CN101672835A - 一种测定乳制品中乳铁蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定乳制品中乳铁蛋白的方法。通过将乳制品的常规预处理方法与阳离子交换色谱柱两者之间有机的结合，解决了复杂乳制品体系中乳铁蛋白的快速富集和准确定量分析的问题，具有检测费用低、准确程度高、受环境变化影响小等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定乳制品中乳铁蛋白的方法。
背景技术
乳铁蛋白(LF)又称“乳转铁蛋白”，它最早是由Sorensen等人于1939年从动物乳汁中发现一种红色糖蛋白，它广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌或血浆中性粒细胞中。乳铁蛋白具有多种生物学功能，它能够参与铁的运转，对肠中铁离子具有增溶作用，并且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能。乳铁蛋白作为一种新兴功能性食品配料，针对其提取纯化工艺和应用研究在不断的增多，它主要在初乳、婴幼儿配方奶粉及专用免疫奶粉等产品中。
目前测定乳制品中乳铁蛋白含量的方法有很多，如酶联免疫法、凝胶色谱法和紫外分光光度法等几种方法。
酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)上发展起来的一种新型免疫测定技术。ELISA是将抗原、抗体特异性反应和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种新颖、快速、实用的免疫学分析技术。ELISA是以待测抗原(或抗体)与酶标抗体(或抗原)的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原(或抗体)含量的。一般ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体，再加相应酶标记抗体，生成抗原——待测抗体——酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。采用ELISA测定乳铁蛋白含量具有灵敏度高、最小检测限低、样品无需纯化等特点，因此该法应用范围最广，适用于包括初乳和专用乳粉等一系列产品中的乳铁蛋白含量的测定，但该法受环境和操作人员的影响较大，同一个样品在两次包被过程后测定的结果差异较大，因此，为了保证实验的准确性，每测定一个样品都需要对标准曲线上所有的点进行一次重复实验后再确定待测样品的量，这大大的增加了实验工作量。并且实验所用试剂盒大多来源于进口，费用昂贵，也不适于长期大量检测乳铁蛋白含量。
紫外分光光度法是利用乳铁蛋白在475nm处具有特征紫外吸收而测定的，该法具有快速简便的特点，但此法受体系内其他物质在475nm处的干扰明显，其准确性稍差，因而也不适合乳铁蛋白的准确定量。
凝胶色谱法是一种HPLC方法，它具有测定准确快速、操作简便等特点，适用于初步分离效果的监控，但对纯度较低的乳铁蛋白检测时，由于凝胶色谱分离是利用了凝胶的多孔性，根据溶剂分子的大小进行分离的，当乳铁蛋白与其他杂蛋白分子大小相近时，在凝胶色谱上保留时间接近，很难达到基线分离，所以，凝胶色谱法仅适用于高纯度的样品测定。
因而，探寻一种成本低廉、检测快速、准确、适用于复杂体系乳制品中乳铁蛋白含量的检测方法是研究的首要问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有测定乳制品中乳铁蛋白含量方法的成本高、准确性较差或样品乳铁蛋白含量低测定不准确等的缺陷，提供了一种准确度高，简便快速地测定乳制品中乳铁蛋白的方法。
本发明测定乳制品中乳铁蛋白的方法包括如下步骤：将乳制品按照本领域常规方法预提纯富集乳铁蛋白，再通过阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱(HPLC)测定含量。
1、预提纯富集乳制品中的乳铁蛋白
本发明中，所述的乳制品是指本领域常用的乳制品，如初乳、婴幼儿奶粉、含有乳铁蛋白的乳粉、还原乳或含乳饮料等。
对乳制品中的乳铁蛋白进行预提纯富集可按本领域常规方法进行。本发明特别优选如下方法：
①离心脱脂：将乳制品溶解于水中得复原乳，离心脱脂；
②去除酪蛋白：将脱脂乳按本领域常规方法，较佳地用0.2mol/L～0.5mol/L盐酸溶液调节pH值；pH值较佳的为4.4～4.8，更佳的为4.6，离心去除酪蛋白，获得乳清溶液；
③盐析：优选硫酸铵分级沉淀法，具体步骤优选如下：将乳清溶液搅拌过程中缓慢加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵浓度较佳的为30％～50％，更佳的为40％；较佳的静置时间为1～3h，更佳的静置时间为3h；离心并取其上清液；将上清液搅拌过程中再缓慢加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵浓度较佳的为70％～90％，更佳的为80％；较佳的静置时间为1～3h，更佳的静置时间为3h；离心取其沉淀部分即得到预纯化富集的乳铁蛋白，百分比为质量百分比。
其中，所述的离心条件中较佳的离心速度为3000～5000r/min，离心时间15～30min，更佳的离心速度为5000r/min，离心时间为30min。
2、阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱(HPLC)测定
本发明中，所述的通过阳离子交换色谱柱HPLC法的分离检测乳铁蛋白的基本原理是：由于乳铁蛋白的等电点为7.8～8.0之间，当调整环境溶液的pH小于7.8时，乳铁蛋白与其他部分蛋白所带电荷极性不同。此时，乳铁蛋白带负电，而其他一些乳清蛋白，如α-乳清(白)蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白等带正电。在利用阳离子交换色谱柱分离，当待测样品通过色谱柱时，乳铁蛋白等带负电的蛋白与柱填料上的阳离子位点结合，其他带正电的物质被流动相首先洗脱出来，随着流动相盐浓度的不断提高，乳铁蛋白和其它部分带负电的蛋白才被一一洗脱出来，进而测量乳铁蛋白的含量。
本发明中，所述的高效液相色谱法的进样及进样前预处理可按照本领域常规方法进行，其优选步骤如下：
①将预提纯富集的乳铁蛋白样品溶于的磷酸盐缓冲溶液中，pH值较佳的为6.8～7.2，更佳的为7.0，得到进样溶液；
②去除杂质：为了去除进样溶液和流动相中的颗粒杂质，避免色谱柱阻塞，将进样溶液和流动相溶液分别用滤膜过滤。进样液量小，较佳地选用针式过滤器进行过滤；流动相量大，较佳地选用水相滤膜过滤；两者所用滤膜孔径均为≤0.45μm，更佳的为0.2μm；
③进样，进样体积根据柱长短来确定，较佳地，8mm×75mm的柱子进样体积为10～20μL，更佳的为10μL。
本发明中，所述的阳离子交换色谱柱可选自本领域常规的阳离子交换色谱柱，可以是强阳离子交换色谱柱，也可以是弱阳离子交换色谱柱，较佳的是弱阳离子交换色谱柱。这主要是因为强阳离子交换色谱柱的结合位点与乳铁蛋白的结合能力更强，在洗脱的过程中需要很高的离子强度才能把乳铁蛋白洗脱出来，但是较高的离子强度对液相色谱仪器的损害较大，不利于仪器的日常维护，因此进一步优选使用弱阳离子交换色谱柱对样品进行分析检测。所述的阳离子交换色谱柱优选磺丙基(如Shodex IEC SP-825)、磺酸基(如Proteomix SCX-NP)或羧甲基(如shodex IEC CM-825)等阳离子交换色谱柱，最佳的选择羧甲基弱阳离子交换色谱柱。所述的阳离子交换色谱柱规格较佳的选用≥8.0×7.5mm的常规型号的色谱分析柱。
本发明中，高效液相色谱的流动相溶液按照本领域常规方法，根据所用的阳离子交换色谱柱的交换基团而选择。如，对本发明优选的磺丙基、磺酸基或羧甲基阳离子交换色谱柱，较佳的选用含有氯化钠或氯化钾的磷酸盐缓冲溶液作为流动相。磷酸盐缓冲溶液的pH值较佳的为6.8～7.2，更佳的为7.0。在高效液相色谱梯度洗脱程序中，通过调节泵的输入梯度，使流动相氯化钠或氯化钾盐浓度的不断增加，从而分离乳铁蛋白，具体过程如下：流动相中，随着氯化钠或氯化钾的浓度的不断增加，不与色谱柱阳离子基团结合的正电蛋白或结合力较弱的蛋白被率先洗脱出来，洗脱液中盐浓度的不断提高，当洗脱液中氯化钠或氯化钾的浓度达到0.9mol/L～1mol/L时，乳铁蛋白开始洗脱出来，当盐浓度达到1.1～1.2mol/L时乳铁蛋白基本被洗脱完全，此时继续提高浓度直至1.4～1.5mol/L并持续一段时间，使其他结合力更强的杂质被完全洗脱出来，从而有利于色谱柱的反复使用。
本发明一优选实例中，高效液相色谱法的梯度洗脱程序如下：
上述优选条件中，所述的磷酸盐缓冲溶液中的共轭酸碱较佳的为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度较佳的为0.01～0.05mol/L，更佳为0.02mol/L；所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。
本发明中，高效液相色谱法测定的其他色谱条件为本领域常规条件。优选条件为：流动相流速较佳的为0.2～1.0mL/min，更佳的为0.5mL/min；检测波长较佳的为260～300nm，更佳的为280nm；柱温较佳的为25～30℃，更佳的为30℃。
本发明中，乳铁蛋白的含量可通过本领域常用的定量分析方法确定的，较佳地选用外标法或内标法计算峰面积，从而确定乳铁蛋白的含量。
本发明中所述的硫酸铵、磷酸盐、氯化钠和氯化钾的纯度可用本领域常规使用纯度，较佳的选用分析纯。本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.本发明将乳制品的常规预处理方法与阳离子交换色谱柱两者之间有机的结合，解决了复杂乳制品体系中乳铁蛋白的快速富集和准确定量分析的问题，该法与目前常用的酶联免疫法相比，具有检测费用低、准确程度高、受环境变化影响小等优点，有利于乳铁蛋白在乳制品中的应用，且该法也为其他功能性乳成分的快速定量分析提供了一定的理论依据。
2.采用阳离子交换色谱柱对样品进行分离分析乳铁蛋白含量，与常规使用的凝胶色谱柱相比，除了依靠样品之间分子大小的差异和分子间作用力的不同来进行分离外，离子交换色谱还依靠样品在不同pH条件下所带电荷的多少来实现样品间的分离，使样品之间能够很好的实现基线分离，从而达到准确定量分析的目的。
3.本发明优选的预分离富集方法中，利用调节pH和硫酸铵分级沉淀来富集乳制品中的乳铁蛋白，与常规使用的蛋白纯化工艺超滤和柱层析相比，具有处理量小、快速、简单易行的特点。
附图说明
图1为乳铁蛋白标准品的HPLC曲线图。
图2为实施例1试验1中初乳的乳铁蛋白检测的HPLC曲线图。
图3为HPLC法测定乳铁蛋白质量浓度的标准曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下述实施例中，缓冲溶液的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。
实施例1～3的高效液相色谱法条件：
色谱柱：IEC CM-825羧甲基弱阳离子交换色谱柱(8mm×75mm，Shodex公司，日本)；流动相：A溶液：pH 7.0的0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液；B溶液：pH 7.0的含1.5mol/L NaCl的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液；流速：0.5mL/min；检测波长：280nm；进样体积：20μL；柱温：30℃。
工作曲线的绘制(外标法测定物质含量)：
准确称取乳铁蛋白标准品(江南大学测试中心提供，图1)制成的乳铁蛋白溶液浓度分别为0.05～4.0mg/mL；用高效液相色谱测定溶液在280nm处的吸收峰绘制标准曲线如下：Y＝494439X+25044(R2＝0.9991，图3)。
实施例1初乳粉中乳铁蛋白的含量测定
准确称取5g初乳粉(由戴纬林国际贸易公司提供)样品，使其完全溶解于200mL水中，然后以5000r/min速度离心30min，去除上层漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀盐酸将初乳溶液调节至pH值为4.6，去除初乳中的酪蛋白，得到乳铁蛋白粗品，即乳清溶液。
向搅拌的乳清溶液中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵浓度为40％，静置3h，离心取其上清液部分；然后再向上清液中缓慢添加硫酸铵至硫酸铵浓度为80％，静置3h，离心取其沉淀部分即得到预纯化富集的乳铁蛋白，百分比为质量百分比。
将富集乳铁蛋白样品用pH7.0的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液溶解于10mL容量瓶中，调整pH值至7.0，再用0.45μm纤维素滤膜针式过滤器至样品瓶内，摇匀后供高效液相色谱测定。离子交换色谱柱分离样品梯度如下表1：
表1采用离子交换色谱柱分离样品的梯度洗脱表
通过上述分析方法对同一份初乳粉样品进行5次分析，试验1的HPLC测定如图2所示，每次分析都能够将乳铁蛋白与其他杂蛋白的基线分离，对照标准曲线，结果如下表2：
表2同一初乳粉的乳铁蛋白含量的测定
上表2结果计算得到的相对标准偏差RSD＝2.70％。
由上式可以看出，相对偏差为2.70％，表明其重现性良好。
实施例2婴幼儿奶粉中乳铁蛋白的含量测定
准确称取20～30g婴幼儿奶粉(市售，光明乳业股份有限公司生产)样品，使其完全溶解于200mL水中，然后以5000r/min速度离心30min，去除上层漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀盐酸将乳粉溶液调节至pH值为4.6，离心去除奶粉中的酪蛋白，得到乳铁蛋白粗品，即乳清溶液。
向乳清溶液中缓慢添加硫酸铵至硫酸铵浓度为40％，静置3h，离心取其上清液部分；然后再向上清液中缓慢添加硫酸铵至硫酸铵浓度为80％，静置3h，离心取其沉淀部分即得到预纯化富集的乳铁蛋白，百分比为质量百分比。
将富集乳铁蛋白样品用pH7.0的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液溶解于10mL容量瓶中，调整pH值至7.0，再用0.45μm纤维素膜针式过滤器过滤至样品瓶内，摇匀后供高效液相色谱测定。离子交换色谱柱分离样品梯度如下表3：
表3采用离子交换色谱柱分离样品的梯度洗脱表
通过上述分析方法对同一婴幼儿奶粉样品进行5次分析，每次分析都能够很好的实现乳铁蛋白与其他杂蛋白的基线分离，对照标准曲线，结果如下表4：
表4同一份婴幼儿奶粉中乳铁蛋白含量的测定
上表4结果计算所得的相对标准偏差RSD＝3.41％。
由上式可以看出，相对偏差为3.41％，表明其重现性良好。
实施例3乳饮料中乳铁蛋白的含量测定
取乳饮料样品(光明乳业有限公司技术中心自制)500ml，以5000r/min速度离心30min，去除上层漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀盐酸将乳饮料调节至pH值为4.6，离心去除酪蛋白，得到乳铁蛋白粗品，即乳清溶液。
向乳清溶液中缓慢添加硫酸铵至硫酸铵浓度为40％，静置3h，离心取其上清液部分；然后再向上清液中缓慢添加硫酸铵至硫酸铵浓度为80％，静置3h，离心取其沉淀部分即得到预纯化富集的乳铁蛋白，百分比为质量百分比。
将富集乳铁蛋白样品用pH7.0的0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液溶解于10mL容量瓶中，调整pH值至7.0，再用0.45μm纤维素针式过滤器过滤至样品瓶内，摇匀后供高效液相色谱测定。离子交换色谱柱分离样品梯度如下表5：
表5采用离子交换色谱柱分离样品的梯度洗脱表
通过上述分析方法对同一种乳饮料样品进行5次分析，每次分析都能够很好的实现乳铁蛋白与其他杂蛋白的基线分离，对照标准曲线，结果如下表6：
表6同一种乳饮料中乳铁蛋白含量的测定
上表6结果计算所得的相对标准偏差RSD＝3.10％。
由上式可以看出，相对偏差为3.10％，表明其重现性良好。
实施例4对婴幼儿奶粉中乳铁蛋白的含量测定
准确称取20～30g婴幼儿奶粉(市售，光明乳业股份有限公司生产)样品，使其完全溶解于200mL水中，然后以3000r/min速度离心30min，去除上层漂浮的脂肪；再用0.5mol/L稀盐酸将初乳溶液调节至pH值为4.4，去除初乳中的酪蛋白，得到乳铁蛋白粗品，即乳清溶液。
向搅拌的乳清溶液中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵浓度为50％，静置1h，离心取其上清液部分；然后再向上清液中缓慢添加硫酸铵至硫酸铵浓度为90％，静置1h，离心取其沉淀部分即得预纯化富集的乳铁蛋白，百分比为质量百分比。
将富集乳铁蛋白样品用pH7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液溶解于10mL容量瓶中，调整pH值至7.2，再用0.45μm纤维素滤膜针式过滤器至样品瓶内，摇匀后供高效液相色谱测定。
高效液相色谱法条件：色谱柱：IEC SP-825磺丙基弱阳离子交换色谱柱(8mm×75mm，Shodex公司，日本)；流动相：A溶液：pH 7.2的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液；B溶液：pH 7.2的含1.5mol/L KCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液；流速：0.2mL/min；检测波长：260nm；进样体积：10μL；柱温：25℃。
离子交换色谱柱分离样品梯度如下表1：
表1采用离子交换色谱柱分离样品的梯度洗脱表
通过上述分析方法对婴幼儿奶粉进行分析，将乳铁蛋白与其他杂蛋白的基线分离，结果样品含量为0.535mg·g-1。
实施例5初乳粉中乳铁蛋白的含量测定
准确称取5g初乳粉(由戴纬林国际贸易公司提供)样品，使其完全溶解于200mL水中，然后以5000r/min速度离心15min，去除上层漂浮的脂肪；再用0.5mol/L稀盐酸将初乳溶液调节至pH值为4.8，去除初乳中的酪蛋白，得到乳铁蛋白粗品，即乳清溶液。
向搅拌的乳清溶液中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵浓度为30％，静置3h，离心取其上清液部分；然后再向上清液中缓慢添加硫酸铵至硫酸铵浓度为70％，静置3h，离心取其沉淀部分即得预纯化富集的乳铁蛋白，百分比为质量百分比。
将富集乳铁蛋白样品用pH6.8的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液溶解于10mL容量瓶中，调整pH值至6.8，再用0.45μm纤维素滤膜针式过滤器至样品瓶内，摇匀后供高效液相色谱测定。
高效液相色谱法条件：色谱柱：SCX-NP磺酸基弱阳离子交换色谱柱(8mm×75mm，Proteomix公司)；流动相：A溶液：pH 6.8的0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液；B溶液：pH 6.8的含1.5mol/LNaCl的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液；流速：1.0mL/min；检测波长：300nm；进样体积：20μL；柱温：30℃。
离子交换色谱柱分离样品梯度如下表1：
表1采用离子交换色谱柱分离样品的梯度洗脱表
通过上述分析初乳粉样品，将乳铁蛋白与其他杂蛋白的基线分离，结果样品含量为1.825mg·g-1。
Claims (10)
1、一种测定乳制品中乳铁蛋白含量的方法，其特征在于：其步骤包括将乳制品按照现有方法预提纯富集乳铁蛋白，再通过阳离子交换色谱柱进行高效液相色谱测定含量。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的阳离子交换色谱柱为弱阳离子交换色谱柱。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的阳离子交换色谱柱为磺丙基、磺酸基或羧甲基阳离子交换色谱柱；所述的阳离子交换色谱柱规格为≥8.0×7.5mm。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法测定的流动相溶液为pH值为6.8～7.2的含有氯化钠或氯化钾的磷酸盐缓冲溶液；所述的高效液相色谱法的梯度洗脱程序为：
5、如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法的梯度洗脱程序为：
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法测定的色谱条件为：流动相流速为0.2～1.0mL/min；检测波长为260～300nm；柱温为25～30℃。
7、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法测定的进样及预处理步骤为：
①将预提纯富集的乳铁蛋白样品溶于pH值为6.8～7.2的磷酸盐缓冲溶液中，得进样溶液；
②去除杂质：将进样溶液用针式过滤器进行过滤，流动相溶液用水相滤膜过滤，滤膜孔径为≤0.45μm；
③进样：进样体积为10～20μL。
8、如权利要求4或7所述的方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲溶液中的共轭酸碱为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01～0.05mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。
9、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的现有方法预提纯富集乳铁蛋白的步骤如下：
①离心脱脂：将乳制品溶解于水中得复原乳，离心脱脂；
②去除酪蛋白：将脱脂乳用0.2mol/L～0.5mol/L盐酸溶液调节pH为4.4～4.8，离心去除酪蛋白，获得乳清溶液；
③盐析：硫酸铵分级沉淀法步骤如下：将乳清溶液搅拌加入硫酸铵至硫酸铵浓度为30％～50％，静置1～3h；离心并取上清液；将上清液搅拌加入硫酸铵至硫酸铵浓度为70％～90％，静置1～3h；离心取沉淀即得预提纯富集的乳铁蛋白，百分比为质量百分比；
上述步骤中所述的离心的条件为：离心速度为3000～5000r/min，离心时间15～30min。
10、如权利要求1或9所述的方法，其特征在于：所述的乳制品为初乳、婴幼儿奶粉、含有乳铁蛋白的乳粉、还原乳或含乳饮料。
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