CN114832439A - 一种自动控制连续层析上样载量的方法和层析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体纯化技术领域，具体而言，涉及一种自动控制连续层析上样载量的方法和层析方法。所述自动控制连续层析上样载量的方法包括如下步骤：将样品上样至层析装置的层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值平稳时，记录该紫外吸收值作为基准值；继续检测所述流穿液的紫外吸收值，当所述紫外吸收值与所述基准值的差值大于5mAu时，切换所述层析柱。通过检测并观察流穿液的紫外吸收值的变化来自动控制单根层析柱的上样量，该方法具有大幅提高填料的载量利用率、降低缓冲液消耗、提升生产率、操作简单和降低生产成本等优点。
Description
技术领域
本发明涉及抗体纯化技术领域，具体而言，涉及一种自动控制连续层析上样载量的方法和层析方法。
背景技术
随着生物制药行业近年来的中高速发展，生产工艺也出现了一些颠覆性的变化。尤其是上游细胞培养中采用了灌流培养技术，极大地提高了上游的生产率。随着上游生产率的提高，很多下游的新技术也被开发出来，以匹配上游的高生产率。其中，多柱连续流捕获是一项关键的技术。该技术可以很好地提高生产率，降低生产成本。但是，该技术也存在着设备投入高、操作及技术原理复杂、层析柱压力高等问题。
通常在捕获层析中，由于上样产品的滴度准确度以及层析柱的差异，导致不能将层析柱上样至满载，以确保可以获得比较高的收率。在常规操作过程中，工艺人员会设置80％～90％的安全系数来降低这些差异产生的影响。
但是，这种方法不能完全的利用填料的载量，导致一定的浪费，同时成本也会很高。并且，这种方法需要提前检测上样液的滴度，以计算上样体积，因此这种方法的操作会比较复杂，同时等待检测结果的时间也比较长。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种自动控制连续层析上样载量的方法，通过检测并观察流穿液的紫外吸收值的变化来自动控制单根层析柱的上样量，该方法具有大幅提高填料的载量利用率、降低缓冲液消耗、提升生产率、操作简单和降低生产成本等优点。
本发明的第二目的在于提供一种层析方法，该方法具有简单、易操作、高载量、高生产率以及低成本等优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种自动控制连续层析上样载量的方法，包括如下步骤：
将样品上样至层析装置的层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值平稳时，记录该紫外吸收值作为基准值。
继续检测所述流穿液的紫外吸收值，当所述紫外吸收值与所述基准值的差值大于5mAu(包括但不限于6mAu、7mAu、8mAu、9mAu、10mAu、13mAu、15mAu、18mAu、20mAu、22mAu、25mAu、28mAu、30mAu、35mAu、40mAu、45mAu、50mAu、55mAu、60mAu、65mAu、70mAu、75mAu、80mAu、85mAu、90mAu、95mAu、98mAu、99mAu、100mAu中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值)时，切换所述层析柱。
本发明通过检测并观察流穿液的紫外吸收值的变化，来自动控制单根层析柱的上样量，该方法能够提高填料的载量利用率，降低缓冲液消耗。并且，该方法还具有生产效率高、工艺简单、易操作、省时省力和大幅降低生产成本等优点。
本发明采用柱后的层析柱的紫外吸收值的变化来自动控制单根层析柱的上样体积，其原理如下：样品在初始上样时，产品会结合层析柱，而杂质会流穿。流穿的杂质会在柱后有一定的紫外吸收值，这个紫外吸收值稳定时为初始的基线，如图1所示。当样品上样过多时，层析柱的结合载量达到上限，样品开始穿透。由于样品在开始穿透时，并不是完全穿透，仍有大部分蛋白结合在层析柱上。因此在当样品开始穿透时结束上样，其收率损失非常小。因此，我们通过检测紫外吸收值相对于基线的升高值，可以自动控制上样体积。
在本发明一些具体的实施方式中，可以采用自动上样层析的设备，设定当所述紫外吸收值与所述基准值的差值大于5mAu时，自动切换所述层析柱，这样能够达到全自动化上样的目的。
优选地，当所述紫外吸收值与所述基准值的差值为5mAu～100mAu(包括但不限于6mAu、7mAu、8mAu、9mAu、10mAu、13mAu、15mAu、18mAu、20mAu、22mAu、25mAu、28mAu、30mAu、35mAu、40mAu、45mAu、50mAu、55mAu、60mAu、65mAu、70mAu、75mAu、80mAu、85mAu、90mAu、95mAu、98mAu、99mAu、100mAu中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值)时，切换所述层析柱。
优选地，将样品上样到层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值的波动范围小于5mAu(包括但不限于4.9mAu、4.7mAu、4.5mAu、4.3mAu、4.1mAu、4mAu、3.8mAu、3.5mAu、3.2mAu、3mAu、2.8mAu、2.5mAu、2.3mAu、2mAu、1.5mAu、1mAu、0.5mAu、0.3mAu、0.1mAu中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值)时，记录该紫外吸收值作为基准值。
其中，波动范围是指因波动而形成的波峰与波谷间的差值。
所述紫外吸收值的波动范围小于5mAu(包括但不限于4mAu、3mAu、2mAu、1mAu、0.5mAu中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值)时，即可认为紫外吸收值达到平稳状态。
优选地，将样品上样到层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值的波动范围小于4mAu时，记录该紫外吸收值作为基准值。
优选地，将样品上样到层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值的波动范围小于3mAu时，记录该紫外吸收值作为基准值。
优选地，所述层析柱的柱高≥15cm；包括但不限于16cm、17cm、18cm、19cm、20cm、21cm、22cm、23cm、24cm、25cm中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值。
优选地，所述层析柱的柱高≥20cm。包括但不限于20cm、21cm、22cm、23cm、24cm、25cm、26cm、27cm、28cm、29cm、30cm中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值。
优选地，每根所述层析柱的保留时间≥4min；包括但不限于5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值。
优选地，每根所述层析柱的保留时间为4～10min，包括但不限于4.5min、5min、6min、7min、8min、9min中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值。
优选地，所述上样载量≥50g/L；包括但不限于51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L、73g/L、75g/L、78g/L、80g/L中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值。
优选地，所述上样载量≥60g/L，包括但不限于60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L、73g/L、75g/L、78g/L、80g/L中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值。
优选地，所述层析装置包括至少两个(包括但不限于三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个和十个中的任意一者的点值或任意两者之间的范围值)层析柱，且至少两个所述层析柱并联运行。
优选地，至少两个所述层析柱切换上样，实现对样品的不间断连续上样。
为了实现连续化生产衔接，需要连续化上样。因此，本发明将至少2根层析柱进行切换上样，如图2所示，当采用两个层析柱进行切换上样时，层析柱1在上样，层析柱2在进行洗脱平衡等操作。当层析柱1上样结束后，层析柱2已经完成了洗脱平衡等操作，此时切换成层析柱2开始上样，层析柱1开始洗脱平衡。这样循环，即可实现全连续自动化上样。
在现有技术中，对于多柱串联层析系统，由于两柱串联上样，会有一些压力的问题，因此层析柱不能装的很高(一般<10cm)；同时，为了增加生产率，需要降低保留时间(2分钟左右)。但是，这样就无法获得更高的载量。而本发明通过采用至少两根层析柱并联运行，并采用上样的层析柱之后的紫外吸收值的变化来控制单根层析的上样体积，能够实现采用更高的层析柱、更多的保留时间，以获得更高的载量。
优选地，所述层析装置包括至少三个层析柱。
在本发明一些具体的实施方式中，所述层析柱中所用的填料包括MabselectPrismA、Mabselect Sure、Mabselect SureLX、Praesto Jetted A50、Eshmuno A、UnimabPro和MabPurix中的至少一种。
本发明提供的自动控制连续层析上样载量的方法，可以采用两根层析柱，或三根层析柱，甚至更多层析柱用于切换。该方法基于层析柱之后的吸收值的变化来控制上样量能够达到全自动化上样控制的目的，并且多柱连续流捕获具有高生产率，低生产成本的优点。
本发明还提供了一种层析方法，包括如上所述的自动控制连续层析上样载量的方法。
该层析方法具有简单、易操作、高载量、高生产率以及低成本等优点。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过检测并观察流穿液的紫外吸收值的变化，来自动控制单根层析柱的上样量，不仅能够提高填料的载量利用率、降低缓冲液消耗，而且该方法具有生产效率高、工艺简单、易操作、省时省力和大幅降低生产成本等优点。
(2)本发明通过检测紫外吸收值和基准值的差值，并通过采用至少两根层析柱并联运行，在实现多柱连续流捕获以提高生产效率和降低成本的同时，获得更高的载量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的自动控制连续层析上样载量的方法的原理示意图；
图2为本发明提供的采用两个层析柱进行切换上样的操作示意图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
图1为本发明提供的自动控制连续层析上样载量的方法的原理示意图；图2为本发明提供的采用两个层析柱进行切换上样的操作示意图。
本发明以下各实施例和各对比例中的单位“M”是指mol/L。
实施例1
该实施例为一个双特异性抗体项目。上游细胞培养采用灌流的方式进行。收获的产品滴度在1.0～1.5g/L之间。采用Cytiva公司的Mabselect PrismA填料进行捕获层析。采用两根直径均为2.2cm(默克
L Laboratory Column VL 22x 250)、柱高均为15cm的层析柱并联运行进行捕获层析，在层析柱1进行上样时，层析柱2在进行非上样步骤(包括消毒，平衡，冲洗，洗脱和再生等)，在自动检测到上样终点后，两个层析柱的角色互换。层析设备采用Cytiva公司的AKTA PCC75运行。其中，捕获层析的具体流程如下表1所示。
表1捕获层析的具体流程
杂质流穿的基线为1mm光程下1.5AU。保留时间为4分钟。层析设备的程序设置紫外增加至1.51AU时切换上样层析柱(即，当紫外吸收值与基准值的差值为10mAu时切换层析柱)。
实际上样载量为69g/L。整个程序运行22小时，共运行6个循环，共处理22克蛋白，总收率为93％。
实施例2
该实施例为一个单抗项目。上游细胞培养采用批次培养的方式进行。收获的产品滴度在4.0g/L左右。采用漂莱特公司的Praesto Jetted A50填料进行捕获层析。采用三根直径均为1.5cm、柱高均为20cm的层析柱并联运行进行捕获层析。层析设备采用Cytiva公司的AKTA PCC75运行。其中，捕获层析的具体流程如下表2所示。
表2捕获层析的具体流程
杂质流穿的基线为1mm光程下1.2AU。平衡和洗脱等共运行28个柱体积，保留时间为4分钟。程序设置紫外增加至1.23AU时切换上样层析柱(即，当紫外吸收值与基准值的差值为30mAu时切换层析柱)。
实际上样载量为77g/L。整个程序运行17小时，共运行10个循环，共处理25克蛋白，总收率为92％。
实施例3
该实施例为一个单抗项目。上游细胞培养采用高密度批次培养的方式进行。收获的产品滴度在6.0g/L左右。采用Cytiva公司的Mabselect SureLX填料进行捕获层析。采用三根直径均为1.5cm、柱高均为20cm的层析柱(迪贝
EZ Columns 15x 250)并联运行进行捕获层析。层析设备采用Cytiva公司的AKTA PCC75运行。其中，捕获层析的具体流程如下表3所示。
表3捕获层析的具体流程
杂质流穿的基线为1mm光程下1.5AU。平衡和洗脱等共运行28个柱体积，保留时间为6分钟。程序设置紫外增加至1.55AU时切换上样层析柱(即，当紫外吸收值与基准值的差值为50mAu时切换层析柱)。
实际上样载量为65g/L。整个程序运行17小时，共运行12个循环，共处理25克蛋白，总收率为91％。
对比例1
该对比例为一个双特异性抗体项目。上游细胞培养采用灌流的方式进行。收获的产品滴度在1.0～1.5g/L之间。采用Cytiva公司的Mabselect PrismA填料进行捕获层析。采用一根直径为2.2cm(默克
L Laboratory Column VL 22x 250)、柱高为15cm的层析柱进行捕获层析，手动检测产品滴度，并手动计算上样量。层析设备采用Cytiva公司的AKTA Pure 150运行。其中，捕获层析的具体流程如下表4所示。
表4捕获层析的具体流程
其中，保留时间为4分钟。基于预先设定的固定体积结束上样步骤。
实际上样载量为50g/L，在所有的步骤(包括消毒，平衡，上样，冲洗，洗脱和再生)都运行完之后，重复运行下一个循环。
整个程序运行25小时，共运行6个循环，共处理17克蛋白，总收率为96％。
通过比较实施例1和对比例1可以看出，本发明通过检测并观察流穿液的紫外吸收值的变化自动控制单根层析柱的上样量，能够提高填料的载量利用率，降低缓冲液消耗。该方法具有生产效率高、工艺简单、易操作、省时省力和大幅降低生产成本等优点。
并且，收率损失也在可接受范围内。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。
Claims (10)
1.一种自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将样品上样至层析装置的层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值平稳时，记录该紫外吸收值作为基准值；
继续检测所述流穿液的紫外吸收值，当所述紫外吸收值与所述基准值的差值大于5mAu时，切换所述层析柱。
2.根据权利要求1所述的自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，当所述紫外吸收值与所述基准值的差值为5mAu～100mAu时，切换所述层析柱。
3.根据权利要求1所述的自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，将样品上样到层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值的波动范围小于5mAu时，记录该紫外吸收值作为基准值；
优选地，将样品上样到层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值的波动范围小于4mAu时，记录该紫外吸收值作为基准值；
优选地，将样品上样到层析柱后，检测流穿所述层析柱的流穿液的紫外吸收值，待所述紫外吸收值的波动范围小于3mAu时，记录该紫外吸收值作为基准值。
4.根据权利要求1所述的自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，所述层析柱的柱高≥15cm；
优选地，所述层析柱的柱高≥20cm。
5.根据权利要求1所述的自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，每根所述层析柱的保留时间≥4min；
优选地，每根所述层析柱的保留时间为4～10min。
6.根据权利要求1所述的自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，所述上样载量≥50g/L；
优选地，所述上样载量≥60g/L。
7.根据权利要求1所述的自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，所述层析装置包括至少两个层析柱，且至少两个所述层析柱并联运行。
8.根据权利要求7所述的自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，至少两个所述层析柱切换上样，实现对样品的不间断连续上样。
9.根据权利要求7所述的自动控制连续层析上样载量的方法，其特征在于，所述层析装置包括至少三个层析柱。
10.一种层析方法，包括如权利要求1～9任一项所述的自动控制连续层析上样载量的方法。
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