JP2725731B2 - 過剰蛍光試薬のクエンチング方法 - Google Patents
過剰蛍光試薬のクエンチング方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸やＤＮＡ断片、ア
ミノ酸、ペプチド、タンパク質、アミノ糖のラベリング
後の精製時および超微量アミノ酸分析、超高感度タンパ
ク質一次構造解析、アミノ糖の微量分析等の液体クロマ
トグラフィーにおいて、蛍光試薬を用いる場合の過剰蛍
光試薬のクエンチング方法に関する。
ミノ酸、ペプチド、タンパク質、アミノ糖のラベリング
後の精製時および超微量アミノ酸分析、超高感度タンパ
ク質一次構造解析、アミノ糖の微量分析等の液体クロマ
トグラフィーにおいて、蛍光試薬を用いる場合の過剰蛍
光試薬のクエンチング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来、タ
ンパク質一次構造の解析等においては、３−フェニル−
２−チオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸のような標
識アミノ酸を逆相高速液体クロマトグラフィーにより分
析するエドマン法が従来より用いられているが、ＵＶ吸
収で分析するため溶離液の有機溶媒や分解物のバックグ
ラウンドの影響が大きく、感度において充分ではない。
ンパク質一次構造の解析等においては、３−フェニル−
２−チオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸のような標
識アミノ酸を逆相高速液体クロマトグラフィーにより分
析するエドマン法が従来より用いられているが、ＵＶ吸
収で分析するため溶離液の有機溶媒や分解物のバックグ
ラウンドの影響が大きく、感度において充分ではない。
【０００３】近年分析の迅速化と微量化において蛍光を
利用した超微量分析が開発されている。この方法では、
アミノ酸中のアミノ基を蛍光試薬で標識する方法であ
り、蛍光試薬としてはイソチオシアネート誘導体（例え
ばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））を
用いる方法である。
利用した超微量分析が開発されている。この方法では、
アミノ酸中のアミノ基を蛍光試薬で標識する方法であ
り、蛍光試薬としてはイソチオシアネート誘導体（例え
ばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））を
用いる方法である。
【０００４】通常、蛍光試薬の場合そのラベル化後に過
剰の試薬を除去する必要があるが、ＦＩＴＣのごとく分
子内に親水性官能基を持つものは過剰の試薬を除去する
条件設定が難しいという問題が指摘されている。即ち、
検出しようとする化合物がイソチオシアネート誘導体と
極性が異なる化合物である場合には、蛍光試薬のラベル
化後、反応溶液を直接クロマトグラフィーで分離するこ
とも可能であるが、アミノ酸や糖のような親水性官能基
を有する化合物の場合には、ラベル化後のラベル化誘導
体と過剰試薬との分離が困難であることが多い。この過
剰の蛍光試薬が検体中に残存していれば、トリプトファ
ン等のアミノ酸、グルコサミン、ガラクトサミン等のア
ミノ糖の検出において、クロマトグラフィー上のピーク
が重複あるいは非常に接近しているため、アミノ酸誘導
体の同定に支障を来すという問題が生じる。一方、過剰
試薬の洗浄除去を完全にすれば、逆に検体中の目的とす
るアミノ酸等を流出させ、検体量を減少させることとも
なる。従って、本発明の目的は、過剰に存在する蛍光試
薬をクエンチングすることによってクロマトグラフィー
上のピークによるアミノ酸の同定の障害をなくす方法を
提供することにある。
剰の試薬を除去する必要があるが、ＦＩＴＣのごとく分
子内に親水性官能基を持つものは過剰の試薬を除去する
条件設定が難しいという問題が指摘されている。即ち、
検出しようとする化合物がイソチオシアネート誘導体と
極性が異なる化合物である場合には、蛍光試薬のラベル
化後、反応溶液を直接クロマトグラフィーで分離するこ
とも可能であるが、アミノ酸や糖のような親水性官能基
を有する化合物の場合には、ラベル化後のラベル化誘導
体と過剰試薬との分離が困難であることが多い。この過
剰の蛍光試薬が検体中に残存していれば、トリプトファ
ン等のアミノ酸、グルコサミン、ガラクトサミン等のア
ミノ糖の検出において、クロマトグラフィー上のピーク
が重複あるいは非常に接近しているため、アミノ酸誘導
体の同定に支障を来すという問題が生じる。一方、過剰
試薬の洗浄除去を完全にすれば、逆に検体中の目的とす
るアミノ酸等を流出させ、検体量を減少させることとも
なる。従って、本発明の目的は、過剰に存在する蛍光試
薬をクエンチングすることによってクロマトグラフィー
上のピークによるアミノ酸の同定の障害をなくす方法を
提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するためにラベル化後に残存する過剰の蛍光試薬
の除去について鋭意検討を行った結果、本発明を完成す
るに到った。即ち、本発明の要旨は、蛍光分析において
蛍光試薬として用いられる過剰のイソチオシアネート誘
導体にアンモニウム塩を反応させることを特徴とする過
剰蛍光試薬のクエンチング方法に関するものである。
を解決するためにラベル化後に残存する過剰の蛍光試薬
の除去について鋭意検討を行った結果、本発明を完成す
るに到った。即ち、本発明の要旨は、蛍光分析において
蛍光試薬として用いられる過剰のイソチオシアネート誘
導体にアンモニウム塩を反応させることを特徴とする過
剰蛍光試薬のクエンチング方法に関するものである。
【０００６】本発明の方法によると、ラベル化化合物に
は影響を与えることなく、残存する蛍光試薬のみが反応
し、その結果生成した化合物は目的化合物の検出に影響
を与えないものである。本発明において用いられるフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、公知の
蛍光試薬であり、アミノ基との反応性を有し、アンモニ
ウム塩と反応するとＦＩＴＣ合成の前駆体であるアミノ
フルオレセインに変換することができる。この変換によ
り生成するアミノフルオレセインの極性はＦＩＴＣより
更に高く、しかも蛍光強度は約５０％である。
は影響を与えることなく、残存する蛍光試薬のみが反応
し、その結果生成した化合物は目的化合物の検出に影響
を与えないものである。本発明において用いられるフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、公知の
蛍光試薬であり、アミノ基との反応性を有し、アンモニ
ウム塩と反応するとＦＩＴＣ合成の前駆体であるアミノ
フルオレセインに変換することができる。この変換によ
り生成するアミノフルオレセインの極性はＦＩＴＣより
更に高く、しかも蛍光強度は約５０％である。
【０００７】本発明における蛍光試薬としては、前記の
ＦＩＴＣの他、４−（Ｎ−１−ジメチルアミノナフタレ
ン−５−スルフォニルアミノ）フェニルイソチオシアネ
ート等が例示され、いずれを用いてもよい。また、本発
明におけるアンモニウム塩としては酢酸アンモニウムの
ような有機酸アンモニウム、などが例示される。これら
のアンモニウム塩は検体中の目的化合物に何ら影響を与
えないものならば、いずれを選択してもよく、また単独
でまたは２種以上の混合物として使用してもよい。
ＦＩＴＣの他、４−（Ｎ−１−ジメチルアミノナフタレ
ン−５−スルフォニルアミノ）フェニルイソチオシアネ
ート等が例示され、いずれを用いてもよい。また、本発
明におけるアンモニウム塩としては酢酸アンモニウムの
ような有機酸アンモニウム、などが例示される。これら
のアンモニウム塩は検体中の目的化合物に何ら影響を与
えないものならば、いずれを選択してもよく、また単独
でまたは２種以上の混合物として使用してもよい。
【０００８】通常、蛍光分析では検出化合物の大過剰の
蛍光試薬を使用するため、過剰試薬が検体中に存在す
る。この過剰試薬に対してアンモニウム塩は通常、０．
１モル以上の濃度で用いられる。本発明の過剰蛍光試薬
のクエンチング方法においては、前記のように検体中の
過剰蛍光試薬に対してアンモニウム塩を添加して反応さ
せるが、この場合反応性の点から通常、５５℃前後に加
温するのが好ましい。反応時間は通常約１０分間程度で
充分である。このような処理により、過剰のＦＩＴＣか
ら生成したアミノフルオレセインは検体中に存在しても
検出目的化合物の分析には影響がなく、蛍光強度もＦＩ
ＴＣの半分であるから、検体から除去する必要はない。
蛍光試薬を使用するため、過剰試薬が検体中に存在す
る。この過剰試薬に対してアンモニウム塩は通常、０．
１モル以上の濃度で用いられる。本発明の過剰蛍光試薬
のクエンチング方法においては、前記のように検体中の
過剰蛍光試薬に対してアンモニウム塩を添加して反応さ
せるが、この場合反応性の点から通常、５５℃前後に加
温するのが好ましい。反応時間は通常約１０分間程度で
充分である。このような処理により、過剰のＦＩＴＣか
ら生成したアミノフルオレセインは検体中に存在しても
検出目的化合物の分析には影響がなく、蛍光強度もＦＩ
ＴＣの半分であるから、検体から除去する必要はない。
【０００９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。 実施例１ ＦＩＴＣ−Ｉ（２０nmol/100μl)をアセトニトリル−
0.1Ｍ酢酸アンモニウム（pH 9.0)(９：１）に溶かし、
５５℃に加温した。加温０分後（溶解直後、加熱せ
ず）、５分後、１０分後に１μｌ（200 pmol) を高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけた。 ＨＰＬＣ条件 カラム： Hypersil ODS (3μm, 4.6×100mm,4.6×50 mm
２本） 温 度： 60 ℃ 流 速： 1.0 ml/min 溶 媒： A: 3% アセトン−10 mM リン酸緩衝液pH 7.0 B: 15% アセトン−10 mM PB pH 7.0 グラジェント: Ｂ溶媒（％） ０分：０％； 30分：50％； 45分：50％； 60分： 1
00％ その結果、酢酸アンモニウムを加えないＦＩＴＣ−Ｉの
みのＨＰＬＣのチャートを図１に、ＦＩＴＣ−Ｉに酢酸
アンモニウムを加えた場合の加温直後のＨＰＬＣのチャ
ートを図２に、５分後を図３に、１０分後を図４に示し
た。ＦＩＴＣは５分後で、その約９０％がアミノフルオ
レセインに変換し、１０分後でほぼすべてが変換した。
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。 実施例１ ＦＩＴＣ−Ｉ（２０nmol/100μl)をアセトニトリル−
0.1Ｍ酢酸アンモニウム（pH 9.0)(９：１）に溶かし、
５５℃に加温した。加温０分後（溶解直後、加熱せ
ず）、５分後、１０分後に１μｌ（200 pmol) を高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけた。 ＨＰＬＣ条件 カラム： Hypersil ODS (3μm, 4.6×100mm,4.6×50 mm
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みのＨＰＬＣのチャートを図１に、ＦＩＴＣ−Ｉに酢酸
アンモニウムを加えた場合の加温直後のＨＰＬＣのチャ
ートを図２に、５分後を図３に、１０分後を図４に示し
た。ＦＩＴＣは５分後で、その約９０％がアミノフルオ
レセインに変換し、１０分後でほぼすべてが変換した。
【００１０】実施例２ 検体中にＦＴＨ−アミノ酸（2 pmol) を加え、実施例１
と同様にしてＨＰＬＣにかけた。ＦＴＨ−アミノ酸のみ
のチャートを図５に、ＦＴＨ−アミノ酸にＦＩＴＣ−Ｉ
を混在させて使用した本発明の方法による加温直後のＨ
ＰＬＣのチャートを図６に、５分後を図７に示した。図
６より過剰ＦＩＴＣの存在はトリプトファンの検出を妨
げ、図７よりアミノフルオレセインはグルタミン酸近く
に溶出するが、ピークは重ならないことが判明した。従
って、プロテインシーケンサーを用いる場合にはコンバ
ージョンプログラムにアセトニトリル−酢酸アンモニウ
ム（pH9.0)導入後、１０分間のInitial timeを設けるこ
とが望ましい。
と同様にしてＨＰＬＣにかけた。ＦＴＨ−アミノ酸のみ
のチャートを図５に、ＦＴＨ−アミノ酸にＦＩＴＣ−Ｉ
を混在させて使用した本発明の方法による加温直後のＨ
ＰＬＣのチャートを図６に、５分後を図７に示した。図
６より過剰ＦＩＴＣの存在はトリプトファンの検出を妨
げ、図７よりアミノフルオレセインはグルタミン酸近く
に溶出するが、ピークは重ならないことが判明した。従
って、プロテインシーケンサーを用いる場合にはコンバ
ージョンプログラムにアセトニトリル−酢酸アンモニウ
ム（pH9.0)導入後、１０分間のInitial timeを設けるこ
とが望ましい。
【００１１】
【発明の効果】本発明の方法は、検体中に過剰に存在す
る蛍光試薬をクエンチングによってアミノフルオレセイ
ンに変換し、ＦＩＴＣのクロマトグラフィー上のピーク
による同定の障害をなくすことができる。従って、トリ
プトファンを含むアミノ酸、グルコサミン、ガラクトサ
ミン、マンノサミン等を含むアミノ糖の微量分析も可能
である。この方法は蛍光プロテインシーケンサー、微量
アミノ酸分析、微量アミノ糖分析等の分析にも応用され
る。
る蛍光試薬をクエンチングによってアミノフルオレセイ
ンに変換し、ＦＩＴＣのクロマトグラフィー上のピーク
による同定の障害をなくすことができる。従って、トリ
プトファンを含むアミノ酸、グルコサミン、ガラクトサ
ミン、マンノサミン等を含むアミノ糖の微量分析も可能
である。この方法は蛍光プロテインシーケンサー、微量
アミノ酸分析、微量アミノ糖分析等の分析にも応用され
る。
【図１】酢酸アンモニウムを加えないＦＩＴＣ−Ｉのみ
でのＨＰＬＣのチャートを示した図である。
でのＨＰＬＣのチャートを示した図である。
【図２】ＦＩＴＣ−Ｉに酢酸アンモニウムを加えた場合
の加温直後のＨＰＬＣのチャートを示した図である。
の加温直後のＨＰＬＣのチャートを示した図である。
【図３】ＦＩＴＣ−Ｉに酢酸アンモニウムを加えた場合
の加温５分後のＨＰＬＣのチャートを示した図である。
の加温５分後のＨＰＬＣのチャートを示した図である。
【図４】ＦＩＴＣ−Ｉに酢酸アンモニウムを加えた場合
の加温１０分後のＨＰＬＣのチャートを示した図であ
る。
の加温１０分後のＨＰＬＣのチャートを示した図であ
る。
【図５】ＦＴＨ−アミノ酸のみでのＨＰＬＣのチャート
を示した図である。
を示した図である。
【図６】ＦＴＨ−アミノ酸にＦＩＴＣ−Ｉを使用した本
発明の方法による加温直後のＨＰＬＣのチャートを示し
た図である。
発明の方法による加温直後のＨＰＬＣのチャートを示し
た図である。
【図７】ＦＴＨ−アミノ酸にＦＩＴＣ−Ｉを使用した本
発明の方法による加温５分後のＨＰＬＣのチャートを示
した図である。
発明の方法による加温５分後のＨＰＬＣのチャートを示
した図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 蛍光分析において蛍光試薬として用いら
れる過剰のイソチオシアネート誘導体にアンモニウム塩
を反応させることを特徴とする過剰蛍光試薬のクエンチ
ング方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3059740A JP2725731B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 過剰蛍光試薬のクエンチング方法 |
| DE69211577T DE69211577T2 (de) | 1991-02-28 | 1992-02-20 | Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz |
| EP92102834A EP0501307B1 (en) | 1991-02-28 | 1992-02-20 | Method for amino acid sequence analysis |
| US07/841,797 US5234836A (en) | 1991-02-28 | 1992-02-26 | Method for amino acid sequence analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3059740A JP2725731B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 過剰蛍光試薬のクエンチング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0580042A JPH0580042A (ja) | 1993-03-30 |
| JP2725731B2 true JP2725731B2 (ja) | 1998-03-11 |
Family
ID=13121923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3059740A Expired - Fee Related JP2725731B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 過剰蛍光試薬のクエンチング方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
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| US (1) | US5234836A (ja) |
| EP (1) | EP0501307B1 (ja) |
| JP (1) | JP2725731B2 (ja) |
| DE (1) | DE69211577T2 (ja) |
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| ATE456046T1 (de) * | 1995-03-29 | 2010-02-15 | Sapporo Breweries | VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON ß-(D)-GLUCAN |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS61199983A (ja) * | 1985-03-01 | 1986-09-04 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多色発色型感熱記録材料 |
| JPS61264264A (ja) * | 1985-05-17 | 1986-11-22 | Seiko Instr & Electronics Ltd | アミノ酸誘導体の高感度検出法 |
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| JPS63196858A (ja) * | 1987-02-12 | 1988-08-15 | Seiko Instr & Electronics Ltd | アミノ酸誘導体の高感度検出法 |
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-
1992
- 1992-02-20 EP EP92102834A patent/EP0501307B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-20 DE DE69211577T patent/DE69211577T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-26 US US07/841,797 patent/US5234836A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69211577T2 (de) | 1996-10-31 |
| EP0501307A2 (en) | 1992-09-02 |
| EP0501307B1 (en) | 1996-06-19 |
| JPH0580042A (ja) | 1993-03-30 |
| DE69211577D1 (de) | 1996-07-25 |
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| EP0501307A3 (en) | 1993-03-03 |
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