DE69211577T2 - Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung-der Aminosäuresequenz Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Mikrosequenzierung von Peptiden oder Proteinen unter Verwendung eines fluoreszierenden Reagens, wobei das überschüssige fluoreszierende Reagens vor der ultrahochempfimdlichen Flüssigkeitschromatographie zur Identifizierung des freigesetzten Aminosäurederivates gequencht wird. Diese Erfindung kann auf die Fluoreszenz-Markierung von beliebigen Aminoverbindungen, wie z.B. Aminozuckern, Aminosäuren, Peptiden, Proteinen usw., ausgedehnt werden, wobei beliebige fluoreszierende Reagenzien eingesetzt werden können.
- Zur Analyse der Primärstruktur von Proteinen und anderen Substanzen wurde bisher üblicherweise das Edman-Verfahren eingesetzt, wobei eine markierte Aminosäure, wie z.B. eine 3-Phenyl-2-thiohydantoin (PTH)-Aminosäure, durch Revers-Phasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie nachgewiesen wird. Da jedoch dieses Verfahren auf UV-Absorption beruht, wird es durch Hintergrundfaktoren signifikant gestört, z.B. durch das organische Lösungmittel des Laufmittels und durch Zersetzungsprodukte, weshalb seine Empfindlichkeit unzureichend ist.
- In den letzten Jahren wurde ein Mikronachweisverfahren, das auf Fluoreszenz beruht, entwickelt, um die Erfordernisse nach einer rascheren Bestimmung und einer größeren Genauigkeit zu erfüllen. In diesem Verfahren wird die Aminogruppe der Aminosäure mit einem fluoreszierenden Reagens markiert, umfassend ein Isothiocyanat-Derivat, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
- Nach der Markierung mit einem fluoreszierenden Reagens muß üblicherweise das überschüssige Reagens entfernt werden; dabei tritt im Fall von FITC und anderen Reagenzien, die in der Molekülstruktur eine hydrophile funktionelle Gruppe aufweisen, das Problem auf, daß die Aufstellung von geeigneten Bedingungen zur Entfernung des überschüssigen Reagens schwierig ist.
- Wenn die nachzusweisende Verbindung eine Verbindung ist, deren Polarität von der Polarität des Isothiocyanat-Derivates verschieden ist, kann die Reaktionslösung nach der Markierung mit dem fluoreszierenden Reagens direkt durch Chromatographie isoliert werden. Wenn jedoch andererseits Verbindungen vorliegen, die eine hydrophile funktionelle Gruppe aufweisen, wie z.B. Aminosäuren und -zucker, bereitet die Abtrennung des markierten Derivates vom überschüssigen Reagens häufig Schwierigkeiten. Wenn dieses überschüssige fluoreszierende Reagens in der Probe verbleibt, tritt das Problem auf, daß die Identifizierung von Aminosäurederivaten beim Nachweis von Aminosäuren, wie z.B. Tryptophan, und Aminozuckern, wie z.B. Glucosamin und Galactosamin, gestört wird, da sich die chromatographischen Peaks überlagern oder sehr nahe nebeneinander liegen.
- Wenn andererseits das überschüssige Reagens vollständig ausgewaschen wird, werden die Zielaminosäuren usw. in der Probe ausgewaschen, was zu einer Verringerung des Probenvolumens führt.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Aminosäuresequenz unter Verwendung eines fluoreszierenden Reagens, wobei die Störung der Identifizierung von Aminosäuren durch chromatographische Peaks vermieden wird, indem das überschüssige fluoreszierende Reagens, das nach der Markierung der Probe oder nach dem schrittweisen Abbau von Peptiden oder Proteinen vorliegt, gequencht wird.
- Mit dem Ziel, die vorstehend beschriebenen Probleme zu lösen, stellten die Erfinder Untersuchungen an, um die Störung durch das überschüssige fluoreszierende Reagens, das nach der Markierung oder nach dem schrittweisen Abbau von Peptiden oder Proteinen verbleibt, zu vermeiden, und sie entwickelten dabei die Erfindung.
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft demge mäß im wesentlichen ein Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Prinzips, wobei das überschüssige fluoreszierende Reagens, das nach der Markierung der Probe mit dem fluoreszierenden Reagens oder nach dem schrittweisen Abbau von Peptiden oder Proteinen mit dem fluoreszierenden Edman-Reagens verbleibt, gequencht wird, indem dieses überschüssige fluoreszierende Reagens mit einem Ammoniumsalz umgesetzt wird.
- Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das verbliebene überschüssige fluoreszierende Reagens alleine umgesetzt, ohne die markierte Verbindung zu beeinflussen, indem ein Ammoniumsalz zugesetzt wird, wobei die daraus resultierende Verbindung den Nachweis der Zielverbindung nicht beeinflußt.
- Fig. 1 zeigt das HPLC-Diagramm für FITC-I alleine in Abwesenheit von Ammoniumacetat.
- Fig. 2 zeigt das HPLC-Diagramm für FITC-I in Gegenwart von Ammoniumacetat, erhalten unmittelbar nach dem Erhitzen.
- Fig. 3 zeigt das HPLC-Diagramm für FITC-I in Gegenwart von Ammoniumacetat, erhalten 5 Minuten nach dem Erhitzen.
- Fig. 4 zeigt das HPLC-Diagramm für FITC-I in Gegenwart von Ammoniumacetat, erhalten 10 Minuten nach dem Erhitzen.
- Fig. 5 zeigt das HPLC-Diagramm für die FTH-Aminosäure alleine.
- Fig. 6 zeigt das HPLC-Diagramm für die FTH-Aminosäure in Gegenwart von FITC-I, erhalten unmittelbar nach dem Erhitzen, gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
- Fig. 7 zeigt das HPLC-Diagramm für die FTH-Aminosäure in Gegenwart von FITC-I, erhalten 5 Minuten nach dem Erhitzen, gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
- Beispiele für das fluoreszierende Reagens der vorliegenden Erfindung umfassen bekannte fluoreszierende Reagenzien, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC). FITC, das Reaktivität mit Aminogruppen aufweist, kann durch Umsetzung mit einem Ammoniumsalz in Aminofluorescein umgewandelt werden, einen Vorläufer der FITC-Synthese. Die Polarität des durch diese Umwandlung erzeugten Aminofluoresceins ist viel höher als die Polarität von FITC, seine Fluoreszenzintensität beträgt etwa 50 %.
- Zusätzlich zum vorstehend beschriebenen FITC umfassen die Beispiele des fluoreszierenden Reagenzes der vorliegenden Erfindung außerdem 4-(N-1-Dimethylaminonaphthalin-5-sulfonylamino)phenylisothiocyanat, jede dieser Verbindungen kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
- Beispiele des Ammoniumsalzes der vorliegenden Erfindung umfassen organische Ammoniumsalze, wie z.B. Ammoniumacetat. Ein beliebiges solches Ammoniumsalz kann eingesetzt werden, solange es keine Wirkung auf die Zielverbindung in der Probe zeigt, dabei kann es alleine oder als Kombination von zwei oder mehreren Verbindungen verwendet werden.
- Üblicherweise liegt bei einer Bestimmung der Aminosäuresequenz unter Verwendung eines fluoreszierenden Reagens in der Probe überschüssiges Reagens vor, da das fluoreszierende Reagens, bezogen auf die Zielverbindung, in großem Überschuß eingesetzt wird. Ammoniumsalz wird in Konzentrationen von nicht weniger als 0,1 Mol, vorzugsweise etwa 100 bis 1000 Mol pro Mol des überschüssigen Reagens eingesetzt.
- In dem Verfahren zum Quenchen des überschüssigen fluoreszierenden Reagens gemäß der vorliegenden Erfindung wird Ammoniumsalz zugesetzt und mit dem überschüssigen fluoreszierenden Reagens in der Probe, wie vorstehend erwähnt, umgesetzt, in diesem Fall ist es jedoch üblicherweise hin sichtlich der Reaktivität vorteilhaft, das Ganze auf etwa 55ºC zu erhitzen. Üblicherweise ist eine Reaktionszeit von etwa 10 Minuten ausreichend.
- Das Aminofluorescein, das durch eine solche Behandlung aus dem überschüssigen FITC erzeugt wird, beeinträchtigt die Bestimmung der Zielverbindung nicht, auch wenn es in der Probe vorliegt, und seine Fluoreszenzintensität ist nur halb so groß wie die von FITC; aus diesem Grund besteht keine Notwendigkeit, diese Substanz aus der Probe zu entfernen. Die Apparatur zur erfindungsgemäßen Bestimmung der Aminosäuresequenz ist mit einem Mittel zum Quenchen des überschüssigen fluoreszierenden Reagens, das nach der Markierung oder nach dem schrittweisen Abbau von Peptiden oder Proteinen verbleibt, ausgestattet. Dieses Mittel zum Quenchen besteht darin, daß ein Ammoniumsalz, wie vorstehend beschrieben, zugegeben und umgesetzt wird. In der Apparatur zur Be stimmung der Aminosäuresequenz wird die Zugabe eines Ammoniumsalzes durchgeführt, indem es in einer der Reaktionsreagenzien-Flaschen zubereitet wird und sodann die vorherbestimmte Menge davon zum Reaktionsgefäß zugesetzt wird. In der vorliegenden Erfindung wird die Bestimmung der Aminosäuresequenz, wie vorstehend erwähnt, durchgeführt, indem mindestens die folgenden Schritte befolgt werden: Markierung einer Probe mit einem fluoreszierenden Reagens und Quenchen des nach der Markierung verbliebenen überschüssigen fluoreszierenden Reagenzes mit einem Ammoniumsalz; und wenn das fluareszierende Reagens als Edman-Reagens verwendet wird, sind die Schritte: Abspaltung der Aminosäuren vom Aminoterminus der Peptide oder Proteine unter Verwendung eines fluoreszierenden Edman-Reagenzes und Quenchen des nach der Abspaltung verbliebenen überschüssigen fluoreszierenden Edman Reagenzes mit einem Ammoniumsalz.
- Das erfindungsgemäße Verfahren macht es möglich, zu verhindern, daß die Identifizierung mit Hilfe chromatographischer Peaks durch das fluoreszierende Reagens, z.B. FITC, gestört wird, indem das überschüssige fluoreszierende Reagens in der Probe gequencht wird. Somit wird eine Mikrobestimmung von Aminosäuren, umfassend Tryptophan, und Aminozuckern, umfassend Glucosamin, Galactosamin und Mannosamin, möglich.
- Dieses Verfahren kann auch auf Fluoreszenz-Protein-Sequenzer, Aminosäure-Mikrobestimmung, Aminozucker-Mikrobestimmung und andere Nachweismethoden angewendet werden.
- Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden Beispiele genauer beschrieben, die jedoch den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken sol len.
- FITC-I (20 nmol/100 µl) wurde in Acetonitril - 0,1 M Ammoniumacetat (pH 9,0) (9:1) gelöst und auf 55ºC erhitzt. Nach 0 Minuten (unmittelbar nach der Auflösung, nicht erhitzt), nach 5 Minuten und nach 10 Minuten Erhitzen wurde 1 µl (200 pmol) davon einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unterworfen.
- Die für die HPLC verwendeten Bedingungen waren: Säule: Hypersil ODS (2 Säulen, 3 µm, 4,6 x 100 mm, 4,6 x 50 mm);
- Temperatur: 60ºC;
- Durchflußgeschwindigkeit: 1,0 ml/min;
- Lösungsmittel A: 3 % Aceton - 10 mM Phosphatpuffer (PB) (pH 7,0);
- Lösungsmittel B: 15 % Aceton - 10 mM PB (pH 7,0);
- Gradient: Lösungmittel B (%), 0 Minuten: 0 %; 30 Minuten: 50 %; 45 Minuten: 50 %; 60 Minuten: 100 %.
- Das HPLC-Diagramm für FITC-I alleine in Abwesenheit von Ammoniumacetat wird in Figur 1 gezeigt. Die HPLC-Diagramme für FITC-I in Gegenwart von Ammoniumacetat, die unmittelbar nach dem Erhitzen, 5 Minuten nach dem Erhitzen und 10 Minuten nach dem Erhitzen erhalten wurden, werden in den Figuren 2, 3 bzw. 4 gezeigt. FITC war nach 5 Minuten zu etwa 90 % in Aminofluorescein übergegangen, nach 10 Minuten war es fast vollständig in Aminofluorescein übergegangen. Beispiel 2
- Nach Zusatz einer Fluorescein-Thiohydantoin (FTH)-Aminosäure (2 pmol) wurde die Probe einer HPLC in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 unterworfen.
- Das HPLC-Diagramm für die FTH-Aminosäure alleine wird in Figur 5 gezeigt. Die HPLC-Diagramme, die unter Verwendung der FTH-Aminosäure in Gegenwart von FITC-I gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unmittelbar nach dem Erhitzen und 5 Minuten nach dem Erhitzen erhalten wurden, werden in den Figuren 6 bzw. 7 gezeigt. Aus Figur 6 ist ersichtlich, daß das vorliegende überschüssige FITC den Nachweis von Tryptophan stört, Figur 7 macht deutlich, daß Aminofluorescein in der Nähe von Glutaminsäure eluiert wird, daß ihre Peaks jedoch nicht überlappen.
- Aus diesem Grund ist es bei Verwendung eines Protein- Sequenzers wünschenswert, nach Einführung von Acetonitril Ammoniumacetat (pH 9,0) im Umwandlungs-Programm anfangs eine Zeit von 10 Minuten anzusetzen.
Claims (6)
1. Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz,
umfassend die folgenden Schritte:
Markierung einer Probe mit einem fluoreszierenden
Reagenz; und
Quenchen des nach der Markierung verbliebenen
überschüssigen fluoreszierenden Reagenzes mit einem Ammoniumsalz.
2. Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz,
umfassend die folgenden Schritte:
Abspaltung von Aminosäuren vom Aminoterminus von
Peptiden oder Proteinen unter Verwendung eines fluoreszie
renden Edman-Reagenzes; und
Quenchen des nach der Abspaltung verbliebenen
überschüssigen fluoreszierenden Edman-Reagenzes mit einem
Ammoniumsalz.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Ammoniumsalz
ein organisches Ammoniumsalz ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Ammoniumsalz
Ammoniumacetat ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das fluoreszierende
Reagenz Fluoresceinisothiocyanat ist.
6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das fluoreszierende
Edman-Reagenz Fluoresceinisothiocyanat ist.
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