JPS61264264A - アミノ酸誘導体の高感度検出法 - Google Patents
アミノ酸誘導体の高感度検出法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、タンパク質のＮ末端基決定に応用するアミノ
酸の検出方法に関する。特に、ヨウ素の放射性同位体を
含む、（たとえばヨードヒスタミン）を用い、または螢
光体アミノ化合物を用い、（たとえば、アミノピレン、
アミノフルオレン）高感度にアミノ酸を検出する方法に
関する。
酸の検出方法に関する。特に、ヨウ素の放射性同位体を
含む、（たとえばヨードヒスタミン）を用い、または螢
光体アミノ化合物を用い、（たとえば、アミノピレン、
アミノフルオレン）高感度にアミノ酸を検出する方法に
関する。
本発明は、ヨウ素の放射性同位体標式または螢光体アミ
ノ化合物を用いて、アミノ酸を高感度に検出しようとす
るものである。
ノ化合物を用いて、アミノ酸を高感度に検出しようとす
るものである。
従来、Ｎ末端基決定法のエドマン法によるＰＴＣ法の最
終段階のアミノ酸の検出には、第２図に示すように、チ
アゾリノン誘導体を酸処理することによりフェニルチオ
ヒダントイン（ＰＴＨ） 誘導体とし、吸光光度法を用
いてきた。（参考文献■） 〔本発明が解決しようとする問題点〕 従来のＰＴＨ誘導体を吸光光度法により検出する方法は
、検出の手酷としては簡便であるが、最近のますます微
量のタンパク質をより高感度に分析しようとする目的に
十分には向かない。そこで本発明は、より高感度にアミ
ノ酸を検出する新しい方法を提供しようとするものであ
る。
終段階のアミノ酸の検出には、第２図に示すように、チ
アゾリノン誘導体を酸処理することによりフェニルチオ
ヒダントイン（ＰＴＨ） 誘導体とし、吸光光度法を用
いてきた。（参考文献■） 〔本発明が解決しようとする問題点〕 従来のＰＴＨ誘導体を吸光光度法により検出する方法は
、検出の手酷としては簡便であるが、最近のますます微
量のタンパク質をより高感度に分析しようとする目的に
十分には向かない。そこで本発明は、より高感度にアミ
ノ酸を検出する新しい方法を提供しようとするものであ
る。
本発明においては、上記の欠点を解決するために、ヨウ
素の放射性同位体標式または螢光体アミノ化合物を用い
て、アミノ酸を高感度に検出しようとするものである。
素の放射性同位体標式または螢光体アミノ化合物を用い
て、アミノ酸を高感度に検出しようとするものである。
以下に、本発明の原理を従来法と比較して説明する。
本発明は、第２図に示すような従来法のように酸処理に
よりチアゾリノン誘導体をＰＴＨへ導き分光光度計で検
出するのではなく、第１図に示すように、チアゾリノン
誘導体とさらにヨウ素の放射性同位体標式または螢光体
のアミノ化合物と反応させ、フェニルチオカルバミルア
ミノ酸誘導体とし、γ線検出器または螢光分光光度針に
より、高感度にアミノ酸誘導体を検出しようとするもの
である。
よりチアゾリノン誘導体をＰＴＨへ導き分光光度計で検
出するのではなく、第１図に示すように、チアゾリノン
誘導体とさらにヨウ素の放射性同位体標式または螢光体
のアミノ化合物と反応させ、フェニルチオカルバミルア
ミノ酸誘導体とし、γ線検出器または螢光分光光度針に
より、高感度にアミノ酸誘導体を検出しようとするもの
である。
以下、実施例にもとづいて本発明の詳細な説明する。
実施例 １
本実施例においては、アミノ酸の５−チアゾリノン誘導
体（ＡＴＺ）とヨウ素の放射性同位体によって標式され
たヨードヒスタミンとを反応させフェニルチオカルバミ
ルアミノ酸誘導体とし、高感度にそれを検出する基本的
方法を示す。
体（ＡＴＺ）とヨウ素の放射性同位体によって標式され
たヨードヒスタミンとを反応させフェニルチオカルバミ
ルアミノ酸誘導体とし、高感度にそれを検出する基本的
方法を示す。
説明は次の順で行う。ただし、簡単のために、タンパク
質のかわりに、ロイシン（Ｌｅｕ ）とアラニン（Ａｌ
ａ ）よりなるジペプチド（Ｌｅｕ−八ｌａ ）を用い
ている。
質のかわりに、ロイシン（Ｌｅｕ ）とアラニン（Ａｌ
ａ ）よりなるジペプチド（Ｌｅｕ−八ｌａ ）を用い
ている。
１、ＰＩＴＣ−Ｌｅｕ−ＡｌａとＡＴＺ−Ｌｅｕｉ ）
ＰＩＴＣ−Ｌｅｕ−Ａｌａの合成ｉｉ ） ＡＴＺ−
Ｌｅｕの合成と精製２、カップリング反応 ３、フェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体の検出１、
ＰＩＴＣ−Ｌｅｕ、ＡｌａとＡＴＺ−Ｌｅｕｉ ） Ｐ
ＩＴＣ−Ｌｅｕ、Ａｌａの合成（参考文献２）Ｌｅｕ−
Ａｌａ （２０２ｍｇ ）を５０％ピリジン水中に熔
解し、２Ｎ−ＮａＯＨを加え、ｐＨを８．６に調整する
。続いてＰＩＴＣを加える。ＰＩＴＣの添加と共４にｐ
Ｈがさがるので、２Ｎ−Ｍａｉｌ（を加えｐＨを８．６
に保つ、ｐｉ（の変動が少なくなったら、溶液を４０’
Ｃ１時間加熱する。反応後、反応液をベンゼンで洗浄す
る。水相に溶解したベンゼンをＮ２ガスで除去した後、
ＩＮ−ＨＣｌを加え、ｐＨを２にするとＰＩＴＣ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａは白色沈殿として得られる。
ＰＩＴＣ−Ｌｅｕ−Ａｌａの合成ｉｉ ） ＡＴＺ−
Ｌｅｕの合成と精製２、カップリング反応 ３、フェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体の検出１、
ＰＩＴＣ−Ｌｅｕ、ＡｌａとＡＴＺ−Ｌｅｕｉ ） Ｐ
ＩＴＣ−Ｌｅｕ、Ａｌａの合成（参考文献２）Ｌｅｕ−
Ａｌａ （２０２ｍｇ ）を５０％ピリジン水中に熔
解し、２Ｎ−ＮａＯＨを加え、ｐＨを８．６に調整する
。続いてＰＩＴＣを加える。ＰＩＴＣの添加と共４にｐ
Ｈがさがるので、２Ｎ−Ｍａｉｌ（を加えｐＨを８．６
に保つ、ｐｉ（の変動が少なくなったら、溶液を４０’
Ｃ１時間加熱する。反応後、反応液をベンゼンで洗浄す
る。水相に溶解したベンゼンをＮ２ガスで除去した後、
ＩＮ−ＨＣｌを加え、ｐＨを２にするとＰＩＴＣ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａは白色沈殿として得られる。
収量： ２７０ｍｇ 、収率：８０％、 ｍｐ、 １
４８°Ｃｉｉ ）八ＴＺ−Ｌｅｕの合成と精製 ＦＡ ＰＩＴＣ，−Ｌｅｕ−Ａｌａ
ＡＴＺ−Ｌｅｕ ＋Ａｌａ上記ＰＩＴＣ−Ｌ
ｅｕ Ａｌａ （１００ｍｇ ）をＴＦＡ（１ｍｊｌり
に熔解し、５０°Ｃ５分間加熱する。反応後溶液を完全
乾固する。残渣にブチルクロライドを加え、生成物をよ
く溶解し、セルロースカラムに通す（’Ａｌａは、カラ
ムに吸着）。流出液を集め乾固する。
４８°Ｃｉｉ ）八ＴＺ−Ｌｅｕの合成と精製 ＦＡ ＰＩＴＣ，−Ｌｅｕ−Ａｌａ
ＡＴＺ−Ｌｅｕ ＋Ａｌａ上記ＰＩＴＣ−Ｌ
ｅｕ Ａｌａ （１００ｍｇ ）をＴＦＡ（１ｍｊｌり
に熔解し、５０°Ｃ５分間加熱する。反応後溶液を完全
乾固する。残渣にブチルクロライドを加え、生成物をよ
く溶解し、セルロースカラムに通す（’Ａｌａは、カラ
ムに吸着）。流出液を集め乾固する。
ＡＴＺ−Ｌｅｕが白色固体として得られる。
収ｉｉ 、 ７Ｑｍｇ、収率：９５％２、カップリン
グ反応 上の反応式が示すごとく、Ｉ・ｔｌｉｓｔａｍｉｎｅの
アミノ基が、＾ＴＸアミノ酸のカルボニル基を攻撃し、
生成物を与える。これはＰＩＴＣとペプチドとのペプチ
ド結合を酸で切る反応の逆反応である。
グ反応 上の反応式が示すごとく、Ｉ・ｔｌｉｓｔａｍｉｎｅの
アミノ基が、＾ＴＸアミノ酸のカルボニル基を攻撃し、
生成物を与える。これはＰＩＴＣとペプチドとのペプチ
ド結合を酸で切る反応の逆反応である。
ＰＩＴＣ−Ｌｅｕ−Ａｌａより得られたＡＴＺ−Ｌｅｕ
（７０ｍｇ）を３０％ピリジン／ジメチルホルムア
ミド（２０ｍｌ）に溶解した。Ｉ−Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ
２ＨＣｊ！ （２００ｍｇ ）を加え、５０℃１
時間加熱攪拌する。反応液を乾固し、残渣を乾固し、Ｉ
Ｍ−重曹、酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル相を乾燥
し、乾固する。残渣をベンゼンで再結晶し、白色結晶と
して生成物を得る。
（７０ｍｇ）を３０％ピリジン／ジメチルホルムア
ミド（２０ｍｌ）に溶解した。Ｉ−Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ
２ＨＣｊ！ （２００ｍｇ ）を加え、５０℃１
時間加熱攪拌する。反応液を乾固し、残渣を乾固し、Ｉ
Ｍ−重曹、酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル相を乾燥
し、乾固する。残渣をベンゼンで再結晶し、白色結晶と
して生成物を得る。
収量： １２０ｍｇ 、収率：８３％
この生成物は元素分析の結果とよい一致を示した。
３、フェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体の検出反応
混合物と反応生成物を高圧液層クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）にかけ紫外螢光スペクトル（２６９ｎｍ ）に
より検出した。結果は、第３図に示す。
混合物と反応生成物を高圧液層クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）にかけ紫外螢光スペクトル（２６９ｎｍ ）に
より検出した。結果は、第３図に示す。
第３図（イ）は混合直後、（ロ）は５０℃、３０分加熱
後、（ハ）は５０℃１時間加熱後のＨＰＬＣのチャート
をそれぞれ示す。図より明らかなように、５０℃１時間
の加熱により、ロイミインのチアゾリノン誘導体とヨー
ドヒスタミンのカップリング反応は完結し、フェニルチ
オカルバミルロイシン誘導体として検出されている。
後、（ハ）は５０℃１時間加熱後のＨＰＬＣのチャート
をそれぞれ示す。図より明らかなように、５０℃１時間
の加熱により、ロイミインのチアゾリノン誘導体とヨー
ドヒスタミンのカップリング反応は完結し、フェニルチ
オカルバミルロイシン誘導体として検出されている。
（ＨＰＬＣの条件）
・カラム；
５ＥＲＶＡ Ｃａｔ、Ｎｏ、４２３１
２５０ｍｍ Ｘ ４．６ｍｍ
ＳＥＲＶＡＣＩＩＲＯＭ ＰａｋｉｎｇＳ ： １０
０ ： ｐｏｌｙｏｌ ： Ｒ２１８５μｍ ・溶媒系： ・流出速度： １．５ｍｆｆ ／ ｍｉｎ・検出
： ＵＶ２６９ｎｍ ・チャートスピード ： １０ｍｍ／ｍｉｎ実施例
２ 本実施例においては、実施例１と同様の方法を種々のジ
ペプチドとペンタペプチドに応用し、薄層クロマトグラ
フィーとＸ線フィルムを用いて検出した例を示す。
０ ： ｐｏｌｙｏｌ ： Ｒ２１８５μｍ ・溶媒系： ・流出速度： １．５ｍｆｆ ／ ｍｉｎ・検出
： ＵＶ２６９ｎｍ ・チャートスピード ： １０ｍｍ／ｍｉｎ実施例
２ 本実施例においては、実施例１と同様の方法を種々のジ
ペプチドとペンタペプチドに応用し、薄層クロマトグラ
フィーとＸ線フィルムを用いて検出した例を示す。
用いたジペプチドとへブタペプチドは次のものである。
Ｌｅｕ−Ｇ１ｙ＋ Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、 Ｐｈｅ−八
ｌａ、 Ｍｅｔ−Ｌｅｕ＋ ５ｅｒ−Ｐｈｅ＋１１
ｅ−Ｓｅｒ、 Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、 Ａｌａ−Ａｌａ、
Ｖａ１４＋：ｕ＋ Ｇｉｎ−Ｇｌｙ。
ｌａ、 Ｍｅｔ−Ｌｅｕ＋ ５ｅｒ−Ｐｈｅ＋１１
ｅ−Ｓｅｒ、 Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、 Ａｌａ−Ａｌａ、
Ｖａ１４＋：ｕ＋ Ｇｉｎ−Ｇｌｙ。
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ方法は実施例
１と同様な方法により行った。すなわち、上記ペプチド
とフェニルイソシアナート（ＰＩＴＣ）と反応させフェ
ニルチオペプチドとし、次にトリフロロ西ヤ酸（ＴＦ八
）により環化切断しチアゾリノン誘導体とする。このチ
アゾリノン誘導体と一部放射性同位体で標式されたヨー
ドヒスタミンと反応させ、フェニルチオカルバミルアミ
ノ酸誘導体とする。生成した種々のフェニルチオカルバ
ミルアミノ酸誘導体は、薄層クロマトグラフィーを用い
、Ｘ線フィルムにて一昼夜感光後、それぞれ一つの明瞭
な感光点として検出した。また、薄層クロマトグラフィ
ーの展開には、ベンゼンメタノール・四級ブチルアルコ
ールの容量比８：１：１の溶媒系を用いた。
１と同様な方法により行った。すなわち、上記ペプチド
とフェニルイソシアナート（ＰＩＴＣ）と反応させフェ
ニルチオペプチドとし、次にトリフロロ西ヤ酸（ＴＦ八
）により環化切断しチアゾリノン誘導体とする。このチ
アゾリノン誘導体と一部放射性同位体で標式されたヨー
ドヒスタミンと反応させ、フェニルチオカルバミルアミ
ノ酸誘導体とする。生成した種々のフェニルチオカルバ
ミルアミノ酸誘導体は、薄層クロマトグラフィーを用い
、Ｘ線フィルムにて一昼夜感光後、それぞれ一つの明瞭
な感光点として検出した。また、薄層クロマトグラフィ
ーの展開には、ベンゼンメタノール・四級ブチルアルコ
ールの容量比８：１：１の溶媒系を用いた。
結果は、第４図に示す。縦軸はＩ’ｌＦ値をとっである
。
。
また、従来法の検出感度と比較すると、次のごとく本発
明の検出感度は著しく高い。
明の検出感度は著しく高い。
検出方法 検出感度フェニルチオ
ヒダントインアミノ酸検出法（従来法）
二 〜１０ ｐ ｍｏｌｅ本発明 ：０．１〜１０ ｆ ｍｏｌｅ 実施例 ３ 本実施例においては、アミノ酸の５−チアゾリノン誘導
体と螢光体アミノ化合物（９−アミノフルオレン）とを
反応させ、フェニルチオカルバミルアミノ＃誘導体とし
高感度にそれを検出する例を示す。
ヒダントインアミノ酸検出法（従来法）
二 〜１０ ｐ ｍｏｌｅ本発明 ：０．１〜１０ ｆ ｍｏｌｅ 実施例 ３ 本実施例においては、アミノ酸の５−チアゾリノン誘導
体と螢光体アミノ化合物（９−アミノフルオレン）とを
反応させ、フェニルチオカルバミルアミノ＃誘導体とし
高感度にそれを検出する例を示す。
チアゾリノン誘導体を得るところまでは、実施例１と同
様の操作を行った。
様の操作を行った。
また、ここでもロイシンのチアゾリノン誘導体（以下Ａ
ＴＺ−Ｌｅｕと略す）を用いた。
ＴＺ−Ｌｅｕと略す）を用いた。
反応は次式に従って進み、フェニルチオカル）＜ミルア
ミノ酸誘導体となる。
ミノ酸誘導体となる。
Ｓ ＣＨ−ＲＮＨ２ＨＣβ
゛Ｃ′
チアゾリノン誘導体 ９−アミノフルオレン反応は次
のごとく行った。３０％ピリジン−ジメチルホルムアミ
ド ン（１３０ｍｇ，０．６ｍｌ’ｌ ）を、ＡＴＺ−Ｌｅ
ｕ （ ７０ｍｇ， ０．２１ｍＭ ）に加え、５０
″０１時間加熱し反応を行った。
のごとく行った。３０％ピリジン−ジメチルホルムアミ
ド ン（１３０ｍｇ，０．６ｍｌ’ｌ ）を、ＡＴＺ−Ｌｅ
ｕ （ ７０ｍｇ， ０．２１ｍＭ ）に加え、５０
″０１時間加熱し反応を行った。
反応後、反応液を乾固し、残渣にＣＨＣ＃ｌ ３を加え
、不溶物（９−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｎ． ＨＣｆｆ
）を濾別し、Ｃ）ＩｃＪ！ ３相を０．ＩＮＩｌｌ
、０。ＩＩＮ ＮａＨＣＯ３で洗浄する。
、不溶物（９−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｎ． ＨＣｆｆ
）を濾別し、Ｃ）ＩｃＪ！ ３相を０．ＩＮＩｌｌ
、０。ＩＩＮ ＮａＨＣＯ３で洗浄する。
さらにＣｆ（ｃβ３相はＮａ２Ｓｏ４で乾燥し、濃縮乾
固する。残渣をベンゼンより再結晶し、生成物を白色結
晶として得る。
固する。残渣をベンゼンより再結晶し、生成物を白色結
晶として得る。
収量： １３０ｍｇ 、収率：８８％ ｍｐ ２２５
°Ｃ反応混合物と反応生成物を高圧液層クロマトグラフ
ィー（）ＩＰＬＣ）にかけ、紫外螢光スペクトル（２６
９ ｎｍ）により、検出した。結果は、第５図に示す。
°Ｃ反応混合物と反応生成物を高圧液層クロマトグラフ
ィー（）ＩＰＬＣ）にかけ、紫外螢光スペクトル（２６
９ ｎｍ）により、検出した。結果は、第５図に示す。
第５図（イ）は、混合直後の反応混合物のＩＩ Ｐ Ｌ
Ｃのチャートであり、第５図（口）は、５０℃１時間
加熱反応後のそれを示す。図より明らかなように、ロイ
シンのチアゾリノン誘導体（ａ）は、反応後フェニルチ
オカルバミルロイシン誘導体ＦＣ）となって検出されて
いる。
Ｃのチャートであり、第５図（口）は、５０℃１時間
加熱反応後のそれを示す。図より明らかなように、ロイ
シンのチアゾリノン誘導体（ａ）は、反応後フェニルチ
オカルバミルロイシン誘導体ＦＣ）となって検出されて
いる。
また、本発明の検出感度と、従来のフェニルチオヒダン
トインアミノ酸検出法のそれとを比較したところ、次の
ようになり、本発明の検出感度が非常に高いことが分か
った。
トインアミノ酸検出法のそれとを比較したところ、次の
ようになり、本発明の検出感度が非常に高いことが分か
った。
検出方法 検出感度フェニルチオ
ヒダントインアミノ酸法（従来法）： ゞ１０ ｐ ｍ
ｏｌｅ 本発明 ：０．１〜ｌ ｐ ｍｏｌｅ 〔発明の効果〕 アミノ酸の高感度検出をも含む本発明の主眼とするとこ
ろは、大きく２つある。
ヒダントインアミノ酸法（従来法）： ゞ１０ ｐ ｍ
ｏｌｅ 本発明 ：０．１〜ｌ ｐ ｍｏｌｅ 〔発明の効果〕 アミノ酸の高感度検出をも含む本発明の主眼とするとこ
ろは、大きく２つある。
１、アミノ酸配列の決定法におけるアミノ酸誘導体の高
感度検出 ２、高感度検出化に用いる放射線同位体の効率的利用 まず、上記２について説明すれば、従来ｓ ｐｒｒｃ（
参考文献３）またはＩ ＰｒＴＣ （参考文献４）標式
を用いて高感度検出化を目脂した方法があるが、いずれ
もエドマン分解法の主反応に放射性同位体元素誘導体が
関与している。高感度を目的として高放射能を用いれば
、放射崩壊が増大し、エドマンアミノ酸配列決定法その
ものの収率を阻害するし、また反応容器の汚染もある。
感度検出 ２、高感度検出化に用いる放射線同位体の効率的利用 まず、上記２について説明すれば、従来ｓ ｐｒｒｃ（
参考文献３）またはＩ ＰｒＴＣ （参考文献４）標式
を用いて高感度検出化を目脂した方法があるが、いずれ
もエドマン分解法の主反応に放射性同位体元素誘導体が
関与している。高感度を目的として高放射能を用いれば
、放射崩壊が増大し、エドマンアミノ酸配列決定法その
ものの収率を阻害するし、また反応容器の汚染もある。
本発明においては、主反応に放射性物質を用いず、配列
決定法の最終段階でのみ特定容器中で放射性物質を用い
るので、主反応はまった〈従来通りで、最終段階での各
ステップの反応物中間体（ＡＴＺ ）の最終修飾の所で
のみ放射性物質を用いるので反応自体には何ら従来法と
変らない。従って反応の収量をそこなうことなく放射能
汚染を最小限度に進める事ができる。
決定法の最終段階でのみ特定容器中で放射性物質を用い
るので、主反応はまった〈従来通りで、最終段階での各
ステップの反応物中間体（ＡＴＺ ）の最終修飾の所で
のみ放射性物質を用いるので反応自体には何ら従来法と
変らない。従って反応の収量をそこなうことなく放射能
汚染を最小限度に進める事ができる。
次に本発明のアミ、ノ酸誘導体の検出感度が非常に高い
ことを、従来のフェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体
を用いる方法と比較して説明すれば次のようになる。
ことを、従来のフェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体
を用いる方法と比較して説明すれば次のようになる。
検出方法 検出感度フェニルチ
オヒダントインアミノ酸検出法１〜Ｌｏｐ ｍｏｌｅ 本発明 ヨウ素の同位体標式を用いる場合０．１〜１０
ｆ ｍｏｌｅ 螢光体アミノ化合物を用いる場合 ０．１〜ｌｐ ｍｏｌｅ 本発明の重要な点は、ヨウ素標式アミノ化合物または螢
光体アミン化合物と、アミノ酸のチアゾリノン誘導体と
反応させフェニルチオカルバミル誘導体とし、高感度に
それを検出するところにある。実施例においては、ヨー
ドヒスタミンとアミノフルオレンを用いた例を示したの
みであるが、次のヨウ素標式アミノ化合物でも、螢光体
アミノ化合物でも可能なことは明らがであり、実施例に
制約されない。よって、本発明によるアミノ酸を高感度
に検出する方法は、その工業的価値は大である。
オヒダントインアミノ酸検出法１〜Ｌｏｐ ｍｏｌｅ 本発明 ヨウ素の同位体標式を用いる場合０．１〜１０
ｆ ｍｏｌｅ 螢光体アミノ化合物を用いる場合 ０．１〜ｌｐ ｍｏｌｅ 本発明の重要な点は、ヨウ素標式アミノ化合物または螢
光体アミン化合物と、アミノ酸のチアゾリノン誘導体と
反応させフェニルチオカルバミル誘導体とし、高感度に
それを検出するところにある。実施例においては、ヨー
ドヒスタミンとアミノフルオレンを用いた例を示したの
みであるが、次のヨウ素標式アミノ化合物でも、螢光体
アミノ化合物でも可能なことは明らがであり、実施例に
制約されない。よって、本発明によるアミノ酸を高感度
に検出する方法は、その工業的価値は大である。
１、成田耕運 「タンパク質の構造」現代化学シリーズ
２２ （１９６８） Ｐ ３２ 東京化学同人２、
モレキュラ バイオロジー バイオケミストリー アン
ド バイオロジンクス ８巻 「プロティン シーフェンス デタミネーション」 ソ
ウル Ｂ、ネーブルマン と スプリンガー ベルラッ
グ 編 Ｐ２Ｓ５ （Ｍｇｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏ−ｐｈｙｓｉｃｓ ８
Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃａ Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ５ａｕｌ Ｉｌｌ、
Ｎｅａｄｌｅｍａｎ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｙＰ２５３） ３、 Ｗ、Ｇ、ラウエル ファンダメンタル テクニ・
ノクス イン バイオロジ− に、バーベル と Ｎ、Ｐ、サルグマン 編（、１９６
９）（アカデミツク プレス ニューヨーク）（Ｗ、Ｇ
、 Ｌａｕｅｒ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ Ｅｄｓ、 Ｋ、
Ｈａｂｅｌ ａｎｄ Ｎ、Ｐ、 Ｓａｌｇｍａｎ（１
９６９） Ｐ３７９ （八ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ ） ）４、 Ｃ，Ｊ、バレル Ｐ、Ｄ、クー
パー とＪ、Ｍ、スワン著 オーストリア ジャーナル
オブ ケミストリー ２８巻 １９７５年 Ｐ２２８
９（ｃ，Ｊ、、 Ｂｕｒｒｅｌｌ、 Ｐ、Ｄ、 Ｃｏｏ
ｐｅｒ＋ Ｊ、Ｍ、 Ｓｗａｎｎ＋Ａｕ５ｔ Ｊ、Ｃｈ
ｅｍ、 ２８ （１９７５） ２２８９ ）
２２ （１９６８） Ｐ ３２ 東京化学同人２、
モレキュラ バイオロジー バイオケミストリー アン
ド バイオロジンクス ８巻 「プロティン シーフェンス デタミネーション」 ソ
ウル Ｂ、ネーブルマン と スプリンガー ベルラッ
グ 編 Ｐ２Ｓ５ （Ｍｇｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏ−ｐｈｙｓｉｃｓ ８
Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃａ Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ５ａｕｌ Ｉｌｌ、
Ｎｅａｄｌｅｍａｎ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｙＰ２５３） ３、 Ｗ、Ｇ、ラウエル ファンダメンタル テクニ・
ノクス イン バイオロジ− に、バーベル と Ｎ、Ｐ、サルグマン 編（、１９６
９）（アカデミツク プレス ニューヨーク）（Ｗ、Ｇ
、 Ｌａｕｅｒ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ Ｅｄｓ、 Ｋ、
Ｈａｂｅｌ ａｎｄ Ｎ、Ｐ、 Ｓａｌｇｍａｎ（１
９６９） Ｐ３７９ （八ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ ） ）４、 Ｃ，Ｊ、バレル Ｐ、Ｄ、クー
パー とＪ、Ｍ、スワン著 オーストリア ジャーナル
オブ ケミストリー ２８巻 １９７５年 Ｐ２２８
９（ｃ，Ｊ、、 Ｂｕｒｒｅｌｌ、 Ｐ、Ｄ、 Ｃｏｏ
ｐｅｒ＋ Ｊ、Ｍ、 Ｓｗａｎｎ＋Ａｕ５ｔ Ｊ、Ｃｈ
ｅｍ、 ２８ （１９７５） ２２８９ ）
第１図二本発明の検出方法を示す工程図第２図：従来方
法の工程図 第３図：反応混合物と反応生成物のＩＩＰＬＣのチャー
ト（ＡＴＺ−Ｌｅｕとヨードヒスタミンの場合）（イ）
混合直後 （ロ）５０℃３０分加熱後 （ハ）５０℃１時間加熱後 （ａｌ ロイシンのチアゾリノン誘導体ｔｃ＋ ロ
イシンのフェニルチオカルバミル誘導体 第４図：種々のフニニルチオカルバミルアミノ酸の薄層
クロマトグラフィー 第５図：反応混合物と反応生成物のＨＰＬＣのチャート
（ＡＴＺ−Ｌｅｕとアミノフルオレンの場合）以上 出願人 セイコー電子工業株式会社 フェニルナオカルバミルタノパク質 ｐ） フェニル子オカルバミ〕レアξノ酸！１４本ネｐｅ明方
法の工Ｈ図 ＠−Ｎ−ｃ−ｓ ＋Ｎｒ−ｔｚｃｓＲ＋−ｃｏ−ＮＨ−
ｃＨＲｚ−ｃｏ−ＮＨ−ｃＨＲｓ−ｃｏ−フェニルイソ
シアナ斗（ＰＩＴＣ） タンパク質ＧしたＩま
、アミノ宋喝を刀呆）門 アミノ酸フェニルチオヒデントイン誘導４本（ＰＴＨ） 第４図
法の工程図 第３図：反応混合物と反応生成物のＩＩＰＬＣのチャー
ト（ＡＴＺ−Ｌｅｕとヨードヒスタミンの場合）（イ）
混合直後 （ロ）５０℃３０分加熱後 （ハ）５０℃１時間加熱後 （ａｌ ロイシンのチアゾリノン誘導体ｔｃ＋ ロ
イシンのフェニルチオカルバミル誘導体 第４図：種々のフニニルチオカルバミルアミノ酸の薄層
クロマトグラフィー 第５図：反応混合物と反応生成物のＨＰＬＣのチャート
（ＡＴＺ−Ｌｅｕとアミノフルオレンの場合）以上 出願人 セイコー電子工業株式会社 フェニルナオカルバミルタノパク質 ｐ） フェニル子オカルバミ〕レアξノ酸！１４本ネｐｅ明方
法の工Ｈ図 ＠−Ｎ−ｃ−ｓ ＋Ｎｒ−ｔｚｃｓＲ＋−ｃｏ−ＮＨ−
ｃＨＲｚ−ｃｏ−ＮＨ−ｃＨＲｓ−ｃｏ−フェニルイソ
シアナ斗（ＰＩＴＣ） タンパク質ＧしたＩま
、アミノ宋喝を刀呆）門 アミノ酸フェニルチオヒデントイン誘導４本（ＰＴＨ） 第４図
Claims (2)
- （１）アミノ酸の５−チアゾリノン誘導体（ａ）と、ヨ
ウ素の放射性同位体標式または螢光体アミノ化合物（ｂ
）を〔 I 〕式に従って反応させ、フェニルチオカルバ
ミルアミノ酸誘導体（ｃ）とし、高感度にそれら（ｃ）
を検出する方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ａ） ＋Ｈ＿２Ｎ
−Ｘ（ｂ） Ｘ：ヨウ素の放射性同位体標式または螢光体→▲数式、
化学式、表等があります▼〔 I 〕（ｃ） - （２）アミノ酸の５−チアゾリノン誘導体（ａ）は、通
常のアミノ酸結合順序決定法（エドマン法）において、
フェニルイソチオシアナート（ｄ）とタンパク質または
ペプチド（ｅ）とを〔II〕式に従って反応させ、フェニ
ルチオカルバミルタンパク質（ｆ）をつくり、〔III〕
式に従って無水の状態で酸と反応させ、環化切断して得
ることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項に記載の
アミノ酸誘導体の高感度検出法。 ▲数式、化学式、表等があります▼−Ｎ＝（ｄ） ・Ｃ
＝Ｓ＋ＮＨ＿２・ＣＨＲ＿１・ＣＯ−ＮＨ・ＣＨＲ＿２
・ＣＯ−ＮＨ・ＣＨＲ＿３・ＣＯ−（ｅ）→▲数式、化
学式、表等があります▼−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ・ＣＨＲ＿
１・ＣＯ−ＮＨ・ＣＨＲ＿２ＣＯ−ＮＨ・ＣＨＲ＿３・
ＣＯ−（ｆ）〔II〕→▲数式、化学式、表等があります
▼（ａ） ＋ＮＨ＿２・ＣＨＲ＿２・ＣＯ−ＮＨ・ＣＨ
Ｒ＿３・ＣＯ−〔III〕
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60105400A JPS61264264A (ja) | 1985-05-17 | 1985-05-17 | アミノ酸誘導体の高感度検出法 |
| EP86303763A EP0202894B1 (en) | 1985-05-17 | 1986-05-16 | A method for detecting amino acid derivatives |
| DE8686303763T DE3683916D1 (de) | 1985-05-17 | 1986-05-16 | Verfahren zum nachweisen von aminosaeurederivaten. |
| US07/185,324 US4865994A (en) | 1985-05-17 | 1988-04-19 | Detection method for amino acid derivatives |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60105400A JPS61264264A (ja) | 1985-05-17 | 1985-05-17 | アミノ酸誘導体の高感度検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61264264A true JPS61264264A (ja) | 1986-11-22 |
| JPH0575068B2 JPH0575068B2 (ja) | 1993-10-19 |
Family
ID=14406579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60105400A Granted JPS61264264A (ja) | 1985-05-17 | 1985-05-17 | アミノ酸誘導体の高感度検出法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4865994A (ja) |
| EP (1) | EP0202894B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61264264A (ja) |
| DE (1) | DE3683916D1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61264264A (ja) * | 1985-05-17 | 1986-11-22 | Seiko Instr & Electronics Ltd | アミノ酸誘導体の高感度検出法 |
| JPS63196858A (ja) * | 1987-02-12 | 1988-08-15 | Seiko Instr & Electronics Ltd | アミノ酸誘導体の高感度検出法 |
| US5008205A (en) * | 1988-08-10 | 1991-04-16 | Hewlett-Packard Company | Method of facilitating detection of amino acid derivatives with enhanced sensitivity |
| JP2725731B2 (ja) * | 1991-02-28 | 1998-03-11 | 株式会社島津製作所 | 過剰蛍光試薬のクエンチング方法 |
| US5270213A (en) * | 1991-06-21 | 1993-12-14 | Porton Instruments, Inc. | Protein sequencing |
| DE69328080T2 (de) * | 1992-07-27 | 2000-12-14 | Seiko Instr Inc | Verfahren zum hochempfindlichen nachweis von aminosäurederivaten |
| AU4817799A (en) * | 1998-03-02 | 1999-10-18 | Biotraces, Inc. | Reagents and methods for protein microsequencing |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3645689A (en) * | 1970-04-09 | 1972-02-29 | Lkb Produkter Ab | Method and apparatus for analyzing proteins |
| US4065412A (en) * | 1976-05-07 | 1977-12-27 | Durrum Instrument Corporation | Peptide or protein sequencing method and apparatus |
| US4153416A (en) * | 1977-06-06 | 1979-05-08 | Bonner Alex G | Process and apparatus for pulse labelling protein material in the Edman degradation process |
| JPS55110955A (en) * | 1979-02-19 | 1980-08-27 | Yuki Gosei Yakuhin Kogyo Kk | Novel fluorescent estimation of phenylthiohydaniton amino acid |
| JPS57182145A (en) * | 1981-05-02 | 1982-11-09 | Asama Kasei Kk | Aminoacid fluorometry |
| JPS61264264A (ja) * | 1985-05-17 | 1986-11-22 | Seiko Instr & Electronics Ltd | アミノ酸誘導体の高感度検出法 |
-
1985
- 1985-05-17 JP JP60105400A patent/JPS61264264A/ja active Granted
-
1986
- 1986-05-16 DE DE8686303763T patent/DE3683916D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-16 EP EP86303763A patent/EP0202894B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-04-19 US US07/185,324 patent/US4865994A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0202894A3 (en) | 1988-09-14 |
| EP0202894A2 (en) | 1986-11-26 |
| JPH0575068B2 (ja) | 1993-10-19 |
| EP0202894B1 (en) | 1992-02-19 |
| US4865994A (en) | 1989-09-12 |
| DE3683916D1 (de) | 1992-03-26 |
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