CN106855543A - 一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,包括以下步骤:(1)采用化学标签A对待测样品进行标记,得到标记样品;(2)采用带同位素标记的化学标签iso‑A对内标物进行标记,得到标记内标物;(3)将所述标记样品与标记内标物按照预设比例混匀,得到初样;(4)对初样进行预处理,得到进样样品;(5)将所述进样样品进行质谱检测。本发明将样品和内标物两种分别标记后,再将两者混合并置于同一反应体系下进行后续的处理工作,使得样品和内标物蛋白质在同一体系中所受到的基质效应、操作误差均相同,使得误差可以得以校正。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法。
背景技术
蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科常涉及的分析内容,在生化实验中,对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析,是经常进行的一项非常重要的工作。但是,由于蛋白质是一种十分重要的生物大分子,它的种类很多,结构不均一,分子量又相差很大,功能各异,这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。
现有蛋白质的定量方法主要是基于液相色谱质谱联用方法,为了控制、降低由于检测过程中带来的误差,可以在样品制备、检测过程中,加入内标。对于质谱来说,最理想的内标为同位素标记的内标,因为内标与被测物的理化性质完全一样,可以用于评估和校正前处理、色谱分离和离子化环节的误差。在质谱分离中,内标和被测物有显著的分子量(质合比)的差异,不会产生相互干扰。
其中蛋白质组学中最常用的标记技术是基于多肽层面的,它的目标在于通过一次操作,能够对所有蛋白质酶解多肽进行标记,通过标记物的同位素形式不同,可以在质谱中将多种多肽/蛋白质进行区分,现有技术中在多肽层面的标记方法包括二甲基法、iTRAQ法、TMT法、ICAT法等,可参见图1。现有基于多肽层面的标记方法进行标记时,存在许多不足,例如第一,多肽层面的标记方法使得两个样品在酶解之后混合,酶解前(提取、净化、还原、烷基化)的所有误差均无法得到校正,降低检测结果的精确度。第二,虽然其中iTRAQ法、TMT法、ICAT法三者均已有商品化试剂,但是商品化的标记试剂约为1000~3000元/反应,价格昂贵。
蛋白质的同位素标记技术还包括SILAC技术,其中SILAC蛋白质的生产步骤主要分成两步:(1)将目标蛋白基因转入大肠杆菌中;(2)将大肠杆菌在同位素标记的培养液中培养,使其表达同位素标记的蛋白质。SILAC同位素蛋白质与目标蛋白质具有完全一致的一级结构,理化结构相近,可以在样品提取前加入SILAC蛋白质作为内标,用于校正样品处理、检测过程中的全过程误差。但是SILAC技术存在以下不足:(1)SILAC蛋白合成的价格昂贵,据SILAC合成企业的估价,大约10mg SILAC蛋白质需要20万欧元左右,大约满足数百到一千次样品的检测需求,折合每次检测200~400欧元左右;(2)SILAC蛋白质的生产基于转基因表达技术,由于现有技术限制,不是所有的蛋白质均能成功通过该技术表达出来;(3)正常表达的蛋白质在表达完成后,会进行表达后修饰和蛋白质折叠,而转基因表达的蛋白质不会进行这两个步骤,所以转基因表达的蛋白质在空间结构上与正常表达蛋白质有显著区别。
由上述可知,现有蛋白质的同位素标记技术依然存在价格昂贵,操作繁琐,操作过程中存在一定的误差等诸多不足。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,使得操作过程中产生的误差得以校正,而且操作方便,成本较低。
本发明的技术方案为:一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,包括以下步骤:
(1)采用化学标签A对待测样品进行标记,得到标记样品;
(2)采用带同位素标记的化学标签iso-A对内标物进行标记,得到标记内标物;
(3)将所述标记样品与标记内标物按照预设比例混匀,得到初样;
(4)对初样进行预处理,得到进样样品;
(5)将所述进样样品进行检测。
本发明中化学标签A与化学标签iso-A为相同的标记物质,化学标签iso-A与化学标签A的不同之处在于,化学标签iso-A与化学标签A上的其中一种或多种化学元素互为同位素。
本发明的标记方法基于蛋白质层面,本发明将待测样品和内标物分别采用化学标签A和带同位素标记的化学标签iso-A标记后,再将两者混合并置于同一反应体系下进行后续的处理工作,使得待测样品和内标物在同一体系中所受到的基质效应、操作误差均相同,使得误差可以得以校正。
天然蛋白质具有一定的空间结构,形成或疏或密的三维结构。作为优选,所述步骤(1)中采用化学标签A对待测样品进行标记之前,将待测样品进行蛋白质变性处理。经由蛋白质变性处理可以破坏蛋白质中固定其空间结构的键,使结构松散,可以使得化学标签结合位点暴露出来,让化学标签A易于接触到其结合位点,增加化学标签结合率。
作为优选,所述步骤(1)中蛋白质变性处理方法包括有机试剂变性处理方法、无机盐变性处理方法、酸处理变性处理方法、碱处理变性处理方法、破坏氢键变性处理方法、破坏非共价键变性处理方法、还原二硫键变性处理方法、加热变性处理方法、超声处理变性处理方法以及加入表面活性剂变性处理方法中的一种或一种以上变性处理方法的组合。
作为优选,所述标记内标物和标记样品之间的分子量大于等于4Da。过小的分子量差异会导致同位素标记产物和非同位素标记产物的天然同位素重叠,导致结果相互干扰。化学标签iso-A可同位素标记的位点过少,可以通过增加化学标签的种类和数量达到这一目的。
本发明基于蛋白质层面的标记,而蛋白质由多个不同种类的氨基酸组成,本发明中可以选择的标记物有多种,因此相比于多肽层面的标记方法来说,本发明的适用性更广,作为优选,所述化学标签A为甲醛和氰基硼氢化物组成的标记组份、碘代乙酰胺、1,2-环己二酮、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、甘氨酰胺、碘代乙酰胺、焦碳酸二乙酯、琥珀酰酐、2-羟基-5-硝基苄溴以及四硝基甲烷中的至少一种组份。
根据上述优选标记组份,化学标签A的作用位点可广泛分布于20种常见氨基酸中的16种,包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。广泛的候选氨基酸侧链增加了本发明的适用范围,可以基本覆盖所有多肽可能性。
作为优选,所述标记位点为精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸中至少一种氨基酸的侧链。
本发明中步骤(4)中的预处理方法可以有多种,作为优选,所述步骤(4)中的预处理方法包括二硫键还原、半胱氨酸烷基化、非共价键断裂、翻译后修饰消除、蛋白酶解反应、蛋白质净化、多肽净化以及稀释处理方法中的一种或者一种以上处理方法的组合。化学标签标记后的内标物和化学标签标记后的待测样品处于同一反应体系下,其反应效率一致,可以用于互相校正基质效应对预处理带来的干扰,也可用于相互校正后续质谱检测中的基质效应问题。
质谱检测技术对多肽长度有一定要求,过短的多肽(少于6个氨基酸)的特异性小,易产生交叉反应;过长的多肽(大于20个氨基酸)在质谱检测中离子化效率低,多重电荷现象严重,导致灵敏度低。同时,氨基酸侧链与化学标签结合后,会影响部分以此为酶切位点的蛋白酶活性。作为优选,所述步骤(4)中的预处理方法包括蛋白酶解反应,所述蛋白酶解反应中的蛋白酶包括碱性胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白质酶K、Rhizopuspepsin、CysN、LysC、LysN、ArgC、ArgN、AspC、AspN、GluC、TyrC、ProC、ProN、V8蛋白酶中的一种或者一种以上。该蛋白酶的选择可以稳定获得适宜于质谱检测的多肽。
作为优选,所述步骤(5)中的检测方法为液相色谱串联质谱法或者原位质谱法。预处理后的样品可用经典的液相色谱串联质谱方法进行检测,也可使用原位质谱技术进行检测,提高检测通量。作为优选,所采用的质谱仪为三重四级杆质谱、时间飞行质谱、离子阱质谱、轨道阱质谱中的一种或者一种以上组成的多重质谱。
作为优选,所述内标物为蛋白质纯品、蛋白质纯品混合物、蛋白质纯品与待测样品基质混合得到的混合物,或蛋白质纯品混合物与待测样品基质混合得到的混合物。
作为优选,所述化学标签A上的同位素化学标记为多重标记。本发明中可以将化学标签A与化学标签iso-A之间设置多个变量,利用质谱对分子量进行检测的原理,可以采用多重化学标签(N重化学标签),理论上在一次预处理操作和进样操作中对N-1个样品同时分析,可以极大地提高检测的效率。
作为优选,标记之后的多肽之间的分子量差异大于等于4Da。
与现有技术相比,本发明的有益效果体现在:
(1)本发明将样品和内标物两种分别标记后,再将两者混合并置于同一反应体系下进行后续的处理工作,使得样品和内标物蛋白质在同一体系中所受到的基质效应、操作误差均相同,使得误差可以得以校正;
(2)本发明的成本较低,可供选择的试剂范围较广,而且本发明所述使用的试剂折算之后成本大约为5000元人民币,满足1000次样品检测,单次检测成本为5元;
(3)本发明的方法基于蛋白质层面进行标记,先标记之后,再进行酶解,标记位点和蛋白酶选择范围较广,使得其操作方便,适用范围较广。
附图说明
图1为现有技术中基于多肽层面的标记方法的流程图。
图2为现有技术中AQUA法的流程图。
图3为现有技术中SILAC法的流程图。
图4为本发明的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明详细说明如下,但不因具体的实施例限制本发明。
实施例1
本实施例为对红酒中alpha s1-酪蛋白(牛奶过敏源)的检测,其中alpha s1-酪蛋白含量为20μg/mL,检测过程包括以下步骤:
(1)取1mL红酒,加入100μL的TEAB缓冲液(1M,pH=8.5),二硫苏糖醇10μL(100mmol/L),在60℃水浴锅中孵育30分钟,加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L),室温环境下避光静置30分钟,得到标记样品;
(2)取alpha s1-酪蛋白溶液按照上述相同方法进行处理,仅将碘代乙酰胺更换成带同位素标记的13C2 2H4-碘代乙酰胺,得到标记内标物;
(3)分别各取500μL的标记样品以及标记内标物,将两者混合均匀,然后加入10μL胰蛋白酶(100μg/mL),置于37℃水浴锅中反应4小时,得到酶解液;
(4)将酶解液过滤后通过液相色谱质谱联用系统进样分析,其中,高效液相色谱分离条件:色谱柱为C18色谱柱,柱温为40℃;流动相A为体积百分比为0.1%的甲酸的乙腈溶液,流动相B为体积百分比为0.1%的甲酸水溶液,梯度洗脱,流速为0.3mL/min;
其中,梯度洗脱为:
流动相A的体积百分比由3%耗时10min上升至40%,对应地流动相B的体积百分比由97%耗时10min下降至60%,然后改为100%流动相A冲洗2min,最后改为流动相A体积百分比3%和流动相B体积百分比97%保留3min;
进样分析质谱条件:
毛细管电压:3.5kv,锥孔电压:35kv,脱溶剂温度:500℃,脱溶剂气流量:900L/min,锥孔反吹气流量:30L/hr,碰撞室压力:3.0×10-3mbar;低端分辨率1:2.5V,高端分辨率1:15.0V,离子能量1:0.5;低端分辨率2:2.8V,高端分辨率2:15.0V,离子能量2:1.0;离子源温度:150℃,提取器电压:3.0V,入口透镜电压:0.5V,出口电压:0.5V,碰撞梯度:1.0。
实施例2
本实施例为对红酒中alpha s1-酪蛋白(牛奶过敏源)的检测,其中alpha s1-酪蛋白含量为20μg/mL,检测过程包括:
取1mL红酒,加入10mL乙腈将蛋白质变性沉淀,在15000g离心30分钟,弃去液体后将加入100μL的TEAB缓冲液(1M,pH=8.5),RapiGest表面活性剂型变性剂10μL(1mg/mL),二硫苏糖醇10μL(100mmol/L),水990μL,在60℃水浴锅中孵育30分钟;后续操作与实施例1中“加入碘代乙酰胺10μL”后相同。
对比例1(二甲基化法)
该对比例以二甲基化法作为对比方法,其操作步骤包括:
(1)取1mL红酒和alphas1-酪蛋白溶液,分别加入100μL的TEAB缓冲液(1M,pH=8.5),二硫苏糖醇10μL(100mmol/L),在60℃水浴锅中孵育30分钟,加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L),室温环境下避光静置30分钟;
(2)在两者溶液各100μL中,分别加入4μL甲醛溶液(4%)和4μL氰基硼氢化钠(0.6mol/L),其中与红酒样品反应的甲醛选择非同位素标记甲醛,与alpha s1-酪蛋白溶液反应的甲醛为13C2H2-甲醛。于室温下震荡孵育1小时后,先后加入16μL氨水(1%)和8μL甲酸(5%)。将两者1:1混合、过滤、通过液相色谱质谱联用系统进样分析,其中液相色谱质谱联用系统中参数设置与实施例1相同。
表1为实施例1和对比例1的MRM参数对比
实施例1的回收率为98.2±5.13%,实施例2的回收率为97.3±3.87%,对比例1的回收率为70.3±10.3%,原因主要是红酒中含有大量单宁类物质(鞣质),会降低蛋白酶的酶解效果,使其失活,对比例1中红酒基质中单宁含量多,蛋白酶酶解效率下降得也多,而对比例1中的alpha s1-酪蛋白在无单宁的环境中进行酶解,能够完全酶解,因此对比例1无法对酶解效率的降低幅度进行评估和校正,导致结果严重偏离理论值。本发明中的实施例1和实施例2将标记后的红酒和内标物alpha s1-酪蛋白在同一体系中进行酶解,使得蛋白酶失活带来的两种蛋白质酶解效率下降幅度一致,可以通过同位素稀释质谱思路进行校正。
其中实施例2中样品回收率为97.3±3.87%。此回收率与实施例1的98.2±5.13%相比没有统计学意义上的显著性差异,但是实施例2引入乙腈变性和表面活性剂变性两个方法,能够在保持回收率稳定的情况下,实施例2中酶解时间可从4小时缩短至1小时,将酶解时间缩短,大大提高了检测效率。
对比例2(AQUA方法)
AQUA方法的操作步骤包括:
取1mL红酒,加入100μL的TEAB缓冲液(1M,pH=8.5),二硫苏糖醇10μL(100mmol/L),在60℃水浴锅中孵育30分钟之后,加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L),室温环境下避光静置30分钟,最后加入10μL LSFNPTQL*EEQCHI*溶液(10nmol/L),过滤、通过液相色谱质谱联用系统进样分析,其中液相色谱质谱联用系统中参数设置与实施例1相同。
表2为实施例1和对比例2的MRM参数对比
实施例1的回收率为98.2±5.13%,实施例2的回收率为97.3±3.87%,对比例2的回收率为73.4±5.9%。原因与上述对比例1与实施例1和实施例2的分析类似,其中对比例2中加入的LSFNPTQL*EEQCHI*溶液无需参与酶解,所以对酶解过程中的误差无法进行有效校正,导致结果偏离理论值。
实施例3(蛋白饮料中beta乳球蛋白的检测)
本实施例对蛋白饮料中beta乳球蛋白进行检测时的步骤包括:
(1)取1mL饮料样品和beta乳球蛋白(20mg/L),分别加入100μL的TEAB缓冲液(1M,pH=8.5),再分别加入40μL甲醛溶液(4%)和40μL氰基硼氢化钠(0.6mol/L),于室温下震荡孵育1小时后,其中与饮料样品反应的甲醛溶液选择非同位素标记甲醛,与beta乳球蛋白溶液反应的甲醛溶液为13C2H2-甲醛;
(2)震荡孵育1小时后,分别依次加入160μL氨水(1%)和80μL甲酸(5%),然后各取500μL饮料样品溶液和beta乳球蛋白溶液,混合后加入二硫苏糖醇10μL(100mmol/L),在60℃水浴锅中孵育30分钟之后,加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L),室温环境下避光静置30分钟之后,加入10μL的V8蛋白酶(100μg/mL),并置于37℃水浴锅中反应,得到酶解液;
(3)反应完成,将酶解液过滤后通过液相色谱质谱联用系统进样分析,其中液相色谱质谱联用系统中参数设置与实施例1相同。
对比例3(SILAC法)
该对比例3通过SILAC法对蛋白饮料中beta乳球蛋白进行检测,具体的操作步骤如下:
取1mL饮料样品,加入100μL的TEAB缓冲液(1M,pH=8.5)和100μL采用SILAC方法制备的同位素标记beta-乳球蛋白,混合后加入二硫苏糖醇10μL(100mmol/L),在60℃水浴锅中孵育30分钟,加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L),室温环境下避光静置30分钟,加入10μLV8蛋白酶(100μg/mL),置于37℃水浴锅中反应,将酶解液过滤后通过液相色谱质谱联用系统进样分析,其中液相色谱质谱联用系统中参数设置与实施例1相同。
表3为实施例2和对比例3的MRM参数对比
表4为实施例2与对比例3的酶解效率对比
正常表达的蛋白质在表达完成后,会进行表达后修饰和蛋白质折叠;而转基因表达的蛋白质不会进行这两个步骤,所以转基因表达的蛋白质在空间结构上与正常表达蛋白质有显著区别,牛乳中的β-乳球蛋白为致密球体,酶解位点大多隐藏在空间结构内部深处,难以酶解,而用SILAC技术合成的蛋白质结构较为松散,极易酶解。本发明中的酶解效率相似度高达101.0%,所以可以依据同位素稀释质谱法进行校正,减少了检测误差。
实施例4(针对精氨酸的化学标记)
标记物:1,2-环己二酮
本实施例采用上述标记物对精氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白(牛血清蛋白为样品,下同)溶于1ml硼酸盐缓冲液(pH=8,100mM);
(b)加入6mg 1,2-环己二酮,于室温中反应2小时;
(c)标记后从上述反应体系中取970μl溶液,并在970μl溶液中加入10μl二硫苏糖醇(100mM)于70℃下反应30分钟;
(d)再加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗处室温保存30分钟;
(e)最后加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反应2小时。
上述标记物1,2-环己二酮对精氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素13C标记的标记物1,2-环己二酮对精氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差4Da。
实施例5(针对谷氨酸和天冬氨酸的化学标记)
标记物:(1)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
(2)甘氨酰胺
本实施例采用上述标记物对谷氨酸和天冬氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白溶于1ml磷酸缓冲盐溶液pH=5(50mM)中;
(b)加入126mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及16mg甘氨酰胺,于室温反应时间120分钟;
(c)再加入氢氧化钠调节pH值到8.5;
(d)标记后从反应体系中取出970μl溶液,并在970μl溶液中加入10μl二硫苏糖醇(100mM),于70℃下反应30分钟;
(e)再加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗处室温保存30分钟;
(f)最后加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反应2小时。
上述标记物对谷氨酸和天冬氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素D标记的标记物对谷氨酸和天冬氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差5Da。
实施例6(针对半胱氨酸的化学标记)
标记物:碘代乙酰胺
本实施例采用上述标记物对半胱氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白溶于1ml NH4CO3pH=8.5(500mM)中;
(b)加入40mg碘代乙酰胺于反应液中,同时加入少量乙醇,使碘乙酸完全溶解,于室温,暗处,反应3小时;
(c)从反应体系中取990μl反应液,在990μl反应液中加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml),于37℃反应2小时。
上述标记物对半胱氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素D标记的标记物对半胱氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差4Da。
实施例7(针对组氨酸的化学标记)
标记物:焦碳酸二乙酯
本实施例采用上述标记物对组氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白溶于1ml乙醇水溶液(pH=6.5)中;
(b)再加入50mg焦碳酸二乙酯于37℃,反应2小时;
(c)除去反应有机溶剂,脱盐,蒸干;
(d)在剩余标记蛋白质加入NH4CO3(500mM)到970μl,pH=8.5;
(e)再加入10μl二硫苏糖醇(100mM)于70℃下反应30分钟;
(f)再加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗处室温保存30分钟;
(g)最后加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃反应2小时。
上述标记物对组氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素D标记的标记物对组氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差5Da。
实施例8(针对赖氨酸的化学标记)
标记物:琥珀酰酐
本实施例采用上述标记物对赖氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白溶于1ml乙醇水溶液(pH=8)中;
(b)再加入80mg琥珀酰酐于反应液中,于37℃,反应2小时;
(d)除去反应有机溶剂,脱盐,蒸干;
(e)在剩余标记蛋白质加入NH4CO3(500mM)到970μl,pH=8.5;
(f)加入10μl二硫苏糖醇(100mM)于70℃下反应30分钟;
(g)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗处室温保存30分钟;
(h)加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反应2小时。
上述标记物对赖氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素18O标记的标记物对赖氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差6Da。
实施例9(针对色氨酸的化学标记)
标记物:2-羟基-5-硝基苄溴
本实施例采用上述标记物对色氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白溶于1ml纯二甲亚砜中(pH=5);
(b)在反应体系中加入15mg2-羟基-5-硝基苄溴于37℃下反应30min;
(c)除去反应有机溶剂,脱盐,蒸干;
(d)在剩余标记蛋白质加入NH4CO3(500mM)到970μl,pH=8.5;
(e)加入10μl二硫苏糖醇(100mM)于70℃下反应30分钟;
(f)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗处室温保存30分钟;
(g)加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃反应2小时。
上述标记物对色氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素13C标记的标记物对色氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差7Da。
实施例10(针对酪氨酸的化学标记)
标记物:四硝基甲烷
本实施例采用上述标记物对酪氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白溶于磷酸缓冲液(pH=8)中;
(b)在反应体系中加入50mg四硝基甲烷,于37℃反应2h;
(c)取970μl反应溶液,加入10μl二硫苏糖醇(100mM)于70℃下反应分钟;
(d)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗处室温保存30分钟;
(e)加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反应2小时。
上述标记物对酪氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素18O标记的标记物对酪氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差4Da。
实施例11(针对丝氨酸的化学标记)
标记物:焦碳酸二乙酯
本实施例采用上述标记物对丝氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白溶于1ml乙醇水溶液(pH=6.5)中;
(b)加入50mg焦碳酸二乙酯于反应液中,于37℃反应2小时;
(c)除去反应有机溶剂,脱盐,蒸干;
(d)在剩余标记蛋白质中加入NH4CO3(500mM)到970μl,pH至8.5;
(e)加入10μl二硫苏糖醇(100mM)于70℃下反应30分钟;
(f)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗处室温保存30分钟;
(g)加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反应2小时。
上述标记物对丝氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素D标记的标记物对丝氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差5Da。
实施例12(针对苏氨酸的化学标记)
标记物:焦碳酸二乙酯
本实施例采用上述标记物对苏氨酸进行化学标记时的步骤如下:
(a)称取50mg牛血清蛋白溶于1ml乙醇水溶液(pH=6.5)中;
(b)加入50mg焦碳酸二乙酯于反应液中,于37℃,反应2小时;
(c)除去反应有机溶剂,脱盐,蒸干;
(d)在剩余标记蛋白质加入NH4CO3(500mM)到970μl,pH至8.5;
(e)加入10μl二硫苏糖醇(100mM)于70℃下反应30分钟;
(f)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗处室温保存30分钟;
(g)加入10μl碱性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反应2小时。
上述标记物对苏氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅰ)式;采用带同位素D标记的标记物对苏氨酸进行标记时的反应方程式,参见(Ⅱ);两种方式标记之后的分子量相差5Da。
实施例13(蛋白质酶的选择)
(1)取三份各1mL alpha s1-酪蛋白溶液,分别加入100μL的TEAB缓冲液(1M,pH=8.5),二硫苏糖醇10μL(100mmol/L),在60℃水浴锅中孵育30分钟,加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L),室温环境下避光静置30分钟,再分别加入4μL甲醛溶液(4%)和4μL氰基硼氢化钠(0.6mol/L),于室温下震荡孵育1小时后,先后加入16μL氨水(1%)和8μL甲酸(5%),得到三份标记样品;
(2)在三份标记样品中分别加入10μL胰蛋白酶(100μg/mL)、Lys-C(100μg/mL)和Lys-N(100μg/mL),置于37℃水浴锅中反应4小时,得到酶解液;
(3)将酶解液过滤后通过液相色谱质谱联用系统进样分析,色谱条件同实施例1,质谱选择Q-ToF高分辨飞行时间质谱。
(4)将所得到的色质谱图用蛋白质组分析软件Waters Proteinlynx GlobalServer进行分析,结果如下表5。
表5
由于胰蛋白酶的酶解位点为赖氨酸和精氨酸的C端肽键,它无法对二甲基化的赖氨酸进行酶解,所以酶解位点仅为精氨酸。它的理论酶解产物多肽共5个,其中4个多肽长度过长,含有19~69个氨基酸,不适宜质谱检测,所以无法测得,仅能够测得YLGYLEQLLR这一条多肽。
Lys-C的酶解位点为赖氨酸的C端肽键,它无法对二甲基化的赖氨酸进行酶解,所以无法在二甲基化的alpha s1酪蛋白中酶解出任何多肽。
Lys-N的酶解位点为赖氨酸的N端肽键,且不受二甲基化的赖氨酸影响,所以理论上它依旧能从二甲基化的alpha s1酪蛋白产生10条多肽。其中8条多肽长度适宜,能够被质谱实际检测到。
由上可知,本发明在进行蛋白酶的选择时,可根据标记位点进行酶的选择,选择以不受标记位点标记而影响酶解活性的蛋白酶。
Claims (10)
1.一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)采用化学标签A对待测样品进行标记,得到标记样品;
(2)采用带同位素标记的化学标签iso-A对内标物进行标记,得到标记内标物;
(3)将所述标记样品与标记内标物按照预设比例混匀,得到初样;
(4)对初样进行预处理,得到进样样品;
(5)将所述进样样品进行检测。
2.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中采用化学标签A对待测样品进行标记之前,将待测样品进行蛋白质变性处理。
3.如权利要求2所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中蛋白质变性处理方法包括有机试剂变性处理方法、无机盐变性处理方法、酸处理变性处理方法、碱处理变性处理方法、破坏氢键变性处理方法、破坏非共价键变性处理方法、还原二硫键变性处理方法、加热变性处理方法、超声处理变性处理方法、加入表面活性剂变性处理方法中的一种或一种以上变性处理方法的组合。
4.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,所述标记内标物和标记样品之间的分子量大于等于4Da。
5.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,所述化学标签A为甲醛和氰基硼氢化物组成的标记组份、碘代乙酰胺、1,2-环己二酮、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、甘氨酰胺、碘代乙酰胺、焦碳酸二乙酯、琥珀酰酐、2-羟基-5-硝基苄溴以及四硝基甲烷中的至少一种组份。
6.如权利要求1或5所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,所述的标记位点为精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸中至少一种氨基酸的侧链。
7.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,所述步骤(4)中的预处理方法包括二硫键还原、半胱氨酸烷基化、非共价键断裂、翻译后修饰消除、蛋白酶解反应、蛋白质净化、多肽净化、稀释处理中的一种或者一种以上预处理方法的组合。
8.如权利要求7所述的蛋白质酶解反应方法,其特征在于,所述步骤(4)中的预处理方法包括蛋白酶解反应,所述蛋白酶解反应中的蛋白酶包括碱性胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白质酶K、Rhizopuspepsin、CysN、LysC、LysN、ArgC、ArgN、AspC、AspN、GluC、TyrC、ProC、ProN、V8蛋白酶中的一种或者一种以上。
9.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,所述步骤(5)中的检测方法为液相色谱串联质谱法或者原位质谱法。
10.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法,其特征在于,所述内标物为蛋白质纯品、蛋白质纯品混合物、蛋白质纯品与待测样品基质混合得到的混合物,或蛋白质纯品混合物与待测样品基质混合得到的混合物。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108426970A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-08-21 | 绿城农科检测技术有限公司 | 通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法 |
CN109283239A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-01-29 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型的方法 |
CN109755095A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-05-14 | 云南师范大学 | 单宁酸在电喷雾电离质谱分析校正液中的应用 |
CN110596261A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-12-20 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中中蜂mrjp1蛋白含量的方法 |
CN112630345A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-04-09 | 中国计量科学研究院 | 检测氘标记化合物同位素分布与丰度的方法 |
CN113684254A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-11-23 | 南通大学附属医院 | 一种同位素稀释质谱法定量检测游离dna含量的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101743604A (zh) * | 2007-06-04 | 2010-06-16 | 微软公司 | 找出成对的同位素组 |
CN102510903A (zh) * | 2009-04-14 | 2012-06-20 | 系统生物学研究所 | 蛋白质和多肽的质谱鉴定和定量检测的方法学革新 |
WO2014067965A1 (en) * | 2012-10-29 | 2014-05-08 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Methods of predicting or diagnosing a pulmonary arterial hypertension |
CN105301119A (zh) * | 2014-07-15 | 2016-02-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法 |
CN105866429A (zh) * | 2016-05-06 | 2016-08-17 | 同济大学 | 基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法 |
-
2016
- 2016-12-22 CN CN201611198414.5A patent/CN106855543A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101743604A (zh) * | 2007-06-04 | 2010-06-16 | 微软公司 | 找出成对的同位素组 |
CN102510903A (zh) * | 2009-04-14 | 2012-06-20 | 系统生物学研究所 | 蛋白质和多肽的质谱鉴定和定量检测的方法学革新 |
WO2014067965A1 (en) * | 2012-10-29 | 2014-05-08 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Methods of predicting or diagnosing a pulmonary arterial hypertension |
CN105301119A (zh) * | 2014-07-15 | 2016-02-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法 |
CN105866429A (zh) * | 2016-05-06 | 2016-08-17 | 同济大学 | 基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
叶雯等: "定量蛋白质组学中的同位素标记技术", 《中国生物工程杂质》 * |
荣举等: "同位素亲和标签(ICAT)系列技术及其在蛋白质组研究中的应用", 《癌变·畸变·突变》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108426970A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-08-21 | 绿城农科检测技术有限公司 | 通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法 |
CN109755095A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-05-14 | 云南师范大学 | 单宁酸在电喷雾电离质谱分析校正液中的应用 |
CN109755095B (zh) * | 2018-08-31 | 2020-09-29 | 云南师范大学 | 单宁酸在电喷雾电离质谱分析校正液中的应用 |
CN109283239A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-01-29 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型的方法 |
CN110596261A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-12-20 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中中蜂mrjp1蛋白含量的方法 |
CN113684254A (zh) * | 2020-10-20 | 2021-11-23 | 南通大学附属医院 | 一种同位素稀释质谱法定量检测游离dna含量的方法 |
CN112630345A (zh) * | 2020-12-14 | 2021-04-09 | 中国计量科学研究院 | 检测氘标记化合物同位素分布与丰度的方法 |
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