HU204538B

HU204538B - Process for purifying proteines

Info

Publication number: HU204538B
Application number: HU895158A
Authority: HU
Inventors: Sau-Chi Betty Yan
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1988-10-04
Filing date: 1989-10-03
Publication date: 1992-01-28
Also published as: KR0139209B1; IL91822A; DK485589D0; ATE106406T1; EP0363126B1; IE893159L; DK176090B1; CA1314011C; IL91822A0; IE63765B1; KR900006511A; JPH02200180A; AU4251989A; HUT53373A; DK485589A; US4981952A; DE68915675T2; EP0363126A3; DE68915675D1; AU635222B2

Description

Számos emberi és emlős fehéq'ét - például a humán növekedési hormont, a humán C-proteint a VII. alvadási faktort- állítanak elő oly módon, hogy gazdasejteket az illető fehérjéket kódoló DNS-sel transzfektálják, majd a megfelelő körülmények között a rekombináns sejtekkel a kérdéses fehéq'ét termeltetik. Grinnel és munkatársai rekombináns humán C-proteínt állítottak elő emberi vesesejtekben. (Biotechnology, 5: 11891192 [1987]). A sejtekből a tápközegbe jut ki a fehéqe, ahonnan azt a sejtekből származó más anyagok - sejttönnelék, más fehéq'ék, egyéb termékek - mellől kell kinyerni. A hatékony elválasztást olyan enyhe körülmények között kell végezni, hogy az eljárás során a fehéqe biológiai aktivitása megmaradjon. Különösen a gyógyszerként való felhasználáskor jelentős tényező a nyert termék kellő tisztasága.

A fehéq'éknek biológiailag aktív formában való kinyerése több problémát vet fel. így például a kívánt fehéq'ét gyakran más, a fehéq'ével szorosan rokon melléktermékek - homológok, inaktív fehéq'ék - mellől kell elválasztani a tápközegből. Az elválasztási folyamatnak tehát olyannak kell lennie, hogy nagy tisztaságú biológiailag aktív fehéq’éhez jussunk.

Jones és munkatársai a 4512922 Iajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan módszert írnak le, mellyel refraktil fehéq'éket (a gazdasejtből nem kifutó, oldhatatlan proteínszemcsék) nyernek ki a gazdasejt citoplazmidjából. Ezzel kapcsolatosak a 4599197, a 4518526 és a 4511503 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, melyek protein denaturáló-renaturálő kinyerési eljárását íq'ák le.

Raush és Meng a 4677196 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ugyancsak refraktil testecskék alakjában lévő heterogén proteinek kinyerését ismertetik.

Hung és munkatársai által a 4734362 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás a refraktil fehéq'éknek a gazdasejtekből történő kinyerésére szolgál. Módszerük a · protein denaturálásából, majd azt követő renaturálásábóláll.

A humán VH. alvadási faktor elválasztását és tisztítását Brose és Majerus íqa le (The Journal of Biological Chemistry, 255: 1242-1247 [1980]). A tisztított ^zVH. faktort 30%-os kitermeléssel nyerik ki. Eljárásuk során a fehéq'éket először bárium-citrátra adszorbeálják, majd kromatográfiával választják el.

A K-vítamin függő proteinek a fehéq'ék olyan csoportját képezik, melyek részt vesznek a hemoszíázis í fenntartásában. A K-vitamintól való függőség a proteinek bioszintézisében nyilvánul meg. A humán C-protein olyan K-vitamin dependens plazma glikoprotein, mely kulcsszerepet játszik a hemoszíázis fenntartásában (C. T. Esmon; Science, 235:1348-1352 [1987]). 55

A kalciumionoknak (Ca²⁺) a humán C-proteinhez (HPC) való kötődése megváltoztatja a HPC konformációját, ami fluoreszcenciás emissziós spektroszkópiával kimutatható (Johnson és munkatársai: J. Bioi. Chem., 258: 5554-5560 [1983]). A konformációs változás a felületi tőltéselosztás megváltozását eredményezi, ami a fehéqe elektromos térben való elmozdulásának különbözőségével követhető nyomon, például agarőz-gélelektroforézis segítségével (J. Stenflo; J. Bi5 ol. Chem., 251:355-363 [1976J).

A találmány eljárást nyújt a gazdasejt által kiválasztott K-vitamin függő fehéqe tápközegből történő kinyerésére és tisztítására. A gazdasejt lehet a proteint kódoló DNS-sel transzformált vagy transzfektált gaz10 dasejt is. A K-vitamin függő fehéq'ék megkötik a kétértékű kationokat, például a kalcium- vagy bárium-ionokat, ezáltal megváltozik a fehéqe konformációja és a felületi töltése. Ezeket a változásokat használja fel a jelen találmány, ezáltal befolyásolva a fehéq'ék kötődé5 si affinitását különféle szubsztrátokhoz kétértékű kationok jelenlétében. Az eljárás a szokásos kromatográfiás módszert használja a proteinek elválasztására, kihasználva a fehéq'éknek az ionok által megváltozó kötődési affinitását

B A találmány szerint a fehéq'éket tartalmazó íenyészközeget kelátképző anyaggal regaáltatjuk, hogy eltávolítsuk az endogén kétértékű kationokat. A közeget ioncserélő gyantával hozzuk érintkezésbe, melyhez a fehérje erős affinitással kötődik. A fehéq'ét kétértékű kat5 ionokat tartalmazó oldattal eluáljuk a gyantáról. A kationok hozzákötődnek a fehéq’éhez, ami protein/kation komplex formájában eluálódik. A protein/kation komplexet ezt követően olyan gyantával hozzuk össze, amin immobilizált kelátképző van, ez megköti a kationt A kelátképző hordozógyanta jobban köti a kationokat, és a fehéqe egymaga eluálódik a gyantáról. A fehéq'ét egy második ioncserélő gyantával tovább tisztítjuk. A proteint egy második, kationt tartalmazó pufferrel reagáltatjuk, létrehozva a protein/kation komplexet, amit egy hidrofób gyantával hozunk össze. A komplex erősen kötődik a hidrofób gyantához. A proteint megkötött gyantát kelátképzővel kezelhetjük, ami megköti a kationokat és a nagy tisztaságú proteint leoldhaíjuk a hidrofób gyantáról. A protein és a protein/kation komp1 lex kötődése közötti különbséget felhasználva olyan hatékony, a proteint nem denaturáló eljáráshoz jutunk, mely lényegében tiszta, biológiailag aktív proteint szolgáltat minden lépésnél 90% feletti kitermeléssel.

Az 1. ábra a kétértékű kationt megkötő protein tisztí' tási eljárásának folyamatábráját mutatja.

A 2. ábrán a humán C-protein elúciós profilja látható

Pharmacia MonoQ ioncserélő gyantáról, nátrium-klorid gradienssel történő eluálásuál.

A 3. ábra a humán C-protein elúciós profiljátmutatja be; a gyanta ez esetben is a Pharmacia MonoQ ioncserélő gyanta, de az elúció kalcium-klorid gradienssel történik.

A 4. ábrán a humán C-proteín elúciós profilja látható. A gyanta ez esetben Pharmacia Fást Flow Q ioncserélő gyanta, eluáláshoz egyaránt használunk kalciumkloridos puffért és nátrium-kloridos puffért

A HPC és a legtöbb K-vitamin-függő protein megköti a kétértékű kationokat, például a kálcium-kationt (Ca²⁺). Úgy vélik, hogy a fehéqe kötőhelyének többsége a módosított glutaminsav egység (Ohlin és munka2

HU 204 538 Β társai; J. Bioi. Chem. 263: 7411-7417 [1988]). Aglutaminsav-részek gamma-karboxilációval módosulnak. A transzláció utáni módosítást a mikroszóma K-vitamin-függő karboxiláza végzi. A K-vitamin függő proteinek biológiai aktivitásához a gamma-karboxilált glutamátok (Gla-ként jelölt aminosav-csoportok) szükségesek. így ahhoz, hogy a HPC biológiailag aktív legyen (például antitrombotikus aktivitással rendelkezzen), az első kilenc, egymást követő glutaminsavnak a HPC molekulában gamma-karboxilációval módosítottnak kell lennie.

A HPC-nél ezek a Gla csoportok alkotják a kalciumkatinok legtöbb kötőhelyét (N. L. Esmon és munkatársai; J. Bioi. Chem., 258: 5548-5553 [1983]). Nagy affinitású kalcium (Ca²⁺) kötőhely alakul ki a HPC könnyű láncában lévő epidermális növekedési faktorszerű dómén és a HPC nehéz lánca között, amint azt többen leírják (Johnson és munkatársai; J. Bioi. Chem., 258: 5554-5560 [1983]; Ohlin és Stenflo, J. Bioi. Chem., 262: 13 798-13 804 [1987], Steoms és munkatársai, J. Bioi. Chem., 269: 826-832 [1986]). A kalcium-ionok (Ca²⁺) semlegesítik a kilenc Gla csoportot (csoportonként két negatív töltést), ennek következtében megváltozik a HPC fehérje felületi töltéseloszlása. Ez a változás a konformáció megváltozását is okozhatja. A konformáció megváltozása befolyásolja az ioncserés és hidrofób kromatográfiában szokásosan alkalmazott gyantákkal szembeni kötődési profilt Közelebbről, ez a változás azt eredményezi, hogy az ioncserélő kromatográfia szokásos gyantái „pszeudo-affinitású” gyantákként viselkednek.

A találmány szerinti módszer szelektíven képes elválasztani az alacsony specifikus aktivitású fehérjéket a magas specifikus aktivitású fehérjéktől. Ez a szelektivitás a proteinben lévő Gla egységek számától függ. így például, az alacsony specifikus aktivitású proteinek (azaz kevés Gla egységgel rendelkező proteinek) elválaszthatók a magasabb specifikus aktivitású proteinektől (azaz amelyekben a Gla egységek száma több), azon az alapon, hogy a Gla-tartalmú proteineknek magasabb az affinitásuk a gyantához. A több Gla egységet tartalmazó proteinek hangsúlyozottabb konformációs és elektromos töltésbeli változást szenvednek a kétértékű kationokkal, például kalcium-ionnal, való komplexképződés következtében, és ezért a magas aktivitású proteinek könnyebben eluálhatók az oszlopról, ha eluensként kétértékű kationokat tartalmazó puffért használunk. Ez rendkívül szelektív és jól alkalmazható. Sok emlőssejtvonal nem képes biológiailag teljesen aktív, rekombináns K-vitamin-függő fehérjét kifejezni annak következtében, hogy nincs jelen valamennyi Gla egység a fehérjében. A találmány szerinti eljárással a teljesen aktív, K-vitamin-függő proteinek elválaszthatók ugyanezen fehérjék kevésbé aktív formáitól. Az eljárás egyszerű, nem költséges és könnyen beállítható bármelyik biokémiai laboratóriumban.

Az eljárás a szokásos kromatográfiás gyanták (ioncserélő vagy hidrofób) „pszeudo-affinilású” gyantaként való alkalmazásán nyugszik. A kétértékű kationok, különösen a kalcium-ion (Ca²⁺) alacsony koncentrációban való jelenléte vagy hiánya befolyásolja a HPC fehérjének a szokásos kromatográfiás gyantákon tanúsított elúciós profilját Ez a jelenség kiterjeszthető valamennyi K-vitamin-függő proteinre és/vagy pepiidre, potenciálisan valamennyi olyan proteinre, ami a kétértékű kationokat megköti, beleértve a Ca²⁺-kötő proteineket, peptideket vagy makromolekulákat Minthogy fiziológiás körülmények között a leginkább rendelkezésre álló kétértékű fémion a kalcium-ion, a legtöbb alábbi kísérletben ezt használjuk a K-vitamin-függő fehérjékkel való komplexképzésre, de más kétértékű kationt is alkalmazhatunk, így a kalcium-iont stroncium-ionnal (Sr²⁺) vagy bárium-ionnal (Ba²⁺) is helyettesíthetjük. Ezekkel a fémionokkal ugyanazok az eredmények érhetők el.

A jelen eljárás hatékonyan alkalmazható valamennyi K-vitamin-függő fehérje esetében, mint amilyen például a humán C-protein (HPC), a IX. faktor, a X. faktor, Π. faktor, VH. faktor, humán S-protein (HSP), Z-protein, csont-Gla-protein és csontmátrix-protein. A jelen eljárás hatékonyan használható úgy a K-vitamin-függő zimogének, például HPC, mint a szérum proteázok megfelelő aktivált formái, például az aktivált C-protein (APC) esetében.

A találmány egyik megvalósítási formája olyan eljárást nyújt, mely alkalmas heterológ rekombináns proteinek izolálására, tisztítására, reaktiválására, miután azok kifejeződtek a mikroorganizmusban (gazdasejtben) és a sejtből kiválasztódtak a sejtkultúra közegébe. A sejtből kijutó proteineket „kiválasztott proteinekként” említjük. Egy másik megvalósítási formánál az izolálás, tisztítás, reaktiválás és felhasználás olyan „kiválasztott proteinekre” vonatkozik, melyek nem transzformált sejtvonalakban termelődnek.

Amikor a gazdasejtet rekombináns DNS technológiával késztetjük arra, hogy idegen fehérjét termeljen, ezeket a fehéq'éket „heterológ” vagy „rekombináns proteineknek” nevezzük. A találmányban „protein” kifejezéssel illetjük valamennyi olyan polipeptidet és proteint, mely kétértékű kationt köt meg. A „heterológ” és „rekombináns” kifejezést felcserélhetöen használjuk, utalva a gazdasejt által kiválasztott kétértékű kationt kötő proteinre.

A proteint először a jól ismert, általánosan használt rekombináns DNS technikával klónozzuk. A HPC klónozását Beckmann és munkatársai írják le (Nucleic Acid Research, 13: 5233 [1985]). A rekombináns HPC (rHPC) humán vesesejt 293-ban való expresszálását Grinnel és munkatársai írták le (Biotechnology, 5: 1189-1192 [1987]).

A tenyészetet Összegyűjtők és - adott esetben 20 000 g értéken centrifugáljuk 20 percen keresztül hideg szobában (4 °C), hogy eltávolítsuk a sejtüledéket. A felülúszó tartalmazza a fehérjét Centrifugálás után proteázgátlót, például benzimidet és kelátképzőt, például etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) vagy etilénbisz(oxi-etilén-nitrilo)-tetraecetsavat (EGTA) adunk a közeghez olyan koncentrációban, hogy valamennyi kétértékű kationt ezzel megkössük (lásd. 1. ábra, 1-2. lépés).

HU 204538 Β

Ezután az oldatot ioncserélő gyantával, például anionos kvaterner- vagy tercier-amin alapú gyantával hozzuk össze (1. ábra, 3. lépés). Néhány példa az ilyen, kereskedelemből beszerezhető gyantákra: Pharmacia Fást How Q (FFQ) és Mono Q, valamint a Sígmától beszerezhető QAE-A50-I20 és a DEAE tercierikvaterner amin. A találmány egyik változata szerint a gyanta lehet oszlopban, de alkalmazhatunk más gyantaágyat vagy megoldást is, ahol a felülösző átszűrhető a gyantán és a gyanta kellő felületével való érintkezés megoldható, hogy biztosítsuk az íoncserét Ezt a lépést hideg szobában végezzük (8—10 °C).

A gyantát először semleges kémhatású gyantával ekvilibráljuk, mely kis mennyiségű proteázgáílót, kelátképzőt és - adott esetben - egyértékű sót tartalmaz. ' Bármilyen semleges puffért használhatunk, feltéve, hogy nem reagál a kalcium-ionnal; a foszfátpuffer tehát például nem alkalmazható, mert a kalcium-ionnal oldhatatlan komplexet képez. Alkalmas ekvilibrációs puffer például az alábbi összetételű: 200 mM íris-puffer, I 2 mM EDTA, 2 mM benzamidín és 0,5 M nátrium-klorid; a kémhatás pH=7,4. Ezután a tartóedényt (például oszlopot) megtöltjük gyantával. A gyantaágynak kellő térfogatúnak kell lennie, hogy megfelelő mennyiségű proteinkötő helyet nyújtson. A íenyészközeget, melyet 2 előzőleg már profeáz-inhibitorral és kelátképzővel kezeltünk, rávisszük az oszlopra. Úgy állítjuk be az átfolyási sebességet hogy a maximális proteinkötést érjük el. A HPC esetében a lineáris átfolyási sebesség 4080 centiméter óránként 3

A feltöltött oszlopot az oszloptérfogat háromszorosát vagy többszőrösétkitevő semleges puferral (például tris-puffer, pH=7,4) mossuk. A puffer egyértékű sót (nátrium-klorid vagy kálium-klorid), proteázgáílót (például benzamidin) és kelátképzőt (például EDTA) 3· tartalmaz. Adott esetben egy második mosást is alkalmazunk két oszloptérfogatnyi semleges pufferral, ami sót és proteázgáílót tartalmaz. Ennél a lépésnél a kívánt protein erősen kötődik, minthogy erős affinitása van a gyantához. A többi protein nagy része és a tenyészkő- 4( zegben lévő szennyezések kimosódnak. Hogy eltávolítsuk a fehérjét az oszlopról, egy kétértékű kationt, előnyösen kalcium-iont (Ca²⁺) tartalmazó „elúciós” puffért használunk (1. ábra, 4. lépés). A kalcium-ionok hozzákötődnek a fehérjéhez kalcium-protein komple- 4í xet képezve. Ennek a komplexnek már alacsony a gyantához való affinitása, ezért a Ca-protein komplex az eluátumba kerül. Az elúciós puffer semleges puffért (például tris), egyértékű sőt (például nátrium-klorid), kalcium-sót (például kalcium-klorid) és proteázgátlót 5C (például benzamidint) tartalmaz. Előnyös pufferösszetétel: 20 mM tris, 0,15 M nátrium-kloríd, 10 mM kalcium-klorid, 5 mM benzamidin, apH=7,4. Aprotein a második oszloptérfogatnyi eluenssel jön le az oszlopról. Amásodik oszloptérfogatnyi eluens végére leoldó- 55 dik a fehérje 90%-a. A protein 80-90%-a ez után a lépés után visszanyerhető.

A fehérjét tartalmazó eluátumot először egy immobilizált kelátképzőt hordozó gyantán, majd egy második ioncserélő gyantán engedjük át (1. ábra, 5-7. lé- 60 pés). A gyantákat tartalmazó két oszlopot vagy gyantaágyat sorba kötjük, oly módon, hogy a kelátos oszlopról lejövő eluátum közvetlenül az ioncserélő oszlopra jusson. Eljárhatunk ettől eltérően úgy is, hogy a kelátos oszlopról lejövő eluátumot összegyűjtjük, és azután visszük az ioncserélő oszlopra. Az eljáráshoz kereskedelmi forgalomban lévő immobilizált kelátképzőt hordozó gyantát alkalmazhatunk, például immobilizált EDTA-t tartalmazó Chelex 100 gyantát (Biorad). En0 nek a gyantának az a feladata, hogy eltávolítsa a kalciumot a proteinről. Ioncserélő gyantaként alkalmazhatjuk ugyanazt a gyantát, mint az első lépésnél. Ennél a lépésnél mindkét gyantát először alacsony koncentrációban sót tartalmazó neutrális pufferrel (pél5 dául tris-puffer) mossuk. A minta térfogata meghatározza, hogy milyen kapacitású oszlopokat használjunk. 200 ml mintára előnyös 20 ml-es kelátképzős gyantaágyat használni; 0,5-1,0 g fehéqére pedig előnyösen 50 ml ioncserélő gyantát alkalmazunk. Az eluens áramlási sebességét úgy választjuk meg, hogy eltávolítsuk a kalciumot és elérjük a fehérje további tisztítását Ezt a lépést ugyancsak hideg szobában végezzük. Az az előnyős, ha az első lépés eluátuma közvetlenül kerül rá a sorbakötött oszlopokra. A feltöltött kelátkép5 zős oszlopot kétszeres oszloptérfogatnyi (kelátképzős oszlopra számított) semleges kémhatású puffenrel mossuk, mely kis koncentrációban sót tartalmaz. Amint az elúció megtörtént, a kelátképzős oszlopot lekapcsolhatjuk. Ekkor a protein az ioncserélő oszlo1 pon van megkötve. Úgy találtuk, hogy a protein alacsony sókoncentrációnál megkötődik az ioncserélő gyantán, majd magasabb sókonceníráciőval onnan leoldhatő. Ezért, hogy a fehérjét leoldjuk, egy sógradienst tartalmazó puffért alkalmazunk (1. ábra, 8. lépés > és 2. ábra). így például olyan eluenst használunk, ami 0-50%-ban tartalmaz 1M nátrium-kloridot tartalmazó, pH=7,4 kémhatású tris-puffert. Az eluensből húsz oszloptérfogatnyi mennyiséget alkalmazunk. A protein a 27% puffért tartalmazó eluensnél kezd eluálódni, és a ¹ csúcs a 30% puffért tartalmazó eluensnél van. A fehérjét magas sókoncentrációjú (például 0,4-1 M nátriumklorid) pufferrel is leoldhatjuk a gradiens helyett. Az elúciót 280 nm-en mérve spektrofotometriásán követhetjük nyomon (Kisíel ésDavie; Meth. in Enzymology, 80: 320-332 [1981]). A protein ennél a lépésnél több mint 90%-han visszanyerhető.

A fehérjetartalmú eluátumot ezután hidrofób gyantán hozzuk össze, mely a proteint megkötve az eluátumből betőményíti és tisztítja. Hidrofób gyantaként például fenil-superosét használhatunk. A kereskedelmi forgalomból beszerezhető gyanták például a Pharmacia cég fenil-superose HR5/5 és fenil-sepharose CL-4B gyantája. A hidrofób gyantát előzőleg semleges pufferral ekvilibráljuk, ami adott esetben egyértékű sót és kétértékű kationt tartalmaz. Előnyösen használható az alábbi összetételű ekvilibrációs puffén 20 mM tris,

M nátrium-klorid, 10 mM kalcium-klorid (CaClJ, pH=7,4.

Ennél a lépésnél az előző lépés proteint tartalmazó frakcióit tehát kétértékű kationnal reagáltatjuk, azaz

HU 204 538 Β egy olyan pufferral, ami például 10 mM kalcium-kloridot tartalmaz, és ezt az anyagot visszük rá a hidrofób gyantára, amit azután az ekvilibrációs pufferével mosunk (1. ábra, 9-10. lépés). Úgy találtuk, hogy a K-vitamin-függő proteinek gyengén kötődnek hidrofób gyantákhoz, például a fenil-superoséhoz, ha nincs jelen kalcium-kation, de nagy a gyantához való affinitásuk kalcium-kation jelenlétében. Apróiéin ezért leoldható a gyantáról, ha kelátképzőt, például etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) tartalmazó eluenst használunk. Az eluens tehát semleges puffért, alacsony koncentrációban egyértékü sót és kelátképzőt tartalmaz. Egy ilyen puffer előnyös összetétele a következő lehet: 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, és 1 mM EDTA, pH=7,4.

Az ismertetett eljárással kapott fehérje 98% feletti tisztaságú, SDS:PAGE (nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid gélelektroforézis) kromatográfiával meghatározva (Laemmli; Natúré, 227: 680-685 [1974]). A fehéq'e 100%-osan megtartja biológiai aktivitását. A biológiai aktivitást Grinnel és munkatársai (Biotechnology, 5: 1189-1192 [1987]) módszerével határozzuk meg.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa

A HPC fehéq'ét ioncserélő oszlopkromatográfiával az alábbiak szerint választjuk el.

A kísérlethez kvatemer-amin alapú erős anioncserélő gyantát (például Fast-Flow Q vagy Mono Q Phaimacia gyantát) használunk. Kvatemer-amin alapú gyantát bármelyik jó hírű kereskedelmi cégtől beszerezhetünk (például QAE-A50-120 a Sigmától).

A HPC fehéq’e tercier-amin alapú gyantán is megkötődik. Ezekkel a gyantákkal ugyanolyan eredmény érhető el, mint a kvatemer-amin alapú gyantákkal. Ilyen tercier-amin alapú gyanta például a DEAE-sepharose CL-6B (Sigma).

Az eredmények igazolják, hogy a HPC hozzákötődik az anioncserélő gyantákhoz, ha nincs jelen kalcium-kation (Ca²⁺).

A kromatografálás körülményei:

oszlop: Pharmacia Mono Q, HR5/5;

készülék: Pharmacia EPLC LCC-500 rendszer nátrium-klorid gradienshez;

A puffer. 20 mM tris, pH=7,4,0,15 M nátrium-klorid;

B puffer: 20 mM tris, pH=7,4,1 M nátrium-klorid, átfolyási sebesség: 1 ml/perc, nátrium-kloridos gradiens: 0 —► 100% B puffer 20 perc alatt.

Az oszlopot a gyári előírásnak megfelelően kondicionáljuk. Az oszlopot ezután pufferrel ekvilibráljuk (a gyantaágy térfogata 1 ml). 6 mg plazma-HPC fehéq'ét tartalmazó mintát 8,5 ml A pufferben rávisszük az oszlopra, majd három oszloptérfogatnyi A pufferral (3 ml) mossuk az oldatot, mielőtt a nátrium-kloridos gradienst ráengednénk. Amint a 2. ábra mutatja, valamennyi HPC rákötődik a gyantára. A HPC koncentrációját 280 nm-en méq'ük az eluátnmban (Kiesel és Davie,

Meth. in Enzymology, 80: 320-332 [1981]), Úgy találtuk, hogy ha 2 mM kalcium-klorid (CaCl₂) van az A pufferben, a HPC fehéq'e nem kötődik a Mono Q gyantához. 2 mM CaCl₂ jellegzetesen jelen van a sejttenyészet közegében vagy a humán plazmában. A HPC 0,4 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM tris pufferei (pH=7,4) leoldható a Mono Q gyantáról. A HPC eluálásához szükséges nátrium-klorid koncentráció a kémhatástól függ. így például minél kisebb a pH érték, annál magasabb nátrium-klorid koncentrációt, illetve minél magasabb a pH érték, annál alacsonyabb nátrium-klorid koncentrációt igényel az eluálás.

2. példa

HPC elúciója anioncserélő oszlopról alacsony koncentrációjú kalcium-klorid oldattal: a vizsgálatokhoz Pharmacia Mono Q oszlopot használunk, az eljárást az

1. példában leírtak szerint hajtjuk végre.

A kromatografálás körülményei:

oszlop: Pharmacia Mono Q HR5/5;

készülék: Pharmacia EPLC LCC 500;

A puffer: 20 mM tris, pH=7,4,0,15 M nátrium-klorid; B puffer: 20 mM tris, pH=7,4,0,15 M nátrium-klorid, mM kalcium-klorid; átfolyási sebesség: 1 ml/perc; nátrium-klorid gradiens: 0—+ 50% B puffer, 2 perc.

Az oszlopot az A pufferrel ekvilibráljuk. 0,7 ml A pufferben oldva 0,6 mg HPC fehéq'ét viszünk az oszlopra. A HPC fehéq'ét 6-9 mM kalcium-klorid gradienssel eluáljuk, amit 0,15 mM nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM tris-pufferben pH=7,4, alakítunk ki. A 3. ábra mutatja, hogy a növekvő kalcium-klorid-koncentráció eluálja a HPC fehéq'ét

A HPC mennyiségi meghatározását fotometriásan végezzük 280 nm-en mérve (Kiesel és Davies, Meth. in Enzymology, 80: 320-332 [1981]).

3. példa

A kétértékű fémkationok specifitása a HPC anioncserélő oszlopról történő elúciójánál: a vizsgálatokat a

2. példában leírtak szerint végezzük. A HPC izokratikusan eluálható A vagy C pufferben lévő kalcium-klorid-koncentrációkkal.

A puffer. 20 mM tris, ph=7,4,0,15 M nátrium-klorid; C puffer 20 mM tris, pH=7,4.

Az eredményeket az I. táblázatban foglaljuk össze.

7. táblázat

Kétértékű kation	A puffer	C puffer	HPC-hozam
5 mM kalcium-klorid	+	-	80%
10 mM kalcium-klorid	+	-	95%
10 mM kalcium-klorid	-	+	0%
10 mM magnéziumklorid	+		20%

Az oldatok azt mutatják, hogy a kétértékű kalciumkation ionspecifikusan eluálja a HPC fehérjét, minthogy az ugyanolyan koncentrációjú magnézium-klorid (MgCIJ jóval kevésbé hatékony.

HU 204538 Β

Ugyancsak fontos a kalcium-kloridot tartalmazó puffer ionerőssége. A 0,15 M nátrium-klorid hiányában a 10 mM kalcium-klorid hatástalan a HPC Mono Q oszlopról való Ieoldásában.

4. példa

A 10 mM kalcium-klorid szelektivitása a HPC fehéq'e Mono Q oszlopról való leoldásánál:

A vizsgálatokat 2% boqűembrió szérumot (FCS) tartalmazó 3,3 pg/ml rHPC fehérjét expresszálő humán-vesesejt293 (Grinelli és munkatársai, Biotechnology, 5: 1189-1192 [1987]) tenyészközegével végezzük. Anioncserélő oszlopot használva, egy lépésben 240-szeres tisztítást érünk el.

100 ml Pharmacia Fást Plow α (FFQ) gyantát a gyári előiiat szerint megfelelően előkészítünk. Az FFQ gyantát 20 mM tris (pH=7,4), 0,15 M nátrium-klorid, 2 mM EDTA, 2 mM benzamidin összetételű pufferrel ekvilibráljuk. EDTA-t és benzamidint adunk 3,3 liter közeghez, mely 2% boquembrió-szérumot tartalmaz. A végkoncentrációk: 4 mM EDTA és 5 mM benzamidin. Atenyészközeget 3x16 cm-es EFQ oszlopon engedjük át 20 cm/óra lineáris áramlási sebességgel. Az oszlopot a következő oldatokkal mossuk: 300 ml (3-szoros oszloptérfogat) 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 2 mM EDTA, 2 mM benzamidin (pH=7,4), 300 ml (3-szoros oszloptérfogat) 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 2 mM benzamidin (pH=7,4), végül 300 ml 20 mM tris,

0,15 M nátrium-klorid, 2 mM benzamidin, 10 mM kalcium-klorid, pH=7,4. Az oszlopot az alábbi összetételű eluenssel eluáljuk tovább: 20 mM tris, 0,4 M nátrium-klorid, 2 mM benzamidin (pH=7,4). A HPC mennyiségét a 2. példában leírtak szerint határozzuk meg 280 nm-en mérve a fényelnyelést A HPC specifikus aktivitását Grinnel és munkatársai szerint határozzuk meg (Biotechnology, 5: 1189-1192 [1987]) az alábbiak szerint: A HPC-t aktivizáljuk egy immobílizált trombomodulin/trombin komplexszel. (C. T. Es15 montól, Oklahoma Medical Research Foundation). Az aktivált C-protein (ACP) amidolitikus aktivitását az S-2238 tripeptid szubsztrát (Helena) hidrolízálásával méq'ük. A HPC antikoaguláns aktivitását az aktivált részleges tromboplasztín idő (APTT) meghosszabbo20 dásával határozzuk meg, Helénától származó reagenseket használva. A meghatározás és a specifikus aktivitás egységnyi aktivitásának a definíciója Grinnel és munkatársaitól származik. Az eredményeket a 4. ábrán és a H. táblázatban mutatjuk be.

IL táblázat

Minta	Összproteinfmg)	Ossz rHPC (mg)	rHPC tisztaság [HPC] antigén	Fajlagos aktivitás (egység/HPCmg)
kiindulási anyag	4422	10,9	0,25%	0,074
megkőtetlen frakció	4290	0,016	0,0004%	-
10 mM CaClz frakció	16,2	9,4	58%	17,5
0,4 mM NaCl frakció	1152	0,12	0,1%	-

Al eredmények aztmutatják, hogy az rHPC tisztasága a kiindulási anyagnál 0,25%-róI 58%-ra nő (232szeres növekedés). Összehasonlításképpen a „szokásos” 0,4 M nátrium-kloriddal eluálva az rHPC fehéq'ét, az rHPC tisztasága ennél az állapotnál 7% (a teljes növekedés 28-szoros). A jelen eljárás egy további 8,3szoros tisztulást eredményez. ^{5 * *}

5. példa

Apróiéin elűciőja az anioncserélő gyantáról specifikus a fehérje kalcium-kation (Ca²*) kötóképességéie és a K-vitamin-függő fehéq'ékre:

A vizsgálatokhoz két nem Ca²*-kötő és nem K-vitamin-függő proteint használunk. Mindkét protein az 1. példa körülményei között, azaz 20 mM tris és 0,15 M nátrium-klorid (pH=7,4) összetételű közegben hozzákötődik a Pharmacia Mono Q oszlophoz. Az alkalmazott két protein: a glükóz-oxidáz és az amilo-glükozidáz (Aspergillus niger, kat-szám: G21133, illetve A3423; Sigma). Az 1. és 2. példában leírt vizsgálatokat megismételjük erre a két proteinre. Az eredményeket a ül. táblázat mutatja.

III táblázat

Protein	Azelűcióhoz szükséges CaCl₂-koncentráció 20 mM tűs, 0,15 mM NaCl, pH = 7,4 pufferben	Azelűcióhoz szükséges NaCl koncentráció 20 mM tris, pH—7,4 pufferben
glükóz-oxidáz	18 mM	0,30 M
amino-glükozidáz	20 mM felett	0,36 M
HPC	9 mM	0,40 M

HU 204 538 Β

6. példa

A „pszeudo-affinitás” módszer szelektivitása nem protein szennyezések eltávolításánál:

A kísérletekhez rHPC fehérjét termelő humánvesesejt 293 szabályozott körülményi! tenyészet közegét használjuk (Grinnel és munkatársai, Biotechnology, 5: 11891192 [1987]). A tenyészközeg 80 endotoxin (lipo-poliszacharid A) egységet tartalmaz milliliterenként (8 ng endotoxin/ml). Az endotoxinok negatív töltésű, a grammnegatív baktériumok külső burkából származó heterogén lipo-poliszacharid-molekulák. Az eljárást a 4. példában leírtak szerint hajtjuk végre, azzal a különbséggel, hogy az összprotein-koncentráció helyett az endotoxin menynyiségét mérjük. A méréshez egy „Endotoxin assay” készletet (Whittaker Bioproducts) használunk 4xl(P endotoxin egységből kiindulva 5,7xl0⁴ endotoxin egységet nyerünk vissza az rHPC fehérje csúcsában, ha az eluáláshoz 10 mM kalcium-klorid, 20 mM tris, 0,15 M nátriumklorid, pH=7,4 összetételű eluenst használunk. Ez azt jelenti, hogy egy lépéssel eltávolítottuk a kiindulási tenyészközegből az endotoxin 98,5%-át

7. példa

A „pszeudo-affinitás” módszer szelektivitása a szennyező organizmusok eltávolításánál:

A kísérleteket a 6. példában leírtak szerint hajtjuk végre. Az' rHPC fehéq'ét expresszáló humán-vesesejt 293 szabályozott körülményű tenyészközegéhez 5xlO^{8 * 10} phi— X174 fágot (ATCC szám: 13 706) (Shinsheimer I. Mól. Bioi. 1:37-53 [1989]) adunk, majd FFQ oszlopon engedjük át Az rHPC-t tartalmazó kalcium-kloridos eluensfrakcióban csak lxlO⁵ phi-X174 fág található, míg 0,4 M nátrium-kloriddal eluálva 2-3X10⁶ phi-X174 fágot kapunk vissza. Ez azt bizonyítja, hogy a kalcium-kloridos elúció („pszeudo-affinitás” módszere) 20-30-szoros jobb szelektivitást mutat, mint a 0,4 M nátrium-kloridos elúció (a szokásos módszer).

8. példa

Rekombináns humán S-protein (HPS) tisztítása

A) AV12 sejtek által termelt rHPS tisztítása

A HPS egy 11 Gla egységet tartalmazó K-vitamin dependens fehérje. A HPS fehérjét tartalmazó tenyészközeget olyan Szíriái hörcsög AV12 sejtek (ATCC szám: CRL9595,1987. november 24-én letétbe helyezve) mellől nyerjük a kísérleteinkhez, melyeket az EPAO247843 európai szabadalmi bejelentés (1987. február 27-én közreadva) kitanítása szerint az ott leírt pShD plazmiddal a szokásos módon transzformáltunk. Az rHPS fehérjét tartalmazó tenyészközeggel az 1. példában leírt eljárást ismételjük meg. Az rHPS-t a „szokásos” módon (7. példában leírva) eluáljuk a Pharmacia FFQ oszlopról, az alábbi összetételű eluenst használva: 20 mM tris, 0,33 M nátrium-klorid, (pH=7,4). Ezután a 2. példában leírtak szerinti, a kalcium-kloridos elúciós eljárást alkalmaztuk. A „pszeudoaffinitás” módszerével az rHPS sikeresen eluálhatő az FFQ oszlopról az alábbi összetételű eluenssel: 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 3,5 mM kalcium-klorid, pH=7,4.

B) A humán-vesesejt 293-as által termelt nagy specifikus aktivitású rHPS fehérje tisztítása:

Az rHPS a pShD plazmiddal szokásos módon transzformált humán-vesesejt 293 tenyésztésével is megkapható. A sejteket szérummentes közegben tenyésztjük. Az rHPS fehérjét tartalmazó tenyészközeget Pharmacia Fást Flow Q gyantára visszük, majd A pufferral mossuk lényegében az 1. példában leírtak szerint Ezt követi a 2. példában leírtak szerint elvégzett kalcium-kloridos elúció, azzal a különbséggel, hogy az eluens összetétele ez esetben: 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 3,0 mM kalcium-klorid, pH=7,4. Három oszloptérfogatnyi eluátumot gyűjtünk össze, majd az oszlopot az alábbi pufferral eluáljuk: 20 mM tris, pH=7,4, 0,5 M nátrium-klorid. Az eluált rHPS biológiai aktivitását mindkét pufferban megvizsgáljuk Maim és munkatársai (Eur. J. Biochem., 165: 39^45 [1987]) módszerével.

Szérumot nem tartalmazó közegben nőtt AV12 transzformált sejtekből nyert rHPS fehéq'ét (mint a 8/A példában) ugyancsak Pharmacia Fást Flow Q gyantára viszünk. Az AV12-ből származó rHPS fehéq'ét 3,0 mM kalcium-kloriddal eluáljuk, amit 0,5 M nátrium-kloridos eluálás követ, lényegében úgy, ahogy azt fentebb a 293 sejtek által termelt rHPS fehérje esetében már leírtuk. A bioaktivitást Maim és munkatársai módszerével mérjük.

A humán-vesesejt 293 által termelt rHPS fehéq'e 97%-a eluálódik 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 3,0 mM kalcium-klorid, pH=7,4 (kalcium-kloridos frakció) pufferrel, míg az összaktivitás maradék 3 %-a eluálódik a 20 mM tris,, 0,5 M nátrium-klorid, pH=7,4 (nátrium-kloridos frakció) pufferrel. Ezzel szemben az AV12 termelte rHPS esetében az összaktivitás 43%-a eluálódik a kalcium-kloridos frakcióban és 53%-a a nátrium-kloridos frakcióban.

A kalcium-kloridos és a nátrium-kloridos frakciók rHPS fehéq'éjében a 9. példában leírtak szerint meghatározzuk a Gla- és a β-hidroxi-aszpartát tartalmat A két frakció rHPS fehéq'énél nincs különbség a β-hidroxi-aszparíát, a molekulatömeg (redukált és nem redukált SDSPAGE) és az N-teiminális szekvenciát illetően. Különböznek viszont a Gla-tartalomban, amennyiben a nátrium-kloridos frakcióban lévő rHPS molekula 2 Gla egységgel kevesebbet tartalmaz, mint a kalcium-kloridosé. Ezzel magyarázható az AVI 2 sejtek által termelt rHPS fehéq'e alacsonyabb fajlagos aktivitása (kb. 50%-kal alacsonyabb) összehasonlítva a vesesejt 293 által termelt rHPS fehéqével, ami teljes működőképességgel bír.

Ezek a vizsgálatok bizonyítják, hogy az rHPS anioncseiés kromatografálásnál a „pszeudo-affínitási” mód (kalcium-kloridos frakció) szelektíven képes elválasztani az alacsony fajlagos aktivitású rHPS-t (alacsonyabb Gla-tartalom) a magasabb fajlagos aktivitású rHPS-től (magas Gla-tartalom).

9. példa

A magas fajlagos aktivitású rHPC elválasztható az alacsony fajlagos aktivitású rHPC-től:

A humán protrombin protein 10 Gla- egységgel ren7

HU 204538 δ delkezik, ami lényeges a biológiai aktivitása szempontjából (Borowski és munkatársai, J. Bioi. Chem., 260: 9258-9264 [1985]). A humán protrombin természetes variánsai két vagy négy Gla-egységgel kevesebbet tartalmaznak, biológiai aktivitásuk ezért csak 66, illetve 5%-os. Minthogy a 10 Gla- egységből 2 egység hiánya több mint 30%-os aktivitásesést okoz, nyilvánvaló, hogy a teljes aktivitáshoz valamennyi Gla-egység jelenléte szükséges.

A plazma HPC standard aktivitásához viszonyítva az rHPC csak 30-60%-os antikoaguláns aktivitást mutat, ha olyan nyers tenyészközegben mérjük, amelyetp 4-14 plazmiddal transzformált Szíriái hörcsög AV12 sejtek (ATCC CRL9595) mellől nyerünk. A transzformáit sejfeketlényegében a P/43 633 számon nyilvánosságra hozott magyar szabadalmi bejelentés (benyújtva 1987. december 4.) szerint készítjük el. Az aktivitást a

4. példában leírtak szerint mérjük. A tenyészközegből nyert rHPC-t a 4. példában leírtak szerint adszorbeáljuk és eluáljuk.

Akiindulási tenyészközegben lévő rHPC összaktivitás 45%-a eluálődik a 20 mM tiis, 0,15 M nátrium-klorid, 10 mM kalcium-klorid (pH=7,4) pufferrel (kalcium-kloridos frakció) és 20%-a a 20 mM tris, 0,4Mnátrium-kIorfd (pH=7,4) pufferrel (nátrium-kloridos frakció). A rHPC antikoaguláns aktivitása a plazma standard HPC-hez viszonyítva 100, illetve 25%-os a kalcium-kloridos, illetve nátrium-kloridos frakcióban. Kuwanda és Katayama módszerével (Anal. Biochem., 131: 173-179 [1983]) megmérjük a kalcium-kloridos és a nátrium-kloridos frakcióban lévő rHPC Gla és β-hidroxi-aszpartát tartalmát Az aminosav analízise előtti alkalikus hidrolízistminiatíír csapokkal ellátott teflon edényben (Pierce, kát szám: 14005,10130) végezzük. A 2,5n nátrium-hidroxidban lévő fehérjémintát légtelenítjük ésa miniatűr szeIepenkeresztül nitrogéngázzal öblítjük át egy „Waters pícotag” készülék felhasználásával. 110 °C hőmérsékleten hidrolizálunk 20 órán át a hidrolizátumot semlegesítjük, extraháljuk és Kuwada és Katayama módszere szerint oftálaldehid/etán-tiol reagenssel származékot képzűnk. A HPLC analízist az alábbi körülmények között végezzük: oszlop: Nucleosil 5SB (4,6x50) (Macherey-Nagel); izokratikus elúcíó: 20 mM nátrium-cifrát pH=4,30 50%-os acetonitrilben;

áramlási sebesség: 1,5 ml/perc.

Az alábbi elúciós időket kapjuk:
aminosav	elúciós idő
nem savas aminosavak	6,0 perc
Glu	9,5 perc
10 Asp	13,0 perc
arito^-OH-Asp	20,0 perc
treo^-OH-Asp	34,0 perc
Gla	44,0 perc
ciszteinsav	53,0 perc
A kalcium-kloridos frakcióban, illetve	a nátrium-

kloridos frakcióban lévő rHPC molekulánként 9, illetve 6,5 mól Gla aminosavat tartalmaz.

A Gla egységek száma nagyon jő összhangban van más K-vitamin-függő fehérjék irodalmi adatai (Borowski és munkatársai, J. Bioi. Chem., 260:9258-9264 [1985]) alapján várt rHPC biológiai aktivitással. A kalcium-kloridos, illetve nátrium-kloridos frakcióban lévő rHPC között nincs különbség a β-hidroxi-aszpartát tartalmat a molekulatömeget (redukált és nem redukált

SDS-PÁGE) és az N-terminális szekvenciát illetően.

Az N-terminális szekvencia-analízisét az Edman-Iebontáson alapuló automatikus módszerrel végezzük egy Applied Biösystem modell 470A gáz fázisú szekvenátor segítségével, mely on-line összeköttetésben van egy HPLC-rendszerrel (modell 120A) a PTH-aminosavak analízisére.

A vizsgálatok azt mutatják, hogy az anioncserélő oszlopról a „pszeudo-affrnítási” módszer (kalcium-kloridos frakció) szelektíve elválasztva eluálva le az ala5 csony aktivitású rHPC-t (alacsony Gla-tartalom) és a magas aktivitású rHPC-t (magas Gla-tartalom). lO.példa

Az aktivált humán C-protein (APC) elúciója az anΌ ioncserélő oszlopról:

A HPC az aktív szerin-proteáz, az aktivált humán C-protein (AHC) zimogén alakja. A HPC és az APC között az az egyetlen különbség, hogy az APC esetében a HPC nehéz láncának N-teimináíisáből hiányzik 5 egy 12 aminosavból álló peptidszakasz. így tehát a Gla-tartalmat illetően nincs különbség az APC és a

HPC fehérje között.

Az rAPC fehérjét immobilizált trombomodulintrombin komplex segítségével választjuk el az rHPC0 tői, amint azt Grinnel és munkatársai leírják (Biotechnology, 5: 1189-1192 [1987]). Az 1. és 2. példában leírt kísérleti eljárást az rAPC-vel is megismételjük. A Pharmacia Mono Q oszlopon kapott rAPC elúciös profil azonos az rHPC profiljával. A „pszeudo-affinitási” és a „konvencionális” módnál az rAPC leoldásához szükséges kalcium-klorid, illetve nátrium-klorid koncentráció azonos, mint az rHPC eluálásánál.

11. példa

Hidrofób oszlopkromatográfía:

A biokémiai kutatásoknál a három legáltalánosabban használt oszlopkromatográfiás típus: az ioncserélő, a hidrofőb/fordított fázisú és az ion-kizárásos kromatográfia. Az első kettőnél az elválasztás a kérdéses > vegyület felületi töltéseloszlásától függ, míg az ion-kizárásos kromatográfiánál nem. Hidrofób oszlopkromaíográfiát használunk annak szemléltetésére, hogy a „pszeudo-affinitású” K-vítamin dependens fehérjék elválaszthatók az ilyen típusú oszlopon, ha a „pszeudo' affinitás!” módot alkalmazzuk.

A hidrofób oldalláncot szilárd hordozóra rögzítjük, hidrofób gyantát hozva így létre. Ennek szemléltetésére fenilcsoportot alkalmazhatunk, de más, például különböző hosszúságú alifás szénhidrogéneket is felhasználhatunk erre a célra. Két különböző típusú szilárd hordozót használunk, a fenil-superose HR 5/5 és a fenil-sepharose CL-4B Pharmacia gyantákat,

a) oszlop: Pharmacia fenil-superose HR 5/5;

A puffer: 20 mMtris, 2 M nátrium-klorid, pH=7,4;

B puffer: 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, pH=7,4;

HU 204 538 Β

C puffén 20 mM tris, 2 M nátrium-klorid, 10 mM kalcium-klorid, pH=7,4;

D puffén 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 10 mM kalcium-klorid, pH=7,4;

áramlási sebesség: 0,5 ml/perc;

készülék: Pharmacia FPLC LCC500 rendszer.

Az oszlopot a gyári előírásnak megfelelően készítjük el, majd A pufferrel ekvilibráljuk. 1 mg rHPC-t oldunk fel az A pufferben, és így visszük az oszlopra. A protein koncentrációt 280 nm-en mérjük. Az rHPC nem kötődik az oszlophoz. 40 perces 0-+100% B pufferes gradienssel további anyag nem eluálható. Az rHPC-t C pufferben oldjuk, és így visszük az oszlopra. Az A és a C puffer közötti egyetlen különbség, hogy a C puffer 10 mM kalcium-kloridot tartalmaz. 0-+100% D puffer gradienst hozunk létre 40 perc alatt Az rHPC 60%-os D pufferrel/vagy 40%-os C pufferrel. 20 mM tris, 0,9 M nátrium-klorid, 10 mM kalcium-klorid (pH=7,4) összetételű pufferrel eluálódik.

Kimutattuk, hogy az rHPC-nek nagy az affinitása a hidrofób gyantához alacsony koncentrációban jelen lévő kalcium-kation mellett.

b) A kísérleteket megismételjük fenil-sepharose oszlopon:

oszlop: Pharmacia fenil-sepharose CL-4B 0,5-5 cm; áramlási sebesség: 0,5 ml/perc.

Az rHPC fehérje 100%-osan kötődik az oszlopon A pufferben vagy a 20 mM tris, 1 M nátrium-klorid, 10 mM kalcium-klorid (pH=7,4) összetételű pufferben, nem kötődik viszont a 20 mM tris, 1 M nátrium-klorid (pH=7,4) oldatban.

12. példa

A „pszeudo-affinitási” kromatográfia alkalmazása az rHPC sejttenyészet-közegből való tisztítására:

Az alábbiakban egy adott körülmények között elvégzett tisztítási folyamatra adunk meg egy példát

Az eljárás valamennyi lépését viszonylag alacsony hőmérsékleten, 8-10 °C hőfokon végezzük.

1. lépés - anioncserélő Flast Flow Q oszlopon

Az rHPC fehérjét expresszáló humán-vesesejt 293as sejtek szérummentes, szabályozott körülmények között tartott tenyészközegre 5 pg/ml rHPC-t tartalmaz. A szérummentes tenyészközeg inzulin, transzferrin protein/peptid adalékanyagot tartalmaz. Az rHPC a tenyészközegben lévő összfehérjének 10-15%-át teszi ki. A Pharmacia Fást Flow Q gyantát (FFQ) IN sósavval és IN nátrium-hidroxiddal tisztítjuk a gyári előírást követve. A gyantát 10x20 cm méretű oszlopba töltjük. 500 liter tenyészközegre 1 liter FFQ gyantát számolunk. A megtöltött oszlopban a 20 mM tris, 1 M nátrium-klorid (pH=7,4) puffer áramlási sebessége 120 cm/óra. A gyantát 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 2 mM EDTA és 2 mM benzamidin (pH=7,4) öszetételű pufferral ekvilibráljuk.

Az rHPC fehérjét tartalmazó tenyészközeghez annyi 0,2M EDTA (pH=7,4) és 1 M benzamidin oldatot adunk, hogy a végső koncentrációjuk 4 mM, illetve 5 mM legyen. A tenyészközeget ezután 80 cm/óra áramlási sebességgel rávisszük az FFQ oszlopra.

Az FFQ oszlopot legkevesebb 3 oszloptérfogatnyi 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 2 mM EDTA, 5 mM benzamidin (pH=7,4) oldattal mossuk. A mosást legkevesebb 3 oszloptérfogatnyi 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 5 mM benzamidin (pH=7,4) oldattal mossuk tovább. Az rHPC eluálásához használt oldat összetétele: 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid, 10 mM kalcium-klorid, 5 mM benzamidin: pH=7,4; az áramlási sebesség: 5 cm/óra. Az rHPC-t Bradford peotein-reagenssel (M. Bradford, Anal. Biochem, 72: 248-254, [1987]) vagy ELISA vizsgálattal detektáljuk. (Grinnel és munkatársai, Biotechnology, 5: 1189-1192 [1987]). Az említett eluenst használva az rHPC a második oszloptérfogat elején eluálódik. Fél oszloptérfogatnyi eluátumban az rHPC 90%-a leoldódik.

2. lépés: Chelex 100 oszlop Fást Low Q oszloppal sorbakapcsolva

Az rHPC mellől (1. lépés) a kalcium-kationt a Chelex 100 oszloppal (Bio-rad) távolítjuk el. Az FFQ oszlopon a kromatografálást ennél a lépésnél hagyományos módon végezzük. 300 ml Chelex 100 gyantát az alábbi sorrendben mosunk: 1 n nátrium-hidroxid/vrz/1 n sósav/víz; amint azt a gyári előírás ajánlja. A gyantát 3,2x40 cm méretű oszlopba töltjük, és 1 M tris oldattal, pH=7,4 mossuk. Az oszlop ekvilibrálásához az alábbi öszzetételű puffért használjuk: 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid (pH=7,4). Az 1 M írisszel való mosás azért szükséges, hogy gyorsan eléqük a ChelexlOO gyanta pH=7,4 értékre való kiegyenlítődését. A 3,2x25 cm méretű FFQ oszlopot az 1. lépésben leírtak szerint tisztítjuk, és 20 mM tris, 0,15 M nátrium-klorid (pH=7,4) oldattal ekvilibráljuk. A Chelex 100 oszlopot az FFQ oszlop fölé helyezzük, hogy az rHPC-t tartalmazó, az 1. lépésből származó eluátum elsőként a Chelex 100, majd az FFQ oszlopon jusson át.

Miután az 1. lépésből származó valamennyi rHPC fehérjét felvisszük az oszlopra, 1,5 liter ekvilibrációs pufferral mossuk, majd a Chelex 100 oszlopot lekapcsoljuk az FFQ oszlopról.

Az FFQ oszlopot tovább mossuk 600 ml ekvilibráló pufferral, majd 600 ml 20 mM tris, 0,25M nátrium-klorid (pH=7,4) pufferral. Ekkor még nem eluálódik rHPC. Az rHPC a magasabb sókoncentrációjú, 20 mM tris, 0,4 M nátrium-klorid (pH=7,4) pufferrel eluálódik az FFQ oszlopról. Az rHPC detektálását 280 nm-en végezzük. Az rHPC kitermelése ennél a lépésnél 9095%.

3. lépés: hidrofób fenil-sepharose gyantán.

3,2x40 cm méretű oszlopot fenil-sepharose CL-4B (Pharmacia) gyantával töltünk meg és 3 oszloptérfogatnyi, alábbi sorrendben mossuk: 50% metanol/víz/1% ecetsav/víz/0,1 M nátrium-hidroxid/víz; az átfolyási sebesség: 20 cm/óra.

Az oszlopot 20 mM tris, 1 M nátrium-klorid, 10 mM kalcium-klorid (pH=7,4) összetételű ekvilibrációs pufferral kiegyenlítjük. A 2. lépésből származó rHPC oldatot 20 mM tris, 2 M nátrium-klorid, 20 mM kalciumklorid (pH=7,4) összetételű oldattal 1:1 arányban hígítjuk és az oszlopra visszük.

HU 204538 Β

Az oszlopot tovább mossuk 1 liter ekviíibrációs pufferrel. Az rHPC fehérjét 20 mM tris, 0,15 M nátriumklorid, 1 mM EDTA (pH=7,4) oldattal eluáljuk.

Ennél a lépésnél az rHPC-visszanyerés kb. 85%-os. Az SPS-PAGE vizsgálatok (Laemmli, Natúré, 227: 680-685 [1974]), vagy a 4. példában leírtak szerint végzett fajlagos aktivitás meghatározás szerint a tisztasága 98% felett van. Ez után a lépés után az endotoxin koncentrációja egytizedére csökkent

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás a kétértékű kationokat kötő fehérjék kinyerésére és tisztítására az említett fehéq'éket termelő sejtek tenyészközegéból, illetve szennyezések eltávolítására a mintákból, azzal jellemezve, hogy

a) a tenyészközegból a kétértékű kationokat eltávolítjuk;

b) az így kapott tenyészközeget fehéq'ekötő ioncserélő gyantával hozzuk érintkezésbe;

c) a gyantán megkötött fehérjét valamely kétértékű kationnal reagáltatjuk;

d) a kation/fehéq'e komplexből a kationt eltávolítjuk, és

e) a szabad, biológiailag aktív fehéqét kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás fehéqe kinyerésére rekombináns fehéq'éket termelő transzformáit sejtek tenyészközegéból, azzal jellemezve, hogy az L igénypont a)-e) lépéseit rekombináns fehéq'éket termelő transzformált sejtek tenyészközegéból kiindulva végezzük el.
3. Az I. vagy 2. igénypont szerinti eljárás nem fehéqe jellegű szennyezések eltávolítására, azzal jellemezve, hogy az I. igénypont a)-d) lépéseinek elvégzése után az e) lépésben nemfehéq'e jellegű szennyezésektől mentes fehéq'ét nyerünk ki.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás a vírusszennyezések eltávolítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont a)-d) lépéseinek elvégzése után az e) lépésben vímsszennyezésektől mentes fehéq'ét nyerünk ki.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás K-vitamin-fÜggő fehéqe kinyerésére és tisztítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti a) lépésben a megfelelő fehéq'ét tartalmazó tenyészközegból · indulunkki.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás aktivált humán C-protein, humán C-protein zimogén vagy humán Sprotein kinyerésére és tisztítására, azzaljellemezve, hogy az a) lépésben a megfelelő fehéq'ét tartalmazó £ tenyészközegból indulunk ki.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésnél a kétértékű kationokat a tenyészközegből kelátképző anyagok hozzáadásával távolítjuk el. £
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben kétértékű kationként kalcium.-, bárium- vagy stroncium-ionnal reagáltatunk.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben a (enyészközeget fehéq'ekötő ion- £ cserélő gyantaként egy anionos, amin-alapú ioncserélő gyantával reagáltatjuk.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a d) lépésnél a kation/fehéq'e komplexből a kationtkelátképző reagens hozzáadásával távolíq'uk el.
11. Eljárás kétértékű kationokat kötő fehéq'ék tisztítására az említett fehéq'éket termelő sejtek íenyészközegéből, azzal jellemezve, hogy

a) a fehéq'ét tartalmazó tenyészközeget valamely kelát10 képzővel reagáltatjuk,

b) az így kapott keveréket ioncserélő anyaggal hozzuk érintkezésbe,

c) az így kapott, ioncserélőn megkötött fehéq'ét kétértékű kationokkal reagáltatjuk,

15 d) az így kapott kation/fehéq'e komplexet valamely kelátképzővel reagáltatjuk,

e) az így kapott fehéq'ét valamely második ioncserélő anyaggal hozzuk érintkezésbe,

f) az így kapott, ioncserélőn megkötött fehéq'ét vala20 mely egyértékű sóval hozzuk érintkezésbe,

g) az így kapott fehéqét valamely kétértékű kationnal hozzuk érintkezésbe,

h) az így kapott kation/fehéq'e komplexet hidrofób anyaggal hozzuk érintkezésbe,

25 i) az így kapott, a kation/fehéq'e komplexet megkötve tartó hidrofób anyagot kelátképzővel reagáltatjuk, j) az így kapott, a hidrofób anyagról levált fehéq'ét kinyeq'ük.
12. A11 igénypont szerinti eljárás fehéqe kinyerésé30 re rekombináns kétértékű kationokat kötő fehéq'éket termelő transzformált sejtek tenyészközegéból, azzal jellemezve, hogy a 11. igénypont a)-j) lépéseit rekombináns fehéq'éket termelő transzformált sejtek íenyészközegéből kiindulva végezzük el.

35
13. AII. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 11. igénypont szerinti c) lépésben kétértékű kationként kalcium-, bárium- vagy stroncium-ionnal reagáltatunk.
14. All. vagy 12. igénypont szerinti eljárás K-vita40 min-függő fehéqe tisztítására, azzal jellemezve, hogy a

11. igénypont szerinti a) lépésben a megfelelő fehéq'ét tartalmazó tenyészközegból indulunkki.
15. A 13. igénypont szerinti eljárás aktíváit humán C-protein, humán C-protein zimogén vagy humán Sprotein tisztítására, azzal jellemezve, hogy a 11. igénypont szerinti a) lépésben a megfelelő fehéq'ét tartalmazó tenyészközegból indulunk ki.
16. A11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben kelátképzőként a fehérjét etilén-diamin-tetraecetsavval reagáltatjuk.
17. A 11. vagy 12 igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben ioncserélő anyagként a keveréket anionos amin-alapú ioncserélő gyantával hozzuk érintkezésbe.
18. A17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ioncserélő gyantát oszlopba töltve alkalmazzuk.
19. All. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kation/fehéq'e komplexet kelátképző etilén-diamin-íeíraecetsavval reagáltatunk.

HU 204 538 Β
20. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az e) lépésben a fehéq'ét, második ioncserélő anyagként, anionos amin-alapú ioncserélő gyantával hozunk érintkezésbe.
21. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az f) lépésben a fehéq'ét, egyértékű sóként, 0,4-1,0 M koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal hozzuk érintkezésbe.
22. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a h) lépésben a kation/fehéq'e komplexet, hidrofób anyagként fenil-szuperóz vagy fenilszefaróz gyantával hozzuk érintkezésbe.
23. Eljárás a nagy fajlagos aktivitású, kétértékű kalciumot kötő fehéq'éknek a kis fajlagos aktivitású, kétértékű kalciumot kötő fehéq'éktől történő elválasztására kétértékű kalciumot kötő fehéq'ét termelő sejtek tenyészközegéből, azza l jellemezve, hogy

a) a fehéq'éket tartalmazó tenyészközeget etilén-diamin-tetraecetsavval reagáltatjuk,

b) az így kapott keveréket ioncserélő gyantával hozzuk érintkezésbe,

c) az így kapott fehéq'ét kötő ioncserélő gyantát kalcium-ionokkal reagáltatjuk,

d) az így kapott kalcium/fehéq'e komplexet immobilizált etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó gyantával hozzuk érintkezésbe,

e) az így kapott fehéq'ét egy második ioncserélő gyantával hozzuk érintkezésbe,

f) az így kapott, a fehéq'ét kötő gyantát valamely egyértékű só oldatával hozzuk érintkezésbe,

g) az így kapott fehéq'ét kalcium-ionnal reagáltatjuk,

h) az így kapott kalcium/fehéq'e komplexet hidrofób anyaggal hozzuk érintkezésbe,

i) az így kapott, kalcium/fehéq'e komplexet megkötve tartó, hidrofób anyagot etilén-diamin-tetraecetsavval reagáltatjuk.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás kétértékű kalciumot kötő fehéq'ék elválasztására rekombináns kétértékű kalciumot kötő fehéq'éket termelő transzformált sejtek tenyészközegéből, azzal jellemezve, hogy a 23. igénypont a)—j) lépéseit rekombináns fehéq'éket termelő transzformált sejtek tenyészközegéből kiindulva végezzük el.
25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás K-vitamin-függő fehéq'ék elválasztására, azzal jellemezve, hogy a 23. igénypont szerinti a) lépésben a megfelelő fehéq'ét tartalmazó tenyészközegből indulunk ki.
26. A 25. igénypont szerinti eljárás aktivált humán C-protein, humán C-protein zimogén vagy humán Sprotein elválasztására, azzal jellemezve, hogy a 23. igénypont szerinti a) lépésben a megfelelő fehéq'ét tartalmazó tenyészközegből indulunk ki.
27. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben a keveréket ioncserélő gyantával hozzuk érintkezésbe.
28. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a h) lépésben a kalcium/fehéq'e komplexet, hidrofób gyantaként, fenil-szuperóz vagy fenil-szefaróz gyantával hozzuk érintkezésbe.
29. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az f) lépésben a fehéq'e/gyanta komplexet, egyértékű sóként, 0,4-1,0 M koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal hozzuk érintkezésbe.