JP2009533065A - 味覚物質同定のための機能的方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明者らは、既知のT1R2ホモマーが、驚くべきことに、甘味物質(例えばスクロースより約370倍強い/甘い合成オキシムであるペリラルチン)と結合するだけでなく、機能的応答を誘発することができ、T1R3の非存在下でGタンパク質を活性化することができる機能的甘味受容体を形成することを見出した。
本発明による方法において、T1R2−TMDおよびGタンパク質を発現するが、T1R3を発現しない細胞を、甘味調節剤としての前記剤の特性を決定するために、任意に知られたまたは新たに決定された甘味物質と組み合わせた試験剤と接触させる。本アッセイは、したがって、甘味物質または(甘味物質、T1R2、または下流イベントの)甘味応答の調節剤としての試験剤の同定に利用され得る。
受容体およびGタンパク質における剤の機能的な効果は、これに限定することなく、例えば細胞内IP3およびCa2+などの伝達経路のパラメータの変化を計測するアッセイなど、適した機能的アッセイによって、またはGTPγSを標識するなどの当業者に知られた技術に従った他のGタンパク質特異的アッセイによって決定される。
最初の側面において、味覚細胞における甘味シグナリングを調節する剤を同定する方法であって、該方法が
(i)甘味刺激に応答するT1R2ホモマー味覚受容体を発現する細胞を、任意に他の剤の存在下で、剤と接触させること、および
(ii)少なくとも1つの剤が細胞における味覚受容体の機能活性に作用するかどうかを、細胞における少なくとも1つの機能的応答により決定すること、
を含み、
ここで、前記T1R2甘味受容体は、配列番号2と実質的に相同なポリペプチド、配列同一性によって決定される、配列番号1と実質的に相同なヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびハイブリダイゼーションによって決定される、配列番号1と実質的に相同なヌクレオチドによってコードされるポリペプチドからなる群より選択され、
配列同一性によって決定される実質的に相同なヌクレオチドは少なくとも64%の配列同一性を有し、
ハイブリダイゼーションによって決定される配列番号1と実質的に相同なヌクレオチドは、50%のホルムアミド、5×SSC、および1%のSDSからなる溶液中での42℃の温度、ならびに0.2×SSCおよび0.1%のSDSからなる溶液中での65℃での洗浄のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、
T1R2ホモマー甘味受容体発現細胞はT1R3受容体を発現しない、前記方法を提供する。
他の態様において、前記方法は、Gタンパク質が、Gaq−ガストデューシンに基づくキメラGタンパク質である方法である。
さらに他の態様において、前記方法は、Gタンパク質がキメラGタンパク質であるGアルファ16−ガストデューシン44である方法である。
さらなる他の態様において、前記方法は、ステップ(ii)が細胞内メッセンジャーにおける変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化の計測によって行われる方法である。
ある態様において、細胞は、例えば、CHO、COS、HeLaおよびHEK−293からなる群より選択された哺乳類細胞である。
他の態様において、上記方法は、ステップ(i)がT1R2甘味受容体を甘味物質の存在下で試験剤と接触させることをさらに含む。甘味物質は、例えば、ペリラルチンであり得る。
(i)T1R2受容体ホモマー、または実質的に類似するそのホモログを発現するが、T1R3受容体は発現しない組換え細胞、および
(ii)T1R2ホモマーのアゴニスト
を、T1R2ホモマーの調節剤としての試験剤を同定するための組み合わせて利用するために含む。
(i)固体支持体上で組換え細胞を成長させること、および
(ii)約1nM〜100mMまたはそれ以上の量の試験剤を、適切な濃度のアゴニストの存在下で、定義されたプレートまたはウェルの培養培地に添加すること、
(iii)試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能的応答の変化を決定し、それにより、試験剤がT1R2ホモマーまたはその実質的に類似するホモログの調節物質であることを同定すること。
アッセイに利用される細胞
本発明によるスクリーニングまたはアッセイに有用な細胞は、T1R3を含まない細胞である。トランスフェクトされたまたは内在性のT1R3は、T1R2のアゴニスト応答または他の調節剤による前記応答の変化を決定する方法を否定的に妨害し得る。T1R3の非存在は、T1R2活性化の決定にヌルバックグラウンド(null background)を提供し、観察されるシグナルは直接T1R2活性の結果とすることができる。このことは、T1R2を特異的に調節する剤の同定を可能にし、T1R3が甘味およびうま味ヘテロダイマー両方の一部であるため、うま味物質をも含み得るT1R3を活性化する剤を排除できる。
代替的に、以下に詳述するように、任意の適切なリポーター遺伝子をT1R2活性化応答プロモーターに連結し、T1R2活性の決定に利用してもよい。
かかる細胞中でGPCRおよび/またはGタンパク質を発現するベクター構築物は、例えば本質的にポリメラーゼ連鎖反応を利用する知られた方法によって産生されてよい。配列の点検後、cDNA断片は、例えばpcDNA3.1哺乳類細胞用哺乳類発現ベクターなど、適切なベクター内へサブクローニングされてよく、正しい遺伝子の発現を可能にするために、哺乳類宿主細胞に一過性にトランスフェクトされてよい。
求めるタンパク質(例えばGPCRおよびGタンパク質)をコードするcDNAを発現するために、転写を導く強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーターおよび翻訳開始のためのリボソーム結合領域を含む、適切なcDNAが入った発現ベクターを典型的にサブクローニングする。例えばE.coli、Bacillus sp.、およびSalmonellaなど、適切な細菌プロモーターは当業者によく知られており、かかる発現系のためのキットが商業的に入手可能である。同様に、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核細胞発現系も商業的に入手可能である。真核細胞発現ベクターは、例えばアデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウィルスベクターなどであってよい。
T1R2は、例えばCMV早期プロモーターなどの強力な構成的プロモーターの制御下に置くことにより過剰発現されることができる。代替的に、保存されているGPCRアミノ酸またはアミノ酸ドメインのある変異を導入し、利用するGPCRを構成的に活性化させることが可能である。
大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫細胞細胞系を産生するのに、標準的なトランスフェクション法が利用可能である。
核酸配列を宿主細胞に導入するために知られたいかなる方法も利用してよい。用いる特定の遺伝子操作手順は、対象となるタンパク質を発現できる宿主細胞中に関係する遺伝子を首尾良く導入できさえすればそれでよい。これらの方法は、クローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来性の遺伝物質を宿主細胞中に導入することを伴ってもよく、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウィルスベクターなどを含む。
トランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞は、当業者によく知られた標準的な培養条件で培養することができる。異なる細胞は、適切な温度および細胞培養培地を含む、異なる培養状態を要求することは、当業者に明らかである。
T1R2受容体活性の調節物質(リガンド、アゴニスト、部分的アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、阻害剤、増強剤)は、以下に記載されたように同定可能である。これから前記アッセイによって同定され得る剤の定義について述べる。
調節剤は、機能的効果/パラメータを決定および比較するための、多様なインビトロおよびインビボアッセイを利用して、同定可能である。受容体の機能上の試験剤の効果は適切な機能的パラメータを分析することで計測可能である。受容体活性に影響するあらゆる生理学的変化は、調節剤の同定のために利用可能である。
アゴニストまたは部分的アゴニストを同定するために、試験剤を有するサンプルを、アゴニスト(例えばペリラルチン)を有するポジティブコントロールと比較し、または代替的に/付加的に、試験剤を有するおよび有さないサンプルを、その受容体活性について比較する。例えば、アゴニストまたは部分的アゴニストは、アゴニストまたは部分的アゴニストが100mMまたはそれ以下で存在していた場合、ポジティブコントロール甘味アゴニストの最大生物学的活性の少なくとも10%に相当する生物学的活性を有しているだろうし、例えばアゴニストの最大生物学的活性に匹敵するまたはそれ以上の最大生物学的活性を有していてもよい。最大生物学的活性は、例えばペリラルチンなど、与えられた受容体アッセイフォーマット内で達成可能なアゴニストに対する最大達成可能受容体応答と定義され、その応答は、同じアゴニストの濃度を増大させても、さらに増大させることはできない。
拮抗剤を同定するために、試験剤を有するおよび有さない、知られたアゴニストの存在下における受容体活性が比較される。拮抗剤は、例えば少なくとも10%の、アゴニスト刺激性受容体活性の減少を示す。
逆アゴニストを同定するために、試験剤を有するおよび有さない受容体活性が、上述のように、受容体を過剰発現した動物/細胞/膜を含有するサンプル中で比較される。逆アゴニストは、例えば少なくとも10%の、受容体の構成的活性の減少を示す。アッセイにおけるT1R2ホモマー受容体活性計測の適切な検出法の様々な例が本明細書中に記載されている。
"G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)", CRC Press 1999; 第1版, Haga and Berstein編に詳述されているように、受容体活性を報告するために細胞をイオン感受性色素で染色する。細胞質または膜電位におけるイオン濃度の変化は、それぞれイオン感受性または膜電位蛍光指標を利用して計測される。
GPCRの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出は、カルシウムに結合する細胞持続性(cell-permanent)色素を利用して決定される。カルシウム結合性色素は、細胞内のカルシウム上昇に比例する蛍光シグナルを発生する。この方法は、受容体活性の迅速かつ定量的な計測を可能にする。
1日目:1ウェルあたり150ngのGPCR DNAおよび0.3μlのリポフェクタミン2000(Invitrogen)を利用して、細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞は栄養成長培地中、一晩37℃で維持する。
アデニル酸シクラーゼ活性のためのアッセイは、例えばKenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585〜591に詳述されているように行われる。反応混合物は通常37℃で10分以下インキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物は0.9mlの冷6%トリクロロ酢酸を添加して除タンパクする。チューブを遠心し、それぞれの上清をDowex AG50w−X4カラムに加える。カラムからのcAMP画分を、アゴニストによる受容体活性化を受けて発生したcAMPレベルを計測するために、4mlの0.1mMイミダゾール−HCl(pH7.5)で計数バイアル中に溶出する。コントロール反応もまた、T1R2ポリペプチドを発現しない細胞のタンパク質ホモジネートを利用して行うべきである。
Gタンパク質を発現している細胞中で、イノシトール三リン酸(IP3)/Ca2+およびその結果としての受容体活性に相当するシグナルを、蛍光を利用して決定可能である。GPCRを発現している細胞は、細胞内貯蔵およびイオンチャネルの活性化経由の寄与の結果、細胞質カルシウムレベルの増大を見せ得、必須ではないが、カルシウムフリー緩衝液中でかかるアッセイを実施し、内在ストアからのカルシウム放出の結果による蛍光応答と区別するために、任意にEDTAなどのキレート剤を補完することが望ましいだろう。
T1R2は、受容体とホスホリパーゼCシグナル伝達経路を連結するGタンパク質を有する細胞で発現される。細胞内Ca2+濃度の変化は、例えば蛍光Ca2+指示色素および/または蛍光イメージングなどを利用して、計測する。
T1R2を含むGPCRにとって、受容体活性の指標はGPCRを含む細胞膜によるGTPの結合である。計測されるのは、標識GTPの結合を検出することで膜と連結するGタンパク質である。受容体を発現する細胞から単離された膜は、35S−GTPγSおよび未標識GDPを含有する緩衝液中でインキュベートされる。活性を有するGTPaseは無機リン酸塩として標識を放出し、これは20mMのH3PO4中の活性炭5%懸濁液中で遊離無機リン酸塩を分離した後にシンチレーションカウンティングによって決定される。混合物をインキュベートし、未結合標識GTPをGF/Bフィルターでろ過して取り除く。結合した標識GTPを液体シンチレーションカウンティングで計測する。コントロールは、試験剤の非特異的効果の可能性を排除するために、T1R2を発現しない細胞(モックトランスフェクションしたもの)から単離した膜を利用するアッセイを含む。方法はTraynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol., 47: 848〜854に詳述されている。
かかるアッセイはHafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 149〜158に詳述されているように行うことができる。
アラキドン酸
アラキドン酸の細胞内レベルは受容体活性の指標として採用される。かかる方法はGijon et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:20146〜20156に詳述されている。
細胞内または細胞外cAMPは、cAMPラジオイムノアッセイ(RIA)または、例えばHorton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91〜105に記載されているような、cAMP結合タンパク質を利用して計測される。代替的に、例えばLJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsの高効率蛍光偏光ベースホモジニアスアッセイなど、複数のcAMP計測のためのキットもまた商業的に入手可能である。代替的に、cGMPの細胞内または細胞外レベルもまた、例えばイムノアッセイを利用して計測可能である。例えば、Felly-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol., 11:159〜164(1994)に記載の方法などが、cGMPレベルを決定するのに利用され得る。代替的に、米国特許4,115,538に記載されているcAMPおよび/またはcGMPを計測するアッセイキットもまた利用可能である。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用されるべきである。
例えばPhospholipid Signaling Protocols, Ian M. Bird, Totowa, N.J.編, Humana Press, 1998に記載のように、受容体活性に起因するリン脂質分解によって放出される、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール(DAG)および/またはイノシトール三リン酸(IP3)を検出し、T1R2活性の指標として利用することが可能である。代替的に、Perkin Elmer and CisBio Internationalから商業的に入手可能な、イノシトール三リン酸の計測のためのキットが利用可能である。試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用されるべきである。
成長因子受容体チロシンキナーゼは、リン脂質およびカルシウム活性化タンパク質キナーゼファミリーの、タンパク質キナーゼC(PKC)の活性化を伴う経路を通してシグナリング可能である。PKCに誘導される遺伝子産物の増大は、PKCの活性化およびその結果としての受容体の活性化を示す。これらの遺伝子産物は、例えばガン原遺伝子転写因子コード遺伝子(c−fos、c−mycおよびc−junを含む)、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤(コラーゲナーゼタイプIおよびプラズミノーゲン活性化因子阻害剤を含む)、および接着分子(細胞内接着因子I(ICAM I)を含む)などを含む。PKC活性はKikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 13341に記載されているように、その後ホスホセルロースペーパーに結合することによって分離されるPKC基質ペプチドのリン酸化を計測することで、直接計測し得る。これは精製キナーゼまたは粗細胞抽出物中の活性の計測に利用可能である。タンパク質キナーゼCサンプルは20mM HEPES/2mM DTTでアッセイ直前に希釈可能である。代替的なアッセイは、PanVeraから商業的に入手可能なタンパク質キナーゼCアッセイキットを利用して行うことも可能である。
MAPキナーゼ活性は、例えばNew England Biolabsのp38MAPキナーゼアッセイキット、またはPerkin-Elmer Life ScienceのFlashPlateTM MAPキナーゼアッセイなど、商業的に入手可能なキットを利用して計測可能である。p42/44MAPキナーゼまたはERK1/2は、GqおよびGi結合GPCRを有する細胞を利用している場合、T1R2活性を示すために計測可能であり、GPCR活性化に続く内在性ERK1/2キナーゼのリン酸化を計測するERK1/2アッセイキットはTGR Biosciencesによって商業的に入手可能である。代替的に、知られた合成または天然チロシンキナーゼ基質および標識リン酸塩を通したチロシンキナーゼ活性の直接計測はよく知られており、他のタイプのキナーゼ(例えばセリン/スレオニンキナーゼ)の活性も同様に計測可能である。
レポーター遺伝子アッセイで調節剤を同定するためには、シグナルにおける少なくとも2倍の増大または10%の減少が有意である。アゴニストは、試験剤の存在下および非存在下における活性を比較した場合、例えば少なくとも2倍、5倍、10倍またはそれ以上刺激する。
T1R2へのアゴニストの結合によって開始される細胞内シグナルは細胞内事象のカスケードを動かし、最終結果として1または2以上の遺伝子の転写または翻訳における迅速かつ検出可能な変化となる。受容体の活性はしたがって、T1R2活性化に応答するプロモーターに駆動されるレポーター遺伝子の発現の計測によって決定される。
ホスファチジルイノシトール(PI)加水分解は、少なくとも48時間またはそれ以上の3H−ミオイノシトールによる細胞標識を伴う、米国特許5,436,128に記載されているように決定できる。標識細胞は試験剤に1時間接触させ、次いでそれらの細胞を溶解し、クロロホルム−メタノール−水に抽出する。その後、イノシトールリン酸をイオン交換クロマトグラフィで分離し、シンチレーションカウンティングで定量する。アゴニストに関して、刺激比(fold stimulation)は、試験剤の存在下における計数毎分(cpm)の、緩衝液コントロールの存在下でのcpmに対する比を計算して決定される。同じように、阻害剤、アンタゴニストおよび逆アゴニストに関して、阻害比は、試験剤の存在下における計数毎分(cpm)の、緩衝液コントロール(アゴニストを含有してもしなくてもよい)の存在下でのcpmに対する比を計算して決定される。
本方法で有用なT1R2ホモマー受容体は野生型受容体、または代替的に実質的に相同で依然として機能的である(つまりリガンドと結合しリガンドによって活性化される)受容体(またはT1R2受容体を形成するヌクレオチド配列)であってよい。かかる相同的な受容体は、例えば、ヒト受容体またはラット(約70%のアミノ酸配列同一性)、マウス(約69%のアミノ酸配列同一性および約64%の核酸同一性)、またはイヌ(約76%のアミノ酸配列同一性)、またはヒト受容体と十分なアミノ酸配列同一性を有する他のあらゆる種を含む異なる種の受容体の対立遺伝子変異体であってよい。
核酸配列について、保存的に改変された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列(保存的に置換されたアミノ酸、すなわちアルギニンに差し替えられたリシンおよび下記に説明されているさらなる例など)をコードする核酸を意味する。
実質的に相同なヌクレオチド配列は、例えば少なくとも64%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の%配列同一性を有する。実質的に相同なポリペプチド配列は、例えば少なくとも69%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の%配列同一性を有する。
ヌクレオチド配列は、本明細書で提示するヌクレオチド配列、またはその相補体と、以下に詳述するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズできた場合、実質的に相同であると考えられる。
ストリンジェントな条件は、50%のホルムアミド、5×SSC、および1%のSDSからなる溶液中の42℃の温度、および0.2×SSCおよび0.1%のSDS(1×SSC=0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7.0)からなる溶液中での65℃での洗浄である。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のヌクレオチド配列が、例えばスクリーニングされるcDNAまたはゲノムDNA中に存在するために起こり得る。バックグラウンドの少なくとも2倍、任意にバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍の陽性シグナルが、標的DNAとの特異的相互作用であるとみなされる。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば32Pによって放射性標識して計測することができる。
例えばスクリーニングキットまたはハイスループットスクリーニングキットなどの、T1R2ホモマー、またはその実質的に相同な配列を発現するがT1R3は発現しないトランスフェクト細胞を含有し;例えばペリラルチンなどのT1R2ホモマーのアゴニストを含有するキットがまた提供される。
キットは以下のように利用されてよい:
(i)組換え細胞を固体支持体上で成長させる。
(ii)約1nMまたはそれ以下から100mMまたはそれ以上までの濃度の試験剤を、所定のプレートまたはウェルの培養培地に好適な濃度のアゴニストの存在下で加える。
(iii)細胞の機能的応答の変化が、試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することで決定され、その結果試験剤が調節剤であり得るかどうかが決定される。
上述の方法によって同定された調節剤は、フレーバリストのパネルまたは試験者に同定された調節剤をテイスティングさせる単純な官能試験によって簡単に確認し得る。化合物は、例えば、甘味を確認するために水中で、または甘味を増強する調節剤であることを確認するために甘味料と一緒に、調節剤のないネガティブコントロールと比較してテイスティングする。
上述の転写レポーターアッセイおよびほとんどの細胞ベースのアッセイは、ライブラリーをT1R2活性を調節する剤についてスクリーニングするのに適している。アッセイは、アッセイ工程の自動化および、典型的には平行して実行される(例えばロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式など)、任意の好都合な給源からの化合物のアッセイへの供給によって、巨大な化学的ライブラリをスクリーニングするように設計され得る。
コンビナトリアルケミカルライブラリは、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」の組合せることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された様々な化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリなどのリニアコンビナトリアルケミカルライブラリは、所定の化合物長(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)について、化学的ビルディングブロック(アミノ酸)のセットをあらゆる可能な方法で組合せることによって形成される。何百万もの化学的化合物が、かかる化学的ビルディングブロックの組合せ混合を通して合成可能である。レアケミカルライブラリはAldrich(Milwaukee, Wis.)から入手可能である。
試験剤は、小化学化合物、化学ポリマー、生物ポリマー、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、核酸および脂質を含む任意の剤であり得る。剤は、合成化合物、化合物の混合物、天然産物または天然サンプル、例えば植物抽出物、培養上清、または組織サンプルなどであり得る。
配列は後述の配列表に示されている。配列番号1はT1R2受容体をコードするヌクレオチド/核酸配列に対応し、配列番号2はT1R2受容体タンパク質のポリペプチド/アミノ酸配列に対応する。
全ての例はヒト受容体を利用する。
例1
Fluo−4カルシウムアッセイ
Fluo−4は、細胞内カルシウムの蛍光指示薬であり、カルシウム濃度の変化、特にリガンド(例えばペリラルチン)添加後に起こる受容体活性化に応答した増加の決定を可能にする。
Gアルファ16−ガストデューシン44(Gα16gust44)を安定発現し、例2、3または4に記載されているようにトランスフェクトしたHEK293細胞を宿主細胞として利用した。
蛍光は、リガンド添加前15秒間およびリガンド添加後105秒間で継続的に監視した(45〜105秒で十分であろう)。
受容体活性化は相対蛍光単位(RFU)で与えられ、次の等式で定義される:
蛍光増加=最大蛍光−基準蛍光
式中、基準蛍光はリガンド添加前の最初の10〜15秒について計算した平均蛍光を表す。
T1R2、T1R3、およびT1R2/T1R3のトランスフェクションならびに異種発現
T1R2ベクター構築物を形成するために、ヒトT1R2およびT1R3全タンパク質コード配列を含有するcDNA断片がヒト茸状細胞cDNAライブラリから単離され、完全にシークエンシングされ、そこでpCDNA3.1(Invitrogen)にサブクローンされた。
0日目に、HEK293T/G16gust44細胞を、96ウェルプレートにウェルあたり8,500個の密度で播種し、選択成長培地で一晩成長させた。
1日目に、培地を抗生物質不含、血清不含の成長培地に交換し、75ngのT1R2またはT1R3ベクター構築物DNAおよび0.3μlのリポフェクタミン2000(Invitrogen)を利用してトランスフェクトした。
発現構築物を一過性にトランスフェクトされた細胞は、例1に記載されているように蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR-Tetra, Molecular Devices)を利用して同定された。
T1R3の存在下および非存在下における、ペリラルチンによるT1R2の活性化
50μMのペリラルチンによる刺激に引き続く細胞内カルシウム応答はG16gust44を安定的に発現し、T1R2モノマー、T1R3モノマー、ならびにT1R2/T1R3ダイマーを与えるようにT1R2およびT1R3両方をトランスフェクトされたHEK293T細胞において決定された。
トランスフェクションは例2に記載されている方法に従って実施され、結果は例1に記載されているように計算された(データは刺激後の蛍光における基準値以上の正味の増加(RFU)を示し、平均値±6反復の標準偏差が与えられている)。
T1R2を発現する安定的細胞系の形成のためのT1R2のトランスフェクション
ヒトT1R2/pcDNA4−Zeocin構築物5μgをPvuIIで消化して直鎖化し、Wizard DNA Clean-Up System(Promega)を利用して精製した。DNAはリポフェクタミン2000試薬を利用して、既に安定的にG16gust44Gタンパク質を発現する細胞(WO2004/055048に記載されているように形成)中にトランスフェクトされた。
Claims (14)
- 味覚細胞における甘味シグナリングを調節する剤を同定する方法であって、
(i)甘味刺激に応答するT1R2ホモマー味覚受容体を発現する細胞を、任意に他の剤の存在下で、剤と接触させること、および
(ii)少なくとも1つの剤が細胞における味覚受容体の機能活性に作用するかどうかを、細胞における少なくとも1つの機能的応答により決定すること、
を含み、
ここで、前記T1R2甘味受容体は、配列番号2と実質的に相同なポリペプチド、配列同一性によって決定される、配列番号1と実質的に相同なヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびハイブリダイゼーションによって決定される、配列番号1と実質的に相同なヌクレオチドによってコードされるポリペプチドからなる群より選択され、
実質的に相同なポリペプチドは少なくとも69%の配列同一性を有し、
配列同一性によって決定される実質的に相同なヌクレオチドは少なくとも64%の配列同一性を有し、
ハイブリダイゼーションによって決定される配列番号1と実質的に相同なヌクレオチドは、50%のホルムアミド、5×SSC、および1%のSDSからなる溶液中での42℃の温度、ならびに0.2×SSCおよび0.1%のSDSからなる溶液中での65℃での洗浄のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、
T1R2ホモマー甘味受容体発現細胞はT1R3受容体を発現しない、前記方法。 - 細胞が、Gタンパク質をも発現する、請求項1に記載の方法。
- Gタンパク質が、Gaq−ガストデューシンに基づくキメラGタンパク質である、請求項2に記載の方法。
- Gタンパク質が、キメラGタンパク質であるGアルファ16−ガストデューシン44である、請求項3に記載の方法。
- (ii)が、細胞内メッセンジャーにおける変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化の計測によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 機能的応答が、IP3およびカルシウム2+から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することによって決定される、請求項2に記載の方法。
- 細胞が、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、哺乳類細胞である、請求項7に記載の方法。
- 細胞が、CHO、COS、HeLaおよびHEK−293からなる群より選択された哺乳類細胞である、請求項8に記載の方法。
- (i)が、T1R2甘味受容体を甘味物質の存在下で試験剤と接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 甘味物質が、ペリラルチンである、請求項10に記載の方法。
- (i)T1R2受容体ホモマー、または実質的に類似するそのホモログを発現するが、T1R3受容体は発現しない組換え細胞、および
(ii)T1R2ホモマーのアゴニスト
を、T1R2ホモマーの調節剤としての試験剤を同定するための組み合わせて利用するために含むキット。 - 請求項12に記載のキットを使用する方法であって、
(i)固体支持体上で組換え細胞を成長させること、
(ii)定義されたプレートまたはウェルの培養培地へ、アゴニストの存在下、適切な濃度で試験剤を添加すること、および
(iii)試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能的応答の変化を決定し、それにより、試験剤がT1R2ホモマーまたはその実質的に類似するホモログの調節物質であることを同定すること
を含む、前記方法。 - 約1nM〜100mMまたはそれ以上の量の試験剤を、適切な濃度のアゴニストの存在下で、定義されたプレートまたはウェルの培養培地に添加することを含む、請求項13に記載の方法。
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