KR20140057348A - 응고 인자를 처리하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 예를 들어, 프로트롬빈(인자 II)을 포함한 재조합 응고 인자 단백질의 정제 방법에 관한 것이다. 실시양태들에서, 상기 방법은 증가된 생물활성과 감소된 트롬빈 수준을 나타내어 프로트롬빈의 안전성이 증가된, 정제된 프로트롬빈을 제공한다. 정제된 재조합 응고 인자 단백질이 또한 제공된다.

Description

응고 인자를 처리하는 방법{METHODS FOR PROCESSING COAGULATION FACTORS}
본 출원은 예를 들어, 프로트롬빈(인자 II)을 포함한 재조합 응고 인자 단백질의 정제 방법에 관한 것이다. 실시양태들에서, 상기 방법은 증가된 생물활성과 감소된 트롬빈 수준을 나타내어 프로트롬빈의 안전성이 증가된, 정제된 프로트롬빈을 제공한다. 정제된 재조합 응고 인자 단백질이 또한 제공된다.
치료 용도를 위한 (예를 들어, 혈우병 및 기타 혈액 장애의 치료를 위한) 응고 인자는 비록 정제가 복잡할 수 있지만 인간 혈장으로부터 얻어질 수 있다. 심지어 혈액-유래 단백질 생성물의 값비싼 안전 대책 및 시험과 함께, 감염성 바이러스 또는 프리온에 의한 오염이 배제될 수 없다. 따라서, 동물 유래 성분들 없이 배지에서 생장한 재조합 세포로부터 인간 치료용 단백질을 생성하는 것이 매우 바람직하다. 이는, 다수의 단백질이 완전히 기능적인 형태로 생성되기 위해, 즉 정확하게 번역후 변형이 되기 위해 포유동물 숙주를 요구함에 따라 늘 간단하지만은 않다.
인자 II(프로트롬빈)는 혈액 응고에 필요한 응고 인자이다. 외부 (또는 조직 인자) 혈액 응고 경로에서, 조직 인자는 프로트롬빈이 인자 Xa, 인자 Va, 인지질, 및 Ca2 + 이온의 존재하에 활성화된 형태인 인자 IIa(트롬빈)가 되는 응고 캐스케이드를 촉발시킨다. 트롬빈은 복수 경로를 통해 피브리노겐을 피브린 혈전(fibrin clots)으로 전환시키고 다른 응고촉진(pro-coagulation) 경로에 참여함으로써 출혈을 멈추는 작용을 한다.
재조합 프로트롬빈 단백질의 제조 및 정제 동안, 트롬빈은 생성물-관련 불순물로서 존재할 수 있다. 자유(free) 트롬빈의 수준은 일반적으로 생성물 안전성을 증가시키기 위해 낮은 수준으로 유지되어야 한다. 부가적으로, 재조합 프로트롬빈은 N-말단 도메인에 10개의 감마-카르복시글루탐산 "Gla-잔기"를 함유한다. 이들 잔기는 Ca2 + 이온을 킬레이팅하는 것으로 생각되며, 이는 트롬빈으로의 프로트롬빈 활성화의 선결 조건인 인지질 막으로의 상기 단백질의 결합을 매개한다.
본 발명자는 높은 수준의 γ-카르복실화 글루탐산 잔기 및 낮은 트롬빈 오염을 갖는 재조합 정제된 프로트롬빈을 제공하는 정제 방법에 대한 요구를 확인하였다.
바람직한 실시양태의 요약
본 출원은 앞서 확인한 요구를 충족하는 응고 단백질의 정제 방법을 제공한다.
실시양태들에서, 재조합 응고 인자 단백질을 정제하는 방법이 제공된다. 이 방법은 적당하게는 재조합 응고 인자 단백질을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계를 포함한다. 혼합물은 적어도 제1 컬럼을 통해 여과되어 제1 컬럼 생성물을 생성한다. 제1 컬럼 생성물은 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 여과되어 PEI 컬럼 생성물을 생성하고, 정제된 재조합 응고 인자 단백질이 회수된다. 적절하게는, 정제된 재조합 응고 인자 단백질은 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손(부재)(missing γ-carboxylated) 글루탐산 부위를 포함한다. 실시양태들에서, 재조합 응고 인자 단백질은 프로트롬빈(인자 II)이다.
적절하게는, 혼합물은 생물반응기로부터의 여과된 혼합물이다. 예시적인 실시양태들에서, 혼합물의 여과는 제1 음이온 교환 컬럼을 통한 여과, 적절하게는 결합 및 용출 여과를 포함한다. 실시양태들에서, 제1 컬럼 생성물은 제2 음이온 교환 컬럼을 통해 여과될 수 있으며, 적절하게는 흐름통과(flowthrough) 여과될 수 있다.
실시양태들에서, 제1 컬럼은 폴리(에틸렌이민) 컬럼을 통한 여과 이전에 용매/세제 불활성화에 의해 불활성화된 생성물이다. 실시양태들에서, 폴리(에틸렌이민) 컬럼을 통한 여과는 결합 및 용출 여과이다. 적절하게는, PEI 컬럼 생성물이 예를 들어 결합 및 용출 여과에서 소수성 상호작용 컬럼(HIC)을 통해 여과된다. 실시양태들에서, 상기 방법은 회수 이전에 나노여과를 포함할 수 있다.
적당한 실시양태들에서, 재조합 프로트롬빈 단백질은 실질적으로 트롬빈이 없고, 약 0.8/10, 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함한다.
추가 실시양태들에서는, 재조합 응고 인자 단백질(예를 들어, 프로트롬빈(인자 II))을 정제하는 방법이 제공된다. 이 방법은 적절하게는 재조합 응고 인자 단백질을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계 및 혼합물을 적어도 제1 음이온 교환 컬럼을 통해 여과(예를 들어, 결합 및 용출 여과)하여 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성하는 단계를 포함한다. 제1 음이온 교환 컬럼 생성물은 용매/세제 바이러스 불활성화로 불활성화되어 불활성화된 혼합물을 생성한다. 적절하게는, 불활성화된 혼합물은 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 여과(예를 들어, 결합 및 용출 여과)되어 PEI 컬럼 생성물을 생성하고, PEI 컬럼 생성물은 소수성 상호작용 컬럼(HIC)을 통해 여과되어 HIC 생성물을 생성한다. 실시양태들에서, HIC 생성물은 이후 여과되고(예를 들어, 나노여과) 정제된 재조합 응고 인자 단백질이 회수된다. 실시양태들에서, 정제된 재조합 응고 인자 단백질은 약 0.8/10, 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함한다. 특정 실시양태들에서, PEI 컬럼을 통한 여과 이전에, 제1 음이온 교환 컬럼 생성물은 제2 음이온 교환 컬럼을 통해 여과(예를 들어, 흐름통과 여과)되어 제2 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성한다. 제2 음이온 교환 컬럼 생성물은 이후 PEI 컬럼을 통해 여과되어 PEI 컬럼 생성물을 생성한다.
적절하게는, 재조합 프로트롬빈 단백질은 실질적으로 트롬빈이 없고, 적절하게는 약 0.8/10, 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함한다.
추가 실시양태들에서는, 재조합 프로트롬빈(인자 II) 단백질을 정제하는 방법이 제공된다. 이 방법은 적절하게는 재조합 프로트롬빈 단백질을 포함하는 생물반응기로부터의 여과된 혼합물을 제공하는 단계, 혼합물을 제1 음이온 교환 컬럼을 통해 결합 및 용출 여과하여 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성하는 단계, 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 제2 음이온 교환 컬럼을 통해 흐름통과 여과하여 제2 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성하는 단계, 제2 음이온 교환 컬럼 생성물을 용매/세제 바이러스 불활성화로 불활성화시켜 불활성화된 혼합물을 생성하는 단계, 불활성화된 혼합물을 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 결합 및 용출 여과하여 PEI 컬럼 생성물을 생성하는 단계, PEI 컬럼 생성물을 소수성 상호작용 컬럼(HIC)을 통해 결합 및 용출 여과하여 HIC 생성물을 생성하는 단계, HIC 생성물을 나노여과하는 단계 및 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
적절하게는, 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질(인자 II)은 약 0.8/10, 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하고 실질적으로 트롬빈이 없다.
추가 실시양태들에서는, 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질(인자 II)이 제공된다. 적절하게는, 상기 단백질은 약 0.8/10, 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하고 실질적으로 트롬빈이 없다.
실시양태들에서, 정제된 재조합 프로트롬빈은 응고 분석에서 약 70%를 초과하는 생물활성(bioactivity)을 나타내고/내거나 보정된 자동화 트롬보그램(calibrated automated thrombogram; CAT) 분석에서 약 70%를 초과하는 생물활성을 나타낸다. 적절하게는, 상기 단백질은 약 2 ng/ml 미만의 트롬빈을 포함한다.
추가 실시양태들, 이들 실시양태들의 특성 및 이점뿐만 아니라 다양한 실시양태들의 구성 및 작용이 첨부 도면을 참조하여 이하 상세히 기재된다.
도 1은 본원에 개시된 정제의 예시적인 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 2는 프로트롬빈의 도메인 구성에 관한 것으로, N-말단 Gla-도메인에서 10개의 γ-카르복실화 글루탐산(Gla) 잔기를 도시한다.
도 3은 재조합 프로트롬빈의 응고(Clot) 및 CAT 생물검정에서 상대 활성도(relative potency)(시험관내 생물활성)에 대한 번역후 카르복실화의 정도를 도시한다.
도 4는 폴리(PEI) 컬럼을 사용한 여과의 함수에 따른 CAT 생물검정의 결과를 도시한다.
도 5a 및 5b는 재조합 인자 II의 단편 K1(5a) 및 K2(5b)에서 글루탐산(Gla)의 γ-카르복실화를 도시한다.
도 6은 재조합 인자 II의 단편 K13(N373)의 글리코프로파일(glycoprofile)을 도시한다.
본원에 도시되고 기재된 특정 구현들은 예시적인 것이고 어떠한 형태로든 본 출원의 범위를 제약하는 의도로 해석되지 않아야 한다.
본원에서 언급된 공개된 특허, 특허 출원, 웹사이트, 회사명, 및 과학 문헌은 각각이 구체적으로 개별적으로 참고적으로 인용되는 것으로 나타낸 바와 동일한 정도로 그 전문이 참고적으로 인용된다. 본원에서 인용된 임의 참고문헌과 본 명세서의 구체적 교시 간에 있는 충돌은 후자를 우선으로 하여 해결될 것이다. 게다가, 단어 또는 문구의 업계에서 이해되는 정의와 본 명세서에서 구체적으로 교시된 단어 또는 문구의 정의 간의 충돌은 후자를 우선으로 하여 해결될 것이다.
본 명세서에서 사용된 단수적 형태 "하나(a), (an)" 및 "그(the)"는 달리 명확하게 언급하지 않은 한 이들이 지칭하는 용어의 복수 형태를 포함하는 것으로 한다. 용어 "약"은 본원에서 대략적으로, ~의 영역에서, 대강, 또는 대략을 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되면, 이는 정해진 수치값의 위와 아래의 경계부까지 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치값을 본원에서 언급된 값의 위와 아래 20% 변이(variance) 만큼 변경하는 의도로 사용된다.
본원에서 사용된 기술 및 학술 용어는 달리 정의하지 않은 한 본 출원이 속한 업계의 숙련인에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 업계의 숙련인에게 공지된 다양한 방법 및 재료들이 본원에서 참조될 수 있다. 재조합 DNA 기술의 일반적인 원리를 기술하고 있는 표준 참고문헌들은 문헌[Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]; 문헌[Kaufman et al., Eds., "Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine," CRC Press, Boca Raton (1995)]; 및 문헌[McPherson, Ed., "Directed Mutagenesis: A Practical Approach," IRL Press, Oxford (1991)]을 포함하며, 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참고적으로 인용된다.
실시양태들에서, 재조합 응고 인자 단백질을 정제하는 방법이 제공된다. 적당한 실시양태들에서, 상기 방법은 재조합 응고 인자 단백질을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계를 포함한다. 혼합물은 적어도 제1 컬럼을 통해 여과되어 제1 컬럼 생성물을 생성한다. 제1 컬럼 생성물은 이후 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 여과되어 PEI 컬럼 생성물을 생성한다. 정제된 재조합 응고 인자 단백질은 이후 PEI 컬럼 생성물로부터 회수된다.
예시적인 실시양태들에서, 정제된 재조합 응고 인자 단백질은 인간 프로트롬빈(인자 II)이다. 용어 "프로트롬빈", "인자 II", "재조합 프로트롬빈" 및 "재조합 인자 II"는 명세서 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다. 다른 재조합 응고 인자 단백질들이 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제될 수 있고 예를 들어, 인자 VI 및 인자 IX를 포함한다.
본원에서 사용된 "재조합 응고 인자 단백질(들)"은 원핵생물 및 진핵생물 발현 시스템 둘다를 포함한 임의의 적합한 발현 시스템을 사용하거나 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성된 응고 인자 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다(예를 들어, 문헌[참조: Dower et al., WO 91/17271] 및 문헌[참조: McCafferty et al., WO 92/01047]; 및 미국특허 제5,969,108호 참조, 그 전문이 본원에서 참고적으로 인용됨). 용어 "단백질" 및 "단백질들"은 명세서 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용되는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 바람직하게는, α-아미노산, D-, L-아미노산, 및 이의 조합의 정해진 순서의 연결에 의해 형성된 중합체를 지칭한다. 일 아미노산 잔기와 다음 아미노산 잔기 간의 연결은 아마이드 결합 또는 펩티드 결합으로서 지칭된다. 단백질은 복수의 폴리펩티드 서브유닛을 가진 폴리펩티드 분자이다. 구별하자면 펩티드는 일반적으로 짧고 폴리펩티드/단백질은 일반적으로 보다 긴 아미노산 쇄이다. 용어 "단백질"은 저분자량 폴리펩티드 뿐만 아니라, 당단백질 및 지단백질과 같은 유도체화된 분자를 포함하는 것으로 의도된다. "아미노산 서열" 및 유사 용어, 예컨대 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 지적된 아미노산 서열을 언급된 단백질 분자와 관련된 완전한, 네이티브 아미노산 서열에 한정하고자 하는 의도가 아니다.
다양한 숙주 세포, 예컨대 박테리아, 식물, 효모, 곤충 및 포유동물 세포를 사용하여 재조합 응고 인자 단백질을 제조하는 방법은 익히 알려져 있다. 예를 들어, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) (이. 콜라이(E. coli)), 다른 박테리아 숙주, 효모, 및 다양한 고등 진핵 세포 예컨대, COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 이용한 단백질의 발현을 위해 다수의 발현 시스템이 활용가능하다.
간단히 설명하면, 원하는 응고 인자 단백질(들)을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은, 일반적으로 DNA 또는 cDNA를 (항시성 또는 유도성) 프로모터에 작동가능하게 연결한 다음 발현 카세트로의 도입에 의해 달성된다. 이러한 카세트는 원핵 또는 진핵 세포주에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 발현 카세트는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 단백질을 코딩하는 DNA의 발현의 조절을 위해 유용한 프로모터를 함유한다. 클로닝된 유전자의 고 수준 발현을 달성하기 위해, 최소한, 전사를 지시하는 강한 프로모터, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 및 전사/번역 종결자를 함유한 발현 카세트를 구축하는 것이 바람직하다. 이. 콜라이의 경우, 이는 프로모터 예컨대, T7, trp, lac, 또는 람다 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 신호를 포함한다. 진핵 세포의 경우, 제어 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스에서 유래한 인핸서 및 프로모터, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있고, 스플라이스 공여체 및 수용체 서열을 포함할 수 있다. 카세트는 익히 알려진 방법 예컨대, 염화칼슘 형질전환 또는 전기천공(이. 콜라이의 경우) 및 인산칼슘 처리, 또는 전기천공 또는 리포펙션(포유동물 세포의 경우)에 의해 선택된 숙주 세포 중으로 전달될 수 있다. 카세트에 의해 형질전환된 세포는 카세트에 함유된 유전자, 예컨대, amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여된 항생제에 대한 내성에 의해 선별될 수 있다.
실시양태들에서, 재조합 응고 인자 단백질은 예를 들어, 미국특허 제7,842,477호 및 제7,989,193호에서와 같이 제조된 인간 프로트롬빈(인자 II)이며, 상기 문헌의 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참고적으로 인용된다. 미국특허 제7,842,477호 및 제7,989,193호는 재조합 프로트롬빈의 제조에 유용한 핵산 서열, 플라스미드 및 숙주 세포를 개시하고 있다.
예시적인 정제 방법이 도 1에 도시되어 있으며 추가의 상세한 설명이 본원에서 제공된다.
명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "정제하다", "정제" 또는 "정제된"은 원하는 단백질 또는 단백질들에서 다른 단백질, 생성물 또는 구조체가 적어도 약 75%가 없거나, 다른 단백질, 생성물 또는 구조체가 적어도 약 80%가 없거나, 다른 단백질, 생성물 또는 구조체가 적어도 약 90%가 없거나, 더욱 적절하게는 다른 단백질, 생성물 또는 구조체가 적어도 약 95%가 없거나, 가장 적절하게는 다른 단백질, 생성물 또는 구조체가 적어도 약 98%가 없도록, 원하는 재조합 단백질 또는 단백질들을 다른 단백질 또는 원치않은 생성물 또는 구조체로부터 제거 (또는 원치않은 생성물 또는 구조체를 원하는 단백질로부터 제거)하는 방법을 지칭하기 위해 사용된다.
명세서 전반에 걸쳐 기재된 정제 방법은 적절하게는 최종의 원하는 재조합 단백질 또는 단백질들로부터 구조체 예컨대, 원치않은 숙주 세포 단백질(HCP) 및 다른 구조체(예를 들어, DNA, RNA)뿐만 아니라, 재조합 응고 인자 단백질의 원치않은, 바람직하지 않은, 또는 최적이 아닌 형태를 제거한다.
본원에서 사용된 용어 "여과"는 재조합 단백질(들)을 포함한 혼합물을 여과 매질과의 접촉하에 두어 용액 또는 혼합물 중의 바람직하지 않은 또는 원치않은 성분들을 여과 매질에 의해 제거하는 것을 의미하도록 사용된다. 재조합 단백질을 포함하는 "혼합물"은 종종, 완충제 또는 다른 액체 매질에서 다양한 HCP, 핵산, 단백질의 재조합 형태, 등을 포함한 다른 단백질을 포함할 수 있다.
실시양태들에서, 재조합 응고 인자 단백질의 혼합물은 생물반응기로부터의 여과된 혼합물의 생성물이거나, 또는 생물반응기의 직접적인 생성물, 또는 재조합 응고 인자 단백질을 생성하는데 사용된 다른 방법의 직접적인 생성물일 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용되는 예시적인 여과 매질은 다양한 종이 필터, 직조 섬유(woven fibers), 중합체 기제(polymer-based) 컬럼 여과 매질, 아가로스, 덱스트란 및 천연 여과 매질뿐만 아니라 업계에 공지된 다른 매질을 포함한다. 적절하게는, 여과 매질은 중합체 기제 여과 매질뿐만 아니라 아가로스 또는 덱스트란 기제 매질이며, 예를 들어, 세파로스(SEPHAROSE)TM, 세파덱스(SEPHADEX)TM 및 폴리(에틸렌이민) 여과 매질을 포함한다.
예시적인 실시양태들에서, 재조합 응고 인자를 포함하는 혼합물은 제1 음이온 교환 컬럼(즉, 아가로스 여과 매질을 사용하여 제조된 크로마토그래피 또는 여과 컬럼)을 통해 여과된다. 적당한 음이온 교환 컬럼의 예는 Q 세파로스TM 컬럼, 예컨대, 고도 가교된 4% 아가로스, 구형 비드를 포함하고, 비드 사이즈가 약 45-165 ㎛ 범위인 Q 세파로스TM 패스트 플로우(Fast Flow) 컬럼(미국 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 GE Healthcare)을 포함한다. 매질의 사용 양을 포함한 이러한 컬럼의 제조 방법, 컬럼의 유지 및 제조를 위한 장치, 및 이러한 컬럼을 사용하여 혼합물을 여과하는 방법은 당업자들이 익히 숙지하고 있다. 이러한 방법은 적절하게는 소정 부피의 혼합물의 컬럼으로의 추가, 컬럼을 평형화시키거나 세척하기 위해 완충제 또는 다른 매질의 첨가, 및 완충제 또는 세척액의 소정 유속으로 컬럼을 통한 통과를 포함한다.
실시양태들에서, 혼합물은 제1 음이온 교환 컬럼에 이어 제2 음이온 교환 컬럼을 통해 여과된다. 적절하게는, 이용되는 제1 및 제2 음이온 교환 컬럼은 Q 세파로스TM 패스트 플로우 컬럼이다. 실시양태들에서, 부가적인 음이온 교환 컬럼이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 등의 음이온 교환 컬럼을 통해 여과될 수 있다. 컬럼 또는 여과 매질의 부가적인 타입이 또한 재조합 응고 인자 단백질을 포함한 혼합물을 초기에 여과하는데 사용될 수 있다.
여과의 최종 생성물은 여과에 사용되는 컬럼의 종류에 따라 본원에서 "생성물", "컬럼 생성물", "음이온 교환 컬럼 생성물" 또는 "PEI 컬럼 생성물"로서 지칭된다. 음이온 교환 컬럼(들)을 통한 여과는 흐름통과 여과 또는 결합 및 용출 여과일 수 있다. 본원에서 사용된 "흐름통과(flowthrough)" 여과는 혼합물을 컬럼에 추가(적절하게는 이후 완충제 또는 세척 용액 추가)한 다음, 혼합물을 컬럼에 통과시키는 여과를 지칭한다. 이러한 여과의 최종 생성물("컬럼 생성물")은 비결합 생성물로서 컬럼을 통과한 물질이다. 임의의 원치않은 또는 바람직하지 않은 성분(예를 들어, DNA, 단백질, 세포 생성물, 등)이 컬럼 상에 보유된다.
본원에서 사용된 "결합 및 용출(binding and elution)" 여과 또는 여과하는, 또는 "결합하고 용출하다"는 혼합물이 추가되고, 적절하게는 뒤이어 세척 또는 평형 완충제가 추가된 컬럼을 이용한 여과를 지칭한다. 원하는 물질은 초기에 컬럼 상에 보유되지만(즉, 컬럼 매질에 결합하거나 이러한 매질에 의해 보유됨), 원치않은 또는 바람직하지 않은 성분들은 컬럼을 통과한다. 이후, 원하는 생성물은 적절한 완충제를 이용한 용출에 의해 컬럼으로부터 용출된다(즉, 생성물은 본래 컬럼 상에 결합됨). 이러한 실시양태들에서, 컬럼 생성물은 혼합물 중에서 컬럼을 통과하고 보유되지 않은 원치않은 또는 바람직하지 않은 성분들이 제거된 후 회수되어진 물질이다.
예시적인 실시양태들에서, 제1 음이온 교환 컬럼(예를 들어, 세파로스TM 컬럼)을 통한 혼합물의 여과는 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성하기 위해 결합 및 용출 여과를 포함한다. 적절하게는, 제2 음이온 교환 컬럼이 혼합물을 여과하는데 사용되면, 제2 음이온 교환(예를 들어, 세파로스TM) 컬럼을 통한 여과는 흐름통과 여과를 포함한다. 원한다면, 음이온 교환 컬럼을 통한 임의의 추가적인 여과가 결합 및 용출 여과 또는 흐름통과 여과를 포함할 수 있다.
실시양태들에서, 상기 방법은 제1 컬럼 생성물(즉, 제1 음이온 교환 컬럼의 생성물 또는 제2 음이온 교환 컬럼의 생성물(두 음이온 교환 컬럼이 사용되는 경우))을 용매/세제 불활성화로 불활성화시켜 불활성화된 혼합물을 생성하는 단계를 더 포함한다. 적절하게는 이러한 불활성화는 예를 들어, 폴리(에틸렌이민) 컬럼을 이용한 임의의 추가 여과 이전에 이루어진다. 적절하게는, 불활성화는 바이러스의 지질 코팅에서 분자 간 상호작용을 방해하기 위해 세제의 사용을 포함한다. 적절하게는 지질 코팅과 세제 간의 응집 반응이 빠르게 일어나는 환경을 만들어내는 용매가 사용된다. 예시적인 세제 및 용매는 업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 세제 트리톤(Triton)-X 100을 포함한다.
적절하게는, 불활성 혼합물은 하나 이상의 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 여과되어 PEI 컬럼 생성물을 생성한다. 적당한 실시양태들에서, 폴리(에틸렌이민) 컬럼을 통한 불활성화된 혼합물의 여과는 결합 및 용출 여과를 포함한다.
본원에 기재된 방법에서 사용되는 폴리(에틸렌이민) 컬럼의 예는 베이커본드(BAKERBOND)TM XWP 500 폴리 PEI-35 (폴리(에틸렌이민)) 컬럼(폴리PEI)을 포함한다. 이러한 예시적인 컬럼은 소수성 중합체 상에 결합된 폴리(에틸렌이민)(PEI)을 포함한다 (아반토르(AVANTOR)TM, 뉴저지주 필립스버그 소재).
실시양태들에서, 상기 방법은 PEI 컬럼 생성물을 하나 이상의 음이온 교환 컬럼, 적절하게는 페닐 세파로스TM 고성능 컬럼을 통해 여과하는 단계를 더 포함한다. 실시양태들에서, 소수성 상호작용 컬럼을 통한 PEI 컬럼 생성물의 여과는 결합 및 용출 여과를 포함한다. PEI 여과 이후에 다른 컬럼 여과가 또한 사용되어 회수 이전에 재조합 응고 인자 단백질을 추가로 정제할 수 있다.
적당한 실시양태들에서, 정제된 재조합 응고 단백질의 회수 이전에, 혼합물은 나노여과된다. 실시양태들에서, 나노여과는 PEI 컬럼을 통한 여과 이후에 이루어질 수 있고(즉, PEI 컬럼 생성물이 나노여과됨), 다른 실시양태들에서는, 소수성 상호작용 컬럼(HIC) 또는 다른 적당한 컬럼을 통해 PEI 컬럼 생성물을 여과한 후 나노여과가 이루어질 수 있다(즉, HIC 생성물이 나노여과됨). 나노여과를 위한 예시적인 방법 및 나노여과를 위한 여과 매질은 업계에 익히 알려져 있고, 적절하게는 포어(pore) 사이즈가 약 1 nm인 막(membrane)을 사용한다. 나노여과 막은 적절하게는 1000 미만의 원자 질량 단위(달톤)의 분자량 컷-오프(MWCO)를 가진다.
본원에 기재된 방법은 적절하게는 실질적으로 트롬빈이 없는 재조합 응고 단백질, 적절하게는 프로트롬빈(인자 II)을 생성한다. 본원에 기재된 바와 같이, 재조합 프로트롬빈으로부터 트롬빈의 제거 (또는 존재하는 트롬빈의 양을 적절한 수준으로 감소)는 최종 단백질 생성물의 안전성을 증가시킨다. 본원에서 사용된, "실질적으로 트롬빈이 없는"은 최종 생성물이 단백질 생성물의 총 질량을 기준으로 약 20% 미만의 트롬빈, 적절하게는 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.1% 미만, 약 0.05% 미만, 약 0.01% 미만, 약 0.005% 미만 또는 약 0.001% 미만의 트롬빈을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다. 적절하게는, 최종 생성물에서 트롬빈의 양은 약 10 ng/ml 미만의 트롬빈, 보다 적절하게는 약 9 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 8 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 7 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 6 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 5 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 4 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 3 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 2 ng/ml 미만의 트롬빈, 또는 약 1 ng/ml 미만의 트롬빈이다.
완전히 기능적인 재조합 인간 응고 인자를 다량으로 얻는데 있어 주된 장애요소 중 하나는 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X 및 단백질 C에 존재하는 Gla-도메인에 있다. 이 도메인은 카르복실기의 첨가에 의해 번역후 변형된 글루탐산 잔기를 함유한다. 이들 인자의 생성은, 이들의 과발현이 언더-카르복실화되어 불활성인 단백질을 생성한다는 사실에 의해 방해된다. Gla 변형은 γ-글루타밀 카르복실라제(GGCX)로 불리는 비타민 K-의존 효소의 작용의 결과이다(예를 들어, WO 88/03926; 문헌[Wu et al . Science 254(5038): 1634-1636, 1991]참조).
도 2에 도시된 바와 같이, 재조합 프로트롬빈은 N-말단 도메인에 10개의 "Gla-잔기"를 함유한다. 이들 잔기는 단백질의 생물 활성에 영향을 미치는 γ-카르복실화 글루탐산(Gla) 잔기이다. 이들 잔기는 Ca2 + 이온을 킬레이팅하는 것으로 생각되고, 이는 트롬빈으로의 프로트롬빈 활성화를 위한 선결조건인 인지질 막으로의 단백질 결합을 매개한다.
인간 인자 II(프로트롬빈)의 경우, 완전히 기능적인 프로트롬빈을 얻기 위해 10개의 Glu 잔기들 중 적어도 8개의 잔기가 정확하게 변형되어야 한다(Malhotra, et al ., J. Biol . Chem . 260: 279-287, 1985; Seegers and Walz 'Prothrombin and other vitamin K proteins', CRC Press, 1986). 몇몇 다양한 시스템 예컨대, CHO 세포, BHK 세포, 293 세포 및 백시니아 바이러스 발현 시스템을 사용하여 rhFII의 높은 생성 수준을 달성하기 위해 광범위한 노력이 이루어지고 있다(Jorgensen et al ., J. Biol . Chem . 262: 6729-6734, 1987; Russo et al ., Biotechnol Appl Biochem 14(2): 222-233, 1991; Fischer et al ., J Biotechnol 38(2): 129-136, 1995; Herlitschka et al . Protein Expr . Purif . 8(3): 358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr . Purif . 10: 214-225, 1997). 재조합 인자 II의 생성을 위한 예시적인 방법은 예를 들어, 미국 특허 제7,842,477호 및 제7,989,193호에 개시되어 있으며, 개시내용은 그 전문이 본원에서 참고적으로 인용된다.
본원에 기재된 방법에 따라 정제된 재조합 응고 인자 단백질(적절하게는 프로트롬빈(인자 II))은 적절하게는 10개 중 약 1개(1/10) 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산(Gla) 부위를 포함한다. 즉, 상기 단백질 내 10개의 글루탐산 부위 중에서, 총 단백질 샘플에 대한 평균을 고려했을 때, 적절하게는 1/10 미만의 Gla 부위가 γ-카르복실화되지 않은, 즉, 평균적으로, 1/10 미만의 γ-카르복실화 글루탐산(Gla) 부위가 부족하다. 실시양태들에서, 본원에 기재된 방법은 적절하게는, 샘플의 평균적으로, 약 0.9/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 더욱 적절하게는 약 0.8/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.7/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.6/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.3/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.2/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.2/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하거나, 또는 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 전혀 포함하지 않은 프로트롬빈을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 기재된 방법이 실질적으로 트롬빈이 없고 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 가진 정제된 재조합 응고 인자 단백질(예를 들어, 프로트롬빈(인자 II) 포함)을 생성하는 것을 밝혀내었다. 이들 정제된 재조합 응고 단백질에 대한 생물활성 시험은 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위의 개수에 있어 감소가 Clot 및 CAT 분석법으로 측정했을 때 생물활성에 있어 증가와 상호관련되는 것을 입증해 준다(Clot 및 CAT 생물활성 분석의 실시예에서의 기재 참조). 도 3을 참조하기 바란다. 실시예에 기재된 바와 같이, 이러한 상호관련성은, 상기 분석에 의해 측정가능한 100% 생물활성을 나타내는 기준 표준물질(reference standard)과 비교했을 때 약 70% 초과, 적절하게는 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 또는 약 100% 생물활성인 정제된 단백질의 생물활성을 제공한다.
활성에 있어 증가에 대한 이유와 관련한 어떤 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 폴리(PEI) 컬럼을 통한 여과에 의한 재조합 응고 단백질의 정제는 감소된 수의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위 (즉, 0.5개 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위)를 포함하는 재조합 응고 인자 단백질을 제공하는 것으로 여겨진다.
추가 실시양태들에서, 재조합 응고 인자를 정제하기 위한 부가적인 방법이 제공된다. 적절하게는, 상기 방법은 재조합 응고 인자 단백질을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계를 포함한다. 혼합물은 적어도 제1 음이온 교환 컬럼을 통해 여과되어 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성한다. 제1 음이온 교환 컬럼 생성물은 용매/세제 바이러스 불활성화로 불활성화되어 불활성화된 혼합물을 생성한다. 불활성화된 혼합물은 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 여과되어 PEI 컬럼 생성물을 생성한다. PEI 컬럼 생성물은 소수성 상호작용 컬럼(HIC)을 통해 여과되어 HIC 생성물을 생성한다. HIC 생성물은 추가 여과된다. 이후, 정제된 재조합 응고 인자 단백질이 회수된다.
적절하게는, 재조합 응고 인자 단백질은, 비록 상기 방법이 다른 재조합 응고 인자 단백질에까지 용이하게 확대적용될 수 있지만, 프로트롬빈(인자 II)이다.
예시적인 실시양태들에서, 재조합 응고 인자 단백질을 포함한 초기 혼합물은 생물반응기로부터의 여과된 혼합물이다.
실시양태들에서, 적어도 제1 음이온 교환 컬럼을 통한 여과는 결합 및 용출 여과를 포함하고, 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 제2 음이온 교환 컬럼을 통해 여과하는 것을 더 포함할 수 있다. 추가의 음이온 교환 컬럼이 또한 사용될 수 있다. 적절하게는, 제2 음이온 교환 컬럼을 통한 여과는 흐름통과 여과를 포함한다.
예시적인 실시양태들에서, PEI 필터를 통한 음이온 교환 컬럼 생성물의 여과는 결합 및 용출 여과를 포함한다. PEI 컬럼 생성물의 추가 여과는 또한 적절하게는 소수성 상호작용 컬럼(HIC)을 포함한다. 실시양태들에서, HIC 생성물의 여과는 나노여과를 포함한다.
본원에 기재된 방법은 또한 재조합 인자 II의 회수에 이어 추가 여과(예를 들어, 최종 생성물의 한외여과 또는 투석여과 포함)를 포함할 수 있다.
명세서 전반에 기재된 바와 같이, 정제 방법은 적절하게는 실질적으로 트롬빈이 없는 재조합 프로트롬빈 단백질 생성물을 생성한다. 부가적으로, 재조합 응고 인자 단백질은 적절하게는 약 1/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 더욱 적절하게는 약 0.9/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.8/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.7/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.6/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.3/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.2/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.2/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하거나 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 전혀 포함하지 않는다.
추가 실시양태들에서, 재조합 프로트롬빈(인자 II) 단백질을 정제하기 위한 추가 방법이 제공된다. 도 1은 예시적인 방법의 흐름도(100)를 도시한다. 적절하게는, 재조합 프로트롬빈 단백질을 포함하는 생물반응기로부터의 여과된 혼합물을 제공한다(102). 실시양태들에서, 이 혼합물은 생물반응기 채취물의 심층 여과(depth filtration)의 생성물일 수 있다.
혼합물은 결합 및 용출 여과를 이용하여 제1 음이온 교환 컬럼(적절하게는 Q 세파로스TM 패스트 플로우 컬럼)을 통해 여과되어(104), 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성한다. 제1 음이온 교환 컬럼 생성물은, 적절하게는 흐름통과 여과를 사용하여 제2 음이온 교환 컬럼(적절하게는 Q 세파로스TM 패스트 플로우 컬럼)을 통해 여과되어(106), 제2 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성한다. 108에서, 제2 음이온 교환 컬럼 생성물은 용매/세제 바이러스 불활성화로 불활성화되어 불활성화된 혼합물을 생성한다.
불활성화된 혼합물은 이후, 적절하게는 결합 및 용출 여과를 사용하여, 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 여과되어(110), PEI 컬럼 생성물을 생성한다. PEI 컬럼 생성물은 이후, 적절하게는 결합 및 용출 여과를 사용하여, 소수성 상호작용 컬럼(예를 들어 페닐 세파로스TM 고성능 컬럼)을 통해 여과(112)되어, HIC 생성물을 생성한다. HIC 생성물은 이후 나노여과되고(114), 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질이 회수된다(116).
본원에 기재된 바와 같이, 적절하게는, 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질은 실질적으로 트롬빈이 없고 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 더욱 적절하게는 약 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함한다.
실시양태들에서, 본원에 기재된 방법은 언급된 단계로만 구성되고, 언급된 단계 이외의 부가적인 개입 단계는 허용되지 않는다. 추가 실시양태들에서, 본원에 기재된 방법은 실질적으로 언급된 단계로 구성된다. 이러한 실시양태들에서, 재조합 단백질의 물리적 또는 화학적 성질을 변경하는 단계의 추가는 이러한 방법에 대한 실질적인 변경으로 간주되고 이에 따라 실질적으로 언급된 단계로 구성된 이러한 방법으로부터 배제된다.
원하는 생물활성, 낮은 수준의 트롬빈, 및 감소된 수준의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 갖는 원하는, 정제된 재조합 응고 인자 단백질을 여전히 달성한다면 본원에 기재된 방법에서 여과의 순서 및 횟수는 변경될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
추가 실시양태들에서, 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질(인자 II)이 제공된다. 적절하게는, 정제된 재조합 인자 II 단백질은 약 1/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하고 실질적으로 트롬빈이 없다.
적절하게는, 정제된 재조합 인자 II 단백질은 약 0.9/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 더욱 적절하게는 약 0.8/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.7/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.6/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.3/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.2/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위, 약 0.1/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하거나, 또는 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하지 않는다.
본원에 기재된 바와 같이, 재조합 인자 II 단백질은 적절하게는 단백질 생성물의 총 질량을 기준으로, 약 20% 미만의 트롬빈, 적절하게는 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.1% 미만, 약 0.05% 미만, 약 0.01% 미만, 약 0.005% 미만, 또는 약 0.001% 미만의 트롬빈을 포함한다. 적절하게는, 정제된 재조합 인자 II 단백질은 약 10 ng/ml 미만의 트롬빈, 보다 적절하게는 약 9 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 8 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 7 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 6 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 5 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 4 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 3 ng/ml 미만의 트롬빈, 약 2 ng/ml 미만의 트롬빈, 또는 약 1 ng/ml 미만의 트롬빈을 포함한다.
실시양태들에서, 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질은 응고(Clot) 분석에서 기준 표준과 비교했을 때 약 50% 초과의 생물활성을 나타낸다. 적절하게는, 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질은 응고 분석에서 약 60% 초과의 생물활성을 나타내거나, 보다 적절하게는, 응고 분석에서 약 70% 초과의 생물활성을 나타내거나, 응고 분석에서 약 75% 초과의 생물활성을 나타내거나, 응고 분석에서 약 80% 초과의 생물활성을 나타내거나, 응고 분석에서 약 85% 초과의 생물활성을 나타내거나, 응고 분석에서 약 90% 초과의 생물활성을 나타내거나, 또는 응고 분석에서 약 95% 초과의 생물활성을 나타낸다.
예시적인 실시양태들에서, 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질은 보정된 자동화 트롬보그램(CAT) 분석에서 기준 표준과 비교했을 때 약 50% 초과의 생물활성을 나타낸다. 적절하게는, 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질은 CAT 분석에서 약 60% 초과의 생물활성을 나타내거나, 보다 적절하게는, CAT 검정에서 약 70% 초과의 생물활성을 나타내거나, CAT 검정에서 약 75% 초과의 생물활성을 나타내거나, CAT 검정에서 약 80% 초과의 생물활성을 나타내거나, CAT 검정에서 약 85% 초과의 생물활성을 나타내거나, CAT 검정에서 약 90% 초과의 생물활성을 나타내거나, 또는 CAT 검정에서 약 95% 초과의 생물활성을 나타낸다.
추가 실시양태들에서, 정제된 인자 II 단백질은 응고 분석에서 약 50% 초과의 생물활성과 보정된 자동화 트롬보그램(CAT) 분석에서 약 50% 초과의 생물활성을 모두 나타낸다.
본원에 기재된 임의의 방법에 의해 제조된 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질(인자 II)이 또한 제공된다. 적절하게는 이들 인자 II 단백질은 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하고, 실질적으로 트롬빈이 없다.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 범위에서 벗어남이 없이 본원에 기재된 방법 및 적용에 대해 다른 적절한 변형 및 개조가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 하기 실시예는 단지 설명을 위해 포함된 것이며 제한적인 의미로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 컬럼 크로마토그래피와 관련된 재료 및 방법
하기는 명세서 전반에 걸쳐 기재된 컬럼 크로마토그래피법과 관련된 예시적인 재료 및 방법이다.
Q 세파로스 TM 패스트 플로우 결합 및 용출 크로마토그래피 (Q B&E)
Q 세파로스TM 패스트 플로우 컬럼(GE Healthcare, 뉴저지주 피츠카타웨이 소재)(QFF B&E)을 로딩 전에 25 mM 시트레이트, 30 mM 염화나트륨, pH 6.0으로 평형화시킨다. 조절된(Conditioned) 배지를 pH 6.0으로 조절하고 여기에 수지 1 L 당 4-11 그램의 생성물을 200　cm/h의 선속도로 로딩한다. 이후, 컬럼을 재평형화시키고 25 mM 시트레이트, 173 mM 염화나트륨, pH 6.0으로 세척한다. 세척 후, 컬럼을 25 mM 시트레이트, 308 mM 염화나트륨, pH 6.0로 일 단계 용출한다.
Q 세파로스 TM 패스트 플로우 흐름통과 크로마토그래피 (Q FT )
Q 세파로스TM 패스트 플로우 컬럼을 흐름통과 방식으로 작동시킨다. 컬럼을 25 mM 시트레이트, 400 mM 염화나트륨, pH 6.0에서 평형화시킨 다음 200 cm/h의 선속도로 생성물을 로딩한다. 로딩은 전형적으로 수지 1 L 당 2-6 그램의 단백질이다. 로딩 후 컬럼을 평형 완충제로 세척하여 비결합 생성물을 모은다.
베이커본드 TM XWP 500 폴리PEI -35 결합 및 용출 크로마토그래피 ( 폴리PEI )
베이커본드TM XWP 500 폴리 PEI-35(폴리(에틸렌이민)) 컬럼(소수성 중합체 상에 결합된 폴리(에틸렌이민)(PEI)를 포함하는 컬럼(폴리PEI))(아반토르TM, 뉴저지주 필립스버그 소재)을 125 mM HEPES, 4% (w/w) 시트레이트, 0.5 M 염화나트륨, pH 6.5로 사전-평형화시킨 다음, 25 mM HEPES, 4% (w/w) 시트레이트, 0.5 M 염화나트륨, pH 6.5로 평형화시킨다. 이후, 컬럼에 수지 1 L 당 5-12 그램의 단백질을 140 cm/h로 로딩한다. 컬럼을 평형 완충제로 세척한 다음 25　mM HEPES, 4% (w/w) 시트레이트, 1.04 M 염화나트륨, pH 6.5로 세척한다. 이후, 생성물을 1 M에서 1.6-2.1 M의 염화나트륨으로 직선 구배로 용출한다.
페닐 세파로스 TM 고성능 결합 및 용출 크로마토그래피 ( 페닐 HP )
컬럼을 25 mM HEPES, 4% (w/w) 시트레이트, 1 M 황산나트륨, pH 6.5로 평형화시킨다. PEI 컬럼으로부터의 용출물을 1 M 황산나트륨으로 조절하고 수지 1 L 당 1-12 그램의 단백질을 100　cm/h로 로딩한다. 컬럼을 재평형화시킨 다음 25 mM HEPES, 0.4% (w/w) 시트레이트, 0.75 M 황산나트륨, pH 6.5로 세척한다. 이후, 컬럼을 0.75에서 0 M의 황산나트륨으로 구배 용출한다.
하이드록시아파타이트 결합 및 용출 크로마토그래피 ( CHT )
컬럼을 낮은 수준의 인산나트륨(10-50 mM) 및 변동 수준의 염화나트륨(0.1 - 1　M NaCl)을 함유한 완충제로 pH 6.5에서 평형화시킨다. 컬럼에 수지 1 L 당 5-10 그램의 단백질을 100 cm/h로 로딩한다. 로딩 후, 컬럼을 낮은 인산염 완충제 및 다양한 농도의 염화나트륨으로 평형화시킨다. 이후, pH 6.5에서 최대 200-400 mM 인산나트륨으로 인산염 농도를 직선 구배로 증가시키면서 생성물을 용출한다.
실시예 2: 프로트롬빈의 정제
재조합 인간 프로트롬빈(인자 II)(rhFII) 단백질을 CHO 세포에서 발현하고 적절하게는 4단계 크로마토그래피, 용매/세제 바이러스 불활성화 단계, 나노여과 단계, 및 최종 제제를 위한 한외여과/투석여과 단계를 포함하는 공정으로 정제한다. 도 1의 모식도는 예시적인 정제 공정에 대한 개괄을 제공한다. 도 1에 도시된 rhFII 정제 방법은 벤치 규모로부터 50 L 생물반응기 및 500 L 생물반응기를 정제하도록 스케일업되어졌다.
표 1은 대표적인 50 L 정제를 위한 관련 컬럼 및 수율 데이터를 요약하고 있다. 분석될 다양한 샘플의 복잡한 성질로 인해, 세 가지 농축 방법을 사용하여 컬럼 성능을 평가하였다. 280 nm에서 측정된 흡광도에 의한 총 단백질 농도는 샘플 중 총 단백질의 측정치를 제공한다. 이는 가장 단순한 방법이며, Q 세파로스TM 패스트 플로우 흐름통과 컬럼(Q FT) 후의 샘플의 경우에 사용되는데 그 이유는 이들 샘플이 비교적 순수하기 때문이다(즉, 낮은 수준의 HCP를 갖는 무색 샘플). 제2의 보다 시간 집중식 방법은 RP-HPLC 방법인데, 이는 공정 중간산물 샘플 중 임의의 샘플 중의 rhFII의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 농축 방법은 초기 컬럼상에 로딩될 rhFII의 질량의 측정치를 제공하기 때문에 주로 미정제 샘플(첫번째 두 컬럼으로부터의 로드(loads) 및 풀(pools))의 경우에 선택되었다. rhFII 정제 공정의 성능을 측정하기 위해 사용된 마지막 농도 분석법은 활성 rhFII의 농도를 측정하는 프로트롬비나제 분석법이다.
50 L 정제로부터의 컬럼 성능의 요약
Q B&E Q FT 폴리PEI 페닐 HP
컬럼 직경 (cm) 10 10 7 7
컬럼 부피 (L) 1.17 1.02 0.48 0.48
로딩된 총 단백질 (g/L; A280에 의해) - - 10.6 5.9
로딩된 생성물 (g/L; RP-HPLC에 의해) 6.1 4.2 - -
로딩된 활성 생성물 (g/L) 4.5 4.4 11.9 6.7
총 단백질 수율 (%) - - 55.3 104.9
생성물 수율 (%) 59.9 130.7 - -
활성 생성물 수율 (%) 86.5 89.9 78.5 96.6
표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 다양한 농도 측정은 다양한 컬럼을 가로질러, 특히 샘플이 보다 나중의 컬럼과 비교해서 더 미정제 상태인 포획 컬럼에서 매우 다양한 단계 수율을 유도한다. 예상한 바와 같이, RP-HPLC 농도를 이용하여 포획 컬럼에 대해 계산된 수율은 프로트롬비나제 분석을 이용하여 계산된 수율보다 더 낮은데, 이는 관련된 생성물이 아니거나 또는 원하는 생성물보다 덜 활성인 불순물의 제거가 있음을 시사한다. 한편, 총 단백질 농도를 이용하여 페닐 HP 컬럼에 대해 계산된 수율은 프로트롬비나제 분석 농도로부터 계산된 수율과 매우 유사한데, 이는 이 컬럼으로부터의 로드 및 풀이 매우 순수함을 시사한다.
표 2는 동일한 50 L 정제로부터 얻어진 인-프로세스(in-process) 생성물 풀로부터의 관련 분석 불순물 데이터를 요약하고 있다. 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 첫번째 두 이온 교환 컬럼은 대부분의 공정 관련 불순물, 특히 숙주 세포 단백질(HCP) 및 DNA를 제거하고, Q 세파로스TM FF 흐름통과 풀은 대부분 생성물과 생성물 관련 변이형(variants)이다.
한편, 생성물 관련 변이형, 특히 HP-IEC 프리-피크(pre-peak) 값으로 측정된 감마-카르복실화 변이형의 수준은 첫번째 두 컬럼에서 비교적 변함없이 유지된다. 첫번째 두 컬럼 후 IEC-HPLC 프리-피크의 전형적인 수준은 대략 40%인데, 이후 완전히 감마-카르복실화된 생성물의 농축(enrichment)을 위해 폴리PEI 컬럼 상에 로딩된다. 이는 보다 적은 감마-카르복실화 부위(즉, 보다 많은 감마-카르복실화결손 부위)를 갖는 생성물을 분리하기 위해 직선형의 염화나트륨 구배의 사용을 통해 달성되며, 보다 적은 감마-카르복실화 부위는, 상기 구배에서 보다 나중에 용출되는 보다 높은 감마-카르복실화 수준을 갖는 생성물로부터 상기 구배에서 보다 조기에 용출된다.
대표적인 50 L 정제로부터의 공정 중간산물에 대한 불순물의 요약
CM Q B&E 풀(Pool) Q FT 풀 폴리PEI 풀 페닐 HP 풀 DS
총 단백질 (g/L)1 - 1.66 1.34 0.78 1.74 11.00
생성물 농도 (g/L)2 0.12 1.28 1.50 - - 11.18
활성 생성물 농도(g/L)3 0.087 1.339 1.079 0.894 1.831 9.563
HCP (ng/mg) - 2266 2351 < 51 < 11 4
DNA (ng/mg) - 2.1 x 10-1 3.6 x 10-1 1.5 x 10-1 1.4 x 10-2 2.4 x 10-3
응집물(aggregates)(%) - - - - - 0.3
IEC 프리피크 (%) - 34.3 39.6 24.9 21.5 19.2
트롬빈 (ng/mg) - 2.4 5.0 2.7 < 0.5 < 0.2
평균 감마-카르복실화 결손 (10개 부위 중에서) 0.6 - - - - 0.38
단편 (%) - 3.0 2.6 2.8 1.4 1.4
시알산(mol NANA/mol) - 2.6 2.9 1.8 2.4 2.6
CLOT 생물검정 (%) - - - 83 106 110
CAT 생물검정 (%) - - - - 69 108
1 농도 (280 nm에서의 흡광도)
2 농도 (RP-HPLC)
3 농도(프로트롬비나제 분석)
50 L 정제 용출 피크를 대략 0.5 - 1.0 컬럼 부피 분획으로 분류하고 모의(mock) 풀을 만들어 HP-IEC로 분석하였다. 표 3은 개개 분획으로부터 제조된 모의 풀뿐만 아니라 개개 분획에 대한 HP-IEC 프리-피크 수준을 제공한다. 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 나중 용출 분획과 나중 용출 분획을 함유한 풀이 HP-IEC 상에서 보다 낮은 수준의 프리-피크를 가졌으며, 이는 보다 높은 수준의 감마-카르복실화와 관련된다. 용출 피크를 분류하고, HP-IEC에 의해 모의 풀을 분석하고, < 25% 프리-피크를 함유한 대부분의 포괄 풀을 앞쪽으로 이동시키기 위해 인프로세스 제어(IPC) 방법을 사용하였다. 이러한 IPC 제어 방법은, 나머지 컬럼(페닐 HP)이 다양한 수준의 감마-카르복실화를 갖는 재료를 분리하지 못하기 때문에 단백질이 <　30% HP-IEC 프리-피크의 원하는 규격(specification)을 충족하도록 해준다. 이러한 특정 시험의 경우, 모의 풀 3(분획 8-18)이 앞쪽으로 이동되었다. 엄격하게 제어된 HP-IEC 프리피크 수준으로 인해, 최종 약물 재료는 낮은 수준의 감마-카르복실화 결손를 가졌고(10개 부위 중 평균 0.38개의(0.38/10) 감마-카르복실화 결손) CLOT 및 CAT 생물검정 둘다에서 매우 활성이었다.
50L 정제 시험에서 얻어진 모의 풀 및 폴리PEI 분획의 HP-IEC 분석
분획 또는 모의 풀 HP-IEC % 프리-피크
분획 2 100 %
분획 4 100 %
분획 6 98.5 %
분획 7 100 %
분획 8 92.7 %
분획 9 84.9 %
분획 10 56.0 %
분획 11 30.9 %
분획 12 12.6 %
분획 13 3.3 %
분획 14 3.7 %
분획 15 1.8 %
분획 16 3.7 %
분획 17 3.6 %
모의 풀 1 (분획 6-18) 24.1 %
모의 풀 2 (분획 7-18) 23.9 %
모의 풀 3 (분획 8-18) 18.8 %
모의 풀 4 (분획 9-18) 12.5 %
모의 풀 5 (분획 10-18) 7.6 %
모의 풀 6 (분획 11-18) 4.8 %
모의 풀 7 (분획 12-18) 3.3 %
모의 풀 8 (분획 13-18) 3.5 %
실시예 3: 재조합 인자 II의 펩티드 맴핑(mapping)
본 실시예는 CHO 세포주에서 발현된 재조합 인간 인자 II 단백질의 펩티드 맵핑 분석을 기재한다.
인간 재조합 인자 II는 글루탐산(Gla)의 γ-카르복실화, 글리코실화, 및 가능한 단편화를 포함한 몇가지 중요한 번역후 변형(PTM)을 내포한다. 인자 II의 기능에 대한 이들의 중대한 기여로 인해, 약물 개발 동안 이들 변형을 모니터링하는 것인 바람직하다.
펩티드 맵핑 분석을 위해, 단백질 샘플을 단백질분해 효소로 처리하여 펩티드 단편을 생성하고, 이를 HPLC-MS로 분리하고 확인한다. 기준 표준과 비교해서, 재조합 인자 II 샘플에 대한 펩티드 맵핑 분석의 적용은 이들의 일차 구조를 확인시켜주고 PTM을 검출할 수 있다.
재료 및 방법
이 방법은 이황화 결합 측정 분석에서 유도된다. 간단히 설명하면, 재조합 인자 II 샘플을 N-에틸말레이미드(NEM)와 함께 인큐베이팅하여 모든 가능한 자유 티올을 캡핑시킨 다음, 이를 구아니딘과 혼합하여 단백질 구조를 변성시킨다. 분해(digestion) 과정은 단백질을 엔도프로테이나제 라이실 엔도펩티다제(Lys-C)와 함께 밤새 중성 pH에서 인큐베이팅함으로써 실시된다. Lys-C 단편을 역상 UPLC로 분리하고, 써모 LTQ 오르비트랩(Orbitrap) 질량 분석기로 분석한다.
데이터 및 토의
표 4에 나타낸 바와 같이, 25개의 Lys-C 단편이 확인되었고 이들 단편은 인자 II 서열의 약 75%를 커버한다. 유일한 중요한 갭은 영역에서 절개 부위의 결여로 인한 잔기 57-200을 포함한다. 기준 표준으로부터 생성된 모든 단편을 분리하고 MS 측정을 허용하기 위해 90-분 HPLC 구배가 충분히 효과적인 것으로 확인되었다.
펩티드 맵핑 분석에 사용된 재조합 인자 II로부터의 Lys-C 단편
단편# 위치 체류 시간 (분) 질량 관측치 질량 이론치 펩티드 서열 서열번호:
K1 1-10 29.9 1294.64 1294.63 ANTFLE*E*VRK(+2Gla) 1
K2 11-43 56.7 4095.58 4095.55 GNLE*RE*CVE*E*TCSYE*E*AFE*ALE*SSTATDVFWAK(+8Gla) 2
K3 44-56 13.1 1511.74 1511.73 YTACETARTPRDK 3
K6 201-204 8.4 418.27 418.27 ALSK 4
K7K8 205-301 68.5 10826.74 10826.74 HQDFNSAVQLVENFCRNPDGDEEGVWCYVAGKPGDFGYCDLNYCEEAVEEETGDGLDEDSDRAIEGRTATSEYQTFFNPRTFGSGEADCGLR PLFEK 5
K10 303-307 9.3 591.30 591.30 SLEDK 6
K11 308-341 57.6 3954.97 3954.97 TERELLESYIDGRIVEGSDAEIGMSPWQVMLFRK 7
K12 342-372 77.9 3482.77 3482.76 SPQELLCGASLISDRWVLTAAHCLLYPPWDK 8
K13 373-385 32.6 3578.56 3578.56 N**FTENDLLVRIGK 9
K14 386-397 11.8 1588.84 1588.83 HSRTRYERNIEK 10
K15 398-403 21.1 720.40 720.40 ISMLEK 11
K16 404-424 38.6 2716.42 2716.41 IYIHPRYNWRENLDRDIALMK 12
K17K18K19 425-455 44.7 3430.84 3430.85 LKKPVAFSDYIHPVCLPDRETAASLLQAGYK 13
K18K19 427-455 45.8 3189.64 3189.66 KPVAFSDYIHPVCLPDRETAASLLQAGYK 14
K19 428-455 49.0 3061.54 3061.55 PVAFSDYIHPVCLPDRETAASLLQAGYK 15
K20 456-465 23.4 1087.60 1087.60 GRVTGWGNLK 16
K21 466-474 20.2 1005.50 1005.50 ETWTANVGK 17
K22 475-494 49.1 2175.24 2175.23 GQPSVLQVVNLPIVERPVCK 18
K23K24 495-516 31.7 2517.19 2517.20 DSTRIRITDNMFCAGYKPDEGK 19
K25 517-532 25.1 1625.72 1625.70 RGDACEGDSGGPFVMK 20
K26 533-556 43.2 2802.28 2802.25 SPFNNRWYQMGIVSWGEGCDRDGK 21
K27 557-567 33.7 1430.76 1430.76 YGFYTHVFRLK 22
K28K29 568-572 14.7 702.44 702.45 KWIQK 23
K29 569-572 14.6 574.33 574.33 WIQK 24
K30 573-579 21.8 807.39 807.39 VIDQFGE 25
* Gla 부위
** N-글리코실화 부위 N373
일차 구조의 확인 이외에, 이 분석법은 또한 재조합 인자 II의 중요한 PTM을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 도 5a 및 5b는 재조합 인자 II 기준 표준이 단편 K1 및 K2 둘다에서 높은 Gla 수준을 함유하는 것을 도시하고 있지만, 도 6은 단편 K13의 글리코실화 프로파일을 나타낸다. 이러한 질량 스펙트럼에 기초하여, 다양한 종의 대략적인 백분율이 추출(extracted) 이온 크로마토그램을 이용하여 계산될 수 있다.
이들 결과는 재조합 인자 II에 대한 펩티드 맵핑 분석을 제공하는데, 상기 단백질의 일차 구조를 확인시켜줄 뿐만 아니라, 임의의 변형, 예컨대, Gla 수준 및 글리코실화 프로파일을 모니터링할 수 있다.
실시예 4: 폴리 PEI 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에서의 트롬빈 감소
폴리(폴리(에틸렌이민))(폴리PEI)(아반토르TM, 뉴저지주 필립스버그)는 용매-세제 바이러스 불활성화 처리 이후에 재조합 인자 II 정제 공정에서 결합 및 용출 컬럼으로서 작용하는 약음이온 교환 수지이다. 이러한 크로마토그래피 여과는 잔류 용매-세제를 제거하는 것으로 여겨진다. 상기 여과는 또한 숙주 세포 단백질(HCP)을 100배 제거하고, DNA 소거(clearance)에 기여하며, 트롬빈을 제거하고, 구배 모드로 실행시에는 고도 카르복실화 (즉, 낮은 수준의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위) 및 고도 활성인 재조합 인자 II를 농축시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
수지는 25 mM HEPES, 0.4 % 시트르산나트륨, 0.5　M 염화나트륨, pH 6.5에서 평형화되고, 재조합 인자 II는 음이온 교환 컬럼 상에 5-12 g/L 수지의 로드 용량으로 로딩된다. 이 크로마토그래피 단계는 140 cm/hr의 선속도에서 실시된다. 이후, 컬럼을 동일한 완충제로 세정한 다음, 25 mM HEPES, 0.4 % 시트르산나트륨, 1.04 M 염화나트륨, pH 6.5로 세척하고, 최종적으로 12개 컬럼 부피에 대해 직선 구배로 25mM HEPES, 0.4 % 시트레이트, 1.66 M NaCl, pH 6.5로 용출한다.
용출 프로파일은 몇몇 프런트 쇼울더(front shoulder)를 갖는 광범위 피크를 보여준다. 용출 동안, 개개 분획(크기가 대략 0.5 컬럼 부피 분획)을 모아 이온 교환(IEX) HPLC 프리-피크 분석을 실시한다. 구배에서 조기에 용출되는 분획은 높은 IEC 프리피크를 갖는 rhFII를 함유하는데, 이는 보다 덜 완전한 카르복실화 (및 감소된 생물활성)를 나타낸다. 이들을 최종 생성물 풀로부터 배제한다. 낮은 프리피크 함량을 가진 재조합 인자 II를 함유하는 (나중에 용출되는) 분획만을 모아, 용출물 풀이 (펩티드 맵핑에 의해 측정시 5 % 미만의 카르복실화결손 글루타메이트 잔기(즉, 0.5/10 미만의 결손)에 상응하는) 25 % 미만의 프리피크 함량을 갖는 재조합 인자 II인자를 함유하도록 한다.
전하 변이형 분리(Charge Variant Separation)
재조합 인자 II는 N-말단 도메인에 10개의 소위 "Gla-잔기"를 함유한다 (도 2 참조). 이들은 γ-카르복실화 글루탐산(글루타메이트) 잔기이며 상기 단백질의 생물학적 활성과 직접적으로 관련된 것으로 여겨진다. 이들 잔기는 Ca2 + 이온을 킬레이팅하는 것으로 생각되며, 재조합 인자 II의 트롬빈으로의 활성화를 위한 선결조건인 인지질 막으로의 단백질 결합을 매개한다.
번역후 변형과 생물활성 간의 상관관계를 조사하기 위해, 직교 방법(orthogonal method)에 의해 전하 변이형의 예비적인 분리를 실시하였다. 개개 분획에 대해 생물활성 시험을 실시하고 질량 분석 및 IEX HPLC에 의해 번역후 변형을 분석하였다. 재조합 인자 II를 (1) Q 포획 음이온 교환 크로마토그래피, (2) 흐름통과 방식의 Q 세파로스 크로마토그래피, (3) 흐름통과 방식으로 페닐-세파로스 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 (4) 결합-용출 방식의 폴리(PEI) 크로마토그래피의 순서로 초기에 98.6 % 순도로 정제하였다.
몇몇 수지에 대해 "전하 변이형", 즉 Gla-도메인에서 카르복실화의 상이한 정도를 함유하는 재조합 인자 II의 종을 분리하기 위해 전위(potential)를 평가하였다. 최상의 기법은 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(CHT)(표 5) 및 폴리PEI(PPEI) 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피(표 6)인 것으로 확인되었으며, 둘 모두 직선 구배 용출 모드로 작동하였다. 두 크로마토그래피 공정을 위해, 개개 분획을 용출 동안 모아 (i) IEX HPLC로 측정한 프리피크 함량, (ii) 질량 분석 펩티드 맵핑에 의한 카르복실화/번역후 변형의 정도, (iii) 응고 분석에서의 생물활성, 및 (iv) 보정된 자동화 트롬보그램(CAT) 분석에서의 생물활성에 대해 분석하였다.
응고 분석은 재조합 인자 II의 첨가시 혈전 형성을 개시하는데 소요된 시간을 측정한다. 이 방법에서는, 재조합 인자 II가 조직 인자, 인지질, 및 Ca2 + 이온의 존재하에 인자 II-결핍 혈장(인자 II를 제외한 필요한 모든 응고 인자를 함유하는 혈장)에 첨가되어 혈전 형성을 자극한다. ACL TOP 응고 분석기는 혈전 형성의 개시에 의해 야기된 혈장 샘플의 광학 밀도에 있어 증가를 검출함으로써 혈전 형성을 측정한다. 분석에서 설정된 역치까지 광학 밀도에 있어 증가를 관찰하는데 소요된 시간, 즉 프로트롬빈 응고 시간(또는 PT 응고 시간)은 기구에 의해 기록이 되며 시험 샘플에 존재하는 활성 트롬빈을 형성할 수 있는 인자 II의 양에 직접적으로 비례한다. 각 시험 샘플을 기구를 사용하여 4회 희석하고 각 희석물에서 혈전 형성을 개시하는 시간을 기구를 사용하여 측정한다. 이후, 샘플 응고 시간을 기구에 의해 작도하고 각 분석에 대해 동일한 방식으로 생성된 기준 표준과 비교하여 로그 전환하고 평행선 분석을 사용하여 유사성을 평가한다. 샘플과 기준 표준 곡선이 평행하면(동일한 기울기를 가지면), 기준 표준 곡선과 시험 샘플 곡선의 절편의 비는 인자 II 시험 샘플의 활성도를 결정한다. 재조합 인자 II 시험 샘플 활성도는 또한 WHO 프로트롬빈 국제 표준(NIBSC)과 비교함으로써 고유 활성(IU/mg)으로서 기록이 된다.
보정된 자동화 트롬보그램(CAT) 분석은 재조합 인자 II의 트롬빈 생성 잠재력을 확인하는데 사용되는 트롬빈 생성 분석이다. 샘플을 4개 농도로 희석하고 각 샘플 희석물에 대해 3회 측정한다. 인자 II 결핍 혈소판 부족 혈장 및 "트리거(trigger) 용액'(조직 인자, Ca2 +, 인지질 비히클 함유)을 샘플에 첨가한다. 데이터 보정을 위해 인자 II-결핍 혈장, 분석 완충제, 및 아미드분해제(amidolytic agent)(트롬빈 보정기)를 사용하여 보정기 웰을 셋업한다. 다음, 느린 형광생성 트롬빈 기질을 모든 웰에 첨가한다. 프로트롬빈이 트롬빈으로 전환됨에 따라, 트롬빈이 형광 기질을 절단한다. 절단된 기질 형광과 이러한 형광은 트롬비노스코프 소프트웨어가 장착된 풀루오로스칸 아센트 플루오로미터(Fluoroskan Ascent Fluorometer)에 의해 검출된다. 각 분석 웰의 형광은 60분간 매 20초마다 측정된다. 각 샘플에 대해 4개 농도에서 재조합 인자 III의 내인성 트롬빈 전위(ETP)를 측정한다. 샘플의 상대 활성도를 기울기-비 방법으로 측정한다. 4개 농도 각각에 대한 ETP의 값을 작도함으로써 각 샘플에 대한 기울기를 계산한다. 최상의 피트(fit) 선을 생성하여, 각 샘플의 기울기를 구한다. 각 샘플의 기울기를 기준 표준 기울기와 비교하고 결과를 상대 활성도%로 기록한다. 상대 활성도%는 혈장 유래 WHO 인자 II 국제 표준에 비해 재조합 인자 II 샘플의 고유 활성을 확인하는데 사용된다.
CHT 크로마토그래피에 따른 결과
샘플 기재 　 펩티드 맵핑 생물활성
IEC 프리-피크 총 Gla 결손 응고 분석 CAT 분석
　 초기 정제된 FII (전하 변이형 분리를 위한 출발 물질) 36.25 0.7 70 % 57 %
A CHT 분획 C9C12 90.7% 1.35 23% 24%
B CHT 분획 D9D6 22.3% 0.5 78% 57%
C CHT 분획 D5D2 10.6% 0.29 106 % 78%
D CHT 분획 D1E4 14.7% 0.37 98% 53%
폴리PEI 크로마토그래피에 따른 결과
샘플 기재 　 펩티드 맵핑 생물활성
IEC 프리-피크 총 Gla 결손 응고 분석 CAT 분석
　 초기 정제된 FII (전하 변이형 분리를 위한 출발 물질) 36.25 0.7 70 % 57 %
A PPEI 분획 C5C7 24.5% 1.31 21 % 25 %
B PPEI 분획 C8C9 29.8% 0.51 81 % 63 %
C PPEI 분획 C10C11 1.8% 0.18 106 % 81 %
D PPEI 분획 C12D12 3.7% 0.14 119 % 87 %
도 3에서 확인된 바와 같이, 응고 및 CAT 생물검정에서 번역후 카르복실화 정도와 상대 활성도(시험관내 생물활성) 간에 강한 상관관계가 관찰되며, 이는 상대 활성도와 Gla 결손(X/10) 간에 상호관련성을 보여준다. 이는 고도 카르복실화 생성물을 생성하기 위해 재조합 인자 II에 대한 상류 및 하류의 병합 프로세싱에 있어 프로세스 제어의 이점을 나타낸다.
정제 동안 재조합 인자 II의 시험관내 생물활성을 CAT 생물검정으로 모니터링하면, 표 7에 나타낸 바와 같이, 폴리PEI 크로마토그래피 단계 이후에 상당한 "활성화"가 관찰된다.
여과에 이어 CAT 및 Clot 분석에서의 활성
정제 순서 CAT 분석에서의 활성 Clot 분석에서의 활성
Q B&E 5 % 100-115 %
Q FT 5 % 100-115%
페닐 HP 15 % 100-115%
폴리PEI 95-120 % 110-130%
폴리PEI 크로마토그래피 동안 제거된 "세척 분획"을 이 컬럼에서 나온 정제된 용출물에 다시 첨가하면, 도 4에 나타낸 바와 같이, 생물활성의 감소가 관찰될 수 있는데, 이는 이러한 컬럼이 금지 오염물질을 제거할 가능성을 시사한다.
청색 세파로스, 페닐 세파로스 및 캡토 부착(capto adhere)을 포함하는 결합-용출 모드로 작동하는 다른 크로마토그래피 수지에서도 재조합 인자 II의 유사한 "활성화"가 달성될 수 있다.
마지막으로, 결합-용출 모드로 작동되는 페닐 세파로스 HP 수지(GE Healthcare) 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시하였다. 이 컬럼은 단편 I, 트롬빈, 잔류 오염원 숙주 세포 단백질 및 DNA를 제거하는 역할을 수행한다. 황산나트륨이 이액(lyotropic) 염으로 사용되고, 2부(parts)의 로드 조정 완충제(25 mM HEPES, 0.4 % 시트레이트, 1 M 황산나트륨, 1.86 M 염화나트륨, pH 6.5)를 3부의 폴리-PEI 용출물에 첨가함으로써 로드 제조를 실시한다. 페닐 세파로스 컬럼을 25 mM HEPES, 0.4 % 시트르산나트륨, 1.0 M 황산나트륨, pH 6.5에서 평형화시키고, 조정된 rhFII를 컬럼 상에 3-10 g/L 수지의 용량으로 로딩한다. 추후, 컬럼을 동일한 완충제로 세정한 다음, 25 mM HEPES, 0.4 % 시트르산나트륨, 0.75 M 황산나트륨, pH 6.5로 세척한다. 6 CV에 대해 25mM HEPES, 0.4 % 시트르산나트륨, pH 6.5로의 직선 구배로 용출을 실시한다. 소수성 상호작용 컬럼에서 용출된 재조합 인자 II를 투석여과 또는 당업자에게 공지된 다른 적당한 방법에 의해 회수하고, 농축하고, 제제화하여 최종의 정제된 재조합 인자 II 생성물을 얻는다.
트롬빈 스파이크(spike) 연구는 폴리PEI 상의 음이온 교환 크로마토그래피가 조제물 중 트롬빈 함량을 감소시키는데 유용함을 보여준다. 상업적으로 입수가능한 트롬빈(Enzyme Research Laboratories, HT 3564A; 3059 유닛/mg)을 폴리PEI 컬럼의 로드에 첨가하고, 컬럼 흐름통과(비-결합 분획), 세척 및 용출 분획에서의 트롬빈 함량을 측정하였다. 트롬빈 활성에 대해 발색 및 형광 분석 둘다를 사용하였다.
출발 물질은 Q 흐름통과 컬럼에서 회수되고 용매-세제로 처리된 재조합 인자 II였다. 56.67 g의 이 물질(2.8 mg/ml의 농도에서)을 1 ug의 트롬빈으로 스파이킹하고 폴리PEI 컬럼 상에 직접 로딩하고, 25mM HEPES, 0.5 M NaCl, 0.4 % 시트레이트, pH 6.5에서 평형화시켰다. 컬럼을 25mM HEPES, 1.04 M NaCl, 0.4 % 시트레이트, pH 6.5로 세척하고, 이후 12 컬럼 부피에 대해 1.86 M NaCl(동일 완충제에서)로의 직선 구배로 용출시켰다. 용출 피크를 모았다.
컬럼 로드에서, 트롬빈 함량은 (발색 분석을 사용하여) 70 ng/ml로 확인되었다. 용출 분획에서, 트롬빈 함량은 보다 민감한 형광 분석을 위한 정량 한계치 보다 낮은 것으로 확인되었다(< 1.876 ng/ml). 컬럼 세척 분획에서는 트롬빈이 검출되지 않았다. 트롬빈은 이 컬럼 (비-결합 분획)으로부터의 흐름통과에서만 검출될 수 있었으며, 3.6 ng/ml로 측정되었다. 이러한 결과 (및 반복된 실험에서 얻어진 데이터)는 공정에 사용된 완충제 조건하에, 트롬빈이 폴리PEI 컬럼에 결합하지 않고 매우 타이트하게 결합하는 재조합 인자 II로부터 분리됨을 시사한다.
실시예 5: 직선 구배 용출 모드에서 폴리PEI를 사용하여 IEC 프리피크 함량의 제어
재조합 인자 II에 대해 관찰된 이온 교환 크로마토그래피(IEC) 프리피크는 소위 "Gla-도메인"에서 10개의 글루타메이트 잔기의 카르복실화 정도를 나타낸다. 높은 IEC-프리피크는 카르복실화결손 글루타메이트 잔기 분자의 높은 비율을 나타내고, 보다 낮은 생물활성과 관련된다.
약음이온 교환 수지 폴리PEI 상에서의 직선 구배 용출은, 선택적으로 농축되고, 고도 카르복실화되고 고도 활성인 재조합 인자 II를 허용하고, 이는 언더카르복실화 단백질에 비해 구배에서 나중에 용출된다. 용출 동안, 분획을 모아 IEX HPLC로 분석한다. 높은 IEC 프리피크를 보이는 조기 용출 분획은 용출 풀에 모아지지 않는다.
컬럼 로드는 Q B&E 및 Q FT 크로마토그래피에 이은 용매-세제 처리 후의 단백질 조제물이었다. 이 재료에서 IEC 프리피크는 39.6 %로 확인되었다. 폴리PEI 수지를 25mM HEPES, 0.5 M NaCl, 0.4 % 시트레이트, pH 6.5로 평형화시켰다. 4.1 g의 재조합 인자 II (1.2 g/L의 농도)를 컬럼 상에(0.48 L의 CV) 140 cm/hr의 유동률로 로딩하였다. 컬럼을 동일한 완충제로 세정한 다음, 25mM HEPES, 1.04 M NaCl, 0.4 % 시트레이트, pH 6.5로 세척하고, 이어서 12 컬럼 부피에 대해 1.86 M NaCl로의 구배로 용출하였다. 구배 용출 동안, 0.5 CV (대략 250 ml)의 개개 부피를 갖는 분획을 모아 IEX HPLC로 분석하였다.
표 8은 개개 용출 분획에 대해 IEX HPLC로 측정한 프리피크 값을 보여준다.
IEC 프리피크 값
용출 분획 IEC 프리-피크
2 100 %
6 98.5 %
8 92.7 %
10 56 %
12 12.6 %
14 3.7 %
분획 8-18을 모아 24.9 %의 IEC 프리피크를 갖는 용출 풀을 생성하였다. A280 UV 흡광도로 측정한 단계수율은 55.3%였고, PTase 분석으로 측정한 수율은 78.5 % 였다.
실시예 6: 프로트롬빈 정제 공정의 스케일 업
실시예 1에 기재된 rhFII 정제 공정을 500 L 생물반응기를 정제하도록 스케일업하였다. 표 9는 500 L 정제로부터 얻어진 컬럼 성능 데이터를 요약하고 있다. 50 L 정제와 유사한 로딩을 유지하기 위해, 컬럼을 대략 10배 스케일링하였다.
500 L 정제로부터 얻어진 컬럼 성능의 요약
QFF B&E QFF FFT 폴리PEI 페닐 HP
컬럼 직경 (cm) 30 30 25 25
컬럼 부피 (L) 9.2 9.2 6.7 6.4
로딩된 총 단백질 (g/L; A280) - - 5.3 3.4
로딩된 생성물 (g/L; RP-HPLC) 6.4 3.5 - -
로딩된 활성 생성물(g/L) 3.1 2.6 4.8 2.7
총 단백질 수율 (%) - - 72.7 111.5
생성물 수율 (%) 54.8 88.6 - -
활성 생성물 수율 (%) 84.8 101.4 97.2 130.7
표 10은 공정 중간산물에서 불순물 수준을 보여준다. 앞서 기재한 50 L 정제와 마찬가지로, Q 세파로스 FF 흐름통과 컬럼 후의 감마-카르복실화 수준은 대략 33.5% HP-IEC 프리피크였고 이를 감마-카르복실화의 강화를 위해 폴리PEI 컬럼 상에 로딩하였다. 유사한 작동 조건 하에서 50 L 스케일 정제 및 벤치 스케일 정제에 대한 500 L 스케일 정제에서의 크로마토그래피 거동의 비교는 폴리PEI 상에서 매우 확고한 분리를 보여준다. 모든 스케일에서 복수의 조기 용출 종들이 관찰될 수 있지만; 각각의 조기 용출 종의 상대적인 양은 폴리PEI 컬럼 상에 로딩될 재료에 따라 달라진다. 표 10은 500 L 스케일 정제로부터 얻어진 개개 분획 및 모의 풀에 대한 HP-IEC 프리피크 수준을 요약한다. 보다 작은 스케일의 시험에서(50 L 및 벤치 스케일 시험), 보다 이른 분획을 함유하는 조기 용출 분획과 모의 풀은 보다 높은 수준의 프리피크를 가졌으며, 이는 보다 높은 수준의 감마-카르복실화 결손에 상응한다. 이러한 실험을 위해, 모의 풀 #2(분획 2-15)을 페닐 크로마토그래피로 이동시켰다.
대표적인 500 L 배치로부터 얻어진 공정 중간산물에 대한 불순물의 요약
CM QFF B&E 풀 QFF FFT 풀 PPEI 풀 페닐 풀 DS
총 단백질 (g/L)1 - 1.01 1.10 0.50 1.42 9.86
생성물 농도 (g/L)2 0.11 1.17 0.99 - - -
활성 생성물 농도 (g/L)3 0.053 0.872 0.645 0.392 1.305 9.036
HCP (ng/mg) - 3517 3173 <80 <28 <8
DNA (ng/mg) - 3.0 x 10-1 2.7 x 10-1 2.3 x 10-1 5.6 x 10-4 2.7 x 10-4
응집물 (%) - 1.2 1.5 0.9 0.1 0.2
IEC 프리피크 (%) - 32.6 33.5 22.9 20.9 17.0
트롬빈 (ng/mg) - 5.6 3.7 < 0.5 < 0.2 0.1
GLA 결손 0.61 - - - - 0.50
단편 (%) - - 1.1 0.9 0.5 0.4
시알산 (mol NANA/mol) - 3.4 1.8 1.6 1.6 2.0
CLOT 생물검정 (%) - - - - 84 94
CAT 생물검정 (%) - - - - 55 83
1 농도 (280 nm에서 흡광도).
2 농도 (RP-HPLC).
3 농도 (프로트롬비나제 분석).
표 12는 대표적인 50 L 및 500 L 배치의 생성물 품질을 요약한다. 최종 약물은 모든 공정 관련 불순물(HCP, DNA)과 모든 생성물 관련 불순물(응집물, 단편, 감마-카르복실화 변이형, 및 시알화된 변이형)에 대한 방출 규격을 충족하며 응고 생물검정에서 매우 활성인 생성물을 생성하였다.
대표적인 50 L 및 500 L 배치로부터 생성된 약물 재료의 요약
50L #1 50L #2 500L #3 500L #4
총 단백질 (g/L) 1 11.0 9.82 9.74 9.86
활성 생성물 농도 (g/L) 2 9.56 9.55 10.36 9.04
HCP (ng/mg) 4 4 8 <8
DNA (ng/mg) 2.4 x 10-3 3.7 x 10-2 9.7 x 10-4 2.7 x 10-4
응집물 (%) 0.3 0.2 0.1 0.2
IEC 프리피크 (%) 19.2 23.9 22.0 17.0
트롬빈 (ng/mg) < 0.2 0.1 0.3 0.1
GLA 결손 0.38 0.46 0.33 0.50
단편 (%) 1.4 0.4 0.4 0.4
시알산 (mol NANA/mol) 2.6 3.3 2.5 2.0
CLOT 생물검정 (%) 110 105 118 94
CAT 생물검정 (%) 108 121 121 83
1 농도 (280 nm에서 흡광도).
2 농도 (프로트롬비나제 분석)
실시예 7: 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 감마-카르복실화 변이형의 농축
폴리PEI 크로마토그래피에 대한 대안으로서, 하이드록시아파타이트에 대해 감마-카르복실화 종을 농축하는 능력을 조사하였다. 재조합 인자 II는 하이드록시아파타이트에 강하게 결합하고 증가된 염화나트륨을 사용하여, 심지어 최대 1M의 농도에서 조차 용출되지 않는다. 그러나, 포스페이트 이온 농도에 있어 증가는 하이드록시아파타이트 컬럼으로부터 재조합 인자 II를 성공적으로 용출시킬 수 있다. 표 11은 벤치 스케일 하이드록시아파타이트 시험을 요약한다.
모든 시험을 위한 로드 재료는 동일했고 37.9 % HP-IEC 프리피크를 포함했으며, 이는 보다 낮은 평균 수준의 감마-카르복실화를 갖는 재료에 상응한다. 포스페이트 구배로 용출된 세가지 모든 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 시험에서, 폴리PEI 크로마토그래피에서의 염화나트륨 구배에서의 재조합 인자 II의 거동과 마찬가지로 프런트 쇼울더가 관찰되었다. 시험들을 각각 분류하고 모의 풀을 제작하였다. 풀 1은 대부분 조기 용출 분획을 함유했지만, 풀 2는 대부분 주된 피크를 함유했다. 전체 용출 피크의 모의 풀도 제작하였다(모아진 풀 1 및 2). 풀의 샘플을 HP-IEC로 시험하여 HP-IEC 프리피크의 수준을 확인하였다.
표 11에 도시된 바와 같이, 조기 용출 분획을 함유하는 풀(조기/풀 #1 및 전체/풀 1 및 2)은 주된 풀(#2) 보다 높은 수준의 HP-IEC 프리 피크를 가졌다. 이는 폴리PEI 상에서 음이온 교환 크로마토그래피에서 이루어진 감마-카르복실화의 강화와 유사하다. 염화나트륨 구배에서 하전된 변이형의 분리가 일어나는 음이온 교환 크로마토그래피와 달리, 하이드록시아파타이트에서의 분리에 대한 염화나트륨의 효과는 덜 주목할만하다. 예를 들어, rhFII는 0.1 M 염화나트륨에 비해 1 M 염화나트륨의 존재하에 포스페이트 구배에서 보다 조기에 용출되지만; 주된 풀에서 유사한 피크 형성 및 HP-IEC 프리피크 수준에 기초했을 때 감마-카르복실화 변이형의 분리에 대한 영향은 무시할 정도이다. 이는 rhFII와 하이드록시아파타이트 간의 메카니즘 또는 상호작용이 다중-방식이고 약간의 이온성 상호작용을 포함함을 시사한다.
하이드록시아파타이트 상에서 감마-카르복실화 재조합 인자 II의 농축의 요약
실험 # [NaCl]
(M)		 [포스페이트]
구배 (mM)		 로딩
(g/L)		 구배 CV 층(bed) 높이
(cm)		 풀
조기 (1) 주된 (2) 전체 (1+2)
1 0.1 50-400 10 10 10 - 15.3 28.6
2 1.0 50-400 10 10 10 - 17.6 27.6
3 1.0 50-250 5 10 20 93.8 24.0 37.9
컬럼 로딩의 효과, 체류 시간, 및 포스페이트 구배 기울기를 또한 조사하였다. 이러한 측정을 위해, 로딩을 10 그램의 재조합 인자 II/L 수지에서 5 그램의 재조합 인자 II/L 수지로 감소시켰고, 체류 시간을 두배로 했으며(6분에서 12분), 포스페이트 기울기를 10 컬럼 부피에 대해 150 mM 포스페이트에 의해 감소시켰다. 이러한 조건하에, 보다 낮은 수준의 감마-카르복실화를 함유하는 조기 용출 쇼울더를 좀더 분해하였다. 나아가, 조기 용출 재료는 복수개의 쇼울더가 관찰된 사실에 기초하여 다양한 수준의 감마-카르복실화 결손를 포함하는 것으로 보였다. 이들 작동 조건 변화 중 어떠한 것이 증가된 분해를 담당하는지 불분명하지만, 가장 가능성있게는 각각의 변화가 개선된 분해를 증가시켰다.
특정 실시양태들이 본원에서 예시되고 기재되고 있지만, 청구범위는 기재되고 도시된 특정 형태 및 구성에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 명세서에는, 예시적인 실시양태들이 기재되어 있고, 특정 용어들이 사용되지만, 이들은 단지 일반적이고 설명적인 의미로 사용되고 제한적인 목적을 위한 것이 아니다. 상기 교시의 관점에서 실시양태들의 변경 및 개조가 가능하다. 따라서 실시양태들은 구체적으로 기재된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE LLC <120> METHODS FOR PROCESSING COAGULATION FACTORS <130> BLOOD-303WO1 <140> PCT/US2012/053319 <141> 2012-08-31 <150> 61/531,314 <151> 2011-09-06 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(7) <223> gamma-carboxyglutamic acid <400> 1 Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(10) <223> gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(16) <223> gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> gamma-carboxyglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> gamma-carboxyglutamic acid <400> 2 Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu 1 5 10 15 Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala 20 25 30 Lys <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Leu Ser Lys 1 <210> 5 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg 1 5 10 15 Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys 20 25 30 Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val 35 40 45 Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile 50 55 60 Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg 65 70 75 80 Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu 85 90 95 Lys <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Leu Glu Asp Lys 1 5 <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu 1 5 10 15 Gly Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe 20 25 30 Arg Lys <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys 20 25 30 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> N-glycosylation site N373 <400> 9 Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ile Ser Met Leu Glu Lys 1 5 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp 1 5 10 15 Ile Ala Leu Met Lys 20 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys 20 25 30 <210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp 1 5 10 15 Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys 20 25 <210> 15 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg 1 5 10 15 Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys 20 25 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys 1 5 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg 1 5 10 15 Pro Val Cys Lys 20 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Lys Pro Asp Glu Gly Lys 20 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys 1 5 10 15 <210> 21 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly 1 5 10 15 Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys 20 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Lys Trp Ile Gln Lys 1 5 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Trp Ile Gln Lys 1 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu 1 5

Claims (34)

  1. 재조합 응고 인자 단백질의 정제 방법으로서,
    a) 재조합 응고 인자 단백질을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 혼합물을 적어도 제1 컬럼을 통해 여과하여 제1 컬럼 생성물을 생성하는 단계;
    c) 제1 컬럼 생성물을 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 여과하여 PEI 컬럼 생성물을 생성하는 단계; 및
    d) 정제된 재조합 응고 인자 단백질을 회수하는 단계를 포함하고,
    정제된 재조합 응고 인자 단백질이 약 0.8/10, 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손(missing γ-carboxylated) 글루탐산 부위를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 응고 인자 단백질이 프로트롬빈(인자 II)인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혼합물이 생물반응기로부터의 여과된 혼합물인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, b)에서의 여과가 제1 음이온 교환 컬럼을 통한 여과를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 음이온 교환 컬럼을 통한 여과가 결합 및 용출 여과를 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, b)에서의 여과가 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 제2 음이온 교환 컬럼을 통해 여과하여 제2 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제2 음이온 교환 컬럼을 통한 여과가 흐름통과(flowthrough) 여과를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, c)에서의 여과 이전에 제1 컬럼 생성물 및/또는 제2 컬럼 생성물을 용매/세제 불활성화로 불활성화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, c)에서 폴리(에틸렌이민) 컬럼을 통한 제1 컬럼 생성물의 여과가 결합 및 용출 여과를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, PEI 컬럼 생성물을 소수성 상호작용 컬럼(hydrophobic interaction column; HIC)을 통해 여과하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, PEI 컬럼 생성물의 여과가 결합 및 용출 여과를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, d)에서의 회수 이전에 나노여과 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 제2항에 있어서, 재조합 프로트롬빈 단백질이 실질적으로 트롬빈이 없는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 재조합 응고 인자 단백질이 약 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하는 것인 방법.
  15. 재조합 응고 인자 단백질을 정제하는 방법으로서,
    a) 재조합 응고 인자 단백질을 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 혼합물을 적어도 제1 음이온 교환 컬럼을 통해 여과하여 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성하는 단계;
    c) 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 용매/세제 바이러스 불활성화로 불활성화시켜 불활성화된 혼합물을 생성하는 단계;
    d) 불활성화된 혼합물을 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 여과하여 PEI 컬럼 생성물을 생성하는 단계;
    e) PEI 컬럼 생성물을 소수성 상호작용 컬럼(HIC)을 통해 여과하여 소수성 상호작용 컬럼(HIC) 생성물을 생성하는 단계;
    f) HIC 생성물을 여과하는 단계; 및
    g) 정제된 재조합 응고 인자 단백질을 회수하는 단계를 포함하고,
    정제된 재조합 응고 인자 단백질이 약 0.8/10, 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 재조합 응고 인자 단백질이 프로트롬빈(인자 II)인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 혼합물이 생물반응기로부터의 여과된 혼합물인 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, b)에서 적어도 제1 음이온 교환 컬럼을 통한 여과가 결합 및 용출 여과를 포함하는 것인 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, b)에서의 여과가 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 제2 음이온 교환 컬럼을 통해 여과하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 제2 음이온 교환 컬럼을 통한 여과가 흐름통과 여과를 포함하는 것인 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, d)에서의 여과가 결합 및 용출 여과를 포함하는 것인 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, e)에서의 여과가 결합 및 용출 여과를 포함하는 것인 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, f)에서의 여과가 나노여과를 포함하는 것인 방법.
  24. 제16항에 있어서, 재조합 프로트롬빈 단백질이 실질적으로 트롬빈이 없는 것인 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 재조합 응고 인자 단백질이 약 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하는 것인 방법.
  26. 재조합 프로트롬빈(인자 II) 단백질을 정제하는 방법으로서,
    a) 재조합 프로트롬빈 단백질을 포함하는 생물반응기로부터 여과된 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 혼합물을 제1 음이온 교환 컬럼을 통해 결합 및 용출 여과하여 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성하는 단계;
    c) 제1 음이온 교환 컬럼 생성물을 제2 음이온 교환 컬럼을 통해 흐름통과 여과하여 제2 음이온 교환 컬럼 생성물을 생성하는 단계;
    d) 제2 음이온 교환 컬럼 생성물을 용매/세제 바이러스 불활성화로 불활성화시켜 불활성화된 혼합물을 생성하는 단계;
    e) 불활성화된 혼합물을 폴리(에틸렌이민)(PEI) 컬럼을 통해 결합 및 용출 여과하여 PEI 컬럼 생성물을 생성하는 단계;
    f) PEI 컬럼 생성물을 소수성 상호작용 컬럼(HIC)을 통해 결합 및 용출 여과하여 HIC 생성물을 생성하는 단계;
    g) HIC 생성물을 나노여과 하는 단계; 및
    h) 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질을 회수하는 단계를 포함하고,
    정제된 재조합 프로트롬빈 단백질(인자 II)이 약 0.8/10, 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 재조합 프로트롬빈 단백질이 실질적으로 트롬빈이 없는 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 정제된 재조합 응고 인자가 약 0.7/10, 0.6/10, 0.5/10 또는 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하는 것인 방법.
  29. 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하고 실질적으로 트롬빈이 없는 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질(인자 II).
  30. 제29항에 있어서, 약 0.4/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하는 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 응고 분석에서 약 70%를 초과하는 생물활성(bioactivity)을 나타내는 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 보정된 자동화 트롬보그램(calibrated automated thrombogram; CAT) 분석에서 약 70%를 초과하는 생물활성을 나타내는 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2 ng/ml 미만의 트롬빈을 포함하는 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질.
  34. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 약 0.5/10 미만의 γ-카르복실화결손 글루탐산 부위를 포함하고 실질적으로 트롬빈이 없는 정제된 재조합 프로트롬빈 단백질(인자 II).
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