DE2622547C3 - Vorrichtung zur fluorometrischen Bestimmung von Aminosäuren - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur fluorometrischen Bestimmung von Aminosäuren in Zuckerrüben und/oder Zuckerfabrikprodukten mit einer Strahlenquelle, einer optischen Fokussiereinrichtung, einem Strahlenteiler, einer Halterung für eine Probe sowie Detektoren für die von der Probe und vom Strahlenteiler angegebene Fluoreszenz- bzw. Reflexionsstrahlung.

Es ist bekannt (Science, Vol. 178,1972, S. 871 und 872; DE-OS 21 02 985), fluorometrische Bestimmungen von Aminosäuren in aminosäurehaltigen Proben durchzuführen.

Weiterhin ist ein Fluorometer bekannt aus dem Prospekt »Fluorometric FT-67« der Firma Camag Chemie-Erzeugnisse und Adsorptionstechnik AG. Dieses Gerät arbeitet mit dem sehr aufwendigen Chopperprinzip, bei dem der Meßstrahl aus der Probe, angeregt durch einen gefilterten Primärstrahl aus der UV-Strahlenquelle, und ein Vergleichsstrahl aus der Strahlenquel- μ Ie über einen Streuspiegel abwechselnd auf einen Detektor treffen. Die Messung der Fluoreszenzintensität erfolgt in dieser optischen Brücke durch Intensitäts-

abgleich von Meß- und VergleichsstrahL

Ein Fluorometer der eingangs genannten Art und wie es in »Science, VoL 164, 1969. S. 301 und 302« beschrieben ist, verwendet zur Anregung der Fluoreszenz in der Probe einen He-Ne-Laser bei 632,8 nm. Zur Bestimmung von Aminosäuren sind jedoch Wellenlängen im Bereich kleiner als 410 nm erforderlich. Für diesen Wellenlängenbereich gibt es aber keinen kontinuierlich arbeitenden Laser. Zudem sind die Einzelelemente des Fluorometers wiederum weder thermisch noch mechanisch miteinander gekoppelt

Die Aufgabe, die zu lösen der Erfindung gestellt ist, besteht nunmehr darin, eine Vorrichtung zur Durchführung eines fluorometrischen Verfahrens zur Bestimmung von Aminosäuren zu bieten, die sich durch ihre Genauigkeit und die Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit der Aminosäurengehalte durch Ausscheidung mechanischer, thermischer und optischer Störeffekte auszeichnet Die Lösung dieser Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet daß die Halterung für die Probe und der Strahlteiler in zwei Ausnehmungen eines Metallblockes untergebracht sind, daß eine beide Ausnehmungen verbindende Bohrung, die axial verlängert aus dem Metallblock heraustritt, vorgesehen ist, daß die Strahlenquelle und die optische Fokussiereinrichtung Strahlung in die Verbindungsbohrung einbringt, daß im Metallblock jeweils eine Austrittsbohrung von den Ausnehmungen im Winkel ausgeht, durch die die von der Probe und dem Strahlteiler abgegebene Reflexions- bzw. Fluoreszenzstrahlung hindurchtritt, und daß die Detektoren an den Austrittsstellen der Austrittsbohrungen angeordnet sind.

Bei einer Weiterführung dieser Vorrichtung wird vorgesehen, daß in der Austrittsbohrung der Ausnehmung für die Probe eine Kondensor-Streulichtfalle untergebracht ist, und daß zwischen der Austrittsöffnung der Ausnehmung und dem Detektor ein Filter eingeschaltet ist. Gleiches gilt für die gemeinsame Bohrung zu den Ausnehmungen, die mittels eines Interenzfilters abgeschlossen wird.

Um Ausbleicheffekte korrigieren bzw. verhindern zu können, ist es besonders vorteilhaft, da3 die Anregungsenergie der Sirahlenquelle variierbar ist.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels mittels der F i g. 1 bis 3 näher erläutert.

Die Grundlage der Fluoreszamin-Methode ist die binäre Reaktion des nichtfJuoreszierenden Fluoreszamins (I) mit Aminosäuren (II) unter Bildung des Fluorophors (III) und vollständige Hydrolyse des im Überschuß zugesetzten Reagenzes zu wiederum nichtfluoreszierenden wasserlöslichen Produkten.

Die Reaktion läuft bei Raumtemperatur in wäßriger Lösung innerhalb von Bruchteilen einer Sekunde nahezu quantitativ ab und besitzt im allgemeinen ein pH-Optimum zwischen pH =8 und 10. Schnelles intensives Durchmischen von Reagenz- und Probelösung ist wegen der Hydrolyse des Flurams als Konkurrenzreaktion der Fluorophor-Bildung unbedingt erforderlich. Das Reagenz ist in wasserfreiem Aceton bei Raumtemperatur mindestens 2 Wochen stabil. Sekundäre Aminosäuren wie Prolin oder Hydroxyprolin reagieren nicht mit Fluoreszamin, sind in Zuckerrüben aber von untergeordneter Bedeutung. Ammoniak stört im Gegensatz zur Ninhydrin-Methode bei der Fluoreszamin-Methode nicht, da der gebildete Fluoreszenzfarbstoff gegenüber den Aminosäuren eine um etwa lOOOfach geringe Fluoreszenzintensität besitzt.

Ein kritischer Schritt bei der Anwendung der FIuoreszamin-Methode auf Bleiacetat-Rltrate von Zukkerrüben ist die Wahl einer geeigneten Puffersubstanz, die unter anderem in alkalischer Lösung mit Pb^-lonen keine Fällung ergeben durfte, so daß eine Verwendung der oberhalb von pH = 7 üblichen Puffergemische (Borat, Phosphat, Tris und anderem nicht möglich war. Diese Schwierigkeit kann durch die Wahl eines Puffers aus der Reihe der N-substituierten Glycine (Bicin = N.N-Bis(2-hydroxyäthyl)-glycin, pK_A=835, 20⁰C, ApK*/ aO "C=-0,018) überwunden werden. Damit ist eine der wichtigsten methodischen Voraussetzungen erfüllt, um Fluoreszamin nicht nur für die Analyse von Säften und Melassen sondern auch für Routinebestimmungen des Amino-N von Zuckerrüben einsetzen zu können.

Alle Messungen wurden bei einer Anregungswellenlänge von 407 nm und einer Emissionswellenlänge für das Fluoreszenzlicht von 502 nm in rechteckigen Glasküvetten 1 (siehe F i g. 1) von z. B. 1 cm Schichtlänge durchgeführt Dem Empfänger 2 ist ein Sperrnlter 3 zur Unterdrückung des Anregungslichtes vorgeschaltet. Die Strahlengänge von Fluoreszenz- und Anregungslicht sind um 90° gegeneinander versetzt. Die Intensität des Anregungslichtes wurde mit einem Fluoreszenzglasstandard von Zeit zu Zeit überprüft.

In den Fig. 1 bis 3 ist diese Vorrichtung genauer dargestellt, mit welcher die Fluoreszenzmessung erfolgen kann. Es handelt sich hierbei um eine Zweistrahleanrichtung, mit der Schwankungen in der Lichtintensität kompensiert werden können. Ebenfalls ist mit ihr ein x> kontrollierte Verbindung zwischen Anregen und Messen sowie die Verhinderung von Ausbleicheffekten möglich.

In der Fig. 1 ist hierbei eine Aufsicht und ein teilweiser Schnitt durch das erfindungsgemäße Fluorometer dargestellt In einem Metallblock 4, z. B. aus Aluminium, sind zwei senkrecht zur Zeichenebene verlaufende Ausnehmungen 5 und 6 eingefügt. In der Ausnehmung 5 wird ein Strahlteiler 7 (siehe auch F i g. 2) untergebracht, während in der Ausnehmung 6 eine Durchflußküvette 1 mittels einer Spannvorrichtung 8 mit Stößel 9 gehaltert wird. Beide Ausnehmungen 5 und 6 sind über eine gemeinsame Bohrung 10 miteinander verbunden, welche sich axial durch eine Bohrung 11, die von der Ausnehmung 5 ausgeht, bis zur Oberfläche des Metallblockes fortsetzt. Die Austrittsöffnung 12 dieser Bohrung 11 wird durch ein Interferenzfilter 13 sowie eine Halteplatte 14 mit koaxialer Eintrittsöffnung 15 verschlossen. An dieser Halteplatte 14 ist die Fokussierungseinrichtung 16 (Köhlersche Beleuchtung) angeschraubt, die nach außen hin eine Blende 17 aufweist.

Eine Strahlquelle 18 aus einem Quarzbrenner mit ihrer Halterung 19 und 20 erzeugt Strahlung mit einer variablen Anregungsenergie zwischen 30 und 70 Watt. Das von diesem Quarzbrenner 18 ausgehende Lichi tritt durch die Blende 17 in die Fokussiereinricbtung 16 ein. wird dort zu einem parallelen Lichtstrahl ausgeblendet und von dem Interferenzfilter gefiltert Dieses Interferenzfilter 12 läßt je nach Verwendung von Anfärbemitteln entweder Licht der Anregungseneigie 408 nm bzw. 367 nm durch. Dieses Licht trifft dann auf den Strahlteiler 7. Dieser Strahlteiler aus einem Glasplättchen reflektiert ca. 10% dieses Lichtes in eine Austrittsbohrung 21, welche senkrecht zum einfallenden Strahl verläuft Hier trifft es auf ein Photoelßment 22 und wird registriert Von dem Strahlteiler 7 werden immer ca. 10% des Lichtes reflektiert

Die restlichen 90% des Lichtes treten durch die geraeinsame Bohrung 10 hindurch und treffen auf die Durchflußküvette 1 und die darin enthaltene Probe. In der Probe regt sie Fluoreszenzlicht an, welches durch die Austrittsbohrung 23 (ebenfalls im Winkel von 90° zur Einfalls-Strahlungsrichtung) ausgeblendet wird. In der Austrittsbohrung 23 befindet sich eine Kondensor- und Streulichtfalle mit den Linsen 24 und 25 sowie den Blenden 26 und 27, die paralleles Fiuoreszenzficht erzeugen. Dieses Fluoreszenzlicht tritt durch ein Filter 3 hindurch, wobei je nach Antarbemittel nur Strahlung von 470 nm bzw. 450 nm hindurchgelassen wird. Dieses hindurchgelassene Licht trifft auf ein weiteres Photoelement 2. Der Meßwert im Photoelement 2 wird mit dem Meßwert des Pholoelementes 22 verglichen, sei es durch Quotienten- oder Differenzmessung. Die beiden Photoelemenle 2 und 22 werden mittels der Platte 28 am Metallblock 4 gehaltert.

Mit einem Drehmagneten 29, an dessen Drehachse 30 eine Blende 31 angeordnet ist, kann die Bestrahlungszeit kontrolliert bzw. die Bestrahlung und die Messung synchronisiert, d. h. aufeinander abgestimmt werden.

In F i g. 2 ist eine Ansicht der Fluoreszenzeinrichtung dargestellt, die den Drehmagneten 29 mit Achse 30, sowie der Blende 31 zeigt. Die Blende 31 ist dabei als Hebelarm ausgebildet auf den eine Rückstellfeder 32 einwirkt Der Drehmagnet 29 sowie die Rückstellfeder 32 und der Metallblock 4 sind auf einer gemeinsamen Grundplatte 33 befestigt. Sichtbar ist noch die Verschlußplatte 14 sowie das vordere Ende der Fokussiereinrichtung 16.

Die F i g. 3 zeigt einen senkrechten Schnitt durch den Metallblock 4. Sichtbar sind die Eintrittsöffnung zur Ausnehmung 6 der Austrittsbohrung 23, die gemeinsame Bohrung 10 sowie die Ausnehmung 5. Der Strahlteiler 7 wird von einem Stopfen 34 gehalten, der die Ausnehmung 5 nach außen hin gleichzeitig verschließt Weiterhin ist nochmals das Filter 13 dargestellt, mit welchem die Bohrung 11 verschlossen wird. Die Fokussierungseinrichtung 16 wird an der Platte 14 angeschraubt. Außerdem wird die Ausnehmung 6 von unten her mittels eines weiteren Stopfens 35 verschlossen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur fluorometrischen Bestimmung von Aminosäuren in Zuckerrüben und/oder Zuckerfabrikprodukten mit einer Strahlenquelle, einer optischen Fokussiereinrichtung, einem Strahlenteiler, einer Halterung für eine Probe sowie Detektoren für die von der Probe und vom Strahlenteiler abgegebene Fluoreszenz- bzw. Reflexionsstrahlung, dadurch gekennzeichnet, daß die Halterung (1) für die Probe und der Strahlteiler (7) in zwei Ausnehmungen (5 und 6) eines Metallblockes (4) untergebracht sind, daß eine beide Ausnehmungen (5,6) verbindende Bohrung (10), die axial verlängert is aus dem Metallblock (4) heraustritt, vorgesehen ist, daß die Strahlenquelle (18) und die optische Fokussiereinrichtung (16) Strahlung in die Verbindungsbohrung (10,11) einbringt, daß im Metallblock (4) jeweils eine Austrittsbohrung (21 und 23) von den Ausnehmungen (S, 6) im Winkel ausgeht, durch die die von der Probe (1) und dem Strahlteiler (7) abgegebene Reflexions- bzw. Fluoreszenzstrahlung hindurchtritt, und daß die Detektoren (2,22) an den Austrittsstellen der Austrittsbohrungen (21 und 23) angeordnet sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Austrittsbohrung (23) der Ausnehmung (6) für die Probe (1) eine Kondensor-Streulichtfalle (24 bis 27) untergebracht ist, und daß zwischen Austrittsöffnung der Ausnehmung (23) und dem Detektor (2) ein Filter (3) eingeschaltet ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gemeinsame Bohrung (10, ti) zu den Ausnehmungen (5, 6) mittels eines Interferenzfilters(13) abgeschlossen ist

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungsenergie der Strahlenquelle (IS) variierbar ist

5. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der « folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (7) aus einer schräggestellten Glasplatte besteht.