CN109473143A - 一种连续流层析上样量的确定方法及其应用 - Google Patents

一种连续流层析上样量的确定方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种连续流层析上样量的确定方法及应用。连续流层析上样量的确定方法，包括如下步骤：将目标蛋白纯品制成上样液，上样获取穿透曲线；按照公式计算蛋白穿透量 获取穿透曲线中C/C0＝a的数据点对应的DBC为穿透载量b；获取蛋白穿透量Pn＝100b±10或Pn＝200b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X‑b)或γ(X‑2b)；其中，a≤5％，0.8≤γ≤1。本发明能够准确给出不同条件下的上样量，以兼顾收率和填料载量，可用于各类蛋白的分离纯化等，确定方法简单，无需积分处理等软件，具有便利性、操作学和易学性。

Description

一种连续流层析上样量的确定方法及其应用
技术领域
本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种连续流层析上样量的确定方法及应用。
背景技术
随着生物制药技术的进步，尤其是上游细胞发酵的技术发展，抗体表达量逐渐升高，从之前的零点几克每升至现在的多达30克每升，由此给下游纯化带来很大的压力。目前制约下游纯化的最大障碍是捕获步骤的填料成本高以及生产效率较低。抗体的粗纯步骤目前主要是通过Protein A亲和层析来进行捕获，而广泛使用的Protein A填料普遍存在价格高昂，载量不高等问题。
生物制药界提出了很多种解决方案，如膜层析，新填料，连续流层析等等。其中连续流层析是目前较为成熟且能有效降低成本提高生产效率的一种方法。连续流层析是通过将一根长的层析柱拆分成几根层析柱运行。通过两根层析柱串联使用，第一根柱子在目标蛋白开始流穿后，会有第二根新柱子来承接，从而提高柱子的载量，降低填料成本。而除了两根上样的柱子之外，还会有载满的柱子在执行洗脱和再生的步骤，从而提高生产效率。同时为了获得更快的流速，可以将柱高装短，从而大大的提高生产效率。
目前很多公司都开发了连续流层析设备，如GE公司的AKTA PCC，Pall公司的Cadence BioSMB，Chromacon公司的CaptureSMB，大多数的设备都可以用来做Protein A捕获。而Protein A捕获步骤目前主要有两种，一种是固定体积上样，如Pall公司的CadenceBioSMB。另一种是动态控制上样，如GE公司的AKTA PCC通过ΔUV控制上样，Chromacon公司的CaptureSMB通过Automab控制上样。在连续流捕获工艺中，常常用一根未载样的柱子串联接在已载满或即将载满的柱子后面，由于第一根柱子已经满载，所以上样液中的目标蛋白会有一部分未被第一根柱子结合而被第二根未载满的柱子捕获。但是如果样品上的过多，会导致第二根柱子也开始发生流穿。所以上样量对于连续流工艺是很重要的参数，上的太多会导致第二根柱子也发生流穿，从而导致样品的流失。上的太少不能最大化的利用填料的载量，使得成本不能降至最低。所以对于连续流层析工艺开发来说，找出上样量的操作范围很重要。然而，现有的连续流层析技术中，并不能够给出上样量的范围进行参考。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种连续流层析上样量的确定方法，以解决现有技术中存在的连续流层析中无法确定合适的上样量的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种连续流层析上样量的确定方法的应用，根据本发明的方法确定连续流层析上样量，可用于各类蛋白的分离纯化。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种连续流层析上样量的确定方法，包括如下步骤：
将目标蛋白纯品制成上样液，上样获取穿透曲线，穿透曲线的X轴为DBC，Y轴为C/C0；其中，C0为上样液的紫外吸收值，C为流出液的紫外吸收值；
按照公式计算蛋白穿透量其中Xi和Xi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的DBC，Yi和Yi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的C/C0，n为正整数；
获取穿透曲线中C/C0＝a的数据点对应的DBC为穿透载量b；获取蛋白穿透量Pn＝100b±10或Pn＝200b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X-b)或γ(X-2b)；其中，a≤5％，0.8≤γ≤1。
γ作为安全系数，避免实际操作造成的流穿，导致样品的流失，优选0.9≤γ≤1，更优选γ＝0.9，兼顾提纯效率和样品收率。
其中C0与C均与上样浓度正相关,所以可以将其近似的看成C0为上样液的蛋白浓度，C为流出液的蛋白浓度。DBC＝(C0-C)*VL/VC；其中VL为上样体积，VC为层析柱体积，在穿透曲线中C0＝100，C＝C/C0。故在穿透曲线中穿透曲线、Y＝100的直线、X轴以及上样点平行于Y轴的直线所围成的的面积可以看做该上样点下每个单位的填料所结合的蛋白量。而穿透曲线与X轴、Y轴以及该上样点平行于Y轴的直线所围成的的面积可以看做该上样点下每个单位的填料所流穿的蛋白量。
本发明针对连续流层析方法，通过蛋白的穿透曲线与X轴的DBC(动态结合载量)之间所形成的面积，计算上样量范围。依据获取的穿透曲线，获得足够多的数据点，将穿透曲线与X轴形成的面积分解成无数个的梯形相加的面积，计算每个小的梯形的面积，针对每个点对应的梯形面积加上该点之前所有的小梯形面积之和作为该数据点对应的蛋白穿透量，即根据求和公式，从i＝1加至i＝n的情况。同时，根据穿透曲线找出第二根柱子蛋白开始穿透点，即C/C0为a时对应点，该点对应的的DBC为穿透载量b，利用矩形面积公式算出该点对应的上样量为100b或200b(当连续流层析系统为一拖一串联上样方式时，该点对应的上样量为100b；当连续流层析系统为一拖二串联上样方式时，该点对应每根上样量为100b，两根柱子对应的总上样量为200b)；通过蛋白穿透量计算公式，找出与穿透点的上样量最接近的蛋白穿透量Pn，对应获取Pn＝100b±10或Pn＝200b±10时对应的X，即穿透曲线中Pn＝100b±10或Pn＝200b±10的数据点对应的DBC，X减去穿透点的载量b后的0.8-1倍或X减去2倍穿透点的载量2b后的0.8-1倍即为在某一工艺条件下的最大上样量。
本发明的方法，也可通过简单的数据处理软件辅助计算，比如Excel，采用Excel进行数据处理，加快数据处理速度，同时可将用户软件成本大幅降低，无需专业的积分处理等软件，具有极大的便利性、操作学和易学性。
优选的，根据穿透曲线获取数据点，每1mL上样液，数据点的数量＞300个。实际测试过程中，可得到上样液体积与紫外吸收值的图谱，将图谱导成ASC格式文件，得到若干个具体上样液体积与紫外吸收值的数据点。将每个数据点的上样液体积乘以上样液中目标蛋白浓度，再乘以柱体积，换算成对应的柱子DBC载量，得到穿透曲线的X轴；将每个数据点的紫外吸收值除以上样液的紫外吸收值为C/C0，得到穿透曲线的Y轴。
为了使确定的上样量更准确，数据点的数量越多越好，根据实际情况进行选择，当数据点个数满足上述要求时，可以满足上样量的准确度，并且减少计算量。
优选的，a≤3％；更优选的，a≤2％，进一步优选的，a≤1％。根据实际层析过程中的需求，调整a值，如为了尽可能保证第二根柱子不流穿，提高样品收率，则选择较小的a，如为了提高柱子的载量，则选择相对较大的a。当a＝1％，较大程度上兼顾了目标蛋白收率和柱子载量。
上样液和流出液的紫外吸收值为280nm处的紫外吸收值。
优选的，将目标蛋白纯品制成上样液，上样直至C/C0≥80％时，停止上样。更优选的，将目标蛋白纯品制成上样液，上样直至C/C0≥85％时，停止上样。上样量足够大，增加蛋白穿透量的数据点，提高上样量的确定的准确度。停止上样后，根据连续流层析方法，进行后续的洗柱、洗脱和再生等步骤。
优选的，连续流层析的方式选自一柱拖一柱、一柱拖二柱、二柱拖二柱的上样方式。其中一柱拖一柱的上样方式最为常见。当柱子载量较小，想提高上样量时则可以通过一柱拖两柱的形式增加上样量。当目标蛋白表达量较低时，想提高生产率则可以通过二柱拖二柱的方式上样。
优选的，当连续流层析的方式为一柱拖一柱串联方式时，蛋白穿透量Pn＝100b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X-b)；
当连续流层析的方式为一柱拖二柱串联方式时，蛋白穿透量Pn＝200b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X-2b)；
当连续流层析的方式为二柱拖二柱串联方式时，蛋白穿透量Pn＝100b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X-b)。
优选的，将目标蛋白纯品制成上样液，上样液的pH值与待分离目标蛋白粗品的pH值之比为(0.97-1.03)﹕1，优选为(0.98-1.02)﹕1，更优选为1﹕1。
优选的，将目标蛋白纯品制成上样液，上样液的电导率与待分离目标蛋白粗品的电导之比为(0.86-1.14)﹕1，优选为(0.93-1.07)﹕1，更优选为1﹕1。
优选的，将目标蛋白纯品制成上样液，上样液的目标蛋白浓度与待分离目标蛋白粗品的目标蛋白浓度之比为(0.66-1.34)﹕1，优选为(0.90-1.07)﹕1，更优选为1﹕1。
通过将目标蛋白制成上样液，使其与待分离的目标蛋白pH、电导、蛋白浓度相近或相同，通过目标蛋白纯品模拟待分离样品的连续流层析过程，得到特定工艺条件下的最大上样量。如在不同实施例中，可以采用平衡液调节目标蛋白纯品上样液的浓度，平衡液可采用50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH7.4。
优选的，上样的流速为0.5-2.5mL/min。上样的流速根据柱体积进行选择，优选保留时间为2min。
优选的，目标蛋白包括CHO细胞表达的单克隆抗体、融合蛋白和血液因子中的任一种。更优选的，目标蛋白为CHO细胞表达的单克隆抗体。
优选的，连续流层析采用的填料为Mabselect Sure LX或者采用HiTrapMabSelectSuRe预装柱。
优选的，上样前，采用平衡液平衡层析柱。更优选的，平衡液为50-55mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH7.4。可采用3-5CV的平衡液平衡层析柱，使层析柱的UV、电导等基线平稳后，进行上样步骤。
本发明还提供了上述连续流层析上样量的确定方法在蛋白分离纯化方面的应用。
本发明的连续流层析上样量的确定方法可用于确定蛋白分离纯化时的最大上样量。
优选的，蛋白包括CHO细胞表达的单克隆抗体、融合蛋白和血液因子中的任一种。
优选的，当待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体的表达量为2-4g/L，pH为6.8-7.2，电导为13-17mS/cm，填料为Mabselect Sure LX，保留时间为2min时，采用78.57±5g/L的上样量；
当待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体的表达量为3-3.5g/L，pH为7.0-7.4，电导为13-17mS/cm，层析柱为HiTrapMabSelectSuRe预装柱，保留时间为2min时，采用37.35±5g/L的上样量；
当待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体的表达量为0.2-1g/L，pH为7.0-7.4，电导为12-16mS/cm，填料为Eshmuno A，保留时间为2min时，采用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明针对连续流层析方法，通过蛋白的穿透曲线与X轴的DBC之间所形成的面积，计算上样量范围；依据获取的穿透曲线，通过特定公式计算蛋白穿透量；根据穿透曲线找出第二根柱子蛋白开始穿透点，利用矩形面积公式算出该点对应的上样量；通过蛋白穿透量计算公式，找出与穿透点的上样量最接近的蛋白穿透量，获取该蛋白穿透量对应的DBC载量，X减去穿透点的载量b即为在某一工艺条件下的最大上样量；从而在连续流层析中给出合适的上样量；
(2)本发明的方法，也可通过简单的数据处理软件辅助计算，加快数据处理速度，同时可将用户软件成本大幅降低，无需专业的积分处理等软件，具有极大的便利性、操作学和易学性；
(3)本发明的上样量的确定方法，能够准确给出不同条件下的上样量，以兼顾收率和填料载量，可用于各类蛋白的分离纯化等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1-3采用的不同上样模式示意图；其中，A为一柱拖一柱上样模式，B为一柱拖二柱上样模式，C为二柱拖二柱上样模式；
图2为本发明实施例1提供的Mabselect Sure LX为填料的层析柱分离纯化CHO细胞表达的单克隆抗体的穿透曲线图；
图3为本发明实施例2提供的HiTrapMabSelectSuRe层析柱分离纯化CHO细胞表达的单克隆抗体的穿透曲线图；
图4为本发明实施例3提供的Eshmuno A为填料的层析柱分离纯化CHO细胞表达的单克隆抗体的穿透曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种采用连续流层析法分离纯化CHO细胞表达的单克隆抗体的上样量的确定方法，待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体粗品中，表达量为3g/L，上样pH7.0,电导15mS/cm。
本实施例的上样量的确定方法，包括如下步骤：
(1)取1g经单柱层析纯化好的CHO细胞表达的单克隆抗体蛋白，将pH调至7.0，电导15mS/cm，蛋白浓度用平衡液(50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH7.4)稀释至3g/L，采用两柱串联上样；其中，层析柱的填料为GE公司的MabselectSure LX，柱体积为5mL(1.1cm*5.3cm)，保留时间为2min；
(2)采用5CV的平衡液(50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH7.4)，以2.5mL/min的流速平衡柱子，待UV、电导基线平稳后，进入上样步骤；
(3)采用上述CHO细胞表达的单克隆抗体蛋白纯品配制的溶液作为上样液，模拟连续流上样工艺，在单柱层析中进行穿透实验；首先，调节柱位阀bypass，使上样液通过旁路进入紫外检测池，待紫外吸收值稳定后获得上样液的紫外吸收值C0为1183mAU；然后为过柱子的上样步骤，采用2.5mL/min的流速恒速上样，观察紫外吸收变化，通过AKTA Pure仪器实时测试上样体积和流出液的280nm处的紫外吸收值C；待流出液的紫外吸收值C达到上样液紫外吸收值C0的86％时停止上样，进入后面的洗柱、洗脱、再生等步骤；
(4)将上样过程中得到的上样体积和流出液的紫外吸收值C以ASC格式导出，用Excel打开ASC文件，得到的数据一列为上样体积一列为对应的280nm的紫外吸收值；共得到20810个数据点；根据上样体积乘蛋白浓度(3g/L)除以柱体积(5mL)，得到一列DBC的数据；紫外吸收值C除以上样液的紫外吸收值C0(1183mAU)，得到一列C/C0的数据，得到X轴为DBC，Y轴为C/C0的穿透曲线，如图2所示；
(5)按照公式计算蛋白穿透量其中Xi和Xi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的DBC，Yi和Yi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的C/C0；分别得到第1个数据点至第20810个数据点P1，P2，P3，P4，…，P20808，P20809，P20810；
(6)获取穿透曲线中C/C0＝1％的数据点对应的DBC为穿透载量b，根据穿透曲线b＝35.297g/L，根据矩形面积公式计算出该点对应的第二根柱子所能上的最大量为3529.7g/L；
(7)根据步骤(5)中得到的数据P1，P2，P3，P4，…，P20808，P20809，P20810，从中获取最接近3529.7g/L的数据点，获取该点对应的DBC为122.6g/L，则采用本实施例的工艺条件，采用双柱串联上样的方式时，最大的上样量优选为78.573g/L；
(8)根据步骤(7)中所得到的数据，在GE公司的AKTA PCC上进行实验验证。柱信息同步骤(1)，上样量为78.57g/L,上样模式为图1(A)中一柱拖一柱的上样模式。连续做30个循环，收率为92.3％,纯度为99.1％。
实施例2
本实施例提供了一种采用连续流层析法分离纯化CHO细胞表达的单克隆抗体的上样量的确定方法，待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体粗品中，表达量为3.3g/L，上样pH7.2,电导15mS/cm。
本实施例的上样量的确定方法，包括如下步骤：
(1)取1g经单柱层析纯化好的CHO细胞表达的单克隆抗体蛋白，将pH调至7.2，电导15mS/cm，蛋白浓度用平衡液(50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH7.4)稀释至3.3g/L，采用一柱拖两柱串联上样；其中，层析柱为GE公司的HiTrapMabSelectSuRe 1mL预装柱，保留时间为2min；
(2)采用5CV的平衡液(50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH7.4)，以0.5mL/min的流速平衡柱子，待UV、电导基线平稳后，进入上样步骤；
(3)采用上述CHO细胞表达的单克隆抗体蛋白纯品配制的溶液作为上样液，模拟连续流上样工艺，在单柱层析中进行穿透实验；首先，调节柱位阀bypass，使上样液通过旁路进入紫外检测池，待紫外吸收值稳定后获得上样液的紫外吸收值C0为1322mAU；然后为过柱子的上样步骤，采用0.5mL/min的流速恒速上样，观察紫外吸收变化，通过AKTA Pure仪器实时测试上样体积和流出液的280nm处的紫外吸收值C；待流出液的紫外吸收值C达到上样液紫外吸收值C0的93％时停止上样，进入后面的洗柱、洗脱、再生等步骤；
(4)将上样过程中得到的上样体积和流出液的紫外吸收值C以ASC格式导出，用Excel打开ASC文件，得到的数据一列为上样体积一列为对应的280nm的紫外吸收值；共得到8840个数据点；根据上样体积乘蛋白浓度(3.3g/L)除以柱体积(1mL)，得到一列DBC的数据；紫外吸收值C除以上样液的紫外吸收值C0(1322mAU)，得到一列C/C0的数据，得到X轴为DBC，Y轴为C/C0的穿透曲线，如图3所示；
(5)按照公式计算蛋白穿透量其中Xi和Xi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的DBC，Yi和Yi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的C/C0；分别得到第1个数据点至第8840个数据点P1，P2，P3，P4，…，P8838，P8839，P8840；
(6)获取穿透曲线中C/C0＝1％的数据点对应的DBC为穿透载量b，根据穿透曲线b＝22.20g/L，根据矩形面积公式计算出该点对应的后两根柱子每根所能上的最大量为2220g/L；
(7)根据步骤(5)中得到的数据P1，P2，P3，P4，…，P8838，P8839，P8840，从中获取最接近4440g/L的数据点，获取该点对应的DBC为85.9g/L，则采用本实施例的工艺条件，采用一柱拖二柱串联上样的方式时，最大的上样量优选为37.35g/L；
(8)根据步骤(7)中所得到的数据，在Pall公司的Cadence BioSMB上进行实验验证。柱信息同步骤(1)，上样量为37.35g/L,上样模式为图1(B)中的一柱拖二柱的上样模式。连续做30个循环，收率为93.4％,纯度为98.7％。
实施例3
本实施例提供了一种采用连续流层析法分离纯化CHO细胞表达的单克隆抗体的上样量的确定方法，待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体粗品中，表达量为0.5g/L，上样pH为7.15,电导14mS/cm。
本实施例的上样量的确定方法，包括如下步骤：
(1)取1g经单柱层析纯化好的CHO细胞表达的单克隆抗体蛋白，将pH调至7.15，电导14mS/cm，蛋白浓度用平衡液(50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH7.4)稀释至0.5g/L，采用两柱拖两柱串联上样；其中，层析柱的填料为Merck公司的Eshmuno A，柱体积为5mL(1.1cm*5.3cm)，保留时间为2min；
(2)采用5CV的平衡液(50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH7.4)，以2.5mL/min的流速平衡柱子，待UV、电导基线平稳后，进入上样步骤；
(3)采用上述CHO细胞表达的单克隆抗体蛋白纯品配制的溶液作为上样液，模拟连续流上样工艺，在单柱层析中进行穿透实验；首先，调节柱位阀bypass，使上样液通过旁路进入紫外检测池，待紫外吸收值稳定后获得上样液的紫外吸收值C0为210mAU；然后为过柱子的上样步骤，采用2.5mL/min的流速恒速上样，观察紫外吸收变化，通过AKTA Pure仪器实时测试上样体积和流出液的280nm处的紫外吸收值C；待流出液的紫外吸收值C达到上样液紫外吸收值C0的98％时停止上样，进入后面的洗柱、洗脱、再生等步骤；
(4)将上样过程中得到的上样体积和流出液的紫外吸收值C以ASC格式导出，用Excel打开ASC文件，得到的数据一列为上样体积一列为对应的280nm的紫外吸收值；共得到7321个数据点；根据上样体积乘蛋白浓度(0.5g/L)除以柱体积(5mL)，得到一列DBC的数据；紫外吸收值C除以上样液的紫外吸收值C0(210mAU)，得到一列C/C0的数据，得到X轴为DBC，Y轴为C/C0的穿透曲线，如图4示；
(5)按照公式计算蛋白穿透量其中Xi和Xi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的DBC，Yi和Yi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的C/C0；分别得到第1个数据点至第7321个数据点P1，P2，P3，P4，…，P7319，P7320，P7321；
(6)获取穿透曲线中C/C0＝1％的数据点对应的DBC为穿透载量b，根据穿透曲线b＝23.96g/L，根据矩形面积公式计算出该点对应的后两根柱子每根所能上的最大量为2396g/L；
(7)根据步骤(5)中得到的数据P1，P2，P3，P4，…，P7319，P7320，P7321，从中获取最接近2396g/L的数据点，获取该点对应的DBC为75.1g/L，则采用本实施例的工艺条件，采用二柱拖二柱串联上样的方式时，最大的上样量优选为46.02g/L；
(8)根据步骤(7)中所得到的数据，在Pall公司的Cadence BioSMB上进行实验验证。柱信息同步骤(1)，上样量为46g/L,上样模式为图1(C)中的二柱拖二柱的上样模式。连续做30个循环，收率为93.1％,纯度为99.0％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，包括如下步骤：
将目标蛋白纯品制成上样液，上样获取穿透曲线，穿透曲线的X轴为DBC，Y轴为C/C0；其中，C0为上样液的紫外吸收值，C为流出液的紫外吸收值；
按照公式计算蛋白穿透量其中Xi和Xi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的DBC，Yi和Yi-1分别为穿透曲线中相邻数据点对应的C/C0，n为正整数；
获取穿透曲线中C/C0＝a的数据点对应的DBC为穿透载量b；获取蛋白穿透量Pn＝100b±10或Pn＝200b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X-b)或γ(X-2b)；其中，a≤5％，0.8≤γ≤1。
2.根据权利要求1所述的连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，所述γ满足：0.9≤γ≤1；
优选的，所述γ＝0.9；
优选的，根据所述穿透曲线获取数据点，每1mL所述上样液，所述数据点的数量＞300个。
3.根据权利要求1所述的连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，所述a≤3％，优选a≤2％，更优选的a≤1％。
4.根据权利要求1所述的连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，将所述目标蛋白纯品制成上样液，上样直至C/C0≥80％时，停止上样；
优选的，将所述目标蛋白纯品制成上样液，上样直至C/C0≥85％时，停止上样。
5.根据权利要求1所述的连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，所述连续流层析的方式选自一柱拖一柱、一柱拖二柱、二柱拖二柱的上样方式；
优选的，当连续流层析的方式为一柱拖一柱串联方式时，蛋白穿透量Pn＝100b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X-b)；当连续流层析的方式为一柱拖二柱串联方式时，蛋白穿透量Pn＝200b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X-2b)；当连续流层析的方式为二柱拖二柱串联方式时，蛋白穿透量Pn＝100b±10时的数据点对应的X，上样量为γ(X-b)。
6.根据权利要求1所述的连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，将所述目标蛋白纯品制成上样液，所述上样液的pH值与待分离目标蛋白粗品的pH值之比为(0.97-1.03)﹕1；
优选的，所述上样液的pH值与待分离目标蛋白粗品的pH值之比为(0.98-1.02)﹕1；
更优选的，所述上样液的pH值与待分离目标蛋白粗品的pH值之比为1﹕1。
7.根据权利要求1所述的连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，将所述目标蛋白纯品制成上样液，所述上样液的电导与待分离目标蛋白粗品的电导之比为(0.86-1.14)﹕1；
优选的，所述上样液的电导与待分离目标蛋白粗品的电导之比为(0.93-1.07)﹕1；
更优选的，所述上样液的电导与待分离目标蛋白粗品的电导之比为1﹕1。
8.根据权利要求1所述的连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，将所述目标蛋白纯品制成上样液，所述上样液的目标蛋白浓度与待分离目标蛋白粗品的目标蛋白浓度之比为(0.66-1.34)﹕1；
优选的，所述上样液的目标蛋白浓度与待分离目标蛋白粗品的目标蛋白浓度之比为(0.90-1.07)﹕1；
更优选的，所述上样液的目标蛋白浓度与待分离目标蛋白粗品的目标蛋白浓度之比为1﹕1。
9.根据权利要求1所述的连续流层析上样量的确定方法，其特征在于，所述上样的流速为0.5-2.5mL/min；
优选的，所述目标蛋白包括CHO细胞表达的单克隆抗体、融合蛋白和血液因子的任一种；
优选的，所述连续流层析采用的填料为Mabselect Sure LX或者采用HiTrapMabSelectSuRe预装柱。
10.权利要求1-9任一项所述的连续流层析上样量的确定方法在蛋白分离纯化方面的应用；
优选的，所述确定方法用于确定蛋白分离纯化时的最大上样量；
优选的，所述蛋白包括CHO细胞表达的单克隆抗体、融合蛋白和血液因子中的任一种；
更优选的，当待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体的表达量为2-4g/L，pH为6.8-7.2，电导为13-17mS/cm，填料为Mabselect Sure LX，保留时间为2min时，采用78.57±5g/L的上样量；
当待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体的表达量为3-3.5g/L，pH为7.0-7.4，电导为13-17mS/cm，层析柱为HiTrapMabSelectSuRe预装柱，保留时间为2min时，采用41.5±5g/L的上样量；
当待纯化的CHO细胞表达的单克隆抗体的表达量为0.2-1g/L，pH为7.0-7.4，电导为12-16mS/cm，填料为Eshmuno A，保留时间为2min时，采用。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110348089A (zh) * 2019-06-28 2019-10-18 浙江大学 基于层析模型实现多柱连续流层析设计及分析的方法
CN110348090A (zh) * 2019-06-28 2019-10-18 浙江大学 基于人工神经网络实现多柱连续流层析设计及分析的方法
CN112451996A (zh) * 2020-11-10 2021-03-09 浙江大学 一种多柱连续流层析捕获蛋白的优化方法
CN113880907A (zh) * 2021-10-12 2022-01-04 郑州创迈生物科技有限公司 一种可用于Protein A亲和层析连续流工艺开发的研究方法
CN114832439A (zh) * 2022-06-07 2022-08-02 杭州奕安济世生物药业有限公司 一种自动控制连续层析上样载量的方法和层析方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101050464A (zh) * 2006-03-17 2007-10-10 上海中信国健药业有限公司 一种重组蛋白a基因及其表达产物的制备方法和用途
CN101891798A (zh) * 2010-03-02 2010-11-24 四川大学 麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法
US20150197542A1 (en) * 2014-01-10 2015-07-16 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of purification of anti-c-met antibody
CN105771940A (zh) * 2014-12-26 2016-07-20 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种亲和层析介质及其制备方法和用途
CN106867984A (zh) * 2015-12-11 2017-06-20 上海天士力药业有限公司 一种重组人尿激酶原的纯化方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101050464A (zh) * 2006-03-17 2007-10-10 上海中信国健药业有限公司 一种重组蛋白a基因及其表达产物的制备方法和用途
CN101891798A (zh) * 2010-03-02 2010-11-24 四川大学 麻疯树种仁毒蛋白的分离纯化方法
US20150197542A1 (en) * 2014-01-10 2015-07-16 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of purification of anti-c-met antibody
CN105771940A (zh) * 2014-12-26 2016-07-20 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种亲和层析介质及其制备方法和用途
CN106867984A (zh) * 2015-12-11 2017-06-20 上海天士力药业有限公司 一种重组人尿激酶原的纯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张佳俐 等: "Western_blot蛋白分析中血清蛋白上样量的研究", 《广西医科大学学报》 *
秦宇 等: "连续流层析在单抗亲和层析中的应用", 《药物生物技术》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110348089A (zh) * 2019-06-28 2019-10-18 浙江大学 基于层析模型实现多柱连续流层析设计及分析的方法
CN110348090A (zh) * 2019-06-28 2019-10-18 浙江大学 基于人工神经网络实现多柱连续流层析设计及分析的方法
CN110348090B (zh) * 2019-06-28 2021-05-04 浙江大学 基于人工神经网络实现多柱连续流层析设计及分析的方法
CN112451996A (zh) * 2020-11-10 2021-03-09 浙江大学 一种多柱连续流层析捕获蛋白的优化方法
CN112451996B (zh) * 2020-11-10 2021-09-24 浙江大学 一种多柱连续流层析捕获蛋白的优化方法
WO2022100325A1 (zh) * 2020-11-10 2022-05-19 浙江大学 一种多柱连续流层析捕获蛋白的优化方法
US11958881B2 (en) 2020-11-10 2024-04-16 Zhejiang University Optimization method for capturing proteins by multi-column continuous chromatography (MCC)
CN113880907A (zh) * 2021-10-12 2022-01-04 郑州创迈生物科技有限公司 一种可用于Protein A亲和层析连续流工艺开发的研究方法
CN114832439A (zh) * 2022-06-07 2022-08-02 杭州奕安济世生物药业有限公司 一种自动控制连续层析上样载量的方法和层析方法

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