JPS62209055A - アミノ酸分析のためのアミノ酸蛍光誘導体混合物とアミノ酸分析のためのアミノ酸蛍光誘導体混合物の製造方法とアミノ酸蛍光誘導体混合物をアミノ酸分析に使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアミノ酸の誘導体生成（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａ
ｔｉｏｎ）に関し、特に、逆相分離カラムからなる液体
クロマトグラフィーを用いて検出や分析に有益なアミノ
酸の蛍光誘導体の混合物及びその製造方法に関する。一
般に本願発明は生理流体（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｆｌｕｔｄ）、薬品，食物，飲料物等の多様なマ）　Ｉ
Ｊソックスおけるアミノ酸分析に用いることが可能であ
る。

〔従来技術とその問題点〕

現在、多様の技術分野において、アミノ酸分析は重要な
必要条件である。特に急速に発展しているバイオテクノ
ロジーの分野において、たんばく質やペプチド類の特性
化（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は重大な手段
である。加えて、生物的物質におけるアミノ酸の特性化
は、診断手段（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｐｒｏｃｅ−ｄ
ｕｒｅｓ）として極めて有効である。また、薬品分野に
おける製品開発と生産物の品質管理にまた、飲食物の分
野における生産物の特性化等にを益である。

成功されたアミノ酸分析を成功裡に行なうには、一般に
１８から３５種のアミノ酸（これは、マトリック間の量
を別々に定量しなければならない。そして、好ましくは
、試料と試料間の相対標準偏差が５％以下であり、他の
マトリクス成分がしばしば存在す、る条件下で、−試料
につき１時間以下の分析時間が好適である。現代の研究
開発においては、高感度で敏速な分析が望まれる。

はとんどのアミノ酸分析法は、液体クロマトグラフィー
に基づいている。この液体クロマトグラフィーは、最近
の高性能型（ＩＩＰＬＣ）もしくは従来の中圧液体クロ
マトグラフィーのどちらでもよい。

どちらの場合でも、分析における主な問題は、これらの
化合物の選択的で感度の高い検出である。

幾つかの例外はあるが、アミノ酸には２２０ｍｎ＋以上
の強い光吸収がほとんどみられない。その結果、要求さ
れる感度を得ようとすれば紫外／可視分光検出の使用は
できなくなってしまう。同様に、屈折率検出を用いても
要求される感度が欠ける。このような理由で、化学的誘
導体生成法が一般に用いられる。化学的誘導体生成は、
化学基を化合物に付加させる働きをし、よってその結果
得られる生成物は紫外／可視又は蛍光検出に対して強い
応答を持つようにする。誘導体生成法はクロマトグラフ
ィーによる分離の以前に行うか（ブリ・カラム（ｐｒｅ
ｃｏ　ｌ　ｕｍｎ）と称する）、分離後に行なうことが
できる　（ポスト・カラム（ｐｏｓｔｃｏｌｕｍｎ）と
称する）。

はとんどの場合、アミノ酸のアミン基は化学的誘導体生
成の活性体（ａｃｔｉｖｅ　５ｉｔｅ）として用いられ
る。なぜならば、官能基としてのアミノ酸なる類の多様
な化学的性質と反応性により、この分析にあたっての主
要な問題が生じる。アミノ酸は共通の骨格構造のまわり
に脂肪族、芳香族、第１アミン、第２アミン、カルボン
酸、アミド、及びチオール等の各種の官能基を有するこ
れにより、全てのアミノ酸と反応して、比較可能な感度
を出せる試薬を見つけ出すことが極めて困難になる。

最近のクロマトグラフィーによるアミノ酸分析法は、誘
導体生成法（ブリ・カラム又はポスト・カラム）あるい
は検出法（紫外／可視又は蛍光）に基づし１て分類する
ことができる。（“Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ八ｎａｌｙｓ
ｉｓ″　１．Ｍ、　　Ｒａｔｔｅｎｂｕｒｙ著、　　Ｗ
ｉｌｅｙ　　Ｉｎｔｅｒｓｃｉ−ｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ、　１９８１参照）誘導体生成法については、
ブリ・カラム誘導体生成法がますます普及している。な
ぜならば、高効率で、微粒子の逆相クロマトグラフのカ
ラムを用いることができるからである。ポスト・カラム
誘導体生成法は、イオン交換クロマトグラフィーを用い
たアミノ酸の分離後しか用いられない。このやり方では
、クロマトグラフィーの効率が低く、長時間の分析時間
を要する傾向がある。

最も一般的なアミノ酸の紫外／可視誘導体生成反応は、
ニンヒドリン（Ｓ、　Ｍｏｏｒｅ、　０．１１．　Ｓｐ
ａｃｋｍａｎｎ。

Ｗ、Ｈ，５ｋｅｉｎ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅａｐ、　３
０（１９５８）　１１８５〜１２０５参照）または、フ
ェニルイソチオシアナート、　ＰＩＴＣ（Ｒ，Ｌ、　ｆ
ｌｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、　Ｓ、Ｃ，Ｍｅｒｅｄｉｔｈ
、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ。

１３６（１９８４）　６５〜７４参照）のどちらかを使
用する。

紫外／可視誘導体生成の主な欠点は、蛍光検出に比べ、
比較的低い検出感度しか有していないことである。ニン
ヒドリンは、ポスト・カラムでしか使うことができない
が、全てのアミノ酸の検出が可能°である。ＰＩＴＣは
ブリ・カラムで使用され、全てのアミノ酸を検出可能で
あるが、自動化のできない誘導体生成法を必要とする。

最も一般的な蛍光誘導体生成反応では、オルト−フタル
アルデヒド、　ＯＰＡ　（ｏｒ　ｔｈｏ−ｐｈ　ｔｈａ
　ｌａ　ｌｄｅｈｙｄｅ）（Ｐ、　　Ｌｉｎｄｒｏｔｈ
、　　Ｋ、　　Ｍｏｐｐｅｒ、　　Ａｎａｌ、　　Ｃｈ
ｅｍ、　　５１（１９７９）１６６７とＭ、Ｒｏｔｈ、
　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　４３／１９７１参照）又は
フルオレニルメチルクロロホルメイトＦＭＯＣ（Ｆｌｕ
ｏｒ−ｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔ
ｅ）　（Ｓ、Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ、Ｂ。

Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ、　Ｓ、　Ｌａｇｅｒｋｖｉｓｔ、
　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　２９２（１９８３）
６０９〜６１８参照）又はダンシル・クロライド（Ｄａ
ｎｓｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｙ、　Ｔａｐｕｈｉ、
　　Ｄ、Ｅ、５ｃｈｏ＋ｉｄｔ。

Ｗ、　Ｌｉｎｄｎｅｒ、　Ｂ、Ｌ、　Ｋａｒｇｅｒ、　
Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ、　１５（１９８１）１２３参
照）が用いられている。ＯＰＡは、高感度を有し、簡単
で、敏速で、自動化が容易にできる方法を基本とするが
、第１アミンとしか反応しない。

現在の方法では、通常、メルカプトエタノール（ｍｅｒ
ｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）の存在下でＯＰＡを反応さ
せている。これによれば、試薬と生成物の安定性が不充
分になってしまう。ＦＭＯＣとダンシル・クロライド　
　（５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　　ａｍｉｎｏ　　ｎａｐｈ
ｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄ
ｅ）のどちらもブリ・カラムで用いられ、高い感度を与
え、第１アミン及び第２アミンと反応するが、長い反応
時間を要し、過剰の試薬を除去する抽出等の補助処理が
必要になる。

さらに、これらいずれの方法を用いても、シスチン（（
：ｙｓｔｉｎｅ）　とシスティン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）
を正確に検出させることは掘めて難しい。シスチンはジ
スルフィド・ブリッジ（ｄｆｓｕｌｆｉｄｅ　ｂｒｉｄ
ｇｅ）で結合した２つのシスティン分子からなる分子で
ある。一般に、シスチンもしくはシスティンのいずれか
の誘導体が検出される。しかし、その時点までの試料の
経歴により、一方のかなりの部分が他方に変化してしま
っていることがある。

〔発明の目的〕 したがって、本発明の目的は、前述の問題点を解消し、
微量のアミノ酸試料を高感度で、そして、良好な選択性
で蛍光検出できるアミノ酸誘導体混合物を得ることにあ
る。また、短時間で自動化が容易であるそのアミノ酸誘
導体混合物の製造方法を提供することにある。

〔発明の概要〕

を含む混合物を供給する。この混合物は、逆相クロマト
グラフィーで分離される。−の過程において、分離カラ
ムから全ての第１アミノ酸誘導体がこれらの間にどの第
２アミノ酸誘導体も溶出しないような順度で溶出する。

そして、誘導体生成のどの残留物も波長−選択的（ｗａ
ｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｓｅｌｅｃＸｔｉｖｅ）クロマトグ
ラフの検出器を用いたアミノ酸誘導体の定量測定を妨げ
るような時間にクロマトグラフのカラムから溶出するこ
とは実質的にない。

本発明はまた、第１アミノ酸と第２アミノ酸間に明確な
差をつけるための一連の４つの処理ステップからなるア
ミノ酸混合物の製造方法を供給する。第１ステツプにお
いて、第１アミノ酸誘導体は、アセトニトリルに溶解し
たＯＰ八へＭＰＡ　（オルト−フタルアルデヒド／メル
カプトプロピオン酸）を用いて、ＯＰＡ／ＭＰＡ誘導体
を生成し、そして次に続くステップにおいて、第２のア
ミノ酸はアセトニトリルに溶解したＦＭＯＣ（フルオレ
ニルメチルクロロホルメイト）を用いてＦＭＯＣ誘導体
に変えられる。

これら全ての反応は、水素指数ｐＨの調整を行うための
適当なバッファの存在下で進められる。その結果得られ
る最終混合物は、所望の性質を有する。

本発明は、また、長期間の保存安定度が改善された、反
応過程の進行に用いる試薬を供給する。

本発明はまた、上述の混合物を用いたアミノ酸の定量分
析を包含している。

全体として見たとき、本発明は各種の、とりわけ以下に
述べるような、利点を有するアミノ酸分析への道を切拓
くものである。

（１）高感度である。（５００フ工ムトモル／アミノ酸
）（２）第１及び第２アミノ酸両方を確実に検出をする
。

（３）全自動化が可能である。

（４）分析時間が短い。　（全分析サイクル：１時間）
以下に本発明の実施例より得られた利点を詳述する。

処理しない限り、ＯＰＡ／ＭＰＡで蛍光誘導体を形成し
ないシスティンが存在する場合、このシスティンはアル
キル基でそのチオール基をブロックさせる（ｂｌｏｃｋ
ｉｎｇ）ことによって、蛍光誘導体を形成するような処
理を行なうことができる。ここでのアルキル基は、例え
ば、メチルカルボキシ基（ｍｅｔｈｙｌ−ｃａｒｂｏｘ
ｙ　ｇｒｏｕｐ）である。

最初の混合物（出発混合物）に含まれるシスチンを、メ
ルカプト官能基とシスティンより高い酸化電位を有する
還元試薬を用いる還元分解（ｒｅｄｕｃ−ｔｉｖｅ　ｃ
ｌｅａｖｉｎｇ）によってシスティンに変換し、次にシ
スティンのチオール基を、続いて、強いアルキル化剤を
用いてブロックしてよい。これにより、その後に行なわ
れる第１アミノ酸のＯＰＡ／ＭＰＡ誘導体生成において
、システィンは蛍光ＯＰＡ／ＭＰＡ誘導体を形成する。

よって、誘導体生成の以前に全てのシスチンをシスティ
ンに変換することにより、シスチン／システィン検出の
あいまいさを避けることができる。

さらに、生成過程の間、混合物から物質の抽出を行う必
要がないことが見い出されている。使用する全ての試薬
は次に行なわれるクロマトグラフによる分析に対して共
存できるからである。したがって、本願発明に係る全プ
ロセスをクロマトグラフの試料注入装置によって行なう
ことができる。

欧州特許出願番号８５１１３１５４．０に開示される装
置はこの目的に適している。ＯＰＡとＭｐＡ’のアセト
ニトリル溶液は、この分野で以前に報告されたＯＰＡ／
ＭＰＡ処法（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）に比べ、より
良好な保存安定度を有するので、その使用にあたって極
めて適している。

本発明に係るアミノ酸誘導体混合物は、アミノ酸の定量
分析に用いることができる。なぜならば、第１アミノ酸
誘導体と第２アミノ酸誘導体を逆相液体クロマトグラフ
ィーによって完全に分離させることができるからである
。このような方法では、特に波長−特定分析が適してい
る。

〔発明の実施例〕

第１図に本発明の好適な実施例の全反応過程を示す。本
発明は連続の、相異なる第１アミノ酸、そして次に第２
アミノ酸の誘導体生成に実質的に基づいているが、本発
明に係る製造過程一実施例では連続する４つの反応ステ
ップで行われてもよい。各反応ステップは分析試料全体
に対して実施されるが、各反応ステップで試料成分（ａ
ｎａｌｙｔａｓ）が全て各反応に関与するわけでない。

これらの反応は以下に詳述するように行なわれる。

（１）第１の条件反応ステップでは、アミノ酸を含む試
料又は基質を好ましくは、尿素またはグアニジン塩化水
素（ｇｕａｄｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）中
に加えられたメルカプトプロピオン酸（ｍｅｒｃａｐｔ
ｏｐｒｏｐｉｏ−ｎｉｃ　ａｃｉｄ）（または、ジチオ
エリドリフト（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ））
等の還元分解剤（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ　ｃｌｅａｖｉｎ
ｇａｐｅｎ　ｔ）と混合させる。この反応の結果は全て
のシスチンをそのジスルスフィド・ブリッジが還元され
、分離によってシスティンに変換する。この反応の目的
はシスチンを例えば、オルト−フタルアルデヒド（ｏｒ
ｔｈｏ−ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ）、　ＯＰＡ等
と強い蛍光を持つ生成物が形成できる構造（反応ステッ
プ■以降）にすることである。シスチンからシスティン
へ変換した後、これら２つの化合物の総和量を決定する
一反応を用いることが可能である。

この反応において、その他のアミノ酸は全く影響を受け
ない。

（Ｉｆ）好ましくは、ヨード酢酸（ｉｏｄｏａｃｅｔｉ
ｃ　ａｃｉｄ）等、ある量のプロフキング剤（ｂｌｏｃ
ｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）を次に反応混合物に加える。ヨ
ード酢酸は、反応混合物に存在するチオール（即ち、本
来のシスティンとステップＩにおいて、シスチンから新
しく変換されたシスティン）と反応し、カルボキシメチ
ルシスティン（ｃａｒｂｏｘ３＋＋＋ｅｔｈｙｌｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ）を形成する。この反応の目的は、システィ
ンを例えばＯＰＡ等と強い蛍光生成物が形成しうる構造
に変換する。

＾ｎａ１．　Ｃｈｅｗ、、　４３（１９７１）８８０に
掲載されたＭ、　Ｒｏｔｈによる論文では、システィン
は、オルト−フタルアルデヒドＯＰ＾と蛍光生成物を形
成しない゛が、チオール基をブロックすることによって
蛍光生成物が形成可能であることが報告されている。そ
の他のアミノ酸については、この反応による影響はない
。

（ＩＩＩ）試料（テスト混合物）にある量のホウ酸塩（
ｓｏｄｉｕｍ　ｂｏｒａｔｅ）バッファ等の適当なバッ
ファを加え、その反応混合物のｐＨを１０．２に調整し
、そして、好ましくは、アセトニトリルに溶解するオル
ト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）　とメルカプト≦４プ
ロビオン酸（ＭＰＡ）を含むある量の試薬（Ｈ，Ｇｏｄ
ｅｌ。

Ｔ、　Ｇｒａｓｅｒ、　Ｐ、　Ｆｏｌｄｉ、　Ｐ、　Ｆ
ａｅｎｄｅｒ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｆｕｒｓｔ。

Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　２９７　（１９８４）
４９−６１参照）を混合する。この反応においては第、
２アミノ酸を除く全て一部 の第１アミノ酸が蛍光イソインドール生成物（ｆｌｕｏ
−ｒｅｓｃｅｎｔ　１ｓｏｉｎｄｏｌｅ　ｐｒｏｄｕｃ
ｔ）を形成するよう反応する。この蛍光イソインドール
生成物は、逆相液体クロマトグラフィーで分離すること
ができ、そして蛍光分光器を用いて検出することができ
る。

（λｅｘ　＝　２３０ｎｍ、λｅｍ　＝　４５５ｎｍ）
　、カルボキシメチルシスティン 生成物も形成する．　ＯＰＡは第１アミノ酸とのみ反応
することから、残りの第２アミノ酸（主としてプロリン
やヒドロキシプロリン）はこの反応に影響されない．ア
セトニトリルに溶解した誘導体生成試薬を使用すること
は、この溶液中で試薬自体の安定度が改善されているこ
とによって極めて大きな改善となる．従来では、ホウ酸
塩バッファに溶解させたＯＰ＾とＭＰＡ　Ｃまたは、さ
らに一般的にはメルカプトエタノール）を用いており、
その安定度は最高１−２週間であった。

（ＩＶ）最後に、この反応混合物（ここでは、第１アミ
ノ酸誘導体、遊離な第２アミノ酸そして過剰の試薬が含
まれている）を好ましくはアセトニトリルに溶解された
フルオロニルメチルクロロホルメイト（ｆｌｕｏｒｅｎ
ｙｌｍｅｔｈｙｌ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、　
ＦＭＯＣと混合し、第２アミノ酸とで蛍光生成物を形成
させる。蛍光試薬と同時に、その生成物はλｅｘ　−　
２６６ｎｍとλｅｘ　＝　３０５ｎｍの蛍光を出す。Ｆ
ＭＯＣは第１アミノ酸ともよく反応するが、ステップ■
において全ての第１７ミノ基はオルト−フタルアルデヒ
ド誘導体を形成しブロックされている。過剰のＦＭＯＣ
試薬の一部は加水分解生成物に変換され、その結果２つ
の蛍光化合物（試薬と加水分解生成物）が得られるが、
これらは試料成分よりクロマトグラフィーによって分離
可能である。全てのアミノ酸を単純にＦＭＯＣと反応さ
せ、１つの生成物を形成しない理由は、もしこのような
処理を行なったとしたら、試薬のピークが混合物の第１
アミノ酸のＦＭＯＣ誘導体と簡単に分離することができ
ず、反応混合物に抽出ステップを施すことが必要になる
からである。

全ての反応過程が完了した後、最初の試料（シスチンと
システィンを含む第１アミノ酸と第２アミノ酸を含む）
から得られた最終生成物は、第１アミノ酸を表わすＯＰ
Ａ誘導体と第２アミノ酸を表わすＦＭＯＣ誘導体を含む
。シスチンとシスティンの総量は、カルボキシメチルシ
スティンのＯＰＡ生成物によって表わされる．この混合
物は、好適には下記の条件下で濃度溶離勾配による逆相
クロマトグラフィーを用いて分離することができる。２
つの異なる化学的誘導体を用いることは、選択性の新た
な次元、すなわちスペクトラム選択性（ｓｐｅｃ−ｔｒ
ａｌ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を用いることができる
ようになる。

選択性を最大にするには、前述の全反応過程を蛍光検出
と共に用いることができるが、同時に又は逐次的に２つ
の検出波長（ＯＰＡ誘導体については３３８＋ｖ，　Ｆ
ＭＯＣ誘導体については２２６ｎｍ）を用いる紫外／可
視検出を用いることもできる。紫外／可視検出では、よ
り低い検出限度しか得られないが、これは、特に次に述
べる好適な条件と試料については十分である。

以下に本発明の好適な実施例に基づいて、その混合物の
特徴と利点及びその嘘遣方法を述べる。

ここでは、以下に述べる利点が他のシステムと比べてど
のようであるかも可能な限り指摘する。

１８重要なアミノ酸を全て決定する。第１及び第２アミ
ノ酸のどちらも単一の分析で決定する。これを従来のオ
ルト−フタルアルデヒド、　ＯＰＡのみを用いてアミノ
酸の誘導体生成と比較すれば、この従来のものでは第１
アミノ酸しか決定できない。

２、シスチンとシスティンを決定する。好ましくは、シ
スチンとシスティンの総量を単一のピークで決定する。

これを、これら２つの相互変換を行わず、シスチンまた
はシスティンのみを決定する方法と比較するとき、より
優れていることがわかる。シスチン及びシスティンを独
立に正確に決定する方法はさらに好適であることは指摘
しておかなければならない。

３．高感度である。蛍光誘導体の使用と蛍光検出を用い
ることにより、５０から１００フェムトモル（ｆｅｍｔ
ｏｍｏｌｅｓ）の検出限界が得られる。このレベルにな
ると、分析方法は、もはや分析における制限因子ではな
くなり、むしろ試料中にみられるバックグランドの方が
制限因子となる。この検出限界は、低ピコモル（ｐｉｃ
ｏｍｏｌｅ）のあたりの限界を有する紫外／可視分析検
出と比較することができる。

４、スペクトル情報を用いることにより高選択性である
。２種類の誘導体（ＯＰＡとＦＭＯＣ）を用いることに
よって、第１と第２アミノ酸の類（ｃｌａｓｓ）分離は
スペクトラムの相異によって決定する。

これはクロマトグラフィーによる分離に追加された、別
の次元の選択性と見なすことができる。

それは、２つの異なる類の化合物間の差を明確にし、同
一の条件下で全てのアミノ酸を検出する方法よりより速
（、より簡単にクロマトグラフィーで得られたデータを
解析することができる。

５、誘４体生成過程が敏速に行われ゛る。以下に述べる
ように、全誘導体生成過程は５−１０分間の時間を要す
る。この処理を手動で行う場合、試料準備時間はしばし
ば分析上のボトルネックとなってしまう。したがって、
敏速な処理は重要である。この処理とオン・ラインで行
う場合（９゜参照）、敏速な誘導体生成過程が極めて高
い試料の処理能力を支える。

６、分析時間が短い。敏速な誘導体生成処理に加えて、
小粒子逆相クロマトグラフ用カラムと濃度勾配溶離方法
を用いることによって、分析も速くなる。自動誘導体生
成を用いることによって、全試料サイクルは３５分間で
ある。これをイオン交換クロマトグラフィーを用いたポ
スト・カラム誘導体生成を用いた方法と比較すれば、こ
の従来の方法では、−試料につき１から１．５時間のを
要する。加えて、逆相クロマトグラフのカラムは、イオ
ン交換カラムに比べより安定であるという傾向がある。

７、室温における反応である。この誘導体生成反応は、
敏速であることに加えて、周囲温度で起こり、したがっ
て、温度制御のための付加的なハードウェアを必要とし
ない。これは、上昇温度と操作のための特別なハードウ
ェア・モジュールを要する長時間の反応である。フェニ
ルイソチオシアナート（ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃ
ｙａｎａｔｅ、　ＰＩＴＣ）法と対比較することができ
る。

８、均一な、共存性のある試薬である。処理に用いる全
ての試薬は相互に共存可能である。換言すれば、これら
の試薬間で相互に反応が起こったりあるいは干渉を起こ
したりすることはない。

これは、本方法における基本的な特徴である。

個々の反応ステップは、何らかの具体的な形で記載して
おいたが、この共存性を保障するために変更しなければ
ならないときがある。例えば、ＯＰ＾は通常、１から５
％のメタノールを含むホウ酸塩バッファに溶解している
が、メタノールは、ＦＭＯＣ反応を妨害するらしいこと
が発見され、ＯＰＡ溶媒はＦＭＯＣと相互作用を起さな
い。１００χア七ト二トリルに変更した方が好ましい。

反応の均一性（すなわち、全反応は、単一の容器で行わ
れ、１つの試薬を１度ずつ加えるが、試薬を取り除くこ
とはないということ）は、システムを自動化するにあた
って理想的である。

この利点は、過剰の試薬を真空下で除去するＰＩＴＣ法
または過剰の試薬を挿出するＦＭＯＣ方法と対比される
べきである。

９、容易に自動化することができる。

上述した事項により、誘導体生成処理は、例えば、本願
発明に引用した欧州特許出願番号８５１１３１５４．０
に記載されるコンピュータ制御ＨＰＬＣオートサンプラ
・システム等を用いて自動化することができる。この点
は、試料の処理能力と自動化適正の点について、極めて
有利であるが、どの方法はまた手動モードでもうまくい
き、かつ有益である。この方法を成功裡に行うのに自動
化という局面に依拠することはない。

１０、　ＯＰＡ反応においてメルカプトプロピオン酸を
用いる。この試薬を用いることは以前に詳述したが、ま
だ完全に受は入れられていない。ＯＰＡ反応においてメ
ルカプトエタノールの代わりにメルカプトプロピオン酸
を用いれば、メルカプトエタノールが分単位の半減期し
か持っていない不安定な物質を得ることに反してより高
い蛍光を発する。安定な蛍光生成物を得る。

１１、安定な試薬溶液である。

オルト−フタルアルデヒド、ＯＰＡ／メルカプトプロピ
オン酸、ＭＰ＾試薬とＦＭＯＣ試薬の溶媒として好適に
用いられるアセトニトリルは、改善された安定性を有す
る試薬溶液をもたらす、これは、極めて重要な改善であ
る。なぜならば、バッファを溶液として用いると（安定
剤がない場合）試薬はたったの数週間しか安定ではない
。これは、試薬を大量に準備させ、後で販売や配布する
場合、極めて重大である。

１２、シスチンのジスリフイド結合を分解させるために
メルカプトプロピオン酸を用いる。８．と９゜で説明し
たように、総反応過程は、数種の相互に共存可能な一連
の反応から成っている。好適で重要な事項は、シスチン
のジスルフィド結合の還元分解のために、メルカプトプ
ロピオン酸を用いるという点である。この物質は後にＯ
ＰＡ反応で用いられるものと同じ化合物であることが重
要である。なぜならば、チオールは、生成物の官能基を
形成するからである。メルカプトプロピオン酸を他のチ
オール酸（例えば、メルカプトエタノール、ジチオエリ
トリトール（ｄｉ−ｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉ　ｔｏｌ）
　、ジチオトリトール（ｄｉｔｈｉｏ−ｔｒｉｔｏｌ）
等）の代わりに用いれば、各アミノ酸について複数の生
成物を形成することを防止できる。さらにジスルフィド
結合することを防ぐ。。

さらに、ジスルフィド結合の分解後、システィンのチオ
ール基は、ＯＰＡ反応において（アミノ酸との反応を阻
害するものとして）チオール基が反応しないようにヨー
ド酢酸等を用いてブロックする。

１３、無毒性の、突然変異誘発性のない（ｎｏｎ−ｍｕ
ｔａ−ｇａｎｉｃ）、発癌性のない試薬である。塩化ニ
トロベンゾオキサジアゾール（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｏ
ｘａｄｉａｚｏｌｅｃｈｌｏｒｉｄｅ）、　ＮＢＤ−Ｃ
Ｉ又はフッ化ニトロベンゾオキサジアゾール（ｎｉｔｒ
ｏｂｅｎｚｏｏｘａｄｉａｚｏｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）
＋ＮＢＤ−Ｆ等の試薬に反して、本発明の実施に用いる
試薬は衛生上比較的安全である。

上述の処理方法で行われる反応ステップの特定の、そし
て、好適な詳細を以下に記する。さらに、所定の試薬容
量と濃度の許容範囲も記した。これら許容範囲は、最適
の又は一般値の後に（）内に記す。詳述する処理法では
、出発試料容量は１μ！であるが、対応する試薬容量の
変化によって、変化することがある。試薬は、特別なも
のでな（、純度が十分なものを多数の業者より得ること
が、できる。各試薬を加えた後、混合物は完全に混合さ
れる。

１．１μｌの試料をｐＨ６−８で４Ｍ（３−６Ｍ）の試
薬グレード尿素またはグアニジン塩化水素に溶解した５
μ６（１−１０μＮ）の０．１Ｍ（０，０１−０，５Ｍ
）の分析グレード　メルカプトプロピオン酸と混合させ
る。あるいは、水酸化ナトリウムで、ｐＨを１０．２（
９，５−１０，５）に調整された０、　４Ｍ　（０，１
−０，４Ｍ）の試薬グレード　ホウ酸ナトリウムバッフ
ァを溶媒として用いることができる。メルカプトプロピ
オン酸の代わりにＯ，ＬＭ（０，０１−０，５Ｍ）のジ
チオエリトリトールを用いることも可能である。反応は
、室温（２０−３０℃）下で、■−５分以内で進行する
。

■、第１ステップで得た混合物に、水酸化ナトリウムで
調整したｐＨ１０，２（９，５−１０，５）調整された
Ｏ、、ｉＭ（０，１−０，４Ｍ）のホウ酸ナトリウム塩
バッファに溶解した０、１Ｍ（０，０５−０，３Ｍ）の
ヨード酢酸を加える。ヨード酢酸の正確な濃度はおよそ
混合物（シスチンより変換したものを含む）に存在する
システィンの量に対してモル換算で１０倍過剰である。

反応は室温下で１−５分以内に終了する。ヨード酢酸の
代わりに、ヨウ素アセトアミド（ｉｄｏａ−ｃｅｔａｍ
ｉｄｅ）を用いることができる。この場合は異なるクロ
マトグラフィーに基く特性を有し、カルボキシメチルシ
スティンと異なる生成物を得る。

■０反反応ステップ■得られた混合物（または１μｌの
出発試料）に、ｐＨ１０，２に調整された０、４Ｍ（０
，１−０，４Ｍ）のホウ酸ナトリウム塩バッファを５μ
ｌ（１−１０μりとアセトニトリルに溶解した０、０２
Ｍ（０，０１−０，１？Ｉ）のオルト−フタルアルデヒ
ドと０．０４Ｍ　（０，０１−０，１Ｍ）のメルカプト
プロピオン酸を加える。反応は室温下で１−５分以内に
完了する。

■１反応ステップ■で得られた混合物にアセトニトリル
に溶解した０、ＯＩＭ　（０，００５−０，０５Ｍ）の
フルオレニルメチルクロロホルメイトよりなる溶液を１
μ！（１−５μｌ）加える。この反応は室温下で１−５
分以内に終了する。

かくして得られた反応混合物全体を以下の条件下で高性
能型液体クロマトグラフに直接に注入する。

分析条件 カラム：　２００　Ｘ　２．１ｍｍ　ｉ、ｄ、５μｍ　
Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　０ＤＳ（オクタ−デシルシラン処理
） カラム温度：３５℃ 固定相：　Ａ：２．４ｇ／Ｌ　　酢酸ナトリウム０．２
５χテトラヒドロフラン （二度蒸留した水（ｂｉｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅ
ｒ）に溶解）Ｂ：８０χアセトニトリル ２０χ０．ＩＭ　　酢酸ナトリウム （二度蒸留した水に溶解） 出発流量：０．２２ｍ１／分 勾配プログラム二Ｔ・０の時Ａ＝９８χＢ・２χＴ・１
０の時Ａ＝８２χＢ・１８χ Ｔ−１８（７）時Ａ、７１！　Ｂ＝２９χＴ＝２０の時
Ａ＝５５χＢ・４５χ Ｔ・２２の時＾・４８χＢ＝５２χ Ｔ、２４ノ時Ａ＝ＯＯＸ　Ｂ＝ｌＯＯＸＴ・２９の時Ａ
＝００χＢ＝１００χ Ｔ＝３１の時Ａ＝９８χ１３．２χ （時間Ｔ（分）） 検出パラメータ 蛍光検出： ＯＰＡ誘導体（Ｔ・０−２１分） 励起波長λｅｘ＝２３０ｎｍ；バンド幅＝５ｎｍ発光波
長λｅｍ＊４５５ｎａ＋；バンド幅＝５ｎｍＦ門ＯＣ誘
導体（Ｔ＝２１−２５分） 励起波長λｅｘ・２６６ｎ鋼；バンド幅・５ｎｍ発光波
長λｅｍ＝３０５ｎｍ　；バンド幅＝５ｎｍ紫外／可視
検出： ＯＰＡ誘導体： 信号（ｓｉｇｎａｌ）　：　３３８ｎｍ、バンド幅：　
１０ｎａ＋レフアレンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）　　：
　　３９０ｎｍ　　パン　ド幅　：　　２０ｎｔａＦＭ
ＯＣ誘導体： 信号：　２６６ｎｍバンド幅：４ｎｔａレフアレシス　
：　　３４９ｎｍ　　パン　ド幅　：６ｎ閤上述のＨＰ
ＬＣ分析条件は、代表的なものであるが、本願発明を実
施の態様を限定するものではない。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本願発明によって例えば、蛍光及
び紫外／可視検出器等で検出を行うにあたって高感度ま
たは良好な選択性をもたらすアミノ酸誘導体混合物を得
ることができる。また、その製造方法は、敏速で、簡単
な操作で容易に実施することができ、さらに自動化する
ことが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本願発明の一実施例であるアミノ酸誘導体混合
物の製造過程の説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１アミノ酸類のオルト−フタルアルデヒド／メル
   カプトプロピオン酸（ＯＰＡ／ＭＰＡ）誘導体と第２ア
   ミノ酸類のフルオレニルメチルクロロホルメイト（ＦＭ
   ＯＣ）誘導体とアセトニトリルとを含むアミノ酸誘導体
   混合物。 ２、前記誘導体生成における反応残留物を含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸誘導体混
   合物。 ３、前記反応残留物は、オルト−フタルアルデヒド（Ｏ
   ＰＡ）とメルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）とフルオレ
   ニルメチルクロロホルメイト（ＦＭＯＣ）であることを
   特徴とする特許請求の範囲第２項記載のアミノ酸誘導体
   混合物。 ４、前記アミノ酸誘導体混合物は水溶液であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項または第２項記載のアミ
   ノ酸誘導体混合物。 ５、第１アミノ酸類と第２アミノ酸類を含む試料混合物
   にまず、所定のバッファとアセトニトリルに溶解したオ
   ルト−フタルアルデヒド （ＯＰＡ）とメルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）溶液を
   任意の順で混合させて第１の混合物を得、前記第１の混
   合物に所定のバッファとアセトニトリルに溶解したフル
   オレニルメチルクロロホルメイト（ＦＭＯＣ）溶液を任
   意の順で混合させることを特徴としたアミノ酸誘導体混
   合物の製造方法。