KR101356914B1 - 단맛 강화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명자들은 또 다른 감미료의 초역치 농도와 함께 사용되는 단맛 역치 이하 내지 단맛 역치에 근접한 농도의 감미료의 사용을 포함하는 단맛 강화 방법을 발견하였다. 상기 단맛 역치 부근 농도로 사용된 감미료는 인간 단맛 수용체의 그의 가능한 결합 부위를 기초로 하여 선택된다. 본 발명은 신규의 단맛 수용체 단백질을 기초로 한 분석을 통해 인간의 미각 반응을 조절할 수 있는 물질(예를 들어 단맛 강화제)의 확인, 상기 신규의 단맛 수용체 단백질을 형성하는 핵산 구조물을 함유하는 이종 발현 시스템, 및 선별에 있어서 상기 신규의 단맛 수용체 단백질의 용도에 관한 것이다.

Description

단맛 강화 방법{METHOD RELATING TO SWEETNESS ENHANCEMENT}
본 발명은 신규의 단맛 수용체 단백질에 근거한 분석을 통해 인간의 미각 반응을 조절할 수 있는 물질(특히 단맛 강화제)의 확인, 상기 단맛 수용체 단백질을 형성하는 핵산 구조물을 함유하는 이종 발현 시스템, 및 선별에 있어서 상기 단맛 수용체 단백질의 용도에 관한 것이다. 상기 단맛 강화제는 어떤 식품을 보다 풍미 좋게 만들거나 경구 약제 및 기능식품을 환자가 더 잘 승낙하게 한다. 상기와 같은 단맛 강화제는 인간의 미각 반응을 유도해 내는 단맛 자극물질을 포함한다.
단맛 조절제 및 특히 단맛 강화제는 식품 및 풍미 산업에 매우 중요하고 상기 산업의 관심사이며, 예를 들어 제품에서 설탕 및 인공 감미료를 포함한, 감미료의 수준을 감소시킨다. 단맛 강화제의 사용은 칼로리를 감소시키고, 당에 의한 치아의 손상을 방지하며, 많은 인공 감미료와 관련된 쓴맛/금속성 이미 및 뒷맛을 피하거나 감소시킬 수 있다.
단맛의 검출은 2 개의 서브유닛, T1R2 및 T1R3(이들은 미각 수용체 세포에서 특이적으로 발현되며 이량체성 단맛 수용체 복합체(T1R2/T1R3 이종이량체)를 형성한다)로 구성된 수용체 TAS1R에 의해 매개되는 것으로 공지되어 있다. 상기 두 서브유닛은 모두 소위 "G-단백질에 커플링된 수용체" 또는 GPCR, 특히 클래스 C GPCR의 계열에 속한다.
대부분의 다른 GPCR처럼, 상기 클래스 C 수용체는 7나선형 경막 도메인(TMD)을 갖는다. 그러나, 다른 유형의 GPCR과 달리, 상기 클래스 C GPCR은 또한 두 부분, 즉 리간드 결합에 관여하는 "파리지옥 모듈"(VFTM) 및 9 개의 고도로 보존된 시스테인을 함유하고 상기 VFTM을 상기 TMD에 연결하는 시스테인-풍부 도메인(CRD)으로 구성된 큰 세포 외 도메인을 갖는다. 가변적인 길이의 세포 내 C-말단 꼬리가 상기 클래스 C 수용체를 완성한다.
상기 단맛 수용체 반응의 활성화는 상기 이량체성 단맛 수용체 복합체의 두 서브유닛을 모두 필요로 하는 것으로 생각되었으며, 지금까지 시험된 모든 감미료는 상기 T1R2/T1R3 이종이량체를 활성화시킨다. 인간 단맛 수용체(T1R2 동가동의체 또는 T1R3 동가동의체)의 별도의 서브유닛들에 의해 수행된 공개된 시험은 활성을 나타내지 않은 반면, 상기 T1R2/T1R3 이종이량체는 천연 당(슈크로스, 프럭토스, 글루코스, 말토오스), 단맛 아미노산(D-트립토판), 및 인공 감미료(아세설팜-K, 아스파탐, 사이클라메이트, 사카린, 슈크랄로스)에서부터 단맛 단백질(모넬린, 타우마틴, 브라제인)에 이르는 광범위한 화학적으로 다양한 감미료들에 반응한다(예를 들어 문헌[Li et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(7), 4692-6]을 참조하시오).
현재 공지된 단맛 조절제용 스크린들은 상기 T1R2/T1R3 이종이량체성 단맛 수용체를 사용한다. 이들 스크린은 대개 샘플들의 결과를 감미료의 존재 하에서 잠재적인 조절제와 함께, 및 상기 조절제 없이 비교함으로써 단맛 조절제를 확인하거나 특성화한다. 그러나, 감미료 및 특히 당은 오스몰농도에 큰 영향을 미치고/미치거나 점성이다. 점도 및 오스몰 농도와 같은 샘플 성질들의 변화로 인해, 표준 선별 방법을 사용하는 경우 잘못된 결과를 야기하는 인공물들이 발생할 수 있다.
공지된 스크린의 또 다른 단점은 야생형 T1R2/T1R3 수용체가 여러 결합 도메인들, 특히 탄수화물 감미료, 예를 들어 슈크로스, 글루코스, 프럭토스뿐만 아니라 인공 감미료인 아스파탐 및 슈크랄로스에 결합하는 파리지옥("VFT") 도메인을 포함한 세포 외 아미노 말단 도메인을 포함한다는 것이다. 따라서, 특정 리간드의 특정 조절제, 및 특히 상기 VFT 리간드를 제외한 경막 도메인("TDM(들)")의 리간드에 대한 스크린은 공지된 선별 방법에 의해 가능하지 않다.
상기 수용체에 결합하는 당과 경쟁할 수 있는 물질의 확인을 방지하기 위해서, 상기 VFT 도메인과 물리적으로 다른 부위, 및 특히 상기 TMD 및/또는 시스테인-풍부 도메인에서 결합하는 추정적인 단맛 수용체 강화제의 확인을 허용하는 스크린이 바람직할 수 있다. 본 발명은 상기 필요성을 강조한다. 예를 들어, 본 발명자들에 의해 제조된 키메라 T1R 수용체(CSR:T1R2 또는 CSR:T1R3 키메라 수용체, 집합적으로 CSR:T1R 키메라 수용체("CSR"은 칼슘-감각 수용체를 지칭한다))를 사용하는 본 발명의 방법은 단맛 화합물인 사이클라메이트가 T1R3의 TMD에서 결합하여, 상기 이종이량체성 T1R2/T1R3 수용체 복합체를 활성화시킴을 보여준다.
지금까지, 상기 TAS1R 단량체들 중 하나의 TMD가 단맛 화합물에 결합할 수 있고 또한 다른 필수적인 단량체 상대의 부재 하에서 G-단백질을 활성화시킬 수 있음은 알려지지 않았다. 이전에, 당해 분야에서는 상기 두 서브유닛의 존재가 신호 전달에 필수적인 것으로 여겼다. 본 발명자들은 상기 T1R2/T1R3 이종이량체 수용체 복합체의 T1R2 동가동의체의 심하게 말단절단된 서열에 상응하는 신규의 수용체 단백질("T1R2-TMD")이 놀랍게도 단맛 리간드에 결합하고 G-단백질을 활성화시킬 수 있는 작용성 단맛 수용체를 형성함을 발견하였다. 상기 신규의 수용체 단백질 T1R2-TMD는 전장 T1R2 동가동의체와 상이한 작용제 범위를 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 단백질은 놀랍게도 리간드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 하향 신호전달을 활성화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 제공된 방법은 T1R2 및/또는 T1R3의 경막 및 세포 내 도메인에 결합하고/하거나 이를 활성화시키는 리간드의 확인을 허용한다. 따라서, CSR:T1R 키메라 수용체 또는 T1R2-TMD 및 G-단백질을 발현하는 세포를, 경우에 따라 공지된 또는 새로이 확인된 단맛 자극물질과 함께, 시험 물질과 접촉시켜 단맛 강화제로서 상기 물질의 성질을 측정한다. 따라서 본 발명에 제공된 분석을 사용하여 시험된 물질을 단맛 자극물질로서 또는 단맛 반응의 강화제로서 확인할 수 있다. 상기 수용체 및 G-단백질에 대한 상기 물질의 작용 효과를 당해 분야에 공지된 기법에 따라, 적합한 작용 분석, 예를 들어 상기 전달 경로의 매개변수, 예를 들어 세포 내 IP3 및 Ca2 +의 변화를 측정하는 분석에 의해, 또는 GTPγS에 의한 표지와 같은 다른 G-단백질 특수 분석에 의해 측정한다. 한편으로, 결합 분석을 사용하여 CSR:T1R 키메라 수용체 또는 T1R2-TMD에 결합하는 리간드를 결정할 수 있다. 이어서 상기 확인된 물질을 본 발명에서 하기에 제한 없이 개시된, 당해 분야에 공지된 기법에 따라 단맛 강화제로서 그의 활성에 대해 시험할 수 있다.
클로닝, 리간드-수용체 쌍의 해명, 및 상기 단맛 반응의 강화제 발견과 관련하여 본 발명에 개시된 다양한 태양 및 실시태양들의 실시에서, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 기법 및 단맛 시험의 통상적인 기법들에 의지한다. 이들 기법은 CSR:T1R 키메라 수용체 또는 T1R2-TMD를 포함한 G-단백질에 커플링된 수용체(GPCR)에 적합한 다양한 공지된 방법들을 포함한다. 따라서, 숙련가는 상기와 같은 기법들을 충분히 알고 있으며 이후에 상기 기법들은 그 자체로서 본 발명의 상황을 보다 충분히 개시하기 위해서 단지 요약적으로 다루어진다.
도 1은 T1R2-TMD 동가동의체(색칠 된 삼각형) 및 T1R2/T1R3 이종이량체(빈 삼각형)의 용량 반응 곡선이다.
첫 번째 태양에서, 본 발명은 물질을 단맛 역치에 근접한 농도 또는 단맛 역치 바로 아래의 농도로 상기 단맛 역치 이상의 농도의 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질과 혼합 시, 상기 물질과 상기 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질과의 혼합물의 단맛을, 상기 단맛 자극물질만 또는 상기 물질만을 함유하는 혼합물의 단맛에 비해 부가 방식보다 더 크게 강화시키는 물질을 포함하며; 여기에서 상기 물질은 상기 물질 존재 하에서의 미각 수용체의 활성에 대한 분석에 의해 생성된 신호를 상기 물질 부재 하에서의 미각 수용체의 활성에 대한 분석에 의해 생성된 신호와 비교함으로써 확인될 수 있고; 상기 미각 수용체의 활성에 대한 분석은 미각 수용체의 파리지옥 도메인에 결합하는 물질을 배제하면서 상기 미각 수용체의 경막 도메인에 결합하는 물질을 확인함을 포함한다.
두 번째 태양에서, 본 발명은 상기 물질 존재 하에서의 미각 수용체와의 결합 및/또는 상기 수용체의 활성화에 대한 분석에 의해 생성된 신호 및 상기 물질 부재 하에서 상기 동일 분석에 의해 생성된 신호를 측정하고 상기 두 측정치를 비교함을 포함하는, 추정적인 단맛 강화제의 확인 방법을 포함하며; 여기에서 상기 분석은 경막 및 세포 내 도메인을 포함하는 단백질을 사용함으로써 미각 수용체의 파리지옥 도메인에 결합하는 물질을 제외하지만, 미각 수용체 이외의 G-단백질에 커플링된 수용체의 세포 외 도메인에 결합된 상기 미각 수용체의 세포 외 도메인은 제외시키지 않고, 상기 미각 수용체의 경막 도메인에 결합하고/하거나 상기 도메인을 활성화시키는 물질을 확인함을 포함한다.
세 번째 태양에서, 본 발명은 상기 물질 존재 하에서의 미각 수용체에 대한 결합 및/또는 상기 수용체의 활성화에 대한 분석에 의해 생성된 신호 및 상기 물질 부재 하에서 상기 동일 분석에 의해 생성된 신호를 측정하고 상기 두 측정치를 비교함을 포함하는, 추정적인 단맛 강화제의 확인 방법을 포함하며; 여기에서 상기 분석은 미각 수용체의 파리지옥 도메인이 결여된 말단 절단된 미각 수용체를 포함하는 단백질을 사용함으로써 상기 미각 수용체의 파리지옥 도메인에 결합하는 물질을 배제하면서 상기 미각 수용체의 경막 도메인에 결합하는 강화제를 확인함을 포함한다.
네 번째 태양에서, 본 발명은 상기 물질 존재 하에서의 미각 수용체의 활성에 대한 분석에 의해 생성된 신호 및 상기 물질 부재 하에서의 상기 미각 수용체의 활성에 대한 분석에 의해 생성된 신호를 측정하고 상기 두 측정치를 비교함을 포함하는, 추정적인 단맛 강화제의 확인 방법을 포함하며; 여기에서 상기 미각 수용체의 활성에 대한 분석은 미각 수용체의 파리지옥 도메인을 제거하기 위해 말단 절단시킨 미각 수용체를 포함하는 단백질을 사용함으로써 상기 미각 수용체의 파리지옥 도메인에 결합하는 물질을 배제하면서 TAS1R 미각 수용체의 T1R2 서브유닛의 경막 도메인에 결합하는 물질을 확인함을 포함한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 방법에 의해 확인된 단맛 강화제를 감미료와 혼합함을 포함하는 감미료의 단맛 강화 방법을 포함하며, 여기에서 상기 감미료는 2% 이상의 슈크로스에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 존재하며, 단맛 강화제는 1 ppb 이상 100,000 ppm의 농도로 존재하고, 상기 단맛 강화제가 또한 감미료인 경우 2%(w/w) 슈크로스 미만의 슈크로스에 대한 단맛 등강도에서 그의 단맛 검출 역치에 근접한 농도로 존재한다. 상기 단맛 강화제는 단일 화합물이거나 화합물들의 혼합물일 수 있다.
더욱 추가의 태양에서 본 발명은 야생형 파리지옥 도메인이 또 다른 클래스 C GPCR 파리지옥 도메인으로 치환된 키메라 미각 수용체의 서브유닛과 상기 야생형 미각 수용체의 서브유닛을 결합시킴을 포함하는, 추정적인 단맛 강화제의 확인 방법을 포함하며; 여기에서 상기 분석은 상기 강화제 존재 하에서의 상기 결합된 키메라 수용체/야생형 미각 수용체 이량체의 활성에 대한 분석에 의해 생성된 신호 및 상기 강화제 부재 하에서의 상기 결합된 키메라 수용체/야생형 미각 수용체의 활성에 대한 분석에 의해 생성된 신호를 측정하고 상기 두 측정치를 비교함을 포함한다.
추가의 태양에서 본 발명은 개질된 미각 수용체를 화합물과 접촉시키고 상기 화합물이 상기 개질된 수용체에 결합하고/하거나 상기 수용체를 활성화시키는 지를 결정함을 포함하는, 상기 미각 수용체의 파리지옥 도메인 외부에서 미각 수용체에 결합하고/하거나 상기 수용체를 활성화시키는 화합물을 확인하는 방법을 포함하며, 여기에서 상기 개질된 수용체는
a) 파리지옥 도메인이 결여된 T1R2 및/또는 파리지옥 도메인이 결여된 T1R3,
b) T1R2-TMD, CSR:T1R, T1R3-TMD, T1R2-TMD 및 T1R3-TMD 모두, CSR:T1R2, CSR:T1R3, CSR:T1R2 및 T1R3-TMD 모두, T1R2-TMD 및 CSR:T1R3 모두,
c) 클래스 C G-단백질에 커플링된 수용체로부터 유래된 파리지옥 도메인 및 파리지옥 도메인이 결여된 T1R2를 포함하는 키메라 단백질 및/또는 클래스 C G-단백질에 커플링된 수용체로부터 유래된 파리지옥 도메인 및 파리지옥 도메인이 결여된 T1R3을 포함하는 키메라 단백질,
d) 아미노산 수준에서 상기 a) 내지 c)에 기재된 단백질들 중 어느 하나와 아미노산 수준이 95% 이상 동일한 임의의 단백질,
e) 상기 a) 내지 c)에 기재된 단백질들 중 어느 하나와 실질적으로 상동성을 나타내는 임의의 단백질,
f) 서열번호: 1, 13, 15 또는 27에 의해 코딩된 임의의 단백질, 및
g) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1, 13, 15 또는 27에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 임의의 단백질
로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩타이드를 포함하며,
상기 개질된 수용체는 신호 서열 및 항체 에피토프로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 서열 태그를 추가로 포함하거나 포함하지 않되, 상기 개질된 수용체의 하나 이상의 서브유닛은 T1R2 또는 T1R3 파리지옥 도메인을 포함하지 않는다.
추가의 태양에서, 본 발명은
a) 개질된 미각 수용체를 화합물 또는 화합물 군과 접촉시키고 상기 화합물 또는 화합물 군이 상기 개질된 수용체에 결합하고/하거나 상기 수용체를 활성화시키는 지를 결정함을 포함하는, 상기 화합물 또는 화합물 군이 미각 수용체의 파리지옥 도메인 외부에서 미각 수용체에 결합하고/하거나 상기 수용체를 활성화시키는 지를 결정하는 단계
b) i) 화합물 또는 화합물 군이 키메라 수용체에 대한 리간드에 의해 상기 수용체에 대한 결합 및/또는 상기 수용체의 활성화를 강화시키는 지를 결정하거나, 또는
ii) 상기 화합물 또는 화합물 군이 감미료의 단맛을 강화시키는 지를 결정(여기에서 상기 감미료는 2% 농도 이상의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도 농도로 존재하고 상기 화합물은 2% 농도 미만의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도 농도로 존재한다)
함으로써 상기 개질된 수용체에 결합하고/하거나 상기 수용체를 활성화시키는 상기 화합물 또는 화합물 군이 단맛을 강화시키는 지를 결정하는 단계
를 포함하는, 단맛을 강화시키는 화합물 또는 화합물 군을 확인하는 방법을 포함하며, 여기에서
상기 키메라 수용체는 1) 클래스 C G-단백질에 커플링된 수용체로부터 유래된 파리지옥 도메인, 및 2) 파리지옥 도메인이 결여된 T1R2를 포함하는 서브유닛을 포함하고, 1) 클래스 C G-단백질에 커플링된 수용체로부터 유래된 파리지옥 도메인, 및 2) 파리지옥 도메인이 결여된 T1R3을 포함하는 서브유닛을 포함하거나 포함하지 않으며, 상기 하나 이상의 서브유닛은 T1R2 또는 T1R3 파리지옥 도메인을 포함하지 않고,
상기 개질된 수용체는
a) 파리지옥 도메인이 결여된 T1R2 및/또는 파리지옥 도메인이 결여된 T1R3,
b) T1R2-TMD, CSR:T1R, T1R3-TMD, T1R2-TMD 및 T1R3-TMD 모두, CSR:T1R2, CSR:T1R3, CSR:T1R2 및 T1R3-TMD 모두, T1R2-TMD 및 CSR:T1R3 모두,
c) 클래스 C G-단백질에 커플링된 수용체로부터 유래된 파리지옥 도메인 및 파리지옥 도메인이 결여된 T1R2를 포함하는 키메라 단백질 및/또는 클래스 C G-단백질에 커플링된 수용체로부터 유래된 파리지옥 도메인 및 파리지옥 도메인이 결여된 T1R3을 포함하는 키메라 단백질,
d) 아미노산 수준에서 상기 a) 내지 c)에 기재된 단백질들 중 어느 하나와 95% 이상 동일한 임의의 단백질,
e) 서열번호: 1, 13, 15 또는 27에 의해 코딩된 임의의 단백질, 및
f) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1, 13, 15 또는 27에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 임의의 단백질
로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩타이드를 포함하며,
상기 개질된 수용체는 신호 서열 및 항체 에피토프로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 서열 태그를 추가로 포함하거나 포함하지 않되, 상기 개질된 수용체의 하나 이상의 서브유닛은 T1R2 또는 T1R3 파리지옥 도메인을 포함하지 않는다.
몇몇 예시적인 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법은 G-단백질을 또한 발현하는 세포를 사용한다.
몇몇 예시적인 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법은 T1R2 및/또는 T1R3의 경막 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산에 의해 일시적으로 또는 안정하게 형질감염된 세포를 사용한다.
다른 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 상기 G-단백질은 Gaq-거스트덕신(Gustducin)을 기초로 한 키메라 G-단백질이다.
추가의 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 상기 G-단백질은 키메라 G-단백질 Galpha16-거스트덕신 44이다.
더욱 추가의 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 하나 이상의 물질이 세포 내의 하나 이상의 작용성 반응에 의해 상기 세포 내의 미각 수용체의 작용 활성에 영향을 미치는 지는 세포내 메신저(messenger)의 변화 또는 상기 메신저에 의해 유발된 변화를 측정함으로써 결정한다.
더욱 추가의 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 상기 작용성 반응은 IP3 및 칼슘2+으로 이루어진 군 중에서 선택된 세포내 메신저의 변화를 측정함으로써 측정된다.
다른 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 상기 세포를 세균 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 양서류 세포 및 연충 세포로 이루어진 군 중에서 선택한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
추가의 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 상기 세포는 CHO, COS, HeLa 및 HEK-293 세포로 이루어진 군 중에서 선택된 포유동물 세포이다.
추가의 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, (i) 단맛 자극물질의 존재 하에서 상기 T1R2 단맛 수용체를 시험 물질과 접촉시킴을 또한 포함한다.
또 다른 태양에서, 키트를 제공하며, 상기 키트는
T1R2-TMD의 조절제로서 시험 물질을 확인하기 위해 병용하기 위한
(i) T1R2-TMD 단맛 수용체, 또는 그의 실질적으로 유사한 상동체를 발현하지만, T1R3 수용체는 발현하지 않는 재조합 세포, 및
(ii) 상기 T1R2-TMD 단맛 수용체의 작용제
를 포함한다.
또 다른 태양에서, 상기 정의된 키트의 사용 방법을 제공한다. 상기 방법은
(i) 고체 지지체 상에서 재조합 세포를 증식시키는 단계;
(ii) 시험 물질을 상기 작용제의 존재 하에서 한정된 플레이트 또는 웰의 배양 배지에 적합한 농도로 첨가하는 단계;
(iii) 상기 시험 물질의 존재 하에서의 반응을 상기 시험 물질의 부재 하에서의 반응과 비교함으로써 상기 세포의 작용성 반응의 변화를 측정하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 상기 시험 물질은 상기 T1R2 단맛 수용체 또는 그의 실질적으로 유사한 상동체로서 확인된다.
또 다른 태양에서, T1R2-TMD를 조절하는 물질을 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) T1R2-TMD에 결합하는 리간드에 반응하여 변하는 매개변수를 측정하는 단계;
(ii) 리간드의 존재 또는 부재 하에서 음성 대조군과 비교할 때 시험 물질에 반응하는 상기 매개변수의 변화를 측정하여 조절제 또는 리간드를 확인하는 단계
를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 상기 리간드를 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 신나모나이트릴, 스테비오사이드, 루부소사이드, 레바우디오사이드 A 및 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘으로 이루어진 군 중에서 선택한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라, 단계 (i)를 형광 분광분석; NMR 분광분석; 흡광도 및 굴절률 중 하나 이상의 측정; 유체역학적 방법; 크로마토그래피; 가용성 측정; 및 생화학적 방법으로 이루어진 군 중에서 선택된 수단에 의해 수행되고, 이때 상기 수단이 용액 환경, 2층 막 환경, 고체 상에 부착되어 있는 환경, 지질 단층내 환경, 막에 결합되어 있는 환경 및 소포체(vesicle)내 환경으로 이루어진 군 중에서 선택된 적합한 환경에서 상기 T1R2-TMD 폴리펩타이드의 성질을 측정한다.
본 발명의 실시태양들은 본 발명이 전장 야생형 T1R2 및 전장 야생형 T1R3 단백질을 모두 사용하는 방법을 포함하지 않는다는 조건을 제외하고 상기 방법을 포함한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 2% 농도 미만의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도 농도에서 단맛 검출 역치 이하 또는 단맛 검출 역치에 근접한 단맛 강화제를 제품에 포함시킴을 포함하는, 상기 제품에서 단맛을 강화시키는 방법을 포함하며, 여기에서 상기 제품은 그의 단맛 검출 역치 이상의 농도로 감미료를 함유한다.
단맛 강화제 후보
추정적인 강화제 및 감미료를 함유하는 혼합물이 상기 추정적인 강화제 단독(상기 혼합물에서와 같은 농도) + 상기 감미료 단독(상기 혼합물에서와 같은 농도)의 단맛의 합보다 더 단 경우 화합물 또는 화합물의 군은 단맛 강화제이다. 본 발명자들은 비 제한적으로, TAS1R의 막 통과 도메인에 결합하는 하기의 화합물들을 단맛 강화제 후보로서 확인하였다: 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 신나모나이트릴, 나린진 다이하이드로찰콘, 사이클라메이트, 스테비오사이드, 루부소사이드, 레바우디오사이드 A, 모그로사이드 V, 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘. 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 신나모나이트릴, 스테비오사이드, 루부소사이드, 레바우디오사이드 A, 및 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘의 화학 구조는 http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/.에서 찾을 수 있다. 나린진 다이하이드로찰콘의 화학 구조는 http://www.chemblink.com/products/18916-17-1.htm에서 찾을 수 있다. 사이클라메이트의 화학 구조는 http://www.chemicalland21.com/lifescience/foco/SODIUM%20CYCLAMATE.htm에서 찾을 수 있다. 모그로사이드 V의 화학 구조는 http://en.wikipedia.org/wiki/Image:LuHanGuo-Mogroside5.jpg에서 찾을 수 있다. 상기 단맛 강화제 후보들을 단맛 강화 활성성분을 포함하는 정제되거나 단리된 형태 또는 식물 추출물의 형태로 사용할 수 있다.
감미료
감미료는 단맛을 증가시키는 화합물이다. 상기 감미료는 비 제한적으로 당 슈크로스, 프럭토스, 글루코스, 고 프럭토스 옥수수 시럽(프럭토스 및 글루코스 함유), 타가토스, 갈락토스, 리보스, 자일로스, 아라비노스, 및 람노스, 당 알콜 에리쓰리톨, 자일리톨, 만니톨, 솔비톨, 및 이노시톨, 및 인공 감미료 AceK, 아스파탐, 네오탐, 슈크랄로스, 및 사카린, 및 이들 감미료의 조합을 포함한다.
설탕 또는 사카로스로서 또한 알려진 슈크로스는 글루코스와 프럭토스의 다이사카라이드이다. 그의 분류명은 α-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-프럭토퓨라노스이다. 프럭토스, 글루코스, 타가토스, 갈락토스, 리보스, 자일로스, 아라비노스 및 람노스는 모노사카라이드 당이다. 고 프럭토스 옥수수 시럽(HFCS)은 글루코스와 프럭토스의 혼합물로 이루어진다. 통상적인 옥수수 시럽처럼, 상기 고 프럭토스 종류는 효소를 사용하여 옥수수 전분으로부터 제조된다. 상기 옥수수 시럽(글루코스)의 프럭토스 함량은 효소 처리를 통해 증가된다. 고 프럭토스 옥수수 시럽의 통상적인 상업 등급은 42%, 55% 또는 90%의 프럭토스 함량을 포함한다. 55% 등급이 청량 음료에 가장 흔히 사용된다. 에리쓰리톨(분류명 1,2,3,4-부탄테트롤)은 비-칼로리의 천연 당 알콜이다. AceK, 아스파탐, 네오탐 및 슈크랄로스는 인공 감미료이다. 아세설팜 칼륨(AceK)은 6-메틸-1,2,3-옥사티아진-4(3H)-온2,2-다이옥사이드, N-설포닐아미드의 칼륨 염이다. 상기 감미료는 또한 아세설팜 K 또는 AceK, 또는 슈네트(Sunett)(등록상표) 및 스위트 원(Sweet One)(등록상표)을 비롯한 다양한 상표명들로서 알려져 있다. 유럽 연합에서는 E 넘버(추가 코드) E950으로 알려져 있다. 아스파탐은 아스파틸-페닐알라닌-1-메틸 에스터, 다이펩타이드에 대한 이름이다. 이는 이퀄(Equal)(등록상표) 및 캔데렐(Canderel)(등록상표)을 비롯한 다양한 상표명들로 알려져 있다. 유럽 연합에서는 또한 E 넘버(추가 코드) E951로 알려져 있다. 슈크랄로스는 클로로데옥시당인 6-다이클로로-1,6-다이데옥시-β-D-프럭토-퓨라노실-4-클로로-4-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드에 대한 이름이다. 이는 또한 상표명 스플렌다(Splenda)(등록상표)로 알려져 있다. 유럽연합에서는 또한 E 넘버(추가 코드) E955로 알려져 있다.
천연 감미료들은 순수하거나 부분 정제된 형태로 사용될 수 있으며, 임의의 방법, 예를 들어 화학 합성, 생물공학적 방법, 예를 들어 발효 또는 천연 공급원, 특히 식물원(비 제한적으로 과일, 사탕수수, 사탕 무 포함), 예를 들어 식물 추출물 또는 시럽, 예를 들어 비 제한적으로 옥수수 시럽, 고 프럭토스 옥수수 시럽, 꿀, 당밀, 단풍나무 시럽, 과일 농축액, 및 다른 시럽 및 추출액으로부터의 단리에 의해 제조될 수 있다.
단맛 강화제와 감미료의 혼합물
단맛 강화제 및 그의 조합에 대한 단맛 검출 역치가 본 발명자들에 의해 측정되었다. 상기 단맛 검출 역치는 인간이 단맛과 달지 않은 맛의 차이를 탐지하는데 필요한 최소 농도이다. 상기 단맛 검출 역치는 상이한 개인들에서 다소 차이가 있다. 예를 들어 어떤 개인은 0.4%의 매우 낮은 농도의 슈크로스의 단맛을 탐지할 수 있고; 다른 사람들은 0.7% 이상 또는 훨씬 더 이상이 필요하다. 모든 실시예들을 적어도 0.5% 이하의 슈크로스를 탐지할 수 있는 단맛 민감성 패널리스트들에 의해 수행하였다. 따라서 평균적인 소비자에 의해 탐지될 수 있는 농도는 그 이상일 것이다.
단맛 강화제의 단맛 검출 역치를 본 발명에서는 단맛 민감성 패널리스트에 의해 탐지 시, 2% 슈크로스 미만, 예를 들어 1% 이하, 0.8% 이하, 0.75% 이하, 0.7% 이하, 또는 0.5% 슈크로스 이하의 슈크로스에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로서 정의한다. 이들 단맛 강화제의 서로 및 임의의 성분들과의 조합은 본 발명에 개시된 바와 같은 감미료에 대해 특히 높은 단맛 강화 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
단맛 강화제의 용도
단맛 강화제를 단일 단맛 강화 성분으로서, 예를 들어 0.0001% 내지 15%(wt/wt) 이상의 하나 이상의 감미료를 함유하는 제형에서 하기 지시된 바와 같은 농도로 사용할 수 있다. 감미료에 유용한 농도는 그 자신이 단독으로 2% 이상, 예를 들어 2 내지 15%, 또는 5 내지 12%의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도이다. 예를 들어 슈크로스, 프럭토스, 글루코스, 고 프럭토스 옥수수 시럽(HFCS) 또는 에리쓰리톨의 유용한 농도는 약 5% 내지 약 12%일 수 있다.
제품은 모든 식품들, 예를 들어 비 제한적으로 재조성을 필요로 하는 형태, 식품 추출물, 식물 추출물, 고기 추출물, 조미료, 감미료, 기능식품, 젤라틴, 약학 및 비 약학 검, 정제, 로젠지, 점적제, 유화액, 엘릭서, 시럽 및 다른 음료수 제조용 제제를 포함하는 곡류 제품, 쌀 제품, 타피오카 제품, 사고 제품, 제빵 제품, 비스킷 제품, 제과 제품, 빵 제품, 과자류 제품, 디저트 제품, 검, 츄잉검, 초콜릿, 빙과류, 꿀 제품, 당밀 제품, 효모 제품, 베이킹 파우더, 소금 및 양념 제품, 향신료 제품, 겨자 제품, 식초 제품, 소스(조미료), 담배 제품, 시가, 궐련, 가공 식품, 조리된 과일 및 식물 제품, 정육 및 정육 제품, 젤리, 잼, 과일 소스, 계란 제품, 우유 및 낙농 제품, 요거트, 치즈 제품, 버터 및 버터 대용품, 우유 대용품, 간장 제품, 식용유 및 지방 제품, 약제, 음료수, 탄산 음료, 알콜 음료, 맥주, 청량 음료, 미네랄 및 탄산수 및 다른 비 알콜 음료, 과일 음료, 과일 주스, 커피, 인공 커피, 차, 코코아, 및 이들의 조합을 포함한다.
제품은 낮은 pH를 제공하는 산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 많은 음료수들이 낮은 pH, 예를 들어 pH 2.6 내지 3을 갖는다. 본 발명에 개시된 단맛 강화제도 또한 낮은 pH 조건 하에서 작용하며 강화 효과를 나타낸다. 본 발명에 개시된 감미료를 충분 량으로 사용하여 제품을 달게 하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 제품에 따라, 본 발명에 개시된 단맛 강화제의 첨가에 의해 감미료의 양을 줄일 수 있다. 예를 들어, 감미료로서 슈크로스의 경우, 약 1 내지 4°Bx(°Bx(당도)는 액체에 용해된 슈크로스 대 물의 질량비의 크기이다) 또는 그 이상의 감소가 성취될 수 있다. 제품은 본 발명에 개시된 바와 같은 감미료를 임의의 양으로 함유할 수 있다. 유용 범위는 예를 들어 2% 이상, 예를 들어 약 2 내지 15%, 또는 약 5 내지 12%의 슈크로스, 프럭토스, 글루코스, 고 프럭토스 옥수수 시럽 및 에리쓰리톨 중에서 선택된 하나 이상이다. 인공 감미료의 유용 범위는 약 2 내지 15% 슈크로스에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도이다. 상이한 감미료들을 약 2% 이상의 슈크로스에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 함께 사용할 수 있다. 예를 들어 탄산 음료는 대개 약 10 내지 12% 고 프럭토스 옥수수 시럽 및/또는 슈크로스를 함유한다.
단맛 강화제의 확인
키메라 미각 수용체 또는 세포 외 도메인을 제거하기 위해 말단 제거한 미각 수용체를 단맛 강화제 후보를 확인하기 위한 분석에 사용한다.
말단 절단된 미각 수용체를 사용하는 분석
T1R2 동가동의체 결합 분석은 US 20050032158에 개시되어 있다. 결합 분석은 작용성 수용체 활성화와 상반되게, 단지 결합만을 나타내며, 동역학 측정을 수반하는 보다 빠른 작용 분석에 비해 최종점 기준이며 시간 소모적이다. US 20050032158은 공지된 작용성 수용체 T1R1/T1R3 및 T1R2/T1R3에 적합한, T1R에 대한 세포 기재 분석을 포함한 작용 분석을 추가로 개시한다.
하기 본 발명에 사용된 바와 같은 T1R2 "동가동의체(homomer)" 또는 "동가동의체성(homomeric)" 폴리펩타이드, 단백질 또는 수용체란 용어는 이종이량체성 T1R2/T1R3 수용체 복합체와 상반되게, T1R2 폴리펩타이드 또는 단백질의 단량체, 이량체 또는 올리고머를 포함함을 의미한다.
본 발명자들은 T1R2/T1R3 이종이량체 수용체 복합체의 T12R 치환체의 크게 말단 절단된 서열에 상응하는, "T1R2-TMD"라 칭하는 신규의 수용체 단백질이 놀랍게도 단맛 리간드에 결합하고 G-단백질을 활성화시킬 수 있는 작용성 단맛 수용체를 형성함을 발견하였다. 상기 신규의 수용체 단백질 T1R2-TMD는 놀랍게도 리간드에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 T1R3의 부재 하에서 하향 신호전달을 활성화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 제공된 방법에 따라, T1R2-TMD 및 G-단백질을 모두 발현하지만 T1R3은 발현하지 않는 세포를 경우에 따라 공지된 또는 새로이 확인된 단맛 자극물질과 함께 시험 물질과 접촉시켜 상기 물질이 상기 T1R2 TMD 도메인에 결합하고/하거나 상기 도메인을 활성화시킬 수 있는 지를 결정한다. 상기 T1R2 도메인에 결합하고/하거나 상기 도메인을 활성화시키는 물질은 감미료 후보이며 단맛 강화제의 후보이다. 따라서 본 발명에 제공된 분석을 사용하여 단맛 자극물질 후보로서 또는 단맛 반응의 강화제 후보로서, 시험된 물질을 확인할 수 있다.
상기 수용체 및 G-단백질에 대한 상기 물질의 작용 효과를 적합한 작용 분석에 의해, 예를 들어 세포 내 IP3 및 Ca2 +의 농도와 같은 신호전달 경로의 매개 변수 변화를 측정하는 분석에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 기법에 따라 다른 G-단백질 특수 분석, 예를 들어 GTPγS에 의한 표지에 의해 측정한다. 한편으로, 결합 분석을 사용하여 T1R2-TMD에 대한 리간드 결합을 측정할 수 있다.
클로닝, 리간드-수용체 쌍의 해명, 및 단맛 반응 강화제의 발견과 관련하여 본 발명에 개시된 다양한 태양 및 실시태양들의 실시에서, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법들의 통상적인 기법에 의지한다. 이들 기법은 T1R2-TMD를 포함한 G-단백질에 커플링된 수용체(GPCR)에 적합한 다양한 공지된 방법들을 포함한다. 따라서, 숙련가는 상기와 같은 기법들을 충분히 알고 있으며 이후에 상기 기법들은 그 자체로서 본 발명의 상황을 보다 충분히 개시하기 위해서 단지 요약적으로 다루어진다.
키메라 수용체를 사용하는 분석
키메라 단백질은 2 개 이상의 상이한 단백질들로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된다. 키메라 단백질은 때때로 목적하는 성질을 겸비하거나 또는 불필요한 성질을 제거할 수 있다. 본 발명에서 하기에 사용된 바와 같은 CSR:T1R이란 용어는 키메라 CSR:T1R2 동가동의체, CSR:T1R3 동가동의체, CSR:T1R2와 CSR:T1R3 또는 야생형 T1R3와의 이종이량체성 복합체(CSR:T1R2/CSR:T1R3 또는 CSR:T1R2/T1R3), 또는 CSR:T1R3와 CSR:T1R2 또는 야생형 T1R2와의 이종이량체성 복합체(CSR:T1R2/CSR:T1R3 또는 T1R2/CSR:T1R3)를 가리킨다.
상기 키메라 미각 수용체의 경우, CSR:T1R 키메라 단백질은 특히 CSR:T1R2 단량체, CSR:T1R3 단량체, CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체, CSR:T1R2/T1R3 이종이량체(키메라 T1R2 서브유닛과 야생형 T1R3), 및 T1R2/CSR:T1R3 이종이량체(키메라 T1R3 서브유닛과 야생형 T1R2)를 포함한다. 상기 CSR:T1R 키메라 단백질은 T1R2, T1R3, 또는 T1R2와 T1R3의 VFT 도메인을 갖지 않으며, 따라서 T1R2 및/또는 T1R3의 TMD 도메인에 결합하는 화합물들을 특이적으로 확인할 수 있게 한다. 상기 확인된 화합물들은 생체 내에서 단맛 수용체에 결합하기 위해 상기 VFT 부위에서 탄수화물 결합과 경쟁할 것으로 예상되지 않기 때문에 특히 중요하며 따라서 탄수화물의 특히 흥미로운 단맛 강화제 후보이다.
본 발명자들은 키메라 단량체, CSR:T1R2 및 CSR:T1R3가 작용성이며 작용성 CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체를 형성할 수 있음을 발견하였다. 상기 본 발명자들의 실험은 상기 CSR:T1R2 단량체성 서브유닛 자신이 또한 이종이량체의 형성 없이, 작용성 단맛 수용체로서 작용함을 지적한다. 예비 실험은 상기 CSR:T1R3이 몇몇 G-단백질을 사용하고/하거나 활성화시키기 어려울 수 있으나; CSR:T1R3은 G-단백질을 활성화시키는 능력을 요하지 않는 결합 분석에 유용함을 지적한다.
따라서, CSR:T1R2 및 CSR:T1R3은 또한 본 발명에 개시된 그들의 단량체 형태로 유용하다. 상기 방법에 사용될 수 있는 또 다른 이종이량체는 키메라 서브유닛/야생형 서브유닛 이종이량체(CSR:T1R2/T1R3 및 T1R2/CSR:T1R3)이다. CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체에서, 상기 이종이량체성 복합체의 CSR:T1R 서브유닛은 각각 2 개의 공급원 단백질로부터 결합된 서열 단편들로 이루어진다. 상기 2 개의 공급원 단백질은 인간 칼슘 감각 수용체(hCaSR) 및 T1R 단백질(T1R2 또는 T1R3)이다. 상기 두 서브유닛에 공통적인 hCaSR-유래된 단편(CSR)은 hCaSR의 세포 외 도메인(ECD)을 포함한다. 상기 T1R-유래된 단편은 상기 T1R 서열의 경막 도메인(TMD)을 포함하며, T1R2 또는 T1R3으로부터 유래되므로 2 개의 상이한 유형을 갖는다.
제공되는 키메라 CSR:T1R 구조물(DNA, 벡터, 형질감염된 세포, 단백질)은 예를 들어 본 발명에 개시된 단맛 강화제 후보와 같은 단맛 반응의 강화제를 선별할 때 유용하다. 전통적인 선별 방법 및 결합 분석을 사용하여 강화제를 또한 선별할 수 있다. 상기와 같은 선별 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 하기에 개략되어 있다.
한편으로, 상기 키메라 CSR:T1R 구조물에서 상기 CSR(상기 hCaSR의 칼슘 감각 수용체 부분)의 이점은 생성되는 수용체가 칼슘에 반응성이라는 것이다. 결과적으로, 상기 T1R 수용체의 리간드/작용제의 존재/부재 하에서 강화제를 선별할 때, 상기 리간드를 단맛 화합물(예를 들어 염화 칼슘의 형태로) 대신에 hCaSR-자극 리간드로 치환시킬 수 있다. 이는 실제 리간드/작용제의 임의의 부정적인 영향이 존재하는 것을 피할 수 있다는 추가적인 이점을 갖는다. 예를 들어, 당 리간드/작용제의 강화제를 선별하는 경우, 오스몰 농도에 대한 당의 역효과 등이 회피된다. 상기 칼슘 감각 수용체 이외에, 키메라 수용체에 대한 잠재적인 상대로 또한 간주될 수 있는 다른 클래스 C GPCR로부터의 세포 외 도메인은 대사성 글루타메이트 수용체(mGluR), GPRC형 수용체(즉 GPRC5 및 GPRC6a), V2R 페로몬 수용체, 및 GABA-B 수용체로부터의 세포 외 도메인을 포함한다. 상기 hCaSR 세포 외 도메인의 사용과 유사하게, 다른 클래스 C GPCR의 세포 외 도메인에 대한 리간드의 사용은 단맛 강화제의 선별에 있어서 당에 대한 또 다른 리간드의 사용을 잠재적으로 허용한다.
말단 절단된 미각 수용체를 수반하는 분석에 사용되는 세포
말단 절단된 미각 수용체에 대해서, 본 발명에 따른 선별 또는 분석에 유용한 세포는 T1R3을 함유하지 않는 세포이다. 형질감염된 또는 내생적인 T1R3은 T1R2-TMD의 작용제 반응 또는 또 다른 강화제에 의존하는 상기 반응의 변화를 측정하는 방법을 부정적으로 간섭할 수 있다. T1R3의 부재는 T1R2-TMD 활성화의 측정에 0의 배경을 제공하며, 따라서 관찰된 신호는 T1R2-TMD 활성에 직접 기여할 수 있다. 이는 T1R2-TMD를 특이적으로 조절하는 물질의 확인을 허용하며, T1R3은 단맛 및 감칠맛 이종이량체 모두의 부분이므로, 감칠맛 자극물질을 또한 포함할 수 있는 T1R3을 활성화시키는 물질을 제외시킨다.
적합한 진핵세포로는 T1R3을 함유하지 않는 진핵 세포, 예를 들어 비 제한적으로 포유동물 세포, 효모 세포, 또는 곤충 세포(Sf9 포함), 양서류 세포(멜라닌 세포 포함), 또는 카에노라브디티스(Caenorhabditis)(카에노라브디티스 엘레간스 포함)의 세포를 포함한 연충 세포가 있다. T1R3을 함유하지 않는 적합한 포유동물 세포는 예를 들어 비 제한적으로 COS 세포(Cos-1 및 Cos-7 포함), CHO 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293 티-렉스(T-Rex, 등록상표) 세포, 또는 다른 형질감염성 진핵 세포 주를 포함한다. T1R3을 함유하지 않는 적합한 세균 세포는 비 제한적으로 대장균(E. coli)을 포함한다.
CSR:T1R2 및/또는 CSR:T1R3 분석에 사용되는 세포
형질감염되거나 내생적인 T1R3 및 T1R2는 각각 CSR:T1R2 및/또는 CSR:T1R3의 작용제 반응, 또는 또 다른 강화제에 의존하는 상기 반응의 변화를 측정하는 방법을 부정적으로 간섭할 수 있다. T1R3 및 T1R2의 부재는 CSR:T1R2 및/또는 CSR:T1R3 활성화의 측정에 0의 배경을 제공하며, 따라서 관찰된 신호는 CSR:T1R2 및/또는 CSR:T1R3 활성에 직접 기여할 수 있다. 이는 CSR:T1R2 및/또는 CSR:T1R3을 특이적으로 조절하는 물질의 확인을 허용하며, T1R3은 단맛 및 감칠맛 이종이량체 모두의 부분이므로, T1R3의 경우에 감칠맛 자극물질을 또한 포함할 수 있는 야생형 T1R2 및 T1R3을 활성화시키는 물질을 제외시킨다.
내생적인 야생형 T1R2 및/또는 T1R3의 존재는 일부 배경 신호를 일으킬 것이며, 이는 바람직하지 못하다. 내생적인 T1R2 및/또는 T1R3을 갖는 세포는 여전히 충분하게 낮은 배경을 갖는 결과를 획득하는데 유용할 수 있지만, 보다 양호한 선택은 대개 상기 내생적인 T1R2 및 T1R3 수용체를 함유하지 않는 세포이다. 그러나 CSR:T1R2/T1R3 키메라 단백질을 사용하는 경우, 상기 세포는 상기 배경에 불리한 영향 없이 야생형 T1R3을 함유할 수 있다. 유사하게, T1R2/CSR:T1R3 키메라 단백질을 사용하는 경우, 상기 세포는 상기 배경에 불리한 영향 없이 야생형 T1R2를 함유할 수 있다.
하기에 나타내는 세포들은 내생/야생형 T1R3 또는 내생적인 야생형 T1R2를 함유하지 않으므로 특히 유용하다. 그러나, 또 다른 세포들도 또한 본 발명에 개시된 방법에 유용하다.
적합한 진핵 세포는 예를 들어 비 제한적으로 포유동물 세포, 효모 세포, 또는 곤충 세포(Sf9 포함), 양서류 세포(멜라닌 세포 포함), 또는 카에노라브디티스(Caenorhabditis)(카에노라브디티스 엘레간스 포함)의 세포를 포함한 연충 세포를 포함한다. 적합한 포유동물 세포는 예를 들어 비 제한적으로 COS 세포(Cos-1 및 Cos-7 포함), CHO 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293 티-렉스 세포, 또는 다른 형질감염성 진핵 세포 주를 포함한다. 적합한 세균 세포는 비 제한적으로 대장균을 포함한다.
세포를 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, GPCR 및 G-단백질(수용체를 포스포리파제 C 신호 전달 경로에 연결시킨다)로 일시적으로 또는 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 맛 GPCR에 향상된 커플링을 제공하는 상기 키메라 G-단백질 G 알파 16-더스트듀신 44를 사용하는 탁월한 이종 발현 시스템이 WO 2004/055048에 상세히 개시되어 있다(또한 G.sub.알파.16 거스트(듀신)44, G.sub.알파.16거스트(듀신)44, Gα16거스트(듀신)44, Ga16거스트(듀신)44, Gα16-거스트덕신 44로서, 또는 본 발명에서 하기에 사용된 바와 같은, "Gα16거스트44"로서 공지되어 있다). 한편으로, WO 2004/055048에 개시된 Gaq-거스트덕신을 기본으로 하는 다른 키메라 G-단백질, 또는 다른 G-단백질, 예를 들어 G16 또는 G15를 또한 사용할 수 있다.
상기 CSR:T1R을, 상기 수용체를 신호 전달 경로, 예를 들어 포스포리파제 G 신호 전달 경로, 또는 예를 들어 하기를 포함하는 신호 전달 경로에 연결시키는 G-단백질을 갖는 세포에서 발현시킬 수 있다: 아데닐레이트 사이클라제, 구아닐레이트 사이클라제, 포스포리파제 C, IP3, GTPase/GTP 결합, 아라키노산, cAMP/cGMP, DAG, 단백질 키나제 c(PKC), MAP 키나제 타이로신 키나제, 또는 ERK 키나제. 한편으로, 임의의 적합한 정보제공 유전자를 CSR:T1R-활성화 반응성 프로모터에 결합시키고 이를 사용하여 하기에 보다 상세히 개시하는 바와 같이, CSR:T1R 활성을 측정할 수 있다.
상술한 세포에 사용되는 벡터 구조물
상기와 같은 세포에서 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 및/또는 G-단백질을 발현하기 위한 벡터 구조물을 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응("PCR")을 사용하는 공지된 기법 또는 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 서열의 확인 후에, cDNA 단편을 적합한 벡터, 예를 들어 포유동물 세포의 경우 pcDNA3.1 포유동물 발현 벡터에 서브 클로닝하고, 상응하는 숙주 세포에 일시적으로 형질감염시켜 상기 유전자(들)의 정확한 발현을 가능하게 할 수 있다.
형질감염 후 기간, 예를 들어 48 시간 후에, 세포 용해물을 제조하고 상기 단백질의 정확한 발현을 확인하기 위해서 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 일단 정확한 단백질 발현이 확인되면, 적합한 세포, 예를 들어 HEK293T 세포 및 HEK 티-렉스를 포함하는 포유동물 세포를 당해 분야에 널리 공지된 기법에 따라 형질감염시켜 상기 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 생성시킬 수 있다.
한편으로, 다양한 비 포유동물 발현 벡터/숙주 시스템을 사용하여 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R G-단백질에 커플링된 수용체(GPCR)를 코딩하는 서열을 함유하고 발현시킬 수 있다. 상기 시스템으로는 예를 들어 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균을 포함하는 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들어 바큘로바이러스), 또는 세균 발현 벡터(예를 들어 pBR322 플라스미드)로 감염된 곤충 세포 시스템이 있다. 본 발명에서 상술한 시스템과 함께 사용될 수 있는 특정 벡터의 예들이 문헌[G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, edited by Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 1st ed., CRC Press-Boca Raton FL; September 1999]에 개시되어 있다.
세균 시스템에서, 다수의 클로닝 및 발현 벡터를, T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 목적으로 하는 용도에 따라 선택할 수 있다. 예를 들어 GPCR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 통상적인 클로닝, 서브 클로닝, 및 확대를 다작용성 대장균 벡터, 예를 들어 pBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla Calif.) 또는 pSPORT1 플라스미드(Life Technologies)를 사용하여 성취할 수 있다. GPCR을 코딩하는 서열의 상기 벡터의 다중 클로닝 부위 내로의 연결은 lacZ 유전자를 분열시켜, 재조합 분자를 함유하는 형질전환된 세균의 확인에 비색측정 선별 과정을 허용한다. 또한, 상기 벡터는 시험관 내 전사, 다이데옥시 서열화, 헬퍼 파지에 의한 단일 가닥 구제, 및 클로닝된 서열에서 네스티드 결실을 생성시키는데 유용할 수 있다. 다량의 GPCR이 필요한 경우, 예를 들어 항체의 생산을 위해서, 높은 수준의 GPCR 발현을 지향하는 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 강한 유도성 SP6 또는 T7 박테리오파지 프로모터를 함유하는 벡터를 사용할 수 있다.
효모 발현 시스템을 GPCR의 생산에 사용할 수 있다. 구성 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 알파 인자, 알콜 옥시다제, 및 PGH 프로모터를 함유하는 다수의 벡터들을 효모 사카로마이세스 세레비지아에 또는 피키아 파스토리스에 사용할 수 있다. 또한, 상기와 같은 벡터는 발현된 단백질의 분비 또는 세포 내 유지를 지향하며 안정한 증식을 위해 외부 서열을 숙주 게놈 내에 통합되게 할 수 있다.
곤충 세포 주에서 이종 단백질을 발현하기 위해, 예를 들어 레피도프테란 바큘로바이러스 또는 아우토그라파 칼리포르니카 멀티캡시드 뉴클레오-바이러스(AcMNPV)의 유도체를 사용할 수 있다. 상기 시스템에서, 외부 유전자 발현은 매우 강한 말기 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 또는 p10 프로모터에 의해 지향되며, 재조합 단백질의 발현 및 회수를 최적화하는 광범위한 벡터 배열을 입수할 수 있다. 상기 벡터는 막-결합된 단백질과 분비된 단백질을 모두 높은 수준으로 발현될 수 있게 하며, 또한 공지된 다수의 번역 후 변경, 예를 들어 N- 및 O-결합된 글리코실화, 인산화, 아실화, 단백질 분해 및 분비된 백신 성분이 포유동물 시스템에서 발생할 수 있게 한다. 다수의 벡터를 상업적으로 입수할 수 있다, 예를 들어 인섹트실렉트(InsectSelect, 등록상표) 시스템을 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수할 수 있다.
발현 시스템
목적하는 단백질(예를 들어 G-단백질 및 CSR:T1R 또는 T1R2-TMD)을 코딩하는 cDNA를 발현하기 위해서, 전형적으로는 적합한 cDNA를, 강한 프로모터를 함유하여 전사를 지향하는 발현 벡터, 전사/번역 종결자, 및 번역 개시를 위한 리보솜-결합 부위에 서브클로닝시킨다. 적합한 세균 프로모터, 예를 들어 대장균, 바실러스 종, 및 살모넬라가 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 상기와 같은 발현 시스템을 위한 키트를 상업적으로 입수할 수 있다. 유사하게, 포유동물 세포, 효모, 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템을 상업적으로 입수할 수 있다. 상기 진핵 발현 벡터는 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련된 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
상기 프로모터 이외에, 상기 발현 벡터는 전형적으로는 숙주 세포에서 단백질-코딩 핵산의 발현에 필요한 모든 추가적인 요소들을 함유하는 발현 카세트 또는 전사 유닛을 함유한다. 따라서 전형적인 발현 카세트는 전사물의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위, 및 번역 종결에 필요한 단백질 및 신호를 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 결합된 프로모터를 함유한다. 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 전형적으로는 막-표적화 신호, 예를 들어 래트 소마토스타틴-3 수용체 서열의 N-말단 45 아미노산에 결합하여 상기 재조합 단백질(세포 표면 수용체에 유용하다)의 효율적인 세포 표면 발현을 촉진한다. 추가적인 벡터 요소는 예를 들어 인헨서를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 또한 효율적인 종결을 제공하기 위해 상기 구조 유전자의 하부의 전사 종결 부위를 함유해야 한다. 상기 종결 부위를 상기 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 획득하거나 또는 상이한 유전자로부터 획득할 수 있다.
상기 단백질들의 발현을 위해서, 당해 분야에 널리 공지된 진핵 또는 원핵 세포에서의 발현에 통상적인 벡터를 사용할 수 있다. 벡터의 예로는 세균 발현 벡터, 예를 들어 pBR322-기재 플라스미드를 포함한 플라스미드, pSKF, 및 pET23D, 및 융합 발현 시스템, 예를 들어 GST 및 LacZ가 있다.
진핵세포 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 전형적으로는 진핵생물 발현 벡터, 예를 들어 SV40 벡터, 거대세포바이러스 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 및 엡스타인-바 바이러스로부터 유래된 벡터에 사용한다. 다른 전형적인 진핵생물 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE, pcDNA3.1, pIRES, 및 SV40 초기 프로모터, SV40 말기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유방종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵세포에서의 발현에 유효한 것으로 나타난 다른 프로모터의 지시 하에서 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다. 일부 발현 시스템은 유전자 증폭을 제공하는 마커, 예를 들어 티미딘 키나제, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 등을 갖는다.
발현 벡터에 전형적으로 포함되는 요소들은 또한 대장균에서 작용하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 함유하는 세균의 선택을 허용하는 약물 내성을 코딩하는 유전자, 및 진핵생물 서열의 삽입을 허용하는 상기 플라스미드의 불 필수 부위 중의 독특한 제한 부위를 포함할 수 있다. 상기 선택된 특정한 약물 내성은 중요하지 않다. 당해 분야에 공지된 다수의 약물 내성 유전자들 중 임의의 유전자가 적합하다. 경우에 따라 원핵생물 서열은 상기 서열이 진핵세포 중의 DNA의 복제를 방해하지 않도록 선택되며, 그의 벡터의 경우 원핵 및 진핵 세포 모두에서 사용될 것이다.
세균 시스템에서 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R cDNA 단편을 단독으로 또는 융합 단백질로서 발현시킬 수 있으며, 여기에서 관심 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 대장균 원형질막 주위 말토오스-결합 단백질(MBP)에 융합시키고, 이때 상기 MBP는 그의 신호 펩타이드를 포함하여 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R의 아미노 말단에 결합된다. 상기 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R cDNA, 또는 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 단백질 cDNA와의 MBP 융합물을 적합한 플라스미드, 예를 들어 pBR322에 서브 클로닝시키며, 여기에서 대장균 GPCR 발현은 lac 야생형 프로모터에 의해 구동된다. 대장균에서의 GPCR의 발현 방법은 예를 들어 문헌[G-Protein coupled receptors, Signal Transduction Series, edited by Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 1st ed., CRC Press-Boca Raton FL; September 1999]에 개시되어 있다.
내생적인 GPCR이 결여된 유전자 공학 효모 시스템 및 곤충 세포 시스템은 CSR:T1R 활성화 선별 또는 T1R2-TMD 활성화 선별에 0 배경의 이점을 제공한다. 유전자 공학 효모 시스템은 상기 내생적인 효모 페로몬 수용체 경로의 상응하는 성분 대신에 인간 GPCR 및 Gα 단백질을 사용한다. 하부의 신호전달 경로를 또한 상기 신호에 대한 통상적인 효모 반응이 선택성 배지 상에서 양의 증식으로 전환되거나 또는 정보제공 유전자 발현으로 전환되도록 변경시킨다(문헌[Broach, J.R. and J. Thorner, 1996, Nature, 384(supp.):14-16]에 개시됨). 유전자 공학 곤충 시스템은 수용체를 포스포리파제 C 신호전달 경로에 커플링될 수 있게 하는 인간 GPCR 및 Gα 단백질을 포함한다(예를 들어 문헌[Knight and Grigliatti, 2004, J. Receptors and Signal Transduction, 24:241-256]을 참조하시오). 양서류 세포 시스템, 특히 멜라닌 세포가 예를 들어 WO 92/01810에 개시되어 있으며, 이는 GPCR 발현 시스템을 개시한다.
T1R2 - TMD 또는 CSR : T1R 의 과발현
T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 강한 구성 프로모터, 예를 들어 CMV 초기 프로모터의 조절 하에 배치함으로써 과발현시킬 수 있다. 한편으로, 보존된 GPCR 아미노산 또는 아미노산 도메인의 몇몇 돌연변이를 도입시켜 상기 사용된 GPCR을 구성적으로 활성으로 만들 수 있다.
유도성 프로모터를 또한 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R의 발현을 지향, 조절 및 조정하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 비 제한적으로, 티-렉스 발현 시스템(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 사용할 수 있다. 상기 티-렉스 시스템은 대장균 Tn10-코딩된 테트라사이클린(Tet) 내성 오페론으로부터의 조절 요소를 사용하는 테트라사이클린-조절된 포유동물 발현 시스템이다. 상기 티-렉스 시스템에서의 테트라사이클린 조절은 Tet 리프레서에 대한 테트라사이클린의 결합 및 관심 유전자의 프로모터 조절 발현의 활성화를 기본으로 한다.
T1R2 - TMD 또는 CSR : T1R 발현 벡터 구조물의 세포에의 형질감염
표준 형질감염 방법을 사용하여 다량의 관심 단백질, 예를 들어 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 발현하는 세균, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포 주를 생성시킬 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에 도입시키기 위한 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 단지, 사용된 특정 유전자 공학 과정이 관심 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 관련 유전자를 성공적으로 도입시킬 수 있는 것이 필요할 뿐이다. 이러한 방법들은 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외부 유전자 물질을 숙주 세포에 도입시킴을 수반하며 칼슘 포스페이트 형질감염, 폴리브렌, 프로토플라스트 융합, 일렉트로포레이션, 리포솜, 미세주입, 원형질 벡터, 바이러스 벡터 등의 사용을 포함할 수 있다.
세포 배양
형질감염 후, 형질감염된 세포를 당해 분야에 널리 공지된 표준 배양 조건을 사용하여 배양할 수 있다. 상이한 세포는 적합한 온도 및 세포 배양 배지를 포함하여 상이한 배양 조건을 필요로 함은 숙련가에게 자명할 것이다.
T1R2 - TMD 또는 CSR : T1R 수용체 단백질 회수
경우에 따라, 표준 기법을 사용하여 세포 배양액으로부터 단백질을 회수할 수 있다. 예를 들어, 세포를 침전 및 크로마토그래피 단계(이의 성질 및 순서는 회수하려는 특정 재조합 물질에 따라 변할 것이다)를 가하기 전에 기계적으로 또는 삼투 쇼크에 의해 개방시킬 수 있다. 한편으로, 상기 재조합 단백질을 재조합 세포가 배양된 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 분석에 의해 확인될 수 있는 미각 조절제
T1R 수용체 활성의 조절제(리간드, 작용제, 부분 작용제, 길항물질, 역 작용제, 억제제, 강화제를 포함한 다양한 유형의 것)를 본 발명에 개시된 분석에 의해 확인할 수 있다. 조절제의 유형은 한 번에 한 가지 유형보다 많은 유형을 포함할 수 있으며, 농도에 따라 변할 수 있다. 예를 들어 물질은 일정 농도 범위에서 작용제로서 작용할 수 있지만, 또 다른 농도 범위에서는 또 다른 작용제(예를 들어 감미료 또는 당)의 강화제로서 작용할 수 있다. 따라서, 물질들을 상이한 농도에서 시험하여 이들의 조절제 활성을 측정해야 한다. 이제 본 발명에 개시된 방법에서 확인될 수 있는 물질의 정의가 이어진다.
강화제는 하기 중 하나 이상의 증가를 유발하는 물질이다: 수용체의 세포 표면 발현, 리간드와 수용체의 결합, 리간드-유도된 수용체 활성, 또는 상기 수용체의 활성 형태에 의해 개시되는 세포 내 반응(작용 물질의 존재 또는 부재 하에서). 억제제는 하기 중 한 이상의 감소를 유발하는 물질이다: 수용체의 세포 표면 발현, 리간드와 수용체의 결합, 리간드-유도된 수용체 활성, 또는 상기 수용체의 활성 형태에 의해 개시되는 세포 내 반응(작용 물질의 존재 또는 부재 하에서). 상기 강화제는 그 자신이 상기 수용체에 결합하고, 상기 수용체를 활성화시키며 이에 의해 세포 반응의 증가를 조절하는 작용제일 수 있다.
강화제는 다양한 유형의 화합물, 예를 들어 소 분자, 펩타이드, 단백질, 핵산, 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 이들은 다양한 출처, 예를 들어 동물, 포유동물, 곤충, 식물, 세균 또는 진균 세포 물질 또는 배양 세포, 또는 상기와 같은 세포의 처리된 배지로부터의 합성 또는 천연, 천연 물질의 추출물로부터 유도될 수 있다.
리간드는 상기 수용체에 결합하는 물질이며, 작용제, 부분 작용제, 강화제, 억제제, 길항물질 또는 역 작용제일 수 있다. 작용제는 상기 수용체를 활성화시키고 상기 작용제 부재 하에서의 세포 내 반응에 비해 수용체에 결합 시 세포 내 반응을 증가시키는 T1R 수용체의 리간드이다. 추가로 또는 한편으로, 작용제는 수용체의 세포 표면 발현이 작용제의 부재 하에 세포의 표면상에 존재하는 세포 표면 수용체의 수에 비해 증가하도록 세포 표면 수용체의 내면화를 감소시킬 수 있다. T1R의 작용제는 예를 들어 칼슘, p-에톡시벤즈알데하이드, 페릴라틴, 사이클라메이트, NDHC, 및 신나모나이트릴을 포함한다. 상기 CSR:T1R 키메라 단백질의 리간드는 CSR-도메인-리간드(예를 들어 칼슘) 및 TAS1R-도메인 리간드(예를 들어 T1R2 또는 T1R3 경막 도메인에 결합하는 단맛 강화제 후보)를 포함한다.
부분 작용제는 상기 수용체를 최대로 활성화시키는 다른 작용제에 비해 상기 수용체를 단지 부분적으로 활성화시키는 작용제이다. 길항물질은 작용제와 동일한(경쟁적 길항물질) 또는 상이한 부위(알로스테릭 길항물질)에서 상기 수용체에 결합하지만, 수용체의 활성 형태에 의해 개시되는 세포 내 반응을 활성화시키지 않고, 이에 의해 작용제의 존재 및 길항물질의 부재 하에서의 세포 내 반응에 비해 작용제에 의해 유도된 세포 내 반응을 억제하는 리간드이다. 수용체에 결합하는 역 작용제는 상기 역 작용제 부재 하에서의 세포 내 반응에 비해 수용체에 의해 매개된 구성적 세포 내 반응을 감소시킨다. 억제제는 상기 억제제 부재 하에서의 작용제의 결합에 비해 상기 수용체에 대한 작용제의 결합을 감소시키고/시키거나 작용제에 의해 유도된 세포 내 반응을 감소시킨다.
리간드와 결합하고 예를 들어 G-단백질을 통해 신호를 전달하는 수용체의 활성 또는 활성 변화(즉 강화제와의 상이한 상호작용으로 인해)를 본 발명에서 하기에 개시하는 분석에 의해 측정할 수 있다.
T1R2 - TMD 또는 CSR : T1R 수용체의 강화제를 확인하기 위한 분석
강화제를 광범위하게 다양한 시험관 내 및 생체 내 분석을 사용하여, 또는 한편으로 결합 분석에 의해 확인하여 작용 효과/매개변수를 측정하고 비교할 수 있다. 상기 수용체의 작용에 대한 시험 물질의 효과를 적합한 작용 매개변수들을 조사하여 측정할 수 있다. 수용체 활성에 의해 영향을 받는 임의의 생리 변화를 사용하여 강화제를 확인할 수 있다.
상기와 같은 작용 분석, 예를 들어 동물로부터 단리된 완전 세포 또는 조직을 사용하고 2 차 메신저(예를 들어 세포 내 칼슘(Ca2+), cAMP, cGMP, 이노시톨 포스페이트(IP3), 다이아실글리세롤/DAG, 아라키노이드산, MAP 키나제 또는 타이로신 키나제 포함), 이온 흐름, 인산화 수준, 전사 수준, 신경전달물질 수준의 농도, 활성 또는 변화를 측정함을 기본으로 하는 분석, 및 GTP-결합, GTPase, 아데닐레이트 사이클라제, 인지질-파괴, 다이아실글리세롤, 이노시톨 트라이포스페이트, 아라키돈산 방출, PKC, 키나제 및 전사 정보제공인자에 근거한 분석은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일부 적합한 분석들이 예를 들어 WO 01/18050에 개시되어 있다.
수용체 활성화는 전형적으로는 후속의 세포 내 사건들을 개시한다, 예를 들어 2 차 메신저, 예를 들어 칼슘 이온의 세포 내 저장물을 방출하는 IP3를 증가시킨다. 일부 G-단백질에 커플링된 수용체의 활성화는 포스파티딜이노시톨의 포스포리파제 C-매개된 가수분해를 통해 이노시톨 트라이포스페이트(IP3)의 형성을 자극한다. 차례로 IP3는 세포 내 칼슘 이온 저장물의 방출을 자극한다. 따라서, 세포질 칼슘 이온 수준의 변화, 또는 2 차 메신저 수준, 예를 들어 IP3의 변화를 사용하여 G-단백질에 커플링된 수용체 활성을 측정할 수 있다. 모든 작용 분석을 예를 들어 세포 표면 또는 단리된 세포막 분획 상에서 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 샘플들을 사용하여 수행할 수 있다. 유용한 세포는 본 발명에서 상기에 개시되어 있다. 또한, 예를 들어 트랜스제닉 동물의 조직을 사용할 수도 있다.
작용제 자체가 아닌 강화제(예를 들어 대신에 상기는 길항물질, 부분 작용제, 역 작용제, 억제제 또는 강화제이다)를 확인하기 위해서, 작용제를 함유하는 시험 물질이 있는 샘플과 없는 샘플을 비교한다. 상기 수용체가 CSR:T1R인 경우, 작용제로서, 예를 들어 칼슘을 사용할 수 있다. 칼슘을 사용하는 것은 상기 두 TMD를 모두 입수할 수 있을 것이라는 이점을 갖는다. 다른 공지되거나 확인된 작용제, 예를 들어 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 사이클라메이트, 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC), 및 신나모나이트릴을 또한 사용할 수 있다. 그러나, 이들은 추정적인 강화제의 강화제 결합 부위와 일치할 수 있는 리간드/작용제 결합 부위를 부분적으로 차지할 것이며 보다 낮은 신호를 유발할 수 있다. 예를 들어 대조군(작용제는 있지만 강화제는 없는)을 100의 상대 수용체 활성 값으로 정한다. 상기 대조군에 대한 활성 감소는 억제제, 길항물질 또는 역 작용제를 확인하는 반면, 증가는 강화제를 확인한다. 예를 들어 10% 이상(또는 임의의 통계학적 유의수준 차이)의 측정된 활성의 증가 또는 감소를, 시험 물질이 없는 샘플에 비해 시험 물질이 있는 샘플에서; 또는 시험 물질은 있지만 세포가 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 발현하지 않는 대조용 샘플(목(mock) 형질감염된 세포)에 비해 시험 물질이 있는 샘플에서 유의수준으로 간주할 수 있다.
작용제 또는 부분 작용제의 확인
VFT 도메인에 결합하지 않는 작용제 또는 부분 작용제를 확인하기 위해서, 시험 물질이 있는 샘플을 작용제(예를 들어 염화 칼슘(수용체가 CSR:T1R인 경우), 페릴라틴, 사이클라메이트, 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC), 신나모나이트릴, 또는 또 다른 확인된 리간드/작용제)이 있는 양성 대조군과 비교한다. 한편으로/추가로, 시험 물질이 있는 샘플과 없는 샘플을 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 키메라 단백질에 대한 이들의 활성에 대해서 비교한다. 예를 들어, 작용제 또는 부분 작용제는 상기 작용제 또는 부분 작용제가 100 mM 이하로 존재하는 경우, 예를 들어 상기 물질에 필적할만하거나 그 이상인 최대 생물 활성을 가질 수 있는 경우 양성 대조용 단맛 작용제의 최대 생물 활성의 10% 이상에 상응하는 생물 활성을 가질 것이다. 최대 생물 활성은 주어진 수용체 분석 포맷 내에서 성취될 수 있는 작용제, 예를 들어 염화 칼슘, 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 사이클라메이트, 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC), 신나모나이트릴에 대한 최대로 성취 가능한 수용체 반응으로서 정의되며, 상기 반응은 동일한 작용제의 농도를 증가시킨다 하더라도 추가로 증가하지 못한다.
상기 언급한 작용제는 상이한 농도에서, 또한 상기 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 키메라 단백질의 작용제의 강화제로서 작용할 수 있다. 이를, 상기 작용제-시험 물질을 단맛 강화 효과를 가리키는 신호에 대해서 시험하기 위해서 칼슘 또는 다른 작용제를 사용함으로써 선별 방법에서 시험할 수 있다. 한편으로, 시험 물질이 있는 샘플에서 예를 들어 10% 이상의 측정된 활성의 증가를 상기 시험 물질이 없는 샘플과 비교하거나 또는 시험 물질은 있지만 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 발현하지 않는 세포(목 형질감염된 세포)를 기본으로 하는 샘플과 비교한다. 길항물질을 확인하기 위해서, 시험 물질이 있고 없는 공지된 작용제의 존재 하에서 수용체 활성을 비교한다. 길항물질은 예를 들어 10% 이상까지 작용제-자극된 수용체 활성의 감소를 보인다. 역 작용제를 확인하기 위해서, 시험 물질이 있고 없는 수용체 활성을 본 발명에서 상기 개시한 바와 같은 수용체를 과발현하는 동물/세포/막을 포함하는 샘플에서 비교한다. 역 작용제는 예를 들어 10% 이상까지 상기 수용체의 구성 활성의 감소를 나타낸다.
다수의 스크린은 칼슘 활성에 의존하며, 이를 위해서 칼슘이 낮은 완충 시스템을 사용하여 세포, 수용체, 효소 또는 정보제공 유전자의 비특이적인 자극을 피해야 한다. 세포질 이온 농도 또는 막 전압의 변화를 검출하기 위해서, 문헌[G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, edited by Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 1st ed., CRC Press-Boca Raton FL; September 1999]에 상세히 개시된 바와 같이, 세포에 이온 민감성 염료를 부하하여 수용체 활성을 보고할 수 있다. 상기 세포질 중의 이온 농도 또는 막 전압의 변화를 각각 이온 민감성 또는 막 전압 형광 지시기를 사용하여 측정한다. 상술한 분석에서 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 수용체 활성을 측정하는 적합한 검출 방법들의 다양한 예는 하기와 같다.
칼슘 흐름 분석
GPCR의 활성화에 의해 유도된 세포 내 칼슘 방출을 칼슘에 결합하는 세포-불변 염료를 사용하여 검출한다. 상기 칼슘-결합된 염료는 세포 내 칼슘 상승에 비례하는 형광 신호를 발생시킨다. 상기 방법은 수용체 활성의 빠르고 정량적인 측정을 허용한다.
사용된 세포는 상술한 포스포리파제 C 경로에의 커플링을 허용하는 G-단백질 및 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R GPCR을 동시 발현하는 형질감염된 세포이다. 음성 대조군은 상기 후보 화합물의 가능한 비 특이적 효과를 배제시키기 위해서, T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 발현하지 않는(목 형질감염된) 세포 또는 그의 막을 포함한다. 상기 칼슘 흐름 검출 프로토콜은 문헌[G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, edited by Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 1st ed., CRC Press-Boca Raton FL; September 1999]에 개시되어 있으며, 적합한 버전을 하기에 요약한다:
제 0 일: 96-웰 플레이트를 웰당 8500 세포로 시딩하고 영양 생육 배지에서 37 ℃에서 밤새 유지시킨다.
제 1 일: 세포를 웰 당 150 ng의 GPCR DNA 및 0.3 ㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 영양 생육 배지에서 37 ℃에서 밤새 유지시킨다.
제 2 일: 생육 배지를 버리고, 세포를 37 ℃에서 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.5 mM CaCl2, 및 10 mM 글루코스(pH 7.4)를 함유하는 환원된 칼슘 C1 완충 용액(표준 C1 완충 제형에 대해서 하기 실시예 1 참조)에 용해된 1.5 μM 플루오-4 AM(몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)) 및 2.5 μM 프로베니시드로 이루어진 칼슘 분석 용액 50 ㎕와 함께 1 시간 동안(실온에서 암실 중에서) 배양한다. 상기 환원된 칼슘 C1 완충액 125 ㎕를 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 암실에서 실온에서 30 분간 추가로 배양한다. 완충 용액을 버리고 플레이트를 세척 완충액으로서 환원된 칼슘 C1 완충액 100 ㎕로 5 회 세척하고 세포를 환원된 칼슘 C1 완충액 200 ㎕에 재조성한다. 이어서 상기 플레이트를 형광 미세플레이트 판독기, 예를 들어 플렉스스테이션(Flexstation, 몰레큘러 다바이시즈(Molecular Devices)) 또는 FLIPR(형광 상 플레이트 판독기, 몰레큘러 디바이시즈)에 놓고 수용체 활성화를 10X 농축된 리간드 모액 20 ㎕의 첨가에 따라 개시시킨다. 리간드 첨가 전 15 초 동안 및 리간드 첨가 후 45 내지 110 초 동안 형광을 연속적으로 모니터한다. 수용체 활성화 수준을 2 개의 하기 식에 의해 한정한다: 활성화 % = ((최대 형광도 - 기준 형광도)/기준 형광도) * 100, 또는 형광 증가 = 최대 형광도 - 기준 형광도(여기에서 기준 형광도는 리간드 첨가 전의 평균 형광도를 나타낸다). 한편으로, 수용체 활성화를 기준선 형광(F0)으로 표준화시킨 피크 형광(F)의 증가에 의해 측정할 수 있다. 데이터를 하기 식을 사용하여 표준화한다: ΔF/F = (F-F0)/F0(여기에서 F는 피크 형광도 신호이고, F0는 기준 형광도 신호이며, 상기 기준 형광도는 리간드 첨가 전 처음 10 내지 15 초 동안 계산된 평균 형광도를 나타낸다).
유용한 세포는 비 제한적으로 본 발명에서 상술한 바와 같은 포유동물 세포, 예를 들어 HEK293T 세포 또는 HEK293 티-렉스 세포이다. 세포를 GPCR 및 G-단백질로 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이 일시적으로 또는 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 탁월한 이종 발현 시스템이 WO 2004/055048에 상세히 개시되어 있다. 칼슘 흐름 분석을 예를 들어 본 발명에서 하기 실시예 1에 개시한 바와 같이 수행할 수 있다. 강화제의 확인을 하기의 변경을 가하여 상술한 바와 같이 수행한다. 신호들을 작용제의 존재 하에서, 그러나 시험 물질의 부재 하에서 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 발현하는 재조합 세포로부터 획득한 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 활성의 기준 수준과 비교한다. T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 활성의 증가 또는 감소, 예를 들어 임의의 통계학적 유의수준의 활성의 증가, 예를 들어 비 제한적으로 10%, 20%, 50%, 또는 100% 이상의 증가는 강화제를 확인한다. 한편으로, 상기 확인은 형광 강도의 통계학적 유의수준의 증가 또는 감소, 예를 들어 비 제한적으로, 강화제가 없는 샘플과 비교 시 또는 강화제는 있으나 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포(목 형질감염된 세포) 중의 샘플과 비교 시, 10% 이상의 증가 또는 감소를 포함한다.
아데닐레이트 사이클라제 활성
아데닐레이트 사이클라제 활성에 대한 분석을 예를 들어 문헌[Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20:585-591]에 상세히 개시된 바와 같이 수행한다. 반응 혼합물을 대개는 37 ℃에서 10 분 미만으로 배양한다. 배양에 이어서, 반응 혼합물을 0.9 ㎖의 저온 6% 트라이클로로아세트산의 첨가에 의해 단백질 제거한다. 튜브를 원심분리시키고 각 상등액 용액을 다우엑스(Dowex) AG50W-X4 컬럼에 가한다. 상기 작용제에 의한 수용체 활성화에 이어서 발생한 cAMP 수준을 측정하기 위해서 0.1 mM 이미다졸-HCl(pH 7.5) 4 ㎖을 사용하여 카운팅 바이알에 상기 컬럼으로부터 cAMP 분획을 용출시킨다. 대조용 반응들을 또한 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포로부터의 단백질 균질물을 사용하여 수행해야 한다.
IP 3 / Ca 2 + 신호
G-단백질을 발현하는 세포에서, 이노시톨 트라이포스페이트(IP3)/Ca2 +에 상응하는 신호 및 이에 의한 수용체 활성을 형광을 사용하여 검출할 수 있다. GPCR을 발현하는 세포는 2 개의 세포 내 저장물 모두로부터의 기여의 결과로서 및 이온 채널의 활성화를 통해 증가된 세포질 칼슘 수준을 나타낼 수 있으며, 이 경우 필요하지는 않지만, 경우에 따라 EDTA와 같은 킬레이트제가 보충된 무 칼슘 완충액 중에서 상기와 같은 분석을 수행하여 내부 저장소로부터의 칼슘 방출로부터 생성되는 형광 반응을 식별하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어 문헌[G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, edited by Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 1st ed., CRC Press-Boca Raton FL; September 1999]을 참조하시오).
포스포리파제 C/세포 내 Ca 2 + 신호
T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을, 상기 수용체를 포스포리파제 C 신호 전달 경로에 연결시키는 G-단백질을 갖는 세포에서 발현시킨다. 세포 내 Ca2 + 농도의 변화를 예를 들어 형광 Ca2 + 지시 염료 및/또는 형광측정 영상을 사용하여 측정한다(문헌[G-protein coupled receptors, Signal Transduction Series, edited by Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 1st ed., CRC Press-Boca Raton FL; September 1999]을 참조하시오).
GTPase / GTP 결합
T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 포함하는 GPCR에 대해서, 수용체 활성의 척도는 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 함유하는 세포막에 의한 GTP의 결합이다. 상기 방법은 표지된 GTP의 결합을 검출함으로써 막에 대한 G-단백질 커플링을 측정한다. 상기 수용체를 발현하는 세포로부터 단리된 막을 35S-GTPγS 및 표지되지 않은 GDP를 함유하는 완충액에서 배양한다. 활성 GTPase는 상기 표지를 무기 포스페이트로서 방출하며, 이는 20 mM H3PO4 중의 활성탄 5% 현탁액 중의 유리 무기 포스페이트의 분리에 이어서 섬광 카운팅에 의해 검출된다. 상기 혼합물을 배양하고 결합되지 않은 표지된 GTP를 GF/B 필터 상으로의 여과에 의해 제거한다. 결합되고 표지된 GTP를 액체 섬광 카운팅에 의해 측정한다. 대조군은 상기 시험 물질의 가능한 비 특이적인 효과를 배제하기 위해서, T1R2-TMD 또는 CSR:T1R를 발현하지 않는(목 형질감염된) 세포로부터 단리된 막을 사용하는 분석을 포함한다. 상기 방법은 문헌[Traynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol., 47:848-854]에 상세히 개시되어 있다.
강화제 또는 억제제를 확인하기 위해서는, 본 발명에서 상기 개시한 바와 같이, GTP 결합 또는 GTPase 활성의, 예를 들어 10% 이상의 통계학적 유의수준의 변화(증가 또는 감소)면 대개 충분하다. 그러나, 작용제를 확인하기 위해서는, 본 발명에서 상기 개시한 분석을 하기의 변경을 가하여 수행한다. 상기 화합물이 100 mM 이하로 존재할 때, 예를 들어 10 내지 500 μM의 범위 내로, 예를 들어 약 100 μM으로 존재할 때 상기 활성이 공지된 작용제(예를 들어 페릴라틴) 활성의 약 50%인 경우, 또는 상기 화합물이 공지된 작용제에 의해 유도되는 것과 동일하거나 이보다 높은 수준을 유도하는 경우, 물질을 작용제로서 확인한다.
마이크로 생리 측정기 또는 바이오센서
상기와 같은 분석을 문헌[Hafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15:149-158]에 상세히 개시된 바와 같이 수행할 수 있다.
아라키노이드 산
아라키노이드 산의 세포 내 수준을 수용체 활성의 지표로서 사용한다. 상기와 같은 방법은 문헌[Gijon et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:20146-20156]에 상세히 개시되어 있다.
cAMP / cGMP
세포 내 또는 세포 외 cAMP를 예를 들어 문헌[Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41:91-105]에 개시된 바와 같이 cAMP 방사능면역분석(RIA) 또는 cAMP 결합 단백질을 사용하여 측정할 수 있다. cAMP 측정용의 다수의 키트들, 예를 들어 고 효율 형광 편광 기재 동종 분석(LJL Biosystems and NEN Life Science Products)을 상업적으로 입수할 수 있다. 한편으로, cGMP의 세포 내 또는 세포 외 수준을 예를 들어 면역분석을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Felley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol., 11:159-164(1994)]에 개시된 방법을 사용하여 cGMP의 수준을 측정할 수 있다. 한편으로, US 4,115,538에 개시된 cAMP 및/또는 cGMP 측정용 분석 키트를 사용할 수 있다. 시험 물질의 가능한 비 특이적인 영향을 배제하기 위해서 목 형질감염된 세포 또는 그의 추출물을 갖는 음성 대조군을 사용할 수 있다.
DAG / IP 3
수용체 활성에 의해 유발된, 인지질 파괴에 의해 방출되는 2 차 메신저 다이아실글리세롤(DAG) 및/또는 이노시톨 트라이포스페이트(IP3)를 예를 들어 문헌[Phospholipid Signaling Protocols, edited by Ian M. Bird, Totowa, N.J., Humana Press, 1998]에 개시된 바와 같이 검출할 수 있으며 GPCR(T1R2-TMD 또는 CSR:T1R) 활성의 지표로서 사용할 수 있다. 예를 들어 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 및 CisBio 인터내셔널로부터 상업적으로 입수할 수 있는, 이노시톨 트라이포스페이트의 측정을 위한 키트를 또한 사용할 수 있다. 시험 물질의 가능한 비 특이적인 영향을 배제시키기 위해서 목 형질감염된 세포 또는 그의 추출물을 갖는 음성 대조군을 사용할 수 있다.
PKC 활성
성장 인자 수용체 타이로신 키나제는 인지질- 및 칼슘-활성화된 단백질 키나제의 계열인 단백질 키나제 C(PKC)의 활성화를 수반하는 경로를 통해 신호할 수 있다. PKC에 의해 유도된 유전사 산물의 증가는 PKC 활성화를 나타내고 이에 의해 수용체 활성을 나타낸다. 상기 유전자 산물은 예를 들어 원 종양유전자 전사 인자 코딩 유전자(c-fos, c-myc 및 c-jun 포함), 프로테아제, 프로테아제 억제제(콜라게나제 I형 및 플라스미노겐 활성화제 억제제 포함), 및 유착 분자(세포 내 유착 분자 I(ICAM I) 포함)를 포함한다. PKC 활성을 문헌[Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem., 257:13341]에 개시된 바와 같이 직접 측정할 수 있으며, 여기에서 포스포셀룰로스 페이퍼에 결합시킴으로써 후속적으로 분리되는 PKC 기질 펩타이드의 인산화를 측정한다. 이를 사용하여 정제된 키나제의 활성 또는 조 세포 추출물 중의 활성을 측정할 수 있다. 단백질 키나제 C 샘플을 상기 분석 바로 전에 20 mM HEPES/2 mM DTT로 희석할 수 있다. 또 다른 분석을 판베라(PanVera)에 의해 상업적으로 입수할 수 있는 단백질 키나제 C 분석 키트를 사용하여 수행할 수 있다.
상술한 PKC 분석을 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R을 발현하는 세포로부터 추출물 상에서 수행한다. 활성을 또한 PKC 활성화에 의해 활성화된 유전자의 조절 서열에 의해 구동된 정보제공 유전자 구조물의 사용을 통해 측정할 수 있다. 시험 물질의 가능한 비특이적인 영향을 배제시키기 위해서 목 형질감염된 세포 또는 그의 추출물을 갖는 음성 대조군을 사용할 수 있다.
MAP 키나제 활성
MAP 키나제 활성을 상업적으로 입수할 수 있는 키트, 예를 들어 p38 MAP 키나제 분석 키트(New England Biolabs) 또는 플래시플레이트(FlashPlate, 등록상표) MAP 키나제 분석(Perkin-Elmer Life Sciences)을 사용하여 측정할 수 있다. Gq 및 Gi 커플링된 GPCR을 발현하는 세포를 사용하는 경우 p42/44 MAP 키나제 또는 ERK1/2를 측정하여 GPCR(CSR:T1R) 활성을 나타낼 수 있으며, ERK1/2 분석 키트를 TGR 바이오사이언스로부터 상업적으로 입수할 수 있고, 상기 키트는 GPCR 활성화에 따른 내생적인 ERK1/2 키나제의 인산화를 측정한다. 공지된 합성 또는 천연 타이로신 키나제 기질 및 표지된 포스페이트를 통한 타이로신 키나제 활성의 직접적인 측정은 널리 공지되어 있으며 또한 사용될 수 있고; 다른 유형의 키나제들(예를 들어 세린/쓰레오닌 키나제)의 활성을 유사하게 측정할 수 있다.
모든 키나제 분석을 정제된 키나제 또는 하나 이상의 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 폴리펩타이드를 발현하는 세포로부터 제조된 조 추출물을 사용하여 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 키나제의 기질은 상기 기질을 나타내는 전장 단백질 또는 합성 펩타이드일 수 있다. 문헌[Pinna & Ruzzene, 1996, Biochem. Biophys. Acta 1314:191-225]은 키나제 활성의 검출에 유용한 다수의 인산화 기질 부위를 나열한다. 다수의 키나제 기질 펩타이드를 상업적으로 입수할 수 있다. 특히 유용한 것은 다수의 수용체 및 비 수용체 타이로신 키나제에 대한 기질인 "Src-관련된 펩타이드", RRLIEDAEYAARG(시그마(Sigma)로부터 상업적으로 입수할 수 있다)이다. 일부 방법은 필터에 대한 펩타이드 기질의 결합을 요하며, 이때 상기 펩타이드 기질은 결합을 촉진하기 위해 순 양 전하를 가져야 한다. 일반적으로, 펩타이드 기질은 2 개 이상의 염기성 잔기 및 유리 아미노 말단을 가져야 한다. 반응은 일반적으로 0.7 내지 1.5 mM의 펩타이드 농도를 사용한다. 시험 물질의 가능한 비특이적인 영향을 배제시키기 위해서 목 형질감염된 세포 또는 그의 추출물을 갖는 음성 대조군을 사용할 수 있다.
전사 정보제공인자 / T1R - TMD 또는 CSR : T1R -반응성 프로모터/정보제공 유전자 분석
정보제공 유전자 분석에 의한 강화제의 확인을 위해서, 예를 들어 정보제공 유전자 발현의 100% 증가가 중요하다. 작용제는 시험 물질 부재 하에서보다 상기 시험 물질 존재 하에서 정보제공 유전자 발현을 예를 들어 100%, 500% 또는 1000% 이상 자극한다. 상기 세포 내 신호는 움직임 중 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 세트에 대한 작용제의 결합, 세포 내 사건의 캐스케이드에 의해 개시되며, 그의 최종적인 결과는 하나 이상의 유전자의 전사 또는 번역의 빠르고 검출 가능한 변화이다. 따라서 상기 수용체의 활성을, T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 활성화에 반응성인 프로모터에 의해 구동되는 정보제공 유전자의 발현을 측정함으로써 측정할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "프로모터"는 기본 프로모터, 인헨서 및 정보제공인자-조절된 발현에 필요한 전사-인자 결합 부위 중 하나 이상을 포함하는, 유전자 발현의 정보제공인자-매개된 조절에 필요한 하나 이상의 전사 조절 요소 또는 서열이다. T1R2-TMD 또는 CSR:T1R에 대한 작용제 결합으로부터 생성되는 세포 내 신호에 반응성인 프로모터를 선택하고 이를 쉽게 검출할 수 있고 측정할 수 있는 발현 또는 유전자 산물 활성을 갖는 상응하는 프로모터-조절된 정보제공 유전자에 작동적으로 결합시킨다.
정보제공 유전자를 예를 들어 루시페린, CAT, GFP, β-락타마제, β-갈락토시다제, 및 소위 "조기반응" 유전자, c-fos 원 종양유전자, 전사 인자 CREB, 혈관작용성 장 펩타이드(VIP) 유전자, 소마토스타틴 유전자, 프로엔케팔린 유전자, 포스포에놀피루베이트 카복시-키나제(PEPCK) 유전자, NF-κB에 반응성인 유전자, 및 AP-1-반응성 유전자(Fos 및 Jun에 대한 유전자, Fos-관련된 항원(Fra) 1 및 2, IκBα, 오르니틴 데카복실라제, 및 아넥신 I 및 II 포함) 중에서 선택할 수 있다. 프로모터를, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 상기 선택된 정보제공 유전자에 따라 선택할 것이다. 루시페라제, CAT, GFP, β-락타마제, β-갈락토시다제 및 이들의 생성물 검출용 분석은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 추가의 정보제공 유전자의 예를 본 발명에서 하기에 개시한다.
"조기반응" 유전자가 적합하며 빠르게 유도된다(예를 들어 상기 정보제공인자와 효과기 단백질 또는 리간드 간의 접촉 수분 내에). 정보제공 유전자에서 바람직한 성질은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 리간드 결합에 대한 빠른 반응성, 무활동 세포에서 낮거나 검출할 수 없는 발현; 새로운 단백질 합성의 일시적이고 독립적인 유도; 새로운 단백질 합성을 필요로 하는 후속의 전사 중단; 및 수 분 내지 수 시간의 짧은 반감기를 갖는 상기 유전자들로부터 전사된 mRNA. 유사하게, 상기 프로모터는 바람직하게는 상기 성질들 중 하나, 여러 개 또는 전부를 갖는다.
상기 c-fos 원 종양유전자는 다수의 상이한 자극에 반응성이고 빠른 유도를 갖는 유전자의 일례이다. 상기 c-fos 조절 요소는 전사 개시에 필요한 TATA 상자; 기본 전사를 위한 2 개의 상위 요소, 및 한 쌍의 대칭을 갖는 요소를 포함하고 TPA, 혈청, EGF 및 PMA에 의한 유도에 필요한 인헨서를 포함한다. 상기 c-fos mRNA 캡 부위로부터 상위 -317과 -298 사이에 위치한 20 bp c-fos 전사 인헨서 요소는 혈청 고갈된 NIH 3T3 세포에서 혈청 유도에 필수적이다. 상기 2 개의 상위 요소들 중 하나는 -63 내지 -57에 위치하며 cAMP 조절을 위한 컨센서스 서열을 닮는다.
전사 인자 CREB(환상 AMP 반응성 요소 결합 단백질)는 세포 내 cAMP의 수준에 반응성이다. 따라서, cAMP 수준의 조절을 통해 신호하는 수용체의 활성화를 상기 전사 인자의 결합, 또는 CREB-결합 요소(CRE, 또는 cAMP 반응 요소라 칭함)에 결합된 정보제공 유전자의 발현을 검출함으로써 측정할 수 있다. 상기 CRE의 DNA 서열은 TGACGTCA이다. CREB 결합 활성에 반응성인 정보제공인자 구조물은 US 5,919,649에 개시되어 있다.
다른 적합한 정보제공 유전자 및 그의 프로모터는 혈관작용성 장 펩타이드(VIP) 유전자 및 그의 프로모터(cAMP 반응성이다); 소마토스타틴 유전자 및 그의 프로모터(cAMP 반응성이다); 프로엔케팔린 및 그의 프로모터(cAMP, 니코틴 작용제 및 포볼 에스터에 반응성이다); 및 포스포에놀피루베이트 카복시-키나제(PEPCK) 유전자 및 그의 프로모터(cAMP 반응성이다)를 포함한다. GPCR 활성의 변화에 반응성인 정보제공 유전자 및 그의 프로모터의 추가적인 예로는 AP-1 전사 인자 및 NF-κB가 있다. 상기 AP-1 프로모터는 팔린드롬 TGA(C/G)TCA인 컨센서스 AP-1 결합 부위를 특징으로 한다. 상기 AP-1 부위는 또한 포볼 에스터 12-O-테트라데카노일포볼-β-아세테이트(TPA)를 포함하는 종양 프로모터에 의한 유도를 매개하는데 기여하며, 따라서 때때로 TPA-반응성 요소의 경우 TRE라 칭한다. AP-1은 성장 자극에 대한 세포의 조기 반응에 관여하는 다수의 유전자들을 활성화시킨다. AP-1 반응성 유전자의 예로는 Fos 및 Jun(상기 단백질들 자체가 AP-1 활성을 구성한다), Fos-관련된 항원(Fra) 1 및 2, IκBα, 오르니틴 데카복실라제, 및 아넥신 I 및 II가 있다.
상기 NF-κB 프로모터/결합 요소는 컨센서스 서열 GGGGACTTTCC를 갖는다. 다수의 유전자가 NF-κB 반응성으로서 확인되었으며, 그의 조절 요소들을 정보제공 유전자에 결합시켜 GPCR 활성을 모니터할 수 있다. NF-κB에 반응성인 유전자는 예를 들어 IL-1β, TNF-α, CCR5, P-선택, Fas 리간드, GM-CSF 및 IκBα를 코딩하는 것들을 포함한다. NF-κB-반응성 정보제공인자를 코딩하는 벡터는 당해 분야에 공지되어 있거나 또는 당해 분야의 통상적인 기술을 사용하여, 예를 들어 합성 NF-κB 요소 및 최소 프로모터를 사용하여, 또는 NF-κB 조절이 가해지는 것으로 공지된 유전자의 NF-κB-반응성 서열을 사용하여 쉽게 형성될 수 있다. 더욱이, NF-κB 반응성 정보제공인자 구조물은 예를 들어 클론테크(CLONTECH)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
주어진 프로모터 구조물을, 상기 구조물로 형질감염시킨 GPCR(T1R2-TMD 또는 CSR:T1R)-발현 세포를 작용제(예를 들어 페릴라틴)에 노출시킴으로써 쉽게 시험할 수 있다. 상기 작용제에 반응하여 정보제공 유전자 발현이 예를 들어 100% 증가함은 상기 정보제공인자가 GPCR(T1R2-TMD 또는 CSR:T1R) 활성을 측정하는데 적합함을 가리킨다. 전사 분석에 대한 대조군은 GPCR(T1R2-TMD 또는 CSR:T1R)은 발현하지 않지만 정보제공인자 구조물은 지니는 세포, 및 프로모터가 없는 정보제공인자 구조물을 갖는 세포 모두를 포함한다.
정보제공 유전자 활성화에 의해 입증된 바와 같이 GPCR(T1R2-TMD 또는 CSR:T1R) 활성을 조절하는 물질은 다른 프로모터 및/또는 다른 수용체를 사용하여 상기 신호의 GPCR(T1R2-TMD 또는 CSR:T1R) 특이성을 입증하고 그의 활성 스펙트럼을 측정하여, 임의의 비특이적인 신호, 예를 들어 상기 정보제공 유전자 경로를 통한 비특이적인 신호를 배제시킴으로써 입증될 수 있다.
이노시톨 포스페이트 ( IP ) 측정
포스파티딜 이노시톨(PI) 가수분해를 US 5,436,128에 개시된 바와 같이 측정할 수 있으며, 48 시간 이상 3H-마이오이노시톨로 세포를 표지함을 포함한다. 상기 표지된 세포를 1 시간 동안 시험 물질과 접촉시키고, 이어서 상기 세포를 용해시키고 클로로폼-메탄올-물로 추출한다. 이어서 상기 이노시톨 포스페이트를 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하고 이들을 섬광 카운팅에 의해 정량분석한다. 작용제의 경우, 시험된 물질 존재 하에서의 카운트/분(cpm) 대 완충제 대조군 존재 하에서의 cpm의 비를 계산하여 자극 배수를 측정한다. 마찬가지로, 억제제, 길항물질 및 역 작용제의 경우, 시험 물질 존재 하에서의 cpm 대 완충제 대조군(작용제를 함유할 수도 함유하지 않을 수도 있다) 존재 하에서의 cpm의 비를 계산하여 억제 배수를 측정한다.
결합 분석
리간드 결합에 대한 작용성 반응에 의해 유발된 매개변수의 변화를 측정하는, 본 발명에서 상기 개시된 작용 분석 이외에, T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 수용체에 대한 리간드의 결합을 측정하는 결합 분석에 의해 리간드 결합을 측정할 수 있다. 결합 분석은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 용액, 경우에 따라 고체 상에 부착된 2층 막, 지질 단층, 또는 소포체 내에서 시험될 수 있다. T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 폴리펩타이드에 대한 강화제의 결합을, 예를 들어 분광학적 특징(예를 들어 형광, 흡광도, 또는 굴절 지수) 변화의 측정, 유체역학적 방법(예를 들어 모양을 사용한다), 및 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 폴리펩타이드의 가용성 성질을 측정하는 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 결합 분석은 생화학적이며 재조합 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 폴리펩타이드를 발현하는 세포/조직으로부터의 막 추출물을 사용한다. 결합 분석을 예를 들어 US20050032158의 [0169] 내지 [0198]에서 애들러(Adler) 등에 의해 T1R에 대해 개시된 바와 같이 수행할 수 있다.
T1R2 - TMD 또는 CSR : T1R 수용체 폴리펩타이드 및 핵산, 및 실질적으로 동종인 폴리 펩타이드 및 핵산
본 발명에 개시된 방법에 유용한 CSR:T1R 키메라 단백질을 서열번호: 14, 서열번호: 16 중에서 선택된 폴리펩타이드, 서열번호: 14 및 서열번호: 16의 키메라 이종이량체, 서열번호: 14와 야생형 T1R3과의 이종이량체, 및 서열번호: 16과 야생형 T1R2와의 이종이량체로 이루어진 군 중에서 선택할 수 있다. 한편으로, 상기 CSR:T1R 키메라 단백질(또는 CSR:T1R을 코딩하는 핵산 서열)은 상기 폴리펩타이드와 실질적으로 상동성을 나타내고(90% 이상, 예를 들어 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 동일성%)하고 작용성으로 남아있는(즉 리간드에 결합하고/하거나 리간드에 의해 활성화되거나, 상기와 같은 수용체를 코딩한다) 단백질(또는 상기와 같은 CSR:T1R 수용체를 코딩하는 핵산 서열)일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 유용한 상기 T1R2-TMD 수용체는 서열번호: 2의 수용체, 또는 한편으로 서열번호: 2와 실질적으로 상동성을 나타내고 작용성으로 남아있는(즉 리간드에 결합하고 리간드에 의해 활성화된다) 수용체일 수 있다. 상기와 같은 동종 수용체들은 서열번호: 2에 90% 이상, 바람직하게는 서열번호: 2에 95% 이상 동일할 수 있다. 상기와 같은 동종 수용체들은 예를 들어 서열번호: 2, 또는 래트(약 77.9%의 아미노산 서열 동일성 및 약 81.2%의 핵산 동일성), 마우스(약 76.2%의 아미노산 서열 동일성 및 약 80.9%의 핵산 동일성), 개(약 74.4%의 아미노산 서열 동일성 및 약 82.6%의 핵산 동일성), 또는 인간 수용체에 충분한 아미노산 서열 동일성을 갖는 임의의 다른 종들을 포함한 상이한 종들의 상응하는 동종 서열의 대립유전자 변형일 수 있다.
실질적으로 동종인 CSR:T1R 키메라 단백질은 상기 T1R2 또는 T1R3 부분이 대립 유전자 변형 또는 상이한 종의 관련 부분, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이 및 개로부터의 T1R2 및/또는 T1R3으로 치환된 상기와 같은 단백질을 포함한다. 더욱이, 실질적으로 동종인 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 보존적 돌연변이 및/또는 점 돌연변이에 의해 형성시킬 수 있으며 상기 서열은 하기에 상세히 나타내는 바와 같은 임의의 보존적으로 변경된 변체들을 포함한다.
핵산 서열에 관하여, 보존적으로 변경된 변체는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열(보존적으로 치환된 아미노산, 즉 아르기닌으로 변경된 리신 및 본 발명에서 하기에 설명하는 바와 같은 추가의 예들)을 코딩하는 핵산을 의미한다.
상기 유전자 암호의 변성으로 인해, 서열은 상이하지만 작용상 동일한 다수의 핵산은 임의의 주어진 폴리펩타이드/단백질을 코딩한다. 상기와 같은 핵산 변화는 "침묵 변화"이며, 이는 보존적으로 변경된 변화 중 하나의 종이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 각각의 핵산 서열은 또한 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변화를 개시한다. 따라서, 핵산 중의 각 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)을 변경시켜 동일한 폴리펩타이드를 생성시키는 작용상 동일한 핵산 서열을 제공할 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변화는 각각의 주어진 핵산 서열에 절대적이다.
아미노산 서열에 관하여, 아미노산 치환을 PCR, 유전자 클로닝, cDNA의 부위 지향된 돌연변이, 숙주 세포의 형질감염, 및 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R 서열에 상기와 같은 변화를 도입시키는데 사용될 수 있는 시험관 내 전사를 포함한 재조합 유전자 기술의 공지된 프로토콜을 사용하여 도입시킬 수 있다. 이어서 상기 변체들을 미각-세포-특이적 GPCR 작용 활성에 대해 선별할 수 있다. 작용상 유사한 아미노산을 제공하는 보존 치환 표는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 보존 치환을 선택하기 위한 하나의 예시적인 지침은 하기를 포함한다(원래의 잔기에 이어서 예시적인 치환): ala/gly 또는 ser; arg/lys; asn/gln 또는 his; asp/glu; cys/ser; gln/asn; gly/asp; gly/ala 또는 pro; his/asn 또는 gln; ile/leu 또는 val; leu/ile 또는 val; lys/arg 또는 gln 또는 glu; met/leu 또는 tyr 또는 ile; phe/met 또는 leu 또는 tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp 또는 phe; val/ile 또는 leu. 또 다른 예시적인 지침은 하기 6 개의 군을 사용하며, 이들 군은 각각 서로 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 쓰레오닌(T); 2) 아스파트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라진(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(1); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W). 또 다른 지침은 양성이든 음성이든 모든 하전된 아미노산을 서로에 대해 보존적 치환으로서 허용하는 것이다. 또한, 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 퍼센트(예를 들어 26% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하)의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 개별적인 치환, 결실 또는 첨가를 또한 보존적으로 변경된 변화인 것으로 간주한다. 실질적으로 동종인 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 하기 나타내는 바와 같은 서열 일치 정도를 갖거나 몇몇 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화한다.
서열 동일성%
CSR:T1R에 대해서, 실질적으로 동종인 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 더욱이, CSR:T1R에 대해서 실질적으로 동종인 폴리펩타이드 서열은 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
T1R2-TMD에 대해서, 실질적으로 동종인 뉴클레오타이드 서열은 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 더욱이, T1R2-TMD에 대해서 실질적으로 동종인 폴리펩타이드 서열은 74% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
서열 동일성%의 계산을 하기와 같이 측정한다: BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov.에서 입수할 수 있는 blastn 프로그램에 의해 사용되는 휴리스틱 탐색 알고리즘이다. 또 다른 뉴클레오타이드 서열에 대한 뉴클레오타이드 검색 서열의 동일성%을 측정하기 위해서, 10의 EXPECT(데이터베이스 서열에 대한 상대를 보고하는 통계적 유의수준 한계), 및 DUST 여과를 포함하는 BLAST 버전 2.2.1.3의 디폴트 매개변수를 사용하는 Blastn을 사용한다. 또 다른 폴리펩타이드 서열에 대한 폴리펩타이드 검색 서열의 동일성%을 측정하기 위해서, 10의 EXPECT, 및 DUST 여과를 포함하는 BLAST 버전 2.2.1.3의 디폴트 매개변수를 사용하는 Blastp를 사용한다.
엄격한 혼성화 조건
뉴클레오타이드 서열은 또한 상기 서열이 하기 상세히 개시된 엄격한 혼성화 조건 하에서 본 발명에 제공된 뉴클레오타이드 서열에, 또는 그의 보체에 선택적으로 혼성화할 수 있는 경우 실질적으로 동종인 것으로 간주된다.
엄격한 혼성화 조건은 50% 포름아미드, 5 x SSC, 및 1% SDS로 이루어진 용액 중에서 42 ℃의 온도 및 0.2 x SSC 및 0.1% SDS(1 x SSC = 0.15M NaCl, 0.015 M 시트르산 나트륨 pH 7.0)로 이루어진 용액 중에서 65 ℃에서 세척이다. 배경 혼성화가 예를 들어 선별되는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 중에 존재하는 다른 뉴클레오타이드 서열로 인해 발생할 수 있다. 혼성화 배경의 2 배 이상, 경우에 따라 10 배의 양성 신호는 표적 DNA와의 특이적인 상호작용으로 간주된다. 상호작용의 강도를, 예를 들어 탐침을 예를 들어 32P로 방사성 표지하여 측정할 수 있다.
강화제를 확인하기 위한 키트
본 발명은 하나의 실시태양에서, 키트, 예를 들어 T1R2-TMD 또는 CSR:T1R, 또는 상기에 실질적으로 동종인 서열을 발현하는 재조합 세포를 포함하고; T1R2-TMD 또는 CSR:T1R에 대한 작용제, 예를 들어 비 제한적으로 염화 칼슘, 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, NDHC, 사이클라메이트, 및 신나모나이트릴을 포함하는 선별 키트 또는 하이 쓰루풋 선별 키트를 포함한다. 칼슘을 포함하는 키트를 사용하는 것은 키메라 단백질의 야생형 수용체 또는 T1R2 및 T1R3 부분은 아닌, 키메라 단백질에만 결합하고 이를 활성화시키는 이점을 갖는다. 경우에 따라, 상기 세포는 예를 들어 칼슘 신호전달을 위해 G-단백질을 포함한다. 적합한 G-단백질은 공지되어 있고 본 발명에서 상기에 개시되어 있으며; 숙련가는 상기 단백질을 필요에 따라 세포에 도입시키는 방법을 알고 있다. 매우 유용한 키메라 G-단백질은 Galpha16-거스트덕신44이다. 상기 작용제를 적합한 농도, 예를 들어 1 nM 내지 10 mM, 또는 0.1 μM 내지 1 mM, 예를 들어 0.1 μM 내지 100 μM로 제공한다. 유용한 농도는 예를 들어 염화 칼슘의 경우 0.2 내지 20 mM, p-에톡시벤즈알데하이드의 경우 5 내지 500 μM, 페릴라틴의 경우 5 내지 500 μM, 신나모나이트릴의 경우 10 내지 1000 μM, 사이클라메이트의 경우 0.01 내지 5 mM, 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC)의 경우 0.033 내지 3.3 mM이다.
임의의 키트 성분은 제공된 재조합 세포의 배양에 적합한 배지, 및 예를 들어 세포 배양 접시 또는 미세적정 플레이트 상에서 세포를 증식시키기 위한 고체 지지체를 포함할 수 있다. 상기 임의의 성분들은 숙련가가 쉽게 입수할 수 있다.
상기 키트를 하기와 같이 사용할 수 있다:
(i) CSR:T1R 키메라 단백질을 발현하는 재조합 세포를 상기 고체 지지체 상에서 증식시킨다.
(ii) 약 1 nM 내지 100 mM 농도의 시험 물질을 적합한 농도의 상기 작용제의 존재 하에서 한정된 플레이트 또는 웰의 배양 배지에 가한다.
(iii) 상기 세포의 작용 반응의 변화를, 상기 반응을 상기 시험 물질의 존재 및 부재 하에서 비교함으로써 측정하고 이에 의해 상기 시험 물질이 강화제일 수 있는 지를 결정한다.
예를 들어, (iii)을 본 발명에서 상기에 개시된 수용체 활성을 보고하는 검출 방법들 중 어느 하나와 함께, 본 발명에서 상기에 개시된 분석들 중 어느 하나에 따라 수행할 수 있다. 이는 특별히 선택되거나 적응시킨 재조합 세포를 필요로 할 수 있으며, 이는 또한 본 발명에서 상기에 개시되어 있다. 적합한 분석은 예를 들어 CSR:T1R의 활성화 및 시험 물질에 반응하는 그의 변화를 측정하기 위한 칼슘 흐름 분석이다.
상기 키트를 또한 하기와 같이 강화제를 확인하는데 사용할 수 있다:
(i) CSR:T1R 키메라 단백질을 발현하는 재조합 세포를 상기 고체 지지체 상에서 증식시킨다.
(ii) 약 1 nM 내지 100 mM 농도의 시험 물질을 적합한 농도의 칼슘 작용제(예를 들어 비 제한적으로 염화 칼슘의 형태로)의 존재 하에서 한정된 플레이트 또는 웰의 배양 배지에 가한다. 적합한 염화 칼슘의 농도는 예를 들어 약 0.2 내지 20 mM, 또는 0.5 내지 10 mM, 또는 약 1 mM이다.
(iii) 상기 세포의 칼슘에 대한 작용 반응의 변화를, 상기 반응을 상기 시험 물질의 존재 및 부재 하에서 비교함으로써 측정하고 이에 의해 상기 시험 물질이 강화제일 수 있는 지를 결정한다.
확인된 강화제의 확인: 본 발명에서 상기 개시된 방법에 의해 확인된 강화제를 식품향료연구자 또는 시험자의 패널을 사용하여 상기 확인된 강화제를 맛보는 간단한 감각 실험에 의해 쉽게 확인할 수 있다. 상기 화합물들을 예를 들어 물 중에서 시음하여 단맛을 확인하거나 또는 강화제가 없는 음성 대조군과 비교하여 단맛 자극물질과 함께 시음하여 상기 단맛을 강화시키는 조절제를 확인한다.
대규모 선별 분석
본 발명에서 상기 개시된 전사 정보제공인자 분석 및 대부분의 세포 기재 분석들은 CSR:T1R 또는 T1R-TMD 활성을 조절하는 물질에 대한 라이브러리를 선별하기에 매우 적합하다. 상기 분석 단계들을 자동화하고 임의의 편리한 출처로부터 화합물을 상기 분석들(전형적으로 병행 실시된다, 예를 들어 로봇식 분석에서 미세적정 플레이트 상에서 미세적정 포맷으로)에 제공함으로써 큰 화학 라이브러리를 선별하도록 상기 분석을 디자인할 수 있다. 분석을 다수의 잠재적인 강화제들을 함유하는 조합적인 화학적 또는 펩타이드 라이브러리를 제공함을 수반하는 하이 쓰루풋 선별 방법으로 실행할 수 있다. 이어서 상기와 같은 라이브러리를 본 발명에서 상기에 개시된 하나 이상의 분석에서 선별하여 본 발명에서 상기에 개시된 활성을 나타내는 라이브러리 물질(특히 화학 종 또는 하위 부류)을 확인한다. 상기와 같이 확인된 강화제는 직접 사용되거나 또는 유도체의 제조 및 시험에 의해 추가의 강화제를 확인하기 위한 전례로서 작용할 수 있다. 합성 화합물 라이브러리를 다수의 회사들, 예를 들어 메이브릿지 케미칼 캄파니(Maybridge Chemical Co., Trevillet, Cornwall, UK), 콤제넥스(Comgenex, Princeton, N.J.), 브랜든 어쏘시에이츠(Brandon Associates, Merrimack, N.H.), 및 마이크로소스(Microsource, New Milford, Conn.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
시험 물질들의 라이브러리
조합적인 화학 라이브러리는 시약과 같은 다수의 화학적 "기초 요소들"을 조합함으로써 화학 합성 또는 생물 합성에 의해 생성되는 다양한 화학 화합물들의 수집물이다. 예를 들어 선형 조합 화학 라이브러리, 예를 들어 폴리펩타이드 라이브러리를, 일련의 화학적 기초 요소들(아미노산)을 주어진 화합물 길이(즉 폴리펩타이드 화합물 중의 아미노산의 수)에 대해 모든 가능한 방식으로 조합하여 형성시킨다. 수백만 개의 화합물을 상기와 같은 화학적 기초 요소들의 조합적 혼합을 통해 합성할 수 있다. 희귀한 화학 라이브러리를 알드리치(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 입수할 수 있다.
세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리를 예를 들어 팬 레보라토리즈(Pan Laboratories, 미국 워싱턴주 보트헬 소재) 또는 마이코써치(MycoSearch, 미국 노스캐롤라이나 소재)로부터 상업적으로 입수하거나, 또는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 쉽게 생산할 수 있다. 또한, 천연 및 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물을 통상적인 화학, 물리 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변경시킨다. 다른 라이브러리들로는 단백질/발현 라이브러리, 천연 공급원, 예를 들어 식품, 식물, 동물, 세균으로부터의 cDNA 라이브러리, 하나 이상의 폴리펩타이드의 랜덤하게 또는 체계적으로 변이된 변체를 발현하는 라이브러리, 및 하나의 세포 또는 조직의 mRNA 내용물을 발현하는데 사용되는 바이러스 벡터 중의 게놈 라이브러리가 있다.
하이 쓰루풋 분석에서, 수 천 개 이하의 상이한 강화제 또는 리간드들을 하루에 선별할 수 있다. 특히, 미세적정 플레이트의 각 웰을 사용하여, 선택된 잠재적인 강화제에 대해 별도의 분석을 실행하거나, 또는 농도 또는 배양 시간 영향을 관찰해야 하는 경우, 매 5 내지 10 개의 웰로 단일 강화제를 시험할 수 있다. 따라서, 단일의 표준 미세적정 플레이트는 약 100 개의 강화제를 분석할 수 있다. 1536-웰 플레이트를 사용하는 경우, 단일 플레이트는 약 100 내지 약 1500 개의 상이한 화합물을 쉽게 분석할 수 있다. 하루에 여러 개의 상이한 플레이트를 분석할 수 있으며; 약 6,000 내지 20,000 개의 상이한 화합물들에 대한 분석 스크린이 가능하다.
분석 방법에서 T1R - TMD 또는 CSR : T1R 조절 효과에 대해 시험될 수 있는 시험 물질의 유형
시험 물질들은 임의의 물질, 예를 들어 작은 화학 화합물, 화학 중합체, 생물 중합체, 펩타이드, 단백질, 당, 탄수화물, 핵산 및 지질일 수 있다. 물질은 합성 화합물, 화합물들의 혼합물, 천연 생성물 또는 천연 샘플, 예를 들어 식물 추출물, 배양 상등액, 또는 조직 샘플일 수 있다. 단맛을 개선시킬 수 있는 화합물의 예로서, 메틸 차비콜, 테아사포닌 E1, 아세설팜 K, 알리탐, 아스파탐, CH 401, 듈신, 네오탐, 나트륨 사이클라메이트, 슈크랄로스, 슈퍼아스파탐, 시나린, 글리시필린, 레바우디오사이드 C, 아브루소사이드 A, 아브루소사이드 B, 아브루소사이드 C, 아브루소사이드 D, 아브루소사이드 E, 아피오글리시리진, 아라보글리시리진, 베이유노사이드, 브라제인, 브리오듈코사이드, 카노시플로사이드 V, 카노시플로사이드 VI, D. 커민시, 사이클로카리오사이드 A, 사이클로카리오사이드 I, 듈코사이드 A, 글리시리즈산, 헤르난듈신, 헤르난듈신, 4베타-하이드록시-헤스페리틴-7-글루코사이드 다이하이드로찰콘, 후앙퀴오사이드 E, 후앙퀴오사이드 E, 3-하이드록시플로리드진, 2,3-다이하이드로-6-메톡시-3-O-아세테이트, 마빈린 말토실-알파-(1,6)-네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘, 모그로사이드 IIE, 모그로사이드 III, 모그로사이드 IIIE, 모그로사이드 IV, 모그로사이드 V, 11-옥소 모그로사이드 V, 모나틴, 모노암모늄 글리시리지네이트(Mag), 머큐로지오사이드 Iib, 나린진 다이하이드로찰콘, 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NHDHC), 네오모그로사이드, 오슬라딘, 페리안드린 I, 페리안드린 II, 페리안드린 III, 페리안드린 IV, 페리안드린 V, 플로미소사이드 I, 플로리진, 필로듈신, 폴리포도사이드 A, 칼륨 마그네슘 칼슘 글리시리진, 프테로카료사이드 A, 프테로카료사이드 B, 레바우디오사이드 A, 레바우디오사이드 B, 루부소사이드, 스칸데노사이드 R6, 시아메노사이드 I, 나트륨 글리시리지네이트, 스테비올바이오사이드, 스테비오사이드, 알파-글리코실 슈아비오사이드 A, 슈아비오사이드 B, 슈아비오사이드 G, 슈아비오사이드 H, 슈아비오사이드 I, 슈아비오사이드 J, 타우마틴, 트라이암모늄 글리시리지네이트(TAG), 트릴로바틴 커귤린, 스트로진 1, 스트로진 2, 스트로진 4, 미라큘린, 호듈신, 주주바사포닌 II, 주주바사포닌 III, 아브루소사이드 E, 페리안드린산 I, 모노글루쿠로나이드, 페리안드린산 II, 모노글리큐로나이드, 클로로젠산, 베타-(1,3-하이드록시-4-메톡시벤질)-헤스퍼틴 다이하이드로찰콘, 3'-카복시-헤스퍼틴 다이하이드로찰콘, 3'-스테비오사이드 상동체를 들 수 있다.
본 발명에 개시된 방법에 의해 확인된 단맛 강화제는 예를 들어 단맛 감각을 이끌어낼 수 있는 인공 감미료의 강화제를 포함할 수 있다. 제품은 식품, 음료수, 구강 보호 제품, 및 상기와 같은 제품에 혼합하기 위한 조성물, 특히 풍미 조성물을 포함한다. 풍미 조성물을 가공된 식품 또는 가공 중인 음료수에 가하거나, 또는 상기 조성물이 실제로 자신의 정의로, 예를 들어 소스 등과 같은 조미료로 제품일 수 있다. 단맛 자극물질이 과자류 및 다른 단맛 제품, 예를 들어 디저트 및 짭짤하고 달고-신 제품에 특히 유용할 수 있다. 제품의 예로는 과자류 제품, 케이크, 곡류 제품, 제빵 제품, 빵 제품, 검, 츄잉 검, 소스(조미료), 수프, 가공 식품, 조리된 과일 및 채소 제품, 육류 및 정육 제품, 계란 제품, 우유 및 유제품, 치즈 제품, 버터 및 버터 대용품, 우유 대용품, 간장 제품, 식용유 및 지방 제품, 약제, 음료수, 알콜 음료, 맥주, 청량 음료, 식품 추출물, 식물 추출물, 육류 추출물, 조미료, 감미료, 기능 식품, 정제, 로젠지, 점적체, 유화액, 엘릭서, 시럽, 및 음료수, 인스턴트 음료 및 발포성 정제 제조용 다른 제제가 있다.
핵산 및 단백질의 서열
본 발명에 개시된 구조물 및 방법에 사용되는 서열을 본 발명에서 하기에 나타내는 서열에서 찾을 수 있다.
T1R2 - TMD 서열
상기 서열을 본 발명에서 하기 나타내는 서열에 나타낸다. 서열번호: 1은 T1R2-TMD 수용체를 코딩하는 뉴클레오타이드/핵산 서열에 상응하고, 서열번호: 2는 T1R2-TMD 수용체 단백질의 폴리펩타이드/아미노산 서열에 상응한다.
형질감염된 구조물에서, SST TAG(서열번호: 3)에 이어서 신규의 T1R2-TMD 단백질을 코딩하는 핵산(서열번호: 1)이 있고, 이어서 HSV TAG 핵산(서열번호: 5)이 있다.
생성되는 단백질은 상응하게 나타낸 순서로 하기의 아미노산들을 포함할 것이다: 서열번호: 4, 서열번호: 2 및 서열번호: 6의 아미노산.
서열번호: 1 + 2: T1R2-TMD 핵산 및 단백질
서열번호: 3 + 4: SST TAG 핵산 및 단백질
서열번호: 5 + 6: HSV TAG 핵산 및 단백질
서열번호: 7 + 8: T1R2-TMD 벡터 구조물에 대한 순방향 및 역 방향 프라이머
서열번호: 9 + 10: T1R2 전장(핵산 및 단백질)
서열번호: 11 + 12: T1R3 전장(핵산 및 단백질)
CSR : T1R 서열
서열번호: 13은 CSR:T1R2 키메라 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드/핵산 서열에 상응하고, 서열번호: 14는 CSR:T1R2 키메라 단백질의 폴리펩타이드/아미노산 서열에 상응한다.
서열번호: 15는 CSR:T1R3 키메라 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드/핵산 서열에 상응하고, 서열번호: 16은 CSR:T1R3 키메라 단백질의 폴리펩타이드/아미노산 서열에 상응한다.
2 개의 서브유닛을 포함하는 복합체로서 함께, 상기 CSR:T1R2 키메라 단백질 및 상기 CSR:T1R3 키메라 단백질은 작용성 키메라 단맛 수용체를 형성한다.
상기 형질감염된 구조물은 예를 들어 서열번호: 13 또는 15에 이어서 서열번호: 17, C-말단의 HSV 태그가 있다.
생성되는 단백질은 상응하게 하기의 아미노산들을 포함할 것이다: 서열번호: 14에 이어서 서열번호: 18, 또는 서열번호: 16에 이어서 서열번호: 18의 아미노산.
공지된 전장 hCaSR 수용체 핵산 및 단백질 서열을 서열번호: 19 + 20으로 제공한다.
서열번호: 13 + 14: CSR:T1R2 핵산 + 단백질
서열번호: 15 + 16: CSR:T1R3 핵산 + 단백질
서열번호: 17 + 18: C-말단 핵산에서 HSV 태그 + 단백질
서열번호: 19 + 20: hCaSR 핵산 + 단백질
서열번호: 21-24: 프라이머 서열, 실시예 13 및 실시예 15 비교
서열번호: 25-26: 프라이머 서열
서열번호: 27-28: T1R3 TMD 핵산 + 단백질
이제 상술한 방법들을 예시하는 작용을 하는 일련의 실시예들이 이어진다. 하기의 실시예들은 단지 예시적일 뿐이며 방법 또는 키트를 어떠한 식으로도 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.
실시예들에 대한 개요를 하기에 제공한다.
실시예 1은 미각 수용체 활성을 측정하는 일반적인 방법을 개시한다.
실시예 2 내지 5는 상이한 T1R 벡터 구조물의 제조를 개시한다.
실시예 6 내지 8은 상기 구조물에 의한 세포의 형질감염을 개시한다.
실시예 9 내지 12는 비 제한적으로 다양한 감미료 강화제의 확인을 개시한다.
실시예 13은 단맛의 일반적인 측정 방법을 개시한다.
실시예 14 내지 20은 또 다른 단맛 자극물질의 부재 하에서 강화제의 단맛을 측정하는 대조용 실험을 개시한다.
실시예 21 내지 29는 단맛 자극물질과 단맛 강화제와의 혼합물에 관한 것이다.
실시예 30 내지 33은 또 다른 단맛 자극물질의 부재 하에서 강화제의 단맛을 측정하는 대조용 실험을 개시한다.
실시예 34 내지 36은 단맛 자극물질과 함께 2 개 이상의 단맛 강화제의 혼합물을 나타낸다.
1. 플루오 -4 칼슘 분석
플루오-4는 세포 내 칼슘의 형광 지표이며, 칼슘 농도의 변화, 특히 리간드 첨가 후 발생하는 수용체 활성화에 반응하는 증가의 측정을 허용한다.
Gα16-거스트덕신 44(Gα16거스트44)를 안정하게 발현하는 HEK293 세포를 숙주 세포로 사용하고 실시예 2 내지 5에 개시된 바와 같은 다양한 구조물로 형질감염시켰다.
검은색의 투명 바닥 96-웰 플레이트를 모든 분석에 사용하였다. 상기 플레이트를 분석 전날에 웰 당 8500 개의 형질감염된 세포로 시딩하고 사용된 세포에 적합한 생육 배지에서 37 ℃에서 밤새 유지시켰다. HEK293 세포의 경우, 고 글루코스, L-글루타민, 피록시딘 염산염을 함유하고 10% 소 태아 혈청이 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지를 상기 HEK293 세포의 생육 및 유지에 사용하였다.
상기 분석 시에, 상기 생육 배지를 버리고 세포를 C1 완충 용액 중에 용해된 1.5 μM 플루오-4 AM(Molecular Probes, 등록상표, 인비트로젠, 미국) 및 2.5 μM 프로베니시드(시그마 알드리치(Sigma-Aldrich))로 이루어진 칼슘 분석 용액 50 ㎕와 함께 1 시간 동안(암실에서 37 ℃) 배양하였다. C1 완충 용액은 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Hepes, 2 mM CaCl2 및 10 mM 글루코스(pH 7.4)를 함유한다.
처음 1 시간의 부하 기간 후에, 상기 플레이트를 자동화된 플레이트 세척기(바이오텍(BioTek))를 사용하여 웰 당 100 ㎕의 Cl 완충액으로 5 회 세척하고, 세척 후 상기 세포를 암실, 실온에서 30 분간 웰 당 100 ㎕의 Cl 완충액 중에서 추가로 배양하여 상기 플루오-4-AM의 탈 에스터화를 완료시켰다. 상기 완충 용액을 버리고, 상기 플레이트를 100 ㎕의 Cl 세척 완충액으로 5 회 세척하고 최종적으로 상기 세포를 180 ㎕의 Cl 세척 완충액에 넣었다.
분석 판독을 위해서, 상기 플레이트를 FLIPR(형광 상 플레이트 판독기(FLIPR-Tetra, 몰레큘러 디바이시즈)에 넣고 수용체 활성화를 10X 농축된 리간드 모액 20 ㎕를 가하여 개시시켰다.
형광을 리간드 첨가 전 15 초간 및 리간드 첨가(45 내지 105초면 충분할 수 있다) 후 105 초간 연속적으로 모니터하였다.
수용체 활성화를 상대 형광 단위(RFU)로 제공하고 하기 식에 의해 한정한다:
형광도 증가 = 최대 형광도 - 기준 형광도
(여기에서, 상기 기준 형광도는 리간드 첨가 전 처음 10 내지 15 초간 계산한 평균 형광도를 나타낸다).
한편으로, 수용체 활성화를 기준 형광도(F0)로 표준화시킨 피크 형광도(F)의 증가에 의해 측정할 수 있다. 데이터를 하기 식을 사용하여 표준화한다: ΔF/F = (F-F0)/F0(여기에서 F는 피크 형광도 신호이고, F0는 기준 형광도 신호이며, 상기 기준 형광도는 리간드 첨가 전 처음 10 내지 15 초 동안 계산된 평균 형광도를 나타낸다).
음성 대조군으로서, 목 형질감염된 세포를 동일한 농도의 리간드에 노출시켰으며, 신호에 상응하지 않는 칼슘 잔량의 농도를 측정하였다. 활성화된 수용체를 갖는 세포를 상기 음성 대조군보다 현저하게 위에 있는 신호(RFU 또는 ΔF/F)에 의해 확인하였다.
2. T1R2 - TMD 벡터 구조물의 제조
Pfu 폴리머라제(인비트로젠)를 사용하는 PCR을 사용하여, 하기 나타낸 특정 프라이머들을 사용하여 T1R2-TMD 구조물을 생성시켰다:
T1R2-TMD 순방향 프라이머(서열번호: 7):
5'-TAT AGA ATT CGC ACC CAC CAT CGC TGT GGC C-3'
T1R2-TMD 역방향 프라이머(서열번호: 8):
5'-ATA TGC GGC CGC AGT CCC TCC TCA TGG T-3'
상기 PCR 증폭에 대한 주형은 인간 용상 돌기 미각 조직으로부터 생성된 cDNA 라이브러리로부터 단리된 인간 T1R2에 대한 전장 cDNA이었다. 반응 매개변수는 5 분간 94 ℃에 이어서 35 주기의 45 초간 94 ℃, 15 초간 54 ℃, 및 1 분간 68℃, 이어서 10 분간 68 ℃의 최종 연장 주기였다.
생성되는 핵산 단편(서열번호: 1과 비교)을 젤 전기영동에 의해 분리시키고, 정제하고 pCR-Topo-II 벡터(인비트로젠)에 서브 클로닝하고 생성되는 클론들을 DNA 서열화에 의해 확인하여 상기 PCR 증폭으로부터 발생하는 돌연변이가 없음을 확실히 했다. 서열화 후에, 상기 T1R2-TMD 삽입물을 pcDNA4-TO(인비트로젠) 기재의 발현 카세트에 서브 클로닝하였다. 상기 클로닝 카세트는 이미 N-말단에 래트 소마토스타틴 유형 3 수용체의 처음 45 개 아미노산을 함유하여 상기 트랜스유전자의 세포 표면 막 표적화를 촉진시킨다(문헌[Bufe et al., 2002, Nat. Genet., 32(3), 397-401]을 참조하시오). 상기 벡터의 C-말단은 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 당단백질 D 에피토프를 코딩하며, 상기 에피토프를 상기 에피토프에 결합하는 특이 항체를 사용하는 면역세포화학 연구에 사용할 수 있다. 생성되는 벡터 구조물은 서열번호: 4(래트 소마토스타틴의 45 개 아미노산)가 선행하고 서열번호: 6(HSV 에피토프)(C 말단 방향에 대해 아미노산 말단에)이 이어지는 서열번호: 2(T1R2-TMD)의 결합된 아미노산 서열들의 T1R2-TMD 단백질의 발현을 허용한다.
상기 개략된 바와 유사한 방법에 의해, T1R3의 세포 외 도메인을 제거하기 위해 말단 절단된 T1R3-TMD 수용체를 생성시킬 수 있다. 이는 PCR 주형(상기 T1R3 경막 도메인 코딩 부위의 5' 및 3' 단부에 특이적인 상응하게 상이한 순방향 및 역방향 프라이머를 갖는다)으로서 T1R3 cDNA의 사용을 수반한다. 이어서 상기 T1R3-TMD 수용체를 사용하여 본 발명에 개시된 바와 같이 T1R2-TMD에 대해 유사한 분석을 수행할 수 있다. 예를 들어, T1R3-TMD를 단독으로 결합 분석에 사용하거나, 또는 예를 들어 결합 또는 활성화 분석에서 T1R2-TMD와 함께 사용할 수 있다.
3. CSR : T1R2 벡터 구조물의 제조
상기 CSR:T1R2 키메라 cDNA 벡터 구조물을, 2 개의 PCR 산물 모두 중의 공통의 제한 효소 부위를 통해 PCR에 의해 생성된 2 개의 DNA 단편, 즉 hCaSR(1-Phe539)의 세포 외 아미노 말단 도메인(ATD)을 코딩하는 단편, 및 Ser493에서 시작하는 T1R2의 시스테인 풍부 도메인(CRD), 경막(TMD) 및 C-말단을 코딩하는 단편을 결합시킴으로써 생성시켰다.
상기 CSR:T1R2 키메라 DNA의 제조를 촉진하기 위해서, Sac II 부위를 본 발명에서 상기 개시된 2 개의 단편을 형성시키는데 사용된 프라이머 내로 도입시켰다. 상기 도입된 부위 및 적합한 제한 효소를 당해 분야에 널리 공지된 조건 하에 완충액 중에서 사용하여 상기 단편들을 효소 연결에 의해 결합시켰다.
상기 형성된 PCR-산물/단편 중의 상기 Sac II 부위를 각각 hCaSR ATD 단편의 C-말단 단부 및 T1R2 단편의 N-말단 단부에 배치하여, 상기 키메라 DNA의 2 개의 PCR-산물/단편을 연결시켰다. 상기 Sac II 부위의 통합은 상기 hCaSR 중의 Phe539를 아르기닌 잔기로 전환시킨다. PCR을 사용하여, 하기에 제공된 서열번호: 21 내지 24의 특정 프라이머들을 사용하여 CSR:T1R2 키메라 cDNA 단편을 포함하는 단편들을 증폭시켰다. F는 순방향 프라이머를, R은 역방향 프라이머를 가리킨다.
밑줄 그은 문자들은 상기 PCR 산물의 후속 서브 클로닝을 위해 프라이머 내에 배치한 제한 부위들을 가리킨다.
hCaSR-ATD 프라이머 F(서열번호: 21):
CACCAAGCTTATGGCATTTTATAGCTGC
hCaSR-ATD 프라이머 R(서열번호: 22):
ATATCCGCGGCACCTCCCTGGAGAACCC
T1R2-단편 프라이머 F(서열번호: 23):
ATATCCGCGGTCCATGTGTTCCAAGAGG
T1R2-단편 프라이머 R(서열번호: 24):
ATATGCGGCCGCAGTCCCTCCTCATGGT
PCR 증폭을 위한 주형은 인간 CaSR(오리진사(Origene Inc.), 미국으로부터 상업적으로 입수할 수 있다), 및 인간 용상 돌기 미각 조직으로부터 생성된 cDNA 라이브러리로부터 단리한 인간 T1R2를 코딩하는 전장 cDNA이었다. PCR 반응 매개변수는 하기와 같았다: 5 분간 94 ℃에 이어서 35 주기의 45 초간 94 ℃, 15 초간 54 ℃, 및 2 분간 72℃, 이어서 10 분간 72 ℃의 최종 연장 주기.
생성되는 핵산 단편을 젤 전기영동에 의해 분리시키고, 정제하고 pCR-Topo-II 벡터(인비트로젠)에 서브 클로닝하고 생성되는 클론들을 DNA 서열화에 의해 입증하여 상기 PCR 증폭으로부터 발생하는 돌연변이가 없음을 확실히 했다. 서열화 후에, 상기 삽입물을 pcDNA4/TO(인비트로젠, 미국으로부터 구입함) 기재의 발현 카세트 벡터 구조물에 3-조각 연결을 통해 서브 클로닝하여, 상기 벡터 구조물 중의 CSR:T1R2 키메라 cDNA 단편의 조립을 허용하였다.
상기 생성되는 삽입물의 C-말단은 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 당단백질 D 에피토프(pcDNA4/T0 벡터에 의해 제공됨)를 코딩하며, 상기 에피토프를 상기 에피토프에 결합하는 특이 항체를 사용하는 면역세포화학 연구에 사용할 수 있다. CSR:T1R2 cDNA를 갖는 생성되는 CSR:T1R2 벡터 구조물은 서열번호: 14(CSR:T1R2)에 이어서 서열번호: 18(HSV 에피토프)(C 말단 방향에 대해 아미노산 말단에)이 이어지는 결합된 아미노산 서열들의 T1R2-TMD 단백질의 발현을 허용한다.
4. CSR : T1R3 벡터 구조물의 제조
CSR:T1R3 키메라 cDNA 벡터 구조물을, 2 개의 PCR 산물 모두 중의 공통의 제한 효소 부위를 통해 PCR에 의해 생성된 2 개의 DNA 단편을 결합시킴으로써, 즉 hCaSR(1-Phe539)의 세포 외 아미노 말단 도메인(ATD)을 코딩하는 PCR 산물을 Ser497에서 시작하는 시스테인 풍부 도메인(CRD), 경막(TMD) 및 C-말단을 코딩하는 T1R3의 단편에 결합시킴으로써 생성시켰다.
상기 CSR:T1R3 키메라 cDNA 벡터 구조물의 제조를 촉진하기 위해서, Sac II 부위를 상기 개시된 2 개의 단편을 제조하는데 사용된 프라이머 내로 도입시켰다.
상기 형성된 PCR-산물/단편 중의 상기 Sac II 부위를 각각 hCaSR ATD 단편의 C-말단 단부 및 T1R3 단편의 N-말단 단부에 배치하여, 상기 2 개의 단편을 연결시켰다. 상기 Sac II 부위의 통합은 원래 hCaSR의 539번 위치에서 페닐알라닌 대신에 아르기닌을 코딩하는 벡터 구조물을 생성시킨다. 당해 분야에 널리 공지된 완 충액 및 조건 하에서 상기 도입된 연결 부위 및 적합한 제한 효소를 사용하여, 상기 단편들을 효소 연결에 의해 결합시켰다.
PCR을 사용하여, 하기에 제공된 서열번호: 25 및 서열번호: 26의 특정 프라이머들을 사용하여 CSR:T1R3 키메라 cDNA 단편을 포함하는 단편들을 증폭시켰다. 그 후에, T1R3의 증폭된 PCR 산물 및 hCaSR의 증폭된 PCR 산물(후자는 상기 실시예 2에 개시된 바와 같이 형성된다)을 하기에 나타낸 프라이머에 지정된 제한 부위를 통해 연결시켰다. F는 순방향 프라이머를, R은 역방향 프라이머를 가리킨다. 밑줄 그은 문자들은 상기 PCR 산물의 후속 연결 및 서브 클로닝을 위해 프라이머 내에 배치한 제한 부위들을 가리킨다.
hCaSR-ATD F 및 hCaSR-ATD R:
상기 실시예 3에 나타낸 바와 같은 서열번호: 25 및 서열번호: 26.
T1R3-단편 프라이머 F(서열번호: 25):
ATATCCGCGGTCCCGGTGCTCGCGGCAG
T1R3-단편 프라이머 R(서열번호: 26):
ATATGCGGCCGCACTCATGTTTCCCCTGATT
PCR 증폭을 위한 주형은 hCaSR(오리진사, 미국으로부터 구입하였다), 또는 인간 용상 돌기 미각 조직으로부터 생성된 cDNA 라이브러리로부터 단리한 hT1R3에 대한 전장 cDNA이었다. PCR 반응 매개변수는 하기와 같았다: 5 분간 94 ℃에 이어서 35 주기의 45 초간 94 ℃, 15 초간 54 ℃, 및 2 분간 72℃, 이어서 10 분간 72 ℃의 최종 연장 주기.
생성되는 핵산 단편(연결을 상기 단편들을 확인 한 후 나중에 수행한다)을 젤 전기영동에 의해 분리시키고, 정제하고 pCR-Topo-II 벡터(인비트로젠, 미국)에 서브 클로닝하였다. 생성되는 클론들을 DNA 서열화에 의해 입증하여 상기 PCR 증폭으로부터 발생하는 돌연변이가 없음을 확실히 했다.
서열화 후에, 상기 삽입물을 pcDNA4/TO(인비트로젠, 미국으로부터 구입함) 기재의 발현 카세트 벡터 구조물에 3-조각 연결을 통해 서브 클로닝하여, 상기 CSR:T1R3 벡터 구조물을 형성시켰다. 상기 벡터 구조물의 C-말단은 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 당단백질 D 에피토프를 코딩하며, 상기 에피토프를 상기 에피토프에 결합하는 특이 항체를 사용하는 면역세포화학 연구에 사용할 수 있다. 상기 생성되는 벡터 구조물은 서열번호: 16(CSR:T1R3)에 이어서 서열번호: 18(HSV 에피토프)(C 말단 방향에 대해 아미노산 말단에)이 이어지는 결합된 아미노산 서열들의 CSR:T1R3:HSV 단백질의 발현을 허용한다.
5. T1R2 , T1R3 벡터 구조물(비교를 위한 야생형 수용체)의 제조
상기 T1R2 및 T1R3 벡터 구조물을 제조하기 위해서, 인간 T1R2 및 T1R3에 대한 전체 단백질 코딩 서열을 코딩하는 cDNA 단편을 인간 용상 cDNA 라이브러리로부터 단리하고, 완전히 서열화하고 이어서 표준 방법에 의해 pCDNA3.1(인비트로젠)에 서브 클로닝하였다.
6. T1R2 - TMD 의 세포 내로의 형질감염, T1R2 - TMD 및 Gα 16거스트44를 안정하게 발현하는 세포
인간 T1R2-TMD를 안정하게 발현하는 인간 세포주를, 상기 인간 T1R2-TMD(실시예 2에 개시된 바와 같이 형성됨)를 함유하는 선형화된 pcDNA 4-T0 벡터(인비트로젠)를 Gα16거스트44 발현 세포 주(WO 2004/055048에 개시된 바와 같이 형성되었다)에 형질감염시킴으로써 생성시켰다. 상기 세포 주는 미각 수용체에 대해 향상된 커플링을 나타내며, 테트라사이클린 유도성이고, Gα16거스트44 불규칙 G-단백질을 안정하게 발현하며, HEK-293 티-렉스 세포 주(인비트로젠, 미국으로부터 상업적으로 입수할 수 있다)를 기본으로 한다.
형질감염을 하기와 같이 수행하였다:
0일째에, 상기 HEK293T/Gα16거스트44 세포를 6-웰의 검은색의 투명 바닥 플레이트에 웰 당 900,000 세포의 밀도로 도말하고 선택성 생육 배지에서 밤새 증식시켰다. 1일째에, 상기 배지를 무 항생제 및 무 혈청 생육 배지로 바꾸고 세포를 4 ㎍의 선형화된 T1R2 TMD 벡터 구조물 DNA 및 0.3 ㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 형질감염시켰다. 상기 리포펙타민/DNA 혼합물을 3 내지 4 시간 동안 상기 세포상에서 배양하고 이어서 무 항생제, 혈청 함유 생육 배지로 교환하였다. 24 시간 후에, 상기 세포를 10% FBS, 블라스티시딘 0.005 ㎎/㎖, G418 0.36 ㎎/㎖ 및 제오신(인비트로젠) 0.1 ㎎/㎖이 보충된 DMEM을 함유하는 선택성 배지에서 37 ℃에서 재 도말하였다. 2 내지 4 주 후에, 제오신 내성 콜로니들을 선택하고, 확대시키고, 50 μM 페릴라틴에 대한 반응에 대해서 실시예 1에 개시된 바와 같이 칼슘 화상에 의해 시험하였다.
내성 콜로니들을 확대시키고, 50 μM 페릴라틴에 대한 그들의 반응에 의해 T1R2-TMD를 함유하는 것으로서 확인하였으며, 상기 반응은 10 ㎍/㎖의 테트라사이클린으로 T1R2-TMD 발현을 유도함에 따른, 실시예 1에 개시된 방법을 사용하여 FLIPR-테트라 기구(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 자동화된 형광측정 화상을 통해 측정되었다.
모든 잠재적인 클론들을 또한 테트라사이클린 유도의 부재 하에서 50 μM 페릴라틴에 대한 작용 반응에 대해 평가하여 기본적으로 낮은 수준이지만 작용상 충분한 수준의 T1R2-TMD 수용체를 발현하는 임의의 클론들을 확인하였다(상기 티-렉스 HEK-293(인비트로젠)과 같은 테트라사이클린-조절된 시스템은 상기 시스템의 고유 누출성으로 인해 낮은 수준의 트랜스유전자 기초 발현을 갖는 것으로 공지되어 있다).
상기 평가의 결과로서, 상기 세포 주가 페릴라틴에 노출될 때, 많은 세포 클론들이 음성 대조군(Gα16거스트44 불규칙 G-단백질을 발현하지만 T1R2-TMD는 발현하지 않는 세포)의 신호에 비해 10 배를 초과하는 신호를 갖는 현저한 형광 증가와 함께 상기 자극에 반응한다.
신호들은 상기 T1R2-TMD의 과발현을 유도하는 테트라사이클린으로 처리된 세포에서 현저하게 더 낮다. 테트라사이클린-유도된 T1R2-TMD 세포에서 반응의 결여는 상기 T1R2-TMD의 테트라사이클린-유도된 과발현으로부터 생성되는 세포 독성에 기인할 수 있다.
평균[RFU] S.D.[RFU]
T1R2-TMD/Gα16거스트44 973.06 69.48
Gα16거스트44 단독(음성 대조군) 73.78 55.43
7. T1R2 / T1R3 단맛 수용체 이종이량체 및 Gα 16거스트44를 안정하게 발현하는 세포 의 형질감염
T1R3을 2 개 단백질 모두의 구성적 과발현의 가능한 세포독성 효과를 피하기 위해서 테트라사이클린-조절된 T1R2의 존재 하에서 구성적으로 과발현시켰다. 이종이량체(T1R2)의 하나의 서브유닛을 테트라사이클린-조절된 벡터에 놓는 것은 상기 안정한 클론 주들의 생육성 및 작용성을 상응하게 최적화할 수 있도록 그의 발현 수준을 조절할 수 있게 한다.
인간 T1R2/T1R3 단맛 이종이량체를 안정하게 발현하는 인간 세포 주를, 상기 인간 T1R3을 함유하는 선형화된 pIRES-Puro 벡터(Clontech)를 먼저 Gα16거스트44 발현 세포 주(WO 2004/055048에 개시된 바와 같이 형성되었다)에 형질감염시킴으로써 생성시켰다. 상기 세포 주는 미각 수용체에 대해 향상된 커플링을 나타내며, 테트라사이클린 유도성이고, Gα16거스트44 불규칙 G-단백질을 안정하게 발현하며, HEK-293 티-렉스 세포 주(인비트로젠, 미국으로부터 상업적으로 입수할 수 있다)를 기본으로 한다. T1R3을 안정하게 발현하는 세포의 이종 집단을 생성시킨 후에, 인간 T1R2 cDNA를 함유하는 선형화된 pcDNA4-TO 벡터(인비트로젠)를 형질감염시켰다.
24 시간 후에, 상기 세포를 10% FBS, 블라스티시딘 0.005 ㎎/㎖, G418 0.36 ㎎/㎖ 및 퓨로마이신 0.4 ㎍/㎖이 보충된 글루타맥스(Glutamax) DMEM(인비트로젠)을 함유하는 선택성 배지에서 37 ℃에서 1:150,000 이하로 10x 희석하여 재 도말하였다. 이어서 2 주 후에 T1R3-발현 세포의 퓨로마이신 내성 이종 집단을 4 ㎍의 선형화된 T1R2 TMD 벡터 구조물 DNA 및 0.3 ㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠)으로 형질감염시켰다. 상기 리포펙타민/DNA 혼합물을 3 내지 4 시간 동안 상기 세포 상에서 배양하고 이어서 무 항생제, 혈청 함유 생육 배지로 교환하였다. 24 시간 후에, 상기 세포를 10% FBS, 블라스티시딘 0.005 ㎎/㎖, G418 0.36 ㎎/㎖, 퓨로마이신 0.4 g/㎖ 및 제오신 0.1 ㎎/㎖이 보충된 글루타맥스 DMEM을 함유하는 선택성 배지에서 37 ℃에서 재 도말하였다.
내성 콜로니들을 확대시키고, 슈크로스, 슈크랄로스, 아스파탐 및 아세설팜 K를 포함한 다양한 감미료 화합물에 대한 그들의 반응에 의해 T1R2/T1R3 단맛 이종이량체를 함유하는 것으로서 확인하였으며, 상기 반응은 실시예 1에 개시된 방법을 사용하여 FLIPR-테트라 기구(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 자동화된 형광측정 화상을 통해 측정되었다. 모든 잠재적인 클론들을 또한 테트라사이클린(T1R2의 과 발현을 유도하기 위해서) 10 ㎍/㎖의 존재 하에서 단맛 자극물질에 대한 작용 반응에 대해 평가하였다. 잠재적인 클론들을 또한 테트라사이클린 유도의 부재 하에서 시험하여 기본적으로 T1R2를 낮은 수준으로 발현하지만 T1R3와의 조립을 허용하기에 충분한 T1R2 수용체 발현을 가져서 작용성 단맛 이종이량체 복합체를 생성시키는 임의의 클론들을 확인하였다(상기 티-렉스 HEK-293(인비트로젠)과 같은 테트라사이클린-조절된 시스템은 상기 시스템의 고유 누출성으로 인해 낮은 수준의 트랜스유전자 기초 발현을 갖는 것으로 공지되어 있다).
상기 평가의 결과로서, 상기 세포 주(테트라사이클린으로 처리되지 않았다)가 단맛 자극물질에 노출될 때, 많은 세포 클론들이 현저한 형광 증가(음성 대조군 세포에서 10 배를 초과하는 신호)와 함께 상기 자극에 반응한다. 신호들은 상기 T1R2의 과발현을 유도하는 테트라사이클린으로 처리된 세포에서 더 낮다. 상기 테 트라사이클린-유도된 T1R2/T1R3 세포에서 보다 낮은 반응은 상기 T1R2의 테트라사이클린-유도된 과발현으로부터 생성되는 세포 독성에 기인할 수 있다. 단맛 자극물질에 대해 가장 큰 반응을 나타내는 하나의 클론 세포 주를 증식시켜 후속의 비교에 사용하였다.
8. CSR : T1R2 / CSR : T1R3 의 형질감염, 및 T1R2 / T1R3 이종 발현
사용된 형질감염된 벡터 구조물은 상술한 바와 같이 형성된 실시예 3, 4 및 5에 개시된 것들이었다. hCaSR의 경우, 전장 cDNA를 기본으로 하는 상업적으로 입수할 수 있는 pCMV-기재 벡터 구조물을 사용하였다(트루클론(TRUECLONE) 콜렉션, 오리진사, 미국).
Gα16거스트44(WO 2004/055048에 개시된 바와 같이 형성됨)를 안정하게 발현하는 HEK293T 세포를 CSR:T1R2 및 CSR:T1R3 벡터 구조물, 또는 T1R2 및 T1R3, 또는 hCaSR로 하기와 같이 형질감염시켰다:
0일째에, 상기 HEK293T/Gα거스트44 세포를 웰 당 8500 세포의 밀도로 96-웰의 검은색, 투명 바닥 플레이트에 도말하고 선택성 생육 배지에서 밤새 증식시켰다. 1일째에, 상기 배지를 무 항생제 및 무 혈청 생육 배지로 바꾸고 상기 세포를 각각 75 ng의 CSR:T1R2 및 CSR:T1R3(총 150 ng), T1R2 및 T1R3(총 150 ng), 또는 75 ng의 hCaSR 벡터 구조물 DNA 및 0.3 ㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 형질감염시켰다.
상기 hCaSR 벡터를 칼슘에 민감한 GPCR(상기 수용체는 칼슘에 민감하며 상기 칼슘 결합 부위가 상기 수용체의 VFT에 놓여있고, 상기 수용체로부터 상기 키메라 에 대한 VFT가 유도되므로)에 대한 양성 대조군으로서 사용한다.
CSR:T1R2/CSR:T1R3 및 T1R2/T1R3 이종이량체 중 어느 하나의 형질감염을 위해서, 각각 75 ng의 벡터 구조물을 한 쌍당 총 150 ng으로 합하고 0.3 ㎕의 리포펙타민 2000과 함께 사용하였다. 75 ng의 hCaSR 벡터 DNA를 상기 칼슘 감각 단량체 GPCR에 사용하였다.
상술한 리포펙타민/DNA 혼합물을 3 내지 4 시간 동안 상기 세포 상에서 배양하고 이어서 무 항생제, 혈청 함유 생육 배지로 대체시켰다. 상기 세포를 밤새 증식시키고 플루오-4 칼슘 분석을 실시예 1에 개시된 바와 같이 수행하였다.
상술한 벡터 구조물들 중 하나로 일시적으로 형질감염시킨 세포를 실시예 1에 개시된 바와 같이 형광 화상 플레이트 판독기(FLIPR-Tetra, 몰레큘러 디바이시즈)를 사용하여 확인하였다.
9. T1R2 - TMD 작용제로서 p- 에톡시벤즈알데하이드의 확인
사용된 세포는 Gα16거스트44를 안정하게 발현하고, 실시예 6에 개시된 바와 같이 형성된 T1R2-TMD로 안정하게 형질감염된 HEK293T 세포였다.
100 μM p-에톡시벤즈알데하이드에 대한 세포 내 칼슘 반응을 측정하였다.
세포를 8500 세포/웰의 밀도로, 검은색의 투명 바닥 플레이트(코스타(Costar))에 도말하고 48 시간 동안 선택성 생육 배지(실시예 6에 개시된 바와 같음)에서 유지시킨 후에 실시예 1에 개시된 바와 같이 수용체 활성을 측정하였다.
상기 세포를 테트라사이클린으로 유도하지 않았는데, 그 이유는 이미 선택된 특정 클론이 기본적으로 충분한 수준의 T1R2-TMD를 발현하여 리간드 자극에 이어서 세포 내 칼슘의 확고한 증가를 생성시켰기 때문이다.
상기 데이터를 실시예 1에 개시된 바와 같이 계산하였으며 상기 세포의 100 μM p-에톡시벤즈알데하이드에 의한 자극에 따라 기준 이상의 순 형광도 증가를 예시하였다. 상기 데이터는 6 개의 반복 실험의 평균±표준 편차를 나타낸다.
칼슘 신호전달의 현저한 증가가, 인간 T1R2-TMD를 안정하게 발현하는 세포에서 p-에톡시벤즈알데하이드에 의해 자극시 관찰되었지만, 음성 대조군(Gα16거스트44 키메라 G-단백질을 발현하지만 T1R2-TMD는 발현하지 않는 숙주 세포)에서는 관찰되지 않았다.
평균[RFU] S.D.[RFU]
T1R2-TMD/Gα16거스트44 728.135 211.5451
Gα16거스트44 단독
(음성 대조군)		 46.835 29.64899
Figure 112008072259412-pct00001
10. p-에톡시벤즈알데하이드에 대한 T1R2-TMD 동가동의체 및 T1R2/T1R3 이종이량체의 용량 반응 곡선
상기 방법은 T1R2-TMD 활성을 정량화하며, 예를 들어 단맛 자극물질을 포함한 확인된 강화제 후보의 효능을 예견하게 한다.
Gα16거스트44 및 T1R2-TMD(실시예 6에 개시된 바와 같이 형성된 것)를 안정하게 발현하는 HEK293T 세포에 칼슘 염료 플루오-4를 부하하고 p-에톡시벤즈알데하 이드에 대한 그의 반응을 실시예 1에 개시된 바와 같은 형광 칼슘 신호를 사용함으로써 측정한다. 상기 데이터를 실시예 1에 개시된 바와 같이 계산하였다(0.1 내지 200 μM의 범위에 걸쳐, 증가하는 용량의 p-에톡시벤즈알데하이드에 의한 상기 세포의 자극에 따른 기준 이상의 순 형광도 증가). 상기 데이터는 3 개의 반복 실험의 평균±표준 편차(STD)를 포함한다.
생체 내 관련성을 입증하기 위해서, T1R2-TMD 발현 세포에서 p-에톡시벤즈알데하이드에 의해 유도된 신호의 용량 반응 곡선을 T1R2/T1R3 이종이량체를 안정하게 발현하는 세포에서 획득한 신호와 비교한다. 상기 두 용량-반응 곡선은 밀접하게 부합하는 것으로 나타났다(도 1 참조).
상기 결과를 하기 표에 나타내며, 상기 용량 반응 곡선을 도 1에 도시한다. 상기 표 중의 데이터는 하기 나타낸 4-매개변수 로지스틱 비-선형 회귀 방정식을 사용하여 그래프패드 프리즘 소프트웨어 패키지(그래프패드 소프트웨어사(GraphPad Software, Inc))로 곡선-대입하였다:
Y = 기부 + (상부-기부)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope)
상기에서,
X는 p-에톡시벤즈알데하이드 농도의 대수이고, Y는 반응이고, EC50은 최대 반응의 50%를 유도하는 작용제 농도를 나타낸다.
반응 대 로그 농도의 플롯에서, Y 값은 S자 모양으로 증가하는 농도에 따라 상승하는 것으로 보인다.
수용체 감도를 가리키는 EC50 값(보다 낮은 EC50 값은 보다 큰 작용제에 대 한 감도를 가리킨다)을 절반 증분으로 200 μM 이하의 농도에 대한 p-에톡시벤즈알데하이드 농도 및 형광 데이터로부터 계산하였다(하기 표에 나타냄). T1R2-TMD에 대해 계산된 EC50은 124 μM이고 T1R2/T1R3 이종이량체의 경우는 64.51 μM이다. 상기 T1R2-TMD는 p-에톡시벤즈알데하이드에 대해 보다 큰 최대 반응을 나타내었지만 유사한 EC50을 가지며, 이는 상기 단맛 이종이량체와 동일한 감도 범위이며, 이는 T1R2-TMD가 생물학적으로 적합한 수용체임을 가리킨다.
Figure 112008072259412-pct00002
11. T1R2-TMD를 활성화시키지만 T1R2/T1R3 이종이량체는 활성화시키지 않는 화합물의 확인
실시예 1에 개시된 칼슘 흐름 분석을 사용하여, 88 개 시험 물질의 패널을 T1R2-TMD 수용체-의존 반응에 대해 평가하였다. 시험 물질들을 100 μM의 최종 농도로 중복 시험하였다. Gα16거스트44 및 T1R2-TMD 함유 세포(실시예 6에 개시된 바와 같이 형성됨)를 안정하게 발현하는 세포에서 상기 시험 물질에 의해 유도된 신호를 Gα16거스트44 및 T1R2/T1R3 이종이량체(실시예 7에 개시된 바와 같이 형성 됨)를 안정하게 발현하는 세포에서 획득한 신호와 비교하였으며, 음성 대조군으로서 Gα16거스트44를 안정하게 발현하는 세포를 사용하였다.
상기 데이터를 실시예 1에 개시된 바와 같이 계산하였으며(시험 작용제에 의한 상기 세포의 자극에 따른 기준 이상의 순 형광도 증가) T1R2-TMD를 강하게 활성화시키지만 T1R2/T1R3 이종이량체 또는 음성 대조군의 활성화는 거의 또는 전혀 유도하지 않는 상기 확인된 물질에 대한 칼슘 신호의 결과를 하기 표에 나타낸다. 상기 데이터는 하나의 전형적인 실험으로부터의 2 개의 반복 실험의 평균에 상응하며, 이를 후속 시험에서 확인하였다.
하기 표에 나타낸 상기 확인된 화합물에 대해서, 칼슘 신호의 현저한 증가가, T1R2-TMD를 안정하게 발현하는 세포에서 상기 화합물에 의해 자극 시 관찰되었다. 상기 T1R2/T1R3 이종이량체를 발현하는 세포는 상기 음성 대조군보다 현저하게 위에 있는 신호를 보이지 않았다.
상기 결과는 T1R2-TMD가 상기 T1R2/T1R3 이종이량체를 활성화시키지 않는 화합물에 의해 활성화됨을 나타낸다. 따라서, 상기 T1R2-TMD 동가동의체에 근거한 분석은 T1R3의 존재 하에서 수행되고 T1R2/T1R3 이종이량체에 근거한 분석을 사용하여 확인될 수 없는 강화제를 확인할 수 있다.
메틸 차비콜(FEMA #2411, 에스트라골(Estragole); p-메톡시알릴벤젠)은 단맛을 갖는 것으로 개시된 공지된 맛이며 상기 맛은 10 ppm에서 하기와 같이 개시된다: "달콤한, 풀 모양의, 아니스-회향풀 향", "달콤한, 페놀향, 아니스, 깔깔한, 조미한, 녹색, 풀, 박하" 향, 및 "달콤한, 감초맛, 페놀향, 잡초같은, 조미한, 셀러리 같은" 맛.
T1R2-TMD 활성 T1R2 TMD
AVG(RFU)		 T1R2 TMD
S.D.EV(RFU)		 단맛
AVG(RFU)		 단맛
S.D.EV(RFU)		 거스트44
AVG(RFU)		 거스트44
S.D.EV(RFU)
메틸 차비콜 728.135 211.5451357 21.195 3.896158364 46.835 29.64898734
Figure 112008072259412-pct00003
T1R3-TMD에 특이적으로 결합하는 화합물을 또한 상기 실시예 11에 개시된 바와 유사한 방법에 의해, 그러나 작용 분석 대신에 결합 분석을 사용하여 확인할 수 있다. 추가의 분석들을 하기 실시예 12A 및 12B에 사용된 바와 유사한 방법에 의해 T1R2-TMD/T1R3-TMD 이종이량체를 사용하여 수행할 수 있다.
12. CSR : T1R2 / CSR : T1R3 의 활성화
하기 개시된 수용체, 핵산, 폴리펩타이드, 방법 및 키트가 본 발명에서 수행된 시험관 내 분석의 예시적인 실시태양이지만(실시예 12A 및 12B), 다른 유사한 실시태양들을 사용하거나 또는 변경 및 첨가를 동일한 작용(들)을 수행하기 위해 상기 개시된 실시태양들에 대해 수행할 수도 있다. 더욱이, 다양한 실시태양들을 조합하여 목적하는 특징들을 제공할 수 있으므로, 개시된 모든 실시태양들이 반드시 서로에 대해 배타적일 필요는 없다. 변화를 상기 내용의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 수행할 수 있다. 따라서, 상기 수용체, 핵산, 폴리펩타이드, 방법 및 키트를 임의의 단일 실시태양으로 제한하지 않고, 오히려 청구의 범위의 인용에 따른 폭과 범위에서 해석해야 한다.
12A. CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체를 발현하는 일시적으로 형질감염된 세포 주의 제조 및 분석
다양한 리간드들에 의한 자극에 따른 세포 내 칼슘 반응을, Gα16거스트44를 안정하게 발현하고 CSR:T1/R2/CSR:T1R3 키메라 이종이량체로 형질감염시킨 HEK293T 세포에서 측정하였다. 상기 결과들을 실시예 5(상기 T1R2/T1R3 단맛 이종이량체를 형성시키기 위해)에 개시된 T1R2 벡터 구조물 및 T1R3 벡터 구조물 모두, 또는 실시예 4(단량체성 hCaSR을 형성시키기 위해서)에 개시된 hCaSR 벡터 구조물로 형질감염시킨 세포에서 획득한 결과들과 비교하였다.
상기 형질감염을 실시예 8에 개시된 바와 같이 수행하였다. 결과를 실시예 1에 개시된 바와 같이 계산하였다(데이터는 자극 후 기준 이상의 순 형광도 증가(상대 형광 유닛 또는 RFU)를 가리키고; 6 개 반복 실험의 평균(AVG)±표준 편차(S.D.)를 제공한다). 하기의 리간드들을 괄호 안에 나타낸 바와 같은 농도로 사용하여 상기 형질감염된 세포를 자극하였다: 염화 칼슘(2 mM), 슈크랄로스(0.5 mM), 아스파탐(0.85 mM), 페릴라틴(50 μM), 신나모나이트릴(100 μM), 사이클라메이트(1 mM), 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC)(0.33 mM). 상기 획득된 신호는 상기 형질감염된 수용체와의 직접 또는 간접적인 상호작용에 반응하는 상기 세포의 칼슘 증가에 상응하는 RFU의 형광이다("신호").
단맛 수용체를 발현하지 않는 구조물 없이 형질감염된, 목 형질감염된 HEK293T/Gα16거스트44 세포를 음성 대조군으로서 사용하여 형광의 배경 수준을 측정하였다. 상기 형질감염된 세포를 지시된 바와 같은 감미료, 및 칼슘 감각 도메인을 함유하는 단백질에 대한 양성 대조군(칼슘) 및 음성 대조군(C1 완충액)에 노출시킨다.
결과를 하기 표에 나타낸다. AVG 컬럼은 평균 형광을 제공하고 S.D. 컬럼은 시험된 다양한 벡터 구조물들 각각에 대한 6 개 반복물의 표준 편차를 제공한다.
Figure 112008072259412-pct00004
상기 음성 대조군/목 형질감염은 배경 신호에 상응하는 신호 수준을 나타낸다.
양성 대조군(칼슘)이 나타내는 바와 같이, 칼슘 감각 도메인을 갖는 모든 형질감염된 세포들은 칼슘에 반응한다(CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체 및 hCaCSR). 칼슘에 대한 상기 키메라 이종이량체의 반응을 단맛 이종이량체에 의해 획득한 것과 비교할 수 없다. 칼슘은 상기 T1R2/T1R3 단맛 이종이량체의 작용제가 아니므로, Gα16거스트44 G-단백질만을 발현하는 목 형질감염된 세포보다 더 큰 신호를 제공하지 않았다.
아스파탐 및 슈크랄로스의 경우, 신호는 T1R2/T1R3 이종이량체에 의해 형질감염된 세포에서만 검출된다. 이는, 슈크랄로스 및 아스파탐이 T1R2의 VFT(CSR:T1R 키메라로부터 부재한다)에서 결합하는 것으로 여겨지므로, 예상된다.
hCaSR은 염화 칼슘에만 반응하였으며 시험된 단맛 자극물질 중 어떤 것에 의해서도 활성화될 수 없었다. 염화 칼슘, 페릴라틴, 신나모나이트릴, 사이클라메이트 및 NDHC의 경우에, 상기 신호의 현저한 증가가 CSR:T1R2/CSR:T1R3 키메라 이종이량체를 발현하는 세포에서 관찰되었다. 페릴라틴, 신나모나이트릴, 사이클라메이트 및 NDHC의 경우, 상기 신호들은 T1R2/T1R3 이종이량체에 대해 검출된 신호에 필적하는 강도를 가졌다.
상기 키메라 CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체에 의해 형질감염된 세포에서 검출된 신호는 음성 대조군(목 형질감염된 HEK293T/Gα16거스트44 세포)에서 획득된 배경보다 현저하게 더 높았다.
상기 결과는 CSR:T1R2/CSR:T1R3가 칼슘, 페릴라틴, 사이클라메이트, 신나모나이트릴, 나린진 다이하이드로찰콘(NarDHC) 및 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC)에 의해 활성화되고 슈크랄로스 또는 아스파탐에 의해서는 활성화되지 않음을 입증한다. 사이클라메이트는 키메라 이량체를 활성화시키지만 T1R2-TMD는 활성화시키지 않으며, 이는 상기 사이클라메이트가 활성을 위해 T1R3 경막 도메인을 필요로 함을 가리킨다. 이는 사이클라메이트가 T1R3 경막 도메인에서 결합함을 가리키는 문헌의 발견과 일치한다. 다이하이드로찰콘은 세포 주로부터의 데이터를 근거로, 2 개의 경막 도메인 모두에 결합 부위를 갖는 것으로 보인다.
2B. CSR : T1R2 / CSR : T1R3 이종이량체를 발현하는 안정한 세포 주의 제조
CSR:T1R3을 테트라사이클린-조절된 CSR:T1R2의 존재 하에서 구성적으로 과발현시켜 상기 두 단백질 모두의 구성적 과발현의 가능한 세포독성 효과를 피한 안정한 세포 주를 생성시켰다. 상기 이종이량체의 하나의 서브유닛(CSR:T1R2)을 코딩하는 DNA를 테트라사이클린-조절된 벡터에 넣어 상기 안정한 클론 주의 생육력 및 작용성을 최적화할 수 있도록 그의 발현 수준을 조절하였다.
요컨대, 키메라 인간 CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체를 안정하게 발현하는 인간 세포주를 먼저, 인간 CSR:T1R2를 함유하는 선형화된 pcDNA4-TO 벡터(인비트로젠)를 Gα16거스트44 발현 세포 주(WO 2004/055048에 개시된 바와 같이 제조됨)에 형질감염시킴으로써 연속적으로 생성시켰다. 상기 Gα16거스트44 발현 세포 주는 미각 수용체에 대해 향상된 커플링을 나타내며, 테트라사이클린 유도성이고, Gα16거스트44 불규칙 G-단백질을 안정하게 발현하며, HEK-293 티-렉스 세포 주(인비트로젠, 미국으로부터 상업적으로 입수할 수 있다)를 기본으로 한다. CSR:T1R2를 발현하는 클론 세포 주를 확인하고 인간 CSR:T1R3 cDNA를 함유하는 선형화된 pcDNA3.1-하이그로 벡터(인비트로젠)로 형질감염시켜 CSR:T1R2와 CSR:T1R3을 모두 발현하는 이중의 안정한 클론 세포 주를 수득하였다.
상기 선형화된 CSR:T1R2/pcDNA4TO 구조물 4 마이크로그램 및 0.3 ㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠)으로 형질감염시킨 후 24 시간째에, 상기 세포를 10% FBS, 블라스티시딘 0.005 ㎎/㎖, G418 0.36 ㎎/㎖ 및 제오신 0.2 ㎍/㎖이 보충된 DMEM(인비트로젠)을 함유하는 선택성 배지에서 37 ℃에서 1:150,000 이하로 10x 희석하여 재 도말하였다. 2 내지 3 주 후에 제오신 내성 콜로니를 개별적으로 확대시키고 안정한 클론을, 상기 CSR:T1R2 cDNA의 발현을 허용하도록 테트라사이클린 10 ㎍/㎖로 4 시간 유도한 다음에 50 마이크로몰의 페릴라틴에 대한 작용 반응을 근거로 선택하였다. 본 발명자들은 상기 CSR:T1R2 cDNA의 최소 기본 발현을 나타내는 개별적인 클론(#17)을 확인하고 이를 상기 CSR:T1R3 구조물에 대한 수용자로서 사용하여 상기 이종이량체성 수용체 복합체의 안정한 세포 주를 생성시켰다. 상기 유도성 CSR:T1R2를 함유하는 클론 17을 4 ㎍의 선형화된 CSR:T1R3/pcDNA3.1-하이그로 벡터 구조물 DNA 및 0.3 ㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠)으로 형질감염시켰다. 상기 리포펙타민/DNA 혼합물을 3 내지 4 시간 동안 상기 세포 상에서 배양하고 이어서 무 항생제, 혈청 함유 생육 배지로 교환하였다. 24 시간 후에, 상기 세포를 10% FBS, 블라스티시딘 0.005 ㎎/㎖, G418 0.36 ㎎/㎖, 제오신 0.2 ㎎/㎖ 및 하이그로마이신 0.2 ㎎/㎖이 보충된 DMEM을 함유하는 선택성 배지에서 37 ℃에서 재 도말하였다.
내성 콜로니들을 확대시키고, 2 개의 페릴라틴 모두(CSR:T1R2의 결합/활성화에 의해 기여된) 및 나트륨 사이클라메이트(CSR:T1R3의 결합/활성화에 의해 기여된)에 대한 반응을 근거로 상기 CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체를 함유하는 것으로서 확인하였으며, 이는 실시예 1에 개시된 방법을 사용하여 FLIPR-테트라 기구(몰레큘러 디바이시즈) 상에서 자동화된 형광측정 화상을 통해 측정되었다. 모든 잠재적인 클론들을 테트라사이클린(CSR:T1R2의 과 발현을 유도하기 위해서) 10 ㎍/㎖에 의한 유도에 따른 단맛 자극물질에 대한 작용 반응에 대해 평가하였다. 잠재적인 클론들을 테트라사이클린 유도의 부재 하에서 또한 시험하여 기본적으로 T1R2를 낮은 수준으로 발현하지만 CSR:T1R3와의 조립을 허용하기에 충분한 CSR:T1R2 수용체 발현을 가져서 작용성 이종이량체 복합체를 생성시키는 임의의 클론들을 확인하였다(상기 티-렉스 HEK-293(인비트로젠)과 같은 테트라사이클린-조절된 시스템은 상기 시스템의 고유 누출성으로 인해 낮은 수준의 트랜스유전자 기초 발현을 갖는 것으로 공지되어 있다). 유도성 작용성 CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체를 발현하는 안정한 클론들을 상기 두 50 마이크로몰 페릴라틴 및 5 mM 나트륨 사이클라메이트에 대한 반응을 근거로 확인하였다. 다수의 단맛 자극물질에 대해 최대의 테트라사이클린 유도성 반응을 나타내는 하나의 클론 세포 주를 증식시키고 이를 후속 비교에 사용하였다.
Figure 112008072259412-pct00005
데이터는 하기 식을 사용하여 자극 후 기준에 대해 표준화된 형광도 증가(ΔF/F)를 가리킨다: ΔF/F = (F-F0)/F0(여기에서 F는 피크 형광도 신호이고, F0는 기준 형광도 신호이며, 이는 리간드 첨가 전 측정된 평균 형광도 신호로부터 측정된다). 상기 획득된 ΔF/F 값은 형질감염된 수용체와의 직접 또는 간접적인 상호작용에 반응한 세포의 칼슘 증가에 상응한다("신호")(3 개의 반복 실험의 평균(AVG) 및 표준 편차(S.D.)를 제공한다).
p-ETBZ = p-에톡시벤즈알데하이드
Figure 112008072259412-pct00006
나트륨 사이클라메이트(나트륨 이온은 수 가용성를 개선시키며, 단맛에는 기여하지 않는다)
나린진 DHC
Figure 112008072259412-pct00007
실시예 12A 또는 12B에 개략된 바와 유사한 방법에 의해 분석을 CSR:T1R2/T1R3 또는 T1R2/CSR:T1R3 이종이량체를 사용하여 수행한다. 상기 어느 경우든 CSR:T1R2 및 CSR:T1R3 단량체 구조물을 각각 상기 실시예 3 및 4에 개시된 바와 같이 생성시킨다. 야생형 T1R2 또는 T1R3 단량체를 상기 실시예 5에 개시된 바와 같이 생성시킨다. 이어서 이들 다른 이종이량체 중 하나를 발현하는 세포를 실시예 12B 및 상기 다른 어딘 가에 개시된 CSR:T1R2/CSR:T1R3 이종이량체 발현 세포의 제조에 대한 방법과 유사한 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 생성된 세포 주는 야생형 VFT 도메인을 발현하며 이를 사용하여, T1R2/T1R3 경막 도메인 결합제 자신들과의 조합 및 VFT 도메인 결합제와의 조합의 활성에 대한 분석을 포함하여, 실시예 1에 개시된 바와 같은 분석을 수행할 수 있다.
추가의 분석들을 실시예 12A 및 12B에 개시된 방법들과 유사한 방법들에 의해 수행하며, 상기 분석들은 CSR:T1R2/T1R3-TMD 및 T1R2-TMD/CSR:T1R3 이종이량체-발현 세포 주의 생성을 포함한다. 상기 어느 경우든 CSR:T1R2 및 CSR:T1R3 단량체 구조물을 각각 상기 실시예 3 및 4에 개시된 바와 같이 생성시킨다. T1R2-TMD 또는 T1R3-TMD의 발현을 지향하는 말단 절단된 수용체 벡터 구조물을 실시예 2에 나타낸 바와 유사한 방법에 의해 생성시킨다. 이어서 상기 이종이량체-발현 세포 주를 실시예 7 및 12B 및 상기 다른 어딘 가에 개시된 방법과 유사한 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 생성된 세포 주는 단일 CSR 세포 외 도메인을 함유하는 이종이량체를 발현하며 이를 사용하여 실시예 1에 개시된 바와 같은 분석을 수행할 수 있다.
추가로, 분석을 상기 미각 수용체의 경막 도메인에 결합하는 2 개 이상의 물질들을 결합시킴으로써 생성되는 수용체 활성에 대해 실시예 12A 및 12B에 개시된 방법에 의해 수행한다. 한편으로 실시예 12A 및 12B에 개시된 바와 유사한 방법을 사용하여, 단맛 강화제 후보와 칼슘 감각 수용체에 대한 리간드의 결합에 의해 생성된 수용체 활성을 시험할 수 있다. 상기 CSR:T1R2 또는 CSR:T1R3 수용체의 생성에 대한 방법(실시예 3 및 4)과 유사한 방법을 사용하여 또 다른 클래스 C GPCR 세포 외 도메인을 사용하는 키메라 수용체를 생성시킬 수 있다. 이어서 상기 또 다른 키메라 수용체를 본 발명에 개시된 바와 유사한 시험에 사용할 수 있다. 상기 또 다른 키메라 수용체는 다른 클래스 C GPCR, 예를 들어 대사성 글루타메이트 수용체(mGluR), GPRC형 수용체(즉 GPRC5 및 GPRC6a), V2R 페로몬 수용체, 및 GABA-B 수용체로부터의 세포 외 도메인을 포함한다.
13. 슈크로스 용액에 대한 단맛 강화제의 단맛 등강도를 측정하기 위한 등급 시험
비교 등급을 위해서, 0.5%, 1%, 1.5%, 7%, 8%, 9%, 10% 및 11% 슈크로스 용액의 샘플들을 제조하였다.
a) 슈크로스 용액 중에서의 단맛 강화제의 단맛 등강도
감각 평가를 등급 방법을 사용하여 수행하였다. 주변 온도의 샘플을 15 ㎖의 맹검 분액(패널리스트들에 의해 식별이 가능하지 않은)으로 랜덤하게 제공하였다. 패널은 10 명의 단맛 민감성 피실험자로 이루어졌으며 샘플을 한 기간에 걸쳐 3 회 반복해서 제공하였다. 각 샘플을 맛본 후에, 다음 샘플을 맛보기 전에 주변온도에서 입을 물로 철저히 헹구었다. 패널리스트에게 7%, 8%, 9%, 10%, 11% 슈크로스 샘플 및 단맛 검출 역치에 근접한 농도로 단맛 강화제를 갖는 7% 슈크로스의 6번째 샘플을 제공하였다. 이들에게 감지된 단맛에 대해 낮은 등급에서 높은 등급까지 샘플들의 순위를 매길 것을 요청하였다. R-지수(하기 참조)를 단맛 강화제가 있는 7% 슈크로스 대 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 11% 슈크로스에 대해 계산하였다.
b) 물 중에서 단맛 강화제의 역치 근접 단맛 등강도
상기 감각 평가를 등급 방법을 사용하여 수행하였다. 주변 온도의 샘플을 15 ㎖의 맹검 분액(패널리스트들에 의해 식별이 가능하지 않은)으로 랜덤하게 제공하였다. 패널은 10 명의 단맛 민감성 피실험자로 이루어졌으며 샘플을 한 기간에 걸쳐 3 회 반복해서 제공하였다. 각 샘플을 맛본 후에, 다음 샘플을 맛보기 전에 주변온도에서 입을 물로 철저히 헹구었다. 패널리스트에게 0.5% 및 1% 슈크로스 또는 1% 및 1.5% 슈크로스 및 단맛 검출 역치에 근접한 농도로 단맛 강화제를 갖는 물의 3번째 샘플을 제공하였다. 이들에게 감지된 단맛에 대해 낮은 등급에서 높은 등급까지 샘플들의 순위를 매길 것을 요청하였다. R-지수를 수중 단맛 강화제 대 0.5% 및 1% 슈크로스 또는 1% 및 1.5% 슈크로스에 대해 계산하였다. 상기 R-지수는 신호 검출에 근거한 분석 과정에 의해 획득된 통계치이고 하나의 샘플을 또 다른 것에 대해 선택하는 피실험자의 비율을 측정하는 최단 방법이다(O'Mahony, 1992, J. Sens. Stud., 7:1-47). 등급 유형의 감각 시험으로부터, 반응들의 행렬(하기 표 X 참조)을 각 세포가, 주어진 샘플이 특정 위치로 순위가 매겨진 회수를 함유하도록 작성한다.
1 번 위치 2 번 위치 3 번 위치(가장 달다)
샘플 X A B C
샘플Y D E F
샘플Z G H I
상기 행렬로부터, R-지수를 하기 식에 따라 계산할 수 있다:
R-지수(X 대 Y) = [A(E+F)+B(F)+0.5((A*D)+(B*E)+(C*F))]/[(A+B+C)*(D+E+F)]
필수적으로, 상기 R-지수는 2 개 샘플 간의 차이의 척도이다. 상기 R-지수는 50%의 검출 기회 수준을 갖는다. 따라서, 2 개의 샘플을 비교할 때, 유도되는 R-지수는 상기 샘플들이 상이한 것으로 간주되기 위해서는 현저하게 50% 차이가 나야 한다. 임계값은 상기 유도된 R-지수가 유의수준으로 간주되기 위해 일탈되어야 하는(즉 보다 크거나 작아야 하는) 통계적으로 적합한 값이다.
상기 보다 큰 임계값보다 큰 R-지수는 상기 단맛 강화제 샘플이 슈크로스 샘플보다 현저하게 더 달다는 것을 의미한다. R-지수가 상기 임계값과 크게 상이하지 않다는 것은 상기 단맛 강화제 샘플이 비교된 슈크로스 샘플과 동등한 단맛을 가짐을 의미한다. 상기 보다 낮은 임계값 아래의 R-지수는 상기 슈크로스 샘플이 상기 단맛 강화제 샘플보다 더 달다는 것을 가리킨다.
14. 물중에서의 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm 사이클라메이트의 등급 시험 및 그의 슈크로스 등강도 측정
수중 150 ppm, 200 ppm 또는 250 ppm을 함유하는 수성 혼합물을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형을 사용하여 0.5% 슈크로스 용액에 대한 등강도에 대해 평가하였다(사이클라메이트 농도를 변화시켰으며, 달리 과정들은 동일하게 남아있다). 결과를 하기 표에 제공한다.
사이클라메이트 용액[ppm] 단맛 샘플
(0.5% 슈크로스)		 R-지수[%] 임계값[%] p-값
150 같은 단맛 41% 35.39 P>0.05
200 덜 단맛 0% 35.39 P<0.05
250 덜 단맛 0% 35.39 P<0.05
보다 낮은 임계값(35.39%)에 근거한 기회와 현저하게 상이하지 않은 41%의 R-지수는 상기 150 ppm 사이클라메이트 샘플이 0.5% 슈크로스와 같은 단맛임을 의미한다. 상기 임계값(35.39%)보다 아래인 0%의 R-지수는 상기 200 ppm 및 250 ppm 사이클라메이트 샘플이 모두 0.5% 슈크로스보다 현저하게 더 단맛임을 의미한다.
15. 수중 250 ppm 사이클라메이트의 등급 시험, 그의 슈크로스 등강도 측정
수중 250 ppm 사이클라메이트 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법을 사용하여 0.5-1% 농도의 슈크로스 용액에 대한 등강도에 대해 평가하였다. 결과를 하기 표에 제공한다.
슈크로스 용액[중량/중량%] 단맛 샘플
(사이클라메이트, 250 ppm)		 R-지수[%] 임계값[%] p-값
0.5% 보다 단맛 89% 64.61 P<0.05
1% 덜 단맛 12% 35.39 P<0.05
상기 임계값(64.61%) 이상인 89%의 R-지수는 상기 사이클라메이트 샘플이 0.5% 슈크로스보다 더 단맛임을 의미한다. 상기 임계값(35.39%)보다 아래인 12%의 R-지수는 상기 사이클라메이트 샘플이 1% 슈크로스보다 현저하게 덜 단맛임을 의미한다. 보간법에 의해, 상기 250 ppm 사이클라메이트의 단맛은 약 0.75% 슈크로스와 같았다.
16. 수중 1700 - 2500 ppm 사이클라메이트의 등급 시험, 단맛에 대한 식별 수준 측정
수중 사이클라메이트 1700 ppm, 1900 ppm, 2100 ppm, 2300 ppm 및 2500 ppm의 용액을 실시예 13에 개시된 방법의 변형을 사용하여 단맛에 대해 순위를 매겼다(사이클라메이트를 초역치 감미료로서 사용하였다). 피실험자에게 1700 내지 2500 ppm 사이클라메이트를 함유하는 5 개의 샘플을 제공하고 최저 단맛에서부터 최고 단맛까지 순위를 매길 것을 요청하였다. 결과를 하기 표에 제공한다.
사이클라메이트 용액 A[ppm] 단맛
A 대 B		 사이클라메이트 용액 B[ppm] R-지수[%] 임계값[%] p-값
1700 보다 덜 달다 1900 90% 64.61 P<0.05
1900 보다 덜 달다 2100 81% 64.61 P<0.05
2100 보다 덜 달다 2300 76% 64.61 P<0.05
2300 보다 덜 달다 2500 76% 64.61 P<0.05
상기 임계값(64.61%) 이상인 90%의 R-지수는 상기 피실험자가 1900 ppm 사이클라메이트와 1700 ppm 사이클라메이트의 단맛을 식별할 수 있음을 의미한다. 상기 임계값(64.61%) 이상인 81%의 R-지수는 상기 피실험자가 2100 ppm 사이클라메이트와 1900 ppm 사이클라메이트의 단맛을 식별할 수 있음을 의미한다. 상기 임계값(64.61%) 이상인 76%의 R-지수는 상기 피실험자가 2300 ppm 사이클라메이트와 2100 ppm 사이클라메이트의 단맛을 식별할 수 있음을 의미한다. 상기 임계값(64.61%) 이상인 76%의 R-지수는 상기 피실험자가 2500 ppm 사이클라메이트와 2300 ppm 사이클라메이트의 단맛을 식별할 수 있음을 의미한다. 이러한 결과들을 근거로, 패널리스트들은 5 개의 사이클라메이트 농도를 서로 확실하게 식별할 수 있다.
17. 수중 75 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드의 등급 시험, 그의 슈크로스 등강도 측정
수중 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법을 사용하여 0.5-1% 농도의 슈크로스 용액에 대한 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
슈크로스 용액
[중량/중량%]		 단맛 샘플
(p-에톡시벤즈알데하이드, 75 ppm)		 R-지수[%] 임계값[%] p-값
0.5% 덜 단맛 7% 35.39 P<0.05
1% 덜 단맛 0% 35.39 P<0.05
상기 임계값(35.39%) 이하인 0% 또는 7%의 R-지수는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 0.5% 슈크로스보다 덜 단맛임을 의미한다. 보간법에 의해, 상기 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 단맛은 단맛이 0.25% 슈크로스와 같거나, 또는 단맛에 대한 검출 역치보다 낮았다.
18. 수중 0.5% 슈크로스의 등급 시험, 그의 p-에톡시벤즈알데하이드 등강도 측정
수중 0.5% 슈크로스 용액을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형(실시예 14에 대해서와 같이 변형시켰으나, 단 p-에톡시벤즈알데하이드 농도를 변화시켰다)을 사용하여 100 ppm 및 150 ppm 농도의 p-에톡시벤즈알데하이드 용액에 대한 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
p-에톡시벤즈알데하이드 용액[ppm] 단맛 샘플
(0.5% 슈크로스)		 R-지수[%] 임계값[%] p-값
100 같은 단맛 63% 64.61 P>0.05
150 덜 단맛 3% 35.39 P<0.05
임계값 범위(35.39-64.61%) 내에 있는 63%의 R-지수는 기회가 크게 다르지 않으며 이는 상기 0.5% 슈크로스 용액이 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수성 용액과 같은 강도임을 가리킨다. 상기 임계값(35.39%)보다 아래인 3%의 R-지수는 상기 0.5% 슈크로스의 용액이 150 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수성 용액보다 현저하게 덜 달다는 것을 의미한다.
19. 수중 600 - 1000 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드의 등급 시험, 단맛에 대한 식별 수준 측정
수중 p-에톡시벤즈알데하이드 600 ppm, 700 ppm, 800 ppm, 900 ppm 및 1000 ppm의 용액을 실시예 13의 방법의 변형을 사용하여 단맛에 대해 순위를 매겼다(p-에톡시벤즈알데하이드를 슈크로스 대신에 초역치 감미료로서 사용하였다). 피실험자에게 600 내지 1000 ppm p-에톡시벤즈알데하이드를 함유하는 5 개의 샘플을 제공하고 최저 단맛에서부터 최고 단맛까지 순위를 매길 것을 요청하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
p-에톡시벤즈알데하이드
용액 A[ppm]		 단맛
A 대 B		 p-에톡히벤즈알데하이드
용액 B[ppm]		 R-지수[%] 임계값[%] p-값
600 보다 덜 달다 700 74% 64.61 P<0.05
700 보다 덜 달다 800 72% 64.61 P<0.05
800 보다 덜 달다 900 67% 64.61 P<0.05
900 보다 덜 달다 1000 73% 64.61 P<0.05
상기 임계값(64.61%) 이상인 74%의 R-지수는 상기 피실험자가 700 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 단맛을 식별할 수 있음을 의미한다. 상기 임계값(64.61%) 이상인 72%의 R-지수는 상기 피실험자가 800 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 700 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 단맛을 식별할 수 있음을 의미한다. 상기 임계값(64.61%) 이상인 67%의 R-지수는 상기 피실험자가 900 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 800 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 단맛을 식별할 수 있음을 의미한다. 상기 임계값(64.61%) 이상인 73%의 R-지수는 상기 피실험자가 1000 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 900 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 단맛을 식별할 수 있음을 의미한다. 이러한 결과들을 근거로, 패널리스트들은 5 개의 p-에톡시벤즈알데하이드 농도를 서로 확실하게 식별할 수 있었다.
20. 수중 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 등급 시험, 그의 사이클라메이트 등강도 측정
수중 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형(사이클라메이트 농도를 p-에톡시벤즈알데하이드에 대해 등강도로 계산하기 위해 변화시켰다)을 사용하여 150-250 ppm 농도의 사이클라메이트 용액에 대한 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
사이클라메이트 용액
[ppm]		 단맛 샘플
(p-에톡시벤즈알데하이드, 100 ppm)		 R-지수[%] 임계값[%] p-값
150 같은 단맛 51% 64.61 P>0.05
200 덜 단맛 17% 35.39 P<0.05
250 덜 단맛 5% 35.39 P<0.05
상기 임계값 범위(35.39-64.61%) 이내인 51%의 R-지수는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 150 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛임을 의미한다. 상기 임계값(35.39%) 아래인 5% 및 17%의 R-지수는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 200 ppm 또는 250 ppm 사이클라메이트보다 덜 단맛임을 의미한다.
21. 7% 슈크로스 중 250 ppm 사이클라메이트의 등급 시험, 그의 슈크로스 등강도 측정
7% 슈크로스 샘플 중의 250 ppm 사이클라메이트를 실시예 13에 개시된 등급 방법을 사용하여 7 내지 11% 농도의 슈크로스 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 결과를 하기 표에 제공한다.
슈크로스 용액
[중량/중량%]		 사이클라메이트 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
7% 보다 단맛 96% 64.61 P<0.05
8% 보다 단맛 80% 64.61 P<0.05
9% 같은 단맛 38% 35.39 P>0.05
10% 덜 단맛 24% 35.39 P<0.05
11% 덜 단맛 0% 35.39 P<0.05
상기 임계값(64.61%)보다 높은 80% 및 96%의 R-지수는 상기 7% 슈크로스 중의 사이클라메이트 샘플이 7% 또는 8% 슈크로스 샘플보다 현저하게 더 단맛임을 의미한다. 상기 임계값 범위(35.39-64.61%) 이내인 38%의 R-지수는 기회가 같으며 이는 상기 사이클라메이트 샘플이 9% 슈크로스와 같은 단맛임을 의미한다. 상기 임계값(35.39%)보다 아래인 0% 내지 24%의 R-지수는 상기 사이클라메이트 샘플이 10% 또는 11% 슈크로스보다 덜 단맛임을 의미한다. 따라서, 7% 슈크로스 중의 250 ppm 사이클라메이트는 2°브릭스의 슈크로스 단맛 강도를 가하여 단맛을 9% 슈크로스 용액과 동등하게 향상시킨다. 상기 7% 슈크로스 + 250 ppm 사이클라메이트(250 ppm 사이클라메이트는 0.75% 슈크로스와 같은 단맛이다, 실시예 15 참조)는 상기 효과가 단지 추가적인 경우, 단맛이 7.5% 이상 9% 이하, 보간하여 7.75% 슈크로스와 같을 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 상기 나타낸 바와 같이, 250 ppm 사이클라메이트와 7% 슈크로스와의 조합은 상기 예상된 효과보다 명백히 더 큰, 9% 슈크로스와 단맛 등강도를 가졌다.
22. 1700 ppm 사이클라메이트 중 0.5% 슈크로스의 등급 시험, 그의 사이클라메이트 등강도 측정
1700 ppm 사이클라메이트 중의 0.5% 슈크로스 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형(사이클라메이트를 초역치 감미료로서 사용하였다)을 사용하여 1700 내지 2500 ppm 농도의 사이클라메이트 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 결과를 하기 표에 제공한다.
사이클라메이트 용액[ppm] 슈크로스 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
1700 더 단맛 85% 64.61 P<0.05
1900 같은 단맛 60% 64.61 P>0.05
2100 덜 단맛 21% 35.39 P<0.05
2300 덜 단맛 7% 35.39 P<0.05
2500 덜 단맛 4% 35.39 P<0.05
상기 임계값(64.61%)보다 높은 85%의 R-지수는 상기 1700 ppm 사이클라메이트 중의 슈크로스 샘플이 1700 ppm에서 사이클라메이트 샘플보다 현저하게 더 단맛임을 의미한다. 상기 임계값 범위(35.39-64.61%) 이내인 60%의 R-지수는 기회가 같으며 이는 상기 슈크로스 샘플이 1900 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛임을 의미한다. 상기 임계값(35.39%)보다 아래인 4% 내지 21%의 R-지수는 상기 슈크로스 샘플이 2100 ppm, 2300 ppm 및 2500 ppm 사이클라메이트보다 덜 단맛임을 의미한다. 따라서, 1700 ppm 사이클라메이트 중의 0.5% 슈크로스는 200 ppm 사이클라메이트와 동등한 단맛을 상기 샘플에 더한다(즉 1700 ppm 사이클라메이트 + 0.5% 슈크로스 = 1900 ppm 사이클라메이트). 이러한 등가는 수중 0.5% 슈크로스의 단맛과 150 ppm 사이클라메이트의 단맛을 비교한 결과(실시예 14 참조)에 의해 추가로 입증된다. 따라서, 1700 ppm 사이클라메이트 + 0.5% 슈크로스가 1850 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛인 것으로 예상될 수 있다.
상기 단맛 민감성 패널리스트들의 검출 역치는 사이클라메이트를 단맛에 대한 초역치 수준으로 사용하는 경우 200 ppm 사이클라메이트였다(실시예 16 참조). 패널리스트는 1850 ppm 사이클라메이트와 1900 ppm 사이클라메이트를 식별할 수 없을 것으로 예상할 수 있다. 요컨대, 상기 데이터는 사이클라메이트 단맛에 대한 슈크로스의 효과가 단지 추가적임을 가리킨다.
23. 1700 ppm 사이클라메이트 중 100 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드의 등급 시험, 그의 사이클라메이트 등강도 측정
1700 ppm 사이클라메이트 중의 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형을 사용하여 1700 내지 2500 ppm 농도의 사이클라메이트 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
사이클라메이트 용액[ppm] p-에톡시벤즈알데하이드 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
1700 더 단맛 87% 64.84 P<0.05
1900 더 단맛 80% 64.84 P<0.05
2100 같은 단맛 50% 64.84 P>0.05
2300 덜 단맛 22% 35.16 P<0.05
2500 덜 단맛 17% 35.16 P<0.05
상기 임계값(64.61%)보다 높은 80% 및 87%의 R-지수는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 1700 ppm 및 1900 ppm의 사이클라메이트 샘플보다 현저하게 더 단맛임을 가리킨다. 상기 임계값 범위(35.16-64.84%) 이내인 50%의 R-지수는 기회가 같으며 이는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 2100 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛임을 의미한다. 상기 임계값(35.16%)보다 아래인 17% 내지 22%의 R-지수는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 2300 ppm 또는 2500 ppm 사이클라메이트보다 덜 단맛임을 의미한다. 따라서, 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드는 1700 ppm 사이클라메이트에 400 ppm 사이클라메이트의 단맛을 더한다(즉 1700 ppm 사이클라메이트 + 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 = 2100 ppm 사이클라메이트). 수중 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 150 ppm 사이클라메이트의 비교(실시예 20 참조)에 의해, 1700 ppm 사이클라메이트 + 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드가 1850 ppm 사이클라메이트의 단맛과 같을 것으로 예상할 수 있다.
그러나, 상기 나타낸 바와 같이, 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 1700 ppm 사이클라메이트와의 혼합물은 2100 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛이고, 이는 명백히 예상된 효과보다 더 크며, 이는 상기 효과가 단지 추가적인 것이 아님을 가리킨다.
24. 7% 슈크로스 중 75 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드의 등급 시험, 그의 슈크로스 등강도 측정
7% 슈크로스 중의 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법을 사용하여 7 내지 11% 농도의 슈크로스 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
슈크로스 용액[중량/중량%] p-에톡시벤즈알데하이드 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
7% 더 단맛 74% 64.61% P<0.05
8% 같은 단맛 36% 35.39% P>0.05
9% 덜 단맛 12% 35.39% P<0.05
10% 덜 단맛 1% 35.39% P<0.05
11% 덜 단맛 0% 35.39% P<0.05
상기 높은 임계값(64.61%)보다 높은 74%의 R-지수는 상기 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 7% 슈크로스 보다 현저하게 더 단맛임을 의미한다. 상기 임계값 범위(35.39-64.61%) 이내인 36%의 R-지수는 기회가 같으며, 이는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 8% 슈크로스와 같은 단맛임을 의미한다. 상기 임계값(35.39%)보다 아래인 0%, 1% 및 12%의 R-지수는 상기 슈크로스 샘플이 상기 p-에톡시벤즈알데하이드 샘플보다 더 단맛임을 가리킨다. 상기 데이터는 7% 슈크로스와 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 혼합물의 인지된 단맛이 8% 슈크로스와 같은 단맛임을 나타낸다. 비교에 의해, 수중 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드는 0.5% 슈크로스 아래의 등강도를 가졌다(실시예 17 참조). 따라서, 7% 슈크로스 + 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 샘플은 상기 효과가 단지 추가적인 경우(실시예 17에 따라), 7.5% 슈크로스 미만, 보간하여 7.25% 슈크로스의 단맛과 같을 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 상기 나타낸 바와 같이, 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 7% 슈크로스와의 조합은 8% 슈크로스와 같은 단맛이며, 이는 명백히 예상된 효과보다 더 크다.
25. 7% 슈크로스 중 250 ppm 사이클라메이트 및 75 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드의 등급 시험, 슈크로스 등강도 측정
7% 슈크로스 중의 250 ppm 사이클라메이트 및 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 혼합물 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법을 사용하여 7 내지 11% 농도의 슈크로스 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
슈크로스 용액[중량/중량%] 혼합물 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
7% 더 단맛 98% 64.61 P<0.05
8% 더 단맛 93% 64.61 P<0.05
9% 더 단맛 74% 64.61 P<0.05
10% 덜 단맛 29% 35.39 P<0.05
11% 덜 단맛 12% 35.39 P<0.05
상기 높은 임계값(64.61%)보다 높은 74-98%의 R-지수는 상기 사이클라메이트/p-에톡시벤즈알데하이드 혼합물 샘플이 7%, 8% 및 9% 슈크로스 보다 더 단맛임을 가리킨다. 상기 임계값 범위(35.39%) 아래인 12 내지 29%의 R-지수는 상기 사이클라메이트/p-에톡시벤즈알데하이드 샘플이 10% 또는 11% 슈크로스보다 덜 단것을 가리킨다. 상기 데이터는 7% 슈크로스와 250 ppm 사이클라메이트 및 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 인지된 단맛이 9% 슈크로스의 단맛보다 현저하게 더 높지만 10% 슈크로스, 또는 보간법에 의해 9.5%의 단맛 아래임을 나타낸다.
비교에 의해, 수중 250 ppm 사이클라메이트는 0.5% 슈크로스 이상이지만 1% 슈크로스 아래, 보간하여 0.75%인 등강도를 갖고(실시예 14 및 15 참조), 수중 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드는 0.5% 슈크로스 아래, 보간하여 0.25%인 등강도를 가졌다(실시예 17 참조). 따라서, 7% 슈크로스 + 250 ppm 사이클라메이트(1% 슈크로스 이하 및 0.5% 슈크로스 이상, 보간하여 0.75% 슈크로스와 같은 단맛) 및 75 ppm p-에톡시벤즈알데하이드(0.5% 슈크로스 이하, 보간하여 0.25% 슈크로스와 같은 단맛)는 8.5% 슈크로스 이하, 또는 보간법에 의해 8% 슈크로스와 같은 단맛인 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 상기 측정된 등강도는 9% 슈크로스 이상, 보간하여 9.5% 슈크로스이며, 이는 명백히 상기 예상된 효과 이상이었다.
26. 1700 ppm 사이클라메이트 중 100 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드 및 0.5% 슈크로스의 등급 시험, 그의 사이클라메이트 등강도 측정
1700 ppm 사이클라메이트 중의 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 및 0.5% 슈크로스의 혼합물 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형을 사용하여 1700 내지 2500 ppm 농도의 사이클라메이트 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
사이클라메이트 용액[ppm] 혼합물 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
1700 더 단맛 98% 64.61 P<0.05
1900 더 단맛 94% 64.61 P<0.05
2100 더 단맛 79% 64.61 P<0.05
2300 같은 단맛 56% 64.61 P>0.05
2500 같은 단맛 44% 35.39 P>0.05
상기 높은 임계값(64.61%)보다 높은 79-98%의 R-지수는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드/슈크로스 혼합물 샘플이 1700 ppm, 1900 ppm 및 2100 ppm 사이클라메이트 보다 더 단맛임을 가리킨다. 상기 임계값 범위(35.39-64.61%) 이내인 56%의 R-지수는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드/사이클라메이트 샘플이 2300 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛임을 가리킨다. 보다 낮은 임계값(35.16%)과 기회가 같은 44%의 R-지수는 상기 p-에톡시벤즈알데하이드/사이클라메이트 샘플이 2500 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛임을 의미한다. 상기 데이터는 1700 ppm 사이클라메이트와 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 및 0.5% 슈크로스와의 인지된 단맛이 2100 ppm 사이클라메이트의 단맛보다 현저하게 더 높지만 2300 ppm 및 2500 ppm 사이클라메이트와 구분할 수 없었음을 나타낸다. 비교에 의해, 수중 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드는 150 ppm 사이클라메이트와 단맛이 같고(실시예 20 참조) 수중 0.5% 슈크로스는 150 ppm 사이클라메이트와 단맛이 같았다(실시예 14 참조). 따라서, 상기 1700 ppm 사이클라메이트 + 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드(150 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛) 및 0.5% 슈크로스(150 ppm 사이클라메이트와 같은 단맛)은 2100 ppm 사이클라메이트 이하, 또는 2000 ppm 사이클라메이트와 단맛이 같을 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 상기 측정된 등강도는 2100 ppm 사이클라메이트 이상이며, 2300 ppm 내지 2500 ppm 사이클라메이트의 등강도 범위를 가지며, 이는 명백히 상기 예상된(추가적인) 효과 이상이었다.
27. 600 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드의 수용액 중의 150 ppm 사이클라메이트의 등급 시험, 그의 p- 에톡시벤즈알데하이드 등강도 측정
600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액 중의 150 ppm 사이클라메이트의 혼합물 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형을 사용하여 600 내지 700 ppm 농도의 p-에톡시벤즈알데하이드 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
p-에톡시벤즈알데하이드 용액[ppm] 혼합물 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
600 더 단맛 92% 64.61 P<0.05
700 더 단맛 70% 64.61 P<0.05
상기 임계값(64.84%)보다 높은 92% 및 70%의 R-지수는 상기 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액 중의 150 ppm 사이클라메이트가 600 ppm 및 700 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 용액 단독보다 더 단맛임을 가리킨다.
비교에 의해, 수중 150 ppm 사이클라메이트는 수중 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 단맛이 같다(실시예 20 참조). 150 ppm 사이클라메이트의 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액에의 첨가는 상기 효과가 단지 추가적인 경우 700 ppm p-에톡사벤즈알데하이드의 수용액과 단맛이 같아야 한다. 그러나, 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액 중의 150 ppm 사이클라메이트는 700 ppm p-에톡시벤즈알데하이드보다 더 단 것으로 밝혀졌으며, 이는 명백히 예상된 효과 이상이었다.
28. 600 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드의 수용액 중의 0.5% 슈크로스의 등급 시험, 그의 p- 에톡시벤즈알데하이드 등강도 측정
0.5% 슈크로스 및 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액 중의 샘플 혼합물을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형을 사용하여 600 내지 700 ppm 농도의 p-에톡시벤즈알데하이드 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
p-에톡시벤즈알데하이드 용액[ppm] 혼합물 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
600 더 단맛 68% 64.61 P<0.05
700 같은 단맛 59% 64.61 P>0.05
상기 임계값(64.61%)보다 높은 68%의 R-지수는 상기 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액 중의 0.5% 슈크로스가 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 용액 단독보다 더 단맛임을 의미한다. 더 높은 임계값(64.61%)에서 기회가 같은 59%의 R-지수는 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액 중의 0.5% 슈크로스가 700 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액과 같은 단맛임을 의미한다.
비교에 의해, 수중 0.5% 슈크로스는 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 단맛이 같다(실시예 18 참조). 0.5% 슈크로스의 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드의 수용액에의 첨가는 700 ppm p-에톡사벤즈알데하이드의 수용액보다 더 달지 않았으며, 이는 상기 효과가 단지 추가적임을 의미한다.
29. 600 ppm p- 에톡시벤즈알데하이드 중의 150 ppm 사이클라메이트 및 0.5% 슈크로 스의 등급 시험, p- 에톡시벤즈알데하이드 등강도 측정
600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 중의 150 ppm 사이클라메이트 및 0.5% 슈크로스의 샘플 혼합물을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형을 사용하여 600 및 700 ppm 농도의 p-에톡시벤즈알데하이드 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 피실험자들은 단맛에 대한 방향 효과를 제거하기 위해 코에 클립을 끼울 것을 요청받았다. 결과를 하기 표에 제공한다.
p-에톡시벤즈알데하이드 용액[ppm] 혼합물 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
600 더 단맛 96% 64.61 P<0.05
700 더 단맛 94% 64.61 P<0.05
상기 임계값(64.61%)보다 높은 94% 및 96%의 R-지수는 상기 사이클라메이트/슈크로스 혼합물 샘플이 600 ppm 및 700 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 보다 더 단맛임을 가리킨다.
비교에 의해, 수중 150 ppm 사이클라메이트는 수중 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 단맛이 같고(실시예 20 참조), 수중 0.5% 슈크로스는 수중 100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 단맛이 같다(실시예 18 참조). 따라서, 수중 600 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 + 150 ppm 사이클라메이트(100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 같은 단맛) 및 0.5% 슈크로스(100 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 같은 단맛)는 800 ppm p-에톡시벤즈알데하이드와 단맛이 같을 것으로 예상된다. 상기 측정된 등강도는 700 ppm p-에톡시벤즈알데하이드 이상이었다.
30. 수중 60 ppm NarDHC 의 등급 시험, 그의 슈크로스 등강도 측정
수중 60 ppm NarDHC 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법의 변형을 사용하여 0.5-1% 농도의 슈크로스 용액에 대한 등강도에 대해 평가하였다. 결과를 하기에 제공한다.
슈크로스 용액[중량/중량%] 단맛 샘플(NarDHC, 60 ppm) R-지수[%] 임계값[%] p-값
0.5% 더 단맛 99% 64.61 P<0.05
1% 더 단맛 71% 64.61 P<0.05
1.5% 덜 단맛 20% 35.39 P<0.05
99% 및 71%의 R-지수는 임계값(64.61) 이상이며, 이는 상기 NarDHC 샘플이 0.5% 또는 1% 슈크로스보다 더 단 것을 가리킨다. 임계값(35.39%) 이하인 20%의 R-지수는 상기 NarDHC 샘플이 1.5% 슈크로스보다 현저하게 덜 단맛임을 의미한다.
보간법에 의해, 60 ppm NarDHC의 단맛은 약 1.25% 슈크로스와 동등하였다.
31. 수중 2 ppm NDHC 의 등급 시험, 그의 슈크로스 등강도 측정
수중 2 ppm NDHC 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법을 사용하여 0.5-1% 농도의 슈크로스 용액에 대한 등강도에 대해 평가하였다. 결과를 하기 표에 제공한다.
슈크로스 용액[중량/중량%] NDHC 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
0.5% 같은 단맛 41% 35.39 P>0.05
1% 덜 단맛 5% 35.39 P<0.05
임계값(35.39%64.61)보다 크게 높지 않은, 41%의 R-지수는 상기 NDHC 샘플이 0.5% 슈크로스와 같은 단맛임을 의미한다. 임계값(35.39%) 아래인 5%의 R-지수는 상기 NDHC 샘플이 1% 슈크로스보다 현저하게 덜 단맛임을 의미한다.
32. 수중 45 ppm, 50 ppm, 55ppm, 및 60 ppm NarDHC 대 0%, 0.5%, 1% 또는 1.5% 슈크로스의 짝 비교
수중 NarDHC(45 ppm, 50 ppm, 55 ppm, 60 ppm) 샘플을 실시예 13에 개시된 짝 비교의 변형을 사용하여 0.5-1% 농도의 슈크로스 용액에 대한 등강도에 대해 평가하였다. 상기 NarDHC 샘플을 0%, 0.5%, 1% 또는 1.5% 슈크로스와 비교하였다. 결과를 하기에 제공한다.
NarDHC[ppm] 비교의 결과 슈크로스[중량/중량%]
45 약간 더 단맛 0
45 같은 단맛 0.5
45 덜 단맛 1
50 현저하게 더 단맛 0.5
50 덜 단맛 1
55 현저하게 더 단맛 0.5
55 같은 단맛 1
60 현저하게 더 단맛 1
60 유의수준으로 덜 단맛 1.5
NarDHC의 45 ppm 용액은 0% 슈크로스에 비해 약간 더 달고 0.5% 슈크로스의 단맛과 같은 단맛이었다. 50 ppm NarDHC 샘플은 0.5% 슈크로스보다 현저하게 더 달았지만 1% 슈크로스보다 덜 단것으로 밝혀졌다. 상기 55 ppm NarDHC 샘플은 0.5% 슈크로스보다 현저하게 더 달았으며 1% 슈크로스의 단맛과 같은 단맛인 것으로 측정되었다. 상기 60 ppm NarDHC 샘플은 1% 슈크로스보다 현저하게 더 달았지만 1.5% 슈크로스보다 유의수준으로 덜 달았다.
33. 수중 60 ppm 나한과 추출물 대 0%, 0.5% 및 1% 슈크로스의 강제 선택 시험
감미료로서 나한과 추출물의 강제 선택 감각 평가를 하기의 변경을 가하여, 실시예 13에 개시된 바와 같이 수행하였다(강제 선택 방법에 대해서 또한 문헌[O'Mahony, 1992, J. Sens. Stud., 7:1-47]을 참조하시오): 나한과 추출물은 수중 60 ppm의 농도를 가졌으며 0% 슈크로스/물, 0.5% 슈크로스/물 또는 1% 슈크로스와 비교하였다. 결과를 하기 표에 나타낸다.
비교 슈크로스[중량/중량%] 더 단 것으로서 수중 나한과를 선택하는 패널리스트 수 더 단 것으로서 0% 또는 1% 슈크로스를 선택하는 패널리스트 수 유의수준(강제 선택)
1 0 30/30 0/30 p<0.001
2 0.5 28/30 2/30 p<0.001
3 1 6/30 24/30 p<0.001
상기 60 ppm 나한과 추출물은 그의 단맛 지각이 역치 농도에 가까우며 약간 단 1% 슈크로스보다 유의수준으로 덜 달다. 상기 수중 60 ppm 나한과 샘플은 모든 패널리스트들에 의해 0% 슈크로스/물보다 더 단 것으로서 인식되었다(30 명의 패널리스트들 중 30 명, p<0.001의 강제 선택에 대해 통계학적 유의수준). 0.63의 낮은 단맛 강도 등급은 매우 약하게 인지 가능한 단맛을 반영한다(0.1 등급을 갖는 0% 슈크로스에 비해. 최고로 상상할 수 있는 단맛 등급은 10이다). 상기 수중 60 ppm 나한과 샘플은 상기 패널리스트들의 거의 대다수에 의해 0.5% 슈크로스/물보다 더 단 것으로서 인식되었다(30 명의 패널리스트들 중 28 명, p<0.001의 강제 선택에 대해 통계학적 유의수준). 패널리스트의 대다수(30 명 중 24 명)는 p<0.001의 강제 선택에 대한 통계학적 유의수준으로, 60 ppm 나한과 추출 용액보다 더 단 것으로서 약간 단 1% 슈크로스 용액을 선택하였다. 수중 나한과 추출물에 대한 0.58 대 1% 슈크로스에 대한 0.72의 낮은 단맛 강도 등급은 나한과 60 ppm의 매우 약하게 인지 가능한 단맛을 반영하며, 이는 1% 슈크로스의 단맛보다 유의수준으로 덜 달다. 보간법에 의해, 60 ppm 나한과 추출물의 단맛은 약 0.75% 슈크로스와 동등하였다.
34. 수중 60 ppm 나한과 추출물 + 60 ppm NarDHC + 2 ppm NDHC 대 2.25% 슈크로스의 강제 선택 시험
나한과 추출물, NarDHC 및 NDHC의 혼합물의 강제 선택 시험을 하기의 변경을 가하여, 실시예 13에 개시된 바와 같이 수행하였다: 수중 60 ppm 나한과 추출물 + 60 ppm NarDHC + 2 ppm NDHC 샘플을 2.25% 슈크로스와 비교하였다. 상기 2.25% 슈크로스 농도는 각 단맛 강화제의 슈크로스에 대한 단맛 등강도의 보간하여 추가된 개별적인 효과보다 약간 적은 것으로 선택되었다: 2 ppm NDHC(실시예 31)의 경우 0.5% + 60 ppm 나한과 추출물(실시예 33)의 경우 0.75% + 60 ppm NarDHC(실시예 30 및 32)의 경우 1.25%. 상기 2ppm NDHC + 60 ppm 나한과 추출물 + 60 ppm NarDHC는 하기 표에 나타낸 바와 같이, 2.25% 슈크로스보다 유의수준으로 덜 달았다. 이러한 결과는 수중 단맛 강화제들의 혼합물(슈크로스의 첨가 없이)이 각 성분들을 합한 단맛보다 아래에 있음을 보인다. 더욱이, 상기 단맛 강화제는 그 자체가 서로의 단맛을 임의의 큰 정도로 강화시키지 않음을 알아야 한다.
슈크로스[중량/중량%] 더 단맛으로서 샘플을 선택하는 패널리스트 수 더 단맛으로서 2.25% 슈크로스를 선택하는 패널리스트 수 유의수준(강제 선택)
2.25 9/30 21/30 p=0.023
35. 7% 슈크로스 중 60 ppm 나한과 추출물 및 2 ppm NDHC 의 등급 시험, 그의 슈크로스 등강도 측정
7% 슈크로스 중의 60 ppm 나한과 추출물 + 2 ppm NDHC의 혼합물 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법을 사용하여 7 내지 11% 농도의 슈크로스 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 결과를 하기 표에 제공한다.
슈크로스 용액[중량/중량%] 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
7% 더 단맛 98% 72.18 P<0.001
8% 더 단맛 82% 72.18 P<0.001
9% 같은 단맛 43% 37.26 P>0.05
10% 덜 단맛 12% 27.82 P<0.001
11% 덜 단맛 4% 27.82 P<0.001
상기 임계값(72.18%)보다 높은 82 및 98%의 R-지수는 상기 NDHC + 나한과 샘플이 7% 또는 8% 슈크로스 샘플보다 유의수준으로 더 단맛임을 가리킨다. 기회가 현저하게 다르지 않은 43%의 R-지수는 상기 NDHC + 나한과 샘플이 9% 슈크로스와 같은 단맛임을 가리킨다. 상기 임계값(27.82%)보다 낮은 4 내지 12%의 R-지수는 상기 NDHC + 나한과 샘플이 10% 또는 11% 슈크로스보다 현저하게 덜 단것을 가리킨다. 상기 수중 2 ppm NDHC는 0.5% 슈크로스의 단맛 등강도를 갖는다(실시예 31 참조). 상기 수중 60 ppm 나한과는 0.5% 슈크로스 이상이지만 1% 슈크로스 아래인 등강도를 갖는다(보간법에 의해 0.75%)(실시예 33 참조). 따라서, 7% 슈크로스 + 2 ppm NDHC(0.5% 슈크로스와 같은 강도) + 60 ppm 나한과 추출물(1% 슈크로스 이하와 같은 강도, 보간하여 0.75% 슈크로스)은 8.5% 슈크로스 이하, 또는 보간법에 의해 8.25% 슈크로스와 같은 단맛인 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 상기 측정된 등강도는 9% 슈크로스였으며, 이는 명백히 단지 추가적인 효과 이상이었다.
36. 7% 슈크로스 중 60 ppm 나한과 추출물 + 60 ppm NarDHC + 2 ppm NDHC 의 등급 시험, 그의 슈크로스 등강도 측정
7% 슈크로스 중의 60 ppm 나한과 추출물 + 60 ppm NarDHC + 2 ppm NDHC의 샘플을 실시예 13에 개시된 등급 방법을 사용하여 7 내지 11% 농도의 슈크로스 용액에 대한 그의 등강도에 대해 평가하였다. 결과를 하기 표에 제공한다.
슈크로스 용액[중량/중량%] 단맛 샘플 R-지수[%] 임계값[%] p-값
7% 더 단맛 100% 74.89 P<0.001
8% 더 단맛 100% 74.89 P<0.001
9% 더 단맛 90% 74.89 P<0.001
10% 더 단맛 79% 74.89 P<0.001
11% 같은 단맛 48% 74.89 P>0.001
상기 임계값(74.89%)보다 높은 79-100%의 R-지수는 상기 NDHC + 나한과 + NarDHC 샘플이 7%, 8%, 9% 및 10% 슈크로스 샘플보다 현저하게 더 단맛임을 가리킨다. 50% 내지 상기 임계값(74.89%)까지의 R-지수는 상기 NDHC + 나한과 + NarDHC 샘플이 비교된 슈크로스 샘플과 동등한 단맛을 가짐을 의미할 수 있다. 48%에서, 상기 NDHC + 나한과 + NarDHC 샘플은 11% 슈크로스와 동등하였다. 비교에 의해, 수중 2 ppm NDHC는 0.5% 슈크로스의 단맛 등강도를 갖는다(실시예 31 참조). 상기 수중 60 ppm NarDHC는 1% 슈크로스 이상이지만 1.5% 슈크로스 아래, 보간하여 1.25% 슈크로스인 등강도를 가졌다(실시예 30 및 32 참조). 상기 수중 60 ppm 나한과는 0.5% 이상이지만 1% 슈크로스 아래, 보간하여 0.75% 슈크로스인 등강도를 가졌다(실시예 33 참조). 따라서, 7% 슈크로스 + 2 ppm NDHC(0.5% 슈크로스와 같은 강도) + 60 ppm NarDHC(1.5% 슈크로스 이하, 보간하여 1.25% 슈크로스와 같은 강도) + 60 ppm 나한과 추출물(1% 슈크로스, 보간하여 0.75% 슈크로스와 같은 강도)은 10% 슈크로스 이하, 또는 보간법에 의해 9.5% 슈크로스와 같은 단맛인 것으로 예상될 수 있으며, 추가적인 효과로 추정된다. 더욱 또한, 수중 2ppm NDHC + 60 ppm 나한과 추출물 + 60 ppm NarDHC는 2.25% 슈크로스보다 덜 단맛인 것으로 측정되었으며(실시에 34 참조) 따라서 상기 7% 슈크로스 중의 상기 혼합물의 등강도는 9.25% 슈크로스보다 적은 것으로 예상될 수 있고, 이는 추가적인 효과로 추정된다. 그러나, 상기 측정된 단맛 등강도는 11% 슈크로스에 대한 등강도였으며, 이는 명백히 단지 추가적인 효과 이상이다.
SEQUENCE LISTING SEQ ID NO. 1: T1R2-TMD nucleic acid gca ccc acc atc gct gtg gcc ctg ctg gcc gcc ctg ggc ttc ctc agc 48 Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser 1 5 10 15 acc ctg gcc atc ctg gtg ata ttc tgg agg cac ttc cag aca ccc ata 96 Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln Thr Pro Ile 20 25 30 gtt cgc tcg gct ggg ggc ccc atg tgc ttc ctg atg ctg aca ctg ctg 144 Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu 35 40 45 ctg gtg gca tac atg gtg gtc ccg gtg tac gtg ggg ccg ccc aag gtc 192 Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val 50 55 60 tcc acc tgc ctc tgc cgc cag gcc ctc ttt ccc ctc tgc ttc aca att 240 Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile 65 70 75 80 tgc atc tcc tgt atc gcc gtg cgt tct ttc cag atc gtc tgc gcc ttc 288 Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe 85 90 95 aag atg gcc agc cgc ttc cca cgc gcc tac agc tac tgg gtc cgc tac 336 Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Tyr 100 105 110 cag ggg ccc tac gtc tct atg gca ttt atc acg gta ctc aaa atg gtc 384 Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu Lys Met Val 115 120 125 att gtg gta att ggc atg ctg gcc acg ggc ctc agt ccc acc acc cgt 432 Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro Thr Thr Arg 130 135 140 act gac ccc gat gac ccc aag atc aca att gtc tcc tgt aac ccc aac 480 Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys Asn Pro Asn 145 150 155 160 tac cgc aac agc ctg ctg ttc aac acc agc ctg gac ctg ctg ctc tca 528 Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu Leu Leu Ser 165 170 175 gtg gtg ggt ttc agc ttc gcc tac atg ggc aaa gag ctg ccc acc aac 576 Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu Pro Thr Asn 180 185 190 tac aac gag gcc aag ttc atc acc ctc agc atg acc ttc tat ttc acc 624 Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe Tyr Phe Thr 195 200 205 tca tct gtc tcc ctc tgc acc ttc atg tct gcc tac agc ggg gtg ctg 672 Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser Gly Val Leu 210 215 220 gtc acc atc gtg gac ctc ttg gtc act gtg ctc aac ctc ctg gcc atc 720 Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Ile 225 230 235 240 agc ctg ggc tac ttc ggc ccc aag tgc tac atg atc ctc ttc tac ccg 768 Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu Phe Tyr Pro 245 250 255 gag cgc aac acg ccc gcc tac ttc aac agc atg atc cag ggc tac acc 816 Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln Gly Tyr Thr 260 265 270 atg agg agg gac 828 Met Arg Arg Asp 275 SEQ ID NO. 2: T1R2-TMD protein Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser 1 5 10 15 Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln Thr Pro Ile 20 25 30 Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu 35 40 45 Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val 50 55 60 Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile 65 70 75 80 Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe 85 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Ser Ser Val Pro Thr Thr Leu Asp 1 5 10 15 cct ggg aat gca tcc tca gcc tgg ccc ctg gac acg tcc ctg ggg aat 96 Pro Gly Asn Ala Ser Ser Ala Trp Pro Leu Asp Thr Ser Leu Gly Asn 20 25 30 gca tct gct ggc act agc ctg gca gga ctg gct gtc agt ggc gaa ttc 144 Ala Ser Ala Gly Thr Ser Leu Ala Gly Leu Ala Val Ser Gly Glu Phe 35 40 45 SEQ ID NO. 4: SST TAG protein Met Ala Ala Val Thr Tyr Pro Ser Ser Val Pro Thr Thr Leu Asp Pro 1 5 10 15 Gly Asn Ala Ser Ser Ala Trp Pro Leu Asp Thr Ser Leu Gly Asn Ala 20 25 30 Ser Ala Gly Thr Ser Leu Ala Gly Leu Ala Val Ser Gly Glu Phe 35 40 45 SEQ ID NO. 5: HSV TAG nucleic acid tgc ggc cgc cag cct gaa ctc gct cct gaa gac ccg gaa gat taa 45 Cys Gly Arg Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 1 5 10 SEQ ID NO. 6: HSV TAG protein Cys Gly Arg Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 1 5 10 SEQ ID NO. 7: Forward primer for T1R2-TMD vector construct tatagaattc gcacccacca tcgctgtggc c 31 SEQ ID NO. 8: Reverse primer for T1R2-TMD vector construct atatgcggcc gcagtccctc ctcatggt 28 SEQ ID NO. 9: T1R2 full length nucleic acid atg ggg ccc agg gca aag acc atc tcc tcc ctg ttc ttc ctc cta tgg 48 Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Ser Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp 1 5 10 15 gtc ctg gct gag ccg gct gag aac tcg gac ttc tac ctg cct ggg gat 96 Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp 20 25 30 tac ctc ctg ggt ggc ctc ttc tcc ctc cat gcc aac atg aag ggc att 144 Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile 35 40 45 gtt cac ctt aac ttc ctg cag gtg ccc atg tgc aag gag tat gaa gtg 192 Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val 50 55 60 aag gtg ata ggc tac aac ctc atg cag gcc atg cgc ttt gcg gtg gag 240 Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu 65 70 75 80 gag atc aac aat gac agc agc ctg ctg cct ggt gtg ctg ctg ggc tat 288 Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr 85 90 95 gag atc gtg gat gtg tgc tac atc tcc aac aat gtc cag ccg gtg ctc 336 Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu 100 105 110 tac ttc ctg gca cac gag gac aac ctc ctt ccc atc caa gag gac tac 384 Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr 115 120 125 agt aac tac att tcc cgt gtg gtg gct gtc att ggc cct gac aac tcc 432 Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser 130 135 140 gag tct gtc atg act gtg gcc aac ttc ctc tcc cta ttt ctc ctt cca 480 Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro 145 150 155 160 cag atc acc tac agc gcc atc agc gat gag ctg cga gac aag gtg cgc 528 Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg 165 170 175 ttc ccg gct ttg ctg cgt acc aca ccc agc gcc gac cac cac atc gag 576 Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Ile Glu 180 185 190 gcc atg gtg cag ctg atg ctg cac ttc cgc tgg aac tgg atc att gtg 624 Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val 195 200 205 ctg gtg agc agc gac acc tat ggc cgc gac aat ggc cag ctg ctt ggc 672 Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly 210 215 220 gag cgc gtg gcc cgg cgc gac atc tgc atc gcc ttc cag gag acg ctg 720 Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu 225 230 235 240 ccc aca ctg cag ccc aac cag aac atg acg tca gag gag cgc cag cgc 768 Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg 245 250 255 ctg gtg acc att gtg gac aag ctg cag cag agc aca gcg cgc gtc gtg 816 Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val 260 265 270 gtc gtg ttc tcg ccc gac ctg acc ctg tac cac ttc ttc aat gag gtg 864 Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val 275 280 285 ctg cgc cag aac ttc act ggc gcc gtg tgg atc gcc tcc gag tcc tgg 912 Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp 290 295 300 gcc atc gac ccg gtc ctg cac aac ctc acg gag ctg cgc cac ttg ggc 960 Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Arg His Leu Gly 305 310 315 320 acc ttc ctg ggc atc acc atc cag agc gtg ccc atc ccg ggc ttc agt 1008 Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser 325 330 335 gag ttc cgc gag tgg ggc cca cag gct ggg ccg cca ccc ctc agc agg 1056 Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg 340 345 350 acc agc cag agc tat acc tgc aac cag gag tgc gac aac tgc ctg aac 1104 Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn 355 360 365 gcc acc ttg tcc ttc aac acc att ctc agg ctc tct ggg gag cgt gtc 1152 Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val 370 375 380 gtc tac agc gtg tac tct gcg gtc tat gct gtg gcc cat gcc ctg cac 1200 Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His 385 390 395 400 agc ctc ctc ggc tgt gac aaa agc acc tgc acc aag agg gtg gtc tac 1248 Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr 405 410 415 ccc tgg cag ctg ctt gag gag atc tgg aag gtc aac ttc act ctc ctg 1296 Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu 420 425 430 gac cac caa atc ttc ttc gac ccg caa ggg gac gtg gct ctg cac ttg 1344 Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu 435 440 445 gag att gtc cag tgg caa tgg gac cgg agc cag aat ccc ttc cag agc 1392 Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser 450 455 460 gtc gcc tcc tac tac ccc ctg cag cga cag ctg aag aac atc caa gac 1440 Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp 465 470 475 480 atc tcc tgg cac acc atc aac aac acg atc cct atg tcc atg tgt tcc 1488 Ile Ser Trp His Thr Ile Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser 485 490 495 aag agg tgc cag tca ggg caa aag aag aag cct gtg ggc atc cac gtc 1536 Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val 500 505 510 tgc tgc ttc gag tgc atc gac tgc ctt ccc ggc acc ttc ctc aac cac 1584 Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His 515 520 525 act gaa gat gaa tat gaa tgc cag gcc tgc ccg aat aac gag tgg tcc 1632 Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser 530 535 540 tac cag agt gag acc tcc tgc ttc aag cgg cag ctg gtc ttc ctg gaa 1680 Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu 545 550 555 560 tgg cat gag gca ccc acc atc gct gtg gcc ctg ctg gcc gcc ctg ggc 1728 Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly 565 570 575 ttc ctc agc acc ctg gcc atc ctg gtg ata ttc tgg agg cac ttc cag 1776 Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln 580 585 590 aca ccc ata gtt cgc tcg gct ggg ggc ccc atg tgc ttc ctg atg ctg 1824 Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu 595 600 605 aca ctg ctg ctg gtg gca tac atg gtg gtc ccg gtg tac gtg ggg ccg 1872 Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro 610 615 620 ccc aag gtc tcc acc tgc ctc tgc cgc cag gcc ctc ttt ccc ctc tgc 1920 Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys 625 630 635 640 ttc aca atc tgc atc tcc tgt atc gcc gtg cgt tct ttc cag atc gtc 1968 Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val 645 650 655 tgc 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Leu Gly Glu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln 355 360 365 cgc tgc ccg cag tgt gac tgc atc acg ctg cag aac gtg agc gca ggg 1152 Arg Cys Pro Gln Cys Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly 370 375 380 cta aat cac cac cag acg ttc tct gtc tac gca gct gtg tat agc gtg 1200 Leu Asn His His Gln Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val 385 390 395 400 gcc cag gcc ctg cac aac act ctt cag tgc aac gcc tca ggc tgc ccc 1248 Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro 405 410 415 gcg cag gac ccc gtg aag ccc tgg cag ctc ctg gag aac atg tac aac 1296 Ala Gln Asp Pro Val Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn 420 425 430 ctg acc ttc cac gtg ggc ggg ctg ccg ctg cgg ttc gac agc agc gga 1344 Leu Thr Phe His Val Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly 435 440 445 aac gtg gac atg gag tac gac ctg aag ctg tgg gtg tgg cag ggc tca 1392 Asn Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser 450 455 460 gtg ccc agg ctc cac gac gtg ggc agg ttc aac ggc agc 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ctg gct gct ttg ggg ctg ttc gtt cac 1776 Ser Leu Ala Leu Gly Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His 580 585 590 cat cgg gac agc cca ctg gtt cag gcc tcg ggg ggg ccc ctg gcc tgc 1824 His Arg Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys 595 600 605 ttt ggc ctg gtg tgc ctg ggc ctg gtc tgc ctc agc gtc ctc ctg ttc 1872 Phe Gly Leu Val Cys Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe 610 615 620 cct ggc cag ccc agc cct gcc cga tgc ctg gcc cag cag ccc ttg tcc 1920 Pro Gly Gln Pro Ser Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser 625 630 635 640 cac ctc ccg ctc acg ggc tgc ctg agc aca ctc ttc ctg cag gcg gcc 1968 His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala 645 650 655 gag atc ttc gtg gag tca gaa ctg cct ctg agc tgg gca gac cgg ctg 2016 Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu 660 665 670 agt ggc tgc ctg cgg ggg ccc tgg gcc tgg ctg gtg gtg ctg ctg gcc 2064 Ser Gly Cys Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala 675 680 685 atg ctg 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Leu Gly Gly Leu Phe Pro Ile His Phe Gly Val Ala Ala Lys Asp 35 40 45 caa gat ctc aaa tca agg ccg gag tct gtg gaa tgt atc agg tat aat 192 Gln Asp Leu Lys Ser Arg Pro Glu Ser Val Glu Cys Ile Arg Tyr Asn 50 55 60 ttc cgt ggg ttt cgc tgg tta cag gct atg ata ttt gcc ata gag gag 240 Phe Arg Gly Phe Arg Trp Leu Gln Ala Met Ile Phe Ala Ile Glu Glu 65 70 75 80 ata aac agc agc cca gcc ctt ctt ccc aac ttg acg ctg gga tac agg 288 Ile Asn Ser Ser Pro Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Leu Gly Tyr Arg 85 90 95 ata ttt gac act tgc aac acc gtt tct aag gcc ttg gaa gcc acc ctg 336 Ile Phe Asp Thr Cys Asn Thr Val Ser Lys Ala Leu Glu Ala Thr Leu 100 105 110 agt ttt gtt gct caa aac aaa att gat tct ttg aac ctt gat gag ttc 384 Ser Phe Val Ala Gln Asn Lys Ile Asp Ser Leu Asn Leu Asp Glu Phe 115 120 125 tgc aac tgc tca gag cac att ccc tct acg att gct gtg gtg gga gca 432 Cys Asn Cys Ser Glu His Ile Pro Ser Thr Ile Ala Val Val Gly Ala 130 135 140 act ggc tca ggc gtc tcc acg gca gtg gca aat ctg ctg ggg ctc ttc 480 Thr Gly Ser Gly Val Ser Thr Ala Val Ala Asn Leu Leu Gly Leu Phe 145 150 155 160 tac att ccc cag gtc agt tat gcc tcc tcc agc aga ctc ctc agc aac 528 Tyr Ile Pro Gln Val Ser Tyr Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ser Asn 165 170 175 aag aat caa ttc aag tct ttc ctc cga acc atc ccc aat gat gag cac 576 Lys Asn Gln Phe Lys Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp Glu His 180 185 190 cag gcc act gcc atg gca gac atc atc gag tat ttc cgc tgg aac tgg 624 Gln Ala Thr Ala Met Ala Asp Ile Ile Glu Tyr Phe Arg Trp Asn Trp 195 200 205 gtg ggc aca att gca gct gat gac gac tat ggg cgg ccg ggg att gag 672 Val Gly Thr Ile Ala Ala Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Pro Gly Ile Glu 210 215 220 aaa ttc cga gag gaa gct gag gaa agg gat atc tgc atc gac ttc agt 720 Lys Phe Arg Glu Glu Ala Glu Glu Arg Asp Ile Cys Ile Asp Phe Ser 225 230 235 240 gaa ctc atc tcc cag tac tct gat gag gaa gag atc cag cat gtg gta 768 Glu Leu Ile Ser Gln Tyr Ser Asp Glu Glu Glu Ile Gln His Val Val 245 250 255 gag gtg att caa aat tcc acg gcc aaa gtc atc gtg gtt ttc tcc agt 816 Glu Val Ile Gln Asn Ser Thr Ala Lys Val Ile Val Val Phe Ser Ser 260 265 270 ggc cca gat ctt gag ccc ctc atc aag gag att gtc cgg cgc aat atc 864 Gly Pro Asp Leu Glu Pro Leu Ile Lys Glu Ile Val Arg Arg Asn Ile 275 280 285 acg ggc aag atc tgg ctg gcc agc gag gcc tgg gcc agc tcc tcc ctg 912 Thr Gly Lys Ile Trp Leu Ala Ser Glu Ala Trp Ala Ser Ser Ser Leu 290 295 300 atc gcc atg cct cag tac ttc cac gtg gtt ggc ggc acc att gga ttc 960 Ile Ala Met Pro Gln Tyr Phe His Val Val Gly Gly Thr Ile Gly Phe 305 310 315 320 gct ctg aag gct ggg cag atc cca ggc ttc cgg gaa ttc ctg aag aag 1008 Ala Leu Lys Ala Gly Gln Ile Pro Gly Phe Arg Glu Phe Leu Lys Lys 325 330 335 gtc cat ccc agg aag tct gtc cac aat ggt ttt gcc aag gag ttt tgg 1056 Val His Pro Arg Lys Ser Val His Asn Gly Phe Ala Lys Glu Phe Trp 340 345 350 gaa gaa aca ttt aac tgc cac ctc caa gaa ggt gca aaa gga cct tta 1104 Glu Glu Thr Phe Asn Cys His Leu Gln Glu Gly Ala Lys Gly Pro Leu 355 360 365 cct gtg gac acc ttt ctg aga ggt cac gaa 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ctg gtg ggg aac tat tcc atc atc aac tgg cac ctc 1488 Glu Cys Gly Asp Leu Val Gly Asn Tyr Ser Ile Ile Asn Trp His Leu 485 490 495 tcc cca gag gat ggc tcc atc gtg ttt aag gaa gtc ggg tat tac aac 1536 Ser Pro Glu Asp Gly Ser Ile Val Phe Lys Glu Val Gly Tyr Tyr Asn 500 505 510 gtc tat gcc aag aag gga gaa aga ctc ttc atc aac gag gag aaa atc 1584 Val Tyr Ala Lys Lys Gly Glu Arg Leu Phe Ile Asn Glu Glu Lys Ile 515 520 525 ctg tgg agt ggg ttc tcc agg gag gtg ccg cgg tcc atg tgt tcc aag 1632 Leu Trp Ser Gly Phe Ser Arg Glu Val Pro Arg Ser Met Cys Ser Lys 530 535 540 agg tgc cag tca ggg caa aag aag aag cct gtg ggc atc cac gtc tgc 1680 Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val Cys 545 550 555 560 tgc ttc gag tgc atc gac tgc ctt ccc ggc acc ttc ctc aac cac act 1728 Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His Thr 565 570 575 gaa gat gaa tat gaa tgc cag gcc tgc ccg aat aac gag tgg tcc tac 1776 Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser Tyr 580 585 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ttg caa 1296 Ser Tyr Asn Val Tyr Leu Ala Val Tyr Ser Ile Ala His Ala Leu Gln 420 425 430 gat ata tat acc tgc tta cct ggg aga ggg ctc ttc acc aat ggc tcc 1344 Asp Ile Tyr Thr Cys Leu Pro Gly Arg Gly Leu Phe Thr Asn Gly Ser 435 440 445 tgt gca gac atc aag aaa gtt gag gcg tgg cag gtc ctg aag cac cta 1392 Cys Ala Asp Ile Lys Lys Val Glu Ala Trp Gln Val Leu Lys His Leu 450 455 460 cgg cat cta aac ttt aca aac aat atg ggg gag cag gtg acc ttt gat 1440 Arg His Leu Asn Phe Thr Asn Asn Met Gly Glu Gln Val Thr Phe Asp 465 470 475 480 gag tgt ggt gac ctg gtg ggg aac tat tcc atc atc aac tgg cac ctc 1488 Glu Cys Gly Asp Leu Val Gly Asn Tyr Ser Ile Ile Asn Trp His Leu 485 490 495 tcc cca gag gat ggc tcc atc gtg ttt aag gaa gtc ggg tat tac aac 1536 Ser Pro Glu Asp Gly Ser Ile Val Phe Lys Glu Val Gly Tyr Tyr Asn 500 505 510 gtc tat gcc aag aag gga gaa aga ctc ttc atc aac gag gag aaa atc 1584 Val Tyr Ala Lys Lys Gly Glu Arg Leu Phe Ile Asn Glu Glu Lys Ile 515 520 525 ctg tgg agt ggg ttc tcc agg gag gtg ccg cgg tcc cgg tgc tcg cgg 1632 Leu Trp Ser Gly Phe Ser Arg Glu Val Pro Arg Ser Arg Cys Ser Arg 530 535 540 cag tgc cag gag ggc cag gtg cgc cgg gtc aag ggg ttc cac tcc tgc 1680 Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys 545 550 555 560 tgc tac gac tgt gtg gac tgc gag gcg ggc agc tac cgg caa aac cca 1728 Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser Tyr Arg Gln Asn Pro 565 570 575 gac gac atc gcc tgc acc ttt tgt ggc cag gat gag tgg tcc ccg gag 1776 Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp Glu Trp Ser Pro Glu 580 585 590 cga agc aca cgc tgc ttc cgc cgc agg tct cgg ttc ctg gca tgg ggc 1824 Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg Phe Leu Ala Trp Gly 595 600 605 gag ccg gct gtg ctg ctg ctg ctc ctg ctg ctg agc ctg gcg ctg ggc 1872 Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly 610 615 620 ctt gtg ctg gct gct ttg ggg ctg ttc gtt cac cat cgg gac agc cca 1920 Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro 625 630 635 640 ctg gtt cag gcc tcg ggg ggg ccc ctg gcc tgc ttt ggc ctg gtg tgc 1968 Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys 645 650 655 ctg ggc ctg gtc tgc ctc agc gtc ctc ctg ttc cct ggc cag ccc agc 2016 Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser 660 665 670 cct gcc cga tgc ctg gcc cag cag ccc ttg tcc cac ctc ccg ctc acg 2064 Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr 675 680 685 ggc tgc ctg agc aca ctc ttc ctg cag gcg gcc gag atc ttc gtg gag 2112 Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu 690 695 700 tca gaa ctg cct ctg agc tgg gca gac cgg ctg agt ggc tgc ctg cgg 2160 Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg 705 710 715 720 ggg ccc tgg gcc tgg ctg gtg gtg ctg ctg gcc atg ctg gtg gag gtc 2208 Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val 725 730 735 gca ctg tgc acc tgg tac ctg gtg gcc ttc ccg ccg gag gtg gtg acg 2256 Ala Leu Cys Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr 740 745 750 gac tgg cac atg ctg ccc acg gag gcg ctg gtg cac tgc cgc aca cgc 2304 Asp Trp His Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg 755 760 765 tcc tgg gtc agc ttc ggc cta gcg cac gcc acc aat gcc acg ctg gcc 2352 Ser Trp Val Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala 770 775 780 ttt ctc tgc ttc ctg ggc act ttc ctg gtg cgg agc cag ccg ggc cgc 2400 Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Arg 785 790 795 800 tac aac cgt gcc cgt ggc ctc acc ttt gcc atg ctg gcc tac ttc atc 2448 Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile 805 810 815 acc tgg gtc tcc ttt gtg ccc ctc ctg gcc aat gtg cag gtg gtc ctc 2496 Thr Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu 820 825 830 agg ccc gcc gtg cag atg ggc gcc ctc ctg ctc tgt gtc ctg ggc atc 2544 Arg Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile 835 840 845 ctg gct gcc ttc cac ctg ccc agg tgt tac ctg ctc atg cgg cag cca 2592 Leu Ala Ala Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro 850 855 860 ggg ctc aac acc ccc gag ttc ttc ctg gga ggg ggc cct ggg gat gcc 2640 Gly Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala 865 870 875 880 caa ggc cag aat gac ggg aac aca gga aat cag ggg aaa cat gag tgc 2688 Gln Gly Gln Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu Cys 885 890 895 ggc cgc cag cct gaa ctc gct cct gaa gac ccg gaa gat 2727 Gly Arg Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 900 905 SEQ ID NO. 16: CSR::T1R3 protein Met Ala Phe Tyr Ser Cys Cys Trp Val Leu Leu Ala Leu Thr Trp His 1 5 10 15 Thr Ser Ala Tyr Gly Pro Asp Gln Arg Ala Gln Lys Lys Gly Asp Ile 20 25 30 Ile Leu Gly Gly Leu Phe Pro Ile His Phe Gly Val Ala Ala Lys Asp 35 40 45 Gln Asp Leu Lys Ser Arg Pro Glu Ser Val Glu Cys Ile Arg Tyr Asn 50 55 60 Phe Arg Gly Phe Arg Trp Leu Gln Ala Met Ile Phe Ala Ile Glu Glu 65 70 75 80 Ile Asn Ser Ser Pro Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Leu Gly Tyr Arg 85 90 95 Ile Phe Asp Thr Cys Asn Thr Val Ser Lys Ala Leu Glu Ala Thr Leu 100 105 110 Ser Phe Val Ala Gln Asn Lys Ile Asp Ser Leu Asn Leu Asp Glu Phe 115 120 125 Cys Asn Cys Ser Glu His Ile Pro Ser Thr Ile Ala Val Val Gly Ala 130 135 140 Thr Gly Ser Gly Val Ser Thr Ala Val Ala Asn Leu Leu Gly Leu Phe 145 150 155 160 Tyr Ile Pro Gln Val Ser Tyr Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ser Asn 165 170 175 Lys Asn Gln Phe Lys Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp Glu His 180 185 190 Gln Ala Thr Ala Met Ala Asp Ile Ile Glu Tyr Phe Arg Trp Asn Trp 195 200 205 Val Gly Thr Ile Ala Ala Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Pro Gly Ile Glu 210 215 220 Lys Phe Arg Glu Glu Ala Glu Glu Arg Asp Ile Cys Ile Asp Phe Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ile Ser Gln Tyr Ser Asp Glu Glu Glu Ile Gln His Val Val 245 250 255 Glu Val Ile Gln Asn Ser Thr Ala Lys Val Ile Val Val Phe Ser Ser 260 265 270 Gly Pro Asp Leu Glu Pro Leu Ile Lys Glu Ile Val Arg Arg Asn Ile 275 280 285 Thr Gly Lys Ile Trp Leu Ala Ser Glu Ala Trp Ala Ser Ser Ser Leu 290 295 300 Ile Ala Met Pro Gln Tyr Phe His Val Val Gly Gly Thr Ile Gly Phe 305 310 315 320 Ala Leu Lys Ala Gly Gln Ile Pro Gly Phe Arg Glu Phe Leu Lys Lys 325 330 335 Val His Pro Arg Lys Ser Val His Asn Gly Phe Ala Lys Glu Phe Trp 340 345 350 Glu Glu Thr Phe Asn Cys His Leu Gln Glu Gly Ala Lys Gly Pro Leu 355 360 365 Pro Val Asp Thr Phe Leu Arg Gly His Glu Glu Ser Gly Asp Arg Phe 370 375 380 Ser Asn Ser Ser Thr Ala Phe Arg Pro Leu Cys Thr Gly Asp Glu Asn 385 390 395 400 Ile Ser Ser Val Glu Thr Pro Tyr Ile Asp Tyr Thr His Leu Arg Ile 405 410 415 Ser Tyr Asn Val Tyr Leu Ala Val Tyr Ser Ile Ala His Ala Leu Gln 420 425 430 Asp Ile Tyr Thr Cys Leu Pro Gly Arg Gly Leu Phe Thr Asn Gly Ser 435 440 445 Cys Ala Asp Ile Lys Lys Val Glu Ala Trp Gln Val Leu Lys His Leu 450 455 460 Arg His Leu Asn Phe Thr Asn Asn Met Gly Glu Gln Val Thr Phe Asp 465 470 475 480 Glu Cys Gly Asp Leu Val Gly Asn Tyr Ser Ile Ile Asn Trp His Leu 485 490 495 Ser Pro Glu Asp Gly Ser Ile Val Phe Lys Glu Val Gly Tyr Tyr Asn 500 505 510 Val Tyr Ala Lys Lys Gly Glu Arg Leu Phe Ile Asn Glu Glu Lys Ile 515 520 525 Leu Trp Ser Gly Phe Ser Arg Glu Val Pro Arg Ser Arg Cys Ser Arg 530 535 540 Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys 545 550 555 560 Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser Tyr Arg Gln Asn Pro 565 570 575 Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp Glu Trp Ser Pro Glu 580 585 590 Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg Phe Leu Ala Trp Gly 595 600 605 Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly 610 615 620 Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro 625 630 635 640 Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys 645 650 655 Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser 660 665 670 Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr 675 680 685 Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu 690 695 700 Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg 705 710 715 720 Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val 725 730 735 Ala Leu Cys Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr 740 745 750 Asp Trp His Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg 755 760 765 Ser Trp Val Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala 770 775 780 Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Arg 785 790 795 800 Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile 805 810 815 Thr Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu 820 825 830 Arg Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile 835 840 845 Leu Ala Ala Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro 850 855 860 Gly Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala 865 870 875 880 Gln Gly Gln Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu Cys 885 890 895 Gly Arg Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 900 905 SEQ ID NO. 17: HSV tag at C-terminus nucleic acid tgc ggc cgc cag cct gaa ctc gct cct gaa gac ccg gaa gat taa 45 Cys Gly Arg Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 1 5 10 SEQ ID NO. 18: HSV tag at C-terminus protein Cys Gly Arg Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 1 5 10 SEQ ID NO. 19: hCaSR nucleic acid atg ggg ccc agg gca aag acc atc tcc tcc ctg ttc ttc ctc cta tgg 48 Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Ser Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp 1 5 10 15 gtc ctg gct gag ccg gct gag aac tcg gac ttc tac ctg cct ggg gat 96 Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp 20 25 30 tac ctc ctg ggt ggc ctc ttc tcc ctc cat gcc aac atg aag ggc att 144 Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile 35 40 45 gtt cac ctt aac ttc ctg cag gtg ccc atg tgc aag gag tat gaa gtg 192 Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val 50 55 60 aag gtg ata ggc tac aac ctc atg cag gcc atg cgc ttt gcg gtg gag 240 Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu 65 70 75 80 gag atc aac aat gac agc agc ctg ctg cct ggt gtg ctg ctg ggc tat 288 Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr 85 90 95 gag atc gtg gat gtg tgc tac atc tcc aac aat gtc cag ccg gtg ctc 336 Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu 100 105 110 tac ttc ctg gca cac gag gac aac ctc ctt ccc atc caa gag gac tac 384 Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr 115 120 125 agt aac tac att tcc cgt gtg gtg gct gtc att ggc cct gac aac tcc 432 Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser 130 135 140 gag tct gtc atg act gtg gcc aac ttc ctc tcc cta ttt ctc ctt cca 480 Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro 145 150 155 160 cag atc acc tac agc gcc atc agc gat gag ctg cga gac aag gtg cgc 528 Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg 165 170 175 ttc ccg gct ttg ctg cgt acc aca ccc agc gcc gac cac cac atc gag 576 Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Ile Glu 180 185 190 gcc atg gtg cag ctg atg ctg cac ttc cgc tgg aac tgg atc att gtg 624 Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val 195 200 205 ctg gtg agc agc gac acc tat ggc cgc gac aat ggc cag ctg ctt ggc 672 Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly 210 215 220 gag cgc gtg gcc cgg cgc gac atc tgc atc gcc ttc cag gag acg ctg 720 Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu 225 230 235 240 ccc aca ctg cag ccc aac cag aac atg acg tca gag gag cgc cag cgc 768 Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg 245 250 255 ctg gtg acc att gtg gac aag ctg cag cag agc aca gcg cgc gtc gtg 816 Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val 260 265 270 gtc gtg ttc tcg ccc gac ctg acc ctg tac cac ttc ttc aat gag gtg 864 Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val 275 280 285 ctg cgc cag aac ttc act ggc gcc gtg tgg atc gcc tcc gag tcc tgg 912 Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp 290 295 300 gcc atc gac ccg gtc ctg cac aac ctc acg gag ctg cgc cac ttg ggc 960 Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Arg His Leu Gly 305 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Asn Phe Thr Leu Leu 420 425 430 gac cac caa atc ttc ttc gac ccg caa ggg gac gtg gct ctg cac ttg 1344 Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu 435 440 445 gag att gtc cag tgg caa tgg gac cgg agc cag aat ccc ttc cag agc 1392 Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser 450 455 460 gtc gcc tcc tac tac ccc ctg cag cga cag ctg aag aac atc caa gac 1440 Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp 465 470 475 480 atc tcc tgg cac acc atc aac aac acg atc cct atg tcc atg tgt tcc 1488 Ile Ser Trp His Thr Ile Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser 485 490 495 aag agg tgc cag tca ggg caa aag aag aag cct gtg ggc atc cac gtc 1536 Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val 500 505 510 tgc tgc ttc gag tgc atc gac tgc ctt ccc ggc acc ttc ctc aac cac 1584 Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His 515 520 525 act gaa gat gaa tat gaa tgc cag gcc tgc ccg aat aac gag tgg tcc 1632 Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser 530 535 540 tac cag agt gag acc tcc tgc ttc aag cgg cag ctg gtc ttc ctg gaa 1680 Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu 545 550 555 560 tgg cat gag gca ccc acc atc gct gtg gcc ctg ctg gcc gcc ctg ggc 1728 Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly 565 570 575 ttc ctc agc acc ctg gcc atc ctg gtg ata ttc tgg agg cac ttc cag 1776 Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln 580 585 590 aca ccc ata gtt cgc tcg gct ggg ggc ccc atg tgc ttc ctg atg ctg 1824 Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu 595 600 605 aca ctg ctg ctg gtg gca tac atg gtg gtc ccg gtg tac gtg ggg ccg 1872 Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro 610 615 620 ccc aag gtc tcc acc tgc ctc tgc cgc cag gcc ctc ttt ccc ctc tgc 1920 Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys 625 630 635 640 ttc aca atc tgc atc tcc tgt atc gcc gtg cgt tct ttc cag atc gtc 1968 Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val 645 650 655 tgc gcc ttc aag atg gcc agc cgc ttc cca cgc gcc tac agc tac tgg 2016 Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp 660 665 670 gtc cgc tac cag ggg ccc tac gtc tct atg gca ttt atc acg gta ctc 2064 Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu 675 680 685 aaa atg gtc att gtg gta att ggc atg ctg gcc acg ggc ctc agt ccc 2112 Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro 690 695 700 acc acc cgt act gac ccc gat gac ccc aag atc aca att gtc tcc tgt 2160 Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys 705 710 715 720 aac ccc aac tac cgc aac agc ctg ctg ttc aac acc agc ctg gac ctg 2208 Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu 725 730 735 ctg ctc tca gtg gtg ggt ttc agc ttc gcc tac atg ggc aaa gag ctg 2256 Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu 740 745 750 ccc acc aac tac aac gag gcc aag ttc atc acc ctc agc atg acc ttc 2304 Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe 755 760 765 tat ttc acc tca tct gtc tcc ctc tgc acc ttc atg tct gcc tac agc 2352 Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser 770 775 780 ggg gtg ctg gtc acc atc gtg gac ctc ttg gtc act gtg ctc aac ctc 2400 Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu 785 790 795 800 ctg gcc atc agc ctg ggc tac ttc ggc ccc aag tgc tac atg atc ctc 2448 Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu 805 810 815 ttc tac ccg gag cgc aac acg ccc gcc tac ttc aac agc atg atc cag 2496 Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln 820 825 830 ggc tac acc atg agg agg gac tag 2520 Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp 835 SEQ ID NO. 20: hCaSR protein Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Ser Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp 1 5 10 15 Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile 35 40 45 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Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val 260 265 270 Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val 275 280 285 Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp 290 295 300 Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Arg His Leu Gly 305 310 315 320 Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser 325 330 335 Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg 340 345 350 Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn 355 360 365 Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val 370 375 380 Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His 385 390 395 400 Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr 405 410 415 Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu 420 425 430 Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu 435 440 445 Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser 450 455 460 Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp 465 470 475 480 Ile Ser Trp His Thr Ile Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser 485 490 495 Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val 500 505 510 Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His 515 520 525 Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser 530 535 540 Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu 545 550 555 560 Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly 565 570 575 Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln 580 585 590 Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu 595 600 605 Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro 610 615 620 Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys 625 630 635 640 Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val 645 650 655 Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp 660 665 670 Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu 675 680 685 Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro 690 695 700 Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys 705 710 715 720 Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu 725 730 735 Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu 740 745 750 Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe 755 760 765 Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser 770 775 780 Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu 785 790 795 800 Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu 805 810 815 Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln 820 825 830 Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp 835 SEQ ID NO. 21 caccaagctt atggcatttt atagctgc 28 SEQ ID NO. 22 atatccgcgg cacctccctg gagaaccc 28 SEQ ID NO. 23 atatccgcgg tccatgtgtt ccaagagg 28 SEQ ID NO. 24 atatgcggcc gcagtccctc ctcatggt 28 SEQ ID NO. 25 atatccgcgg tcccggtgct cgcggcag 28 SEQ ID NO. 26 atatgcggcc gcactcatgt ttcccctgat t 31 SEQ ID NO. 27 T1R3-TMD nucleic acid sequence (beginning from amino acid 539 on SEQ. ID. NO. 15) cgg tcc cgg tgc tcg cgg 1632 Arg Ser Arg Cys Ser Arg 540 cag tgc cag gag ggc cag gtg cgc cgg gtc aag ggg ttc cac tcc tgc 1680 Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys 545 550 555 560 tgc tac gac tgt gtg gac tgc gag gcg ggc agc tac cgg caa aac cca 1728 Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser Tyr Arg Gln Asn Pro 565 570 575 gac gac atc gcc tgc acc ttt tgt ggc cag gat gag tgg tcc ccg gag 1776 Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp Glu Trp Ser Pro Glu 580 585 590 cga agc aca cgc tgc ttc cgc cgc agg tct cgg ttc ctg gca tgg ggc 1824 Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg Phe Leu Ala Trp Gly 595 600 605 gag ccg gct gtg ctg ctg ctg ctc ctg ctg ctg agc ctg gcg ctg ggc 1872 Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly 610 615 620 ctt gtg ctg gct gct ttg ggg ctg ttc gtt cac cat cgg gac agc cca 1920 Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro 625 630 635 640 ctg gtt cag gcc tcg ggg ggg ccc ctg gcc tgc ttt ggc ctg gtg tgc 1968 Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys 645 650 655 ctg ggc ctg gtc tgc ctc agc gtc ctc ctg ttc cct ggc cag ccc agc 2016 Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser 660 665 670 cct gcc cga tgc ctg gcc cag cag ccc ttg tcc cac ctc ccg ctc acg 2064 Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr 675 680 685 ggc tgc ctg agc aca ctc ttc ctg cag gcg gcc gag atc ttc gtg gag 2112 Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu 690 695 700 tca gaa ctg cct ctg agc tgg gca gac cgg ctg agt ggc tgc ctg cgg 2160 Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg 705 710 715 720 ggg ccc tgg gcc tgg ctg gtg gtg ctg ctg gcc atg ctg gtg gag gtc 2208 Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val 725 730 735 gca ctg tgc acc tgg tac ctg gtg gcc ttc ccg ccg gag gtg gtg acg 2256 Ala Leu Cys Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr 740 745 750 gac tgg cac atg ctg ccc acg gag gcg ctg gtg cac tgc cgc aca cgc 2304 Asp Trp His Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg 755 760 765 tcc tgg gtc agc ttc ggc cta gcg cac gcc acc aat gcc acg ctg gcc 2352 Ser Trp Val Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala 770 775 780 ttt ctc tgc ttc ctg ggc act ttc ctg gtg cgg agc cag ccg ggc cgc 2400 Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Arg 785 790 795 800 tac aac cgt gcc cgt ggc ctc acc ttt gcc atg ctg gcc tac ttc atc 2448 Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile 805 810 815 acc tgg gtc tcc ttt gtg ccc ctc ctg gcc aat gtg cag gtg gtc ctc 2496 Thr Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu 820 825 830 agg ccc gcc gtg cag atg ggc gcc ctc ctg ctc tgt gtc ctg ggc atc 2544 Arg Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile 835 840 845 ctg gct gcc ttc cac ctg ccc agg tgt tac ctg ctc atg cgg cag cca 2592 Leu Ala Ala Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro 850 855 860 ggg ctc aac acc ccc gag ttc ttc ctg gga ggg ggc cct ggg gat gcc 2640 Gly Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala 865 870 875 880 caa ggc cag aat gac ggg aac aca gga aat cag ggg aaa cat gag tgc 2688 Gln Gly Gln Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu Cys 885 890 895 ggc cgc cag cct gaa ctc gct cct gaa gac ccg gaa gat 2727 Gly Arg Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 900 905 SEQ. ID. NO. 28 T1R3-TMD Protein sequence (beginning from 539 on SEQ. ID. No. 15) Arg Ser Arg Cys Ser Arg 540 Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys 545 550 555 560 Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser Tyr Arg Gln Asn Pro 565 570 575 Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp Glu Trp Ser Pro Glu 580 585 590 Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg Phe Leu Ala Trp Gly 595 600 605 Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly 610 615 620 Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro 625 630 635 640 Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys 645 650 655 Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser 660 665 670 Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr 675 680 685 Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu 690 695 700 Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg 705 710 715 720 Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val 725 730 735 Ala Leu Cys Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr 740 745 750 Asp Trp His Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg 755 760 765 Ser Trp Val Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala 770 775 780 Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Arg 785 790 795 800 Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile 805 810 815 Thr Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu 820 825 830 Arg Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile 835 840 845 Leu Ala Ala Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro 850 855 860 Gly Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala 865 870 875 880 Gln Gly Gln Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu Cys 885 890 895 Gly Arg Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 900 905

Claims (29)

  1. 레바우디오사이드 A, 모그로사이드 V, 스테비오사이드, 루부소사이드, 나린진 다이하이드로찰콘(NarDHC), 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 신나모나이트릴, 사이클라메이트 및 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는 단맛 강화제로서,
    단맛 역치에 근접한 농도 또는 단맛 역치 바로 아래의 농도의 상기 단맛 강화제를, G-단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥(venus fly-trap) 도메인에 결합할 수 있는 단맛 역치 초과 농도의 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질과 혼합하였을 때, 상기 단맛 강화제와 상기 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질의 혼합물의 단맛을, 상기 단맛 자극물질만을 함유하는 혼합물의 단맛과 상기 단맛 강화제만을 함유하는 혼합물의 단맛의 합보다 더 큰 방식으로 강화시키는데 사용하기 위한 단맛 강화제.
  2. 레바우디오사이드 A, 모그로사이드 V, 스테비오사이드, 루부소사이드, 나린진 다이하이드로찰콘(NarDHC), 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 신나모나이트릴, 사이클라메이트 및 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을, G-단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥 도메인에 결합할 수 있는 감미료와 혼합함을 포함하는 혼합물의 생산 방법으로서,
    이때 상기 감미료가 2% 이상의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 존재하며, 상기 화합물이 1 ppb 이상 내지 100,000 ppm의 농도로 존재하고, 상기 화합물이 감미료인 경우 2%(w/w) 미만의 슈크로스에 대한 단맛 등강도에서 그의 단맛 검출 역치에 근접한 농도로 존재하는, 방법.
  3. 2% 미만의 슈크로스 용액과 동등한 단맛을 나타내는 농도에서 단맛 검출 역치에 근접하거나 또는 단맛 검출 역치 바로 아래인 단맛 강화제 화합물을 소비재에 함유함을 포함하는 소비재에서 단맛을 강화시키는 방법으로서,
    상기 단맛 강화제 화합물이 레바우디오사이드 A, 모그로사이드 V, 스테비오사이드, 루부소사이드, 나린진 다이하이드로찰콘(NarDHC), 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 신나모나이트릴, 사이클라메이트 및 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC)으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 소비재가 단맛 검출 역치 초과의 농도에서 G-단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥 도메인에 결합할 수 있는 감미료를 함유하는, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    감미료가 2% 이상의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 존재하며, 단맛 강화제가 1 ppb 이상 내지 100,000 ppm의 농도로 존재하고 2%(w/w) 미만의 슈크로스에 대한 단맛 등강도에서 그의 단맛 검출 역치에 근접하는 것인, 방법.
  5. 단맛 역치에 근접한 농도 또는 단맛 역치 바로 아래의 농도의 레바우디오사이드 A를, G-단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥 도메인에 결합할 수 있는 단맛 역치 초과 농도의 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질과 혼합하였을 때, 레바우디오사이드 A와 상기 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질의 혼합물의 단맛을, 상기 단맛 자극물질만을 함유하는 혼합물의 단맛과 레바우디오사이드 A만을 함유하는 혼합물의 단맛의 합보다 더 큰 방식으로 강화시키는데 사용하기 위한 레바우디오사이드 A를 포함하는 단맛 강화제.
  6. 레바우디오사이드 A와 감미료를 혼합함을 포함하는 혼합물의 생산 방법으로서,
    이때 상기 감미료가 2% 이상의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 존재하고, 레바우디오사이드 A가 1 ppb 이상 내지 100,000 ppm의 농도로 존재하며 2%(w/w) 미만의 슈크로스에 대한 단맛 등강도에서 그의 단맛 검출 역치에 근접하는 것인, 방법.
  7. 단맛 역치에 근접한 농도 또는 단맛 역치 바로 아래의 농도의 모그로사이드 V를, G-단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥 도메인에 결합할 수 있는 단맛 역치 초과 농도의 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질과 혼합하였을 때, 모그로사이드 V와 상기 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질의 혼합물의 단맛을, 상기 단맛 자극물질만을 함유하는 혼합물의 단맛과 모그로사이드 V만을 함유하는 혼합물의 단맛의 합보다 더 큰 방식으로 강화시키는데 사용하기 위한 모그로사이드 V를 포함하는 단맛 강화제.
  8. 모그로사이드 V와 감미료를 혼합함을 포함하는 혼합물의 생산 방법으로서,
    이때 상기 감미료가 G-단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥 도메인에 결합할 수 있고 2% 이상의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 존재하고, 모그로사이드 V가 1 ppb 이상 내지 100,000 ppm의 농도로 존재하며 2%(w/w) 미만의 슈크로스에 대한 단맛 등강도에서 그의 단맛 검출 역치에 근접하는 것인, 방법.
  9. 레바우디오사이드 A와 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질의 혼합물의 단맛을, 상기 단맛 자극물질만을 함유하는 혼합물의 단맛과 레바우디오사이드 A만을 함유하는 혼합물의 단맛의 합보다 더 큰 방식으로 강화시키기 위한, 단맛 역치에 근접한 농도 또는 단맛 역치 바로 아래의 농도의 레바우디오사이드 A와, 단맛 역치 초과 농도의 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질을 포함하는 조성물로서, 이 때 상기 단맛 자극물질이 단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥 도메인에 결합할 수 있는 것인, 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    단맛 자극물질이 2% 이상의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 존재하고, 레바우디오사이드 A가 1 ppb 이상 내지 100,000 ppm의 농도로 존재하며 2%(w/w) 미만의 슈크로스에 대한 단맛 등강도에서 그의 단맛 검출 역치에 근접하는 것인, 조성물.
  11. 모그로사이드 V와 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질의 혼합물의 단맛을, 상기 단맛 자극물질만을 함유하는 혼합물의 단맛과 모그로사이드 V만을 함유하는 혼합물의 단맛의 합보다 더 큰 방식으로 강화시키기 위한, 단맛 역치에 근접한 농도 또는 단맛 역치 바로 아래의 농도의 모그로사이드 V와, 단맛 역치 초과 농도의 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질을 포함하는 조성물로서, 이 때 상기 단맛 자극물질이 단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥 도메인에 결합할 수 있는 것인, 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    단맛 자극물질이 2% 이상의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 존재하고, 모그로사이드 V가 1 ppb 이상 내지 100,000 ppm의 농도로 존재하며 2%(w/w) 미만의 슈크로스에 대한 단맛 등강도에서 그의 단맛 검출 역치에 근접하는 것인, 조성물.
  13. 레바우디오사이드 A, 모그로사이드 V, 스테비오사이드, 루부소사이드, 나린진 다이하이드로찰콘(NarDHC), 페릴라틴, p-에톡시벤즈알데하이드, 신나모나이트릴, 사이클라메이트 및 네오헤스페리딘 다이하이드로찰콘(NDHC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물과 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질의 혼합물의 단맛을, 상기 단맛 자극물질만을 함유하는 혼합물의 단맛과 상기 화합물만을 함유하는 혼합물의 단맛의 합보다 더 큰 방식으로 강화시키기 위한, 단맛 역치에 근접한 농도 또는 단맛 역치 바로 아래의 농도의 상기 화합물과, 단맛 역치 초과 농도의 공지된 또는 소정의 단맛 자극물질을 포함하는 조성물로서, 이 때 상기 단맛 자극물질이 단백질에 커플링된 수용체의 파리지옥 도메인에 결합할 수 있는 것인, 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    단맛 자극물질이 2% 이상의 슈크로스 용액에 대한 단맛 등강도를 나타내는 농도로 존재하고, 상기 화합물이 1 ppb 이상 내지 100,000 ppm의 농도로 존재하며 2%(w/w) 미만의 슈크로스에 대한 단맛 등강도에서 그의 단맛 검출 역치에 근접하는 것인, 조성물.
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