CN104437408A - 黄曲霉毒素b1免疫亲和柱的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种黄曲霉毒素B1(以下简称AFB1)免疫亲和柱的制备方法及其应用其采用重组蛋白A琼脂糖凝胶作为固相载体，载体上的重组蛋白A与AFB1抗体IgG的Fc段定向结合，再通过双功能结合剂二甲基庚二亚胺二盐酸盐(DMP)将其交联，形成亲和介质。该亲和柱制备方法简单，成本低、可用作一次性使用。由于使用重组蛋白A，经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了重组蛋白A与AFB1抗体IgG的结合能力，从而使抗体的Fab端朝向外侧，抗原结合区域不受空间位阻干扰。因此，柱子的负载量更大，产品更加稳定，通过定向偶联单抗有效利用率提高近一倍，且在柱容量不变的情况下IAC柱体积缩减一半，使得制备总成本节约近30％。

Description

黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法及其应用，属于免疫亲和层析及真菌毒素残留检测技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一组结构类似的代谢物，其毒性属于剧毒，具有致畸、致癌、致诱变作用，而黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性和致癌性最强，被称为第一大类致癌物，能诱发人和动物的肝癌。
目前，对于黄曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、酶联免疫吸附法、免疫亲和柱-高效液相色谱法、免疫亲和柱-荧光光度法等。其中薄层层析法耗时长、灵敏度低，实验操作需接触大量标准品，既不利于操作者健康又不环保。酶联免疫吸附法适合大量样本的快速筛选，定量确定还需依靠高效液相色谱等仪器分析方法，而这往往需要复杂的样品净化过程。
国家标准GB/T18979-2003采用的方法是免疫亲和柱层析柱-高效液相色谱法和荧光光度法，该法特异性高，快速、灵敏、准确。因此，制备性能稳定、结果可靠的黄曲霉毒素免疫亲和柱乃是当务之急。目前，免疫亲和柱载体的活化方法有溴化氰法、过碘酸钠法等。当采用溴化氰活化的琼脂糖作为载体时，其中凝胶载体与抗体的偶联为随机偶联，若建合位置靠近抗体的结合位点指向有碍与待测物结合的空间时，则抗体的结合能力下降，为制备高载量的亲和介质，则所需抗体的纯度高且用量大，或制备较大的柱床体积，增加非特异性吸附的风险，成本居高不下，产品不稳定。若利用过碘酸钠法直接活化琼脂糖获得开环醛基，直接与抗体偶联，存在问题与上述溴化氰活化后偶联相似。陈光宇等专利报道过碘酸钠法使用NaIO4将IgG Fc片段特有的单糖氧化，开环成醛，带有醛基的Fc段再与CNBr/己二酰二肼活化的基质偶联，生成稳定的腙衍生物(无需还原)。但是当糖含量较少，游离氨基较多，氧化时易发生本身聚合，此法常见于酶标记抗体中使用。此外，过碘酸钠氧化抗体法步骤繁琐，活化时间较长、氧化过程复杂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的一个或多个问题，提供一种黄曲霉毒素B1(AFB1)免疫亲和柱的制备方法及其应用。
根据本发明的一方面提供的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法，方法步骤如下:
(1)固相载体的准备：将保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓冲液洗涤后，用PBS缓冲液悬浮； 
(2)抗体与固相载体的偶联：
a、将AFB1单克隆抗体与步骤(1)中得到的固相载体重组蛋白A琼脂糖凝 胶室温下在垂直混匀器上混合1-3h；
b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3～4倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，以除去未结合的抗体及其他杂蛋白，得反应物；
c、然后在步骤b所得反应物中加入0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和二甲基庚二亚胺二盐酸盐DMP固体粉末，室温下，在垂直混匀器上混匀1-3h；
d、反应结束后，用10～30mL的0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次，并用20～40mL、50mmol/L的三乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混匀器上混匀4～6min，以终止联接反应；
e、用20～40mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入5～10mL 50mmol/L，pH3.0的甘氨酸-HCL溶液，室温下，在垂直混匀器上混匀4～6min，以除去未结合的抗体；
f、反应结束后，用10～30mL的质量浓度为20％乙醇-水洗涤两次，最后用等体积的20％乙醇-水重新悬浮，得到混悬液；
(3)装柱：取步骤(2)制备的混悬液进行装柱，沉降，安装筛板，用质量浓度为20％的乙醇-水密封，4℃保存，即得到黄曲霉毒素B1免疫亲和柱。
由此本黄曲霉毒素B1免疫亲和柱重组蛋白A经改造含有一C末端半胱氨酸，单一位点偶联于琼脂糖；AFB1单克隆抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到重组蛋白A琼脂糖凝胶，AFB1单克隆抗体抗原结合部位充分暴露。净化效率和方法的灵敏度提高。
由此可以获得以下技术优点，第一，提高AFB1单克隆抗体有效利用率节约资源与成本，且本方法为定向偶联，制备过程中不需要高纯度的AFB1单克隆抗体，方法简便节省生产成本。第二，本方法实际应用中较现有技术减少了装柱体积，在保持柱容量不变的前提下，虽然使用了蛋白A凝胶载体实际上却并未增加成本反而降低了实际造价。第三，现有黄曲霉毒素B1免疫亲和柱造价昂贵，且多次重复使用使得亲和柱净化效果降低结果不可靠性，使用本方法成本节约，为生产一次性免疫亲和柱提供了可能。
在一些实施方式中，步骤(1)保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶使用乙醇保存，保存效果好稳定。
在一些实施方式中，步骤2中的步骤a其中的重组蛋白A琼脂糖凝胶、AFB1单克隆抗体和步骤(1)中悬浮用到的PBS缓冲液体积比为2：3：3。
在一些实施方式中，步骤2中的步骤c中的反应物(偶联AFB1单克隆抗体的重组蛋白A琼脂糖凝胶)、三乙醇胺-硼酸溶液、DMP体积比为2:20:100。
在一些实施方式中，AFB1单克隆抗体由以下制备方法获得：
取10～12周龄或产后的雌性BALB/c小鼠，石蜡油或降植烷每只0.5～1mL或石蜡与弗氏不完全佐剂混合液0.4～0.6mL预刺激，分笼做标记；
选取处于生长期的细胞即稳定分泌抗AFB1单抗的杂交瘤细胞株，去掉培养液，换成无血清DMEM培养基或无菌生理盐水，将贴壁细胞吹下，置入50mL灭菌离心管中，800～1000rpm离心5～8min，去掉上清重新用DMEM悬起细胞，再离心去上清，加入DMEM培养基，调整细胞数量为1×106/mL，每只小鼠细 胞注射剂量为0.5～1.0mL；
接种杂交瘤细胞株后在10～13天采集腹水，采用分步骤引流收集或一次性收集，腹水4000rpm离心1～5min去细胞碎片；
辛酸-饱和硫酸铵纯化腹水中AFB1单克隆抗体，AFB1单克隆抗体浓度在2.0～5.0mg/mL。
由此可以高效的得到所需的AFB1单克隆抗体。
在一些实施方式中，辛酸-饱和硫酸铵纯化腹水中AFB1单克隆抗体方法为：
取去细胞碎片的腹水，4℃10000-14000r/min，离心10～30min，去沉淀；
用3～4倍的腹水体积的醋酸钠缓冲液稀释，pH控制在4.2～4.6，温度保持在2～8℃，边搅拌边缓慢滴加正辛酸，添加量为按未稀释腹水计40μL/mL；
继续搅拌15～30min，2～8℃静置2～4h，4℃下以10000-14000r/min的速度离心20-30min；
收集上清液，弃去沉淀，过0.45μm的滤膜；
加入10倍浓缩的PBS缓冲液，加入量为上清液体积的1/10，2～8℃预冷，按277g/L上清液的量缓慢加入硫酸铵研磨粉末；
加完继续磁力搅拌器，搅拌20～30min，2～8℃静置2～4h或静置过夜；4℃下以8000～12000r/min的速度离心15～20min，收集沉淀，弃去上清液；
在沉淀中缓慢加入150mmol/L的PBS溶液，加入量为总体积的25％～50％；将溶解的抗体溶液转移置透析袋中，用100～200倍体积的PBS溶液在2～8℃磁力搅拌透析；
每2～4h更换透析液，至少3～4次，得到纯化后的抗体；用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS稀释，得到AFB1单克隆抗体，单抗浓度在2.0-5.0mg/mL。
由此可以高效的得到高纯度的AFB1单克隆抗体，进而提高黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的灵敏度和可靠性。
根据本发明的一些方面提供的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法所得的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，黄曲霉毒素B1免疫亲和柱重组蛋白A经改造含有一C末端半胱氨酸，单一位点偶联于琼脂糖；AFB1单克隆抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到重组蛋白A琼脂糖凝胶，AFB1单克隆抗体抗原结合部位充分暴露。
根据本发明的一方面提供的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法的应用，该方法用于免疫亲和柱层析柱-高效液相色谱法荧光光度法检测黄曲霉毒素B1中样品前处理。
根据本发明的一方面，样品前处理具体方法为：
放掉黄曲霉毒素B1免疫亲和柱内液体，用4～6倍柱体积的PBS缓冲液淋洗柱床；将稀释好的样品提取液过柱，控制流速0.5～1滴/秒；用水淋洗柱床，流速2-4滴/秒，弃去，直至空气通过；用色谱纯甲醇洗脱，收集洗脱液进行液相色谱检测；
根据本发明的一方面，黄曲霉毒素B1免疫亲和柱使用后的再生方法为：
将使用完毕的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱先用纯甲醇淋洗，再用PBS缓冲液 活化再生；最后用的乙醇-水置换AFB1免疫亲和柱内液体，4℃保存。
按照本发明提供的技术方案，本发明采用重组蛋白A琼脂糖凝胶(r protein A-Sepharose CL-4B)作为固相载体；与经过辛酸-饱和硫酸铵纯化的AFB1单克隆抗体定向偶联,使用这种纯化方案，该方法经济，更重要的是能保证有效IgG与proteinA高效结合，杂蛋白不被结合，洗涤后除去，通过双功能结合剂二甲基庚二亚胺二盐酸盐(DMP)将其交联，取制备的混悬液进行装柱，过夜沉降使柱体积为0.25mL，安装上筛板，20％乙醇-水密封，4℃保存，得到AFB1免疫亲和柱。制备的免疫亲和层析柱，可提高样品的净化效率和方法的灵敏度，尤其适合复杂样品的前处理。
与现有技术相比，本发明的抗体与基质偶联方法具有以下显著优点：
(1)载体上重组蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与AFB1抗体IgG的结合能力；
(2)将抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到重组proteinA琼脂糖凝胶上，更好地保持了抗体的活性，使抗体上的抗原结合部位充分暴露，较小的柱床体积下完成净化过程，减小了非特异性吸附。
(3)生产工艺简单，过程温和易控制，亲和介质稳定。
附图说明
图1为本发明AFB110ppb标准品HPLC图谱；
图2为本发明AFB1柱容量HPLC图谱；
图3为本发明柱容量随时间变化(2～8℃)图；
图4为本发明应用原理示意图；
图5为传统随机偶联示意图；
图6为本发明定向偶联示意图。
具体实施方式
实施例1
AFB1单克隆抗体的制备
(1)抗体的制备： 
a、取10-12周龄或产后的雌性BALB/c小鼠，石蜡油或降植烷每只0.5-1mL或石蜡与弗氏不完全佐剂混合液0.4-0.6mL预刺激，分笼做标记。
b、选取处于生长期的细胞(稳定分泌抗AFB1单抗的杂交瘤细胞株)，去掉培养液，换成无血清DMEM培养基或无菌生理盐水，将贴壁细胞吹下，置入50mL灭菌离心管中，800-1000rpm离心5-8min，去掉上清重新用DMEM悬起细胞，再离心去上清，加入DMEM培养基，调整细胞数量为1×106/mL。每只小鼠细胞注射剂量为0.5-1.0mL；
c、接种杂交瘤细胞株后小鼠在7-10天会出现腹部膨大，在10-13天左右采集腹水，采用分步骤引流收集或一次性收集，腹水4000rpm离心1-5min去细胞碎片，-20℃保存备用。
(2)抗体的纯化： 
a、取AFB1腹水，解冻后，4℃10000-14000r/min，离心10-30min，去沉淀，记录腹水体积；
b、用3-4倍的腹水体积的醋酸钠缓冲液稀释，pH控制在4.2-4.6，温度保持在2-8℃，边搅拌边缓慢滴加正辛酸，添加量为按未稀释腹水计40μL/mL；
c、继续搅拌15-30min，2-8℃静置2-4h，4℃下以10000-14000r/min的速度离心20-30min；
d、收集上清液，弃去沉淀，过0.45μm的滤膜；
e、记录上清液体积，加入10倍浓缩的PBS缓冲液，加入量为上清液体积的1/10，2-8℃预冷，按277g/L上清液的量缓慢加入硫酸铵研磨粉末；
f、加完继续磁力搅拌器，搅拌20-30min，2-8℃静置2-4h或静置过夜；4℃下以8000-12000r/min的速度离心15-20min，收集沉淀，弃去上清液；
g、在沉淀中缓慢加入150mmol/L的PBS溶液，加入量为步骤f搅拌完毕后总体积的25％-50％；将溶解的抗体溶液转移置透析袋中，用100-200倍体积的PBS溶液在2-8℃磁力搅拌透析；
h、每2-4h更换透析液，至少3-4次，得到纯化后的抗体；用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS稀释，得到AFB1单克隆抗体，单抗浓度在2.0-5.0mg/mL。
实施例二黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备
(1)固相载体的准备：将在乙醇中保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓冲液洗涤2次后，再用PBS缓冲液悬浮；
(2)抗体与固相基质的偶联：
a、将AFB1单克隆抗体与步骤(1)得到的固相载体重组蛋白A琼脂糖凝胶室温下在垂直混匀器上混合1-3h；其中抽干后重组蛋白A琼脂糖凝胶：AFB1单克隆抗体：PBS缓冲液悬浮中用到的PBS缓冲液按体积2：3：3配比混合；
b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3-4倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，除去未结合的抗体及其他杂蛋白；
c、然后在步骤b所得反应物中加入0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和二甲基庚二亚胺二盐酸盐DMP固体粉末，室温下，在垂直混匀器上混匀1-3h；反应时的重组蛋白A琼脂糖凝胶：三乙醇胺-硼酸溶液：DMP按2mL:20mL:100mg配比；
d、反应结束后，用10-30mL的0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次，并用20-40mL、50mmol/L的乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混匀器上混匀4-6min，以终止联接反应；
e、用20-40mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入5-10mL 50mmol/L，pH3.0的甘氨酸-HCL溶液，室温下，在垂直混匀器上混匀4-6min，以除去未结合的抗体；
f、反应结束后，用10-30mL的质量浓度为20％乙醇-水洗涤两次，最后用等体积的20％乙醇-水重新悬浮，得到混悬液；
(3)装柱：取步骤(2)制备的混悬液进行装柱，过夜沉降，安装上筛板，用质量浓度为20％的乙醇-水密封，4℃保存，即得到AFB1免疫亲和柱。
本方法以重组蛋白A-(rprteinA)琼脂糖凝胶为配基定向偶联单抗，成功制备了AFB1免疫亲和柱。单抗偶联率经测定达98.1％，取48μl纯化抗体偶联，平均相对柱容量在105ng/0.125ml凝胶。
如图5和图6所示，使用定向偶联减少抗体有效空间位点被占据或失活的可能，保证抗体偶联后活性。
本发明偶联时单抗纯度要求不高，将进行偶联后的反应液电泳，其结果表明，条带为杂蛋白，且有效单抗全部偶联在rproteinA上，揭示本发明方法偶联单抗，对其纯度没有过高要求，由于rproteinA对IgG有特异性结合，辛酸-饱和硫酸铵只需初步纯化抗体即可满足偶联要求，大大简便了方法。
实施例三黄曲霉毒素B1免疫亲和柱使用方法及性能参数
(1)黄曲霉B1免疫亲和柱柱容量测定
a.标准对照液制备
用移液管准确移取1.0mL的储备液到10mL锥形试管中，用氮气将溶液吹干，然后用45％的甲醇水将残渣重新溶解,定容至10mL容量瓶，振摇15min，配成浓度为10ng/mL的AFB1标准对照品液，过0.22μm水相微孔滤膜后进样。
b.测试工作液制备
用移液管准确移取5.0mL的储备液到10mL锥形试管中，用氮气将溶液吹干，然后用10％甲醇-PBS将残渣重新溶解,定容至10mL容量瓶，振摇15min，配成浓度为50ng/mL的AFB1测试工作液。 
c.样品过亲和柱净化
将亲和柱上方堵头取出后斜剪断，再插回亲和柱；将一次性20mL注射器连接于亲和柱上部，用10mL pH7.4PBS缓冲液平衡柱子，以1滴/秒通过亲和柱；准确移取标准液5mL注入注射器中，以1滴/2秒的速度缓慢通过亲和柱；用20mL水冲洗亲和柱，流速2滴/秒，弃去流出液，直至2-3mL空气通过柱体，保证柱内无残余液体；准确加入1.0mL甲醇(B.2.1)洗脱，流速1滴/2-3秒，直至2-3mL空气通过柱体。收集全部洗脱液，取适量用甲醇水稀释10倍，测定AFB1含量。
色谱条件： 
色谱柱：HP-C18柱(250nm*4.6nm，填料直径5μm)
流动相:55％甲醇水
流速：0.8mL/min
色谱柱温度：40℃
荧光检测器：激发波长365nm，发射波长440nm，，柱后光化学衍生系统
定量环：20μL
高效液相色谱如图1、图2。
(2)黄曲霉B1免疫亲和柱柱稳定性测定
每月取2-8℃保存的不同柱容量(柱容量Ⅰ为200ng/0.125mL,柱容量Ⅱ为120ng/0.125mL,柱容量Ⅲ为50ng/0.125mL)的亲和柱5支，按照上述亲和柱柱容 量测试方法进行测定，计算平均柱容量，以柱容量为纵坐标，月份为横坐标绘制曲线。由图3可以发现，在0-6个月的时候柱容量几乎没有任何变化，8-10月的时候缓慢有所降低，降幅在10％左右，10-12月柱容量降至原来的20％。测试结果说明当亲和柱需长期保存1年以上的时间，设定柱容量需提高20％。如图3。
(3)抗体利用率 
IgG的相对分子量为1.5×105g/moL，理想状态下每个抗体分子可以与2个抗原分子结合，那么固载了48.0μg抗AFB1单抗的理想柱容量为199.7ng/0.125mL胶。试验测得的柱容量为105ng/0.125mL，即抗体有效利用率为52.6％。因为空间位阻、热力学参数、反应平衡系数K等原因，即使在溶液中免疫反应也无法达到每个抗体分子与两分子抗原结合的理想状态(张秀莉，2006)。
章英等(2007)将纯化好的单抗与溴化氰活化的4FF葡聚糖偶联制备抗ZEN单克隆抗体免疫亲和柱，固载350ugZEN单克隆抗体的容量为0.40ug，则抗体的有效利用率为26.93％。从不同偶联方法制备真菌毒素亲和柱的单抗有效利用率来比较，蛋白A-凝胶的定向偶联是溴化氰活化随机偶联的1.96倍。该结果与黄昕(1999)报道MG31-r protein A-Sepharose FF的抗原结合容量是MG31-CNBr-Sepharose 4B抗原结合容量的1.8倍结论相同，说明定向偶联有助于提高免疫亲和吸附剂的抗原结合容量。
(4)非特异性吸附 
非特异性吸附被过量上样时，样品中的待测物除与特异性抗体结合外，还可与琼脂糖基质或杂蛋白发生非特异性吸附作用，通常用非特异性吸附率来表示，因为无法在亲和柱上直接测量待测物的非特异性吸附量，所以制备未偶联特异性单抗的蛋白A-琼脂糖凝胶柱(以下简称空白柱)对待测物的吸附作用，以非特异性吸附率来表示。
准确移取AFB1测试工作液1mL，以1滴/2秒的速度过空白柱(柱体积为0.125mL)，然后用20mL水洗涤除杂，最后用1.0mL甲醇洗脱，收集洗脱液，经高效液相色谱仪岛津LC-20AT(含RF-20aXS荧光检测器)检测，计算非特异性吸附率。
说明偶联载体对AFB1无非特异性吸附，以较小的柱体积完成净化是可行的。
实施例四黄曲霉毒素B1免疫亲和柱具体应用(样品加标回收率测定)
4.1玉米、花生加标回收
4.1.1a.玉米粉加标：分别称取5.0g玉米粉样品两份，一份设为空白样，一份添加110ngAFB1标样设为加标样(加标浓度为22ng/g)，加入1g NaCl，再加入25mL 70％甲醇-水，振荡30min，过滤收集滤液。取10mL滤液加入20mL水混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，取15mL过柱。
4.1.1b.花生油样品加标：分别称取5.0g花生油样品两份，一份设为空白样，一份添加110ngAFB1标样设为加标样(加标浓度为22ng/g)，加入1g NaCl，再加入25mL70％甲醇-水，振荡30min，过滤收集滤液。取10mL滤液加入20mL水混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，取15mL过柱。
4.1.2净化：
按照实施例3c步骤进行样品过亲和柱净化，分别得试样洗脱液2份，用HPLC测定AFB1含量，按照下述公式计算样品加标回收率：
4.1.3色谱条件： 
色谱柱：C18柱(100mm×4.6mm×5μm)
流动相：52％甲醇-水
流速：0.8mL/min
荧光检测器：激发波长365nm发射波长440nm，光化学衍生 
柱温：40℃
进样量：10μL
表1.玉米花生油样品过亲和柱液相测定结果
4.2酱油样品加标 
4.2.1加标、提取：分别称取5.0g酱油样品两份。一份设为空白样，一份添加100ngAFB1标样设为加标样(加标浓度为20ng/g)，加入0.25g NaCl，加入80％甲醇-水至10mL，振荡30min，过滤收集滤液。
取10mL滤液加入40mL水稀释混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，调pH至7.0后取10mL混合液过柱。
4.2.2按照实施例3c步骤进行样品过亲和柱净化，分别得试样洗脱液2份。
4.2.3柱前化学衍生：准确吸取100μL洗脱液或者标准溶液(44ng/ml)于刻度离心管中，氮气吹干；加入2ml正己烷、1.0ml三氟乙酸，振荡1min，静置10min，氮气吹干；准确移取1.0ml乙腈水(85+15)溶解混匀，过0.45μm滤膜，待测。
4.2.4色谱条件
色谱柱：C18柱(250mm×4.60mm×5μm，Luna 100A)，荧光检测器(Agilent1100)
流动相：乙腈-水，梯度洗脱，乙腈的浓度从25％到35％再到25％
流速：1.0mL/min
荧光检测器：激发波长360nm发射波长440nm
进样量：20μL
柱温：30℃
表2.酱油样品过亲和柱液相测定结果
从以上数据可以看出，玉米粉、花生油、酱油几个样品回收率均在85％以上，表明本发明亲和柱载体制备的方法性能稳定、结果可靠、可用于样品中黄曲霉毒素B1分离、净化的要求。
实施例五本发明应用流程
应用本发明制得的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱进行样品净化过程流程如图4所示。
使用时样品液加入免疫亲和柱，目标物黄曲霉毒素B1与单抗结合，经过淋洗除去干扰物，最后洗脱结合的黄曲霉毒素B1，用于后续检测。
使用到的仪器有，高效液相色谱仪岛津LC-20AT(含RF-20aXS荧光检测器)柱后光化学衍生器(PH RED-HR，北京中科汇仁科技有限公司)，垂直混匀器HS-3(宁波新芝生物)，DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)等。

Claims (10)

1.黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，该方法步骤如下:
(1)固相载体的准备：将保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓冲液洗涤后，用PBS缓冲液悬浮；
(2)抗体与固相载体的偶联：
a、将AFB1单克隆抗体与步骤(1)中得到的固相载体重组蛋白A琼脂糖凝胶室温下在垂直混匀器上混合1～3h；
b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3～4倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，得反应物；
c、然后在步骤b所得反应物中加入0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和二甲基庚二亚胺二盐酸盐DMP固体粉末，室温下，在垂直混匀器上混匀1～3h；
d、用10～30mL的0.2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次，并用20～40mL、50mmol/L的乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混匀器上混匀4～6min；
e、用20～40mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入5～10mL 50mmol/L，pH3.0的甘氨酸-HCL溶液，室温下，在垂直混匀器上混匀4～6min；
f、反应结束后，用10～30mL的质量浓度为20％乙醇-水洗涤两次，最后用等体积的20％乙醇-水重新悬浮，得到混悬液；
(3)装柱：取步骤(2)制备的混悬液进行装柱，沉降，安装筛板，用质量浓度为20％的乙醇-水密封，4℃保存，即得到黄曲霉毒素B1免疫亲和柱。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，步骤(1)保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶使用乙醇保存。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述步骤a其中重组蛋白A琼脂糖凝胶、AFB1单克隆抗体和步骤(1)悬浮用到的PBS缓冲液体积比为2：3：3。
4.根据权利要求3所述的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，步骤c中反应物、三乙醇胺-硼酸溶液、DMP体积比为2:20:100。
5.根据权利要求3所述的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述AFB1单克隆抗体由以下制备方法获得：
取10～12周龄或产后的雌性BALB/c小鼠，石蜡油或降植烷每只0.5～1mL或石蜡与弗氏不完全佐剂混合液0.4～0.6mL预刺激，分笼做标记；
选取处于生长期的细胞即稳定分泌抗AFB1单抗的杂交瘤细胞株，去掉培养液，换成无血清DMEM培养基或无菌生理盐水，将贴壁细胞吹下，置入50mL灭菌离心管中，800～1000rpm离心5～8min，去掉上清重新用DMEM悬起细胞，再离心去上清，加入DMEM培养基，调整细胞数量为1×106/mL，每只小鼠细 胞注射剂量为0.5～1.0mL；
接种杂交瘤细胞株后在10～13天采集腹水，采用分步骤引流收集或一次性收集，腹水4000rpm离心1～5min去细胞碎片；
辛酸-饱和硫酸铵纯化腹水中AFB1单克隆抗体，AFB1单克隆抗体浓度在2.0～5.0mg/mL。
6.根据权利要求3所述的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，所述辛酸-饱和硫酸铵纯化腹水中AFB1单克隆抗体方法为：
取去细胞碎片的腹水，4℃10000-14000r/min，离心10～30min，去沉淀；
用3～4倍的腹水体积的醋酸钠缓冲液稀释，pH控制在4.2～4.6，温度保持在2～8℃，边搅拌边缓慢滴加正辛酸，添加量为按未稀释腹水计40μL/mL；
继续搅拌15～30min，2～8℃静置2～4h，4℃下以10000-14000r/min的速度离心20-30min；
收集上清液，弃去沉淀，过0.45μm的滤膜；
加入10倍浓缩的PBS缓冲液，加入量为上清液体积的1/10，2～8℃预冷，按277g/L上清液的量缓慢加入硫酸铵研磨粉末；
加完继续磁力搅拌器，搅拌20～30min，2～8℃静置2～4h或静置过夜；4℃下以8000～12000r/min的速度离心15～20min，收集沉淀，弃去上清液；
在沉淀中缓慢加入150mmol/L的PBS溶液，加入量为总体积的25％～50％；将溶解的抗体溶液转移置透析袋中，用100～200倍体积的PBS溶液在2～8℃磁力搅拌透析；
每2～4h更换透析液，至少3～4次，得到纯化后的抗体；用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS稀释，得到AFB1单克隆抗体，单抗浓度在2.0～5.0mg/mL。
7.根据权利要求1～5任一方法所得的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，所述黄曲霉毒素B1免疫亲和柱重组蛋白A经改造含有一C末端半胱氨酸，单一位点偶联于琼脂糖；AFB1单克隆抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到重组蛋白A琼脂糖凝胶，AFB1单克隆抗体抗原结合部位充分暴露。
8.黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法的应用，其特征在于，用于免疫亲和柱层析柱-高效液相色谱法荧光光度法检测黄曲霉毒素B1中样品前处理。
9.根据权利要求8所述的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法的应用，其特征在于，所述前处理具体方法为：
放掉黄曲霉毒素B1免疫亲和柱内液体，用4～6倍柱体积的PBS缓冲液淋洗柱床；将稀释好的样品提取液过柱，控制流速0.5～1滴/秒；用水淋洗柱床，流速2-4滴/秒，弃去，直至空气通过；用色谱纯甲醇洗脱，收集洗脱液进行液相色谱检测。
10.根据权利要求9所述的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备方法的应用，其 特征在于，所述黄曲霉毒素B1免疫亲和柱使用后的再生方法为：
将使用完毕的黄曲霉毒素B1免疫亲和柱先用纯甲醇淋洗，再用PBS缓冲液活化再生；最后用的乙醇-水置换AFB1免疫亲和柱内液体，4℃保存。
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