JP2848461B2 - タンパク質の精製法 - Google Patents
タンパク質の精製法Info
- Publication number
- JP2848461B2 JP2848461B2 JP1259873A JP25987389A JP2848461B2 JP 2848461 B2 JP2848461 B2 JP 2848461B2 JP 1259873 A JP1259873 A JP 1259873A JP 25987389 A JP25987389 A JP 25987389A JP 2848461 B2 JP2848461 B2 JP 2848461B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- resin
- cation
- contacting
- ion exchange
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
Description
【発明の詳細な説明】 ヒト成長ホルモン、ヒトプロテインＣおよび凝固因子
VII等を包含する、多数の、ヒトおよびその他の哺乳動
物タンパクが、これらのタンパクをコードしているDNA
で宿主細胞をトランスフェクトし、その組換え細胞をタ
ンパクの発現に適切な条件下で増殖させることによっ
て、これらの細胞中で生産されている。グリンネル等
（Grinnell et al）は、バイオテクノロジー（Biotechn
ology）５:1189−1192（1987）に、ヒト腎細胞による組
換えヒトプロテインＣ（HPC）の発現を記載している。
このタンパクは細胞によって細胞培養培地に分泌され、
培養培地およびその他の成分、例えば細胞排泄物、細胞
残骸およびタンパクまたは同様に培地に集積されるその
他の物質等から分離されなければならない。また、タン
パクの生物学的活性は保持されねばならないので、回収
条件を、タンパクの生物学的活性を保持し、同時に、培
地中の不純物からタンパクを効果的に分離するような、
穏やかな条件としなければならない。純度はしばしば、
考慮しなければならない重要事項であり、とりわけ医薬
への応用のためには重要である。
VII等を包含する、多数の、ヒトおよびその他の哺乳動
物タンパクが、これらのタンパクをコードしているDNA
で宿主細胞をトランスフェクトし、その組換え細胞をタ
ンパクの発現に適切な条件下で増殖させることによっ
て、これらの細胞中で生産されている。グリンネル等
（Grinnell et al）は、バイオテクノロジー（Biotechn
ology）５:1189−1192（1987）に、ヒト腎細胞による組
換えヒトプロテインＣ（HPC）の発現を記載している。
このタンパクは細胞によって細胞培養培地に分泌され、
培養培地およびその他の成分、例えば細胞排泄物、細胞
残骸およびタンパクまたは同様に培地に集積されるその
他の物質等から分離されなければならない。また、タン
パクの生物学的活性は保持されねばならないので、回収
条件を、タンパクの生物学的活性を保持し、同時に、培
地中の不純物からタンパクを効果的に分離するような、
穏やかな条件としなければならない。純度はしばしば、
考慮しなければならない重要事項であり、とりわけ医薬
への応用のためには重要である。
細胞培養培地から生物学的に活性な形態のタンパクを
回収するには、多数の問題がある。例えば、所望のタン
パクを、該タンパクを伴っているかもしれないホモロー
ガスな生物学的に不活性なタンパクの様な、細胞培養培
地中の、他の非常に類似しているタンパクから分離しな
ければならない。回収方法によって、高レベルの純度を
有する生物学的に活性な形態のタンパクを得るべきであ
る。
回収するには、多数の問題がある。例えば、所望のタン
パクを、該タンパクを伴っているかもしれないホモロー
ガスな生物学的に不活性なタンパクの様な、細胞培養培
地中の、他の非常に類似しているタンパクから分離しな
ければならない。回収方法によって、高レベルの純度を
有する生物学的に活性な形態のタンパクを得るべきであ
る。
ジョーンズ等（Jones et al）は、米国特許第4,512,9
22号に宿主細胞の細胞質から屈折力のあるタンパク（宿
主細胞内で不溶性顆粒タンパクを形成する輸送されない
タンパク）を回収するための方法を記載している。変性
−再生タンパクの回収系を記載している関連特許には、
米国特許第4,599,197号、第4,518,526号および第4,511,
503号がある。
22号に宿主細胞の細胞質から屈折力のあるタンパク（宿
主細胞内で不溶性顆粒タンパクを形成する輸送されない
タンパク）を回収するための方法を記載している。変性
−再生タンパクの回収系を記載している関連特許には、
米国特許第4,599,197号、第4,518,526号および第4,511,
503号がある。
ラウシュおよびメング（Raush and Meng）の米国特許
第4,677,196号は、屈折体の形態でもある、宿主細胞か
らのヘテロジニアスな（heterogenous）タンパクの回収
を記載している。
第4,677,196号は、屈折体の形態でもある、宿主細胞か
らのヘテロジニアスな（heterogenous）タンパクの回収
を記載している。
ハング等（Hung et al）の米国特許第4,734,362号
は、タンパクを変性させ、次いで、再生させて所望の生
成物を得ることを含む、宿主細胞から組換え屈折タンパ
クを回収するための方法を記載している。
は、タンパクを変性させ、次いで、再生させて所望の生
成物を得ることを含む、宿主細胞から組換え屈折タンパ
クを回収するための方法を記載している。
ヒト凝固因子VIIの回収および精製は、ブローズおよ
びマジェラス（Brose and Majerus）によってザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Jo
urnal of Biological Chemistry）255:1242−1247（198
0）に記載されている。彼らは、まず、クエン酸バリウ
ムにタンパクを吸着させ、クロマトグラフィーによって
分離することからなる方法を使用し、ヒト血漿から約30
％の収率で因子VIIを精製した。
びマジェラス（Brose and Majerus）によってザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Jo
urnal of Biological Chemistry）255:1242−1247（198
0）に記載されている。彼らは、まず、クエン酸バリウ
ムにタンパクを吸着させ、クロマトグラフィーによって
分離することからなる方法を使用し、ヒト血漿から約30
％の収率で因子VIIを精製した。
ビタミンＫ依存性タンパクは、止血の維持に関連のあ
る種類のタンパクである。ビタミンＫへの依存は、タン
パクの生合成の間に起こる。ヒトプロテインＣ（HPC）
は、止血の維持に重要な役割を果たすビタミンＫ依存性
血漿糖タンパクである。エズモン（C.T.Esmon）のサイ
エンス（Science）235:1348−1352（1987）。
る種類のタンパクである。ビタミンＫへの依存は、タン
パクの生合成の間に起こる。ヒトプロテインＣ（HPC）
は、止血の維持に重要な役割を果たすビタミンＫ依存性
血漿糖タンパクである。エズモン（C.T.Esmon）のサイ
エンス（Science）235:1348−1352（1987）。
HPCにカルシウムイオン（Ca2+）が結合すると、蛍光
放射分光学によって測定し得るHPCの構造上の変化を生
じる。ジョンソン等（Johnson et al）のジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、258:5554−5560（1983）。構造変化は、アガロー
スゲル電機泳動の様な電機的分野においてタンパクの移
動パターンの相違によって測定される様な表面の荷電分
布の変化をもたらす。ステンフロ（Stenflo,J.）のジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）、251:355−363（1976）。
放射分光学によって測定し得るHPCの構造上の変化を生
じる。ジョンソン等（Johnson et al）のジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、258:5554−5560（1983）。構造変化は、アガロー
スゲル電機泳動の様な電機的分野においてタンパクの移
動パターンの相違によって測定される様な表面の荷電分
布の変化をもたらす。ステンフロ（Stenflo,J.）のジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）、251:355−363（1976）。
本発明は、宿主細胞によって産生されたか、またはタ
ンパクをコードしているDNAでトランスフォームまたは
トランスフェクトされた後の宿主細胞によって産生され
た、排出ビタミンＫ依存性タンパクを細胞培養培地から
回収および精製する方法を提供するものである。ビタミ
ンＫ依存性タンパクは、カルシウムイオンまたはバリウ
ムイオンの様な２価陽イオンと結合し、その結果、タン
パクの構造が変化したりタンパクの表面荷電が変化した
りする。本発明では、これらの変化を利用し、２価陽イ
オンの存在下で、種々の基質へのタンパクの結合親和性
を制御する。この方法は、タンパクのイオン的に変化し
た結合親和性に基づいてタンパクを分離するために、通
常のクロマトグラフィーを使用する。
ンパクをコードしているDNAでトランスフォームまたは
トランスフェクトされた後の宿主細胞によって産生され
た、排出ビタミンＫ依存性タンパクを細胞培養培地から
回収および精製する方法を提供するものである。ビタミ
ンＫ依存性タンパクは、カルシウムイオンまたはバリウ
ムイオンの様な２価陽イオンと結合し、その結果、タン
パクの構造が変化したりタンパクの表面荷電が変化した
りする。本発明では、これらの変化を利用し、２価陽イ
オンの存在下で、種々の基質へのタンパクの結合親和性
を制御する。この方法は、タンパクのイオン的に変化し
た結合親和性に基づいてタンパクを分離するために、通
常のクロマトグラフィーを使用する。
本発明方法では、タンパクを含んでいる細胞培養培地
をキレート剤で処理し、内生の２価陽イオンを除去す
る。培地を、これが強い親和性を有するイオン交換樹脂
と接触させる。次いで、タンパクに結合し、タンパク−
陽イオン複合体として溶離する２価陽イオンを含有する
溶液で樹脂からタンパクを溶離する。次に、このタンパ
ク−陽イオン複合体を、陽イオンと結合する固定化キレ
ート剤を有する樹脂と接触させる。キレート樹脂へ選択
的に陽イオンと結合し、この樹脂からタンパクのみが溶
離する。次に、更に精製するために、タンパクを第２の
イオン交換樹脂と接触させる。タンパクを第２の陽イオ
ン含有バッファーで処理すると、タンパク−陽イオン複
合体が形成し、この複合体を疎水性樹脂と接触させる。
タンパク−陽イオン複合体は、疎水性樹脂に強く結合す
る。次いで、樹脂と結合しているタンパクを、陽イオン
と結合するキレート剤で処理し、疎水性樹脂から高純度
のタンパクを溶出することができる。タンパクとタンパ
ク−陽イオン複合体間の結合差を利用し、各工程におい
て90％以上の収率で、実質上純粋な生物学的に活性なタ
ンパクを回収するための、効率的でタンパクを変性させ
ない方法とすることができる。
をキレート剤で処理し、内生の２価陽イオンを除去す
る。培地を、これが強い親和性を有するイオン交換樹脂
と接触させる。次いで、タンパクに結合し、タンパク−
陽イオン複合体として溶離する２価陽イオンを含有する
溶液で樹脂からタンパクを溶離する。次に、このタンパ
ク−陽イオン複合体を、陽イオンと結合する固定化キレ
ート剤を有する樹脂と接触させる。キレート樹脂へ選択
的に陽イオンと結合し、この樹脂からタンパクのみが溶
離する。次に、更に精製するために、タンパクを第２の
イオン交換樹脂と接触させる。タンパクを第２の陽イオ
ン含有バッファーで処理すると、タンパク−陽イオン複
合体が形成し、この複合体を疎水性樹脂と接触させる。
タンパク−陽イオン複合体は、疎水性樹脂に強く結合す
る。次いで、樹脂と結合しているタンパクを、陽イオン
と結合するキレート剤で処理し、疎水性樹脂から高純度
のタンパクを溶出することができる。タンパクとタンパ
ク−陽イオン複合体間の結合差を利用し、各工程におい
て90％以上の収率で、実質上純粋な生物学的に活性なタ
ンパクを回収するための、効率的でタンパクを変性させ
ない方法とすることができる。
第１図は、２価陽イオン結合タンパクの精製について
本発明方法を説明するフローチャートを示す。
本発明方法を説明するフローチャートを示す。
第２図は、NaClグラジエントを使用する、ファルマシ
ア・モノＱ（Pharmacia MonoQ）イオン交換樹脂からの
ヒトプロテインＣの溶出プロファイルを示す。
ア・モノＱ（Pharmacia MonoQ）イオン交換樹脂からの
ヒトプロテインＣの溶出プロファイルを示す。
第３図は、CaCl2グラジエントを使用する、ファルマ
シア・モノＱイオン交換樹脂からのヒトプロテインＣの
溶出プロファイルを示す。
シア・モノＱイオン交換樹脂からのヒトプロテインＣの
溶出プロファイルを示す。
第４図は、CaCl2溶離バッファーおよび高NaClバッフ
ァーの両者を使用する、ファルマシア・ファーストフロ
ーＱ（Pharmacia Fast Flow Q）イオン交換樹脂からの
ヒトプロテインＣの溶出プロファイルを示す。
ァーの両者を使用する、ファルマシア・ファーストフロ
ーＱ（Pharmacia Fast Flow Q）イオン交換樹脂からの
ヒトプロテインＣの溶出プロファイルを示す。
HPCおよびその他のビタミンＫ依存性タンパクの大部
分は、Ca2+の様な２価陽イオンと結合する。タンパクの
結合部位の大部分は、修飾されたグルタミン酸残基であ
るらしい。オーリン等（Ohlin et al）、1988、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）、263:7411−7417。グルタミン酸残基が修飾され
る反応は、ガンマカルボキシル化であり、これは、ミク
ロソーム酵素、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼによ
って行われる翻訳後修飾である。ガンマカルボキシル化
グルタメート（Gla残基と呼ばれる）は、ビタミンＫ依
存性タンパクの生物学的活性に必要である。例えば、HP
Cの場合、タンパクを生物学的に活性（例えば、抗血栓
活性）にするために、HPCタンパク配列の最初の９個の
連続したグルタメート残基を、ガンマカルボキシル化に
よって修飾しなければならない。
分は、Ca2+の様な２価陽イオンと結合する。タンパクの
結合部位の大部分は、修飾されたグルタミン酸残基であ
るらしい。オーリン等（Ohlin et al）、1988、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）、263:7411−7417。グルタミン酸残基が修飾され
る反応は、ガンマカルボキシル化であり、これは、ミク
ロソーム酵素、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼによ
って行われる翻訳後修飾である。ガンマカルボキシル化
グルタメート（Gla残基と呼ばれる）は、ビタミンＫ依
存性タンパクの生物学的活性に必要である。例えば、HP
Cの場合、タンパクを生物学的に活性（例えば、抗血栓
活性）にするために、HPCタンパク配列の最初の９個の
連続したグルタメート残基を、ガンマカルボキシル化に
よって修飾しなければならない。
HPCの場合、これらのGla残基は、Ca2+に対する結合部
位の大部分を構成する。エスモン等（N.L.Esmon et a
l）のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）、258:5548−5553（1983）。ジョン
ソン等（Johnson et al）のジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー、258:5554−5560（1983）；オ
ーリンおよびステンフロー（Ohlin and Stenflo）のジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、262:
I3798−13804（1987）；およびスターンズ等（Stearns
et al）のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー、269:826−832（1986）によって記載された様
に、HPCの軽鎖およびHPCの重鎖には、表皮細胞成長因子
様領域で形成される高親和性Ca2+結合部位がある。HPC
タンパクの表面荷電分布の変化は、Ca2+による９個のGl
a残基の中和（１残基当たり２個の負の荷電）に起因
し、その結果、正味18個の負の荷電を失う。Ca2+結合に
よって起こるHPCの表面荷電分布の変化は、構造変化の
結果でもある。構造におけるこの変化は、イオン交換ク
ロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーで使
用される樹脂の様な通常の樹脂に対するその結合プロフ
ァイルに影響する。より具体的には、この変化は通常の
イオン交換クロマトグラフィー樹脂を「偽親和性」樹脂
として作用させる。
位の大部分を構成する。エスモン等（N.L.Esmon et a
l）のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）、258:5548−5553（1983）。ジョン
ソン等（Johnson et al）のジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー、258:5554−5560（1983）；オ
ーリンおよびステンフロー（Ohlin and Stenflo）のジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、262:
I3798−13804（1987）；およびスターンズ等（Stearns
et al）のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー、269:826−832（1986）によって記載された様
に、HPCの軽鎖およびHPCの重鎖には、表皮細胞成長因子
様領域で形成される高親和性Ca2+結合部位がある。HPC
タンパクの表面荷電分布の変化は、Ca2+による９個のGl
a残基の中和（１残基当たり２個の負の荷電）に起因
し、その結果、正味18個の負の荷電を失う。Ca2+結合に
よって起こるHPCの表面荷電分布の変化は、構造変化の
結果でもある。構造におけるこの変化は、イオン交換ク
ロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーで使
用される樹脂の様な通常の樹脂に対するその結合プロフ
ァイルに影響する。より具体的には、この変化は通常の
イオン交換クロマトグラフィー樹脂を「偽親和性」樹脂
として作用させる。
本発明の方法は、高比活性のタンパクから低比活性の
タンパクを選択的に分離することができる。この選択性
は、タンパクに存在するGla残基の数に基づく。例え
ば、樹脂に対するGla含有タンパクの親和性の高さに基
づき、低比活性のタンパク（即ち、より少ないGla残基
を有するタンパク）を、より高比活性のタンパク（即
ち、多数のGla残基を有するタンパク）から分離するこ
とができる。より多数のGla残基を有するタンパクは、
カルシウムの様な２価陽イオンと複合体形成して、より
明白な構造的および電気的変化を示し、２価陽イオンを
含有する溶離バッファーが使用される場合、これらの高
活性タンパクは、カラムから、より容易に溶離するであ
ろう。この選択性は非常に有効かつ有用である。多数の
ほにゅう動物セルラインは、全てのGla残基の存在を欠
いているため、完全に生物学的に活性な組換えビタミン
Ｋ依存性タンパクを発現することができない。本発明の
方法は、完全に活性なビタミンＫ依存性タンパクを、そ
れより低活性の形態の同一のタンパクから分離すること
ができる。この方法は、簡単であり、経済的であり、い
ずれの生化学研究室によっても容易に組み立てられる。
タンパクを選択的に分離することができる。この選択性
は、タンパクに存在するGla残基の数に基づく。例え
ば、樹脂に対するGla含有タンパクの親和性の高さに基
づき、低比活性のタンパク（即ち、より少ないGla残基
を有するタンパク）を、より高比活性のタンパク（即
ち、多数のGla残基を有するタンパク）から分離するこ
とができる。より多数のGla残基を有するタンパクは、
カルシウムの様な２価陽イオンと複合体形成して、より
明白な構造的および電気的変化を示し、２価陽イオンを
含有する溶離バッファーが使用される場合、これらの高
活性タンパクは、カラムから、より容易に溶離するであ
ろう。この選択性は非常に有効かつ有用である。多数の
ほにゅう動物セルラインは、全てのGla残基の存在を欠
いているため、完全に生物学的に活性な組換えビタミン
Ｋ依存性タンパクを発現することができない。本発明の
方法は、完全に活性なビタミンＫ依存性タンパクを、そ
れより低活性の形態の同一のタンパクから分離すること
ができる。この方法は、簡単であり、経済的であり、い
ずれの生化学研究室によっても容易に組み立てられる。
本発明は、偽親和性樹脂として通常のクロマトグラフ
ィー樹脂（イオン交換または疎水性の様な）を使用する
ことを基礎とする。低濃度の２価陽イオン、とりわけCa
2+の存在または非存在は、通常のクロマトグラフィー樹
脂におけるHPCの溶離プロファイルに影響する。この現
象は、全てのビタミンＫ依存性タンパクおよび／または
ペプチド、およびCa2+結合タンパク、ペプチドまたは巨
大分子を包含する全ての２価陽イオン結合タンパクに及
ぶかもしれない。Ca2+は、既知のビタミンＫ依存性タン
パクに結合させるための、生理学的に非常に豊富なエフ
ェクター２価金属イオンなので、これを以下の大部分の
試験について使用する。しかしながら、Ca2+を、ストロ
ンチウム（Sr2+）およびバリウム（Ba2+）の様な他の２
価陽イオンで置き換えてもよい。これらの金属イオンに
よっても同じ結果が得られる。
ィー樹脂（イオン交換または疎水性の様な）を使用する
ことを基礎とする。低濃度の２価陽イオン、とりわけCa
2+の存在または非存在は、通常のクロマトグラフィー樹
脂におけるHPCの溶離プロファイルに影響する。この現
象は、全てのビタミンＫ依存性タンパクおよび／または
ペプチド、およびCa2+結合タンパク、ペプチドまたは巨
大分子を包含する全ての２価陽イオン結合タンパクに及
ぶかもしれない。Ca2+は、既知のビタミンＫ依存性タン
パクに結合させるための、生理学的に非常に豊富なエフ
ェクター２価金属イオンなので、これを以下の大部分の
試験について使用する。しかしながら、Ca2+を、ストロ
ンチウム（Sr2+）およびバリウム（Ba2+）の様な他の２
価陽イオンで置き換えてもよい。これらの金属イオンに
よっても同じ結果が得られる。
本発明方法は、例えばヒトプロテインＣ（HPC）、因
子IX、因子Ｘ、因子II、因子VII、ヒトプロテインＳ（H
PS）、プロテインＺ、骨Glaタンパクおよび骨マトリッ
クスGlaタンパクを包含する、産生される全てのビタミ
ンｋ依存性タンパクに有効である。この方法は、HPCの
様なビタミンＫ依存性タンパク酵素原、および活性化プ
ロテインＣ（APC）の様な対応する活性化形の血漿プロ
テアーゼの両者に有効である。
子IX、因子Ｘ、因子II、因子VII、ヒトプロテインＳ（H
PS）、プロテインＺ、骨Glaタンパクおよび骨マトリッ
クスGlaタンパクを包含する、産生される全てのビタミ
ンｋ依存性タンパクに有効である。この方法は、HPCの
様なビタミンＫ依存性タンパク酵素原、および活性化プ
ロテインＣ（APC）の様な対応する活性化形の血漿プロ
テアーゼの両者に有効である。
本明細書記載の発明はまた、微生物（宿主細胞）中で
発現した後に宿主細胞から細胞培養培地に分泌されるヘ
テロローガスな組換えタンパクの単離、精製、再活性化
および使用に有用な方法に関するものである。本発明の
目的のために、分泌されたタンパクを「排出タンパク」
と呼ぶ。本明細書記載の発明は更に、非形質転換セルラ
イン中で産生された排出タンパクの単離、精製、再活性
化および使用に関するものである。
発現した後に宿主細胞から細胞培養培地に分泌されるヘ
テロローガスな組換えタンパクの単離、精製、再活性化
および使用に有用な方法に関するものである。本発明の
目的のために、分泌されたタンパクを「排出タンパク」
と呼ぶ。本明細書記載の発明は更に、非形質転換セルラ
イン中で産生された排出タンパクの単離、精製、再活性
化および使用に関するものである。
組換えDNA法を使用して宿主微生物に外来のタンパク
を産生させる場合、その様なタンパクはしばしば「ヘテ
ロローガスなタンパク」または「組換えタンパク」と呼
ばれる。本発明において、「タンパク」なる語句は、２
価陽イオン結合ポリペプチドおよびタンパクの全てを包
含するものとする。「ヘテロローガス」および「組換
え」なる語句は、２価陽イオンと結合する、宿主微生物
によって分泌されるタンパクを意味するために互換的に
使用される。
を産生させる場合、その様なタンパクはしばしば「ヘテ
ロローガスなタンパク」または「組換えタンパク」と呼
ばれる。本発明において、「タンパク」なる語句は、２
価陽イオン結合ポリペプチドおよびタンパクの全てを包
含するものとする。「ヘテロローガス」および「組換
え」なる語句は、２価陽イオンと結合する、宿主微生物
によって分泌されるタンパクを意味するために互換的に
使用される。
まず、周知の標準的組換えDNA法によって、タンパク
をクローニングする。HPCのクローニングは、ベックマ
ン等（Beckmann et al）によって、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）13:5233（1
985）に記載された。ヒト腎293細胞による組換えHPC（r
HPC）の発現は、グリンネル等（Grinnell et al）によ
ってバイオテクノロジー（Biotechnology）５:1189−11
92（1987）に記載された。
をクローニングする。HPCのクローニングは、ベックマ
ン等（Beckmann et al）によって、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）13:5233（1
985）に記載された。ヒト腎293細胞による組換えHPC（r
HPC）の発現は、グリンネル等（Grinnell et al）によ
ってバイオテクノロジー（Biotechnology）５:1189−11
92（1987）に記載された。
培養培地を集め、所望により、冷室温（約４℃）にて
約20,000Gで約20分間遠心して、細胞残骸を除去する。
上清はタンパクを含有している。遠心後、ベンズアミジ
ンの様なプロテアーゼ阻害剤、およびEDTAまたはEGTAの
様なキレート剤を、全ての２価陽イオンを除去するのに
十分な濃度で培地に加えることができる（第１図、第１
−２工程参照）。
約20,000Gで約20分間遠心して、細胞残骸を除去する。
上清はタンパクを含有している。遠心後、ベンズアミジ
ンの様なプロテアーゼ阻害剤、およびEDTAまたはEGTAの
様なキレート剤を、全ての２価陽イオンを除去するのに
十分な濃度で培地に加えることができる（第１図、第１
−２工程参照）。
次いで、培地を陰イオン性４級または３級アミンベー
スの樹脂の様なイオン交換樹脂と接触させる（第１図、
第３工程）。市販品として入手し得る好適な樹脂の幾つ
かの例には、ファルマシア・ファーストフローＱ（FF
Q）およびモノＱ、およびシグマ社製QAE−A50−120およ
びDEAE3級/4級アミンがある。本発明の１態様では、樹
脂をカラムに入れることができる。しかしながら、培地
が通過し、適切なイオン交換を保証する十分な樹脂表面
積と接触し得る限り、樹脂のベッドまたはその他の形状
とすることもできる。この工程は、冷室温（８〜10℃）
で行う。
スの樹脂の様なイオン交換樹脂と接触させる（第１図、
第３工程）。市販品として入手し得る好適な樹脂の幾つ
かの例には、ファルマシア・ファーストフローＱ（FF
Q）およびモノＱ、およびシグマ社製QAE−A50−120およ
びDEAE3級/4級アミンがある。本発明の１態様では、樹
脂をカラムに入れることができる。しかしながら、培地
が通過し、適切なイオン交換を保証する十分な樹脂表面
積と接触し得る限り、樹脂のベッドまたはその他の形状
とすることもできる。この工程は、冷室温（８〜10℃）
で行う。
まず、少量のプロテアーゼ阻害剤、キレート剤、およ
び、所望により、１価の塩を含有している中性pHのバッ
ファー溶液で樹脂を平衡化する。Ca2+と反応しない限
り、いずれの中性バッファーを使用してもよいが、例え
ば、リン酸バッファーはCa2+と不溶性複合体を形成する
ので使用することができない。好ましい平衡化バッファ
ー溶液は、約20mMトリスバッファー、2mM EDTA、2mMベ
ンズアミジンおよび0.15M NaClを含有し、約7.4のpHを
有する。次いで、受容器（例えば、カラム）に樹脂を充
填する。ベッドボリュームは、タンパクのための結合部
位を与えるのに十分とすべきである。次に、既にプロテ
アーゼ阻害剤およびキレート剤で処理された培養培地を
カラムに負荷する。タンパク結合が最もよく起こるよう
に流速を調節する。HPCの場合、直接状流速を１時間当
たり、約40−80センチメートルとすべきである。
び、所望により、１価の塩を含有している中性pHのバッ
ファー溶液で樹脂を平衡化する。Ca2+と反応しない限
り、いずれの中性バッファーを使用してもよいが、例え
ば、リン酸バッファーはCa2+と不溶性複合体を形成する
ので使用することができない。好ましい平衡化バッファ
ー溶液は、約20mMトリスバッファー、2mM EDTA、2mMベ
ンズアミジンおよび0.15M NaClを含有し、約7.4のpHを
有する。次いで、受容器（例えば、カラム）に樹脂を充
填する。ベッドボリュームは、タンパクのための結合部
位を与えるのに十分とすべきである。次に、既にプロテ
アーゼ阻害剤およびキレート剤で処理された培養培地を
カラムに負荷する。タンパク結合が最もよく起こるよう
に流速を調節する。HPCの場合、直接状流速を１時間当
たり、約40−80センチメートルとすべきである。
次いで、負荷されたカラムを、１価の塩（例えば、Na
ClまたはKCl）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ベンズ
アミジン）およびキレート剤（例えば、EDTA）を含有す
る、カラム容量の約３倍またはそれ以上の量の中性バッ
ファー（例えば、トリスバッファー、pH7.4）で洗浄す
る。所望により、塩およびプロテアーゼ阻害剤を含有す
る、カラム容量の約２倍量の中性バッファーで２回目の
洗浄を行ってもよい。所望のタンパクは樹脂に対して高
い親和性を有するので、これらのタンパクは、この時点
で、イオン性樹脂に強く結合している。細胞培養培地中
のその他のタンパクおよび不純物の大部分は洗い流され
ている。カラムからタンパクを取り出すために、２価陽
イオン、好ましくはカルシウム（Ca2+）を含有している
「溶離」バッファーを使用する（第１図、第４工程）。
カルシウムイオンは、タンパクに選択的に結合し、Ca−
タンパク複合体を形成するであろう。この複合体は樹脂
に対して低い親和性を有し、従って、Ca−タンパク複合
体は、溶出液に含まれるであろう。溶離バッファーは、
中性バッファー（例えば、トリス）、１価の塩（例え
ば、NaCl）、カルシウム塩（例えば、CaCl2）およびプ
ロテアーゼ阻害剤（例えば、ベンズアミジン）の組み合
わせであってよい。好ましい溶離バッファーは、20mMト
リス、0.15NaCl、10mM CaCl2および5mMベンズアミジン
を含有し、約7.4のpHを有する。タンパクは、カラム容
量の２倍の溶離剤で溶出する。タンパクの約90パーセン
ト（90％）は、カラム容量の２倍の終わりまでに溶出さ
れる。この工程後のタンパクの回収は、約80−90％であ
る。
ClまたはKCl）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ベンズ
アミジン）およびキレート剤（例えば、EDTA）を含有す
る、カラム容量の約３倍またはそれ以上の量の中性バッ
ファー（例えば、トリスバッファー、pH7.4）で洗浄す
る。所望により、塩およびプロテアーゼ阻害剤を含有す
る、カラム容量の約２倍量の中性バッファーで２回目の
洗浄を行ってもよい。所望のタンパクは樹脂に対して高
い親和性を有するので、これらのタンパクは、この時点
で、イオン性樹脂に強く結合している。細胞培養培地中
のその他のタンパクおよび不純物の大部分は洗い流され
ている。カラムからタンパクを取り出すために、２価陽
イオン、好ましくはカルシウム（Ca2+）を含有している
「溶離」バッファーを使用する（第１図、第４工程）。
カルシウムイオンは、タンパクに選択的に結合し、Ca−
タンパク複合体を形成するであろう。この複合体は樹脂
に対して低い親和性を有し、従って、Ca−タンパク複合
体は、溶出液に含まれるであろう。溶離バッファーは、
中性バッファー（例えば、トリス）、１価の塩（例え
ば、NaCl）、カルシウム塩（例えば、CaCl2）およびプ
ロテアーゼ阻害剤（例えば、ベンズアミジン）の組み合
わせであってよい。好ましい溶離バッファーは、20mMト
リス、0.15NaCl、10mM CaCl2および5mMベンズアミジン
を含有し、約7.4のpHを有する。タンパクは、カラム容
量の２倍の溶離剤で溶出する。タンパクの約90パーセン
ト（90％）は、カラム容量の２倍の終わりまでに溶出さ
れる。この工程後のタンパクの回収は、約80−90％であ
る。
次に、タンパクを含有している溶出液を、固定化キレ
ート剤を含有する樹脂で処理し、第２のイオン交換樹脂
と接触させる（第１図、第５−７工程）。これらの２種
類の樹脂を含有しているカラムまたはベッドを、所望に
より、縦列に組み立て、キレートカラムからの溶出液を
直接イオン交換カラムに流入させてもよい。別法とし
て、キレートカラムからの溶出液を集め、次いで、イオ
ン交換カラムに負荷させてもよい。固定化EDTAを有する
チェレックス100（Chelex100）（バイオラド（Biora
d））の様な、固定化キレート剤を有する樹脂を含有し
ている市販のキレートカラムを使用することができる。
このカラムの目的は、タンパクからカルシウムを除去す
ることである。イオン交換樹脂は、最初の工程で使用し
たイオン交換樹脂と同じタイプとすることができる。こ
の工程では、まず、低濃度の塩を含有している中性pHの
バッファー（例えば、トリスバッファー）で洗浄するこ
とによって、両樹脂を平衡化させる。カラムの容量は試
料の容量に依存する。キレートカラムのベッド容量は、
好ましくは、試料200ml当たり約20mlとするべきであ
り、イオン交換カラムのベッド容量は、好ましくは、タ
ンパク0.5−1.0グラム当たり約50mlとするべきである。
両カラムは、結合していないカルシウムを除去し、更に
タンパクを精製するのに十分な流速で流すべきである。
この工程も、冷室温で行うことができる。好ましい方法
では、最初の工程からの溶出液を、直列に連結したカラ
ムに負荷する。次に、負荷したキレートカラムを、キレ
ートカラム容量に基づき、カラム容量の２倍量の、低濃
度の塩を有する中性pHのバッファーで洗浄する。液体が
溶出したら、キレートカラムの連結をはずすことができ
る。この時点で、タンパクは、イオン交換カラムに結合
している。タンパクは低い塩濃度でイオン交換カラムに
結合し、より高い塩濃度で溶離するということがわかっ
ている。従って、タンパクを溶出するためには、塩グラ
ジエントを含有している一連のバッファーでカラムを処
理すればよい（第１図、第８工程および第２図参照）。
例えば、pH7.4のトリスバッファーおよび1M NaClからな
るバッファーを、このバッファーを０−50％含有してい
る一連の溶液をカラム容量の約20倍以上使用して、カラ
ムと接触させることができる。タンパクは、約27％バッ
ファーを含有している溶液で溶離し始め、約30％バッフ
ァーで最大に溶離する。グラジエントの代わりに高い塩
濃度のバッファーを使用しても、タンパクを溶離させる
ことができる（例えば、約0.4〜1M NaCl）。キシエルお
よびデイビー（Kisiel and Davie）のメソズ・イン・エ
ンザイモロジー（Meth.in Enzymology）80:320−332（1
981）の記載に従い、分光学を使用して280nmにおける吸
収を測定し、光学密度の変化を調べることによって、溶
出をモニターする。この時点で、タンパクの回収は90％
以上である。
ート剤を含有する樹脂で処理し、第２のイオン交換樹脂
と接触させる（第１図、第５−７工程）。これらの２種
類の樹脂を含有しているカラムまたはベッドを、所望に
より、縦列に組み立て、キレートカラムからの溶出液を
直接イオン交換カラムに流入させてもよい。別法とし
て、キレートカラムからの溶出液を集め、次いで、イオ
ン交換カラムに負荷させてもよい。固定化EDTAを有する
チェレックス100（Chelex100）（バイオラド（Biora
d））の様な、固定化キレート剤を有する樹脂を含有し
ている市販のキレートカラムを使用することができる。
このカラムの目的は、タンパクからカルシウムを除去す
ることである。イオン交換樹脂は、最初の工程で使用し
たイオン交換樹脂と同じタイプとすることができる。こ
の工程では、まず、低濃度の塩を含有している中性pHの
バッファー（例えば、トリスバッファー）で洗浄するこ
とによって、両樹脂を平衡化させる。カラムの容量は試
料の容量に依存する。キレートカラムのベッド容量は、
好ましくは、試料200ml当たり約20mlとするべきであ
り、イオン交換カラムのベッド容量は、好ましくは、タ
ンパク0.5−1.0グラム当たり約50mlとするべきである。
両カラムは、結合していないカルシウムを除去し、更に
タンパクを精製するのに十分な流速で流すべきである。
この工程も、冷室温で行うことができる。好ましい方法
では、最初の工程からの溶出液を、直列に連結したカラ
ムに負荷する。次に、負荷したキレートカラムを、キレ
ートカラム容量に基づき、カラム容量の２倍量の、低濃
度の塩を有する中性pHのバッファーで洗浄する。液体が
溶出したら、キレートカラムの連結をはずすことができ
る。この時点で、タンパクは、イオン交換カラムに結合
している。タンパクは低い塩濃度でイオン交換カラムに
結合し、より高い塩濃度で溶離するということがわかっ
ている。従って、タンパクを溶出するためには、塩グラ
ジエントを含有している一連のバッファーでカラムを処
理すればよい（第１図、第８工程および第２図参照）。
例えば、pH7.4のトリスバッファーおよび1M NaClからな
るバッファーを、このバッファーを０−50％含有してい
る一連の溶液をカラム容量の約20倍以上使用して、カラ
ムと接触させることができる。タンパクは、約27％バッ
ファーを含有している溶液で溶離し始め、約30％バッフ
ァーで最大に溶離する。グラジエントの代わりに高い塩
濃度のバッファーを使用しても、タンパクを溶離させる
ことができる（例えば、約0.4〜1M NaCl）。キシエルお
よびデイビー（Kisiel and Davie）のメソズ・イン・エ
ンザイモロジー（Meth.in Enzymology）80:320−332（1
981）の記載に従い、分光学を使用して280nmにおける吸
収を測定し、光学密度の変化を調べることによって、溶
出をモニターする。この時点で、タンパクの回収は90％
以上である。
次いで、溶出液からタンパク不純物を除去することに
よってタンパクを濃縮および精製するために、タンパク
含有溶出画分を疎水性樹脂と接触させる。フェニルスペ
ロースの様な疎水性樹脂を使用することができる。市販
品として入手し得る樹脂には、フェニルスペロースHR5/
5およびフェニルセファロースCL−4B（両者ともフォル
マシア製）がある。疎水性樹脂をまず、１価の塩および
２価陽イオンを含有していることもある中性バッファー
で平衡化する。好ましい平衡化バッファーは、約7.4のp
Hを有する20mMトリス、1M CaClおよび10mM CaCl2であ
る。
よってタンパクを濃縮および精製するために、タンパク
含有溶出画分を疎水性樹脂と接触させる。フェニルスペ
ロースの様な疎水性樹脂を使用することができる。市販
品として入手し得る樹脂には、フェニルスペロースHR5/
5およびフェニルセファロースCL−4B（両者ともフォル
マシア製）がある。疎水性樹脂をまず、１価の塩および
２価陽イオンを含有していることもある中性バッファー
で平衡化する。好ましい平衡化バッファーは、約7.4のp
Hを有する20mMトリス、1M CaClおよび10mM CaCl2であ
る。
この工程では、前工程から溶出されたタンパク含有画
分を、約10mM CaCl2を含有しているバッファーの様な第
２の２価陽イオンで処理し、疎水性樹脂に負荷し、平衡
化バッファーで洗浄する（第１図、第９−10工程）。ビ
タミンＫ依存性タンパクは、Ca2+の非存在下でフェニル
スペロースの様な疎水性樹脂に弱く結合するが、Ca2+の
存在下では樹脂に対して高い親和性を有し、そのため、
EDTAの様なキレート剤を含有している溶液によって樹脂
から溶離され得るということがわかった。中性バッファ
ー、低濃度の１価の塩およびキレート剤を含有している
溶離バッファーを用いてタンパクを溶離することができ
る。好ましい溶離バッファーは、約20mMトリス、0.15M
NaClおよび1mM EDTA（pH7.4）を含有する。
分を、約10mM CaCl2を含有しているバッファーの様な第
２の２価陽イオンで処理し、疎水性樹脂に負荷し、平衡
化バッファーで洗浄する（第１図、第９−10工程）。ビ
タミンＫ依存性タンパクは、Ca2+の非存在下でフェニル
スペロースの様な疎水性樹脂に弱く結合するが、Ca2+の
存在下では樹脂に対して高い親和性を有し、そのため、
EDTAの様なキレート剤を含有している溶液によって樹脂
から溶離され得るということがわかった。中性バッファ
ー、低濃度の１価の塩およびキレート剤を含有している
溶離バッファーを用いてタンパクを溶離することができ
る。好ましい溶離バッファーは、約20mMトリス、0.15M
NaClおよび1mM EDTA（pH7.4）を含有する。
この方法によるタンパクの純度は、SDS:PAGEクロマト
グラフィーによって調べると、98％より高い。ラエムリ
（Laemmli）、ネイチャー（Nature）227:680−685（197
4）。グリンネル等（Grinnell et al）のバイオテクノ
ロジー（Biotechnology）５:1189−1192（1987）に記載
の機能分析によって調べた結果、タンパクは100％の生
物学的活性をも保持している。
グラフィーによって調べると、98％より高い。ラエムリ
（Laemmli）、ネイチャー（Nature）227:680−685（197
4）。グリンネル等（Grinnell et al）のバイオテクノ
ロジー（Biotechnology）５:1189−1192（1987）に記載
の機能分析によって調べた結果、タンパクは100％の生
物学的活性をも保持している。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する
が、本発明はいかなる意味においてもこれらの実施例に
よって限定されるものではない。
が、本発明はいかなる意味においてもこれらの実施例に
よって限定されるものではない。
実施例１ 陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによ
るHPCの分離 以下の試験のために、４級アミンベースの強陰イオン
交換樹脂（即ち、ファーストフローＱまたはモノ−Ｑ、
ファルマシア社製）を使用する。評判のよい会社からの
４級アミンベースの樹脂を使用するべきである（例え
ば、QAE−A50−120、シグマ社製）。HPCはDEAE−セファ
ロースCL−6B（シグマ社）の様な３級アミンベースの樹
脂にも結合するので、これらの樹脂を使用しても同じ結
果を得ることができる。
るHPCの分離 以下の試験のために、４級アミンベースの強陰イオン
交換樹脂（即ち、ファーストフローＱまたはモノ−Ｑ、
ファルマシア社製）を使用する。評判のよい会社からの
４級アミンベースの樹脂を使用するべきである（例え
ば、QAE−A50−120、シグマ社製）。HPCはDEAE−セファ
ロースCL−6B（シグマ社）の様な３級アミンベースの樹
脂にも結合するので、これらの樹脂を使用しても同じ結
果を得ることができる。
この結果から、HPCはCa2+の非存在下で陰イオン交換
樹脂に結合することがわかる。
樹脂に結合することがわかる。
物質： カラム：ファルマシア・モノ−Ｑ、HR5/5 器具:NaClグラジエントを流すためのファルマシアFPLC
LCC−500システム バッファーA:20mMトリス、pH7.4、0.15M NaCl 10バッファーB:20mMトリス、pH7.4、1M NaCl 流速:1ml/分 NaClグラジエント:20分間で０−100％バッファーＢ 製造業者の指示に従い、カラムを条件設定した。次い
で、カラム（ベッド容量1ml）をバッファーＡで平衡化
した。バッファーA8.5ml中、血漿HPC6mgを含有している
試料をカラムに負荷し、NaClグラジエントを開始前にカ
ラムをバッファーＡ（カラム容量の３倍量、3ml）で洗
浄した。第２図に示される様に、全てのHPCが樹脂に結
合した。HPCの濃度は、キシエルおよびデイビーのメソ
ッズ・イン・エンザイモロジー80:320−332（1981）の
記載に従い、280nmにおける吸収を測定することによっ
て光学密度よりモニターした。
LCC−500システム バッファーA:20mMトリス、pH7.4、0.15M NaCl 10バッファーB:20mMトリス、pH7.4、1M NaCl 流速:1ml/分 NaClグラジエント:20分間で０−100％バッファーＢ 製造業者の指示に従い、カラムを条件設定した。次い
で、カラム（ベッド容量1ml）をバッファーＡで平衡化
した。バッファーA8.5ml中、血漿HPC6mgを含有している
試料をカラムに負荷し、NaClグラジエントを開始前にカ
ラムをバッファーＡ（カラム容量の３倍量、3ml）で洗
浄した。第２図に示される様に、全てのHPCが樹脂に結
合した。HPCの濃度は、キシエルおよびデイビーのメソ
ッズ・イン・エンザイモロジー80:320−332（1981）の
記載に従い、280nmにおける吸収を測定することによっ
て光学密度よりモニターした。
HPCが、2mM CaCl2を含有しているバッファーＡ中にあ
る場合、HPCはモノ−Ｑカラムに結合しないということ
がわかった。2mM CaCl2は、細胞培養培地またはヒト血
漿中に通常存在しているものである。HPCは、20mMトリ
ス（pH7.4）中に0.4M NaClを含有している溶液でモノ−
Ｑ樹脂から溶離することがわかった。HPCを溶離するの
に必要なNaClの量は、pHに依存する。例えば、pHが低い
ほど、必要なNaCl濃度は高く、pHが高いほど、必要なNa
Cl濃度は低い。
る場合、HPCはモノ−Ｑカラムに結合しないということ
がわかった。2mM CaCl2は、細胞培養培地またはヒト血
漿中に通常存在しているものである。HPCは、20mMトリ
ス（pH7.4）中に0.4M NaClを含有している溶液でモノ−
Ｑ樹脂から溶離することがわかった。HPCを溶離するの
に必要なNaClの量は、pHに依存する。例えば、pHが低い
ほど、必要なNaCl濃度は高く、pHが高いほど、必要なNa
Cl濃度は低い。
実施例２ 低濃度のCaCl2により陰イオン交換カラムのH
PCの溶離 以下の試験は、実施例１に記載のファルマシア・モノ
−Ｑカラムおよび同一のプロトコールを使用する。
PCの溶離 以下の試験は、実施例１に記載のファルマシア・モノ
−Ｑカラムおよび同一のプロトコールを使用する。
物質： カラム：ファルマシア・モノ−Ｑ、HR5/5 器具：ファルマシアFPLC LCC−500 バッファーA:20mMトリス、pH7.4、0.15M NaCl バッファーB:20mMトリス、pH7.4、0.15M NaCl、30mM Ca
Cl2 流速:1ml/分 NaClグラジエント:2分間で０−50％バッファーＢ カラムをバッファーＡで平衡化した。Ca2+グラジエン
トの展開前に、バッファーA0.7mlに溶解したHPC0.6mgを
含有している試料をバッファーＡといっしょにカラムに
負荷した。20mMトリス、pH7.4、0.15NaCl中、６−9mM C
aCl2のグラジエントで、HPCを溶離した。第３図に示し
た結果は、漸増濃度のCaCl2中でHPCが溶離することを示
している。
Cl2 流速:1ml/分 NaClグラジエント:2分間で０−50％バッファーＢ カラムをバッファーＡで平衡化した。Ca2+グラジエン
トの展開前に、バッファーA0.7mlに溶解したHPC0.6mgを
含有している試料をバッファーＡといっしょにカラムに
負荷した。20mMトリス、pH7.4、0.15NaCl中、６−9mM C
aCl2のグラジエントで、HPCを溶離した。第３図に示し
た結果は、漸増濃度のCaCl2中でHPCが溶離することを示
している。
キシエルおよびデイビーのメソッズ・イン・エンザイ
モロジー80:320−332（1981）の記載に従い、280nmにお
ける吸収を測定して光学密度を調べることによって、HP
Cを定量した。
モロジー80:320−332（1981）の記載に従い、280nmにお
ける吸収を測定して光学密度を調べることによって、HP
Cを定量した。
実施例３ 陰イオン交換カラムからのHPCの溶離に対す
る２価金属陽イオンの特異性 実施例２の記載と同様にして試験を組み立て、実施し
た。これによって、バッファーＡまたはバッファーＣ
中、種々の濃度のCaCl2で、HPCがイソクラティック溶離
し得ることがわかった。バッファーA:20mMトリス、pH7.
4、0.15M NaCl バッファーC:20mMトリス、pH7.4 結果を第１表に示す。
る２価金属陽イオンの特異性 実施例２の記載と同様にして試験を組み立て、実施し
た。これによって、バッファーＡまたはバッファーＣ
中、種々の濃度のCaCl2で、HPCがイソクラティック溶離
し得ることがわかった。バッファーA:20mMトリス、pH7.
4、0.15M NaCl バッファーC:20mMトリス、pH7.4 結果を第１表に示す。
このデータから、同濃度の塩化マグネシウム（MgC
l2）はCaClよりずっと効果が低いので、HPCの溶離にお
けるCa2+の２価陽イオン効果はイオン特異的であること
がわかった。
l2）はCaClよりずっと効果が低いので、HPCの溶離にお
けるCa2+の２価陽イオン効果はイオン特異的であること
がわかった。
CaCl2を含有しているバッファーのイオン強度も重要
である。0.15M NaClの非存在下では、10mM CaCl2のCaCl
2は、モノ−ＱカラムからのHPCの溶離に有効ではなかっ
た。
である。0.15M NaClの非存在下では、10mM CaCl2のCaCl
2は、モノ−ＱカラムからのHPCの溶離に有効ではなかっ
た。
実施例４ モノ−ＱカラムからHPCを溶離するために0.4
M NaClの代わりに10mM CaCl2を使用することの選択性 rHPC 3.3μg/mlを発現しているヒト腎293細胞からの
２％ウシ胎児血清（FCS）調整培地（グリンネル等（Gin
nell et al.,（1987）Biotechnology ５:1189−119
2））を使用し、陰イオン交換カラムを使用する１工程
で240倍の精製が達成されたことがわかった。
M NaClの代わりに10mM CaCl2を使用することの選択性 rHPC 3.3μg/mlを発現しているヒト腎293細胞からの
２％ウシ胎児血清（FCS）調整培地（グリンネル等（Gin
nell et al.,（1987）Biotechnology ５:1189−119
2））を使用し、陰イオン交換カラムを使用する１工程
で240倍の精製が達成されたことがわかった。
製造業者の指示に従い、ファルマシア・ファーストフ
ローＱ（FFQ）樹脂100mlを適切に調製した。次いで、FF
Q樹脂を、20mMトリス、0.15M NaCl、2mM EDTA、2mMベン
ズアミジン（pH7.4）を含有するバッファー溶液で平衡
化した。3.3μg/ml rHPCを含有している２％FCS調製培
地3.3リットルに、EDTAおよびベンズアミジンをそれぞ
れ、4mMおよび5mMの終濃度まで加えた。この培養培地
を、20cm.h-1の直線状流速でFFQカラム（３×16cm）に
通した。カラムを、まず、20mMトリス、0.15M NaCl、2m
M EDTA、2mMベンズアミジン（pH7.4）を含有する溶液30
0ml（カラム容量の３倍量）で、次に、20mMトリス、0.1
5M NaCl、2mMベンズアミジン（pH7.4）を含有する溶液3
00ml（カラム容量の３倍）、次いで、20mMトリス、0.15
M NaCl、2mMベンズアミジン、10mM CaCl2（pH7.4）を含
有している溶液300mlで洗浄した。次いで、カラムを更
に、20mMトリス、0.4M NaCl、2mMベンズアミジン（pH7.
4）を含有する溶液で溶離した。実施例２の記載と同様
にして、OD280を測定することによって、HPCの量を調べ
た。グリンネル等によって記載された方法（Cinnell et
al.,（1987）Biotechnology ５:1189−1192）に従い、
HPCの比活性を以下の様にして調べた：まず、HPCを固定
化トロンボモジュリン−トロンビン複合体（エスモン博
士（Dr.C.T.Esmon,Oklahoma Medical Research Foundat
ion）から入手）で活性化した。活性化プロテインＣ（A
PC）のアミド分解活性を、トリペプチド基質Ｓ−2238
（ヘレナ（Helena））の加水分解によって測定した。HP
Cの抗凝固活性を、ヘレナからの試薬を使用し、活性化
された部分トロンボプラスチン時間（APTT）の延長によ
って調べた。HPCの比活性の単位の検定および定義は、
グリンネル等によって記載されたものである。結果を第
４図および以下の第２表に示す。
ローＱ（FFQ）樹脂100mlを適切に調製した。次いで、FF
Q樹脂を、20mMトリス、0.15M NaCl、2mM EDTA、2mMベン
ズアミジン（pH7.4）を含有するバッファー溶液で平衡
化した。3.3μg/ml rHPCを含有している２％FCS調製培
地3.3リットルに、EDTAおよびベンズアミジンをそれぞ
れ、4mMおよび5mMの終濃度まで加えた。この培養培地
を、20cm.h-1の直線状流速でFFQカラム（３×16cm）に
通した。カラムを、まず、20mMトリス、0.15M NaCl、2m
M EDTA、2mMベンズアミジン（pH7.4）を含有する溶液30
0ml（カラム容量の３倍量）で、次に、20mMトリス、0.1
5M NaCl、2mMベンズアミジン（pH7.4）を含有する溶液3
00ml（カラム容量の３倍）、次いで、20mMトリス、0.15
M NaCl、2mMベンズアミジン、10mM CaCl2（pH7.4）を含
有している溶液300mlで洗浄した。次いで、カラムを更
に、20mMトリス、0.4M NaCl、2mMベンズアミジン（pH7.
4）を含有する溶液で溶離した。実施例２の記載と同様
にして、OD280を測定することによって、HPCの量を調べ
た。グリンネル等によって記載された方法（Cinnell et
al.,（1987）Biotechnology ５:1189−1192）に従い、
HPCの比活性を以下の様にして調べた：まず、HPCを固定
化トロンボモジュリン−トロンビン複合体（エスモン博
士（Dr.C.T.Esmon,Oklahoma Medical Research Foundat
ion）から入手）で活性化した。活性化プロテインＣ（A
PC）のアミド分解活性を、トリペプチド基質Ｓ−2238
（ヘレナ（Helena））の加水分解によって測定した。HP
Cの抗凝固活性を、ヘレナからの試薬を使用し、活性化
された部分トロンボプラスチン時間（APTT）の延長によ
って調べた。HPCの比活性の単位の検定および定義は、
グリンネル等によって記載されたものである。結果を第
４図および以下の第２表に示す。
この試験からの結果は、rHPCの純度は出発物質の0.25
％から約58％に上昇（計232倍の上昇）したことをはっ
きり示した。0.4M NaClでrHPCを溶離する「従来」法を
使用して比較すると、この段階でのrHPCの純度はわずか
７％である（計28倍の上昇）。従って、本発明の方法
は、更に8.3倍の精製を与える。
％から約58％に上昇（計232倍の上昇）したことをはっ
きり示した。0.4M NaClでrHPCを溶離する「従来」法を
使用して比較すると、この段階でのrHPCの純度はわずか
７％である（計28倍の上昇）。従って、本発明の方法
は、更に8.3倍の精製を与える。
実施例５ 陰イオン交換クロマトグラフィーからのタン
パクの溶離は、Ca2+結合タンパクおよびビタミンＫ依存
性タンパクに特異的である。
パクの溶離は、Ca2+結合タンパクおよびビタミンＫ依存
性タンパクに特異的である。
この実施例では、非Ca2+結合および非ビタミンＫ依存
性の２種類のタンパクを使用した。両タンパクは通常、
実施例１で特定された条件下、即ち、20mMトリス、0.15
M NaCl（pH7.4）でファルマシア・モノ−Ｑカラムに結
合する。使用した２種類のタンパクは、グルコースオキ
シダーゼおよびアミログルコシダーゼ（それぞれ、Aspe
rgillus niger Cat.＃G2133およびA3423、シグマ社製）
であった。２種類のタンパク各々について実施例１およ
び２に記載の試験を繰り返した。結果を第３表に示す。
性の２種類のタンパクを使用した。両タンパクは通常、
実施例１で特定された条件下、即ち、20mMトリス、0.15
M NaCl（pH7.4）でファルマシア・モノ−Ｑカラムに結
合する。使用した２種類のタンパクは、グルコースオキ
シダーゼおよびアミログルコシダーゼ（それぞれ、Aspe
rgillus niger Cat.＃G2133およびA3423、シグマ社製）
であった。２種類のタンパク各々について実施例１およ
び２に記載の試験を繰り返した。結果を第３表に示す。
実施例６ 非タンパク不純物の除去のための「偽親和」
法の選択性 rHPCを発現しているヒト腎293細胞からの調整培養培
地をこの試験に使用した。グリンネル等（Cinnell et a
l.,（1987）Biotechnology ５:1189−1192））。培養培
地に、80内毒素単位/ml（8ng内毒素/ml）で内毒素（リ
ポ多糖Ａ）を含有させた。内毒素は、負に荷電した、グ
ラム陰性菌の外皮由来のリポ多糖のヘテロローガスな分
子である。総タンパク濃度の代わりに内毒素濃度を測定
する以外は実施例４の記載に従って、試験を行った。ウ
ィットエイカー・バイオプロダクツ（Whittaker Biopro
ducts）からの内毒素検定キットを使用し、内毒素濃度
を測定した。計４×106内毒素単位で出発し、10mM CaCl
2、20mMトリス、0.15M NaCl、pH7.4で溶離されたrHPCピ
ークで、5.7×104内毒素単位が回収された。これは、１
工程の精製後、出発培養培地から計98.5％の内毒素が除
去されたことを示す。
法の選択性 rHPCを発現しているヒト腎293細胞からの調整培養培
地をこの試験に使用した。グリンネル等（Cinnell et a
l.,（1987）Biotechnology ５:1189−1192））。培養培
地に、80内毒素単位/ml（8ng内毒素/ml）で内毒素（リ
ポ多糖Ａ）を含有させた。内毒素は、負に荷電した、グ
ラム陰性菌の外皮由来のリポ多糖のヘテロローガスな分
子である。総タンパク濃度の代わりに内毒素濃度を測定
する以外は実施例４の記載に従って、試験を行った。ウ
ィットエイカー・バイオプロダクツ（Whittaker Biopro
ducts）からの内毒素検定キットを使用し、内毒素濃度
を測定した。計４×106内毒素単位で出発し、10mM CaCl
2、20mMトリス、0.15M NaCl、pH7.4で溶離されたrHPCピ
ークで、5.7×104内毒素単位が回収された。これは、１
工程の精製後、出発培養培地から計98.5％の内毒素が除
去されたことを示す。
実施例７ 汚染微生物の除去のための「偽親和」法の選
択性 実施例６の記載と同様にして、試験を行った。５×10
10phi−X174ファージ（ATCC番号13706−sin siemer−ｃ
−bl）を、rHPCを発現しているヒト腎293細胞からの調
整培養培地に導入した。次いで、この培地をFFQカラム
に通した。rHPCを含有しているCaCl2溶出画分中には１
×105phi−X174ファージが回収されただけであったが、
0.4M NaCl溶出画分中には２−３×106phi−X174ファー
ジが回収された。これらの結果は、CaCl2溶離（「偽親
和」法）が0.4M NaCl溶離（従来法）より20−30倍の選
択性を与えることを示している。
択性 実施例６の記載と同様にして、試験を行った。５×10
10phi−X174ファージ（ATCC番号13706−sin siemer−ｃ
−bl）を、rHPCを発現しているヒト腎293細胞からの調
整培養培地に導入した。次いで、この培地をFFQカラム
に通した。rHPCを含有しているCaCl2溶出画分中には１
×105phi−X174ファージが回収されただけであったが、
0.4M NaCl溶出画分中には２−３×106phi−X174ファー
ジが回収された。これらの結果は、CaCl2溶離（「偽親
和」法）が0.4M NaCl溶離（従来法）より20−30倍の選
択性を与えることを示している。
実施例８ 組換えヒトプロテインＳ（HPS）の精製 A.AV12細胞によって産生されたrHPSの精製 HPSは、11Gla残基を有しているビタミンＫ依存性タン
パクである。シリアン（Syrian）ハムスターAV12細胞
（ATCC番号CRL9595、1987年11月24日受託）を、実質
上、ヨーロッパ特許出願EP−A 0247843号（1987年２月1
2日公開）の教示に従って構築されたプラスミドpShDで
常法通り形質転換することによって、HPSを含有してい
る調整培養培地を得、以下の試験に使用した。
パクである。シリアン（Syrian）ハムスターAV12細胞
（ATCC番号CRL9595、1987年11月24日受託）を、実質
上、ヨーロッパ特許出願EP−A 0247843号（1987年２月1
2日公開）の教示に従って構築されたプラスミドpShDで
常法通り形質転換することによって、HPSを含有してい
る調整培養培地を得、以下の試験に使用した。
rHPSを含有しているこの培養培地を使用し、実施例１
に記載の方法を再び行った。「従来」法（実施例７に記
載）を使用し、20mMトリス、0.33M NaCl（pH7.4）の溶
液を用いて、ファルマシアFFQカラムからrHPSを溶離し
た。次に、rHPSを含有している培養培地について、実施
例２に記載のCaCl2溶離法を使用した。次いで、「偽親
和」法を使用し、20mMトリス、0.15M NaCl、3.5mM CaCl
2（pH7.4）の溶液を用いてFFQカラムからrHPSを溶離し
た。
に記載の方法を再び行った。「従来」法（実施例７に記
載）を使用し、20mMトリス、0.33M NaCl（pH7.4）の溶
液を用いて、ファルマシアFFQカラムからrHPSを溶離し
た。次に、rHPSを含有している培養培地について、実施
例２に記載のCaCl2溶離法を使用した。次いで、「偽親
和」法を使用し、20mMトリス、0.15M NaCl、3.5mM CaCl
2（pH7.4）の溶液を用いてFFQカラムからrHPSを溶離し
た。
B. 293細胞によって産生された高比活性rHPSの精製 ヒト腎293細胞をプラスミドpShDで常法通り形質転換
し、次に血清不含の培地で細胞を培養することによっ
て、更にrHPSを得た。実質上、実施例１の教示に従い、
rHPS培養培地をファルマシア・ファーストフローＱ樹脂
に加え、その後、バッファーＡで洗浄した。次いで、溶
離バッファーが20mMトリス、0.15M NaCl、3.0mM CaCl2
（pH7.4）を含有している以外、実施例２に記載のCaCl2
溶離法を、HPS培養培地について行った。カラム容量の
約３倍量を集め、次いで、20mMトリス、pH7.4、9.5M Na
Clを含有しているバッファーでカラムを溶離した。両溶
離バッファーからの溶出rHPSの生物学的活性を、マーム
等の検定方法（Malm et al（1987）Eur.J.Biochem.165:
39−45）を使用して試験した。
し、次に血清不含の培地で細胞を培養することによっ
て、更にrHPSを得た。実質上、実施例１の教示に従い、
rHPS培養培地をファルマシア・ファーストフローＱ樹脂
に加え、その後、バッファーＡで洗浄した。次いで、溶
離バッファーが20mMトリス、0.15M NaCl、3.0mM CaCl2
（pH7.4）を含有している以外、実施例２に記載のCaCl2
溶離法を、HPS培養培地について行った。カラム容量の
約３倍量を集め、次いで、20mMトリス、pH7.4、9.5M Na
Clを含有しているバッファーでカラムを溶離した。両溶
離バッファーからの溶出rHPSの生物学的活性を、マーム
等の検定方法（Malm et al（1987）Eur.J.Biochem.165:
39−45）を使用して試験した。
血清不含の培地で増殖させたAV12−形質転換細胞から
得たrHPS（実施例8Aと同様）を、更にファルマシア・フ
ォーストフローＱ樹脂に負荷した。次に、実質上、上の
293由来のrHPSのための記載と同様にして、AV12由来のr
HPSを、3.0mM CaCl2、次いで、0.5M NaClで溶離した。
次に、マーム等の方法によって、生物学的活性を検定し
た。
得たrHPS（実施例8Aと同様）を、更にファルマシア・フ
ォーストフローＱ樹脂に負荷した。次に、実質上、上の
293由来のrHPSのための記載と同様にして、AV12由来のr
HPSを、3.0mM CaCl2、次いで、0.5M NaClで溶離した。
次に、マーム等の方法によって、生物学的活性を検定し
た。
293由来のrHPSの全機能活性の97％が、20mMトリス、
0.15M NaCl、3.0mM CaCl2（pH7.4）の溶液で溶離され
（CaCl2画分）、293由来のrHPSの機能活性の残りの３％
が、20mMトリス、0.5M NaClの溶液（pH7.4）で溶離され
た（NaCl画分）。しかしながら、AV12由来のrHPSの全機
能活性の43％のみが、CaCl2画分に溶出され、AV12由来
のrHPSが機能活性の53％がNaCl画分に溶出された。
0.15M NaCl、3.0mM CaCl2（pH7.4）の溶液で溶離され
（CaCl2画分）、293由来のrHPSの機能活性の残りの３％
が、20mMトリス、0.5M NaClの溶液（pH7.4）で溶離され
た（NaCl画分）。しかしながら、AV12由来のrHPSの全機
能活性の43％のみが、CaCl2画分に溶出され、AV12由来
のrHPSが機能活性の53％がNaCl画分に溶出された。
実施例９の記載と同様にして、rHPSのCaCl2およびNaC
l両画分中のGla含有量およびベーターヒドロキシアスパ
ルテート含有量を測定した。CaCl2およびNaCl画分から
のrHPS分子は、ベーターヒドロキシアスパルテート含有
量、分子量（還元および非還元SDS−PAGE）およびＮ−
末端タンパク配列に相違を示さなかった。しかしなが
ら、NaCl画分からの分子はCaCl2画分からの分子より２
個少ないGla残基を有しているので、この２画分からのr
HPS分子は、Gla含有量が異なった。これは、293細胞由
来の非常に機能的なrHPSに比較して、AV12細胞由来のrH
PSの比活性が低い（約50％低い）理由である。
l両画分中のGla含有量およびベーターヒドロキシアスパ
ルテート含有量を測定した。CaCl2およびNaCl画分から
のrHPS分子は、ベーターヒドロキシアスパルテート含有
量、分子量（還元および非還元SDS−PAGE）およびＮ−
末端タンパク配列に相違を示さなかった。しかしなが
ら、NaCl画分からの分子はCaCl2画分からの分子より２
個少ないGla残基を有しているので、この２画分からのr
HPS分子は、Gla含有量が異なった。これは、293細胞由
来の非常に機能的なrHPSに比較して、AV12細胞由来のrH
PSの比活性が低い（約50％低い）理由である。
この試験は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用
する溶出rHPSの「偽親和」法（CaCl2画分）によって、
高比活性rHPS（高Gla含有量）から低比活性rHPS（低Gla
含有量）を選択的に分離し得ることを示す。
する溶出rHPSの「偽親和」法（CaCl2画分）によって、
高比活性rHPS（高Gla含有量）から低比活性rHPS（低Gla
含有量）を選択的に分離し得ることを示す。
実施例９ 高比活性を有するrHPCは、低比活性rHPCから
分離し得る。
分離し得る。
ヒトプロトロンビンタンパクは、生物学的活性に必須
である10個のGla残基を有している。ボロウスキー等（B
orowski et al,J.Biol.Chem.,260:9258−9264（198
5））。２または４個のGla残基を欠損しているヒトプロ
トロンビンの天然の変異体は、その生物学的活性の、そ
れぞれ66％および５％のみを保持している。計10個のGl
a残基の内、２個のGlaを欠損しているプロトロンビン
は、30％以上の活性の低下を生じるので、完全な活性の
ためには全てのGla残基の存在が必須である。
である10個のGla残基を有している。ボロウスキー等（B
orowski et al,J.Biol.Chem.,260:9258−9264（198
5））。２または４個のGla残基を欠損しているヒトプロ
トロンビンの天然の変異体は、その生物学的活性の、そ
れぞれ66％および５％のみを保持している。計10個のGl
a残基の内、２個のGlaを欠損しているプロトロンビン
は、30％以上の活性の低下を生じるので、完全な活性の
ためには全てのGla残基の存在が必須である。
不純な培養培地で測定した時、１部分のみ活性である
（血漿HPC標準品に比較すると、30−60％の抗凝固活
性）rHPCを、実質上、米国特許出願129,028号（1987年1
2月４日出願）の教示に従って構築されたプラスミドp4
−14でシリアンハムスターAV12細胞（ATCC番号CRL959
5）を形質転換することによって得た。実施例４のHPCの
ための記載と同様にして、活性を測定した。この培養培
地からのrHPCを、実施例４に記載の方法によって、吸着
させ、溶離した。
（血漿HPC標準品に比較すると、30−60％の抗凝固活
性）rHPCを、実質上、米国特許出願129,028号（1987年1
2月４日出願）の教示に従って構築されたプラスミドp4
−14でシリアンハムスターAV12細胞（ATCC番号CRL959
5）を形質転換することによって得た。実施例４のHPCの
ための記載と同様にして、活性を測定した。この培養培
地からのrHPCを、実施例４に記載の方法によって、吸着
させ、溶離した。
培養培地中の全出発rHPCの45パーセントが、20mMトリ
ス、0.15M NaCl、10mM CaCl2の溶液（pH7.4）で溶離さ
れ（CaCl2画分）、20％が20mMトリス、0.4M NaCl（pH7.
4）で溶離された（NaCl画分）。CaCl2画分およびNaCl画
分中のrHPCの抗凝固活性は、血症HPC標準品に比較する
と、それぞれ100％および25％であった。CaCl2画分およ
びNaCl画分の両者におけるrHPC中のGla含有量およびベ
ーターヒドロキシアスパルテート含有量を、クワンダお
よびカタヤマに記載の方法（Kuwanda and Katayama,Ana
l.Biochem.,131:173−179（1983））の改良法を使用し
て測定した。即ち、アミノ酸分析の前にミニエール（mi
niert）バルブを備えたテフロンバイアルを用いて、タ
ンパクのアルカリ加水分解を行った。（ピアス（Pierc
e）,Cat.＃14005,10130）。2.5N NaOH中のタンパク試料
を注ぎ、ウォータース：ピコタッグ・ウォーク・ステー
ション（Waters picotag work station）を使用し、ミ
ニエールバルブを介してN2を通した。クワンダおよびカ
タヤマの記載に従い、110℃で20時間加水分解した後、
加水分解物を中和し、抽出し、ｏ−フタルアルデヒド／
エタンチオールで誘導体化した。以下の条件下でHPLC分
析を行った： カラム： ヌクレオシル5SB（4.6×50）（マチェレイ−ナゲル
（Macherey−Nagel）） イソクラティック溶離:20mMクエン酸ナトリウム、pH
4.30、50％アセチルニトリル中 流速:1.5ml/分 以下の溶離時間を得た： CaCl2画分およびNaCl画分は、rHPC 1モル当たり、そ
れぞれ９および6.5モルのGlaを含有していることがわか
った。
ス、0.15M NaCl、10mM CaCl2の溶液（pH7.4）で溶離さ
れ（CaCl2画分）、20％が20mMトリス、0.4M NaCl（pH7.
4）で溶離された（NaCl画分）。CaCl2画分およびNaCl画
分中のrHPCの抗凝固活性は、血症HPC標準品に比較する
と、それぞれ100％および25％であった。CaCl2画分およ
びNaCl画分の両者におけるrHPC中のGla含有量およびベ
ーターヒドロキシアスパルテート含有量を、クワンダお
よびカタヤマに記載の方法（Kuwanda and Katayama,Ana
l.Biochem.,131:173−179（1983））の改良法を使用し
て測定した。即ち、アミノ酸分析の前にミニエール（mi
niert）バルブを備えたテフロンバイアルを用いて、タ
ンパクのアルカリ加水分解を行った。（ピアス（Pierc
e）,Cat.＃14005,10130）。2.5N NaOH中のタンパク試料
を注ぎ、ウォータース：ピコタッグ・ウォーク・ステー
ション（Waters picotag work station）を使用し、ミ
ニエールバルブを介してN2を通した。クワンダおよびカ
タヤマの記載に従い、110℃で20時間加水分解した後、
加水分解物を中和し、抽出し、ｏ−フタルアルデヒド／
エタンチオールで誘導体化した。以下の条件下でHPLC分
析を行った： カラム： ヌクレオシル5SB（4.6×50）（マチェレイ−ナゲル
（Macherey−Nagel）） イソクラティック溶離:20mMクエン酸ナトリウム、pH
4.30、50％アセチルニトリル中 流速:1.5ml/分 以下の溶離時間を得た： CaCl2画分およびNaCl画分は、rHPC 1モル当たり、そ
れぞれ９および6.5モルのGlaを含有していることがわか
った。
存在しているGla残基の数は、他のビタミンＫ依存性
タンパクについて文献で報告されたことによって予想さ
れるように、rHPCの生物学的活性と非常によく相関して
いる。ボロウスキー等（Borowski et al.,J.Biol.Che
m.,260:9258−9264（1985））。CaCl2画分およびNaCl画
分間のrHPC中Gla含有量の相違以外に、ベータ−ヒドロ
キシアスパルテート含有量、分子量（還元および非還元
SDS−PAGE）およびＮ−末端タンパク配列に相違は検出
されなかった。Ｎ−末端タンパク配列分析は、PTH−ア
ミノ酸分析溶オンラインHPLCシステム（モデル120A）を
備えたアプライド・バイオシステム（Applied Biosyste
m）・モデル470A気相シークエネーターを用い、自動エ
ドマン・デグラデーションケミストリーによって行われ
た。
タンパクについて文献で報告されたことによって予想さ
れるように、rHPCの生物学的活性と非常によく相関して
いる。ボロウスキー等（Borowski et al.,J.Biol.Che
m.,260:9258−9264（1985））。CaCl2画分およびNaCl画
分間のrHPC中Gla含有量の相違以外に、ベータ−ヒドロ
キシアスパルテート含有量、分子量（還元および非還元
SDS−PAGE）およびＮ−末端タンパク配列に相違は検出
されなかった。Ｎ−末端タンパク配列分析は、PTH−ア
ミノ酸分析溶オンラインHPLCシステム（モデル120A）を
備えたアプライド・バイオシステム（Applied Biosyste
m）・モデル470A気相シークエネーターを用い、自動エ
ドマン・デグラデーションケミストリーによって行われ
た。
この試験から、陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーを使用するrHPCの溶離の「偽親和」法（CaCl2画分）
は、高比活性rHPC（高Gla含有量）から低比活性rHPC
（低Gla含有量）を選択的に分離し得ることがわかっ
た。
ーを使用するrHPCの溶離の「偽親和」法（CaCl2画分）
は、高比活性rHPC（高Gla含有量）から低比活性rHPC
（低Gla含有量）を選択的に分離し得ることがわかっ
た。
実施例10 陰イオン交換カラムからの活性化ヒトプロテ
インＣ（APC）の溶離 HPCは、活性セリンプロテアーゼ、活性化ヒトプロテ
インＣ（APC）の酵素原形態である。HPCとAPC間の分子
上の唯一の相違は、APCがHPCの重鎖のＮ−末端の12−ア
ミノ酸ペプチドを欠如していることである。即ち、APC
とHPCのGla含有量には相違がない。
インＣ（APC）の溶離 HPCは、活性セリンプロテアーゼ、活性化ヒトプロテ
インＣ（APC）の酵素原形態である。HPCとAPC間の分子
上の唯一の相違は、APCがHPCの重鎖のＮ−末端の12−ア
ミノ酸ペプチドを欠如していることである。即ち、APC
とHPCのGla含有量には相違がない。
rAPCは、グリンネル等（Ginnell et al.,（1987）Bio
technology ５:1189−1192））の記載に従い、固定化さ
れたトロンボモジュリン−トロンビン複合体を用い、rH
PCから製造された。実施例１および２に記載の試験プロ
トコールを、rAPCについて再び行った。ファルマシア・
モノ−ＱカラムからのrAPCの溶離フロファイルの結果
は、rHPCの結果と同じであった。「偽親和」法または
「従来」法について、rAPCの溶離のために必要なCaCl2
またはNaClの量は、rHPCの量に一致した。
technology ５:1189−1192））の記載に従い、固定化さ
れたトロンボモジュリン−トロンビン複合体を用い、rH
PCから製造された。実施例１および２に記載の試験プロ
トコールを、rAPCについて再び行った。ファルマシア・
モノ−ＱカラムからのrAPCの溶離フロファイルの結果
は、rHPCの結果と同じであった。「偽親和」法または
「従来」法について、rAPCの溶離のために必要なCaCl2
またはNaClの量は、rHPCの量に一致した。
実施例11 疎水性カラムクロマトグラフィー 生化学の研究において使用される最も一般的な通常の
タイプの３種類のカラムクロマトグラフィーは、イオン
交換、疎水性／逆相およびサイズ排除である。前者２タ
イプは、問題の生化学的化合物の表面電荷分布に依存す
るが、サイズ排除クロマトグラフィーは依存しない。そ
のため、「偽親和」ビタミンＫ依存性タンパクが、「偽
親和」法を使用するこのタイプのカラムで分離され得る
ことを説明するために、疎水性カラムクロマトグラフィ
ーを使用した。
タイプの３種類のカラムクロマトグラフィーは、イオン
交換、疎水性／逆相およびサイズ排除である。前者２タ
イプは、問題の生化学的化合物の表面電荷分布に依存す
るが、サイズ排除クロマトグラフィーは依存しない。そ
のため、「偽親和」ビタミンＫ依存性タンパクが、「偽
親和」法を使用するこのタイプのカラムで分離され得る
ことを説明するために、疎水性カラムクロマトグラフィ
ーを使用した。
疎水性側鎖は固定担体に結合され、疎水性カラム樹脂
を作り出す。これを説明するために、フェニル基を使用
した。種々の長さの脂肪族炭化水素のような、その他の
疎水性側鎖を使用してもよい。フェニルスペロースHR5/
5およびフェニルセファロースCL−4B（両者ともファル
マシア製）のために、２種類のタイプの固定担体を使用
した。
を作り出す。これを説明するために、フェニル基を使用
した。種々の長さの脂肪族炭化水素のような、その他の
疎水性側鎖を使用してもよい。フェニルスペロースHR5/
5およびフェニルセファロースCL−4B（両者ともファル
マシア製）のために、２種類のタイプの固定担体を使用
した。
（ａ）物質： カラム：ファルマシア・フェニルスペロースHR5/5 バッファーA:20mMトリス、2M NaCl、pH7.4 バッファーB:20mMトリス、0.15M NaCl、pH7.4 バッファーC:20mMトリス、2M NaCl、10mM CaCl2、pH7.4 バッファーD:20mMトリス、0.15M NaCl、10mM CaCl2、pH
7.4 流速:0.5ml/分 クロマトグラフィーシステム：ファルマシアFPLC LCC−
500システム 製造業者の指示に従ってカラムを調製し、次いで、バ
ッファーＡで平衡化した。rHPC 1mgをバッファーＡに溶
解し、次にカラムに負荷した。タンパクの濃度を、280n
mでの光学密度を測定することによってモニターした。r
HPCは、カラムに結合しなかった。０−100％バッファー
Ｂのグラジエント（40分間）では、それ以上の物質が溶
離されなかった。rHPCをバッファーＣに溶解し、カラム
に負荷した。全てのrHPCがフェニルスペロースカラムに
結合した。バッファーＡとＣ間の唯一の相違は、バッフ
ァーＣが10mM CaCl2を含有していることである。０−10
0％バッファーＤのグラジエントを40分で展開した。rHP
Cは、60％バッファーＤおよび40％バッファーＣ、また
は20mMトリス、0.9M NaCl、10mM CaCl2（pH7.4）で溶離
された。
7.4 流速:0.5ml/分 クロマトグラフィーシステム：ファルマシアFPLC LCC−
500システム 製造業者の指示に従ってカラムを調製し、次いで、バ
ッファーＡで平衡化した。rHPC 1mgをバッファーＡに溶
解し、次にカラムに負荷した。タンパクの濃度を、280n
mでの光学密度を測定することによってモニターした。r
HPCは、カラムに結合しなかった。０−100％バッファー
Ｂのグラジエント（40分間）では、それ以上の物質が溶
離されなかった。rHPCをバッファーＣに溶解し、カラム
に負荷した。全てのrHPCがフェニルスペロースカラムに
結合した。バッファーＡとＣ間の唯一の相違は、バッフ
ァーＣが10mM CaCl2を含有していることである。０−10
0％バッファーＤのグラジエントを40分で展開した。rHP
Cは、60％バッファーＤおよび40％バッファーＣ、また
は20mMトリス、0.9M NaCl、10mM CaCl2（pH7.4）で溶離
された。
従って、このことから、rHPCは、低濃度のCa2+の存在
下で疎水性樹脂に対して、より高い親和性を有している
ことがわかる。
下で疎水性樹脂に対して、より高い親和性を有している
ことがわかる。
フェニルセファロースカラムを使用し、試験を繰り返
した： （ｂ）物質： カラム：ファルマシア・フェニルセファロースCL−4B
0.5×5cm 流速:0.5ml/分 rHPCは、バッファーＡ（20mMトリス、2M NaCl、pH7.
4）、または20mMトリス、1M NaCl、10mM CaCl2（pH7.
4）のいずれかで、カラムに100％結合することがわかっ
た。しかしながら、rHPCは、20mMトリス、1M NaCl、pH
7.4の溶液中ではカラムに結合しなかった。
した： （ｂ）物質： カラム：ファルマシア・フェニルセファロースCL−4B
0.5×5cm 流速:0.5ml/分 rHPCは、バッファーＡ（20mMトリス、2M NaCl、pH7.
4）、または20mMトリス、1M NaCl、10mM CaCl2（pH7.
4）のいずれかで、カラムに100％結合することがわかっ
た。しかしながら、rHPCは、20mMトリス、1M NaCl、pH
7.4の溶液中ではカラムに結合しなかった。
実施例12 細胞培養培地からrHPCを精製するための「偽
親和」クロマトグラフィーの使用 以下の構成は、ある一連の条件および変数についての
精製体系の例である。
親和」クロマトグラフィーの使用 以下の構成は、ある一連の条件および変数についての
精製体系の例である。
以下の工程を全て、冷室温（８−10℃）で行った。
工程１ 陰イオン交換ファースト・フローＱカラム rHPCを５μg/mlで発現している293細胞からの血清不
含調整培養培地を使用した。血清不含培養培地は、イン
シュリン、トランスフェリンのタンパク／ペプチド補足
物を含有した。rHPCの濃度は通常、調整培養培地中、総
タンパクの10−15％であった。ファルマシア・ファース
トフローＱ樹脂（FFQ）を、製造業者の指示に従い、1N
HClおよび1N NaOHで洗浄した。次に、樹脂を10×20cmカ
ラムに充填した。培養培地500リットル当たり、１リッ
トルのFFQ樹脂が必要であった。カラムを充填し、20mM
トリス、1M NaCl（pH7.4）を使用し、120cm.h-1の速度
で流した。カラムを、20mMトリス、0.15M NaCl、2mM ED
TAおよび2mMベンズアミジン（pH7.4）の溶液で平衡化し
た。
含調整培養培地を使用した。血清不含培養培地は、イン
シュリン、トランスフェリンのタンパク／ペプチド補足
物を含有した。rHPCの濃度は通常、調整培養培地中、総
タンパクの10−15％であった。ファルマシア・ファース
トフローＱ樹脂（FFQ）を、製造業者の指示に従い、1N
HClおよび1N NaOHで洗浄した。次に、樹脂を10×20cmカ
ラムに充填した。培養培地500リットル当たり、１リッ
トルのFFQ樹脂が必要であった。カラムを充填し、20mM
トリス、1M NaCl（pH7.4）を使用し、120cm.h-1の速度
で流した。カラムを、20mMトリス、0.15M NaCl、2mM ED
TAおよび2mMベンズアミジン（pH7.4）の溶液で平衡化し
た。
0.2M EDTA（pH7.4）および1Mベンズアミジンの溶液
を、rHPCを含有している培養培地に加え、それぞれ4mM
および5mMの終濃度とした。次に、培養培地を80cm.h-1
の流速でFFQカラムに負荷した。
を、rHPCを含有している培養培地に加え、それぞれ4mM
および5mMの終濃度とした。次に、培養培地を80cm.h-1
の流速でFFQカラムに負荷した。
次いで、FFQカラムを、カラム容量の最小３倍量の、2
0mMトリス、0.15M NaCl、2mM EDTA、5mMベンズアミジン
（pH7.4）を含有している溶液で洗浄した。FFQカラムを
更に、最小３倍カラム容量の、20mMトリス、0.15M NaC
l、5mMベンズアミジン（pH7.4）を含有している溶液で
洗浄した。rHPCを、20mMトリス、0.15M NaCl、10mM CaC
l2、5mMベンズアミジン（pH7.4）の溶液で溶離した。流
速は、5cm.h-1であった。ブラッドフォードのタンパク
試薬（M.Bradford（1976）Anal.Biochem.72:248−254）
またはグリンネル等の記載のELISA検定（Ginnell et a
l.,（1987）Biotechnology ５:1189−1192））でrHPCを
検出した。rHPCは、この溶離バッファーによって、カラ
ム容量の２倍目の始めに溶出した。rHPCの90％は、カラ
ム容量の半分で溶離した。
0mMトリス、0.15M NaCl、2mM EDTA、5mMベンズアミジン
（pH7.4）を含有している溶液で洗浄した。FFQカラムを
更に、最小３倍カラム容量の、20mMトリス、0.15M NaC
l、5mMベンズアミジン（pH7.4）を含有している溶液で
洗浄した。rHPCを、20mMトリス、0.15M NaCl、10mM CaC
l2、5mMベンズアミジン（pH7.4）の溶液で溶離した。流
速は、5cm.h-1であった。ブラッドフォードのタンパク
試薬（M.Bradford（1976）Anal.Biochem.72:248−254）
またはグリンネル等の記載のELISA検定（Ginnell et a
l.,（1987）Biotechnology ５:1189−1192））でrHPCを
検出した。rHPCは、この溶離バッファーによって、カラ
ム容量の２倍目の始めに溶出した。rHPCの90％は、カラ
ム容量の半分で溶離した。
工程２ ファーストフローＱカラムと直列のチェレック
ス100カラム チェレックス100カラム（バイオ−ラド）を使用し、
工程１からのrHPC中のCa2+を除去した。この工程では、
通常の方法でFFQを流した。チェレックス100樹脂（300m
l）を、製造業者の指示に従い、1N NaOH−H2O−1N HCl
−H2Oで洗浄した。樹脂を3.2×40cmカラムに充填し、1M
トリス（pH7.4）の溶液で洗浄した。カラムを、20mMト
リス、0.15M NaCl（pH7.4）を含有している平衡化バッ
ファーで平衡化した。1Mトリス洗液は、チェレックス10
0をpH7.4に迅速に平衡化するのに必要であった。FFQカ
ラム（3.2×25cm）を工程１の記載の様にして洗浄し、2
0mMトリス、0.15M NaCl（pH7.4）の溶液で平衡化した。
このチェレックス100カラムをFFQカラムと直列につな
ぎ、工程１からのrHPCを含有している溶出液が、まず、
チェレックス100、次にFFQを通るようにした。
ス100カラム チェレックス100カラム（バイオ−ラド）を使用し、
工程１からのrHPC中のCa2+を除去した。この工程では、
通常の方法でFFQを流した。チェレックス100樹脂（300m
l）を、製造業者の指示に従い、1N NaOH−H2O−1N HCl
−H2Oで洗浄した。樹脂を3.2×40cmカラムに充填し、1M
トリス（pH7.4）の溶液で洗浄した。カラムを、20mMト
リス、0.15M NaCl（pH7.4）を含有している平衡化バッ
ファーで平衡化した。1Mトリス洗液は、チェレックス10
0をpH7.4に迅速に平衡化するのに必要であった。FFQカ
ラム（3.2×25cm）を工程１の記載の様にして洗浄し、2
0mMトリス、0.15M NaCl（pH7.4）の溶液で平衡化した。
このチェレックス100カラムをFFQカラムと直列につな
ぎ、工程１からのrHPCを含有している溶出液が、まず、
チェレックス100、次にFFQを通るようにした。
工程１からのrHPCの全てが負荷された後、カラムを平
衡化バッファー1.5リットルで洗浄した。次いで、チェ
レックス100カラムをFFQからはずした。
衡化バッファー1.5リットルで洗浄した。次いで、チェ
レックス100カラムをFFQからはずした。
FFQを平衡化バッファー600mlで更に洗浄した。次に、
FFQを、20mMトリス、0.25M NaCl（pH7.4）の溶液600ml
で洗浄した。この時点では、rHPCは全く溶離されなかっ
た。rHPCを、20mMトリス、0.4M NaCl（pH7.4）の高い塩
溶液でFFQから溶離した。280nmでの吸収をモニターする
ことによって、rHPCを検出した。この工程からのrHPCの
収率は、90−95％であった。
FFQを、20mMトリス、0.25M NaCl（pH7.4）の溶液600ml
で洗浄した。この時点では、rHPCは全く溶離されなかっ
た。rHPCを、20mMトリス、0.4M NaCl（pH7.4）の高い塩
溶液でFFQから溶離した。280nmでの吸収をモニターする
ことによって、rHPCを検出した。この工程からのrHPCの
収率は、90−95％であった。
工程３ 疎水性フェニルセファロース樹脂 フェニルセファロースCL−4B（ファルマシア）の3.2
×40cmカラムを充填し、次いで、以下の溶液をそれぞれ
カラム容量の３倍量を用い、20cm.h-1の流速で洗浄し
た:50％メタノール;H2O;1％酢酸;H2O;0.1M NaOH;H2O。
×40cmカラムを充填し、次いで、以下の溶液をそれぞれ
カラム容量の３倍量を用い、20cm.h-1の流速で洗浄し
た:50％メタノール;H2O;1％酢酸;H2O;0.1M NaOH;H2O。
次いで、カラムを、20mMトリス、1M NaCl、10mM CaCl
2（pH7.4）を含有している平衡化バッファーで平衡化し
た。工程２からのrHPCを、20mMトリス、2M NaCl、20mM
CaCl2（pH7.4）を含有している溶液（等容量）で希釈
し、カラムを通した。
2（pH7.4）を含有している平衡化バッファーで平衡化し
た。工程２からのrHPCを、20mMトリス、2M NaCl、20mM
CaCl2（pH7.4）を含有している溶液（等容量）で希釈
し、カラムを通した。
カラムを平衡化バッファー１リットルで更に洗浄し
た。rHPCを、20mMトリス、0.15M NaCl、1mM EDTA（pH7.
4）の溶液で溶離した。
た。rHPCを、20mMトリス、0.15M NaCl、1mM EDTA（pH7.
4）の溶液で溶離した。
この工程でのrHPCの回収は、約85％であった。SDS−P
AGEによって測定するか（ラエムリ（Laemmli,（1974）N
ature,227:680−685）または実施例４の記載の比活性に
よって測定した純度は98％より大きかった。この工程
後、内毒素の濃度は、10分の１に低下した。
AGEによって測定するか（ラエムリ（Laemmli,（1974）N
ature,227:680−685）または実施例４の記載の比活性に
よって測定した純度は98％より大きかった。この工程
後、内毒素の濃度は、10分の１に低下した。
当業者は、通常の実験を使用し、本明細書記載の特定
物質および方法に対する多数の等価物を認めるか、また
は確認することができるであろう。この様な等価物は、
本発明の範囲内であると思われ、本明細書特許請求の範
囲に包含される。
物質および方法に対する多数の等価物を認めるか、また
は確認することができるであろう。この様な等価物は、
本発明の範囲内であると思われ、本明細書特許請求の範
囲に包含される。
第１図は、２価陽イオン結合タンパクの精製について本
発明方法を説明するフローチャートであり、第２図は、
NaClグラジエントを使用する、ファルマシア・モノＱ
（Pharmacia MonoQ）イオン交換樹脂からのヒトプロテ
インＣの溶出プロファイルであり、第３図は、CaCl2グ
ラジエントを使用する、ファルマシア・モノＱイオン交
換樹脂からのヒトプロテインＣの溶出プロファイルであ
り、第４図は、CaCl2溶離バッファーおよび高NaClバッ
ファーの両者を使用する、ファルマシア・ファーストフ
ローＱ（Pharmacia Fast Flow Q）イオン交換樹脂から
のヒトプロテインＣの溶出プロファイルである。
発明方法を説明するフローチャートであり、第２図は、
NaClグラジエントを使用する、ファルマシア・モノＱ
（Pharmacia MonoQ）イオン交換樹脂からのヒトプロテ
インＣの溶出プロファイルであり、第３図は、CaCl2グ
ラジエントを使用する、ファルマシア・モノＱイオン交
換樹脂からのヒトプロテインＣの溶出プロファイルであ
り、第４図は、CaCl2溶離バッファーおよび高NaClバッ
ファーの両者を使用する、ファルマシア・ファーストフ
ローＱ（Pharmacia Fast Flow Q）イオン交換樹脂から
のヒトプロテインＣの溶出プロファイルである。
Claims (29)
- 【請求項１】組換えビタミンＫ依存性タンパクを産生す
る形質転換細胞の細胞培養培地からビタミンＫ依存性タ
ンパクを回収および精製するための方法であって、 （ａ）培地から２価陽イオンを除去し、 （ｂ）培地を、タンパクが樹脂に結合する様な条件下で
陰イオン性アミンベースのイオン交換樹脂と接触させ、 （ｃ）樹脂結合タンパクを、陽イオン−タンパク複合体
を形成させそれによって樹脂からタンパクを遊離させる
のに適した条件下で２価陽イオンで処理し、 （ｄ）陽イオン−タンパク複合体を、陽イオンを除去
し、遊離の、生物学的に活性なタンパクを得るのに適し
た条件下で処理することからなる方法（但し、上記工程
（ｄ）は陽イオン−タンパク複合体を該陽イオン−タン
パク複合体に対する固定化された抗体と接触させる工程
を含まない）。 - 【請求項２】ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化され
たヒトプロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒ
トプロテインＳからなる群から選択される請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】（ａ）における２価陽イオンの除去が、培
地にキレート剤を加えることからなる請求項１に記載の
方法。 - 【請求項４】２価陽イオンがカルシウムイオン、バリウ
ムイオンおよびストロンチウムイオンからなる群から選
択される請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】（ｄ）における陽イオン−タンパク複合体
の処理が、キレート剤を複合体と混合することからなる
請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】組換えビタミンＫ依存性タンパクを産生す
る形質転換細胞の細胞培養培地からビタミンＫ依存性タ
ンパクを精製するための方法であって、 （ａ）タンパクを含有している細胞培養培地を、該培地
由来の内生の２価陽イオンを除去するのに十分なキレー
ト剤と合し、 （ｂ）（ａ）からの混合物を、タンパクを陰イオン性ア
ミンベースのイオン交換樹脂に結合させるのに適した条
件下で陰イオン性アミンベースのイオン交換樹脂と接触
させ、 （ｃ）（ｂ）からのタンパク結合イオン交換樹脂を、陰
イオン−タンパク複合体の形成させそれによってイオン
交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件下で
２価陽イオン供給源と接触させ、 （ｄ）（ｃ）で生成した陽イオン−タンパク複合体を、
複合体から陽イオンを除去しそれによって遊離のタンパ
クを得るのに適した条件下で固定化キレート剤を含有す
る樹脂と接触させ、 （ｅ）（ｄ）で得たタンパクの、タンパクを陰イオン性
アミンベースのイオン交換樹脂に結合させるのに適した
条件下でタンパクと第２の陰イオン性アミンベースのイ
オン交換樹脂を接触させることによって精製し、 （ｆ）（ｅ）からのタンパク結合イオン交換樹脂を、イ
オン交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件
下で１価の塩と接触させ、 （ｇ）（ｆ）で得たタンパクを、陽イオン−タンパク複
合体を形成させるのに十分な２価陽イオンと接触させ、 （ｈ）（ｇ）で得た陽イオン−タンパク複合体を、陽イ
オン−タンパク複合体を疎水性樹脂に結合させるのに適
した条件下で疎水性樹脂と接触させ、 （ｉ）（ｈ）のタンパク結合疎水性樹脂を、陽イオン−
タンパク複合体から陽イオンを除去しそれによって疎水
性樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件下でキ
レート剤と接触させることからなる方法（但し、上記工
程（ｄ）は陽イオン−タンパク複合体を該陽イオン−タ
ンパク複合体に対する固定化された抗体と接触させる工
程を含まない。） - 【請求項７】２価陽イオンがカルシウムイオン、バリウ
ムイオン、ストロンチウムイオンからなる群から選択さ
れる請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化され
たヒトプロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒ
トプロテインＳからなる群から選択される請求項６また
は７に記載の方法。 - 【請求項９】キレート剤がEDTAからなる請求項６に記載
の方法。 - 【請求項１０】陰イオン性アミンベースのイオン交換樹
脂をカラムに充填する請求項６に記載の方法。 - 【請求項１１】（ｄ）の固定化キレート剤を含有する樹
脂が、EDTAが固定化された樹脂からなる請求項６に記載
の方法。 - 【請求項１２】（ｆ）の１価の塩が約0.4M〜約1.0Mの濃
度を有する塩化ナトリウムからなる請求項６に記載の方
法。 - 【請求項１３】（ｈ）の疎水性樹脂がフェニルスペロー
ス樹脂およびフェニルセファロース樹脂からなる群から
選択される請求項６に記載の方法。 - 【請求項１４】組換えビタミンＫ依存性タンパクを産生
する形質転換細胞の細胞培養培地に含有されている低比
活性ビタミンＫ依存性タンパクから高比活性ビタミンＫ
依存性タンパクを分離するための方法であって、 （ａ）タンパクを含有している細胞培養培地を、培地か
ら内生のカルシウムを除去するのに十分な量のEDTAと合
し、 （ｂ）（ａ）で得た混合物を、タンパクを陰イオン性ア
ミンベースのイオン交換樹脂に結合させるのに適した条
件下で陰イオン性アミンベースのイオン交換樹脂と接触
させ、 （ｃ）（ｂ）におけるタンパク結合イオン交換樹脂を、
カルシウム−タンパク複合体を形成させそれによってイ
オン交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件
下でカルシウムイオン供給源と接触させ、 （ｄ）（ｃ）で生成したカルシウム−タンパク複合体
を、複合体からカルシウムイオンを除去しそれによって
遊離のタンパクを得るのに適した条件下でEDTAが固定化
された樹脂物質と接触させ、 （ｅ）（ｄ）で得たタンパクを、タンパクを陰イオン性
アミンベースのイオン交換樹脂に結合させるのに適した
条件下でタンパクと第２の陰イオン性アミンベースのイ
オン交換樹脂を接触させることによって精製し、 （ｆ）（ｅ）からのタンパク結合イオン交換樹脂を、イ
オン交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件
下で１価の塩と接触させ、 （ｇ）（ｆ）で得たタンパクを、カルシウム−タンパク
複合体を形成させるのに十分なカルシウムイオン供給源
と接触させ、 （ｈ）（ｇ）で得たカルシウム−タンパク複合体を、カ
ルシウム−タンパク複合体を疎水性樹脂に結合させるの
に適した条件下で疎水性樹脂と接触させ、 （ｉ）（ｈ）のタンパク結合疎水性樹脂を、カルシウム
−タンパク複合体からカルシウムを除去しそれによって
疎水性樹脂から高比活性タンパクを選択的に遊離させる
のに十分な量のEDTAと接触させることからなる方法。 - 【請求項１５】ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化さ
れたヒトプロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原および
ヒトプロテインＳからなる群から選択される請求項14に
記載の方法。 - 【請求項１６】（ｇ）の疎水性樹脂がフェニルスペロー
スおよびフェニルセファロースからなる群から選択され
る請求項14に記載の方法。 - 【請求項１７】（ｆ）の１価の塩が約0.4〜約1.0Mの濃
度を有する塩化ナトリウムからなる請求項14に記載の方
法。 - 【請求項１８】ビタミンＫ依存性タンパクを産生する細
胞の細胞培養培地からビタミンＫ依存性タンパクを回収
および精製するための方法であって、 （ａ）培地から２価陽イオンを除去し、 （ｂ）培地を、タンパクが樹脂に結合する様な条件下て
陰イオン性アミンベースのイオン交換樹脂と接触させ、 （ｃ）樹脂結合タンパクを、陽イオン−タンパク複合体
を形成させそれによって樹脂からタンパクを遊離させる
のに適した条件下で２価陽イオンで処理し、 （ｄ）陽イオン−タンパク複合体を、陽イオンを除去
し、遊離の、生物学的に活性なタンパクを得るのに適し
た条件下で処理することからなる方法（但し、上記工程
（ｄ）は陽イオン−タンパク複合体を該陽イオン−タン
パク複合体に対する固定化された抗体と接触させる工程
を含まない）、 - 【請求項１９】タンパクがヒトプロテインＣ、ヒトプロ
テインＣ酵素原およびヒトプロテインＳからなる群から
選択される請求項18に記載の方法。 - 【請求項２０】ビタミンＫ依存性タンパクを産生する細
胞の細胞培養培地からビタミンＫ依存性タンパクを精製
するための方法であって、 （ａ）タンパクを含有している細胞培養培地を、培地か
ら内生の２価陽イオンを除去するのに十分なキレート剤
と合し、 （ｂ）（ａ）からの混合物を、タンパクを陰イオン性ア
ミンベースのイオン交換樹脂に結合させるのに適した条
件下で陰イオン性アミンベースのイオン交換樹脂と接触
させ、 （ｃ）（ｂ）からのタンパク結合イオン交換樹脂を、陽
イオン−タンパク複合体を形成させそれによってイオン
交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件下で
２価陽イオン供給源と接触させ、 （ｄ）（ｃ）で生成した陽イオン−タンパク複合体を、
複合体から陽イオンを除去しそれによって遊離のタンパ
クを得るのに適した条件下で固定化キレート剤を含有す
る樹脂と接触させ、 （ｅ）（ｄ）で得たタンパクを、タンパクを陰イオン性
アミンベースのイオン交換樹脂に結合させるのに適した
条件下でタンパクと第２の陰イオン性アミンベースのイ
オン交換樹脂を接触させることによって精製し、 （ｆ）（ｅ）からのタンパク結合イオン交換樹脂を、イ
オン交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件
下で１価の塩と接触させ、 （ｇ）（ｆ）で得たタンパクを、陽イオン−タンパク複
合体を形成させるのに十分な２価陽イオンと接触させ、 （ｈ）（ｇ）で得た陽イオン−タンパク複合体を、陽イ
オン−タンパク複合体を疎水性樹脂に結合させるのに適
した条件下で疎水性樹脂と接触させ、 （ｉ）（ｈ）のタンパク結合疎水性樹脂を、陽イオン−
タンパク複合体から陽イオンを除去しそれによって疎水
性樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件下でキ
レート剤と接触させることからなる方法（但し、上記工
程（ｄ）は陽イオン−タンパク複合体を該陽イオン−タ
ンパク複合体に対する固定化された抗体と接触させる工
程を含まない）。 - 【請求項２１】２価陽イオンがカルシウムイオン、バリ
ウムイオン、ストロンチウムイオンからなる群から選択
される請求項20に記載の方法。 - 【請求項２２】タンパクが、活性化されたヒトプロテイ
ンＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒトプロテインＳ
からなる群から選択される請求項20に記載の方法。 - 【請求項２３】ビタミンＫ依存性タンパクを産生する細
胞の細胞培養培地に含有されている低比活性ビタミンＫ
依存性タンパクから高比活性ビタミンＫ依存性タンパク
を分離するための方法であって、 （ａ）タンパクを含有している細胞培養培地を、培地か
ら内生のカルシウムを除去するのに十分な量なEDTAと合
し、 （ｂ）（ａ）で得た混合物を、タンパクを陰イオン性ア
ミンベースのイオン交換樹脂に結合させるのに適した条
件下で陰イオン性アミンベースのイオン交換樹脂と接触
させ、 （ｃ）（ｂ）におけるタンパク結合イオン交換樹脂を、
カルシウム−タンパク複合体を形成させそれによってイ
オン交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件
下でカルシウムイオン供給源と接触させ、 （ｄ）（ｃ）で生成したカルシウム−タンパク複合体
を、複合体からカルシウムイオンを除去しそれによって
遊離のタンパクを得るのに適した条件下でEDTAが固定化
された樹脂物質と接触させ、 （ｅ）（ｄ）で得たタンパクを、タンパクを陰イオン性
アミンベースのイオン交換樹脂に結合させるのに適した
条件下でタンパクと第２の陰イオン性アミンベースのイ
オン交換樹脂を接触させることによって精製し、 （ｆ）（ｅ）からのタンパク結合イオン交換樹脂を、イ
オン交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件
下で１価の塩と接触させ、 （ｇ）（ｆ）で得たタンパクを、カルシウム−タンパク
複合体を形成させるのに十分なカルシウムイオン供給源
と接触させ、 （ｈ）（ｇ）で得たカルシウム−タンパク複合体を、カ
ルシウム−タンパク複合体を疎水性樹脂に結合させるの
に適した条件下で疎水性樹脂と接触させ、 （ｉ）（ｈ）のタンパク結合疎水性樹脂を、カルシウム
−タンパク複合体からカルシウムを除去しそれによって
疎水性樹脂から高比活性タンパクを選択的に遊離させる
のに十分な量のEDTAと接触させることからなる方法。 - 【請求項２４】ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化さ
れたヒトプロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原および
ヒトプロテインＳからなる群から選択される請求項23に
記載の方法。 - 【請求項２５】ビタミンＫ依存性タンパクの試料から非
タンパク性不純物を除去するための方法であって、 （ａ）試料から２価陽イオンを除去し、 （ｂ）試料を、タンパクが樹脂に結合する様な条件下で
陰イオン性アミンベースのイオン交換樹脂と接触させ、 （ｃ）樹脂結合タンパクを、陽イオン−タンパク複合体
を形成させそれによって樹脂からタンパクを遊離させる
のに適した条件下で２価陽イオンで処理し、 （ｄ）陽イオン−タンパク複合体を、陽イオンを除去
し、遊離の、生物学的に活性なタンパクを得るのに適し
た条件下で処理することからなる方法（但し、上記工程
（ｄ）は陽イオン−タンパク複合体を該陽イオン−タン
パク複合体に対する固定化された抗体と接触させる工程
を含まない）。 - 【請求項２６】ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化さ
れたヒトプロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原および
ヒトプロテインＳからなる群から選択される請求項25に
記載の方法。 - 【請求項２７】非タンパク性不純物が細菌内毒素である
請求項25に記載の方法。 - 【請求項２８】ビタミンＫ依存性タンパクの試料からウ
イルス不純物を除去するための方法であって、 （ａ）試料から２価陽イオンを除去し、 （ｂ）試料を、タンパクが樹脂に結合する様な条件下で
陰イオン性アミンベースのイオン交換樹脂と接触させ、 （ｃ）樹脂結合タンパクを、陽イオン−タンパク複合体
を形成させそれによって樹脂からタンパクを遊離させる
のに適した条件下で２価陽イオンで処理し、 （ｄ）陽イオン−タンパク複合体を、陽イオンを除去
し、遊離の、生物学的に活性なタンパクを得るのに適し
た条件下で処理することからなる方法（但し、上記工程
（ｄ）は陽イオン−タンパク複合体を該陽イオン−タン
パク複合体に対する固定化された抗体と接触させる工程
を含まない）。 - 【請求項２９】ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化さ
れたヒトプロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原および
ヒトプロテインＳからなる群から選択される請求項28に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US393281 | 1982-06-29 | ||
| US25327988A | 1988-10-04 | 1988-10-04 | |
| US253279 | 1988-10-04 | ||
| US07/393,281 US4981952A (en) | 1988-10-04 | 1989-08-16 | Method for the purification of vitamin K-dependent proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02200180A JPH02200180A (ja) | 1990-08-08 |
| JP2848461B2 true JP2848461B2 (ja) | 1999-01-20 |
Family
ID=26943089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1259873A Expired - Lifetime JP2848461B2 (ja) | 1988-10-04 | 1989-10-03 | タンパク質の精製法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4981952A (ja) |
| EP (1) | EP0363126B2 (ja) |
| JP (1) | JP2848461B2 (ja) |
| KR (1) | KR0139209B1 (ja) |
| AT (1) | ATE106406T1 (ja) |
| AU (1) | AU635222B2 (ja) |
| CA (1) | CA1314011C (ja) |
| DE (1) | DE68915675T3 (ja) |
| DK (1) | DK176090B1 (ja) |
| ES (1) | ES2054019T5 (ja) |
| HU (1) | HU204538B (ja) |
| IE (1) | IE63765B1 (ja) |
| IL (1) | IL91822A (ja) |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8729822D0 (en) * | 1987-12-22 | 1988-02-03 | Central Blood Lab Authority | Chemical process |
| DE3833936C1 (ja) * | 1988-10-05 | 1989-09-21 | Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk, 1000 Berlin, De | |
| DE3911629A1 (de) * | 1989-04-10 | 1990-10-11 | Behringwerke Ag | Verfahren zur abtrennung von toxinen aus proteinloesungen |
| IL97312A (en) | 1990-02-23 | 1999-01-26 | Lilly Co Eli | A method of generating a polypeptide in an eukaryotic vector AND recombinant surrogate cell containing an enhanced transcriptional control unit based on the primary late adenovirus coefficient |
| EP0573605B1 (en) * | 1991-03-01 | 2000-08-30 | Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. | Preparation of factor ix |
| IT1262899B (it) * | 1992-03-27 | 1996-07-22 | Sclavo Spa | Processo per l'isolamento di fattore ix, fattore x e fattore ii altamente purificati dal complesso protrombinico o dal plasma umano |
| MY110664A (en) * | 1992-05-21 | 1999-01-30 | Lilly Co Eli | Protein c derivatives |
| DK38293D0 (da) * | 1993-03-31 | 1993-03-31 | Novo Nordisk As | Fremstilling af proteiner |
| US5618714A (en) * | 1993-12-15 | 1997-04-08 | Eli Lilly And Company | Methods for producing protein C |
| DE4406515C1 (de) * | 1994-02-28 | 1995-10-19 | Immuno Ag | Verfahren zur Isolierung und Reinigung Vitamin K-abhängiger Proteine |
| DE4435520A1 (de) * | 1994-10-04 | 1996-04-11 | Immuno Ag | Verfahren zur Trennung von rekombinantem pro-Faktor IX von rekombinantem Faktor IX |
| US5714583A (en) * | 1995-06-07 | 1998-02-03 | Genetics Institute, Inc. | Factor IX purification methods |
| US5869604A (en) * | 1995-11-09 | 1999-02-09 | Georgia Institute Of Technology | Crystallization and purification of polypeptides |
| US5910584A (en) * | 1996-09-05 | 1999-06-08 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for isolating plasmid DNA |
| US5843731A (en) * | 1996-09-05 | 1998-12-01 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for purifying plasmid DNA on calcium phosphate compound |
| HU224826B1 (en) * | 1997-04-28 | 2006-02-28 | Lilly Co Eli | Activated protein c formulations |
| US6630137B1 (en) | 1997-04-28 | 2003-10-07 | Eli Lilly And Company | Activated protein C formulations |
| EP1557463A1 (en) * | 1997-04-28 | 2005-07-27 | Eli Lilly & Company | Improved methods for processing activated protein C |
| ZA984698B (en) * | 1997-06-05 | 2000-02-01 | Lilly Co Eli | Methods for treating thombotic disorders. |
| HUP0001237A3 (en) * | 1997-10-20 | 2002-01-28 | Lilly Co Eli | Methods for treating vascular disorders |
| CN1324244A (zh) | 1998-10-22 | 2001-11-28 | 伊莱利利公司 | 治疗脓毒症的方法 |
| CA2351067A1 (en) | 1998-11-13 | 2000-05-25 | Eli Lilly And Company | Method of treating heparin-induced thrombocytopenia |
| ES2195655T3 (es) | 1998-11-20 | 2003-12-01 | Lilly Co Eli | Procedimiento para tratar fiebre hemorragica virica con proteina c. |
| BR9915572A (pt) | 1998-11-23 | 2001-08-14 | Lilly Co Eli | Processo de tratamento de doença de célula falciforme e talassemia |
| US7204981B2 (en) * | 2000-03-28 | 2007-04-17 | Eli Lilly And Company | Methods of treating diseases with activated protein C |
| US7087578B2 (en) | 2000-05-24 | 2006-08-08 | Eli Lilly And Company | Formulations and methods for treating hypercoagulable states |
| DE60138111D1 (de) * | 2000-07-21 | 2009-05-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Verfahren zur reinigung eines kalziumionen-bindenden proteins |
| US20040198652A1 (en) * | 2001-04-24 | 2004-10-07 | Carter J. Paul | Methods and compositions for preventing and treating septic shock and endotoxemia |
| US20030055003A1 (en) * | 2001-07-19 | 2003-03-20 | David Bar-Or | Use of copper chelators to inhibit the inactivation of protein C |
| JP4628618B2 (ja) * | 2001-09-26 | 2011-02-09 | 富士フイルム株式会社 | 撮像光学系 |
| AU2003213146A1 (en) * | 2002-03-08 | 2003-09-22 | Eli Lilly And Company | Activated protein c formulations |
| WO2004056309A2 (en) | 2002-12-05 | 2004-07-08 | Socratech L.L.C. | Neuroprotective activity of activated protein c is independent of its anticoagulant activity |
| US20070142272A1 (en) * | 2003-01-24 | 2007-06-21 | Zlokovic Berislav V | Neuroprotective activity of activated protein c independent of its anticoagulant activity |
| KR101284884B1 (ko) | 2003-07-08 | 2013-07-10 | 더 스크립스 리서치 인스티튜트 | 정상의 세포보호 활성 및 저하된 항응고 활성을 지닌활성화 단백질 ｃ 변이체 |
| US9192657B2 (en) * | 2003-07-08 | 2015-11-24 | The Scripps Research Institute | Activated protein C variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity |
| WO2006014839A2 (en) * | 2004-07-23 | 2006-02-09 | The University Of Rochester | Activated protein c inhibits undesirable effects of plasminogen activator in the brain |
| KR101364001B1 (ko) | 2004-12-23 | 2014-02-17 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 관심있는 비타민 ｋ-의존성 단백질을 포함한 조성물 중의단백질 오염물질의 양의 감소 |
| DE602006015907D1 (de) * | 2005-01-14 | 2010-09-16 | Bayer Healthcare Llc | Verfahren zur reinigung von factor vii |
| CN101262879B (zh) * | 2005-06-24 | 2013-04-10 | 德拉格雷丘尔公司 | 在影响呼吸道的炎症病状中气道施用活化的蛋白c |
| WO2007071767A1 (en) * | 2005-12-23 | 2007-06-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Purification of vitamin k-dependent polypeptides using preparative reverse phase chromatography (rpc) |
| WO2007112005A2 (en) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Pc5 as a factor ix propeptide processing enzyme |
| US20100284997A1 (en) * | 2006-10-31 | 2010-11-11 | Griffin John H | Dosing regimen of activated protein c and variants having reduced anticoagulant activity |
| WO2008104372A1 (en) * | 2007-02-28 | 2008-09-04 | Baxter International Inc. | Method for the purification of recombinant blood coagulation factor ix enriched in sulfated and/or phosphorylated molecules |
| EP2139499A4 (en) | 2007-04-26 | 2010-05-05 | Inspiration Biopharmaceuticals | RECOMBINANT VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS WITH HIGH SIALIC ACID CONTENT AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| US20090053786A1 (en) | 2007-07-09 | 2009-02-26 | Yung-Hsiang Kao | Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides |
| ES2576109T3 (es) * | 2008-12-02 | 2016-07-05 | Novo Nordisk Health Care Ag | Purificación de polipéptidos |
| EP2199387A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-06-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Serine protease derivatives and uses for the prevention and/or the treatment of blood coagulation disorders |
| CN104262479A (zh) | 2008-12-19 | 2015-01-07 | 国家健康与医学研究院 | 丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途 |
| JP5851410B2 (ja) | 2009-10-30 | 2016-02-03 | シーエヌジェイ ホールディングス、インク． | 組換えビタミンｋ依存性タンパク質の生成法 |
| KR20120118028A (ko) | 2010-01-18 | 2012-10-25 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 혈액 응고 인자의 정제 |
| KR101780518B1 (ko) * | 2010-04-29 | 2017-09-21 | 박스알타 인코퍼레이티드 | 음이온 교환 수지상에서의 2가 양이온 결합 단백질의 정제 방법 |
| ES2784628T3 (es) | 2011-03-29 | 2020-09-29 | Glaxosmithkline Llc | Sistema de tampón para purificación de proteína |
| CA2847818A1 (en) * | 2011-09-06 | 2013-03-14 | Medimmune, Llc | Methods for processing coagulation factors |
| JP6117219B2 (ja) * | 2011-10-14 | 2017-04-19 | バクスアルタ ゲーエムベーハー | 陰イオン交換クロマトグラフィによるタンパク質の精製方法 |
| EP2748179B1 (en) * | 2011-10-14 | 2021-12-29 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Protein purification by anion exchange chromatography |
| US20150150954A1 (en) | 2012-07-04 | 2015-06-04 | The University Of Sydney | Treatment of inflammatory skin disorders |
| NZ629845A (en) | 2013-03-15 | 2016-10-28 | Baxalta Inc | Purification method for vitamin k dependent proteins by anion exchange chromatography |
| DK3137102T3 (da) | 2014-04-16 | 2021-10-11 | Zz Biotech Llc | Apc til anvendelse til behandling af unormal kutan ardannelse |
| US20180369346A1 (en) * | 2016-01-07 | 2018-12-27 | Eio Biomedical Ltd. | Methods, compositions and kits for reducing tissue adhesions |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4512992A (en) * | 1980-06-13 | 1985-04-23 | Burroughs Wellcome Co. | Treatment with dialkoxy pyridopyrimidine compounds |
| DE3101752A1 (de) * | 1981-01-21 | 1982-08-26 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | "verfahren zur reinigung der blutgerinnungsfaktoren ii, vii, ix und/oder x und danach hergestellte praeparationen" |
| US4599197A (en) * | 1982-12-22 | 1986-07-08 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4518526A (en) * | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4766224A (en) * | 1985-08-19 | 1988-08-23 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
| US4677196A (en) * | 1985-09-06 | 1987-06-30 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
| US4786726A (en) * | 1986-01-06 | 1988-11-22 | Blood Systems, Inc. | Factor IX therapeutic blood product, means and methods of preparing same |
| US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
| DE3615558A1 (de) * | 1986-05-09 | 1987-11-12 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung eines faktor v-konzentrats |
-
1989
- 1989-08-16 US US07/393,281 patent/US4981952A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-27 CA CA000613553A patent/CA1314011C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 IL IL9182289A patent/IL91822A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-10-02 AT AT89310061T patent/ATE106406T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-10-02 ES ES89310061T patent/ES2054019T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-02 DE DE68915675T patent/DE68915675T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-02 EP EP89310061A patent/EP0363126B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-03 HU HU895158A patent/HU204538B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-10-03 JP JP1259873A patent/JP2848461B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-03 DK DK198904855A patent/DK176090B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-10-03 IE IE315989A patent/IE63765B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-10-03 AU AU42519/89A patent/AU635222B2/en not_active Ceased
- 1989-10-04 KR KR1019890014186A patent/KR0139209B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL91822A0 (en) | 1990-06-10 |
| DE68915675T3 (de) | 2002-08-14 |
| DK176090B1 (da) | 2006-05-22 |
| ATE106406T1 (de) | 1994-06-15 |
| EP0363126A3 (en) | 1991-09-11 |
| AU635222B2 (en) | 1993-03-18 |
| EP0363126B1 (en) | 1994-06-01 |
| US4981952A (en) | 1991-01-01 |
| KR900006511A (ko) | 1990-05-08 |
| DE68915675T2 (de) | 1994-10-20 |
| ES2054019T3 (es) | 1994-08-01 |
| EP0363126B2 (en) | 2002-03-06 |
| HU204538B (en) | 1992-01-28 |
| IE63765B1 (en) | 1995-06-14 |
| HUT53373A (en) | 1990-10-28 |
| ES2054019T5 (es) | 2002-10-16 |
| JPH02200180A (ja) | 1990-08-08 |
| EP0363126A2 (en) | 1990-04-11 |
| DE68915675D1 (de) | 1994-07-07 |
| AU4251989A (en) | 1990-04-12 |
| DK485589A (da) | 1990-04-05 |
| IE893159L (en) | 1990-04-04 |
| DK485589D0 (da) | 1989-10-03 |
| IL91822A (en) | 2001-06-14 |
| KR0139209B1 (ko) | 1998-04-30 |
| CA1314011C (en) | 1993-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2848461B2 (ja) | タンパク質の精製法 | |
| EP2459715B1 (en) | Method for purifying recombinant adamts13 and other proteins and compositions thereof | |
| RU2458067C2 (ru) | Способ выделения плазминогена или плазмина в присутствии фибриногена из смеси | |
| CN106967150B (zh) | 二价阳离子结合蛋白在阴离子交换树脂上的纯化方法 | |
| US5633350A (en) | Method for the isolation and purification of vitamin K-dependent proteins | |
| JPH0260312B2 (ja) | ||
| AU1642992A (en) | Preparation of factor ix | |
| JP2832129B2 (ja) | 酵素的分解によるタンパク質の切断方法およびその利用方法 | |
| JPH1075778A (ja) | プロトロンビンおよびトロンビンに結合するペプチド | |
| JPH09183794A (ja) | タンパク質の調製および回収方法 | |
| Fischer et al. | Purification of recombinant human coagulation factors II and IX and protein S expressed in recombinant Vaccinia virus-infected Vero cells | |
| HUT71326A (en) | Purification of kringle containing proteins, and especially t-pa | |
| JPH0244510B2 (ja) | ||
| EP0275282A1 (en) | Process for purifying a plasminogen activator | |
| JPH03219892A (ja) | タンパク質の製造法 | |
| JP2714817B2 (ja) | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 | |
| JPH07100032B2 (ja) | 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 | |
| JPH0471488A (ja) | ウロキナーゼ前駆体の精製法 | |
| JPH03164172A (ja) | ウロキナーゼ前駆体様蛋白質の精製方法 | |
| JPS6391080A (ja) | ヒト組織プラスミノゲン活性化因子の精製法 | |
| JPH11158198A (ja) | インターロイキン６レセプターの精製方法 | |
| JPS61246131A (ja) | 新しいタイプのプラスミノ−ゲン活性化因子及びその調製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071106 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081106 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091106 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |