JP2023184465A - Ｇタンパク質共役型受容体の解析方法 - Google Patents

Ｇタンパク質共役型受容体の解析方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023184465A
JP2023184465A JP2023093473A JP2023093473A JP2023184465A JP 2023184465 A JP2023184465 A JP 2023184465A JP 2023093473 A JP2023093473 A JP 2023093473A JP 2023093473 A JP2023093473 A JP 2023093473A JP 2023184465 A JP2023184465 A JP 2023184465A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
gpcr
consensus
residue
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023093473A
Other languages
English (en)
Inventor
敬一 吉川
Keiichi Yoshikawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
Publication of JP2023184465A publication Critical patent/JP2023184465A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

【課題】Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を発現かつ機能させることができる手法の提供。【解決手段】ＧＰＣＲポリペプチドの発現方法であって、目的のＧＰＣＲ（但し、嗅覚受容体を除く）のアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１つをこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、方法。【選択図】なし

Description

新規性喪失の例外適用申請有り
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体の解析方法に関する。
細胞は生体の構成員として、周囲の生理状況の変化を認識し挙動を変化する。生物個体は、外界の環境変化を察知する感覚を利用して適応行動をとる。ホルモンや神経伝達物質といった内因性の情報化学物質、もしくは味物質など外因性の情報化学物質に対して、個々の生命単位が適切に応答することが生体メカニズムの根幹をなしている。これら化学受容を担うのは、個々の組織細胞がもつ受容体タンパク質である。近年、特定の受容体遺伝子を欠損させた生物個体が数多く作製され、生理機能における受容体の必要性が実証されてきた。また、受容体を標的分子とした様々な薬剤が、生理機能を調整するものとして実用されている。その一方で、未だ機能が不明な受容体が数多く存在している。
生物がもつ代表的な受容体はＧタンパク質共役型受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）である。これは７回膜貫通型の構造を特徴としており、アゴニストを結合することで活性化型の構造に推移し、基本的には細胞内のＧタンパク質との相互作用を経てシグナルを伝達する。ヒトでは約８００種類のＧＰＣＲが存在し、そのうち約半数は感覚に関連する体内の生理機能には直接関与しないものとして知られていた。嗅覚受容体、鋤鼻受容体を除くヒトＧＰＣＲの情報はデータベース（G protein-coupled receptors（IUPHAR/BPS Guide to PHARMACOLOGY, http://www.guidetopharmacology.org/GRAC/FamilyDisplayForward?familyId=694））から取得することができる。２０１７年１１月時点で、１３４のＧＰＣＲがアメリカにおける承認薬の標的分子とされる（非特許文献１）。加えて、感覚のみに関与すると考えられていた受容体も、実際には感覚組織以外の組織でも発現し、体内の特定の生理機能に関与することが示されてきている。
例えば、鋤鼻受容体（ｖｏｍｅｒｏｎａｓａｌ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＮ１Ｒ）は、ＣｌａｓｓＡファミリーのＧＰＣＲであり、ヒトには５種類の遺伝子が存在する。マウスにおける相同遺伝子の解析より、鼻腔内にて発現しフェロモンの認識を担っていることが予測されている（非特許文献２）。ヒトにおいてＶＮ１Ｒ１に関して１例のみ、培養細胞での機能解析が報告されており、この報告では低分子の揮発性化合物を認識することが示されている（非特許文献２）。また、スウェーデンでの大規模調査において、ＶＮ１Ｒ１の遺伝的多型によりどのような性質の違いが生じるのかが調査された結果、女性の性的な特性に違いが認められることが示され、ＶＮ１Ｒ１の潜在的な機能が示唆されている（非特許文献３）。その他のＶＮ１Ｒ２～５に関しては、認識する物質の特定など機能解析の報告例はない。
味覚受容体であるＴＡＳ１Ｒ（ｔａｓｔｅ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、舌に発現するＧＰＣＲとして発見された遺伝子ファミリーであり、ヒトのゲノムには３種類の遺伝子ＴＡＳ１Ｒ１、ＴＡＳ１Ｒ２、ＴＡＳ１Ｒ３が存在し、いずれもＣｌａｓｓ ＣタイプのＧＰＣＲに分類される。舌の味らいにおいて、ＴＡＳ１Ｒ１、ＴＡＳ１Ｒ２は異なる味細胞に発現し、いずれもＴＡＳ１Ｒ３を共発現している。代謝型グルタミン酸受容体をはじめとするＣｌａｓｓ ＣタイプのＧＰＣＲは二量体を形成して機能することが知られているがＴＡＳ１Ｒも例外ではない。ＴＡＳ１Ｒ３をＴＡＳ１Ｒ１、ＴＡＳ１Ｒ２のいずれかと共発現させたときに、ＨＥＫ２９３細胞は味物質に対して応答する。ＴＡＳ１Ｒ１／ＴＡＳ１Ｒ３複合体、ＴＡＳ１Ｒ２／ＴＡＳ１Ｒ３複合体はそれぞれうま味、甘味物質を受容する。ＴＡＳ１Ｒ２／ＴＡＳ１Ｒ３複合体を培養細胞に発現させてスクリーニングを行うことで、当該複合体に対してアロステリックモジュレーターとして機能し、甘味を増強させる物質の特定が報告されている（非特許文献４）。同様に、ＴＡＳ１Ｒ１／ＴＡＳ１Ｒ３複合体を発現させれば、うま味を増強するイノシン酸が、当該複合体の活性を高めるという評価結果を得ることも可能である（非特許文献５）。これらＴＡＳ１Ｒタンパク質をより安定なものとして獲得する、あるいはより多量に培養細胞の膜上に発現させることができれば、うま味や甘味を高める素材の特定を効率よく行うことが可能になる。
同じく味覚受容体であるＴＡＳ２Ｒ（ｔａｓｔｅ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、舌に発現する苦味受容体として発見された遺伝子ファミリーであり、ヒトのゲノムには２５種類の遺伝子が存在する。Ｃｌａｓｓ ＡタイプのＧＰＣＲに分類され、様々な苦味物質を認識することが示されているが、ヒトＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４２、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４８及びＴＡＳ２Ｒ６０は機能解析に成功しておらず、どのような物質を認識するのかは不明である。特許文献１には、ＴＡＳ２Ｒを利用して苦味評価や苦味調節物質の特定を可能にするために、ＴＡＳ２Ｒを効率よく機能解析するための工夫としてＧタンパク質との融合タンパク質とすることが開示されている。ＴＡＳ２Ｒの発現は舌上に限定されず、呼吸器、循環器、神経系にも認められ、舌において苦味を受容する以外に様々な生理作用を担うことが示されている（非特許文献６）。加えて、卵巣がん、前立腺がん等、がん化した組織細胞にも発現が認められる。
微量アミン関連受容体（ｔｒａｃｅ ａｍｉｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＡＡＲ）は、ＣｌａｓｓＡファミリーのＧＰＣＲであり、ヒトでは６種類の遺伝子からなる。最初に発見されたＴＡＡＲ１については、脳において神経伝達物質の認識を担っていることが示されている。そのことからＴＡＡＲ１は統合失調症、うつ病、中毒、パーキンソン病との関わりが検討されており、そのアゴニストを神経性疼痛の治療に利用しようとする取り組みがある（特許文献２）。一方でＴＡＡＲ１を除く他のＴＡＡＲは、嗅上皮において高発現し、揮発性アミンを選択的かつ高感度に認識し、においの感覚を生み出す役割が示されている（非特許文献７）。
Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体（Ｍａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｍｒｇｐｒ）はＣｌａｓｓＡファミリーのＧＰＣＲであり、ヒトには１０種類の遺伝子が存在する。その発現は末梢の皮膚などの知覚神経系およびその関連組織に認められ、アゴニストを認識することで掻痒や痛みを感知させる（非特許文献８）。また、マウスにおいて、ＭｒｇｐｒＢ４を発現する知覚神経細胞が快い触覚に関与することを踏まえて、ＭｒｇｐｒＢ４を標的とした快感情向上剤の探索の取り組みが開示されている（特許文献３）。より近年ではＭｒｇｐｒのうちＭｒｇｐｒＥとＭｒｇｐｒＦは回腸など、知覚神経以外の様々な組織にも発現し、多様な生理機能を担っていることが示唆されているが、アゴニストの報告例は乏しい（非特許文献９）。
一般的にＧＰＣＲの機能解析は、培養細胞に発現させる方法が簡便であり最も広く用いられている。その解析法については非常に多岐に渡る工夫がなされてきた。それでもなお、未だ機能解析に成功していないものは多い。機能解析に成功しておらず、どのような分子をリガンドとして認識するのかが不明なＧＰＣＲは総じてＧＰＲ（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）Ｘ（Ｘは任意の数字）と表記される。これらＧＰＲ群についてリガンドの同定が立ち遅れた原因の一つは、目的とするＧＰＣＲを培養細胞に発現させようとしても、本来の組織細胞とは異なる培養細胞には、そのＧＰＣＲを安定的にかつ細胞膜上に発現させる因子が不足していることが挙げられる。
特許第６９２４５９０号公報 特表２０１９－５１７５２４号公報 特開２０１９－１１８３４０号公報
Sriram K, Insel PA. Mol Pharmacol. 93(4):251-258 (2018) Shirokova E, et al. FASEB J. 22(5):1416-25 (2008) Henningsson, S., Hovey, D., Vass, K. et al. Transl Psychiatry 7, e1102 (2017) Servant G, Tachdjian C, Tang XQ, Werner S, Zhang F, Li X, Kamdar P, Petrovic G, Ditschun T, Java A, Brust P, Brune N, DuBois GE, Zoller M, Karanewsky DS. Proc Natl Acad Sci U S A. 107(10):4746-51 (2010) Nelson, G., Chandrashekar, J., Hoon, M. et al. Nature 416, 199-202 (2002) Tuzim K., Korolczuk A. J Transl Med 19, 440 (2021) Liberles S.D. Curr Opin Neurobiol. 34:1-7 (2015) Liu Q, et al. Cell 139(7):1353-1365 (2009) Juan M. et al. Neuroscience Letters, Volume 748, 2021
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の解析にあたり、ＧＰＣＲを効率よく発現させる方法が求められている。
本発明者は、ＧＰＣＲを効率よく発現させることができる手法について鋭意検討した。その結果、本発明者は、ＧＰＣＲのコンセンサス化により、ＧＰＣＲの培養細胞での膜発現をオリジナルのＧＰＣＲに比べて向上できることを見出した。嗅覚受容体を除くＧＰＣＲをコンセンサス化した例はこれまで知られていない。
したがって、本発明は、以下の１）～１３）を提供する。
１）ＧＰＣＲポリペプチドの発現方法であって、
目的のＧＰＣＲ（但し、嗅覚受容体を除く）のアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、
該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、
方法。
２）ＧＰＣＲポリペプチドの発現方法であって、
目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、
該ＧＰＣＲポリペプチドが、ヒトＴＡＡＲ６の配列番号３６で示されるアミノ酸配列において配列番号１４３で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる、
方法。
３）目的のＧＰＣＲの応答の測定方法であって、
１）又は２）記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含む方法。
４）目的のＧＰＣＲのリガンドの探索方法であって、
試験物質存在下で、１）又は２）記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、及び
該ＧＰＣＲポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、
を含む方法。
５）目的のＧＰＣＲのリガンドの認識の制御剤の評価及び／又は選択方法であって、
１）又は２）記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び目的のＧＰＣＲのリガンドを添加すること、及び
該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含む方法。
６）味の評価方法であって、
１）又は２）記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を添加すること、及び
該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが味覚受容体ポリペプチドである、
方法。
７）目的のＧＰＣＲのリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法であって、
１）又は２）記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び目的のＧＰＣＲのリガンドを添加すること、及び
該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが微量アミン関連受容体ポリペプチドである、
方法。
８）目的のＧＰＣＲのリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法であって、
１）又は２）記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を添加すること、及び
該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが微量アミン関連受容体ポリペプチドである、
方法。
９）改変ＧＰＣＲポリペプチドであって、
目的のＧＰＣＲ（但し、嗅覚受容体を除く）のアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなり、
該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、
改変ＧＰＣＲポリペプチド。
１０）改変ＧＰＣＲポリペプチドであって、
ヒトＴＡＡＲ６の配列番号３６で示されるアミノ酸配列において配列番号１４３で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる、
改変ＧＰＣＲポリペプチド。
１１）９）又は１０）記載の改変ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１２）１１）記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
１３）１２）記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
本発明は、ＧＰＣＲを効率よく発現させることができる手法を提供する。斯かるＧＰＣＲを用いることで、ＧＰＣＲの機能の解明や機能制御剤の特定に資することができる。
ＧＰＣＲ（味覚受容体）の膜発現量。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、「Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）」とは、７回膜貫通型の構造を有し、リガンドを結合することで活性化型の構造に推移し、基本的には細胞内のＧタンパク質との相互作用を経てシグナルを伝達する受容体の総称である。ＧＰＣＲとしては、鋤鼻受容体、味覚受容体、微量アミン関連受容体、Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体等の他、リガンドが不明なＧＰＲＸ（Ｘは任意の数字）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、「鋤鼻受容体」とは、ＶＮ１Ｒ（ｖｏｍｅｒｏｎａｓａｌ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をいう。例えば、ヒトのゲノムには５種類のＶＮ１Ｒ遺伝子が存在する。
本明細書において、「味覚受容体」とは、生体において味分子を受容する受容体をいい、うま味分子又は甘味分子を受容するＴＡＳ１Ｒ（ｔａｓｔｅ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーに属するうま味又は甘味受容体と、苦味分子を受容するＴＡＳ２Ｒ（ｔａｓｔｅ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーに属する苦味受容体を包含する。例えば、ヒトのゲノムには３種類のＴＡＳ１Ｒ遺伝子が存在する。このうち、ＴＡＳＲ１とＴＡＳ１Ｒ３は複合体を形成してうま味物質受容体として機能し、ＴＡＳ１Ｒ２とＴＡＳ１Ｒ３は複合体を形成して甘味物質受容体として機能する。また、ヒトのゲノムには２５種類のＴＡＳ２Ｒ遺伝子が存在する。
本発明において、「微量アミン関連受容体」とは、ＴＡＡＲ（ｔｒａｃｅ ａｍｉｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をいう。例えば、ヒトのゲノムには６種類のＴＡＡＲ遺伝子が存在する。
本明細書において、「Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体」とは、Ｍｒｐｇｒ（Ｍａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をいう。ＭＡＳとはアンギオテンシンに結合するＧタンパク質共役型受容体である。例えば、ヒトのゲノムには１０種類のＭｒｐｇｒ遺伝子が存在する（ＭＡＳ１、ＭＡＳＬ１、ＭｒｇｐｒＤ、ＭｒｇｐｒＥ、ＭｒｇｐｒＦ、ＭｒｇｐｒＧ、ＭｒｇｐｒＸ１－４）。
本明細書において、「嗅覚受容体」とは、Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒもしくはＯｄｏｒａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒをいう。全体的な配列の相同性、７回膜貫通領域が予測されること、保存された部分アミノ酸配列を有するか否か等の基準により、ヒトゲノム中に約４００の嗅覚受容体遺伝子が予測されている。
本明細書において、「ＧＰＣＲポリペプチド」とは、ＧＰＣＲ又はそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、ＧＰＣＲと同等の機能を有するポリペプチドとは、ＧＰＣＲと同様に、細胞膜上に発現することができ、リガンドの結合によって活性化し、且つ活性化されると、共役するＧタンパク質αサブユニットのＧＤＰ／ＧＴＰ交換を促進する機能など、細胞内にシグナルを伝達する機能を有するポリペプチドをいう。
本明細書において、細胞でＧＰＣＲポリペプチドが「機能的に発現する」とは、発現された該ＧＰＣＲポリペプチドが、該細胞において対応するリガンドの受容体として機能することをいう。
本明細書において「アゴニスト」とは、受容体に結合し、活性化させる物質をいう。一方、本明細書において「アンタゴニスト」とは、受容体に結合するが、受容体を活性化しないか、又はアゴニストに対する受容体の応答を抑制する物質をいう。
本明細書において、「受容体アゴニズム」とは、受容体に結合して、その受容体を活性化することをいう。
本明細書において、標的においに関する「においの交差順応（又は嗅覚の交差順応）」とは、該標的においの原因物質とは別の物質のにおいを予め受容し、そのにおいに慣れることによって、該標的においの原因物質に対する嗅覚感受性が低下又は変化する現象を指す。本発明者らは、以前、「においの交差順応」が、受容体アゴニズムに基づく現象であることを明らかにした（国際公開公報第２０１６／１９４７８８号）。すなわち、「においの交差順応」においては、標的においの原因物質に対する受容体が、該標的においの原因物質への応答に先だって異なるにおいの原因物質に応答し、次いで脱感作することにより、後から該標的においの原因物質に曝されても低い応答しかできず、その結果、個体に認識される標的においの強度の低下又は変質が生じる。こうした受容体の挙動により引き起こされるにおいの交差順応の仕組みを、本明細書において「受容体アゴニズムによるにおいの交差順応」とも呼ぶ。
本明細書において、標的においの「受容体アンタゴニズムによる抑制」とは、標的においを有する物質に対する受容体の応答を、アンタゴニストにより抑制し、結果的に個体に認識される標的においを抑制することをいう。
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン－パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
本明細書において、アミノ酸の改変は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記により、［元のアミノ酸、位置、改変されたアミノ酸］で表記されることがある。例えば、４３位のヒスチジンのアルギニンへの改変は、「Ｈ４３Ｒ」と示される。
本明細書において、アミノ酸配列上の「相当する位置」は、目的配列と基準配列（本発明においてはオリジナルのＧＰＣＲのアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト［ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ］、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより基準配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
加えて、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントは、例えば、ＧＰＣＲ間で高度に保存されたアミノ酸もしくはアミノ酸モチーフを基準に、最適化するようにさらに微調整することができる。
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
本明細書において、「ホモログ」とは、共通の祖先に由来する相同遺伝子を指す。「オルソログ」とは、「オーソログ」とも呼ばれ、種分化の際に分岐したホモログを指し、異なる生物種に存在し、同一又は類似の機能を有する。一例において、本発明で用いるオルソログは、目的のＧＰＣＲ遺伝子の相同遺伝子のうち、目的のＧＰＣＲ遺伝子と同一の名称を含む目的のＧＰＣＲが由来する生物種とは異なる生物種のＧＰＣＲ遺伝子であり得る。ある生物種のＧＰＣＲの命名法が目的のＧＰＣＲが由来する生物種における命名法と異なる場合、オルソログは、該ある生物種における目的のＧＰＣＲ遺伝子と高い相同性を有するＧＰＣＲ遺伝子、好ましくは最も高い相同性を有するＧＰＣＲ遺伝子であり得る。あるいは、該ある生物種における目的のＧＰＣＲ遺伝子のオルソログであることが知られているＧＰＣＲ遺伝子であり得る。別の一例において、本発明で用いるオルソログは、上記オルソログのうち、系統樹解析により種分化の際に分岐した可能性が示唆されるＧＰＣＲ遺伝子であり得る。
後述の実施例に示すとおり、本発明者は、ヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列を、該ヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列と該ヒトＧＰＣＲの特定のオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列とから導き出されるコンセンサスアミノ酸配列に基づいて改変し、得られたＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させたところ、該ＧＰＣＲポリペプチドの細胞での膜発現が改変前のヒトＧＰＣＲに比べて増加することを見出した（表７、図１）。すなわち、該ＧＰＣＲポリペプチドは、改変前のヒトＧＰＣＲに比べて発現時の安定性が向上している。本明細書において、改変前のＧＰＣＲを「オリジナルのＧＰＣＲ」と称し、ＧＰＣＲのアミノ酸配列をコンセンサスアミノ酸配列に基づいて改変することを「コンセンサス化する」と称し、コンセンサス化されたＧＰＣＲを「コンセンサスＧＰＣＲ」あるいは「改変ＧＰＣＲポリペプチド」と称することがある。
よって、ＧＰＣＲの上記コンセンサス化は、ＧＰＣＲ、特にこれまで培養細胞での膜発現が不十分なために機能解析が非効率であったＧＰＣＲを細胞の細胞膜に発現させるのに有用である。したがって、一態様において本発明は、ＧＰＣＲポリペプチドの発現方法を提供する。本発明の発現方法は、ＧＰＣＲの発現向上（例えば、発現増加、発現安定化）を可能とするので、当該方法は、好ましくは、ＧＰＣＲポリペプチドの発現向上方法である。当該方法は、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、方法である。
本発明の発現方法において、目的のＧＰＣＲは、特に制限されず、いずれの生物種のＧＰＣＲであってもよく、哺乳類のＧＰＣＲが好ましく、ヒトＧＰＣＲがより好ましい。目的のＧＰＣＲとしては、従来法による培養細胞を用いた機能解析が可能なＧＰＣＲであっても、非効率なＧＰＣＲであってもよいが、本発明の方法は、従来法による培養細胞を用いての機能解析が非効率なＧＰＣＲにより好適に適用される。
本発明の発現方法において、脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲは、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲから選択されるＧＰＣＲであり、より好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類及び両生類における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲから選択されるＧＰＣＲであり、さらに好ましくは哺乳類における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲである。該オルソログとしては、特に制限されないが、目的のＧＰＣＲ遺伝子との相同性が高いオルソログ程好ましい。ここで、哺乳類（Ｍａｍｍａｌｓ）とは、脊椎動物門哺乳網に属する生物種を指し、約５５００種が現存することが知られている。哺乳類としては、ヒト、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、スマトラオランウータン、キタホウジロテナガザル、ドリル、ゲラダヒヒ、アカゲザル、アヌビスヒヒ、スーティーマンガベイ、グリーンモンキー、ハイアカコロブス、アンゴラコロブス、ガーネットガラゴ、ハイイロネズミキツネザル、コクレルシファカ、フィリピンメガネザル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、キツネ、タヌキ、イタチ、トラ、チーター、クマ、アシカ、アザラシ、オットセイ、ウマ、サイ、ラクダ、ブタ、イノシシ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、キリン、カバ、ゾウ、センザンコウ、モグラ、コウモリなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鳥類（Ａｖｅｓ）とは、脊椎動物門鳥網に属する生物種を指す。鳥類としては、ニワトリ、カモ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ダチョウ、キジ、ハト、オウム、カナリア、ジュウシマツ、ハチドリ、マイコドリ、ウズラ、ヒタキなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。爬虫類（Ｒｅｐｔｉｌｉａ）とは、脊椎動物門爬虫網に属する生物種を指す。爬虫類としては、カメ、トカゲ、ワニ、イグアナ、カメレオン、ヤモリ、ヘビなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。両生類（Ａｍｐｈｉｂｉａ）とは、脊椎動物門両生網に属する生物種を指す。両生類としては、カエル、イモリ、サンショウウオなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。魚類（Ｆｉｓｈ）とは、脊椎動物門ヌタウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚綱及び硬骨魚綱に属する生物種を指す総称である。魚類としては、ヌタウナギ、ヤツメウナギ、サメ、エイ、マグロ、カツオ、サケ、マス、タラ、タイ、ヒラメ、ブリ、アジ、サバなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本実施形態の好ましい一例において、脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログは、脊椎動物に属する生物種が有するＧＰＣＲ遺伝子のうち、目的のＧＰＣＲ遺伝子と同じ名称を含む遺伝子である。斯かるオルソログは、例えば、以下の手順で選択することができる。目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴなどで公知のデータベースに対してデータベース検索を行う。その結果得られた相同遺伝子群（例えば、上位５００遺伝子、好ましくは上位２５０遺伝子、より好ましくは上位１００遺伝子、さらに好ましくは上位５０遺伝子）から、目的のＧＰＣＲ遺伝子と同じ名称を含む遺伝子を選択する。さらに好ましくは、目的のＧＰＣＲと一定のアミノ酸配列同一性、例えば６５％以上のアミノ酸配列同一性を有するＧＰＣＲをコードする遺伝子を選択する。
尚、オルソログとして、同一生物種に由来する遺伝子が複数選択される場合、目的のＧＰＣＲ遺伝子と最も相同性が高い１遺伝子のみを選択してもよい。例えば、目的のＧＰＣＲがヒトＧＰＣＲであり、オルソログとして、ヒト以外のある生物種の遺伝子が複数選択される場合、目的のヒトＧＰＣＲ遺伝子と最も相同性が高い該ある生物種の遺伝子を選択すればよい。また、ある生物種のＧＰＣＲの命名法が目的のＧＰＣＲが由来する生物種における命名法と異なる場合、オルソログとして、該ある生物種における目的のＧＰＣＲ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子、好ましくは最も高い相同性を有する遺伝子を選択してもよい。あるいは、該ある生物種における目的のＧＰＣＲ遺伝子のオルソログであることが知られている遺伝子を選択してもよい。
脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲの種類数は、受容体数として、少なくとも２種類であり、好ましくは少なくとも５種類であり、より好ましくは少なくとも１１種類であり、さらに好ましくは少なくとも１５種類であり、さらに好ましくは少なくとも３０種類であり、さらに好ましくは１００種類である。一方、種類数の上限は、脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログの全種類数であり、該種類数は、受容体数として、好ましくは５００種類以下、より好ましくは４００種類以下、さらに好ましくは３００種類以下である。脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲの種類数は、受容体数として、例えば、２種類～脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログの全種類、５種類～脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログの全種類、１１種類～脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログの全種類、５～５００種類、５～４００種類、５～３００種類、１１～５００種類、１１～４００種類、１１～３００種類、１５～３００種類、３０～３００種類、１００～３００種類であり得る。
本発明の発現方法において、「コンセンサスアミノ酸配列」とは、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である。具体的には、「コンセンサスアミノ酸配列」とは、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の基準に従い同定したコンセンサス残基からなるアミノ酸配列である。
（ｉ）該アラインメントの各アミノ酸位置において、
（ｉ－ｉ）該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基と異なり且つ出現頻度５０％以上のアミノ酸残基が１種存在する場合、該アミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｉｉ）出現頻度５０％のアミノ酸残基が２種存在する場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｉｉｉ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在し且つ出現頻度４０％以上でアミノ酸残基が存在しない場合、コンセンサス残基なしと同定する、
（ｉ－ｉｖ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在せず且つ出現頻度６０％以上でアミノ酸残基が存在する場合、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｖ）上記（ｉ－ｉ）～（ｉ－ｉｖ）のいずれにも該当しない場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端又はそれよりもＣ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、最もＮ末端に近い位置のメチオニン残基からなるコンセンサス残基よりＮ末端側のコンセンサス残基をコンセンサス残基なしに変更する、
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端よりもＮ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、該アラインメントの該コンセンサス残基の位置よりＮ末端側にアミノ酸位置を１つずつ遡り、メチオニン残基が出現するまで、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する。
ここで、「出現頻度」とは、アミノ酸配列のアラインメントの各アミノ酸位置における特定のアミノ酸残基の出現数をアラインメントに供したアミノ酸配列数に対する百分率で示したものである。アミノ酸配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムにより実行することができる。
基準（ｉ）の（ｉ－ｉ）は、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントのあるアミノ酸位置において、目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在する場合の基準である。このとき、目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基と異なり且つ出現頻度５０％以上のアミノ酸残基が１種存在すれば、該出現頻度５０％以上のアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定する。一方、目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基の出現頻度がいずれも５０％未満であれば、基準（ｉ－ｖ）に従い、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定する。
基準（ｉ）の（ｉ－ｉｉ）は、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントのあるアミノ酸位置において、目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在する場合の基準である。このとき、出現頻度５０％のアミノ酸残基が２種存在すると、２種のうち片方のアミノ酸残基は必ず目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基であり、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定する。
基準（ｉ）の（ｉ－ｉｉｉ）は、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントのあるアミノ酸位置において、目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在する場合の基準である。このとき、出現頻度４０％以上でアミノ酸残基が存在しなければ、該位置にはコンセンサス残基なしと同定する。一方、アミノ酸残基なしの出現頻度が４０％未満であれば、上記基準（ｉ－ｉ）に該当するときは、該基準に従って該位置のコンセンサス残基を同定し、該当しないときは、基準（ｉ－ｖ）に従って該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定する。
基準（ｉ）の（ｉ－ｉｖ）は、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントのあるアミノ酸位置において、目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在しない場合の基準である。このとき、出現頻度６０％以上でアミノ酸残基が存在すれば、最も出現頻度が高いアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸が２種以上存在する場合は、最も出現頻度が高いアミノ酸のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する。例えば、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が１種であれば、該１種のアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上あれば、そのうちの最も分子量が小さいアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定すればよい。尚、該変更によりコンセンサスアミノ酸配列の全長が目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列の全長よりＮ末端側に１０％以上長くなる場合には、ＧＰＣＲの構造の維持の観点から、該コンセンサスアミノ酸配列において該目的のＧＰＣＲのＮ末端に相当する位置のコンセンサス残基をメチオニン残基とし、該メチオニン残基よりＮ末端側のコンセンサス残基をなしに変更してもよい。すなわち、該目的のＧＰＣＲのＮ末端構造をそのまま維持してもよい。一方、アミノ酸残基ありの出現頻度が６０％未満であれば、基準（ｉ－ｖ）に従い、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定する。すなわち、該位置にはアミノ酸残基なしと同定する。
目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントのあるアミノ酸位置において、上記（ｉ）の（ｉ－ｉ）～（ｉ－ｉｖ）のいずれにも該当しない場合、目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基を該位置のコンセンサス残基と同定する。このとき、目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在しなければ、コンセンサスアミノ酸配列の該位置にはアミノ酸残基なしと同定すればよい。
基準（ｉｉ）は、上記基準（ｉ）に従って目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントの各アミノ酸位置においてコンセンサス残基を同定したときに、コンセンサス残基のうち最もＮ末端側に位置するコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端又はそれよりもＣ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合の基準である。このとき、Ｎ末端のコンセンサス残基がメチオニン残基となるように、言い換えれば、ＧＰＣＲポリペプチドの翻訳の開始アミノ酸がメチオニン残基となるように、コンセンサス残基のうち最もＮ末端に近い位置のメチオニン残基からなるコンセンサス残基よりＮ末端側のコンセンサス残基をコンセンサス残基なしに変更する。例えば、Ｎ末端からコンセンサス残基を１残基ずつ確認していき、メチオニン残基でなければ、その位置にはコンセンサス残基なしと同定し、初めてメチオニン残基が出現するまでこれを繰り返せばよい。尚、該変更によりコンセンサスアミノ酸配列の全長が目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列の全長より１０％以上短くなる場合には、ＧＰＣＲのヘリックス構造の維持の観点から、該変更前のコンセンサス残基のうち最もＮ末端側のコンセンサス残基をメチオニン残基からなるコンセンサス残基に変更してもよい。このとき、該変更前のコンセンサス残基のうち最もＮ末端側のコンセンサス残基が、糖鎖修飾及び／又は膜移行に関わるアスパラギン、セリン又はスレオニンであれば、ＧＰＣＲの構造の維持の観点から、該変更前のコンセンサス残基のうち最もＮ末端側のコンセンサス残基は変更せず、該コンセンサス残基に相当する位置よりもＮ末端側の該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基としてもよい。すなわち、該目的のＧＰＣＲのＮ末端構造をそのまま維持してもよい。
基準（ｉｉｉ）は、上記基準（ｉ）に従って目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントの各アミノ酸位置においてコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端よりもＮ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合の基準である。このとき、Ｎ末端のコンセンサス残基がメチオニン残基となるように、言い換えれば、ＧＰＣＲポリペプチドの翻訳の開始アミノ酸がメチオニン残基となるように、最もＮ末端側のコンセンサス残基の位置よりＮ末端側にアミノ酸位置を１つずつ遡ってアラインメントを確認し、メチオニン残基が出現するまで、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する。
斯くして同定されたコンセンサス残基からなるアミノ酸配列が、コンセンサスアミノ酸配列である。本発明で用いられるＧＰＣＲポリペプチドは、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる改変ＧＰＣＲポリペプチドである。ここで、「改変」とは、置換、欠失、付加、挿入のいずれをも含む概念である。目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列とコンセンサスアミノ酸配列の違いは、例えば、公知のアルゴリズムによりアミノ酸配列のアラインメントをとって両アミノ酸配列を比較することで見出すことができる。例えば、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列とコンセンサスアミノ酸配列を比較し、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列のあるアミノ酸位置のアミノ酸残基が、コンセンサスアミノ酸配列のこれに相当する位置のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基であれば、目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基で置換すればよい。あるいは、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列とコンセンサスアミノ酸配列を比較し、コンセンサスアミノ酸配列において目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列のあるアミノ酸位置に相当する位置にアミノ酸残基が存在しなければ、目的のＧＰＣＲの該アミノ酸位置のアミノ酸残基を欠失させればよい。あるいは、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列とコンセンサスアミノ酸配列を比較し、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列においてアミノ酸残基が存在しない位置に相当する位置にコンセンサスアミノ酸配列ではアミノ酸残基が存在すれば、目的のＧＰＣＲの該アミノ酸位置にコンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基を挿入すればよい。尚、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列とコンセンサスアミノ酸配列を比較し、コンセンサスアミノ酸配列の方が目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列に比べＮ末端が長ければ、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列のＮ末端にコンセンサスアミノ酸配列にのみ存在するＮ末端部を付加すればよい。あるいは、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列とコンセンサスアミノ酸配列を比較し、コンセンサスアミノ酸配列の方が目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列に比べＣ末端が長ければ、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列のＣ末端にコンセンサスアミノ酸配列にのみ存在するＣ末端部を付加すればよい。
目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列において改変されるアミノ酸残基数は、少なくとも１個であり、好ましくは少なくとも５個であり、より好ましくは少なくとも１０個であり、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の全てがこれらに相当する位置のコンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変される（すなわち、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列がコンセンサスアミノ酸配列に改変される）のがさらに好ましい。
あるいは、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列において改変されるアミノ酸残基数は、コンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基数の好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは１００％（すなわち、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列がコンセンサスアミノ酸配列に改変される）の数であり得る。
尚、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列に比べコンセンサスアミノ酸配列のＮ末端が長ければ、アミノ酸残基数にかかわらず、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列のＮ末端にコンセンサスアミノ酸配列にのみ存在するＮ末端部を一体として付加して改変するのが好ましい。目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列に比べコンセンサスアミノ酸配列のＮ末端が短ければ、アミノ酸残基数にかかわらず、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列のＮ末端から目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列にのみ存在するＮ末端部を一体として欠失させて改変するのが好ましい。目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列に比べコンセンサスアミノ酸配列のＣ末端が長ければ、アミノ酸残基数にかかわらず、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列のＣ末端にコンセンサスアミノ酸配列にのみ存在するＣ末端部を一体として付加して改変するのが好ましい。目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列に比べコンセンサスアミノ酸配列のＣ末端が短ければ、アミノ酸残基数にかかわらず、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列のＣ末端から目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列にのみ存在するＣ末端部を一体として欠失させて改変するのが好ましい。
本発明で用いられるＧＰＣＲポリペプチドとしては、その機能が損なわれない限り、上記のコンセンサスアミノ酸配列に基づく改変の対象アミノ酸位置以外のアミノ酸位置に１～数個（例えば、１～１０個、１～５個、１～３個）のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を含むポリペプチドも本発明に含まれる。
本実施形態の好ましい一例において、ＧＰＣＲポリペプチドは、下記表１－１及び１－２の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる。より好ましくは、該ＧＰＣＲポリペプチドは、下記表１－１及び１－２の（３）の配列番号１０８～２１４及び２７５～３１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチド、又は下記表１－１の（３）の配列番号１１２若しくは１１３で示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドと配列番号１１４で示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドとの組み合わせである。尚、配列番号１０８～１１２、１１４～１２０、１３８～１４５、１６７、１８３、１８７、１９２及び２０９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、オリジナルのＧＰＣＲに比べて、膜発現が高度に向上している。表１－１及び１－２において、Ｎｏ．１～１４５の（１）のＧＰＣＲはヒトＧＰＣＲであり、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．とは、ＧｅｎＢａｎｋにおけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．を示す。
上記表１－１のＮｏ．１～４の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、鋤鼻受容体ポリペプチドである。上記表１－１において、（３）の配列番号１０８～１１１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる鋤鼻受容体ポリペプチドは、Ｎｏ．１～４の（１）の鋤鼻受容体の（２）の配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列及び脊椎動物における該鋤鼻受容体のオルソログにコードされる鋤鼻受容体のアミノ酸配列から導き出されるコンセンサスアミノ酸配列からなるコンセンサス鋤鼻受容体である。
上記表１－１のＮｏ．５～３０の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、味覚受容体ポリペプチドである。このうち、Ｎｏ．５の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドと、Ｎｏ．７の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、うま味受容体複合体を形成する。また、Ｎｏ．６の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドと、Ｎｏ．７の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、甘味受容体複合体を形成する。一方、Ｎｏ．８～３０の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、苦味受容体ポリペプチドである。上記表１－１において、（３）の配列番号１１２～１３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる味覚受容体ポリペプチドは、Ｎｏ．５～３０の（１）の味覚受容体の（２）の配列番号５～３０のいずれかで示されるアミノ酸配列及び脊椎動物における該味覚受容体のオルソログにコードされる味覚受容体のアミノ酸配列から導き出されるコンセンサスアミノ酸配列からなるコンセンサス味覚受容体である。
上記表１－１のＮｏ．３１～３６の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、微量アミン関連受容体ポリペプチドである。上記表１－１において、（３）の配列番号１３８～１４３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる微量アミン関連受容体ポリペプチドは、Ｎｏ．３１～３６の（１）の微量アミン関連受容体ポリペプチドの（２）の配列番号３１～３６のいずれかで示されるアミノ酸配列及び脊椎動物における該微量アミン関連受容体ポリペプチドのオルソログにコードされる微量アミン関連受容体ポリペプチドのアミノ酸配列から導き出されるコンセンサスアミノ酸配列からなるコンセンサス微量アミン関連受容体ポリペプチドである。そのうち、配列番号１４３で示されるアミノ酸配列からなる微量アミン関連受容体ポリペプチドは、上記基準（ｉｉ）において、目的の微量アミン関連受容体ポリペプチドのＮ末端構造をそのまま維持して得られたコンセンサスアミノ酸配列からなるコンセンサス微量アミン関連受容体である。
上記表１－１のＮｏ．３７～４６の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体ポリペプチドである。上記表１－１において、（３）の配列番号１４４～１５３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＭａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体ポリペプチドは、Ｎｏ．３７～４６の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号３７～４６のいずれかで示されるアミノ酸配列及び脊椎動物における該Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体のオルソログにコードされるＭａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体のアミノ酸配列から導き出されるコンセンサスアミノ酸配列からなるコンセンサスＭａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体である。
上記表１－１及び１－２のＮｏ．４７～１０８の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、ＧＰＲポリペプチドである。上記表１－１及び１－２において、（３）の配列番号１５４～２１４及び２７５のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＧＰＲポリペプチドは、Ｎｏ．４７～１０８の（１）のＧＰＲの（２）の配列番号４７～１０７及び２３７のいずれかで示されるアミノ酸配列及び脊椎動物における該ＧＰＲのオルソログにコードされるＧＰＲのアミノ酸配列から導き出されるコンセンサスアミノ酸配列からなるコンセンサスＧＰＲである。
上記表１－２のＮｏ．１０９～１４５の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、鋤鼻受容体ポリペプチド、味覚受容体ポリペプチド、微量アミン関連受容体ポリペプチド、Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体ポリペプチド、ＧＰＲポリペプチド、及び嗅覚受容体ポリペプチド以外のその他のＧＰＣＲポリペプチドである。上記表１－２において、（３）の配列番号２７６～３１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドは、Ｎｏ．１０９～１４５の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号２３８～２７４のいずれかで示されるアミノ酸配列及び脊椎動物における該ＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列から導き出されるコンセンサスアミノ酸配列からなるコンセンサスＧＰＣＲである。
本発明のＧＰＣＲポリペプチドの「発現」とは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから、翻訳産物が産生され、且つ翻訳産物が機能的な状態でその作用部位である細胞膜に局在することをいう。本発明のＧＰＣＲポリペプチドは、当技術分野で公知の手法により、細胞に発現させればよい。例えば、ＧＰＣＲポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを宿主となる細胞に導入するか、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主となる細胞のゲノムに導入することで、該細胞の細胞膜に発現させることができる。好ましくは、ＧＰＣＲポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて宿主細胞を形質転換することで、該宿主細胞の細胞膜に発現される。宿主細胞は、外来のＧＰＣＲを機能的に発現できる細胞であればよい。具体的な細胞の例としては、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ細胞）、サル細胞（ＣＯＳ細胞）、単離嗅神経細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、昆虫細胞、酵母または細菌等が挙げられるが、これに限定されない。
ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して得ることができる。例えば、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにおいて、改変すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、改変後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に改変することにより得ることができる。
目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドへの目的の変異の導入は、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
あるいは、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、人工ＤＮＡ切断酵素（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いたゲノム編集、そのヌクレオチド配列に基づいたＤＮＡ合成などによっても取得することができる。
ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また該ポリヌクレオチドは、ＧＰＣＲの発現用細胞の種にあわせて、コドンが最適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
好ましい一例において、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１５～２３４及び３１３～３１７のいずれかで示される塩基配列からなる。該ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１０８～１１２、１１４～１２０、１３８～１４５、１６７、１８３、１８７、１９２及び２０９で示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドをコードする。
得られたＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクター又はＤＮＡ断片に組み込むことができる。好ましくは、該ベクターは発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、ＧＰＣＲポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。具体的なベクターの例としては、ｐＭＥ１８Ｓが挙げられるが、これに限定されない。
該ベクターは、好ましくは、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該制御領域は、該ベクターが導入された宿主細胞内で、導入されたＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えば、プロモーターやターミネーター等の発現調節領域、転写開始点などが挙げられる。該制御領域の種類は、ベクターの種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして有していてもよい。該制御領域及び選択マーカー遺伝子は、該ベクターに元々含まれているものを使用してもよく、又はＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと一緒に又は別々に該ベクターに組み込まれてもよい。
ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片の例としては、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、該ポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。使用できる制御領域の例は、ベクターの場合と同様である。
好適には、ＧＰＣＲポリペプチドの細胞膜発現を促進するために、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとともに、ＲＴＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチド（本明細書において、ＲＴＰ遺伝子ともいう）を細胞に導入する。あるいは、好適には、ＧＰＣＲポリペプチドの細胞膜発現を促進するために、ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとともに、ＲＥＥＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチド（本明細書において、ＲＥＥＰ遺伝子ともいう）を細胞に導入する。例えば、ＲＴＰ遺伝子もしくはＲＥＥＰ遺伝子とＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含むベクターを構築し、それを宿主細胞に導入してもよく、又はＲＴＰ遺伝子もしくはＲＥＥＰ遺伝子を含むベクターとＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターをそれぞれ宿主細胞に導入してもよい。ＲＴＰの例としてはＲＴＰ１Ｓ、ＲＴＰ３及びＲＴＰ４が挙げられ、ＲＴＰ１Ｓの例としては、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＡＹ５６２２３５として登録されており、配列番号２３５のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２３６のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ＲＥＥＰの例としてはＲＥＥＰ１及びＲＥＥＰ２が挙げられ、ＲＥＥＰ１の例としては、ヒトＲＥＥＰ１が、ＲＥＥＰ２の例としては、ヒトＲＥＥＰ２が挙げられる。
宿主細胞へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、哺乳動物細胞に関して一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーティクル・ガン法などを用いることができる。目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞は、選択マーカーを利用して選択することができる。あるいは、細胞のＤＮＡの配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
上記手順で細胞に導入されたベクター又はＤＮＡ断片に含まれる本発明のＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから該ＧＰＣＲポリペプチドが産生され、細胞膜に組み込まれる。よって、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドは、該ＧＰＣＲポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された形質転換細胞の細胞膜に発現される。
本発明のＧＰＣＲポリペプチドの細胞膜発現（量）は、例えば、該ＧＰＣＲポリペプチドに予めＦＬＡＧタグなどのタグを融合させておき、該タグを特異的に認識する抗体を用いてフローサイトメトリー法などの公知の手法により測定することができる。
本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドは、オリジナルのＧＰＣＲに比して培養細胞膜上で効率よく発現することができる。また、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答は、オリジナルのＧＰＣＲの応答を反映していると考えられる。したがって、別の一態様において本発明は、目的のＧＰＣＲの応答の測定方法を提供する。当該方法は、本発明のＧＰＣＲポリペプチドの発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、を含む。本発明の応答測定方法によれば、目的のＧＰＣＲの応答測定効率を改善でき、従来培養細胞の細胞膜での発現が不十分なために機能解析ができなかった目的のＧＰＣＲの応答の測定を可能にする。
本発明の応答測定方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチドは、本発明の発現方法で発現されたＧＰＣＲポリペプチドであればよい。該ＧＰＣＲポリペプチドについては、上述のとおりである。該ＧＰＣＲポリペプチドの具体例としては、好ましくは、配列番号１０８～２１４及び２７５～３１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチド、又は配列番号１１２若しくは１１３で示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドと配列番号１１４で示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドとの組み合わせが挙げられる。該ＧＰＣＲポリペプチドは、リガンドに対する応答性を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、該ＧＰＣＲポリペプチドは、該ＧＰＣＲポリペプチドを発現する形質転換細胞又はその培養物、該ＧＰＣＲポリペプチドを有する該形質転換細胞の膜、該ＧＰＣＲポリペプチドを有する人工脂質二重膜、などの形態で使用され得る。好ましくは、該ＧＰＣＲポリペプチドとして、該ＧＰＣＲポリペプチドを発現する形質転換細胞又はその培養物が使用される。
本発明の応答測定方法において、ＧＰＣＲポリペプチドの応答の測定は、ＧＰＣＲの応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法によって行えばよい。例えば、直接的若しくは間接的に細胞内ｃＡＭＰ量を測定する方法によって行えばよい。例えば、Ｇタンパク質共役型受容体は、リガンドによって活性化されると、細胞内のＧｓファミリーに分類されるＧタンパク質αサブユニットもしくはＧｉファミリーに分類されるＧタンパク質αサブユニットと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化もしくは抑制することで、細胞内ｃＡＭＰ量を変動させることが知られている。一方で、Ｇタンパク質共役型受容体はリガンドにより活性化されると、細胞内でＧαｑ、Ｇα１６、Ｇα１５などＧｑファミリーに属するタンパク質とも共役し、細胞内でカルシウムイオン量を増加させることもできる。したがって、細胞内カルシムイオン量、もしくはそれらを介して活性化する下流分子の挙動を指標にすることで、ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ等が挙げられる。カルシウムイオン濃度を測定する方法は、カルシウムイメージング法やＴＧＦα ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｓｓａｙが挙げられる。ＴＧＦα ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｓｓａｙはＧＰＣＲが細胞内でＧα１２、Ｇα１３と共役した場合、そのシグナルを測定するためにも有効である。また、ｃＡＭＰ量を介して活性化する下流分子の挙動を指標とした方法の例として、アフリカツメガエル卵母細胞において、ｃＡＭＰシグナルにより活性化する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子ＣＦＴＲを介した細胞膜内外の電位変化を測定する二電極膜電位固定法も有効である。目的のＧＰＣＲと共役しやすいＧタンパク質αサブユニットと、他の任意のＧタンパク質αサブユニットとのキメラタンパク質を利用することで、上記の任意の応答測定方法を用いることができる。例えば、味覚受容体は様々なＧタンパク質αサブユニットの中で、Ｇｉファミリーに属するものと効率よく共役できる。このことを踏まえて、Ｇαｉ３やＧαｇｕｓｔのＣ末端側５アミノ酸をもつＧα１５（Ｇα１５／ｉ３、Ｇα１５／ｇｕｓｔ）を利用することで、活性化した味覚受容体を由来とするシグナルを、本来の細胞内ｃＡＭＰ量の低下ではなく細胞内カルシウムイオン濃度の上昇として検出することができる。また、本発明に従いＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させた細胞から該ＧＰＣＲポリペプチドを精製した上で、リガンドとの結合性を評価してもよい。精製ＧＰＣＲポリペプチドのリガンドとの結合性を評価する方法は、当該分野で知られている任意の方法によって行えばよい。例えば、リガンド添加条件でのＧＰＣＲポリペプチドから生じる熱量を測定する方法、及びＧＰＣＲポリペプチドの熱安定性の変化を評価する方法が挙げられる。
上述したように、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドは、オリジナルのＧＰＣＲに比して培養細胞膜上で効率よく発現することができ、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答はオリジナルのＧＰＣＲの応答を反映していると考えられるので、該ＧＰＣＲポリペプチドを用いてオリジナルのＧＰＣＲのリガンドを探索することができる。したがって、別の一態様において本発明は、目的のＧＰＣＲのリガンドの探索方法を提供する。当該方法は、試験物質存在下で、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、及び該ＧＰＣＲポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、を含む。本発明のリガンド探索方法によれば、目的のＧＰＣＲのリガンド探索効率を改善でき、従来培養細胞の細胞膜での発現が十分でないために機能解析ができなかった目的のＧＰＣＲのリガンドの探索を可能にする。
本発明のリガンド探索方法に使用される試験物質は、目的のＧＰＣＲのリガンドであるか否かの確認を所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的もしくは生物学的方法などで人工的に合成した物質であってもよく、又は化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。
本発明のリガンド探索方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチド及びその形態については、本発明の応答測定方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチド及びその形態と同様である。
本発明のリガンド探索方法においては、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質が適用される。ＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を適用する手段としては、該ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞を培養する培地に試験物質を添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
本発明のリガンド探索方法においては、ＧＰＣＲポリペプチドへの試験物質の添加に続いて、該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が測定される。応答を測定する方法としては、本発明の応答測定方法と同様の手法を使用できる。
次いで、測定されたＧＰＣＲポリペプチドの応答に基づいて、試験物質を評価する。該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を引き起こす試験物質は、該ＧＰＣＲポリペプチドのリガンド、すなわちオリジナルのＧＰＣＲのリガンドと判定することができる。したがって、本発明のリガンド探索方法においては、該ＧＰＣＲポリペプチドが応答した試験物質がオリジナルのＧＰＣＲのリガンドとして選択される。
好適には、試験物質に対するＧＰＣＲポリペプチドの応答は、試験物質を添加したＧＰＣＲポリペプチド（試験群）の応答を、対照群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答と比較することによって評価することができる。対照群としては、試験物質を添加していない該ＧＰＣＲポリペプチド、対照物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド、より低濃度の試験物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド、試験物質を添加する前の該ＧＰＣＲポリペプチド、などを挙げることができる。試験群における応答が対照群と比べてより高い場合、該ＧＰＣＲポリペプチドは該試験物質に応答したと評価され、該試験物質はオリジナルのＧＰＣＲのリガンドとして選択される。
したがって、本発明のリガンド探索方法の一実施形態においては、試験物質の存在下及び非存在下でのＧＰＣＲポリペプチドの応答が測定され、次いで、試験物質の存在下での応答が、試験物質非存在下での応答に比べて高いか否かが判定される。試験物質の存在下での応答がより高い場合、該試験物質はリガンドとして選択される。好ましい実施形態においては、試験物質の存在下でのＧＰＣＲポリペプチドの応答強度が、試験物質非存在下と比較して、好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上であれば、該試験物質はオリジナルのＧＰＣＲのリガンドとして選択される。別の好ましい実施形態においては、試験物質の存在下でのＧＰＣＲポリペプチドの応答強度が、試験物質非存在下と比較して統計学的に有意に増加していれば、該試験物質はオリジナルのＧＰＣＲのリガンドとして選択される。
また、上述したように、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドは、オリジナルのＧＰＣＲに比して培養細胞膜上で効率よく発現することができ、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答はオリジナルのＧＰＣＲの応答を反映していると考えられるので、該ＧＰＣＲポリペプチドを用いてオリジナルのＧＰＣＲにおけるリガンドの認識を制御する物質を評価及び／又は選択することができる。したがって、別の一態様において本発明は、目的のＧＰＣＲのリガンドの認識の制御剤の評価及び／又は選択方法を提供する。当該方法は、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び標的のリガンドを添加すること、及び該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、を含む。一例において、鋤鼻受容体は、フェロモン受容体として機能すると考えられているので、ＧＰＣＲポリペプチドとして鋤鼻受容体ポリペプチドを用いる場合、リガンドとしては、好ましくはフェロモン物質が挙げられる。また、別の一例において、ＧＰＣＲポリペプチドとして味覚受容体ポリペプチドを用いる場合、リガンドとしては、好ましくは味物質（苦味物質、うま味物質、又は甘味物質）が挙げられる。目的のＧＰＣＲのリガンドとしては、本発明のリガンドの探索方法により選択されたリガンドが好ましい。本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法によれば、標的のリガンドの認識を選択的に抑制又は増強することができる物質を効率よく評価又は選択することができる。
本発明の制御剤の評価及び／又は選択は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われる方法であり得る。
本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法に使用される試験物質は、標的のリガンドの認識の制御剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的若しくは生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、又は化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチド及びその形態については、本発明の応答測定方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチド及びその形態と同様である。
本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法においては、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び標的のリガンドが適用される。ＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び標的のリガンドを適用する手段としては、該ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞を培養する培地に試験物質及び標的のリガンドを添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法においては、ＧＰＣＲポリペプチドへの試験物質及び標的のリガンドの添加に続いて、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が測定される。応答を測定する方法としては、本発明の応答測定方法と同様の手法を使用できる。
次いで、測定した応答に基づいて、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する試験物質を検出する。検出された試験物質は、該リガンドの認識の抑制剤として選択される。あるいは、測定した応答に基づいて、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する試験物質を検出する。検出された試験物質は、該リガンドの認識の増強剤として選択される。
該ＧＰＣＲポリペプチドの該リガンドに対する応答を抑制する試験物質は、該リガンドの認識の抑制剤として選択される。あるいは、該ＧＰＣＲポリペプチドの該リガンドに対する応答を増強する試験物質は、該リガンドの認識の増強剤として選択される。該ＧＰＣＲポリペプチドの該リガンドへの応答に対して該試験物質が及ぼす作用は、例えば、試験物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド（試験群）の該リガンドに対する応答を、対照群における該リガンドに対する応答と比較することによって評価することができる。対照群の例としては、試験物質を添加していない該ＧＰＣＲポリペプチド、対照物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド、より低濃度の試験物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド、試験物質を添加する前の該ＧＰＣＲポリペプチド、該ＧＰＣＲポリペプチドが発現していない細胞、などを挙げることができる。好ましくは、本発明の抑制剤の評価及び／又は選択方法は、試験物質の存在下及び非存在下で、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの活性を測定することを含む。
例えば、試験群における応答が、対照群よりも抑制されていた場合、該試験物質を、標的のリガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。例えば、試験群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、対照群と比較して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていれば、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。あるいは、試験群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、対照群と比較して統計学的に有意に抑制されていれば、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。
あるいは、例えば、試験群における応答が、対照群よりも増強されていた場合、該試験物質を、標的のリガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を増強する物質として同定することができる。例えば、試験群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、対照群と比較して好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上に増強されていれば、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を増強する物質として同定することができる。あるいは、試験群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、対照群と比較して統計学的に有意に増強されていれば、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を増強する物質として同定することができる。
本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法の一実施形態においては、ＧＰＣＲポリペプチドは本発明の発現方法により発現された鋤鼻受容体ポリペプチドであり、目的のＧＰＣＲのリガンドはフェロモン物質であり、リガンド認識の制御剤として、フェロモン抑制剤又はフェロモン増強剤が評価及び／又は選択される。本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法の別の一実施形態においては、ＧＰＣＲポリペプチドは本発明の発現方法により発現されたうま味受容体ポリペプチド（コンセンサスＴＡＳ１Ｒ１とコンセンサスＴＡＳ１Ｒ３との組み合わせ）であり、目的のＧＰＣＲのリガンドはうま味物質であり、リガンド認識の制御剤として、うま味抑制剤又はうま味増強剤が評価及び／又は選択される。本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法の別の一実施形態においては、ＧＰＣＲポリペプチドは本発明の発現方法により発現された甘味受容体ポリペプチド（コンセンサスＴＡＳ１Ｒ２とコンセンサスＴＡＳ１Ｒ３との組み合わせ）であり、目的のＧＰＣＲのリガンドは甘味物質であり、リガンド認識の制御剤として、甘味抑制剤又は甘味増強剤が評価及び／又は選択される。本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法の別の一実施形態においては、ＧＰＣＲポリペプチドは本発明の発現方法により発現された苦味受容体ポリペプチドであり、目的のＧＰＣＲのリガンドは苦味物質であり、リガンド認識の制御剤として、苦味抑制剤又は苦味増強剤が評価及び／又は選択される。
上記の手順で同定された試験物質は、標的のリガンドに対するＧＰＣＲの応答を制御することによって、個体による該リガンドの認識を制御することができる物質である。したがって、上記手順で同定された試験物質は、該リガンドの認識の制御剤として選択することができる。本発明の制御剤の評価及び／又は選択方法によって標的のリガンドの認識の制御剤として選択された物質は、該リガンドに対するＧＰＣＲの応答制御によって、該リガンドの認識を制御することができる。
したがって、一実施形態において、本発明のリガンドの認識の制御剤の評価及び／又は選択方法によって選択された物質は、該リガンドの認識の制御剤の有効成分であり得る。あるいは、本発明のリガンドの認識の制御剤の評価及び／又は選択方法によって選択された物質は、該リガンドの認識を制御するための化合物又は組成物に、該リガンドの認識を制御するための有効成分として含有され得る。またあるいは、本発明のリガンドの認識の制御剤の評価及び／又は選択方法によって選択された物質は、該リガンドの認識の制御剤の製造のため、又は該リガンドの認識を制御するための化合物若しくは組成物の製造のために使用することができる。該物質によれば、標的のリガンドの認識を抑制又は増強することができる。
また、上述したように、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドは、オリジナルのＧＰＣＲに比して培養細胞膜上で効率よく発現することができ、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答はオリジナルのＧＰＣＲの応答を反映していると考えられるので、該ＧＰＣＲポリペプチドとして味覚受容体ポリペプチドを用いて試験物質の味を評価することができる。したがって、別の一態様において本発明は、味の評価方法を提供する。当該方法は、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を添加すること、及び該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが味覚受容体ポリペプチドである方法である。本発明の味評価方法によれば、試験物質の味を効率よく評価することができる。
本発明の味評価方法に使用される試験物質は、味（例えば、うま味、甘味、又は苦味）の有無又は程度の確認を所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的もしくは生物学的方法などで人工的に合成した物質であってもよく、又は化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。
本発明の味評価方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチド及びその形態については、該ＧＰＣＲポリペプチドが味覚受容体ポリペプチドである限りにおいて、本発明の応答測定方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチド及びその形態と同様である。
本発明の味評価方法においては、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質が適用される。ＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を適用する手段としては、該ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞を培養する培地に試験物質を添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
本発明の味評価方法においては、ＧＰＣＲポリペプチドへの試験物質の添加に続いて、該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が測定される。応答を測定する方法としては、本発明の応答測定方法と同様の手法を使用できる。
次いで、測定されたＧＰＣＲポリペプチドの応答に基づいて、試験物質を評価する。該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を引き起こす試験物質は、味（例えば、うま味、甘味、又は苦味）を呈する物質であると評価することができる。試験物質が引き起こす応答強度が大きい程、該試験物質の味の程度は大きい（例えば、よりうま味が強い、より甘味が強い、又はより苦味が強い）と評価される。
好適には、試験物質に対するＧＰＣＲポリペプチドの応答は、試験物質を添加したＧＰＣＲポリペプチド（試験群）の応答を、対照群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答と比較することによって評価することができる。対照群としては、試験物質を添加していない該ＧＰＣＲポリペプチド、対照物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド、より低濃度の試験物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド、試験物質を添加する前の該ＧＰＣＲポリペプチド、などを挙げることができる。試験群における応答が対照群と比べてより高い場合、該試験物質は味を呈する物質であると評価される。
したがって、本発明の味評価方法の一実施形態においては、試験物質の存在下及び非存在下でのＧＰＣＲポリペプチドの応答が測定され、次いで、試験物質の存在下での応答が、試験物質非存在下での応答に比べて高いか否かが判定される。試験物質の存在下での応答がより高い場合、該試験物質は味を呈する物質であると評価される。好ましい実施形態においては、試験物質の存在下でのＧＰＣＲポリペプチドの応答強度が、試験物質非存在下と比較して、好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上であれば、該試験物質は味を呈する物質であると評価される。別の好ましい実施形態においては、試験物質の存在下でのＧＰＣＲポリペプチドの応答強度が、試験物質非存在下と比較して統計学的に有意に増加していれば、該試験物質は味を呈する物質であると評価される。
本発明の味評価方法の一実施形態においては、ＧＰＣＲポリペプチドは本発明の発現方法により発現されたうま味受容体ポリペプチド（コンセンサスＴＡＳ１Ｒ１とコンセンサスＴＡＳ１Ｒ３との組み合わせ）であり、評価対象の味はうま味である。本発明の味評価方法の別の一実施形態においては、ＧＰＣＲポリペプチドは本発明の発現方法により発現された甘味受容体ポリペプチド（コンセンサスＴＡＳ１Ｒ２とコンセンサスＴＡＳ１Ｒ３との組み合わせ）であり、評価対象の味は甘味である。本発明の味評価方法の別の一実施形態においては、ＧＰＣＲポリペプチドは本発明の発現方法により発現された苦味受容体ポリペプチドであり、評価対象の味は苦味である。
また、上述したように、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドは、オリジナルのＧＰＣＲに比して培養細胞膜上で効率よく発現することができ、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答はオリジナルのＧＰＣＲの応答を反映していると考えられるので、該ＧＰＣＲポリペプチドとして微量アミン関連受容体ポリペプチドを用いてオリジナルのＧＰＣＲにおけるリガンド（におい物質、具体的にはアミン）のにおい認識を抑制する物質を評価及び／又は選択することができる。該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質は、該ＧＰＣＲポリペプチドのリガンド応答に変化を生じさせ、すなわちオリジナルのＧＰＣＲのリガンド応答に変化を生じさせ、結果として、受容体アンタゴニズムに基づいてリガンドのにおいを選択的に抑制することができる。一方、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する物質は、該ＧＰＣＲポリペプチドのリガンド応答に変化を生じさせ、すなわちオリジナルのＧＰＣＲのリガンド応答に変化を生じさせ、結果として、受容体アゴニズムによるにおいの交差順応に基づいてリガンドのにおいを選択的に抑制することができる。
したがって、別の一態様において本発明は、目的のＧＰＣＲのリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法を提供する。当該方法は、試験物質添加後の該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定することを含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが微量アミン関連受容体ポリペプチドである方法である。測定された応答に基づいて、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制又は増強する試験物質が検出される。検出された試験物質は、標的のリガンドのにおいの抑制剤として選択される。すなわち、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する試験物質は、受容体アンタゴニズムに基づく該リガンドのにおいの抑制剤として選択され、該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する試験物質は、受容体アゴニズムによるにおいの交差順応に基づく該リガンドのにおいの抑制剤として選択される。目的のＧＰＣＲのリガンドとしては、本発明のリガンドの探索方法により選択されたリガンドが好ましい。本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法によれば、標的のリガンドのにおいを選択的に抑制することができる物質を効率よく評価又は選択することができ、標的のリガンドが従来培養細胞の細胞膜での発現が十分でないために機能解析ができなかったＧＰＣＲのリガンドである場合でも、該リガンドのにおいを選択的に抑制することができる物質を評価又は選択することができる。
本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われる方法であり得る。
本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法に使用される試験物質は、標的のリガンドのにおいの抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的若しくは生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、又は化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチド及びその形態については、該ＧＰＣＲポリペプチドが微量アミン関連受容体ポリペプチドである限りにおいて、本発明の応答測定方法に使用されるＧＰＣＲポリペプチド及びその形態と同様である。
本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法においては、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質が適用される。ＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を適用する手段としては、該ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞を培養する培地に試験物質を添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法においては、ＧＰＣＲポリペプチドへの試験物質の添加に続いて、該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が測定される。応答を測定する方法としては、本発明の応答測定方法と同様の手法を使用できる。
第一の実施形態において、本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法は、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び標的のリガンドを添加すること、及び該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、を含む。ＧＰＣＲポリペプチドにリガンドを適用する方法としては、試験物質を適用する方法と同様の手法を使用できる。次いで、測定した応答に基づいて、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する試験物質を検出する。検出された試験物質は、該リガンドのにおいの抑制剤として選択される。
該第一の実施形態においては、該ＧＰＣＲポリペプチドの該リガンドに対する応答を抑制する試験物質は、受容体アンタゴニズムに基づく該リガンドのにおいの抑制剤として選択される。該ＧＰＣＲポリペプチドの該リガンドへの応答に対して該試験物質が及ぼす作用は、例えば、試験物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド（試験群）の該リガンドに対する応答を、対照群における該リガンドに対する応答と比較することによって評価することができる。対照群の例としては、試験物質を添加していない該ＧＰＣＲポリペプチド、対照物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド、より低濃度の試験物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド、試験物質を添加する前の該ＧＰＣＲポリペプチド、該ＧＰＣＲポリペプチドが発現していない細胞、などを挙げることができる。好ましくは、該第一の実施形態における本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法は、試験物質の存在下及び非存在下で、該リガンドに対する該嗅ＧＰＣＲポリペプチドの活性を測定することを含む。
例えば、試験群における応答が、対照群よりも抑制されていた場合、該試験物質を、標的のリガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。例えば、試験群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、対照群と比較して好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは２５％以下に抑制されていれば、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。あるいは、試験群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、対照群と比較して統計学的に有意に抑制されていれば、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。
第二の実施形態において、本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法は、本発明の発現方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を添加すること、及び該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、を含む。次いで、測定した応答に基づいて、標的のリガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する試験物質を検出する。検出された試験物質は、該リガンドのにおいの抑制剤として選択される。
該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する試験物質は、先にＧＰＣＲの応答を増強させておくことで、後で標的のリガンドに曝露されたときの該ＧＰＣＲの応答を弱めることができる。結果、におい交差順応に基づいて、個体による該リガンドのにおいの認識を抑制することができる。したがって、該第二の実施形態では、受容体アゴニズムによるにおいの交差順応に基づくリガンドのにおいの抑制剤が選択される。
該ＧＰＣＲポリペプチドに対する試験物質の作用は、例えば、試験物質を添加した該ＧＰＣＲポリペプチド（試験群）の応答を、対照群における応答と比較することによって評価することができる。対照群の例としては、上述したものが挙げられる。好ましくは、該第二の実施形態における本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法は、試験物質の存在下および非存在下での該ＧＰＣＲポリペプチドの活性を測定することを含む。また好ましくは、該第二の実施形態における本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法は、試験物質の存在下で、該ＧＰＣＲポリペプチドが発現した細胞及び未発現の細胞の該リガンドに対する応答を測定することを含む。
例えば、試験群における応答が対照群と比べて増強されていた場合、該試験物質を、標的のリガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。例えば、試験群における該ＧＰＣＲ体ポリペプチドの応答が、対照群と比較して、好ましくは１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％に増強されていれば、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。あるいは、試験群における該ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、対照群と比較して統計学的に有意に増強されていれば、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質、すなわち該リガンドに対するオリジナルのＧＰＣＲの応答を抑制する物質として同定することができる。
上記の手順で同定された試験物質は、標的のリガンドに対するＧＰＣＲの応答を抑制することによって、個体による該リガンドのにおいの認識を抑制することができる物質である。したがって、上記手順で同定された試験物質は、該リガンドのにおいの抑制剤として選択することができる。本発明のにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法によって標的のリガンドのにおいの抑制剤として選択された物質は、該リガンドに対するＧＰＣＲの応答抑制によって、該リガンドのにおいを抑制することができる。
したがって、一実施形態において、本発明のリガンドのにおい抑制剤の評価及び／又は選択方法によって選択された物質は、該リガンドのにおいの抑制剤の有効成分であり得る。あるいは、本発明のリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法によって選択された物質は、該リガンドのにおいを抑制するための化合物又は組成物に、該リガンドのにおいを抑制するための有効成分として含有され得る。またあるいは、本発明のリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法によって選択された物質は、該リガンドのにおいの抑制剤の製造のため、又は該リガンドのにおいを抑制するための化合物若しくは組成物の製造のために使用することができる。該物質によれば、従来の消臭剤または芳香剤を用いる消臭方法において生じていた芳香剤の強いにおいに基づく不快感等や、他のにおいをも抑えてしまうという問題を生じることがなく、標的のリガンドのにおいを消臭することができる。
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕ＧＰＣＲポリペプチドの発現方法であって、
目的のＧＰＣＲ（但し、嗅覚受容体を除く）のアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、
該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、
方法。
〔２〕ＧＰＣＲポリペプチドの発現向上方法である、〔１〕記載の方法。
〔３〕目的のＧＰＣＲの機能化方法であって、
目的のＧＰＣＲ（但し、嗅覚受容体を除く）のアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、
該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、
方法。
〔４〕前記オルソログが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類におけるオルソログから選択されるオルソログ、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類及び両生類におけるオルソログから選択されるオルソログ、より好ましくは哺乳類におけるオルソログである、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記コンセンサスアミノ酸配列が、前記アラインメントから以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の基準に従い同定したコンセンサス残基からなるアミノ酸配列である、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法：
（ｉ）該アラインメントの各アミノ酸位置において、
（ｉ－ｉ）該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基と異なり且つ出現頻度５０％以上のアミノ酸残基が１種存在する場合、該アミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｉｉ）出現頻度５０％のアミノ酸残基が２種存在する場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｉｉｉ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在し且つ出現頻度４０％以上でアミノ酸残基が存在しない場合、コンセンサス残基なしと同定する、
（ｉ－ｉｖ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在せず且つ出現頻度６０％以上でアミノ酸残基が存在する場合、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｖ）上記（ｉ－ｉ）～（ｉ－ｉｖ）のいずれにも該当しない場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端又はそれよりもＣ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、最もＮ末端に近い位置のメチオニン残基からなるコンセンサス残基よりＮ末端側のコンセンサス残基をコンセンサス残基なしに変更する、
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端よりもＮ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、該アラインメントの該コンセンサス残基の位置よりＮ末端側にアミノ酸位置を１つずつ遡り、メチオニン残基が出現するまで、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する。
〔６〕前記アラインメントが、前記目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列と、前記脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲであって、少なくとも２種、好ましくは少なくとも５種、より好ましくは少なくとも１１種、さらに好ましくは少なくとも１５種、さらに好ましくは少なくとも３０種、さらに好ましくは少なくとも１００種のＧＰＣＲのアミノ酸配列とのアラインメントである、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記目的のＧＰＣＲがヒトＧＰＣＲである、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記目的のＧＰＣＲが、鋤鼻受容体、味覚受容体、微量アミン関連受容体、Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体、又はＧＰＲである、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記ＧＰＣＲポリペプチドが、好ましくは下記表２－１及び２－２の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕前記ＧＰＣＲポリペプチドが、好ましくは配列番号１０８～１４２、１４４～２１４及び２７５～３１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、〔９〕記載の方法。
〔１１〕ＧＰＣＲポリペプチドの発現方法であって、
目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、
該ＧＰＣＲポリペプチドが、ヒトＴＡＡＲ６の配列番号３６で示されるアミノ酸配列において配列番号１４３で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなり、好ましくは配列番号１４３で示されるアミノ酸配列からなるものである、
方法。
〔１２〕ＧＰＣＲポリペプチドの発現向上方法である、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕目的のＧＰＣＲの機能化方法であって、
目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、
該ＧＰＣＲポリペプチドが、ヒトＴＡＡＲ６の配列番号３６で示されるアミノ酸配列において配列番号１４３で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなり、好ましくは配列番号１４３で示されるアミノ酸配列からなるものである、
方法。
〔１４〕前記ＧＰＣＲポリペプチドが前記細胞の細胞膜に発現するものである、〔１〕～〔１３〕のいずれか１項記載の方法。
〔１５〕好ましくは、ＲＴＰ１Ｓを前記細胞に発現させることをさらに含む、〔１〕～〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、〔１〕～〔１５〕のいずれか１項記載の方法。
〔１７〕目的のＧＰＣＲの応答の測定方法であって、
〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含む方法。
〔１８〕目的のＧＰＣＲのリガンドの探索方法であって、
試験物質存在下で、〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、及び
該ＧＰＣＲポリペプチドが応答した試験物質を選択すること
、を含む方法。
〔１９〕好ましくは、試験物質非存在下での前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定することをさらに含む、〔１８〕記載の方法。
〔２０〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を、前記試験物質非存在下での応答の１２０％以上に増加させる試験物質を選択する、〔１９〕記載の方法。
〔２１〕好ましくは、前記試験物質存在下での前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を、前記試験物質非存在下での応答と比べて統計学的に有意に増加させる試験物質を選択する、〔１９〕記載の方法。
〔２２〕目的のＧＰＣＲのリガンドの認識の制御剤の評価及び／又は選択方法であって、
〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び目的のＧＰＣＲのリガンドを添加すること、及び
該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含む方法。
〔２３〕前記リガンドが〔１８〕～〔２１〕のいずれか１項記載の方法により選択されたリガンドである、〔２２〕記載の方法。
〔２４〕測定された応答に基づいて前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を制御する試験物質、好ましくは抑制又は増強する試験物質を同定することをさらに含む、〔２２〕又は〔２３〕のいずれか１項記載の方法。
〔２５〕前記試験物質を添加しなかった前記ＧＰＣＲポリペプチドの前記リガンドに対する応答を測定することをさらに含む、〔２２〕～〔２４〕のいずれか１項記載の方法。
〔２６〕前記試験物質を添加した前記ＧＰＣＲポリペプチドの前記リガンドに対する応答が、該試験物質を添加しなかった該ＧＰＣＲポリペプチドの該リガンドに対する応答よりも抑制されていたときに、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質として同定するか、前記試験物質を添加した前記ＧＰＣＲポリペプチドの前記リガンドに対する応答が、該試験物質を添加しなかった該ＧＰＣＲポリペプチドの該リガンドに対する応答よりも増強されていたときに、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する物質として同定することをさらに含む、〔２５〕記載の方法。
〔２７〕味の評価方法であって、
〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を添加すること、及び
該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが味覚受容体ポリペプチドである、
方法。
〔２８〕好ましくは、前記試験物質を添加しなかった前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定することをさらに含む、〔２７〕記載の方法。
〔２９〕好ましくは、前記試験物質を添加した前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を、該試験物質を添加しなかった該ＧＰＣＲポリペプチドの応答の１２０％以上に増加させる試験物質を、味を呈する物質と評価する、〔２８〕記載の方法。
〔３０〕好ましくは、前記試験物質を添加した前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を、該試験物質を添加しなかった該ＧＰＣＲポリペプチドの応答と比べて統計学的に有意に増加させる試験物質を、味を呈する物質と評価する、〔２８〕記載の方法。
〔３１〕好ましくは、前記味がうま味、甘味、又は苦味である、〔２７〕～〔３０〕のいずれか１項記載の方法。
〔３２〕目的のＧＰＣＲのリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法であって、
〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び目的のＧＰＣＲのリガンドを添加すること、及び
該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが微量アミン関連受容体ポリペプチドである、
方法。
〔３３〕前記リガンドが〔１８〕～〔２１〕のいずれか１項記載の方法により選択されたリガンドである、〔３２〕記載の方法。
〔３４〕測定された応答に基づいて前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定することをさらに含む、〔３２〕又は〔３３〕記載の方法。
〔３５〕前記試験物質を添加しなかった前記ＧＰＣＲポリペプチドの前記リガンドに対する応答を測定することをさらに含む、〔３２〕～〔３４〕のいずれか１項記載の方法。
〔３６〕前記試験物質を添加した前記ＧＰＣＲポリペプチドの前記リガンドに対する応答が、該試験物質を添加しなかった該ＧＰＣＲポリペプチドの該リガンドに対する応答よりも抑制されていたときに、該試験物質を、該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することをさらに含む、〔３５〕記載の方法。
〔３７〕目的のＧＰＣＲのリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法であって、
〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を添加すること、及び
該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが微量アミン関連受容体ポリペプチドである、
方法。
〔３８〕前記リガンドが〔１８〕～〔２１〕のいずれか１項記載の方法により選択されたリガンドである、〔３７〕記載の方法。
〔３９〕測定された応答に基づいて前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を増強する試験物質を同定することをさらに含む、〔３７〕又は〔３８〕記載の方法。
〔４０〕前記試験物質を添加しなかった前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定することをさらに含む、〔３７〕～〔３９〕のいずれか１項記載の方法。
〔４１〕前記試験物質を添加した前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、該試験物質を添加しなかった該ＧＰＣＲポリペプチドの応答よりも増強されていたときに、該試験物質を、前記リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を抑制する物質として同定することをさらに含む、〔４０〕記載の方法。
〔４２〕好ましくは、前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、ＥＬＩＳＡもしくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、カルシウムイメージングもしくはＴＧＦα ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｓｓａｙによるカルシウムイオン量測定、又はアフリカツメガエル卵母細胞を用いた二電極膜電位固定法による細胞膜内外の電位変化測定により測定される、〔１７〕～〔４１〕のいずれか１項記載の方法。
〔４３〕改変ＧＰＣＲポリペプチドであって、
目的のＧＰＣＲ（但し、嗅覚受容体を除く）のアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなり、
該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、
改変ＧＰＣＲポリペプチド。
〔４４〕前記オルソログが、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類におけるオルソログから選択されるオルソログ、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類及び両生類におけるオルソログから選択されるオルソログ、より好ましくは哺乳類におけるオルソログである、〔４３〕記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
〔４５〕前記コンセンサスアミノ酸配列が、前記アラインメントから以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の基準に従い同定したコンセンサス残基からなるアミノ酸配列である、〔４３〕又は〔４４〕記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド：
（ｉ）該アラインメントの各アミノ酸位置において、
（ｉ－ｉ）該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基と異なり且つ出現頻度５０％以上のアミノ酸残基が１種存在する場合、該アミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｉｉ）出現頻度５０％のアミノ酸残基が２種存在する場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｉｉｉ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在し且つ出現頻度４０％以上でアミノ酸残基が存在しない場合、コンセンサス残基なしと同定する、
（ｉ－ｉｖ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在せず且つ出現頻度６０％以上でアミノ酸残基が存在する場合、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉ－ｖ）上記（ｉ－ｉ）～（ｉ－ｉｖ）のいずれにも該当しない場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
（ｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端又はそれよりもＣ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、最もＮ末端に近い位置のメチオニン残基からなるコンセンサス残基よりＮ末端側のコンセンサス残基をコンセンサス残基なしに変更する、
（ｉｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端よりもＮ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、該アラインメントの該コンセンサス残基の位置よりＮ末端側にアミノ酸位置を１つずつ遡り、メチオニン残基が出現するまで、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する。
〔４６〕前記アラインメントが、前記目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列と、前記脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲであって、少なくとも２種、好ましくは少なくとも５種、より好ましくは少なくとも１１種、さらに好ましくは少なくとも１５種、さらに好ましくは少なくとも３０種、さらに好ましくは少なくとも１００種のＧＰＣＲのアミノ酸配列とのアラインメントである、〔４３〕～〔４５〕のいずれか１項記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
〔４７〕前記目的のＧＰＣＲがヒトＧＰＣＲである、〔４３〕～〔４６〕のいずれか１項記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
〔４８〕前記目的のＧＰＣＲが、鋤鼻受容体、味覚受容体、微量アミン関連受容体、Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体、又はＧＰＲである、〔４３〕～〔４７〕のいずれか１項記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
〔４９〕好ましくは、上記表２－１及び２－２の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる、〔４３〕～〔４８〕のいずれか１項記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
〔５０〕好ましくは、配列番号１０８～１４２、１４４～２１４及び２７５～３１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、〔４９〕記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
〔５１〕改変ＧＰＣＲポリペプチドであって、
ヒトＴＡＡＲ６の配列番号３６で示されるアミノ酸配列において配列番号１４３で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなり、好ましくは配列番号１４３で示されるアミノ酸配列からなるものである、
改変ＧＰＣＲポリペプチド。
〔５２〕〔４３〕～〔５１〕のいずれか１項記載の改変ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔５３〕配列番号２１５～２３４及び３１３～３１７のいずれかで示される塩基配列からなる、〔５２〕記載のポリヌクレオチド。
〔５４〕〔５２〕又は〔５３〕記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
〔５５〕〔５４〕記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
〔５６〕好ましくは、ＲＴＰ１Ｓをコードするポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片をさらに含む、〔５５〕記載の形質転換細胞。
〔５７〕前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、〔５５〕又は〔５６〕記載の形質転換細胞。
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１ コンセンサス受容体の作製及び解析
１）受容体遺伝子の作製
コンセンサス受容体をデザインするにあたり、目的の受容体遺伝子の相同遺伝子候補の検索はＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用いて行った。得られた遺伝子群についてオルソログ群を特定した。
具体的には、ヒト受容体（ＧＰＣＲ）を目的の受容体とするとき、オルソログの特定では、ＢＬＡＳＴにより検索された相同性上位の遺伝子から、目的の受容体と同じ名称をもつ遺伝子をオルソログとして選択した。
例えばヒト微量アミン関連受容体であるＴＡＡＲ１の場合、ヒトＴＡＡＲ１（ＮＰ＿６１２２００．１）のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＢＬＡＳＴにより検索された相同性上位の２５０遺伝子の中から、名称にＴＡＡＲ１を含む２４９遺伝子をオルソログとして特定した。これら２４９遺伝子にヒトＴＡＡＲ１を加えた計２５０遺伝子（表３－１～４）のアミノ酸配列について以下に述べるようにアラインメント解析及びコンセンサスアミノ酸の特定を行った。ヒトＴＡＡＲ２、ＴＡＡＲ５、ＴＡＡＲ６、ＴＡＡＲ８及びＴＡＡＲ９についても、同様にしてオルソログ群を特定した。ヒトＴＡＡＲ６、ＴＡＡＲ８又はＴＡＡＲ９を目的の受容体とするとき、特定したオルソログは霊長目のオルソログ及び霊長目以外の目の哺乳類のオルソログであり、ＴＡＡＲ２又はＴＡＡＲ５を目的の受容体とするとき、特定したオルソログは霊長目のオルソログ、霊長目以外の目の哺乳類のオルソログ及び鳥類のオルソログであり、ＴＡＡＲ１を目的の受容体とするとき、特定したオルソログは霊長目のオルソログ、霊長目以外の目の哺乳類のオルソログ、鳥類のオルソログ、爬虫類のオルソログ及び両生類のオルソログであった。
例えばヒト鋤鼻受容体であるＶＮ１Ｒ１の場合、ヒトＶＮ１Ｒ１（ＮＰ＿０６５６８４．１）のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列として、ＢＬＡＳＴ検索を行うと、相同性上位の２５０遺伝子の中に名称にｖｏｍｅｒｏｎａｓａｌ ｔｙｐｅ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １を含む遺伝子は２２個特定された。ＶＮ１Ｒは、相同遺伝子間の多様性が大きい受容体遺伝子ファミリーであり、それら相同遺伝子のうちヒトＶＮ１Ｒ１と６５％以上のアミノ酸同一性をもつ７遺伝子をオルソログとして特定した。これら７遺伝子にヒトＶＮ１Ｒ１を加えた計８遺伝子のアミノ酸配列について以下に述べるようにアラインメント解析及びコンセンサスアミノ酸の特定を行った。ヒトＶＮ１Ｒ２、ＶＮ１Ｒ４及びＶＮ１Ｒ５についても、同様にしてオルソログ群を特定した。ＶＮ１Ｒ１、ＶＮ１Ｒ２、ＶＮ１Ｒ４又はＶＮ１Ｒ５を目的の受容体とするとき、特定したオルソログは哺乳類（霊長目）のオルソログであった。
例えばヒト味覚受容体（うま味受容体）であるＴＡＳ１Ｒ１の場合、ヒトＴＡＳ１Ｒ１（ＮＰ＿６１９６４２．２）のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＢＬＡＳＴにより検索された相同性上位の２５０遺伝子の中から、名称にＴＡＳ１Ｒ１を含む２４９遺伝子をオルソログとして特定した。これら２４９遺伝子にヒトＴＡＳ１Ｒ１を加えた計２５０遺伝子のアミノ酸配列について以下に述べるようにアラインメント解析及びコンセンサスアミノ酸の特定を行った。ヒトＴＡＳ１Ｒ２及びＴＡＳ１Ｒ３についても、同様にしてオルソログ群を特定した。ＴＡＳ１Ｒ１、ＴＡＳ１Ｒ２又はＴＡＳ１Ｒ３を目的の受容体とするとき、特定したオルソログは霊長目のオルソログ、霊長目以外の目の哺乳類のオルソログ、鳥類のオルソログ、爬虫類のオルソログ、両生類のオルソログ及び魚類のオルソログであった。
例えばヒト味覚受容体（苦味受容体）であるＴＡＳ２Ｒ８の場合、ヒトＴＡＳ２Ｒ８（ＮＰ＿０７６４０７．１）のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＢＬＡＳＴにより検索された相同性上位の２５０遺伝子の中から、名称にＴＡＳ２Ｒ８を含む９０遺伝子をオルソログとして特定した。これら９０遺伝子にヒトＴＡＳ２Ｒ８を加えた計９１遺伝子のアミノ酸配列について以下に述べるようにアラインメント解析及びコンセンサスアミノ酸の特定を行った。ヒトＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ４２、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ３１、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ２０、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ５０及びＴＡＳ２Ｒ６０についても、同様にしてオルソログ群を特定した。ヒトＴＡＳ２Ｒ４５を目的の受容体とするとき、特定したオルソログは霊長目のオルソログであり、ヒトＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ４２又はＴＡＳ２Ｒ４６を目的の受容体とするとき、特定したオルソログは霊長目のオルソログ及び霊長目以外の目の哺乳類のオルソログであった。
例えばヒトＭａｓ関連Ｇタンパク質共役型受容体であるＭｒｇｐｒＥの場合、ヒトＭｒｇｐｒＥ（ＮＰ＿００１０３４２５４．２）のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＢＬＡＳＴにより検索された相同性上位の２５０遺伝子の中から、名称にＭｒｇｐｒＥを含む７２遺伝子をオルソログとして特定した。これら７２遺伝子にヒトＭｒｇｐｒＥを加えた計７３遺伝子のアミノ酸配列について以下に述べるようにアラインメント解析及びコンセンサスアミノ酸の特定を行った。ヒトＭｒｇｐｒＦ、ＭＡＳ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧＰＲＤ、ＭＲＧＰＲＧ、ＭＲＧＰＲＸ１、ＭＲＧＰＲＸ２、ＭＲＧＰＲＸ３及びＭＲＧＰＲＸ４についても、同様にしてオルソログ群を特定した。ヒトＭｒｇｐｒＥ又はＭｒｇｐｒＦを目的の受容体とするとき、特定したオルソログは霊長目のオルソログ及び霊長目以外の目の哺乳類のオルソログであった。
例えば、ヒトＧＰＲであるＧＰＲ３の場合、ヒトＧＰＲ３（ＮＰ＿００５２７２．１）のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＢＬＡＳＴにより検索された相同性上位の２５０遺伝子の中から、名称にＧＰＲ３を含む２３４遺伝子をオルソログとして特定した。これら２３４遺伝子にヒトＧＰＲ３を加えた計２３５遺伝子のアミノ酸配列について以下に述べるようにアラインメント解析及びコンセンサスアミノ酸の特定を行った。表４に記載のＧＰＲ３、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ５０、ＧＰＲ６５、ＧＰＲ６８及びＧＰＲ４２以外のヒトＧＰＲについても、同様にしてオルソログ群を特定した。尚、ヒトＧＰＲ１７の場合は名称にオルソログとして知られる「ｕｒａｃｉｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」を含む遺伝子をオルソログとして特定した。同様に、ヒトＧＰＲ３１の場合は名称に「１２－（Ｓ）－ｈｙｄｒｏｘｙ－５，８，１０，１４－ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＧＰＲ５０の場合は名称に「ｍｅｌａｔｏｎｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＧＰＲ６５の場合は名称に「ｐｓｙｃｈｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＧＰＲ６８の場合は名称に「ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １」を含む遺伝子を、それぞれオルソログとして特定した。また、ヒトＧＰＲ４２の場合は名称に「ＧＰＲ４２」を含む遺伝子及び名称に「ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３」を含む遺伝子（ＧＰＲ４２遺伝子と相同性が高いＧＰＣＲ遺伝子）をオルソログとして特定した。
上記以外のヒトＧＰＣＲのうち、ＡＤＧＲＢ１の場合、ヒトＡＤＧＲＢ１（ＮＰ＿００１６９３．２）のアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＢＬＡＳＴにより検索された相同性上位の２５０遺伝子の中から、名称にＡＤＧＲＢ１を含む２３４遺伝子をオルソログとして特定した。これら２３４遺伝子にヒトＡＤＧＲＢ１を加えた計２３５遺伝子のアミノ酸配列について以下に述べるようにアラインメント解析及びコンセンサスアミノ酸の特定を行った。ヒトＡＤＧＲＢ２、ＡＤＧＲＢ３及びＡＤＧＲＤ１についても、同様にしてオルソログ群を特定した。また、ヒトＡＤＧＲＡ１の場合は名称に「ＡＤＧＲＡ１」を含む遺伝子及び名称に「ＧＰＲ１２３」を含む遺伝子（ＡＤＧＲＡ１遺伝子と相同性が高いＧＰＣＲ遺伝子）をオルソログとして特定した。同様に、ヒトＡＤＧＲＡ２の場合は名称に「ＡＤＧＲＡ２」を含む遺伝子及び名称に「ＧＰＲ１２４」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＡ３の場合は名称に「ＡＤＧＲＡ３」を含む遺伝子及び名称に「ＧＰＲ１２５」を含む遺伝子を、それぞれオルソログとして特定した。また、ヒトＡＤＧＲＣ１の場合は名称に「ＥＧＦ ＬＡＧ ｓｅｖｅｎ－ｐａｓｓ Ｇ－ｔｙｐｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １」を含む遺伝子（ＡＤＧＲＣ１遺伝子と相同性が高いＧＰＣＲ遺伝子）をオルソログとして特定した。同様に、ヒトＡＤＧＲＣ２の場合は名称に「ｃａｄｈｅｒｉｎ ＥＧＦ ＬＡＧ ｓｅｖｅｎ－ｐａｓｓ Ｇ－ｔｙｐｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＣ３の場合は名称に「ｃａｄｈｅｒｉｎ ＥＧＦ ＬＡＧ ｓｅｖｅｎ－ｐａｓｓ Ｇ－ｔｙｐｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＤ２の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄ２」又は「Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １４４」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＥ１の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅ１」又は「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅ１ ｉｓｏｆｏｒｍ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＥ２の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅ２」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＥ３の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅ３」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＥ５の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅ５」又は「ＣＤ９７ ａｎｔｉｇｅｎ」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＦ１の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆ１」又は「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆ１ ｉｓｏｆｏｒｍ １ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＦ３の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆ３」又は「Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １１３」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＦ４の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆ４」又は「Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １１５」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＦ５の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆ５」又は「Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １１６」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＧ１の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇ１」又は「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇ１ ｉｓｏｆｏｒｍ ｂ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＧ２の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇ２」又は「Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ６４」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＧ４の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇ４」又は「Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １１２」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＧ５の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇ５」又は「Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １１４」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＧ６の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇ６」又は「Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １２６」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＧ７の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇ７」又は「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇ７ ｉｓｏｆｏｒｍ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＬ１の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌ１」又は「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌ１ ｉｓｏｆｏｒｍ １ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＬ２の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌ２」又は「ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ ａｎｄ ｓｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＬ３の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌ３」又は「ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ－３」を含む遺伝子を、ヒトＡＤＧＲＬ４の場合は名称に「ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌ４」又は「ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ－２ ｉｓｏｆｏｒｍ」を含む遺伝子を、ヒトＣｈｒｍ－４／Ｍ４Ｒの場合は名称に「Ｍ４Ｒ」を含む遺伝子を、ヒトＦ２ＲＬ１の場合は名称に「ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２」を含む遺伝子を、ヒトＧＲＭ５の場合は名称に「ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５」を含む遺伝子を、ヒトＡＰＬＮＲの場合は名称に「ａｐｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＣＡＬＣＲＬの場合は名称に「ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｙｐｅ １」を含む遺伝子を、ヒトＧＬＰ２Ｒの場合は名称に「ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＭＣ４Ｒの場合は名称に「ＭＣ４Ｒ」、「Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４」、「Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」又は「Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」を含む遺伝子を、ヒトＣＣＲ６の場合は名称に「Ｃ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ６」を含む遺伝子を、それぞれオルソログとして特定した。
表４に、各ヒトＧＰＣＲについて、該ヒトＧＰＣＲの遺伝子と特定したオルソログの合計数を参照遺伝子数として示す。
表４のＮｏ．１～１４５のＧＰＣＲに関して、特定した遺伝子群についてのアラインメント解析はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて行った。アラインメント結果に基づき、Ｊａｌｖｉｅｗを用いてコンセンサス受容体の設計を行った。該アラインメントにおいて、基準となる目的の受容体のオリジナルの受容体アミノ酸配列の各アミノ酸位置に相当する位置に該基準アミノ酸配列のアミノ酸残基と異なり且つ出現頻度が５０％以上のアミノ酸残基が１種存在する場合に該基準アミノ酸配列のアミノ酸残基を該アミノ酸残基に改変した。尚、基準となる目的の受容体のオリジナルの受容体アミノ酸配列の各アミノ酸位置に相当する位置に該基準アミノ酸配列のアミノ酸残基と異なり且つ出現頻度が５０％のアミノ酸残基が１種存在する場合であっても、該基準アミノ酸配列のアミノ酸残基の出現頻度も５０％の場合には該基準アミノ酸配列のアミノ酸残基を改変しなかった。該アラインメントにおいて、基準となる目的の受容体のオリジナルの受容体アミノ酸配列の各アミノ酸位置に相当する位置に出現頻度が４０％以上で欠失が存在する場合に該基準アミノ酸配列のアミノ酸残基を欠失に改変した。例えばＴＡＡＲ１のようにＣ末端のアミノ酸位置に相当する位置に出現頻度が４０％以上で欠失が存在することから、該基準アミノ酸配列のアミノ酸残基を欠失に改変した。さらに例えばＴＡＡＲ１、ＴＡＡＲ２、ＭＡＳ１Ｌ、ＧＰＲ１３５、ＡＤＧＲＧ４のようにヒトの配列における開始メチオニン位置に相当する位置に出現頻度４０％以上で欠失が認められることから、該基準アミノ酸配列のアミノ酸残基を欠失に改変し、さらに上記手順による改変後アミノ酸配列において最初のメチオニンを開始メチオニンとして選択し、それ以前のアミノ酸配列を削除した。ただし、この方法においてＴＡＡＲ６は最もＮ末端に近い位置のメチオニン残基からなるコンセンサス残基よりＮ末端側のコンセンサス残基をコンセンサス残基なしに変更した場合、その結果として生じるコンセンサス受容体のアミノ酸配列の全長がオリジナルの受容体のアミノ酸配列の全長より１０％以上短くなったためこの方法に従わず、代わりにオリジナルの受容体のＮ末端構造をそのまま維持した。具体的には、最もＮ末端側のコンセンサス残基アスパラギンが糖鎖修飾及び膜移行に重要なアミノ酸残基であったため、該コンセンサス残基は変更せず、該コンセンサス残基に相当する位置よりもＮ末端側のオリジナルの受容体のＮ末端構造をそのまま維持した。一方で、該アラインメントにおいて、基準となる目的の受容体のオリジナルの受容体アミノ酸配列の欠失位置に相当する位置に出現頻度が６０％以上でアミノ酸が存在する場合に該基準アミノ酸配列の欠失位置に最も保存性の高いアミノ酸を挿入するよう改変した。最も保存性の高いアミノ酸が２種以上ある場合は、最も分子量が小さいアミノ酸を挿入するように改変した。例えばＴＡＳ２Ｒ１のようにＮ末端のアミノ酸位置に相当する位置よりもＮ末端側に出現頻度が６０％以上でアミノ酸が存在することから、該基準アミノ酸配列のＮ末端よりＮ末端側にアミノ酸残基を付加した。
設計における受容体のトポロジーの確認は、ＴＭＨＭＭ（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ）を使用した。デザインした各種受容体は７回膜貫通型の構造を有する必要がある。
表４のＮｏ．１～５、７～１３、３１～３８、６０、７６、８０、８５及び１０２のＧＰＣＲに関して、デザインした各種受容体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、そのアミノ酸配列に対応する塩基配列コドンをヒト培養細胞での発現用に最適化した上でＤＮＡ合成により獲得した。この塩基配列の両末端にはＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトを付加しており、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ－Ｒｈｏタグ配列の下流に作製したＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへと組換えた。培養細胞内で作られたＧＰＣＲタンパク質を細胞膜上へ移行するヒトＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子を、別のｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトへ組込み、ｐＭＥ１８Ｓ－ＲＴＰ１Ｓベクターを作製した。
２）受容体遺伝子で形質転換した培養細胞の作製１
Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法のために、６ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈのそれぞれのｗｅｌｌに、ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ）で懸濁させたＨＥＫ２９３細胞を３．３×１０５ｃｅｌｌｓで播種して２４時間後に、表５に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で２０分静置した後、６ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈの各ウェルに添加した。ここで、受容体遺伝子とは、表４のＮｏ．１～４、８～１３、３１～３８、６０、７６、８０、８５及び１０２のＧＰＣＲの遺伝子である。３７℃、５％ＣＯ２を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。対照として、受容体を発現させない細胞（ｍｏｃｋ）を用意した。
３）受容体遺伝子で形質転換した培養細胞の作製２
Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法のために、６ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈのそれぞれのｗｅｌｌに、ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ）で懸濁させたＨＥＫ２９３細胞を３．３×１０５ｃｅｌｌｓで播種して２４時間後に、表６に示す組成の反応液を調製し、クリーンベンチ内で２０分静置した後、６ ｗｅｌｌ ｄｉｓｈの各ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ２を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。対照として、受容体を発現させない細胞（ｍｏｃｋ）を用意した。
４）細胞膜上の受容体タンパク量の測定（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法）
Ｃｅｌｌｓｔｒｉｐｐｅｒを用いて回収した細胞に一次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体（コスモバイオ社）を１時間氷上で作用させた。細胞を洗浄後、二次抗体としてＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（アブカム株式会社）を３０分間氷上で作用させた。洗浄後０．２５μｇの７－ＡＡＤ（７－Ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、富士フイルム和光純薬株式会社）を添加してフローサイトメトリーシステム（ＢＤ）により７－ＡＡＤが陰性である細胞集団のＰＥシグナルの平均値を、細胞膜上の受容体量の指標として測定した。各実験回で、ＦＬＡＧ－Ｍ２アセチルコリン受容体を発現させた細胞を陽性コントロール（ＰＣ）として、受容体を発現させない細胞を陰性コントロール（ＮＣ）として上記と同様にＰＥシグナルの平均値を求めた。ＮＣのＰＥシグナルを０％、ＰＣのＰＥシグナルを１００％として基準化を行い、各種受容体のＰＥシグナル（％）を膜発現量（Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）として算出した。
５）結果
Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法（上記２）及び４））を用いて各受容体のＨＥＫ２９３細胞上での発現量を解析した。表７に示すように、３回の実験の平均値を比較した結果、膜発現量解析を行った受容体全て、具体的にはＶＮ１Ｒ１、ＶＮ１Ｒ２、ＶＮ１Ｒ４、ＶＮ１Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ４２、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＡＲ１、ＴＡＡＲ２、ＴＡＡＲ５、ＴＡＡＲ６、ＴＡＡＲ８、ＴＡＡＲ９、ＭｒｇｐｒＥ、ＭｒｇｐｒＦ、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ６５、ＧＰＲ８２、ＧＰＲ８８及びＧＰＲ１７１について、コンセンサス化方法による膜発現量の増加が認められた。
Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法（上記３）及び４））を用いて、ＴＡＳ１Ｒ１のオリジナル受容体とＴＡＳ１Ｒ３のオリジナル受容体、ＴＡＳ１Ｒ１のコンセンサス受容体とＴＡＳ１Ｒ３のコンセンサス受容体、ＴＡＳ１Ｒ１のオリジナル受容体とＴＡＳ１Ｒ３のコンセンサス受容体、あるいはＴＡＳ１Ｒ１のコンセンサス受容体とＴＡＳ１Ｒ３のオリジナル受容体の組み合わせのＨＥＫ２９３細胞上での発現量を解析した。図１に示すように、ＴＡＳ１Ｒ１とＴＡＳ１Ｒ３の二つのオリジナル受容体をＨＥＫ２９３細胞に共発現させた時と比べて、いずれかをコンセンサス化した受容体を発現させると、ＴＡＳ１Ｒ１の膜発現量が増加することが明らかになった。特にＴＡＳ１Ｒ１とＴＡＳ１Ｒ３の双方をコンセンサス化した時が最も多量に発現した。
上記実施例のオリジナルＧＰＣＲのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．とアミノ酸配列及びコンセンサスＧＰＣＲのアミノ酸配列を下記表８－１及び８－２に示す。また、配列番号１０８～１１２、１１４～１２０、１３８～１４５、１６７、１８３、１８７、１９２及び２０９で示されるアミノ酸配列からなるコンセンサスＧＰＣＲをコードするＤＮＡ配列を配列番号２１５～２３４及び３１３～３１７に示す。

Claims (24)

  1. Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ポリペプチドの発現方法であって、
    目的のＧＰＣＲ（但し、嗅覚受容体を除く）のアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、
    該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、
    方法。
  2. 前記コンセンサスアミノ酸配列が、前記アラインメントから以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の基準に従い同定したコンセンサス残基からなるアミノ酸配列である、請求項１記載の方法：
    （ｉ）該アラインメントの各アミノ酸位置において、
    （ｉ－ｉ）該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基と異なり且つ出現頻度５０％以上のアミノ酸残基が１種存在する場合、該アミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
    （ｉ－ｉｉ）出現頻度５０％のアミノ酸残基が２種存在する場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
    （ｉ－ｉｉｉ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在し且つ出現頻度４０％以上でアミノ酸残基が存在しない場合、コンセンサス残基なしと同定する、
    （ｉ－ｉｖ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在せず且つ出現頻度６０％以上でアミノ酸残基が存在する場合、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
    （ｉ－ｖ）上記（ｉ－ｉ）～（ｉ－ｉｖ）のいずれにも該当しない場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
    （ｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端又はそれよりもＣ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、最もＮ末端に近い位置のメチオニン残基からなるコンセンサス残基よりＮ末端側のコンセンサス残基をコンセンサス残基なしに変更する、
    （ｉｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端よりもＮ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、該アラインメントの該コンセンサス残基の位置よりＮ末端側にアミノ酸位置を１つずつ遡り、メチオニン残基が出現するまで、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する。
  3. 前記目的のＧＰＣＲがヒトＧＰＣＲである、請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記ＧＰＣＲポリペプチドが、下記表１及び２の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 前記ＧＰＣＲポリペプチドが、配列番号１０８～１４２、１４４～２１４及び２７５～３１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、請求項４記載の方法。
  6. ＧＰＣＲポリペプチドの発現方法であって、
    目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなるＧＰＣＲポリペプチドを細胞に発現させることを含み、
    該ＧＰＣＲポリペプチドが、ヒトＴＡＡＲ６の配列番号３６で示されるアミノ酸配列において配列番号１４３で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる、
    方法。
  7. 前記ＧＰＣＲポリペプチドが、配列番号１４３で示されるアミノ酸配列からなる、請求項６記載の方法。
  8. 目的のＧＰＣＲの応答の測定方法であって、
    請求項１～７のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
    を含む方法。
  9. 目的のＧＰＣＲのリガンドの探索方法であって、
    試験物質存在下で、請求項１～７のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、及び
    該ＧＰＣＲポリペプチドが応答した試験物質を選択すること、
    を含む方法。
  10. 目的のＧＰＣＲのリガンドの認識の制御剤の評価及び／又は選択方法であって、
    請求項１～７のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び目的のＧＰＣＲのリガンドを添加すること、及び
    該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
    を含む方法。
  11. 味の評価方法であって、
    請求項１～７のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を添加すること、及び
    該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
    を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが味覚受容体ポリペプチドである、
    方法。
  12. 目的のＧＰＣＲのリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法であって、
    請求項１～７のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質及び目的のＧＰＣＲのリガンドを添加すること、及び
    該リガンドに対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
    を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが微量アミン関連受容体ポリペプチドである、
    方法。
  13. 目的のＧＰＣＲのリガンドのにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法であって、
    請求項１～７のいずれか１項記載の方法により発現されたＧＰＣＲポリペプチドに試験物質を添加すること、及び
    該試験物質に対する該ＧＰＣＲポリペプチドの応答を測定すること、
    を含み、該ＧＰＣＲポリペプチドが微量アミン関連受容体ポリペプチドである、
    方法。
  14. 前記ＧＰＣＲポリペプチドの応答が、ＥＬＩＳＡもしくはレポータージーンアッセイによる細胞内ｃＡＭＰ量測定、カルシウムイメージングもしくはＴＧＦα ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｓｓａｙによるカルシウムイオン量測定、又はアフリカツメガエル卵母細胞を用いた二電極膜電位固定法による細胞膜内外の電位変化測定により測定される、請求項８～１３のいずれか１項記載の方法。
  15. 改変ＧＰＣＲポリペプチドであって、
    目的のＧＰＣＲ（但し、嗅覚受容体を除く）のアミノ酸配列においてコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなり、
    該コンセンサスアミノ酸配列が、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸配列及び脊椎動物における該目的のＧＰＣＲのオルソログにコードされるＧＰＣＲのアミノ酸配列のアラインメントから導き出されるアミノ酸配列である、
    改変ＧＰＣＲポリペプチド。
  16. 前記コンセンサスアミノ酸配列が、前記アラインメントから以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の基準に従い同定したコンセンサス残基からなるアミノ酸配列である、請求項１５記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド：
    （ｉ）該アラインメントの各アミノ酸位置において、
    （ｉ－ｉ）該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基と異なり且つ出現頻度５０％以上のアミノ酸残基が１種存在する場合、該アミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
    （ｉ－ｉｉ）出現頻度５０％のアミノ酸残基が２種存在する場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
    （ｉ－ｉｉｉ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在し且つ出現頻度４０％以上でアミノ酸残基が存在しない場合、コンセンサス残基なしと同定する、
    （ｉ－ｉｖ）該目的のＧＰＣＲにアミノ酸残基が存在せず且つ出現頻度６０％以上でアミノ酸残基が存在する場合、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
    （ｉ－ｖ）上記（ｉ－ｉ）～（ｉ－ｉｖ）のいずれにも該当しない場合、該目的のＧＰＣＲのアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する、
    （ｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端又はそれよりもＣ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、最もＮ末端に近い位置のメチオニン残基からなるコンセンサス残基よりＮ末端側のコンセンサス残基をコンセンサス残基なしに変更する、
    （ｉｉｉ）上記（ｉ）の基準に従いコンセンサス残基を同定したときに、最もＮ末端側のコンセンサス残基が該目的のＧＰＣＲのＮ末端よりもＮ末端側に相当する位置のコンセンサス残基であり且つメチオニン残基でない場合、該アラインメントの該コンセンサス残基の位置よりＮ末端側にアミノ酸位置を１つずつ遡り、メチオニン残基が出現するまで、最も出現頻度が高いアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定し、最も出現頻度が高いアミノ酸残基が２種以上存在する場合は、該アミノ酸残基のうち最も分子量が小さいアミノ酸残基をコンセンサス残基と同定する。
  17. 前記目的のＧＰＣＲがヒトＧＰＣＲである、請求項１５又は１６記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
  18. 前記ＧＰＣＲポリペプチドが、上記表１及び２の（１）のＧＰＣＲの（２）の配列番号で示されるアミノ酸配列において（３）の配列番号で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる、請求項１５～１７のいずれか１項記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
  19. 配列番号１０８～１４２、１４４～２１４及び２７５～３１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、請求項１８記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
  20. 改変ＧＰＣＲポリペプチドであって、
    ヒトＴＡＡＲ６の配列番号３６で示されるアミノ酸配列において配列番号１４３で示されるコンセンサスアミノ酸配列と異なるアミノ酸残基の少なくとも１個をこれに相当する位置の該コンセンサスアミノ酸配列のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる、
    改変ＧＰＣＲポリペプチド。
  21. 配列番号１４３で示されるアミノ酸配列からなる、請求項２０記載の改変ＧＰＣＲポリペプチド。
  22. 請求項１５～２１のいずれか１項記載の改変ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  23. 請求項２２記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
  24. 請求項２３記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
JP2023093473A 2022-06-16 2023-06-06 Ｇタンパク質共役型受容体の解析方法 Pending JP2023184465A (ja)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022097446 2022-06-16
JP2022097447 2022-06-16
JP2022097445 2022-06-16
JP2022097446 2022-06-16
JP2022097444 2022-06-16
JP2022097444 2022-06-16
JP2022097445 2022-06-16
JP2022097443 2022-06-16
JP2022097443 2022-06-16
JP2022097447 2022-06-16
JP2022205847 2022-12-22
JP2022205847 2022-12-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023184465A true JP2023184465A (ja) 2023-12-28

Family

ID=89191136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023093473A Pending JP2023184465A (ja) 2022-06-16 2023-06-06 Ｇタンパク質共役型受容体の解析方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2023184465A (ja)
WO (1) WO2023243495A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002511871A (ja) * 1997-06-30 2002-04-16 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ フェロモンレセプターの新規なファミリー
JP2003530098A (ja) * 2000-04-07 2003-10-14 セノミックス、インコーポレイテッド Ｔ２ｒ味覚受容体及びそれをコードする遺伝子
JP2005500817A (ja) * 2001-01-03 2005-01-13 セノミックス、インコーポレイテッド Ｔ１ｒ味覚受容体及びそれをコードする遺伝子
JP2006051020A (ja) * 2004-07-08 2006-02-23 F Hoffmann La Roche Ag ヒト微量アミン関連受容体
WO2020006108A2 (en) * 2018-06-26 2020-01-02 Duke University Synthetic odorant receptors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7397917B2 (ja) * 2021-06-22 2023-12-13 花王株式会社 嗅覚受容体の発現方法及び応答測定方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002511871A (ja) * 1997-06-30 2002-04-16 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ フェロモンレセプターの新規なファミリー
JP2003530098A (ja) * 2000-04-07 2003-10-14 セノミックス、インコーポレイテッド Ｔ２ｒ味覚受容体及びそれをコードする遺伝子
JP2005500817A (ja) * 2001-01-03 2005-01-13 セノミックス、インコーポレイテッド Ｔ１ｒ味覚受容体及びそれをコードする遺伝子
JP2006051020A (ja) * 2004-07-08 2006-02-23 F Hoffmann La Roche Ag ヒト微量アミン関連受容体
WO2020006108A2 (en) * 2018-06-26 2020-01-02 Duke University Synthetic odorant receptors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, U.S.A., vol. 117, no. 6, JPN6023052434, 2020, pages 2957 - 2967, ISSN: 0005228060 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023243495A1 (ja) 2023-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pierce et al. Classical and new roles of β-arrestins in the regulation of G-protein-coupled receptors
Furukawa et al. Differential Interactions of the C terminus and the Cytoplasmic I-II Loop of Neuronal Ca2+ Channels with G-protein α and βγ Subunits: II. EVIDENCE FOR DIRECT BINDING
US20090226403A1 (en) Olfactory and pheromones G-protein coupled receptors
Hay et al. Structure–activity relationships of the N‐terminus of calcitonin gene‐related peptide: key roles of alanine‐5 and threonine‐6 in receptor activation
JP2008503201A5 (ja)
US20050221436A1 (en) Human neuropeptide Y-like G protein-coupled receptor
US20080182266A1 (en) Trp8, a transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells
JP2024069247A (ja) Ｇタンパク質
JP2019074379A (ja) 生ニンニク様香料素材のスクリーニング方法
JP2024015143A (ja) 嗅覚受容体の発現方法及び応答測定方法
WO2023243495A1 (ja) Ｇタンパク質共役型受容体の解析方法
JP2019037197A (ja) ロースト様香料素材のスクリーニング方法
Agosto et al. Differential epitope masking reveals synapse-specific complexes of TRPM1
Pernollet et al. Structural Recognition Between Odorants, Olfactory‐Binding Proteins and Olfactory Receptors‐First Events in Odour Coding
JP2019039711A (ja) 嗅覚受容体の応答測定方法
CA2463553A1 (en) Gastrointestinal chemosensory receptors
Jain G protein-coupled receptor expression and signaling in yeast: Design and optimization of Host/Protein platform for therapeutic development
JP2023084475A (ja) カルボン酸を原因とするにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法
CN117677700A (zh) 嗅觉受体的表达方法和应答测定方法
WO2020175562A1 (ja) ナトリウムの作用を調節する物質のスクリーニング方法
JP2023084476A (ja) カビ臭抑制剤の評価及び／又は選択方法
JP2023084474A (ja) アミンを原因とするにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法
JP2023084473A (ja) フェノール化合物を原因とするにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法
JP2023084479A (ja) 複素環式芳香族化合物を原因とするにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法
Palenzuela Pulve Characterization of the microseminoprotein, prostate-associated (MSMP) gene and its potential role in bone biology

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231106

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231106

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20231106

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231226

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240215

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240422