JP5465656B2 - 調節物質を同定するための方法 - Google Patents
調節物質を同定するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5465656B2 JP5465656B2 JP2010500047A JP2010500047A JP5465656B2 JP 5465656 B2 JP5465656 B2 JP 5465656B2 JP 2010500047 A JP2010500047 A JP 2010500047A JP 2010500047 A JP2010500047 A JP 2010500047A JP 5465656 B2 JP5465656 B2 JP 5465656B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sucralose
- cells
- seq
- receptor
- tag
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 71
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 174
- 239000004376 Sucralose Substances 0.000 claims description 98
- 235000019408 sucralose Nutrition 0.000 claims description 98
- BAQAVOSOZGMPRM-QBMZZYIRSA-N sucralose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](Cl)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@]1(CCl)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CCl)O1 BAQAVOSOZGMPRM-QBMZZYIRSA-N 0.000 claims description 98
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 75
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 71
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 71
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 66
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 54
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 40
- 102100025866 Taste receptor type 2 member 31 Human genes 0.000 claims description 39
- 108091005708 gustatory receptors Proteins 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 36
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 claims description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- 101000633010 Rattus norvegicus Somatostatin Proteins 0.000 claims description 21
- 101000892439 Homo sapiens Taste receptor type 2 member 10 Proteins 0.000 claims description 20
- 102100040649 Taste receptor type 2 member 10 Human genes 0.000 claims description 19
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 101000838287 Homo sapiens Taste receptor type 2 member 46 Proteins 0.000 claims description 12
- 102100029029 Taste receptor type 2 member 46 Human genes 0.000 claims description 12
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 claims description 10
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 claims description 6
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 101000626659 Homo sapiens Taste receptor type 2 member 1 Proteins 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 101000787841 Homo sapiens Taste receptor type 2 member 31 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024845 Taste receptor type 2 member 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 66
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 50
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 45
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 44
- 101710149046 Taste receptor type 2 member 31 Proteins 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 34
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 29
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 24
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 21
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 21
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 21
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 description 20
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 13
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 11
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 11
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 9
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 9
- -1 but not limited to Proteins 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 9
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 9
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 9
- XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N γS-GTP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 8
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 8
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 8
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 8
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- 206010013911 Dysgeusia Diseases 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 6
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 6
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 6
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- YRIPPWABYROTJJ-GQCTYLIASA-N (e)-4-(2,2,3-trimethylcyclopent-3-en-1-yl)but-2-enoic acid Chemical compound CC1=CCC(C\C=C\C(O)=O)C1(C)C YRIPPWABYROTJJ-GQCTYLIASA-N 0.000 description 5
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101710105094 Cyclic AMP-responsive element-binding protein Proteins 0.000 description 5
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 5
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 5
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 5
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000028956 calcium-mediated signaling Effects 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 4
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 4
- NEZJDVYDSZTRFS-RMPHRYRLSA-N Phenyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1 NEZJDVYDSZTRFS-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 4
- 102100040756 Rhodopsin Human genes 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 4
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 4
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N Fluo-4 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(F)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000018745 NF-KappaB Inhibitor alpha Human genes 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 description 3
- 102400000015 Vasoactive intestinal peptide Human genes 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[2-[2-[5-[3-(acetyloxymethoxy)-2,7-difluoro-6-oxoxanthen-9-yl]-2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]-n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(OCOC(C)=O)=C(F)C=C32)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N invicorp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N 0.000 description 3
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 3
- 239000013554 lipid monolayer Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 101001086405 Bos taurus Rhodopsin Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039215 Guanine nucleotide-binding protein G(t) subunit alpha-3 Human genes 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101100098799 Magnaporthe oryzae (strain 70-15 / ATCC MYA-4617 / FGSC 8958) TAS2 gene Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 2
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 2
- 108700025906 fos Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 108010005995 gustducin Proteins 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 210000003574 melanophore Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N probenecid Chemical compound CCCN(CCC)S(=O)(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010041071 proenkephalin Proteins 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 108010063331 type 2 taste receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHUDABBLXXYHKI-UHFFFAOYSA-N 4-(2,2,3-trimethylcyclopentyl)butanamide Chemical compound CC1CCC(CCCC(N)=O)C1(C)C AHUDABBLXXYHKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- KHOITXIGCFIULA-UHFFFAOYSA-N Alophen Chemical compound C1=CC(OC(=O)C)=CC=C1C(C=1N=CC=CC=1)C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1 KHOITXIGCFIULA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 102000004145 Annexin A1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000663 Annexin A1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108091006099 G alpha subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000034353 G alpha subunit Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 101000674775 Homo sapiens Taste receptor type 2 member 16 Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023482 Mitogen-activated protein kinase 14 Human genes 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- XCOJIVIDDFTHGB-UEUZTHOGSA-N Perillartine Chemical compound CC(=C)[C@H]1CCC(\C=N\O)=CC1 XCOJIVIDDFTHGB-UEUZTHOGSA-N 0.000 description 1
- 108010002724 Pheromone Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 1
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102100038931 Proenkephalin-A Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 101000829140 Rattus norvegicus Somatostatin receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 102000045879 Taste receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710129400 Taste receptor type 2 member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710149221 Taste receptor type 2 member 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100021234 Taste receptor type 2 member 16 Human genes 0.000 description 1
- 101710149002 Taste receptor type 2 member 16 Proteins 0.000 description 1
- 101710149372 Taste receptor type 2 member 46 Proteins 0.000 description 1
- 108091005711 Taste receptors type 2 (bitter) Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100038344 Vomeronasal type-1 receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 235000012180 bread and bread product Nutrition 0.000 description 1
- 102000036109 cAMP binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091010966 cAMP binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000002442 collagenase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940109275 cyclamate Drugs 0.000 description 1
- HCAJEUSONLESMK-UHFFFAOYSA-N cyclohexylsulfamic acid Chemical compound OS(=O)(=O)NC1CCCCC1 HCAJEUSONLESMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000007257 deesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 235000011850 desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000007938 effervescent tablet Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 102000045884 human TAS2R1 Human genes 0.000 description 1
- 102000056291 human TAS2R10 Human genes 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000031852 maintenance of location in cell Effects 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013384 milk substitute Nutrition 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000181 nicotinic agonist Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002427 pheromone receptor Substances 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960003081 probenecid Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000033300 receptor internalization Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 235000019614 sour taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005453 strychnine Drugs 0.000 description 1
- QMGVPVSNSZLJIA-FVWCLLPLSA-N strychnine Chemical compound O([C@H]1CC(N([C@H]2[C@H]1[C@H]1C3)C=4C5=CC=CC=4)=O)CC=C1CN1[C@@H]3[C@]25CC1 QMGVPVSNSZLJIA-FVWCLLPLSA-N 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000006068 taste-masking agent Substances 0.000 description 1
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000717 tumor promoter Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/30—Artificial sweetening agents
- A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
- A23L27/37—Halogenated sugars
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/84—Flavour masking or reducing agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/86—Addition of bitterness inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Description
苦味は、味覚受容体を介して知覚され、25種の機能的な苦味受容体のファミリー(TAS2RまたはT2R)が知られている。これらの受容体のいずれも、スクラロースにより活性化されることは、これまでに示されていない。
出願人は、これらの受容体のうち4種がスクラロースにより活性化されることを見出した。
この知見により、同定されたSABTRおよびこれらのアゴニストであるスクラロースを用いて、スクラロースに対するSABTRの応答を調節する成分、例えばスクラロース依存性SABTR活性化のアンタゴニスト(遮断剤、阻害剤またはマスキング剤)を同定する方法を提供することが可能となる。したがって、該方法により、(E)−4−(2,2,3−トリメチルシクロペンタ−3−エニル)ブト−2−エン酸について実証されたように、スクラロースに対する苦味マスキング剤を含む調節物質を同定することを可能にする。(E)−4−(2,2,3−トリメチルシクロペンタ−3−エニル)ブト−2−エン酸は、スクラロースに対するSABTRの応答を阻害すること、およびヒト官能評価においてスクラロースの苦い後味を著しく低減することが示された。
以下のものが提供される:
(1)スクラロースの味覚を調節する薬剤を同定するための方法であって:
(i)スクラロースにより活性化されることが可能なTAS2R苦味受容体を発現する細胞を、少なくとも1種の薬剤の存在下においてスクラロースと接触させること;および
(ii)前記少なくとも1種の薬剤が、前記TAS2R苦味受容体のスクラロースへの結合またはそれに対する機能的応答に影響を及ぼすか否かを決定すること、
を含み、ただし、前記細胞はそれらの天然の環境において操作されていない細胞ではない、前記方法。
配列番号2、配列番号4、配列番号6および配列番号8からなる群より選択されるポリペプチドに対して実質的に相同であり、少なくとも90%の配列同一性を有する、TAS2R苦味受容体;
配列番号1、配列番号3、および配列番号5、配列番号7からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して、配列同一性により決定される場合に実質的に相同である核酸、
配列番号1、配列番号3、および配列番号5、配列番号7からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して、ハイブリダイゼーションにより決定される場合に実質的に相同である核酸、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされるTAS2R苦味受容体、
ここで、前記ハイブリダイゼーションにより決定される場合に実質的に相同である核酸は、42℃の温度で、50%ホルムアミド、5×SSCおよび1%SDSからなる溶液中でのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、ならびに65℃で0.2×SSCおよび0.1%SDSからなる溶液中での洗浄で、ハイブリダイズし;
ここで、前記核酸は、任意に、対応するタンパク質において、その終末またはその付近に、C末端を形成するように配列番号12(HSVタグ)を含み、および任意に、その終末またはその付近にN末端を形成するように、任意に、ラットソマトスタチン(RSS)およびロドプシンから選択され、任意に、配列番号11(RSSタグ)から選択される膜輸送タグを含み、
およびここで、TAS2R苦味受容体ポリペプチド配列は、任意に、その終末またはその付近にC末端を形成するように配列番号12(HSVタグ)を含み、および任意に、その終末またはその付近にN末端を形成するように、任意に、ラットソマトスタチン(RSS)およびロドプシンから選択され、任意に、配列番号11(RSSタグ)から選択される膜輸送タグを含む。
(4)本明細書に記載の、(1)、(2)または(3)に記載のものを含む方法であって、細胞がまた、Gタンパク質、任意に、Gaq−ガストデューシン(Gaq-Gustducin)と実質的に相同な、またはキメラGアルファ16−ガストデューシン44と実質的に相同なキメラGタンパク質を発現する、前記方法。
(6)本明細書に記載の、(1)〜(5)に記載のものを含む方法であって、IP3およびカルシウム2+から選択される細胞内メッセンジャーの変化を測定することにより機能的応答を決定する、前記方法。
(8)本明細書に記載の、(7)に記載のものを含む方法であって、細胞が哺乳動物細胞を含む、前記方法。
(10)本明細書に記載の、(1)〜(9)に記載のものを含む方法であって、工程(i)が、TAS2R苦味受容体を(任意に塩化カルシウムの形態の)カルシウムの存在下において試験剤と接触させることをさらに含む、前記方法。
(i)(1)〜(3)において定義されるものを含む、本明細書において定義されるTAS2R苦味受容体を発現する細胞、および
(ii)スクラロース。
(i)(1)〜(3)において定義されるものを含む、本明細書において定義されるTAS2R苦味受容体を発現する組み換え細胞を増殖させること、
(ii)試験剤を、好適な濃度のスクラロースの存在下において添加すること、および
(iii)TAS2R苦味受容体へのスクラロースの結合に応答して変化するパラメーター、または細胞の機能的応答を、前記試験剤の存在下または不在下における前記パラメーターまたは機能的応答を比較することにより決定して、スクラロースの味覚を調節する試験剤を同定すること、
を含む、前記方法。
(i)TAS2R苦味受容体に対するスクラロースの結合に応答して変化するパラメーターまたは機能的応答を測定すること、および
(ii)試験剤に応答しての前記パラメーターの変化を、陰性対照と比較して決定し、それによりスクラロースの味覚の調節物質を同定すること、
を含む、前記方法。
本明細書において提供される方法は、SABTRに対するスクラロースの効果を増大または低下させる試験剤(調節物質)を同定することを可能にする。該方法は、インビボであってもインビトロであってもよい。スクラロース味覚調節物質(例としてスクラロース苦味遮断剤が挙げられるがこれに限定されない)としての試験剤の特性を決定するために、SABTRを任意にGタンパク質と共に発現する細胞を、スクラロースと組み合わせて該試験剤と接触させる。
SABTRに対する試験剤の効果は、SABTR結合のあらゆる好適なパラメーター、または活性化されたSABTRの機能的応答を試験することにより測定することができる。TAS2R受容体活性を検出するあらゆる好適なアッセイを用いることができる。
調節物質を同定するために用いることができる機能的応答は、SABTR活性により影響を受けるあらゆる生理学的変化を含む。多様なかかる変化が、異なる機能アッセイにおいて決定される。
例えば、対照(スクラロースを含むが調節物質を含まないもの)を、100の相対的受容体活性値に指定する。対照に対して相対的な活性の低下は、阻害剤またはアンタゴニストを同定し、一方、増大は増強剤を同定する。試験剤を含むサンプルにおける、試験剤を含まないサンプルと比較しての、または、試験剤を含むサンプルにおける、試験剤を含むが細胞がSABTRを発現しない(偽(mock)トランスフェクト細胞)対照サンプルと比較しての、例えば10%またはそれ以上の測定される活性の増大または低下(またはあらゆる実質的に有意な相違)を、有意とみなすことができる。
本明細書に記載のアゴニストの結合に対する機能的応答により引き起こされるパラメーターの変化を測定する機能アッセイに加えて、SABTRへのスクラロースの結合に対する効果を測定する結合アッセイにより、アゴニストの結合自体の変化を決定することができる。結合アッセイは当該分野において公知であり、溶液中で、二層膜において、任意に固相に結合した状態で、脂質単層において、または小胞中で、試験することができる。SABTRポリペプチドに対するスクラロースの結合における変化は、分光学的特徴(例えば、蛍光、吸光度または屈折率)を含むパラメーターを測定すること、流体力学法(例えば形状を用いて)およびクロマトグラフィー、SABTRポリペプチドの可溶性特性を測定することによって決定することができるが、これらに限定されない。一態様において、結合アッセイは、生化学的であり、組み換えSABTRポリペプチドを発現する細胞/組織からの膜抽出物を用いる。結合アッセイは、例えば、T1RsについてAdler et al.によってUS20050032158の段落[0169]〜[0198]に記載されるように行ってもよい。
限定することなく、アッセイにおいてSABTR受容体活性を測定する好適な検出方法の多様な例を本明細書において以下に記載する。
全ての機能アッセイは、その表面に受容体を発現する細胞を含むサンプルにより、または単離された細胞膜分画において行うことができる。有用な細胞は、上述してある。個別の細胞または細胞膜を含むサンプルの代わりに、トランスジェニック動物由来の組織を用いてもよい。
SABTRを天然に発現する単離された細胞または組織を、本明細書に記載の方法において用いることができる。あるいは、安定性または一過性の発現系を用いてSABTRを発現させてもよい。安定した細胞株の作製は周知であり、一例を、本明細書の例2に記載する。あるいは、SABTRを一過性に発現する細胞、例えばSABTRを一過性に発現するHEK293T/Gアルファ16−ガストデューシン44細胞を用いることができる。
好適な細菌細胞としてE. coliが挙げられるがこれに限定されない。
あるいは、本明細書において以下により詳細に記載するように、あらゆる好適なレポーター遺伝子を、SABTR活性化応答性プロモーターと結合させ、SABTR活性を決定するために用いてもよい。
あらゆる好適な発現ベクター、例えば、発現カセットを有するプラスミドベクターを用いることができる。例えば、pcDNA3.1ZeoまたはpcDNA5/FRT(Invitrogen、Carlsbad、CA、US)。
一過性発現のために、あらゆる好適なベクターを用いることができ、例えば、pcDNA5/FRTは有用な結果をもたらす。
SABTR構築物は、いわゆるタグを含むことができる。タグとして、膜輸送タグ、および免疫検出を非限定的に含むSABTRの検出のために用いられるタグが挙げられるが、これらに限定されない。
トランスフェクション後の期間、例えば48時間の後、細胞溶解物を調製し、タンパク質の正確な発現を確認するためにウェスタンブロット分析により分析してもよい。正確なタンパク質発現を確認したら、当該分野において周知の技術に従って、好適な細胞、例えばHEK293T細胞およびHEK T-Rex(登録商標)を含む哺乳動物細胞をトランスフェクトして、タンパク質を安定して発現する細胞を作製することができる。
上述の系と共に用いることができる特異的ベクターの例は、「G-protein coupled receptors(Signal Transduction Series)」;Tatsuya HagaおよびGabriel Berstein編、第1版(CRC Press−Boca Raton FL;1999年9月)に記載される。
所望のタンパク質(GPCR(SABTR)およびGタンパク質)をコードするcDNAを発現させるために、代表的には、適切なcDNAを、転写を誘導する強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーターおよび翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中にサブクローニングする。好適な細菌プロモーターは当該分野において周知であり、例えば、E. coli、Bacillus sp.およびSalmonellaのものであり、かかる発現系のためのキットが市販されている。同様に、哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核細胞発現系も市販されている。真核細胞発現ベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクターまたはレトロウイルスベクターであってもよい。
タンパク質の発現のために、真核または原核細胞における発現のための当該分野において周知の従来のベクターを用いることができる。ベクターの例として、細菌発現ベクター、例えばpBR322をベースとするプラスミド、pSKF、およびpET23Dを含むプラスミド、ならびに融合発現系、例えばGSTおよびLacZが挙げられる。
いくつかの発現系は、遺伝子増幅をもたらすマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどを有する。
遺伝子操作された酵母系は、ヒトGPCRおよびGαタンパク質を、内因性酵母フェロモン受容体経路の対応する構成要素と置き換える。下流のシグナル経路もまた、シグナルに対する正常な酵母の応答が、選択培地上での正の増殖またはレポーター遺伝子の発現に変換されるように、改変される(Broach, J. R. and J. Thorner (1996) Nature 384 (supp.):14-16により記載される)。
両生類細胞系、特にメラノフォア細胞は、例えば、GPCR発現系を記載するWO 92/01810において記載される。
SABTRを、強力な構成的プロモーター、例えばCMV初期プロモーターの制御下に置くことにより過剰発現させることができる。あるいは、保存されたGPCRアミノ酸またはアミノ酸ドメインの特定の変異を導入し、使用されるSABTR GPCRを構成的に賦活することができる。
標準的なトランスフェクション方法を用いて、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株を作製することができる。
ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するためのあらゆる公知の方法を用いることができる。ただし、用いられる特定の遺伝子操作手段が、目的のタンパク質を発現することができる宿主細胞に関連する遺伝子を首尾よく導入することができることが必要である。これらの方法は、クローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来性遺伝子材料を宿主細胞に導入することを含み得、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどの使用を含み得る。
トランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞を、当該分野において周知の標準的な培養条件を用いて培養することができる。当業者には、異なる細胞が異なる培養条件(適切な温度および細胞培養培地を含む)を必要とすることは明らかである。
所望の場合、タンパク質を細胞培養から標準的な技術を用いて回収することができる。例えば、細胞を機械的にまたは浸透圧ショックにより破裂させ、その後、沈殿およびクロマトグラフィーの工程に供してもよい。これらの工程の性質および順序は、回収すべき特定の組み換え材料に依存する。あるいは、組み換えタンパク質は、組み換え細胞が培養された培養培地から回収してもよい。
SABTR受容体活性の調節物質(例えば阻害剤、増強剤およびアンタゴニストであるが、アゴニストではないもの)は、本明細書において以下に記載するように同定することができる。調節物質のタイプは、一度に1種類より多いものも含み得、濃度に依存し得る。例えば、ある薬剤は、特定の濃度範囲においてはアゴニストとして作用し得るが、別の濃度範囲においては、別のアゴニスト(例えば甘味料または糖)の調節物質または増強剤として作用し得る。したがって、薬剤を調節物質として同定するためには、異なる濃度で試験すべきである。
調節物質とは、本明細書において用いられる場合、以下の1または2以上の増大または減少に影響を及ぼす薬剤である:受容体の細胞表面発現、アゴニスト(スクラロース)の受容体への結合、(スクラロースの存在下において)活性化形態の受容体により開始される細胞内応答、または別の生理学的応答。調節物質は、スクラロースに対するSABTRの応答を調節する(増大または低下させる)。
スクラロースは、SABTRのアクチベーターであり、SABTRに結合すると、SABTRを活性化し、SABTRの不在下と比較して細胞内応答の増大を引き起こす。さらに、またはあるいは、スクラロースは、細胞表面受容体の内部移行を低下させ、その結果、アゴニストの不在下において細胞の表面に存在する細胞表面受容体の数と比較して、細胞表面の受容体の発現を増大させる。
阻害剤は、受容体へのアゴニスト/スクラロースの結合を、阻害剤の不在下におけるアゴニストの結合と比較して低下させ、かつ/またはアゴニストにより誘導される細胞内応答を低下させる。
アゴニストに結合し、例えばGタンパク質を介してシグナルを伝達する受容体の、(調節物質との多様な相互作用に起因する)活性または活性の変化は、本明細書において以下に記載されるアッセイにより決定することができる。
細胞質イオンまたは膜電位の変化の検出:
「G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)」(CRC Press 1999;第1版;HagaおよびBerstein編)において詳細に記載されるように、受容体活性をレポートするためのイオン感受性色素を、細胞に取り込ませる。細胞質中のイオンの濃度または膜電位の変化を、それぞれイオン感受性または膜電位蛍光指示薬を用いて測定する。
GPCRの活性化により誘導される細胞内カルシウム放出を、カルシウムに結合する細胞透過性色素を用いて検出する。カルシウム結合色素は、細胞内カルシウムの上昇に比例する蛍光を発生させる。この方法により、迅速かつ定量的な受容体活性の測定が可能になる。
第1日:ウェル当たり150ngのSABTR GPCR DNAおよび0.3μlのリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を、37℃で一晩栄養増殖培地中に維持する。
第2日:増殖培地を捨て、細胞を1時間(室温で暗所にて)、C1バッファー溶液(130mM NaCl、5mM KCl、10mM Hepes、2mM CaCl2および10mMグルコースを含む(pH7.4))中に溶解した1.5μMのFluo-4 AM(Molecular Probes)および2.5μMのプロベニシドからなる37℃の50μlのカルシウムアッセイ溶液と共にインキュベートする。125μlのC1バッファーを各ウェルに添加し、プレートをさらに30分間室温で暗所にてインキュベートする。
バッファー溶液を捨てて、プレートを、洗浄バッファーとしての100μlのC1バッファーで5回洗浄し、細胞を200μlのC1バッファーに戻す。
カルシウム流量アッセイは、例えば、本明細書における以下の例1に記載されるように行ってもよい。
あるいは、同定には、調節物質を含まないサンプルと比較した場合、または調節物質を含むがSABTRポリペプチドを発現しない細胞(偽トランスフェクト細胞)におけるサンプルと比較した場合の、例えば10%またはそれ以上の、蛍光強度の増大または低下が含まれる。
アデニル酸シクラーゼ活性についてのアッセイを、例えばKenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585-591により詳細に記載されるように行う。反応混合物を、通常37℃で10分未満の間インキュベートする。インキュベーション後、反応混合物を、0.9mlの冷たい6%トリクロロ酢酸の添加により除タンパクする。試験管を遠心し、各上清溶液をDowex AG50W-X4カラムに加える。アゴニストによる受容体活性化の後に生成されたcAMPのレベルを測定するために、カラムからcAMP画分を4mlの0.1mMイミダゾール−HCl(pH7.5)でカウンティング(counting)バイアル中に溶離させる。対照反応もまた、SABTRポリペプチドを発現しない細胞由来のタンパク質ホモジェネートを用いて行うべきである。
Gタンパク質を発現する細胞において、イノシトール三リン酸(IP3)/Ca2+に対応するシグナル、およびこれにより受容体活性を、蛍光を用いて検出することができる。SABTR GPCRを発現する細胞は、細胞内貯留からのものとイオンチャネルの活性化を介してのものとの両方の寄与の結果として、細胞内カルシウムレベルの増大を示し得、この場合、カルシウム放出から生じる蛍光応答を内部貯留からのものと区別するために、カルシウムフリーで任意にEDTAなどのキレート剤を添加したバッファー中においてかかるアッセイを行うことが、必須ではないが望ましいことがある。
受容体をホスホリパーゼCシグナル伝達経路に連結するGタンパク質を有する細胞において、SABTRを発現させる。細胞内Ca2+濃度の変化を、例えば蛍光Ca2+指示色素および/または蛍光イメージングを用いて測定する。
SABTRを含むGPCRについて、受容体活性の尺度は、GPCRを含む細胞膜によるGTPの結合である。標識されたGTPの結合を検出することにより、膜へのGタンパク質のカップリングが測定される。
受容体を発現する細胞から単離された膜を、35S−GTPγSおよび未標識GDPを含むバッファー中でインキュベートする。活性なGTPアーゼは、標識を無機リン酸として放出し、これは、20mMのH3PO4中5%の活性炭の懸濁液中の遊離の無機リン酸の分離と、その後のシンチレーション計数によって検出される。混合物をインキュベートし、未結合の標識GTPをGF/Bフィルター上での濾過により除去する。結合した標識GTPを、液体シンチレーション計数により測定する。対照は、試験剤の非特異的効果の可能性を除外するために、SABTRを発現しない(偽トランスフェクトされた)細胞から単離された膜を用いるアッセイを含む。この方法は、Traynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848-854により詳細に記載される。
かかるアッセイは、Hafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 149-158において詳細に記載されるように行うことができる。
アラキドン酸:
アラキドン酸の細胞内レベルを、受容体活性の指標として用いる。かかる方法は、Gijon et al., 2000,J. Biol. Chem., 275:20146-20156によって詳細に記載される。
細胞内または細胞外cAMPを、cAMPラジオイムノアッセイ(RIA)またはcAMP結合タンパク質を用いて、例えばHorton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91-105によって記載されるように測定する。代替的に、cAMPの測定のための多数のキット、例えばLJL BiosystemsおよびNEN Life Science Products製のHigh Efficiency Fluorescence Polarization-based homogeneous assayが市販されている。あるいは、cGMPの細胞内または細胞外レベルを、イムノアッセイを用いて測定してもよい。例えば、Felley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol., 11:159-164 (1994)に記載の方法を用いてcGMPのレベルを決定してもよい。あるいは、US 4,115,538に記載されるようなcAMPおよび/またはcGMPを測定するためのアッセイキットを用いてもよい。
試験剤の非特異的効果の可能性を除外するための、偽トランスフェクトされた細胞またはその抽出物による陰性対照を用いてもよい。
例えばPhospholipid Signalling Protocols、Ian M. Bird、Totowa, N.J.編(Humana Press、1998年)に記載のように、受容体活性により引き起こされるリン脂質分解により放出されるセカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロール(DAG)および/またはイノシトール三リン酸(IP3)を検出して、GPCR(SABTR)活性の指標として用いてもよい。あるいは、イノシトール三リン酸の測定のためのキットが、Perkin ElmerおよびCisBio Internationalから市販されている。
試験剤の非特異的効果の可能性を除外するための、偽トランスフェクトされた細胞またはその抽出物による陰性対照を用いてもよい。
成長因子受容体チロシンキナーゼは、リン脂質によっておよびカルシウムによって活性化されるプロテインキナーゼのファミリーであるプロテインキナーゼC(PKC)の活性化を伴う経路を介してシグナル伝達することができる。
PKCにより誘導される遺伝子産物の増加は、PKC活性化を示し、したがって受容体活性化を示す。これらの遺伝子産物として、例えば、癌原遺伝子転写因子をコードする遺伝子(c−fos、c−mycおよびc−junを含む)、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤(I型コラゲナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を含む)、および接着分子(細胞内接着分子I(ICAM I)を含む)が挙げられる。
代替的アッセイは、PanVeraから市販されているProtein Kinase C Assay Kitを用いて行ってもよい。
あるいは、PKCにより活性化される遺伝子の制御配列により駆動されるレポーター遺伝子構築物の使用を介して、活性を測定することができる。
試験剤の非特異的効果の可能性を除外するための、偽トランスフェクトされた細胞またはその抽出物による陰性対照を用いてもよい。
MAPキナーゼ活性を、市販のキット、例えばNew England Biolabs製のp38 MAPキナーゼアッセイキット、またはPerkin-Elmer Life Sciences製のFlashPlate(登録商標)MAPキナーゼアッセイを用いて測定することができる。GqまたはGi共役型GPCRを有する細胞を用いる場合、p42/44 MAPキナーゼまたはERK1/2を、GPCR(SABTR)活性を示すために測定してもよく、GPCR活性化後の内因性ERK1/2キナーゼのリン酸化を測定するERK1/2アッセイキットがTGR Biosciencesから市販されている。
全てのキナーゼアッセイを、精製されたキナーゼと、1または2以上のSABTRポリペプチドを発現する細胞から調製された粗抽出物との両方について行うことができる。
試験剤の非特異的効果の可能性を除外するための、偽トランスフェクトされた細胞またはその抽出物による陰性対照を用いてもよい。
レポーター遺伝子アッセイにより調節物質を同定するために、シグナルの少なくとも2倍の増大または10%の低下を有意であるものとする。アゴニストは、試験剤の存在下および非存在下において活性を比較した場合に、例えば少なくとも2倍、5倍、10倍またはそれ以上刺激する。アゴニストのSABTRへの結合により開始される細胞内シグナルは、細胞内の事象のキャスケードを引き起こし、その最終的な結果は、1または2以上の遺伝子の転写または翻訳の、迅速かつ検出可能な変化である。
「プロモーター」は、本明細書において用いられる場合、1もしくは2以上の転写制御エレメント、または遺伝子発現の受容体媒介性の調節のために必要な配列であり、1もしくは2以上の基本的なプロモーター、エンハンサー、および受容体により制御される発現のために必要な転写因子結合部位を含む。アゴニストのSABTRへの結合から生じる細胞内シグナルに応答性のプロモーターが選択され、対応するレポーター遺伝子(プロモーターにより制御され、転写、翻訳または最終的な活性が容易に検出可能および測定可能なもの)に作動的に連結される。
当業者に明らかであるとおり、プロモーターは選択されたレポーター遺伝子に従って選択される。
「最初期」遺伝子が好適であり、迅速に(例えば、受容体とエフェクタータンパク質またはアゴニストとの間の接触の後数分間以内に)誘導される。レポーター遺伝子において望ましい特性としては、以下の1または2以上が挙げられる:アゴニスト結合に対する迅速な応答性;静止状態の細胞において発現が低いかまたは検出不可能であること;誘導が一過性であってかつ新たなタンパク質合成とは独立していること;その後の転写の遮断が新たなタンパク質合成を必要とすること;これらの遺伝子から転写されたmRNAが数分間から数時間の短い半減期を有すること。同様に、プロモーターは、これらの特性の1つ、いくつかまたは全てを有していてもよい。
転写アッセイのための対照として、GPCR(SABTR)を発現しないがレポーター構築物を有する細胞と、プロモーターを有さないレポーター構築物を含む細胞の両方が挙げられる。
レポーター遺伝子活性化により示されるGPCR(SABTR)活性を調節する薬剤は、シグナルのGPCR(SABTR)特異性を確認し、それらの活性のスペクトルを決定するために他のプロモーターおよび/または他の受容体を用いて確認することができ、それによって非特異的シグナル、例えばレポーター遺伝子の経路を介した非特異的シグナルを除外する。
ホスファチジルイノシトールの加水分解を、US 5,436,128に記載されるように決定することができる。ここでは、細胞を3H−ミオイノシトールで少なくとも48時間またはそれ以上の間標識することが含まれる。標識された細胞を、試験剤と1時間接触させ、次いで、これらの細胞を溶解し、クロロホルム−メタノール−水で抽出する。この後、イオン交換クロマトグラフィーによりイノシトールリン酸を分離し、これをシンチレーション計数により定量する。アゴニストについて、バッファー対照の存在下における1分間当たりのカウント(cpm)に対する試験剤の存在下におけるcpmの比を計算することにより、刺激の倍率を決定する。同様に、阻害剤およびアンタゴニストについて、バッファー(これはアゴニストを含んでも含まなくてもよい)対照の存在下におけるcpmに対する試験剤の存在下におけるcpmの比を計算することにより、阻害の倍率を決定する。
上述のアゴニスト結合に対する機能的応答により引き起こされるパラメーターの変化を測定する機能アッセイの代わりに、アゴニストのSABTR受容体への結合を測定する結合アッセイにより、アゴニストの結合を決定することができる。
結合アッセイは、当該分野において周知であり、溶液中で、二層膜において、任意に固相に結合して、脂質単層において、または小胞中で試験することができる。SABTRポリペプチドに対する調節物質の結合は、例えば、分光学的特徴(例えば蛍光、吸光度または屈折率)の変化を測定することにより、流体力学法により(例えば形状を用いて)、クロマトグラフィーにより、SABTRポリペプチドの可溶性特性を測定することにより、決定することができる。一態様において、結合アッセイは生化学的であり、組み換えSABTRポリペプチドを発現する細胞/組織由来の膜抽出物を用いる。結合アッセイは、例えば、T1RについてAdlerらによりUS20050032158中段落[0169]〜[0198]に記載のように行うことができる。
さらに、実質的に相同であるSABTRヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、保存的変異および/または点変異により形成され、限定することなく、以下に詳細に記載するようなあらゆる保存的に改変されたバリアントを含む。
別の代替的ガイドラインは、荷電された全てのアミノ酸を、それらが正または負のいずれであるかに従って、保存的置換とするものである。
さらに、コードされている配列中の単一のアミノ酸または低いパーセンテージ(例えば26%まで、または20%まで、または10%まで)のアミノ酸を置換するか、付加するかまたは欠失する、個々の置換、欠失または付加もまた、保存的に改変された異形とみなされる。
%配列同一性:
実質的に相同なヌクレオチド配列は、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の%配列同一性を有する。
あるいは、実質的に相同なヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、少なくとも70%、80%、または85%の%配列同一性を有することができ、本明細書において上に詳細に記載するような保存的機能的バリアントである。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で利用可能なプログラムblastinにより使用されるヒューリスティックな検索アルゴリズムである。
ヌクレオチドクエリー配列の別のヌクレオチド配列に対する%同一性を決定するために、BLASTバージョン2.2.1.3のデフォルトのパラメーター(EXPECT(データベース配列に対する一致を報告するための統計学的有意性閾値)が10であることを含む)およびDUSTフィルタリングを使用して、Blastinを用いる。
ポリペプチドクエリー配列の別のポリペプチド配列に対する%同一性を決定するために、BLASTバージョン2.2.1.3のデフォルトのパラメーター(EXPECTが10であることを含む)およびDUSTフィルタリングを使用して、Blastpを用いる。
本明細書において示すヌクレオチド配列に対して、またはその相補配列に対して、以下に詳細に記載するストリンジェントな条件下において選択的にハイブリダイズすることができる場合に、ヌクレオチド配列が実質的に相同であると見なす。
ストリンジェントな条件とは、42℃の温度で、50%のホルムアミド、5×SSCおよび1%のSDSの溶液中、ならびに、65℃で、0.2×SSCおよび0.1%のSDSの溶液中での洗浄である(1×SSC=0.15MのNaCl、0.015MのNa3クエン酸、pH7.0)。
標的DNAとの間で観察される特異的相互作用の強度の10分の1より低いシグナルは、バックグラウンドとみなす。例えばプローブを(例えば32Pで)放射線標識することにより、相互作用の強度を測定することができる。
キット、例えばスクリーニングキットまたはハイスループットスクリーニングキットであって、SABTRまたはそれと実質的に相同な配列を発現する組み換え細胞を含み、スクラロース(アゴニスト)を含むもの。
任意に、細胞は、例えばカルシウムシグナル伝達のために、さらにGタンパク質を含む。好適なGタンパク質は公知であり、上述してある。当業者は、必要であればそれらを細胞に導入する方法を知っている。非常に有用なキメラGタンパク質は、Gアルファ16−ガストデューシン44である。
任意的なキットの構成要素として、提供される組み換え細胞を培養するための好適な培地、細胞をその上で増殖させるための固体支持体、例えば細胞培養ディッシュまたはマイクロタイタープレート、これらの任意的構成要素は、当業者が容易に入手することができる。
キットは、以下のように用いることができる:
(i)SABTRタンパク質を発現する組み換え細胞を、固体支持体上で増殖させる;
(ii)約1nM〜約100mMまたはそれ以上の濃度の試験剤を、好適な濃度のアゴニストスクラロースの存在下において、規定のプレートまたはウェルの培養培地に添加する;および
(iii)試験剤の存在下および不在下における応答を比較することによって細胞の機能的応答の変化を決定し、これにより試験剤を調節物質として同定する。
好適なアッセイは、例えば、SABTRの活性化、および試験剤に対する応答におけるその変化を決定する、カルシウム流量アッセイである。
(i)SABTRタンパク質を発現する組み換え細胞を、固体支持体上で増殖させる;
(ii)約1nM〜約100mMまたはそれ以上の濃度の試験剤を、好適な濃度のアゴニストスクラロースの存在下において、規定のプレートまたはウェルの培養培地に添加する;および
(iii)試験剤の存在下および不在下における応答を比較することによって細胞の機能的応答の変化を決定し、これにより試験剤を増強剤として同定する。
上述の方法により同定した調節物質を、同定された調節物質を味わうフレーバリスト(flavorist)または試験者のパネルを用いる簡便な官能実験により、容易に確認することができる。化合物を、例えばスクラロースと共に水に入れて味わい、調節物質を含まない陰性対照と比較して、調節物質がスクラロースの甘味を増強するかまたはスクラロースの苦味を阻害することを確認する。
上述の転写レポーターアッセイおよび殆どの細胞ベースのアッセイが、SABTR活性を調節する薬剤についてライブラリーをスクリーニングするために非常に好適である。
アッセイの工程を自動化し、化合物をあらゆる便利なソースから複数のアッセイ(これらは代表的には平行して(例えばロボット化アッセイにおいてはマイクロタイターウェル上でのマイクロタイターフォーマットにおいて)行われる)に供給することにより、大規模な化学ライブラリーをスクリーニングするためにアッセイを設計してもよい。
合成の化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co.(Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex(Princeton, N.J.)、Brandon Associates(Merrimack, N.H.)およびMicrosource(New Milford, Conn.)を含む多数の会社から市販されている。
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬などの多数の化学的「構成要素(building block)」を組み合わせることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかにより生成された、多様な化学化合物の集合である。例えば、ペプチドライブラリーなどの一次的(linear)コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学的構成要素(アミノ酸)のセットを、所与の化合物の長さ(例えばポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)についての全通りの可能性で組み合わせることにより作製する。何百万もの化合物を、かかるコンビナトリアルな化学的構成要素の混合により合成することができる。
細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態における天然の化合物のライブラリーは、例えばPan Laboratories(Bothell, Wash.)またはMycoSearch(NC)から市販されており、または当該分野において周知の方法により容易に作製することができる。
さらに、天然にまたは合成で作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理学的または生物学的手段により容易に修飾される。
他のライブラリーとして、タンパク質/発現ライブラリー、天然のソース(例えば、食品、植物、動物、細菌を含む)からのcDNAライブラリー、1または2以上のポリペプチドのランダムまたは系統的に変異を誘発したバリアントを発現するライブラリー、1個の細胞または組織中のmRNA含有物を発現するために用いられるウイルスベクター中のゲノムライブラリーが挙げられる。
試験剤は、低分子化学化合物、化学ポリマー、生物学的ポリマー、ペプチド、タンパク質、糖、炭化水素、核酸および脂質を含むあらゆる薬剤であってよい。薬剤は、合成の化合物であっても、化合物の混合物であっても、天然の産物または天然の試料、例えば植物抽出物、培養上清もしくは組織試料であってもよい。
((E)−4−(2,2,3−トリメチルシクロペンタ−3−エニル)ブト−2−エン酸)を含むがこれに限定されない同定された調節物質を、スクラロースの苦い後味を低減し、および/または甘味を増強するために、スクラロースと共に食品製品に添加してもよい。
本明細書に記載の構築物および方法において用いられる配列は、以下の配列表において見出される。これらはアミノ末端からカルボキシ末端の方向に示される。全てのTAS2R配列は、ヒト配列である。
TAS2R受容体CDSをコードする配列は公知であり、下記の名称および参照番号により公開されている。
配列番号3および4:TAS2R1をコードする配列。ヒト味覚受容体2型メンバー1(TAS2R1またはT2R1)、Reference Sequence Accession Number(RefSeq)NM_019599.2 GI:67782322 RefSeqデータベース、The National Center for Biotechnology Information(NCBI)、および対応する受容体タンパク質(NP_062545.1、GI:9625043、NCBI RefSeq)。
配列番号7および8:TAS2R46をコードする配列。ヒト味覚受容体2型メンバー46(TAS2R46またはT2R46)、Reference Sequence Accession Number(RefSeq)NM_176887.2 GI:117414132 RefSeqデータベース、The National Center for Biotechnology Information(NCBI)、および対応する受容体タンパク質(NP_795368.2 GI:117414133)。
全てのコード配列は、ATG開始コドンを含むが、終止コドンを含まない。発現ベクター中にクローニングされた場合、ベクター中の完全なカセットは、膜配列としてN末端rssタグ、および終止コドンを提供するC末端のHSVタグを含む(TAS2R44ベクターカセットについて配列番号13および14において例として示される)。
配列番号3および4:TAS2R1をコードする配列(核酸+タンパク質)
配列番号5および6:TAS2R10をコードする配列(核酸+タンパク質)
配列番号7および8:TAS2R46をコードする配列(核酸+タンパク質)
配列番号9および10:TAS2R16をコードする配列(核酸+タンパク質)
配列番号11:RSSタグはラットソマトスタチンの45個のアミノ酸とEcoRI部位とを含む。
配列番号12:HSVタグ、フレームに浸入するための「T」、NotI部位および終止コドンを含む。
配列番号13および14:hTAS2R44構築物(核酸+タンパク質)
(RSSタグ−EcoRI部位−TAS2R44−NotI部位−終止コドンを含むHSVタグ)
以下、上記の方法を説明するために役立つの一連の例を示す。以下の例は、単に説明のためのものであり、決して記載される方法およびキットを含む主題を限定するものと解釈されるべきではない。
全ての例は、対応するヒト苦味受容体2型のメンバー(44、1、10、16および46)のmRNAに基づくDNA配列を用いる。
以下の例は、TAS2R44について記載する。TAS2R44のcDNAを、TAS2R1、TAS2R10、TAS2R46の該当するcDNAにより置換すれば、これらのSABTRのための発現ベクターまたはTAS2R16(スクラロースにより活性化されない対照として)のための発現ベクターが作製される。
ヒトTAS2Rの全長遺伝子を、コード領域全体にわたる遺伝子特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。
発現ベクター中にトランスフェクトした構築物は、pcDNA3.1Zeo-TAS2R44と称され、これはTAS2R44タンパク質(配列番号14)の発現を可能にする。
例2a
安定した細胞株の作製
HEK293T/Gα16−ガストデューシン44細胞を用いた。これらは、WO 2004/055048に記載されるように作製した。宿主細胞株HEK-293Tは、American Tissue Culture Collection(ATCC)から市販されている(ATCC登録番号CRL-11268)。
HEK293T/Gα16−ガストデューシン44細胞におけるTAS2Rの一過性トラスフェクション/発現
第0日に、HEK293T/Gα16−ガストデューシン44細胞を、96ウェルの壁面が黒色で底面が透明のプレートに、14,000細胞/ウェルの密度で播種し、増殖培地(10%(v/v)の加熱不活化ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むDMEM)中で増殖させる。
細胞を、リポフェクタミン2000(Invitrogen)で製造者の推奨に従ってトランスフェクトする。
96ウェルプレートのウェル毎に、150ngのベクターDNA(例1からのSABTR発現ベクターまたはTAS2R16発現ベクター)を12.5μlのDMEM中に希釈する。第2のチューブにおいて、0.3μlのリポフェクタミン2000を、12.5μlのDMEM中に希釈し、5分間室温でインキュベートする。5分後、両方の溶液を混合して、20分間室温でインキュベートする。プレート中の増殖培地を50μlのDMEMおよび25μlのリポフェクタミン/DNA混合物で置き換え、細胞上で3〜4時間37℃で加湿大気中でインキュベートする。混合物を、次いで、抗生物質フリーの血清含有DMEMに交換する。
トランスフェクションの24時間後、細胞を例3に記載するFluo-4カルシウムアッセイにおいて用いる。
Gα16−ガストデューシン44およびSABTR(TAS2R44、TAS2R1、TAS2R10)を安定して発現する細胞株の作製
pcDNA3.1Zeo-SABRをHEK293T/Gα16−ガストデューシン44細胞(いずれも例1に記載のように作製されたもの)へトランスフェクトすることにより、SABTR(TAS2R44、TAS2R1、TAS2R10)を安定して発現する細胞株を作製した。宿主細胞株HEK-293Tは、American Tissue Culture Collection(ATCC)から市販されている(ATCC登録番号CRL-11268)。
第0日に、培地を2mlの抗生物質フリーかつ血清フリーの増殖培地で交換した。10μlのリポフェクタミン2000を、250μlのDMEM中に希釈し、5分間室温でインキュベートした。平行して、4μlのSABTR(TAS2R44、TAS2R1、TAS2R10)ベクターDNAを、250μlのDMEM中に溶解した。生じたこれら2種の溶液を混合して、20分間室温でインキュベートし、その後、細胞に(細胞培養培地中に)添加した。4時間後、培地を、抗生物質フリーの血清含有増殖培地で交換する。
細胞を、加湿大気(37℃、5%CO2)中でインキュベートした。
2〜4週間の培養(必要に応じて培地を交換する)の後、ゼオシン耐性のコロニーを選択し、増殖させた。
スクラロースに加えて公知のTAS2R44アゴニストであるサッカリン(WO 2004/029087において記載される)に対する機能的応答の存在について試験することにより、TAS2R44の発現を評価した。これは、例3において記載するように、FLIPR-TETRA(登録商標)(Molecular Devices、Sunnyvale、CA, US)における自動カルシウムイメージングにより決定した。
スクラロースに加えて0.125mMの塩酸ストリキニーネ(WO 2004/029087に記載される公知のTAS2R10アゴニスト)に対する応答により、TAS2R10発現細胞を同定した。これは、例3に記載する方法を用いて、FLIPR-Tetra測定装置(Molecular Devices)における自動蛍光イメージングにより決定した。HEK293T/Gα16−ガストデューシン44細胞/TAS2R10細胞株において生じた1つのクローンを選択した。
Fluo-4カルシウムアッセイ
Fluo-4AM(Invitrogen、Carlsbad、CA、US)は、細胞内カルシウム動態(濃度の変化)の蛍光指示薬であり、これによって、カルシウム濃度の変化、特にアゴニストへの暴露の後で起こる受容体活性化に応答しての増大をモニタリングすることができる。
第0日に、例2bまたは2cにおいて記載するとおり作製したGα16−ガストデューシン44およびTAS2R苦味受容体を発現するHEK293T細胞株を、抗生物質フリー増殖培地(10%(v/v)の加熱不活化ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを含むDMEM)中、壁面が黒色で底面が透明のポリ(エチレンイミン)(0.005%v/v)でコートされた96ウェルプレートに、15,000細胞/ウェルの濃度で播種し、48時間、加湿大気(37℃、5%CO2)中でインキュベートした。
その後、96ウェルプレートを、ウェル当たり100μlのアッセイバッファー(130mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのHEPES、2mMのCaCl2および5mMのデキストロース、pH7.4)で、自動プレート洗浄機(BioTek)を用いて5回洗浄した。プレートを、30分間室温で暗所においてさらにインキュベートし、Fluo-4の脱エステル化を完了させる。その後、プレートを、ウェル当たり100μlのアッセイバッファーで5回洗浄し、ウェル当たり100μlのアッセイバッファーを再度添加する。
アッセイを読み取るために、プレートをFluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)(FLIPR-TETRA(登録商標)、Molecular Devices、Sunnyvale、CA、US)中に置いて、100μlの2倍濃度のアゴニストストック溶液(100マイクロリットルのアッセイバッファー容積に添加したときに所望のアゴニスト最終濃度が得られるように)の添加により、受容体の活性化を開始させる。
濃度−応答分析を行い、EC50値を、関数f(x)=(a−d)/(1+(x/C)nh)+dを用いて非線形回帰により計算した。ここで、a=最小シグナル、d=最大シグナル、nh=ヒル係数、C=EC50、およびx=アゴニスト濃度である。EC50は、そのアゴニストについて最大の可能な有効応答の50%を生じるアゴニストのモル濃度である。より強力なアゴニストは、より低いEC50値を有する。
得られたカルシウムシグナルを、Gタンパク質αサブユニット(Gα16−ガストデューシン44)のみを発現する細胞の応答に対して修正し、ΔF/F0(Fmax−Fmin/F0)を用いて刺激前の細胞の蛍光に対して正規化した。
サッカリンによるTAS2R44の活性化
例2cにおいて作製した細胞株が苦味受容体TAS2R44を安定して発現することを確認するために、TAS2R44の公知のアゴニストであるサッカリンの濃度−応答曲線を作成した。陰性対照として、HEK293T Gα16ガストデューシン44細胞(TAS2R44を発現しない)を、サッカリンに暴露した。結果を、例4に記載するように計算し、表1に示す。標準偏差は(+/−STD)もまた示す。
各サンプル(受容体ならびに対照)は、以下の全ての例に対する適合性のために、0.02%の最終濃度のDMSOを含んだ。
例5
スクラロースによるTAS2R44の活性化
例2aに記載したとおり作製したGα16−ガストデューシン44およびTAS2R44を安定して発現するHEK293T細胞株において、スクラロースの添加に続く細胞内カルシウム応答を決定した。
スクラロースおよびTAS2R44について計算されたEC50値は、16.69±1.01mMであった。この結果は、TAS2R44がスクラロースによって活性化されることを実証する。サッカリン(例4)のEC50との比較により、スクラロースはサッカリンより多少強力でないアゴニストであることが示される。
さらに、公知の苦い後味を有する甘味料であるシクラメートおよびアスパルテームもまた試験し、TAS2R44のアゴニストではないことを見出し、このことは、スクラロースによる受容体活性化の特異性が高いことをさらに示している。
スクラロースによるTAS2R1の活性化
例2cに記載したとおり作製したGα16−ガストデューシン44およびTAS2R1を安定して発現するHEK293T細胞において、スクラロースの添加に続く細胞内カルシウム応答を決定した。
結果を以下の表3に示す。
スクラロースによるTAS2R10の活性化
例2aに記載したとおり作製したGα16−ガストデューシン44およびTAS2R10を安定して発現するHEK293T細胞において、スクラロースの添加に続く細胞内カルシウム応答を決定した。
結果を以下の表4に示す。
スクラロースによるTAS2R46の活性化
例2bに記載したとおり作製したGα16−ガストデューシン44およびTAS2R46を安定して発現するHEK293T細胞において、スクラロースの添加に続く細胞内カルシウム応答を決定した。
結果を以下の表5に示す。
スクラロースに対するTAS2R44の応答のアンタゴニストの同定
全ての細胞は、Gα16−ガストデューシン44を安定して発現するか、またはGα16−ガストデューシン44およびTAS2R受容体(TAS2R44、TAS2R16)を発現するHEK293T細胞であった。
方法は、例3に記載されるとおり行い、以下の改変を行った:サンプルを試験化合物A(test cpd A)を用いて、および試験化合物Aを用いないで試験し、シグナルを比較した。試験化合物をジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、次いで、溶媒の阻害効果の可能性を除外するために、当量のDMSO濃度(0.02%)を用いた陰性対照を行った。
さらに、次いで、スクラロースおよびDMSO(0.02%)を用いた対照実験を行った(例5の表を参照)。
陰性対照として、各アゴニスト、および各アゴニストとアンタゴニスト/試験化合物(test cpd A)とを、Gα16−ガストデューシン44のみを発現するがTAS2受容体を発現しない細胞に適用する(本明細書に中以下の表7の結果を参照)。
アゴニスト特異性の対照として、関連性のない苦味受容体(TAS2R16)の、そのアゴニストであるフェニル−β−グルコピラノシドに対する応答もまた検出した(結果は、本明細書中以下の表8を参照)。
EC50値を、例3に記載するとおり計算した。アゴニストとして、TAS2R44のためにスクラロースを用い、TAS2R16のためにフェニル−β−グルコピラノシドを用いた。結果を以下の表9に示す。
表9の結果は、異なる濃度のスクラロースに対するTAS2R44の応答が、25μMの(E)−4−(2,2,3−トリメチルシクロペンタ−3−エニル)ブト−2−エン酸により阻害されることを示す。TAS2R16がシグナルを有さないことにより、試験化合物による阻害の特異性が示される。
上記の表6、7および8における対照実験により、試験化合物AのTAS2R44に対する阻害効果が特異的であることが実証された。
官能評価
スクラロース(3mM)溶液中の試験化合物A(13ppm)の苦味遮断能力を評価した。
20mlの各溶液(スクラロースまたはスクラロースおよび試験化合物A)を、15人の苦味に対して感受性のパネリストにランダムな順序で示した。2回の複製実験において、パネリストは、より苦いものとして受容される溶液を選択するよう要求された。過剰分散(overdispersion)を修正するために、強制選択データからベータ二項分析を計算した。
パネリストが苦味を2回の複製実験にわたって評価したため、データを二項d’分析に供し、過剰分散が起こっているか否かを決定した。過剰分散に起因して試験が行われた有意レベルを過小評価し、その結果偽陽性の結果をもたらしている可能性はなかった。分析は、過剰分散を否定し(ガンマ=0.00;p=0.109)、調整の必要性はなかった。
データから、試験化合物A(13ppm)が3mMのスクラロース溶液の受容される苦味を低減することが示された。
Claims (4)
- スクラロースの味覚を調節する薬剤を同定する方法であって、
(i)スクラロースにより活性化することができるTAS2R苦味受容体を発現する細胞を、少なくとも1種の薬剤の存在下において、スクラロースと接触させること;および
(ii)前記少なくとも1種の薬剤が、前記TAS2R苦味受容体のスクラロースへの結合またはスクラロースへの結合に対する機能的応答に影響を及ぼすか否かを決定すること
を含み、ただし、前記細胞が、その天然の環境において操作されていない細胞ではなく、前記TAS2R苦味受容体が、TAS2R1、TAS2R10、TAS2R44およびTAS2R46からなる群から選択される、前記方法(但し、人体で実施する方法を除く)。 - 請求項1に記載の方法であって、TAS2R苦味受容体が、
配列番号2、配列番号4、配列番号6および配列番号8からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して実質的に相同であり、少なくとも90%の配列同一性を有する、TAS2R苦味受容体;
配列番号1、配列番号3および配列番号5、配列番号7からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して、配列同一性によって決定される場合に実質的に相同である核酸によりコードされるTAS2R苦味受容体
から選択される1または2以上の配列を含み、
ここで、配列同一性により決定される場合に実質的に相同な核酸は、少なくとも90%の配列同一性を有し;
ここで、前記核酸は、任意に、対応するタンパク質において、その終末またはその付近に、C末端を形成するように配列番号12(HSVタグ)を含み、および任意に、ラットソマトスタチン(RSS)およびロドプシンから任意に選択され、配列番号11(RSSタグ)から任意に選択される膜輸送タグを、その終末またはその付近に、N末端を形成するように含み、
およびここで、前記TAS2R苦味受容体は、任意に、そのC末端にアミノ酸配列QPELAPEDPEDからなるHSVタグを含み、および任意に、ラットソマトスタチン(RSS)タグおよびロドプシンタグから任意に選択され、アミノ酸配列MAAVTYPSSVPTTLDPGNASSAWPLDTSLGNASAGTSLAGLAVSGからなるRSSタグから任意に選択される膜輸送タグを、そのN末端に含む、前記方法。 - スクラロースの味覚の調節物質としての試験剤を同定するための組合せ使用のための、以下を含むキット:
(i)請求項1または2に記載のTAS2R苦味受容体を発現する組み換え細胞、および
(ii)スクラロース。 - 請求項1または2に記載のTAS2R苦味受容体を調節する薬剤を同定する方法であって、
(i)TAS2R苦味受容体へのスクラロースの結合に応答して変化するパラメーターを測定すること、および
(ii)試験剤に応答してのパラメーターの変化を陰性対照と比較して決定し、それによってスクラロースの味覚の調節物質を同定すること
を含む、前記方法(但し、人体で実施する方法を除く)。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US90914307P | 2007-03-30 | 2007-03-30 | |
US60/909,143 | 2007-03-30 | ||
US96254907P | 2007-07-30 | 2007-07-30 | |
US60/962,549 | 2007-07-30 | ||
PCT/CH2008/000134 WO2008119195A1 (en) | 2007-03-30 | 2008-03-27 | Methods to identify modulators |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010522541A JP2010522541A (ja) | 2010-07-08 |
JP2010522541A5 JP2010522541A5 (ja) | 2011-05-12 |
JP5465656B2 true JP5465656B2 (ja) | 2014-04-09 |
Family
ID=39709251
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010500047A Active JP5465656B2 (ja) | 2007-03-30 | 2008-03-27 | 調節物質を同定するための方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8187822B2 (ja) |
EP (1) | EP2137322B1 (ja) |
JP (1) | JP5465656B2 (ja) |
KR (1) | KR20100016044A (ja) |
WO (1) | WO2008119195A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8546085B2 (en) | 2008-06-13 | 2013-10-01 | Givaudan Sa | Methods of identifying modulators of the bitter taste receptor TAS2R44 |
EP2329263A1 (en) * | 2008-08-07 | 2011-06-08 | Givaudan SA | Methods to identify modulators of the interaction between dextromethorphan and the bitter taste receptor tas2r46 |
WO2010088633A2 (en) * | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Chromocell Corporation | Novel cell lines and methods |
US9347934B2 (en) * | 2011-10-20 | 2016-05-24 | Chromocell Corporation | Assays for identifying compounds that modulate bitter taste |
WO2013072332A1 (en) | 2011-11-14 | 2013-05-23 | Givaudan Sa | Methods of using antagonists of bitter taste receptors |
US9169311B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-10-27 | Applied Food Biotechnology, Inc. | Feline bitter taste receptors and methods |
US9603379B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-28 | Applied Food Biotechnology, Inc | Feline bitter taste receptors and methods |
SG11201508572UA (en) | 2013-04-24 | 2015-11-27 | Chromocell Corp | Assays for identifying compounds that modulate bitter taste |
ES2776159T3 (es) | 2013-05-10 | 2020-07-29 | Pepsico Inc | Ensayo de internalización de los receptores del sabor |
EP2994477A4 (en) | 2013-05-10 | 2017-03-22 | Pepsico, Inc. | Cells as a model to identify potential taste modulators |
CN104713927A (zh) * | 2015-03-16 | 2015-06-17 | 常州大学 | 一种检测食品中三氯蔗糖的电化学方法 |
US20180372721A1 (en) * | 2015-07-28 | 2018-12-27 | Mars, Incorporated | Screening methods using canine t2r receptors and pet food products and compositions identified using the same |
WO2023205647A1 (en) * | 2022-04-19 | 2023-10-26 | Firmenich Incorporated | Reduction of bitter taste of active pharmaceutical ingredients and related assays and screening methods |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5825980B2 (ja) | 1976-02-12 | 1983-05-31 | ヤマサ醤油株式会社 | サイクリックヌクレオチドの定量法 |
WO1990005745A1 (en) * | 1988-11-18 | 1990-05-31 | The General Hospital Corporation | A cAMP-RESPONSIVE TRANSCRIPTIONAL ENHANCER BINDING PROTEIN |
US5462856A (en) | 1990-07-19 | 1995-10-31 | Bunsen Rush Laboratories, Inc. | Methods for identifying chemicals that act as agonists or antagonists for receptors and other proteins involved in signal transduction via pathways that utilize G-proteins |
CA2384777A1 (en) | 1999-09-10 | 2001-03-15 | Charles S. Zuker | T2r taste receptor family |
US6558910B2 (en) | 1999-09-10 | 2003-05-06 | The Regents Of The University Of California | SF, a novel family of taste receptors |
JP2003530098A (ja) * | 2000-04-07 | 2003-10-14 | セノミックス、インコーポレイテッド | T2r味覚受容体及びそれをコードする遺伝子 |
TW201022287A (en) * | 2001-01-03 | 2010-06-16 | Senomyx Inc | T1R taste receptors and genes encoding same |
US7413535B2 (en) * | 2001-07-27 | 2008-08-19 | Illinois Tool Works Inc. | Method for manufacturing tamper evident reclosable plastic bags |
EP2270155A3 (en) | 2002-09-25 | 2011-08-10 | Deutsches Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke | Bitter taste receptors |
EP1581555B1 (en) * | 2002-12-18 | 2008-04-30 | Givaudan SA | Chimeric alpha q-gustducin g-proteins |
WO2004069191A2 (en) * | 2003-02-03 | 2004-08-19 | Senomyx Inc. | Identification of t1r and t2r modulators |
WO2005007891A2 (en) * | 2003-06-19 | 2005-01-27 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Variants of human taste receptor genes |
JP4812752B2 (ja) * | 2004-04-20 | 2011-11-09 | ドイチェス インシュティテュート フェア エルネールングスフォルシュング | 苦味受容体のアゴニストおよびその使用 |
US7829299B2 (en) | 2004-11-18 | 2010-11-09 | Deutsches Institut fur Ernahrungforschung Potsdam-Rehbrucke Stiftung des Offentlichen Rechts | Agonists of bitter taste receptors and uses thereof |
JP4688517B2 (ja) * | 2005-02-15 | 2011-05-25 | 小川香料株式会社 | 高甘味度甘味料の呈味改善剤 |
-
2008
- 2008-03-27 EP EP08714784A patent/EP2137322B1/en active Active
- 2008-03-27 JP JP2010500047A patent/JP5465656B2/ja active Active
- 2008-03-27 US US12/593,155 patent/US8187822B2/en active Active
- 2008-03-27 KR KR1020097022661A patent/KR20100016044A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-03-27 WO PCT/CH2008/000134 patent/WO2008119195A1/en active Application Filing
-
2012
- 2012-05-26 US US13/481,797 patent/US8597896B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010522541A (ja) | 2010-07-08 |
US20100129833A1 (en) | 2010-05-27 |
KR20100016044A (ko) | 2010-02-12 |
WO2008119195A1 (en) | 2008-10-09 |
EP2137322B1 (en) | 2013-02-27 |
EP2137322A1 (en) | 2009-12-30 |
US8187822B2 (en) | 2012-05-29 |
US20120237953A1 (en) | 2012-09-20 |
US8597896B2 (en) | 2013-12-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7292347B2 (ja) | 甘味増強に関する方法 | |
JP5465656B2 (ja) | 調節物質を同定するための方法 | |
JP5225986B2 (ja) | 核酸、ポリペプチドおよびその利用 | |
US8546085B2 (en) | Methods of identifying modulators of the bitter taste receptor TAS2R44 | |
JP2009533065A (ja) | 味覚物質同定のための機能的方法 | |
US8557530B2 (en) | Use of a TAS2R7 nucleic acid sequence to identify modulators | |
JP2009534017A (ja) | 核酸、ポリペプチドおよびその利用 | |
US8603762B2 (en) | Methods to identify modulators of the interaction between dextromethorphan and the bitter taste receptor TAS2R46 | |
KR101511394B1 (ko) | 키메라 우마미 미각 수용체, 이를 코딩하는 핵산 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110325 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110325 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130604 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130904 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130911 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131004 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140114 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140122 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5465656 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |