CN101838304B - 扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法，包括以下步骤：(a)将融化后的冰冻血浆采用冷冻式连续流离心机分离出冷沉淀，收集上清液为原料；(b)扩张床先用缓冲液A进行稳定扩张，所述的缓冲液A为pH7.0的0.05mol/L1tris-柠檬酸；(c)扩张床达稳定平衡后，迅速切换为原料液，待穿透点达5～10％时，停止进料并迅速切换为缓冲液A在扩张模式下进行洗涤；(d)洗涤结束后切换为缓冲液为0.4mol/LNaCl和1.6mol/L NaCl在固定床模式下进行梯度洗脱，收集缓冲液为1.6molNaCl的蛋白洗脱峰，得凝血酶原复合物粗品。

Description

扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体是指一种采用新型扩张床吸附分离技术分离制备人凝血酶原复合物的方法。

背景技术

扩张床吸附分离技术是英国剑桥大学Chase教授1992年首先提出，它是利用吸附剂本身的物理性质，通过仔细设计流化床装置，来得到稳定的、返混很小的流化床，即扩张床(expanded bed)。随后的研究表明，扩张床吸附层析可直接从原料液中吸附并初步纯化目标蛋白，它把澄清、浓缩和初步纯化几个步骤集成于一个单元操作中，减少了操作步骤，提高了产品收率，减少了纯化费用和资本投入，因此McCormick称扩张床是近几十年来出现的第一个新的单元操作。作为一个新的单元操作，扩张床吸附层析技术综合了流化床和填充床的优点，同时克服了流化床和填充床自身的一些缺陷。扩张床的操作方式与填充床不同，料液是从扩张床的底部泵入，利用流体从下向上流动产生的速度和浮力，床内的吸附剂不同程度地向上浮动而引起扩张，当吸附剂颗粒的沉降速度与流体向上的流速相等时，扩张床达到平衡。此时由于吸附剂的扩张，吸附剂之间空隙率增大，足以让料液中的细胞、细胞碎片等固体颗粒顺利通过床层，达到除去这些颗粒的目的。由于扩张床吸附剂粒径有一分布，在扩张过程中会分层，粒径大的吸附剂在扩张床的底部，而粒径小则在床层的上部，这样，与传统的流化床相比，扩张床内的填料层处于相对稳定，床内返混小，所以料液中的目标蛋白基本上按填充床的模式被吸附在吸附剂上。

凝血酶原复合物(Prothrombin Complex Concentrate，PCC)是从健康人混合血浆中分离制备的一种主要含有凝血因子II、VII、IX、X的血浆蛋白制品，含量以IX的剂量为准，于20世纪50年代后期开始制备并用于临床，广泛用于治疗乙型血友病、因肝疾患引起的凝血功能异常和各种由于II、VII、IX、X因子水平低下而致出血。我国是肝炎病人的大国，近几年对PCC制剂有着比较大的用量需求。目前PCC的制备主要是采用进口DEAE Sephadex A50凝胶树脂，利用罐式批量吸附，将吸附后的凝胶转移到固定床上进行洗涤、洗脱，收集洗脱峰得到PCC粗品。该制备工艺存在操作麻烦，工序多，凝胶损耗大，生产成本高，并且存在开敞式操作，有交叉污染风险影响制品质量等缺点。

采用扩张床吸附分离目标蛋白的应用已初见成效，在基因工程发酵产物目标蛋白的分离提取已达生产规模，但在血浆蛋白的分离提取中还未见研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法，将新型单元化的扩张床吸附分离技术引入血浆蛋白的分离过程，特别是用于PCC的吸附分离，简化了PCC的制备工艺，开发出高效的可自动化、管道化操作的扩张床吸附分离PCC替代传统的批式吸附分离PCC的工艺。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法，包括以下步骤：

(a)将融化后的冰冻血浆采用冷冻式连续流离心机分离出冷沉淀或将从血浆蛋白中分离出来的含有凝血因子的第三组分沉淀溶解液采用冷冻式连续流离心机分离出硅藻土，收集上清液为原料液备装有吸附树脂的扩张床装置使用；

(b)扩张床先用缓冲液A进行稳定扩张，扩张率为2倍，流速为350cm/h，平衡时间为20～30min，所述的缓冲液A为PH值均为7.0的0.05mol/L tris-柠檬酸、0.01mol/L柠檬酸-NaOH或0.01mol/L tris-HCl中的任一种，蛋白活性保护剂浓度为0.06mol/L的溶液，所述蛋白活性保护剂为蔗糖、甘露醇或甘氨酸中的任一种；

(c)扩张床达稳定平衡后，迅速切换为步骤(a)制得的原料液，待穿透点达5～10％时，停止进料并迅速切换为缓冲液A在扩张模式下进行洗涤，洗涤液的量为4～6倍柱体积；

(d)洗涤结束后切换为缓冲液B1和B2在固定床模式下进行梯度洗脱，洗脱液的量为2～3倍柱体积，收集洗脱液得初步纯化的凝血酶原复合物蛋白溶液，所述缓冲液B1为0.4mol/LNaCl溶液，缓冲液B2为1.6mol/LNaCl溶液，收集缓冲液B2的蛋白洗脱峰，得凝血酶原复合物粗品。

连续循环操作上述步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)五个循环后，进行一次吸附树脂的再生处理，所述吸附树脂的再生处理包括下列步骤：(a)采用固定床方式，使用2mol/LNaCl溶液清洗树脂直至流出液无蛋白；(b)然后用1mol/L HCl溶液采用扩张床法用约300cm/h的流速处理2h；(c)再用1mol/L NaOH溶液采用扩张床法用约300cm/h的流速处理2h；(d)最后用纯水洗涤树脂，待流出液用酚酞试剂检测为微红色时停止洗涤。

进一步的，所述的步骤(a)中的原料液为去冷沉淀的上清血浆。

在进行所述步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)时，吸附剂的界面与扩张床上部集液头的距离为5～10mm。

为了更大程度的降低成本，所述的步骤(b)中扩张床内采用的吸附树脂为EBA-CG6。

其中，所述EBA-CG6树脂的参数表如下：

平均孔径(nm)	微孔比率(％)	微孔的比表面积m2/g(干重)	微孔体积m3/g(干重)	含水量(％)
					153.57	43.51	34.659	0.0678	43
湿密度g/ml	离子交换量mmol/g(湿重)	粒径分布μm	体积平均粒径μm	表面积平均粒径μm
					1.3	3～4	63～400	165.89	46.335

综上，本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明引入近些年来被誉为集成单元的扩张床吸附分离技术用于分离血浆中的微量高价值的具备临床应用价值的PCC，从根本上客服了传统的PCC制备工艺所存在的缺陷。通过吸附介质的优选和操作条件的优化，使扩张床内吸附树脂稳定扩张返混较小，如图2、图3所示，实验测得的优选出的EBA-CG6树脂的轴向混合系数均为10^-6数量级，其理论塔板数均高于20，说明EBA-CG6在扩张床中能稳定扩张，流体的流动接近于活塞流，能达到较好的吸附分离效果，从而实现PCC的高效吸附分离。本发明可以通过多柱并联的方式实现自动化连续操作，将传统的批式吸附改变为连续生产过程，提高了生产能力、减少了树脂的损失、降低了生产成本，整个分离过程更加符合GMP的要求。

表1扩张床吸附一步分离PCC的实验结果

序号	物料	上样量(ml)	洗脱量(ml)	FIX比活性(IU/mg)	纯化因子	FIX回收率(％)
							1	冷冻血浆	765	147	1.385	115	70.4
2	冷冻血浆	800	185	1.023	85	71.6
							3	FIII冷沉淀	1250	145	0.537	40	53.4

附图说明

图1为本发明的扩张床吸附分离PCC的生产工艺流程。

图2～3为本发明所采用EBA-CG6吸附树脂与DEAE-Streamline吸附凝胶的扩张性能比较，其中图2为不同流速下的轴向混合系数，该图中横坐标为流速，竖坐标为轴向混合系数；图3为不同流速下的扩张率，该图中横坐标为流速，竖坐标为扩张率。

图4为本发明的PCC的扩张床吸附穿透曲线，该图中横坐标为时间，竖坐标为PCC的扩张床吸附穿透情况。

图5为本发明的PCC洗脱二级阶跃洗脱层析图谱，该图中横坐标为时间，竖坐标为PCC洗脱二级阶跃洗脱层析情况。

具体实施方式

下面结合实施例及附图，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

血浆原料的制备：

取两袋血浆(每袋600mL)，将冰冻袋装血浆放入23℃的水浴中，20min后血浆融化；将融化后的血浆分装于四个离心杯中，放入BECKMAN J2-HS型高速冷冻离心机中，9000rpm、温度2℃下离心20min；倒出离心杯中的上清血浆装于塑料瓶中。

实施例2

如图1所示，本发明提供的扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法工艺流程如下：

(1)取出冰冻血浆，用常温注射用水清洗血浆袋的外表面，并用70％的乙醇溶液进行消毒，消毒后再用常温注射用水冲洗。采用人工或机械破袋，将血浆倒入融浆罐，夹套通入37℃的热水，待血浆完全融化后并控制血浆的温度为2℃±0.5℃。用转子泵或隔膜泵将血浆输入连续流离心机分离出冷沉淀，收集上清血浆。冰冻血浆系采用单采浆机从合格献血浆者的身体采集，并立即放入-25～-30℃的速冻冰箱中冻存。

若以组分III沉淀为原料，则将组分III沉淀在密闭罐中用低温注射用水溶解，温度控制在2℃±0.5℃，用转子泵或隔膜泵将蛋白溶液输入连续流离心机分离出硅藻土等杂质，收集上清蛋白溶液；组份III沉淀来自于采用低温乙醇法生产血制产品的企业，为分离组份II后的沉淀。

上述原料中：

组分I沉淀为：采用Cohn氏低温乙醇法分离血浆蛋白过程中产生的组分一沉淀，该组分沉淀中主要含纤维蛋白原成分；

组分II沉淀为：采用Cohn氏低温乙醇法分离血浆蛋白过程中产生的组分二沉淀，该组分沉淀中主要含丙种球蛋白(IgG)；

组分III沉淀为：采用Cohn氏低温乙醇法分离血浆蛋白过程中产生的组分三沉淀，该组分沉淀中含有部分人凝血因子(PCC)；

组分IV沉淀为：采用Cohn氏低温乙醇法分离血浆蛋白过程中产生的组分四沉淀，该组分沉淀中含有部分抗胰蛋白酶；

组分V沉淀为：采用Cohn氏低温乙醇法分离血浆蛋白过程中产生的组分五沉淀，该组分沉淀中主要含白蛋白。

(2)用缓冲液A平衡扩张床中的EBA-CG6树脂，树脂的装填高度为15cm±0.5cm。采用250～300cm/h流速稳定扩张20～30min，所采用的树脂为高分子合成吸附树脂EBA-CG6，也可以采用GE公司生产的StreamlineDEAE扩张床凝胶，图3～4为本发明所采用EBA-CG6吸附树脂与GE公司提供的Streamline DEAE吸附凝胶的扩张性能比较，由此可见采用EBA-CG6更利于降低生产成本。

(3)用蠕动泵将步骤(1)准备好的上清血浆或上清蛋白溶液输送到已稳定的扩张床中进行目标蛋白的吸附，待穿透点达到5～10％时，停止进料。切换为缓冲液A进行洗涤，洗涤液的量为4～6倍柱体积，直至目标物检测基线趋于恒定。步骤(2)、(3)中流速以床层扩张率为操作控制参数，优选平衡、吸附、和洗涤过程中床层扩张率保持为1.5。

(4)洗涤结束后切换阀门，让树脂自然沉降后排空扩张床内缓冲液A。将进液方式由下进液切换为上进液，用蠕动泵输入缓冲液B1和B2在固定床模式下进行目标蛋白的梯度洗脱，洗脱液的量为2～3倍柱体积，收集洗脱液得初步纯化的PCC蛋白溶液。缓冲液B1为0.4mol/L NaCl，B2为1.6mol/LNaCl溶液，收集缓冲液B2的蛋白洗脱峰得PCC粗品。

洗脱方式采用固定床模式的梯度洗脱，即步骤(3)完成后，让树脂自然沉降，排空缓冲液A，将上分布头降到树脂表面上2～5mm，首先由柱子上部加入缓冲液B1，当第一个峰回到基线时由柱子上部加入缓冲液B2，收集该洗脱峰得PCC粗品。经检测第一个洗脱峰中IX的比活性仅为0.112～0.211IU/mg，第二个洗脱峰的IX的比活性为1.023～1.385IU/mg，IX的回收率为70.4～71.6％。

(5)操作过程中，保持吸附剂的界面与扩张床上部集液头的距离为5～10mm。连续循环操作5个循环后，进行一次吸附剂的再生处理。首先采用固定床方式，使用2mol/L NaCl溶液清洗树脂直至流出液无蛋白，然后用1mol/L HCl溶液采用扩张床法用约300cm/h的流速处理2h，再用1mol/L NaOH溶液采用扩张床法用约300cm/h的流速处理2h，最后用纯水洗涤树脂直至流出液用酚酞试剂检测为微红色为止，具体检测终点的判断标准与水质有关，以无NaOH残留在树脂上为准。

(6)扩张床不使用时，采用1～2％的NaOH溶液循环清洗吸附剂30min，用无热源的纯水和注射用水分别清洗5倍柱体积后，再用1～2％的NaOH溶液装满扩张床和管路，关闭管路中的阀门。

实施例3

如图4、图5所示，扩张床吸附分离PCC的吸附及阶跃式洗脱纯化中优化的洗脱条件：

将称量好EBA-CG6吸附树脂96g装入扩张床柱(100cm×25mmI.D.)，先用缓冲液A平衡，扩张率控制为1.5，待扩张床稳定20min后，迅速将进料液切换为实施案例1准备好的血浆；先检测血浆在A280下的吸收值，流出柱子的血浆用紫外分光光度计连续监测，当出口A280吸收值基本恒定时停止上样，用平衡缓冲液A在扩张床模式下冲洗至UV信号回到基线为止，冲洗液体积为6倍柱体积；待树脂充分沉降到柱子下部，将上分布头下降到树脂顶面，首先用缓冲液B1进行洗脱，洗脱液体积为2倍柱体积；待洗脱液峰回到基点并趋于稳定后用缓冲液B2进行洗脱，洗脱液体积为2倍柱体积。收集第二个洗脱峰的洗脱液，检测IX比活为1.385IU/mg，纯化因子达115倍，IX的回收率为70.4％。

使用本发明提供的PCC吸附分离方法，操作简便，处理量大，IX回收率高(传统批式吸附法为55％)，可实现管道化和自动化，能连续生产，操作过程满足GMP的要求，是较传统工艺更为先进的PCC生产工艺。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将融化后的冰冻血浆采用冷冻式连续流离心机分离出冷沉淀或将从血浆蛋白中分离出来的含有凝血因子的第三组分沉淀溶解液采用冷冻式连续流离心机分离出硅藻土，收集上清液为原料液备装有吸附树脂的扩张床装置使用；

(b)扩张床先用缓冲液A进行稳定扩张，扩张率为2倍，流速为350cm/h，平衡时间为20～30min，所述的缓冲液A为PH值均为7.0的0.05mol/L tris-柠檬酸、0.01mol/L柠檬酸-NaOH或0.01mol/L tris-HCl中的任一种，在加入缓冲液A的同时加入蛋白活性保护剂，所述蛋白活性保护剂为浓度0.06mol/L的溶液，所述蛋白活性保护剂为蔗糖、甘露醇或甘氨酸中的任一种，扩张床内采用的吸附树脂为EBA-CG6，所述EBA-CG6树脂的参数表如下：

(c)扩张床达稳定平衡后，迅速切换为步骤(a)制得的原料液，待穿透点达5～10％时，停止进料并迅速切换为缓冲液A在扩张模式下进行洗涤，洗涤液的量为4～6倍柱体积；

(d)洗涤结束后切换为缓冲液B1和B2在固定床模式下进行梯度洗脱，洗脱液的量为2～3倍柱体积，收集洗脱液得初步纯化的凝血酶原复合物蛋白溶液，所述缓冲液B1为0.4mol/L NaCl溶液，缓冲液B2为1.6mol/L NaCl溶液，收集缓冲液B2的蛋白洗脱峰，得凝血酶原复合物粗品；

在进行所述步骤(b)、步骤(c)时，吸附剂的界面与扩张床上部集液头的距离为5～10mm。

2.根据权利要求1所述的扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法，其特征在于，连续循环操作步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)五个循环后，进行一次吸附树脂的再生处理。

3.根据权利要求2所述的扩张床吸附分离人凝血酶复合物的方法，其特征在于，所述吸附树脂的再生处理包括下列步骤：

(a)采用固定床方式，使用2mol/L NaCl溶液清洗树脂直至流出液无蛋白；

(b)然后用1mol/L HCl溶液采用扩张床法用约300cm/h的流速处理2h；

(c)再用1mol/L NaOH溶液采用扩张床法用约300cm/h的流速处理2h；

(d)最后用纯水洗涤树脂，待流出液用酚酞试剂检测为微红色时停止洗涤。

4.根据权利要求1所述的扩张床吸附分离人凝血酶原复合物的方法，其特征在于，所述的步骤(a)中的原料液为去冷沉淀的上清血浆。

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