DE2705897B2

DE2705897B2 - Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von cyclischen! Adenosin-3', 5'-monophosphat und/oder cyclischen! Guanosin-3',5'-monophosphat

Info

Publication number: DE2705897B2
Application number: DE2705897A
Authority: DE
Inventors: Chiba Choshi; Miyuki Honma; Akira Kuninaka; Hokkaido Sapporo; Tomokazu Satoh; Junichi Takezawa; Michio Ui
Original assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba (japan)
Current assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba (japan)
Priority date: 1976-02-12
Filing date: 1977-02-11
Publication date: 1979-06-21
Also published as: GB1527465A; DE2705897C3; DE2705897A1; US4115538A; JPS5825980B2; CA1092022A; FR2341139B1; CH618015A5; FR2341139A1; JPS52117418A

Description

Cyclisches Adenosin-3',5'-monophosphat und cyclisehes Guanosin-3',5'-monophosphat spielen bei der Hormonwirkung eine große Rolle. Da sich der Gehalt von cAMP und cGMP in einem lebenden Organismus ändert, wenn sich dieser Organismus in einem unphysiologischen oder pathologischen Zustand befindet, wie z. B. einer Krankheit, ist die Bestimmung dieser cyclischen Nucleotide von größter Bedeutung nicht nur für die Grundlagenforschung sondern auch in der klinischen Medizin, für die Diagnose, die Vorbeugung und die Therapie.

In »J. biol. Chem.«, Bd. 247, S. 1106-1113 (1972) ist eine radioimmunologische Bestimmungsmethode für cyclische Nucleotide beschrieben, in der bei der Herstellung des Antigens modifizierte Nucleotide verwendet werden. Die Bestimmung von cA.MP und cGMP erfolgt in Natriumacetatpuffer, bei cIMP und cUMP wird 0,05 m Imidazolpuffer verwendet. Die Empfindlichkeit dieser Methode ist jedoch für die Praxis viel zu gering.

Aus »Analytical Biochemistry«, Band 56, Seiten 394 bis 407 (1973) ist bekannt, daß man die Empfindlichkeit im Radioimmunitätsversuch dadurch erhöhen kann, daß man das cAMP succinyliert und dadurch seine Affinität zu seinem Antikörper erhöht. Diese Succinylierung kann auf zwei verschiedene Weisen erfolgen: Im Verfahren A wird eine gefriergetrocknete Probe eines Organismus und 4-Morpholino-N,N'-dicyclohexylcarboxamidin in Pyridif» gelöst und mit einer Lösung von Bernsteinsäure-anhydrid in Dioxan versetzt. Im Verfahren B wird gepulvertes. Bernsteinsäure-anhydrid und Triäthylamin zu einer wäßrigen Lösung der Organismusprobe zugegeben.

Verfahren A ist wegen verschiedener Schwierigkeiten jedoch praktisch nicht durchführbar, z. B. wegen des gefriergetrockneten Zustands der Probe und wegen der niedrigen Succinylierungsrate, die auf die niedrige Löslichkeit des cAMP in dem Lösungsmittel zurückzuführen ist. Im Verfahren B ist es wegen der Pulverform des Bernsteinsäure-anhydrids und seiner Hydrolysierbarkeit in einem wäßrigen Lösun^smittelsystem wesentlich, für die rasche Auflösung und die Diffusion des Bernsteinsäure-anhydrids in die wäßrige Lösung der Probe zu sorgen, damit die Succinylierung mit genügend hoher Geschwindigkeit stattfinden kann. Zusätzlich zur Schwierigkeit der Handhabung dieses Pulvers muß in diesem Verfahren B für eine Schüttelausrüstung gesorgt sein. Die gleichzeitige Bestimmung einer großen Anzahl von Proben ist deshalb in diesem Verfahren besonders schwierig. Außerdem wird in diesem Verfahren B zur Trennung des ftvien cAMP und des nach der Antigen-Antikörperreaktion an den Antikörper gebundenen cAMP die Dialyse verwendet. Auch für die Dialyse ist eine spezielle Ausrüstung notwendig, so daß dieses Verfahren im gesamten keine zufriedenstellenden Ergebnisse ergibt.

Aufgabe der Erfindung war es, die bei der Bestimmung von cAMP und cGMP mit herkömmlichen Reagentien anfallenden Probleme zu lösen und die gleichzeitige ultramikroskopische Bestimmung von cAMP und cGMP zu ermöglichen.

Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von cyclischen! Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) und/oder cyclischem Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP) in von lebenden Organismen entnommenen Proben, wobei man das oder die cyclische(n) Phosphat(e) mittels einer Lösung von Bernsteinsäure-anhydrid in Gegenwart eines organischen tertiären Amins succinyliert und anschließend einer Antigen-Antikörperreaktion mittels

eines für das betreffende cyclische Nucleotid spezifischen Anti-Serums in Gegenwart von mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-S'^'-monophosphat-tyrosin-methylester und/oder cyclischem Succinyl-guanosin-S'^'-monophosphat-tyrosinmethylester unterwirft, den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex abtrennt, die Radioaktivität des Komplexes oder des freien Antigens mißt und daraus durch Vergleich mit den Ergebnissen einer das oder die Nucleotide enthaltenden Standardlösung den Nucleotidgehalt bestimmt, und ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Succinylierung von cAMP und/oder cGMP in einem System von Wasser und einem organischen Lösungsmittel und die Ar.tigen-Antikörper-Reaktion in einem Imidazol-Puffer mit einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol durchführt.

im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt durch einfaches Vermischen der organischen Lösung des Bernsteinsäure-anhydrids mit dem organischen tertiären Amin unmittelbar vor dem Versuch und Zugeben des Gemisches zur cAMP- und/oder cGMP-Standardlösung oder einer Probe die Succinylierung c*-;s cAMF und/oder cGMP sofort, außerdem kann die Empfindlichkeit gegenüber dem Antiserum deutlich erhöht werden. Wegen dieser verbesserten Empfindlichkeit kann man die Probe vor der Reaktion mit dem Antiserum noch einmal verdünnen.

Durch diese Verdünnung ist es nun möglich, die die Reaktion hemmenden Faktoren zu entfernen, außerdem wird der Bestimmungsfehler stark vermindert Dank des jo größeren Flüssigkeitsvolumens ist es möglich, mit der gleichen Probe gleichzeitig mehrere Bestimmungen von cAMP und cGMP durchzuführen. Außerdem können Körperflüssigkeiten, wie Blut, cerebrospinale Flüssigkeit, Urin und saure Extrakte von Körpergewebe als Ji solche als Proben verwendet werden.

Außerdem kann im erfindungsgemäßen Verfahren durch Verwendung des Imidazol-Puffers mit einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol in der Antigen-Antr'-.örper· Reaktion anstelle des bisher verwendeten Acetat-, Phosphat- oder Citratpuffers die Antigen-Antikörper-Reaktion stabilisiert werden, und die Hemmwirkung des Succinylierungsmittels wird vollständig ausgeschaltet.

Auf diese Weise gestattet das erfindungsgemäße Verfahren -.um ersten Mal die gleichzeitige ultramikroskopische Bestimmung von cAMP und cGMP in einer einzigen Probe auf sehr einfache Weise. Außerdem liegt die geringste meßbare Menge für cAMP und cGMP jeweils bei etwa 0,006 pMH/Röhrchen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise unter Verwendung der nachstehenden vorbereiteten Reagentien durchgeführt:

a) Lösung von mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosinO'.S'-monophosphattyrosinmelhylester und/oder cyclischem Succinyiguanosin-3\5'-monophosphattyrosinmethylester,

b) Anti-cAMP-Serumund/oder Anti-cGMP-Serum,

c) Imidazol-Pufferlösung in einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol,

d) Substanzen für die Abtrennung des Antigen-Antikörper-Komplexcs von freiem cAMP bzw.cGMP,

e) Bernsteinsäure-anhydrid in einem organischen Probe Lösungsmittel,

f) organisches tertiäres Amin und μ

g) cAMP-und/odercGMP-Standardlösung.

Die Menge an Bernstehsäure-anhydrid im Reagens c Rattenlunge beträgt vorzugsweise 2 bis 6 mg. insbesondere 3,5 bis Rattenhirn 4,5ΐτ^/100μ| der zu untersuchenden Probe, Es wurde festgestellt, daß bei einem Überschuß von Bernsteinsäure-anhydrid diese Verbindung während der Succinylierungsreaktion ausfällt und möglicherweise die Antigen-Antikörper-Reaktion hemmt.

Als Lösungsmittel für das Bernsteinsäure-anhydrid geeignet ist jedes organische Lösungsmittel, das das Bernsteinsäureanhydrid stabil auflöst, jedoch keine nachteilige Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion hat, z. B. Pyridin, Dioxan, Aceton, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Diäthylenglykol-dimethyläther, Hexamethylphosphortriamid, Tetrahydropyran und Äthylenglykolmonomethyläther-acetat. Als Lösungsmittel bevorzugt sind Dioxan und Hexamethylphosphortriamid.

Für das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens f ist jedes organische tertiäre Amin geeignet, das sich leicht mit dem Reagens e homogen vermischen läßt, die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht nachteilig beeinflußt und die Succinylierungsreaktion beschleunigt, τ. B, Triäthylamin und 4-Morpholino-HN'-dicyclohexylcarboxamidin. Die Menge an diesem tertiären Amin beträgt im Fall des Triäthylamins z.B. 15 μΐ oder weniger, vorzugsweise 10 μΙ/100 μΐ der zu untersuchenden Probe oder darunter. Wird ein Überschuß verwenuet, so steigt der pH-Wert und die Succinylierungsreaktion wird gehemmt.

Das Mischverhältnis von Reagens e und f hängt von dem organischen Lösungsmittel und dem organischen tertiären Amin ab. Wird z. B. als Lösungsmittel Dioxan und Triäthylamin für die Succinylierung von 1 pMol cAMP in Blutplasma verwendet, so sind die Verhältnisse wie in Tabelle I angegeben, wobei die Succinylierung mittels Elektrophorese auf Celluloseestern bestimmt wurde.

Tabelle I

Zusammensetzung des Succinylierungsmittels	Triäthylamin Dioxan	i	(μ!)	(μΐ)	Succinyl
Bernstein	0	100	ierung
säure unhydrii	1,25	98,75
(mg)	2,5	97,5	(%)
0	5,0	95,0	0
0,5	10,0	90	45
1,0		70
2,0	100
4,0	100

Im erfindungsgemäßen Verfahren sind somit eine Lösung von 4 mg Bernsteinsäure-anhydrid in 90 μΙ Dioxan (etwa 4,4prozentige Bernsteinsäure-anhydridlösu,ig) als Reagens e und 10 μΐ Triäthylamin als Reagens f geeignet. Die Succinylierung von cAMP und cGMP mit diesem Succinylierungsmittel bei verschiedenen Organproben zeigt Tabelle II.

Tabelle II

Succinylierung von lebenden Proben nach Sa'ure-

extraklion Konzentration Succinylierung

lOmg/lOOpü
10 mg/100 jjJ

99,4
98,3

Fortsetzung

Konzentration Succinylierung

Rattenleber

Rattenherz

Kaninchenplasma

Cerebrospinale

Flüssigkeit von

Kaninchen

Humanplasma

10 mg/100 (J
10 mg/100 μ]
100 μΐ
100 μ]

100 μΙ

97,5

97,2

94,0

100,0

Die Succinylierung von cAMP und cGMP erfolgt in guter Wirkung unabhängig von der Art der Probe durch einfaches Vermischen der Reagentien e und f mit der Probe.

Obwohl die Art der Herstellung der Probe nicht kritisch ist, werden vorzugsweise Flüssigkeiten, wie Blut, cerebrospinale Flüssigkeit und Urin als solche oder als Lösungen, denen Äthylendiamin-tetraessigsäurc zugesetzt wurde, verwendet. Gewebe werden im allgemeinen extrahiert, z. B. mit Säuren, wie Salzsäure. Perchlorsäure und Trichloressigsäure, in Wasser oder in einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, mit Alkali, z. B. Bariumhydroxid und Zinksulfat, in Wasser oder einem hydrophilen organischen Lösungsmittel oder mit hydrophilen organischen Lösungsmitteln.

Die Bedingungen der Succinylierungsreaktion sind nicht kritisch, Raumtemperatur und eine Reaktionszeit von 5 bis 60 Minuten sind im allgemeinen ausreichend.

Für das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens c ist eine 0,1 m Imidazol-Pufferlösung mit einem pH von 5 bis 8, der durch Zugabe einer Säure, wie Salzsäure, die keine nachteilige Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion hat, eingestellt wurde, geeignet.

Die Tabellen III und IV zeigen die günstige Wirkung des Imidazol-Puffers im Vergleich zu bisher verwendeten Acetat-, Phosphat- und Citrat-Puffern für die Bestimmung von cAMP und cGMP.

Tabelle III

Pufferlösung	Meßbare Mindest
	menge (IMoI*)/
	Röhrchen)
Imidazoi	6.25
Acetat	25
Phosphat	25
Citrat	25
·) Femtomol = ICT¹⁵ Mol
Tabelle IV
Pufferlösung	Antigen-Antikörper-
	Reaktion
Imidazoi	65,4
Acetat	68,7
Phosphat	47,0
Citrat	38,2

Bei Verwendung der imidazoi-Pufferlösung erhält man vernünftige Ergebnisse von 15,5 pMol cAMP/ml Plasma und 7,5 pMol cAMP/0,5 ml Plasma. Wird jedoch ein Acetat- oder Citrat-Puffer verwendet, so liegen die Ergebnisse bei 14,5 bzw. 30 pMol cAMP/ml Plasma und bei lO.Sbzw^OpMolcAMP/CSml Plasma.

Die Antigen-Antikörper-Reaktion eines Plasmas, das kein cAMP und cGMP enthält, d. h. ein Plasma, das 24 Stunden bei 37°C stehengelassen wurde, um das cAMP und cGMP vollständig zu zerstören, und die Antigen-Antikörper-Reaktion in destilliertem Wasser sind theoretisch gleich. Bei Verwenudng der Imidazol-Pufferlösung sind die Reaktionsgrade in beiden Fällen gleich. Verwendet man jedoch Acetat-Puffer, so erhält man eine Reaktion von 73,9 Prozent mit dem Plasma und von 68,7 Prozent mit destilliertem Wasser, d. h. es besteht eine Differenz von über 5 Prozent.

Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die Plasmaprobe cAMH und cGMH in so niedrigen Mengen enthält, z. B. etwa 10 fMol/Röhrchen, daß sie mit dem Reagens, das Acetat-Puffer enthält, nicht erfaßt werden konnten. In einem anderen Fall wurde mit einem Citrat-Puffer eine Antigen-Antikörper-Reaktion von 38,2 Prozent für die Plasmaprobe im Gegensatz zu 34,5 Prozent in destilliertem Wasser gefunden.

Daraus ist ersichtlich, daß die Imidazol-Pufferlösung (Reagens c) nicht nur die Empfindlichkeit der Bestimmung ei floht, sondern auch die Antigen-Antikörper-Reaktion stabilisiert. Außerdem werden im erfindungsgemäßen Verfahren viel bessere Werte erhalten, sogar in Proben, aus denen die Proteine nicnt entfernt wurden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Konzentration der Imidazol-Pufferlösung wesentlich. Liegt die Konzentration nämlich unter 0.1 Mol. so erhält man abnormale Werte. Der optimale pH-Wert für diese Pufferlösung liegt bei 6.5. Ist der pH-Wert niedriger als 5. so ist die Pufferwirkung zu schwach, und ist er über 8. so zersetzen sich die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und Succinyl-guanosin-3'.5'-monophosphat-Tyrosinmeth) lester.

Es ist bekannt, daß Imidazoi die enzymatische Wirkung der Phosphodiesterase begünstigt. Um Fehler bei der Bestimmung in der Probe oder im Antiserum. die auf die Wirkung von eventuell vorhandener Phosphordiesterase beruhen, zu verhindern, kann man vorsorglich einen Phosphodiesterase-Inhibitor, wie Äthylendiamin-tetraessigsäure oder Theophyllin, zusetzen.

Die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und/oder Succinyl-guanosin-3',5'-monophosphat-tyrosinmethylester des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reagens a werden im allgemeinen als Lösung in einem Puffer, wie einem Imidazol-Puffer, oder als gefriergetrocknetes Pulver in Kombination mit einem möglichen Stabilisator, hergestellt. Das Reagens a wird je nach Bedarf mit den anderen Reagentien kombiniert: Wird z. B. nur cAMP oder cGMP bestimmt, so wird nur der eine radioaktiv markierte Tyrosinmethylester verwendet. Werden jedoch beide Nucleotide bestimmt, so werden die mit radioaktivem Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und Succinyl-guanosin-S'^'-monophosphat-tyrosinmethylester entweder getrennt oder vermischt anderen Reagentien zugesetzt Für die gleichzeitige Bestimmung der beiden Nucleotide im Gemisch ist es günstig, verschiedene Jodisotope zu verwenden, z. B. ¹²⁵Jod und ^m Jod, und diese getrennt zu bestimmen.

Das Anti-cAMP-Serum und/oder Anti-cGMP-Serum des Reagens b kann in herkömmlicher Weise hergestellt

werden. So ist z. B. eine nach Steiner et al. in »J. Biol. Chem.« Band 247, Seiten 1106 bis 1113 (1973) hergestellte Lösung eines Kaninchen-Antiserums in einem Imidazol- oder Acetat-Puffer sehr geeignet. Das Antiserum hat eine Bindungsfähigkeit von z. B. 50 Prozent oder darüber, bezogen auf die Gesamtradioaktivität des zugesetzten mit ^l25Jod markierten cyclischen Adenojin- oder Guanosin-monophosphat-tyrosin-methylesters, wenn man 0,03 μΙ (1 :9900) Antiserum eines gewissen Kaninchens für diese Bestimmung verwendet. Die Verwendung dieses Antiserums entspricht dem Reagens a.

Für die Antigen-Antikörper-Reaktion können herkömmliche Bedingungen angewendet werden. /.. B. eine Temperatur von I bis 5°C und eine Reaktionszeit von 6 bis 48 Stunden, vorzugsweise 12 bis 24 Stunden.

Die in Reagens d verwendeten Substanzen sind für eine Trennung des an den Antikörper gebundenen cÄfviP oder cGfviP, d. h. des Antigen-Äiuikorper-Komplexes, von dem freien cAMP oder cGMP bestimmt. Beispiele für geeignete Substanzen für diese Trennung sind mit Dextran überzogene Kohle, Ammoniumsulfat, Polyäthylenglykol und ein Anti-gamma-Globulin-Serum, die im allgemeinen bei Radioimmunitätsversuchen verwendet werden. D:ese Substanzen liegen als solche oder als Dispersion oder Lösung in Wasser oder einer Pufferlösung vor.

Die Trennung hängt von der Art der zu trennenden Verbindungen ab. So kann man zum Beispiel 100 μΙ eines mit '"Jod markierten cyclischen Succinyl-adenosin-3',y-monophosphat-tyrosinmethylesters mit 100 μΙ eines 0,3molarcn Imidazol-Puffers, pH 6,5, und 100 μΐ eines Anti-cAMP-Serums in 0,3molarem Imidazol-Puffer. pH 6.5, in Eiswasser 16 Stunden umsetzen, zu diesem System 500 ml einer Suspension von mit Dextran überzogener Kohle in Wasser zusetzen, das Gemisch zentrifugieren und anschließend die Radioaktivität des Überstands messen, der das gebundene cAMP, d. h. den Antigen-Antikörper-Komplex, enthält.

In Tabelle V ist die prozentuale Radioaktivität des Antigen-Antikörper-Komplexes, bezogen auf die Gesamtradioaktivität, unter verschiedenen Bedingungen zusammengestellt.

Tabelle V

Mit Dextran überzogene Kohle

(mg/500 ;jJ)

Radioaktivität des Antigen-Antikörper-Komplexes in Prozent der Gesamlaklivität

Versuch

52,5
51,5
52,5

50,0
49,0
50,0

51,0
50,0
50,5

*) Versuch 1: Es wird unmittelbar nach der Zugabe der mit

Dextran überzogenen Kohle abzentrifugiert. **) Versuch 2: Es wird erst 30 Minuten nach der Zugabe der

Kohle abzentrifugiert.

***) Versuch 3: Es wird unmittelbar nach der Zugabe der Kohle abzentrifugiert und 30 Minuten später abgetrennt.

Diese Ergebnisse beweisen, daß eine Menge von 2^> mg mit Dextran überzogener Kohle genügen und daß die Trennfähigkeit noch mindestens 30 Minuten nach der Zugabe erhalten bleibt

Als cAMP- und/oder cGMP-Standardlösung für das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens g ist eine Lösung in Wasser oder in einem Imidazol-Puffer von freiem cAMP und/oder cGMP oder dessen Salz,

Ί wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder eines Salzes, das keine nachteilige Wirkung auf die Antigen-Antikörper-Reaktion zeigt, geeignet.

In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens vermischt man die Lösung des

in Bernsteinsäureanhydrids in einem organischen Lösungsmittel (Reagens e) mit dem organischen tertiären Arnin (Reagens f), gibt dieses Gemisch zu der zu untersuchenden Probe und zu der cAMP- und/oder cGMP-Standardlösung (Reagens g), verdünnt mit der

ι") Imidazol-Pufferlösung (Reagens c) und vermischt mit dem radioaktiv markierten cyclischen Succinyl-adenosin- und/oder Succinyl-guanosin-monophosphat-tyrosinmethylester (Reagens a) und dem Antiserum (Reagens b), versetzt das Gemisch mit den Trennsub-

.'Ii stanzen (Reagens d), trennt den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex ab und bestimmt in herkömmlicher Weise die Radioaktivität dieses Antigen-Antikörperkomplexes.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die in einer

:> Probe gleichzeitig vorhandenen cAMP und cGMP gleichzeitig succinyliert. So kann man eine Probe dieser succinylierten Nucleotide aufbewahren und das cAMP und cGMP im Verhältnis zueinander radioimmunologisch bestimmen. Enthält das Reagens a ζ. Β. ein

κι Gemisch von mit ^l25Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-monophosphat-tyrosinmethylester und mit ^IJIJod markiertem cyclischem Succinyl-guanosin-monophosphat-tyrosinmethylester, so so kann man nicht nur die Succinylierung sondern auch den

r> radioimmunologischen Versuch ir. dem gleichen Röhrchen durchführen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

4(i Beispiel!

Für die Bestimmung von cAMP in 75 Proben werden folgende Reagentien hergestellt:

a) 8 ml einer Lösung von mit ^l25Jod cyclischem ·»') Succinyl-adenosin-S'.S'-monophosphat-tyrosinme-

thylester (1 μο) in 0,3 m Imidazol-Puffer, pH 6,5,

b) 8 ml Anti-cAMP-Serum aus Hauskaninchen in 0,3 m Imidazol-Puffer, pH 6,5

c) 12 ml 1.5 m Imidazol-Puffer. pH 6,5. der auf das vi fünffache vor der Verwendung verdünnt wird,

d) 200 mg Kohle, 200 mg Rinderserumalbumin, eine Suspension von 30 mg Dextran in 20 ml Wasser, die auf das Doppelte vor der Verwendung verdünnt wird,

e) 400 mg Bernsteinsäure-anhydrid in 9 ml Dioxan,

f) 1 ml Triäthylamin und

g) 320 pMolcAMP (Natriumsalz) in 1 ml Wasser.

Beispiel 2

Für die Bestimmung von cGMP in 75 Proben werden die folgenden Reagentien hergestellt:
a) 8 ml mit ^I2S]od markiertem cyclischem Succinylguanosin-3',5'-monophosphat-tyrosinmethyIester (1 \ic) in 03 m Imidazol-Puffer, pH 63,
b) 8 ml Anti-cGMP-Serum aus Hauskaninchen in

03 m Imidazol-Puffer, pH 6,5,
Reagentien c) bis e) gemäß Beispiel 1 und
f) 320 pMolcGMP(Natriumsalz in 1 ml Wasser).

Beispiel 3

Für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben werden die Reagentien a) und b) des Beispiels 2, die Reagentien a), b), c), e) und f) des Beispiels I, das Peagens d) des Beispiels 1 in doppelter Menge und als Reagens g) 320 pMcl cAMP (Natriumsalz) und 320 pivtol cGMP (Natriumsalz) in 1 ml Wasser verwendet.

Beispiel 4

Für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben werden als Reagens a) 8 ml mit '"Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-monophosphat-tyrosinmethylestcr und mit '"Jod markiertem cyclischem Succinyl-guanosin-monophosphat-tyrosinmethylester (1 μί·) in 0,3 m Imidazol-Puffer, pH 6,5, sowie die anderen Reagentien gemäß Beispiel 3

Beispiel 5

Für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben werden als Reagens c) 24 ml 1,5 m Imidazol-Puffer, pH 6,5, der 12,5 mMol Äthylendiamin-tetraessigsäure enthält, und die anderen Reagentien wie in Beispiel 3 verwendet.

Beispiel 6

Für die gleichzeitige Bestimmung von cAMP und cGMP in 75 Proben verwendet man als Reagens e) 400 mg Bernsteinsäure-anhydrid in 9 ml Hexamethylphosphortriamid. Die anderen Reagentien sind gemäß Beispiel 3.

Beispiel 7

Die Reagentien des Beispiels 1 werden zur Bestimmung von cAMP in Blutplasma verwendet.

1. Die Reagentien e) und f) werden in einem Volumenverhältnis von 9 : 1 zum Succinylierungsmittel vermischt.

2. Das Reagens c), ds"= vor der Verwendung auf ein Fünftel der Konzentration verdünnt wird, destilliertes Wasser und das Succinylierungsmittel werden in einem Volumenverhältnis von 8 : 1 : I vermischt.

3. 100 μΙ des Reagens g) werden in ein kleines Probcröhrchen eingefüllt und mit 100 μΙ des Süccinylicrungsmittels vermischt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, dann mit 800 μΐ des Reagens c) versetzt. Auf diese Weise erhält man I ml Succinyl-cAMP-Standardlösung mit einem Gehalt von 3.2 pMol/100 μΙ (Probe I).

4. In jedes von 9 Proberöhrchen (Proben 11 bis X) werden 500 μI des gemäß 2. für die Verdünnung hergestellten Puffers und 500 μΙ der Succinyl-cAMP-Standardlösung gemäß 3. eingefüllt und vermischt Die Röhrchen III bis X werden jeweils um die Hälfte verdünnt, so daß man Succinyl-cAMP-Standardlösungen mit einer Konzentration von 3200, 1600, 800, 400, 200,100,50,25.12,5 und 6,25 fMol/100 μΐ erhält

5. 100 μΐ Plasma werden in einem Röhrchen mit 100 μΙ Succinylierungsmittel vermischt, das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und mit 800 μΙ des Reagens c) versetzt. Das Reagens c) wird in einer solchen Menge verwendet, daß die Bernsteinsäure-anhydrid-Konzentration zur Zeit der Antigen-Antikörper-Reaktion die Reaktion nicht stört (etwa 0,15 Prozent oder weniger).

ίο

6. Folgende Röhrchen werden vorbereitet:

für die Gesamtzählung: 3 Röhrchen, Nr. I bis 3
für den Leerwert: 2 Röhrchen, Nr. 4 und 5

für den Nullwert: 2 Röhrchen, Nr. 6 und 7

für die Standardlösung: 20 Röhrchen, Nr. 8 bis 27
für die Plasmaprobe: 2 Röhrchen, Nr. 28 und 29

7. 100 μΙ des Reagens a) werden in jedes Röhrchen eingefüllt.

8. 100 μΙ Puffer werden in die Röhrchen I bis 3 (Gesamtzählung), 4 und 5 (l.cerwert) und 6 und 7 (Nullwert) eingefüllt.

9. 100 μΙ der Succinyl-cAMP-Standardlösung I bis X werden in jedes der Röhrchen 8 bis 27 eingefüllt.

10. 100 μΙ succinyliertes Plasma werden den Röhrchen 28 und 29 zugesetzt.

11. 100 μΙ Reagens b) werden in jedes Röhrchen Nr. 6 bis 29 für den Nullwert, für die Standardlösung und für die P!3Sm?.probc

Nlarh Hrm VprmKrhpn

2Ii werden die Gemische in Eiswasser 12 bis 24 Stunden (18 Stunden in diesem Beispiel) stehengelassen.

12. 100 μΙ 0,3 m Imidazol-Puffer werden in jedes Röhrchen I bis 5 für die Gesamtzählung und den Leerwert eingefüllt. Nach dem Vermischen werden die

2i Lösungen gemäß 1 !.stehengelassen.

13. 500 μΙ Reagens d), das vor der Verwendung auf das Zweifache verdünnt wird, werden zu jedem Röhrchen außer zu den Röhrchen, die für die Gesamtzählung bestimmt sind, zugegeben. Die Röhr-

i(i chen werden dann bei 300 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert.

' 14. Die Röhrchen für die Gesamtzählung weiden mit 500 μΐ Wasser vermisch;

15. 500 μΐ des Überstands aus jedem Röhrchen Γ) werden für die Radioaktivitätsbestimmung in ein anderes Röhrchen übergeführt.

16. Die Radioaktivität jedes Überstands wird gemessen.

17. Der mittlere Leerwert BL wird von dem mittleren Gesamtwert 7"und dem Mittelwert B jeder Standardlösung abgezogen. Die Bindungstähigkeit ß/Tin Prozent wird gemäß folgender Gleichung berechnet:

S T ("O) =

^(ß)-^(ßL

(D-(BL)

Die Ergebnisse sind in Tabelle Vl zusammengefaßt.
Tabelle VI

Mittelwerte	6,25	fMol	cpm	cpm	*B,T*
	12,5	fMol		*-BL*	(%)
55 Leerwert (BL)	25	fMol	300
Gesamtwert (T)	50	fMol	9109	8809	100
Nullwert	100	fMol	6065	5765	65,4
Standardlösung	200	fMol	5806	5506	62,5
Standardlösung	400	fMol	5543	5243	59,5
60 Standardlösung	800	fMol	5069	4769	54,1
Standardlösung	1600	fMoi	4600	4300	48,8
Standardlösung	3200	(Mol	3614	3314	37,6
Standardlösung			2837	2537	28,8
Standardlösung		1992	1692	19,2
b5 Standardlösung		1391	1091	12,4
Standardiösung		888	588	6,7
Standardlösung		620	320	3,6
Plasma		3119	2819	32,0

18. Die Bindungsfähigkeit dt.' verschiedenen Slandardlösungen wird gegen deren Konzentrationen halblogaritiimisch aufgetragen(Fig. 1).

19. An Hand der Standardkurve wird die cAMP- Konzentration des untersuchten Plasmas aus denn Ö/T-Wert auf fMol/Röhrchen, entsprechend 15 000 fMol/ml Piastna berechnet.

Beispiel 8

Die Arbeitsweise: von Beispiel 7 wird für die Bestimmung von <:GMP mit den Reapentien des Beispiels 2 durchgeführt. Die Prgebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Tabelle VlI Mittelwerte

c pm

cpm -Rl.

B'i

Leerwert (B^.)	6,	25	IMoI	200	—
Gesamtwert (T)	12,	5	FMoI	9885	9685
Nullwert	25		fMol	6540	6340
Standardlösung			6296	6096
Standardlösung			5821	5621
Standardlösung			5058	4858

100,0 65,5 62,9 58,0 50,2

Mittelwerte

cpm

cpm -BL

Standardlösung Standardlösung Standardlösung Standardlösung Standardlösung

50
100
200
400
800

Standardlösung 1600

Standardlösung 3200
Plasma

fMol fMol fMol fMol fMol fMol fMol

4033

2870

1866

1288

846

563

428

4113

383^

2670

1666

1088

646

363

228

3933

20. Diese Werte werden wie im Beispiel 7 halblogarithmisch aufgetragen (F i g. 2).

21. Anhand dieser Kurve wird die cGMP-Konzentration des untersuchten Plasmas auf 46 f.viol/Röhrchen, pnRnrprhpnH 4700 fMnl/ml Plasma hprprhnpt

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reagentien können in Form einer Gesamtpackung vorliegen, welche die Reagentien (a) bis (e) gebrauchsfertig abgepackt enthält. Hierdurch wird die Anwendung bei Routineuntersuchungen erleichtert. Gegebenenfalls ist nur noch eine Verdünnung der Komponenten erforderlich.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von cyclischem Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) und/oder cyclischem Guanosin-3'3'-monophosphat (cGMP) in von lebenden Organismen entnommenen Proben, wobei man das oder die cyclische(n) Phosphate) mittels einer Lösung von Bernsteinsäure-anhydrid in Gegenwart eines organi- ι ο sehen tertiären Amins succinyliert und anschließend einer Antigen-Antikörperreaktion mittels eines für das betreffende cyclische Nucleotid spezifischen Anti-Serums in Gegenwart von mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosin-3'^'-monophosphat-tyrosinmethylester und/oder cyclischem Succinyl-guanosin-S'i'-monophosphat-tyrosinmethylester unterwirft, den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex abtrennt, die Radioaktivität des Komplexes oder des freien Antigens mißt und daraus durcfi Vergleich mit den Ergebnissen einer das oder die Nucleotide enthaltenden Standardlösung den Nucleotidgehalt bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Succinylierung von cAMP und/oder cGMP in einem System von Wasser und einem organischen Lösungsmittel und die Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Irnidazol-Puffer mit einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, d?.3 die Imidazol-Pufferlösung einen pH-Wert von 5 bis 8 hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Imidazol-Pufferlösung einen Phosphodiesterase-Inhibi:>,r enthält.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man es unter Verwendung der nachstehenden vorbereiteten Reagentien durchführt:

a) Lösung von mit radioaktivem Jod markiertem cyclischem Succinyl-adenosinO'^'-monophosphat-tyrosinmethylester und/oder cyclischem Succinyl-guanosinO'.S'-monophosphat-tyrosinmethylester,

b) Anti-cAMP-Serum und/oder Anti-cGMP-Se- v, rum,

c) Imidazol-Pufferlösung in einer Konzentration von mindestens 0,1 Mol,

d) Substanzen für die Abtrennung des Antigen-Anlikörper-Komplexes von freiem cAMP bzw. m cGMP.

c) Bernsteinsäure-anhydrid in einem organischen Lösungsmittel,

f) organisches tertiäres Amin und

g) cAMP-und/odercGMP-Standardlösung.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reagens (e) eine Dioxanlösung verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reagenslösung (e) ho unmittelbar vor der Zugabe zur Nueleotid-Standardlösung bzw. zur zu untersuchenden Probe mit dem tertiären Amin (Reagens f) vermischt.