CN103267822B

CN103267822B - 一种牛乳铁蛋白定量检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103267822B
Application number: CN201310187213.5A
Authority: CN
Inventors: 任一平; 张京顺; 赖世云; 蔡增轩; 徐小民
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2033-05-17
Also published as: CN103267822A

Abstract

本发明提供了一种牛乳铁蛋白的定量检测试剂盒，主要包括牛乳铁蛋白特异肽（氨基酸序列为：LRPVAAEIYGTK）、同位素标记牛乳铁蛋白特异肽（氨基酸序列为：LRPV^*AAEI^*YGTK，其中I^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸）和同位素标记牛乳铁蛋白内标标准品（氨基酸序列为：GRDPYKLRPV^*AAEI^*YGTKESPQTHY，其中I^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸）；本发明试剂盒使用时具有样品预处理简单、灵敏度高、特异性强、检测成本低等优点，适于大批量样本的快速检测，可以满足各类乳制品中牛乳铁蛋白的准确定量。

Description

一种牛乳铁蛋白定量检测试剂盒及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种牛乳铁蛋白定量检测试剂盒及其应用。

（二）背景技术

牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin）分子的主体是由689个氨基酸残基组成的铁离子结合性单链糖蛋白，含有2个铁结合部位，具有可逆的铁结合特性，铁结合的乳铁蛋白随pH的降低而释放铁离子。通常，糖基化和铁结合率的不同会使不同状态和来源的乳铁蛋白的相对分子量有所差异，总体介于75～82.6kDa之间。牛乳铁蛋白与人乳中的乳铁蛋白的氨基酸组成比较相近，约有70%的氨基酸序列一致，且两者的铁结合能力相差不大，分别为93%和95%。乳铁蛋白作为一种新型的天然营养蛋白质，含有人体所需的多种氨基酸，具有广泛的生物学活性。其主要营养价值作用是与铁离子具有良好的可逆结合能力，能够促进儿童与妇女对铁的吸收率。此外乳铁蛋白可以夺走细菌生长所需的铁而抑制细菌生长繁殖，从而可以作为一种广谱抗菌剂。乳铁蛋白的生物学功能还包括提高机体免疫力、抗炎、抑制肿瘤细胞生长等。目前，乳铁蛋白已被公认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品、化妆品添加剂，美国食品药品管理局批准将其作为食品添加剂用于运动和功能性食品。近几年，市场上出现了大量声称添加牛乳铁蛋白的乳制品和配方食品，由于原料复杂、加工工艺不同等原因造成产品质量良莠不齐，但又没有建立准确有效的定量检测方法，其中主要原因是缺少快速有效的可准确定量检测的方法。

目前国内外用于牛乳铁蛋白的检测方法仍以SDS-PAGE法和酶联免疫化学法为主，其中前者为半定量方法，不能进行准确定量，由于操作繁琐费时不利于在常规检测中进行推广应用；而后者虽然具有良好的检测灵敏度和特异性，但是检测成本较高，且容易出现假阳性，不能准确有效检测由于生产加工而受到部分破坏的乳铁蛋白。近年来有研究者尝试了应用HPLC-UV的检测方法，由于分辨力差而无法用于复杂基质尤其是乳铁蛋白含量较低的食品检测；Li Jia等建立了毛细管电泳-紫外检测器的方法测定婴幼儿配方中的牛乳铁蛋白，样品经乙酸溶液溶解提取后离心过滤，根据不同蛋白组分在高压电场下的毛细管中的迁移不同而实现分离，采用214nm紫外光波长下进行检测，但是毛细管电泳法稳定性差、难重现，且只限于试样中非变性的牛乳铁蛋白定量的检测，而无法全面反映食品中乳铁蛋白的含量，进而无法全面评价产品的质量和营养价值。经查询，至今为止还未发现应用同位素内标肽稀释法，结合HPLC-ESI-MS/MS测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白的内标定量方法。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种应用同位素标记内标肽稀释法，结合HPLC-MS/MS可定量测定不同乳及乳制品中牛乳铁蛋白的试剂盒及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种牛乳铁蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛乳铁蛋白特异肽、同位素标记牛乳铁蛋白特异肽和同位素标记牛乳铁蛋白内标，所述牛乳铁蛋白特异肽的氨基酸序列为LRPVAAEIYGTK；所述同位素标记牛乳铁蛋白特异肽的氨基酸序列为LRPV^*AAEI^*YGTK，其中V^*和I^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳铁蛋白内标的氨基酸序列为GRDPYKLRPV^*AAEI^*YGTKESPQTHY，其中V^*和I^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

本发明试剂盒的关键：在碱性胰蛋白酶酶解的牛乳铁蛋白产物中经实验确认了牛乳铁蛋白所独自具有的多肽产物；根据该肽段的氨基酸序列设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标肽的序列，并经化学合成获得三种高纯度的多肽成品。试剂盒中的其他试剂和物品，可根据现有技术进行确定，也可根据需求在市场选择优化，例如参照CN102590413A中所使用的部分试剂。

本发明试剂盒中，牛乳铁蛋白特异肽（以下简称：特异肽）是从牛乳铁蛋白经酶解后所产生的多肽中筛选所得，将牛乳铁蛋白一级结构通过相关软件以胰蛋白酶为参数进行预测酶解，分析比较产生的理论酶解肽谱，发现LRPVAAEIYGTK是牛乳铁蛋白的特异肽段之一（附图1）。在Swiss-Prot和NCBI数据库检索比对发现，存在牛乳及其制品中的酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等其他蛋白质中均不存在与该氨基酸序列一致的氨基酸片段。经使用高分辨液相色谱串联质谱法检测鉴定结果表明：该氨基酸序列组成的多肽是牛乳铁蛋白经牛胰蛋白酶酶解后所特有的多肽，在未经酶解的样品中均不存在。经化学合成、提纯后纯度可达95%以上（附图2），在本试剂盒中作为定量标准物质使用。

本发明试剂盒中，同位素标记牛乳铁蛋白特异肽是依据牛乳铁蛋白特异肽的氨基酸序列，经化学合成的带有同位素标记氨基酸的特异肽（以下简称：同位素特异肽）。其氨基酸序列为LRPV^*AAEI^*YGTK，其中V^*和I^*为碳氮全同位素标记的氨基酸，经合成、提纯后纯度可达95%以上（附图3），而且经高分辨液相色谱串联质谱法检测鉴定其中不存在特异肽。在本试剂盒中作为同位素内标酶解后质谱标记物质使用。

本发明试剂盒中，同位素标记牛乳铁蛋白内标是专为定量测定而设计合成的内标物（以下简称：同位素内标）。其氨基酸序列为GRDPYKLRPV^*AAEI^*YGTKESPQTHY，其中V^*和I^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。该肽段具有与牛乳铁蛋白同等的酶解效率，并可获得等摩尔量的同位素特异肽，从而可对样品中的牛乳铁蛋白进行准确定量。经合成、提纯后可达95%以上的纯度（附图4），而且在测定过程中不产生特异肽。在本试剂盒中作为内标物质使用。

具体的，所述试剂盒中还包括：氯化钙（使用浓度100mM），碳酸氢铵（使用浓度50mM），二硫苏糖醇（使用浓度500mM），碘代乙酰胺（使用浓度500mM），胰蛋白酶（使用浓度200μg/mL）和甲酸。

本发明还涉及所述的试剂盒在定量检测乳或乳制品中牛乳铁蛋白含量中的应用。

各种合成肽的质量控制方法：

建立高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）和高效液相四级杆/时间飞行串联质谱联用（HPLC-Q-TOF）检测方法对牛乳铁蛋白特异肽，同位素特异肽，和同位素内标进行纯度与杂质鉴定。

①应用HPLC检测合成肽的纯度

称取肽段1mg，溶解于1mL水中，将溶解液用流动相稀释5倍后，用HPLC-UV法在220nm波长下进行检测，面积归一法计算目标肽纯度。

②应用HPLC-Q-TOF检测合成肽的杂质

称取肽段1mg，溶解于1mL水中，将溶解液用流动相稀释20倍后，HPLC-Q-TOF法进行检测，通过全扫描模式以质量数的差异来鉴别杂质。

其中液相色谱分离条件如下：色谱柱：C18（孔径）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.08%（v/v）的三氟乙酸水溶液，流动相B为含0.08%（v/v）的三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

其中质谱检测条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：40kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：800L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0，全扫描质量数区间200-2000m/z，停留时间100ms。

乳或乳制品中牛乳铁蛋白的测定方法：

本发明适用于各种含量的牛乳铁蛋白样品的定量检测，原料包括浓缩乳清粉、脱盐乳清粉、乳铁蛋白营养添加剂、生鲜乳等；产品包括婴幼儿配方粉、脱脂乳粉、全脂乳粉、高温杀菌奶、巴氏消毒奶、发酵型酸奶等。样品加入同位素内标后经胰蛋白酶酶切等样品前处理后，通过液相色谱分离，注入串联四级杆质谱，采用多反应监测方式进行检测，内标法计算结果。

所述样品前处理过程如下：称取待测样品适量，用温水溶解并稀释至总蛋白浓度约为1mg/mL，待冷却至室温，准确吸取500μL样品溶液，加入100μL同位素内标（1μM）和400μL NH₄HCO₃溶液（50mM）混匀，加入10μL DTT溶液（500mM），50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL IAA溶液（500mM），暗处静置30min，加入10μLCaCl₂溶液（100mM）和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL甲酸，室温静置30min，最后加900μL水使酶解液定容至2mL，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析。

所述液相色谱分离参考条件如下：色谱柱：C18（孔径）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

所述质谱检测参考条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：40kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：800L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。

所述质谱多反应监测方法的参数参考条件如下：牛乳铁蛋白特异肽的母离子为双电荷形式，氨基酸序列为LRPVAAEIYGTK，其质荷比为659.2m/z，它的两个特征碎片离子分别为737.2m/z和850.2m/z，对应的碰撞能量分别为32eV和30eV；同位素特异肽的母离子为双电荷形式，氨基酸序列为LRPV^*AAEI^*YGTK（其中V^*和I^*为碳氮全同位素标记的氨基酸），其质荷比为665.8m/z，它的两个特征碎片离子分别为742.9m/z和863.0m/z，对应的碰撞能量分别为32eV和30eV。

所述内标法计算过程如下：用牛乳铁蛋白特异肽和同位素特异肽配制成系列浓度的标准工作曲线溶液，与酶解后的样品溶液在相同的液相色谱质谱条件下进行分离检测，根据得到的标准工作曲线中牛乳铁蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得出线性方程Y=kX+b，其中Y为牛乳铁蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为牛乳铁蛋白特异肽的浓度，单位为nM；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。将酶解后样品溶液中测得的牛乳铁蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入线性方程，即可计算得到样液中牛乳铁蛋白特异肽的浓度，将此浓度代入含量计算公式即可得到被测样品中牛乳铁蛋白的含量C_x。公式中C_x为被测样品中牛乳铁蛋白的含量，单位为mg/100g；n_a为被测样液中牛乳铁蛋白特异肽的浓度的值；M_r为牛乳铁蛋白的分子量的值，为76095.1；V为被测样品的定容体积；V₁为被测样品溶液中取出用于酶解的体积；V₂为酶解体系的终体积。

本发明利用胰蛋白酶只作用于精氨酸（R）和赖氨酸（K）的专一性，把乳蛋白酶切成不同分子量的一系列多肽，从中选择只有牛乳铁蛋白所特有的多肽分子（特异肽）作为定性目标，并以此多肽的氨基酸序列为依据合成高纯度特异肽为定量标准品，然后设计合成高纯度的同位素标记特异肽和同位素内标物参与同位素稀释串联质谱法中酶解、色谱和质谱检测的全程定量。

本发明采用的装置为：高效液相串联四级杆质谱联用仪，高效液相四级杆/时间飞行串联质谱仪，并配备相应的控制软件，恒温水浴摇床或恒温箱，蛋白质序列合成仪，微量移液器。

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明试剂盒，配制齐全，可操作简便地完成试剂配制，易于在一般实验室推广应用；

2、先进可靠的质量检测和控制方法，保证了试剂盒的质量和检测结果的重现性；可满足大批量样品检测的需求。

3、本发明所开发的方法使用经研究设计合成的同位素标记内标物，能够更为准确地对乳与乳制品中的牛乳铁蛋白进行定量，保证了结果的可靠性。

4、本发明可用于同时检测样品中非变性和热变性的牛乳铁蛋白。

5、本发明所使用的试剂用量较少，检测成本较低，利于大批量样品的检测。

（四）附图说明

图1为本发明中所选牛乳铁蛋白特异肽在牛乳铁蛋白一级结构中的位置；

图2为本发明中的牛乳铁蛋白特异肽色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图3为本发明中的同位素特异肽的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图4为本发明中的同位素内标的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图5为本发明中的同位素特异肽与牛乳铁蛋白特异肽的线性比较图；

图6为本发明中的同位素内标与牛乳铁蛋白的酶解效率比较图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1．本发明同位素特异肽的设计与确定：

根据实验确定的牛乳铁蛋白特异肽的氨基酸序列，充分考虑其相关理化性质以及在质谱检测过程中的干扰与离子化效率问题，并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的缬氨酸（V^*）和异亮氨酸（I^*）设计合成了牛乳铁蛋白特异肽的同位素特异肽，其氨基酸序列为LRPV^*AAEI^*YGTK。

保留时间、线性和基质效应等要素在一定程度上可反映被测物质的色谱行为和质谱离子化效率，为了验证本发明所设计的同位素特异肽与牛乳铁蛋白特异肽，在色谱分离和质谱离子化过程中的行为是否最大程度上相近，实验设计比较了本发明中的同位素特异肽和牛乳铁蛋白特异肽，在相同色质谱条件下的保留时间、线性及其在不同基质中的基质效应。分别配制相同浓度的本发明中的同位素特异肽和牛乳铁蛋白特异肽，以及这二者的标准系列工作溶液，在相同的色谱质谱条件下进样分析，得二者的保留时间与线性回归方程（图5）。其中本发明中同位素特异肽和牛乳铁蛋白特异肽的保留时间一致，分别为3.04min，由此可见本发明中同位素特异肽和牛乳铁蛋白特异肽具有更相近的色谱行为。两者的线性回归方程分别为Y=66.130X-311.74和Y=64.067X+265.29，由图5可见本发明中同位素特异肽和牛乳铁蛋白特异肽在相同浓度时的信号响应比较相近，二者的线性关系相近，对其进行T-test分析表明二者无显著性差异（p=0.691>0.05），进而表明二者在质谱中的离子化、碰撞碎裂等过程中具有相近的质谱行为。

2．本发明同位素内标的设计与确定：

在配方食品等复杂基质样品中，蛋白的酶解过程存在众多的影响因素，可能影响蛋白的酶解效率，为消除这些不确定因素对定量结果带来的影响，在已设计选择并验证确定的同位素特异肽的基础上，充分考虑保留酶解位点的完整性并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的缬氨酸（V^*）和异亮氨酸（I^*）设计合成了同位素内标，其氨基酸序列为GRDPYKLRPV^*AAEI^*YGTKESPQTHY，该同位素内标经碱性胰蛋白酶酶解后可产生同位素特异肽LRPV^*AAEI^*YGTK。

为了验证本发明中的同位素内标与牛乳铁蛋白是否具有相近的酶解效率，设计进行了如下实验：

取配制成蛋白质总含量不大于1mg/mL的配方奶粉溶液和空白溶剂；将牛乳铁蛋白和本发明的同位素内标配成浓度均为5μM的混合标准溶液；吸取基质溶或空白溶剂500μL，加入80μL混合标准溶液和420μL NH₄HCO₃溶液（50mM）混匀，加入10μL DTT溶液（500mM），50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL IAA溶液（500mM），暗处静置30min，加入10μL CaCl₂溶液（100mM）和40μL200μg/mL胰蛋白酶（来源于牛胰腺，活力>10000BAEE units）溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL甲酸，室温静置30min，最后加900μL水使酶解液定容至2mL，然后过0.22μm微孔滤膜得到理论浓度为200nM的各物质对应的特异肽；另取牛乳铁蛋白特异肽和本发明的同位素特异肽分别配制成200nM的标准溶液，在相同的色谱质谱条件下进行检测分析，将各物质酶解后测得的对应特异肽浓度与理论浓度进行比较，计算得到对应物质的酶解效率（附图6）。由图6可知，在样品基质中，本发明的同位素内标具有与牛乳铁蛋白非常相近的酶解效率。

实施例2：试剂盒配制及使用说明

一、试剂配制：

1、牛乳铁蛋白特异肽标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质1管（该管内装有已预先准确称量的牛乳铁蛋白特异肽）中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μM的牛乳铁蛋白特异肽标准储备液；

2、同位素特异肽标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质2管（该管内装有已预先准确称量的同位素标记牛乳铁蛋白特异肽）中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μM的同位素特异肽标准储备液；

3、同位素内标标准储备液的配制：准确移取5mL超纯水，加入标准物质3管（该管内装有已预先准确称量的同位素内标）中，超声溶解（30s），所得溶液即为500μM的同位素内标标准储备液；

4、牛胰蛋白酶溶液的配制：准确移取10mL1.0%（v/v）乙酸水溶液，加入牛胰蛋白酶（试剂1）管中（该管内装有已预先准确称量的牛胰蛋白酶，来源于牛胰腺，活力>10000BAEE units），经超声溶解（30s），所得溶液即为1mg/mL的牛胰蛋白酶溶液；

5、碳酸氢铵溶液（NH₄HCO₃）的配制：准确称取3.95g NH₄HCO₃（试剂2）于1000mL容量瓶中，加入超纯水超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为50mM的碳酸氢铵溶液；

6、碘代乙酰胺（IAA）溶液的配制：准确称取0.925g IAA（试剂3）于10mL容量瓶中，加入50mM的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mM的碘代乙酰胺溶液；

7、二硫苏糖醇（DTT）溶液的配制：准确称取0.7712g DTT（试剂4）于10mL容量瓶中，加入50mM的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为500mM的二硫苏糖醇溶液；

8、氯化钙（CaCl₂）溶液的配制：准确称取0.111g CaCl₂（试剂5）于10mL容量瓶中，加入超纯水约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为100mM的氯化钙溶液。

二、样品前处理及分析：

称取待测样品适量，用温水溶解并稀释至总蛋白浓度约为1mg/mL，待冷却至室温，准确吸取500μL样品溶液，加入80μL同位素内标（5μM）和420μL NH₄HCO₃溶液（50mM）混匀，加入10μL DTT溶液（500mM），50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL IAA溶液（500mM），暗处静置30min，加入10μL CaCl₂溶液（100mM）和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL甲酸，室温静置30min，最后加900μL水使酶解液定容至2mL，然后将所得溶液过0.22μm微孔滤膜后进样分析。

实施例3：

样品类型：市售婴幼儿配方奶粉的定量测定。

称样品0.5g于100mL容量瓶中，加温水溶解，待冷却至室温加水定容至刻度，准确吸取500μL，加入80μL5μM同位素内标和420μLNH₄HCO₃溶液（50mM）混匀，加入10μL DTT溶液（500mM），50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL IAA溶液（500mM），暗处静置30min，加入10μL CaCl₂溶液（100mM）和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL纯甲酸，室温静置30min，最后加900μL水使酶解液定容至2mL，取所得样液按照前述方法步骤进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳铁蛋白的含量为37.3mg/100g，产品包装标示为38mg/100g。

实施例4：

样品类型：牛乳铁蛋白原料。

称样品0.5g于100mL容量瓶中，加温水溶解，待冷却至室温加水定容至刻度，将样液稀释10倍后，再准确吸取500μL，加入80μL5μM同位素内标和420μL NH₄HCO₃溶液（50mM）混匀，加入10μL DTT溶液（500mM），50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL IAA溶液（500mM），暗处静置30min，加入10μL CaCl₂溶液（100mM）和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL甲酸，室温静置30min，最后加900μL水使酶解液定容至2mL，取所得样液按照前述方法步骤进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳铁蛋白的含量为81.2g/100g，供货商提供的资料为牛乳铁蛋白含量大于80%。

实施例5：

样品类型：生鲜牛乳。

称样品2.0g于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，准确吸取500μL试样溶液，加入80μL5μM同位素内标和420μL NH₄HCO₃溶液（50mM）混匀，加入10μL DTT溶液（500mM），50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入30μL IAA溶液（500mM），暗处静置30min，加入10μLCaCl₂溶液（100mM）和40μL200μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温过夜酶解，次日取出加入10μL甲酸，室温静置30min，最后加900μL水使酶解液定容至2mL，取所得样液按照前述方法步骤进行检测分析，并用内标法计算结果，所测得样品中牛乳铁蛋白的含量为6.1mg/100g，在文献资料中报道的牛乳中乳铁蛋白含量范围（2-35mg/100g）内。

本发明试剂盒的牛乳铁蛋白定量检测方法具有以下特点：灵敏度高（定量限为0.5mg/100g），重现性好（RSD<6.55%，n=11），回收率高（93.2～107.3%，n=6），试样前处理操作简单、快速、成本低，广泛适用于各类试样中牛乳铁蛋白的准确定量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种牛乳铁蛋白定量检测试剂盒，包括氯化钙，碳酸氢铵，二硫苏糖醇，碘代乙酰胺，胰蛋白酶，甲酸，牛乳铁蛋白特异肽、同位素标记牛乳铁蛋白特异肽和同位素标记牛乳铁蛋白内标，所述牛乳铁蛋白特异肽的氨基酸序列为LRPVAAEIYGTK；所述同位素标记牛乳铁蛋白特异肽的氨基酸序列为LRPV^*AAEI^*YGTK，其中V^*和I^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳铁蛋白内标的氨基酸序列为GRDPYKLRPV^*AAEI^*YGTKESPQTHY，其中V^*和I^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

2.权利要求1所述的试剂盒在定量检测乳或乳制品中牛乳铁蛋白含量中的应用。