CN104634910B - 一种检测乳制品中乳铁蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测乳制品中乳铁蛋白（LF）的方法。该方法包括对待测乳制品进行预处理后再进行高效液相色谱分析检测的过程，其中，所述预处理的过程包括：将待测乳制品调配成质量浓度0.5%～5%的溶液作为待测样品溶液，离心，离心后除去上浮的脂肪；然后将除去脂肪的样品溶液的pH值调节到乳铁蛋白的等电点使样品中的乳铁蛋白沉淀，离心后弃去上清液；将乳铁蛋白沉淀用三氟乙酸溶液溶解，进行高效液相色谱分析检测。本发明的方法简化了传统的样品预处理步骤，可将样品的前处理时间由原来的几小时缩短到现在的几十分钟；且检出限可达到1mg/100g，适合低含量LF的检测。

Description

一种检测乳制品中乳铁蛋白的方法

技术领域

本发明是关于一种检测乳制品中乳铁蛋白的方法，属于乳品检测技术领域。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，简称LF)是一种天然的、具有免疫功能的糖蛋白，由转铁蛋白转变而来。研究表明，乳铁蛋白是一种多功能蛋白质，具有广谱抗菌、抗病毒感染、调节体内铁的平衡、调节骨髓细胞的生成、促进细胞的生长、调节机体免疫功能、增强机体抗病能力、抑制人体肿瘤细胞等作用。目前，乳铁蛋白作为功能性成分已广泛应用于食品行业。

现有测定乳制品中乳铁蛋白含量的方法有很多，如酶联免疫法（ELISA法）、凝胶色谱法、紫外分光光度法、免疫扩散法、放射免疫检测法、免疫组织化学染色法、毛细管电泳法、亲和层析法等多种方法。ELISA法虽然灵敏度高，但要进行多重的孵化、洗涤和清洗，操作过程繁琐、耗时，价格昂贵，且重现性不好；紫外分光光度法虽然快速简便，但其准确性稍差，不适合乳铁蛋白的准确定量；凝胶色谱法仅适用于高纯度的样品测定；免疫扩散法的检测范围有限，仅能实现LF在一定范围内的定性检测，且操作繁琐；放射免疫检测法存在一定的放射危害；免疫组织化学染色法，只能用于定性；毛细管电泳仪、亲和层析柱等因设备昂贵，大多工厂的实验室均不配备，也不适合工厂的在线检测。

目前也有采用液相色谱法测定乳制品中乳铁蛋白的方法，比如：CN 101672835A公开了一种测定乳制品中乳铁蛋白的方法，其中是先通过离心脱脂、去除酪蛋白和盐析等步骤提纯富集牛乳中的乳铁蛋白，然后再通过高效液相色谱测定其含量。“反相高效液相色谱法检测牛初乳乳铁蛋白的方法研究”（程静，高学军，刘晓飞，姚永豪，佟慧丽，《乳业科学与技术》，2009年01期）公开了一种反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定牛初乳乳铁蛋白的含量的方法，其中需要先通过离心、离子交换层析富集牛初乳中的乳铁蛋白，然后再测定其含量，并对色谱条件进行了优化。然而，目前的液相色谱法测定乳制品中乳铁蛋白的方法的最低检出限为2.5mg/100g，不适合乳铁蛋白含量低于2.5mg/100g的样品的检测。并且，这种方法需要先通过盐析提纯富集乳铁蛋白，而一般用于盐析的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等，如前述专利CN 101672835A中即是用硫酸铵分级沉淀法对样品中的乳铁蛋白进行富集，主要利用的是乳铁蛋白和杂蛋白在不同浓度硫酸铵溶液中溶解度的不同而达到分离的目的，而硫酸铵分级沉淀法一般都需要经过半饱和硫酸铵溶液和饱和硫酸铵溶液的分级沉淀才能将乳铁蛋白和杂蛋白分离开，操作步骤繁琐，费时。

因此，开发一种低检出限的检测乳铁蛋白的简便方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种低检出限的检测乳铁蛋白的方法，弥补业界低含量乳铁蛋白检测技术的空白。

为此，本发明提供了一种检测乳制品中乳铁蛋白的方法，该方法是一种低检出限的乳铁蛋白的高效液相色谱法，操作简便。

根据本发明的具体实施例，本发明提供的检测乳制品中乳铁蛋白的方法包括对待测乳制品进行预处理后再进行高效液相色谱分析检测的过程，其中，所述预处理的过程包括：

将待测乳制品调配成质量浓度0.5%～5%的溶液作为待测样品溶液，离心，离心后除去上浮的脂肪；具体实施时，当待测乳制品为液态乳制品时，可以适当稀释定容（通常可控制其中总固形物含量0.5%～5%）后直接离心除去上浮的脂肪；当待测乳制品为固体时，先配成质量浓度为0.5%～5%的溶液再离心除去上浮的脂肪；

将除去脂肪后的样品溶液的pH值调节到乳铁蛋白的等电点使样品中的乳铁蛋白沉淀，离心后弃去上清液；

将乳铁蛋白沉淀用三氟乙酸溶液溶解，进行高效液相色谱分析检测。

本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法中，主要是通过除脂、调pH值、溶解三个步骤富集乳制品中的乳铁蛋白，一方面由于省去了传统盐析（硫酸铵分级沉淀法）这个相对繁琐的步骤，简化了样品的前处理步骤，可将样品的前处理时间缩短；另一方面由于通过调节LF的等电点而使样品中的LF沉淀，可使检测方法的检出限降低，适合低含量LF的检测。

本发明中，除特别注明外，所述百分比及比例均为重量百分比及比例。

根据本发明的具体实施例，本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法中，除去样品中的脂肪的离心条件为：4～8℃，1500～2000rpm，离心15～20min。

根据本发明的具体实施例，本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法中，是将除去脂肪后的样品溶液的pH值调节到7.8～8.0使样品中的乳铁蛋白沉淀，在4～8℃，1500～2000rpm离心10～15min后弃去上清液。

根据本发明的具体实施例，本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法中，溶解沉淀用的三氟乙酸溶液为三氟乙酸质量浓度为0.08%～0.12%的水溶液。三氟乙酸溶液的用量视沉淀量可以适当调整。通常情况下，可控制每50mL待测样品溶液中的沉淀量使用5mL三氟乙酸溶液溶解。

根据本发明的具体实施例，本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法中，用三氟乙酸溶液溶解后的样品溶液可先过0.45μm的微孔滤膜，之后再上机进行高效液相色谱分析检测。

根据本发明的具体实施例，本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法中，用三氟乙酸溶液溶解后的样品溶液还可以是先超声处理10～15min以使沉淀充分溶解（实验室常规超声强度即可），之后过0.45μm的微孔滤膜，再上机进行高效液相色谱分析检测。

根据本发明的具体实施例，本发明还对高效液相色谱的分析条件进行了优化。具体地，本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法中，所述高效液相色谱条件主要是流动相的组成和检测波长会直接影响到本发明的检测效果。本发明中，优选控制流动相的组成为：流动相由乙腈、0.5M氯化钠溶液及三氟乙酸组成，其中，乙腈的含量为45～50%；0.5M氯化钠溶液的含量为50～55%；三氟乙酸的含量为0.02～0.05%；并控制检测波长为220nm。

在本发明的具体实施例中，流动相的组成如下：

A：乙腈+氯化钠溶液（0.5M）+三氟乙酸=45%＋54.95%＋0.05%

B：乙腈+氯化钠溶液（0.5M）+三氟乙酸=49.97%＋50%＋0.03%。

更具体的高效液相色谱条件为：C18柱；流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。

根据本发明的具体实施例，本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法包括：

标准曲线的绘制：将乳铁蛋白标准品用0.1%三氟乙酸溶液溶解，稀释至浓度为1～50mg/100mL，用高效液相色谱仪对标准品溶液进行检测，根据乳铁蛋白标准溶液的浓度和对应的检测结果之间的关系绘制标准曲线；

样品处理：对待测乳制品进行如前所述的预处理，用高效液相色谱仪进行检测，获得检测结果；例如，可以是称取20g液体样品或称取0.5g固体样品，用去离子水溶解定容至50mL，4～8℃、1500～2000rpm离心15～20min，去除上浮的脂肪后调节溶液的pH值到7.8～8.0，4～8℃、1500～2000rpm离心10～15min，离心后弃去上清液，将沉淀用5mL的0.1%三氟乙酸溶液溶解并定容于10mL的容量瓶中，过0.45μm的微孔滤膜后上机进行检测；

结果计算：根据标准曲线及样品的检测结果计算出乳制品中乳铁蛋白的含量。

本发明中，未详细提及的操作条件例如调节pH值、色谱分析的其它条件等按照所属领域的常规操作进行即可。

本发明的检测乳制品中乳铁蛋白的方法，可适用于对乳粉或液态乳制品等乳制品中的乳铁蛋白含量进行检测。其中先通过离心去除样品中的脂肪，然后将溶液的pH值调节到LF的等电点（7.8～8.0）使样品中的LF沉淀，离心后弃去上清液，将沉淀用三氟乙酸溶液溶解，然后进行高效液相色谱分析检测，省去了传统的盐析步骤，可将样品的前处理时间大大缩短（由原来的几小时缩短到几十分钟）；并且，本发明通过调节LF的等电点而使样品中的LF沉淀，可使检测方法的检出限达到1mg/100g，适合低含量LF的检测（所述乳制品中乳铁蛋白含量范围为≥1mg/100g）；此外，尽管本发明省去了现有技术采用的硫酸铵分级沉淀对样品中的LF进行富集，但通过调节LF的等电点同样也可以使LF得到富集，且纯度相对较高。

附图说明

图1-图5为本发明具体实施例1中不同浓度的LF标准溶液的图谱。

图6为本发明具体实施例1中所绘制的LF标准曲线。

图7为本发明具体实施例1中待测样品的图谱。

图8为本发明具体实施例2中所绘制的LF标准曲线。

图9为本发明具体实施例3中所绘制的LF标准曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明技术方案的实施和所具有的有益效果，但不能认定为对本发明的可实施范围的任何限定。

实施例一

流动相的配置：

A:乙腈+氯化钠溶液（0.5M）+三氟乙酸=45%＋54.95%＋0.05%

B:乙腈+氯化钠溶液（0.5M）+三氟乙酸=49.97%＋50%＋0.03%

高效液相色谱参考条件如下：C18柱；流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。

本发明的检测乳制品中LF的方法包括如下步骤：

1、吸取适量的LF标准储备液于100mL容量瓶中，用0.1%三氟乙酸溶液稀释至每100毫升相当于1、5、10、20、50mg的标准工作液系列。用高效液相色谱仪进行检测分析，检测所得的图谱进行积分后的峰面积分别为5100、24800、48900、112000、253000，见图1-图5所示。根据上述标准溶液的浓度及对应的峰面积之间的关系利用Excel绘制标准曲线1，如图6所示，所得标准曲线的线性相关系数为0.9974。

2、称取19.5400g液体乳制品样品，用去离子水定容至50mL，4℃、1500rpm，离心20min。去除上浮的脂肪后调节溶液的pH值到7.8，4℃、2000rpm，离心10min，离心后弃去上清液，将沉淀用5mL浓度为0.1%三氟乙酸溶液溶解并定容于10mL的容量瓶中，过0.45μm的微孔滤膜后，用高效液相色谱仪进行检测。

3、根据步骤2中用Agilent公司的Agilent-1100高效液相色谱仪检测的图谱（见图7）得到该乳制品样品中LF的峰面积为12000，通过计算得出该乳制品样品中LF的含量为10.86mg/100g。

实施例二

流动相的配置：

A:乙腈+氯化钠溶液（0.5M）+三氟乙酸=45%＋54.95%＋0.05%

B:乙腈+氯化钠溶液（0.5M）+三氟乙酸=49.97%＋50%＋0.03%

高效液相色谱参考条件如下：

C18柱；流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。

本发明的检测乳制品中LF的方法包括如下步骤：

1、吸取适量的LF标准储备液于100mL容量瓶中，用0.1％三氟乙酸溶液稀释至每100毫升相当于1、5、10、20、50mg的标准工作液系列。用高效液相色谱仪进行检测分析，检测所得的图谱进行积分后的峰面积分别为4950、25100、49600、105000、249000。根据上述标准溶液的浓度及对应的峰面积之间的关系利用Excel绘制标准曲线2，如图8所示，所得标准曲线的线性相关系数为0.9994。

2、称取20.3290g液体乳制品样品，用去离子水定容至50mL，4℃，2000rpm，离心15min。去除上浮的脂肪后调节溶液的pH值到8.0，4℃，1500rpm，离心15min，离心后弃去上清液，将沉淀用5mL浓度为0.1％三氟乙酸溶液溶解，超声波处理15min，定容于10mL的容量瓶中，过0.45μm的微孔滤膜后，用高效液相色谱仪进行检测。

3、根据步骤2中用Agilent公司的Agilent-1100高效液相色谱仪检测的图谱得到该乳制品样品中LF的峰面积为11800，通过计算得出该乳制品样品中LF的含量为10.73mg/100g。

实施例三

流动相的配置：

A:乙腈+氯化钠溶液（0.5M）+三氟乙酸=45%＋54.95%＋0.05%

B:乙腈+氯化钠溶液（0.5M）+三氟乙酸=49.97%＋50%＋0.03%

高效液相色谱参考条件如下：

C18柱；流速：1.2mL/min；柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。

本发明的检测乳制品中LF的方法包括如下步骤：

1、吸取适量的LF标准储备液于100mL容量瓶中，用0.1％三氟乙酸溶液稀释至每100毫升相当于1、5、10、20、50mg的标准工作液系列。用高效液相色谱仪进行检测分析，检测所得的图谱进行积分后的峰面积分别为5030、25400、52600、110000、251000。根据上述标准溶液的浓度及对应的峰面积之间的关系利用Excel绘制标准曲线3，如图9所示，所得标准曲线的线性相关系数为0.9983。

2、称取0.5280g固体乳粉样品，用去离子水溶解后定容至50mL，4℃，1500rpm，离心15min。去除上浮的脂肪后调节溶液的pH值到7.8，4℃，1500rpm，离心15min，离心后弃去上清液，将沉淀用5mL浓度为0.1％三氟乙酸溶液溶解，超声波处理10min后定容于10mL的容量瓶中。过滤后将滤液过0.45μm的微孔滤膜后，用高效液相色谱仪进行检测。

3、根据步骤2中用Agilent公司的Agilent-1100高效液相色谱仪检测的图谱得到该乳制品样品中LF的峰面积为13020，通过计算得出该乳制品样品中LF的含量为400.46mg/100g。

本发明的方法与传统硫酸铵分级沉淀法的对比

以市售某品牌纯牛奶为待测样品，采用本发明上述实施例一的方法对其中的乳铁蛋白含量进行检测，未检测到其中含有乳铁蛋白。

采用传统硫酸铵分级沉淀法对上述市售纯牛奶进行前处理，将得到的上清液过0.45μm的微孔滤膜后，用高效液相色谱仪进行检测，也未检出其中含有乳铁蛋白。

在上述市售某品牌纯牛奶中添加乳铁蛋白标准品，理论添加值为5mg/100g，将其分为三份，分别采用如上述本发明的实施例一、实施例二中步骤2的方法条件进行检测并对照相应的标准曲线进行计算，同时以传统的硫酸铵分级沉淀法的检测结果进行对比。检测结果列于下表：

比较上述检测结果可以看出，采用硫酸铵分级沉淀法对理论添加值为5mg/100g的乳制品样品进行检测，检测结果仅为3.46mg/100g，回收率为69.2%，低于检测方法所要求的80～120%的回收率。而采用本发明上述实施例一的方法的检测结果为：5.20mg/100g，回收率为104%；采用实施例二的方法的检测结果为4.75mg/100g，回收率为95.0%。这说明现有的硫酸铵分级沉淀法虽然也可以对样品中的LF进行富集，但得到的LF的纯度不如采用本发明的调节LF等电点法的高。

在同样的上述市售某品牌纯牛奶中添加乳铁蛋白标准品，理论添加值为1mg/100g，分别采用上述实施例一和实施例二中步骤2的方法进行检测，对照相应的标准曲线进行计算，所检测得到的结果如下表所示：

从上表可以看出，上述两种实施例的检测结果的回收率均介于80～120%，符合仪器检测法对回收率的要求，同时可表明本发明方法的检出限可达到1mg/100g。

Claims (6)

1.一种检测乳制品中乳铁蛋白的方法，所述乳制品为乳粉或液态乳制品，该方法包括对待测乳制品进行预处理后再进行高效液相色谱分析检测的过程，其中，所述预处理的过程包括：

将待测乳制品调配成质量浓度0.5％～5％的溶液作为待测样品溶液，离心，离心后除去上浮的脂肪；其中，除去样品中的脂肪的离心条件为：4～8℃，1500～2000rpm，离心15～20min；

将除去脂肪后的样品溶液的pH值调节到乳铁蛋白的等电点使样品中的乳铁蛋白沉淀，离心后弃去上清液；其中，是将除去脂肪后的样品溶液的pH值调节到7.8～8.0使样品中的乳铁蛋白沉淀，在4～8℃，1500～2000rpm，离心10～15min后弃去上清液；

将乳铁蛋白沉淀用三氟乙酸溶液溶解，进行高效液相色谱分析检测；其中，所述高效液相色谱分析检测中，控制流动相的组成为：流动相由乙腈、0.5M氯化钠溶液及三氟乙酸组成，其中，乙腈的含量为45～50％；0.5M氯化钠溶液的含量为50～55％；三氟乙酸的含量为0.02～0.05％；并控制检测波长为220nm。

2.根据权利要求1所述的检测乳制品中乳铁蛋白的方法，其中，溶解沉淀用的三氟乙酸溶液为三氟乙酸质量浓度为0.08％～0.12％的水溶液。

3.根据权利要求1所述的检测乳制品中乳铁蛋白的方法，其中，用三氟乙酸溶液溶解后的样品溶液过0.45μm的微孔滤膜，之后再上机进行高效液相色谱分析检测。

4.根据权利要求1所述的检测乳制品中乳铁蛋白的方法，其中，用三氟乙酸溶液溶解后的样品溶液先经超声处理10～15min，之后过0.45μm的微孔滤膜，再上机进行高效液相色谱分析检测。

5.根据权利要求1所述的检测乳制品中乳铁蛋白的方法，该方法包括：

标准曲线的绘制：将乳铁蛋白标准品用0.10％三氟乙酸溶液溶解，稀释至浓度为1～50mg/100mL，用高效液相色谱仪对标准品溶液进行检测，根据乳铁蛋白标准溶液的浓度和对应的检测结果之间的关系绘制标准曲线；

样品处理：对待测乳制品进行如权利要求1～4任一项中所述的预处理，用高效液相色谱仪进行检测，获得检测结果；

结果计算：根据标准曲线及样品的检测结果计算出乳制品中乳铁蛋白的含量。

6.根据权利要求1～5任一项所述的检测乳制品中乳铁蛋白的方法，其中，所述待测样品溶液中乳铁蛋白含量范围为≥1mg/100g。