】
【表７】
【００６８】ｂ）カルシウムイオンの添加を伴うアニオ
ン交換クロマトグラフィーによる随伴タンパク質の吸着
によるｒFaIIの精製 Fraktogel EMD TMAE 650M(Merck 社製）がアニオン交換
樹脂として役立った。 材料 カラム：Fraktogel EMD TMAE 650M, Merck；1.6cm ×５
cm。 機器 ：Pharmacia EPLC LCC-500。 緩衝液Ａ：50mM Tris ／HCl 、pH7.4 。 緩衝液Ｂ：50mM Tris ／HCl 、pH7.4 、150mM NaCl、10
mM CaCl2。 緩衝液Ｃ：50mM Tris ／HCl 、pH7.4 、1.0mM NaCl。
【００６９】カラムを製造業者の使用説明書に対応して
再生させて緩衝液Ｂによって平衡させた。実施例４．
ａ）に記載したように細胞培養上澄み液から単離した組
換えファクターIIを、NaClの濃度が総計して０．２Ｍ以
下になるような緩衝液Ａによって２倍希釈した。CaCl2
を１０mMの濃度まで添加した。引き続き、タンパク質混
合物をカラムに適用して非結合タンパク質を緩衝液Ｂに
よってカラムから洗い出した。結合したタンパク質を緩
衝液Ｃによって溶離した。
【００７０】クロマトグラフィーの進行を先述の実施例
のように追跡してタンパク質濃度を測定した。結果は、
ｒFaIIはじゃまをされずにカラムを通過したが、一方支
配的な大多数の汚染タンパク質はカラムにくっついたま
まであることを示した。これらのタンパク質は、次いで
１M NaClによって溶離した。
【００７１】本質的な結果を図１１、図１２および表８
に示す。実施例４．ａ）およびｂ）に記載した精製によ
って、ｒFaIIの比活性は１１倍まで増加した。Laemmli
による変性電気泳動分析は、実施例４ａおよびｂに記載
した精製により、ｒFaIIが９５％以上の純度で単離され
たことを証明した。
【００７２】
【表８】
【図面の簡単な説明】
【図１】Q-Hyper D 上のクロマトグラフィーによる細胞
培養上澄み液からの組換えタンパク質Ｓの精製（予備工
程＝第１工程）。
【図２】カルシウムイオンの添加を伴なうQ-Hyper D 上
のクロマトグラフィーによる組換えタンパク質Ｓの精製
（＝第２工程）。
【図３】精製組換えタンパク質ＳのSDS-ポリアクリルア
ミド（PAGE）ゲル電気泳動（Ａ：細胞培養上澄み液、
Ｂ：精製ｒＰＳ）。
【図４】Q-Hyper D 上のクロマトグラフィーによるｒFa
IXの精製（第１工程）。
【図５】カルシウムイオンの添加を伴なうQ-Hyper D 上
のクロマトグラフィーによるｒFaIXの精製（第２工
程）。
【図６】ｒFaIXのSDS-PAGEゲル電気泳動（Ａ：細胞培養
上澄み液、Ｂ：精製ｒFaIX）。
【図７】ヘパリン−セファロース上のクロマトグラフィ
ーによるｒFaIXの精製（第３工程）。
【図８】Q-Hyper D およびヘパリン−セファロース上の
結合されたクロマトグラフィーによるｒFaIXの精製（第
２および第３工程）。
【図９】図８で得られたｒFaIXのSDS-PAGEゲル電気泳
動。
【図１０】Fraktogel （登録商標）EMD TMAE 650上のク
ロマトグラフィーによる細胞培養上澄み液からのｒFaII
の精製（第１工程）。
【図１１】Fraktogel （登録商標）EMD TMAE 650上のク
ロマトグラフィーによるｒFaIIの精製（第２工程）。
【図１２】SDS-PAGEゲル電気泳動によるｒFaIIのの分析
（Ａ：細胞培養上澄み液、Ｂ：精製ｒFaII）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/43 ＡＣＡ (72)発明者 フライトリッヒ・ドルナー オーストリア国 フィエナ、ペテルリニガ ーセ 17

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タンパク質含有溶液から非ビタミンＫ依
    存性随伴タンパク質よりビタミンＫ依存性タンパク質を
    分離する方法であって、カルシウムイオンをこの溶液に
    添加してカルシウム含有溶液をビタミンＫ依存性タンパ
    ク質でなくて随伴タンパク質が吸着される条件下に陰イ
    オン交換体と接触させることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記ビタミンＫ依存性タンパク質が陰イ
    オン交換体に吸着され、洗浄され、溶離されたものであ
    って、場合によっては、溶離剤のイオン強度が低下させ
    られる条件下に、前記ビタミンＫ依存性タンパク質含有
    溶液が更に陰イオン交換体と接触させられる、請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 非吸着ビタミンＫ依存性タンパク質が親
    和性基体上に吸着されて選択的に溶離される、請求項１
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 任意の組合せまたは順序で請求項２およ
    び／または３記載の方法の工程を使用して実行される、
    請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 分離工程が同じ陰イオン交換体を使用し
    て、好ましくはクロマトグラフィーによって行なわれ
    る、請求項１または２記載の方法。
  6. 【請求項６】 陰イオン交換体が超拡散性を有する、請
    求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 基体Q-Hyper D(登録商標）が陰イオン交
    換体として使用される、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 陰イオン交換体が触手構造を有する、請
    求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 親和性基体がヘパリン結合基体材料、ヘ
    パリン−セファロースおよびヘパリンアガロースからな
    る群より選ばれたる、請求項３記載の方法。
  10. 【請求項１０】 溶離後のタンパク質溶液のイオン強度
    が０．１５〜０．２Ｍまで減少される、請求項９記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 CaCl2 が１．０mMの最小濃度まで添加
    される、請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 タンパク質溶液が４〜９のｐＨ値を有
    する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ビタミンＫ依存性タンパク質がＦII、
    ＦVII 、ＦIX、ＦＸ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｃおよ
    びタンパク質Ｚから選ばれる、請求項１〜１２のいずれ
    か１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 タンパク質が遺伝子技術の方法により
    生産され、形質転換またはトランスフェクトした細胞の
    培養上澄み液から単離される、請求項１３に記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１４記載のビタミンＫ依存
    性タンパク質の単離方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜１４記載の非ビタミンＫ依
    存性随伴タンパク質の単離方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜１４記載の方法によって生
    産され、そして少なくとも９５％の純度であることを特
    徴とする、高純度ビタミンＫ依存性タンパク質。
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