JP2003530098A - Ｔ２ｒ味覚受容体及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
Ｔ２ｒ味覚受容体及びそれをコードする遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
新規に同定された哺乳動物味覚細胞特異的Ｇタンパク質共役受容体及び該受容体をコードする遺伝子が記述されている。特に、苦味感覚に関係すると考えられるＴ２Ｒ味覚Ｇタンパク質共役受容体及びそれをコードする遺伝子が、遺伝子の単離方法及びその受容体の単離及び発現方法と共に、記述されている。哺乳動物における特別な呈味物質の味覚感知を表現する方法も、哺乳動物における予定した味覚感知を引き起こす新規分子または分子の組合せを創り出す方法及び１以上の味を模倣する方法と共に記述されている。
Description
【０００１】関連出願の相互参照
本出願は米国出願番号６０／１９５，５３２、２０００年４月７日出願、及び
米国出願番号６０／２４７，０１４、２０００年１１月１３日出願の優先権を主
張し、両者の全てを引用してここに取り入れた。
米国出願番号６０／２４７，０１４、２０００年１１月１３日出願の優先権を主
張し、両者の全てを引用してここに取り入れた。
【０００２】発明の分野
本発明は、新規に同定した哺乳動物化学感受性Ｇタンパク質共役受容体に、そ
の受容体のファミリーに、そして該受容体をコードする遺伝子及びｃＤＮＡに関
するものである。特に、本発明は味覚シグナル伝達に活性のある新規に同定した
哺乳動物化学感受性Ｇタンパク質共役受容体に、その受容体のファミリーに、そ
して該受容体をコードする遺伝子及びｃＤＮＡに、並びに味覚調節剤（ｔａｓｔ
ｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を分析しそして発見する際に受容体、遺伝子及びｃＤ
ＮＡを使用する方法に関するものである。
の受容体のファミリーに、そして該受容体をコードする遺伝子及びｃＤＮＡに関
するものである。特に、本発明は味覚シグナル伝達に活性のある新規に同定した
哺乳動物化学感受性Ｇタンパク質共役受容体に、その受容体のファミリーに、そ
して該受容体をコードする遺伝子及びｃＤＮＡに、並びに味覚調節剤（ｔａｓｔ
ｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を分析しそして発見する際に受容体、遺伝子及びｃＤ
ＮＡを使用する方法に関するものである。
【０００３】関連技術の説明
味覚システムは外界の化学組成に関する感覚情報を提供する。味覚伝達は動物
においては化学的に誘発される感覚の最も精巧な形の一つである、そして単純な
原生動物から最も複雑な脊椎動物に至る動物界に広く見出されている。哺乳動物
は５つの基本的味覚様式：甘味、苦味、酸味、塩辛味、そしてうま味（グルタミ
ン酸一ナトリウム塩の味）を持つと考えられている。
においては化学的に誘発される感覚の最も精巧な形の一つである、そして単純な
原生動物から最も複雑な脊椎動物に至る動物界に広く見出されている。哺乳動物
は５つの基本的味覚様式：甘味、苦味、酸味、塩辛味、そしてうま味（グルタミ
ン酸一ナトリウム塩の味）を持つと考えられている。
【０００４】
それぞれの味覚の様式は異なる伝達経路により伝達されると考えられている。
これらの経路は受容体細胞のサブセットに発現した受容体、例えば代謝調節型受
容体またはイオンチャネル型受容体、によって伝達されると考えられている。例
えば、ある味覚はＧタンパク質共役受容体により伝達され、その一方で他の味覚
はチャネルタンパク質によって伝達されると考えられている（例えば、Ｋａｗａ
ｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｕｍａｍｉ：Ａ
Ｂａｓｉｃ Ｔａｓｔｅ（１９８７）；Ｋｉｎｎａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５４：７１５−３１（１９９２）；Ｌｉｎｄｅ
ｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７６：７１８−６６（１９９６）；Ｓｔ
ｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７２：１−２６（
１９９７）参照）。
これらの経路は受容体細胞のサブセットに発現した受容体、例えば代謝調節型受
容体またはイオンチャネル型受容体、によって伝達されると考えられている。例
えば、ある味覚はＧタンパク質共役受容体により伝達され、その一方で他の味覚
はチャネルタンパク質によって伝達されると考えられている（例えば、Ｋａｗａ
ｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｕｍａｍｉ：Ａ
Ｂａｓｉｃ Ｔａｓｔｅ（１９８７）；Ｋｉｎｎａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５４：７１５−３１（１９９２）；Ｌｉｎｄｅ
ｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７６：７１８−６６（１９９６）；Ｓｔ
ｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７２：１−２６（
１９９７）参照）。
【０００５】
哺乳動物では、味覚受容体細胞は舌上皮の異なる乳頭中に分布している味蕾の
中に組み込まれている。舌の奥に認められる輪郭乳頭は数百から数千の味蕾を含
んでいる。これに対して、舌縁の後端に局在する葉状乳頭は数十から数百の味蕾
を含んでいる。さらに、舌の前部に局在する茸状乳頭はわずか少数の味蕾を含む
のみである。
中に組み込まれている。舌の奥に認められる輪郭乳頭は数百から数千の味蕾を含
んでいる。これに対して、舌縁の後端に局在する葉状乳頭は数十から数百の味蕾
を含んでいる。さらに、舌の前部に局在する茸状乳頭はわずか少数の味蕾を含む
のみである。
【０００６】
各味蕾は、動物種によって、前駆細胞、支持細胞、及び味覚受容体細胞を含め
て、５０−１５０細胞を含んでいる。例えば、Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．Ｒｅｖ．，７６：７１８−６６（１９９６）を参照。受容体細胞はその基
底において、脳幹及び視床においてシナプスを介して皮質味覚中枢へ情報を伝達
する求心性神経末端と連絡している。味覚細胞の情報伝達及び情報処理の機構を
解明することは、味覚の機能、調節及び知覚を理解するために重要である。
て、５０−１５０細胞を含んでいる。例えば、Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．Ｒｅｖ．，７６：７１８−６６（１９９６）を参照。受容体細胞はその基
底において、脳幹及び視床においてシナプスを介して皮質味覚中枢へ情報を伝達
する求心性神経末端と連絡している。味覚細胞の情報伝達及び情報処理の機構を
解明することは、味覚の機能、調節及び知覚を理解するために重要である。
【０００７】
動物における多くの生理学的研究は、味覚受容体細胞は異なる化学刺激に対し
て選択的に応答することを示している（例えば、Ａｋａｂａｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１０４７−５０（１９８８）；Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００：８０３−２４（１９
９２）；Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４９０：
３２５−３６（１９９６）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｐｈｙｓｉｏｌ．，７５：１２５６−６３（１９９６）参照、）。特に、味覚受
容体を発現している細胞は、ある化学刺激に曝された時に活動電位を発生して脱
分極することにより味覚感覚を生じる。この活動電位は味覚求心神経シナプスに
おける神経伝達物質の放出を誘発し、それによって味覚感覚を仲介する神経経路
に沿って情報伝達を開始すると考えられている（例えば、Ｒｏｐｅｒ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：３２９−５３（１９８９）参照）。しかし
、現在のところ、味覚感覚を引き出す手段はまだよく分かっていない（例えば、
Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１５：６４５−５０（１９９３）
；Ａｖｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．，１１２：
１−８（１９８９）参照）。
て選択的に応答することを示している（例えば、Ａｋａｂａｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１０４７−５０（１９８８）；Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００：８０３−２４（１９
９２）；Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４９０：
３２５−３６（１９９６）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｐｈｙｓｉｏｌ．，７５：１２５６−６３（１９９６）参照、）。特に、味覚受
容体を発現している細胞は、ある化学刺激に曝された時に活動電位を発生して脱
分極することにより味覚感覚を生じる。この活動電位は味覚求心神経シナプスに
おける神経伝達物質の放出を誘発し、それによって味覚感覚を仲介する神経経路
に沿って情報伝達を開始すると考えられている（例えば、Ｒｏｐｅｒ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：３２９−５３（１９８９）参照）。しかし
、現在のところ、味覚感覚を引き出す手段はまだよく分かっていない（例えば、
Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１５：６４５−５０（１９９３）
；Ａｖｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．，１１２：
１−８（１９８９）参照）。
【０００８】
上記のように、味覚受容体は特定の味覚感覚を引き起こす分子を特異的に認識
する。これらの分子をここでは「呈味物質（ｔａｓｔａｎｔ）」という。多数の
味覚受容体は７回膜貫通受容体スーパーファミリーに属し（Ｈｏｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ ９６：４５１（１９９９）；Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ，１００：６９３（２０００））、それらはまたＧタンパク質共役受容体（
ＧＰＣＲ）としても知られている。Ｇタンパク質共役受容体は、内分泌機能、外
分泌機能、心拍数、脂肪分解、及び炭水化物代謝のような多くの生理機能を調節
している。そのような受容体の生化学分析及び分子クローニングによりこれらの
受容体の機能に関する多くの基本原理が明らかにされた。
する。これらの分子をここでは「呈味物質（ｔａｓｔａｎｔ）」という。多数の
味覚受容体は７回膜貫通受容体スーパーファミリーに属し（Ｈｏｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ ９６：４５１（１９９９）；Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅ
ｌｌ，１００：６９３（２０００））、それらはまたＧタンパク質共役受容体（
ＧＰＣＲ）としても知られている。Ｇタンパク質共役受容体は、内分泌機能、外
分泌機能、心拍数、脂肪分解、及び炭水化物代謝のような多くの生理機能を調節
している。そのような受容体の生化学分析及び分子クローニングによりこれらの
受容体の機能に関する多くの基本原理が明らかにされた。
【０００９】
例えば、米国特許５，６９１，１８８には、リガンドがＧＰＣＲに結合する際
にＧタンパク質活性化を生じる受容体の形態変化が推定としてどのように行われ
るかが記述されている。Ｇタンパク質は３つのサブユニットからなる：グアニル
ヌクレオチドが結合するαサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニット
。Ｇタンパク質は、αサブユニットにＧＤＰが結合するかＧＴＰが結合するかに
よって、２つの形を行き来している。ＧＤＰが結合した時には、Ｇタンパク質は
ヘテロトリマー：Ｇαβγ複合体として存在する。ＧＴＰが結合した時には、ヘ
テロトリマーからαサブユニットが解離して、Ｇβγとなる。Ｇαβγ複合体が
細胞膜の活性化Ｇタンパク質共役受容体と作動的に会合している場合には、ＧＤ
Ｐに代わってＧＴＰが交換する速度が増加し、そしてＧαβγ複合体からＧαサ
ブユニットが解離する速度が増加する。こうしてＧαサブユニット及びＧβγ複
合体は種々のシグナル伝達経路の下流構成分子に情報を伝達することができる。
このような事象は、例えば味覚及び／または嗅覚のような神経的感覚として認め
られる情報伝達現象を含めて、多数の異なる細胞情報伝達現象の基本である。
にＧタンパク質活性化を生じる受容体の形態変化が推定としてどのように行われ
るかが記述されている。Ｇタンパク質は３つのサブユニットからなる：グアニル
ヌクレオチドが結合するαサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニット
。Ｇタンパク質は、αサブユニットにＧＤＰが結合するかＧＴＰが結合するかに
よって、２つの形を行き来している。ＧＤＰが結合した時には、Ｇタンパク質は
ヘテロトリマー：Ｇαβγ複合体として存在する。ＧＴＰが結合した時には、ヘ
テロトリマーからαサブユニットが解離して、Ｇβγとなる。Ｇαβγ複合体が
細胞膜の活性化Ｇタンパク質共役受容体と作動的に会合している場合には、ＧＤ
Ｐに代わってＧＴＰが交換する速度が増加し、そしてＧαβγ複合体からＧαサ
ブユニットが解離する速度が増加する。こうしてＧαサブユニット及びＧβγ複
合体は種々のシグナル伝達経路の下流構成分子に情報を伝達することができる。
このような事象は、例えば味覚及び／または嗅覚のような神経的感覚として認め
られる情報伝達現象を含めて、多数の異なる細胞情報伝達現象の基本である。
【００１０】
ヒト及びその他の真核生物の多数の化学受容体の完全なあるいは部分的な配列
は現在判明している（例えば、Ｐｉｌｐｅｌ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，８：９６９−７７（１９９９）；Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，Ｐ
．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：４８７−５０（１９９９）
；ＥＰ０８６７５０８Ａ２；ＵＳ ５８７４２４３；ＷＯ ９２／１７５８５；
ＷＯ ９５／１８１４０；ＷＯ ９７／１７４４４；ＷＯ ９９／６７２８２参
照）。味覚細胞機能の精神物理学及び生理学については多くのことが判明してい
るが、その感覚情報応答を仲介する分子及び経路についてはよく分かっていない
。新規の味覚受容体及び味覚情報伝達分子の同定及び単離は、味覚伝達経路の化
学的及び遺伝的調節の新しい方法を可能にするであろう。例えば、受容体及びチ
ャネル分子を利用することにより、高親和性アゴニスト、拮抗剤、逆アゴニスト
、及び味覚活性の調節剤をスクリーニングすることを可能にするであろう。その
ような調節化合物は医薬産業及び食品産業において種々の消費物資の味の改善、
あるいは商品中の、苦味のような好ましくない味を阻止するのに有用であろう。
は現在判明している（例えば、Ｐｉｌｐｅｌ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，８：９６９−７７（１９９９）；Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，Ｐ
．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：４８７−５０（１９９９）
；ＥＰ０８６７５０８Ａ２；ＵＳ ５８７４２４３；ＷＯ ９２／１７５８５；
ＷＯ ９５／１８１４０；ＷＯ ９７／１７４４４；ＷＯ ９９／６７２８２参
照）。味覚細胞機能の精神物理学及び生理学については多くのことが判明してい
るが、その感覚情報応答を仲介する分子及び経路についてはよく分かっていない
。新規の味覚受容体及び味覚情報伝達分子の同定及び単離は、味覚伝達経路の化
学的及び遺伝的調節の新しい方法を可能にするであろう。例えば、受容体及びチ
ャネル分子を利用することにより、高親和性アゴニスト、拮抗剤、逆アゴニスト
、及び味覚活性の調節剤をスクリーニングすることを可能にするであろう。その
ような調節化合物は医薬産業及び食品産業において種々の消費物資の味の改善、
あるいは商品中の、苦味のような好ましくない味を阻止するのに有用であろう。
【００１１】発明の要約
一つには、本発明は化学受容体と化学刺激の相互作用をよく理解したいという
要望に応えるものである。したがって、本発明は、とりわけ、味覚情報伝達（ｔ
ａｓｔｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を調節するのに使用できる分子を同定す
るために、新規味覚受容体、及びその受容体の利用方法、及びその受容体をコー
ドする遺伝子及びｃＤＮＡを提供する。
要望に応えるものである。したがって、本発明は、とりわけ、味覚情報伝達（ｔ
ａｓｔｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を調節するのに使用できる分子を同定す
るために、新規味覚受容体、及びその受容体の利用方法、及びその受容体をコー
ドする遺伝子及びｃＤＮＡを提供する。
【００１２】
特に、本発明は最近発見されたＧタンパク質共役受容体ファミリー、及び該受
容体をコードする遺伝子及びｃＤＮＡに関係している。この受容体は主に苦味情
報伝達に関係していると考えられているが、他様式の味覚の情報伝達にも関係し
ている可能性がある。
容体をコードする遺伝子及びｃＤＮＡに関係している。この受容体は主に苦味情
報伝達に関係していると考えられているが、他様式の味覚の情報伝達にも関係し
ている可能性がある。
【００１３】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物において味覚感覚を表示する方法及び／または
味覚感覚を予想する方法を提供する。その方法はここに開示した受容体及び該受
容体をコードする遺伝子を使用して実施することが望ましい。
味覚感覚を予想する方法を提供する。その方法はここに開示した受容体及び該受
容体をコードする遺伝子を使用して実施することが望ましい。
【００１４】
そのために、本発明の一つの目的は、味覚受容体において活性のある哺乳動物
のＧタンパク質共役受容体、ここではＴ２Ｒと呼ぶ、の新しいファミリーを提供
することである。本発明のもう一つの目的は、呈味物質結合活性を有するそのＴ
２Ｒのフラグメント及び変異体を提供することである。
のＧタンパク質共役受容体、ここではＴ２Ｒと呼ぶ、の新しいファミリーを提供
することである。本発明のもう一つの目的は、呈味物質結合活性を有するそのＴ
２Ｒのフラグメント及び変異体を提供することである。
【００１５】
本発明のさらにその他の目的は、そのＴ２Ｒ、そのフラグメント、及び変異体
をコードする核酸配列または分子を提供することである。
をコードする核酸配列または分子を提供することである。
【００１６】
本発明のさらにその他の目的は、少なくとも一つの調節配列、例えばプロモー
ター、エンハンサー、またはポジティブあるいはネガティブ遺伝子転写及び／ま
たは翻訳に関係する配列、と作動的に連結している、そのＴ２Ｒ、またはそのフ
ラグメントまたは変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを供給するこ
とである。
ター、エンハンサー、またはポジティブあるいはネガティブ遺伝子転写及び／ま
たは翻訳に関係する配列、と作動的に連結している、そのＴ２Ｒ、またはそのフ
ラグメントまたは変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを供給するこ
とである。
【００１７】
本発明のさらにその他の目的は、そのＴ２Ｒ、またはそのフラグメントまたは
変異体の少なくとも一つを機能的に発現するヒト及び非ヒト細胞を提供すること
である。
変異体の少なくとも一つを機能的に発現するヒト及び非ヒト細胞を提供すること
である。
【００１８】
本発明のさらにその他の目的は、そのＴ２Ｒの少なくとも一つの少なくともフ
ラグメントを含むＴ２Ｒ融合タンパク質またはポリペプチドを提供することであ
る。
ラグメントを含むＴ２Ｒ融合タンパク質またはポリペプチドを提供することであ
る。
【００１９】
本発明のその他の目的は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、
１７、１９及び２３、及びその保存的修飾変異体を含む群から選択した核酸配列
と少なくとも５０％、望ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％一致する核酸分子を含むＴ２Ｒポリペプチドをコー
ドする単離核酸分子を提供することである。
１７、１９及び２３、及びその保存的修飾変異体を含む群から選択した核酸配列
と少なくとも５０％、望ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％一致する核酸分子を含むＴ２Ｒポリペプチドをコー
ドする単離核酸分子を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６
、１８、２０及び２４、及びその保存的修飾変異体、この変異体は少なくとも２
０、望ましくは４０、６０、８０、１００、１５０、２００、あるいは２５０ア
ミノ酸長である、を含む群から選択したアミノ酸配列と少なくとも３５から５０
％、望ましくは６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％、あるいは９９％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
核酸配列を含む単離核酸分子を提供することである。さらに、フラグメントは抗
Ｔ２Ｒ抗体に結合する抗原性フラグメントであり得る。
、１８、２０及び２４、及びその保存的修飾変異体、この変異体は少なくとも２
０、望ましくは４０、６０、８０、１００、１５０、２００、あるいは２５０ア
ミノ酸長である、を含む群から選択したアミノ酸配列と少なくとも３５から５０
％、望ましくは６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％、あるいは９９％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
核酸配列を含む単離核酸分子を提供することである。さらに、フラグメントは抗
Ｔ２Ｒ抗体に結合する抗原性フラグメントであり得る。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、変異が少なくとも１０、望ましくは５、４、３、２
あるいは１アミノ酸残基である該フラグメントの変異体を含む単離ポリペプチド
を提供することである。
あるいは１アミノ酸残基である該フラグメントの変異体を含む単離ポリペプチド
を提供することである。
【００２２】
本発明のさらにその他の目的は、そのＴ２Ｒまたはそのフラグメントまたは変
異体のアゴニストまたは拮抗剤を提供することである。
異体のアゴニストまたは拮抗剤を提供することである。
【００２３】
本発明のさらにその他の目的は、ヒトを含む哺乳動物における味覚感覚の表示
方法及び／または味覚感覚を予言する方法を提供することである。その方法はこ
こに開示したそのＴ２Ｒまたはそのフラグメントまたは変異体及びそのＴ２Ｒま
たはそのフラグメントまたは変異体をコードする遺伝子を使用して行なうことが
望ましい。
方法及び／または味覚感覚を予言する方法を提供することである。その方法はこ
こに開示したそのＴ２Ｒまたはそのフラグメントまたは変異体及びそのＴ２Ｒま
たはそのフラグメントまたは変異体をコードする遺伝子を使用して行なうことが
望ましい。
【００２４】
本発明のさらにその他の目的は、哺乳動物において予定した味覚感覚を引き起
こす新規分子または分子の組合せを提供することである。そのような分子または
組合せは、既知の分子または分子の組合せに対する哺乳動物における味覚感覚の
値を決めることにより創り出す事ができる；１以上の未知分子または分子の組合
せに対する哺乳動物における味覚感覚の値を決める；１以上の未知組成物に対す
る哺乳動物における味覚感覚の値を１以上の既知組成物の哺乳動物における味覚
感覚の値と比較する；哺乳動物において予定した味覚感覚を引き起こす分子また
は分子の組合せを選択する；そして、哺乳動物において予定した味覚感覚を引き
起こす分子または分子の組合せを形成するために２以上の未知分子または分子の
組合せを結合する。この結合段階により哺乳動物において予定した味覚感覚を引
き起こす単一分子または分子の混合物を生じる。
こす新規分子または分子の組合せを提供することである。そのような分子または
組合せは、既知の分子または分子の組合せに対する哺乳動物における味覚感覚の
値を決めることにより創り出す事ができる；１以上の未知分子または分子の組合
せに対する哺乳動物における味覚感覚の値を決める；１以上の未知組成物に対す
る哺乳動物における味覚感覚の値を１以上の既知組成物の哺乳動物における味覚
感覚の値と比較する；哺乳動物において予定した味覚感覚を引き起こす分子また
は分子の組合せを選択する；そして、哺乳動物において予定した味覚感覚を引き
起こす分子または分子の組合せを形成するために２以上の未知分子または分子の
組合せを結合する。この結合段階により哺乳動物において予定した味覚感覚を引
き起こす単一分子または分子の混合物を生じる。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、哺乳動物（ヒトであることが望ましい）によって
検出される味覚の存在を示す１以上の化合物をスクリーニングする方法を提供す
ることであり、その方法は次の段階を含む：開示したＴ２Ｒ、そのフラグメント
及び変異体の少なくとも一つと１以上の該化合物を接触させる段階。
検出される味覚の存在を示す１以上の化合物をスクリーニングする方法を提供す
ることであり、その方法は次の段階を含む：開示したＴ２Ｒ、そのフラグメント
及び変異体の少なくとも一つと１以上の該化合物を接触させる段階。
【００２６】
本発明のその他の目的は、味覚を刺激する方法を提供することであり、その方
法は次の段階を含む：ここに開示した、ヒトＴ２Ｒであることが望ましい、多数
のＴ２Ｒ、そのフラグメント及び変異体のそれぞれについてＴ２Ｒが呈味物質と
相互作用する程度を確認する；１以上のＴ２Ｒとの相互作用を予め確認した複数
の化合物それぞれを、味のプロフィールと類似した受容体刺激プロフィールを共
同して示す量で組み合わせる。呈味物質とＴ２Ｒの相互作用はここに記述した結
合アッセイまたはレポーターアッセイにより測定することができる。複数の化合
物は次いで結合して混合物とすることができる。望むならば、１以上の複数の化
合物を共有結合で結合することもできる。結合された化合物は呈味物質により実
質的に刺激される受容体の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％
、または９０％または全てを実質的に刺激する。
法は次の段階を含む：ここに開示した、ヒトＴ２Ｒであることが望ましい、多数
のＴ２Ｒ、そのフラグメント及び変異体のそれぞれについてＴ２Ｒが呈味物質と
相互作用する程度を確認する；１以上のＴ２Ｒとの相互作用を予め確認した複数
の化合物それぞれを、味のプロフィールと類似した受容体刺激プロフィールを共
同して示す量で組み合わせる。呈味物質とＴ２Ｒの相互作用はここに記述した結
合アッセイまたはレポーターアッセイにより測定することができる。複数の化合
物は次いで結合して混合物とすることができる。望むならば、１以上の複数の化
合物を共有結合で結合することもできる。結合された化合物は呈味物質により実
質的に刺激される受容体の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％
、または９０％または全てを実質的に刺激する。
【００２７】
本発明のその他の態様において、多数の標準化合物を多数のＴ２Ｒ、そのフラ
グメント及び変異体のそれぞれに対して試験を行ない、Ｔ２Ｒそれぞれが各標準
化合物に対して相互作用する程度を確認し、それによって各標準化合物に対する
受容体刺激プロフィールを作成する方法を提供する。これらの受容体刺激プロフ
ィールは次いでデータ保存媒体上のリレーショナルデータベース中に保管される
。この方法はさらに望ましい味の受容体刺激プロフィールの提供を含んでいる；
望ましい受容体刺激プロフィールをリレーショナルデータベースと比較する；そ
して望ましい受容体刺激プロフィールに最もよく適合する１以上の標準化合物の
組み合わせを確認する。この方法はさらに味覚を刺激するために標準化合物を１
以上の確認した組合せに結合することを含んでいる。
グメント及び変異体のそれぞれに対して試験を行ない、Ｔ２Ｒそれぞれが各標準
化合物に対して相互作用する程度を確認し、それによって各標準化合物に対する
受容体刺激プロフィールを作成する方法を提供する。これらの受容体刺激プロフ
ィールは次いでデータ保存媒体上のリレーショナルデータベース中に保管される
。この方法はさらに望ましい味の受容体刺激プロフィールの提供を含んでいる；
望ましい受容体刺激プロフィールをリレーショナルデータベースと比較する；そ
して望ましい受容体刺激プロフィールに最もよく適合する１以上の標準化合物の
組み合わせを確認する。この方法はさらに味覚を刺激するために標準化合物を１
以上の確認した組合せに結合することを含んでいる。
【００２８】
本発明のその他の目的は、哺乳動物における特別な物質の味覚感覚を表示する
方法を提供することであり、その方法は次の段階を含む：該脊椎動物のｎＴ２Ｒ
のそれぞれの定量的刺激を表す値Ｘ1からＸnを与える、このｎは４以上、ｎは１
２以上；ｎは２４以上、またはｎは４０以上；そして該値から味覚感覚の定量的
表示を作成する。Ｔ２Ｒはここに開示した味覚受容体、またはそのフラグメント
または変異体であり、表示はｎ次元空間の点または容積を構成し、グラフまたは
スペクトルを構成するかまたは定量的表示のマトリックスを構成する。また、提
供する段階は、遺伝子組換えで作製した多数のＴ２Ｒまたはそのフラグメントま
たは変異体と試験化合物と接触させそして該組成物と該受容体の相互作用を定量
的に測定することを含んでいる。
方法を提供することであり、その方法は次の段階を含む：該脊椎動物のｎＴ２Ｒ
のそれぞれの定量的刺激を表す値Ｘ1からＸnを与える、このｎは４以上、ｎは１
２以上；ｎは２４以上、またはｎは４０以上；そして該値から味覚感覚の定量的
表示を作成する。Ｔ２Ｒはここに開示した味覚受容体、またはそのフラグメント
または変異体であり、表示はｎ次元空間の点または容積を構成し、グラフまたは
スペクトルを構成するかまたは定量的表示のマトリックスを構成する。また、提
供する段階は、遺伝子組換えで作製した多数のＴ２Ｒまたはそのフラグメントま
たは変異体と試験化合物と接触させそして該組成物と該受容体の相互作用を定量
的に測定することを含んでいる。
【００２９】
本発明の関連する目的は、哺乳動物において未知の味覚感覚を生じる１以上の
分子または分子の組合せにより発生する味覚感覚を予言するする方法を提供する
ことであり、その方法は次の段階を含む：哺乳動物において既知味覚感覚を生じ
る１以上の分子または分子の組合せに対して、該脊椎動物のｎＴ２Ｒのそれぞれ
の定量的刺激を表す値Ｘ1からＸnを与える、このｎは４以上、ｎは１２以上；ｎ
は２４以上、またはｎは４０以上；そして該値から哺乳動物において既知味覚感
覚を生じる１以上の分子または分子の組合せに対して哺乳動物における味覚感覚
の定量的表示を作製する、哺乳動物において未知味覚感覚を生じる１以上の分子
または分子の組合せに対して、該脊椎動物のｎＴ２Ｒのそれぞれの定量的刺激を
表す値Ｘ1からＸnを与える、このｎは４以上、ｎは１２以上；ｎは２４以上、ま
たはｎは４０以上；そして該値から哺乳動物において未知味覚感覚を生じる１以
上の分子または分子の組合せに対して哺乳動物における味覚感覚の定量的表示を
作製する、そして哺乳動物において未知味覚感覚を生じる１以上の分子または分
子の組合せに対する哺乳動物における味覚感覚の定量的表示を哺乳動物において
既知味覚感覚を生じる１以上の分子または分子の組合せに対する哺乳動物におけ
る味覚感覚の定量的表示と比較することにより哺乳動物において未知味覚感覚を
生じる１以上の分子または分子の組合せにより発生する哺乳動物における味覚感
覚を予言する。この方法に使用したＴ２Ｒはここに開示した味覚受容体、または
そのフラグメントまたは変異体を含むことができる。
分子または分子の組合せにより発生する味覚感覚を予言するする方法を提供する
ことであり、その方法は次の段階を含む：哺乳動物において既知味覚感覚を生じ
る１以上の分子または分子の組合せに対して、該脊椎動物のｎＴ２Ｒのそれぞれ
の定量的刺激を表す値Ｘ1からＸnを与える、このｎは４以上、ｎは１２以上；ｎ
は２４以上、またはｎは４０以上；そして該値から哺乳動物において既知味覚感
覚を生じる１以上の分子または分子の組合せに対して哺乳動物における味覚感覚
の定量的表示を作製する、哺乳動物において未知味覚感覚を生じる１以上の分子
または分子の組合せに対して、該脊椎動物のｎＴ２Ｒのそれぞれの定量的刺激を
表す値Ｘ1からＸnを与える、このｎは４以上、ｎは１２以上；ｎは２４以上、ま
たはｎは４０以上；そして該値から哺乳動物において未知味覚感覚を生じる１以
上の分子または分子の組合せに対して哺乳動物における味覚感覚の定量的表示を
作製する、そして哺乳動物において未知味覚感覚を生じる１以上の分子または分
子の組合せに対する哺乳動物における味覚感覚の定量的表示を哺乳動物において
既知味覚感覚を生じる１以上の分子または分子の組合せに対する哺乳動物におけ
る味覚感覚の定量的表示と比較することにより哺乳動物において未知味覚感覚を
生じる１以上の分子または分子の組合せにより発生する哺乳動物における味覚感
覚を予言する。この方法に使用したＴ２Ｒはここに開示した味覚受容体、または
そのフラグメントまたは変異体を含むことができる。
【００３０】発明の詳細な説明
本発明はこのように味覚細胞特異的Ｇタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）
をコードする単離核酸分子及びそれがコードするポリペプチドを提供する。これ
らの核酸分子及びそれがコードするポリペプチドは味覚細胞特異的ＧＰＣＲのＴ
２Ｒファミリーの構成員である。特に、最近同定されたＴ２Ｒ遺伝子ファミリー
は、苦味受容体候補をコードしており、データベース登録番号ＡＦ２２７１２９
−ＡＦ２２７１４９及びＡＦ２４０７６５−ＡＦ２４０７６８、公開ヌクレオチ
ド配列デタベースにおける関連遺伝子の探索及び同定を促進した。本発明は新規
に同定されたこのファミリーの構成員に関係している。Ｔ２Ｒファミリーに関す
るその他の情報は、Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１００：６９３−７
０２（２０００）及びＣｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，
１００：７０３−１１（２０００）に見ることができ、両者の全体を引用してこ
こに取り入れた。
をコードする単離核酸分子及びそれがコードするポリペプチドを提供する。これ
らの核酸分子及びそれがコードするポリペプチドは味覚細胞特異的ＧＰＣＲのＴ
２Ｒファミリーの構成員である。特に、最近同定されたＴ２Ｒ遺伝子ファミリー
は、苦味受容体候補をコードしており、データベース登録番号ＡＦ２２７１２９
−ＡＦ２２７１４９及びＡＦ２４０７６５−ＡＦ２４０７６８、公開ヌクレオチ
ド配列デタベースにおける関連遺伝子の探索及び同定を促進した。本発明は新規
に同定されたこのファミリーの構成員に関係している。Ｔ２Ｒファミリーに関す
るその他の情報は、Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１００：６９３−７
０２（２０００）及びＣｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，
１００：７０３−１１（２０００）に見ることができ、両者の全体を引用してこ
こに取り入れた。
【００３１】
本発明のＴ２Ｒタンパク質をコードする核酸及びポリペプチドは、全体を引用
してここに取り入れたＷＯ ００／３５３７４に開示されている方法にしたがっ
て、種々の資源、遺伝子操作、増幅、合成、及び／または組み替え発現から単離
することができる。
してここに取り入れたＷＯ ００／３５３７４に開示されている方法にしたがっ
て、種々の資源、遺伝子操作、増幅、合成、及び／または組み替え発現から単離
することができる。
【００３２】
特に、本発明は味覚細胞特異的Ｇタンパク質共役受容体の新規ファミリーをコ
ードする核酸を提供する。これらの核酸及びそれがコードする受容体は味覚細胞
特異的Ｇタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）の「Ｔ２Ｒ」ファミリーの構成
員と呼ばれる。これらの味覚細胞特異的ＧＰＣＲは味覚伝達経路、特に、苦味伝
達経路の構成成分と考えられており、苦味物質、６−ｎ−プロピルチオウラシル
（ＰＲＯＰ）、しょ糖オクタアセテート（ｓｏａ）、ラフィノースウンデカアセ
テート（ｒｕａ）、デナトニウム（ｄｅｎａｔｏｎｉｕｍ）、グリシン銅、及び
キニーネ、のような物質の味覚検出に関係している。しかし、Ｔ２Ｒは他の種類
の味にも同様に関係しているであろう。
ードする核酸を提供する。これらの核酸及びそれがコードする受容体は味覚細胞
特異的Ｇタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）の「Ｔ２Ｒ」ファミリーの構成
員と呼ばれる。これらの味覚細胞特異的ＧＰＣＲは味覚伝達経路、特に、苦味伝
達経路の構成成分と考えられており、苦味物質、６−ｎ−プロピルチオウラシル
（ＰＲＯＰ）、しょ糖オクタアセテート（ｓｏａ）、ラフィノースウンデカアセ
テート（ｒｕａ）、デナトニウム（ｄｅｎａｔｏｎｉｕｍ）、グリシン銅、及び
キニーネ、のような物質の味覚検出に関係している。しかし、Ｔ２Ｒは他の種類
の味にも同様に関係しているであろう。
【００３３】
さらに、Ｔ２Ｒファミリーメンバーは他のＴ２Ｒファミリーメンバー、他の味
覚細胞特異的ＧＰＣＲ、またはそれらの組合せと複合して働き、化学感受性味覚
伝達に作用している。例えば、Ｔ２Ｒファミリーメンバーは多分同じ味覚受容体
細胞型に一緒に発現し、一緒に発現した受容体は物理的に相互作用してヘテロダ
イマー味覚受容体を形成するであろう。それとも、一緒に発現した受容体はそれ
ぞれ同じタイプのリガンドに結合し、そしてそれらは共に結合し特別な味覚感覚
を生じるのであろう。
覚細胞特異的ＧＰＣＲ、またはそれらの組合せと複合して働き、化学感受性味覚
伝達に作用している。例えば、Ｔ２Ｒファミリーメンバーは多分同じ味覚受容体
細胞型に一緒に発現し、一緒に発現した受容体は物理的に相互作用してヘテロダ
イマー味覚受容体を形成するであろう。それとも、一緒に発現した受容体はそれ
ぞれ同じタイプのリガンドに結合し、そしてそれらは共に結合し特別な味覚感覚
を生じるのであろう。
【００３４】
本発明はまた、この新規味覚細胞特異的ＧＰＣＲの調節剤、例えば、活性化剤
、阻害剤、刺激剤、強化剤、アゴニスト、拮抗剤、をスクリーニング方法を提供
する。そのような味覚伝達の調節剤は味覚シグナル伝達経路の薬理学的及び遺伝
的調節に有用である。このスクリーニング方法は味覚細胞活性の高親和性アゴニ
スト及び拮抗剤を同定するために使用することができる。これらの調節化合物は
食品産業及び医薬品産業において味を注文に合わせる、例えば、食品や薬品の苦
味を減らすあるいはマスクするために使用することができる。
、阻害剤、刺激剤、強化剤、アゴニスト、拮抗剤、をスクリーニング方法を提供
する。そのような味覚伝達の調節剤は味覚シグナル伝達経路の薬理学的及び遺伝
的調節に有用である。このスクリーニング方法は味覚細胞活性の高親和性アゴニ
スト及び拮抗剤を同定するために使用することができる。これらの調節化合物は
食品産業及び医薬品産業において味を注文に合わせる、例えば、食品や薬品の苦
味を減らすあるいはマスクするために使用することができる。
【００３５】
このように、本発明は、Ｔ２Ｒファミリーメンバーが直接あるいは間接に味覚
伝達に対する調節剤の影響のレポーター分子として働く、味調節剤のアッセイを
提供する。ＧＰＣＲはインビトロ、インビボ及びエクスビボにおけるアッセイに
、例えば、リガンド結合、イオン濃度、膜電位、電流、イオン流束（ｉｏｎ ｆ
ｌｕｘ）、転写、シグナル伝達、受容体‐リガンド相互作用、セカンドメッセン
ジャー濃度、の変化を測定するために使用することができる。一態様において、
Ｔ２Ｒファミリーメンバーは緑色蛍光タンパク質のような第二レポーター分子を
結合することにより間接的なレポーターとして使用することができる（例えば、
Ｍｉｓｔｉｌｉ ＆ Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，１５：９６１−６４（１９９７）参照）。その他の態様では、Ｔ２Ｒファ
ミリーメンバーは細胞に組換え発現させ、そしてＣａ2+の変化及びｃＡＭＰ、ｃ
ＧＭＰまたはＩＰ３のような細胞内メッセンジャーの変化を測定することにより
ＧＰＣＲ活性を介する味覚伝達の調節をアッセイすることができる。
伝達に対する調節剤の影響のレポーター分子として働く、味調節剤のアッセイを
提供する。ＧＰＣＲはインビトロ、インビボ及びエクスビボにおけるアッセイに
、例えば、リガンド結合、イオン濃度、膜電位、電流、イオン流束（ｉｏｎ ｆ
ｌｕｘ）、転写、シグナル伝達、受容体‐リガンド相互作用、セカンドメッセン
ジャー濃度、の変化を測定するために使用することができる。一態様において、
Ｔ２Ｒファミリーメンバーは緑色蛍光タンパク質のような第二レポーター分子を
結合することにより間接的なレポーターとして使用することができる（例えば、
Ｍｉｓｔｉｌｉ ＆ Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，１５：９６１−６４（１９９７）参照）。その他の態様では、Ｔ２Ｒファ
ミリーメンバーは細胞に組換え発現させ、そしてＣａ2+の変化及びｃＡＭＰ、ｃ
ＧＭＰまたはＩＰ３のような細胞内メッセンジャーの変化を測定することにより
ＧＰＣＲ活性を介する味覚伝達の調節をアッセイすることができる。
【００３６】
望ましい態様において、Ｔ２Ｒポリペプチドは真核細胞中に、形質膜移動また
は成熟及び分泌経路を介するターゲティングを促進する異種配列を有するキメラ
受容体として発現される。望ましい態様において、異種配列はロドプシンのＮ−
端フラグメントのようなロドプシン配列である。そのようなキメラＴ２Ｒ受容体
は、例えばＨＥＫ−２９３細胞のような真核細胞中に発現することができる。そ
の細胞は、細胞内シグナル伝達経路とあるいはホスフォリパーゼＣのようなシグ
ナル伝達タンパク質とキメラ受容体が共役できる機能的Ｇタンパク質、例えば、
Ｇα１５、を含んでいることが望ましい。その細胞におけるそのキメラ受容体の
活性化は、標準的な方法、例えば、細胞中のＦＵＲＡ−２依存性蛍光を検出する
ことにより細胞内カルシウムの変化を検出して、検出することができる。もし宿
主細胞が適当なＧタンパク質を発現しないならば、その全体を引用してここに取
り入れた米国出願番号６０／２４３，７７０に記述されているような相手を選ば
ないＧタンパク質をコードする遺伝子を導入することができる。
は成熟及び分泌経路を介するターゲティングを促進する異種配列を有するキメラ
受容体として発現される。望ましい態様において、異種配列はロドプシンのＮ−
端フラグメントのようなロドプシン配列である。そのようなキメラＴ２Ｒ受容体
は、例えばＨＥＫ−２９３細胞のような真核細胞中に発現することができる。そ
の細胞は、細胞内シグナル伝達経路とあるいはホスフォリパーゼＣのようなシグ
ナル伝達タンパク質とキメラ受容体が共役できる機能的Ｇタンパク質、例えば、
Ｇα１５、を含んでいることが望ましい。その細胞におけるそのキメラ受容体の
活性化は、標準的な方法、例えば、細胞中のＦＵＲＡ−２依存性蛍光を検出する
ことにより細胞内カルシウムの変化を検出して、検出することができる。もし宿
主細胞が適当なＧタンパク質を発現しないならば、その全体を引用してここに取
り入れた米国出願番号６０／２４３，７７０に記述されているような相手を選ば
ないＧタンパク質をコードする遺伝子を導入することができる。
【００３７】
味覚伝達の調節剤のアッセイ方法には、Ｔ２Ｒポリペプチド、その部分、例え
ば細胞外ドメイン、膜貫通領域、またはその組み合わせ、またはＴ２Ｒファミリ
ーメンバーの１以上のドメインを含むキメラタンパク質；卵母細胞、初代細胞ま
たは組織培養細胞Ｔ２Ｒ遺伝子発現、またはＴ２Ｒフラグメントまたはロドプシ
ン融合タンパク質のような融合タンパク質の発現；Ｔ２Ｒファミリーメンバーの
リン酸化及び脱リン酸化；ＧＰＣＲへのＧタンパク質の結合；アレスチン（ａｒ
ｒｅｓｔｉｎ）結合；インターナリゼーション；リガンド結合アッセイ；電圧、
膜電位及び伝導度変化；イオン流束アッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー、
例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰまたはＩＰ３の変化；細胞内Ｃａ2+濃度の変化；及
び神経伝達物質放出、を使用するインビトロリガンド結合アッセイが含まれ得る
。
ば細胞外ドメイン、膜貫通領域、またはその組み合わせ、またはＴ２Ｒファミリ
ーメンバーの１以上のドメインを含むキメラタンパク質；卵母細胞、初代細胞ま
たは組織培養細胞Ｔ２Ｒ遺伝子発現、またはＴ２Ｒフラグメントまたはロドプシ
ン融合タンパク質のような融合タンパク質の発現；Ｔ２Ｒファミリーメンバーの
リン酸化及び脱リン酸化；ＧＰＣＲへのＧタンパク質の結合；アレスチン（ａｒ
ｒｅｓｔｉｎ）結合；インターナリゼーション；リガンド結合アッセイ；電圧、
膜電位及び伝導度変化；イオン流束アッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー、
例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰまたはＩＰ３の変化；細胞内Ｃａ2+濃度の変化；及
び神経伝達物質放出、を使用するインビトロリガンド結合アッセイが含まれ得る
。
【００３８】
さらに本発明は、味覚伝達調節の研究及び味覚受容体細胞の特異的同定をする
ことができるＴ２Ｒ核酸及びタンパク質発現を検出する方法を提供する。Ｔ２Ｒ
ファミリーメンバーは又起源及び法医学の研究のための核酸プローブを提供する
。Ｔ２Ｒ遺伝子はまた味覚受容体細胞、例えば、葉状乳頭、茸状乳頭、輪郭乳頭
、味覚帯及び喉頭蓋味覚受容体細胞、特に、苦味感受性、ガストジューシン発現
細胞を同定する核酸プローブとして有用である。さらにその核酸及びそれがコー
ドするポリペプチドは味覚誘導行動を分析する道具として使用することができる
。
ことができるＴ２Ｒ核酸及びタンパク質発現を検出する方法を提供する。Ｔ２Ｒ
ファミリーメンバーは又起源及び法医学の研究のための核酸プローブを提供する
。Ｔ２Ｒ遺伝子はまた味覚受容体細胞、例えば、葉状乳頭、茸状乳頭、輪郭乳頭
、味覚帯及び喉頭蓋味覚受容体細胞、特に、苦味感受性、ガストジューシン発現
細胞を同定する核酸プローブとして有用である。さらにその核酸及びそれがコー
ドするポリペプチドは味覚誘導行動を分析する道具として使用することができる
。
【００３９】
Ｔ２Ｒポリペプチドは味覚受容体細胞を同定するのに役立つモノクロナール及
びポリクロナール抗体を作製するためにも使用することができる。味覚受容体細
胞はｍＲＮＡの逆転写及び増幅、全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ、ノーザンブロ
ッティング、ドットブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、
ＲＮアーゼ阻害、Ｓ１消化、プローブ化ＤＮＡマイクロチップアレイ、ウエスタ
ンブロッティングなどのような技術を使用して同定することができる。
びポリクロナール抗体を作製するためにも使用することができる。味覚受容体細
胞はｍＲＮＡの逆転写及び増幅、全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ、ノーザンブロ
ッティング、ドットブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、
ＲＮアーゼ阻害、Ｓ１消化、プローブ化ＤＮＡマイクロチップアレイ、ウエスタ
ンブロッティングなどのような技術を使用して同定することができる。
【００４０】
Ｔ２Ｒ遺伝子及びそれがコードするポリペプチドは関連味覚細胞特異的Ｇタン
パク質共役受容体のファミリーを含んでいる。ゲノムの中では、これらの遺伝子
は単独であるいはいくつかの遺伝子集団の一つの中に存在する。ヒトゲノム領域
１２ｐ１３に位置する一つの遺伝子集団は少なくとも２４遺伝子を含んでおり、
７ｑ３３に位置する第二の集団は少なくとも７遺伝子を含んでいる。合計して、
推定偽遺伝子数個を含めて、異なる生物体から６０以上の異なるＴ２Ｒファミリ
ーメンバーが同定されている。ヒトゲノムは、約４０の異なるＴ２Ｒ遺伝子を含
み、約３０の機能的ヒト受容体をコードすると推定されている。
パク質共役受容体のファミリーを含んでいる。ゲノムの中では、これらの遺伝子
は単独であるいはいくつかの遺伝子集団の一つの中に存在する。ヒトゲノム領域
１２ｐ１３に位置する一つの遺伝子集団は少なくとも２４遺伝子を含んでおり、
７ｑ３３に位置する第二の集団は少なくとも７遺伝子を含んでいる。合計して、
推定偽遺伝子数個を含めて、異なる生物体から６０以上の異なるＴ２Ｒファミリ
ーメンバーが同定されている。ヒトゲノムは、約４０の異なるＴ２Ｒ遺伝子を含
み、約３０の機能的ヒト受容体をコードすると推定されている。
【００４１】
Ｔ２Ｒ遺伝子の一部は、苦味の調節に関係すると既にマップされた遺伝子座に
関連していた。例えば、ヒトＴ２Ｒ１はヒトインターバル５ｐ１５、正確には物
質ＰＲＯＰを味わう能力に影響する座がマップされた場所に位置している（Ｒｅ
ｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６４：１４７８−８０
（１９９９）参照）。さらに、ゲノム領域１２ｐ１３に発見されたヒト遺伝子集
団は、多くの苦味遺伝子を含むことが示されているマウス染色体６の領域に相当
し、これは例えば、しょ糖オクタアセテート、ラフィノースウンデカアセテート
、シクロヘキシミド及びキニーネ、を含む味覚感覚または知覚に影響すると考え
られている（例えば、Ｌｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．，６：１
６７−７４（１９９５）参照）。この関連性はＴ２Ｒ遺伝子が種々の物質、特に
苦味物質、の味覚検出に関係していることを示している。さらに、マウスＴ２Ｒ
５は特異的にシクロヘキシミドに対して感受性があり、そしてｍＴ２Ｒ遺伝子に
突然変異があるとシクロヘキシミドの味覚を消失した表現型を生じると考えられ
てきた。同様に、ヒトＴ２Ｒ４及びマウスＴ２Ｒ８は特異的にデナトニウム及び
ＰＲＯＰの両者に応答する。
関連していた。例えば、ヒトＴ２Ｒ１はヒトインターバル５ｐ１５、正確には物
質ＰＲＯＰを味わう能力に影響する座がマップされた場所に位置している（Ｒｅ
ｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６４：１４７８−８０
（１９９９）参照）。さらに、ゲノム領域１２ｐ１３に発見されたヒト遺伝子集
団は、多くの苦味遺伝子を含むことが示されているマウス染色体６の領域に相当
し、これは例えば、しょ糖オクタアセテート、ラフィノースウンデカアセテート
、シクロヘキシミド及びキニーネ、を含む味覚感覚または知覚に影響すると考え
られている（例えば、Ｌｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．，６：１
６７−７４（１９９５）参照）。この関連性はＴ２Ｒ遺伝子が種々の物質、特に
苦味物質、の味覚検出に関係していることを示している。さらに、マウスＴ２Ｒ
５は特異的にシクロヘキシミドに対して感受性があり、そしてｍＴ２Ｒ遺伝子に
突然変異があるとシクロヘキシミドの味覚を消失した表現型を生じると考えられ
てきた。同様に、ヒトＴ２Ｒ４及びマウスＴ２Ｒ８は特異的にデナトニウム及び
ＰＲＯＰの両者に応答する。
【００４２】
機能的には、Ｔ２Ｒ遺伝子は、味覚伝達に関係すると考えられており、そして
Ｇタンパク質と相互作用して味覚シグナル伝達を仲介する関連７回膜貫通Ｇタン
パク質共役受容体のファミリーを含んでいる（例えば、Ｆｏｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｓ
ｉｇｎａｌ，８：２１７（１９９６）；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：１８０（１９９４）参照）。特に、Ｔ２Ｒはリガン
ド特異的様式でＧタンパク質ガストジューシン（ｇｕｓｔｄｕｃｉｎ）と相互作
用すると考えられている。
Ｇタンパク質と相互作用して味覚シグナル伝達を仲介する関連７回膜貫通Ｇタン
パク質共役受容体のファミリーを含んでいる（例えば、Ｆｏｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｓ
ｉｇｎａｌ，８：２１７（１９９６）；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：１８０（１９９４）参照）。特に、Ｔ２Ｒはリガン
ド特異的様式でＧタンパク質ガストジューシン（ｇｕｓｔｄｕｃｉｎ）と相互作
用すると考えられている。
【００４３】
構造的には、Ｔ２Ｒファミリーメンバーのヌクレオチド配列は細胞外ドメイン
、７回膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む関連ポリペプチドのファミリ
ーをコードしている。他の動物種の関連Ｔ２Ｒファミリー遺伝子は典型的に、配
列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２３、またはそ
の保存的修飾変異体の少なくとも約５０ヌクレオチド長、さらに１００、２００
、５００またはそれ以上のヌクレオチド長の領域にわたって約２０−３０％のヌ
クレオチド配列同一性を共有しているであろう；あるいは、配列番号２、４、６
、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２４、またはその保存的修飾変
異体の少なくとも２５アミノ酸長、さらに５０から１００アミノ酸長のアミノ酸
領域にわたって少なくとも約３０−４０％のアミノ酸配列同一性を共有するポリ
ペプチドをコードしている。Ｔ２Ｒ遺伝子は選択的に舌、口蓋上皮、葉状乳頭、
味覚帯及び喉頭蓋の味覚受容体細胞のサブセットに発現している。これに対して
、Ｔ２Ｒは茸状乳頭にはあまり発現しないことが研究で示されている。さらに、
Ｔ２Ｒは選択的にガストジューシン陽性細胞に発現することが示されている。
、７回膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む関連ポリペプチドのファミリ
ーをコードしている。他の動物種の関連Ｔ２Ｒファミリー遺伝子は典型的に、配
列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２３、またはそ
の保存的修飾変異体の少なくとも約５０ヌクレオチド長、さらに１００、２００
、５００またはそれ以上のヌクレオチド長の領域にわたって約２０−３０％のヌ
クレオチド配列同一性を共有しているであろう；あるいは、配列番号２、４、６
、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２４、またはその保存的修飾変
異体の少なくとも２５アミノ酸長、さらに５０から１００アミノ酸長のアミノ酸
領域にわたって少なくとも約３０−４０％のアミノ酸配列同一性を共有するポリ
ペプチドをコードしている。Ｔ２Ｒ遺伝子は選択的に舌、口蓋上皮、葉状乳頭、
味覚帯及び喉頭蓋の味覚受容体細胞のサブセットに発現している。これに対して
、Ｔ２Ｒは茸状乳頭にはあまり発現しないことが研究で示されている。さらに、
Ｔ２Ｒは選択的にガストジューシン陽性細胞に発現することが示されている。
【００４４】
Ｔ２Ｒファミリーメンバーに特徴的ないくつかの共通アミノ酸配列またはドメ
インが同定されている。特に、Ｔ２Ｒファミリーメンバーは典型的に、Ｔ２Ｒ膜
貫通領域Ｉ、Ｔ２Ｒ膜貫通領域ＩＩ、Ｔ２Ｒ膜貫通領域ＩＩＩ、Ｔ２Ｒ膜貫通領
域ＩＶ、Ｔ２Ｒ膜貫通領域Ｖ、Ｔ２Ｒ膜貫通領域ＶＩＩに少なくとも５０％、さ
らに５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５
％、またはそれ以上の同一性を有する配列を含んでいる。これらの保存ドメイン
は、同一性、特異的ハイブリダイゼーションまたは増幅、またはドメインに対し
て生じる抗体の特異的結合によりＴ２Ｒファミリーメンバーを同定するために使
用することができる。そのようなＴ２Ｒ膜貫通領域は以下のアミノ酸配列を有し
ている：
インが同定されている。特に、Ｔ２Ｒファミリーメンバーは典型的に、Ｔ２Ｒ膜
貫通領域Ｉ、Ｔ２Ｒ膜貫通領域ＩＩ、Ｔ２Ｒ膜貫通領域ＩＩＩ、Ｔ２Ｒ膜貫通領
域ＩＶ、Ｔ２Ｒ膜貫通領域Ｖ、Ｔ２Ｒ膜貫通領域ＶＩＩに少なくとも５０％、さ
らに５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５
％、またはそれ以上の同一性を有する配列を含んでいる。これらの保存ドメイン
は、同一性、特異的ハイブリダイゼーションまたは増幅、またはドメインに対し
て生じる抗体の特異的結合によりＴ２Ｒファミリーメンバーを同定するために使
用することができる。そのようなＴ２Ｒ膜貫通領域は以下のアミノ酸配列を有し
ている：
【００４５】
ヒトＴ２Ｒヌクレオチド及びアミノ酸配列の特異な領域はヒトまたは他の動物
種に含まれる多形変異体または対立遺伝子または同族体を同定するために使用す
ることができる。この同定はインビトロで行なうことができる、例えば、ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはＰＣＲ（例えば、上記のＴ２
Ｒ共通配列をコードするプライマーを使用して）、及び配列分析、または他のヌ
クレオチド配列と比較するコンピューターシステムにおける配列情報を使用して
。典型的に、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの多形変異体または対立遺伝子の同定は
約２５アミノ酸以上、例えば５０−１００アミノ酸のアミノ酸配列を比較するこ
とによって行なうことができる。アミノ酸同一性が約３０−４０％、さらに５０
−６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５−９
９％あるいはそれ以上であればタンパク質がＴ２Ｒファミリーメンバーの多形変
異体か対立遺伝子か同族体かオルソログであることを示している。配列同一性は
以下に開示する方法により計算することができる。既に同定されているＴ２Ｒフ
ァミリー共通配列と同一か少なくとも７５％一致する保存配列が少なくとも一つ
追加して存在することに基づけば、そのＴ２Ｒ遺伝子はＴ２Ｒファミリーの中に
入ることを殆ど確実に決定することができる。配列比較は以下に検討する配列比
較アルゴリズムのいずれかを使用して行なうことができる。Ｔ２Ｒポリペプチド
またはその保存領域と特異的に結合する抗体もＴ２Ｒタンパク質の対立遺伝子、
種間同族体、及び多形変異体を同定するために使用することができる。
種に含まれる多形変異体または対立遺伝子または同族体を同定するために使用す
ることができる。この同定はインビトロで行なうことができる、例えば、ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはＰＣＲ（例えば、上記のＴ２
Ｒ共通配列をコードするプライマーを使用して）、及び配列分析、または他のヌ
クレオチド配列と比較するコンピューターシステムにおける配列情報を使用して
。典型的に、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの多形変異体または対立遺伝子の同定は
約２５アミノ酸以上、例えば５０−１００アミノ酸のアミノ酸配列を比較するこ
とによって行なうことができる。アミノ酸同一性が約３０−４０％、さらに５０
−６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５−９
９％あるいはそれ以上であればタンパク質がＴ２Ｒファミリーメンバーの多形変
異体か対立遺伝子か同族体かオルソログであることを示している。配列同一性は
以下に開示する方法により計算することができる。既に同定されているＴ２Ｒフ
ァミリー共通配列と同一か少なくとも７５％一致する保存配列が少なくとも一つ
追加して存在することに基づけば、そのＴ２Ｒ遺伝子はＴ２Ｒファミリーの中に
入ることを殆ど確実に決定することができる。配列比較は以下に検討する配列比
較アルゴリズムのいずれかを使用して行なうことができる。Ｔ２Ｒポリペプチド
またはその保存領域と特異的に結合する抗体もＴ２Ｒタンパク質の対立遺伝子、
種間同族体、及び多形変異体を同定するために使用することができる。
【００４６】
多形変異体または対立遺伝子、及び関連Ｔ２Ｒ同族体またはオルソログ（ｏｒ
ｔｈｏｌｏｇ）は推定Ｔ２Ｒポリペプチドの味覚細胞特異的発現を調べることに
より確認することができる。典型的に、ここに開示したアミノ酸配列を持つＴ２
Ｒポリペプチドは、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの対立遺伝子または同族体の確証
を示すために、推定Ｔ２Ｒタンパク質と比較する際の陽性対照として使用するこ
とができる。その同族体または対立遺伝子はＧタンパク質共役受容体の７回膜貫
通構造を同様に持っているであろう。
ｔｈｏｌｏｇ）は推定Ｔ２Ｒポリペプチドの味覚細胞特異的発現を調べることに
より確認することができる。典型的に、ここに開示したアミノ酸配列を持つＴ２
Ｒポリペプチドは、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの対立遺伝子または同族体の確証
を示すために、推定Ｔ２Ｒタンパク質と比較する際の陽性対照として使用するこ
とができる。その同族体または対立遺伝子はＧタンパク質共役受容体の７回膜貫
通構造を同様に持っているであろう。
【００４７】
Ｔ２Ｒファミリーメンバーに関するヌクレオチド及びアミノ酸配列情報もまた
、コンピューターシステムにおいて味覚細胞特異的ポリペプチドのモデルを構築
するために使用することができる。これらのモデルは次いでＴ２Ｒ受容体タンパ
ク質を活性化または阻害する化合物を同定するために使用される。Ｔ２Ｒファミ
リーメンバーの活性を調節する化合物は味覚伝達におけるＴ２Ｒ遺伝子及びポリ
ペプチドの役割を解明するために使用することができる。
、コンピューターシステムにおいて味覚細胞特異的ポリペプチドのモデルを構築
するために使用することができる。これらのモデルは次いでＴ２Ｒ受容体タンパ
ク質を活性化または阻害する化合物を同定するために使用される。Ｔ２Ｒファミ
リーメンバーの活性を調節する化合物は味覚伝達におけるＴ２Ｒ遺伝子及びポリ
ペプチドの役割を解明するために使用することができる。
【００４８】
Ｔ２Ｒファミリーメンバーの単離により味覚伝達の阻害剤及び活性化剤をアッ
セイする手段が提供される。生物学的に活性なＴ２Ｒタンパク質は、下記を測定
するインビボ（動物を使用するアッセイ）及びインビトロアッセイを使用する、
味覚伝達物質、特に苦味伝達物質としてのＴ２Ｒの阻害剤及び活性化剤の試験に
有用である：例えば、リガンド結合；リン酸化及び脱リン酸化；Ｇタンパク質へ
の結合；Ｇタンパク質活性化；調節分子結合；電圧、膜電位及び伝導度変化；イ
オン流束；ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３のような細胞内セカンドメッセンジャー
；及び細胞内カルシウム濃度。Ｔ２Ｒファミリーメンバーを使用して同定したそ
の活性化剤及び阻害剤はさらに味覚伝達を研究するために、また特異的味覚アゴ
ニスト及び拮抗剤を同定するために使用することができる。その活性化剤及び阻
害剤は医薬品及び食品として味を注文に合わせる、例えば食品や医薬品の苦味を
減ずるために有用である。
セイする手段が提供される。生物学的に活性なＴ２Ｒタンパク質は、下記を測定
するインビボ（動物を使用するアッセイ）及びインビトロアッセイを使用する、
味覚伝達物質、特に苦味伝達物質としてのＴ２Ｒの阻害剤及び活性化剤の試験に
有用である：例えば、リガンド結合；リン酸化及び脱リン酸化；Ｇタンパク質へ
の結合；Ｇタンパク質活性化；調節分子結合；電圧、膜電位及び伝導度変化；イ
オン流束；ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３のような細胞内セカンドメッセンジャー
；及び細胞内カルシウム濃度。Ｔ２Ｒファミリーメンバーを使用して同定したそ
の活性化剤及び阻害剤はさらに味覚伝達を研究するために、また特異的味覚アゴ
ニスト及び拮抗剤を同定するために使用することができる。その活性化剤及び阻
害剤は医薬品及び食品として味を注文に合わせる、例えば食品や医薬品の苦味を
減ずるために有用である。
【００４９】
本発明はまたＴ２Ｒポリペプチドと相互作用する及び／または調節する分子を
同定するためのアッセイ、望ましくは高処理量（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ）アッセイを提供する。多数のアッセイにおいて、Ｔ２Ｒファミリーメンバー
の特別な部分、例えば、細胞外、膜貫通、または細胞内または領域、が使用され
るであろう。多数の態様において、細胞外ドメイン、膜貫通領域、またはそれら
の組み合わせが固相基質に結合され、そして、例えばリガンド、アゴニスト、逆
（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニスト、拮抗剤、またはＴ２Ｒポリペプチドの細胞外ま
たは膜貫通領域に結合し及び／または活性を調節するその他の分子を単離するた
めに使用される。
同定するためのアッセイ、望ましくは高処理量（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ）アッセイを提供する。多数のアッセイにおいて、Ｔ２Ｒファミリーメンバー
の特別な部分、例えば、細胞外、膜貫通、または細胞内または領域、が使用され
るであろう。多数の態様において、細胞外ドメイン、膜貫通領域、またはそれら
の組み合わせが固相基質に結合され、そして、例えばリガンド、アゴニスト、逆
（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニスト、拮抗剤、またはＴ２Ｒポリペプチドの細胞外ま
たは膜貫通領域に結合し及び／または活性を調節するその他の分子を単離するた
めに使用される。
【００５０】
ある態様において、Ｔ２Ｒポリペプチドの領域、例えば、細胞外、膜貫通、ま
たは細胞内領域、は異種ポリペプチドと融合し、キメラポリペプチド、例えば、
ＧＰＣＲ活性を有するキメラポリペプチドを形成する。そのキメラポリペプチド
は、例えば、リガンド、アゴニスト、逆アゴニスト、拮抗剤、またはその他のＴ
２Ｒポリペプチド調節剤を同定するためのアッセイに有用である。さらに、その
ようなキメラポリペプチドは新規リガンド結合特異性、制御様式、シグナル伝達
経路、またはその他の性質を持つ新規味覚受容体を創るために、あるいはリガン
ド結合特異性、制御様式、シグナル伝達経路などの新規な組合せの新規味覚受容
体を創るために有用である。またＴ２Ｒ核酸及びＴ２Ｒポリペプチドの発現は、
舌の味覚受容体細胞と脳内の味覚感覚ニューロンの関連を研究するために使用す
ることができる舌の解剖学的地図を創るためにも使用することができる。特に、
Ｔ２Ｒを検出する方法は苦味物質に敏感な味覚細胞を同定するために使用するこ
とができる可能性がある。ヒトＴ２Ｒ遺伝子をコードする遺伝子の染色体局在は
、病気、突然変異、及びＴ２Ｒファミリーメンバーによるかそれに関連する特性
を同定するために使用することができる可能性がある。
たは細胞内領域、は異種ポリペプチドと融合し、キメラポリペプチド、例えば、
ＧＰＣＲ活性を有するキメラポリペプチドを形成する。そのキメラポリペプチド
は、例えば、リガンド、アゴニスト、逆アゴニスト、拮抗剤、またはその他のＴ
２Ｒポリペプチド調節剤を同定するためのアッセイに有用である。さらに、その
ようなキメラポリペプチドは新規リガンド結合特異性、制御様式、シグナル伝達
経路、またはその他の性質を持つ新規味覚受容体を創るために、あるいはリガン
ド結合特異性、制御様式、シグナル伝達経路などの新規な組合せの新規味覚受容
体を創るために有用である。またＴ２Ｒ核酸及びＴ２Ｒポリペプチドの発現は、
舌の味覚受容体細胞と脳内の味覚感覚ニューロンの関連を研究するために使用す
ることができる舌の解剖学的地図を創るためにも使用することができる。特に、
Ｔ２Ｒを検出する方法は苦味物質に敏感な味覚細胞を同定するために使用するこ
とができる可能性がある。ヒトＴ２Ｒ遺伝子をコードする遺伝子の染色体局在は
、病気、突然変異、及びＴ２Ｒファミリーメンバーによるかそれに関連する特性
を同定するために使用することができる可能性がある。
【００５１】
一般的に、本発明はＴ２Ｒ遺伝子ファミリーの単離核酸分子及びそれがコード
する味覚受容体を提供する。本発明はまた特定のアミノ酸配列を持つ核酸及びポ
リペプチド配列のみならず、フラグメント、特に例えば、４０、６０、８０、１
００、１５０、２００または２５０ヌクレオチドかそれ以上のフラグメント、並
びに、例えば、１０、２０、３０、５０、７０、１００、または１５０アミノ酸
かそれ以上のタンパク質フラグメントも含んでいる。
する味覚受容体を提供する。本発明はまた特定のアミノ酸配列を持つ核酸及びポ
リペプチド配列のみならず、フラグメント、特に例えば、４０、６０、８０、１
００、１５０、２００または２５０ヌクレオチドかそれ以上のフラグメント、並
びに、例えば、１０、２０、３０、５０、７０、１００、または１５０アミノ酸
かそれ以上のタンパク質フラグメントも含んでいる。
【００５２】
種々の保存的突然変異及び置換は本発明の範囲内にあると考えられる。例えば
、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの位置特定変異、宿主細胞の遺伝子導
入、及びインビトロ転写を含む、組換え遺伝子技術の既知プロトコールを使用し
てアミノ酸置換を行なうことは当業者の能力の範囲内であろう。変異体は次いで
機能的活性をスクリーニングすることができる。
、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの位置特定変異、宿主細胞の遺伝子導
入、及びインビトロ転写を含む、組換え遺伝子技術の既知プロトコールを使用し
てアミノ酸置換を行なうことは当業者の能力の範囲内であろう。変異体は次いで
機能的活性をスクリーニングすることができる。
【００５３】
特に、ここに開示した核酸配列の特異的領域、及びそれがコードするポリペプ
チドは多形変異体、種間同族体及び配列の対立遺伝子を同定するために使用する
ことができる。この同定は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下に、ＰＣＲ、及び配列分析または他の核酸配列と比較するためのコンピ
ューターシステムにおける配列情報を使用して、インビトロで行なうことができ
る。一動物種の集団内のＴ２Ｒ遺伝子の異なる対立遺伝子は、対立遺伝子配列の
相違が集団内個体の間の味覚感覚の相違と関連するか否かを調べるのに有用であ
ろう。
チドは多形変異体、種間同族体及び配列の対立遺伝子を同定するために使用する
ことができる。この同定は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下に、ＰＣＲ、及び配列分析または他の核酸配列と比較するためのコンピ
ューターシステムにおける配列情報を使用して、インビトロで行なうことができ
る。一動物種の集団内のＴ２Ｒ遺伝子の異なる対立遺伝子は、対立遺伝子配列の
相違が集団内個体の間の味覚感覚の相違と関連するか否かを調べるのに有用であ
ろう。
【００５４】
本発明の核酸分子は一般的にイントロンがなく、一般的に約３００残基の長さ
を有する推定Ｔ２Ｒをコードし、疎水性プロッティング分析により予測されたよ
うに、Ｇタンパク質共役受容体（７ＴＭ）スーパーファミリーに属することを示
す７個の膜貫通領域からなる。全体的構造類似性に加えて、ここに同定されたＴ
２ＲのそれぞれはＴ２Ｒファミリーメンバーの特徴的配列記号を有している。特
に、全ての配列が、上記に示したＴ２Ｒファミリー共通配列に極めてよく合致し
ている。同定した遺伝子及びコードタンパク質の上記構造的特徴の全てを組合せ
ると、それらはＴ２Ｒ受容体ファミリーの新規構成員であることを強く示してい
る。
を有する推定Ｔ２Ｒをコードし、疎水性プロッティング分析により予測されたよ
うに、Ｇタンパク質共役受容体（７ＴＭ）スーパーファミリーに属することを示
す７個の膜貫通領域からなる。全体的構造類似性に加えて、ここに同定されたＴ
２ＲのそれぞれはＴ２Ｒファミリーメンバーの特徴的配列記号を有している。特
に、全ての配列が、上記に示したＴ２Ｒファミリー共通配列に極めてよく合致し
ている。同定した遺伝子及びコードタンパク質の上記構造的特徴の全てを組合せ
ると、それらはＴ２Ｒ受容体ファミリーの新規構成員であることを強く示してい
る。
【００５５】
Ｔ２Ｒ受容体及びその遺伝子は、単独でまたは他のタイプの味覚受容体と組み
合わせて、これらの受容体によって特異的に認識される異なるタイプの分子を化
学的に同定する検出システム及びアッセイを開発するのに、並びに診断及び研究
目的に使用することができる。
合わせて、これらの受容体によって特異的に認識される異なるタイプの分子を化
学的に同定する検出システム及びアッセイを開発するのに、並びに診断及び研究
目的に使用することができる。
【００５６】
本発明の核酸配列及び本発明を実施するために使用されるその他の核酸は、Ｒ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッ
ドのいずれであっても、種々の資源、遺伝的操作、増幅及び／または組換え発現
により単離することができる。哺乳動物細胞に加えて、例えば、細菌、イースト
、昆虫または植物システムのどの組換え発現システムも使用できる。
ＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッ
ドのいずれであっても、種々の資源、遺伝的操作、増幅及び／または組換え発現
により単離することができる。哺乳動物細胞に加えて、例えば、細菌、イースト
、昆虫または植物システムのどの組換え発現システムも使用できる。
【００５７】
Ａ．Ｔ２Ｒの同定
本発明のＴ２Ｒタンパク質及びポリペプチドのアミノ酸配列はコード核酸配列
の理論的翻訳により同定することができる。これらの種々のアミノ酸配列及びコ
ード核酸配列は多くの方法によって他の配列と互いに比較することができる。特
別な態様において、ここに開示された偽遺伝子は当業者に既知のゲノムデータベ
ース中の機能的対立遺伝子または関連遺伝子を同定するために使用することがで
きる。
の理論的翻訳により同定することができる。これらの種々のアミノ酸配列及びコ
ード核酸配列は多くの方法によって他の配列と互いに比較することができる。特
別な態様において、ここに開示された偽遺伝子は当業者に既知のゲノムデータベ
ース中の機能的対立遺伝子または関連遺伝子を同定するために使用することがで
きる。
【００５８】
例えば、配列比較において、典型的にある配列は試験配列が比較される対照配
列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験及び対照配列をコ
ンピュータに入力し、必要があれば部分配列座標を入力し、そして配列アルゴリ
ズムプログラムパラメータを指定する。以下にＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰに
ついて記述するように、デフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）プログラムパラメータを
使用することができるし、あるいは別のパラメータを指定することもできる。次
いでこの配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、対照配列
に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験及び対照配列をコ
ンピュータに入力し、必要があれば部分配列座標を入力し、そして配列アルゴリ
ズムプログラムパラメータを指定する。以下にＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰに
ついて記述するように、デフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）プログラムパラメータを
使用することができるし、あるいは別のパラメータを指定することもできる。次
いでこの配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、対照配列
に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００５９】
ここに使用された「比較枠（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」は、２
０から６００、通常は約５０から約２００、もっと普通には約１００から約１５
０からなる群から選択した隣接位置数の区分の事であり、この中で二つの配列を
最適に整列した後に同数の隣接位置の対照配列とある配列を比較する。比較のた
めの配列整列方法は当業者にはよく知られている。比較のための配列の最適整列
は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ
．，２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅ
ｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０
）の相同性整列（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）アルゴリズムによっ
て、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ，８５：２４４４（１９８８
）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施法により（
ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、または人手で整列し目で見て調べる方法によ
り（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐ
ｐｌｅｍｅｎｔ）参照）行なうことができる。
０から６００、通常は約５０から約２００、もっと普通には約１００から約１５
０からなる群から選択した隣接位置数の区分の事であり、この中で二つの配列を
最適に整列した後に同数の隣接位置の対照配列とある配列を比較する。比較のた
めの配列整列方法は当業者にはよく知られている。比較のための配列の最適整列
は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ
．，２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅ
ｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０
）の相同性整列（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）アルゴリズムによっ
て、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ，８５：２４４４（１９８８
）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施法により（
ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、または人手で整列し目で見て調べる方法によ
り（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐ
ｐｌｅｍｅｎｔ）参照）行なうことができる。
【００６０】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決めるのに適したアルゴリズムの望ま
しい例はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それぞれＡｌ
ｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９
−４０２（１９７７）及び Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，２１５：４０３−１０（１９９０）に記述されている。ＢＬＡＳＴ分
析を実行するソフトウエアはｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて入手できる。このアルゴリ
ズムは問題配列の長さＷの短い記号列を同定することにより、データベース配列
と同じ長さの記号列で整列した時に一致するかあるいはある閾値得点（ｐｏｓｉ
ｔｉｖｅ ｖａｌｕｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）Ｔを満足する、高
得点配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ，ＨＳ
Ｐ）を最初に同定することを含んでいる。Ｔは近隣記号列得点閾値（ｎｅｉｇｈ
ｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８
９−４０２（１９７７）及び Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））。これらの最初の近隣記号列の
一致は長いＨＳＰ発見のための探索を開始する核となる。記号列一致は、累積整
列得点が増加する限り各配列に沿って両方向に拡張する。累積得点は、ヌクレオ
チド配列に対しては、パラメータＭ（一致残基対に対する報奨得点（ｒｅｗａｒ
ｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）及びＮ（不一致残基に対する罰得点（ｐｅｎａｌ
ｔｙ ｓｃｏｒｅ）；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については
、得点マトリックスが累積得点を計算するために使用される。それぞれの方向に
ついて記号列一致の延長は以下の時に中止する：累積整列得点が最高値から一定
値Ｘ低下した時；１以上の減点残基整列が蓄積したために、累積得点が零かそれ
以下になった時；あるいはどちらかの配列の末端に達した時。ＢＬＡＳＴアルゴ
リズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮ
プログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとして記号列長（Ｗ）１１、期
待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に
対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして記号列長３、及び期待値
（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆
Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰＮＡＳ，８９：１０９１５（１９８９）参照）整列（Ｂ）
５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較、を使用する。
しい例はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それぞれＡｌ
ｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９
−４０２（１９７７）及び Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，２１５：４０３−１０（１９９０）に記述されている。ＢＬＡＳＴ分
析を実行するソフトウエアはｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて入手できる。このアルゴリ
ズムは問題配列の長さＷの短い記号列を同定することにより、データベース配列
と同じ長さの記号列で整列した時に一致するかあるいはある閾値得点（ｐｏｓｉ
ｔｉｖｅ ｖａｌｕｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）Ｔを満足する、高
得点配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ，ＨＳ
Ｐ）を最初に同定することを含んでいる。Ｔは近隣記号列得点閾値（ｎｅｉｇｈ
ｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８
９−４０２（１９７７）及び Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））。これらの最初の近隣記号列の
一致は長いＨＳＰ発見のための探索を開始する核となる。記号列一致は、累積整
列得点が増加する限り各配列に沿って両方向に拡張する。累積得点は、ヌクレオ
チド配列に対しては、パラメータＭ（一致残基対に対する報奨得点（ｒｅｗａｒ
ｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）及びＮ（不一致残基に対する罰得点（ｐｅｎａｌ
ｔｙ ｓｃｏｒｅ）；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については
、得点マトリックスが累積得点を計算するために使用される。それぞれの方向に
ついて記号列一致の延長は以下の時に中止する：累積整列得点が最高値から一定
値Ｘ低下した時；１以上の減点残基整列が蓄積したために、累積得点が零かそれ
以下になった時；あるいはどちらかの配列の末端に達した時。ＢＬＡＳＴアルゴ
リズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮ
プログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとして記号列長（Ｗ）１１、期
待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に
対しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして記号列長３、及び期待値
（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆
Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰＮＡＳ，８９：１０９１５（１９８９）参照）整列（Ｂ）
５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較、を使用する。
【００６１】
有用なアルゴリズムのもう一つの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは関
連配列の群から連続的に、対毎の整列を使用して複数配列の整列を創り、関連性
及びパーセント配列同一性を呈示する。それはまた整列を創るために使用された
群関連性を示すいわゆる「木（ｔｒｅｅ）」または「樹状図（ｄｅｎｄｏｇｒａ
ｍ）」を描く（例えば、図２参照）。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉ
ｔｔｌｅ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３５：３５１−６０（１９８７）の連続的
整列法の簡便法を使用する。使用されるこの方法はＨｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａ
ｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−５３（１９８９）により記述されている方法
に類似している。このプログラムはそれぞれの最大長５，０００ヌクレオチドま
たはアミノ酸の３００配列まで整列することができる。多重整列（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）方法は二つの最も類似した配列の対毎の整列で始ま
り、二つの整列配列の群を形成する。この群は次いでその次にもっとも類似する
配列に整列し、あるいは整列した配列の群に連合する。配列の二つの群は二つの
個別の配列の対毎の整列の単純な拡張により連合する。最終的な整列は一連の連
続的、対毎の整列ににより達成される。プログラムは特定の配列及び配列比較の
領域のそのアミノ酸またはヌクレオチド座標の指定及びプログラムパラメータの
指定により稼動する。ＰＩＬＥＵＰを使用して、対照配列を他の試験配列と比較
してパーセント配列同一性関係を決めるには次のパラメータを使用する：デフォ
ルトギャップ重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デ
フォルトギャップ長重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈ
ｔ）（０．１０）、及び荷重端ギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄｇａｐ）。
ＰＩＬＥＵＰはＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージ、例えば、バージョン７
．０ Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
２：３８７−９５（１９８４）から入手できる。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使
用して公開配列データベース中の全ての既知タンパク質とこれらのタンパク質配
列を比較したところＴ２Ｒファミリーの構成員と強い相同性が明らかとなった、
Ｔ２Ｒファミリー配列のそれぞれは、ファミリーメンバーの少なくとも一つに対
して、少なくとも５０％、及び望ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％
、少なくとも６５％、最も望ましくは少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有し
ている。
連配列の群から連続的に、対毎の整列を使用して複数配列の整列を創り、関連性
及びパーセント配列同一性を呈示する。それはまた整列を創るために使用された
群関連性を示すいわゆる「木（ｔｒｅｅ）」または「樹状図（ｄｅｎｄｏｇｒａ
ｍ）」を描く（例えば、図２参照）。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉ
ｔｔｌｅ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３５：３５１−６０（１９８７）の連続的
整列法の簡便法を使用する。使用されるこの方法はＨｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａ
ｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−５３（１９８９）により記述されている方法
に類似している。このプログラムはそれぞれの最大長５，０００ヌクレオチドま
たはアミノ酸の３００配列まで整列することができる。多重整列（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）方法は二つの最も類似した配列の対毎の整列で始ま
り、二つの整列配列の群を形成する。この群は次いでその次にもっとも類似する
配列に整列し、あるいは整列した配列の群に連合する。配列の二つの群は二つの
個別の配列の対毎の整列の単純な拡張により連合する。最終的な整列は一連の連
続的、対毎の整列ににより達成される。プログラムは特定の配列及び配列比較の
領域のそのアミノ酸またはヌクレオチド座標の指定及びプログラムパラメータの
指定により稼動する。ＰＩＬＥＵＰを使用して、対照配列を他の試験配列と比較
してパーセント配列同一性関係を決めるには次のパラメータを使用する：デフォ
ルトギャップ重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デ
フォルトギャップ長重量（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈ
ｔ）（０．１０）、及び荷重端ギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄｇａｐ）。
ＰＩＬＥＵＰはＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージ、例えば、バージョン７
．０ Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
２：３８７−９５（１９８４）から入手できる。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使
用して公開配列データベース中の全ての既知タンパク質とこれらのタンパク質配
列を比較したところＴ２Ｒファミリーの構成員と強い相同性が明らかとなった、
Ｔ２Ｒファミリー配列のそれぞれは、ファミリーメンバーの少なくとも一つに対
して、少なくとも５０％、及び望ましくは少なくとも５５％、少なくとも６０％
、少なくとも６５％、最も望ましくは少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有し
ている。
【００６２】
Ｂ．定義
ここに使用されているように、以下の用語は特記しない限りその元来の意味を
有す。
有す。
【００６３】
「味覚細胞」は舌の味蕾を形成する群に組織される神経上皮細胞、例えば、葉
状、茸状及び輪郭細胞を含む（参照、例えば、Ｒｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：３２９−３５３（１９８９））。味覚
細胞は口蓋及び食道及び胃のような他の組織にも認められる。
状、茸状及び輪郭細胞を含む（参照、例えば、Ｒｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：３２９−３５３（１９８９））。味覚
細胞は口蓋及び食道及び胃のような他の組織にも認められる。
【００６４】
「Ｔ２Ｒ」はＧタンパク質共役受容体ファミリーの１以上の構成員のことであ
り、選択的に舌及び口蓋上皮の味覚細胞、例えば、葉状、味覚帯、喉頭蓋、茸状
、及び輪郭細胞、並びに食道及び胃の細胞、に発現する（例えば、Ａｄｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１００：６９３−７０２（２０００）参照）。このフ
ァミリーはまた「ＳＦファミリー」とも呼ばれる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／
２４８２１参照、この全体を引用してここに取り入れた）。その味覚細胞は、ガ
ストジューシン、味覚細胞特異的Ｇタンパク質、またはその他の味覚特異的分子
のような特異的分子を発現するので、同定することができる（ＭｃＬａｕｇｈｉ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：５６３−６９（１９９２））。味覚
受容体細胞は形態に基づいて同定することもできる（例えば、Ｒｏｐｅｒ，前記
、参照）。Ｔ２Ｒファミリーメンバーは味覚伝達のための受容体として働く。Ｔ
２Ｒファミリーメンバーは、味覚受容体の「ＧＲ」ファミリー、あるいは「ＳＦ
」ファミリーとも呼ばれる。
り、選択的に舌及び口蓋上皮の味覚細胞、例えば、葉状、味覚帯、喉頭蓋、茸状
、及び輪郭細胞、並びに食道及び胃の細胞、に発現する（例えば、Ａｄｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１００：６９３−７０２（２０００）参照）。このフ
ァミリーはまた「ＳＦファミリー」とも呼ばれる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／
２４８２１参照、この全体を引用してここに取り入れた）。その味覚細胞は、ガ
ストジューシン、味覚細胞特異的Ｇタンパク質、またはその他の味覚特異的分子
のような特異的分子を発現するので、同定することができる（ＭｃＬａｕｇｈｉ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：５６３−６９（１９９２））。味覚
受容体細胞は形態に基づいて同定することもできる（例えば、Ｒｏｐｅｒ，前記
、参照）。Ｔ２Ｒファミリーメンバーは味覚伝達のための受容体として働く。Ｔ
２Ｒファミリーメンバーは、味覚受容体の「ＧＲ」ファミリー、あるいは「ＳＦ
」ファミリーとも呼ばれる。
【００６５】
「Ｔ２Ｒ」核酸は、「Ｇタンパク質共役受容体活性」を持つ７個の膜貫通領域
を持つＧＰＣＲファミリーをコードしている、例えば、それは細胞外刺激に応答
してＧタンパク質に結合し、そしてホスフォリパーゼＣ及びアデニル酸シクラー
ゼのような酵素の活性化を介してＩＰ３、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、及びＣａ2+のよ
うなセカンドメッセンジャー生産を促進する（ＧＰＣＲの構造及び機能の記述に
ついては、例えば、Ｆｏｎｇ，前記、Ｂａｌｄｗｉｎ，前記、参照）。これらの
核酸は、味覚細胞、特に苦味物質に応答するガストジューシン発現味覚細胞に発
現するタンパク質をコードしている。一つの味覚細胞は多数の異なるＴ２Ｒポリ
ペプチドを含んでいるであろう。
を持つＧＰＣＲファミリーをコードしている、例えば、それは細胞外刺激に応答
してＧタンパク質に結合し、そしてホスフォリパーゼＣ及びアデニル酸シクラー
ゼのような酵素の活性化を介してＩＰ３、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、及びＣａ2+のよ
うなセカンドメッセンジャー生産を促進する（ＧＰＣＲの構造及び機能の記述に
ついては、例えば、Ｆｏｎｇ，前記、Ｂａｌｄｗｉｎ，前記、参照）。これらの
核酸は、味覚細胞、特に苦味物質に応答するガストジューシン発現味覚細胞に発
現するタンパク質をコードしている。一つの味覚細胞は多数の異なるＴ２Ｒポリ
ペプチドを含んでいるであろう。
【００６６】
したがって用語「Ｔ２Ｒ」ファミリーは下記の多形変異体、対立遺伝子、突然
変異、及び同族体を含む：（１）約２５アミノ酸、さらに５０−１００アミノ酸
の枠上で、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び
２４と約３０−４０％のアミノ酸配列同一性、特に約４０、５０、６０、７０、
７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％のアミノ酸配列
同一性を持つ；（２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４、及びその保存的修飾変異体からなる群から選択されたアミノ酸
配列を含む免疫原に対して生じた抗体に特異的に結合する；（３）配列番号１、
３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２３、及びその保存的修飾
変異体からなる群から選択された配列とストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下で特異的にハイブリダイズする（少なくとも約１００、さらに少なく
とも約５００−１０００ヌクレオチドの大きさで）；（４）配列番号２、４、６
、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２４からなる群から選択された
アミノ酸配列と少なくとも約４０％同一な配列を含む；または（５）配列番号２
５−３０をコードする縮重プライマーセットと同一な配列とストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーにより
増幅される。
変異、及び同族体を含む：（１）約２５アミノ酸、さらに５０−１００アミノ酸
の枠上で、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び
２４と約３０−４０％のアミノ酸配列同一性、特に約４０、５０、６０、７０、
７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％のアミノ酸配列
同一性を持つ；（２）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４、及びその保存的修飾変異体からなる群から選択されたアミノ酸
配列を含む免疫原に対して生じた抗体に特異的に結合する；（３）配列番号１、
３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２３、及びその保存的修飾
変異体からなる群から選択された配列とストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下で特異的にハイブリダイズする（少なくとも約１００、さらに少なく
とも約５００−１０００ヌクレオチドの大きさで）；（４）配列番号２、４、６
、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２４からなる群から選択された
アミノ酸配列と少なくとも約４０％同一な配列を含む；または（５）配列番号２
５−３０をコードする縮重プライマーセットと同一な配列とストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーにより
増幅される。
【００６７】
既に検討したように、Ｔ２Ｒ遺伝子はタンパク質及びＤＮＡ両レベルにおいて
かなりの配列相違を示すが、今日単離されたものはすべてある共通配列を含むこ
とが認められている、特に既に同定されたＴ２Ｒ共通配列（配列番号２５−３０
）と一致するかまたは少なくとも７０−７５％の配列同一性を持つ領域を含んで
いる。
かなりの配列相違を示すが、今日単離されたものはすべてある共通配列を含むこ
とが認められている、特に既に同定されたＴ２Ｒ共通配列（配列番号２５−３０
）と一致するかまたは少なくとも７０−７５％の配列同一性を持つ領域を含んで
いる。
【００６８】
位相幾何学的には、ある化学感受性ＧＰＣＲは「Ｎ−末端ドメイン」、「細胞
外ドメイン」、７個の膜貫通領域、及び対応する細胞質及び細胞外ループを含む
「膜貫通ドメイン」、「細胞質領域」及び「Ｃ−末端領域」を持っている（例え
ば、Ｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：５４１−５１（１９９９）；Ｂ
ｕｃｋ ＆ Ａｘｅｌ，Ｃｅｌｌ，６５：１７５−８７（１９９１）参照）。こ
れらの領域は構造的に当業者には既知の方法、例えば、疎水性及び親水性ドメイ
ンを同定する配列分析プログラムを使用して同定することができる（例えば、Ｓ
ｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（３ｒｄ ｅｄ．１９８８）；また、ｄ
ｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕに見られるような多数のインターネ
ット上の配列分析プログラムのいずれかを参照）。これらの領域はキメラタンパ
ク質を作製するために、また本発明のインビトロアッセイ、例えば、リガンド結
合アッセイに有用である。
外ドメイン」、７個の膜貫通領域、及び対応する細胞質及び細胞外ループを含む
「膜貫通ドメイン」、「細胞質領域」及び「Ｃ−末端領域」を持っている（例え
ば、Ｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：５４１−５１（１９９９）；Ｂ
ｕｃｋ ＆ Ａｘｅｌ，Ｃｅｌｌ，６５：１７５−８７（１９９１）参照）。こ
れらの領域は構造的に当業者には既知の方法、例えば、疎水性及び親水性ドメイ
ンを同定する配列分析プログラムを使用して同定することができる（例えば、Ｓ
ｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（３ｒｄ ｅｄ．１９８８）；また、ｄ
ｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕに見られるような多数のインターネ
ット上の配列分析プログラムのいずれかを参照）。これらの領域はキメラタンパ
ク質を作製するために、また本発明のインビトロアッセイ、例えば、リガンド結
合アッセイに有用である。
【００６９】
「細胞外ドメイン」はしたがって、細胞の膜から突き出でそして細胞の細胞外
表面に露出しているＴ２Ｒポリペプチドのドメインのことである。その領域は、
細胞の細胞外表面に露出した「Ｎ−末端ドメイン」、並びに細胞の細胞外表面に
露出した膜貫通ドメインの細胞外ループ、すなわち、膜貫通領域２と３の間、膜
貫通領域４と５の間、膜貫通領域６と７の間、を含む。「Ｎ−末端ドメイン」は
Ｎ−末端に始まり、そして膜貫通領域の始点に接する領域へ至る。これらの細胞
外領域はインビトロリガンド結合アッセイに、液相及び固相のいずれにおいても
有用である。さらに、膜貫通領域は下記のように、他の細胞外領域と共にあるい
は単独で、リガンド結合に関係することができ、したがってリガンド結合アッセ
イに有用である。
表面に露出しているＴ２Ｒポリペプチドのドメインのことである。その領域は、
細胞の細胞外表面に露出した「Ｎ−末端ドメイン」、並びに細胞の細胞外表面に
露出した膜貫通ドメインの細胞外ループ、すなわち、膜貫通領域２と３の間、膜
貫通領域４と５の間、膜貫通領域６と７の間、を含む。「Ｎ−末端ドメイン」は
Ｎ−末端に始まり、そして膜貫通領域の始点に接する領域へ至る。これらの細胞
外領域はインビトロリガンド結合アッセイに、液相及び固相のいずれにおいても
有用である。さらに、膜貫通領域は下記のように、他の細胞外領域と共にあるい
は単独で、リガンド結合に関係することができ、したがってリガンド結合アッセ
イに有用である。
【００７０】
７個の膜貫通「領域」を含む「膜貫通ドメイン」は、形質膜の中に存在し、ま
た対応する細胞質（細胞内）及び細胞外ループを含むＴ２Ｒポリペプチドのドメ
インのことであり、膜貫通「領域」とも呼ばれる。７個の膜貫通領域及び細胞外
及び細胞質ループは、Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１５７：１０５−３２（１９８２）、またはＳｔｒｙｅｒ（前記）に記述
されているように、標準的方法を使用して同定することができる。
た対応する細胞質（細胞内）及び細胞外ループを含むＴ２Ｒポリペプチドのドメ
インのことであり、膜貫通「領域」とも呼ばれる。７個の膜貫通領域及び細胞外
及び細胞質ループは、Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１５７：１０５−３２（１９８２）、またはＳｔｒｙｅｒ（前記）に記述
されているように、標準的方法を使用して同定することができる。
【００７１】
「細胞質ドメイン」は細胞の内側に面しているＴ２Ｒタンパク質のドメイン、
例えば、「Ｃ−末端ドメイン」及び膜貫通ドメインの細胞内ループ、例えば、膜
貫通領域１と２の間、膜貫通領域３と４の間、膜貫通領域５と６の間、の細胞内
ループ、のことである。「Ｃ−末端ドメイン」は最後の膜貫通領域の終点からタ
ンパク質のＣ−末端までにわたる領域のことである。
例えば、「Ｃ−末端ドメイン」及び膜貫通ドメインの細胞内ループ、例えば、膜
貫通領域１と２の間、膜貫通領域３と４の間、膜貫通領域５と６の間、の細胞内
ループ、のことである。「Ｃ−末端ドメイン」は最後の膜貫通領域の終点からタ
ンパク質のＣ−末端までにわたる領域のことである。
【００７２】
用語「７回膜貫通受容体」は形質膜を７回渡る７個の領域を持つ膜貫通タンパ
ク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する（したがって、７領
域は「膜貫通」または「ＴＭ」ドメインＴＭ ＩからＴＭ ＶＩＩと呼ばれる）
。嗅覚及び一部の味覚受容体のファミリーはそれぞれこのスーパーファミリーに
属している。７回膜貫通受容体ポリペプチド類は、以下に更に詳細に検討するよ
うに、類似した特徴的一次、二次及び三次構造を持っている。
ク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する（したがって、７領
域は「膜貫通」または「ＴＭ」ドメインＴＭ ＩからＴＭ ＶＩＩと呼ばれる）
。嗅覚及び一部の味覚受容体のファミリーはそれぞれこのスーパーファミリーに
属している。７回膜貫通受容体ポリペプチド類は、以下に更に詳細に検討するよ
うに、類似した特徴的一次、二次及び三次構造を持っている。
【００７３】
用語「リガンド結合領域」は実質的に膜貫通ドメインＩＩからＶＩＩ（ＴＭ
ＩＩからＶＩＩ）を組み込んだ化学感受性または味覚受容体から由来した配列の
ことである。この領域はリガンド、特に呈味物質と結合することができる。
ＩＩからＶＩＩ）を組み込んだ化学感受性または味覚受容体から由来した配列の
ことである。この領域はリガンド、特に呈味物質と結合することができる。
【００７４】
用語「形質膜トランスロケーションドメイン」または簡単に「トランスロケー
ションドメイン」は代表的トランスロケーションドメイン（５’−ＭＮＧＴＥＧ
ＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶ；配列番号３１）に機能的に同等なポリペプチド
ドメインを意味する。ポリペプチドコード配列のアミノ端に取り込まれた時に、
これらのペプチドドメインは細胞形質膜にハイブリッド（「融合」）タンパク質
を極めて効率よく「シャペロン」または「トランスロケート」することができる
。この特別な「トランスロケーションドメイン」は最初ヒトロドプシン受容体ポ
リペプチド、７回膜貫通受容体、のアミノ端から由来した。もう一つのトランス
ロケーションドメインはウシロドプシン配列から由来し、そしてやはりトランス
ロケーションを促進するために有用である。ロドプシン由来配列は７回膜貫通融
合タンパク質を形質膜へトランスロケートするのに特に有効である。
ションドメイン」は代表的トランスロケーションドメイン（５’−ＭＮＧＴＥＧ
ＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶ；配列番号３１）に機能的に同等なポリペプチド
ドメインを意味する。ポリペプチドコード配列のアミノ端に取り込まれた時に、
これらのペプチドドメインは細胞形質膜にハイブリッド（「融合」）タンパク質
を極めて効率よく「シャペロン」または「トランスロケート」することができる
。この特別な「トランスロケーションドメイン」は最初ヒトロドプシン受容体ポ
リペプチド、７回膜貫通受容体、のアミノ端から由来した。もう一つのトランス
ロケーションドメインはウシロドプシン配列から由来し、そしてやはりトランス
ロケーションを促進するために有用である。ロドプシン由来配列は７回膜貫通融
合タンパク質を形質膜へトランスロケートするのに特に有効である。
【００７５】
「機能的に同等」とは、新規に翻訳されたタンパク質を形質膜へトランスロケ
ートするドメインの能力及び効率が、同じ条件において代表的配列番号３１と同
じであることを意味する；ここに記述したように、効率は測定され（定量的用語
で）そして比較される。本発明の範囲内に入るドメインは、新規に合成されたポ
リペプチドを細胞（哺乳動物、アフリカツメガエルなど）の形質膜へトランスロ
ケートする効率の定型的スクリーニングにより、２０アミノ酸長のトランスロケ
ーションドメイン配列番号３１と同じ効率を基準に決めることができる。
ートするドメインの能力及び効率が、同じ条件において代表的配列番号３１と同
じであることを意味する；ここに記述したように、効率は測定され（定量的用語
で）そして比較される。本発明の範囲内に入るドメインは、新規に合成されたポ
リペプチドを細胞（哺乳動物、アフリカツメガエルなど）の形質膜へトランスロ
ケートする効率の定型的スクリーニングにより、２０アミノ酸長のトランスロケ
ーションドメイン配列番号３１と同じ効率を基準に決めることができる。
【００７６】
味覚伝達を仲介するＴ２Ｒファミリーメンバーを調節する試験化合物をアッセ
イする文脈における「機能的効果」には、間接あるいは直接に受容体の影響の下
にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的及び化学的効果、の測定が含まれる
。それには、リガンド結合、イオン流束、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結
合、ＧＰＣＲリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達、受容体リガンド相互作
用、セカンドメッセンジャー濃度（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３または
細胞内Ｃａ2+）の変化、インビトロ、インビボ及びエクスビボ、が含まれ、また
神経伝達物質の増減あるいはホルモン放出のような生理的効果も含まれる。
イする文脈における「機能的効果」には、間接あるいは直接に受容体の影響の下
にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的及び化学的効果、の測定が含まれる
。それには、リガンド結合、イオン流束、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結
合、ＧＰＣＲリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達、受容体リガンド相互作
用、セカンドメッセンジャー濃度（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３または
細胞内Ｃａ2+）の変化、インビトロ、インビボ及びエクスビボ、が含まれ、また
神経伝達物質の増減あるいはホルモン放出のような生理的効果も含まれる。
【００７７】
「機能的効果の測定」によるとは、間接あるいは直接にＴ２Ｒファミリーメン
バーの影響の下にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的及び化学的効果、の
増減をする化合物のアッセイを意味する。そのような機能的効果は当業者には既
知の方法のいずれかにより測定することができる、例えば、分光学的特性（例え
ば、蛍光、吸光度、屈折率）、水力学的（例えば、形状）、クロマトグラフィー
の変化、または溶解性、パッチクランプ、電圧感受性色素、ホールセル電流、放
射性同位体流出、導入マーカー、卵母細胞Ｔ２Ｒ遺伝子発現；組織培養細胞Ｔ２
Ｒ発現；Ｔ２Ｒ遺伝子の転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位及び
伝導度変化；イオン流束アッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー、例えば、ｃ
ＡＭＰ、ｃＧＭＰ及びイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の変化；細胞内カルシウ
ム濃度の変化；神経伝達物質放出など。
バーの影響の下にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的及び化学的効果、の
増減をする化合物のアッセイを意味する。そのような機能的効果は当業者には既
知の方法のいずれかにより測定することができる、例えば、分光学的特性（例え
ば、蛍光、吸光度、屈折率）、水力学的（例えば、形状）、クロマトグラフィー
の変化、または溶解性、パッチクランプ、電圧感受性色素、ホールセル電流、放
射性同位体流出、導入マーカー、卵母細胞Ｔ２Ｒ遺伝子発現；組織培養細胞Ｔ２
Ｒ発現；Ｔ２Ｒ遺伝子の転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位及び
伝導度変化；イオン流束アッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー、例えば、ｃ
ＡＭＰ、ｃＧＭＰ及びイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の変化；細胞内カルシウ
ム濃度の変化；神経伝達物質放出など。
【００７８】
Ｔ２Ｒ遺伝子またはタンパク質の「阻害剤」「活性化剤」及び「調節剤」は相
互に交換して使用され、そして味覚伝達のインビトロ及びインビボアッセイを使
用して同定された、阻害し、活性化し、あるいは調節する分子のことであり、例
えば、リガンド、アゴニスト、拮抗剤、及びその同族体及び類似体のことである
。阻害剤は、例えば、結合し、部分的に、あるいは完全に刺激を阻止し、活性化
を減じ、妨害し、遅らせ、不活性化し、感受性を下げ、あるいは味覚伝達を下方
調節する化合物、例えば、拮抗剤、である。活性化剤は、例えば、結合し、刺激
し、増加し、開き、活性化し、促進し、活性化を増強し、感受性を高め、あるい
は味覚伝達を上方調節する化合物、例えば、アゴニスト、である。調節剤は、例
えば、下記物質と受容体の相互作用を変化させる化合物を含む：活性化剤または
阻害剤と結合する細胞外タンパク質（例えば、エブネリン（ｅｂｎｅｒｉｎ）及
び疎水性を有するファミリーの他の構成員）；Ｇタンパク質；キナーゼ類（例え
ば、受容体の脱活性化及び脱感受性に関係するロドプシンキナーゼ及びベータア
ドレナリン作動性受容体キナーゼ）；及び受容体を脱活性化及び脱感受性にする
アレスチン。調節剤にはＴ２Ｒファミリーメンバーの遺伝的修飾体、例えば、変
化した活性を持つ、並びに、天然に存在するかあるいは合成したリガンド、拮抗
剤、アゴニスト、小さな化学分子などが含まれる。
互に交換して使用され、そして味覚伝達のインビトロ及びインビボアッセイを使
用して同定された、阻害し、活性化し、あるいは調節する分子のことであり、例
えば、リガンド、アゴニスト、拮抗剤、及びその同族体及び類似体のことである
。阻害剤は、例えば、結合し、部分的に、あるいは完全に刺激を阻止し、活性化
を減じ、妨害し、遅らせ、不活性化し、感受性を下げ、あるいは味覚伝達を下方
調節する化合物、例えば、拮抗剤、である。活性化剤は、例えば、結合し、刺激
し、増加し、開き、活性化し、促進し、活性化を増強し、感受性を高め、あるい
は味覚伝達を上方調節する化合物、例えば、アゴニスト、である。調節剤は、例
えば、下記物質と受容体の相互作用を変化させる化合物を含む：活性化剤または
阻害剤と結合する細胞外タンパク質（例えば、エブネリン（ｅｂｎｅｒｉｎ）及
び疎水性を有するファミリーの他の構成員）；Ｇタンパク質；キナーゼ類（例え
ば、受容体の脱活性化及び脱感受性に関係するロドプシンキナーゼ及びベータア
ドレナリン作動性受容体キナーゼ）；及び受容体を脱活性化及び脱感受性にする
アレスチン。調節剤にはＴ２Ｒファミリーメンバーの遺伝的修飾体、例えば、変
化した活性を持つ、並びに、天然に存在するかあるいは合成したリガンド、拮抗
剤、アゴニスト、小さな化学分子などが含まれる。
【００７９】
阻害剤及び活性化剤のアッセイには、例えば、細胞または細胞の膜にＴ２Ｒフ
ァミリーメンバーの発現し、呈味物質、例えば、苦味物質の存在下または非存在
下に推定調節化合物を適用し、そして次いで味覚伝達に及ぼす、上記のような機
能的効果を測定することが含まれる。潜在的活性化剤、阻害剤または調節剤で処
理されたＴ２Ｒファミリーメンバーを含む検体またはアッセイは、阻害剤、活性
化剤または調節剤を使用しない対照サンプルと比較し、調節の程度を調べる。対
照サンプル（調節剤なし）を相対的Ｔ２Ｒ活性値１００％とする。Ｔ２Ｒの阻害
は、対照に対する相対的Ｔ２Ｒ活性値が約８０％、さらに５０％または２５−０
％の時に達成される。Ｔ２Ｒの活性化は、対照に対する相対的Ｔ２Ｒ活性値が１
１０％、さらに１５０％、さらに２００−５００％または１０００−３０００％
の時に達成される。
ァミリーメンバーの発現し、呈味物質、例えば、苦味物質の存在下または非存在
下に推定調節化合物を適用し、そして次いで味覚伝達に及ぼす、上記のような機
能的効果を測定することが含まれる。潜在的活性化剤、阻害剤または調節剤で処
理されたＴ２Ｒファミリーメンバーを含む検体またはアッセイは、阻害剤、活性
化剤または調節剤を使用しない対照サンプルと比較し、調節の程度を調べる。対
照サンプル（調節剤なし）を相対的Ｔ２Ｒ活性値１００％とする。Ｔ２Ｒの阻害
は、対照に対する相対的Ｔ２Ｒ活性値が約８０％、さらに５０％または２５−０
％の時に達成される。Ｔ２Ｒの活性化は、対照に対する相対的Ｔ２Ｒ活性値が１
１０％、さらに１５０％、さらに２００−５００％または１０００−３０００％
の時に達成される。
【００８０】
ここに使用された用語「精製された」「実質的に精製された」及び「単離され
た」は本発明の化合物が自然の状態で通常共存する他の異なる化合物が除かれた
状態をいう。望ましくは、「精製された」「実質的に精製された」及び「単離さ
れた」は、組成物が所与のサンプルを重量で全体の少なくとも０．５％、１％、
５％、１０％、２０％、及びもっとも望ましいのは少なくとも５０％または７５
％含んでいることを意味する。望ましい一態様において、これらの用語は所与の
サンプルを重量で全体の少なくとも９５％含む本発明の化合物ことをいう。ここ
に使用された「精製された」「実質的に精製された」及び「単離された」は、核
酸またはタンパク質についていうときは、やはり哺乳動物、特にヒト、体内に自
然に存在する状態と異なる精製または濃度の状態をいう。（１）他の会合構造ま
たは化合物から精製、または（２）哺乳動物、特にヒト、体内において自然には
会合しない構造または化合物と会合する、を含む哺乳動物、特にヒト、体内にお
いて自然に存在するよりも高い精製または濃度の程度は、「単離」の意味の範囲
内にある。ここに記述した核酸またはタンパク質または核酸またはタンパク質の
クラスは、単離されているか、あるいは、当業者には既知の種々な方法及び操作
にしたがって、自然では通常会合しない構造または化合物と会合している。
た」は本発明の化合物が自然の状態で通常共存する他の異なる化合物が除かれた
状態をいう。望ましくは、「精製された」「実質的に精製された」及び「単離さ
れた」は、組成物が所与のサンプルを重量で全体の少なくとも０．５％、１％、
５％、１０％、２０％、及びもっとも望ましいのは少なくとも５０％または７５
％含んでいることを意味する。望ましい一態様において、これらの用語は所与の
サンプルを重量で全体の少なくとも９５％含む本発明の化合物ことをいう。ここ
に使用された「精製された」「実質的に精製された」及び「単離された」は、核
酸またはタンパク質についていうときは、やはり哺乳動物、特にヒト、体内に自
然に存在する状態と異なる精製または濃度の状態をいう。（１）他の会合構造ま
たは化合物から精製、または（２）哺乳動物、特にヒト、体内において自然には
会合しない構造または化合物と会合する、を含む哺乳動物、特にヒト、体内にお
いて自然に存在するよりも高い精製または濃度の程度は、「単離」の意味の範囲
内にある。ここに記述した核酸またはタンパク質または核酸またはタンパク質の
クラスは、単離されているか、あるいは、当業者には既知の種々な方法及び操作
にしたがって、自然では通常会合しない構造または化合物と会合している。
【００８１】
ここに使用されている用語「単離された」は、核酸またはポリペプチドに関す
る時は、哺乳動物、特にヒト、体内に自然に存在するのと異なる精製または濃度
の状態をいう。（１）他の天然に存在する会合構造または化合物から精製、また
は（２）哺乳動物、特にヒト、体内において自然には会合しない構造または化合
物と会合する、を含む哺乳動物、特にヒト、体内において自然に存在するよりも
高い精製または濃度の程度は、「単離」の意味の範囲内にある。ここに記述した
核酸またはタンパク質または核酸またはタンパク質のクラスは、単離されている
か、あるいは、当業者には既知の種々な方法及び操作にしたがって、自然では通
常会合しない構造または化合物と会合している。
る時は、哺乳動物、特にヒト、体内に自然に存在するのと異なる精製または濃度
の状態をいう。（１）他の天然に存在する会合構造または化合物から精製、また
は（２）哺乳動物、特にヒト、体内において自然には会合しない構造または化合
物と会合する、を含む哺乳動物、特にヒト、体内において自然に存在するよりも
高い精製または濃度の程度は、「単離」の意味の範囲内にある。ここに記述した
核酸またはタンパク質または核酸またはタンパク質のクラスは、単離されている
か、あるいは、当業者には既知の種々な方法及び操作にしたがって、自然では通
常会合しない構造または化合物と会合している。
【００８２】
ここに使用されている用語「増幅する」及び「増幅」は、以下に詳細に記述す
るように、組換えまたは自然に発現した核酸を発生させるためにあるいは検出す
るために適当な増幅方法論を使用することである。例えば、本発明は、天然に発
現した核酸（例えば、ゲノムまたはｍＲＮＡ）または本発明（例えば本発明の呈
味物質）の組換え核酸（例えば、ｃＤＮＡ）をインビボまたはインビトロにおい
て増幅（例えば複製連鎖反応、ＰＣＲにより）するための方法及び試薬（例えば
、特異的オリゴヌクレオチドプライマー対）を提供する。
るように、組換えまたは自然に発現した核酸を発生させるためにあるいは検出す
るために適当な増幅方法論を使用することである。例えば、本発明は、天然に発
現した核酸（例えば、ゲノムまたはｍＲＮＡ）または本発明（例えば本発明の呈
味物質）の組換え核酸（例えば、ｃＤＮＡ）をインビボまたはインビトロにおい
て増幅（例えば複製連鎖反応、ＰＣＲにより）するための方法及び試薬（例えば
、特異的オリゴヌクレオチドプライマー対）を提供する。
【００８３】
用語「発現ベクター」は、原核細胞、イースト、真菌、植物、昆虫または哺乳
動物の細胞中に、構成的にまたは誘導的に、インビトロまたはインビボで本発明
の核酸配列を発現させる目的の組換え発現システムのことである。この用語は線
状または環状発現システムを含む。この用語は、エピソームに止まっているか、
または宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現システムを含んでいる。発現システ
ムは自己複製能力を持つこともできるし、持たないこともある、すなわち、細胞
内に一過性にのみ発現する。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最小限の
配列のみを含む組換え発現「カセット」が含まれる。
動物の細胞中に、構成的にまたは誘導的に、インビトロまたはインビボで本発明
の核酸配列を発現させる目的の組換え発現システムのことである。この用語は線
状または環状発現システムを含む。この用語は、エピソームに止まっているか、
または宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現システムを含んでいる。発現システ
ムは自己複製能力を持つこともできるし、持たないこともある、すなわち、細胞
内に一過性にのみ発現する。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最小限の
配列のみを含む組換え発現「カセット」が含まれる。
【００８４】
用語「ライブラリー」は、異なる核酸またはポリペプチド分子の混合物である
調製品、例えば、組換えで発生させた感覚受容体、特に縮重プライマー対で核酸
を増幅して発生させた味覚受容体リガンド結合領域のライブラリー、あるいは増
幅したリガンド結合領域を組み込んだベクターの単離集合、または味覚受容体を
コードするベクターの少なくとも一つで無作為に導入した細胞の混合、のことで
ある。
調製品、例えば、組換えで発生させた感覚受容体、特に縮重プライマー対で核酸
を増幅して発生させた味覚受容体リガンド結合領域のライブラリー、あるいは増
幅したリガンド結合領域を組み込んだベクターの単離集合、または味覚受容体を
コードするベクターの少なくとも一つで無作為に導入した細胞の混合、のことで
ある。
【００８５】
用語「核酸」または「核酸配列」は、一本鎖及び二本鎖のデオキシリボヌクレ
オチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドのことである。この用語は、
核酸、すなわち、天然ヌクレオチドの既知同族体を含むオリゴヌクレオチドを包
含している。この用語はまた合成骨格を持った核酸様構造を包含している。
オチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドのことである。この用語は、
核酸、すなわち、天然ヌクレオチドの既知同族体を含むオリゴヌクレオチドを包
含している。この用語はまた合成骨格を持った核酸様構造を包含している。
【００８６】
特記しない限り、特別な核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体（例えば
、縮重コドン置換）及び相補的配列を明らかに示された配列と同様に、暗黙のう
ちに包含している。特に、縮重コドン置換は生成により行なうことができる、例
えば、１以上の選択したコドンの３番目の位置を混合塩基及び／またはデオキシ
イノシン残基で置換した配列（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−０８（１９８５）；Ｒｏ
ｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−
９８（１９９４））。用語核酸は遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオ
チド及びポリヌクレオチドと相互交換して使用される。
、縮重コドン置換）及び相補的配列を明らかに示された配列と同様に、暗黙のう
ちに包含している。特に、縮重コドン置換は生成により行なうことができる、例
えば、１以上の選択したコドンの３番目の位置を混合塩基及び／またはデオキシ
イノシン残基で置換した配列（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−０８（１９８５）；Ｒｏ
ｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−
９８（１９９４））。用語核酸は遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオ
チド及びポリヌクレオチドと相互交換して使用される。
【００８７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は相互に交換して使
用され、アミノ酸残基の重合体のことである。この用語は天然に存在するアミノ
酸重合体及び天然に存在しないアミノ酸重合体と同様に、１以上のアミノ酸残基
が対応する天然アミノ酸の人工的化学類似物であるアミノ酸重合体にも適用する
。
用され、アミノ酸残基の重合体のことである。この用語は天然に存在するアミノ
酸重合体及び天然に存在しないアミノ酸重合体と同様に、１以上のアミノ酸残基
が対応する天然アミノ酸の人工的化学類似物であるアミノ酸重合体にも適用する
。
【００８８】
ここに記述した「トランスロケーションドメイン」、「リガンド結合領域」及
びキメラ受容体組成物は「同族体」または「保存的変異体」及び実質的に代表的
配列に相当する構造及び活性を持つ「類似体」（「ペプチド類似体」）も含んで
いる。このように、用語「保存的変異体」または「同族体」または「類似体」と
は、変化がポリペプチドの（保存的変異体の）、ここに定義した、構造及び／ま
たは活性を実質的に変化させないような修飾アミノ酸配列を持つポリペプチドの
ことである。これには、アミノ酸配列の保存的修飾変異、すなわち、タンパク質
活性に重要でないアミノ酸置換、付加または削除、あるいは重要なアミノ酸の置
換であっても構造及び／または活性を変化させないように同性質（例えば、酸性
、塩基性、陽性または陰性電荷、極性または非極性、など）を持つ残基でアミノ
酸を置換、が含まれる。
びキメラ受容体組成物は「同族体」または「保存的変異体」及び実質的に代表的
配列に相当する構造及び活性を持つ「類似体」（「ペプチド類似体」）も含んで
いる。このように、用語「保存的変異体」または「同族体」または「類似体」と
は、変化がポリペプチドの（保存的変異体の）、ここに定義した、構造及び／ま
たは活性を実質的に変化させないような修飾アミノ酸配列を持つポリペプチドの
ことである。これには、アミノ酸配列の保存的修飾変異、すなわち、タンパク質
活性に重要でないアミノ酸置換、付加または削除、あるいは重要なアミノ酸の置
換であっても構造及び／または活性を変化させないように同性質（例えば、酸性
、塩基性、陽性または陰性電荷、極性または非極性、など）を持つ残基でアミノ
酸を置換、が含まれる。
【００８９】
「保存的修飾変異体」は特にアミノ酸配列にも核酸配列にも適用する。特別な
核酸配列に関しては、保存的修飾変異体とは同一のまたは本質的に同一のアミノ
酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない時は、本質
的に同一の配列の核酸のことである。遺伝子コードの縮重のために、極めて多数
の機能的に同一の核酸が所与のポリペプチドをコードしている。
核酸配列に関しては、保存的修飾変異体とは同一のまたは本質的に同一のアミノ
酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない時は、本質
的に同一の配列の核酸のことである。遺伝子コードの縮重のために、極めて多数
の機能的に同一の核酸が所与のポリペプチドをコードしている。
【００９０】
例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンを
コードしている。このように、コドンによってアラニンが特定されている位置の
どこでも、コードされたポリペプチドを変えることなくそのコドンは相当するコ
ドンのいずれかと替えることができる。
コードしている。このように、コドンによってアラニンが特定されている位置の
どこでも、コードされたポリペプチドを変えることなくそのコドンは相当するコ
ドンのいずれかと替えることができる。
【００９１】
そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存修飾変異の一種
である。ポリペプチドをコードする核酸配列はどれも核酸の可能なサイレント変
異の全てを表示している。核酸の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであ
るＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）は機
能的に同一の分子を得るために修飾できることは、当業者は認識しているであろ
う。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸の各サイレント変異は記載
された配列のそれぞれに暗黙のうちに含まれている。
である。ポリペプチドをコードする核酸配列はどれも核酸の可能なサイレント変
異の全てを表示している。核酸の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであ
るＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）は機
能的に同一の分子を得るために修飾できることは、当業者は認識しているであろ
う。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸の各サイレント変異は記載
された配列のそれぞれに暗黙のうちに含まれている。
【００９２】
機能的に類似アミノ酸を提供する保存置換表は当業者によく知られている。例
えば、保存置換を選択するための代表的ガイドラインは（元来の残基次いで代表
的置換）：ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ；ａｒｇ／ｌｙｓ；ａｓｎ／ｇｌｎまた
はｈｉｓ；ａｓｐ／ｇｌｕ；ｃｙｓ／ｓｅｒ；ｇｌｎ／ａｓｎ；ｇｌｙ／ａｓｐ
；ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ；ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ；ｉｌｅ／ｌｅｕ
またはｖａｌ；ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ；ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまた
はｇｌｕ；ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ；ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌ
ｅｕまたはｔｙｒ；ｓｅｒ／ｔｈｒ；ｔｈｒ／ｓｅｒ；ｔｒｐ／ｔｙｒ；ｔｙｒ
／ｔｒｐまたはｐｈｅ；ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕ。別の代表的なガイドライ
ンは以下の６群を使用し、その群は互いに保存置換できるアミノ酸を含んでいる
：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸
（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４
）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）
、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシ
ン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）；Ｓｃ
ｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９７９）も
参照）。当業者は上記に示した置換は唯一の可能な保存置換でないことはよく理
解しているであろう。例えば、ある目的では、全ての荷電アミノ酸を相互に陽性
か陰性かで保存置換とみなすこともできる。さらに、１個のアミノ酸またはコー
ド配列における少ないパーセンテージのアミノ酸の変更、追加または削除である
個別の置換、削除または追加もまた「保存的修飾変異体」とみなすこともできる
。
えば、保存置換を選択するための代表的ガイドラインは（元来の残基次いで代表
的置換）：ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ；ａｒｇ／ｌｙｓ；ａｓｎ／ｇｌｎまた
はｈｉｓ；ａｓｐ／ｇｌｕ；ｃｙｓ／ｓｅｒ；ｇｌｎ／ａｓｎ；ｇｌｙ／ａｓｐ
；ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ；ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ；ｉｌｅ／ｌｅｕ
またはｖａｌ；ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ；ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまた
はｇｌｕ；ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ；ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌ
ｅｕまたはｔｙｒ；ｓｅｒ／ｔｈｒ；ｔｈｒ／ｓｅｒ；ｔｒｐ／ｔｙｒ；ｔｙｒ
／ｔｒｐまたはｐｈｅ；ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕ。別の代表的なガイドライ
ンは以下の６群を使用し、その群は互いに保存置換できるアミノ酸を含んでいる
：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸
（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４
）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）
、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシ
ン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）；Ｓｃ
ｈｕｌｔｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９７９）も
参照）。当業者は上記に示した置換は唯一の可能な保存置換でないことはよく理
解しているであろう。例えば、ある目的では、全ての荷電アミノ酸を相互に陽性
か陰性かで保存置換とみなすこともできる。さらに、１個のアミノ酸またはコー
ド配列における少ないパーセンテージのアミノ酸の変更、追加または削除である
個別の置換、削除または追加もまた「保存的修飾変異体」とみなすこともできる
。
【００９３】
用語「類似体」及び「ペプチド類似体」とは、ポリペプチド、例えば、トラン
スロケーションドメイン、リガンド結合ドメイン、または本発明のキメラ受容体
、と実質的に同じ構造及び／または機能の特徴を有する合成化合物のことである
。類似体は、全く合成的、非天然アミノ酸同族体からなるか、あるいは部分的に
天然ペプチドアミノ酸そして部分的に非天然アミノ酸同族体のキメラ分子であり
得る。類似体は、置換が類似体の構造及び／または活性を実質的に変化させない
範囲の保存置換で、天然アミノ酸を取り込むこともできる。
スロケーションドメイン、リガンド結合ドメイン、または本発明のキメラ受容体
、と実質的に同じ構造及び／または機能の特徴を有する合成化合物のことである
。類似体は、全く合成的、非天然アミノ酸同族体からなるか、あるいは部分的に
天然ペプチドアミノ酸そして部分的に非天然アミノ酸同族体のキメラ分子であり
得る。類似体は、置換が類似体の構造及び／または活性を実質的に変化させない
範囲の保存置換で、天然アミノ酸を取り込むこともできる。
【００９４】
保存変異体である本発明のポリペプチドのように、定法実験により類似体が本
発明の範囲内にあるか否かを明らかにするであろう、すなわち、その構造及び／
または機能が実質的に変化していないことを。ポリペプチド類似組成物は非天然
構造化合物のどのような組合せも含むことができ、それらは典型的に３構造グル
ープから由来する：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基結合
グループ；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりに非天然残基；または、ｃ
）二次構造模倣を誘導する残基、すなわち、例えば、βターン、γターン、βシ
ート、αへリックス構造、などの二次構造を誘導または安定化すること。その残
基の全てまたは一部が天然のペプチド結合以外の化学的方法によって結合してい
る時はポリペプチドは類似体に分類される。個々のペプチド類似残基はペプチド
結合、その他の化学結合または結合方法、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒ
ドロキシコハク酸イミドエステル、二官能性マレインイミド、Ｎ、Ｎ’−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジ
イミド（ＤＩＣ）、で結合することができる。古典的アミド結合（「ペプチド結
合」）に変わることができる結合基には、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ
（＝Ｏ）−ＮＨ−の代わりに−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−）、アミノメチレン（ＣＨ2 −ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ2−Ｏ）、チ
オエーテル（ＣＨ2−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ4）、チアゾール、レトロアミド
、チオアミド、またはエステルが含まれる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ
ｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，２６７−３５
７，Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏ
ｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ＮＹ（１９８３）を参照）。天然に存在するアミノ酸
残基の代わりに全部か一部の非天然残基を含むことにより、ポリペプチドはまた
類似体に分類される；非天然残基は科学文献及び特許文献によく記述されている
。
発明の範囲内にあるか否かを明らかにするであろう、すなわち、その構造及び／
または機能が実質的に変化していないことを。ポリペプチド類似組成物は非天然
構造化合物のどのような組合せも含むことができ、それらは典型的に３構造グル
ープから由来する：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基結合
グループ；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりに非天然残基；または、ｃ
）二次構造模倣を誘導する残基、すなわち、例えば、βターン、γターン、βシ
ート、αへリックス構造、などの二次構造を誘導または安定化すること。その残
基の全てまたは一部が天然のペプチド結合以外の化学的方法によって結合してい
る時はポリペプチドは類似体に分類される。個々のペプチド類似残基はペプチド
結合、その他の化学結合または結合方法、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒ
ドロキシコハク酸イミドエステル、二官能性マレインイミド、Ｎ、Ｎ’−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジ
イミド（ＤＩＣ）、で結合することができる。古典的アミド結合（「ペプチド結
合」）に変わることができる結合基には、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ
（＝Ｏ）−ＮＨ−の代わりに−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−）、アミノメチレン（ＣＨ2 −ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ2−Ｏ）、チ
オエーテル（ＣＨ2−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ4）、チアゾール、レトロアミド
、チオアミド、またはエステルが含まれる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ
ｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，２６７−３５
７，Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏ
ｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ＮＹ（１９８３）を参照）。天然に存在するアミノ酸
残基の代わりに全部か一部の非天然残基を含むことにより、ポリペプチドはまた
類似体に分類される；非天然残基は科学文献及び特許文献によく記述されている
。
【００９５】
「標識」または「検出基」は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、ま
たは化学的な方法により検出できる組成物である。例えば、有用な標識には、32 Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに一般的に使用される
ような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン及び、例えば放射標識を
ペプチドの中に取り込むことにより検出できるようにしたタンパク質あるいはペ
プチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用されるタンパク質が含まれ
る。
たは化学的な方法により検出できる組成物である。例えば、有用な標識には、32 Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに一般的に使用される
ような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン及び、例えば放射標識を
ペプチドの中に取り込むことにより検出できるようにしたタンパク質あるいはペ
プチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用されるタンパク質が含まれ
る。
【００９６】
「標識核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、プローブと結合する標識
の存在を検出することによりプローブの存在を検出することができる標識と、リ
ンカーまたは化学結合を介して共有結合するか、またはイオン、ファンデルワー
ルス、静電により非共有結合するか、または水素結合することにより、結合して
いるものである。
の存在を検出することによりプローブの存在を検出することができる標識と、リ
ンカーまたは化学結合を介して共有結合するか、またはイオン、ファンデルワー
ルス、静電により非共有結合するか、または水素結合することにより、結合して
いるものである。
【００９７】
ここに使用されている「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１以上
のタイプの化学結合、通常は相補的塩基対、通常は水素結合により、相補配列の
標的核酸と結合することができる核酸と定義される。ここに使用されるように、
プローブは天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）あるいは修飾塩基（７−デ
アザグアノシン、イノシンなど）を含むことができる。さらに、プローブ中の塩
基はハイブリダイゼーションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結
合で連結することができる。したがって、例えば、プローブは、その中の構成塩
基がホスホジエステル結合でなくペプチド結合で連結しているペプチド核酸とい
うことがありうる。プローブはハイブリダイゼーション条件の厳密さに依存して
プローブ配列との完全な相補性を欠いた標的配列と結合できることは、当業者に
は理解されているであろう。プローブはさらに直接的に同位体、発色団、蛍光団
、クロモゲンで標識され、あるいは後にストレプトアビジン複合体を形成するビ
オチンのようなもので間接的に標識される。プローブが存在するか存在しないか
をアッセイすることにより、選択した配列または部分配列が存在するか否かを検
出することができる。
のタイプの化学結合、通常は相補的塩基対、通常は水素結合により、相補配列の
標的核酸と結合することができる核酸と定義される。ここに使用されるように、
プローブは天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）あるいは修飾塩基（７−デ
アザグアノシン、イノシンなど）を含むことができる。さらに、プローブ中の塩
基はハイブリダイゼーションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結
合で連結することができる。したがって、例えば、プローブは、その中の構成塩
基がホスホジエステル結合でなくペプチド結合で連結しているペプチド核酸とい
うことがありうる。プローブはハイブリダイゼーション条件の厳密さに依存して
プローブ配列との完全な相補性を欠いた標的配列と結合できることは、当業者に
は理解されているであろう。プローブはさらに直接的に同位体、発色団、蛍光団
、クロモゲンで標識され、あるいは後にストレプトアビジン複合体を形成するビ
オチンのようなもので間接的に標識される。プローブが存在するか存在しないか
をアッセイすることにより、選択した配列または部分配列が存在するか否かを検
出することができる。
【００９８】
「非相同性の」という用語は、一つの核酸の部分をさす語と共に使用される場
合、核酸が互いに同一の類縁の中には全く見出されない二つ以上の部分配列から
成ることを示す。例えば、核酸は代表的には組換えによって作製され、例えば一
つの発生源からはプロモーター、もう一つの発生源からはコード領域として、新
しい機能性核酸を作製するために配列した関連性のない遺伝子から生じた二つ以
上の配列を有する。同様に、非相同タンパク質はそのタンパク質が互いに同一の
類縁の中には全く見出されない二つ以上の部分配列から成ることを示す（例えば
、融合タンパク質）。
合、核酸が互いに同一の類縁の中には全く見出されない二つ以上の部分配列から
成ることを示す。例えば、核酸は代表的には組換えによって作製され、例えば一
つの発生源からはプロモーター、もう一つの発生源からはコード領域として、新
しい機能性核酸を作製するために配列した関連性のない遺伝子から生じた二つ以
上の配列を有する。同様に、非相同タンパク質はそのタンパク質が互いに同一の
類縁の中には全く見出されない二つ以上の部分配列から成ることを示す（例えば
、融合タンパク質）。
【００９９】
「プロモーター」は核酸の転写を導く一連の核酸配列と定義される。この文書
の中で用いたように、プロモーターにはポリメラーゼＩＩ型プロモーターである
ＴＡＴＡエレメントの場合のように、転写の開始部位の近傍に必須核酸配列が含
まれる。またプロモーターには任意に末端エンハンサーもしくはリプレッサーエ
レメントが含まれ、それらは転写開始部位から数千個にもおよぶ塩基対が特定さ
れる。「構造性」プロモーターは大部分の環境的条件下及び発生の条件下で活性
をもつプロモーターである。「誘発性」プロモーターは環境的制御下もしくは発
生の制御下で活性をもつプロモーターである。「作動できるように連鎖した」と
いう表現は核酸発現制御配列（プロモーターあるいは転写因子結合部位の配列の
ような）と発現制御配列が第二の配列に相応した核酸の転写を導く第二核酸配列
との間の機能性連鎖をさす。
の中で用いたように、プロモーターにはポリメラーゼＩＩ型プロモーターである
ＴＡＴＡエレメントの場合のように、転写の開始部位の近傍に必須核酸配列が含
まれる。またプロモーターには任意に末端エンハンサーもしくはリプレッサーエ
レメントが含まれ、それらは転写開始部位から数千個にもおよぶ塩基対が特定さ
れる。「構造性」プロモーターは大部分の環境的条件下及び発生の条件下で活性
をもつプロモーターである。「誘発性」プロモーターは環境的制御下もしくは発
生の制御下で活性をもつプロモーターである。「作動できるように連鎖した」と
いう表現は核酸発現制御配列（プロモーターあるいは転写因子結合部位の配列の
ような）と発現制御配列が第二の配列に相応した核酸の転写を導く第二核酸配列
との間の機能性連鎖をさす。
【０１００】
この文書の中で用いられたように、「組換え」は合成されたもしくはそうでな
ければインビトロで操作されたポリヌクレオチド、細胞または他の生体組織内の
遺伝子生成物を産生するための組換えポリヌクレオチドを用いる方法、あるいは
組換えポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド（「組換えタンパク質
」）をさす。「組換え法」にはまた異なる発生源から発現カセットまたは発現ベ
クター内に別々のコード領域またはドメインあるいはプロモーター配列をもつ核
酸の連結反応も含まれる。例えば、本発明のトランスロケーションドメインから
成る融合タンパク質の誘発性発現もしくは構造性発現に対する発現カセットまた
はベクターである。
ければインビトロで操作されたポリヌクレオチド、細胞または他の生体組織内の
遺伝子生成物を産生するための組換えポリヌクレオチドを用いる方法、あるいは
組換えポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド（「組換えタンパク質
」）をさす。「組換え法」にはまた異なる発生源から発現カセットまたは発現ベ
クター内に別々のコード領域またはドメインあるいはプロモーター配列をもつ核
酸の連結反応も含まれる。例えば、本発明のトランスロケーションドメインから
成る融合タンパク質の誘発性発現もしくは構造性発現に対する発現カセットまた
はベクターである。
【０１０１】
「選択的または特異的ハイブリダイズ」という語句は、配列が複合混合物内に
存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌク
レオチド配列だけに対する分子の結合、二重構造形成、あるいはハイブリダイズ
をさす（例えば、全細胞もしくはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）。
存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌク
レオチド配列だけに対する分子の結合、二重構造形成、あるいはハイブリダイズ
をさす（例えば、全細胞もしくはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）。
【０１０２】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とはプローブが代表的に
は核酸の複合混合物内の、他の配列でなく標的部分配列に対してハイブリダイズ
するであろう。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる環境では違って
くるであろう。より長い配列はより高温で特異的にハイブリッドを形成する。核
酸のハイブリダイゼーションに対する包括的指針はＴｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐ
ｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅ
ｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に記載されている。一般的に、ス
トリンジェントな条件は定められたイオン強度ｐＨで個々の配列の融点（Ｔｍ）
より約５−１０℃低い条件を選択する。Ｔｍは標的に相補的な５０％のプローブ
が平衡状態で標的配列に対してハイブリッドを形成する温度（定められたイオン
強度、ｐＨ及び核酸濃度）である（Ｔｍでは標的配列が過剰に存在する時、５０
％のプローブが平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は塩濃度が約
１．０Ｍナトリウムイオンより低い条件、代表的にはｐＨ７．０から８．３で約
０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度であり、また温度が短いプローブ（
例えば１０から５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃、また長いプ
ローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）に対しては少なくとも約６０℃であ
ろう。ストリンジェントな条件はまたホルムアミドのような不安定化剤の追加に
より作ることができる。選択的あるいは特異的ハイブリダイゼーションのために
、陽性のシグナルは少なくともバックグラウンドの２倍、任意にバックグラウン
ドの１０倍のハイブリダイゼーションである。代表的なストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件は以下のようである：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ
、及び１％ＳＤＳを加えて４２℃でインキュベート、あるいは５ｘＳＳＣ、１％
ＳＤＳを加えて６５℃でインキュベート、０．２ｘＳＳＣで洗浄、及び０．１％
ＳＤＳを加えて６５℃でインキュベート。このようなハイブリダイゼーション及
び洗浄段階は例えば１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、また
はそれ以上の時間実施する事が可能である。
は核酸の複合混合物内の、他の配列でなく標的部分配列に対してハイブリダイズ
するであろう。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる環境では違って
くるであろう。より長い配列はより高温で特異的にハイブリッドを形成する。核
酸のハイブリダイゼーションに対する包括的指針はＴｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐ
ｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅ
ｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に記載されている。一般的に、ス
トリンジェントな条件は定められたイオン強度ｐＨで個々の配列の融点（Ｔｍ）
より約５−１０℃低い条件を選択する。Ｔｍは標的に相補的な５０％のプローブ
が平衡状態で標的配列に対してハイブリッドを形成する温度（定められたイオン
強度、ｐＨ及び核酸濃度）である（Ｔｍでは標的配列が過剰に存在する時、５０
％のプローブが平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は塩濃度が約
１．０Ｍナトリウムイオンより低い条件、代表的にはｐＨ７．０から８．３で約
０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度であり、また温度が短いプローブ（
例えば１０から５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃、また長いプ
ローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）に対しては少なくとも約６０℃であ
ろう。ストリンジェントな条件はまたホルムアミドのような不安定化剤の追加に
より作ることができる。選択的あるいは特異的ハイブリダイゼーションのために
、陽性のシグナルは少なくともバックグラウンドの２倍、任意にバックグラウン
ドの１０倍のハイブリダイゼーションである。代表的なストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件は以下のようである：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ
、及び１％ＳＤＳを加えて４２℃でインキュベート、あるいは５ｘＳＳＣ、１％
ＳＤＳを加えて６５℃でインキュベート、０．２ｘＳＳＣで洗浄、及び０．１％
ＳＤＳを加えて６５℃でインキュベート。このようなハイブリダイゼーション及
び洗浄段階は例えば１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、また
はそれ以上の時間実施する事が可能である。
【０１０３】
ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリッドを形成しない核酸は、コー
ドするポリペプチドがかなり関連性がある場合やはり相当関連性がある。例えば
、遺伝子コードによって生じた最大コドン縮重を利用して核酸の複写が生成され
る場合、このことが起こる。このような場合、核酸は代表的には中程度のストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッドを形成する。代表的
な「中程度の（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ）ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件」には３７℃で４０％ホルムアミド緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤ
Ｓ内でのハイブリダイゼーション、及び４５℃で１ｘＳＳＣ中での洗浄が含まれ
る。このようなハイブリダイゼーションと洗浄段階を例えば１分、２分、５分、
１０分、１５分、３０分、６０分またはそれ以上の時間実施する。陽性のハイブ
リダイゼーションは少なくともバックグラウンドの２倍である。他のハイブリダ
イゼーション及び洗浄条件が同様な厳密さの条件をつくるために利用できるとい
うことは当業者には容易に理解されるであろう。
ドするポリペプチドがかなり関連性がある場合やはり相当関連性がある。例えば
、遺伝子コードによって生じた最大コドン縮重を利用して核酸の複写が生成され
る場合、このことが起こる。このような場合、核酸は代表的には中程度のストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッドを形成する。代表的
な「中程度の（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ）ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件」には３７℃で４０％ホルムアミド緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤ
Ｓ内でのハイブリダイゼーション、及び４５℃で１ｘＳＳＣ中での洗浄が含まれ
る。このようなハイブリダイゼーションと洗浄段階を例えば１分、２分、５分、
１０分、１５分、３０分、６０分またはそれ以上の時間実施する。陽性のハイブ
リダイゼーションは少なくともバックグラウンドの２倍である。他のハイブリダ
イゼーション及び洗浄条件が同様な厳密さの条件をつくるために利用できるとい
うことは当業者には容易に理解されるであろう。
【０１０４】
「抗体」は抗原に特異的に結合し抗原を認識する免疫グロブリン遺伝子あるい
はそのフラグメントから生成した構造領域から成るポリペプチドをさす。認識さ
れた免疫グロブリン遺伝子には、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子だけでな
く、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー不変
部領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパあるいはラムダのいずれかとして分類さ
れる。重鎖はそれぞれ順に免疫グロブリン類、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ
及びＩｇＥと定義されたガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、もしくはイプシロ
ンとして分類される。
はそのフラグメントから生成した構造領域から成るポリペプチドをさす。認識さ
れた免疫グロブリン遺伝子には、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子だけでな
く、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー不変
部領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパあるいはラムダのいずれかとして分類さ
れる。重鎖はそれぞれ順に免疫グロブリン類、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ
及びＩｇＥと定義されたガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、もしくはイプシロ
ンとして分類される。
【０１０５】
代表的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは四量体から成る。個々の四量
体はポリペプチド鎖の二つの全く一致した対から成り、個々の対は一つの「軽」
鎖（約２５ｋＤａ）及び一つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）をもつ。個々の
鎖のＮ末端は抗原認識を主につかさどる約１００から１１０以上のアミノ酸の可
変領域を決定する。（ＶＬ：可変軽鎖）及び（ＶＨ：可変重鎖）はそれぞれこれ
らの軽鎖及び重鎖をさす。
体はポリペプチド鎖の二つの全く一致した対から成り、個々の対は一つの「軽」
鎖（約２５ｋＤａ）及び一つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）をもつ。個々の
鎖のＮ末端は抗原認識を主につかさどる約１００から１１０以上のアミノ酸の可
変領域を決定する。（ＶＬ：可変軽鎖）及び（ＶＨ：可変重鎖）はそれぞれこれ
らの軽鎖及び重鎖をさす。
【０１０６】
「キメラ抗体」は（ａ）抗原結合部位（可変領域）が別々のまたは変化した類
、エフェクター機能及び／もしくは種、あるいはキメラ抗体に新規の性質を与え
る全く別々の分子の不変部領域に連結されるように、不変部領域またはその部分
が変化し、置換され、交換される抗体分子である。例えば、酵素、毒素、ホルモ
ン、成長因子、薬剤等；あるいは（ｂ）別々のまたは変化した抗原特異性をもつ
可変領域により変化し、置換し、交換された可変領域、またはその部分である。
、エフェクター機能及び／もしくは種、あるいはキメラ抗体に新規の性質を与え
る全く別々の分子の不変部領域に連結されるように、不変部領域またはその部分
が変化し、置換され、交換される抗体分子である。例えば、酵素、毒素、ホルモ
ン、成長因子、薬剤等；あるいは（ｂ）別々のまたは変化した抗原特異性をもつ
可変領域により変化し、置換し、交換された可変領域、またはその部分である。
【０１０７】
「ａｎｔｉ−Ｔ２Ｒ」抗体はＴ２Ｒ遺伝子、ｃＤＮＡ、またはその部分配列に
よりコードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメン
トである。
よりコードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメン
トである。
【０１０８】
「免疫アッセイ」は抗原に特異的に結合するために抗体を用いるアッセイであ
る。免疫アッセイは抗原を分離し、標的とし、及び／もしくは定量するために特
定の抗体の特異的結合性を利用することを特徴とする。
る。免疫アッセイは抗原を分離し、標的とし、及び／もしくは定量するために特
定の抗体の特異的結合性を利用することを特徴とする。
【０１０９】
抗体に「特異的にまたは選択的に結合する」、あるいは「特異的にまたは選択
的に免疫活性をもつ」という語句は、タンパク質またはペプチドをいう場合、非
相同タンパク質の母集団及び他の生物学的製剤中のタンパク質の存在を決定する
結合反応をさす。したがって、提示された免疫アッセイの条件下で、明示された
抗体は個々のタンパク質に少なくともバックグラウンドの２倍結合し、検体中に
存在する他のタンパク質に対して有意な量で十分には結合しない。そのような条
件下での抗体に対する特異的結合は個々のタンパク質に対する特異性のために選
択される抗体が必要であろう。
的に免疫活性をもつ」という語句は、タンパク質またはペプチドをいう場合、非
相同タンパク質の母集団及び他の生物学的製剤中のタンパク質の存在を決定する
結合反応をさす。したがって、提示された免疫アッセイの条件下で、明示された
抗体は個々のタンパク質に少なくともバックグラウンドの２倍結合し、検体中に
存在する他のタンパク質に対して有意な量で十分には結合しない。そのような条
件下での抗体に対する特異的結合は個々のタンパク質に対する特異性のために選
択される抗体が必要であろう。
【０１１０】
例えば、ラット、マウス、またはヒトのような個々の種由来のＴ２Ｒファミリ
ーメンバーに対して増大したポリクロナール抗体は、Ｔ２Ｒポリペプチドあるい
はその免疫原性の部分により特異的に免疫活性をもつポリクロナール抗体だけを
得るために選択できる。またＴ２Ｒポリペプチドのオルソログあるいは多型変異
体及び対立遺伝子を除く他のタンパク質ではこの活性はない。この選択は他の種
もしくは他のＴ２Ｒ分子から得られたＴ２Ｒ分子と交差反応を起こす抗体を除去
することによって行なわれる。抗体はまた他のファミリー由来のＧＰＣＲｓ（Ｇ
タンパク質共役型受容体）ではなく、Ｔ２Ｒ ＧＰＣＲファミリーメンバーのみ
を認識するよう選択できる。異なった免疫アッセイの形式が個々のタンパク質と
の特異的な免疫活性をもつ抗体を選択するために用いられる可能性がある。例え
ば、固相ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）免疫アッセイは通常タンパク質との
特異的免疫活性をもつ抗体を選択するために用いられる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ
＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，（１９８８），ｆｏｒ ａ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｃ
ａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍ
ｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ参照）。代表的には特異的または選択的反応は少な
くとも２回のバックグラウンドシグナルもしくはノイズ及びさらに代表的にはバ
ックグラウンドの１０から１００倍を超えるであろう。
ーメンバーに対して増大したポリクロナール抗体は、Ｔ２Ｒポリペプチドあるい
はその免疫原性の部分により特異的に免疫活性をもつポリクロナール抗体だけを
得るために選択できる。またＴ２Ｒポリペプチドのオルソログあるいは多型変異
体及び対立遺伝子を除く他のタンパク質ではこの活性はない。この選択は他の種
もしくは他のＴ２Ｒ分子から得られたＴ２Ｒ分子と交差反応を起こす抗体を除去
することによって行なわれる。抗体はまた他のファミリー由来のＧＰＣＲｓ（Ｇ
タンパク質共役型受容体）ではなく、Ｔ２Ｒ ＧＰＣＲファミリーメンバーのみ
を認識するよう選択できる。異なった免疫アッセイの形式が個々のタンパク質と
の特異的な免疫活性をもつ抗体を選択するために用いられる可能性がある。例え
ば、固相ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）免疫アッセイは通常タンパク質との
特異的免疫活性をもつ抗体を選択するために用いられる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ
＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，（１９８８），ｆｏｒ ａ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｃ
ａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍ
ｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ参照）。代表的には特異的または選択的反応は少な
くとも２回のバックグラウンドシグナルもしくはノイズ及びさらに代表的にはバ
ックグラウンドの１０から１００倍を超えるであろう。
【０１１１】
「選択的に結合した」という語句は上記に定義したように他方との「選択的に
ハイブリダイズする」ための核酸の能力、もしくは上記に定義した「タンパク質
と選択的に（又は特に）結合する」ことをさす。
ハイブリダイズする」ための核酸の能力、もしくは上記に定義した「タンパク質
と選択的に（又は特に）結合する」ことをさす。
【０１１２】
「発現ベクター」という用語は原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫もしくは哺
乳動物の細胞などを含むあらゆる細胞に構造的に誘発的に、インビトロまたはイ
ンビボにおける本発明の核酸配列を発現するためのあらゆる組換え発現システム
をさす。この用語には直線的なもしくは循環的な発現システムが含まれる。この
用語にはエピソームのままのあるいは宿主細胞ゲノム内に組み込む発現システム
が含まれる。発現システムは自己複製の能力をもつことができるか、そうでなけ
れば、即ち細胞内に一過性の発現だけを生じさせることができる。この用語には
組換え発現「組換え核酸の転写を必要とする最小エレメントだけを含むカセット
」が含まれる。
乳動物の細胞などを含むあらゆる細胞に構造的に誘発的に、インビトロまたはイ
ンビボにおける本発明の核酸配列を発現するためのあらゆる組換え発現システム
をさす。この用語には直線的なもしくは循環的な発現システムが含まれる。この
用語にはエピソームのままのあるいは宿主細胞ゲノム内に組み込む発現システム
が含まれる。発現システムは自己複製の能力をもつことができるか、そうでなけ
れば、即ち細胞内に一過性の発現だけを生じさせることができる。この用語には
組換え発現「組換え核酸の転写を必要とする最小エレメントだけを含むカセット
」が含まれる。
【０１１３】
「宿主」は発現ベクターを含みまた発現ベクターの複製もしくは発現を助ける
細胞を意味する。宿主細胞はＥ．ｔｏｌｌのような原核細胞、あるいは酵母のよ
うな真核細胞、昆虫、両生類、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３等のよ
うな哺乳動物の細胞、例えば培養された細胞、外植片とインビボにおける細胞の
ようなものである。
細胞を意味する。宿主細胞はＥ．ｔｏｌｌのような原核細胞、あるいは酵母のよ
うな真核細胞、昆虫、両生類、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３等のよ
うな哺乳動物の細胞、例えば培養された細胞、外植片とインビボにおける細胞の
ようなものである。
【０１１４】
Ｃ．Ｔ２Ｒｓの分離及び発現
本発明のＴ２Ｒｓ、あるいはそのフラグメントまたはその変異体の分離と発現
は、本出願の中に開示されたＴ２Ｒ核酸配列に基づいて構築されたプローブもし
くはプライマーを用いた確立されたクローニング法によって都合よく行なわれる
。関連Ｔ２Ｒ配列もこの文書の中に開示した配列もしくは例えばＢＬＡＳＴ配列
検査のようなよく知られたコンピューターによる検査法を用いてヒトあるいは他
の種のゲノムデータベースから確認することが可能である。個々の態様として、
この文書のなかに開示した偽遺伝子は機能性対立遺伝子または関連遺伝子を確認
するために用いることができる。
は、本出願の中に開示されたＴ２Ｒ核酸配列に基づいて構築されたプローブもし
くはプライマーを用いた確立されたクローニング法によって都合よく行なわれる
。関連Ｔ２Ｒ配列もこの文書の中に開示した配列もしくは例えばＢＬＡＳＴ配列
検査のようなよく知られたコンピューターによる検査法を用いてヒトあるいは他
の種のゲノムデータベースから確認することが可能である。個々の態様として、
この文書のなかに開示した偽遺伝子は機能性対立遺伝子または関連遺伝子を確認
するために用いることができる。
【０１１５】
発現ベクターはその後これらの配列における機能性発現のための宿主細胞を感
染させるかあるいは移入させるために用いられる。これらの遺伝子及びベクター
はインビトロまたはインビボで作製され発現される。当業者は核酸発現を変化さ
せ制御する適切な表現型が本発明のベクター内の遺伝子と核酸（例えば、プロモ
ーター、エンハンサー等）の発現もしくは活性を調節することによって得られる
ということを理解するであろう。発現あるいは活性の増大または減少について記
したよく知られたあらゆる方法を用いることが可能である。本発明は、科学的文
献及び特許文献に詳しく述べられた、当業者には周知のあらゆる手法あるいはプ
ロトコールによって接合させることができる。
染させるかあるいは移入させるために用いられる。これらの遺伝子及びベクター
はインビトロまたはインビボで作製され発現される。当業者は核酸発現を変化さ
せ制御する適切な表現型が本発明のベクター内の遺伝子と核酸（例えば、プロモ
ーター、エンハンサー等）の発現もしくは活性を調節することによって得られる
ということを理解するであろう。発現あるいは活性の増大または減少について記
したよく知られたあらゆる方法を用いることが可能である。本発明は、科学的文
献及び特許文献に詳しく述べられた、当業者には周知のあらゆる手法あるいはプ
ロトコールによって接合させることができる。
【０１１６】
他方、これらの核酸は、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂａｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４７： ４１１−１８ （１
９８２）；Ａｄａｍｓ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５： ６６１（１９８
３）；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３４
４０−３４４４（１９９７）；Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｍｅｄ．，１９：３７３−３８０（１９９５）；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７８８６−７８９６（１９９４）；Ｎａｒａｎｇ，
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ，Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９（１９７９）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｔｅｔｒ
ａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９（１９８１）；米国特許４，４５８，０６６に
記載されているように、よく知られた化学的合成法によってインビトロで合成で
きる。２本鎖ＤＮＡフラグメントは、その後適当な条件下で相補的ストランドを
合成することによってまたストランドを共にアニールすることにより、あるいは
適当なプライマー配列をもったＤＮＡポリメラーゼを用いて相補的ストランドを
加えることによって得られる可能性がある。
ａｒｂａｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４７： ４１１−１８ （１
９８２）；Ａｄａｍｓ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５： ６６１（１９８
３）；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３４
４０−３４４４（１９９７）；Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｍｅｄ．，１９：３７３−３８０（１９９５）；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７８８６−７８９６（１９９４）；Ｎａｒａｎｇ，
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ，Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９（１９７９）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｔｅｔｒ
ａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９（１９８１）；米国特許４，４５８，０６６に
記載されているように、よく知られた化学的合成法によってインビトロで合成で
きる。２本鎖ＤＮＡフラグメントは、その後適当な条件下で相補的ストランドを
合成することによってまたストランドを共にアニールすることにより、あるいは
適当なプライマー配列をもったＤＮＡポリメラーゼを用いて相補的ストランドを
加えることによって得られる可能性がある。
【０１１７】
核酸の操作法は、例えば配列における突然変異発生、サブクローニング、プロ
ーブの標識、シークエンシング、ハイブリダイゼーション等のための核酸操作法
が科学的文献及び特許文献に詳しく記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．
，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（
１９９７）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を
参照。
ーブの標識、シークエンシング、ハイブリダイゼーション等のための核酸操作法
が科学的文献及び特許文献に詳しく記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．
，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（
１９９７）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を
参照。
【０１１８】
核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチド等は当業者には周知の多数の一般的
な方法のいずれかによって分析し定量することができる。これらには、ＮＭＲの
ような生物化学的分析法、分光光度法、Ｘ線撮影法、電気泳動法、毛細管電気泳
動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）、高速拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば液体または
ゲル沈降反応、免疫拡散、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）
、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫蛍光アッセイ、サザン解析法、ノ
ーザン解析、ドットブロット法、ゲル電気泳動法（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法））、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、
他の核酸法または標的法またはシグナル増幅法、放射能標識、シンチレーション
計数、及び親和性クロマトグラフィーが含まれる。
な方法のいずれかによって分析し定量することができる。これらには、ＮＭＲの
ような生物化学的分析法、分光光度法、Ｘ線撮影法、電気泳動法、毛細管電気泳
動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）、高速拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば液体または
ゲル沈降反応、免疫拡散、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）
、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫蛍光アッセイ、サザン解析法、ノ
ーザン解析、ドットブロット法、ゲル電気泳動法（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法））、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、
他の核酸法または標的法またはシグナル増幅法、放射能標識、シンチレーション
計数、及び親和性クロマトグラフィーが含まれる。
【０１１９】
オリゴヌクレオチドプライマーはＴ２Ｒリガンド結合領域をコードする核酸を
増幅するために用いる。この文書の中に記載した核酸はまたクローン化し増幅法
を用いて定量的に測定できる。増幅法は当業者にはよく知られ、例えばポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ ｅｄ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｎｉｓ ｅｄ．，Ｐ
ＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．
Ｙ．（１９９５））；リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４
：５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７
７（１９８８）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０））
；転写増幅（Ｋｗｏｈ，ＰＮＡＳ，８６：１１７３（１９８９））；自動継続配
列複写（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ＰＮＡＳ，８７：１８７４（１９９０））；Ｑベ
ータ複写増幅（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：１４
７７−９１（１９９７））；自動Ｑベータ複写増幅アッセイ（Ｂｕｒｇ，Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１０：２５７−７１（１９９６））；及び他のＲＮ
Ａポリメラーゼ媒介法（例えば、ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓ
ａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）が含まれる。またＢｅｒｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：３０７−１６（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ａ
ｕｓｕｂｅｌ；米国特許４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２；Ｓｏｏｋ
ｎａｎａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３−６４（１９９５）を
参照。
増幅するために用いる。この文書の中に記載した核酸はまたクローン化し増幅法
を用いて定量的に測定できる。増幅法は当業者にはよく知られ、例えばポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ ｅｄ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｉｎｎｉｓ ｅｄ．，Ｐ
ＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．
Ｙ．（１９９５））；リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４
：５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７
７（１９８８）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０））
；転写増幅（Ｋｗｏｈ，ＰＮＡＳ，８６：１１７３（１９８９））；自動継続配
列複写（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ＰＮＡＳ，８７：１８７４（１９９０））；Ｑベ
ータ複写増幅（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：１４
７７−９１（１９９７））；自動Ｑベータ複写増幅アッセイ（Ｂｕｒｇ，Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１０：２５７−７１（１９９６））；及び他のＲＮ
Ａポリメラーゼ媒介法（例えば、ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓ
ａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）が含まれる。またＢｅｒｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：３０７−１６（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ａ
ｕｓｕｂｅｌ；米国特許４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２；Ｓｏｏｋ
ｎａｎａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３−６４（１９９５）を
参照。
【０１２０】
核酸は増幅すると個々にもしくはライブラリーとして当業者には周知の方法に
より、必要に応じて通常の分子生物学的方法を用いて異なるベクターのいずれか
にクローン化される。増幅された核酸をインビトロでクローニングする方法につ
いて例えば米国特許５，４２６，０３９に記載されている。増幅された配列のク
ローニングを促進するために、制限酵素部位をＰＣＲプライマー対に「組み込む
」ことができる。例えば、ＰｓｔＩ及びＢｓｐ Ｅ１部位は本発明の代表的なプ
ライマー対の中に設計された。これらの個々の制限部位は連結の際スライスされ
る７−メンブラン受容体「ドナー」コード配列に関して「骨組みのできた」状態
である（リガンド結合領域コード配列は７−メンブランポリペプチドの内部に存
在する。したがって構造物が制限酵素スライス部位の翻訳された下流領域である
ことが望ましい場合、骨組み外で得られた結果は除外されなければならない。挿
入したリガンド結合領域がトランスメンブランＶＩＩ領域のかなり大部分から成
る場合、このことは必要ではない。プライマーは「ドナー」７メンブラン受容体
の最初の配列を維持するよう設計することが可能である。他方、プライマーは保
存的置換（例えば疎水性残基に対する疎水性、上記の考察を参照）もしくは機能
的に良性の置換（例えば細胞膜挿入を妨げない、ペプチダーゼによって切断を引
き起こす、受容体の異常な折りたたみを引き起こす等）であるアミノ酸残基をコ
ードできる。
より、必要に応じて通常の分子生物学的方法を用いて異なるベクターのいずれか
にクローン化される。増幅された核酸をインビトロでクローニングする方法につ
いて例えば米国特許５，４２６，０３９に記載されている。増幅された配列のク
ローニングを促進するために、制限酵素部位をＰＣＲプライマー対に「組み込む
」ことができる。例えば、ＰｓｔＩ及びＢｓｐ Ｅ１部位は本発明の代表的なプ
ライマー対の中に設計された。これらの個々の制限部位は連結の際スライスされ
る７−メンブラン受容体「ドナー」コード配列に関して「骨組みのできた」状態
である（リガンド結合領域コード配列は７−メンブランポリペプチドの内部に存
在する。したがって構造物が制限酵素スライス部位の翻訳された下流領域である
ことが望ましい場合、骨組み外で得られた結果は除外されなければならない。挿
入したリガンド結合領域がトランスメンブランＶＩＩ領域のかなり大部分から成
る場合、このことは必要ではない。プライマーは「ドナー」７メンブラン受容体
の最初の配列を維持するよう設計することが可能である。他方、プライマーは保
存的置換（例えば疎水性残基に対する疎水性、上記の考察を参照）もしくは機能
的に良性の置換（例えば細胞膜挿入を妨げない、ペプチダーゼによって切断を引
き起こす、受容体の異常な折りたたみを引き起こす等）であるアミノ酸残基をコ
ードできる。
【０１２１】
プライマー対はＴ２Ｒタンパク質のリガンド結合領域を選択的に増幅するよう
設計される可能性がある。これらの結合領域は別々のリガンドに対して異なるで
あろう；したがって、一つのリガンドに対して最小の結合であるものは第二の可
能性のあるリガンドに対して過度に制限的である可能性がある。このことから、
別々のドメイン構造から成る別々の大きさの結合領域は増幅されるであろう；例
えば７−膜貫通Ｔ２Ｒの膜貫通（ＴＭ）ドメインＩＩからＶＩＩ、ＩＩＩからＶ
ＩＩ、ＩＩＩからＶＩもしくはＩＩからＶＩまたはその変形（例えば、個々のド
メインの部分配列、ドメインの順序の混合等）である。
設計される可能性がある。これらの結合領域は別々のリガンドに対して異なるで
あろう；したがって、一つのリガンドに対して最小の結合であるものは第二の可
能性のあるリガンドに対して過度に制限的である可能性がある。このことから、
別々のドメイン構造から成る別々の大きさの結合領域は増幅されるであろう；例
えば７−膜貫通Ｔ２Ｒの膜貫通（ＴＭ）ドメインＩＩからＶＩＩ、ＩＩＩからＶ
ＩＩ、ＩＩＩからＶＩもしくはＩＩからＶＩまたはその変形（例えば、個々のド
メインの部分配列、ドメインの順序の混合等）である。
【０１２２】
多くの７−メンブランＴ２Ｒタンパク質のドメイン構造と配列が知られている
ため、当業者には縮重増幅プライマー対を設計するためのモデル配列として、フ
ランキング領域及び内部ドメイン配列を容易に選択することが可能である。例え
ば、ドメイン領域ＩＩからＶＩＩをコードする核酸配列はプライマー対を用いた
ＰＣＲ増幅によって生成できる。膜貫通ドメインＩ（ＴＭ Ｉ）配列から成る核
酸を増幅するために、縮重プライマーを上記のＴ２Ｒファミリー共通配列のアミ
ノ酸配列をコードする核酸から設計することが可能である。このような縮重プラ
イマーはＴＭ ＩからＴＭ ＩＩＩ、ＴＭ ＩからＴＭ ＩＶ、ＴＭ ＩからＴ
Ｍ Ｖ、ＴＭ ＩからＴＭ ＶＩあるいはＴＭ ＩからＴＭ ＶＩＩを組み込む
結合領域を生成するために用いる。他の縮重プライマーはこの文書の中に記載さ
れた他のＴ２Ｒファミリー共通配列に基づいて設計できる。このような縮重プラ
イマーはＴＭ ＩＩＩからＴＭ ＩＶ、ＴＭ ＩＩＩからＴＭ Ｖ、ＴＭ ＩＩ
ＩからＴＭ ＶＩ、もしくはＴＭ ＩＩＩからＴＭ ＶＩＩを組み込む結合領域
を生成するために用いることが可能である。
ため、当業者には縮重増幅プライマー対を設計するためのモデル配列として、フ
ランキング領域及び内部ドメイン配列を容易に選択することが可能である。例え
ば、ドメイン領域ＩＩからＶＩＩをコードする核酸配列はプライマー対を用いた
ＰＣＲ増幅によって生成できる。膜貫通ドメインＩ（ＴＭ Ｉ）配列から成る核
酸を増幅するために、縮重プライマーを上記のＴ２Ｒファミリー共通配列のアミ
ノ酸配列をコードする核酸から設計することが可能である。このような縮重プラ
イマーはＴＭ ＩからＴＭ ＩＩＩ、ＴＭ ＩからＴＭ ＩＶ、ＴＭ ＩからＴ
Ｍ Ｖ、ＴＭ ＩからＴＭ ＶＩあるいはＴＭ ＩからＴＭ ＶＩＩを組み込む
結合領域を生成するために用いる。他の縮重プライマーはこの文書の中に記載さ
れた他のＴ２Ｒファミリー共通配列に基づいて設計できる。このような縮重プラ
イマーはＴＭ ＩＩＩからＴＭ ＩＶ、ＴＭ ＩＩＩからＴＭ Ｖ、ＴＭ ＩＩ
ＩからＴＭ ＶＩ、もしくはＴＭ ＩＩＩからＴＭ ＶＩＩを組み込む結合領域
を生成するために用いることが可能である。
【０１２３】
縮重プライマー対を設計するためのパラダイムは当業者にはよく知られている
。例えば、共通縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＯＤＥＨＯ
Ｐ）戦略コンピュータープログラムはｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ
．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌでアクセス可能であり、また周知の味覚受
容体リガンド結合領域のように、一連の関連タンパク質配列により開始するハイ
ブリッドプライマー予言に対するＢｌｏｃｋＭａｋｅｒの複数配列アラインメン
ト部位から直接連結される（例えば、Ｒｏｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，２６：１６２８−３５（１９９８）；Ｓｉｎｇｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ，２４：３１８−１９（１９９８））。
。例えば、共通縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＯＤＥＨＯ
Ｐ）戦略コンピュータープログラムはｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ
．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌでアクセス可能であり、また周知の味覚受
容体リガンド結合領域のように、一連の関連タンパク質配列により開始するハイ
ブリッドプライマー予言に対するＢｌｏｃｋＭａｋｅｒの複数配列アラインメン
ト部位から直接連結される（例えば、Ｒｏｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，２６：１６２８−３５（１９９８）；Ｓｉｎｇｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ，２４：３１８−１９（１９９８））。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドプライマーを合成する方法は当業者にはよく知られている
。「天然の」塩基対あるいは合成の塩基対を用いることが可能である。例えば、
人工の核酸塩基を利用することによりプライマー配列を操作し増幅生成物のより
多くの複合混合物を生成する回転性の手法が示される。人工ヌクレオチドの異な
るファミリーは縮重分子認識の方法を提供する内部結合回転により複数の水素結
合配向を呈することができる。これらの類似体をＰＣＲプライマーの単一の位置
に組み込むことにより増幅による生成物の複合ライブラリーを作製することがで
きる。例えば、Ｈｏｏｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：４
８６６−７１（１９９７）を参照。無極性分子はまた天然のＤＮＡ塩基の形態を
模倣するために用いることが可能である。アデニンの非水素結合形の模倣により
チミンの非極性形の模倣と対照的に効果的にまた選択的に複写できる（例えばＭ
ｏｒａｌｅｓ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５：９５０−５４（１９９
８）を参照）。例えば、二つの縮重塩基はピリミジン塩基６Ｈ，８Ｈ−３，４−
ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オンあるいはプリ
ン塩基Ｎ６−メトキン−２，６−ジアミノプリンである（Ｈｉｌｌ，ＰＮＡＳ，
９５：４２５８−６３（１９９８）を参照）。本発明の代表的な縮重プライマー
は核酸塩基類似体５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシ
−シチジン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−
ホスホラミダイトを組み込む（配列の中の「Ｐ」という用語は上記を参照）。こ
のピリミジン類似体はＡとＧ残基を含むプリンと水素結合する。
。「天然の」塩基対あるいは合成の塩基対を用いることが可能である。例えば、
人工の核酸塩基を利用することによりプライマー配列を操作し増幅生成物のより
多くの複合混合物を生成する回転性の手法が示される。人工ヌクレオチドの異な
るファミリーは縮重分子認識の方法を提供する内部結合回転により複数の水素結
合配向を呈することができる。これらの類似体をＰＣＲプライマーの単一の位置
に組み込むことにより増幅による生成物の複合ライブラリーを作製することがで
きる。例えば、Ｈｏｏｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：４
８６６−７１（１９９７）を参照。無極性分子はまた天然のＤＮＡ塩基の形態を
模倣するために用いることが可能である。アデニンの非水素結合形の模倣により
チミンの非極性形の模倣と対照的に効果的にまた選択的に複写できる（例えばＭ
ｏｒａｌｅｓ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５：９５０−５４（１９９
８）を参照）。例えば、二つの縮重塩基はピリミジン塩基６Ｈ，８Ｈ−３，４−
ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オンあるいはプリ
ン塩基Ｎ６−メトキン−２，６−ジアミノプリンである（Ｈｉｌｌ，ＰＮＡＳ，
９５：４２５８−６３（１９９８）を参照）。本発明の代表的な縮重プライマー
は核酸塩基類似体５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシ
−シチジン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−
ホスホラミダイトを組み込む（配列の中の「Ｐ」という用語は上記を参照）。こ
のピリミジン類似体はＡとＧ残基を含むプリンと水素結合する。
【０１２５】
この文書の中で開示した味覚受容体にかなり一致する多型変異体、対立遺伝子
、及び生物種間の同族体が上記の核酸プローブを用いて分離できる。他方、発現
ライブラリーはＴ２Ｒポリペプチドをクローン化するために用いられる。また多
型変異体、対立遺伝子、及びその種間同族体は、Ｔ２Ｒ同族体を認識し選択的に
結合するＴ２Ｒポリペプチドと対照的に作製された抗血清もしくは精製された抗
体を免疫学的に備える同族体を発現した。
、及び生物種間の同族体が上記の核酸プローブを用いて分離できる。他方、発現
ライブラリーはＴ２Ｒポリペプチドをクローン化するために用いられる。また多
型変異体、対立遺伝子、及びその種間同族体は、Ｔ２Ｒ同族体を認識し選択的に
結合するＴ２Ｒポリペプチドと対照的に作製された抗血清もしくは精製された抗
体を免疫学的に備える同族体を発現した。
【０１２６】
味覚受容体のリガンド結合領域をコードする核酸は適切な（完全または縮重）
プライマー対を用いて適切な核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲ）によって生成さ
れる。増幅された核酸はあらゆる細胞または組織由来のゲノムＤＮＡもしくは味
覚受容体由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである可能性がある。
プライマー対を用いて適切な核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲ）によって生成さ
れる。増幅された核酸はあらゆる細胞または組織由来のゲノムＤＮＡもしくは味
覚受容体由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである可能性がある。
【０１２７】
一つの態様として、トランスロケーション配列に融合されたＴ２Ｒｓをコード
する核酸から成るハイブリッドタンパク質コーディング配列が構築される可能性
がある。ただしそれは化学感覚の受容体、とりわけ味覚受容体の他のファミリー
のトランスロケーションモチーフ及び呈味物質結合領域から成るハイブリッドＴ
２Ｒｓである。これらの核酸配列は転写あるいは翻訳制御エレメントに作動でき
るように連結することが可能である。例えば転写と翻訳開始配列、プロモーター
とエンハンサー、転写と翻訳ターミネーター、ポリアデニル化配列、及びＲＮＡ
へのＤＮＡの転写に有用な他の配列である。組換え発現カセット、ベクター、及
び形質転換の構築には、プロモーターフラグメントがすべての適切な細胞または
組織に適切な核酸を直接発現させるために利用が可能である。
する核酸から成るハイブリッドタンパク質コーディング配列が構築される可能性
がある。ただしそれは化学感覚の受容体、とりわけ味覚受容体の他のファミリー
のトランスロケーションモチーフ及び呈味物質結合領域から成るハイブリッドＴ
２Ｒｓである。これらの核酸配列は転写あるいは翻訳制御エレメントに作動でき
るように連結することが可能である。例えば転写と翻訳開始配列、プロモーター
とエンハンサー、転写と翻訳ターミネーター、ポリアデニル化配列、及びＲＮＡ
へのＤＮＡの転写に有用な他の配列である。組換え発現カセット、ベクター、及
び形質転換の構築には、プロモーターフラグメントがすべての適切な細胞または
組織に適切な核酸を直接発現させるために利用が可能である。
【０１２８】
他の態様として、融合タンパク質にはＣ末端あるいはＮ末端トランスロケーシ
ョン配列が含まれる。さらに、融合タンパク質は他のエレメント、例えばタンパ
ク質の検出、精製、もしくは他の応用のためのエレメントから成る可能性がある
。検出と精製を促進するドメインには、例えばポリヒスチジン領域のような金属
キレートペプチド、ヒスチジン−トリプトファンモジュール、あるいは固定化さ
れた金属上で精製を可能にする他のドメイン；マルトース結合タンパク質；固定
化された免疫グロブリン上で精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、もしくは
ＦＬＡＧＳ拡張／親和性精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ，シアトル、
ワシントン州）が含まれる。
ョン配列が含まれる。さらに、融合タンパク質は他のエレメント、例えばタンパ
ク質の検出、精製、もしくは他の応用のためのエレメントから成る可能性がある
。検出と精製を促進するドメインには、例えばポリヒスチジン領域のような金属
キレートペプチド、ヒスチジン−トリプトファンモジュール、あるいは固定化さ
れた金属上で精製を可能にする他のドメイン；マルトース結合タンパク質；固定
化された免疫グロブリン上で精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、もしくは
ＦＬＡＧＳ拡張／親和性精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ，シアトル、
ワシントン州）が含まれる。
【０１２９】
トランスロケーションドメイン（効率のよい原形質膜発現）と新規に翻訳され
たポリペプチドの残余の間のＦａｃｔｏｒ Ｘａ（例えば、Ｏｔｔａｖｉ，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍｉｅ，８０：２８９−９３（１９９８）を参照）、スブチリシンプロ
テアーゼ認識モチーフ（例えば、Ｐｏｌｙａｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１
０：６１５−１９（１９９７）を参照）、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，サンジエゴ、カリフォルニア州）等のような切断できるリンカー配列を含
むことが精製を促進するために役立つであろう。例えば、一つの構造には６個の
ヒスチジン残基に連結した核酸配列をコードするポリペプチドが含まれ、チオレ
ドキシン、エンテロキナーゼ切断部位（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１７８７−９７（１９９５）参照）、及びＣ末端トラン
スロケーションドメインがそれに続く。エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパ
ク質の残余から適切なタンパク質を精製する方法を提供するが、ヒスチジン残基
は検出と精製を促進する。融合タンパク質をコードするベクターに関連する方法
は科学的文献及び特許文献に詳しく述べられている（例えば、Ｋｒｏｌｌ，ＤＮ
Ａ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：４４１−５３（１９９３）を参照）。
たポリペプチドの残余の間のＦａｃｔｏｒ Ｘａ（例えば、Ｏｔｔａｖｉ，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍｉｅ，８０：２８９−９３（１９９８）を参照）、スブチリシンプロ
テアーゼ認識モチーフ（例えば、Ｐｏｌｙａｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１
０：６１５−１９（１９９７）を参照）、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，サンジエゴ、カリフォルニア州）等のような切断できるリンカー配列を含
むことが精製を促進するために役立つであろう。例えば、一つの構造には６個の
ヒスチジン残基に連結した核酸配列をコードするポリペプチドが含まれ、チオレ
ドキシン、エンテロキナーゼ切断部位（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１７８７−９７（１９９５）参照）、及びＣ末端トラン
スロケーションドメインがそれに続く。エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパ
ク質の残余から適切なタンパク質を精製する方法を提供するが、ヒスチジン残基
は検出と精製を促進する。融合タンパク質をコードするベクターに関連する方法
は科学的文献及び特許文献に詳しく述べられている（例えば、Ｋｒｏｌｌ，ＤＮ
Ａ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：４４１−５３（１９９３）を参照）。
【０１３０】
個々の発現ベクターとしてあるいは発現ベクターのライブラリーとして、配列
をコードするリガンド結合領域から成る発現ベクターはゲノム内にあるいは細胞
の細胞質または核内に導入され、あるいは科学的文献及び特許文献に詳しく述べ
られている異なった従来の方法によって導入される可能性がある。Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｂｅｒｇｅｒ（前記）；Ｓｃ
ｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，６４３５：１０（
１９９５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ；Ａｕｓｕｂｅｌを参照。生物
学的試薬と実験用装置の製造業者からの製品情報も周知の生物学的手法に関する
情報を提供する。ベクターは天然の発生源から分離され、ＡＴＣＣもしくはＧｅ
ｎＢａｎｋライブラリーのような発生源から得られ、あるいは合成または組換え
法によって調製される。
をコードするリガンド結合領域から成る発現ベクターはゲノム内にあるいは細胞
の細胞質または核内に導入され、あるいは科学的文献及び特許文献に詳しく述べ
られている異なった従来の方法によって導入される可能性がある。Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｂｅｒｇｅｒ（前記）；Ｓｃ
ｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，６４３５：１０（
１９９５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ；Ａｕｓｕｂｅｌを参照。生物
学的試薬と実験用装置の製造業者からの製品情報も周知の生物学的手法に関する
情報を提供する。ベクターは天然の発生源から分離され、ＡＴＣＣもしくはＧｅ
ｎＢａｎｋライブラリーのような発生源から得られ、あるいは合成または組換え
法によって調製される。
【０１３１】
核酸は細胞内で安定してまたは一過性に発現する発現カセット、ベクターある
いはウイルス内で発現することができる（例えば、エピソーム発現システム）。
選択マーカーは形質転換された細胞と配列上に選択できる表現型を与えるために
発現カセット及びベクター内に組み込まれることが可能である。例えば、選択マ
ーカーは宿主ゲノムへ組み込むことを必要としないように、エピソームの維持と
複写のためにコードすることが可能である。例えば、適切なＤＮＡ配列により形
質転換した細胞を選択できるようにするために、マーカーは抗生物質耐性（例え
ば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロ
マイシン）、あるいは除草剤耐性（例えば、クロスルフロンまたはＢａｓｔａ）
をコードする可能性がある（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｇ
ｅｎｅ，１９０：３１５−１７（１９９７）；Ａｕｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８１：９９２−９７（１９９７）参照）。
ネオマイシンあるいはヒグロマイシンのような基質に耐性を与える選択できるマ
ーカー遺伝子は組織培養でのみ利用できるため、化学的耐性遺伝子はまたインビ
トロ及びインビボにおいて選択できるマーカーとして用いられる。
いはウイルス内で発現することができる（例えば、エピソーム発現システム）。
選択マーカーは形質転換された細胞と配列上に選択できる表現型を与えるために
発現カセット及びベクター内に組み込まれることが可能である。例えば、選択マ
ーカーは宿主ゲノムへ組み込むことを必要としないように、エピソームの維持と
複写のためにコードすることが可能である。例えば、適切なＤＮＡ配列により形
質転換した細胞を選択できるようにするために、マーカーは抗生物質耐性（例え
ば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロ
マイシン）、あるいは除草剤耐性（例えば、クロスルフロンまたはＢａｓｔａ）
をコードする可能性がある（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｇ
ｅｎｅ，１９０：３１５−１７（１９９７）；Ａｕｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８１：９９２−９７（１９９７）参照）。
ネオマイシンあるいはヒグロマイシンのような基質に耐性を与える選択できるマ
ーカー遺伝子は組織培養でのみ利用できるため、化学的耐性遺伝子はまたインビ
トロ及びインビボにおいて選択できるマーカーとして用いられる。
【０１３２】
キメラ核酸配列はあらゆる７−膜貫通ポリペプチド内のＴ２Ｒリガンド結合領
域をコードする可能性がある。７−膜貫通受容体ポリペプチドは同様の主な配列
及び二次構造と三次構造をもつことから、構造的ドメイン（例えば、細胞外ドメ
イン、ＴＭドメイン、細胞質ドメイン等）は配列解析により容易に確認できる。
例えば、相同性モデリングであるフーリエ解析及びラセン周期性検出法は７トラ
ンスメンブラン受容体配列をもつ７個のドメインを確認できまた特徴づけられる
。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）アルゴリズムは解析された配列の疎水性及び変異
性を特徴とする優性期間を評価するために用いることが可能である。周期性検出
の増強及びαらせん周期性指標は、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉ．，２：５５−７０（１９９３）に従って実施が可能である。他のアラ
インメント及びモデリングアルゴリズムは当業者にはよく知られている（例えば
、Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，４：１６１−６４
（１９９６）；Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｄ．Ｂｉｏｌ．，１
５７：１０５−３２（１９８２）；Ｃｒｏｎｅｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，
６：５９−６４（１９９３）；ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｗｅｉｚｍａｎ
ｎ．ａｃ．ｉｌ／を参照）。
域をコードする可能性がある。７−膜貫通受容体ポリペプチドは同様の主な配列
及び二次構造と三次構造をもつことから、構造的ドメイン（例えば、細胞外ドメ
イン、ＴＭドメイン、細胞質ドメイン等）は配列解析により容易に確認できる。
例えば、相同性モデリングであるフーリエ解析及びラセン周期性検出法は７トラ
ンスメンブラン受容体配列をもつ７個のドメインを確認できまた特徴づけられる
。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）アルゴリズムは解析された配列の疎水性及び変異
性を特徴とする優性期間を評価するために用いることが可能である。周期性検出
の増強及びαらせん周期性指標は、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉ．，２：５５−７０（１９９３）に従って実施が可能である。他のアラ
インメント及びモデリングアルゴリズムは当業者にはよく知られている（例えば
、Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，４：１６１−６４
（１９９６）；Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｄ．Ｂｉｏｌ．，１
５７：１０５−３２（１９８２）；Ｃｒｏｎｅｔ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，
６：５９−６４（１９９３）；ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｗｅｉｚｍａｎ
ｎ．ａｃ．ｉｌ／を参照）。
【０１３３】
また本発明には明記された核酸及びアミノ酸配列をもつ核酸分子とポリペプチ
ドだけでなく、それらのフラグメントも含まれる。特に、例えば１０、２０、３
０、５０、７０、１００、または１５０個以上のアミノ酸のポリペプチドフラグ
メントだけでなく、例えば４０、６０、８０、１００、１５０、２００、または
２５０個以上のヌクレオチドのフラグメントも含まれる。任意に、核酸フラグメ
ントはＴ２Ｒファミリーメンバーにと対照的に増大した抗体に結合できる抗原性
ポリペプチドをコードすることが可能である。さらに、本発明のタンパク質フラ
グメントは任意にＴ２Ｒファミリーメンバーと対照的に増大した抗体に結合でき
る抗原性フラグメントである。
ドだけでなく、それらのフラグメントも含まれる。特に、例えば１０、２０、３
０、５０、７０、１００、または１５０個以上のアミノ酸のポリペプチドフラグ
メントだけでなく、例えば４０、６０、８０、１００、１５０、２００、または
２５０個以上のヌクレオチドのフラグメントも含まれる。任意に、核酸フラグメ
ントはＴ２Ｒファミリーメンバーにと対照的に増大した抗体に結合できる抗原性
ポリペプチドをコードすることが可能である。さらに、本発明のタンパク質フラ
グメントは任意にＴ２Ｒファミリーメンバーと対照的に増大した抗体に結合でき
る抗原性フラグメントである。
【０１３４】
また意図されたものは、少なくとも１０、２０、３０、５０、７０、１００、
または１５０個以上のアミノ酸から成る、この文書の中に記載したＴ２Ｒポリペ
プチドのうち少なくとも一つの、他のＧＰＣＲのすべてあるいは一部分を代表す
る他のアミノ酸に連結した、好ましくは７膜貫通スーパーファミリーのメンバー
であるキメラタンパク質である。これらのキメラは即席の受容体及び他のＧＰＣ
Ｒから作製され、あるいは本発明の受容体の二つ以上の組み合わせによって作製
することが可能である。一つの態様として、キメラの一部分は本発明のＴ２Ｒポ
リペプチドの膜貫通領域に一致するか、もしくはそれ由来である。他の態様とし
て、キメラの一部分はこの文書の中に記載したＴ２Ｒポリペプチドの一つ以上の
膜貫通領域に一致するか、もしくはそれ由来であり、残りの一部分または複数部
分は他のＧＰＣＲ由来である可能性がある。キメラ受容体は当業者にはよく知ら
れており、またそれらの作製法とその中に組み込まれたＧタンパク質共役受容体
のドメインあるいはフラグメントの選択と境界もよく知られている。したがって
、このことについての当業者の知識はキメラ受容体を作製するために容易に利用
できる。このようなキメラ受容体の利用により、例えば、上記の検定システムに
用いられた周知の受容体のような他の受容体シグナル形質導入の特徴と共役した
、この文書の中に個々に開示した一つの受容体の味覚選択性を特徴づけることが
できる。
または１５０個以上のアミノ酸から成る、この文書の中に記載したＴ２Ｒポリペ
プチドのうち少なくとも一つの、他のＧＰＣＲのすべてあるいは一部分を代表す
る他のアミノ酸に連結した、好ましくは７膜貫通スーパーファミリーのメンバー
であるキメラタンパク質である。これらのキメラは即席の受容体及び他のＧＰＣ
Ｒから作製され、あるいは本発明の受容体の二つ以上の組み合わせによって作製
することが可能である。一つの態様として、キメラの一部分は本発明のＴ２Ｒポ
リペプチドの膜貫通領域に一致するか、もしくはそれ由来である。他の態様とし
て、キメラの一部分はこの文書の中に記載したＴ２Ｒポリペプチドの一つ以上の
膜貫通領域に一致するか、もしくはそれ由来であり、残りの一部分または複数部
分は他のＧＰＣＲ由来である可能性がある。キメラ受容体は当業者にはよく知ら
れており、またそれらの作製法とその中に組み込まれたＧタンパク質共役受容体
のドメインあるいはフラグメントの選択と境界もよく知られている。したがって
、このことについての当業者の知識はキメラ受容体を作製するために容易に利用
できる。このようなキメラ受容体の利用により、例えば、上記の検定システムに
用いられた周知の受容体のような他の受容体シグナル形質導入の特徴と共役した
、この文書の中に個々に開示した一つの受容体の味覚選択性を特徴づけることが
できる。
【０１３５】
例えば、リガンド結合領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイ
ン、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、あるいはそれらの組み合わせは非相同タ
ンパク質に共有結合することができる。例として、Ｔ２Ｒ膜貫通領域は非相同Ｇ
ＰＣＲ膜貫通ドメインに連結が可能で、あるいは非相同ＧＰＣＲ細胞外ドメイン
はＴ２Ｒ膜貫通領域に連結が可能である。一般に好まれる他の非相同タンパク質
には、例えば緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトース、グルタミン酸受容体、及
びロドプシン（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）Ｎ末端が含まれる。
ン、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、あるいはそれらの組み合わせは非相同タ
ンパク質に共有結合することができる。例として、Ｔ２Ｒ膜貫通領域は非相同Ｇ
ＰＣＲ膜貫通ドメインに連結が可能で、あるいは非相同ＧＰＣＲ細胞外ドメイン
はＴ２Ｒ膜貫通領域に連結が可能である。一般に好まれる他の非相同タンパク質
には、例えば緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトース、グルタミン酸受容体、及
びロドプシン（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）Ｎ末端が含まれる。
【０１３６】
また本発明の範囲には、本発明のＴ２Ｒｓ、フラグメント、または変異体を発
現するための宿主細胞が含まれる。本発明のＴ２Ｒ、フラグメント、または変異
体をコードするｃＤＮＡのようなクローン遺伝子あるいは核酸を高レベルに発現
させるために、当業者は代表的には直接転写、転写／翻訳ターミネーター、及び
タンパク質をコードする核酸に対する場合には翻訳開始のリボゾーム結合部位に
対する強力なプロモーターを含む発現ベクターに興味深い核酸配列をサブクロー
ン化する。適切な細菌プロモーターは当業者には周知で、例えばＳａｍｂｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．に記載されている。しかしながら、細菌もしくは真核生物の発現
システムを利用することができる。
現するための宿主細胞が含まれる。本発明のＴ２Ｒ、フラグメント、または変異
体をコードするｃＤＮＡのようなクローン遺伝子あるいは核酸を高レベルに発現
させるために、当業者は代表的には直接転写、転写／翻訳ターミネーター、及び
タンパク質をコードする核酸に対する場合には翻訳開始のリボゾーム結合部位に
対する強力なプロモーターを含む発現ベクターに興味深い核酸配列をサブクロー
ン化する。適切な細菌プロモーターは当業者には周知で、例えばＳａｍｂｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．に記載されている。しかしながら、細菌もしくは真核生物の発現
システムを利用することができる。
【０１３７】
宿主細胞内に異質のヌクレオチド配列を導入するよく知られたあらゆる手順を
用いるであろう。これらにはリン酸カルシウム移入、ポリブレン、プロトプラス
ト融合、電気穿孔法、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクタ
ー、ウイルスベクター及び宿主細胞内にクローンゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成
ＤＮＡまたは他の異質の遺伝子物質を導入する他の周知の方法が含まれる（例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．参照）。ただ用いられる遺伝子工学の手順
により興味深いＴ２Ｒ、フラグメント、もしくは変異体の発現により可能な宿主
内に少なくとも一つの核酸分子をうまく導入することができるということが必要
である。
用いるであろう。これらにはリン酸カルシウム移入、ポリブレン、プロトプラス
ト融合、電気穿孔法、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクタ
ー、ウイルスベクター及び宿主細胞内にクローンゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成
ＤＮＡまたは他の異質の遺伝子物質を導入する他の周知の方法が含まれる（例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．参照）。ただ用いられる遺伝子工学の手順
により興味深いＴ２Ｒ、フラグメント、もしくは変異体の発現により可能な宿主
内に少なくとも一つの核酸分子をうまく導入することができるということが必要
である。
【０１３８】
発現ベクターが細胞内に導入された後、移入された細胞は興味深い受容体、フ
ラグメント、あるいは変異体の発現を助ける条件下で培養され、その後標準的な
手法を用いて培養から再生する。このような手法は当業者にはよく知られている
。例えば、この開示に一致する方法で参考文献に組み入れられているＷＯ ００
／０６５９３を参照。
ラグメント、あるいは変異体の発現を助ける条件下で培養され、その後標準的な
手法を用いて培養から再生する。このような手法は当業者にはよく知られている
。例えば、この開示に一致する方法で参考文献に組み入れられているＷＯ ００
／０６５９３を参照。
【０１３９】
Ｄ．Ｔ２Ｒｓの免疫学的検出法
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いたＴ２Ｒ遺伝子の検出と遺伝子発現に
加えて、Ｔ２Ｒｓを検出するために、例えば味覚受容体細胞及びＴ２Ｒファミリ
ーメンバーの変異体を確認するために免疫アッセイが用いられる。免疫アッセイ
はＴ２Ｒｓを定性的にあるいは定量的に解析するために利用される。応用できる
方法の全般的な概要はＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）に記載されている。
加えて、Ｔ２Ｒｓを検出するために、例えば味覚受容体細胞及びＴ２Ｒファミリ
ーメンバーの変異体を確認するために免疫アッセイが用いられる。免疫アッセイ
はＴ２Ｒｓを定性的にあるいは定量的に解析するために利用される。応用できる
方法の全般的な概要はＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）に記載されている。
【０１４０】
１．Ｔ２Ｒファミリーメンバーに対する抗体
Ｔ２Ｒファミリーメンバーに特異的に反応するポリクロナール及びモノクロナ
ール抗体を産生する手法は当業者にはよく知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａ
ｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９
９１）；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，ｓｕｐｒａ；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６）；及びＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）を参照）。このような方法
にはウサギあるいはマウスを免疫することによってポリクロナールとモノクロナ
ール抗体の調製だけでなく、ファージ内の組換え抗体または類似ベクターのライ
ブラリーから得られた抗体の選択による抗体調製が含まれる（例えば、Ｈｕｓｅ
ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９）；Ｗａｒ
ｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−４６（１９８９）参照）。
ール抗体を産生する手法は当業者にはよく知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａ
ｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９
９１）；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，ｓｕｐｒａ；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６）；及びＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）を参照）。このような方法
にはウサギあるいはマウスを免疫することによってポリクロナールとモノクロナ
ール抗体の調製だけでなく、ファージ内の組換え抗体または類似ベクターのライ
ブラリーから得られた抗体の選択による抗体調製が含まれる（例えば、Ｈｕｓｅ
ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９）；Ｗａｒ
ｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−４６（１９８９）参照）。
【０１４１】
免疫原から成る多数のＴ２ＲはＴ２Ｒファミリーメンバーと特異的に反応する
抗体を産生するために用いる。例えば、組換えＴ２Ｒタンパク質、もしくはその
抗原性フラグメントはこの文書の中に記載したように分離が可能である。適切な
抗原性領域には、例えばＴ２Ｒファミリーのメンバーを確認するために用いるこ
とができる上記に開示した共通配列が含まれる。組換えタンパク質は上記のよう
に真核細胞もしくは原核細胞内に発現し、当業者には周知のように精製すること
ができる。組換えタンパク質はモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体の
産生のための好ましい免疫原である。他方、この文書の中で開示された配列由来
の、キャリアタンパク質に抱合された合成ペプチドは免疫原として用いられる。
自然に発生したタンパク質はまた純粋な形であるいは不純な形で用いられる可能
性がある。その後生成物は抗体を産生できる動物に注射する。モノクロナール抗
体かポリクロナール抗体かのいずれかがタンパク質測定のための免疫アッセイに
おいて引き続き使用するために、生成する可能性がある。
抗体を産生するために用いる。例えば、組換えＴ２Ｒタンパク質、もしくはその
抗原性フラグメントはこの文書の中に記載したように分離が可能である。適切な
抗原性領域には、例えばＴ２Ｒファミリーのメンバーを確認するために用いるこ
とができる上記に開示した共通配列が含まれる。組換えタンパク質は上記のよう
に真核細胞もしくは原核細胞内に発現し、当業者には周知のように精製すること
ができる。組換えタンパク質はモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体の
産生のための好ましい免疫原である。他方、この文書の中で開示された配列由来
の、キャリアタンパク質に抱合された合成ペプチドは免疫原として用いられる。
自然に発生したタンパク質はまた純粋な形であるいは不純な形で用いられる可能
性がある。その後生成物は抗体を産生できる動物に注射する。モノクロナール抗
体かポリクロナール抗体かのいずれかがタンパク質測定のための免疫アッセイに
おいて引き続き使用するために、生成する可能性がある。
【０１４２】
さらに個々には、ポリクロナール抗体の産出法が当業者には知られている。例
えば、近交系のマウス（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）もしくはウサギがフロイ
ントアジュバントのような標準アジュバント及び標準免疫プロトコールを用いて
Ｔ２Ｒにより免疫される。免疫原調製に反応する動物の免疫はその後試験採血し
Ｔ２Ｒに対する反応性の力価を測定することによってモニターされる。免疫原に
対する抗体の高い力価が適切に得られる場合、血液を動物から収集し抗血清を調
製する。さらにＴ２Ｒポリペプチドに反応性のある抗体を豊富にするために、抗
血清の分画を必要に応じて作製する事が可能である（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎ
ｅ，前記、参照）。
えば、近交系のマウス（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）もしくはウサギがフロイ
ントアジュバントのような標準アジュバント及び標準免疫プロトコールを用いて
Ｔ２Ｒにより免疫される。免疫原調製に反応する動物の免疫はその後試験採血し
Ｔ２Ｒに対する反応性の力価を測定することによってモニターされる。免疫原に
対する抗体の高い力価が適切に得られる場合、血液を動物から収集し抗血清を調
製する。さらにＴ２Ｒポリペプチドに反応性のある抗体を豊富にするために、抗
血清の分画を必要に応じて作製する事が可能である（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎ
ｅ，前記、参照）。
【０１４３】
モノクロナール抗体は当業者にはよく知られた様々な技術によって得られる。
簡単に述べると、適切な抗原で免疫した動物から得られた脾臓の細胞を通常の方
法で骨髄腫細胞と融合することによって固定化する（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−１９（１９７６）参
照）。固定化の他の手法にはエプスタイン・バールウイルス、がん遺伝子、レト
ロウイルスによる形質転換、あるいは当業者によく知られた手法が含まれる。単
一の免疫された細胞から増殖したコロニーはその後抗原に対する適切な特異性と
親和性をもつ抗体の産生に対して選別される。そのような細胞によって産生した
モノクロナール抗体の産出量は脊椎動物の宿主の腹腔内への注射を含む様々な技
術によって増大する。他方、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６
：１２７５−８１（１９８９）によって略述された一般的なプロトコールに従っ
てヒトＢ細胞から得られた核酸ライブラリーを選別することによって、モノクロ
ナール抗体、またはその結合フラグメントをコードする核酸配列を分離する。
簡単に述べると、適切な抗原で免疫した動物から得られた脾臓の細胞を通常の方
法で骨髄腫細胞と融合することによって固定化する（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−１９（１９７６）参
照）。固定化の他の手法にはエプスタイン・バールウイルス、がん遺伝子、レト
ロウイルスによる形質転換、あるいは当業者によく知られた手法が含まれる。単
一の免疫された細胞から増殖したコロニーはその後抗原に対する適切な特異性と
親和性をもつ抗体の産生に対して選別される。そのような細胞によって産生した
モノクロナール抗体の産出量は脊椎動物の宿主の腹腔内への注射を含む様々な技
術によって増大する。他方、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６
：１２７５−８１（１９８９）によって略述された一般的なプロトコールに従っ
てヒトＢ細胞から得られた核酸ライブラリーを選別することによって、モノクロ
ナール抗体、またはその結合フラグメントをコードする核酸配列を分離する。
【０１４４】
モノクロナール抗体とポリクロナール血清は免疫アッセイ、例えば固体支持体
上で免疫された免疫原をもつ固相免疫アッセイの免疫タンパク質と対照的に全般
的に収集され、力価が測定される。代表的には、競合的結合免疫アッセイを用い
て、１０4以上の力価をもつポリクロナール抗血清が選択されまた非Ｔ２Ｒタン
パク質、もしくは他のＴ２Ｒファミリーメンバーまたは他の生物体由来である他
の関連タンパク質に対して交差反応性が測定される。個々のポリクロナール抗血
清及びモノクロナール抗体は通常少なくとも約０．１ｍＭのＫｄと、さらに通常
少なくとも約１ｐＭ以上、任意に少なくとも約０．１ｐＭ以上、また任意に０．
０１ｐＭ以上結合するであろう。
上で免疫された免疫原をもつ固相免疫アッセイの免疫タンパク質と対照的に全般
的に収集され、力価が測定される。代表的には、競合的結合免疫アッセイを用い
て、１０4以上の力価をもつポリクロナール抗血清が選択されまた非Ｔ２Ｒタン
パク質、もしくは他のＴ２Ｒファミリーメンバーまたは他の生物体由来である他
の関連タンパク質に対して交差反応性が測定される。個々のポリクロナール抗血
清及びモノクロナール抗体は通常少なくとも約０．１ｍＭのＫｄと、さらに通常
少なくとも約１ｐＭ以上、任意に少なくとも約０．１ｐＭ以上、また任意に０．
０１ｐＭ以上結合するであろう。
【０１４５】
Ｔ２Ｒファミリーメンバーの個々の抗体が利用できれば、個々のＴ２Ｒタンパ
ク質が異なる免疫アッセイによって検出できる。免疫学的手順及び免疫アッセイ
手順を検討するためには、Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ ｅｄｓ．，Ｂａｓｉｃ
ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（７ｔｈ ｅｄ．１９９１
）を参照。さらに、本発明の免疫アッセイはあらゆる別々の配列で実施すること
が可能で、Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（１
９８０）；及びＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（前記）で包括的に検討している。
ク質が異なる免疫アッセイによって検出できる。免疫学的手順及び免疫アッセイ
手順を検討するためには、Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ ｅｄｓ．，Ｂａｓｉｃ
ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（７ｔｈ ｅｄ．１９９１
）を参照。さらに、本発明の免疫アッセイはあらゆる別々の配列で実施すること
が可能で、Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（１
９８０）；及びＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（前記）で包括的に検討している。
【０１４６】
２．免疫学的結合アッセイ
Ｔ２Ｒタンパク質は多数のよく理解された免疫学的結合アッセイ（例えば、米
国特許４，３６６，２４１；４，３７６，１１０；４，５１７，２８８；及び４
，８３７，１６８を参照）のいずれかを用いて検出及び／もしくは定量できる。
全般的な免疫アッセイの検討には、Ａｓａｉ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３７（１９９３）；Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ，ｅｄ
ｓ．，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（７ｔｈ
ｅｄ．１９９１）を参照。免疫学的結合アッセイ（または免疫アッセイ）では
一般に好まれるタンパク質もしくは抗原に特異的に結合する抗体が用いられる（
この場合Ｔ２Ｒファミリーメンバーあるいはその抗原部分配列）抗体（例えば、
抗Ｔ２Ｒ）は上記のように当業者にはよく知られた多くの方法のいづれかにより
生成される。
国特許４，３６６，２４１；４，３７６，１１０；４，５１７，２８８；及び４
，８３７，１６８を参照）のいずれかを用いて検出及び／もしくは定量できる。
全般的な免疫アッセイの検討には、Ａｓａｉ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３７（１９９３）；Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ，ｅｄ
ｓ．，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（７ｔｈ
ｅｄ．１９９１）を参照。免疫学的結合アッセイ（または免疫アッセイ）では
一般に好まれるタンパク質もしくは抗原に特異的に結合する抗体が用いられる（
この場合Ｔ２Ｒファミリーメンバーあるいはその抗原部分配列）抗体（例えば、
抗Ｔ２Ｒ）は上記のように当業者にはよく知られた多くの方法のいづれかにより
生成される。
【０１４７】
免疫アッセイはまた多くの場合抗体及び抗原によって形成された複合体に特異
的に結合し標識するための標識物質を用いる。標識物質は抗体／抗原複合体から
成る部分の一つである可能性がある。したがって、標識物質は標識されたＴ２Ｒ
ポリペプチドもしくは標識された抗Ｔ２Ｒ抗体であろう。他方、標識物質は第三
の部分、例えば特異的に抗体／Ｔ２Ｒ複合体に結合する二次抗体である可能性が
ある（二次抗体は代表的には第一の抗体が得られる生物種の抗体に特異的である
）。タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇのような免疫グロブリン不変部領域に特
異的に結合できる他のタンパク質も標識物質として利用できる。これらのタンパ
ク質は異なった種由来の免疫グロブリン不変部領域と強い非免疫原反応性を示す
（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１
４０１−０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，１３５：２５８９−６４２（１９８５）参照）。ストレプトアビジン
のような標識物質は他の分子が特異的に結合できるビオチンのような検出可能な
部分により修飾が可能である。異なった検出可能な部分は当業者にはよく知られ
ている。
的に結合し標識するための標識物質を用いる。標識物質は抗体／抗原複合体から
成る部分の一つである可能性がある。したがって、標識物質は標識されたＴ２Ｒ
ポリペプチドもしくは標識された抗Ｔ２Ｒ抗体であろう。他方、標識物質は第三
の部分、例えば特異的に抗体／Ｔ２Ｒ複合体に結合する二次抗体である可能性が
ある（二次抗体は代表的には第一の抗体が得られる生物種の抗体に特異的である
）。タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇのような免疫グロブリン不変部領域に特
異的に結合できる他のタンパク質も標識物質として利用できる。これらのタンパ
ク質は異なった種由来の免疫グロブリン不変部領域と強い非免疫原反応性を示す
（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１
４０１−０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，１３５：２５８９−６４２（１９８５）参照）。ストレプトアビジン
のような標識物質は他の分子が特異的に結合できるビオチンのような検出可能な
部分により修飾が可能である。異なった検出可能な部分は当業者にはよく知られ
ている。
【０１４８】
検定の全体にわたって、インキュベーション及び／もしくは洗浄段階は個々の
試薬の組み合わせの後必要となる。インキュベーション段階は約５秒から数時間
まで、任意に約５分から約２４時間まで変更できる。しかしながら、インキュベ
ーションの時間は一般的に検定のフォーマット、溶液量、濃度等に依存する。通
常検定は、例えば約１０℃から約４０℃までの温度範囲を超えて実施可能ではあ
るが、環境温度で実施されるであろう。
試薬の組み合わせの後必要となる。インキュベーション段階は約５秒から数時間
まで、任意に約５分から約２４時間まで変更できる。しかしながら、インキュベ
ーションの時間は一般的に検定のフォーマット、溶液量、濃度等に依存する。通
常検定は、例えば約１０℃から約４０℃までの温度範囲を超えて実施可能ではあ
るが、環境温度で実施されるであろう。
【０１４９】
ａ．非競合的アッセイフォーマット
検体中のＴ２Ｒを検出するための免疫アッセイは競合的あるいは非競合的のい
ずれかである。非競合的免疫アッセイは抗原の量を直接測定するアッセイである
。例えば、好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、抗Ｔ２Ｒ抗体は固定化され
る固体基質に直接結合できる。これらの固定化された抗体はその後試験用検体中
に存在するＴ２Ｒタンパク質を捕捉する可能性がある。Ｔ２Ｒタンパク質はこの
ように固定化され、その後標識をもつ第二Ｔ２Ｒ抗体のような標識物質が結合す
る。他方、第二抗体は、第二抗体が得られる生物種の抗体に特異的な標識された
第三抗体が順に結合する可能性があるが、標識されない可能性がある。第二もし
くは第三の抗体は代表的には例えば検出可能な部分を提供するストレプトアビジ
ンのような他の分子が特異的に結合するビオチンのような検出可能な部分により
修飾される。
ずれかである。非競合的免疫アッセイは抗原の量を直接測定するアッセイである
。例えば、好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、抗Ｔ２Ｒ抗体は固定化され
る固体基質に直接結合できる。これらの固定化された抗体はその後試験用検体中
に存在するＴ２Ｒタンパク質を捕捉する可能性がある。Ｔ２Ｒタンパク質はこの
ように固定化され、その後標識をもつ第二Ｔ２Ｒ抗体のような標識物質が結合す
る。他方、第二抗体は、第二抗体が得られる生物種の抗体に特異的な標識された
第三抗体が順に結合する可能性があるが、標識されない可能性がある。第二もし
くは第三の抗体は代表的には例えば検出可能な部分を提供するストレプトアビジ
ンのような他の分子が特異的に結合するビオチンのような検出可能な部分により
修飾される。
【０１５０】
ｂ．競合的アッセイフォーマット
競合的アッセイにおいて、検体中に存在するＴ２Ｒタンパク質の量は、検体中
に存在する未知のＴ２Ｒタンパク質によって抗Ｔ２Ｒ抗体から置換された（競合
的に除去）、既知の追加されたＴ２Ｒタンパク質の量を測定することによって評
価される。一つの競合的アッセイでは、既知量のＴ２Ｒタンパク質を検体に追加
し、またその後検体をＴ２Ｒに特異的に結合した抗体と接触させる。抗体に結合
した外因性Ｔ２Ｒタンパク質の量は検体中に存在するＴ２Ｒタンパク質の濃度に
反比例する。とくに好ましい態様として、抗体は固体基質に固定化される。抗体
に結合したＴ２Ｒタンパク質の量は、Ｔ２Ｒ／抗体複合体中に存在するＴ２Ｒタ
ンパク質の量を測定することによって、あるいは他方残りの複合体化されていな
いタンパク質の量を測定することによって確認される。Ｔ２Ｒタンパク質の量は
標識されたＴ２Ｒ分子を追加することによって検出される可能性がある。
に存在する未知のＴ２Ｒタンパク質によって抗Ｔ２Ｒ抗体から置換された（競合
的に除去）、既知の追加されたＴ２Ｒタンパク質の量を測定することによって評
価される。一つの競合的アッセイでは、既知量のＴ２Ｒタンパク質を検体に追加
し、またその後検体をＴ２Ｒに特異的に結合した抗体と接触させる。抗体に結合
した外因性Ｔ２Ｒタンパク質の量は検体中に存在するＴ２Ｒタンパク質の濃度に
反比例する。とくに好ましい態様として、抗体は固体基質に固定化される。抗体
に結合したＴ２Ｒタンパク質の量は、Ｔ２Ｒ／抗体複合体中に存在するＴ２Ｒタ
ンパク質の量を測定することによって、あるいは他方残りの複合体化されていな
いタンパク質の量を測定することによって確認される。Ｔ２Ｒタンパク質の量は
標識されたＴ２Ｒ分子を追加することによって検出される可能性がある。
【０１５１】
ハプテン阻害アッセイは他の好ましい競合的アッセイである。このアッセイで
は既知のＴ２Ｒタンパク質が固体基質に固定化される。既知量の抗Ｔ２Ｒ抗体を
検体に追加し、その後検体を固定化したＴ２Ｒに接触させる。既知の固定化され
たＴ２Ｒタンパク質に結合した抗Ｔ２Ｒ抗体の量は検体中に存在するＴ２Ｒタン
パク質の量に反比例する。また、固定化された抗体の量は固定化された分画ある
いは溶液中に残っている抗体の分画のいずれかを検出することによって確認でき
る。検出は抗体が標識される位置に直接に、もしくは上記の抗体に結合する標識
された部分の後の追加によって間接的に行なわれる。
は既知のＴ２Ｒタンパク質が固体基質に固定化される。既知量の抗Ｔ２Ｒ抗体を
検体に追加し、その後検体を固定化したＴ２Ｒに接触させる。既知の固定化され
たＴ２Ｒタンパク質に結合した抗Ｔ２Ｒ抗体の量は検体中に存在するＴ２Ｒタン
パク質の量に反比例する。また、固定化された抗体の量は固定化された分画ある
いは溶液中に残っている抗体の分画のいずれかを検出することによって確認でき
る。検出は抗体が標識される位置に直接に、もしくは上記の抗体に結合する標識
された部分の後の追加によって間接的に行なわれる。
【０１５２】
ｃ．交差反応性測定
競合的結合フォーマットでの免疫アッセイはまた、交差反応性測定に利用でき
る。例えば、この文書の中に開示された核酸配列によって少なくとも部分的にコ
ードされたタンパク質は固体支持体に固定化することが可能である。タンパク質
（例えば、Ｔ２Ｒポリペプチド及びその同族体）をアッセイに追加し、それによ
って固定化された抗原に対する抗血清の結合に競合できる。追加されたタンパク
質の、固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合に競合する能力をこの文書
の中で開示された核酸配列によってコードされたＴ２Ｒポリペプチドの競合能力
と比較する。上記のタンパク質のパーセント交差反応性を標準的な計算を用いて
計算する。上記にリストアップした追加された個々のタンパク質と１０％未満の
交差反応性をもつ抗血清が選択されプールされる。交差反応性のある抗体は任意
に例えば少し関連のある同族体のような考慮されたタンパク質の追加による免疫
吸着法によってプールされた抗血清から除去する。さらに、Ｔ２Ｒファミリーの
メンバーを確認するために用いられる共通配列を示すアミノ酸から成るペプチド
を交差反応性測定に利用できる。
る。例えば、この文書の中に開示された核酸配列によって少なくとも部分的にコ
ードされたタンパク質は固体支持体に固定化することが可能である。タンパク質
（例えば、Ｔ２Ｒポリペプチド及びその同族体）をアッセイに追加し、それによ
って固定化された抗原に対する抗血清の結合に競合できる。追加されたタンパク
質の、固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合に競合する能力をこの文書
の中で開示された核酸配列によってコードされたＴ２Ｒポリペプチドの競合能力
と比較する。上記のタンパク質のパーセント交差反応性を標準的な計算を用いて
計算する。上記にリストアップした追加された個々のタンパク質と１０％未満の
交差反応性をもつ抗血清が選択されプールされる。交差反応性のある抗体は任意
に例えば少し関連のある同族体のような考慮されたタンパク質の追加による免疫
吸着法によってプールされた抗血清から除去する。さらに、Ｔ２Ｒファミリーの
メンバーを確認するために用いられる共通配列を示すアミノ酸から成るペプチド
を交差反応性測定に利用できる。
【０１５３】
免疫吸着した、プールされた抗血清はその後上記の競合的結合免疫アッセイで
用いられ不確実ではあるが、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの対立遺伝子もしくは多
型変異体と考えられる第二のタンパク質が免疫タンパク質と比較されるであろう
（即ち、この文書の中で開示された核酸配列のよってコードされたＴ２Ｒタンパ
ク質）。この比較を行なうために、二つのタンパク質がそれぞれ広範囲の濃度で
アッセイされまた固定されたタンパク質に対する抗血清の結合の５０％を阻害す
ることが必要な個々のタンパク質の量が測定される。結合の５０％を阻害するこ
とが必要な第二タンパク質の量は、結合の５０％を阻害することが必要なこの文
書の中に開示された核酸配列によってコードされたタンパク質の量の１０倍未満
である場合、第二タンパク質はＴ２Ｒ免疫原に対して生じたポリクロナール抗体
に特異的に結合するとされている。
用いられ不確実ではあるが、Ｔ２Ｒファミリーメンバーの対立遺伝子もしくは多
型変異体と考えられる第二のタンパク質が免疫タンパク質と比較されるであろう
（即ち、この文書の中で開示された核酸配列のよってコードされたＴ２Ｒタンパ
ク質）。この比較を行なうために、二つのタンパク質がそれぞれ広範囲の濃度で
アッセイされまた固定されたタンパク質に対する抗血清の結合の５０％を阻害す
ることが必要な個々のタンパク質の量が測定される。結合の５０％を阻害するこ
とが必要な第二タンパク質の量は、結合の５０％を阻害することが必要なこの文
書の中に開示された核酸配列によってコードされたタンパク質の量の１０倍未満
である場合、第二タンパク質はＴ２Ｒ免疫原に対して生じたポリクロナール抗体
に特異的に結合するとされている。
【０１５４】
Ｔ２Ｒ共通配列と対照的に増加した抗体はまたＴ２ＲファミリーのＧＰＣＲに
のみ特異的に結合する抗体を調製するために利用できるが、他のファミリー由来
のＧＰＣＲではできない。例えば、Ｔ２Ｒファミリーの個々のメンバーに特異的
に結合するポリクロナール抗体は他のＴ２Ｒファミリーメンバーを用いて交差反
応抗体を除去することによって作製できる。種−特異性ポリクロナール抗体は同
様の方法で作製できる。例えば、ヒトＴ２Ｒ１に特異的な抗体は例えば、ラット
Ｔ２Ｒ１もしくはマウスＴ２Ｒ１のような、オルソログ配列によって交差反応性
をもつ抗体を除去することによって作製できる。
のみ特異的に結合する抗体を調製するために利用できるが、他のファミリー由来
のＧＰＣＲではできない。例えば、Ｔ２Ｒファミリーの個々のメンバーに特異的
に結合するポリクロナール抗体は他のＴ２Ｒファミリーメンバーを用いて交差反
応抗体を除去することによって作製できる。種−特異性ポリクロナール抗体は同
様の方法で作製できる。例えば、ヒトＴ２Ｒ１に特異的な抗体は例えば、ラット
Ｔ２Ｒ１もしくはマウスＴ２Ｒ１のような、オルソログ配列によって交差反応性
をもつ抗体を除去することによって作製できる。
【０１５５】
ｄ．他のアッセイフォーマット
ウェスタンブロット（免疫ブロット）解析は検体中のＴ２Ｒタンパク質の存在
を検出し定量するために用いられる。この技術は一般的に分子量に基づいてゲル
電気泳動法により検体のタンパク質を分離すること、適切な固体支持体（例えば
、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、誘導体化されたナイロン
フィルター）に分離したタンパク質を転移させること、及びＴ２Ｒタンパク質に
特異的に結合する抗体をもつ検体をインキュベートすることから成る。その後抗
Ｔ２Ｒポリペプチド抗体は固体支持体上のＴ２Ｒポリペプチドに特異的に結合す
る。これらの抗体は直接標識され、あるいは他方抗Ｔ２Ｒ抗体に特異的に結合す
る標識された抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて引き続き
検出される。
を検出し定量するために用いられる。この技術は一般的に分子量に基づいてゲル
電気泳動法により検体のタンパク質を分離すること、適切な固体支持体（例えば
、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、誘導体化されたナイロン
フィルター）に分離したタンパク質を転移させること、及びＴ２Ｒタンパク質に
特異的に結合する抗体をもつ検体をインキュベートすることから成る。その後抗
Ｔ２Ｒポリペプチド抗体は固体支持体上のＴ２Ｒポリペプチドに特異的に結合す
る。これらの抗体は直接標識され、あるいは他方抗Ｔ２Ｒ抗体に特異的に結合す
る標識された抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて引き続き
検出される。
【０１５６】
他のアッセイフォーマットには、個々の分子（例えば抗体）に結合するよう設
計されたリポソームを用い、カプセル化された試薬もしくはマーカーを放出する
、リポソーム免疫アッセイ（ＬＩＡ）が含まれる。放出された化学物質はその後
標準的な技術（Ｍｏｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．
Ｒｅｖ．，５：３４−４１（１９８６）参照）によって検出する。
計されたリポソームを用い、カプセル化された試薬もしくはマーカーを放出する
、リポソーム免疫アッセイ（ＬＩＡ）が含まれる。放出された化学物質はその後
標準的な技術（Ｍｏｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．
Ｒｅｖ．，５：３４−４１（１９８６）参照）によって検出する。
【０１５７】
ｅ．非特異的結合の減少
当業者には免疫アッセイにおいては非特異的結合を最小にすることが多くの場
合望ましいと理解されるであろう。とりわけ、検定に固体基質に固定化された抗
原あるいは抗体が含まれる場合、基質に結合する非特異的結合の量を最小にする
ことが望ましい。このような非特異的結合を減少させる方法は当業者にはよく知
られている。代表的には、これらの技術にはタンパク質様の成分を含む基質をコ
ーティングすることが含まれる。個別的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
無脂肪粉末ミルク、及びゼラチンのようなタンパク質成分が広範囲に利用され、
中でも粉末ミルクが最も好ましい。
合望ましいと理解されるであろう。とりわけ、検定に固体基質に固定化された抗
原あるいは抗体が含まれる場合、基質に結合する非特異的結合の量を最小にする
ことが望ましい。このような非特異的結合を減少させる方法は当業者にはよく知
られている。代表的には、これらの技術にはタンパク質様の成分を含む基質をコ
ーティングすることが含まれる。個別的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
無脂肪粉末ミルク、及びゼラチンのようなタンパク質成分が広範囲に利用され、
中でも粉末ミルクが最も好ましい。
【０１５８】
ｆ．標識
アッセイに用いられる個々の標識あるいは検出可能な基は、アッセイに用いら
れる抗体の特異的結合を有意に妨げない限り、本発明の重要な問題ではない。検
出可能な基が検出できる物理的または化学的性質をもついずれかの物質である可
能性がある。このような検出可能な標識は免疫アッセイの分野で十分発展し、ま
た一般的にこのような手法に有用な大部分のあらゆる標識が本発明に応用できる
。それゆえ、標識は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学
的、もしくは化学的方法によって検出できるあらゆる成分である。本発明におけ
る有用な標識には磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍
光染料（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミ
ン等）、放射性標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、32Ｐ等）、酵素（西洋
ワサビ過酸化酵素、アルカリフォスファターゼ及びＥＬＩＳＡに通常用いられる
他の物質）、及びコロイド状金または色ガラスまたはプラスチックビーズ（例え
ば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のような比色による標識が
含まれる。
れる抗体の特異的結合を有意に妨げない限り、本発明の重要な問題ではない。検
出可能な基が検出できる物理的または化学的性質をもついずれかの物質である可
能性がある。このような検出可能な標識は免疫アッセイの分野で十分発展し、ま
た一般的にこのような手法に有用な大部分のあらゆる標識が本発明に応用できる
。それゆえ、標識は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学
的、もしくは化学的方法によって検出できるあらゆる成分である。本発明におけ
る有用な標識には磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍
光染料（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミ
ン等）、放射性標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、32Ｐ等）、酵素（西洋
ワサビ過酸化酵素、アルカリフォスファターゼ及びＥＬＩＳＡに通常用いられる
他の物質）、及びコロイド状金または色ガラスまたはプラスチックビーズ（例え
ば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のような比色による標識が
含まれる。
【０１５９】
標識は直接または間接に当業者にはよく知られた方法でアッセイの適切な成分
に結合される。上記のように、広範囲の異なる標識が用いられ、必要とされる感
受性、化合物との抱合の容易さ、安定性のための条件、利用できる器具の使用、
及び廃棄設備によって標識を選択する。
に結合される。上記のように、広範囲の異なる標識が用いられ、必要とされる感
受性、化合物との抱合の容易さ、安定性のための条件、利用できる器具の使用、
及び廃棄設備によって標識を選択する。
【０１６０】
非放射活性標識は多くの場合間接的な方法で付着される。一般的に、リガンド
分子（例えば、ビオチン）は分子と共役結合する。その後リガンドは検出できる
酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物のような、本質的に検出できるかシ
グナルシステムに共有結合した他の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合
する。リガンド及びその標的はＴ２Ｒタンパク質を認識する抗体もしくは抗Ｔ２
Ｒを認識する二次抗体と適切に組み合わせて利用可能である。
分子（例えば、ビオチン）は分子と共役結合する。その後リガンドは検出できる
酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物のような、本質的に検出できるかシ
グナルシステムに共有結合した他の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合
する。リガンド及びその標的はＴ２Ｒタンパク質を認識する抗体もしくは抗Ｔ２
Ｒを認識する二次抗体と適切に組み合わせて利用可能である。
【０１６１】
分子はまた例えば酵素あるいはフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）と
の抱合によってシグナル発生化合物に直接抱合される。標識として興味深い酵素
は主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、
またはオキシドターゼ、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物にはフルオ
レセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェ
ロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）等が含まれる。化学発光化合物にはルシフ
ェリン、及び２，３−ジヒドロフタラジネディオン類、例えばルミノールが含ま
れる。用いられる可能性のある異なる標識またはシグナル発生システムの検討の
ために、米国特許４，３９１，９０４を参照。
の抱合によってシグナル発生化合物に直接抱合される。標識として興味深い酵素
は主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、
またはオキシドターゼ、特にペルオキシダーゼであろう。蛍光化合物にはフルオ
レセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェ
ロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）等が含まれる。化学発光化合物にはルシフ
ェリン、及び２，３−ジヒドロフタラジネディオン類、例えばルミノールが含ま
れる。用いられる可能性のある異なる標識またはシグナル発生システムの検討の
ために、米国特許４，３９１，９０４を参照。
【０１６２】
標識を検出する方法は当業者にはよく知られている。したがって、例えば、標
識が放射活性標識である場合、検出の方法にはシンチレーションカウンターある
いは自動Ｘ線撮影のような写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合
、標識は適当な波長の光によって蛍光色素を発光させまた生じた蛍光を感知する
ことによって検出する。蛍光は写真フィルムの方法によって、電荷結合デバイス
（ＣＣＤｓ）もしくは光電子増倍管等のような電気検出器の利用によって、視覚
的に検出できる。同様に、酵素標識は酵素に対して適切な基質を提供し生じた反
応生成物を感知することによって検出できる。最後に単一の比色標識は標識に結
合した色を観察することによって簡単に検出できる。このことから、異なったデ
ィップスティックアッセイでは、異なった接合ビーズはそのビーズの色であるが
、接合された金は多くの場合ピンクに見える。
識が放射活性標識である場合、検出の方法にはシンチレーションカウンターある
いは自動Ｘ線撮影のような写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合
、標識は適当な波長の光によって蛍光色素を発光させまた生じた蛍光を感知する
ことによって検出する。蛍光は写真フィルムの方法によって、電荷結合デバイス
（ＣＣＤｓ）もしくは光電子増倍管等のような電気検出器の利用によって、視覚
的に検出できる。同様に、酵素標識は酵素に対して適切な基質を提供し生じた反
応生成物を感知することによって検出できる。最後に単一の比色標識は標識に結
合した色を観察することによって簡単に検出できる。このことから、異なったデ
ィップスティックアッセイでは、異なった接合ビーズはそのビーズの色であるが
、接合された金は多くの場合ピンクに見える。
【０１６３】
一部のアッセイフォーマットでは標識成分を使用する必要がない。例えば、凝
集アッセイは標的抗体の存在を検出するために用いられる。この場合、粒子をコ
ーティングした抗原は標的抗体から成る検体によって凝集する。このフォーマッ
トでは、どの成分も簡単な視覚による検査で検出する。
集アッセイは標的抗体の存在を検出するために用いられる。この場合、粒子をコ
ーティングした抗原は標的抗体から成る検体によって凝集する。このフォーマッ
トでは、どの成分も簡単な視覚による検査で検出する。
【０１６４】
Ｅ．味覚調節剤の検出
インビトロ及びインビボにおいて試験成分が本発明のＴ２Ｒポリペプチドに特
異的に結合するかどうか確認するための手法及び製剤は以下に記載する。細胞生
理学の多くの特徴は自然発生のＴ２ＲもしくはキメラＴ２Ｒに対するリガンドの
結合作用を評価するためにモニターできる。これらのアッセイは透過性の上がっ
た細胞で、標準的手法によって生成された膜分画で、Ｔ２Ｒポリペプチドを表現
する無傷の細胞で実施する。
異的に結合するかどうか確認するための手法及び製剤は以下に記載する。細胞生
理学の多くの特徴は自然発生のＴ２ＲもしくはキメラＴ２Ｒに対するリガンドの
結合作用を評価するためにモニターできる。これらのアッセイは透過性の上がっ
た細胞で、標準的手法によって生成された膜分画で、Ｔ２Ｒポリペプチドを表現
する無傷の細胞で実施する。
【０１６５】
味覚受容体は呈味物質に結合し電気的シグナルに化学的刺激の形質導入を開始
する。活性化されたもしくは阻害されたＧタンパク質は同様に標的酵素、チャン
ネル、及びエフェクタータンパク質の性質を変化させるであろう。一部の例とし
て視覚的システムのトランスジューシン（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）によるｃＧＭ
Ｐ、刺激剤Ｇタンパク質によるアデニルサイクラーゼ、Ｇｑによるホスホリパー
ゼＣ及び他の同族のＧタンパク質の活性化、及びＧｉと他のＧタンパク質による
異なったチャンネルの調節があげられる。下流の結果もホスホリパーゼＣによる
ジアシルグリセロール及びＩＰ３の生成のように、また同様にＩＰ３によるカル
シウムの移動に対して試験を行なうことができる。
する。活性化されたもしくは阻害されたＧタンパク質は同様に標的酵素、チャン
ネル、及びエフェクタータンパク質の性質を変化させるであろう。一部の例とし
て視覚的システムのトランスジューシン（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）によるｃＧＭ
Ｐ、刺激剤Ｇタンパク質によるアデニルサイクラーゼ、Ｇｑによるホスホリパー
ゼＣ及び他の同族のＧタンパク質の活性化、及びＧｉと他のＧタンパク質による
異なったチャンネルの調節があげられる。下流の結果もホスホリパーゼＣによる
ジアシルグリセロール及びＩＰ３の生成のように、また同様にＩＰ３によるカル
シウムの移動に対して試験を行なうことができる。
【０１６６】
本アッセイのＴ２Ｒタンパク質もしくはポリペプチドは代表的には配列番号２
、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２４、あるいはそのフ
ラグメントまたは保存的に修飾された変異体の配列をもつポリペプチドから選択
される。
、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２４、あるいはそのフ
ラグメントまたは保存的に修飾された変異体の配列をもつポリペプチドから選択
される。
【０１６７】
他方、本アッセイのポリペプチドのＴ２Ｒタンパク質は真核宿主細胞由来であ
り、また配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び
２４、あるいはその保存的に修飾された変異体に対して一致するアミノ酸配列を
含む。一般的に、アミノ酸配列が一致するのは少なくとも３０％、好ましくは３
０−４０％、さらに個々には５０−６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であろう。任意に、本
発明のＴ２Ｒタンパク質もしくはポリペプチドは細胞外ドメイン、膜貫通領域、
細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン等のようなＴ２Ｒポリペプチドの領域か
ら成る可能性がある。任意に、Ｔ２Ｒポリペプチド、もしくはその部分はこの文
書の中に記載したアッセイにおいてキメラタンパク質を作製するために非相同タ
ンパク質に共有結合により連結できる。
り、また配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び
２４、あるいはその保存的に修飾された変異体に対して一致するアミノ酸配列を
含む。一般的に、アミノ酸配列が一致するのは少なくとも３０％、好ましくは３
０−４０％、さらに個々には５０−６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であろう。任意に、本
発明のＴ２Ｒタンパク質もしくはポリペプチドは細胞外ドメイン、膜貫通領域、
細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン等のようなＴ２Ｒポリペプチドの領域か
ら成る可能性がある。任意に、Ｔ２Ｒポリペプチド、もしくはその部分はこの文
書の中に記載したアッセイにおいてキメラタンパク質を作製するために非相同タ
ンパク質に共有結合により連結できる。
【０１６８】
Ｔ２Ｒ活性の調節剤は組換えまたは自然発生のいずれかの上記のＴ２Ｒタンパ
ク質あるいはポリペプチドを用いて試験が行なわれる可能性がある。細胞内で発
現し、細胞由来の膜内で発現し、組織あるいは哺乳動物で発現し、組換えもしく
は自然発生によって生じたＴ２Ｒタンパク質もしくはポリペプチドが分離できる
。例えば、舌のスライス、舌から分離した細胞、形質転換した細胞、あるいは膜
が利用できる。調節はこの文書の中にインビトロもしくはインビボでのアッセイ
の一つを用いて試験を実施することが可能である。
ク質あるいはポリペプチドを用いて試験が行なわれる可能性がある。細胞内で発
現し、細胞由来の膜内で発現し、組織あるいは哺乳動物で発現し、組換えもしく
は自然発生によって生じたＴ２Ｒタンパク質もしくはポリペプチドが分離できる
。例えば、舌のスライス、舌から分離した細胞、形質転換した細胞、あるいは膜
が利用できる。調節はこの文書の中にインビトロもしくはインビボでのアッセイ
の一つを用いて試験を実施することが可能である。
【０１６９】
１．インビトロにおける結合アッセイ
味覚形質導入はまた非相同シグナル形質導入ドメインに共有結合により連結し
たＴ２Ｒの、細胞外ドメイン、膜貫通領域、あるいはその組み合わせ、もしくは
Ｔ２Ｒタンパク質またはペプチドの膜貫通及び／もしくは細胞質ドメインに共有
結合によって連結した非相同細胞外ドメイン及び／もしくは膜貫通領域のような
Ｔ２Ｒポリペプチドあるいはキメラ分子を用いて、インビトロで可溶性物質ある
いは固体反応により試験を行なうことも可能である。さらに、Ｔ２Ｒポリペプチ
ドのリガンド結合領域はリガンド結合を評価するためにインビトロでの可溶性物
質または固体反応に利用できる。非常に多数の態様として、ロドプシン、例えば
ロドプシンタンパク質のＮ末端フラグメントのような、膜に対するＴ２Ｒの局在
化を促進する他の配列だけでなく、Ｔ２Ｒポリペプチドのすべてあるいは部分か
ら成るキメラ受容体が作製される。
たＴ２Ｒの、細胞外ドメイン、膜貫通領域、あるいはその組み合わせ、もしくは
Ｔ２Ｒタンパク質またはペプチドの膜貫通及び／もしくは細胞質ドメインに共有
結合によって連結した非相同細胞外ドメイン及び／もしくは膜貫通領域のような
Ｔ２Ｒポリペプチドあるいはキメラ分子を用いて、インビトロで可溶性物質ある
いは固体反応により試験を行なうことも可能である。さらに、Ｔ２Ｒポリペプチ
ドのリガンド結合領域はリガンド結合を評価するためにインビトロでの可溶性物
質または固体反応に利用できる。非常に多数の態様として、ロドプシン、例えば
ロドプシンタンパク質のＮ末端フラグメントのような、膜に対するＴ２Ｒの局在
化を促進する他の配列だけでなく、Ｔ２Ｒポリペプチドのすべてあるいは部分か
ら成るキメラ受容体が作製される。
【０１７０】
Ｔ２Ｒタンパク質、リガンド結合領域、もしくはキメラタンパク質に結合する
リガンドは、溶液中で、固相に固着した二分子膜内で、脂質単分子層内で、もし
くは小胞内で試験を実施できる。調節剤の結合は、例えば分光法（例えば、蛍光
、吸収、屈折率）、流体力学（例えば、形）、クロマトグラフィー、もしくは溶
解性の特性における変化を利用して分析が可能である。
リガンドは、溶液中で、固相に固着した二分子膜内で、脂質単分子層内で、もし
くは小胞内で試験を実施できる。調節剤の結合は、例えば分光法（例えば、蛍光
、吸収、屈折率）、流体力学（例えば、形）、クロマトグラフィー、もしくは溶
解性の特性における変化を利用して分析が可能である。
【０１７１】
Ｔ２Ｒ−Ｇタンパク質相互作用も試験が可能である。例えば、Ｔ２Ｒポリペプ
チドに対するＧタンパク質の結合あるいはポリペプチドからの遊離が試験できる
。ＧＴＰを欠いている場合は、活性化物質によりＴ２Ｒを含んだＧタンパク質（
すべての３個のサブユニット）をしっかり固定した複合体が形成されるであろう
。この複合体は上記のように異なる方法で検出できる。このようなアッセイは、
例えば、固定した複合体を形成するＧＴＰが存在しない場合、Ｔ２ＲとＧタンパ
ク質に活性化物質を追加することによって阻害物質を探索し、Ｔ２Ｒ−Ｇタンパ
ク質複合体の解離を観察することにより阻害物質を選別するよう修飾することが
できる。ＧＴＰが存在しない場合、他の二つのＧタンパク質サブユニットからＧ
タンパク質のアルファサブユニットを遊離することは活性化の尺度として役立つ
。
チドに対するＧタンパク質の結合あるいはポリペプチドからの遊離が試験できる
。ＧＴＰを欠いている場合は、活性化物質によりＴ２Ｒを含んだＧタンパク質（
すべての３個のサブユニット）をしっかり固定した複合体が形成されるであろう
。この複合体は上記のように異なる方法で検出できる。このようなアッセイは、
例えば、固定した複合体を形成するＧＴＰが存在しない場合、Ｔ２ＲとＧタンパ
ク質に活性化物質を追加することによって阻害物質を探索し、Ｔ２Ｒ−Ｇタンパ
ク質複合体の解離を観察することにより阻害物質を選別するよう修飾することが
できる。ＧＴＰが存在しない場合、他の二つのＧタンパク質サブユニットからＧ
タンパク質のアルファサブユニットを遊離することは活性化の尺度として役立つ
。
【０１７２】
本発明の他の態様として、ＧＴＰγＳアッセイが用いられる。上記のように、
ＧＰＣＲの活性化において、Ｇタンパク質複合体のＧαサブユニットを結合した
ＧＤＰをＧＴＰと交換するよう刺激を与える。Ｇタンパク質交換活性のリガンド
媒介刺激が、推定リガンドの存在下でＧタンパク質に対する追加された放射活性
標識ＧＴＰγ35Ｓの結合を測定する生化学的アッセイで測定できる。代表的には
、興味深い化学感覚受容体を含む膜をＧタンパク質の複合体と混合する。可能性
がある阻害剤及び／もしくは活性化物質及びＧＴＰγＳを検定に追加し、Ｇタン
パク質に対するＧＴＰγＳの結合を測定する。結合は液体シンチレーション計数
、もしくはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を含む当業者によく知られ
た他の方法で測定が可能である。他のアッセイフォーマットでは、蛍光的に標識
されたＧＴＰγＳが利用できる。
ＧＰＣＲの活性化において、Ｇタンパク質複合体のＧαサブユニットを結合した
ＧＤＰをＧＴＰと交換するよう刺激を与える。Ｇタンパク質交換活性のリガンド
媒介刺激が、推定リガンドの存在下でＧタンパク質に対する追加された放射活性
標識ＧＴＰγ35Ｓの結合を測定する生化学的アッセイで測定できる。代表的には
、興味深い化学感覚受容体を含む膜をＧタンパク質の複合体と混合する。可能性
がある阻害剤及び／もしくは活性化物質及びＧＴＰγＳを検定に追加し、Ｇタン
パク質に対するＧＴＰγＳの結合を測定する。結合は液体シンチレーション計数
、もしくはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を含む当業者によく知られ
た他の方法で測定が可能である。他のアッセイフォーマットでは、蛍光的に標識
されたＧＴＰγＳが利用できる。
【０１７３】
特に好ましい態様として、Ｔ２Ｒ−ガストジューシン間の相互作用をＴ２Ｒ受
容体活性化の機能としてモニターする。例えば、マウスのＴ２Ｒ５はガストジュ
ーシンと共役した強いシクロヘキサミド依存性を示す。Ｔ２Ｒ受容体がガストジ
ューシンと共役したこのようなリガンド依存性はＴ２Ｒファミリーのメンバーの
修飾物質を確認するためのマーカーとして用いることができる。
容体活性化の機能としてモニターする。例えば、マウスのＴ２Ｒ５はガストジュ
ーシンと共役した強いシクロヘキサミド依存性を示す。Ｔ２Ｒ受容体がガストジ
ューシンと共役したこのようなリガンド依存性はＴ２Ｒファミリーのメンバーの
修飾物質を確認するためのマーカーとして用いることができる。
【０１７４】
２．蛍光偏光アッセイ
他の態様として、蛍光偏光（「ＦＰ」）に基づいたアッセイがリガンド結合を
検出しモニターするために利用される。蛍光偏光法は平衡結合、核酸ハイブリダ
イゼーション、及び酵素活性測定のための万能検査法である。蛍光偏光アッセイ
は遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、沈降もしくは電気泳動のような分離法
を必要としないという点で均質である。これらのアッセイは、直接溶液中でまた
固定相を必要とせず、リアルタイムで実施される。偏光値は偏光の測定が迅速で
検体を破壊しないことから、繰り返しまた試薬追加の後測定することが可能であ
る。一般的にこの方法はピコモルからマイクロモルという低値の蛍光団の偏光値
を測定することができる。この章では本発明のＴ２Ｒポリペプチドに対するリガ
ンドの結合を測定するために蛍光偏光法を簡単で定量的な方法でいかに利用でき
るかについて記載する。
検出しモニターするために利用される。蛍光偏光法は平衡結合、核酸ハイブリダ
イゼーション、及び酵素活性測定のための万能検査法である。蛍光偏光アッセイ
は遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、沈降もしくは電気泳動のような分離法
を必要としないという点で均質である。これらのアッセイは、直接溶液中でまた
固定相を必要とせず、リアルタイムで実施される。偏光値は偏光の測定が迅速で
検体を破壊しないことから、繰り返しまた試薬追加の後測定することが可能であ
る。一般的にこの方法はピコモルからマイクロモルという低値の蛍光団の偏光値
を測定することができる。この章では本発明のＴ２Ｒポリペプチドに対するリガ
ンドの結合を測定するために蛍光偏光法を簡単で定量的な方法でいかに利用でき
るかについて記載する。
【０１７５】
蛍光により標識された分子が平面的な偏向光により励起される場合、それは分
子の回転に反比例する偏光の程度を示す光を発する。蛍光により大規模に標識さ
れた分子は発光状態の間は比較的固定されたままであり、また光の偏光は励起と
発光との間は比較的一定のままである。励起状態の間蛍光により小規模に標識さ
れた分子は迅速に回転し、また偏光は励起と発光との間有為に変化する。したが
って、小さい分子は低い偏光値をもち、また大きな分子は高い偏光値をもつ。例
えば、一本鎖フルオロセイン標識オリゴヌクレオチドは比較的低い偏光値をもつ
が、相補的ストランドに対してハイブリダイゼーションが行なわれた場合、高い
偏光値をもつ。本発明の化学感覚受容体を活性化あるいは阻害する可能性のある
呈味物質−結合を検出しモニターするためにＦｐを利用する場合、蛍光標識呈味
物質もしくは自動蛍光呈味物質が用いられる。
子の回転に反比例する偏光の程度を示す光を発する。蛍光により大規模に標識さ
れた分子は発光状態の間は比較的固定されたままであり、また光の偏光は励起と
発光との間は比較的一定のままである。励起状態の間蛍光により小規模に標識さ
れた分子は迅速に回転し、また偏光は励起と発光との間有為に変化する。したが
って、小さい分子は低い偏光値をもち、また大きな分子は高い偏光値をもつ。例
えば、一本鎖フルオロセイン標識オリゴヌクレオチドは比較的低い偏光値をもつ
が、相補的ストランドに対してハイブリダイゼーションが行なわれた場合、高い
偏光値をもつ。本発明の化学感覚受容体を活性化あるいは阻害する可能性のある
呈味物質−結合を検出しモニターするためにＦｐを利用する場合、蛍光標識呈味
物質もしくは自動蛍光呈味物質が用いられる。
【０１７６】
蛍光偏光値（Ｐ）は以下のように定義される。
【０１７７】
ここで
は励起光面に平行した発光光の強さであり、また
は励起光面に垂直な発光光の強さである。光の強さの割合であるＰはディメンシ
ョンのない数値である。例えば、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）及びＢｅａｃｏｎ２
０００（登録商標）システムはこれらのアッセイに関連して用いられる。代表的
にはこのようなシステムではミリ偏光単位で偏光が表される（１偏光単位＝１０
００ｍＰ Ｕｎｉｔ）。
ョンのない数値である。例えば、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）及びＢｅａｃｏｎ２
０００（登録商標）システムはこれらのアッセイに関連して用いられる。代表的
にはこのようなシステムではミリ偏光単位で偏光が表される（１偏光単位＝１０
００ｍＰ Ｕｎｉｔ）。
【０１７８】
分子回転と大きさの間の関係はＰｅｒｒｉｎ方程式によって表される。要約す
ると、Ｐｅｒｒｉｎ方程式は偏光が、分子が約６８．５°の角度で回転するため
に必要な時間である、回転の緩和時間に直接比例すると明言している。以下の方
程式では回転の緩和時間は粘度（η）、絶対温度（Ｔ）、分子量（Ｖ）、及び気
体定数（Ｒ）に関連する。 回転の緩和時間＝３ηＶ／ＲＴ
ると、Ｐｅｒｒｉｎ方程式は偏光が、分子が約６８．５°の角度で回転するため
に必要な時間である、回転の緩和時間に直接比例すると明言している。以下の方
程式では回転の緩和時間は粘度（η）、絶対温度（Ｔ）、分子量（Ｖ）、及び気
体定数（Ｒ）に関連する。 回転の緩和時間＝３ηＶ／ＲＴ
【０１７９】
回転の緩和時間は小さい分子（例えば、フルオレセイン）に対しては小さく（
〜１ナノ秒）、また大きい分子（例えば、免疫グロブリン）に対しては大きい値
（〜１００ナノ秒）である。粘度及び温度が一定に保たれる場合は、回転の緩和
時間と偏光は分子量に直接関連する。分子量の変化は蛍光で標識された分子の他
の分子との相互作用、解離、重合、縮重、ハイブリダイゼーション、もしくは高
次構造の変化による可能性がある。例えば、蛍光偏光法はプロテアーゼ、ＤＮａ
ｓｅ、及びＲＮａｓｅによる大規模に蛍光標識されたポリマーの酵素的切断を測
定するために利用されてきた。それはまたタンパク質／タンパク質相互作用、抗
体／抗原結合、及びタンパク質／ＤＮＡ結合のために平衡結合を測定するために
用いられてきた。
〜１ナノ秒）、また大きい分子（例えば、免疫グロブリン）に対しては大きい値
（〜１００ナノ秒）である。粘度及び温度が一定に保たれる場合は、回転の緩和
時間と偏光は分子量に直接関連する。分子量の変化は蛍光で標識された分子の他
の分子との相互作用、解離、重合、縮重、ハイブリダイゼーション、もしくは高
次構造の変化による可能性がある。例えば、蛍光偏光法はプロテアーゼ、ＤＮａ
ｓｅ、及びＲＮａｓｅによる大規模に蛍光標識されたポリマーの酵素的切断を測
定するために利用されてきた。それはまたタンパク質／タンパク質相互作用、抗
体／抗原結合、及びタンパク質／ＤＮＡ結合のために平衡結合を測定するために
用いられてきた。
【０１８０】
３．固体状態及び可溶性の高処理量アッセイ
さらに他の態様として、本発明はＴ２Ｒポリペプチド、もしくはＴ２Ｒポリペ
プチドを発現する細胞または組織を用いた可溶性アッセイを提供する。別の態様
として、本発明は、Ｔ２Ｒポリペプチド、またはＴ２Ｒポリペプチドを発現する
細胞もしくは組織が固相基質に付着する、インビトロアッセイに基づいた高処理
量フォーマットでの固相を提供する。
プチドを発現する細胞または組織を用いた可溶性アッセイを提供する。別の態様
として、本発明は、Ｔ２Ｒポリペプチド、またはＴ２Ｒポリペプチドを発現する
細胞もしくは組織が固相基質に付着する、インビトロアッセイに基づいた高処理
量フォーマットでの固相を提供する。
【０１８１】
本発明の高処理量アッセイでは、一日で何千もの別々の調節剤もしくはリガン
ドを選別することが可能である。とりわけ、マイクロプレートの個々のウェルは
選択された可能性のある調節剤と対照的に別のアッセイを実施するために利用で
きる。あるいは濃度またはインキュベーション時間の影響が観察された場合、５
−１０ウェル毎に一つの調節剤を試験できる。それゆえ、一つの標準的マイクロ
プレートで約１００（例えば９６）の調節剤をアッセイすることが可能である。
もし１５３６ウェルが使用されるならば、一つのプレートで約１０００−１５０
０の異なった化合物を容易に定量することが出来る。また個々のプレートのウェ
ル内の複数の化合物をアッセイすることも可能である。さらに、１日あたり約６
，０００−２０，０００の化合物を選別することを考慮した場合、１日にいくら
かの別々のプレートを検定することが可能である。さらに最近、試薬の扱い方に
対する微小流体アプローチ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ）が
開発された。
ドを選別することが可能である。とりわけ、マイクロプレートの個々のウェルは
選択された可能性のある調節剤と対照的に別のアッセイを実施するために利用で
きる。あるいは濃度またはインキュベーション時間の影響が観察された場合、５
−１０ウェル毎に一つの調節剤を試験できる。それゆえ、一つの標準的マイクロ
プレートで約１００（例えば９６）の調節剤をアッセイすることが可能である。
もし１５３６ウェルが使用されるならば、一つのプレートで約１０００−１５０
０の異なった化合物を容易に定量することが出来る。また個々のプレートのウェ
ル内の複数の化合物をアッセイすることも可能である。さらに、１日あたり約６
，０００−２０，０００の化合物を選別することを考慮した場合、１日にいくら
かの別々のプレートを検定することが可能である。さらに最近、試薬の扱い方に
対する微小流体アプローチ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ）が
開発された。
【０１８２】
興味深い分子は、直接にあるいは間接に、共有結合あるいは非共有結合によっ
て、例えば標識によって、固体成分に結合できる。一般的に、標識（標識結合剤
）に結合する分子は固体の支持体に固定され、また興味深い識別された分子（興
味深い味覚形質導入分子）は標識と標識結合剤との相互作用によって固体支持体
に付着する。
て、例えば標識によって、固体成分に結合できる。一般的に、標識（標識結合剤
）に結合する分子は固体の支持体に固定され、また興味深い識別された分子（興
味深い味覚形質導入分子）は標識と標識結合剤との相互作用によって固体支持体
に付着する。
【０１８３】
多数の標識及び標識結合剤が、文献に詳しく記されているよく知られた分子相
互作用に基づいて利用できる。例えば、標識が天然の結合剤、例として、ビオチ
ン、タンパク質Ａ、もしくはタンパク質Ｇをもつ場合、適当な標識結合剤（アビ
ジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、免
疫グロブリンのＦｃ領域等）との連結に用いることが可能である。ビオチンのよ
うな天然の結合剤をもつ分子に対する抗体は広範囲に利用でき、また適切な標識
結合剤である（ＳＩＧＭＡ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９８ ｃａ
ｔａｌｏｇｕｅ，ＳＩＧＭＡ，セントルイス、ミズーリ州）。
互作用に基づいて利用できる。例えば、標識が天然の結合剤、例として、ビオチ
ン、タンパク質Ａ、もしくはタンパク質Ｇをもつ場合、適当な標識結合剤（アビ
ジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、免
疫グロブリンのＦｃ領域等）との連結に用いることが可能である。ビオチンのよ
うな天然の結合剤をもつ分子に対する抗体は広範囲に利用でき、また適切な標識
結合剤である（ＳＩＧＭＡ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９８ ｃａ
ｔａｌｏｇｕｅ，ＳＩＧＭＡ，セントルイス、ミズーリ州）。
【０１８４】
同様に、あらゆる部分抗原もしくは抗原化合物が標識／標識対を形成するため
に適切な抗体との結合に利用できる。何千もの個々の抗体が市販で入手可能でま
た他の抗体は文献の中に記載されている。例えば、一般的な立体配置では、標識
は第一抗体であり標識結合剤は第一抗体を認識する第二抗体である。抗体−抗原
相互作用に加えて、受容体リガンド相互作用も標識と標識結合剤対として適当で
ある。例えば、細胞膜受容体の作動薬及び拮抗薬（例えば、トランスフェリンの
ような細胞受容体リガンド相互作用、ｃ−キット、ウイルス受容体リガンド、サ
イトカイン受容体、ケモキン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン
受容体及び抗体、カドヒアリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチ
ンファミリー等；例えば、Ｐｉｇｏｔｔ ＆ Ｐｏｗｅｒ，Ｔｈｅ Ａｄｈｅｓ
ｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ Ｉ（１９９３）参照）。同
様に、毒素と毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン薬、ステロ
イド等）細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド及び
ビタミンＤ；ペプチドを含む様々な小リガンドの影響を伝達する）、薬剤、レク
チン、砂糖、核酸（直線状の及び環状のポリマー立体配置）、オリゴサッカライ
ド、タンパク質、リン脂質及び抗体はすべて異なった細胞受容体と相互作用を引
き起こす可能性がある。
に適切な抗体との結合に利用できる。何千もの個々の抗体が市販で入手可能でま
た他の抗体は文献の中に記載されている。例えば、一般的な立体配置では、標識
は第一抗体であり標識結合剤は第一抗体を認識する第二抗体である。抗体−抗原
相互作用に加えて、受容体リガンド相互作用も標識と標識結合剤対として適当で
ある。例えば、細胞膜受容体の作動薬及び拮抗薬（例えば、トランスフェリンの
ような細胞受容体リガンド相互作用、ｃ−キット、ウイルス受容体リガンド、サ
イトカイン受容体、ケモキン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン
受容体及び抗体、カドヒアリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチ
ンファミリー等；例えば、Ｐｉｇｏｔｔ ＆ Ｐｏｗｅｒ，Ｔｈｅ Ａｄｈｅｓ
ｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ Ｉ（１９９３）参照）。同
様に、毒素と毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン薬、ステロ
イド等）細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド及び
ビタミンＤ；ペプチドを含む様々な小リガンドの影響を伝達する）、薬剤、レク
チン、砂糖、核酸（直線状の及び環状のポリマー立体配置）、オリゴサッカライ
ド、タンパク質、リン脂質及び抗体はすべて異なった細胞受容体と相互作用を引
き起こす可能性がある。
【０１８５】
合成ポリマー、例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポ
リウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンスルフィド、ポリシ
ロキサン、ポリイミド、及びポリアセテート、もまた適当な標識あるいは標識結
合剤を形成できる。多数の標識／標識結合剤もこの文書の中に記載した検定シス
テムに有用で、この開示を検討すれば当業者には明らかであろう。
リウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンスルフィド、ポリシ
ロキサン、ポリイミド、及びポリアセテート、もまた適当な標識あるいは標識結
合剤を形成できる。多数の標識／標識結合剤もこの文書の中に記載した検定シス
テムに有用で、この開示を検討すれば当業者には明らかであろう。
【０１８６】
ペプチド、ポリエーテル等のような一般的なリンカーは標識として役立つ。ま
た約５から２００の間のアミノ酸の多くのグリシン配列のようなポリペプチド配
列を含む。このような柔軟性のあるリンカーは当業者には知られている。例えば
、ポリ（エチレングリコール）リンカーはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，アラバマ州から入手できる。これらのリ
ンカーは任意にアミド連鎖、スルフヒドリル連鎖、もしくは非相同機能性連鎖を
有していてもよい。
た約５から２００の間のアミノ酸の多くのグリシン配列のようなポリペプチド配
列を含む。このような柔軟性のあるリンカーは当業者には知られている。例えば
、ポリ（エチレングリコール）リンカーはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，アラバマ州から入手できる。これらのリ
ンカーは任意にアミド連鎖、スルフヒドリル連鎖、もしくは非相同機能性連鎖を
有していてもよい。
【０１８７】
標識結合剤は現在入手可能な異なる手法のいずれかを用いて固体基質に固定す
る。固体基質は一般的に、標識結合剤の一部分に反応性のある表面に化学的基を
固定する化学的試薬に基質の全部あるいは一部分を曝露することによって誘導体
化されあるいは機能的にされる。例えば、より長い鎖部分への付着に適切な基に
はアミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基が含まれる。アミノア
ルキルシランとヒドロキシアルキルシランはガラスの表面のように、異なる表面
を機能的にするために利用可能である。このような固相生体高分子の構築は文献
に詳しく記載されている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−５４（１９６３）（例えば、ペプチドの固相合成
について記載している）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅ
ｔｈ．，１０２：２５９−７４（１９８７）（固相成分の合成について記載して
いる）；Ｆｒａｎｋ ＆ Ｄｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４４：６０
３１−６０４０（１９８８）（セルロースディスク上に異なるペプチド配列の合
成について記載している）Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１
：７６７−７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（４）：，７１８−１９（１９９３）；Ｋｏｚａ
ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（７）：，７５３−７
５９（１９９６）（固体基質に固定される生体高分子の配列について記載してい
る）。基質に標識結合剤を固定するための非化学的方法には加熱、紫外線照射に
よる交差結合等のような他の一般的な手法が含まれる。
る。固体基質は一般的に、標識結合剤の一部分に反応性のある表面に化学的基を
固定する化学的試薬に基質の全部あるいは一部分を曝露することによって誘導体
化されあるいは機能的にされる。例えば、より長い鎖部分への付着に適切な基に
はアミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基が含まれる。アミノア
ルキルシランとヒドロキシアルキルシランはガラスの表面のように、異なる表面
を機能的にするために利用可能である。このような固相生体高分子の構築は文献
に詳しく記載されている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−５４（１９６３）（例えば、ペプチドの固相合成
について記載している）；Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅ
ｔｈ．，１０２：２５９−７４（１９８７）（固相成分の合成について記載して
いる）；Ｆｒａｎｋ ＆ Ｄｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４４：６０
３１−６０４０（１９８８）（セルロースディスク上に異なるペプチド配列の合
成について記載している）Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１
：７６７−７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９（４）：，７１８−１９（１９９３）；Ｋｏｚａ
ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（７）：，７５３−７
５９（１９９６）（固体基質に固定される生体高分子の配列について記載してい
る）。基質に標識結合剤を固定するための非化学的方法には加熱、紫外線照射に
よる交差結合等のような他の一般的な手法が含まれる。
【０１８８】
４．コンピューターに基づくアッセイ
Ｔ２Ｒポリペプチド活性を調節する化合物のためのさらに他のアッセイは、コ
ンピューター補助の化合物デザインを伴うものであり、このアッセイにおいては
、コンピューターシステムが、アミノ酸配列によってコードされた構造的情報に
基づいてＴ２Ｒポリペプチドの三次元構造を生成するために用いられる。入力デ
ータのアミノ酸配列はタンパク質の二次、三次、及び四次構造のモデルを産出す
るためにコンピュータープログラムの前もって確立したアルゴリズムと直接的及
び間接的に相互作用する。タンパク質構造のモデルはその後、たとえばリガンド
のように結合する能力をもつ構造の領域を確認するために試験が行なわれる。こ
れらの領域はその後タンパク質に結合するリガンドを確認するために利用される
。
ンピューター補助の化合物デザインを伴うものであり、このアッセイにおいては
、コンピューターシステムが、アミノ酸配列によってコードされた構造的情報に
基づいてＴ２Ｒポリペプチドの三次元構造を生成するために用いられる。入力デ
ータのアミノ酸配列はタンパク質の二次、三次、及び四次構造のモデルを産出す
るためにコンピュータープログラムの前もって確立したアルゴリズムと直接的及
び間接的に相互作用する。タンパク質構造のモデルはその後、たとえばリガンド
のように結合する能力をもつ構造の領域を確認するために試験が行なわれる。こ
れらの領域はその後タンパク質に結合するリガンドを確認するために利用される
。
【０１８９】
タンパク質の三次元構造モデルは少なくとも１０個のアミノ酸残基のタンパク
質アミノ酸配列あるいはＴ２Ｒポリペプチドをコードする対応の核酸配列をコン
ピューターシステムに入力することによって作製する。Ｔ２Ｒポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列、もしくはそのアミノ酸配列はこの文書の中に開示さ
れたいずれかの配列であり、また保存的に修飾されたそれらの変更型である。
質アミノ酸配列あるいはＴ２Ｒポリペプチドをコードする対応の核酸配列をコン
ピューターシステムに入力することによって作製する。Ｔ２Ｒポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列、もしくはそのアミノ酸配列はこの文書の中に開示さ
れたいずれかの配列であり、また保存的に修飾されたそれらの変更型である。
【０１９０】
アミノ酸配列はタンパク質の構造上の情報をコードするタンパク質の主要な配
列もしくは部分配列を表す。少なくとも１０個のアミノ酸配列（もしくは１０個
のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）の残基がコンピューターのキーボー
ド、これらに限ったことではないが、電子的保存媒体（例えば、磁気ディスケッ
ト、テープ、カートリッジ、及びチップ）、光学的媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ
）、インターネットサイト及びランダムアクセス（ＲＡＭ）により送信された情
報を含むコンピューター可読基板からコンピューターシステムへ入力される。タ
ンパク質の三次元構造が、当業者に周知のソフトウェアを利用して、アミノ酸配
列アミノ酸配列とコンピューターシステムの間の相互の影響によって作製される
。
列もしくは部分配列を表す。少なくとも１０個のアミノ酸配列（もしくは１０個
のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列）の残基がコンピューターのキーボー
ド、これらに限ったことではないが、電子的保存媒体（例えば、磁気ディスケッ
ト、テープ、カートリッジ、及びチップ）、光学的媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ
）、インターネットサイト及びランダムアクセス（ＲＡＭ）により送信された情
報を含むコンピューター可読基板からコンピューターシステムへ入力される。タ
ンパク質の三次元構造が、当業者に周知のソフトウェアを利用して、アミノ酸配
列アミノ酸配列とコンピューターシステムの間の相互の影響によって作製される
。
【０１９１】
アミノ酸配列は興味深いタンパク質の二次、三次、四次構造を形成するために
必要な情報をコードする主要な構造を表す。ソフトウェアは構造モデルを作製す
るための主要な配列によってコードされた一定のパラメータを観察する。これら
のパラメータは「エネルギー項」として示され、主に静電気電位、疎水性電位、
溶媒が接近可能な表面、及び水素結合を含む。二次的エネルギー項はファンデル
ワールス電位を含む。生体分子は累積型でエネルギー項を最小にする構造を形成
する。それ故コンピュータープログラムは二次構造モデルを作製するために主要
な構造あるいはアミノ酸配列によってコードされたこれらの項を利用している。
必要な情報をコードする主要な構造を表す。ソフトウェアは構造モデルを作製す
るための主要な配列によってコードされた一定のパラメータを観察する。これら
のパラメータは「エネルギー項」として示され、主に静電気電位、疎水性電位、
溶媒が接近可能な表面、及び水素結合を含む。二次的エネルギー項はファンデル
ワールス電位を含む。生体分子は累積型でエネルギー項を最小にする構造を形成
する。それ故コンピュータープログラムは二次構造モデルを作製するために主要
な構造あるいはアミノ酸配列によってコードされたこれらの項を利用している。
【０１９２】
二次構造によってコードされたタンパク質の三次構造はその後二次構造のエネ
ルギー項に基づいて形成される。この点で利用者は、タンパク質が膜に結合して
いるかあるいは溶解しているか、体内でのその分布、及び例えば細胞質、表面、
もしくは核といった細胞内の分布のような他の変数を入力できる。二次構造のエ
ネルギー項に伴うこれらの変数は三次構造のモデルを形成するために用いられる
。三次構造のモデリングにおいて、コンピュータープログラムは二次構造の疎水
性の特徴、及び二次構造の親水性の特徴と合致する。
ルギー項に基づいて形成される。この点で利用者は、タンパク質が膜に結合して
いるかあるいは溶解しているか、体内でのその分布、及び例えば細胞質、表面、
もしくは核といった細胞内の分布のような他の変数を入力できる。二次構造のエ
ネルギー項に伴うこれらの変数は三次構造のモデルを形成するために用いられる
。三次構造のモデリングにおいて、コンピュータープログラムは二次構造の疎水
性の特徴、及び二次構造の親水性の特徴と合致する。
【０１９３】
一度構造が生成されると、潜在的リガンド結合領域はコンピューターシステム
によって確認する。潜在的リガンドの三次元構造は上記のように、化合物のアミ
ノ酸またはヌクレオチド配列あるいは化学式を入力することによって作製される
。その後潜在的リガンドの三次元構造はタンパク質に結合するリガンドを確認す
るためにＴ２Ｒポリペプチドの三次元構造と比較する。タンパク質とリガンドの
間の結合親和性は、リガンドがタンパク質に結合する可能性を高めることを確認
するためにエネルギー項を用いて測定する。
によって確認する。潜在的リガンドの三次元構造は上記のように、化合物のアミ
ノ酸またはヌクレオチド配列あるいは化学式を入力することによって作製される
。その後潜在的リガンドの三次元構造はタンパク質に結合するリガンドを確認す
るためにＴ２Ｒポリペプチドの三次元構造と比較する。タンパク質とリガンドの
間の結合親和性は、リガンドがタンパク質に結合する可能性を高めることを確認
するためにエネルギー項を用いて測定する。
【０１９４】
コンピューターシステムはまた突然変異、多型変異体、対立遺伝子、及びＴ２
Ｒ遺伝子の同族体を選別するために用いられる。このような突然変異は疾病もし
くは遺伝形質に関連する。上記のように、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）及び関
連技術はまた突然変異、多型変異体、対立遺伝子、及び種間同族体の選別に用い
ることができる。一度変異体が確認されると、診断的アッセイはこのような突然
変異を起こした遺伝子をもつ患者を確認するために利用できる。変異したＴ２Ｒ
遺伝子の確認には最初の核酸もしくはアミノ酸配列、あるいはその保存的に修飾
されたバージョンの入力をうけることが含まれる。配列は上記のようにコンピュ
ーターシステムに入力される。最初の核酸配列もしくはアミノ酸配列はその後最
初の配列に十分一致する第二の核酸もしくはアミノ酸配列と比較される。第二の
配列は上記の方法でコンピューターシステムに入力される。一度第一と第二の配
列が比較されると、配列の間のヌクレオチドもしくはアミノ酸の差が確認される
。このような配列は異なるＴ２Ｒ遺伝子の対立遺伝子の差、及び疾患と遺伝的特
徴に関連した突然変異を表す。
Ｒ遺伝子の同族体を選別するために用いられる。このような突然変異は疾病もし
くは遺伝形質に関連する。上記のように、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）及び関
連技術はまた突然変異、多型変異体、対立遺伝子、及び種間同族体の選別に用い
ることができる。一度変異体が確認されると、診断的アッセイはこのような突然
変異を起こした遺伝子をもつ患者を確認するために利用できる。変異したＴ２Ｒ
遺伝子の確認には最初の核酸もしくはアミノ酸配列、あるいはその保存的に修飾
されたバージョンの入力をうけることが含まれる。配列は上記のようにコンピュ
ーターシステムに入力される。最初の核酸配列もしくはアミノ酸配列はその後最
初の配列に十分一致する第二の核酸もしくはアミノ酸配列と比較される。第二の
配列は上記の方法でコンピューターシステムに入力される。一度第一と第二の配
列が比較されると、配列の間のヌクレオチドもしくはアミノ酸の差が確認される
。このような配列は異なるＴ２Ｒ遺伝子の対立遺伝子の差、及び疾患と遺伝的特
徴に関連した突然変異を表す。
【０１９５】
５．細胞に基づく結合アッセイ
好ましい態様として、Ｔ２Ｒタンパク質もしくはポリペプチドは成熟及び分泌
経路を介して標的とするのを促進する非相同シャプロン配列をもつキメラ受容体
として真核細胞に発現する。好ましい態様として、非相同配列はロドプシンのＮ
末端フラグメントのようなロドプシン配列である。このようなキメラＴ２Ｒタン
パク質はＨＥＫ−２９３のようなあらゆる真核細胞に発現する。おそらく、その
細胞は、細胞内シグナリング経路あるいはホスホリパーゼＣのようなシグナリン
グタンパク質に対してキメラ受容体を共役することが可能なＧタンパク質、例え
ば、Ｇα１５から成る。このような細胞内のこのようなキメラ受容体の活性化は
細胞内ＦＵＲＡ−２依存性蛍光を検出することによる方法のような、あらゆる標
準的な方法を用いて検出できる。
経路を介して標的とするのを促進する非相同シャプロン配列をもつキメラ受容体
として真核細胞に発現する。好ましい態様として、非相同配列はロドプシンのＮ
末端フラグメントのようなロドプシン配列である。このようなキメラＴ２Ｒタン
パク質はＨＥＫ−２９３のようなあらゆる真核細胞に発現する。おそらく、その
細胞は、細胞内シグナリング経路あるいはホスホリパーゼＣのようなシグナリン
グタンパク質に対してキメラ受容体を共役することが可能なＧタンパク質、例え
ば、Ｇα１５から成る。このような細胞内のこのようなキメラ受容体の活性化は
細胞内ＦＵＲＡ−２依存性蛍光を検出することによる方法のような、あらゆる標
準的な方法を用いて検出できる。
【０１９６】
活性化されたＧＰＣＲ受容体は受容体のＣ末端の尾部をリン酸化するキナーゼ
に対する基質になる。したがって、活性化物質はガンマ標識ＧＴＰからシンチレ
ーションカウンターを用いてアッセイできる受容体への32Ｐの転移を促進するで
あろう。Ｃ末端尾部のリン酸化はアレスチン様タンパク質の結合を促進し、また
Ｇタンパク質の結合を妨げるであろう。キナーゼ／アレスチン経路は多数のＧＰ
ＣＲｓの脱感作における主要な役割を果たす。例えば、味覚受容体が活性を保っ
ている時間を調節する化合物は適切な味覚を持続し好ましくない味覚を排除する
方法として有用である。ＧＰＣＲシグナル形質導入の全般的な検討及びシグナル
形質導入をアッセイする方法のためには、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，ｖｏｌｓ．２３７，２３８（１９９４）及びｖｏｌｕｍｅ ９６（１
９８３）；Ｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１０：３４９：１１７
−２７（１９９１）；Ｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：１
２５−３２（１９９０）；Ｐｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：６５３−９２（１９９８）を参照。
に対する基質になる。したがって、活性化物質はガンマ標識ＧＴＰからシンチレ
ーションカウンターを用いてアッセイできる受容体への32Ｐの転移を促進するで
あろう。Ｃ末端尾部のリン酸化はアレスチン様タンパク質の結合を促進し、また
Ｇタンパク質の結合を妨げるであろう。キナーゼ／アレスチン経路は多数のＧＰ
ＣＲｓの脱感作における主要な役割を果たす。例えば、味覚受容体が活性を保っ
ている時間を調節する化合物は適切な味覚を持続し好ましくない味覚を排除する
方法として有用である。ＧＰＣＲシグナル形質導入の全般的な検討及びシグナル
形質導入をアッセイする方法のためには、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，ｖｏｌｓ．２３７，２３８（１９９４）及びｖｏｌｕｍｅ ９６（１
９８３）；Ｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１０：３４９：１１７
−２７（１９９１）；Ｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：１
２５−３２（１９９０）；Ｐｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：６５３−９２（１９９８）を参照。
【０１９７】
Ｔ２Ｒ調節は、推定Ｔ２Ｒ調節剤で処理されたＴ２Ｒポリペプチドの反応を、
処理していない対照の検体の反応と比較することによってアッセイされる可能性
がある。このような推定Ｔ２Ｒ調節剤にはＴ２Ｒポリペプチド活性を阻害あるい
は活性化する呈味物質が含まれる。一つの態様として、対照検体（活性化物質あ
るいは阻害物質で処理されていない）のＴ２Ｒ比活性値を１００と定める。Ｔ２
Ｒ活性が対照と比べて約９０％（オプションとして５０％又は２５−０％）であ
る時Ｔ２Ｒポリペプチドの阻害が達成される。対照と比較したＴ２Ｒ活性値が１
１０％、任意に１５０％、２００−５００％、もしくは１０００−２０００％で
ある場合、Ｔ２Ｒポリペプチドの阻害が起こる。
処理していない対照の検体の反応と比較することによってアッセイされる可能性
がある。このような推定Ｔ２Ｒ調節剤にはＴ２Ｒポリペプチド活性を阻害あるい
は活性化する呈味物質が含まれる。一つの態様として、対照検体（活性化物質あ
るいは阻害物質で処理されていない）のＴ２Ｒ比活性値を１００と定める。Ｔ２
Ｒ活性が対照と比べて約９０％（オプションとして５０％又は２５−０％）であ
る時Ｔ２Ｒポリペプチドの阻害が達成される。対照と比較したＴ２Ｒ活性値が１
１０％、任意に１５０％、２００−５００％、もしくは１０００−２０００％で
ある場合、Ｔ２Ｒポリペプチドの阻害が起こる。
【０１９８】
イオン流束の変化はＴ２Ｒポリペプチドの発現する細胞または膜のイオン分極
（即ち、電気的電位）の変化を測定することによって評価できる。細胞分極の変
化を測定する一つの方法は電圧固定法及びパッチ固定法を用いた電流の変化を測
定する方法（それによって分極の変化を測定する）である（例えば、「細胞−付
着」様式、インサイド−アウト様式、及び「全細胞」様式、Ａｃｋｅｒｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．，３３６：１５７５−９５（１
９９７）参照）。全細胞の電流は既知の標準を用いて都合よく測定される。他の
知られているアッセイには：放射能標識イオン流束アッセイ、電圧感受性染料を
用いた蛍光アッセイが含まれる（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎ
ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．，８８：６７−７５（１
９８８）；Ｇｏｎｚａｌｅｓ ＆ Ｔｓｉｅｎ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：２
６９−７７（１９９７）；Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．Ｍｅｔｈ．，２５：１８５−９３（１９９１）；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３７：５９−７０（１
９９４）参照）。一般的に、試験が行なわれる化合物は１ｐＭから１００ｍＭの
範囲にある。
（即ち、電気的電位）の変化を測定することによって評価できる。細胞分極の変
化を測定する一つの方法は電圧固定法及びパッチ固定法を用いた電流の変化を測
定する方法（それによって分極の変化を測定する）である（例えば、「細胞−付
着」様式、インサイド−アウト様式、及び「全細胞」様式、Ａｃｋｅｒｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．，３３６：１５７５−９５（１
９９７）参照）。全細胞の電流は既知の標準を用いて都合よく測定される。他の
知られているアッセイには：放射能標識イオン流束アッセイ、電圧感受性染料を
用いた蛍光アッセイが含まれる（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎ
ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．，８８：６７−７５（１
９８８）；Ｇｏｎｚａｌｅｓ ＆ Ｔｓｉｅｎ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：２
６９−７７（１９９７）；Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．Ｍｅｔｈ．，２５：１８５−９３（１９９１）；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３７：５９−７０（１
９９４）参照）。一般的に、試験が行なわれる化合物は１ｐＭから１００ｍＭの
範囲にある。
【０１９９】
Ｔ２Ｒポリペプチドの機能に対する試験化合物の効力は上記のパラメータのい
ずれかを調べることによって測定できる。ＧＰＣＲ活性に影響を与える適当ない
ずれかの生理学的変化が本発明のＴ２Ｒポリペプチドに対する試験化合物の影響
を評価するために用いられる。機能性が無傷の細胞もしくは哺乳動物を用いて測
定された場合、伝達物質放出、ホルモン放出、周知の記載されていない遺伝子マ
ーカー（例えば、ノーザンブロット）、細胞の成長あるいはｐＨ変化のような細
胞代謝の変化、及びＣａ2+、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、もしくはｃＡＭＰのような細胞
内セカンドメッセンジャーの変化のような異なった効果を測定することもできる
。
ずれかを調べることによって測定できる。ＧＰＣＲ活性に影響を与える適当ない
ずれかの生理学的変化が本発明のＴ２Ｒポリペプチドに対する試験化合物の影響
を評価するために用いられる。機能性が無傷の細胞もしくは哺乳動物を用いて測
定された場合、伝達物質放出、ホルモン放出、周知の記載されていない遺伝子マ
ーカー（例えば、ノーザンブロット）、細胞の成長あるいはｐＨ変化のような細
胞代謝の変化、及びＣａ2+、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、もしくはｃＡＭＰのような細胞
内セカンドメッセンジャーの変化のような異なった効果を測定することもできる
。
【０２００】
ＧＰＣＲｓの好ましいアッセイには受容体活性を報告するために、イオンある
いは電圧感受性染料で充填された細胞が含まれる。このような受容体の活性を測
定するアッセイは試験化合物を評価するために負の対照もしくは正の対照として
周知のＧタンパク質共役受容体の作動薬及び阻害薬も利用できる。調節化合物（
例えば、作動薬、阻害薬）を確認するアッセイでは、細胞質あるいは膜電位のイ
オン濃度の変化が、それぞれイオン感受性もしくは膜電位蛍光指示薬を用いてモ
ニターされる。イオン感受性指示薬と電位との間に、使用されたプローブはｔｈ
ｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ １９９７ Ｃａｔａｌｏｇに開示され
たプローブである。ＧＰＣＲｓのために、Ｇα１５及びＧα１６のような相手を
選ばないＧタンパク質は選択のアッセイに利用できる（Ｗｉｌｋｉｅ ｅｔ ａ
ｌ．，ＰＮＡＳ，８８：１００４９−５３（１９９１））。このような相手を選
ばないＧタンパク質のために受容体の広範囲の共役が可能になる。
いは電圧感受性染料で充填された細胞が含まれる。このような受容体の活性を測
定するアッセイは試験化合物を評価するために負の対照もしくは正の対照として
周知のＧタンパク質共役受容体の作動薬及び阻害薬も利用できる。調節化合物（
例えば、作動薬、阻害薬）を確認するアッセイでは、細胞質あるいは膜電位のイ
オン濃度の変化が、それぞれイオン感受性もしくは膜電位蛍光指示薬を用いてモ
ニターされる。イオン感受性指示薬と電位との間に、使用されたプローブはｔｈ
ｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ １９９７ Ｃａｔａｌｏｇに開示され
たプローブである。ＧＰＣＲｓのために、Ｇα１５及びＧα１６のような相手を
選ばないＧタンパク質は選択のアッセイに利用できる（Ｗｉｌｋｉｅ ｅｔ ａ
ｌ．，ＰＮＡＳ，８８：１００４９−５３（１９９１））。このような相手を選
ばないＧタンパク質のために受容体の広範囲の共役が可能になる。
【０２０１】
受容体活性化は代表的には細胞内事象、例えば細胞内に蓄積したカルシウムイ
オンを放出するＩＰ３のようなセカンドメッセンジャーの増加を起動する。一部
のＧＰＣＲｓの活性化はホスファチジルイノシトールのホスホリパーゼＣ−仲介
加水分解によってイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（Ｂｅｒｒ
ｉｄｇｅ ＆ Ｉｒｖｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３１５−２１（１９８４
））。同様にＩＰ３は細胞内に蓄積したカルシウムイオンの放出を刺激する。し
たがって、細胞質カルシウムイオン濃度の変化もしくはＩＰ３のようなセカンド
メッセンジャー濃度の変化はＧＰＣＲ機能を評価するために利用できる。このよ
うなＧＰＣＲｓを発現する細胞は細胞内蓄積からまたイオンチャンネルの活性化
を通して寄与する結果細胞質カルシウム濃度の増加を阻害する可能性がある。こ
の場合、細胞内部の蓄積からカルシウムを放出する結果蛍光反応を識別するため
に、カルシウムを含有しない、任意にＥＧＴＡのようなキレート形成物質で補足
された緩衝液内でこのようなアッセイを実施することは必要ではないが、望まし
い。
オンを放出するＩＰ３のようなセカンドメッセンジャーの増加を起動する。一部
のＧＰＣＲｓの活性化はホスファチジルイノシトールのホスホリパーゼＣ−仲介
加水分解によってイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（Ｂｅｒｒ
ｉｄｇｅ ＆ Ｉｒｖｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３１５−２１（１９８４
））。同様にＩＰ３は細胞内に蓄積したカルシウムイオンの放出を刺激する。し
たがって、細胞質カルシウムイオン濃度の変化もしくはＩＰ３のようなセカンド
メッセンジャー濃度の変化はＧＰＣＲ機能を評価するために利用できる。このよ
うなＧＰＣＲｓを発現する細胞は細胞内蓄積からまたイオンチャンネルの活性化
を通して寄与する結果細胞質カルシウム濃度の増加を阻害する可能性がある。こ
の場合、細胞内部の蓄積からカルシウムを放出する結果蛍光反応を識別するため
に、カルシウムを含有しない、任意にＥＧＴＡのようなキレート形成物質で補足
された緩衝液内でこのようなアッセイを実施することは必要ではないが、望まし
い。
【０２０２】
他のアッセイには、活性化した場合、アデニルサイクレースのような酵素を活
性化あるいは阻害することによって、細胞内環状ヌクレオチド、たとえばｃＡＭ
ＰもしくはｃＧＭＰの濃度を変化させる受容体の活性を測定することが含まれる
。環状ヌクレオチドゲートをもつイオンチャンネル、例えばｃＡＭＰまたはｃＧ
ＭＰの結合による活性化において陽イオンに対して透過性がある桿菌光受容体細
胞チャンネル及び嗅覚神経チャンネルが存在する（例えば、Ａｌｔｅｎｈｏｆｅ
ｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８８：９８６８−７２（１９９１）；Ｄｈａｌｌ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４７：１８４−８７（１９９０）参照）
。受容体の活性化が環状ヌクレオチド濃度の減少を引き起こす場合、アッセイに
おいて、細胞に受容体活性化化合物を追加する前に、細胞内環状ヌクレオチド濃
度を増加させる薬剤（例えば、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ））に細胞
を曝露させることが好ましいであろう。このタイプのアッセイに使用される細胞
は環状ヌクレオチドの詰まったイオンチャンネルをコードするＤＮＡ、ＧＰＣＲ
ホスファターゼ及び受容体（例えば、ある種のグルタミン酸受容体、ムスカリン
様アセチルコリン受容体、ドパミン受容体、セロトニン受容体等）をコードする
ＤＮＡをもつ宿主細胞の共移入によって作製することができる。これらの受容体
は活性化された場合、細胞質の環状ヌクレオチド濃度に変化をおこす。
性化あるいは阻害することによって、細胞内環状ヌクレオチド、たとえばｃＡＭ
ＰもしくはｃＧＭＰの濃度を変化させる受容体の活性を測定することが含まれる
。環状ヌクレオチドゲートをもつイオンチャンネル、例えばｃＡＭＰまたはｃＧ
ＭＰの結合による活性化において陽イオンに対して透過性がある桿菌光受容体細
胞チャンネル及び嗅覚神経チャンネルが存在する（例えば、Ａｌｔｅｎｈｏｆｅ
ｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８８：９８６８−７２（１９９１）；Ｄｈａｌｌ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４７：１８４−８７（１９９０）参照）
。受容体の活性化が環状ヌクレオチド濃度の減少を引き起こす場合、アッセイに
おいて、細胞に受容体活性化化合物を追加する前に、細胞内環状ヌクレオチド濃
度を増加させる薬剤（例えば、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ））に細胞
を曝露させることが好ましいであろう。このタイプのアッセイに使用される細胞
は環状ヌクレオチドの詰まったイオンチャンネルをコードするＤＮＡ、ＧＰＣＲ
ホスファターゼ及び受容体（例えば、ある種のグルタミン酸受容体、ムスカリン
様アセチルコリン受容体、ドパミン受容体、セロトニン受容体等）をコードする
ＤＮＡをもつ宿主細胞の共移入によって作製することができる。これらの受容体
は活性化された場合、細胞質の環状ヌクレオチド濃度に変化をおこす。
【０２０３】
好ましい態様として、Ｔ２Ｒポリペプチド活性はホスホリパーゼＣシグナル形
質導入経路に受容体を連結する相手を選ばないＧタンパク質をもつ非相同細胞の
Ｔ２Ｒ遺伝子を発現することによって測定される（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ ＆
Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５１７５−８０（１９９５
）を参照）。任意に細胞系はＨＥＫ−２９３（Ｔ２Ｒ遺伝子を自然に発現しない
）でありまた相手を選ばないＧタンパク質はＧα１５である（Ｏｆｆｅｒｍａｎ
ｎｓ ＆ Ｓｉｍｏｎ，前記）。味覚形質導入の調節はＴ２Ｒポリペプチドと結
合する分子の投与によりＴ２Ｒシグナル形質導入の調節に反応して変化する、細
胞内Ｃａ2+濃度の変化を測定することによって分析する。Ｃａ2+濃度の変化は任
意に蛍光Ｃａ2+指示色素及び蛍光測定画像法をもちいて測定する。
質導入経路に受容体を連結する相手を選ばないＧタンパク質をもつ非相同細胞の
Ｔ２Ｒ遺伝子を発現することによって測定される（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ ＆
Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５１７５−８０（１９９５
）を参照）。任意に細胞系はＨＥＫ−２９３（Ｔ２Ｒ遺伝子を自然に発現しない
）でありまた相手を選ばないＧタンパク質はＧα１５である（Ｏｆｆｅｒｍａｎ
ｎｓ ＆ Ｓｉｍｏｎ，前記）。味覚形質導入の調節はＴ２Ｒポリペプチドと結
合する分子の投与によりＴ２Ｒシグナル形質導入の調節に反応して変化する、細
胞内Ｃａ2+濃度の変化を測定することによって分析する。Ｃａ2+濃度の変化は任
意に蛍光Ｃａ2+指示色素及び蛍光測定画像法をもちいて測定する。
【０２０４】
一つの態様として、細胞内ｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰは免疫アッセイを用いて
測定できる。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ ＆ Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．
，２７０：１５１７５−１８０（１９９５）に記載された手法はｃＡＭＰの濃度
を測定するために利用されるであろう。また、Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏｅｔ
ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ及び Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：１５
９−６４（１９９４）に記載された手法はｃＧＭＰの濃度を測定するために用い
られるであろう。さらに、ｃＡＭＰ及び／もしくはｃＧＭＰを測定するためのア
ッセイキットは米国特許４，１１５，５３８に記載されており、この文書の中の
参考文献に組み入れている。
測定できる。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ ＆ Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．
，２７０：１５１７５−１８０（１９９５）に記載された手法はｃＡＭＰの濃度
を測定するために利用されるであろう。また、Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏｅｔ
ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ及び Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：１５
９−６４（１９９４）に記載された手法はｃＧＭＰの濃度を測定するために用い
られるであろう。さらに、ｃＡＭＰ及び／もしくはｃＧＭＰを測定するためのア
ッセイキットは米国特許４，１１５，５３８に記載されており、この文書の中の
参考文献に組み入れている。
【０２０５】
他の具体例として、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解は米国特許
５，４３６，１２８に従って解析が可能で、この文書の中の参考文献に組み入れ
ている。簡潔に言えば、このアッセイには４８時間以上の3Ｈ−ミオイノシトー
ルによる細胞標識が含まれる。標識細胞は１時間試験化合物で処理する。処理し
た細胞を溶解し、またクロロホルム−メタノール−水で抽出する。その後リン酸
イノシトールをイオン交換クロマトグラフィーで分離し、シンチレーション計数
により定量する。ヒダ刺激は緩衝液対照の存在下でのｃｐｍに対する作動薬の存
在下でのｃｐｍの比を計算することによって測定する。同様にヒダ阻害は緩衝液
対照の存在下でのｃｐｍに対する阻害薬の存在下でのｃｐｍの比を計算すること
によって測定する（作動薬を含むことが可能かどうか）。
５，４３６，１２８に従って解析が可能で、この文書の中の参考文献に組み入れ
ている。簡潔に言えば、このアッセイには４８時間以上の3Ｈ−ミオイノシトー
ルによる細胞標識が含まれる。標識細胞は１時間試験化合物で処理する。処理し
た細胞を溶解し、またクロロホルム−メタノール−水で抽出する。その後リン酸
イノシトールをイオン交換クロマトグラフィーで分離し、シンチレーション計数
により定量する。ヒダ刺激は緩衝液対照の存在下でのｃｐｍに対する作動薬の存
在下でのｃｐｍの比を計算することによって測定する。同様にヒダ阻害は緩衝液
対照の存在下でのｃｐｍに対する阻害薬の存在下でのｃｐｍの比を計算すること
によって測定する（作動薬を含むことが可能かどうか）。
【０２０６】
他の態様として、転写レベルはシグナル形質導入における試験化合物の効力を
評価するために測定が可能である。Ｔ２Ｒポリペプチドを含む宿主細胞はいずれ
かの相互作用をもたらすのに十分な時間試験化合物と接触させ、その後興味深い
タンパク質の遺伝子発現のレベルを測定する。このような相互作用をもたらすた
めの時間はタイムコースをとりまた時間の関数として転写のレベルを測定するこ
とによって経験的に測定されるであろう。転写の量は当業者にとって適切な周知
の手法で測定する。例えば、興味深いタンパク質のｍＲＮＡ発現はノーザンブロ
ット法を用いて検出し、あるいはそれらのポリペプチド生成物は免疫アッセイを
利用して確認する。他方、リポーター遺伝子を用いた転写に基づくアッセイは米
国特許５，４３６，１２８に記載され、この文書の参考文献に組み入れている。
リポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、ルシフェラーゼ、３’−ガラクトシダーゼ及びアルカリフォスファターゼで
ある。さらに、興味深いタンパク質は緑色蛍光タンパク質のようなセカンドリポ
ーターに付着することにより間接リポーターとして利用できる（例えば、Ｍｉｓ
ｔｉｌｉ ＆ Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１５：９６１−６４（１９９７）参照）。
評価するために測定が可能である。Ｔ２Ｒポリペプチドを含む宿主細胞はいずれ
かの相互作用をもたらすのに十分な時間試験化合物と接触させ、その後興味深い
タンパク質の遺伝子発現のレベルを測定する。このような相互作用をもたらすた
めの時間はタイムコースをとりまた時間の関数として転写のレベルを測定するこ
とによって経験的に測定されるであろう。転写の量は当業者にとって適切な周知
の手法で測定する。例えば、興味深いタンパク質のｍＲＮＡ発現はノーザンブロ
ット法を用いて検出し、あるいはそれらのポリペプチド生成物は免疫アッセイを
利用して確認する。他方、リポーター遺伝子を用いた転写に基づくアッセイは米
国特許５，４３６，１２８に記載され、この文書の参考文献に組み入れている。
リポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、ルシフェラーゼ、３’−ガラクトシダーゼ及びアルカリフォスファターゼで
ある。さらに、興味深いタンパク質は緑色蛍光タンパク質のようなセカンドリポ
ーターに付着することにより間接リポーターとして利用できる（例えば、Ｍｉｓ
ｔｉｌｉ ＆ Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１５：９６１−６４（１９９７）参照）。
【０２０７】
転写の量はその後試験化合物の存在しない同様の細胞の転写量と比較するか、
あるいはＴ２Ｒポリペプチドの存在しないかなり一致する細胞の転写量と比較す
るであろう。かなり一致する細胞はその細胞から組換え細胞が調製されたが非相
同ＤＮＡの導入によって修飾されなかった同様の細胞由来である。転写量の差は
試験化合物がなんらかの方法で興味深いＴ２Ｒポリペプチドの活性を変えたとい
うことを示している。
あるいはＴ２Ｒポリペプチドの存在しないかなり一致する細胞の転写量と比較す
るであろう。かなり一致する細胞はその細胞から組換え細胞が調製されたが非相
同ＤＮＡの導入によって修飾されなかった同様の細胞由来である。転写量の差は
試験化合物がなんらかの方法で興味深いＴ２Ｒポリペプチドの活性を変えたとい
うことを示している。
【０２０８】
６．形質転換非ヒト哺乳動物発現味覚受容体
本発明の一つ以上のＴ２Ｒポリペプチドを発現する非ヒト哺乳動物はまたアッ
セイに利用できる。このような発現は、試験化合物によってＴ２Ｒポリペプチド
もしくはそのリガンド結合領域をコードする核酸を用いて非ヒト哺乳動物に安定
して接触するかあるいは一過性に移入することによって、また哺乳動物がポリペ
プチドに特異的に結合することによって試験化合物に反応するかどうか確認する
ことによってインビボにおける哺乳動物Ｔ２Ｒポリペプチドに試験化合物が結合
するかどうか確認するために利用できる。
セイに利用できる。このような発現は、試験化合物によってＴ２Ｒポリペプチド
もしくはそのリガンド結合領域をコードする核酸を用いて非ヒト哺乳動物に安定
して接触するかあるいは一過性に移入することによって、また哺乳動物がポリペ
プチドに特異的に結合することによって試験化合物に反応するかどうか確認する
ことによってインビボにおける哺乳動物Ｔ２Ｒポリペプチドに試験化合物が結合
するかどうか確認するために利用できる。
【０２０９】
本発明のベクターにより移入され、感染した哺乳動物は、特に個々の受容体も
しくは集団の受容体に結合できる呈味物質／リガンドを確認し特徴づけるための
アッセイに有用である。ヒト化学感覚受容体配列を発現するこのようなベクター
−感染哺乳動物はインビボにおける呈味物質及び例えば細胞生理学（例えば、味
覚神経）、核酸中枢神経系（ＣＮＳ）に対するその効力あるいは反応を選別する
ために利用できる。
しくは集団の受容体に結合できる呈味物質／リガンドを確認し特徴づけるための
アッセイに有用である。ヒト化学感覚受容体配列を発現するこのようなベクター
−感染哺乳動物はインビボにおける呈味物質及び例えば細胞生理学（例えば、味
覚神経）、核酸中枢神経系（ＣＮＳ）に対するその効力あるいは反応を選別する
ために利用できる。
【０２１０】
核酸及びベクターを、個々にもしくはライブラリーとして、感染／発現する方
法は当業者にはよく知られている。異なった個々の細胞、器官、もしくは全体の
哺乳動物パラメータが異なる方法で測定できる。本発明のＴ２Ｒ配列は例として
感染物資、例えばアデノウイルス発現ベクターによって哺乳動物の味覚組織に発
現できる。
法は当業者にはよく知られている。異なった個々の細胞、器官、もしくは全体の
哺乳動物パラメータが異なる方法で測定できる。本発明のＴ２Ｒ配列は例として
感染物資、例えばアデノウイルス発現ベクターによって哺乳動物の味覚組織に発
現できる。
【０２１１】
内因性化学感覚受容体遺伝子は依然機能を果たし、野生型（自然のまま）の活性
はまだ存在可能である。他の状況では、すべての化学感覚受容体活性が導入され
た外因性ハイブリッド受容体によるということが望ましい場合、ノックアウト系
を利用することが好ましい。非ヒト形質転換哺乳動物の構築法、特に形質転換マ
ウス、及び形質転換細胞を生じる組換えの選択と調製が当業者にはよく知られて
いる。
はまだ存在可能である。他の状況では、すべての化学感覚受容体活性が導入され
た外因性ハイブリッド受容体によるということが望ましい場合、ノックアウト系
を利用することが好ましい。非ヒト形質転換哺乳動物の構築法、特に形質転換マ
ウス、及び形質転換細胞を生じる組換えの選択と調製が当業者にはよく知られて
いる。
【０２１２】
「ノックアウト」細胞及び動物の構築は哺乳動物の細胞における個々の遺伝の
発現レベルが抑制された遺伝子の一部のＤＮＡ配列を妨げることを助ける新規の
ゲノムＤＮＡ配列に導入することによって減少あるいは完全に妨げられる可能性
があるという前提に基づいている。また、「遺伝子捕捉挿入」は宿主細胞分離す
るために利用でき、またマウス胚芽幹（ＥＳ）細胞はノックアウト形質転換動物
を作製するために利用できる（例えば、Ｈｏｌｚｓｃｈｕ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ Ｒｅｓ，６：９７−１０６（１９９７）参照）。外因性物質の挿入は代表的
には相補性核酸と配列の間の相同組換えによって行なわれる。外因性配列は外因
性の、イントロンの転写制御配列、標的遺伝子の発現レベルに影響を与える可能
性のあるあらゆるゲノム配列；あるいはその組み合わせのような修飾された一部
の標的遺伝子である。分化可能な胚芽幹細胞の相同組換えによる遺伝子標的が興
味深いゲノム配列を正確に修飾が可能にする。ノックアウト動物を作製し選別し
増殖させるためにあらゆる方法が利用できる。例えば、Ｂｉｊｖｏｅｔ，Ｈｕｍ
．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７：５３−６２（１９９８）；Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，
Ｊ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．，７５：２０８−１６（１９９７）；Ｔｏｊｏ，Ｃｙｔｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：１６１−１６５（１９９５）；Ｍｕｄｇｅｔｔ，
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：１６７−１８４（１９９５）；Ｌ
ｏｎｇｏ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，６：３２１−３２８（１９９７）
；米国特許５，６１６，４９１；５，４６４，７６４；５，６３１，１５３；５
，４８７，９９２；５，６２７，０５９；５，２７２，０７１；ＷＯ ９１／０
９９５５；ＷＯ ９３／０９２２２；ＷＯ ９６／２９４１１；ＷＯ ９５／３
１５６０；ＷＯ ９１／１２６５０。
発現レベルが抑制された遺伝子の一部のＤＮＡ配列を妨げることを助ける新規の
ゲノムＤＮＡ配列に導入することによって減少あるいは完全に妨げられる可能性
があるという前提に基づいている。また、「遺伝子捕捉挿入」は宿主細胞分離す
るために利用でき、またマウス胚芽幹（ＥＳ）細胞はノックアウト形質転換動物
を作製するために利用できる（例えば、Ｈｏｌｚｓｃｈｕ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ Ｒｅｓ，６：９７−１０６（１９９７）参照）。外因性物質の挿入は代表的
には相補性核酸と配列の間の相同組換えによって行なわれる。外因性配列は外因
性の、イントロンの転写制御配列、標的遺伝子の発現レベルに影響を与える可能
性のあるあらゆるゲノム配列；あるいはその組み合わせのような修飾された一部
の標的遺伝子である。分化可能な胚芽幹細胞の相同組換えによる遺伝子標的が興
味深いゲノム配列を正確に修飾が可能にする。ノックアウト動物を作製し選別し
増殖させるためにあらゆる方法が利用できる。例えば、Ｂｉｊｖｏｅｔ，Ｈｕｍ
．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７：５３−６２（１９９８）；Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，
Ｊ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．，７５：２０８−１６（１９９７）；Ｔｏｊｏ，Ｃｙｔｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：１６１−１６５（１９９５）；Ｍｕｄｇｅｔｔ，
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：１６７−１８４（１９９５）；Ｌ
ｏｎｇｏ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，６：３２１−３２８（１９９７）
；米国特許５，６１６，４９１；５，４６４，７６４；５，６３１，１５３；５
，４８７，９９２；５，６２７，０５９；５，２７２，０７１；ＷＯ ９１／０
９９５５；ＷＯ ９３／０９２２２；ＷＯ ９６／２９４１１；ＷＯ ９５／３
１５６０；ＷＯ ９１／１２６５０。
【０２１３】
本発明の核酸はまた「ノックアウト」ヒト細胞及びその子孫を作製する物質と
して利用できる。同様に、本発明の核酸はまたマウスの「ノックイン」を作製す
るための物質として利用可能である。ヒトもしくはラットのＴ２Ｒ遺伝子配列は
マウスのゲノムのオルソログＴ２Ｒに置換できる。この方法で、ヒトもしくはラ
ットのＴ２Ｒを発現するマウスが作製される。このマウスはヒトあるいはラット
のＴ２Ｒの機能を解析し、またこのようなＴ２Ｒに対するリガンドを確認するた
めに利用できる。
して利用できる。同様に、本発明の核酸はまたマウスの「ノックイン」を作製す
るための物質として利用可能である。ヒトもしくはラットのＴ２Ｒ遺伝子配列は
マウスのゲノムのオルソログＴ２Ｒに置換できる。この方法で、ヒトもしくはラ
ットのＴ２Ｒを発現するマウスが作製される。このマウスはヒトあるいはラット
のＴ２Ｒの機能を解析し、またこのようなＴ２Ｒに対するリガンドを確認するた
めに利用できる。
【０２１４】
Ｆ．調節剤
Ｔ２Ｒファミリーメンバーの調節剤として試験が行なわれた化合物はタンパク
質、砂糖、核酸もしくは脂肪のような低分子化学化合物、あるいは生物学的物質
である。他方、調節剤はＴ２Ｒファミリーメンバーの遺伝的変更されたバージョ
ンである可能性がある。代表的には、試験化合物は小さな化学分子及びペプチド
であろう。多くの場合化合物は用いられる水溶液もしくは有機（とりわけＤＭＳ
Ｏに基づいた）溶液に溶解することができる。本質的には化学的化合物は本発明
のアッセイの潜在的な調節剤あるいはリガンドとして利用できる。このアッセイ
はアッセイの段階を自動化することによってまた代表的には並行して実行される
アッセイのために都合の良い発生源から得られた化合物を提供することによって
大きな化学的ライブラリーを選別するよう設計されるだろう（例えばロボット（
ｒｏｂｏｔｉｃ）アッセイにおけるマイクロプレートの微量滴定フォーマット）
。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ミズーリ州）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズ
ーリ州）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔ
ｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，スイス）等含む化学化合物の多くの製造業者があることが
評価されるであろう。
質、砂糖、核酸もしくは脂肪のような低分子化学化合物、あるいは生物学的物質
である。他方、調節剤はＴ２Ｒファミリーメンバーの遺伝的変更されたバージョ
ンである可能性がある。代表的には、試験化合物は小さな化学分子及びペプチド
であろう。多くの場合化合物は用いられる水溶液もしくは有機（とりわけＤＭＳ
Ｏに基づいた）溶液に溶解することができる。本質的には化学的化合物は本発明
のアッセイの潜在的な調節剤あるいはリガンドとして利用できる。このアッセイ
はアッセイの段階を自動化することによってまた代表的には並行して実行される
アッセイのために都合の良い発生源から得られた化合物を提供することによって
大きな化学的ライブラリーを選別するよう設計されるだろう（例えばロボット（
ｒｏｂｏｔｉｃ）アッセイにおけるマイクロプレートの微量滴定フォーマット）
。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ミズーリ州）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズ
ーリ州）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔ
ｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，スイス）等含む化学化合物の多くの製造業者があることが
評価されるであろう。
【０２１５】
一つの態様として高処理スクリーニング法には多数の可能性のある治療的化合
物（潜在的な調節剤あるいはリガンド化合物）を含む組み合わせ化学的あるいは
ペプチドライブラリー供給することが含まれる。このような「組み合わせ化学ラ
イブラリー」あるいは「リガンドライブラリー」はその後適切な特徴を持つ活性
を示すライブラリーメンバー（個々の化学種もしくは小区分）を確認するために
、上記のように、一つ以上のアッセイで選別される。従って確認された化合物は
都合よく「化合物を導く」ように働きあるいは潜在的なもしくは現実の消費物質
として利用できる。
物（潜在的な調節剤あるいはリガンド化合物）を含む組み合わせ化学的あるいは
ペプチドライブラリー供給することが含まれる。このような「組み合わせ化学ラ
イブラリー」あるいは「リガンドライブラリー」はその後適切な特徴を持つ活性
を示すライブラリーメンバー（個々の化学種もしくは小区分）を確認するために
、上記のように、一つ以上のアッセイで選別される。従って確認された化合物は
都合よく「化合物を導く」ように働きあるいは潜在的なもしくは現実の消費物質
として利用できる。
【０２１６】
組み合わせ化学ライブラリーは化学的合成あるいは生物学的合成によって、試
薬のような多数の化学的な「構築ブロック」を結合することによって生成した異
なった化学的化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリー
のような直線的な組み合わせ化学ライブラリーは既定の化合物の長さ（すなわち
、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）に対してすべての可能な方法で一連の化
学的構築ブロックを結合することによって形成される。何百万もの化学化合物が
化学的構築ブロックのこのような組み合わせによる混合によって合成できる。
薬のような多数の化学的な「構築ブロック」を結合することによって生成した異
なった化学的化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリー
のような直線的な組み合わせ化学ライブラリーは既定の化合物の長さ（すなわち
、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）に対してすべての可能な方法で一連の化
学的構築ブロックを結合することによって形成される。何百万もの化学化合物が
化学的構築ブロックのこのような組み合わせによる混合によって合成できる。
【０２１７】
組み合わせ化学ライブラリーの調製及び選別は当業者にはよく知られている。
このような組み合わせ化学ライブラリーには、これに限ったことではないが、ペ
プチドライブラリーが含まれる（例えば米国特許５，０１０，１７５、Ｆｕｒｋ
ａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−９３（１９９
１）及びＨｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８（
１９９１）を参照）。化学的多様性ライブラリーを作製するための他の化学的方
法も利用できる。このような化学的方法には、これに限ったことではないが：ペ
プトイド（例えば、ＷＯ ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば
、ＷＯ ９３／２０２４２）、ランダム生体オリゴマー（例えば、ＷＯ ９２／
０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許５，２８８，５１４）、ヒ
ダントイン、ベンゾジアゾピン及びジペプチドのようなｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ
（Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．，９０：６９０９−１３（１９９３）
）、ビニール様ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格をも
つ非ペプチド疑似ペプチド（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：９２１７−１８（１９９２）、低分子化合物
ライブラリーの類似した有機合成（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメイト（Ｃ
ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１３０３（１９９３））、ペプ
チジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ
．，５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒ
ｇｅｒ，及びＳａｍｂｒｏｏｋ，全て前記）、ペプチド核酸ライブラリー（米国
特許５，５３９，０８３）、抗体ライブラリー（Ｖａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−１４（１９
９６）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、カルボハイドレートライブラリー
（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−２２（１９
９６）及び米国特許５，５９３，８５３）、有機低分子ライブラリー（ベンゾジ
アゼピン類、Ｂａｕｍ，Ｃ ＆ ＥＮ，Ｊａｎ １８；ｐａｇｅ ３３（１９９
３）；チアゾリジノン類及びメタチアザノン類、米国特許５，５４９，９７４；
ピンロリジン類、米国特許５，５２５，７３５及び５，５１９，１３４；モルホ
リノ化合物、米国特許５，５０６，３３７；ベンゾジアゼピン類、５，２８８，
５１４等）。
このような組み合わせ化学ライブラリーには、これに限ったことではないが、ペ
プチドライブラリーが含まれる（例えば米国特許５，０１０，１７５、Ｆｕｒｋ
ａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−９３（１９９
１）及びＨｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８（
１９９１）を参照）。化学的多様性ライブラリーを作製するための他の化学的方
法も利用できる。このような化学的方法には、これに限ったことではないが：ペ
プトイド（例えば、ＷＯ ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば
、ＷＯ ９３／２０２４２）、ランダム生体オリゴマー（例えば、ＷＯ ９２／
０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許５，２８８，５１４）、ヒ
ダントイン、ベンゾジアゾピン及びジペプチドのようなｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ
（Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．，９０：６９０９−１３（１９９３）
）、ビニール様ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格をも
つ非ペプチド疑似ペプチド（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：９２１７−１８（１９９２）、低分子化合物
ライブラリーの類似した有機合成（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメイト（Ｃ
ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１：１３０３（１９９３））、ペプ
チジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ
．，５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｅｒ
ｇｅｒ，及びＳａｍｂｒｏｏｋ，全て前記）、ペプチド核酸ライブラリー（米国
特許５，５３９，０８３）、抗体ライブラリー（Ｖａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−１４（１９
９６）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、カルボハイドレートライブラリー
（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−２２（１９
９６）及び米国特許５，５９３，８５３）、有機低分子ライブラリー（ベンゾジ
アゼピン類、Ｂａｕｍ，Ｃ ＆ ＥＮ，Ｊａｎ １８；ｐａｇｅ ３３（１９９
３）；チアゾリジノン類及びメタチアザノン類、米国特許５，５４９，９７４；
ピンロリジン類、米国特許５，５２５，７３５及び５，５１９，１３４；モルホ
リノ化合物、米国特許５，５０６，３３７；ベンゾジアゼピン類、５，２８８，
５１４等）。
【０２１８】
組み合わせライブラリーの調製のための装置は市販で入手できる（例えば、３
５７ ＭＰＳ，３９０ ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏ
ｕｉｓｖｉｌｌｅ，ケンタッキー州）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏ
ｂｕｒｎ，マサチューセッツ州）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）、９０５０ Ｐｌｕｓ（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ベッドフォード、マサチューセッツ州））。さらに、多数
の組み合わせライブラリーが市販で入手可能である（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ
，プリンストン、ニュージャージー州；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，セントルイス
、ミズーリ州；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ペンシル
ベニア州；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；コロンビア、メリーランド
州等）。
５７ ＭＰＳ，３９０ ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏ
ｕｉｓｖｉｌｌｅ，ケンタッキー州）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏ
ｂｕｒｎ，マサチューセッツ州）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）、９０５０ Ｐｌｕｓ（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ベッドフォード、マサチューセッツ州））。さらに、多数
の組み合わせライブラリーが市販で入手可能である（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ
，プリンストン、ニュージャージー州；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，セントルイス
、ミズーリ州；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ペンシル
ベニア州；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；コロンビア、メリーランド
州等）。
【０２１９】
本発明の一つの側面として、Ｔ２Ｒ調節剤はあらゆる食料品、菓子、薬剤、も
しくはその成分に利用し、その製品、製剤、もしくは成分の味覚を適切な方法で
調節できる。例えば、苦味の感覚を高めるＴ２Ｒ調節剤を加え製品もしくは製剤
に苦味を生じさせることができる。一方苦味の感覚を阻害するＴ２Ｒ調節剤を加
え製品あるいは製剤の味覚を改善することが可能である。
しくはその成分に利用し、その製品、製剤、もしくは成分の味覚を適切な方法で
調節できる。例えば、苦味の感覚を高めるＴ２Ｒ調節剤を加え製品もしくは製剤
に苦味を生じさせることができる。一方苦味の感覚を阻害するＴ２Ｒ調節剤を加
え製品あるいは製剤の味覚を改善することが可能である。
【０２２０】
Ｇ．味覚表現法と味覚予想法
本発明はまた好ましくはヒトを含む哺乳動物における味覚表現法及び／もしく
は味覚予想法を提供する。好ましくは、このような方法はこの文書の中に開示し
た上記のＴ２Ｒタンパク質をコードする受容体と遺伝子を用いて実施する。
は味覚予想法を提供する。好ましくは、このような方法はこの文書の中に開示し
た上記のＴ２Ｒタンパク質をコードする受容体と遺伝子を用いて実施する。
【０２２１】
また本発明の中で意図したものは、開示した受容体をもつ上記の一つ以上の化
合物に接触させることから成る哺乳動物によって検出可能な味覚の存在に関して
一つ以上の化合物を選別する方法であり、哺乳動物とは好ましくはヒトである。
また本発明の中で意図したものは、以下の段階からなる哺乳動物における個々の
味の感覚を表現する方法である：上記の脊椎動物のｎ個の味覚受容体のそれぞれ
の定量的刺激を表現した値Ｘ1からＸnを与えること（ここではｎは４以上である
）、また味覚の定量的表現を上記の値から作りだすこと。味覚受容体はこの文書
の中に開示された味覚受容体である可能性があり、その表現はｎ次元空間の点ま
たは体積を設定し、図表もしくはスペクトルを作り、また定量的表現の基盤を設
定するであろう。また、提供する段階は試験製剤により組換えによって作製され
た多数の味覚受容体に接触させること、及び上記の受容体をもつ上記の製剤の相
互作用を定量的に測定することから成る。
合物に接触させることから成る哺乳動物によって検出可能な味覚の存在に関して
一つ以上の化合物を選別する方法であり、哺乳動物とは好ましくはヒトである。
また本発明の中で意図したものは、以下の段階からなる哺乳動物における個々の
味の感覚を表現する方法である：上記の脊椎動物のｎ個の味覚受容体のそれぞれ
の定量的刺激を表現した値Ｘ1からＸnを与えること（ここではｎは４以上である
）、また味覚の定量的表現を上記の値から作りだすこと。味覚受容体はこの文書
の中に開示された味覚受容体である可能性があり、その表現はｎ次元空間の点ま
たは体積を設定し、図表もしくはスペクトルを作り、また定量的表現の基盤を設
定するであろう。また、提供する段階は試験製剤により組換えによって作製され
た多数の味覚受容体に接触させること、及び上記の受容体をもつ上記の製剤の相
互作用を定量的に測定することから成る。
【０２２２】
また本発明の中で意図したものは、以下の段階を含む哺乳動物の未知の味覚を
生み出す一つ以上の分子もしくは分子の組み合わせによって生じた哺乳動物の味
覚を予想する方法である：上記の脊椎動物のｎ個の味覚受容体のそれぞれの定量
的刺激を表現した値Ｘ1からＸnを与えること（ここでは哺乳動物の周知の味覚を
生み出す一つ以上の分子もしくは分子の組み合わせに対してｎは４以上である）
、また哺乳動物の周知の味覚を生み出す一つ以上の分子もしくは分子の組み合わ
せに対して哺乳動物の味覚の定量的表現を上記の値から作りだすこと。上記の脊
椎動物のｎ個の味覚受容体のそれぞれの定量的刺激を表現した値Ｘ1からＸnを与
えること（ここでは哺乳動物の未知の味覚を生み出す一つ以上の分子もしくは分
子の組み合わせに対してｎは４以上である）、また哺乳動物の未知の味覚を生み
出す一つ以上の分子もしくは分子の組み合わせに対して哺乳動物の味覚の定量的
表現を上記の値から作りだすこと、及び哺乳動物の未知の味覚を生み出す一つ以
上の分子あるいはその組み合わせに対して、哺乳動物における味覚の定量的表現
を、哺乳動物の既知の味覚を生み出す一つ以上の分子あるいはその組み合わせに
対する哺乳動物の味覚の定量的表現と比較することによって哺乳動物の未知の味
覚を生み出す一つ以上の分子またはその組み合わせによって作り出された哺乳動
物の味覚を予想すること。この方法で用いられた味覚受容体にはこの文書の中で
開示された味覚受容体が含まれるであろう。
生み出す一つ以上の分子もしくは分子の組み合わせによって生じた哺乳動物の味
覚を予想する方法である：上記の脊椎動物のｎ個の味覚受容体のそれぞれの定量
的刺激を表現した値Ｘ1からＸnを与えること（ここでは哺乳動物の周知の味覚を
生み出す一つ以上の分子もしくは分子の組み合わせに対してｎは４以上である）
、また哺乳動物の周知の味覚を生み出す一つ以上の分子もしくは分子の組み合わ
せに対して哺乳動物の味覚の定量的表現を上記の値から作りだすこと。上記の脊
椎動物のｎ個の味覚受容体のそれぞれの定量的刺激を表現した値Ｘ1からＸnを与
えること（ここでは哺乳動物の未知の味覚を生み出す一つ以上の分子もしくは分
子の組み合わせに対してｎは４以上である）、また哺乳動物の未知の味覚を生み
出す一つ以上の分子もしくは分子の組み合わせに対して哺乳動物の味覚の定量的
表現を上記の値から作りだすこと、及び哺乳動物の未知の味覚を生み出す一つ以
上の分子あるいはその組み合わせに対して、哺乳動物における味覚の定量的表現
を、哺乳動物の既知の味覚を生み出す一つ以上の分子あるいはその組み合わせに
対する哺乳動物の味覚の定量的表現と比較することによって哺乳動物の未知の味
覚を生み出す一つ以上の分子またはその組み合わせによって作り出された哺乳動
物の味覚を予想すること。この方法で用いられた味覚受容体にはこの文書の中で
開示された味覚受容体が含まれるであろう。
【０２２３】
他の態様として、新しい分子もしくは分子の組み合わせは上記のように既知の
分子あるいは分子の組み合わせに対して哺乳動物の味覚の値を測定すること、上
記のように未知の分子あるいは分子の組み合わせに対して哺乳動物の味覚の値を
測定すること、一つ以上の分子あるいはその組み合わせに対する哺乳動物におけ
る未知の味覚の値を、一つ以上の分子あるいはその組み合わせに対する哺乳動物
の既知の味覚の値と比較すること、哺乳動物の前もって測定された味覚を引き出
す分子もしくはその組み合わせを選択すること、二つ以上の未知の分子もしくは
その組み合わせを哺乳動物の前もって測定された味覚を引き出す一つの分子また
はその組み合わせを作製するために組み合わせること、によって哺乳動物の前も
って測定された味覚を引き出す新しい分子もしくはその組み合わせが作り出され
る。組み合わせの段階は哺乳動物の前もって測定された味覚を引き出す一つの分
子もしくはその組み合わせを作り出す。
分子あるいは分子の組み合わせに対して哺乳動物の味覚の値を測定すること、上
記のように未知の分子あるいは分子の組み合わせに対して哺乳動物の味覚の値を
測定すること、一つ以上の分子あるいはその組み合わせに対する哺乳動物におけ
る未知の味覚の値を、一つ以上の分子あるいはその組み合わせに対する哺乳動物
の既知の味覚の値と比較すること、哺乳動物の前もって測定された味覚を引き出
す分子もしくはその組み合わせを選択すること、二つ以上の未知の分子もしくは
その組み合わせを哺乳動物の前もって測定された味覚を引き出す一つの分子また
はその組み合わせを作製するために組み合わせること、によって哺乳動物の前も
って測定された味覚を引き出す新しい分子もしくはその組み合わせが作り出され
る。組み合わせの段階は哺乳動物の前もって測定された味覚を引き出す一つの分
子もしくはその組み合わせを作り出す。
【０２２４】
本発明の他の態様として、以下の段階から成る味覚を刺激する方法が提供され
る：多数のクローン味覚受容体、好ましくはヒト受容体、のそれぞれに対して、
受容体が呈味物質と相互作用する程度を確認すること；及び呈味物質の特徴を模
倣した受容体刺激の特徴を与える量で、一つ以上の受容体との前もって確認した
相互作用をもつ多数の化合物を組み合わせること。呈味物質の味覚受容体との相
互作用はこの文書の中に記載した結合あるいはレポーターアッセイのいずれかを
用いて測定できる。多数の化合物がその後組み合わされ混合物を形成する。必要
に応じて、一つ以上の多数の化合物が共有結合で結合できる。組み合わされた化
合物は呈味物質によって十分刺激される受容体の少なくとも７５％、８０％、も
しくは９０％を十分刺激する。
る：多数のクローン味覚受容体、好ましくはヒト受容体、のそれぞれに対して、
受容体が呈味物質と相互作用する程度を確認すること；及び呈味物質の特徴を模
倣した受容体刺激の特徴を与える量で、一つ以上の受容体との前もって確認した
相互作用をもつ多数の化合物を組み合わせること。呈味物質の味覚受容体との相
互作用はこの文書の中に記載した結合あるいはレポーターアッセイのいずれかを
用いて測定できる。多数の化合物がその後組み合わされ混合物を形成する。必要
に応じて、一つ以上の多数の化合物が共有結合で結合できる。組み合わされた化
合物は呈味物質によって十分刺激される受容体の少なくとも７５％、８０％、も
しくは９０％を十分刺激する。
【０２２５】
本発明の他の好ましい態様として、受容体が個々の標準的な化合物を相互作用
をおこす程度を確認するために、多数の標準的な化合物が多数の味覚受容体と対
照的に試験され、それによって個々の標準的化合物の受容体刺激の特徴を作り出
す。これらの受容体刺激の特徴はその後データ蓄積媒体の関連データベースに蓄
積される可能性がある。その手法はさらに味覚の適切な受容体刺激の特徴を与え
ること、適切な受容体刺激の特徴を関連データベースと比較すること；及び適切
な受容体刺激の特徴を最もぴったり合致する標準的な化合物の一つ以上の組み合
わせを確認することから成る。この手法はさらに味覚を刺激する確認された一つ
以上の組み合わせに標準的な化合物を組み合わせることから成る。
をおこす程度を確認するために、多数の標準的な化合物が多数の味覚受容体と対
照的に試験され、それによって個々の標準的化合物の受容体刺激の特徴を作り出
す。これらの受容体刺激の特徴はその後データ蓄積媒体の関連データベースに蓄
積される可能性がある。その手法はさらに味覚の適切な受容体刺激の特徴を与え
ること、適切な受容体刺激の特徴を関連データベースと比較すること；及び適切
な受容体刺激の特徴を最もぴったり合致する標準的な化合物の一つ以上の組み合
わせを確認することから成る。この手法はさらに味覚を刺激する確認された一つ
以上の組み合わせに標準的な化合物を組み合わせることから成る。
【０２２６】
Ｈ．キット
Ｔ２Ｒ遺伝子及びそれらの同族体は、公式討論及び著作者決定のための、また
形質導入を試験するための、味覚受容体を確認する有用な手段である。Ｔ２Ｒプ
ローブ及びプライマーのような、Ｔ２Ｒ核酸に対して特異的にハイブリッドを形
成するＴ２Ｒファミリーメンバー特異的試薬、及び例えばＴ２Ｒ抗体のようなＴ
２Ｒタンパク質に特異的に結合するＴ２Ｒ特異的試薬は味覚細胞発現と味覚形質
導入制御の試験を実施するために有用である。
形質導入を試験するための、味覚受容体を確認する有用な手段である。Ｔ２Ｒプ
ローブ及びプライマーのような、Ｔ２Ｒ核酸に対して特異的にハイブリッドを形
成するＴ２Ｒファミリーメンバー特異的試薬、及び例えばＴ２Ｒ抗体のようなＴ
２Ｒタンパク質に特異的に結合するＴ２Ｒ特異的試薬は味覚細胞発現と味覚形質
導入制御の試験を実施するために有用である。
【０２２７】
検体中のＴ２ＲファミリーメンバーのＤＮＡ及びＲＮＡの存在に対する核酸ア
ッセイにはサザン解析、ノーザン解析、ドットブロット法、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ
１解析、ＰＣＲのような増幅法、及びｉｎ ｓｉｔｕにおけるハイブリダイゼー
ションのような当業者には周知の多数の方法が含まれる。例えば、ｉｎ ｓｉｔ
ｕにおけるハイブリダイゼーションでは、標的核酸は、後に続く翻訳と解析のた
めの細胞形態学を維持する間、細胞内のハイブリダイゼーションに利用できるよ
うな細胞環境から解放される。以下の論文はｉｎ ｓｉｔｕにおけるハイブリダ
イゼーションの技術の概要を提供する。Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２３０−２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．ＶＩＩ，１８９−２
２６（１９８４）及びＮａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ（１９８７）。さらに、Ｔ２Ｒタンパク質は上記の種々の免疫アッセイ技
術により検出可能である。試験検体は代表的には正の対照（例えば、組換えＴ２
Ｒタンパク質を発現する検体）及び負の対照の両方と比較する。
ッセイにはサザン解析、ノーザン解析、ドットブロット法、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ
１解析、ＰＣＲのような増幅法、及びｉｎ ｓｉｔｕにおけるハイブリダイゼー
ションのような当業者には周知の多数の方法が含まれる。例えば、ｉｎ ｓｉｔ
ｕにおけるハイブリダイゼーションでは、標的核酸は、後に続く翻訳と解析のた
めの細胞形態学を維持する間、細胞内のハイブリダイゼーションに利用できるよ
うな細胞環境から解放される。以下の論文はｉｎ ｓｉｔｕにおけるハイブリダ
イゼーションの技術の概要を提供する。Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２３０−２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．ＶＩＩ，１８９−２
２６（１９８４）及びＮａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ（１９８７）。さらに、Ｔ２Ｒタンパク質は上記の種々の免疫アッセイ技
術により検出可能である。試験検体は代表的には正の対照（例えば、組換えＴ２
Ｒタンパク質を発現する検体）及び負の対照の両方と比較する。
【０２２８】
本発明はまたＴ２Ｒファミリーメンバーの調節剤を選別するためのキットを提
供する。このようなキットは容易に入手できる物質及び試薬から調製することが
できる。たとえば、このようなキットは以下の物質のいずれか一つ以上から成る
：Ｔ２Ｒ核酸もしくはタンパク質、反応試験管、及びＴ２Ｒ活性の試験のための
指示書。オプションとしてキットは機能的なポリペプチドを含む。広範囲の異な
るキット及び成分は本発明に従って、予定されたキットの使用者及び使用者の個
々の必要性によって調製することができる。
供する。このようなキットは容易に入手できる物質及び試薬から調製することが
できる。たとえば、このようなキットは以下の物質のいずれか一つ以上から成る
：Ｔ２Ｒ核酸もしくはタンパク質、反応試験管、及びＴ２Ｒ活性の試験のための
指示書。オプションとしてキットは機能的なポリペプチドを含む。広範囲の異な
るキット及び成分は本発明に従って、予定されたキットの使用者及び使用者の個
々の必要性によって調製することができる。
【０２２９】
（例）
以下の例は本発明の分離された核酸及び核酸分子の概念上の翻訳に一致したポ
リペプチド配列の要約を提供する。この文書の中に提供されたタンパク質配列で
、一つの文字コードＸもしくはＸａａは２０個の共通のアミノ酸残基のいずれか
をさす。この文書の中に提供されたＤＮＡ配列において、一つの文字コードＮも
しくはｎは四つの共通のヌクレオチド塩基、Ａ、Ｔ、Ｃ、あるいはＧのいずれか
をさす。
リペプチド配列の要約を提供する。この文書の中に提供されたタンパク質配列で
、一つの文字コードＸもしくはＸａａは２０個の共通のアミノ酸残基のいずれか
をさす。この文書の中に提供されたＤＮＡ配列において、一つの文字コードＮも
しくはｎは四つの共通のヌクレオチド塩基、Ａ、Ｔ、Ｃ、あるいはＧのいずれか
をさす。
【０２３０】
【０２３１】
【０２３２】
【０２３３】
上記の詳細な説明には本発明の種々の態様を記載したが、上記の説明は実例と
なるだけであって、開示された本発明に限ったことではないということが理解さ
れなければならない。本発明は以下の請求項によってのみ限定されるべきである
。
なるだけであって、開示された本発明に限ったことではないということが理解さ
れなければならない。本発明は以下の請求項によってのみ限定されるべきである
。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｂ０６５
Ｃ１２Ｍ 1/00 1/19 ４Ｈ０４５
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 11/08 Ｇ
1/21 Ｈ
5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02
11/08 1/68 Ａ
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/02 33/483 Ｃ
1/68 33/50 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ
33/483 Ｍ
33/50 33/566
33/53 33/58 Ａ
37/00 １０２
33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/58 5/00 Ｂ
37/00 １０２ 15/00 Ｆ
5/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，
ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，
ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ
Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 DA13 DA36 FB02
FB03 FB12 GC15
4B024 AA01 AA11 AA19 AA20 BA63
CA02 CA05 CA09 DA02 DA03
DA11 EA02 HA14 HA17 HA19
4B029 AA07 FA12
4B033 NA15 NB33 NC03 ND08 ND12
NG05 NH06
4B063 QA13 QA18 QQ08 QQ38 QQ42
QQ89 QR18 QR32 QR50 QR55
QR62 QR77 QR82 QS25 QS34
QX02 QX07
4B065 AA72X AA90X AA93X AA93Y
AB01 CA24 CA44 CA46
4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41
BA62 CA40 DA50 EA20 EA50
FA74 FA81
Claims (137)
- 【請求項１】 （ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１
７、１９及び２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分
子、または少なくとも７５のヌクレオチドを含むそのフラグメント、 （ｉｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び
２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単
離ｃＤＮＡまたはそれから転写された不溶性ＲＮＡ、または該ポリペプチドの少
なくとも２５の隣接アミノ酸をコードするそのフラグメント、 （ｉｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び
２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも２０〜３０％の配列同一性
を有する単離核酸分子、または少なくともその１００の隣接ヌクレオチドを含む
そのフラグメント、 （ｉｖ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び
２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとアミノ酸レ
ベルで少なくとも４０％配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離核酸
分子、または少なくともその５０の隣接アミノ酸残基をコードする単離核酸分子
、 （ｖ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２３
からなる群から選択される核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下に特異的にハイブリダイズする、味覚受容体またはそのフラグメントを
コードする単離核酸分子、及び （ｖｉ）コード領域に少なくとも一つの置換、欠失または付加の変異を含有す
る、（ｉ）または（ｉｉ）に記載の単離核酸分子の変異体、 からなる群から選択される単離核酸分子。 - 【請求項２】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９及び２３からなる群から選択される請求項１記載の単離核酸分子、またはその
少なくとも７５の隣接ヌクレオチドを含むフラグメント。 - 【請求項３】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、
２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードする請求項１記載の単離核酸分子、または該ポリペプチドの少なくとも２５
の隣接アミノ酸残基をコードするそのフラグメント。 - 【請求項４】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも３０％の配列同一性
を有する単離核酸分子、または該配列のいずれかの少なくとも１００の隣接ヌク
レオチドを含むそのフラグメント。 - 【請求項５】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも４０〜６０％の配列
同一性を有する単離核酸分子、または該配列のいずれかの少なくとも１００の隣
接ヌクレオチドを含むそのフラグメント。 - 【請求項６】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも７０％の配列同一性
を有する単離核酸分子、または該配列のいずれかの少なくとも１００の隣接ヌク
レオチドを含むそのフラグメント。 - 【請求項７】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性
を有する単離核酸分子、または該配列のいずれかの少なくとも１００の隣接ヌク
レオチドを含むそのフラグメント。 - 【請求項８】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性
を有する単離核酸分子、または該配列のいずれかの少なくとも１００の隣接ヌク
レオチドを含むそのフラグメント。 - 【請求項９】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、
２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少
なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド、またはその少なくとも４０
の隣接アミノ酸含むそのフラグメントをコードする請求項１記載の単離核酸分子
。 - 【請求項１０】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
少なくとも９６％の配列同一性を有するポリペプチド、またはその少なくとも４
０の隣接アミノ酸含むそのフラグメントをコードする請求項１記載の単離核酸分
子。 - 【請求項１１】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
少なくとも９７％の配列同一性を有するポリペプチド、またはその少なくとも４
０の隣接アミノ酸含むそのフラグメントをコードする請求項１記載の単離核酸分
子。 - 【請求項１２】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチド、またはその少なくとも４
０の隣接アミノ酸含むそのフラグメントをコードする請求項１記載の単離核酸分
子。 - 【請求項１３】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド、またはその少なくとも４
０の隣接アミノ酸含むそのフラグメントをコードする請求項１記載の単離核酸分
子。 - 【請求項１４】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも２０〜３０％の配
列同一性を示すかあるいは該核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌクレオチドを
含むフラグメントと少なくとも３０％の配列同一性を示し、及びさらに配列番号
２５、２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される共通配列に少
なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくとも一つ含有す
る単離核酸分子。 - 【請求項１５】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも４０〜６０％の配
列同一性を示すかあるいは該核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌクレオチドを
含むフラグメントと少なくとも４０〜６０％の配列同一性を示し、及びさらに配
列番号２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される共通
配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくとも一
つ含有する単離核酸分子。 - 【請求項１６】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも７０％の配列同一
性を示すかあるいは該核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌクレオチドを含むフ
ラグメントと少なくとも７０％の配列同一性を示し、及びさらに配列番号２５、
２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される共通配列に少なくと
も７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくとも一つ含有する単離
核酸分子。 - 【請求項１７】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の配列同一
性を示すかあるいは該核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌクレオチドを含むフ
ラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を示し、及びさらに配列番号２５、
２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される共通配列に少なくと
も７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくとも一つ含有する単離
核酸分子。 - 【請求項１８】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一
性を示すかあるいは該核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌクレオチドを含むフ
ラグメントと少なくとも８５％の配列同一性を示し、及びさらに配列番号２５、
２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される共通配列に少なくと
も７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくとも一つ含有する単離
核酸分子。 - 【請求項１９】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一
性を示すかあるいは該核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌクレオチドを含むフ
ラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を示し、及びさらに配列番号２５、
２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される共通配列に少なくと
も７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくとも一つ含有する単離
核酸分子。 - 【請求項２０】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％の配列同一
性を示すかあるいは該核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌクレオチドを含むフ
ラグメントと少なくとも９５％の配列同一性を示し、及びさらに配列番号２５、
２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される共通配列に少なくと
も７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくとも一つ含有する単離
核酸分子。 - 【請求項２１】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列と約９５〜９９％の配列同一性
を示すかあるいは該核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌクレオチドを含むフラ
グメントと約９５〜９９％の配列同一性を示し、及びさらに配列番号２５、２６
、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される共通配列に少なくとも７
０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくとも一つ含有する単離核酸
分子。 - 【請求項２２】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択される核酸配列の少なくとも１００の隣接ヌク
レオチドの部分と少なくとも４０％の配列同一性を示す少なくとも１００のヌク
レオチドの長さの部分を含む機能的味覚受容体をコードする単離核酸分子。 - 【請求項２３】 該キメラ核酸分子が少なくとも二つの異なるＧタンパク質
共役受容体の部分を結合して作られたキメラ核酸分子である請求項２２記載の核
酸分子。 - 【請求項２４】 該二つの異なるＧタンパク質共役受容体が味覚受容体であ
る請求項２３記載のキメラ核酸分子。 - 【請求項２５】 該キメラ核酸分子が該核酸配列の一つの部分と少なくとも
４０％一致する少なくとも２００の隣接ヌクレオチドを含む請求項２３記載のキ
メラ核酸分子。 - 【請求項２６】 検出可能なポリペプチドをコードする核酸配列に直接また
は間接的に結合する請求項１記載の単離核酸分子。 - 【請求項２７】 該検出可能なポリペプチドが緑色蛍光タンパク質である請
求項２６記載の核酸分子、またはそのフラグメントまたは変異体。 - 【請求項２８】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるポリペプチドと約３０〜４０％の配列
同一性を示すポリペプチドをコードする単離核酸分子、または細胞表面上の該ポ
リペプチドの発現及び／またはトランスロケーションを促進する配列に直接的ま
たは間接的に結合する少なくともその４０の隣接アミノ酸を含むフラグメント。 - 【請求項２９】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されたポリペプチドと約５０％の配列同一性
を示すポリペプチドをコードする単離核酸分子、または細胞表面上の該ポリペプ
チドの発現及び／またはトランスロケーションを促進する配列に直接的または間
接的に結合する少なくともその４０の隣接アミノ酸を含むフラグメント。 - 【請求項３０】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるポリペプチドと約６０％の配列同一性
を示すポリペプチドをコードする単離核酸分子、または細胞表面上の該ポリペプ
チドの発現及び／またはトランスロケーションを促進する配列に直接的または間
接的に結合する少なくともその４０の隣接アミノ酸を含むフラグメント。 - 【請求項３１】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも７０％の配
列同一性を示すポリペプチドをコードする単離核酸分子、または細胞表面上の該
ポリペプチドの発現及び／またはトランスロケーションを促進する配列に直接的
または間接的に結合する少なくともその４０の隣接アミノ酸を含むフラグメント
。 - 【請求項３２】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０％の配
列同一性を示すポリペプチドをコードする単離核酸分子、または細胞表面上の該
ポリペプチドの発現及び／またはトランスロケーションを促進する配列に直接的
または間接的に結合する少なくともその４０の隣接アミノ酸を含むフラグメント
。 - 【請求項３３】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の配
列同一性を示すポリペプチドをコードする単離核酸分子、または細胞表面上の該
ポリペプチドの発現及び／またはトランスロケーションを促進する配列に直接的
または間接的に結合する少なくともその４０の隣接アミノ酸を含むフラグメント
。 - 【請求項３４】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９５％の配
列同一性を示すポリペプチドをコードする単離核酸分子、または細胞表面上の該
ポリペプチドの発現及び／またはトランスロケーションを促進する配列に直接的
または間接的に結合する少なくともその４０の隣接アミノ酸を含むフラグメント
。 - 【請求項３５】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるポリペプチドと約９５〜９９％の配列
同一性を示すポリペプチドをコードする単離核酸分子、または細胞表面上の該ポ
リペプチドの発現及び／またはトランスロケーションを促進する配列に直接的ま
たは間接的に結合する少なくともその４０の隣接アミノ酸を含むフラグメント。 - 【請求項３６】 構成的プロモーターに作動的に結合している請求項１記載
の単離核酸分子。 - 【請求項３７】 調節可能プロモーターに作動的に結合している請求項１記
載の単離核酸分子。 - 【請求項３８】 シャペロンタンパク質をコードする核酸配列に直接的また
は間接的に結合している請求項１記載の単離核酸分子またはそのフラグメント。 - 【請求項３９】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの
少なくとも６０の隣接アミノ酸のフラグメントをコードするヌクレオチド配列を
含む単離核酸分子。 - 【請求項４０】 ヌクレオチド配列が少なくとも１００のアミノ酸をコード
する請求項３９記載の単離核酸分子。 - 【請求項４１】 ヌクレオチド配列が少なくとも１５０のアミノ酸をコード
する請求項３９記載の単離核酸分子。 - 【請求項４２】 ヌクレオチド配列が少なくとも２００のアミノ酸をコード
する請求項３９記載の単離核酸分子。 - 【請求項４３】 ヌクレオチド配列が少なくとも２５０のアミノ酸をコード
する請求項３９記載の単離核酸分子。 - 【請求項４４】 ポリペプチドがＴ２Ｒポリペプチドである請求項３９記載
の単離核酸分子。 - 【請求項４５】 フラグメントが６−ｎ−プロピルチオウラシル、しょ糖オ
クタアセテート、ラフィノースウンデカアセテート、シクロヘキシミド、デナト
ニウム、グリシン銅及びキニーネからなる群から選択されるリガンドに特異的に
結合する請求項３９記載の単離核酸分子。 - 【請求項４６】 配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、
１９及び２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１記載の
単離核酸分子。 - 【請求項４７】 請求項１記載の核酸配列を含む発現ベクター。
- 【請求項４８】 哺乳動物、イースト、細菌または昆虫の発現ベクターであ
る請求項４７記載の発現ベクター。 - 【請求項４９】 請求項１に記載の核酸配列の少なくとも一つで遺伝子導入
あるいは形質転換されている細胞。 - 【請求項５０】 細胞が哺乳動物細胞である請求項４９記載の細胞。
- 【請求項５１】 細胞がヒト細胞である請求項５０記載の哺乳動物細胞。
- 【請求項５２】 細胞がイーストまたは昆虫細胞である請求項４９記載の細
胞。 - 【請求項５３】 味覚細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハム
スター腎細胞及び骨髄腫細胞からなる群から選択される請求項５０記載の哺乳動
物細胞。 - 【請求項５４】 請求項１記載の単離核酸配列の少なくとも一つを含む固相
。 - 【請求項５５】 請求項１記載の配列の少なくとも一つを含む異なる核酸配
列のアレイに結合する固相。 - 【請求項５６】 機能的味覚受容体またはそのフラグメントまたは変異体を
コードする少なくとも４個の異なる核酸配列のアレイを含む請求項５４記載の固
相。 - 【請求項５７】 機能的味覚受容体をコードする少なくとも１０個の異なる
核酸配列を含む請求項５４記載の核酸アレイを含む固相。 - 【請求項５８】 味覚受容体またはそのフラグメントまたは変異体をコード
する少なくとも５０個の異なる核酸配列を含む請求項５４記載の核酸アレイを含
む固相。 - 【請求項５９】 味覚受容体またはそのフラグメントまたは変異体をコード
する少なくとも１００個の異なる核酸配列を含む請求項５４記載の核酸アレイを
含む固相。 - 【請求項６０】 （ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６
、１８、２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド、 （ｉｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び
２４からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を
示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、 （ｉｉｉ）少なくとも４０のアミノ酸の長さである（ｉ）に記載のポリペプチ
ドのフラグメントと少なくとも７５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むポ
リペプチド、 （ｉｖ）少なくとも４０のアミノ酸の長さである（ｉ）または（ｉｉ）に記載
のポリペプチドの部分、及び少なくとも一つの他のＧタンパク質共役受容体の部
分を含むキメラポリペプチド、及び （ｖ）少なくとも一つの置換、付加または欠失の修飾によって該ポリペプチド
と相違する（ｉ）に記載のポリペプチドの変異体、 からなる群から選択される単離ポリペプチドまたは融合タンパク質。 - 【請求項６１】 そのポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０及び２４、または少なくとも２００のアミノ酸である
そのフラグメントからなる群から選択される配列を有するポリペプチドと少なく
とも６０％の配列同一性を示す請求項６０記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項６２】 そのポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０及び２４、または少なくとも２００のアミノ酸である
そのフラグメントからなる群から選択される配列を有するポリペプチドと少なく
とも６５％の配列同一性を示す請求項６０記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項６３】 そのポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０及び２４、または少なくとも２００のアミノ酸である
そのフラグメントからなる群から選択される配列を有するポリペプチドと少なく
とも７５％の配列同一性を示す請求項６０記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項６４】 そのポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０及び２４、または少なくとも２００のアミノ酸である
そのフラグメントからなる群から選択される配列を有するポリペプチドと少なく
とも７５％の配列同一性を示す請求項６０記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項６５】 そのポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０及び２４、または少なくとも２００のアミノ酸である
そのフラグメントからなる群から選択される配列を有するポリペプチドと少なく
とも８０％の配列同一性を示す請求項６０記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項６６】 そのポリペプチドが配列番号２、４、６、８、１０、１２
、１４、１６、１８、２０及び２４、または少なくとも２００のアミノ酸である
そのフラグメントからなる群から選択される配列を有するポリペプチドと少なく
とも９０％の配列同一性を示す請求項６０記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項６７】 少なくとも５つの保存的アミノ酸置換を含む請求項６０記
載の変異体。 - 【請求項６８】 多くても５つの保存的アミノ酸置換を含む請求項６０記載
の変異体。 - 【請求項６９】 ５〜７の保存的アミノ酸置換を含む請求項６０記載の変異
体。 - 【請求項７０】 ３〜４の保存的アミノ酸置換を含む請求項６０記載の変異
体。 - 【請求項７１】 １または２の保存的アミノ酸置換を含む請求項６０記載の
変異体。 - 【請求項７２】 請求項６０記載の単離ポリペプチドの少なくとも一つまた
はその表面に該ポリペプチドを発現する細胞を直接または間接的に固定化した固
相。 - 【請求項７３】 請求項６０記載の少なくとも４個の異なるポリペプチド、
またはその表面に該ポリペプチドを発現する細胞が固定される請求項７２記載の
固相。 - 【請求項７４】 請求項６０記載の少なくとも１６個の異なるポリペプチド
、またはその表面に該ポリペプチドを発現する細胞が固定される請求項７２記載
の固相。 - 【請求項７５】 請求項４８記載の少なくとも２５個の異なるポリペプチド
、またはその表面に該ポリペプチドを発現する細胞が固定される請求項７２記載
の固相。 - 【請求項７６】 （ａ）請求項１記載の核酸分子と少なくとも一つのサンプ
ルをハイブリダイズする、及び （ｂ）陽性のハイブリダイゼーション信号により味覚受容体遺伝子の発現を検
出する、 ことからなる味覚受容体遺伝子の発現を検出する方法。 - 【請求項７７】 （ａ）請求項１記載の核酸分子とライブラリーをハイブリ
ダイズする、及び （ｂ）陽性のハイブリダイゼーション信号によりライブラリー中の１以上の味
覚受容体クローンを検出する、 ことからなるライブラリーのスクリーニング方法。 - 【請求項７８】 異種核酸分子に直接的または間接的に結合している請求項
１記載の核酸分子を含む組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項７９】 核酸分子がその発現を進行させる異種核酸分子に作動的に
結合している請求項１記載の核酸分子を含む発現ベクター。 - 【請求項８０】 宿主細胞に導入された請求項７８記載の組換えポリヌクレ
オチドを含む遺伝子導入あるいは形質転換細胞、またはその子孫。 - 【請求項８１】 宿主非ヒト生物体の細胞に導入された請求項７８記載の組
換えポリヌクレオチドを含む形質転換非ヒト生物体、またはその子孫。 - 【請求項８２】 請求項１記載の核酸分子を異種核酸に結合することを含む
組換えポリヌクレオチドを作る方法。 - 【請求項８３】 異種核酸が翻訳及び／または転写調節領域を含む請求項８
２記載の方法。 - 【請求項８４】 請求項７８記載の組換えポリヌクレオチドを宿主細胞に導
入すること、または組換えポリヌクレオチドが導入された細胞を増殖することを
含む遺伝子導入細胞を作る方法。 - 【請求項８５】 （ａ）それによって味覚受容体が細胞により発現される請
求項７９記載の発現ベクターを導入した細胞と推定リガンドを接触させる、及び （ｂ）推定リガンドと味覚受容体の間の特異的結合を直接的または間接的に検
出する、 ことからなる推定リガンドの味覚受容体への特異的結合を検出する方法。 - 【請求項８６】 請求項７８記載の組換えポリヌクレオチドを宿主非ヒト生
物体の細胞に導入するか、または組換えポリヌクレオチドを導入した宿主非ヒト
生物体を増殖することからなる遺伝子導入非ヒト生物体を作る方法。 - 【請求項８７】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの
少なくとも６０の隣接アミノ酸のフラグメントを含む単離ポリペプチド分子。 - 【請求項８８】 フラグメントが少なくとも１００のアミノ酸を含む請求項
８７記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項８９】 フラグメントが少なくとも１５０のアミノ酸を含む請求項
８７記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項９０】 フラグメントが少なくとも２００のアミノ酸を含む請求項
８７記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項９１】 フラグメントが少なくとも２５０のアミノ酸を含む請求項
８７記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項９２】 フラグメントがＴ２Ｒポリペプチドである請求項８７記載
の単離ポリペプチド。 - 【請求項９３】 フラグメントが６−ｎ−プロピルチオウラシル、しょ糖オ
クタアセテート、ラフィノースウンデカアセテート、シクロヘキシミド、デナト
ニウム、グリシン銅及びキニーネからなる群から選択される苦味物質と結合した
呈味物質に特異的に結合する請求項８７記載の単離ポリペプチド。 - 【請求項９４】 請求項８７記載のポリペプチド及び異種ペプチドドメイン
からなる組換えポリペプチド。 - 【請求項９５】 異種ペプチドドメインがＧタンパク質共役受容体の膜貫通
領域を含む請求項９４記載の組換えポリペプチド。 - 【請求項９６】 味覚受容体リガンド結合領域か少なくとも２個の異なる味
覚受容体のキメラである味覚受容体リガンド結合領域を持つ７回膜貫通受容体を
含む請求項９４記載の組換えポリペプチド。 - 【請求項９７】 （ａ）請求項８７記載のポリペプチドとリガンドを接触さ
せる、及び （ｂ）リガンドと味覚受容体の間の特異的結合を直接的または間接的に検出す
る、 ことからなるリガンドの味覚受容体への特異的結合を検出する方法。 - 【請求項９８】 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８
、２０及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに
特異的に結合する抗体または抗体フラグメント。 - 【請求項９９】 （ａ）味覚受容体を含む可能性のあるサンプルと抗体を接
触させる、及び （ｂ）それらの間の特異的結合を検出する、 ことからなる請求項９８記載の抗体の味覚受容体への特異的結合を検出する方法
。 - 【請求項１００】 サンプル中の細胞に抗体が特異的に結合することにより
味覚細胞として細胞を同定する請求項９９記載の方法。 - 【請求項１０１】 請求項８７記載のポリペプチドの少なくとも一つと該ラ
イブラリー中の化合物を接触させる、及び該ポリペプチドの少なくとも一つと特
異的に結合する化合物を同定することからなる味覚感覚に関係する化合物のため
の化合物ライブラリーのスクリーニング方法。 - 【請求項１０２】 該ライブラリーがコンビナトリアル化学ライブラリーで
ある請求項１０１記載の方法。 - 【請求項１０３】 該ライブラリーがペプチドライブラリーである請求項１
０１記載の方法。 - 【請求項１０４】 該ライブラリーがペプチド、コードされたペプチド、ベ
ンゾジアゼピン、ダイバーソマー、ビニローグポリペプチド、非ペプチド性ペプ
チド類似体、または小分子有機化合物ライブラリーである請求項１０１記載の方
法。 - 【請求項１０５】 該ライブラリーが化合物の無作為の組合せである請求項
１０１記載の方法。 - 【請求項１０６】 該化合物がハイスループットスクリーニングによりスク
リーニングされる請求項１０１記載の方法。 - 【請求項１０７】 該スクリーニングが該ポリペプチドの少なくとも一つを
発現する動物細胞または組織を使用して行われる請求項１０１記載の方法。 - 【請求項１０８】 少なくとも一つの機能的Ｔ２Ｒポリペプチドまたは機能
的Ｔ２Ｒポリペプチドを含むキメラポリペプチド、及びさらに少なくとも一つの
機能的Ｇタンパク質を発現してもよい細胞または非ヒト動物を得る、 Ｔ２Ｒポリペプチドを調節する能力をスクリーニングされる分子と該細胞また
は非ヒト動物を接触させる、及び 調節が生じるか否かを検出する、 ことからなるＴ２Ｒポリペプチドと相互作用する分子を同定するための細胞また
は非ヒト動物アッセイ。 - 【請求項１０９】 調節が細胞内カルシウムの変化に基づいて検出される請
求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１０】 調節がγ標識ＧＴＰからＴ２Ｒポリペプチドへの32Ｐの
転移を測定することにより検出される請求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１１】 調節が、特別のＴ２Ｒポリペプチドを調節することが知
られている対照化合物との比較に基づいて測定される請求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１２】 Ｇタンパク質がＧα１５またはＧα１６または別の乱交
雑のＧタンパク質である請求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１３】 調節が細胞内サイクリックヌクレオチド濃度の変化を生
じるか否かを検出することにより測定される請求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１４】 調節が細胞とスクリーニング化合物を接触させた後予定
の標的タンパク質の転写レベルに基づいて測定される請求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１５】 Ｔ２Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ酸
配列の予想されるまたは実際の３次元構造に基づくコンピュータによる化合物デ
ザインによりスクリーニング化合物が合成される請求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１６】 Ｔ２Ｒポリペプチドを調節する化合物がＴ２Ｒポリペプ
チドと特異的に結合するか否かに基づいて同定される請求項１０８記載の方法。 - 【請求項１１７】 調節がＴ２Ｒポリペプチド機能の阻害のことである請求
項１０８記載の方法。 - 【請求項１１８】 調節がＴ２Ｒポリペプチド機能の増強のことである請求
項１０８記載の方法。 - 【請求項１１９】 該哺乳動物のｎ味覚受容体それぞれの定量的刺激を表す
値Ｘ1からＸnを提供する、及び 該値から味覚感知の定量的表示を作成し、該味覚受容体の少なくとも一つは配
列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２４からなる
群から選択される配列と少なくとも約７５％一致する配列を有する味覚受容体ポ
リペプチドである、 ことからなる１以上の哺乳動物における１以上の味の感知を表示する方法。 - 【請求項１２０】 該表示がｎ次元空間における点または容積を構成する請
求項１１９記載の方法。 - 【請求項１２１】 該表示がグラフまたはスペクトルを構成する請求項１１
９記載の方法。 - 【請求項１２２】 該表示が定量的表示のマトリックスを構成する請求項１
１９記載の方法。 - 【請求項１２３】 該提供段階が組換えで産生される複数の味覚受容体を試
験組成物と接触させる、及び該組成物の該受容体との相互作用を定量的に測定す
ることを含む請求項１１９記載の方法。 - 【請求項１２４】 哺乳動物において既知味覚感知を生じる１以上の分子ま
たは分子の組合せに対して該哺乳動物のｎ味覚受容体それぞれの定量的刺激を表
す値Ｘ1からＸnを提供する、 該値から哺乳動物において既知味覚感知を生じる１以上の分子または分子の組
合せに対する哺乳動物における味覚感知の定量的表示を作成する、 哺乳動物において未知味覚感知を生じる１以上の分子または分子の組合せに対
して該哺乳動物のｎ味覚受容体それぞれの定量的刺激を表す値Ｘ1からＸnを提供
する、 該値から哺乳動物において未知味覚感知を生じる１以上の分子または分子の組
合せに対する哺乳動物における味覚感知の定量的表示を作成する、及び 哺乳動物において未知味覚感知を生じる１以上の分子または分子の組合せによ
り発生する哺乳動物における味覚感知の定量的表示を哺乳動物において既知味覚
感知を生じる１以上の分子または分子の組合せにより発生する哺乳動物における
味覚感知の定量的表示と比較することにより、哺乳動物において未知味覚感知を
生じる１以上の分子または分子の組合せにより発生する哺乳動物における味覚感
知を予想する、 ことからなる１以上の分子または分子の組合せにより発生する哺乳動物における
味覚感知を予想する方法であって、 少なくとも一つの該味覚受容体は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４
、１６、１８、２０及び２４からなる群から選択される配列と少なくとも約７５
％一致する配列を有する味覚受容体ポリペプチドである上記方法。 - 【請求項１２５】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列と少なくとも２０〜３０％配列同一性を示すか、または該核酸配列の少なくと
も１００の隣接ヌクレオチドを含むフラグメントと少なくとも３０％配列同一性
を示し、及びさらに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０からなる群
から選択される共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする
配列を少なくとも一つ含む単離核酸分子。 - 【請求項１２６】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列と少なくとも４０〜６０％配列同一性を示すか、または該核酸配列の少なくと
も１００の隣接ヌクレオチドを含むフラグメントと少なくとも４０〜６０％配列
同一性を示し、及びさらに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０から
なる群から選択される共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコー
ドする配列を少なくとも一つ含む単離核酸分子。 - 【請求項１２７】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列と少なくとも７０％配列同一性を示すか、またはその少なくとも１００の隣接
ヌクレオチドを含むフラグメントと少なくとも７０％配列同一性を示し、及びさ
らに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される
共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくと
も一つ含む単離核酸分子。 - 【請求項１２８】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列と少なくとも８０％配列同一性を示すか、またはその少なくとも１００の隣接
ヌクレオチドを含むフラグメントと少なくとも９０％配列同一性を示し、及びさ
らに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される
共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくと
も一つ含む単離核酸分子。 - 【請求項１２９】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列と少なくとも８５％配列同一性を示すか、またはその少なくとも１００の隣接
ヌクレオチドを含むフラグメントと少なくとも８５％配列同一性を示し、及びさ
らに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される
共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくと
も一つ含む単離核酸分子。 - 【請求項１３０】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列と少なくとも９０％配列同一性を示すか、またはその少なくとも１００の隣接
ヌクレオチドを含むそのフラグメントと少なくとも９０％配列同一性を示し、及
びさらに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択さ
れる共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少な
くとも一つ含む単離核酸分子。 - 【請求項１３１】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列と少なくとも９５％配列同一性を示すか、またはその少なくとも１００の隣接
ヌクレオチドを含むそのフラグメントと少なくとも９５％配列同一性を示し、及
びさらに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択さ
れる共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少な
くとも一つ含む単離核酸分子。 - 【請求項１３２】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列と約９５〜９９％配列同一性を示すか、またはその少なくとも１００の隣接ヌ
クレオチドを含むそのフラグメントと約９５〜９９％配列同一性を示し、及びさ
らに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び３０からなる群から選択される
共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチドをコードする配列を少なくと
も一つ含む単離核酸分子。 - 【請求項１３３】 配列番号２１及び２２からなる群から選択される核酸配
列を有する単離核酸分子または少なくともその１００の隣接ヌクレオチドを含む
そのフラグメントであって、さらに配列番号２５、２６、２７、２８、２９及び
３０からなる群から選択される共通配列に少なくとも７０％一致するポリペプチ
ドをコードする配列を少なくとも一つ含有する上記単離核酸分子またはフラグメ
ント。 - 【請求項１３４】 （ａ）請求項１２５記載の単離核酸分子とライブラリー
をハイブダイズする、及び （ｂ）陽性のハイブリダイゼーション信号によりライブラリー中の１以上の味
覚受容体クローンを検出する、 ことからなるライブラリーのスクリーニング方法。 - 【請求項１３５】 該細胞を請求項１２５記載の単離核酸分子とストリンジ
ェントな条件下にハイブリダイズする核酸分子と接触させる、及び 該Ｇタンパク質共役受容体ポリペプチドの発現を検出するためにハイブリダイ
ゼーションを検出する、 ことからなる細胞におけるＧタンパク質共役受容体ポリペプチド遺伝子の発現を
検出する方法。 - 【請求項１３６】 （ｉ）該哺乳動物ゲノムを配列番号２５、２６、２７、
２８、２９及び３０の共通配列をコードする核酸配列を本質的に含む縮重プライ
マーの少なくとも一つ、または請求項１２５記載の単離核酸分子から誘導される
縮重プライマーの少なくとも１つと接触させる、 （ｉｉ）該少なくとも一つのプライマーを含む該ゲノム配列をポリメラーゼの
存在下に、ヌクレオチド及びコファクター無しで増幅する、及び （ｉｉｉ）Ｇタンパク質共役受容体ポリペプチド遺伝子を含む増幅配列の存在
を検出する、 ことからなる味覚シグナル伝達に活性なＧタンパク質共役受容体ポリペプチドの
コード配列のために哺乳動物ゲノムをスクリーニングする方法。 - 【請求項１３７】 （ｉ）請求項８７記載の１以上のポリペプチドをＧタン
パク質標本及びＧＴＰγＳ、及び１以上の推定呈味物質リガンドまたは１以上の
推定呈味物質リガンドを含む組成物と接触させる、及び （ｉｉ）Ｇタンパク質へのＧＴＰγＳの結合を測定することにより味覚シグナ
ル伝達に活性な該Ｇタンパク質共役受容体に対する結合特異性を有する呈味物質
リガンドの結合を検出する、 ことからなる味覚シグナル伝達に活性なＧタンパク質共役受容体に対する結合特
異性を有する呈味物質リガンドを同定する生化学的アッセイ。
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