CN104130247B - 人t2r苦味受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及T2R味觉受体家族中特定的人味觉受体响应存在于例如咖啡中的特定的苦味化合物的发现。另外，本发明涉及含有起苦味阻断剂功能的具体化合物和组合物，以及其作为在，例如咖啡和咖啡味食物、饮料和药物中的苦味阻断剂或味道调节剂的用途的发现。另外，本发明涉及拮抗许多不同的人T2R的化合物，以及其在测定和作为用于人和动物摄取的组合物中的苦味阻断剂的用途的发现。

Description

人T2R苦味受体及其用途
相关申请
本申请要求2007年8月21日提交的美国临时申请序列号60/957,129和2008年4月23日提交的美国临时申请序列号61/047,187的权益，并且涉及美国申请序列号11/766,974，美国申请序列号11/766,974是2006年11月1日提交的美国申请序列号11/555,617的部分连续申请，而美国申请序列号11/555,617是2002年`7月10日提交的美国申请序列号10/191,058的部分连续申请，并且还是2003年12月1日提交的美国申请序列号10/742,209的部分连续申请，美国申请序列号10/742,209是2001年4月5日提交的美国申请序列号09/825,882(现在是美国专利号7,105,650)的分案申请，全部这些申请通过引用它们的整体在此并入。
发明领域
本申请涉及人2型味觉受体(hT2R)的鉴别及其在活化特异性T2R的配体的鉴别测定中的用途。这些配体用于调节味觉，特别是苦味。在我们先前的专利申请中，我们描述了人苦味受体，包括hT2R8和hT2R14的功能表达。在这一专利申请中，我们报道了hT2R8和hT2R14通过咖啡的苦味富集的级分活化，我们还报道了使用高通量筛选测定鉴别hT2R8和hT2R14的桔抗剂，且该拮抗剂的组合物可减少咖啡和咖啡级分的苦味。这一发明提供了修饰和改善咖啡饮品的味道的方法。
特别地，本发明涉及hT2R8和/或hT2T14在鉴别抑制(阻断)咖啡和其他食物和饮料的苦味的化合物的筛选测定和味觉测试中的用途。
另外，本发明涉及具有宽泛的苦味拮抗特性的配体的发现，即该配体 明显地阻断或抑制不同组的苦味配体对许多(13)不同的苦味受体的活化，并阻断或抑制六种其他苦味受体的活化，以及抑制由一些苦味化合物引起的苦味，对所述化合物来说，与它们相互作用的苦味受体至今还没有被说明。
更加具体地，本发明涉及具有宽泛的苦味拮抗特性，本文中称为化合物C的配体的发现，即该配体明显地阻断或抑制由不同组的苦味配体对hT2R3、7、10、14、16、44、51、55、61、63、64、65和71苦味受体的活化，并阻断或抑制六种其他苦味受体，即hT2R5、9、13、54、67和75的活化，以及抑制由一些苦味化合物引起的苦味，对所述化合物来说，与它们相互作用的苦味受体至今还没有被说明。
更加具体地，本发明还提供了这一拮抗剂化合物减少水杨苷(hT2R16拮抗剂)和苯硫脲(hT2R51激动剂)的苦味的发现。
更加具体地，本发明还提供了以下发现，这一相同的拮抗剂化合物阻断由活化多种苦味受体的苦味化合物引起的苦味，所述苦味化合物包括活化hT2R10、14和75的奥美拉唑；莱鲍迪甙A(Rebaudioside A)，一种活化至少7种苦味受体的天然增甜剂；并且这一相同的拮抗剂还进一步抑制由苦味化合物引起的苦味，其中与它们相互作用的苦味受体是未知的，苦味化合物包括右美沙芬和苯海拉明。
根据以上，本发明涉及这一化合物在食物、饮料、药物和其他摄取物(ingestibles)中的用途，从而缓解其苦味，包括由未鉴别的苦味配体或化合物引起的苦味，其中苦味涉及多种苦味受体的活化，或对于苦味化合物，其中其受体特异性未被确定。
根据以上，本发明还涉及这一拮抗剂用于说明存在于不同的人T2R的保守基序的用途，所述基序涉及配体结合和T2R活化，以及嵌合和突变G蛋白偶联受体(GPCR)的设计，设计该G蛋白偶联受体以含有这一基序。
此外，本发明涉及使用这些筛选测定鉴别的化合物中的任何一个，以及其在食物饮料和药物中的用途，所述食物饮料和药物包括咖啡和咖啡味食物和饮料和药物。
相关领域描述
人类可识别的基本味觉形式之一是苦味。直到最近，对苦味的生理学仍然知之甚少。最近的研究已经开始阐明味觉生物学(Lindemann，Nature(2001))。目前已知许多苦味化合物通过与细胞表面受体相互作用产生苦味。这些受体属于与胞内G蛋白相互作用的七跨膜结构域受体家族。已经在人和啮齿动物中鉴别了称为T2R的GPCR的新家族(Adler等人，Cell100(6)：693-702(2000)；Chandrashekar等人，Cell100(6)：703-711(2000)；MatsunamiH，Montmayeur J P，Buck L B.Nature404(6778)：601-4(2000))。本发明前的几项证据表明T2R介导对苦味化合物的响应。第一，T2R基因在舌和腭上皮细胞的味觉受体细胞的亚群中特异性表达。第二，人T2R之一(hT2R1)的基因位于与人对苦味化合物6-正丙基-2-硫尿嘧啶的敏感性有关的染色体位点(Adler等人，(Id.)(2000))。第三，小鼠的T2R之一(mT2R5)位于与小鼠对苦味化合物环己酰亚胺的敏感性有关的染色体位点。还表明mT2R5可以活化味转导素，味转导素是特异性表达于味觉细胞并与苦味刺激转导有关的G蛋白(Wong等人，Nature381：796-800(1996))。mT2R5对味转导素的活化仅出现于对环己酰亚胺的响应(Chandrashekar等人，(Id.)(2000)。因此，已提议mT2R家族介导小鼠的苦味响应，而hT2R家族介导人的苦味响应。仅一种人T2R表明具有鉴别的苦味配体——hT2R4，显示被地那铵活化(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。然而，该研究使用的有效地那铵的浓度(1.5mM)非同寻常地高，即比报道的人对地那铵的苦味阀值高105倍(Saroli，Naturwissenschaften71：428-429(1984))。因此，没有特定的苦味配体有说服力地匹配于任何hT2R。还表明每种hT2R能够结合多种苦味配体。这一假设是基于hT2R家族仅由25个鉴别的成员组成，而人类可以识别数百种不同的苦味化合物的事实。先前已经报道了hT2R的序列并且公开于Zuker等人(WO01/18050A2，(2001))和Adler等人(WO01/77676A1(2001))的公布的PCT申请，两者通过引用整体并入本文。
研究T2R功能的困难之一是这些受体在培养的哺乳动物细胞系中不容易表达。为了提高T2R的表达，将来自很好地表达的GPCR(视紫红质)的N末端序列连接到T2R序列(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。由于有可 用的抗体，这一N末端标签还允许容易地监测蛋白质的表达。此外，SSTR3标签(Bufe等人，Nat.Genet.32：397-400(2002))，一种不同的N末端标签已经用于提高T2R的表达。尽管视紫红质标签的并入提高了一些T2R在哺乳动物细胞系中的表达，但是它们中的许多仍然没有被十分充分地表达以用于功能研究。在一个不同的方法中，mT2R5在昆虫Sf9细胞中成功地表达并且用于使用生物化学GTPγS结合测定的功能研究(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。
在申请人以前的专利申请美国申请序列号09/825,882(现在为美国专利号7,105,650)中，申请人鉴别并提供了许多当时新型的人味觉受体包括hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R63、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71和hT2R75的核酸序列和多肽序列。此外在美国申请序列号11/182,942和10/628,464(其整体通过引用在此并入)中，申请人提供了另一种鉴别的新型人味觉受体(在其中称为hT2R76)的多肽和DNA序列。
另外，在美国申请序列号10/191,058(其通过引用整体并入本文)中，申请人发现了特异性活化三种不同人T2R的配体。此外，申请人最近提交了美国中请序列号11/455,693(其整体通过引用在此并入)，其进一步鉴别了特异性结合到其他人T2R的苦味配体并且提供了相关的测定。
另外，关于本发明的实际应用，已报道T2R和T1R味觉受体均在胃肠系统中表达。例如，Wu等人，Proc，Natl.Acad.Sci，USA99(4)：2392-7(2002)报道T2R与味转导素和转导蛋白的亚基在肠内分泌细胞(enterendocrine cell)(STC1细胞)中表达，并且这些细胞在胃肠道中可能响应苦味配体。另外，Chen等人，AM J.Physiol.Cell Phyisol.291(4)：C726-39(2006)报道苦味刺激在肠内分泌STC-1细胞中诱导Ca++信号和缩胆囊素(CCK)释放。另外，Rozengurt，A J PhysiolGastrointes Liver Physiol291(2)：G171-7(2006)报道肠中的味觉受体可能在感受(sensing)消化功能和激素和/或神经途径控制的分子中起作用，并且它们可以在有害药物和生存响应的检测中起作用。此外，Sternini Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol.292(2)：G457-61(2007)报道肠中的味觉受体可参与胃肠功能，例如分子感受、营养吸收、防御有害物质，并且进一步表明这些机理的理解可以与疾病的状态和情况 (例如喂食障碍(feeding disorders))以及炎症有关。此外，Mace等人，JPhysiol.2007(Epub)最近表明T2R和T1R活化磷脂酶Cβ2(PLCβ2)，并且在肠中可能有与存在于舌细胞中的分子感受系统相似的分子肠感受系统，并且表达味觉受体的胃肠细胞，例如刷细胞或孤立化学感受细胞(solitary chemosensory cells)可引起GLUT2的增加并在营养感受，以及肥胖症和糖尿病治疗的营养学中起作用。另外，Cui等人，Curr Pharm Des.12(35)：4591-600(2006)表明在肠中表达的T1R可用于对治疗肥胖症和糖尿病中的化合物以及人工增甜剂的测定。
然而，尽管已经报道并且了解T2R成员调节苦味和它们在胃肠功能中的可能作用，但是仍然存在鉴别活化人苦味T2R味觉受体的特定的配体的需要。更深入地了解不同T2R特别是人T2R的结合特性将十分有益，原因是这将更有力地促进其在选择具有预期味觉调节特性(即阻断或抑制特定的苦味化合物的味道)的化合物中的应用。另外，将提供用于治疗和调节胃肠功能和相关疾病例如肥胖症、糖尿病、食物吸收(food absorption)、食物感受、进食障碍以及调控诸如GLUT2、缩胆囊素(cholecystokin)等的相关激素和肽的化合物的鉴别。
发明概述
综上，本发明涉及hT2R8和hT2R14通过咖啡的苦味富集的级分活化的发现。
另外，本发明涉及其用于鉴别抑制或阻断咖啡和咖啡相关的食物、饮料和药物的苦味的hT2R8和hT2R14的拮抗剂的用途。
此外，本发明涉及抑制咖啡和其他咖啡味的食物、饮料和药物的苦味的具体拮抗剂(苦味阻断剂)化合物。
另外，本发明涉及具有宽泛的苦味拮抗特性的配体的发现，即该配体明显地阻断或抑制不同组的苦味配体对许多(13)不同的苦味受体的活化，并阻断或抑制六种其他苦味受体的活化，以及抑制由一些苦味化合物引起的苦味，对所述化合物来说，与它们相互作用的苦味受体至今还没有被说 明。
更加具体地，本发明涉及具有宽泛的苦味拮抗特性，本文中称为化合物C的配体的发现，即该配体明显地阻断或抑制由不同组的苦味配体对hT2R3、7、10、14、16、44、51、55、61、63、64、65和71苦味受体的活化，并阻断或抑制六种其他苦味受体，即hT2R5、9、13、54、67和75的活化，以及抑制由一些苦味化合物引起的苦味，对所述化合物来说，与它们相互作用的苦味受体至今还没有被说明。
更加具体地，本发明还提供了这一拮抗剂化合物减少水杨苷(hT2R16拮抗剂)和苯硫脲(hT2R51激动剂)的苦味的发现。
更加具体地，本发明还提供了以下发现，这一相同的拮抗剂化合物阻断由活化多种苦味受体的苦味化合物引起的苦味，所述苦味化合物包括活化hT2R10、14和75的化合物奥美拉唑；莱鲍迪甙A(Rebaudioside A)，一种活化至少7种苦味受体的天然增甜剂；并且这一相同的拮抗剂化合物还进一步抑制由苦味化合物引起的苦味，其中与它们相互作用的苦味受体是未知的，苦味化合物包括右美沙芬和苯海拉明。
根据以上，本发明涉及根据本发明的这一和相关化合物在食物、饮料、药物和其他摄取物中的用途，从而缓解其苦味，包括由未鉴别的苦味配体或化合物(其中苦味涉及多种苦味受体的活化)或苦味化合物(其中其受体特异性未被确定)引起的苦味。
另外，本发明涉及含有足以抑制或阻断食物、饮料和药物的苦味的量的鉴别的苦味拮抗剂化合物中的至少一种的所述食物、饮料和药物。
使用基于细胞的测定进行发明性发现，所述测定使用在存在和缺少特异性苦味配体时表达特定T2R的细胞测量T2R的活性。特别地，如以下更加详细地描述，HEK细胞系在它们的表面上表达以上鉴别的特异性T2R，并且进一步表达功能地偶联于所述T2R的嵌合G蛋白，所述细胞系用于检测细胞内钙浓度的变化的基于细胞的测定，且被发现由特定苦味化合物特异性活化，而在相似条件下，其他hT2R未被活化。
因此，本发明包括这些人味觉受体在测定，优选高通量测定中鉴别其 他化合物的用途，所述其他化合物调节，优选阻断由存在于咖啡和相关食物和饮料中的这些和其他苦味化合物对这些受体的活化。
另外，本发明涉及这些受体鉴别引起苦味的化合物，特别是存在于咖啡和咖啡味的食物、饮料和药物中的那些化合物的用途。
另外，本发明涉及拥有宽泛范围的拮抗剂性质的拮抗剂化合物用于鉴别苦味化合物或苦味级分的体外测定和体内味觉测试的用途，对苦味化合物或苦味级分而言，该拮抗剂化合物抑制由苦味化合物或苦味级分引起的苦味，和/或抑制苦味化合物或含有这一苦味化合物的级分对一种或多种苦味受体的活化。
此外，本发明特别涉及这一宽泛作用的拮抗剂在食物、饮料、药物和人或动物摄取的其他消费品中的用途，其中苦味被明显地缓解。
本发明还涵盖包括一个额外步骤的测定，所述额外步骤评价鉴别的调节化合物在人或其他味觉测试中的效应，且特别评价鉴别的化合物对苦味的效应，特别是对由咖啡和衍生自咖啡的含有一种或多种引起苦味感觉的化合物的级分引起的苦味的效应。
此外，本发明包括已经被处理以除去特异性活化这些苦味受体的化合物的咖啡和咖啡味食物、饮料和药物的生产，例如已经被处理以除去或减少其中包含的苦味化合物的量的食物和饮料的生产。
在一些方面中，本发明还涉及由以下给出的两种骨架代表的化合物的结构类型。骨架1显示代表性的尿唑骨架，且骨架2显示代表性的乙内酰脲骨架。
本发明的另一个具体目的是使用以上显示的化合物以及骨架1和骨架2的类似物作为苦味阻断剂减少食物/药物应用中由T2R8受体介导的苦味， 特别是咖啡和咖啡味食物、饮料和药物的苦味。
本发明的另一个目的是确认鉴别的化合物在人或动物味觉测试，优选人味觉测试中调节，优选地抑制或阻断苦味，例如由咖啡和咖啡味食物、饮料和药物引起的苦味。实施例1显示这些化合物之一的代表性感觉资料。这些资料清楚地证明了特定的T2R8激动剂引起的苦味的显著降低，且效力明显高于已知的T2R8苦味阻断剂。
本发明的另一个目的是使用本文描述的化合物作为组合物中的添加剂或味道调节剂从而抑制或阻断由特异性活化这些味觉受体的化合物引起的苦味。本发明的一个优选目的是使用抑制T2R8受体的活化的化合物，从而阻断存在于咖啡和咖啡味食物、饮料和药物中的化合物的苦味。
根据本发明鉴别的化合物可添加到食物、饮料、化妆品或药物组合物中，以调节优选地阻断由存在于咖啡和相关的食物、饮料和药物的苦味化合物或结构相关的化合物或其他苦味化合物(例如引起苦味感觉的食物和饮料或药物或化妆品中发现的化合物)对hT2R8的活化触发的苦味。
发明目的
本发明的一个目的是提供使用hT2R8和/或hT2R14和其嵌合体和变体的测定，其鉴别引起或阻断与咖啡和咖啡味食物、饮料和药物相关的苦味的化合物和含有该化合物的组合物。
本发明的一个特定目的是提供鉴别活化，或阻断或调节hT2R8对含有的引起咖啡苦味的化合物或组合物的活化和/或结合的化合物的测定。
本发明的一个特定目的还是提供了鉴别活化，或阻断或调节hT2R14对含有的引起咖啡苦味的化合物或组合物的活化和/或结合的化合物的测定。
本发明的另一个具体的目的是提供使用本发明的测定鉴别的具体化合物，和含有该化合物的组合物，特别是咖啡和咖啡味食物、饮料和药物。
本发明的一个具体的目的是提供以下显示的已显示出阻断咖啡的苦 味的为T2R8和T2R14拮抗剂的化合物。
本发明的另一个具体的目的是使用以上显示的化合物和化合物A、化合物B和化合物C的类似物作为苦味阻断剂以减少食物/药物应用中由T2R8和/或T2R14受体介导的苦味，特别是咖啡和咖啡味食物、饮料和药物的苦味。
本发明的另一个具体的目的是使用化合物C及其类似物作为宽泛作用的苦味阻断剂以减少食物/药物应用中由人T2R3、7、10、14、16、44、51、55、61、63、64、65或71和/或人T2R5、9、13、54、67或75中的任何一种介导的苦味，特别是含有多种苦味化合物的食物、饮料和药物，与多种苦味受体相互作用的苦味化合物，或含有未知苦味化合物或其中苦味化合物的受体特异性为未知的苦味化合物的组合物。
本发明的另一个具体的目的是提供可由下式代表的化合物。
在第一方面，提供了结构式(I)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar1是5或6元芳基、杂芳基或环烷基环；
m是0、1、2或3；
R1是SO2；C＝O；C＝S；或C＝NOR4；
X选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R1′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
或可选地，X和/或至少一个R1′与它们所键合的原子一起形成芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基环，其中所述环任选地稠合于另一芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基环；
R4-R8独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基和取代的杂芳基烷基，或可选地，R5和R6、R6和R7、R7和R8与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；
A和B独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基；且
b是0、1或2。
在一些实施方案中，A和B与它们所连接的氮原子一起形成可与额外取代的或未取代的环融合的环，且可包括至少一个双键。这种环的非限制性实例包括具有下式的基团：
在第二个方面，本发明提供了以下所示的结构式(II)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar1、Ar2和Ar3独立地是5或6元芳基、杂芳基或环烷基环；
m是0、1、2或3；
n和p独立地是0、1、2、3或4；
r和t独立地是0、1或2；
Y和Z独立地选自由CR6R7、C＝O、C＝S、C＝NOR6、O、NR6和S(O)b组成的组；
R1选自由SO2、C＝O、C＝S和C＝NOR4组成的组；
X可选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、-OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、 B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
X优选地选自由以下组成的组：氢、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、S(O)bR6、CONR6R7、-CO2R6、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)。
每个R1′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R2′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)和P(O)(OR5)(OR6)；
每个R3′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
或可选地，X和/或R1’中的至少一个与它们所键合的原子一起形成芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基环，其中所述环任选地稠合于另一芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基环；
R4-R8独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基，或可选地，R5和R6、R6和R7、R7和R8与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；
b是0、1或2。
在另一个方面中，本发明提供了具有以下所示的结构式(III)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar1、Ar2和Ar3独立地是5或6元芳基、杂芳基或环烷基环，且Ar2和Ar3可任选地被省略；
m是0、1、2或3；
n和p独立地是0、1、2、3或4；
每个R1′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R2′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、 NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R3′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
R5-R8独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基，或可选地，R5和R6、R6和R7、R7和R8与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；
b是0、1或2。
在又一个方面中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一个方面中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在相关的方面中，提供了结构式(IV)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar4和Ar5独立地是5或6元芳基或杂芳基环；
W选自由CR6R7、C＝O、C＝S；C＝NOR6；O、NR6、S、SO、SO2和(CH2)n组成的组；
n是0、1、2或3；
G选自由CR6R7、C＝O、C＝S、C＝NOR6和S(O)b组成的组；
R20选自由以下组成的组：氢、芳基烯基、杂芳基烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基-烷基、烯基、环烷基、环烯基和取代的衍生物；
R21选自由以下组成的组：芳基烯基、杂芳基烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基-烷基、烯基、环烷基、环烯基和取代的衍生物；
R2和R7独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基，或可选地，R6和R7与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；且
b是0、1或2。
在另一个相关的方面中，提供了结构式(V)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar4和Ar5独立地是5或6元芳基或杂芳基环；
n是0、1、2或3；
R21选自由以下组成的组：芳基烯基、杂芳基烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基-烷基、烯基、环烷基、环烯基和取代的衍生物；
R35选自由氢、烷基和取代的烷基组成的组。
在另外其他的实施方案中，本发明提供了结构式(VI)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
R30选自由以下组成的组：芳基烯基、杂芳基烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基-烷基、烯基、环烷基、环烯基和取代的衍生物；
R35选自由氢、烷基和取代的烷基组成的组。
在另外其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中每个R独立地是Cl、MeO、CN、EtO、OH、Me、-SO2Me、F或H，且
n是0、1、2、3或4。
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中每个R独立地是MeO或OH，且
n是0、1、2、3或4。
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中R是H、Me、Et、OCOMe、CH2OH、OMe或Ph。
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在一方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Ar6和Ar7彼此独立地相同或不同，它们是5或6元芳基或5或6元杂芳基；
Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R36和R37彼此独立地相同或不同，它们是H、烷基，或
R36和R37与它们所连接的原子一起形成任选地取代的5或6元杂环；且
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基。
在一个方面中，本发明的化合物含有五元杂环。在一个实施方案中，五元杂环是乙内酰脲或取代的或未取代的环脲。
在一个实施方案中，所述乙内酰脲是下式的乙内酰脲，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Ar6和Ar7彼此独立地相同或不同，它们是5或6元芳基或5或6元杂芳基；
Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；且
R39和R40彼此独立地相同或不同，它们是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基、卤代烷基，或R39和R40与它们所连接的碳原子一起形成C＝O基团或取代的或未取代的烯基。
在另一个方面中，本发明的化合物含有五元杂环，其为尿唑。在一个实施方案中，所述尿唑是下式的尿唑，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Ar6和Ar7彼此独立地相同或不同，它们是5或6元芳基或5或6元杂芳基；
Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；且
R41是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基。
在另一个方面中，本发明的化合物含有6元杂环。在一个实施方案中，所述6元杂环是下式的6元杂环，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；且
R42、R43、R44、R45和R46彼此独立地相同或不同，它们是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或R42和R43或R45和R46与各自所连接的碳原子 一起形成C＝O基团。
在另一方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
M1是N或CR49，其中R49是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR50，其中R50是H或取代的或未取代的烷基；
R36和R37彼此独立地相同或不同，它们是H、烷基，或
R36和R37与它们所连接的原子一起形成任选地取代的5或6元杂环；且
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；
R47是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；且
R48是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代。
在又一个方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
T1是C＝O，且Q是CR51R52或NR51，其中R51和R52彼此独立地相同或不同，它们是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基、卤代烷基，或R51和R52与它们所连接的碳原子一起形成C＝O基团或取代的或未取代的烯基；
M1是N或CR49，其中R49是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR50，其中R50是H或取代的或未取代的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；
R47是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；且
R48是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代。
在另一个实施方案中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
在另一方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
在又一个方面中，本发明涉及制备下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药的方法：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
T2是C＝S、C＝O或S(O)2；
R53是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的芳基烷基；
M1是N或CR54，其中R54是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR55，其中R55是H或取代的或未取代的烷基；
R56是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；且
R57是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；
其中所述方法包括将式
的化合物与式
的化合物反应，
其中R56、R57和Alk如上文定义，且J是离去基团；
其中M1和M2如上文定义
以获得具有NO2基团的下式的化合物
还原NO2基团以获得具有NH2基团的化合物；且
将具有NH2基团的化合物与下式的化合物反应：
其中J2是离去基团，且T2和R53如上文定义。
在又一个方面中，本发明涉及制备下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药的方法：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R51和R52彼此独立地相同或不同，它们是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基、卤代烷基，或R51和R52与它们所连接的碳原子一起形成取代的或未取代的烯基；
M1是N或CR49，其中R49是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR50，其中R50是H或取代的或未取代的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；
R47是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的 或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；且
R48是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；
其中所述方法包括加热下式的化合物：
其中R47、R48、Alk、M1和M2如上文定义；
以将-CON3基团转化成-N＝C＝O基团，且随后与下式的化合物反应：
其中J3是离去基团，且R38、R51和R52如上文定义。
在又一个方面中，本发明涉及制备下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药的方法：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R52是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取 代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基、卤代烷基；
M1是N或CR49，其中R49是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR50，其中R50是H或取代的或未取代的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；
R47是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；且
R48是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；
其中所述方法包括加热下式的化合物：
其中R47、R48、Alk、M1和M2如上文定义；
以将-CON3基团转化成-N＝C＝O基团，且随后与下式的肼反应：
其中R38如上文定义。
在又一个方面中，本发明涉及制备下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物的方法：
其中：
Ar1、Ar2和Ar3独立地是5或6元芳基、杂芳基或环烷基环，且Ar2和Ar3可任选地被省略；
m是0、1、2或3；
n和p独立地是0、1、2、3或4；
每个R1′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R2′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R3′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
R5-R8独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基，或可选地，R6和R7、R7和R8与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；
b是0、1或2；
其中所述方法包括使式
的化合物与式
的化合物反应，其中J是离去基团；
以获得产物；且
将产物与下式的化合物反应：
其中J是离去基团。
本发明的另一个目的是利用在本文描述的测定中鉴别的化合物作为组合物中的添加剂或味道调节剂，从而抑制或阻断由特异性活化这些味觉受体的化合物引起的苦味。本发明的优选的目的是使用抑制以上鉴别的人T2R受体中的至少一种的活化的化合物，从而阻断咖啡和咖啡味食物、饮料和药物中存在的化合物的苦味。
以上鉴别的人T2R受体中的至少一种的活化，从而阻断存在于咖啡和咖啡味食物、饮料和药物中的化合物的苦味。本发明的另一个目的是在人或动物味觉测试，优选地，人味觉测试中确认，鉴别的化合物调节，优选地抑制或阻断苦味，例如由咖啡和咖啡味食物、饮料和药物引起的苦味。
本发明的另一个目的是利用在本文描述的测定中鉴别的化合物作为组合物中的添加剂或味道调节剂，从而抑制或阻断由特异性活化这些味觉受体的化合物引起的苦味。本发明的优选的目的是使用抑制以上鉴别的人T2R受体中的至少一种的活化的化合物，从而阻断咖啡和咖啡味食物、饮料和药物中存在的化合物的苦味。
在特别优选的实施方案中，化合物C及其类似物用作宽泛作用的苦味阻断剂，从而抑制或阻断特异性活化hT2R3、7、10、14、16、44、51、55、61、63、64、65、71和/或hT2R5、9、13、54、67和75味觉受体的化合物、活化多种苦味受体的配体、具有未知受体特异性的苦味化合物或含有未知或多种苦味化合物的组合物引起的苦味。假定化合物C宽泛的拮抗特性，其应该基本上缓解大多数苦味化合物和含有所述苦味化合物的组合物的苦味。本发明的优选目的是使用抑制以上鉴别的人T2R受体中的至少一种的活化的化合物，诸如化合物C或类似物，从而阻断咖啡和咖啡味食物、饮料和药物中存在的化合物的苦味。
附图详述
图1涉及以下实验，其中来自咖啡的部分纯化的苦味级分用于筛选在瞬时转染的HEK细胞中的25种人T2R，其如申请人先前的专利申请所描述，所述专利通过引用在此并入。如图1所示，在钙成像测定中，咖啡级分活化用hT2R8和hT2R14瞬时转染的HEK293细胞。蓝色染料FD&C用于减少将干扰该测定的咖啡级分的荧光水平。在图1中，苦味咖啡级分活化hT2R8和hT2R14，[咖啡级分]＝1mg/mL，蓝色染料＝1.9mM FD&C 1。
图2是显示hT2R8和hT2R14对获自咖啡的苦味级分的剂量依赖性响应的ΔF/F对log咖啡级分的图。使用hT2R8和hT2R14稳定细胞系和自动荧光检测器FLIPR进行该测定。图2涉及hT2R8和hT2R14对咖啡级分剂 量依赖性响应。
图3是hT2R8活性的百分比抑制对化合物的浓度的log的图，并且显示化合物A和B对稳定hT2R8表达细胞系的剂量依赖性抑制。图3是化合物A和B对稳定hT2R8稳定细胞系的剂量依赖性抑制曲线。
图4是hT2R14活性的百分比抑制对化合物C的浓度的log的图，并且显示化合物C对稳定hT2R8表达细胞系的剂量抑制。图4是化合物C对hT2R14稳定细胞系的剂量依赖性抑制曲线。
图5显示化合物C针对不同(2)人苦味受体的抑制活性。图5显示S5105对22种hT2R的抑制活性。
图6是作为糖精浓度的log函数的受体活性的图。图6显示在表达hT2R43、hT2R44和hT2R8的变体的转染细胞中的剂量响应关系和糖精对受体活性的效应。在体外测定中，hT2R8对糖精的响应低于“品尝者(taster)”hT2R43-W35和hT2R44-W35等位基因，但hT2R8对糖精的响应优于“非品尝者”hT2R43-S35和hT2R44-R35等位基因。
发明详述
根据本发明，本发明的化合物可用于缓解或减轻组合物，例如可摄取组合物的苦味。如本文所用，“可摄取组合物”包括期望用于单独或与另一物质一起口服消耗的任何物质。可摄取组合物包括“食物或饮料产品”和“不可食用产品”两者。“食物或饮料产品”指期望由人或动物消耗的任何可食用产品，包括固体、半固体或液体(例如饮料)。术语“不可食用产品”或“不可吃的组合物”包括补充物、营养制品、功能食品(例如声称具有超越供应营养物质的基础营养功能的健康促进和/或疾病预防性质的任何新鲜的或加工的食物)、药物和非处方药、口腔护理产品(诸如牙膏和漱口剂)、美容产品(诸如唇膏)和其他个人护理产品。
可摄取组合物还包括药物、医药或可吃的组合物，或可选地包含在制品中，例如药物或医药制品，或食物或饮料产品或制品。
还可单独地提供本发明的化合物，或提供该化合物与已知或以后开发的任何可摄取组合物的组合。例如，可摄取组合物可以是可吃的组合物或不可吃的组合物。“可吃的组合物”指可由人或动物作为食物消耗的任何组合物，包括固体、凝胶、糊状物、泡沫状物质、半固体、液体或其混合物。“不可吃的组合物”指期望由人或动物不作为食物消耗或使用的任何
在一个实施方案中，本发明的化合物可被加入到不可吃的组合物或不可食用的产品，诸如补充物、营养制品、功能食品(例如声称具有超越供应营养物质的基础营养功能的健康促进和/或疾病预防性质的任何新鲜的或加工的食物)、药物和非处方药、口腔护理产品(诸如牙膏和漱口剂)、美容产品(诸如唇膏)和其他个人护理产品。
一般来说，非处方(OTC)产品和口腔保健产品一般指没有处方和/或没有问诊医学专业人员便可出售的用于家庭和/或个人使用的产品。OTC产品的实例包括但不限于维生素和膳食补充物；局部镇痛剂和/或麻醉剂；治疗咳嗽、感冒和过敏的药品；抗组胺和/或抗过敏药；及其组合。维生素和膳食补充物包括但不限于维生素、膳食补充物、补品/瓶装营养饮品、儿童型维生素、膳食补充物、营养的或涉及或提供营养的任何其他产品及其组合。局部镇痛剂和/或麻醉剂包括用于缓解表面的或深层的头痛和疼痛，例如肌肉痛的任何局部乳膏/软膏/凝胶；出牙止痛凝胶(teething gel)；具有镇痛成分的贴片；及其组合。治疗咳嗽、感冒和过敏的药品包括但不限于减充血剂、镇咳药、咽部制品、药制糖果、抗组胺和儿童型治疗咳嗽、感冒和过敏的药品；及组合产品。抗组胺和/或抗过敏药包括但不限于用于花粉热、变应性鼻炎、昆虫咬伤和叮伤的任何全身性治疗。口腔保健产品的实例包括但不限于口腔清洁条、牙膏、牙刷、漱口剂/牙齿清洗剂(dental rinses)、假牙护理、口腔清新剂、家用牙齿增白剂和牙线。
在另一个实施方案中，本发明的化合物可加入到食物或饮料的产品或制品。食物和饮料的产品或制品的实例包括但不限于用于可吃产品或包含于以下类别的任何实体的糖衣、糖霜或糖浆：汤类、干加工食品类、饮料类、即食类、灌装或罐头食品类、冷藏加工食品类、冷冻加工食品类、点心类、焙烤食品类、糖果类、乳制品类、冰激凌类、代餐类、意大利面及面条类和酱类、酱汁(Dressings)类、调味品类、婴儿食品类和/或涂抹食 品类。
一般来说，汤类指罐装/罐头的、脱水的、即食的、冷冻的、UHT和冷藏的汤。为了这一定义，汤指由肉、家禽、鱼、植物、谷物、水果和其他成分制备的，烹制成可包括有形的成片的这些成分中的一些或全部的液体的食物。其可以是澄清的(如肉汤)或浓稠的(如杂烩)、调匀的、浓浆(pureed)或稠厚的(chunky)、即食的、半浓缩的或浓缩的，且可以热汤或冷汤食用，其作为头盘、主菜或作为进餐之间的小吃(像饮料一样吸食)。汤可用作准备其他食物组分的成分，且其范围可以是肉汤(清汤)至酱类(基于奶油或奶酪的汤)。
“脱水和烹饪食物类”通常指：(i)烹饪辅助产品，诸如：面粉、米粒、面团、浓缩的液体产品，包括压制的方丁、饼或粉末或颗粒形式的浓缩肉汤、肉汤和类肉汤产品，其作为成品单独地出售或作为产品、酱类和烹饪粉(忽视工艺)中的成分出售；(ii)食物溶液产品，诸如：脱水和冻干的汤，包括脱水汤粉、脱水速溶汤粉、脱水即食汤粉、预先制备的菜、食物和单独服务的主菜(包括意大利面、马铃薯和米饭)的脱水或常温制品(ambientpreparation)；以及(iii)食物装饰产品，诸如：调味品、腌泡汁、色拉味调料、色拉淋酱、蘸湿料(dips)、裹面、裹浆粉、耐储存的涂抹食品、烤肉调味酱、液体烹饪粉、浓缩物、酱类或酱粉，包括色拉烹饪粉，其作为成品出售，或作为产品中的成分出售，不论其为脱水的、液体或冷冻的。
饮料类通常指饮料、饮料粉和浓缩液，包括但不限于碳酸和非碳酸饮料、酒精和非酒精饮料、即饮饮料、用于制作饮料的浓缩液制品(诸如苏打水)和干粉饮料前体粉(precursor mixes)。饮料类还包括酒精饮料、软饮料、运动饮料、等渗饮料和热饮。酒精饮料包括但不限于啤酒、苹果酒/梨酒、FAB、红酒和烈酒。软饮料包括但不限于诸如可乐的碳酸饮料和非可乐碳酸饮料；水果汁，诸如果汁、花蜜、果汁饮料和水果味饮料；瓶装水，其包括苏打水、矿泉水和纯净水/地下水；功能饮料，其可以是碳酸饮料或普通饮料，且包括运动饮料、能量饮料或药酒(elixir drink)；浓缩液，诸如即饮程度的液体和粉末浓缩物。热饮包括但不限于咖啡，诸如现磨咖 啡(例如自酿咖啡)、速溶咖啡、组合咖啡、液体咖啡饮料、即饮咖啡饮料、可溶咖啡饮料和干咖啡饮料、咖啡饮料粉和浓缩物(糖浆形式、纯形式、配制形式或粉末形式；“粉末形式”的实例是包含均为粉末形式的咖啡、增甜剂和增白剂的产品)；茶，诸如红茶、绿茶、白茶、乌龙茶和调味茶；以及其他热饮，包括与乳液或水混合的基于味道、麦芽或植物的粉末、颗粒、块或饼。
点心类一般指可能是不重要的非正式食物的任何食品，包括但不限于甜点和成味点心以及甜饼曲奇类(snack bars)。点心的实例包括但不限于水果点心、薯条/薯片、挤压点心、玉米粉圆饼/玉米条、爆米花、椒盐卷饼、坚果和其他甜点和成味点心。甜饼曲奇类的实例包括但不限于麦片条/牛奶什锦早餐条(muesli bars)、早餐条、能量条、水果条和其他点心条。
焙烤食品类一般指制作过程包括暴露于热或过度阳光的任何可食用的产品。焙烤食品的实例包括但不限于面包、小面包、饼干、松饼、谷物、烤面包机甜点(toasterpastries)、甜点、蛋奶烘饼、玉米粉圆饼、饼干、派类、硬面包圈、果馅饼、乳蛋饼、蛋糕、任何的焙烤食品及其任何组合。
冰激凌类一般指含有奶油和糖和调味剂的冷冻甜点。冰激凌的实例包括但不限于：冲动冰激凌(impulse ice cream)；家庭装冰激凌；冷冻酸奶冰激凌和手工冰激凌；大豆、燕麦、扁豆(例如红豆和绿豆)和基于大米的冰激凌。
糖果类一般指具有甜味的可食的产品。糖果类的实例包括但不限于糖果、明胶、巧克力糖果、糖巧克力、口香糖以及类似产品，及任何组合产品。
代餐类一般指期望代替正常食物的任何食物，特别针对具有健康或舒适问题的人。代餐的实例包括但不限于瘦身产品和康复产品。
即食类一般指可作为餐饭且不用大规模准备或加工的任何食物。即食包括具有由生产商加入到产品的烹饪“技术”，产生高度的迅速、完全和方便的产品。即食的实例包括但不限于灌装/罐头即食、冷藏即食、干即食、冷冻即食；晚餐粉；冷藏披萨；冷冻披萨；和预制色拉。
意大利面及面条类包括任何的意大利面和/或面条，包括但不限于罐装意大利面、干制意大利面和冷冻/新鲜意大利面；以及阳春面、即食面、冷面(chilled noodle)、冷冻面条和点心面。
灌装/罐头食物类包括但不限于灌装/罐头肉和肉制品、鱼/海鲜、蔬菜、马铃薯、扁豆、水果、即食、汤、意大利面和其他灌装/罐头食物。
冷藏加工食物类包括但不限于冷藏加工的红肉、加工的家禽肉、加工的鱼/海鲜、加工的蔬菜、肉代替品、加工的马铃薯、焙烤食品、点心、即食、披萨、汤、面条和其他冷藏食品。
干加工食品类包括但不限于大米、什锦点心、干即食、脱水汤、即食汤、干意大利面、阳春面和即食面。
冷冻加工食品类包括但不限于冷冻加工的肉类、加工的鱼/海鲜产品、午餐包、现切水果、即食、披萨、预制的色拉、汤、新鲜意大利面和面条。
酱类、酱汁类和调味品类包括但不限于番茄酱和菜泥、肉汤/浓缩固体汤料、香草和香料、谷氨酸一钠(MSG)、佐餐酱、酱油、意大利面酱、湿酱/烹饪酱(wet/cookingsauces)、干酱/混合粉、番茄沙司、蛋黄酱、芥末、色拉味调料、法式调味酱、蘸湿料、腌制品和其他酱、酱汁和调味品。
婴儿食品类包括但不限于基于乳液或大豆的配方；和预制婴儿食品、干婴儿食品和其他婴儿食品。
涂抹食品类包括但不限于果酱和蜜饯、蜂蜜、巧克力涂抹食品类、基于坚果的涂抹食品类和基于酵母的涂抹食品类。
乳制品类一般指由哺乳动物的乳液产生的可食的产品。乳制品的实例包括但不限于饮用乳品、奶酪、酸奶和酸奶饮料和其他的乳制品。
可吃组合物，特别是食物和饮料产品或制品的其他实例提供如下。示例可吃的组合物包括一种或多种糖果、巧克力糖果、饼、夹心果仁类、包装selflines/softlines、盒装食品、标准盒装食品、迷你棒棒糖(miniatures)、季节性巧克力、玩具巧克力、焦糖甜饼、其他的巧克力糖果、薄荷、标准薄荷、强力薄荷、硬糖、糖果锭剂、香口胶类、果胶和橡皮糖、太妃糖、焦糖和牛轧糖、药制糖果、棒棒糖、甘草、其他的糖果、香口胶、口香糖、 含糖口香糖、无糖口香糖、功能口香糖、泡泡糖、面包、包装/工业面包、未包装/人工面包、甜点、蛋糕、包装/工业蛋糕、未包装/人工蛋糕、曲奇、涂有巧克力的饼干、夹心饼干、实心饼干、香薄荷饼干和成饼干、面包代替品、早餐谷物食品、即食谷物食品、家庭型早餐谷物食品、玉米片、牛奶什锦早餐、其他谷物食品、儿童型早餐谷物食品、热谷物食品、冰激凌、冲动冰激凌、单份乳制冰激凌、单份水冰激凌、多重包装乳制冰激凌、多重包装水冰激凌、家庭装冰激凌、家庭装乳制冰激凌、冰激凌点心、散装冰激凌、家庭装水冰激凌、冷冻酸奶、人工冰激凌、乳制品、牛奶、新鲜/灭菌牛奶、全脂新鲜/灭菌牛奶、半脱脂新鲜/灭菌牛奶、保存期较长的牛奶/超热处理过的牛奶、全脂保存期较长的牛奶/超热处理过的牛奶、半脱脂保存期较长的牛奶/超热处理过的牛奶、脱脂保存期较长的牛奶/超热处理过的牛奶、羊奶、浓缩/脱水牛奶、原味浓缩/脱水牛奶、香味奶、功能奶和其他炼乳、香味奶饮料、仅含乳制品的香味奶饮料、具有果汁的香味奶饮料、豆奶、酸奶饮料、发酵乳制品饮料、咖啡增白剂(例如用于咖啡饮料的基于乳制品和非乳制品的奶精或增白剂)、奶粉、风味奶粉饮料、奶油、奶酪、加工奶酪、容易被涂开的加工奶酪、不容易被涂开的加工奶酪、未加工奶酪、容易被涂开的未加工奶酪、硬质奶酪、包装的硬质奶酪、未包装的硬质奶酪、酸奶、原味/天然酸奶、风味酸奶、水果味酸奶、益生菌酸奶、饮料型酸乳、常规饮料型酸乳、益生菌饮料型酸乳、冷冻和耐储存点心、基于乳制品的点心、基于大豆的点心、冷冻点心、清爽干酪和夸克(quark)、原味清爽干酪和夸克、风味清爽干酪和夸克、成味清爽干酪和夸克、甜味和成味点心、水果点心、薯条/薯片、挤压点心、玉米粉圆饼/玉米条、爆米花、椒盐卷饼、坚果、其他甜点和成味点心、点心条、麦片条、早餐条、能量条、水果条和其他点心条、代餐产品、瘦身产品、康复饮品、即食、灌装即食、冷藏即食、干即食、冷冻即食、晚餐粉、冷藏披萨、冷冻披萨、汤、灌装汤、脱水汤、即食汤、冷冻汤、热汤、冷藏汤、意大利面、罐装意大利面、干制意大利面、冷冻/新鲜意大利面、面条、阳春面、即食面、杯/碗即食面、袋装即食面、冷面、点心面、灌装食物、灌装肉和肉制品、灌装鱼/海鲜、灌装蔬菜、灌装马铃薯、灌装扁豆、灌装水果、灌装即食、灌装汤、灌装意大利面、其他灌装食物、冷藏食物、冷藏 加工的红肉、冷藏加工的家禽肉、冷藏加工的鱼/海鲜、冷藏加工的蔬菜、冷藏肉代替品、冷藏的马铃薯、烘箱烤马铃薯条、其他烘箱烤马铃薯产品、非烘箱冷藏马铃薯、冷藏焙烤食品、冷藏点心、冷藏即食、冷藏披萨、冷藏汤、冷藏面条、其他冷藏食品、干制食品、什锦点心、干即食、脱水汤、即食汤、干制意大利面、阳春面、即食面、杯/碗即食面、袋装即食面、冷冻面条、冷冻加工的肉类、冷冻的鱼/海鲜产品、冷冻加工的鱼、冷冻包裹的鱼(chilled coated fish)、冷冻熏鱼、冷冻午餐包、冷冻即食、冷冻披萨、冷冻汤、冷冻/新鲜意大利面、冷冻面条、油类和脂肪类、橄榄油、植物油和种子油、烹饪油、黄油、人造黄油、容易被涂开的油类和脂肪类、功能性容易被涂开的油类和脂肪类、酱类、酱汁类和调味品类、番茄酱、菜泥、肉汤/浓缩固体汤料、浓缩固体汤料、肉汁颗粒、液体原料和食物(fonds)、香草和香料、发酵酱油、酱油、意大利面酱、湿酱、干酱/混合粉、番茄沙司、蛋黄酱、标准蛋黄酱、芥末、色拉味调料、标准色拉味调料、低脂色拉味调料、法式调味酱、蘸湿料、腌制品、其他酱、酱汁和调味品、婴儿食品、配方奶粉、标准配方奶粉、第二代配方奶粉、幼儿配方奶粉、低变应原性配方奶粉、预制婴儿食品、干婴儿食品、其他婴儿食品、涂抹食品类、果酱和蜜饯、蜂蜜、巧克力涂抹食品类、基于坚果的涂抹食品类和基于酵母的涂抹食品类。示例性的可吃组合物还包括糖果类、焙烤产品类、冰激凌类、乳制品类、甜点和成味点心类、甜饼曲奇类、代餐产品类、即食类、汤类、意大利面类、面条类、灌装食品类、冷藏食品类、干食品类、冷冻食品类、油类和脂肪类、婴儿食品类或涂抹食品类或其混合物。示例的可吃组合物还包括早餐谷物类、甜饮料或用于制作饮料的固体或液体浓缩组合物。示例性的可吃组合物还包括咖啡味食物(例如咖啡味冰激凌)。
通常，将足以缓解或减轻与组合物(例如可摄取组合物)相关的苦味的量的本发明的化合物加入到组合物以按照人类或动物判断，与没有用本发明的化合物制作的组合物对比，缓解或减轻与该组合物相关的苦味。或在制品测试的情况中，经本领域通常知晓的程序，按照一组例如8个人的味觉测试者的大多数的判断。
有效缓解或减轻与组合物相关的苦味的本发明的化合物的浓度当然 将依赖于许多变量，包括可吃组合物及其多种其他成分的具体类型、品尝组合物的不同人的自然遗传可变性和个人偏好和健康状况，以及特定化合物对这种化学感应化合物的味觉的主观影响(subjective effect)。在一些实施方案中，有效缓解或减轻与组合物相关的苦味的本发明的化合物的浓度从约0.001ppm至约100ppm，例如从约0.1ppm至约100ppm、从约1ppm至约25ppm、从约1ppm至约10ppm、从约0.1ppm至约10ppm、从约0.01ppm至约30ppm、从约0.05ppm至约10ppm、从约0.01ppm至约5ppm、从约0.02ppm至约2ppm或从约0.01ppm至约1ppm。
还包括，在本发明的一些实施方案中，一种或多种本发明的化合物的混合物将用于缓解或减轻与组合物相关的苦味。一种或多种化合物的浓度可以是相同的，或各个化合物的浓度可以是不同的。
进一步描述本发明前，提供以下定义。
术语“T2R”家族包括多态变体、等位基因、突变体和同系物，其：(1)与下文和Zuker(Id)(2001)和Adler(Id.)(2001)申请(在此通过引用并入)中公开的T2R在约25个氨基酸最优地50-100个氨基酸的窗口上具有约30-40％的氨基酸序列同一性，更加具体地约40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的氨基酸序列同一性；(2)特异性结合于产生的针对免疫原的抗体，所述免疫原含有选自由下文公开的T2R序列和其保守修饰变体组成的组的氨基酸序列；(3)在严格杂交条件下特异性杂交(具有至少约100个，任选地至少约500-1000个核苷酸的大小)于选自由下文公开的T2R DNA序列和其保守修饰变体组成的组的序列；(4)含有与选自由下文公开的T2R氨基酸序列组成的组的氨基酸序列至少约40％同一的序列或(5)通过在严格杂交条件下特异性杂交于描述的T2R序列的引物扩增。
特别地，这些“T2R”包括具有本申请提供的核酸序列和氨基酸序列的在本文中被称为hT2R8和hT2R14的味觉受体GPCR和其特异性结合于本文鉴别的苦味配体和其他结构相关的化合物和苦味化合物的变体、等位基因、突变体、直向同源物和嵌合体。
尽管T2R基因显示出蛋白质和DNA两种水平上相当的序列分歧，但是发现至今分离的所有T2R在特定的区域中含有某些共有序列，所述共有 序列是同一的或与在Adler等人(WO 01/77676A1(2001)和Zuker等人WO 01/18050A2(两者通过引用整体并入本文)中早先鉴别的T2R共有序列具有至少70-75％的序列同一性。
从拓扑学上说，某些化学感受GPCR具有“N末端结构域”、“胞外结构域”、含有七个跨膜区的“跨膜结构域”和相应的胞质和胞外环、“胞质区”和“C末端区”(参见例如Hoon等人，Cell，96：541-51(1999)；Buck&Axel，Cell，65：175-87(1991))。使用本领域技术人员所知的方法可在结构上鉴别这些区域，所述方法如鉴别疏水和亲水结构域的序列分析程序(参见例如Stryer，Biochemistry(生物化学)(第三版1988)；还参见许多基于互联网的序列分析程序中的任何一个，例如发现于dot.imgen.bcm.tmc.edu的序列分析程序)。这些区域可用于制备嵌合蛋白并可用于本发明的体外测定，例如配体结合测定。例如，嵌合T2R可通过组合一个T2R的胞外区和相同或不同种类的另一个T2R的跨膜区来制备。
因此，“胞外结构域”指从细胞膜突出并且暴露于细胞的胞外面的T2R多肽结构域。此类区域将包括暴露于细胞的胞外面的“N末端结构域”，以及暴露于细胞的胞外面的跨膜结构域的胞外环，即跨膜区2和3之间、跨膜区4和5之间和跨膜区6和7之间的胞外环。“N末端结构域”起始于N末端并延伸至接近跨膜区起始点的区域。这些胞外区用于可溶相和固相的体外配体结合测定。此外，以下描述的跨膜区还可以与胞外区组合地或单独地参与配体结合，并因此也用于体外配体结合测定。
本文的“T2R表达细胞”包含表达依据本发明的人T2R序列的重组细胞和内源T2R表达细胞。此类细胞存在于舌和胃肠系统，并且包括口腔中的细胞(例如舌上表达的味蕾)以及胃肠系统和相关器官中的细胞，例如胃肠道中的刷细胞、肠内分泌细胞(例如STC-1细胞)。这些细胞还可表达G蛋白，例如味转导素、转导蛋白、Gα15或Gα16。表达特定的T2R的细胞可通过已知方法鉴别并分离，例如通过FACS细胞分离和/或磁珠细胞分离规程。
包括七个跨膜“区”的“跨膜结构域”指存在于质膜内的T2R多肽的结构域，并且还可包括相应的胞质(细胞内)和胞外环，也称为跨膜“区”。 使用标准方法可鉴别所述七个跨膜区以及细胞外和胞质环，参见Kyte&Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-32(1982))，或Stryer，见上。
“胞质结构域”指面对细胞内部的T2R蛋白质的结构域，例如“C末端结构域”和跨膜结构域的胞内环，例如跨膜区1和2之间、跨膜区3和4之间和跨膜区5和6之间的胞内环。“C末端结构域”指从最后的跨膜区的末端跨越至蛋白质的C末端的区域，并且其正常位于胞质内。
术语“7跨膜受体”指属于具有跨越所述质膜七次的七个区域(因此，所述七个区域称为“跨膜”或“TM”结构域TM I至TM VII)的跨膜蛋白质超家族的多肽。嗅觉和某些味觉受体的家族各自属于这一超家族。如以下进一步详述，7跨膜受体多肽具有相似的和特征性的一级、二级和三级结构。
术语“配体结合区”指源自基本并入跨膜结构域II至VII(TM II至VII)的化学感受或味觉受体的序列。所述区域能够结合配体，并且更加特别地结合引起味觉的化合物。
术语“质膜易位结构域(plasma membrane translocation domain)”或简单地“易位结构域”指在并入多肽编码序列的氨基末端时，能够十分有效地将杂合体(“融合”)蛋白“伴随(chaperone)”或“易位”至细胞质膜的多肽结构域。例如，可以使用最初源自人视紫红质受体多肽(一种7跨膜受体)的氨基末端的特定“易位结构域”。另一种易位结构域源自牛视紫红质序列并且也用于促进易位。源自视紫红质的序列在7跨膜融合蛋白向质膜的易位中特别有效。
“功能等效性(Functional equivalency)”指在相似条件下，结构域将新翻译的蛋白质易位至质膜的能力和效力与示例的易位结构域(例如源自视紫红质的易位结构域)一样有效；如本文所述，可测量(以量化形式)和比较相对效力。属于本发明范围的结构域可通过以下的常规筛选确定：它们将新合成的多肽易位至细胞(哺乳动物、爪蟾以及类似动物)质膜的效力与二十个氨基酸长的易位结构域SEQ ID NO：1相同。
在用于检测调节T2R家族成员介导的味觉转导的化合物的测定的环 境中，短语“功能效应”，包括确定间接或直接受受体影响的任何参数，例如功能、物理和化学效应。其包括体外、体内和离体(ex vivo)的配体结合、离子流的变化、膜电位、电流量、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号转导、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如cAMP、cGMP、IP3或胞内Ca2+)，还包括其他生理学效应，例如神经递质或激素释放的增加或减少。
“确定功能效应”指针对增加或减少间接或直接受T2R家族成员影响的参数，例如功能、物理和化学效应的化合物的测定。此类功能效应可通过本领域技术人员所知的任何方法测量，例如光谱特征(例如荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱或溶解特性的变化、膜片钳术、电压敏感染料、全细胞电流、放射性同位素流出、诱导型标志物、卵母细胞T2R基因表达；组织培养细胞T2R的表达；T2R基因的转录激活；配体结合测定；电压、膜电位和电导的变化；离子流测定；细胞内第二信使例如cAMP、cGMP和肌醇三磷酸(IP3)的变化；细胞内钙水平的变化；神经递质释放以及类似变化。
可互换使用T2R蛋白质受体的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”以指使用体外和体内味觉转导测定鉴别的抑制、活化或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗物和它们的同系物和模拟物。抑制剂是例如结合以部分或完全阻断刺激，降低、防止、延迟活化，灭活、脱敏或下调味觉转导的化合物，例如拮抗物。活化剂是例如结合以刺激、增加、打开、活化、促进、增强活化作用、敏化或上调味觉转导的化合物，例如激动剂。调节剂包括例如改变受体与以下物质的相互作用的化合物：结合活化剂或抑制剂的细胞外蛋白质(例如ebnerin和疏水载体家族的其他成员)；G蛋白；激酶(例如参与受体的钝化和脱敏的视紫红质激酶和β肾上腺素能受体激酶的同系物)；以及也钝化和脱敏受体的抑制蛋白。调节剂包括例如具有改变的活性的T2R家族成员的遗传修饰形式以及天然存在的和合成的配体、拮抗物、激动剂、小化学分子以及类似分子。
抑制剂和活化剂的此类测定包括，例如在细胞或细胞膜中表达T2R家族成员，在存在或不存在调节例如苦味化合物的化合物下应用假定的调节 剂化合物，然后确定对味觉转导的功能效应，如上文所述。含有用潜在的活化剂、抑制剂或调节剂处理的T2R家族成员的样品或测定与没有所述抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品比较，从而检测调节的程度。对照样品(未用调节剂处理)的相对T2R活性值被指定为100％。当相对于对照的T2R活性值为约80％，任选地50％或25-0％时，实现对T2R的抑制。当相对于对照的T2R活性值为110％、任选地150％、任选地200-500％或1000-3000％更高时，实现T2R的活化。
如本文所用，术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”指没有其他的不同化合物的状态，所述不同化合物在自然状态下通常与本发明的化合物联合(associate)。优选地，“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”指组合物含有按重量计至少0.5％、1％、5％、10％或20％，以及最优选地至少50％或75％的给定样品的主要成分(mass)。在一个优选的实施方案中，这些术语指本发明的化合物含有按重量计至少95％的给定样品的主要成分。如本文所用，当指核酸或蛋白质时，术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”的核酸或蛋白质还指不同于天然存在于哺乳动物(特别是人)体内的纯化或浓缩的状态。超过天然存在于哺乳动物(特别是人)体内的任何程度的纯化或浓缩，包括(1)从其他联合的结构或化合物纯化或(2)与在哺乳动物(特别是人)体内通常不联合的结构或化合物联合，均属于“分离的”的含义。根据本领域技术人员所知的多种方法和过程，本文描述的核酸或蛋白质或者所述类别的核酸或蛋白质可以是分离的，或另外与它们在天然状态下通常不联合的结构或化合物联合。
如本文所用，当指核酸或多肽时，术语“分离的”指不同于天然存在于哺乳动物(特别是人)体内的纯化或浓缩的状态。超过天然存在于体内的任何程度的纯化或浓缩，包括(1)从其他天然存在的联合的结构或化合物纯化或(2)与在体内通常不联合的结构或化合物联合，均属于本文所用的“分离的”的含义。根据本领域技术人员所知的多种方法和过程，本文描述的核酸或多肽可以是分离的，或另外与它们在天然状态下通常不联合的结构或化合物联合。
如本文所用，术语“扩增(amplifying)”和“扩增(amplification)”指使 用任何合适的扩增方法，产生或检测重组或天然表达的核酸，其在下文中详细描述。例如，本发明提供了体内或体外扩增(例如通过聚合酶链式反应，PCR)本发明的天然表达(例如基因组或mRNA)的或重组(例如cDNA)的核酸(，例如本发明的味觉引起化合物的结合序列)的方法和试剂(例如特异性寡核苷酸引物对)。
术语“表达载体”指用于在任何细胞中、体外或体内组成型地或诱导型地表达本发明的核酸序列目的的任何重组表达系统，所述任何细胞包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)。所述术语包括线状或环状表达系统。所述术语包括保持游离或整合于宿主细胞基因组的表达系统。所述表达系统可具有自我复制的能力或者没有该能力，即在细胞中仅驱动瞬时表达。所述术语包括仅含有重组核酸转录所需的最少元件的重组表达“盒”。
术语“文库”指为不同核酸或多肽分子的混合物的制品，例如通过用简并引物对扩增核酸产生的重组产生的感觉(特别是味觉)受体配体结合区的文库，或包括扩增的配体结合区的载体的分离的集合(collection)，或各自用编码味觉受体的至少一种载体随机转染的细胞的混合物。
术语“核酸”或“核酸序列”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。所述术语还包括具有合成主链的核酸样结构。
除非另外指出，特定核酸序列还暗示包括其保守修饰变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确表示的序列。具体地，简并密码子置换可通过产生例如其中一个或多个选择的密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.，19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，260：2605-08(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，8：91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。
本文中可互换使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”以指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物 和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，“烷基”以及具有前缀“alk”的其他基团，诸如例如烷氧基、烷酰基、烯基、炔基以及类似的基团，指可以是直链或支链或其组合的碳链。烷基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、已基、庚基以及类似烷基。优选的烷基基团具有1-4个碳。“烯基”及其他类似术语包括含有至少一个不饱和碳-碳键的碳链。“炔基”及其他类似术语包括含有至少一个碳-碳三键的碳链。
术语“环烷基”指不含杂原子的碳环，且包括单环、双环和三环饱和碳环，以及稠环系统。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、十氢化萘、金刚烷、茚满基、茚基、芴基、1，2，3，4-四氢化萘以及类似基团。
术语“芳基”指为单环或稠合到一起的多环的芳族取代基。示例性的芳基基团包括但不限于，苯基、萘基、蒽基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、苯硫基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、三唑基和四唑基基团。含有一个或多个杂原子的芳基基团(例如吡啶基)通常称为“杂芳基基团”。当形成多环时，组成环中的至少一个是芳族的。在一些实施方案中，多环中的至少一个包括杂原子，由此形成含有杂原子的芳基基团。含有杂原子的芳基基团包括但不限于苯并噁唑基、苯并咪唑基、喹喔啉基、苯并呋喃基和1H-苯并[d][1，2，3]三唑基基团。含有杂原子的芳基基团还包括但不限于2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英基和苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯基基团。含有杂原子的芳基基团还包括稠合于包含至少一个杂原子和至少一个羰基的杂环的芳族环。这种基团包括但不限于二氧代四氢喹喔啉基和二氧代四氢喹唑啉基基团。
术语“芳基烷氧基”指键合于烷氧基的芳基。
术语“芳基酰氨基烷基”指芳基-C(O)NR-烷基或芳基-NRC(O)-烷基。
术语“芳基烷基酰氨基烷基”指芳基-烷基-C(O)NR-烷基或芳基-烷基-NRC(O)-烷基，其中R是以下列出的任何合适的基团。
术语“芳基烷基”指键合于烷基的芳基。
术语“卤素”或“卤代”指氯、溴、氟和碘。
术语“离去基团”指在取代反应，诸如亲核取代反应中可由另一官能团或原子取代的官能团或原子。例如，代表性的离去基团包括氯代、溴代和碘代基团；磺酸酯基团，诸如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、对溴苯磺酸酯、硝基苯磺酸酯以及类似的基团；和酰氧基基团，诸如乙酰氧基、三氟乙酰氧基以及类似基团。
术语“卤代烷基”指具有一个或多个卤原子的烷基(例如CF3)。
术语“杂烷基”指包含杂原子，诸如N、O、P、B、S或Si的烷基部分。杂原子可通过饱和或不饱和键连接于杂烷基部分的其他部分。因此用诸如杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、硼烷基、膦基、氨基、甲硅烷基、硫代或硒代的基团取代的烷基属于术语杂烷基的范围。杂烷基的实例包括但不限于氰基、苯甲酰基、2-吡啶基和2-呋喃基。
术语“杂芳基烷基”指烷基连接的杂芳基。
术语“杂环”指包含碳和氢原子，任选地具有1或2个重键的单环或多环，且所述环原子含有独立地选自氮、氧和硫的至少一个杂原子，特别是1至4个杂原子。杂环结构包括但不限于单环、双环和三环化合物。特定的杂环是单环或双环。代表性的杂环包括环脲、吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙基(oxiranyl)、氧杂环丁基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基、四氢硫代吡喃基、四唑基和尿唑基。杂环可以是未取代的或取代的。优选的杂环是5元和6元杂环，特别是乙内酰脲基和尿唑基。
术语“杂环烷基”指其中环中的碳原子中的至少一个由杂原子(例如O、S或N)代替的环烷基。
术语“杂环烷基烷基”指烷基连接的杂环烷基。
术语“取代的”特别期望并允许本领域中常见的一个或多个取代。然而，本领域技术人员应一般理解，应选择没有不利地影响化合物的有用特 征或不利地干扰其功能的取代基。合适的取代基可包括例如，卤代基团、全氟代烷基基团、全氟代烷氧基基团、烷基基团、烯基基团、炔基基团、羟基基团、氧代基团、巯基基团、烷基硫基团、烷氧基基团、芳基或杂芳基基团、芳氧基或杂芳氧基基团、芳烷基或杂芳烷基基团、芳烷氧基或杂芳烷氧基基团、氨基基团、烷基氨基基团和二烷基氨基基团、氨基甲酰基基团、烷基羰基基团、羧基基团、烷氧基羰基基团、烷基氨基羰基基团、二烷基氨基羰基基团、芳基羰基基团、芳氧基羰基基团、烷基磺酰基基团、芳基磺酰基基团、环烷基基团、氰基基团、C1-C6烷基硫基团、芳基硫基团、硝基基团、酮基基团、酰基基团、硼酸酯或硼酸基(boronyl)基团、磷酸酯或膦酰基基团、氨磺酰基基团、磺酰基基团、亚硫酰基基团，及其组合。在取代的组合的情况下，诸如“取代的芳基烷基”，不论是芳基或烷基可被取代，或芳基和烷基基团两者可用一个或多个取代基取代。此外，在一些情况下，合适的取代基可结合以形成如本领域技术人员所知的一个或多个环。
本文描述的化合物含有一个或多个双键，且因此可产生顺式/反式异构体以及其他构象异构体。本发明包括所有这种可能的异构体以及这种异构体的混合物。
本文描述的化合物，且特别是以上描述的取代基，可含有一个或多个不对称中心，且因此可产生非对映异构体和光学异构体。本发明包括所有此类可能的非对映异构体以及它们的外消旋混合物、它们的基本纯的拆分对映体、所有可能的几何异构体和其可接受的盐。此外，还包括立体异构体的混合物以及分离的具体立体异构体。在用于制备这种化合物的合成程序期间，或在使用本领域技术人员所知的外消旋化或差向异构化程序中，这种程序的产物可以是立体异构体的混合物。
如本文所用，术语“盐”和“药学上可接受的盐”指本公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸或碱的盐被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性基团(诸如胺类)的无机或有机酸盐；和酸性基团(诸如羧酸)的碱盐或有机盐。药学上可接受的盐包括常规无毒的盐或例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的季铵盐。例如，这种常 规的无毒的盐包括衍生自无机酸的盐，无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；和由有机酸制备的盐，有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸和羟乙磺酸以及类似的酸。
本发明的药学上可接受的盐可由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规的化学方法合成。一般来说，可通过将这些化合物的游离酸或碱的形式与化学计算量的合适的碱或酸在水或有机溶剂或在两者的混合物中反应制备这种盐；一般优选无水介质，像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表参见Remington′s PharmaceuticalScience(雷明顿药学)，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页，其公开内容通过引用在此并入。
术语“溶剂化物”指进一步包括通过非共价分子间力结合的化学计算量或非化学计算量的溶剂的化合物或其盐。如果溶剂是水，则溶剂化物是水合物。
术语“前药”指可在生物条件(体外或体内)下水解、氧化或以其他方式反应以提供活性化合物，特别是本发明的化合物的化合物的衍生物。前药的实例包括但不限于本发明的化合物的衍生物和代谢物，其包括可生物水解的部分，诸如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物。具有羧基官能团的化合物的具体前药是羧酸的低级烷基酯。通过酯化存在于分子上的羧酸部分中的任何一个方便地形成羧酸酯。前药通常可使用公知的方法制备，所述方法诸如Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery(Burger药物化学和药物开发)第6版(Donald J.Abraham编，2001，Wiley)和Design and Application ofProdrugs(前药的设计和应用)(H.Bundgaard编，1985，Harwood Academic PublishersGmfh)描述的那些方法。
如本文所用，且除非另外说明，否则术语“可生物水解的酰胺”、“可 生物水解的酯”、“可生物水解的氨基甲酸酯”、“可生物水解的碳酸酯”、“可生物水解的脲基”、“可生物水解的磷酸酯”分别指化合物的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、脲基和磷酸酯，它们：1)不干扰化合物的生物活性，但可赋予化合物体内的有利性质，诸如吸收、作用时间或作用的起效；或2)是生物学上无活性的，但体内转化成生物活性化合物。可生物水解的酯的实例包括但不限于低级烷基酯、烷氧基酰氧基酯、烷基酰基氨基烷基酯和胆碱酯。可生物水解的酰胺的实例包括但不限于低级烷基酰胺、α-氨基酸酰胺、烷氧基酰基酰胺和烷基氨基烷基羰基酰胺。可生物水解的氨基甲酸酯的实例包括但不限于低级烷基胺、取代的乙二胺、氨基酸、羟基烷基胺、杂环胺和杂芳族胺和聚醚胺。
如本文所用，在本文公开的化合物的上下文中的术语“其类似物”包括化合物的非对映体、水合物、溶剂化物、盐、前药和N-氧化物。
本文描述的“易位结构域”、“配体结合区”和嵌合受体组合物还包括具有与示例序列基本相当的结构和活性的“类似物”或“保守变体”和“模拟物，，(“肽模拟物”)。因此，术语“保守变体”或“类似物”或“模拟物”指具有修饰的氨基酸序列的多肽，且所述变化没有显著改变多肽的(保守变体的)结构和/或活性，其如本文定义。这些包括氨基酸序列的保守修饰变化，即对蛋白质活性不重要的那些残基的氨基酸置换、添加或缺失，或者用具有相似性质(例如酸性、碱性、带正或负电荷、极性或非极性等)的残基置换氨基酸，以致即使置换重要的氨基酸也不大幅改变结构和/或活性。
更加特别地，“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰变体指编码同一的或基本同一的氨基酸序列的那些核酸，或如果核酸不编码氨基酸序列，指基本同一的序列。由于遗传密码的简并性，因此大量功能同一的核酸编码任何给定的蛋白质。
例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在被密码子确定为丙氨酸的每个位置，所述密码子可改变为描述的任何相应的密码子而不改变编码的多肽。
此类核酸变化是“沉默变化”，其是保守修饰变化的一种。本文中编 码多肽的每个核酸序列还描述了所述核酸的每种可能的沉默变化。技术人员应理解，可以修饰核酸中的每种密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能同一的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变化暗含于每种描述的序列中。
提供功能相似的氨基酸的保守置换表为本领域所熟知。例如，选择保守置换物的一个示例性指导原则包括(原始残基在前，示例性置换在后)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gin/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gin或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。一个可选的示例性指导原则使用以下六组，每组含有彼此为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(I)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(还参见例如Creighton，Proteins(蛋白质)，W.H.Freeman and Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure(蛋白质结构原理)，Springer-Verlag(1979))。本领域技术人员应理解，以上提到的置换不是唯一可能的保守置换。例如出于一些目的，技术人员可以把所有的带电氨基酸看作彼此的保守置换，不论它们是正电还是负电。此外，在编码序列中改变、添加或删除单一氨基酸或小百分比的氨基酸的个别置换、缺失或添加也可被认为是“保守修饰变化”。
术语“模拟物”和“肽模拟物”指具有与多肽基本相同的结构和/或功能特征的合成化合物，例如本发明的易位结构域、配体结合区或嵌合受体。所述模拟物可以是完全地由氨基酸的合成的非天然类似物组成，或可以是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。所述模拟物还可以包括任何量的天然氨基酸保守置换，只要所述置换也没有显著改变所述模拟物的结构和/或活性。
对于是保守变体的本发明的多肽，常规实验将确定模拟物是否属于本发明的范围，即其结构和/或功能没有显著改变。多肽模拟物组合物可包含 非天然结构组成的任何组合，其通常来自三种结构组：a)除了天然酰胺键(″肽键″)连接以外的残基连接组；b)非天然残基取代天然存在的氨基酸残基；或c)诱导二级结构模拟的残基，即诱导或稳定二级结构，例如β转角、γ转角、β片层、α螺旋构象以及类似结构。当多肽的所有或一些残基通过化学方式而不是天然肽键连接时，所述多肽即可被鉴定为模拟物。个别肽模拟物残基可通过肽键、其他化学键或偶联方式连接，例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)。可代替常规酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，例如酮亚甲基(例如--C(.＝O)--CH2替代--C(.＝O)--NH--)、氨基亚甲基(CH2NH)、亚乙基、烯烃(olefin)(CH.dbd.CH)、醚(CH2O)、硫醚(CH2--S)、四唑(CN4)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(参见例如Spatola，Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins(氨基酸、肽和蛋白质的化学与生物化学)，第7卷，267-357，Marcell Dekker，Peptide Backbone Modifications(肽主链修饰)，NY(1983))。含有所有或一些非天然残基置换天然存在的氨基酸残基的多肽也可被鉴定为模拟物；非天然残基在科学和专利文献中已有详尽的描述。
“标记”，或“可检测部分”是通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法可检测的组分。例如，有用的标记包括32p、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如像ELlSA中通常使用的)、生物素、地高辛配基或半抗原以及可通过例如向所述肽掺入放射性标记变得可检测的或可用于检测与所述肽特异性反应的抗体的蛋白质。
“标记的核酸探针或寡核苷酸”是通过连接体或化学键共价地或通过离子键、范德华键、静电键或氢键非共价地结合于标记，从而可通过检测结合于所述探针的标记的存在来检测所述探针的存在的核酸探针或寡核苷酸。
如本文所用，将“核酸探针或寡核苷酸”定义为能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成结合至互补序列的靶核酸的核酸。
如本文所用，探针可包括天然(即A、G、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮 鸟苷、肌苷等)。此外，探针的碱基可通过除磷酸二酯键以外的键来连接，只要其不干扰杂交。因此，例如探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键来连接。本领域技术人员应理解，依据杂交条件的严格性，探针可结合与所述探针序列缺乏完全互补性的靶序列。所述探针任选地用如同位素、发色团、发光团、色原直接标记，或诸如用生物素(链霉亲和素复合体稍后可与其结合)间接标记。通过测定是否存在所述探针，技术人员可检测是否存在所述选择的序列或子序列。
当用于指核酸的部分时，术语“异源的”表示所述核酸含有两个或多个子序列，所述子序列在天然状态下未发现彼此位于相同的关系。例如，所述核酸通常是重组制备的，使来自不相关的基因的两个或多个序列排列起来以产生具有新功能的核酸，例如启动子来自一个来源并且编码区来自另一个来源。相似地，异源蛋白质表示所述蛋白质含有两个或多个子序列，所述子序列在天然状态下未发现彼此位于相同的关系(例如融合蛋白)。
“启动子”定义为指导核酸转录的一系列核酸序列。如本文所用，启动子包括接近转录起始位点的必要核酸序列，例如就聚合酶II型启动子来说的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件，其可位于距转录起始位点的多达数千碱基对的远处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育的条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育的调节下具有活性的启动子。术语“可操作地连接”指核酸表达控制序列(例如启动子或转录因子结合位点阵列)和第二核酸序列之间的功能连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸的转录。
如本文所用，“重组”指合成的或另外地在体外操作的多核苷酸(例如“重组多核苷酸”)，指使用重组多核苷酸在细胞或其他生物系统中产生基因产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。“重组方法，，还包括将具有来自不同来源的多种编码区或结构域或启动子序列的核酸连接到表达盒或载体，所述表达盒或载体用于表达，例如诱导型或组成型表达含有本发明的易位结构域和使用本发明的引物扩增的核酸序列的融合蛋白。
短语“选择性(或特异性)杂交于”指当特定核苷酸序列存在于复杂混 合物(例如总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与所述核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。
短语“严格杂交条件”指探针与通常在核酸的复杂混合物中的其靶子序列杂交而不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境中将是不同的。较长的序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的一个广泛指导参见Tiissen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes(生物化学和分子生物学技术-使用核探针的杂交)，″Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays″(“杂交原理和核酸测定策略综述”)(1993)。通常，严格条件选择为比所述特异性序列在指定的离子强度pH下的热解链温度(Tm)低约5-10℃。所述Tm是在该温度下平衡时50％的与所述靶互补的探针杂交于所述靶序列的温度(在确定的离子强度、pH和核浓度)(由于靶序列过量存在，在Tm下平衡时50％的探针被占据)。严格条件将是以下的条件：盐浓度低于约10M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH7.0至8.3，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，并且对于长探针(例如超过50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号为至少两倍的背景，任选地10倍的背景杂交。示例性的严格杂交条件可如下：50％甲酰胺，5xSSC和1％SDS，42℃下孵育或5xSSC，1％SDS，65℃下孵育，用0.2xSSC和0.1％SDS在65℃洗涤。此类杂交和洗涤步骤可执行例如，1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。
在严格条件下彼此不杂交的核酸，如果它们编码的多肽是大体相关的，则它们仍是大体相关的。这发生于例如当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性制备核酸副本时。在此类情况下，所述核酸通常在中度严格杂交条件下杂交。示例的“中度严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS的缓冲液中在37℃下杂交，并且用1xSSC在45℃下洗涤。此类杂交和洗涤步骤可执行例如，1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。正杂交为至少两倍的背景。普通技术人员将容易地理解，可选的杂交和洗涤条件可用于提供相似严格性的条件。
“抗体”指含有来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，其特异性结合并识别抗原。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及大量的免疫球蛋白可变区基因。将轻链分类为κ或λ。将重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其又分别定义免疫球蛋白的类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例的免疫球蛋白(抗体)结构单位包括四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有一个“轻”(约25kDa)链和一个“重”(约50-70kDa)链。每条链的N末端确定一个主要负责抗原识别的约100至110或更多的氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、取代或交换，从而将抗原结合位点(可变区)连接至不同或改变的类型、效应功能和/或种类的恒定区或赋予嵌合抗体新的性质的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、取代或交换。
“抗T2R”抗体是特异性结合由T2R基因、其cDNA或子序列编码的多肽的抗体或抗体片段。
术语“免疫测定”是使用抗体以特异性结合抗原的测定。免疫测定的特征在于使用特定抗体的特异性结合性质分离、靶向和/或定量所述抗原。
当指蛋白质或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”于抗体或“与...特异性(或选择性)免疫反应”指确定所述蛋白质在蛋白质和其他生物产品的异源群体中的存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，所述指定的抗体与特定蛋白质的结合为背景的至少两倍，并且基本不以显著的量结合于所述样品中存在的其他蛋白质。在此类条件下对抗体的特异性结合可需要根据对特定蛋白质的特异性而选择的抗体。
例如，可选择针对来自特定的物种(例如大鼠、小鼠或人)的T2R家族成员产生的多克隆抗体以获得仅与所述T2R多肽或其免疫原性部分特异性免疫反应而不与其他蛋白质(所述T2R多肽的直向同源物或多态变体和 等位基因除外)免疫反应的那些多克隆抗体。此选择可通过除去与来自其他物种的T2R分子或其他T2R分子交叉反应的抗体实现。还可选择只识别T2R GPCR家族成员但不识别来自其他家族的GPCR的抗体。可使用多种免疫测定形式选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(有关可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的说明，参见例如Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，(抗体实验手册)(1988))。典型地，特异性或选择性反应将为至少两倍的背景信号或噪声，并且更加典型地超过10至100倍背景。
短语“与...选择性缔合”指核酸与另一个核酸“选择性杂交”(如上文所定义)的能力，或抗体与蛋白质“选择性(或特异性)结合”(如上文所定义)的能力。
术语“表达载体”指用于在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中、体外或体内、组成型地或诱导型地表达本发明的核酸序列目的的任何重组表达系统。所述术语包括线状或环状表达系统。所述术语包括保持游离或整合于宿主细胞基因组的表达系统。所述表达系统可具有自我复制的能力或者没有该能力，即在细胞中仅驱动瞬时的表达。所述术语包括仅含有重组核酸转录所需的最少元件的重组表达盒。
“宿主细胞”，指含有表达载体并且支持所述表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母，昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，例如CHO、HeLa、HEK-293以及类似细胞，例如培养细胞、外植体和体内细胞。
基于上文，本发明提供鉴别化合物的测定，所述化合物调节(优选地阻断)先前鉴别的人苦味受体被苦味化合物(例如咖啡和由其衍生的提取物中存在的苦味化合物和结构相关的和其他的苦味化合物)的特异性活化。特别地，本发明提供用于鉴别调节(例如阻断)hT2R8和hT2R14的活化的化合物的基于细胞的测定。这些化合物将在人受治疗者中调节与这些味觉受体相关的苦味。这将在味觉测试中确认。
另外，本发明鉴别并提供具有宽范围的拮抗剂性质的拮抗剂，其可用 于含有已知和未知的苦味化合物的食物、饮料、药物和用于人或动物摄取的其他物质，其中期望苦味被最小化或消除。
以上味觉受体特异性响应咖啡中存在的苦味化合物，并响应与一个、多个或未知的苦味受体相互作用的具体苦味化合物是通过使用HEK-293表达系统和钙成像方法来基本确定的，所述HEK-293表达系统和钙成像方法参见其他出版物和本代理人提交的专利申请，例如美国序列号10/191,058和09/825,882，两者通过引用整体并入本文。更加特别地，本发明人用视紫红质35氨基酸标记物(SEQ ID NO：1)标记的特定hT2R和嵌合G蛋白(G16gust44)一起转染HEK-293细胞，其中所述嵌合G蛋白含有通过用味转导素的相应残基取代其羧基-44氨基酸残基进行修饰的Gα16G蛋白序列，并且通过钙成像方法记录这些细胞对特定的苦味配体的响应。
具体地，本发明人使用基于哺乳动物细胞的测定监测hT2R活性。对于钙成像测定，将细胞接种于48孔组织培养板。24小时后，所述细胞用含有hT2R核酸序列的表达质粒(pEAK10)和含有嵌合G蛋白(G16gust44)的质粒(pEAK10)瞬时转染。另外24小时后，所述细胞用钙特异性荧光染料(Fluo-4；Molecular Probes)孵育。使所述装载的细胞暴露于不同的苦味分子，并且hT2R的活化导致G16gust44的活化，其转而导致钙在细胞内部的转移。钙浓度的此增加改变了细胞内部钙染料的荧光性质。这些变化使用荧光显微术监测。
本发明人还使用自动荧光测定瞄准系统(automated fluorimetric aimingsystem)FLIPR，方案略有不同。稳定表达G16gust44的HEK-293细胞系用hT2R表达质粒转染，24小时后装载细胞并在FLIPR上分析。
鉴别特定hT2R的配体后，制备稳定表达hT2R和G16gust44二者的HEK-293细胞系以促进将来鉴别其他配体的筛选测定，所述其他配体活化所述特定的hT2R或调节(阻断或增强)此hT2R被另一个苦味配体(诸如咖啡中含有的苦味化合物)的活化。这避免了对瞬时转染的需求。
如图所示，这一实验反映了hT2R8和hT2R14响应咖啡中存在的苦味化合物，并鉴别抑制或阻断咖啡的苦味的化合物。另外，以下图5和实施例3中的实验特别反映化合物C的宽泛的拮抗剂性质。
这些结果表明鉴别hT2R味觉受体的细胞可用于鉴别配体的测定以及检测产生苦味的化合物的测定，所述配体调节与所述特定hT2R中的至少一种相关的苦味。
优选地，这些测定将应用表达编码hT2R的DNA的测试细胞，所述hT2R具有下文鉴别的氨基酸序列之一。然而预期，保留这些苦味受体的功能性质，即响应一些苦味化合物的这些受体多肽的片段、直向同源物、变体或嵌合体也将用于这些测定。此类变体的实例包括通过重组或化学方法产生的或天然存在的剪接变体、单核苷酸多态、等位基因变体和突变(mutations)。以下列出分离和表达T2R的方法，所述方法用于本发明的测定和预期用于本发明的测定，以鉴别抑制这些受体的活化的化合物。
T2R的分离和表达
本发明的T2R或其片段或变体的分离和表达可通过成熟的克隆程序，使用基于本申请公开的T2R核酸序列构建的探针或引物来实现。相关的T2R序列也可以使用本文公开的序列和已知的基于计算机的搜索技术(例如BLAST序列搜索)从人或其他物种的基因组数据库中鉴别。在一个特定的实施方案中，本文公开的假基因可用于鉴别功能等位基因或相关的基因。
然后表达载体可用于感染或转染宿主细胞以功能表达这些序列。这些基因和载体可在体外或体内制备并表达。技术人员应理解，用于改变并控制核酸表达的预期表型可通过调节本发明的载体中所述基因和核酸(例如启动子、增强子以及类似核酸)的表达或活性来获得。可使用用于增加或降低表达或活性的任何已知方法。本发明可与本领域已知的任何方法或方案一起实施，所述方法或方案在科学和专利文献中详细描述。
可选地，这些核酸可通过熟知的化学合成技术在体外合成，参见例如Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-18(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.，105：661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.25：3440-3444(1997)；Frenkel，FreeRadic.Biol.Med.19：373-380(1995)；Blommers， Biochemistry33：7886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.68：90(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68：109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.22：1859(1981)；美国专利第4,458,066号。然后，双链DNA片段可通过合成互补链并在合适条件下将所述链退火到一起来获得，或通过使用DNA聚合酶和合适的引物序列添加互补链来获得。
用于操作核酸(诸如，例如用于产生序列的突变、亚克隆、标记探针、测序、杂交以及类似操作)的技术在科学和专利文献中已详细描述。参见例如Sambrook编，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)(第二版)，1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)；Ausubel编，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)，John Wiley&Sons，Inc.，New York(1997)；Tijssen编，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology：HybridizationWith Nucleic Acid Probes，Part I，Theory and Nucleic Acid Preparation(生物化学和分子生物学实验室技术：核酸探针的杂交，第一部分，原理和核酸制备)，Elsevier，N.Y.(1993)。
核酸、载体、病毒壳体(capsids)、多肽以及类似物质可通过本领域技术人员熟知的许多一般方法中的任何一种来分析和定量。这些包括例如分析生物化学方法，例如NMR、分光光度法、射线照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)和超扩散色谱法(hyperdiffusion chromatography)，多种免疫学方法，例如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散、免疫电泳、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、Southern分析、Northern分析、点渍法分析、凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信号的扩增方法，放射性标记、闪烁计数和亲和性色谱。
寡核苷酸引物可用于扩增编码T2R配体结合区的核酸。本文描述的核酸还可使用扩增技术克隆或定量测量。扩增方法也为本领域所熟知，并且包括例如聚合酶链式反应(PCR)(Innis编，PCR Protocols，a Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指南)，Academic Press，N.Y.(1990)；Innis编，PCR Strategies(PCR策略)，Academic Press，Inc.， N.Y.(1995))；连接酶链式反应(LCR)(Wu，Genomics，4：560(1989)；Landegren，Science，241：1077(1988)；Barringer，Gene，89：117(1990))；转录扩增(Kwoh，PNAS，86：1173(1989))；自动维持序列扩增(Guatelli，PNAS，87：1874(1990))；Q-β复制酶扩增(Smith，J.Clin.Microbiol.，35：1477-9l(1997))；自动Q-β复制酶扩增测定(Burg，Mol.Cell.Probes，10：257-71(1996))；和其他RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)。还参见Berger，Methods Enzymol.，152：307-16(1987)；Sambrook；Ausubel；美国专利第4,683,195和4,683,202号；Sooknanan，Biotechnology，13：563-64(1995)。
扩增后，需要时，可根据本领域已知的方法，使用常规的分子生物学方法将所述核酸单独地或作为文库克隆至多种载体中的任何一个；体外克隆扩增的核酸的方法参见美国专利第5,426,039号。为了促进扩增序列的克隆，可将限制酶位点“构建入”所述PCR引物对。例如，本发明的示例引物对设计了Pst I和Bsp E1位点。这些特定限制位点具有当连接时，对于它们所剪接的7-膜受体“供体”编码序列是“符合读框的(in-frame)”序列(配体结合区编码序列位于7-膜多肽的内部，因此如果需要在限制酶剪接位点的下游翻译构建体，应该避免不符合读框(out of frame)的结果；如果插入的配体结合区包含几乎大部分的跨膜VII区，这就可以不是必须的)。所述引物可设计为保留所述“供体”7-膜受体的原始序列。可选地，所述引物可编码保守置换(例如疏水残基置换疏水残基，参见上文讨论)的或功能良性置换(例如没有阻止质膜插入、引起肽酶的切割、引起受体的异常折叠以及类似情况)的氨基酸残基。
所述引物对可设计为选择性地扩增T2R蛋白质的配体结合区。这些结合区可根据不同的配体变化；因此，一个配体的最小结合区可能对第二种潜在的配体是远远不够的。因此可扩增含有不同结构域结构的不同大小的结合区；例如7-跨膜T2R的跨膜(TM)结构域II至VII、III至VII、III至VI或II至VI，或其变体(例如，仅特定结构域的子序列，混合结构域的顺序以及类似情况)。
由于已知许多7-膜T2R蛋白质的结构域结构和序列，熟练的技术人员 可容易地选择结构域侧翼序列和内部结构域序列作为设计简并扩增引物对的模式序列。例如，编码结构域区II至VII的核酸序列可通过使用引物对PCR扩增产生。为了扩增含有跨膜结构域I(TMI)序列的核酸，可以从上文描述的编码T2R家族共有序列1的氨基酸序列的核酸设计简并引物。此简并引物可用于产生包括TM I至TM III、TM I至TM IV、TM I至TM V、TM I至TM VI或TM I至TM VII的结合区。其他简并引物可根据本文提供的其他T2R家族共有序列设计。此简并引物可用于产生包括TM III至TM IV、TM III至TM V、TM III至TM VI或TM III至TM VII的结合区。
设计简并引物对的范例为本领域所熟知。例如，共有-简并杂种寡核苷酸引物(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer，CODEHOP)策略计算机程序可从http：//blocks.fhcrc.org/codehop.html访问，并且直接链接于从一组相关蛋白质序列(如已知味觉受体配体结合区)开始预测杂种引物的BlockMaker多序列比对的网址(参见例如Rose，Nucleic Acids Res.，26：1628-35(1998)；Singh，Biotechniques，24：318-19(1998))。
合成寡核苷酸引物对的方法为本领域所熟知。可使用“天然的”碱基对或合成的碱基对。例如，使用人工的核苷碱基(nucleobase)提供一种通用的方法来操作引物序列并产生扩增产物的更加复杂的混合物。多个家族的人工核苷碱基能够通过内部键旋转而假设多种氢键键合方向(hydrogen bonding orientations)以提供简并分子识别的方法。这些类似物向PCR引物的单一位置的掺入允许产生复杂的扩增产物文库。参见例如Hoops，NucleicAcids Res.，25：4866-71(1997)。非极性分子也可用于模拟天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键形状模拟物可针对胸腺嘧啶的非极性形状模拟物有效地并选择性地复制(参见例如Morales，Nat.Struct。Biol.，5：950-54(1998))。例如，两个简并碱基可以是嘧啶碱基6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮或嘌呤碱基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(参见例如Hill，PNAS，95：4258-63(1998))。本发明的示例简并引物包括核苷碱基类似物5’-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷，3′-[(2-氰乙基)--(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(所述序列中的术语“P”，参见上文)。这一嘧啶类似 物氢键结合于嘌呤，包括A和G残基。
基本同一于本文公开的味觉受体的多态变体、等位基因和种间同系物可使用上文描述的核酸探针分离。可选地，表达文库可用于克隆T2R多肽和其多态变体、等位基因和种间同系物，这是通过用针对T2R多肽制备的抗血清或纯化抗体(其还识别并选择性结合所述T2R同系物)免疫学检测表达的同系物实现的。
编码味觉受体的配体结合区的核酸可通过使用合适的(完全或简并)引物对扩增(例如PCR)合适的核酸序列产生。扩增的核酸可以是来自任何细胞或组织的基因组DNA或源自味觉受体表达细胞的mRNA或cDNA。
在一个实施方案中，可以构建含有编码T2R的核酸的杂种蛋白质编码序列，所述T2R稠合于易位序列。还提供杂种T2R，其含有所述易位基序和其他家族的化学感受受体(特别是味觉受体)的味觉引起化合物结合区。这些核酸序列可以可操作地连接到转录或翻译控制元件，例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子，转录和翻译终止子、多腺苷酸化序列以及用于将DNA转录成RNA的其他序列。在重组表达盒、载体和转基因生物的构建中，可使用启动子片段在所有预期的细胞或组织中指导预期核酸的表达。
在另一个实施方案中，融合蛋白可包括C末端或N末端易位序列。此外，融合蛋白可包括附加的元件，例如用于蛋白质检测、纯化或其他应用。促进检测和纯化的结构域包括，例如金属螯合肽，例如聚组氨酸段、组氨酸-色氨酸模块或允许在固定化金属上纯化的其他结构域；麦芽糖结合蛋白；允许在固定化免疫球蛋白上纯化的A蛋白结构域；或应用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle Wash.)的结构域。
将可切割连接体序列，例如因子Xa(参见例如Ottavi，Biochimie，80：289-93(1998))、枯草溶菌素蛋白酶识别基序(参见例如Polyak，Protein Eng.，10：615-19(1997))；肠激酶(Invitrogen，San Diego，Calif.)以及类似序列，包括于易位结构域(用于有效的质膜表达)和新翻译的多肽的其余部分之间，可用于促进纯化。例如一个构建体可包括多肽编码核酸序列，其连接于六个组氨酸残基，随后是硫氧还蛋白、肠激酶切割位点(参见例如 Williams，Biochemistry，34：1787-97(1995))和C末端易位结构域。所述组氨酸残基促进检测和纯化，而肠激酶切割位点提供从融合蛋白的剩余部分纯化预期的蛋白质的方法。关于编码融合蛋白的载体和融合蛋白的应用的技术在科学和专利文献中已详细描述(参见例如Kroll，DNA Cell.Biol.，.12：441-53(1993))。
包括配体结合区编码序列的表达载体(无论是作为个体表达载体或表达载体的文库)可引入细胞的基因组或引入细胞的胞质或细胞核并且通过多种常规技术表达，所述技术详细描述于科学和专利文献。参见例如Roberts，Nature，328：731(1987)；Berger见上；Schneider，Protein Exper.Purif.，6435：10(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。来自生物试剂和实验仪器的生产商的产品信息也提供了相关已知生物学方法的信息。所述载体可以从天然来源分离，从诸如ATCC或GenBank文库的资源获得，或通过合成或重组方法制备。
核酸可在表达盒、载体或病毒中表达，所述表达盒、载体或病毒在细胞中稳定地或瞬时地表达(例如游离表达系统)。选择标志物可掺入表达盒和载体以赋予转化细胞和序列可选择的表型。例如，选择标志物可编码游离型维持和复制，从而不需要向所述宿主基因组整合。例如所述标志物可编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如氯磺隆(chlorosulfurone)或草丁膦(Basta))，以允许选择那些由预期DNA序列转化的细胞(参见例如Blondelet-Rouault，Gene，190：315-17(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.，281：992-97(1997))。因为赋予底物(如新霉素或潮霉素)抗性的选择标志物基因仅可用于组织培养，所以化学抗性基因也用作体外和体内选择标志物。
嵌合核酸序列可编码任何7-跨膜多肽中的T2R配体结合区。因为7-跨膜受体多肽具有相似的一级序列以及二级和三级结构，结构结构域(例如胞外结构域、TM结构域、胞质结构域等)可通过序列分析容易地鉴别。例如同源建模、傅立叶分析和螺旋周期检测可以鉴别并描述具有7-跨膜受体序列的七个结构域。快速傅里叶变换(FFT)算法可用于评估描述所分析的序列的疏水性和可变性特征的主周期(dominant period)。周期检测加强和α螺旋周期指数，可按照例如Donnelly，Protein Sci.，2：55-70(1993)进行。其他的比对和建模算法为本领域所熟知(参见例如Peitsch，Receptors Channels，4：161-64(1996)；Kyte&Doolittle，J.Md.Biol.，157：105-32(1982)；和Cronet，Protein Eng.，6：59-64(1993)。
本发明不仅还包括含有指定的核酸和氨基酸序列的核酸分子和多肽，还包括其片段，特别是例如40、60、80、100、150、200或250个核苷酸或更多的片段，以及例如10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多的多肽片段。任选地，所述核酸片段可编码抗原性多肽，所述多肽能够结合针对T2R家族成员培养的抗体。此外，本发明的蛋白质片段可任选地为抗原性片段，其能够结合针对T2R家族成员培养的抗体。
还预期了含有本文描述的至少一种T2R多肽之一的至少10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多，偶联于代表另一个GPCR(优选7跨膜超家族的成员)的所有或部分的附加氨基酸的嵌合蛋白。这些嵌合体可由所述受体和另一个GPCR制备，或它们可通过组合本发明的两种或多种受体制备。在一个实施方案中，所述嵌合体的一部分相当于或源自本发明的T2R多肽的跨膜结构域。在另一个实施方案中，所述嵌合体的一部分相当于或源自本文描述的T2R多肽的一个或多个跨膜区，并且剩余的一个或多个部分可来自另一个GPCR。嵌合受体为本领域所熟知，并且创建它们的技术以及选择和界定掺入其中的G蛋白偶联受体的结构域或片段也是熟知的。因此，本领域技术人员的这一知识可容易地用于创建此类嵌合受体。使用此类嵌合受体可提供例如本文具体公开的受体之一的味觉选择性特征，所述味觉选择性特征偶联于另一种受体(例如用于现有技术的测定系统的熟知受体)的信号转导特征。
例如，诸如配体结合区、胞外结构域、跨膜结构域、跨膜结构域、胞质结构域、N末端结构域、C末端结构域或其任何组合的区域可共价连接于异源蛋白质。例如，T2R跨膜区可连接于异源GPCR跨膜结构域，或者异源GPCR胞外结构域可连接于T2R跨膜区。可选择的其他异源蛋白质可包括，例如绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶多肽、谷氨酸受体和视紫红质多肽，例如视紫红质(如牛视紫红质)的N末端片段。
使用不同的宿主细胞表达本发明的T2R、片段或变体也属于本发明的范围。为了获得高水平表达克隆的基因或核酸，例如编码本发明的T2R、片段或变体的cDNA，技术人员通常将所关注的核酸序列亚克隆于表达载体，所述表达载体含有指导转录的强力启动子、转录/翻译终止子和如果是编码蛋白质的核酸，用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为本领域所熟知并且参见例如Sambrook等人。优选地，真核表达系统用于表达主题hT2R受体。
可以使用将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知技术。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、原生质载体(plasmavector)、病毒载体和将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如Sambrook等人)。仅需要所使用的特定的遗传工程程序能够将至少一个核酸分子成功地引入能够表达关注的T2R、片段或变体的宿主细胞。
所述表达载体引入所述细胞后，所述转染的细胞在有利于表达关注的受体、片段或变体的条件下培养，然后使用标准技术从培养物回收所述受体、片段或变体。这些技术的实例为本领域熟知。参见例如WO00/06593，其以符合本公开的方式通过引用并入。
用于检测调节依据本发明的hT2R活性的化合物的测定
用于确定测试的化合物是否在体外和体内特异性结合于本发明的T2R多肽的方法和组合物描述如下。可监测细胞生理学的许多方面以评估对天然存在的或嵌合的T2R的配体结合的效应。这些测定可在表达T2R多肽的完整细胞、透过性(permeabilized)细胞或由标准方法产生的膜组分上执行。
味觉受体结合味觉引起化合物，并且启动化学刺激向电信号的转导。活化的或抑制的G蛋白将转而改变靶酶、通道和其他效应蛋白质的性质。一些实例为在视觉系统中转导蛋白活化cGMP磷酸二酯酶、刺激性G蛋白(stimulatory G protein)活化腺苷酸环化酶、Gq和其他同类(cognate)G蛋白 活化磷脂酶C以及Gi和其他的G蛋白调节多种通道。还可检查下游结果，例如由磷脂酶C产生二酰甘油和IP3，并且IP3转而用于钙转移。
所述测定的主题hT2R蛋白质或多肽将通常选自具有本文权利要求书前的序列表中所含的序列的多肽或其片段或保守修饰变体。
可选地，所述测定的T2R蛋白质或多肽可源自真核宿主细胞，并可包含与这些hT2R多肽或其保守修饰变体具有特定百分比的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。一般来说，所述氨基酸序列同一性将为至少30％，优选地30-40％，更加具体地，50-60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。任选地，所述测定的T2R蛋白质或多肽可包含T2R多肽的区域，例如胞外结构域、跨膜区、胞质结构域、配体结合结构域以及类似区域。任选地，如本文所示例，T2R多肽或其部分可共价连接至异源蛋白质以创建在本文描述的测定中使用的嵌合蛋白。
使用上文描述的T2R蛋白质或多肽(重组的或天然存在的)可测试T2R活性的调节剂。所述T2R蛋白质或多肽(重组的或天然存在的)可以是分离的、在细胞中表达，在源自细胞的膜中表达，在组织或动物中表达。例如，可使用舌切片(tongue slice)、来自舌的解离细胞(dissociated cells)、转化细胞或膜。使用本文描述的一种体外或体内测定可测试调节。
调节剂的检测
用于确定测试的化合物是否在体外和体内特异性结合于本发明的T2R受体的方法和组合物描述如下。可监测细胞生理学的许多方面以评估对本发明的T2R多肽的配体结合的效应。这些测定可在表达化学感受受体的完整细胞、透过性细胞或由标准方法产生的膜部分或在体外使用从头合成的蛋白质执行。
在体内，味觉受体结合味觉调节化合物，并且启动化学刺激向电信号的转导。活化的或抑制的G蛋白将转而改变靶酶、通道和其他效应蛋白质的性质。一些实例为在视觉系统中转导蛋白活化cGMP磷酸二酯酶、刺激性G蛋白活化腺苷酸环化酶、Gq和其他同类G蛋白活化磷脂酶C以及 Gi和其他的G蛋白调节多种通道。还可检查下游结果，例如由磷脂酶C产生二酰甘油和IP3，并且IP3转而用于钙转移。
可选地，所述测定的T2R蛋白质或多肽可源自真核宿主细胞，并可包含与本文公开的T2R多肽或其片段或保守修饰变体具有氨基酸序列同一性的氨基酸序列。一般来说，所述氨基酸序列同一性将为至少35％至50％，或任选地75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。任选地，所述测定的T2R蛋白质或多肽可包含T2R蛋白质的结构域，例如胞外结构域、跨膜区、跨膜结构域、胞质结构域、配体结合结构域以及类似区域。此外，如上所述，T2R蛋白质或其结构域可共价连接至异源蛋白质以创建在本文描述的测定中使用的嵌合蛋白。
使用上文描述的T2R蛋白质或多肽(重组的或天然存在的)测试T2R受体活性的调节剂。所述T2R蛋白质或多肽(重组的或天然存在的)可以是分离的、在细胞中表达，在源自细胞的膜中表达，在组织或动物中表达。例如，可使用舌切片、来自舌的解离细胞、转化细胞或膜。使用本文描述的一种体外或体内测定可测试调节。
体外结合测定
也可以用可溶或固态反应，使用本发明的T2R多肽体外检查味觉转导。在一个特定的实施方案中，T2R配体结合结构域可用于体外可溶或固态反应以测定配体结合。
N末端结构域与胞外结构域的其他部分(例如跨膜结构域的胞外环)一起可形成所述配体结合结构域是可能的。
体外结合测定已经用于其他GPCR，例如代谢型谷氨酸受体(参见例如Han和Hampson，J.Biol.Chem.274：10008-10013(1999))。这些测定可包括置换放射性或荧光标记的配体、测量内在荧光的变化或蛋白水解易感性的变化等。
可以在溶液、双分子膜(任选地连接于固相)、脂单层或小泡中测试配体与依据本发明的T2R多肽的结合。可使用例如光谱特征(例如荧光、吸 光度、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱或溶解性的变化测试调节剂的结合。
在本发明的一个优选实施方案中，使用[35S]GTPγS结合测定。如上所述，当GPCR活化时，刺激G蛋白复合体的Gα亚基将结合的GDP交换为GTP。配体介导的G蛋白交换活性的刺激可在生物化学测定中测量，所述生物化学测定测量在假定配体存在下，添加的放射性标记的[35S]GTPγS与G蛋白的结合。通常，将含有关注的化学感受受体的膜与G蛋白混合。将潜在的抑制剂和/或活化剂和[35S]GTPγS加入所述测定，并且测量 [35S]GTPγS与G蛋白的结合。可通过液体闪烁计数或通过本领域已知的任何其他方法，包括闪烁邻近测定法(scintillation proximity assay，SPA)测量结合。在其他的测定形式中，可应用荧光标记的GTPγS。
荧光偏振测定
在另一个实施方案中，基于荧光偏振("FP")的测定可用于检测和监测配体结合。荧光偏振是用于测量平衡结合、核酸杂交和酶活性的通用实验技术。荧光偏振测定的相同之处在于它们不需要分离步骤，如离心、过滤、色谱、沉淀或电泳。这些测定直接在溶液中实时进行并且不需要固定相。可重复地并且在添加试剂后测量偏振值，因为测量偏振是快速的并且不破坏样品。一般来说，这一技术可用于测量低皮摩尔至微摩尔水平的荧光团的偏振值。本部分描述荧光偏振如何可以以简单和定量的方式用于测量配体与本发明的T2R多肽的结合。
当荧光标记的分子用平面偏振光激发时，其发射偏振度反比于其分子旋转的光。大的荧光标记分子在激发态期间(就荧光素而言为4纳秒)仍然是相对静止的，并且光的偏振在激发和发射之间保持相对恒定。小的荧光标记分子在激发态期间快速旋转并且偏振在激发和发射之间显著变化。因此，小分子具有低偏振值而大分子具有高偏振值。例如，单链的荧光素标记的寡核苷酸具有相对低的偏振值，但是当它与互补链杂交时，其具有较高的偏振值。当使用FP检测和监测味觉引起化合物结合(其可活化或抑制本发明的化学感受受体)时，可使用荧光标记的味觉引起化合物或自身具有 荧光的味觉引起化合物。
荧光偏振(P)定义为
其中Intpar是平行于激发光平面的发射光强度并且Intperp是垂直于激发光平面的发射光强度。P是光强度的比，为无量纲数。例如BeaconTM和Beacon2000TM系统可与这些测定一起使用。此类系统通常以毫偏振单位(1偏振单位＝1000mP单位)表示偏振。
分子旋转和大小之间的关系通过Perrin方程描述，并且读者可参阅Jolley，M.E.(1991)Journal ofAnalytical Toxicology，第236-240页，其通过引用并入，所述文献提供这一方程的全面解释。概要地，Perrin方程陈述了偏振与旋转弛豫时间直接成比例，所述时间为分子旋转约68.5°角所花的时间。旋转弛豫时间与黏度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)和气体常数(R)通过以下等式相关：2(旋转弛豫时间)＝3V RT。
旋转弛豫时间对小分子(例如荧光素)短(～纳秒)并且对大分子(例如免疫球蛋白)长(～100纳秒)。如果保持黏度和温度恒定，旋转弛豫时间以及因此偏振与分子体积直接相关。分子体积的变化可能是由于荧光标记分子与其他分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或构象变化。例如，荧光偏振已经用于测量蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶对大型荧光素标记的聚合物的酶促切割。其还用于测量蛋白质/蛋白质相互作用、抗体/抗原结合和蛋白质/DNA结合的平衡结合。
固态和可溶高通量测定
在另一个实施方案中，本发明提供使用T2R多肽；或表达T2R多肽的细胞或组织的可溶测定。在另一个实施方案中，本发明提供高通量形式的基于固相的体外测定，其中T2R多肽或表达所述T2R多肽的细胞或组织连接于固相基质或味觉刺激化合物并且与T2R受体接触，并且使用合适的标记物或针对T2R受体培养的抗体检测结合。
在本发明的高通量测定中，可在一天内筛选多达数千种不同调节剂或配体。特别地，微量滴定板的每个孔可用于进行针对一种选择的潜在调节剂的单独测定，或者如果观察浓度或孵育时间效应，每5-10个孔可以测试一个调节剂。因此，一个标准微量滴定板可测定约100(例如96)个调节剂。如果使用1536孔的板，那么一个板可容易地测定约1000至约1500个不同的化合物。在每个板孔中测定多个化合物也是可能的。每天可测定数个不同的板；使用本发明的集成系统，筛选多达约6,000-20,000个不同化合物的测定是可能的。最近，已经开发试剂操作的微流体方法。
关注的分子可经共价或非共价键(例如经标记物)直接地或间接地连接于固态组分。所述标记物是多种组分中的任何一个。一般来说，将结合标记物的分子(标记物结合物)固定于固相支持体，并且关注的标记分子(例如关注的味觉转导分子)通过所述标记物和所述标记物结合物的相互作用连接于所述固相支持体。
基于文献中详细描述的已知的分子相互作用，可以使用许多标记物和标记物结合物。例如，如果标记物具有天然结合物(例如生物素、A蛋白或G蛋白)，其可与合适的标记物结合物(抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性链亲和素、免疫球蛋白的Fc区等)一起使用。具有天然结合物的分子(例如生物素)的抗体也是广泛可用的和合适的标记物结合物(参见SIGMA Immunochemicals1998catalogue(SIGMA免疫化学品1998年目录)SIGMA，St.LouisMo.)。
相似地，任何半抗原性或抗原性化合物可与合适的抗体组合使用以形成标记物/标记物结合物对。数千个特异性抗体是可以商业获得的并且许多附加抗体描述于文献中。例如在一个普通配置中，所述标记物是第一个抗体并且所述标记物结合物是识别所述第一个抗体的第二个抗体。除了抗体-抗原相互作用，受体-配体相互作用也适合作为标记物和标记物结合物对。例如细胞膜受体的激动剂和拮抗物(例如细胞受体-配体相互作用，如运铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘蛋白家族、整联蛋白家族、选择蛋白家族以及类似受体；参见例如Pigott&Power，The Adhesion Molecule Facts Book I (黏附分子资料手册)(1993))。相似地，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如阿片类、类固醇等)、细胞内受体(例如介导多种小配体，包括类固醇、甲状腺激素、类视黄醇和维生素D；肽的效应)、药物、凝集素、糖、核酸(线状和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体都可与多种细胞受体相互作用。
合成的聚合物，例如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳撑硫醚(polyarylene sulfides)、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯(polyacetates)，也可形成合适的标记物或标记物结合物。许多其它的标记物/标记物结合物对也用于本文描述的测定系统中，这对参阅本公开的技术人员是明显的。
普通连接体诸如肽、聚醚以及类似连接体也可作为标记物，并且包括多肽序列，例如约5至200个氨基酸之间的聚甘氨酸序列。此类柔性的连接体为本领域技术人员所知。例如聚(乙二醇)连接体可从Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Ala获得。这些连接体任选地具有酰胺键、巯基键或异官能键(heterofunctional linkages)。
使用当前可行的多种方法中的任何一种将标记物结合物固定于固体基质。固体基质通常通过将全部或部分的所述基质暴露于化学试剂来进行衍生或功能化，所述化学试剂将化学基团固定于与标记物结合物的部分反应的表面。例如，适于连接长链部分的基团将包括胺、羟基、硫醇和羧基基团。氨烷基硅烷和羟烷基硅烷可用于使多种表面(例如玻璃表面)进行功能化。此类固相生物聚合物阵列的构建详细描述于文献中。参见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成)；Geysen等人，J.Immun.Meth.，102：259-274(1987)(描述在针上合成固相组成)；Frank&Doring，Tetrahedron，44：60316040(1988)(描述在纤维素盘上合成多种肽序列)；Fodor等人，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等人，Clinical Chemistry，39(4)：718-719(1993)；和Kozal等人，Nature Medicine，2(7)：753759(1996)(全部描述固定于固体基质的生物聚合物阵列)。将标记物结合物固定于基质的非化学方法包括其他普通的方法，例如加热、通过UV辐射交联以及类似方法。
基于细胞的测定
在一个优选的实施方案中，T2R蛋白质以未修饰的形式或作为嵌合受体、变体受体或截短的受体在真核细胞中表达，其中所述嵌合受体、变体受体或截短的受体具有或优选没有通过分泌途径促进其成熟和靶向的异源伴侣序列。此类T2R多肽可表达于任何真核细胞，例如HEK-293细胞。优选地，所述细胞包括功能G蛋白，例如Gα15或嵌合Gα16、味转导素或转导蛋白或嵌合G蛋白，例如能够将嵌合受体偶联于细胞内信号途径或诸如磷脂酶C的信号蛋白的G16gust44。此类细胞中T2R受体的活化可使用任何标准方法检测，例如通过检测所述细胞中FURA-2依赖性荧光进而检测细胞内钙的变化。此测定是本申请中提出的实验发现的基础。
活化的GPCR受体通常是磷酸化受体C-末端尾(C-terminal tail)(以及还有可能的其他位点)的激酶的底物。因此，活化剂将促进32P从放射标记的ATP转移至所述受体，其可用闪烁计数器测定。所述C-末端尾的磷酸化将促进抑制蛋白样蛋白质的结合并将干扰G蛋白的结合。有关GPCR信号转导和测定信号转导的方法的一般综述参见例如Methods inEnzymology(酶学方法)，第237和238卷(1994)和第96卷(1983)；Bourne等人，Nature，10：349：117-27(1991)；Bourne等人，Nature，348：125-32(1990)；Pitcher等人，Annu.Rev.Biochem.，67：653-92(1998)。
通过比较用假定的T2R调节剂处理的T2R多肽的响应和未处理的对照样品或含有已知“阳性”对照的样品的响应，可测定T2R调节。此类假定的T2R调节剂可包括抑制或活化T2R多肽活性的分子。在一个实施方案中，用活化所述T2R的化合物处理的对照样品的相对T2R活性值被指定为100。当相对于所述对照样品的T2R活性值为约90％，任选50％，任选25-0％时，实现对T2R多肽的抑制。当相对于所述对照的T2R活性值为110％，任选150％，200-500％或1000-2000％时，实现对T2R多肽的活化。
通过确定表达T2R多肽的细胞或膜的离子极化(即电位)的变化，可评估离子流的变化。确定细胞极化的变化的一种方法是通过用电压钳和膜片钳技术测量电流的变化(因而测量极化的变化)(参见例如“细胞粘附”模式、 “内翻外(inside-out)”模式和“全细胞”模式，例如Ackerman等人，New Engl.J Med.，336：1575-1595(1997))。使用所述标准方便地确定全细胞电流。其他已知测定包括：放射标记离子流测定和使用电压敏感染料的荧光测定(参见例如Vestergarrd-Bogind等人，J.Membrane Biol.，88：67-75(1988)；Gonzales&Tsien，Chem.Biol.，4：269-277(1997)；Daniel等人，J.Pharmacol.Meth.，25：185-193(1991)；Holevinsky等人，J.Membrane Biology，137：59-70(1994))。
测试化合物对所述多肽功能的效应可以通过检测上文描述的任何参数测量。影响GPCR活性的任何合适的生理学变化可用于评估测试的化合物对本发明的多肽的影响。当使用完整的细胞或动物确定功能结果时，技术人员还可测量多种效应，例如递质释放、激素释放、已知和未鉴定的遗传标志物的转录变化(例如RNA印迹)、细胞代谢的变化(例如细胞生长或pH变化)以及细胞内第二信使(例如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP)的变化。
GPCR的优选测定包含用离子或电压敏感染料装载以报道受体活性的细胞。用于确定此类受体的活性的测定还可使用其他G蛋白偶联受体的已知激动剂和拮抗物作为对照以评估测试化合物的活性。在鉴别调节化合物(例如激动剂、拮抗物)的测定中，将分别使用离子敏感的或膜电压荧光的指示剂监测胞质中离子水平或膜电压的变化。可使用的离子敏感指示剂和电压探针包括公开于Molecular Probes1997Catalog(分子探针1997目录)的那些。对于G蛋白偶联受体，混栖(promiscuous)G蛋白(例如Gα15和Gα16)可用于选择的测定(Wilkie等人，Proc.Nat′I Acad.Sci.，88：10049-10053(1991))。可选地，可使用其他G蛋白，例如味转导素、转导蛋白和嵌合G蛋白，如Gα16gust44或Gα16t25。
受体活化启动后续的细胞内事件，例如第二信使的增加。一些G蛋白偶联受体的活化通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇的水解刺激肌醇三磷酸(IP3)的形成(Berridge&Irvine，Nature，312：315-21(1984))。IP3转而刺激细胞内钙离子储存的释放。因此，胞质钙离子水平的变化或诸如IP3的第二信使水平的变化可用于评估G蛋白偶联的受体功能。表达此类G蛋白偶联的受体的细胞可表现出增加的胞质钙水平，这是由于钙从细胞内储存释 放以及细胞外的钙经由质膜的离子通道进入两方面的贡献。
在一个优选的实施方案中，通过在具有混栖G蛋白的异源细胞中表达T2R基因测量T2R多肽的活性，所述混栖G蛋白将所述受体连接于磷脂酶C信号转导途径(参见Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，270：15175-15180(1995))。优选地，所述细胞系是HEK-293(其正常地不表达T2R基因)并且所述混栖G蛋白是Gα15(Offermanns&Simon，见上)或嵌合G蛋白，例如Gα16gust44。通过测量细胞内Ca2+水平的变化测定味觉转导的调节，所述Ca2+水平响应施用与T2R多肽缔合的分子对T2R信号转导途径的调节而变化。任选地使用荧光Ca2+指示剂染料和荧光测定成像测量Ca2+水平的变化。
在另一个实施方案中，磷脂酰肌醇(PI)水解可根据美国专利第5,436,128号分析，所述专利通过引用在此并入。简单地说，所述测定包括用3H-肌醇标记细胞48小时或更长。所述标记的细胞用测试化合物处理一小时。在氯仿-甲醇-水中裂解并提取处理的细胞，之后通过离子交换色谱分离肌醇磷酸并通过闪烁计数定量。通过计算存在激动剂的cpm与存在缓冲液对照的cpm的比值确定刺激倍数。相似地，通过计算存在拮抗物的cpm与存在缓冲液对照(其可含或不含激动剂)的cpm的比值确定抑制倍数。
其他的受体测定包括确定细胞内环核苷酸(例如cAMP或cGMP)的水平。在活化所述受体引起环核苷酸水平下降的情况下，可优选在测定中在将受体活化化合物添加到所述细胞前，使所述细胞暴露于增加细胞内环核苷酸水平的试剂，例如毛喉素。在一个实施方案中，细胞内cAMP或cGMP的变化可使用免疫测定测量。Offermanns&Simon，J.Bio.Chem.，270：15175-15180(1995)中描述的方法可用于确定cAMP的水平。另外Felley-Bosco等人，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11：159-164(1994)中描述的方法可用于确定cGMP的水平。此外，用于测量cAMP和/或cGMP的测定试剂盒参见美国专利第4,115,538号，在此通过引用并入。
在另一个实施方案中，可测量转录的水平以评估测试化合物对信号转导的效应。使含有关注的T2R多肽的宿主细胞与测试化合物接触足够的时间以实现任何的相互作用，然后测量基因表达的水平。实现所述相互作用 的时间量可经验地确定，例如通过运行一个时间过程并测量作为时间函数的转录水平。可通过使用本领域的技术人员所知的任何合适的方法测量转录的量。例如，可使用RNA印迹检测关注的蛋白质的mRNA表达，或可使用免疫测定鉴别它们的多肽产物。可选地，基于转录的测定(其使用报道基因)可按照美国专利第5,436,128号的描述来使用，所述专利在此通过引用并入。所述报道基因可以是，例如氯霉素、乙酰转移酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外，关注的蛋白质可经连接于第二种报道基因(例如绿色荧光蛋白)而用作间接报道基因(参见例如Mistili&Spector，Nature Biotechnology，15：961-964(1997))。
然后比较所述转录的量和在缺少测试化合物的相同细胞中的转录的量，或者可与在缺少关注的T2R多肽的基本同一的细胞中的转录的量比较。基本同一的细胞可源自用来制备重组细胞，但是没有通过引入异源DNA进行修饰的相同细胞。转录的量的任何差异表明测试化合物以某种方式改变关注的T2R多肽的活性。
表达化学感受受体的转基因非人动物
表达本发明的一种或多种味觉受体序列的非人动物也可用于受体测定。此类表达可用于确定测试化合物是否体内特异性结合于哺乳动物味觉跨膜受体复合体，其通过使非人动物接触测试化合物并且确定所述动物是否与测试化合物反应(通过对所述受体多肽复合体的特异性结合)，所述非人动物用编码化学感受受体或其配体结合区的核酸稳定地或瞬时地转染。
用本发明的载体转染或感染的动物在鉴别和鉴定可结合于具体或系列受体的味觉刺激物的测定中特别有用。此类表达人味觉受体序列的载体感染的动物可用于体内筛选味觉刺激物和它们对例如细胞生理学(例如对味觉神经元)、对CNS或行为的效应。
感染/表达所述核酸和载体(单独地或作为文库)的方法为本领域所熟知。多种个体细胞、器官或全动物参数可通过多种方法测量。本发明的T2R序列可，例如通过用感染媒介(例如腺病毒表达载体)传递而表达于动物味 觉组织。
内源味觉受体基因可保持功能并且野生型(天然的)活性可仍然存在。在其他的情况下，如果需要所有味觉受体活性来自引入的外源杂种受体，优选使用敲除系。构建非人转基因动物(特别是转基因小鼠)以及选择和制备用于产生转化细胞的重组构建体的方法为本领域所熟知。
“敲除”细胞和动物的构建是基于以下前提：通过向基因组引入新的DNA序列，可降低或完全清除哺乳动物细胞中特定基因的表达水平，所述新的DNA序列用于干扰被抑制基因的DNA序列的某个部分。此外，“基因捕获插入(gene trap insertion)”可用于破坏宿主基因，并且小鼠胚胎干(ES)细胞可用于产生敲除转基因动物(参见例如Holzschu，Transgenic Res.6：97-106(1997))。所述外源物的插入通常是通过互补核酸序列之间的同源重组。所述外源序列是待修饰的靶基因的某个部分，例如外显子、内含子或转录调节序列或能够影响靶基因表达水平的任何基因组序列；或其组合。在多能胚胎干细胞中，经由同源重组的基因打靶允许技术人员精确地修饰关注的基因组序列。任何技术可用于产生、筛选、繁殖敲除动物，例如参见Bijvoet，Hum.Mol.Genet.7：53-62(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75：208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology19：161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48：167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6：321-328(1997)；美国专利第5,616,491、5,464,764、5,631,153、5,487,992、5,627,059、5,272,071号；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。
本发明的核酸还可用作产生“敲除”人细胞和它们的子代的试剂。相似地，本发明的核酸还可用作在小鼠中产生“敲入”的试剂。人或大鼠T2R基因序列可置换小鼠基因组中的T2R直向同源物。这样就产生了表达人或大鼠T2R的小鼠。然后所述小鼠可用于分析人或大鼠T2R的功能并鉴别此类T2R的配体。
调节剂
测试为T2R家族成员调节剂的化合物可以是任何小化合物或生物实体(biological entity)，例如蛋白质、糖、核酸或脂质。可选地，调节剂可以是T2R家族成员的遗传改变形式。通常，测试的化合物可以是小化学分子和肽。基本上任何化合物都可用作本发明的测定中的潜在调节剂或配体，尽管最经常使用可溶于水溶液或有机(特别是基于DMSO的)溶液的化合物。通过使所述测定步骤自动化和从任何方便的来源向测定提供化合物(其通常平行进行(例如在自动测定中在微量滴定板上以微量滴定的形式))，可将所述测定设计为筛选大型化学文库。应理解，有许多化合物的供应商，例如Sigma(St.Louis，Mo.)、Aldrich(St.Louis，Mo.)、Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)、Fluka Chemika-B iochemicaAnalytika(Buchs，Switzerland)以及类似供应商。
在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在的治疗化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合化学或肽的文库。然后，如本文所述，可以在一个或多个测定中筛选此类“组合化学文库(combinatorial chemical libraries)”或“配体文库”，从而鉴别表现出预期特征活性的那些文库成员(特别的化学种类或亚类)。由此鉴别的化合物可用作常规“先导化合物”或其自身可用作潜在的或实际的消费产品。
组合化学文库是通过化学合成或生物合成，通过组合许多化学“结构单元(building blocks)”，例如试剂而产生的不同化合物的集合(collection)。例如，线性组合化学文库(例如多肽文库)通过以给定化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数量)的每个可能方式组合一组化学结构单元(氨基酸)来形成。通过化学结构单元的此类组合混合，可合成数百万种化合物。
组合化学文库的制备和筛选为本领域技术人员所熟知。所述组合化学文库包括但不限于肽文库(参见例如美国专利第5,010,175号，Furka，Int.J.Pept.Prot Res.，37：487-93(1991)和Houghton等人，Nature，354：84-88(1991))。还可使用产生化学多样性文库的其他化学。所述化学包括但不限于：类肽(例如WO 91/19735)、编码的肽(例如WO93/20242)、随机生物寡聚物(例如WO 92/00091)、苯并二氮卓类(例如美国专利第5,288,514号)、多样体(diversomers)例如乙内酰脲类、苯并二氮卓类和二肽类(Hobbs等人， PNAS.，90：6909-13(1993))、插烯多肽类(vinylogous polypeptides)(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc.，114：6568(1992))、具有葡萄糖骨架(glucose scaffolding)的非肽肽模拟物(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.，114：9217-18(1992))、小化合物文库的类似有机合成(analogousorganic syntheses)(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.，116：2661(1994))、寡氨基甲酸酯(Cho等人，Science，261：1303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等人，J.Org.Chem.，59：658(1994))、核酸文库(Ausubel，Berger和Sambrook，均见上)、肽核酸文库(美国专利第5,539,083号)、抗体文库(Vaughn等人，Nature Biotechnology，14(3)：309-14(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(Liang等人，Science，274：1520-22(1996)和美国专利第5,593,853号)、小有机分子文库(苯并二氮卓类，Baum，C&EN，1月18日，第33页(1993)；噻唑烷二酮类(thiazolidinones)和间噻嗪酮类(metathiazanones)，美国专利第5,549,974号；吡咯烷类(pynrolidines)，美国专利第5,525,735和5,519,134号；吗啉化合物，美国专利第5,506,337号；苯并二氮卓类，5,288,514以及类似化合物)。
用于制备组合文库的设备是可商业获得的(参见例如357MPS、390MPS(AdvancedChem Tech，Louisville Ky.)、Symphony(Rainin，Wobum，Mass.)、433A(AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)、9050Plus(Millipore，Bedford，Mass.))。此外，许多组合文库自身是可商业获得的(参见例如ComGenex，Princeton，N.J.；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.；Martek Biosciences；Columbia，Md.；等)。
在本发明的一个方面中，所述T2R调节剂可用于任何食品、糖果、药物组合物或其成分，从而以预期的方式调节所述产品、组合物或成分的味道。例如，可添加增强苦味感知的T2R调节剂以向产品或组合物提供苦味，而可添加阻断苦味感知的T2R调节剂以阻断产品或组合物的苦味。此外，本发明提供鉴别存在于食品、饮料、化妆品和药品中的苦味化合物和产生味道改良的食品、饮料和药品的方法，所述改良的食品、饮料和药品缺乏或具有减少的量的所鉴别的苦味化合物。
本发明鉴别的化合物的用途
根据本发明鉴别的化合物可添加于食品、饮料、化妆品或药物组合物以调节(优选地阻断)苦味，所述苦味由咖啡和相关食物、饮料和药物中存在的苦味化合物或结构相关的化合物或其他苦味化合物(例如存在于食品和饮料或药品或化妆品的引起苦味感知的化合物)活化hT2R8和/或hT2R14之一中的至少一种而引发。
特别地，化合物C及其类似物基于其宽范围的拮抗剂性质，可用作其中期望缓解苦味的任何食品、饮料、药物或人或动物消耗的物质中的添加剂。假定化合物C的性质，这些物质可含有苦味配体，所述苦味配体已知与具体苦味配体(诸如hT2R3、7、10、14、16、44、51、55、61、63、64、65或71)和/或与hT2R5、9、13、54、67和75或其组合，或含有其苦味受体选择性未知的苦味化合物的物质相互作用。特别优选的应用是含有活化多个苦味受体的组合物。
此外，包括化合物C的主题化合物可用于竞争性结合和功能测定以及味觉测定以鉴别化合物C阻断或抑制苦味的苦味化合物。
如前所示，优选地，在主题T2R的基于细胞的测定中鉴别的化合物的味觉调节性质(优选地苦味阻断性质)将在人或动物味觉测试(优选地人味觉测试)中确认。
试剂盒
T2R基因和它们的同系物是鉴别味觉受体细胞、用于取证(forensics)和亲子确定以及检查味觉转导的有用工具。使用特异性杂交于T2R核酸(例如T2R探针和引物)的T2R家族成员特异性试剂和特异性结合于T2R蛋白质的T2R特异性试剂(例如T2R抗体)检查味觉细胞表达和味觉转导调控。
测定样品中T2R家族成员的DNA和RNA的存在的核酸测定包括本领域技术人员所知的许多技术，例如southern分析、northern分析、点渍法、核糖核酸酶保护、S1分析、诸如PCR扩增技术和原位杂交。例如在原位杂交中，靶核酸从其细胞环境中释放，从而可以在细胞内杂交而保留 细胞形态学以用于后续解释和分析。以下文献提供原位杂交领域的综述：Singer等人，Biotechniques，4：230250(1986)；Haase等人，Methods in Virology(病毒学方法)第VII卷，189-226(1984)；和Names等人编，Nucleic Acid Hybridization：APractical Approach(核酸杂交实用方法)(1987)。此外，可用以上描述的多种免疫测定技术检测T2R蛋白质。测试样品通常与阳性对照(例如表达重组T2R蛋白质的样品)和阴性对照进行比较。
本发明还提供用于筛选T2R家族成员的调节剂的试剂盒。此类试剂盒可从容易获得的材料和试剂制备。例如，此类试剂盒可包括任何一种或多种以下材料：T2R核酸或蛋白质、反应管和测试T2R活性的说明书。任选地，所述试剂盒含有功能性T2R多肽。依据所述试剂盒的预期使用者和所述使用者的特别需要，可根据本发明制备多种试剂盒和组分。
现在已经一般地描述了本发明，通过参考以下的实施例将更容易理解本发明，所述实施例以例证方式提供，并非意在限制。应理解，可对本文公开的示例实施方案进行多种改良和变化，而不背离本发明的精神和范围。
实施例
实施例1
hT2R8和hT2R14由咖啡苦味级分活化
来自咖啡的部分纯化的苦味级分用于筛选在如先前专利申请中描述的瞬时转染的HEK细胞中的25种人T2R。简而言之(如在美国专利公布号2003/0170608中更加详细地讨论，该专利通过引用在此并入)，稳定表达大型T细胞抗原和G15蛋白(HEK-G15)的人胚胎肾细胞用hT2R表达质粒瞬时地转染(例如通过使用磷酸钙或通过使用基于脂质的系统)。此外，其他HEK-G15细胞系用其他人T2R瞬时地转染。此后，基于荧光的测定用于检测瞬时转染的细胞中的钙浓度的变化。测试化合物与转染的细胞的相互作用产生导致PLC活化的信号传导级联和随后的导致荧光的增加的细胞内钙浓度的增加，所述荧光的增加使用钙敏感荧光染料检测。例如使用荧光显微镜和适当设计的软件(诸如成像工作站(ImagingWorkstation)，Axon)监测这些变化。
咖啡级分具有高水平的荧光，其干扰测定。为了克服干扰，测试了许多蓝色染料的阻断来自咖啡级分的荧光的能力。如图1所示，在使用瞬时转染的细胞的钙成像测定中，咖啡级分活化hT2R8和hT2R14。图1的实验中使用的蓝色染料是1.9mM的FD&C1。几种其他的hT2R也表现出由这一咖啡级分活化。使用不同的蓝色染料，hT2R的不同组合被活化(表1)。然而，因为对咖啡级分的响应，hT2R8和hT2R14始终被选出，且这两种受体的活性具有咖啡级分剂量依赖性(图2)。图2的实验中使用的蓝色染料是台盼蓝(tryptan blue)。
表1 使用不同的蓝色染料的咖啡级分对hT2R的活化
使用这一测定，已发现，将来自咖啡的苦味级分添加到表达hT2R8和hT2R14的细胞活化细胞内G蛋白。相反，使用相同的测定，来自咖啡的苦味级分没有特异性活化用其他hT2R瞬时转染的HEK-G15细胞。这一实验支持以下结论：味觉受体hT2R8和hT2R14特异性响应咖啡中存在的苦味化合物。
实施例2
hT2R8和hT2R14的拮抗剂的鉴别
为了鉴别拮抗剂，按照先前专利申请中所描述，产生分别稳定表达hT2R8和hT2R14以及混杂的(promiscuous)嵌合G16944蛋白的细胞系。使用稳定的细胞系和FLIPR(荧光显像读板器)建立高通量测定。使用hT2R8或hT2R14的激动剂将所述受体活化多达它们各自最大活性的70-80％。对于hT2R8，使用的激动剂是穿心莲内酯(200μM)；对于hT2R14， 激动剂是马兜铃酸(3μM)。为了鉴别拮抗剂，具有不同化学结构的化合物与激动剂一起添加。将引起受体活性的统计学显著的减少的化合物收集起来，并用剂量依赖性抑制曲线重新确认。化合物A和化合物B被鉴别为hT2R8拮抗剂(图3)。化合物C被鉴别为hT2R14拮抗剂(图4)。
实施例2a
组合hT2R8和hT2R14拮抗剂减少咖啡的苦味
在咖啡级分和两种类型的速溶咖啡(中度烘焙和中深度烘焙)中，用hT2R8和hT2R14拮抗剂的组合执行味觉测试，其使用具有4-5个小组成员的味觉小组的2选1强迫选择方法。具有拮抗剂的咖啡样品与没有拮抗剂的相同样品一起提供给味觉小组成员，要求小组成员在每对中鉴别较苦的样品。如表2所示，小组成员一致鉴别没有拮抗剂的咖啡级分样品比具有拮抗剂的咖啡级分样品苦，说明拮抗剂减少咖啡级分的苦味。相似地，如表3所示，拮抗剂减少两种类型的速溶咖啡的苦味。
如这一实施例的味觉测试所证实，表现苦味的组合物(例如食物、饮料和/或药物)中的苦味的感知可通过将hT2R8和/或hT2R14的拮抗剂掺入这种组合物来减少或消除。
为了确定各个拮抗剂的作用，用具有化合物C的中度烘焙速溶咖啡执行味觉测试。如表4所示，hT2R14拮抗剂(化合物C)自身足以减少这一实施例的咖啡中的苦味。
表2 咖啡级分和2种不同的拮抗剂的组合的味觉测试结果
表3 2种类型的速溶咖啡的味觉测试结果
表4 中度烘焙咖啡和单个拮抗剂的味觉测试结果
实施例3
化合物C是宽泛作用的苦味受体拮抗剂
以上实施例2教导化合物C是通过高通量筛选测定使用hT2R14鉴别的人T2R拮抗剂。其他的实验揭示化合物C是13种人T2R的宽泛调谐的拮抗剂，且以较低程度拮抗6种其他的人T2R。此外，味觉测试中的这一化合物阻断由许多不同的苦味物质引起的苦味强度。
特别地，为了评估化合物C化合物的抑制选择性，针对22种人T2R测试这一化合物，所述人T2R由Senomyx脱孤。这些受体和活化这些人T2R的苦味配体报道于早期专利申请中，所述专利申请通过引用在此并入。这22种人T2R是hT2R1、3、4、5、7、8、9、10、13、14、16、44、51、54、55、61、63、64、65、67、71和75。所有这些T2R的氨基酸序列和核酸序列可参见这些早期的专利申请中。这些人T2R各自被单独地瞬时转染到稳定表达混杂的G蛋白G16944的HEK293细胞，且按照在这些相同 的专利申请中所公开，使用这些受体实现功能测定。在这些实验中，每个受体通过其配体之一活化，所述配体选自先前被证实活化特定T2R的苦味分子。以EC80浓度水平使用配体。使用的苦味配体和测试的配体浓度的列表包含在这一实施例的表5中。
此外，为了确认受体测定中这一化合物的体外活性，发明人执行成对比较味觉测试以体内确定化合物的作用。味觉小组成员被要求品尝具有和没有化合物C的苦味物质，并鉴别哪个样品的味道更苦。每个小组成员品尝多对以增加样本大小，并且使用合适的统计方法分析结果。具有和没有化合物C的样品的顺序是随机的，且为反向平衡的。
为了确立这一化合物的宽泛的拮抗剂性质，测试其阻断由多种苦味配体引起的苦味以及由已知活化多种苦味受体的苦味配体和还没有被证实活化具体hT2R的苦味配体引起的苦味的能力。测试了已知活化苦味受体的几种苦味分子，对它们而言，活化通过化合物C抑制。具体地，水杨苷是活化hT2R16的苦味分子，且味觉测试结果显示，40μM的化合物C可减少其苦味。苯硫脲是活化hT2R51的苦味分子，且25μM的化合物C减少其苦味。
可活化多个T2R的几种苦味分子用化合物C相似地测试。苦味受体对这些分子中的一些的活化通过化合物C部分地抑制。奥美拉唑是活化hT2R10、14和75的苦味分子。尽管其苦味可涉及多个苦味受体，但其苦味也由化合物C明显地减少。莱鲍迪甙A是具有强烈苦味的天然增甜剂，其活化至少7种人T2R。其苦味还由化合物C减少。
此外，化合物C抑制一些化合物的苦味，其中与所述化合物相互作用的受体是未知的，诸如右美沙芬和苯海拉明。测试化合物C对这些化合物的作用，并发现它们的苦味也被减少。
涉及以上，图5含有实验结果，其中化合物C用不同的激动剂化合物测试。通过化合物C存在时受体活性的减少代表抑制活性。图5反映化合物C显著抑制(大于30％)13种不同的hT2R。这13种hT2R是hT2R3、7、10、14、16、44、51、55、61、63、64、65和71。6种其他的受体，包括hT2R5、9、13、54、67和75也被抑制，尽管程度较低。
表5 每个测试的T2R使用的配体和浓度的列表
hT2R 激动剂 浓度
1 苦味酸 0.05mM
3 氯喹pH6.5 50μM
4 氯喹pH6.5 5mM
5 皮考啉 10mM
7 氯喹pH6.5 10mM
8 穿心莲内酯 0.5mM
9 氧氟沙星 1mM
10 番木鳖碱 50μM
13 奥芬铵 1mM
14 马兜铃酸 2μM
16 水杨苷 1mM
44 苯甲地那铵 0.5μM
51 Prop 2.5μM
54 雷尼替丁 5mM
55 辛可宁 150μM
61 马兜铃酸 25nM
63 咖啡因 1mM
63 穿心莲内酯 100μM
64 马兜铃酸 1μM
65 橄榄苦苷 1mM
67 穿心莲内酯 5μM
71 苦味酸 10μM
75 番木鳖碱 1μM
实施例4
hT2R8拮抗剂：制备本发明的化合物
按照以下合成根据本发明的示例化合物
实施例4-1：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)吡啶酰胺.
将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)(400mg，2.1mmol)、皮考啉酸(256mg，2.1mmol)和HOBt(388mg，2.50mmol)在DCM(7mL)中混合。反应用三乙胺(670mL，4.8mmol)处理，并在室温和氮气气氛下搅拌15分钟。加入EDC(598mg，3.1mmol)，并将反应搅拌额外的4小时。然后，反应用二氯甲烷(5mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液(5mL，2x)洗涤，然后用饱和NaCl水溶液(5mL)洗涤。收集有机层，干燥并过滤。真空除去溶剂。将粗产物再次悬浮于EtOH(5mL)，并通过反相HPLC(5％-95％ACN于H2O水中：25分钟梯度)纯化。合并纯级分，并浓缩以获得白色固体N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)吡啶酰胺(372mg，60％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.21(s，3H)，2.44(s，3H)，5.05(s，2H)，7.49-7.47(m，1H)，7.59(s，1H)，7.93-7.88(dt，J＝14，2Hz，1H)，8.07(s，1H)，8.24-8.21(d，J＝8Hz，1H)，8.61-8.56(m，1H)，9.83(bs，1H)。LC/MS；计算C15H15N5O2的[M+H]；计算值297.1；实测值298.3。熔点：135-137℃。
化合物具有0.57μM对hT2R8苦味受体的IC50。
实施例4-1a：盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺
室温下，将1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基氨基甲酸叔丁酯(实施例4-1b)(592mg，2mmol)在4N HCl的二噁烷溶液(20mL)中搅拌2小时。减压除去溶剂，且将残留物溶解于1/1乙酸乙酯/己烷的混合物(30mL)，并浓缩(2次)。固体用己烷研磨，并通过过滤收集，提供白色固体盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(500mg，99％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ2.11(s，3H)，2.38(s，3H)，5.16(s，2H)，7.51(s，1H)，8.03(s，1H)，10.27(bs，3H)。
实施例4-1b：1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基氨基甲酸叔丁酯
室温下，将3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)异噁唑(实施例4-1c)(14.6g，66mmol)、Boc酐和10％Pd/C(3.8g)在1大气压H2下，在MeOH(400mL)中搅拌16小时。将混合物过滤，并减压除去溶液。残留物通过硅胶色谱(20％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得淡粉色固体1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基氨基甲酸叔丁酯(12.7g，66％)。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ1.41(s，9H)，2.10(s，3H)，2.32(s，3H)，4.90(s，2H)，6.19(bs，1H)，7.19(s，1H)，7.50(s，1H)。MS293(MH+)。
实施例4-1c：3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)异噁唑
将t-BuOK(4.2g，38mmol)加入到经冰/水浴冷却至0℃的在DMF(80mL)中的4-硝基-1H-吡唑(实施例4-1d)(3.8g，34mmol)中。加入碱后，移走冰浴，并将混合物搅拌30分钟，随后加入4-(氯甲基)-3，5-二甲基异噁唑(5g，34mmol)。将反应回流16小时，然后冷却至室温。将H2O加入到反应混合物，并通过过滤收集形成的沉淀。沉淀用额外H2O洗涤，然后在高真空下干燥以获得淡黄色固体3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)异噁唑(5.8g，78％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.23(s，3H)，2.46(s，3H)，5.08(s，2H)，8.02(s，1H)，8.08(s，1H)。
实施例4-1d：4-硝基-1H-吡唑
将吡唑(10g，147mmol)分批加入到浓硫酸(100mL)中，同时经冰水浴将内部反应温度维持在低于50℃。然后滴加浓硝酸(10mL)，经冰水浴将内部反应温度维持在低于50℃。移走冰水浴，然后将反应加热至60℃，并搅拌4小时。反应经冰水浴冷却，并用18N NaOH水溶液(150mL)使之成碱性，至～pH8。通过过滤收集沉淀为白色固体的产物，用H2O洗涤，并在高真空下干燥以获得白色固体4-硝基-1H-吡唑(7g，42％)。13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ126.4，137.0。
实施例4-2：3-氯-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-4-(甲基磺酰基)噻吩-2-羧酰胺
将三乙胺(600mg，6mmol)加入到搅拌的经冰水浴冷却至0℃的盐酸((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)(500mg，2mmol)在DCM(20mL)中的混合物。搅拌混合物，直到所有固体溶解(～10分钟)。0℃下，将在2mL CH3CN中的3-氯-4-(甲基磺酰基)噻吩-2-碳酰氯(543mg，2.1mmol)经注射器加入到游离胺中。移走冰浴，将混合物搅拌2小时。反应用二氯甲烷(100mL)稀释，然后有机相用H2O(200mL)洗涤。有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。固体用乙酸乙酯/己烷(1/5)研磨以获得白色固体3-氯-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-4(甲基磺酰基)噻吩-2-羧酰胺(375mg，45％)。1HNMR(CDCl3，400MHz)：2.20(s，3H)，2.43(s，4H)，3.22(s，3H)，5.05(s，2H)，7.57(s，1H)，7.94(s，1H)，8.41(s，1H)，8.59(bs，1H)。LC/MS；[M+H]415.5。熔点：202-204℃。
化合物具有2.09μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-3：(S)-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-苯丙酰胺.
将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)(200mg，1mmol)、(S)-2-苯基丙酸(156mg，1mmol)和PyBop(650mg，1.3mmol)加入到DMF(4mL)中，随后加入三乙胺(0.3mL，2.1mmol)。在室温下，将反应在氮气气氛下搅拌4小时，然后用乙酸乙酯(20mL)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(2x15mL)，随后用饱和NaCl水溶液(15mL)洗 涤。将有机相干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。将粗产物再次悬浮于甲醇(3mL)中，并通过反相HPLC(5％-95％ACN于H2O中：25分钟梯度)纯化。将含有纯产物的级分浓缩以获得白色固体(S)-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-苯丙酰胺(200mg，60％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.36(d，J＝7.2，Hz，3H)，2.09(s，3H)，2.36(s，3H)，3.71-3.66(m，1H)，5.05(s，2H)，7.33-7.17(m，5H)，7.37(s，1H)，7.90(s，1H)，10.05(s，1H)。MS325(M+H)。熔点108℃-110℃。
化合物具有0.41μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-4：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)乙酰胺.
在室温下，将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)(376mg，1.7mmol)、2-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)乙酸(350mg，1.7mmol)、PyBop(1g，2mmol)和三乙胺(605mg，6mmol)在DMF(10mL)中一起搅拌2小时。反应混合物用1N HCl水溶液(100mL)稀释，并用DCM(3x，75mL)萃取。合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过硅胶色谱(30％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得白色固体N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)乙酰胺(189mg，29％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.10(s，3H)，2.36(s，3H)，3.40(s，2H)，3.70(s，6H)，5.07(s，2H)，6.53(s，2H)，7.39(s，1H)，7.92(s，1H)，8.18(s，1H)，10.03(s，1H)。LC/MS；计算C19H22N4O5的[M+H]；计算值387.16；实测值387.6。熔点：187-188℃。
化合物具有0.46μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-5：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-苯丙酰胺.
在室温下，将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)(300mg，1.3mmol)、2-苯基丙酸(225mg，1.5mmol)、三乙胺(300mg，3mmol)、DMAP(61mg，0.5mmol)和EDC(386mg，2mmol)在DCM(10mL)中一起搅拌4小时。反应混合物用1N HCl水溶液(100mL)稀释，并用DCM(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过硅胶色谱(30％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得白色固体N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-苯丙酰胺(272mg，81％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.36(d，3H，J＝7.2Hz)，2.10(s，3H)，2.37(s，3H)，3.70(m，1H，J＝6.8Hz)，5.06(s，2H)，7.20(t，1H，J＝8.4Hz)，7.31-7.28(m，4H)，7.38(s，1H)，7.91(s，1H)，10.10(s，1H)。LC/MS；计算C18H20N4O2的[M+H]；计算值325.16；实测值325.5。熔点：129-130℃。
化合物具有0.32μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-6：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-苯基乙酰胺.
将1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺盐酸盐(实施例4-1a)(230mg，1mmol)和三乙胺(300mg，3mmol)在经冰/水浴冷却至0℃的DCM(10mL)中搅拌。将2-苯基乙酰氯(184mg，1.3mmol)滴加于搅拌的反应混合物。当添加完成时，移出冰浴，然后将反应搅拌1小时。混合物用DCM(50mL)稀释，用1N HCl水溶液(100mL)，随后用1N NaOH水溶液(100mL)，然后用H2O(100mL)洗涤。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤，然后在旋转蒸发仪上除去溶剂。产生的残留物通过硅胶色谱(50％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得210mg固体产物，其在乙酸乙酯/己烷(1/9)中研磨以获得白色固体N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-苯基乙酰胺(188mg，68％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ.2.15(s，3H)，2.38(s，3H)，3.69(s，2H)，4.97(s，2H)，7.15b(s，1H)，7.40-7.27(m，6H)，7.84(s，1H)。LC/MS；计算C17H18N4O2的[M+H]；计算值311.14；实测值311.40。熔点：106-108℃。
化合物具有0.53μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-7：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-甲氧基苯甲酰胺.
室温下，将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)(300mg，1.3mmol)、3-甲氧基苯甲酸(172mg，1.3mmol)、EDC(386mg，2mmol)和三乙胺(303mg，3mmol)在DCM(5mL)中搅拌6小时。反应用DCM(50mL)稀释，且有机相用0.1N HCL水溶液(150mL)，随后用1N NaOH水溶液(150mL)洗涤。有机层用硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。粗产物通过硅胶色谱(40％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得225mg灰白色固体。固体用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，并且通过过滤收集白色固体。将纯产物溶解于无水乙醇，并在旋转蒸发仪上浓缩(4x，25mL)以获得白色固体N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-甲氧基苯甲酰胺(185mg，43％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.20(s，3H)，2.42(s，3H)，3.85(s，3H)，5.03(s，2H)，7.09-7.06(m，1H)，7.37-7.35(m，2H)，7.41(m，1H)，7.51(s，1H)，7.93(bs，1H)，8.03(s，1H)。LC/MS；计算C17H18N4O3的[M+H]；计算值327.14；实测值327.30。熔点：127-129℃。
化合物具有0.39μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-8：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-羧酰胺
将盐酸1-((3，5--二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例1a)(8mg，35μmol)和苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-羧酸(7mg，42μmol)各自溶解于200uL二甲基甲酰胺。将Si-碳二亚胺树脂(70mg，70μmol)载入1.2mL96孔Greiner板，随后加入胺和酸。将羟基苯并三唑(6mg，42μmol)溶解于100uL二甲基甲酰胺，然后加入到反应孔中。反应在室温下振荡过夜。为了除去过量的羧酸和羟基苯并三唑，将PS-三甲醇氨基甲烷树脂(35mg，70μmol)加入到反应混合物，并使之在室温下振荡过夜。将200uL乙腈加入到反应孔，并振荡1分钟。将顶部澄清溶液转移至新的板。萃取过程再重复两次。将溶液真空蒸发，并获得所需产物。收率6％。MS M+H计算值341.1，实测值341.2。
化合物具有0.2μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-9：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二甲氧基苯甲酰胺
按照实施例4-8由2，5-二甲氧基苯甲酸和盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)制备。收率13％。MS M+H计算值357.5，实测值357.3。
化合物具有0.17μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-10：3-氰基-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4- 基)苯甲酰胺
按照实施例4-8由3-氰基苯甲酸和盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)制备。收率15％。MS M+H计算值322.6，实测值322.3。
化合物具有0.2μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-11：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-苯基环丙烷羧酰胺
按照实施例4-8由1-苯基环丙烷羧酸和盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)制备。收率6％。MS M+H计算值337.6，实测值337.5。
化合物具有0.25μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-12：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-苯基丁酰胺
按照实施例4-8由3-苯基丁酸和盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)制备。收率6％。MS M+H计算值339.6，实测值339.5。
化合物具有0.28μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-13：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1H-吡咯-2-羧酰胺
按照实施例4-8由1H-吡咯-2-羧酸和盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)制备。收率18％。MS M+H计算值286.6，实测值286.3。
化合物具有0.57μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-14：2-环己基-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)乙酰胺
按照实施例4-8由2-环己基乙酸和盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)制备。收率17％。MS M+H计算值317.6，实测值317.4。
化合物具有0.73μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-15：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)肉桂酰胺
按照实施例4-8由肉桂酸和盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H- 吡唑-4-胺(实施例4-1a)制备。收率4％。MS M+H计算值322.6，实测值322.4。
化合物具有0.7μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-16：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)金刚烷.
将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(300mg，1.56mmol)、金刚烷-1-羧酸(281mg，1.56mmol)、PyBop(972mg，1.87mmol)和三乙胺(.438mL，3.12mmol)在DMF(5mL)中混合。在室温下，将反应在氮气气氛下搅拌4小时。反应用乙酸乙酯(4mL)稀释，并用饱和NaHCO3溶液(2x，3mL)，然后用饱和NaCl溶液(3mL)洗涤。萃取有机层，干燥，并过滤。真空除去溶剂。将粗产物再次悬浮于甲醇(4mL)，并通过HPLC纯化。将纯产物再次溶解于乙醇，并真空浓缩(3x3mL)以获得白色固体N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)金刚烷，收率60％。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.79-1.70(m，6H)，1.93-1.92(m，6H)，2.08(bs，3H)，2.18(s，3H)，2.41(s，3H)，4.98(s，2H)，7.37(s，1H)，7.38(s，1H)，7.92(s，1H)。MS355(M+H)。熔点167-169℃。
化合物具有0.88μM对hT2R8苦味受体的IC50
按照实施例4-1至4-16中描述的相似方案合成额外的化合物，并对其实验地测试并发现其具有作为hT2R8苦味受体的抑制剂的相对高水平的功效。该测试的结果显示于以下表A中。
表A
实施例4-67至4-91：
按照实施例4-73由盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)和他们对应的官能化羧酸制备。通过其中发现所需质量的LCMS完成表征。
实施例4-73：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3，4-二羟基-5-甲氧基苯甲酰胺
在微波瓶中，将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)(228mg，1mmol)、3，4-二羟基-5-甲氧基苯甲酸(184mg，1mmol)、HOBt(135mg，1mmol)和EDC(191mg，1mmol)溶解于2mL DMF，随后加入三乙胺(101mg，1mmol)。165℃下，将反应置于微波反应器中，持续5分钟。使用Varian HPLC(10％-95％ACN于H2O中：25分钟梯度)直接纯化粗产物。将纯级分合并，并浓缩以获得N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3，4-二羟基-5-甲氧基苯甲酰胺。(280mg，70％)。LC/MS；计算C17H18N4O5的[M+H]；计算值359.1；实测值359.1。
化合物具有2.2μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-92：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-7-甲氧基苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-羧酰胺
将N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3，4-二羟基-5-甲氧基苯甲酰胺(实施例73)(50mg，0.14mmol)和碳酸铯(113mg，2.5mmol)溶解于1mL丙酮，随后加入二溴甲烷(239mg，1.4mmol)。120℃下，将反应置于微波反应器中，持续20分钟。从反应中除去澄清溶液，并真空蒸发。将粗产物溶解于1mL乙醇，并通过varian HPLC(10％-95％ACN于H2O中：25分钟梯度)纯化。将纯级分合并，并浓缩以获得N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-(7-甲氧基苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基)乙酰胺。(12mg，23％)。LC/MS；计算C18H18N4O5的[M+H]；计算值371.1；实测值371.1。
化合物具有0.7μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-93：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-8-甲氧基-2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-羧酰胺
按照实施例4-92由N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3，4-二羟基-5-甲氧基苯甲酰胺(实施例4-73)、碳酸铯和二溴乙烷制备。收率20％。MS M+H计算值385.1，实测值385.1。
化合物具有0.7μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-94：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-7-甲氧基-2-甲基苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-羧酰胺
按照实施例4-92由N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3，4-二羟基-5-甲氧基苯甲酰胺(实施例4-73)、碳酸铯和1，1-二溴乙烷制备。收率25％。MS M+H计算值385.1，实测值385.1。
化合物具有0.7μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-95：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-7-甲氧基-2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-羧酰胺
按照实施例4-73由盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例4-1a)和7-甲氧基-2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-羧酸(实施例4-95a)制备。收率50％。MS M+H计算值385.1，实测值385.1。1H NMR(400MHz，DMSO)：2.136(s，3H)，2.410(s，3H)，3.851(s，3H)，4.214(bs，2H)，4.296(bs，2H)，5.120(s，2H)，6.688(s，1H)，7.290(s，1H)，7.6006(s，1H)，8.069(s，1H)，9.856(s，1H)。
化合物具有0.7μM对hT2R8苦味受体的IC50
实施例4-95a：7-甲氧基-2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-羧酸
在2mL微波瓶中，将7-溴-2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-羧酸甲酯(273mg，1mmol)和CuBr(14.3mg，0.1mmol)溶解于干燥DMF，并置于冰浴中。在0℃搅拌下，将甲醇钠(540mg，10mmol)滴加于反应混合物。将反应升至室温，并搅拌45分钟。然后，在135℃下，将反应置于微波反应器中，持续5分钟。将反应混合物溶解于水，并用乙酸乙酯洗涤。收集水层，并用1M HCl酸化至pH4。使用乙酸乙酯萃取产物，然后用硫酸钠干燥。真空蒸发溶剂以获得所需中间体7-甲氧基-2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-羧酸，其不经进一步纯化直接使用。收率57％。MS M+H计算值211.1，实测值211.1。
实施例5
hT2R14拮抗剂：制备本发明的化合物
提供以下实施例以阐释本发明的多种示例性实施方案，且不期望以任何方式限制。
实施例5-1：4-(N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
室温下，将4-(N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸苄酯(实施例5-1a)(517mg，1mmol)的6N NaOH(水溶液)/THF/MeOH(27mL)的10/1/2溶液搅拌6小时。溶液用3NHCl(水溶液)酸化至pH～3(大约50mL)，并且水相用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，并 在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物溶解于MeOH(15mL)，并通过反相HPLC(5-95％乙腈于H2O中的梯度：25分钟)纯化3份5mL等份试样。将纯级分合并，并浓缩至白色固体。将产物溶解于15mL无水乙醇，并在旋转蒸发仪上蒸发(4x)以获得白色固体纯4-(N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸(174mg，42％)。熔点161-163℃。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ3.78(s，3H)，4.32(s，2H)，4.36(s，2H)，6.78(d，J＝8.4Hz，2H)，6.99(d，J＝8.8Hz，2H)，709-7.07(m，2H)，7.27-7.24(m，3H)，7.93(d，J＝8.8Hz，2H)，8.24(d，J＝8Hz，2H)。MS412(MH+)。
化合物具有0.22μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-1a：4-(N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸苄酯
80℃下，将在DMF(10mL)中的4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸(实施例5-1b)(450，mg，1.4mmol)、苄基溴(770mg，4.5mmol)和碳酸铯(1.5g，4.5mmol)搅拌2小时。将溶液冷却至室温，用H2O(200mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，100mL)萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩。残留物通过硅胶色谱(10％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得白色固体4-(N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸苄酯(517mg，73％)。 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.76(s，3H)，4.28(s，2H)，4.32(s，2H0，5.40(s，2H)，6.79(d，J＝8Hz，2H)，6.96(d，J＝8Hz，2H)，7.04-7.07(m，2H)，7.21-7.23(m，3H)，7.35-7.47(m，5H)，7.85(d，J＝8Hz，2H)，8.17(d，J＝8.4Hz，2H)。
实施例5-1b：4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
将固体4-(氯磺酰基)苯甲酸(5g，22.7mmol)分三份加入到搅拌的4-甲氧基苄胺(6.1g，45mmol)和三乙胺(2.3g，22.7mmol)在丙酮(100mL)中的溶液，在10分钟的时间内经冰水浴冷却至0℃。移走冰浴，并将反应搅拌额外的4小时。反应混合物用5％乙酸的H2O溶液(150mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，100mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。产生的白色固体用己烷/乙酸乙酯(9/1)研磨，以获得白色固体4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸(5.1g，70％)。1H NMR(400MHz，DMSO d6)δ3.68(s，3H)，3.91(s，2H)，6.79(d，J＝8.4Hz，2H)，7.10(d，J＝8.8Hz，2H)，7.80(d，J＝8.8Hz，2H)，8.02(d，J＝8.4Hz，2H)。
实施例5-2：4-(N-(呋喃-2-基甲基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
室温下，将4-(N-(呋喃-2-基甲基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸4-甲氧基苄酯(实施例5-2a)(750mg，1.4mmol)在2N LiOH水溶液/THF/MeOH(45mL)的2/2/1混合物中搅拌3小时。溶液用1N HCl水溶液酸化至pH～3(大约100mL)，并用乙酸乙酯(3x，100mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，并在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物溶解于MeOH(9mL)，并通过反相HPLC(5-95％ACN于H2O中的梯度：40分钟)纯化3份3mL等份试样。将纯级分合并，并浓缩至白色固体。将产物溶解于无水乙醇，并蒸发(4x，20mL)以获得白色固体纯4-(N-(呋喃-2-基甲基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸(205mg，36％)。熔点151-152℃。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ3.71(s，3H)，4.24(s，2H)，4.27(s，2H)，6.14(d，1H，J＝3.2Hz)，6.26(m，1H)，6.87(d，2H，J＝9.2Hz)，7.14(d，2H，J＝8.8Hz)，7.41(s，1H)，7.89(d，2H，J＝8Hz)，8.06(d，2H，J＝8.4Hz)，13.48(bs，1H)。MS400(M-H)。
化合物具有0.59μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-2a：4-(N-(呋喃-2-基甲基)-N-(4-甲氧基芐基)氨磺酰基)苯甲酸4-甲氧 基芐酯：
将4-(N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸(实施例5-2b)(500mg，1.8mmol)、对甲氧基苄基氯(624mg，4.0mmol)和碳酸铯(1.3g，4.0mmol)溶解于DMF(10mL)中，并在80℃下搅拌1小时。将混合物冷却至室温，用H2O(200mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。合并的有机物用硫酸钠干燥，并在旋转蒸发仪上浓缩。产物通过硅胶色谱(15％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得澄清油状4-(N-(呋喃-2-基甲基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰 基)苯甲酸4-甲氧基苄酯(753mg，80％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ3.70(s，3H)，3.75(s，3H)，4.22(s，2H)，4.26(s，2H)，5.39(s，2H)，6.14(d，1H，J＝3.2Hz)，6.25(m，1H)，6.87(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，2H，J＝8.8Hz)，7.13(d，2H，J＝8.4Hz)，7.39(m，1H)，7.43(d，2H，J＝8.4Hz)，7.91(d，2H，J＝8.4Hz)，8.07(d，2H，J＝8.4Hz)。
实施例5-2b：4-(N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸：
将4-(氯磺酰基)苯甲酸(5.0g，22.7mmol)在10分钟的时间内分三份加入到经冰水浴冷却至0℃的搅拌的糠胺(6.6g，68mmol)的丙酮(200mL)溶液中。加入磺酰氯完成后，移走冰浴，并将溶液在室温下搅拌1小时。将混合物浓缩，并经受硅胶色谱(90％乙酸乙酯、8％己烷和2％乙酸)以获得白色固体4.4g的4-(N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸(4.4g，68％)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ4.04(d，2H，J＝6Hz)，6.13(d，1H，J＝3.2Hz)，6.25(m，1H)，7.43(m，1H)，7.83(d，2H，J＝8.4Hz)，8.05(d，2H，J＝8.4Hz)，8.36(t，1H，J＝6Hz)，13.4(bs，1H)。
实施例5-3：4-(N-(4-乙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸
80℃下，将4-氰基-N-(4-乙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)苯磺酰胺(实施例5-3a)(300mg，0.8mmol)在二噁烷/1.5N NaOH水溶液(100mL)的1/1混合物中搅拌16小时。将混合物冷却，用1N HCl水溶液(100mL)酸化，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。固体用乙酸乙酯/己烷(～1/9)研磨，通过过滤收集以获得白色固体4-(N-(4-乙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸(250mg，69％)。NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ1.29(t，J＝6.8Hz，3H)，3.97(q，J＝6.4Hz，2H)，4.23(s，2H)，4.27(s，2H)，6.15(d，J＝3.2Hz，1H)，6.27(m，1H)，6.84(d，J＝8.8Hz，2H)，7.11(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(m，1H)，7.87(d， J＝8.4Hz，2H)，8.00(d，J＝8.4Hz，2H)。
化合物具有3.0μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-3a：4-氰基-N-(4-乙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)苯磺酰胺：
将4-氰基苯-1-磺酰氯(600mg，2.9mmol)加入到搅拌的N-(4-乙氧基苄基)-1-(呋喃-2-基)甲胺(实施例5-3b)(685mg，2.9mmol)和三乙胺(455mg，4.5mmol)的DCM(100mL)溶液中，并将反应搅拌2小时。反应用H2O(200mL)稀释，并用DCM(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过硅胶色谱(10％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得灰白色固体4-氰基-N-(4-乙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)苯磺酰胺(665mg，68％)。NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ1.29(t，J＝7.2Hz，3H)，3.97(q，J＝6.8Hz，2H)，4.23(s，2H)，4.27(s，2H)，6.15(d，J＝3.2Hz，1H)，6.27(m，1H)，6.84(d，J＝8.8Hz，2H)，7.11(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(m，1H)，7.92(d，J＝8.4Hz，2H)，8.03(d，J＝8.4Hz，2H)。
实施例5-3b：4N-(4-乙氧基芐基)-1-(呋喃-2-基)甲胺：
在室温下，将甲醇(50mL)、三甲基原甲酸酯(10mL)和AcOH(1mL)的混合物中的4-乙氧基苯甲醛(5g，33mmol)和糠胺(4.2g，43mmoL)在氮气气氛下搅拌16小时。在30分钟内分4份加入硼氢化钠(1.4g，35mmol)(放热反应)。在室温下将反应搅拌额外的2小时。真空除去溶剂，且将残留物溶解于乙酸乙酯(150mL)。有机相用H2O(200mL)洗涤，且水相用乙酸乙酯(2x，100mL)反萃取。将合并的有机层浓缩，且残留物在硅胶(具有～0.5％三乙胺的70％乙酸乙酯于己烷中)上纯化以获得澄清油状N-(4-乙氧基苄基)-1-(呋喃-2-基)甲胺(6.1g，80％)。NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.40(t，J＝7.2Hz，3H)，3.71(s，2H)，3.76(s，2H)，4.02(q，J＝7.2Hz，2H)，6.17(d，J＝4Hz，1H)，6.31(m，1H)，6.84(d，J＝8.8Hz，2H)，7.23(d，J＝8.8Hz，2H)，7.36(m，1H)。
实施例5-4：4-(N-乙基-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
将4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸(实施例5-1b)(160mg，0.5mmol)和碳酸铯(325mg，1mmol)置于微波瓶，并溶解于2mL DMF。将碘乙烷(155mg，1mmol)加入到反应混合物。将反应置于微波反应器，并在165℃下加热5分钟。将反应混合物溶解于乙酸乙酯，并用水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，并真空蒸发。将粗产物溶解于4/16N NaOH(水溶液)/四氢呋喃(3mL)的溶液，并在室温下搅拌6小时。溶液用3N HCl(水溶液)酸化至pH～3，且产物用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，并真空浓缩。将残留物溶解于甲醇(3mL)，并通过反相HPLC(5-95％乙腈于H2O中的梯度：25分钟)纯化。已知化合物以20μM的IC50抑制hT2R14。收率35％。MS M+H计算值350.11，实测值350.0。
化合物具有10μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-5：4-(N-苄基-N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸
将4-(N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸(实施例5-2b)(140mg，0.5mmol)和碳酸铯(325mg，1mmol)置于微波瓶中，并溶解于2mL DMF。将(溴甲基)苯(170mg，1mmol)加入到反应混合物。将反应置于微波反应器中，并在165℃下加热5分钟。将反应混合物溶解于乙酸乙酯，并用水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，并真空蒸发。将粗产物溶解于4/16N NaOH(水溶液)/四氢呋喃的溶液(3mL)，并在室温下搅拌6小时。溶液用3N HCI(水溶液)酸化至pH～3，且产物用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫 酸钠干燥，并真空浓缩。将残留物溶解于甲醇(3mL)，并通过反相HPLC(5-95％乙腈于H2O中的梯度：25分钟)纯化。收率35％。MS M+H计算值372.4，实测值372.0。
化合物具有4.6μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-6：4-(N-(呋喃-2-基甲基)-N-(3-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-5由1-(溴甲基)-3-甲氧基苯和4-(N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸(实施例5-2b)制备。收率35％。MS M+H计算值402.3，实测值402.0。
化合物具有10μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-7：4-(N-(呋喃-2-基甲基)-N-(2-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-5由1-(溴甲基)-2-甲氧基苯和4-(N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸(实施例5-2b)制备。收率35％。MS M+H计算值402.3，实测值402.0。
化合物具有12μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-8：4-(N-(4-丙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸
80℃下，将4-氰基-N-(4-丙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)苯磺酰胺(实施例5-8a)(300mg，0.8mmol)在二噁烷/1.5N NaOH水溶液(100mL)的1/1混合物中搅拌16小时。将混合物冷却，用1N HCl水溶液(100mL)酸化，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。固体用乙酸乙酯/己烷(～1/9)研磨，并通过过滤收集以获得白色固体4-(N-(4-丙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)氨磺酰基)苯甲酸(165mg，63％)。NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ0.94(t，J＝7.6Hz，3H)，1.70(m，J＝6.8Hz，2H)，3.87(t，J＝6.4Hz，2H)，4.23(s，2H)，4.27(s，2H)，6.13(d，J＝2.8Hz，1H)，6.27(m，1H)，6.84(d，J＝6.8Hz，2H)，7.11(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(m，1H)，7.87(d，J＝6.8Hz，2H)，8.05(d，J＝6.8Hz，2H)，13.45(bs，1H)。
化合物具有2.5μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-8a：4-氰基-N-(4-丙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)苯磺酰胺：
将4-氰基苯-1-磺酰氯(600mg，2.9mmol)加入到搅拌的N-(4-丙氧基苄基)-1-(呋喃-2-基)甲胺(实施例5-8b)(685mg，2.9mmol)和三乙胺(455mg，4.5mmol)的DCM(100mL)溶液中，并将反应搅拌2小时。反应用H2O(200mL)稀释，并用DCM(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过硅胶色谱(10％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得灰白色固体4-氰基-N-(4-丙氧基苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)苯磺酰胺(500mg，50％)。NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ0.95(t，J＝7.2Hz，3H)，1.70(m，J＝6.4Hz，2H)，3.88(t，J＝6.4Hz，2H)，4.25(s，2H)，4.28(s，2H)，6.15(d，J＝3.2Hz，1H)，6.27(m，1H)，6.84(d，J＝6.8Hz，2H)，7.11(d，J＝8.8Hz，2H)，7.39(m，1H)，7.93(d，J＝6.4Hz，2H)，8.01(d，J＝6.4Hz，2H)。
实施例5-8b：4N-(4-丙氧基苄基)-1-(呋喃-2-基)甲胺：
在室温下，将甲醇(50mL)、三甲基原甲酸酯(10mL)和AcOH(～1mL)的混合物中的4-丙氧基苯甲醛(5g，31mmol)和糠胺(3.9g，40mmol)在氮气气氛下搅拌16小时。在30分钟内分4份加入硼氢化钠(1.4g，35mmol)(放热反应)。在室温下将反应搅拌额外的2小时。在旋转蒸发仪上除去溶剂，且将残留物溶解于乙酸乙酯(150mL)。有机相用H2O(200mL)洗涤，且水相用乙酸乙酯(2x，100mL)反萃取。将合并的有机层浓缩，且残留物在硅胶(具有～2％三乙胺的70％乙酸乙酯于己烷中)上纯化以获得黄色油状N-(4-丙氧基苄基)-1-(呋喃-2-基)甲胺(5.3g，75％)。NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.03(t，J＝7.2Hz，3H)，1.79(m，J＝6.4Hz，2H)，3.71(s，2H)，3.76(s，2H)，3.90(t，J＝6.8Hz，2H)，6.17(d，J＝3.2Hz，1H)，6.32(m，1H)，6.85(d，J＝8.4Hz，2H)，7.22(d，J＝8.8Hz，2H)，7.37(m，1H)。
其他的化合物被实验地测试，并发现其作为hT2R14苦味受体的抑制剂具有相对高水平的效力。该测试的结果显示于以下表B中。
表B
实施例5-10：4-(N-(4-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
将4-(N-(4-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10a)(3.7g，8.3mmol)溶解于MeOH/THF(1∶1.5，30mL)，并用NaOH水溶液(3N，15mL)处理。混合物在室温下搅拌过夜，然后真空除去MeOH和THF。产生的水溶液用6N HCl水溶液酸化至pH～3，并用EtOAc(3x40mL)萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并浓缩。粗产物通过在EtOH中重结晶来纯化以获得白色结晶固体纯4-(N-(4-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸(2.1g，58.6％)。MS(M-H，428.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.66(s，3H)，4.23(s，2H)，4.26(s，2H)，6.72(d，2H，J＝8Hz)，6.95(m，6H)，7.92(d，2H J＝8Hz)，8.07(d，2H，J＝8Hz)。化合物具有1.97μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-10a：4-(N-(4-氟芐基)-N-(4-甲氧基芐基)氨磺酰基)-苯甲酸甲酯
将4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)(4.3g，12.8mmol)溶解于丙酮(70mL)。加入碳酸铯(8.57g，25.6mmol)和4-氟苄基溴(1.76mL，14.08mmol)，并且混合物在室温下搅拌过夜。滤出无机盐，并且真空除去丙酮。将残留物再次溶解于乙酸乙酯，用水和盐水洗涤，然后有机层用硫酸镁干燥，并浓缩。粗产物用乙酸乙酯/己烷重结晶来纯化，以获得白色固体纯4-(N-(4-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(3.7g，65％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ，ppm：3.77(s，3H)，3.98(s，3H)，4.27(s，2H)，4.28(s，2H)，6.74(d，2H，J＝8Hz)，6.92(m，4H)，7.03(m，2H)，7.88(d，2H J＝8Hz)，8.16(d，2H，J＝8Hz)。
实施例5-10b：4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯.
将(4-甲氧基苯基)甲胺(2.56mL，19.65mmol)和三乙胺(2.38mL，17.1 mmol)加入到在0℃的冰浴中的4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10c)(4g，17.09mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液。然后，移出冰浴，并使得混合物升至室温，且搅拌额外的2小时。当完成时(通过TLC40％乙酸乙酯/己烷监测)，真空除去溶剂。残留物再次溶解于乙酸乙酯(200mL)，用1NHCl(水溶液，20mL)、水(20mL)和盐水(20mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥。将溶液浓缩，且产物通过用热乙酸乙酯/己烷重结晶来纯化，以获得白色固体纯4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(4.3g，74.8％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.67(s，3H)，3.78(s，3H)，3.93(s，2H)，6.78(m，2H)，7.09(m，2H)，7.87(m，2H)，8.08(m，2H)，8.25(br，s，1H)。
实施例5-10c：4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯
将在二氯乙烷(10mL)中的4-氯磺酰基苯甲酸(5g，23mmol)和亚硫酰氯(，20mL)加热至80℃，持续2小时。反应混合物经旋转蒸发浓缩以获得棕色固体。固体在冰上冷却5分钟，并加入冰冷的甲醇(40mL)，并在0℃下搅拌5分钟。使得反应混合物升至室温，并搅拌额外的10分钟。加入冰冷的水(40mL)产生白色固体，其通过过滤收集，并真空干燥以获得纯4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(4.5g，84％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.84(s，3H)，7.70(d，2H，J＝8.4Hz)，7.93(d，2H，J＝8.4Hz)。
实施例5-11：4-((N-苄基-4-甲基苯基磺酰氨基)甲基)环己烷-羧酸
将HCl(10ml，36％水溶液)加入到4-(氨基甲基)环己烷羧酸(1.57g，10mmol)的100ml2，2-二甲氧基丙烷的悬浮液中。将混合物在室温下搅拌18小时，然后浓缩。将残留物溶解于最小体积的MeOH，并加入乙醚以沉淀出灰白色固体4-(氨基甲基)环己烷羧酸甲酯盐酸盐。这一物质未经进一步纯化或表征而使用。
将三乙胺(360uL，2.58mmol)和4-甲基苯-1-磺酰氯(190mg，1mmol)加入到在0℃的冰浴中的4-(氨基甲基)环己烷羧酸甲酯的盐酸盐(208mg，1mmol)在5mL二氯甲烷中的混合物中。使得冰浴缓慢升至室温，并搅拌过夜。真空除去溶剂。残留物再次溶解于乙酸乙酯(20mL)，用1N HCl(5mL)、水(5mL)和盐水(5mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥并浓缩。将这一粗产物(162mg，0.5mmol)再次溶解于丙酮(5mL)，并用碳酸钾(110mg，0.79mmol)和(4-氟苯基)甲胺(1.76mL，14.08mmol)处理。80℃下，混合物在压力容器中搅拌过夜，然后冷却，并滤出无机盐。真空除去丙酮，且残留物再次溶解于乙酸乙酯，并用水，随后用盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，并浓缩。将粗产物(162mg，0.4mmol)溶解于MeOH/THF(1∶1.5，10mL)，并用NaOH水溶液(10N，400uL)处理。100℃下，将混合物在微波中搅拌20分钟，然后真空除去MeOH和THF。残留物用6N HCl水溶液酸化至pH～3，并用EtOAc萃取；合并的有机层用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并浓缩。粗产物通过在EtOH中重结晶来纯化，以获得白色固体纯4-((N-苄基-4-甲基苯基磺酰氨基)甲基)环己烷羧酸(120mg，74％)。MS(M+H，402)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：0.68(m，2H))，0.91(m，2H)，1.06(br，s，1H)，1.50(d，2H)，1.72(d，2H)，2.0(1H)，2.41(s，3H)，2.86(m，2H)，4.21(s，2H)，7.30(m，5H)，7.43(m，2H)，7.73(m，2H)，11.97(br，s，1H)。
化合物具有0.014μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-12：4-(N-(3-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
将4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)(500mg，1.49mmol)、3-氟苄基溴(280mg，2.98mmol)和碳酸铯(971mg，2.98mmol)置于DMF(12mL)中，并90℃下搅拌4小时。将溶液冷却至室温，用H2O (200mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，100mL)萃取。合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。残留物通过硅胶色谱(10-20％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得白色固体4-(N-(3-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(528mg，80％)。
将4-(N-(3-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(500mg，1.12mmol)溶解于MeOH/THF(1∶1，40mL)，并用NaOH水溶液(10N，8ml)处理。将混合物在室温下搅拌过夜，然后通过旋转蒸发除去MeOH和THF。产生的水溶液用EtOAc(10mL)洗涤，并用6N HCI水溶液(～15mL)酸化至pH～4。水溶液用EtOAc(3x，40mL)萃取，且合并的有机层用水、盐水洗涤，用MgSO4干燥，并浓缩。粗产物通过在EtOH中重结晶来纯化，以获得白色结晶固体标题化合物4-(N-(3-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸(150mg)，收率30％。
MS(M-H，428.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.65(s，3H)，4.27(s，2H)，4.29(s，2H)，6.75-7.00(m，7H)，7.20(m，1H)，7.95(d，2H，J＝8Hz)；8.10(d，2H，J＝8Hz)。
实施例5-13：4-(N-苄基-N-(2，4-二甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由(2，4-二甲氧基苯基)甲胺、4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10c)和苄基溴制备。MS(M-H，440.10)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.50(s，63H)，3.66(s，3H)，4.20(s，2H)，4.34(s，2H)，6.29(s，1H)，6.33(d，J＝8.0Hz，1H)，6.91(d，J＝808Hz，1H)，7.12-7.23(m，5H)，7.80(d，J＝8.0Hz，2H)，8.01(d，J＝8.4Hz，2H)，13.49(s，1H)。
实施例5-14：4-(N-(3-氯苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和1-(溴甲基)-3-氯苯制备。MS(M-H，444.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.69(s，3H)，4.30(m，4H)，6.76-7.24(m，8H)，7.99(m，2H)，8.13(m，2H)。
化合物具有1.88μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-15：4-(N-苄基-N-(2，4，6-三甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由(2，4，6-三甲氧基苯基)甲胺、4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10c)和苄基溴制备。MS(M-H，470.10)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.45(s，6H)，3.69(s，3H)，4.26(s，2H)，4.28(s，2H)，5.98(s，2H)，7.11-7.26(m，5H)，7.82(d，J＝8.0Hz，2H)，8.07(d，J＝8Hz，2H)，13.49(s，1H)。元素分析(实测值，％)：C61.05；H5.49；N2.98；(计算值，％)：C61.13；H5.34和N2.97
化合物具有10.76μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-16：4-((N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)甲基)苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和苄基溴制备。MS(M-H，424.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.72(s，3H)，4.18(d，2H)，4.55(s，2H)，6.83(m，2H)，7.12(m，2H)，7.21(m，2H)，7.28(m，3H)，7.43(m，2H)，7.93(m，2H)。
实施例5-17：4-(N-(4-甲氧基苄基)-N-丙基氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和正丙基溴制备。MS(M-H，362.1)；1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ，ppm：0.70(m，3H)，1.35(m，3H)，3.08(m，2H)，3.73(s，3H)，4.31(s，2H)，6.83(m，2H)，7.17(m，2H)，7.93(m，2H)，8.23(m，2H)。
化合物具有3.75μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-18：4-(N-(4-甲氧基苄基)-N-苯基氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由苯胺、4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10c)和1-(氯甲基)-4-甲氧基苯制备。MS(M-H，396.1)；1H NMR(400MHz， DMSO-d6)：δ，ppm：3.66(s，3H)，4.73(s，2H)，6.78(d，J＝8.4Hz，2H)，7，00(d，J＝7.6Hz，2H)，7.12(d，J＝8.0Hz，2H)，7.24(d，J＝8.0Hz，2H)，8.11(d，J＝8.4Hz，2H)，13.49(s，1H)。
实施例5-19：4-(N-(4-甲氧基苄基)-N-苯乙基氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由2-苯基乙胺、4-(氯磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-10c)和1-(氯甲基)-4-甲氧基苯制备。MS(M-H，424.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：2.51(m，2H)，3.23(m，2H)，3.74(s，3H)，4.31(s，2H)，4.31(s，2H)，6.92(m，2H)，6.98(m，2H)，7.20-7.27(m，5H)，7.85(m，2H)，8.06(m，2H)。
化合物具有4.58μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-20：4-((N-(4-氟苄基)-4-甲基苯基磺酰氨基)甲基)-环己烷羧酸
按照实施例5-11由1-(溴甲基)-4-氟苯、4-(氨基甲基)环己烷羧酸和4-甲基苯-1-磺酰氯制备。MS(M+H，420)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：0.71(m，2H))，0.95(m，2H)，1.15(br，s，1H)，1.51(d，2H)，1.76(d，2H)，2.0(1H)，2.40(s，3H)，2.85(m，2H)，4.22(s，2H)，7.14(m，2H)，7.32(m，2H)，7.40(m，2H)，7.69(m，2H)，11.93(br，s，1H)。
化合物具有0.083μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-21：4-((4-乙酰氨基-N-苄基苯基磺酰氨基)甲基)-环己烷羧酸
按照实施例5-11由乙酰氨基苯-1-磺酰氯、4-(氨基甲基)环己烷羧酸和苄基溴制备。MS(M+H，445.2)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：0.65(m，2H)，0.68(m，2H)，1.05(m，1H)，1.48(m，2H)，1.70(m，2H)，1.92(m，1H)，2.00(s，3H)，2.82(s，2H)，4.21(s，2H)，7.27(m，5H)，7.76(m，4H)，7.62(m，2H)，10.1(s，1H)，11.93(br，s，1H)。
化合物具有1.619μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-22：4-((N-(4-氟苄基)苯基磺酰氨基)甲基)-环己烷羧酸
按照实施例5-11由苯磺酰氯、4-(氨基甲基)-环己烷羧酸和1-(溴甲基)-4-氟苯制备。MS(M+H，406)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：0.77(m，2H)，0.94(m，2H)，0.98(m，2H)，1.50(m，2H0，1.75(m，2H)，1.77(m，1H)，2.80(d，2H)，4.28(s，2H)，7.20(m，2H)，7.38(m，2H)，7.62(m，2H)，7.70(m，1H)，7.88(m，2H)，11.93(br，s，1H)。
化合物具有0.240μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-23：4-(N-(环己基甲基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和环己基甲胺制备。MS(M-H，416.1)：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：0.63(m，2H)，0.87(m，3H)，0.94(m，1H)，1.25-1.52(m，5H)，1.70(m，2H)，2.86(m，2H)，3.70(s，3H)，4.22(s，2H)，6.84(m，2H)，7.16(m，2H)，7.91(m，2H)，7.62(m，2H)，8.09(m，2H)。
化合物具有3.47μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-24：4-((N-(4-氟苄基)-1-苯基甲基磺酰氨基)甲基)-环己烷羧酸
按照实施例5-10由苯基甲磺酰氯和4-(氨基甲基)环己烷羧酸甲酯和1-(溴甲基)-4-氟苯制备。MS(M-H，418)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：0.639(m，2H)，0.897(m，2H)，1.034(m，1H)，1.467(d，宽峰，2H，J＝11.2Hz)，1.709(d，宽峰，2H，J＝11.2Hz)，1.961(m，1H)，2.828(d，2H，J＝7.6Hz)，4.207(s，2H)，4.449(s，2H)，7.155(t，2H，J＝9.2Hz)，7.377(m，7H)，12(s，宽峰，1H)
化合物具有9.57μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-25：4-(N-(2-氰基苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和α-溴-邻甲苯基腈制备。MS(M-H，435.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.664(s，2H)，4.348(s，2H)，4.498(s，2H)，6.728(d，2H，J＝8.4Hz)，7.036(d，2H，j＝8.4Hz)，7.352(t，2H，J＝9.2Hz)，7.548(t，1H，J＝7.6Hz)，7.640(d，1H，J＝7.6Hz)，8.003(d，2H，J＝8Hz)，8.139(d，2H，J＝8.4Hz)，13.559(s，宽峰，1H)。
化合物具有4.61μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-26：4-(N-(4-乙酰氨基苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和N-(4-(氯甲基)苯基)乙酰胺制备。MS(M-H，467.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：2.0(s，3H)，3.69s，3H)，4.23(s，4H)，6.78(d，2H，J＝7.6Hz)，6.98(m，4H)，7.41(d，2H，J＝8Hz)，7.94(d，2H，J＝8Hz)，8.09(d，2H，J＝8Hz)，9.90(s，1H)。
实施例5-27：4-(N-(呋喃-3-基甲基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
将110mg1-(呋喃-3-基)-N-(4-甲氧基苄基)甲胺(实施例5-27a)与4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10c)(117mg，0.5mmol)和三乙胺(100uL)在DCM(5mL)中混合。将混合物在室温下搅拌过夜，并浓缩。将残留物再次溶解于乙酸乙酯(20mL)，用1N HCl(水溶液，2mL)，随后用水(5mL)和盐水(5mL)洗涤，然后用硫酸镁干燥。粗产物通过制备型TLC(40％乙酸乙酯/己烷)纯化以获得白色固体4-(N-(呋喃-3-基甲基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯。按照实施例5-10皂化获得白色结晶固体4-(N-(呋喃-3-基甲基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸(68mg，收率64％)。MS(M-H，400.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.72(s，3H)，4.13(s，2H)，4.26(s，2H)，5.99(s，1H)，6.87(m，4H)，6.87(d，2H，J＝8.8Hz)，7.13(d，2H，J＝8.8Hz)，7.39(s，1H)，7.49(s，1H)，7.95(d，2H，J＝8.4Hz)，8.09(d，2H，J＝8.8Hz)。
实施例5-27a：1-(呋喃-3-基)-N-(4-甲氧基苄基)甲胺
3-糠醛(5mmol，437μL)和(4-甲氧基苯基)甲胺在MeOH(20mL)中的混合物在室温下搅拌过夜，然后缓慢加入硼氢化钠(300mg，7.89mmol)。产生的混合物在室温下搅拌15分钟，并用NaOH(1N，水溶液)淬灭。真空除去甲醇，且将产生的浆状物再次溶解于乙酸乙酯，然后用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。通过硅胶色谱(乙酸乙酯∶己烷7∶3)的纯化获得油状1-(呋喃-3-基)-N-(4-甲氧基苄基)甲胺。MS(M+H，218.10)；1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ，ppm：3.64(s，2H)，3.74(s，2H)，3.80(s，3H)，6.39(m，1H)，6.86(m，1H)，6.88(m，1H)，7.23(m，1H)，7.25(m，1H)，7.35(m，1H)，7.38(m，1H)。
实施例5-28：4-(N，N-二苄基氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-27由二苄基胺和4-(氯磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-10c)制备。MS(M-H，380.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：4.52(s，4H)，7.10(m，4H)，7.25(m，6H)，8.00(d，2H，J＝8.4Hz)，8.15(d，2H J＝8.4Hz)，13.5(s，宽峰，1H)。
化合物具有7.74μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-29：4-(N-(4-甲氧基苄基)-N-甲基氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-27由1-(4-甲氧基苯基)-N-甲基甲胺和4-(氯磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-10c)制备。MS(M-H，335.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：2.51(s，3H)，3.71(s，3H)，4.05(s，2H)，6.88(d，2H)，7.18(d，2H)，7.91(d，2H)；8.13(d，2H)。元素分析：(实测值)：C57.47％，H4.77％且N4.31％；(理论值)：C57.30％，H5.11％且N4.18％
实施例5-30：4-(N，N-双(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-27由双(4-甲氧基苄基)胺和4-(氯磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-10c)制备。MS(M-H，440.1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.68(s，6H)，4.20(s，4H)，6.77(d，4H，J＝10Hz)，6.98(d，4H，J＝10Hz)，7.92(dd，2H J＝8Hz)，8.06(dd，2H，J＝8Hz)。元素分析：(实测值)：C62.45％，H5.19％且N3.06％；(理论值)：C62.57％，H5.25％且N3.17％
化合物具有4.14μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-31：4-(N-(2-氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和1-(溴甲基)-2-氟苯制备。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.66(s，3H)，4.29(s，2H)，4.37(s，2H)，6.72(d，2H，J＝8Hz)，7.01-7.03(m，6H)，7.93(d，2H，J＝8Hz)，8.08(d，2H，J＝8Hz)。
实施例5-32：4-(N-(2，5-二氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和2-(溴甲基)-1，4-二氟苯制备。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.66(s，3H)，4.31(s，2H)，4.33(s，2H)，6.74-7.06(m，7H)，7.95(d，2H， J＝8Hz)，8.09(d，2H，J＝8Hz)。
实施例5-33：4-(N-(2，3-二氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和1-(溴甲基)-2，3-二氟苯制备。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.30(s，3H)，4.29(s，2H)，4.32(s，2H)，，6.87(d，2H，J＝8Hz)，7.02-7.20(m，5H)，7.95(d，2H，J＝8Hz)。8.05(d，2H，J＝8Hz)。
实施例5-34：4-(N-(3-甲氧基苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)和3-甲氧基苄基溴制备。MS(M-H，440.50)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.58(s，3H)，3.68(s，3H)，4.24(s，2H)，4.25(s，2H)，6.50(s，1H)，6.64(d，J＝4Hz，1H)，6.73(m，1H)，6.77(d，J＝8Hz，2H)，7.00(d，J＝8Hz，2H)，7.12(t，J＝8Hz，1H)，7.94(d，J＝8Hz，2H)，8.09(d，J＝8Hz，2H)，13.49(s，1H)。
化合物具有2.46μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-35：4-(N-苄基-N-(4-甲氧基苯基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由4-(N-(4-甲氧基苯基)氨磺酰基)-苯甲酸甲酯(实施例5-35a)和苄基溴制备。MS(M-H，396)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.66(s，3H)，4.75(s，2H)，6.76(d，J＝8Hz，2H)，6.90(d，J＝8Hz，2H)，7.23(m，5H)，7.74(d，J＝8Hz，2H)，8.11(d，J＝8Hz，2H)，13.51(s，1H)。
实施例5-35a：4-(N-(4-甲氧基苯基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯
将4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(1.00g，4.28mmol)加入到在二氯甲烷(10mL)中的4-甲氧基苯胺(580mg，4.71mmol)和三乙胺(1.48mL，10.7mmol)。这一混合物在室温下搅拌16小时。反应用二氯甲烷(50mL)稀释，并用水、10％柠檬酸和盐水依次洗涤。有机物用硫酸钠干燥，并经旋转蒸发仪浓缩。产生的粗物质在硅胶上使用100％二氯甲烷作为洗脱剂色谱分离，获得白色结晶固体4-(N-(4-甲氧基苯基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(400mg，30％收率)。
实施例5-36：4-(N-(3，4-二氟苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由N-(3，4-二氟苄基)(4-甲氧基苯基)-甲胺(实施例5-36a)和4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10c)制备。MS(M-H，446)； 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δppm：3.69(s，3H)，4.20(s，4H)，6.73(d，J＝8.8Hz，2H)，6.93(m，2H)，6.98(d，J＝8.8Hz，2H)，7.22(m，1H)，7.74(d，J＝8.4Hz，2H)，7.99(d，J＝8.4Hz，2H)。
实施例5-36a：N-(3，4-二氟苄基)(4-甲氧基苯基)甲胺
将3，4-二氟苯甲醛(1.0m，9.08mmol)加入到在二氯甲烷(15mL)中的(4-甲氧基苯基)甲胺(1.77mL，13.6mmol)和乙酸(2.7mL，45mmol)。在100℃下，这一混合物在微波中加热15分钟。将反应冷却至室温，并分批加入大孔氰基硼氢化物树脂(9.8g，22.7mmol)。将这一混合物在室温下搅拌16小时。滤掉树脂，并用二氯甲烷淋洗，且有机物用饱和碳酸氢钠洗涤，直到鼓泡停止。有机物用硫酸钠干燥，并经旋转蒸发仪浓缩。产生的粗物质通过硅胶色谱使用甲醇二氯甲烷梯度作为洗脱剂纯化以获得淡黄色油状N-(3，4-二氟苄基)(4-甲氧基苯基)甲胺(1.9g，80％收率)。MS(M+H，264)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：2.63(br s，1H)，3.56(s，2H)，3.61(s，2H)，3.71(s，3H)，6.84(d，J＝8.8Hz，2H)，7.14(m，1H)，7.21(d，J＝8.4Hz，2H)，7.34(m，2H)。
实施例5-37：4-((N-(4-氟苄基)-4-甲基苯基磺酰氨基)甲基)苯甲酸
按照实施例5-11由4-(氨基甲基)苯基羧酸、4-甲基苯-1-磺酰氯和4-氟苄基溴制备.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.11(s，3H)，4.21(s，2H)，4.24(s，2H)，6.94-7.08(m，6H)，7.40-7.42(d，2H，J＝8Hz)，7.63(d，2H，J＝8Hz)。7.73(d，2H，J＝8Hz)
化合物具有0.054μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-38：4-((4-羧基-N-(4-甲氧基苄基)苯基磺酰氨基)甲基)-苯甲酸
按照实施例5-10由4-(溴甲基)苯甲酸甲酯和4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)制备。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.65(s，3H)，4.24(s，2H)，4.33(s，2H)，6.71(d，2H，J＝8Hz)，6.95(d，2H，J＝8Hz)，7.14(d，2H，J＝8Hz)。7.73(d，2H，J＝8Hz)，7.89(d，2H，J＝8Hz)，8.06(d，2H，J＝8Hz)。
实施例5-39：4-(N-苄基-N-(3，4-二甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由(3，4-二甲氧基苯基)甲胺、4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10c)和苄基氯制备。MS(M-H，440.10)；1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ，ppm：3.59(s，3H)，3.76(s，3H)，4.30(s，2H)，4.36(s，2H)，6.51(d，1H，J＝1.7Hz)，6.60(m，1H)，6.76(d，1H，J＝8.2Hz)，7.12(m，2H)，7.21(m，3H)，7.95(d，2H，J＝8.6Hz)，8.18(d，2H，J＝8.6Hz)。
化合物具有0.678μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-40：4-(N-(3，4-二甲氧基苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸
按照实施例5-10由(3，4-二甲氧基苯基)甲胺、4-(氯磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10c)和4-甲氧基苄基溴制备。MS(M-H，470.10)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.49(s，3H)，3.67(s，3H)，3.68(s，3H)，4.20(s，2H)，4.22(s，2H)，6.41(d，1H，J＝1.4Hz)，6.58(dd，1H，J1＝8.2Hz，J2＝1.4Hz)，6.78(m，3H)，7.02(d，2H，J＝8.6Hz)，7.94(d，2H，J＝8.4Hz)，8.09(d，2H，J＝8.4Hz)。
化合物具有1.47μM对hT2R14苦味受体的IC50
实施例5-41：4-(N-(3-氟-4-甲氧基苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸
按照实施例5-10由4-(溴甲基)-2-氟-1-甲氧基苯和4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)制备。MS(M-H，458.10)；1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ，ppm：3.73(s，3H)，3.80(s，3H)，4.24(s，2H)，4.28(s，2H)，6.75(m，4H)，6.88(m，1H)，6.97(d，2H，J＝8.6Hz)，7.88(d，2H，J＝8.3Hz)，8.14(d，2H，J＝8.3Hz)。
化合物具有1.11μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例5-42：4-((4-羟基-N-(2-甲氧基苄基)苯基磺酰氨基)甲基)-苯甲酸
4-(N-(2-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯基乙酸酯(实施例5-42a)(50mg，0.15mmol)溶解于丙酮(1.0mL)，随后加入碳酸铯(97mg，0.30mmol)和4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(38mg，0.17mmol)。混合物在室温下搅拌过夜，然后滤掉无机盐。真空除去丙酮，且残留物再次溶解于乙酸乙酯，并用水，随后用盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，并浓缩。粗产物通过柱色谱用乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂纯化以获得4-((4-乙酰氧基-N-(2-甲氧基苄基)苯基磺酰氨基)甲基)苯甲酸甲酯。
将4-((4-乙酰氧基-N-(2-甲氧基苄基)苯基磺酰氨基)甲基)苯甲酸甲酯(粗制)溶解于THF(1.0mL)，并用NaOH水溶液(1N，2.0mL，2.0mmol)处理。将混合物回流1小时。当完成时，真空除去THF，且产生的水溶液用6N HCl水溶液酸化至pH～3。水相用EtOAc(2x15mL)萃取，且合并的有机层用水、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。粗产物通过反相HPLC纯化以获得10.8mg标题化合物(15％两步总收率)。MS(M-H，426.1)；1H NMR(400MHz，丙酮-d6)：δ，ppm：3.65(s，3H)，4.37(s，2H)，4.43(s，2H)，6.79(m，2H)，7.01(d，2H，J＝8.0Hz)，7.17(m，2H)，7.28(d，2H，J＝7.9Hz)，7.73(d，2H，J＝8.0Hz)，7.87(d，2H，J＝7.9Hz)。
化合物具有2.56μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例5-42a：4-(N-(2-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯基乙酸酯
将4-(氯磺酰基)苯基乙酸酯(实施例5-42b)(531mg，2.265mmol)的5.0mL二氯甲烷溶液在冰浴中冷却至0℃。加入(2-甲氧基苯基)甲胺(325μL，2.492mmol)和三乙胺(347μL，2.492mmol)。然后，移出冰浴，并将混合物 升至室温，并搅拌2小时。将反应混合物浓缩，且粗产物通过柱色谱(己烷/乙酸乙酯＝90/10至30/70)纯化以获得白色固体纯4-(N-(2-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯基乙酸酯(743mg，89％)。MS(M+H，336.1)1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ，ppm：2.32(s，3H)，3.71(s，3H)，4.18(d，2H，J＝5.8Hz)，5.15(t，1H，J＝5.8Hz)，6.71(d，1H，J＝8.2Hz)，6.82(br t，1H，J＝7.4Hz)，7.07(br d，1H，J＝7.4Hz)，7.10(d，2H，J＝8.7Hz)，7.19(br t，1H，J＝7.8Hz)，7.74(d，2H，J＝8.7Hz)。
实施例5-42b：4-(氯磺酰基)苯基乙酸酯
将6.285g(36.08mmol)4-羟基苯磺酸溶解于30mL乙酸酐和15mL乙酸的混合物，并回流6小时。蒸发挥发物，并置于高真空下过夜。将产生的粗产物溶解于100mL DCM，并用4.72mL草酰氯(54.12mmol)和139μLDMF(1.804mmol)在0℃下处理。继续搅拌，直至气体生成停止，然后将反应浓缩，并再次溶解于EtOAc。有机层用2N H2SO4洗涤2次，并且用盐水和MgSO4干燥。浓缩获得7.067g深色粘稠油状4-(氯磺酰基)苯基乙酸酯，其最终固化(83％两步总收率)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ，ppm：2.35(s，3H)，7.37(d，2H，J＝8.9Hz)，8.06(d，2H，J＝8.9Hz)。13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ，ppm：21.13，123.05，128.91，141.15，155.80，168.29。
实施例5-43：4-((4-羟基-N-(3-甲氧基苄基)苯基磺酰氨基)甲基)-苯甲酸
按照实施例5-42由(3-甲氧基苯基)甲胺和4-(溴甲基)苯甲酸甲酯制备。MS(M-H，426.10)；1H NMR(400MHz，丙酮-d6)：δ，ppm：3.66(s，3H)，4.32(s，2H)，4.40(s，2H)，6.65(brs，1H)，6.73(m，2H)，7.05(d，2H，J＝8.5Hz)， 7.12(t，1H，J＝8.0Hz)，7.27(d，2H，J＝8.0Hz)，7.82(d，2H，J＝8.5Hz)，7.88(d，2H，J＝8.0Hz)。
化合物具有0.188μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例5-44：4-((4-羟基-N-(4-甲氧基苄基)苯基磺酰氨基)甲基)-苯甲酸
按照实施例5-42由(4-甲氧基苯基)甲胺和4-(溴甲基)苯甲酸甲酯制备。MS(M-H，426.10)；1H NMR(400MHz，丙酮-d6)：δ，ppm：3.73(s，3H)，4.27(s，2H)，4.35(s，2H)，6.76(d，2H，J＝8.0Hz)，7.04(d，4H)，7.24(d，2H，J＝7.8Hz)，7.79(d，2H，J＝8.2Hz)，7.88(d，2H，J＝7.8Hz)。
化合物具有3.43μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例5-45：4-((N-(3-氟苄基)-4-羟基苯基磺酰氨基)甲基)苯甲酸
按照实施例5-42由(3-氟苯基)甲胺和4-(溴甲基)苯甲酸甲酯制备。MS(M-H，414.1)，1H NMR(400MHz，丙酮-d6)：δ，ppm：4.37(s，2H)，4.42(s，2H)，6.94(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.3Hz)，7.21(m，1H)，7.28(d，2H，J＝7.6Hz)，7.81(d，2H，J＝8.3Hz)，7.87(d，2H，J＝7.6Hz)。
化合物具有0.459μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例5-46：N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)-4-(1H-四唑-5-基)苯-磺酰胺
将N-苄基-4-氰基-N-(4-甲氧基苄基)苯磺酰胺(实施例5-46a，400mg，1mmol)和三甲基叠氮化锡(400mg，2mmol)溶解于甲苯(10mL)，并在150℃下微波辐射3小时。加入另外2当量的三甲基叠氮化锡，并将反应在150℃下微波辐射另外的3小时。将混合物冷却，并过滤以获得粗四唑锡(tin tetrazole)，其在MEOH/浓HCl(50mL∶20mL)中水解。加入水，并通过过滤收集产生的沉淀。产物用无水乙醇和水重结晶以获得白色固体N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)-4-(1H-四唑-5-基)苯-磺酰胺。MS(M+H，436.10)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.65(s，3H)，4.27(s，2H)，4.30(s，2H)，6.75(d，J＝8.4Hz，2H)，6.98(d，J＝8.4Hz，2H)，7.08(m，2H)，7.20(m，3H)，8.05(d，J＝8.4Hz，2H)，8.22(d，J＝9.2Hz，2H)。
化合物具有3.67μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例5-46a：N-苄基-4-氰基-N-(4-甲氧基苄基)苯磺酰胺。
将4-氰基苯-1-磺酰氯(600mg，3mmol)加入到N-苄基-1-(4-甲氧基苯基)甲胺(实施例5-46b，750mg，3.3mmol)和三乙胺(500mg，3.6mmol)的二氯甲烷(15mL)溶液中。反应在室温下搅拌4小时，然后在旋转蒸发仪上浓缩。粗产物在硅胶上纯化以获得白色固体N-苄基-4-氰基-N-(4-甲氧基苄基)苯-磺酰胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.68(s，3H)，4.26(s，2H)，4.31(s，2H)，6.75(d，J＝8.4Hz，2H)，6.97(d，J＝9.2Hz，2H)，7.07(m，2H)，7.21(m，3H)，7.98(d，J＝8.4Hz，2H)，8.04(d，J＝8.8Hz，2H)。
实施例5-46b：N-苄基-1-(4-甲氧基苯基)甲胺。
将4-甲氧基苯甲醛(5g，35mmol)和苄基胺(3.8g，35mmol)加入到在二氯乙烷(125mL)中的三乙酰氧基硼氢化钠(10.4g，49mmol)。反应在室温 下搅拌2小时，然后浓缩。混合物用二氯甲烷(200mL)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)、盐水(200mL)洗涤，并用硫酸镁干燥。将粗制胺浓缩，并通过硅胶色谱(70％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得油状N-苄基-1-(4-甲氧基苯基)甲胺。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.59(s，2H)，3.64(s，2H)，3.71(s，3H)，6.86(d，J＝8.8Hz，2H)，7.28(m，7H)。
实施例5-47：2-(4-(N-苄基-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯基)乙酸。
按照实施例5-27由2-(4-(氯磺酰基)苯基)乙酸甲酯(实施例5-47a)、4-甲氧基苯甲醛和苄基胺制备。MS(M-H，424.10)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.66(s，3H)，3.72(s，2H)，4.18(s，2H)，4.22(s，2H)，6.73(d，J＝8.4Hz，2H)，6.91(d，J＝8.4Hz，2H)，7.02(m，2H)，7.19(m，3H)，7.49(d，J＝8.4Hz，2H)，7.80(d，J＝8Hz，2H)。
实施例5-47a：2-(4-(氯磺酰基)苯基)乙酸甲酯。
将2-(4-(氯磺酰基)苯基)乙酸(600mg，2.6mmol)加入到亚硫酰氯(3mL)，并加热至80℃持续1小时。将反应混合物浓缩，在冰浴中冷却至0℃，并滴加冰冷的甲醇。将混合物搅拌30分钟，并浓缩以获得油状2-(4-(氯磺酰基)苯基)-乙酸甲酯。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.57(s，3H)，3.65(s，2H)，7.21(d，J＝8Hz，2H)，7.55(d，J＝8Hz，2H)。
实施例5-48：4-((N-苄基-4-羧基苯基磺酰氨基)甲基)苯甲酸。
按照实施例5-10由甲基-4-(氯磺酰基)苯甲酸酯(实施例5-10c)、苄胺和4-(溴甲基)苯甲酸甲酯制备。MS(M+H，426.10)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：4.29(s，2H)，4.34(s，2H)，7.03(m，2H)，7.12(m，2H)，7.68(d，J＝8Hz，2H)，7.94(d，J＝8.8Hz，2H)，8.06(d，J＝8.8Hz，2H)，13.03(s，2H)。
实施例5-49：4-(苄基(4-甲氧基苄基)氨基甲酰基)苯甲酸
按照实施例5-27由4-(氯羰基)苯甲酸酯和N-苄基-1-(4-甲氧基苯基)甲胺制备。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.72(d，J＝7.6Hz，3H)，4.26(s，1H)，4.30(s，1H)，4.50(s，1H)，4.55(s，1H)，6.89(m，2H)，7.02(m，1H)，7.10(m，1H)，7.10(m，1H)，7.20(m，1H)，7.28(m，4H)，7.55(m，2H)，7.96(m，2H)，13.13(s，1H)。
实施例5-50：4-(N-(4-氟-3-甲氧基苄基)-N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)-苯甲酸
按照实施例5-10由4-(溴甲基)-4-氟-3-甲氧基苯和4-(N-(4-甲氧基苄基)氨磺酰基)苯甲酸甲酯(实施例5-10b)制备。MS(M-H，458.10)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.59(s，3H)，3.67(s，3H)，4.25(s，2H)，4.25(s，2H)，6.62(m，2H)，6.77(d，J＝8.4Hz，2H)，7.02(m，3H)，7.97(d，J＝8Hz，2H)，8.01(d，J＝8.8Hz，2H)，13.49(s，1H)。
化合物具有1.65μM对hT2R14苦味受体的IC50。
其他的化合物被实验地测试，并发现其作为hT2R14苦味受体的抑制剂具有相对高水平的效力。该测试的结果显示于以下表C中。
表C
实施例6-1：(Z)-3-(5-(2，5-二甲氧基亚苄基)-4-氧代-2-硫代噻唑烷-3-基)丙酸
将3-(4-氧代-2-硫代噻唑烷-3-基)丙酸(200mg，1mmol)、2，5-二甲氧基苯甲醛(168mg，1mmol)和哌啶(0.3mL)在乙醇(3mL)中结合，并在100℃下，在微波中辐射10分钟。将反应冷却，且通过过滤收集固体，用乙酸乙酯/己烷(1/1)洗涤，并在乙醇中重结晶以获得收率85％的标题化合物(309mg，橙褐色固体)。MS(M+H，284)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：2.57(t，2H))，3.74(s，J＝6.8Hz，3H)，3.84(s，3H)，4.19(t，2H)，6.90(s，1H)，7.10(s，2H)，7.86(s，1H)。
化合物具有2.75μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例6-2：(E)-2-氰基-3-(呋喃-2-基)-N-(5-苯基-1，3，4-噻二唑-2-基)丙烯酰胺
室温下，将5-苯基-1，3，4-噻二唑-2-胺(600mg，3.3mmol)、氰基乙酸(300mg，3.6mmol)和EDC-HCl(86l mg，4.5mmol)在乙腈(15mL)中搅拌2小时。混合物用1N HCl水溶液稀释，且水相用乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残留物用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨以获得白色固体2-氰基-N-(5-苯基-1，3，4-噻二唑-2-基)乙酰胺，其不经进一步纯化而使用。
将312mg2-氰基-N-(5-苯基-1，3，4-噻二唑-2-基)乙酰胺和150uL呋喃-2-甲醛在2.5mL DMF中混合，并在150℃下，在微波中加热15分钟。加入5ml H2O，并收集产生的沉淀，且用水(4x)洗涤以获得粗产物。在乙醇中重 结晶获得180mg棕色固体纯产物。MS(M+H，323)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：6.82(m，1H))，7.43(d，1H)，7.49(m，4H)，7.87(m，2H)，8.15(s，1H)，8.22(br，s，1H)。
化合物具有0.499μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例6-3：N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-基)-1，4-二甲基-2，3-二氧代-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-磺酰胺
将1，4-二甲基-2，3-二氧代-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-磺酰氯(实施例6-3a，450mg，1.6mmol)加入到搅拌的2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-胺(215mg，1.4mmol)和三乙胺(170mg，1.7mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中。反应在室温下搅拌过夜，然后浓缩。粗产物通过硅胶色谱(0-30％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得白色固体N-(2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁英-6-基)-1，4-二甲基-2，3-二氧代-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-磺酰胺。MS(M+H，404.10)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.47(s，3H)，3.49(s，3H)，4.12(m，4H)，6.55(m，1H)，6.61(d，J＝2.4Hz，1H)，6.69(d，J＝8.4Hz，1H)，7.53(m，1H)，7.59(d，J＝2Hz，1H)，10.00(s，1H)。
化合物具有7.71μM对hT2R14苦味受体的IC50。
实施例6-3a：1，4-二甲基-2，3-二氧代-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-磺酰氯
将氯磺酸(3mL)加热至65℃，并在0.5小时内分批加入1，4-二甲基喹喔啉-2，3(1H，4H)-二酮(实施例6-3b，1g，5.5mmol)。将反应混合物搅拌4小时，然后冷却至室温，并缓慢倾于冰上。过滤产生的沉淀，并用水洗涤，以获得白色固体1，4-二甲基-2，3-二氧代-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-磺酰氯。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.50(s，6H)，7.25(m，2H)，7.38(m，4H)。
实施例6-3b：1，4-二甲基喹喔啉-2，3(1H，4H)-二酮
将喹喔啉-2，3(1H，4H)-二酮(5g)分批加入到NaH(2.5g)的DMF(200 mL)溶液，随后缓慢加入碘甲烷(3.8mL)。将反应混合物在室温下搅拌4小时，然后加入水(200mL)。通过过滤收集产生的沉淀，并用水洗涤以获得白色固体1，4-二甲基喹喔啉-2，3(1H，4H)-二酮，收率95％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：3.50(s，6H)，7.25(m，2H)，7.38(m，4H)。
实施例6-4：1，4-二甲基-2，3-二氧代-N-(4-(吡啶-2-基甲基)苯基)-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-磺酰胺.
化合物是商业上可得的，且可通过Ryan Scientific购买。
化合物具有6.14μM对hT2R14苦味受体的IC50。
其他的化合物被实验地测试，并发现其作为hT2R14苦味受体的抑制剂具有相对高水平的效力。该测试的结果显示于以下表D中。
表D
表7：针对23种苦味受体的代表性筛选结果
针对23种苦味受体的组，筛选来自以上实施例5和6的化合物。苦味受体用对应的激动剂活化至EC80，然后用以上化合物以25μM的浓度处理。数据归纳于下表。
80％或更高的抑制＝++++
60％至80％的抑制＝+++
40％至60％的抑制＝++
20％至40％的抑制＝+
*
实施例7.实施例10-10的感觉数据
为了确定单个拮抗剂的功效，用T2R8特异性激动剂、关注的化合物和参照苦味阻断剂进行味觉测试。我们先前已经描述了证实具有味觉效应，来自2007年8月21日提交的美国临时申请序列号No.60/957,129的实施例4-8的良好hT2R8拮抗剂：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H- 吡唑-4-基)苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-羧酰胺。已显示其自身，和与广谱苦味阻断剂组合减少咖啡的苦味。如表6所示，当与我们的对照拮抗剂(实施例10-8)对比时，实施例10-10的hT2R8拮抗剂显示阻断感知的苦味的更强大的能力。
表6.对比对照苦味阻断剂和更强效的苦味阻断剂10-10的味觉测试结果
如这一实施例的味觉测试所证实，苦味的感知可通过掺入hT2R8的拮抗剂来减少或消除，且实施例10-10的拮抗剂当与已知苦味拮抗剂，例如N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-羧酰胺(7767)对比时，表现为更加强效的类似物。由此得出结论，苦味的感知可通过在其中hT2R8激动剂引起苦味的组合物，诸如食物、饮料和/或药物中掺入T2R8的拮抗剂来减少或消除。
实施例8.hT2R8的拮抗剂的鉴别
为了鉴别拮抗剂，按照先前专利申请中所描述，产生稳定表达hT2R8以及混杂的嵌合G16944蛋白的细胞系。使用稳定的细胞系和FLIPR(荧光显像读板器)建立高通量测定。使用hT2R8的激动剂将所述受体活化多达它们各自最大活性的70-80％。对于hT2R8，使用的激动剂是穿心莲内酯(200μM)。为了鉴别拮抗剂，具有不同化学结构的化合物与激动剂一起添加。将引起受体活性的统计学显著的减少的化合物收集起来，并用剂量依赖性抑制曲线重新确认。骨架A和骨架B被鉴别为hT2R8拮抗剂(图1)。具体的实施例提供于表1。
实施例9.hT2R8拮抗剂
实施例9-1：2-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)异二氢 吲哚-1，3-二酮
80℃下，2-(1H-吡唑-4-基)异二氢吲哚-1，3-二酮(实施例9-1a)(1.5g，7mmol)、4-(氯甲基)-3，5-二甲基异噁唑(1.5g，10mmol)和碳酸铯(3.3g，10mmol)在DMF(20mL)中搅拌3小时。将反应冷却，用H2O(150mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。固体产物用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，并在回流无水乙醇(30mL)中重结晶，以获得澄清淡黄色固体2-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)异二氢吲哚-1，3-二酮(900mg，38％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)1.36(d，3H，δJ2.16(s，3H)，2.41(s，3H)，＝7.2Hz)，5.22(s，2H)，7.81(s，1H)，7.91-7.83(m，4H)，8.21(s，1H)。MS M+H计算值323.11；实测值323.1。熔点：170-171℃。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.18μM的IC50。
实施例9-1a：1-甲苯磺酰基-1H-吡唑-4-胺
100℃下，将1-甲苯磺酰基-1H-吡唑-4-胺(实施例9-1b)(3g，12.7mmol)和异苯并呋喃-1，3-二酮(1.9g，13mmol)在DMF/乙腈(1/1)(20mL)中搅拌1小时。将混合物冷却，并用H2O稀释。通过过滤收集沉淀，用额外的水，随后用乙酸乙酯和己烷洗涤。固体产物在高真空下干燥以获得黄色固体2-(1H-吡唑-4-基)异二氢吲哚-1，3-二酮(2.5g，92％)。MS M+H计算值214.1；实测值214.1。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.93-8.10(m，6H)，13.03(bs，1H)。
实施例9-1b：1-甲苯磺酰基-1H-吡唑-4-胺
将4-硝基-1-甲苯磺酰基-1H-吡唑(实施例9-1c)(3g，11.2mmol)和10％钯碳(800mg)在MeOH(150mL)中在2个大气压氢气下在Parr氢化器上搅拌3小时。混合物通过硅藻土过滤，浓缩，并通过硅胶色谱(80％乙酸乙酯于己烷中)纯化，以获得粉色固体1-甲苯磺酰基-1H-吡唑-4-胺(1.9g，71％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.40(s，3H)，3.01(bs，2H)，7.29(d，2H，J＝8Hz)，7.41(d，1H，J＝1.2Hz)，7.53(d，1H，J＝1.2Hz)，7.81(d，2H，J＝8Hz)。
实施例9-1c：4-硝基-1-甲苯磺酰基-1H-吡唑
80℃，将4-硝基-1H-吡唑(500mg，4.4mmol)、4-甲基苯-1-磺酰氯(840mg，4.4mmol)和三乙胺(510mg，5mmol)在DMF(25mL)中搅拌1小时。将反应冷却，用H2O(200mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，100ml)萃取。有机相用1N HCl水溶液(200mL)和H2O(200mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。固体用己烷研磨以获得灰白色固体4-硝基-1-甲苯磺酰基-1H-吡唑(600mg，50％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.40(s，3H)，7.52(d，2H，J＝8.4Hz)，7.98(d，2H，Ｊ=8.8Hz)，8.57(s，1H)，9.58(s，1H)。
实施例9-2：2-((1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基氨基)甲基)苄腈
将1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺-盐酸盐(100mg，0.44mmol)、2-(溴甲基)苄腈(115mg，0.6mmol)和三乙胺(0.5mL，3.5mmmol)在DMF(3mL)中辐射，并在80℃下，在微波反应器中搅拌10分钟。将反应冷却，用H2O(50mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，30mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，并在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物溶解于乙醇(70mL)、H2O(3mL)和乙酸(1mL)，并将混合物回流2小时。将溶液在旋转蒸发仪上浓缩，溶解于甲醇(3mL)，并通过反相HPLC纯化3份1mL等份试样(5至95％乙腈于H2O中：16分钟梯度)。合并纯级分，并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，以获得纯白色固体2-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)异吲哚啉-1-酮(85mg，61％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ2.18(s，3H)，2.43(s，3H)，4.97(s，2H)，5.18(s，2H)，7.58-7.68(m，3H)，7.77(s，1H)，8.10(d，J＝8Hz，1H)，8.27(s，1H)，9.19(bs，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有大于30μM的IC50值。
实施例9-3：2-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)异吲哚啉-1-酮
100℃下，在微波反应器中，将2-((1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基氨基)甲基)苄腈(实施例9-2)(30mg，0.14mmol)在MeOH/2N NaOH水溶液的混合物(5mL)中搅拌30分钟。反应用1N HCl水溶液(100mL)酸化，并用乙酸乙酯(3x，70mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，并浓缩。将残留物溶解于MeOH(3mL)，并通过反相HPLC纯化2份1.5mL等份试样(5至95％乙腈于H2O中：16分钟梯度)。将纯级分合并并浓缩以获得纯白色固体2-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)异吲哚啉-1-酮(21mg，50％)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ215(s，3H)，2.41(s，3H)，4.81(s，2H)，5.17(s，2H)，7.48-7.50(m，1H)，7.51-7.52(m， 2H)，7.72(d，J＝7.2Hz，1H)，7.75(s，1H)，8.20(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有11μM的IC50。
实施例9-4：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)喹唑啉-2，4(1H，3H)-二酮
100℃下，将在乙腈(3mL)中的盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(75mg，0.33mmol)、2-异氰酸基苯甲酸甲酯和三乙胺(200mg，2mmol)在微波反应器中辐射30分钟。将反应冷却，用H2O(75mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，50mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过硅胶色谱(75％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得淡粉色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)喹唑啉-2，4(1H，3H)-二酮(20mg，18％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.16(s，3H)，2.40(s，3H)，5.17(s，2H)，7.17-7.22(m，2H)，7.50(s，1H)，7.66(dt，J＝8，1.2Hz，1H)，7.92(d，J＝6.8Hz，1H)，7.95(s，1H)，11.52(bs，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.5μM的IC50。
实施例9-5：1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮
在室温下，将1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮(实施例9-5a)(50mg，0.18mmol)和60％氢化钠(8mg，0.20mmol)在DMF(3mL)中搅拌15分钟，然后冷却至0℃。将苄基溴(31mg，0.18mmol)加入到混合物，并使之升至室温，然后搅拌2小时。反应用甲醇淬灭，并浓缩。反应用盐水(50mL)稀释，并用二氯甲烷(2x，50mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物 溶解于二氯甲烷(5mL)，并通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化以获得白色固体1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮(20mg，30％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)；.δ1.85-1.91(m，2H)，2.10(s，3H)，2.37(s，3H)，3.12(m，2H)，3.55(t，J＝5.8.Hz，2H)，4.48(s，2H)，5.05(s，2H)，7.22-7.31(m，5H)，7.49(s，1H)，7.84(s，1H)。LC/MS；计算C20H23N5O2的[M+H]；计算值366.19；实测值366.15。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.65μN的IC50。
实施例9-5a：1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)四氢嘧啶-2 (1H)-酮
0℃下，将1-(3-氯丙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)1H-吡唑-4-基)脲(实施例9-5b)(200mg，0.64mmol)和60％氢化钠(28mg，0.71mmol)在DMF(2mL)中搅拌15分钟，然后使之升至室温，并搅拌2小时。反应用甲醇淬灭，并浓缩。反应用盐水(50mL)稀释，并用二氯甲烷(2x，50mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残留物溶解于二氯甲烷(5mL)，并通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化以获得白色固体1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)四氢嘧啶-2(1H)-酮(84mg，48％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ1.85-1.91(m，2H)，2.10(s，3H)，2.37(s，3H)，3.12(m，2H)，3.48(t，J＝6.0Hz，2H)，5.05(s，2H)，6.57(s，1H)，7.46(s，1H)，7.80(s，1H)。LC/MS；计算C13H17N5O2的[M+H]；计算值276.14；实测值276.10。
实施例9-5b：1-(3-氯丙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4- 基)脲
在65℃下，将在乙腈(5mL)中的1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(342mg，1.78mmol)和异氰酸2-氯丙酯(213mg，1.78mmol)加热16小时。将反应冷却至室温，浓缩，然后将残留物溶解于二氯甲烷(5mL)，并通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化。将纯级分合并，并浓缩然后用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨以获得白色固体(1-(3-氯丙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)1H-吡唑-4-基)脲(218mg，39％)。LC/MS；计算C12H16ClN5O2的[M+H]；计算值298.10；实测值298.10。
实施例9-6：1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，3，5-三嗪-2-酮
在室温下，将1-苄基-5-(2，4-二甲氧基苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，3，5-三嗪-2-酮(实施例9-6a)(44mg，0.09mmol)、苯甲醚(9mg，0.09mmol)和50％三氟乙酸/二氯甲烷溶液(1mL)在二氯甲烷(1mL)中搅拌2小时。将反应浓缩，用饱和碳酸氢钠(50mL)淬灭，用乙酸乙酯(2x，50mL)萃取，并用盐水(50mL)洗涤。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化获得白色固体1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，3，5-三嗪-2-酮(19mg，62％)。LC/MS；计算C19H22N6O2的[M+H]；计算值367.18；实测值367.20。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有5.84μM的IC50。
实施例9-6a：1-苄基-5-(2，4-二甲氧基苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，3，5-三嗪-2-酮
将1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)脲(实施例9-6b)(50mg，0.15mmol)、2，4-甲氧基苄胺(26mg，0.15mmol)和甲醛(37％按重量计，水溶液)(25mg，0.31mmol)在100℃下加热16小时。将反应冷却至室温，用盐水(50mL)稀释，并用二氯甲烷(2x，50mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化以获得油状1-苄基-5-(2，4-二甲氧基苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，3，5-三嗪-2-酮(44mg，56％)。LC/MS；计算C28H32N6O4的[M+H]；计算值517.25；实测值517.20。
实施例9-6b：1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)脲
将在乙腈(5mL)中的1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(287mg，1.49mmol)和异氰酸苄酯(199mg，1.49mmol)在65℃下加热16小时。将反应冷却至室温，并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化，并用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨以获得白色固体1-苄基-3-(1-((3，5二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)脲(246mg，51％)。LC/MS；计算C17H19N5O2的[M+H]；计算值326.15；实测值326.10。
实施例9-7：5-苄基-1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-苯乙基-1，3，5-三嗪-2-酮
按照实施例9-6a由1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-苯乙基脲(实施例9-7a)、甲醛和苄胺制备。收率：15％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.11(s，3H)，2.37(s，3H)，2.69(t，J＝7.6Hz，2H)，3.39(t，J＝7.8Hz，2H)，3.81(s，2H)，4.16(s，2H)，4.42(s，2H)，5.05(s，2H)，7.17-7.32(m，10H)，7.42(s，1H)，7.78(s，1H)。LC/MS；计算C27H30N6O2的[M+H]；计算值471.24；实测值471.15。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有2.64μM的IC50。
实施例9-7a：1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-苯乙基脲
按照实施例9-6b由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺和异氰酸苯乙酯制备。收率：29％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ2.10(s，3H)，2.36(s，3H)，2.69(t，J＝7.2Hz，2H)，3.25(q，J＝7.4Hz，2H)，5.02(s，2H)，6.00(t，J＝5.8Hz，1H)，7.16-7.30(m，6H)，7.68(s，1H)，8.13(s，1H)。LC/MS；计算C18H21N5O2的[M+H]；计算值340.17；实测值340.20。
实施例9-8：1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-苯乙基-1，3，5-三嗪-2，4，6-三酮
将在THF(2mL)中的1-(1-((3，5-2二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-苯乙基脲(实施例9-7a)(100mg，0.29mmol)冷却至0℃，并缓慢加入异氰酸正氯羰基酯(93mg，0.88mmol)。添加后，使得反应升至室温，并搅拌1小时。将反应浓缩，然后残留物通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇：30分钟梯度)纯化以获得白色固体(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-3-苯乙基-1，3，5-三嗪-2，4，6-三酮(100mg，83％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.13(s，3H)，2.39(s，3H)，2.82(t，J＝5.8Hz，2H)，3.88(t，J＝8.0Hz，2H)，5.17(s，2H)，7.19-7.31(m，5H)，7.44(s，1H)，7.89(s，1H)，11.84(s，1H)。LC/MS；计算C20H20N6O4的[M+H]；计算值409.15；实测值409.20。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有3.03μM的IC50。
实施例9-9：1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，3，5-三嗪-2，4，6-三酮
将在THF(2mL)中的1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)脲(实施例95b)(100mg，0.31mmol)冷却至0℃，并缓慢加入异氰酸正氯羰基酯(97mg，0.92mmol)。添加后，使得反应升至室温，并搅拌1小时。将反应浓缩，然后残留物通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇：30分钟梯度)纯化以获得白色固体以获得1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，3，5-三嗪-2，4，6-三酮(112mg，93％)。 1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.12(s，3H)，2.38(s，3H)，4.87(s，2H)，5.16(s，2H)，7.23-7.34(m，5H)，7.45(s，1H)，7.90(s，1H)，11.93(s，1H)。LC/MS；计算C19H18N6O4的[M+H]；计算值395.14；实测值395.15。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.14μM的IC50。
实施例10.hT2R8拮抗剂：制备本发明的化合物
实施例10-1：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
将在甲苯(100mL)中的1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)(6g，25.5mmol)回流1小时，然后在氮气气氛下冷却至室温。加入甘氨酸甲酯-盐酸盐(3.1g，26mmol)和三乙胺(3.2g，32mmol)，并将混合物回流16小时。将反应冷却，并在旋转蒸发仪上除去溶剂。将固体再次溶解于乙酸乙酯(100mL)，并且有机相用1NHCl溶液(2x，150mL)洗涤。水相用乙酸乙酯(2x，75mL)反萃，且合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，并浓缩。产生的固体用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，并在高真空下干燥以获得白色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(5.2g，74％)。1HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ2.19(s，3H)，2.42(s，3H)，4.09(s，2H)，5.06(s，2H)，5.68(bs，1H)，7.90(s，1H)，8.05(1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.7μM的IC50。
实施例10-1a：1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物
将亚硝酸钠(450mg，6.5mmol，于H2O中)(10mL)在10分钟内滴加于 1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-碳酰肼(实施例10-1b)(1g，4.3mmol)在10％乙酸水溶液(50mL)中的悬浮液，并经冰水浴冷却至0℃。将反应搅拌额外的15分钟，然后用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用饱和碳酸钠水溶液(100mL)，随后用H2O(100mL)洗涤。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。固体产物用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，并真空(en vacuo)干燥以获得白色固体1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(1g，93％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.20(s，3H)，2.44(s，3H)，5.07(s，2H)，7.81(s，1H)，7.93(s，1H)。
实施例10-1b：1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-碳酰肼
将1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(实施例10-1c)(6g，24mmol)和肼(7.5g，240mmol)在EtOH(100mL)中回流搅拌12小时。溶液在旋转蒸发仪上浓缩，且固体产物用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，并在高真空下干燥以获得纯白色固体1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-碳酰肼(5.5g，97％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.11(s，3H)，2.39(s，3H)，5.15(s，2H)，7.81(s，1H)，8.17(s，1H)，9.31(bs，1H)。
实施例10-1c：1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羧酸酯
将在DMF(50mL)中的1H-吡唑-4-羧酸乙酯(4.2g，30mmol)、4-(氯甲基)-3，5-二甲基异噁唑(5.1g，35mmol)和碳酸铯(9.8g，30mmol)在80℃下搅拌12小时。将反应冷却至室温，用0.1N HCl(150mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，并在旋转蒸发仪上 浓缩。固体产物用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，并通过过滤收集以获得白色固体1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(6g，80％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：.δ1.34(t，J＝7.2Hz，3H)，2.19(s，3H)，2.43(s，3H)，4.29(q，J＝7.2Hz，2H)，5.06(s，2H)，7.77(s，1H)，7.91(s，1H)。
实施例10-2：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-1由盐酸(+/-)-苯丙氨酸甲酯和1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物制备。收率：58％。1H NMR(丙酮-d6，400MHz)：.δ2.17(s，3H)，2.43(s，3H)，3.07(dd，J＝14.4，6.4Hz，1H)，3.20(dd，J＝14，4.4Hz，1H)，4.53(t，J＝4.8Hz，1H)，5.18(s，2H)，7.27-7.19(m，5H)，7.46(bs，1H)，7.79(s，1H)，7.99(s，1H)。MS M+H计算值366.15；实测值366.1。熔点：169-171℃。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.18μM的IC50。
实施例10-3：(S)-5-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-1由盐酸(S)-苯丙氨酸甲酯和1-((3，5-二甲基异噁唑-4- 基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例6a)制备。从手性色谱分离的收率：13％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：.δ2.19(s，3H)，2.42(s，3H)，2.88(dd，J＝13.6，9.2Hz，1H)，3.35(dd，J＝13.6，3.6Hz，1H)，4.31-4.35(m，1H)5.06(s，2H)，5.53(bs，1H)，7.21-7.36(m，5H)，7.85(s，1H)，8.01(s，1H)。LC/MS；计算C19H19N5O3的[M+H]；计算值366.15；实测值366.1。[α]D＝(-)-136，c＝0.1，乙醇。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.12μM的IC50。
实施例10-4：(R)-5-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-1由盐酸(R)-苯丙氨酸甲酯和1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物制备。从手性色谱分离的收率：9％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：.δ2.19(s，3H)，2.42(s，3H)，2.88(dd，J＝13.6，9.2Hz，1H)，3.35(dd，J＝13.6，3.6Hz，1H)，4.31-4.35(m，1H)5.06(s，2H)，5.53(bs，1H)，7.21-7.36(m，5H)，7.85(s，1H)，8.01(s，1H)。MS M+H计算值366.15；实测值366.1。[α]D＝(+)-124，c＝0.2，乙醇。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.11μM的IC50。
实施例10-5：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-苯氧基乙基)咪唑烷-2，4-二酮
85℃下，将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷 -2，4-二酮(实施例10-1)(200mg，0.7mmol)、(2-溴乙氧基)苯(200mg，1mmol)和碳酸铯(325mg，1mmol)在微波反应器中辐射20分钟。将反应冷却至室温，用1N HCl水溶液(100mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物溶解于甲醇(10mL)，并通过反相HPLC(5至95％乙腈于H2O中：25分钟梯度)纯化。收集纯级分，浓缩，然后再次溶解于无水乙醇，并在旋转蒸发仪上浓缩(4x)以获得白色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-苯氧基乙基)咪唑烷-2，4-二酮(150mg，54％)。1H NMR(CDCl32.18，400MHz)：.δ(s，3H)，2.41(s，3H)，3.86(t，J＝5.2Hz，2H)，4.19(t，J＝4.4Hz，2H)，4.25(s，2H)，5.05(s，2H)，6.88(dd，J＝9.2，1.2Hz，2H)，7.00(dt，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.27-7.32(m，2H)，7.89(s，1H)，8.05(s，1H)。MS M+H计算值396.17；实测值396.1。熔点：117-118℃。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.06μM的IC50。
实施例10-6：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-甲氧基苄基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例6)和3-甲氧基-苄基溴制备。收率：55％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：.δ2.19(s，3H)，2.42(s，3H)，3.81(s，3H)，3.85(s，2H)，4.58(s，2H)，5.06(s，2H)，6.81-6.88(m，3H)，7.26-7.31(m，1H)，7.92(s，1H)，8.08(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.07μM的IC50。
实施例10-7：3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苯甲酸甲酯
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮和3-甲氧基-苄基溴制备。收率：83％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：.δ2.20(s，3H)，2.43(s，3H)，3.86(s，2H)，3.93(s，3H)，4.67(s，2H)，5.07(s，2H)，7.45-7.52(m，2H)，7.93(s，1H)，7.95(s，1H)，8.03(dd，J＝7.2，1.6Hz，1H)，8.08(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.09μM的IC50。
实施例10-8：3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苯甲酸
85℃下在微波反应器中，将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(500mg，1.8mmol)(实施例10-5)、3-(溴甲基)苯甲酸甲酯(456mg，2mmol)和碳酸铯(650mg，2mmol)在DMF(4mL)中搅拌20分钟。将反应冷却，用1N HCl水溶液(100mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗酯溶解于甲醇(5mL)，并加入NaOH水溶液(50mL，10％按重量计)，并将混合物在室温下搅拌2小时。反应用1N HCl(150mL)酸化，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。游离酸用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，并真空干燥以获得白色固体3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苯甲酸(610.mg，83％)。1H NMR(DMSO-d6，4002.13(s，3H)，2.29(s，3H)，4.00(s，2H)，4.59(s，2H)，5.18(s，2H)，MHz)：δ7.46-7.59(m，2H)，7.78(s，1H)，7.85-7.88(m，2H)，8.18(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08 苦味受体，并具有1.8μM的IC50。
实施例10-9：3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)-N-甲基苯甲酰胺
80℃下，将在乙腈(3mL)中的3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苯甲酸(100mg，0.24mmol)(实施例10-8)、盐酸甲胺(methylamaine)(67mg，1mmol)、三乙胺(155mg，1.5mmol)和EDC(57mg，0.3mmol)在微波反应器中辐射10分钟。将反应冷却，用1N HCl水溶液(100mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗产物溶解于MeOH(3mL)，并通过反相HPLC(5至95％乙腈于H2O中：25分钟梯度)以获得白色固体3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)-N-甲基苯甲酰胺(25mg，25％)。MS M+H计算值423.17；实测值423.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.14μM的IC50。
实施例10-10：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-羟基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和2-(3-羟基苄基氨基)乙酸甲酯(实施例10-10a)制备。收率：24％。1HNMR(DMSO，400MHz)：.δ2.15(s，3H)，2.41(s，3H)，3.99(s，2H)，4.45(s，2H)，5.21(s，2H)，6.70(m，3H)，7.15(m，H)，7.80(s，1H)， 8.19(s，H)，9.44(s，H)。LC/MS；[M+H]计算值382.1；实测值382.1。熔点：35-136℃。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.035uM的IC50。
实施例10-10a：2-(3-羟基苄基氨基)乙酸甲酯：
将甘氨酸甲酯(500mg，4mmol)和3-羟基苯甲醛(480mg，4mmol)溶解于5mL THF/甲醇(1∶1)。将在乙酸(240mg，4mmol)和1M在THF中氰基硼氢化钠(4.8mL，4.8mmol)缓慢加入到反应。85℃下，将反应在微波反应器中辐射15分钟，冷却室温，然后通过过滤除去盐。将澄清溶液浓缩，然后残留物通过反相HPLC(10至95％乙腈于H2O中：25分钟梯度)纯化以获得澄清凝胶状标题化合物。收率45％。MS M+H计算值196.1；实测值196.1。
实施例10-11：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-羟基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和2-(2-羟基苄基氨基)乙酸甲酯(实施例10-11a)制备。收率：28％。1HNMR(DMSO，400MHz)：.δ2.12(s，3H)，2.38(s，3H)，4.00(s，2H)，4.45(s，2H)，5.17(s，2H)，6.83(m，2H)，7.10(m，2H)，7.78(s，1H)，8.16(s，H)，9.66(s，H)。LC/MS；[M+H]计算值382.1；实测值382.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.07uM的IC50。
实施例10-11a：甲基2-(2-羟基苄基氨基)乙酸酯：
按照实施例10-10a由甘氨酸甲酯和2-羟基苯甲醛制备。收率40％。MS M+H计算值196.1；实测值196.1
实施例10-12：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(4-羟基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物和2-(4-羟基苄基氨基)乙酸甲酯(实施例10-12a)制备。收率9％。 1H NMR(DMSO，400MHz)：δ2.117(s，3H)，2.383(s，3H)，3.918(s，2H)，4.387(s，2H)，5.174(s，2H)，6.719(J＝8.8，d，2H)，7.108(J＝8.8，m，2H)，7.761(s，1H)，8.154(s，H)，9.399(s，H)。LC/MS；[M+H]计算值382.1；实测值382.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.06uM的IC50。
实施例10-12a：2-(4-羟基苄基氨基)乙酸甲酯：
按照实施例10-10a由甘氨酸甲酯和4-羟基苯甲醛制备。收率40％。MS M+H计算值196.1；实测值196.1
实施例10-13：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-羟基-4-甲氧基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和2-(3-羟基-4-甲氧基苄基氨基)乙酸甲酯(实施例10-13a)制备。收率22％。1H NMR(DMSO，400MHz)：.δ2.119(s，3H)，2.383(s，3H)，3.716(s，3H)，3.923(s，2H)，4.361(s，2H)，5.117(s，2H)，6.667(m，2H)，6.863(J＝8.4，d，1H)，7.766(s，H)，8.159(s，H)。MS M+H计算值412.1；实测值412.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.1uM的IC50。
实施例10-13a：2-(3-羟基-4-甲氧基苄基氨基)乙酸甲酯：
按照实施例10-10a由甘氨酸甲酯和3-羟基-4-甲氧基苯甲醛制备。收率47％。MS M+H计算值226.1；实测值226.1
实施例10-14：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-(2-甲氧基乙氧基)苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和2-(3-(2-甲氧基乙氧基)苄基氨基)乙酸甲酯(实施 例10-14a)制备。收率27％。1H NMR(DMSO，400MHz)：.δ2.12(s，3H)，2.38(s，3H)，3.26(s，3H)，3.62(t，J＝4.4，2H)，3.98(s，2H)，4.06(t，J＝4.4，2H)，4.48(s，2H)，5.18(s，2H)，6.86(m，3H)，7.24(t，J＝8，1H)，7.78(s，1H)，8.17(s，1H)。MS M+H计算值440.2；实测值440.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.07uM的IC50。
实施例10-14a：2-(3-(2-甲氧基乙氧基)苄基氨基)乙酸甲酯：
按照实施例10-10a由甘氨酸甲酯和3-(2-甲氧基乙氧基)苯甲醛制备。收率55％。MS M+H计算值254.1；实测值254.1
实施例10-15：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-(甲基硫)苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和2-(2-(甲基硫)苄基氨基)乙酸甲酯(实施例10-15a)制备。收率67％。1HNMR(DMSO，400MHz)：.δ2.12(s，3H)，2.39(s，3H)，248(s，3H)，3.98(s，2H)，4.54(s，2H)，5.19(s，2H)，7.18(m，1H)，7.30(m，3H)，7.79(s，1H)，8.18(s，1H)。LC/MS；[M+H]计算值412.1；实测值412.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.03uM的IC50。
实施例10-15a：2-(2-(甲基硫)苄基氨基)乙酸甲酯：
按照实施例10-10a由甘氨酸甲酯和2-(甲基硫)苯甲醛制备。收率50％。MS M+H计算值226.1；实测值226.1
实施例10-16：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-(2-甲氧基乙氧基)苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-羟基苄基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-11)和2-溴乙基甲基醚制备。收率19％。1H NMR(DMSO，400MHz)：.δ2.11(s，3H)，2.08(s，3H)，3.25(s，3H)，3.64(t，J＝3.6，2H)，4.00(s，2H)，4.11(t，J＝3.2，2H)，4.27(s，2H)，5.17(s，2H)，6.90(m，1H)，7.00(m，1H)，7.26(m，2H)，7.76(s，1H)，8.15(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.1uM的IC50。
实施例10-17：33-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-(甲基亚硫酰基)苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
在20mL微波瓶中，将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-(甲基硫)苄基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-15)(70mg，0.17mmol)和m-CPBA(58mg，0.34mmol)在0℃下溶解于二氯甲烷。将反应在0℃下搅 拌，并使之升至室温，持续4小时。真空除去反应的溶剂，并将粗产物溶解于1mL乙醇，并通过varian HPLC(10至95％乙腈/水；25分钟)纯化。真空蒸发纯化的级分以获得标题化合物。MS M+H计算值428.1；实测值428.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.4uM的IC50。收率：12mg，17％。
实施例10-18：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-甲氧基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-2-甲氧基苯(199mg，1mmol)制备。收率：33％。MSM+H计算值396.1；实测值396.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.06uM的IC50。
实施例10-19：2-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苄腈：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和2-(溴甲基)苄腈制备。收率：27％。MS M+H计算值391.1；实测值391.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.5μM的IC50。
实施例10-20：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-甲基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-2-甲基苯制备。收率：21％。MS M+H计算值380.1；实测值380.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.1uM的IC50。
实施例10-21：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-氟苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-2-氟苯制备。收率42％。MS M+H计算值384.1；实测值384.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.08uM的IC50。
实施例10-22：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-(三氟甲基)苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-2-(三氟甲基)苯制备。收率：37％。MS M+H计算值434.1；实测值434.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.2uM的IC50。
实施例10-23：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-硝基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-2-硝基苯制备。收率22％。MS M+H计算值411.1；实测值411.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.07uM的IC50。
实施例10-24：3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苯甲醛：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和3-(溴甲基)苯甲醛制备。收率：35％。1H NMR(DMSO，400MHz)：.δ2.123(s，3H)，2.388(s，3H)，4.035(s，2H)，4.631(s，2H)，5.186(s，2H)，7.581(m，1H)，7.643(m，1H)，7.787(m，3H)，8.178(s，H)，9.997(s，H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.2uM的IC50。
实施例10-25：3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苄腈：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和3-(溴甲基)苄腈制备。收率21％。MS M+H计算值411.1；实测值411.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1uM的IC50。
实施例10-26：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-甲基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-3-甲基苯制备。收率25％。MS M+H计算值380.1；实测值380.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.02uM的IC50。
实施例10-27：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-氟苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-3-氟苯制备。收率27％。MS M+H计算值384.1；实测值384.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体， 并具有0.06uM的IC50。
实施例10-28：1-((1，5-二甲基-1H-吡唑-3-基)甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和3-(溴甲基)-1，5-二甲基-1H-吡唑制备。收率：22％。MS M+H计算值384.1；实测值384.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.3uM的IC50。
实施例10-29：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(4-甲氧基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-4-甲氧基苯制备。收率19％。MS M+H计算值396.1；实测值396.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.07uM的IC50。
实施例10-30：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(4-甲基苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-4-甲基苯制备。收率25％。MS M+H计算值380.1；实测值380.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.06uM的IC50。
实施例10-31：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(4-氟苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(溴甲基)-4-氟苯制备。收率33％。MS M+H计算值384.1；实测值384.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.05uM的IIC50。
实施例10-32：4-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苄腈：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和4-(溴甲基)苄腈制备。收率21％。MS M+H计算值391.1；实测值391.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.05uM的IC50。
实施例10-33：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-(羟基甲基)苄基)咪唑烷-2，4-二酮：
将3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苯甲醛(实施例10-24)(131mg，0.3mmol)溶解于2mL乙醇。在室温下，使用10％Pd/C催化剂，将溶液以1ml/分钟的流速穿过H-Cube仪器。将收集的级分浓缩，再次溶解于2mL乙醇，并通过HPLC(10-95％乙腈/水，25分钟)纯化。将纯化的级分合并，并浓缩以获得标题化合物。1H NMR(DMSO，400MHz)：.δ2.123(s，3H)，2.388(s，3H)，3.978(s，2H)，4.516(s，2H)，5.182(s，2H)，7.242(m，4H)，7.779(s，1H)，8.172(s，1H)，8.505(s，1H)。MS M+H计算值396.1；实测值396.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.3uM的IC50。收率：24mg，18％。
实施例10-34：1-(2-氨基苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮：
将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-硝基苄基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-23)(126mg，0.3mmol)溶解于2mL乙醇。在室温下，使用10％Pd/C催化剂，将溶液以1ml/分钟的流速穿过H-Cube仪器。将收集的级分浓缩，再次溶解于2mL乙醇，并通过HPLC(10-95％乙腈/水，25分钟)纯化。将纯化的级分合并，并浓缩以获得标题化合物。收率26％。MS M+H计算值381.1；实测值381.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.02uM的IC50。
实施例10-35：1-(3，4-二甲氧基苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮：
3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)(275mg，1mmol)、(3，4-二甲氧基苯基)甲醇(201mg，1.2mmol)、N，N，N，N-四甲基氮杂二羧酰胺(344mg，2mmol)溶解于2mL无水THF。加入三丁基膦(404mg，2mmol)，并在90℃，将反应混合物置于微波反应器中，持续5分钟。将反应过滤，浓缩，并通过HPLC(10-95％乙腈/水，25分钟)纯化以获得标题化合物。收率：25mg，6％。1H NMR(DMSO，400MHz)：δ2.119(s，3H)，2.385(s，3H)，3.724(J＝6.4d，6H)，3.946(s，2H)，4.435(s，2H)，5.178(s，2H)，6.885(m，3H)，7.776(s，1H)，8.166(s，1H)。MS M+H计算值426.1；实测值426.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.06uM的IC50。
实施例10-36：1-(苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-35由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基甲醇制备。收率：19％。1HNMR(DMSO，400MHz)δ2.143(s，3H)，2.408(s，3H)，3.977(s，2H)，4.440(s，2H)，5.202(s，2H)，6.003(s，2H)，6.897(m，3H)，7.788(s，1H)，8.181(s，1H)。MS M+H计算值410.1；实测值410.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.07uM的IC50。
实施例10-37：1-(3-((二甲基氨基)甲基)苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮：
将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)(275mg，1mmol)、1，3-双(溴甲基)苯(263mg，1mmol)和碳酸铯(325mg，1mmol)溶解于2mL DMF，并在165℃下在微波反应器中辐射5分钟。将反应冷却至室温，并通过过滤除去盐沉淀。将含有粗产物的澄清溶液浓缩，并再次溶解于乙酸乙酯。有机溶液用水洗涤两次，随后用盐水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，并蒸发以获得粗产物，其不经进一步纯化或表征而直接用于下一步骤。将1-(3-(溴甲基)苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例42a)(152mg，0.3mmol)、二甲胺(2M THF溶液)(1.5mL，3mmol)和氢化钠(9mg，0.36mmol)溶解于1mL无水THF。120℃下，将反应置于微波反应器，持续5分钟。将粗产物溶解于2mL乙醇，并通过HPLC(10-95％乙腈/水，25分钟)纯化以获得1-(3-((二甲基氨基)甲基)苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(16mg，13％)。MS M+H计算值423.1；实测值423.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.2uM的IC50。
实施例10-38：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-((1-甲基-1H-吡唑-3-基)甲基)咪唑烷-2，4-二酮：
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基) 咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和3-(溴甲基)-1-甲基-1H-吡唑制备。收率19％。MS M+H计算值370.1；实测值370。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.4uM的IC50。
实施例10-39：N-(2-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-2H-四唑-5-基)-3-甲氧基苯甲酰胺
100℃下，将在乙腈(3mL)中的2-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-2H-四唑-5-胺(实施例10-39a)(102mg，0.528mmol)、3-甲氧基苯甲酰氯(0.065mL，0.528mmol)和吡啶(0.043mL，0.528mmol)搅拌1小时。反应用二氯甲烷(30mL)稀释，然后用盐水(30mL)洗涤。有机物用硫酸钠干燥，浓缩并通过反相HPLC(溶剂系统：乙腈/水10％至100％梯度)，运行25分钟)纯化，获得白色结晶固体N-(2-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-2H-四唑-5-基)-3-甲氧基苯甲酰胺(60mg，35％收率)。MS M+H计算值329.1，实测值329。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.02(s，3H)，2.46(s，3H)，3.81(s，3H)，5.78(s，2H)，7.16(m，1H)，7.42(t，J＝8Hz，2H)，7.54(m，1H)，11.3(s，1H)。化合物具有1.87μM对hT2R8苦味受体的IC50。
实施例10-39a：2-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-2H-四唑-5-胺
将2H-四唑-5-胺(1.29g，12.5mmol)、4-(氯甲基)-3，5-二甲基异噁唑(1.56mL，12.5mmol)和碳酸钾(1.73g，15.5mmol)在DMF(20mL)中加热至80℃，并搅拌16小时。将反应冷却至室温，用二氯甲烷(100mL)稀释，并 用盐水和水相继洗涤。有机物用硫酸钠干燥，并用旋转蒸发浓缩。粗产物通过硅胶色谱(0-10％乙酸乙酯/二氯甲烷梯度)纯化，获得白色结晶固体2-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-2H-四唑-5-胺(970mg，40％收率)MS M+H计算值195.1，实测值195。
实施例10-40：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-咪唑-4-基)苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-羧酰胺
将1-((3，5二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-咪唑-4-胺(实施例10-40a)(110mg，0.57mmol)、苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-碳酰氯(105mg，0.57mmol)和三乙胺(90μL，0.69mmol)在二氯甲烷中搅拌16小时。反应用二氯甲烷(30mL)稀释，并用盐水和水相继洗涤。有机物用硫酸钠干燥，并用旋转蒸发浓缩。粗产物通过反相HPLC(溶剂系统：乙腈/水，10％至100％梯度，运行25分钟)纯化以获得白色结晶固体N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-咪唑-4-基)苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-羧酰胺(32mg，15％收率)。MS M+H计算值341.3，实测值341.3。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ2.08(s，3H)，2.41(s，3H)，5.02(s，2H)，6.07(s，2H)，6.95(d，J＝8.4Hz，1H)，7.27(d，J＝1.6Hz，1H)，7.54(m，3H)，10.6(s，1H)。化合物具有12.1μM对hT2R8苦味受体的IC50。
实施例10-40a：1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-咪唑-4-胺
在2.5bar氢气下，将在甲醇(40mL)中的3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-咪唑-1-基)甲基)异噁唑(实施例10-40b)(1.0g，4.5mmol)和10％钯炭(200mg)在Parr振荡器上振荡2小时。通过硅藻土塞过滤，随后旋转蒸发获得黄红色固体1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-咪唑-4-胺(800mg，93％收率)。MS M+H计算值193，实测值193。
实施例10-40b：3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-咪唑-1-基)甲基)异噁唑
以与实施例10-41c相似的方式，通过4-硝基-1H-咪唑的烷基化制备3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-咪唑-1-基)甲基)异噁唑，获得白色结晶固体3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-咪唑-1-基)甲基)异噁唑(5.0g，80％收率)。MS M+H计算值223，实测值223。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ，ppm：2.09(s，3H)，2.43(s，3H)，5.15(s，2H)，7.90(d，J＝1.6Hz，1H)，8.35(d，J＝1.9Hz，1H)。
实施例10-41：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-甲基咪唑烷-2，4-二酮
将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例10-41a)(1.0g，5.20mmol)、乙基-2-异氰酸丙酸酯(0.745g，5.20mmol)和三乙胺(1.5mL，10.4mmol)混合于EtOH(20mL)中。将反应回流12小时，然后使之冷却至室温。真空除去溶剂，并放置形成晶体。收集晶体，并用己烷洗涤以获得白色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-甲基咪唑烷-2，4-二酮，收率80％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ1.53-1.51(d，3H)，2.19(s，3H)，2.42(s，3H)，4.21-4.19(m，1H)，5.06(s，2H)，6.00(bs，1H)，7.90(s，1H)，8.05(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.3μM的IC50。
实施例10-41a：盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺
室温下，将1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基氨基甲酸叔丁酯(实施例10-41b)(592mg，2mmol)在4N HCl的二噁烷溶液(20mL)中搅拌2小时。除去溶剂，并将残留物溶解于乙酸乙酯/己烷(30mL)的1/1混合物，并浓缩两次。固体用己烷研磨，并通过过滤收集，获得白色固体盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(500mg，99％)。1H NMR (DMSO-d6，400MHz)：δ2.11(s，3H)，2.38(s，3H)，5.16(s，2H)，7.51(s，1H)，8.03(s，1H)，10.27(bs，3H)。
实施例10-41b：1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基氨基甲酸叔丁酯
在Parr反应瓶中，将3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)异噁唑(实施例10-41c)(12g，53.8mmol)和BOC酐(12.8g，64mmol)溶解于MeOH/EtOH/THF的3/1/1混合物(300mL)中，随后加入10％Pd/C(1.5g)。将混合物在2大气压氢气下，在Parr氢化器上振荡3小时。混合物通过3英寸硅藻土塞过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。粉色油状物通过硅胶色谱(25％乙酸乙酯于己烷中)纯化以获得粉/红色油状1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基氨基甲酸叔丁酯(12.6g，80％)，其放置固化成淡粉色固体。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.41(s，9H)，2.10(s，3H)，2.32(s，3H)，4.90(s，2H)，6.19(bs，1H)，7.19(s，1H)，7.50(s，1H)。
实施例10-41c：3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)异噁唑
将1H-吡唑(10g，147mmol)分小批加入到浓H2SO4(100mL)，经冰/水浴冷却至0℃，维持内部反应温度低于40℃。小心地滴加浓HNO3(10mL)至反应混合物，维持内部反应温度低于55℃。然后，将反应加热至55℃，并搅拌5小时。将混合物冷却至0℃，并用NaOH水溶液(110g NaOH于150mL H2O中)小心使之碱化(pH～8)，直到形成白色沉淀，小心地保证溶液的内部温度仍然低于40℃。通过过滤收集白色固体，并用乙酸乙酯/己烷(1/3)洗涤，然后真空干燥以获得4-硝基-1H-吡唑(7g，42％，分离的收率)。13C NMR(DMSO-d6，100MHz)δ137.0，126.4。将碳酸铯(26g，80mmol) 加入到在DMF(100mL)中的4-硝基-1H-吡唑(9g，80mmol)，随后加入4-(氯甲基)-3，5-二甲基异噁唑(12.3g，85mmol)。80℃下，将反应混合物在DMF(100mL)中搅拌30分钟，然后冷却，用H2O(150mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(200mL)，并用H2O(2x，100mL)洗涤。有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。固体产物用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨，并通过过滤收集。产物在高真空下干燥以获得淡黄色固体3，5-二甲基-4-((4-硝基-1H-吡唑-1-基)甲基)异噁唑(12g，67％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：.δ2.23(s，3H)，2.46(s，3H)，5.08(s，2H)，8.02(s，1H)，8.08(s，1H)。
实施例10-42：5-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-5由5-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-2)和碘甲烷制备。收率：95％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.04(s，3H)，2.15(s，3H)，2.96(s，3H)，3.24-3.23(m，2H，J＝4.0Hz)，4.23-4.21(m，1H)，5.00(s，2H)，7.24-7.23(m，5H，J＝4.0Hz)，7.70(s，1H)7.87(s，1H)。
显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.15μM的IC50。
实施例10-43：1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-甲基咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4- 基)-5-甲基咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-41)和苄基溴制备。收率：50％。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ1.44(s，3H)，2.19(s，3H)，3.88(s，3H)，4.18(d，J＝8Hz，2H)，4.22(t，1H，J＝4Hz))，5.06(s，2H)，7.39-7.29(m，5H)，7.94(s，1H)，8.10(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.02μM的IC50。
实施例10-44：2-(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二氧代咪唑烷-4-基)乙酸
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和H-Asp-OMe制备。收率：85％。MS M+H计算值334.1；实测值334.1
实施例10-45：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-苯乙基咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和2-氨基-4-苯基丁酸甲酯制备。收率：15％。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ2.09-2.02(m，2H)，2.19(s，3H)，2.41(s，3H)，2.83-2.78(m，2H)，4.13-4.09(t，1H，J＝8Hz)，5.05(s，2H)，5.95(bs，1H)，7.30-7.19(m，5H)，7.95(s，1H)，8.03(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.22μM的IC50。
实施例10-46：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-(3- 苯基丙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和2-氨基-5-苯基戊酸甲酯制备。收率：20％。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ1.72-1.68(m，1H)，1.85-1.78(m，2H)，1.99-1.91(m，1H)，2.19(s，3H)，2.41(s，3H)，2.69-2.63(t，J＝8Hz，2H)，4.13(bs，1H)，5.05(s，2H)，5.95(bs，1H)，7.30-7.19(m，5H)，7.95(s，1H)，8.03(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.17μM的IC50。
实施例10-47：5-(苄氧基甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-1由1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)和2-氨基-3-(苄氧基)丙酸甲酯制备。收率：32％。 1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.19(s，3H)，2.43(s，3H)，3.70-3.67(m，1H)，3.89-3.86(m，1H)，4.31-4.30(m，1H)，4.56-4.32(d，J＝1.6Hz，2H)，5.05(s，2H)，5.62(bs，1H)，7.35-7.29(m，5H)，7.88(s，1H)，8.04(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.76μM的IC50。
实施例10-48：2-(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二氧代咪唑烷-4-基)-N-苯基乙酰胺
将3-(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二氧代咪唑烷-4-基)乙酸(实施例10-44)(100mg，0.3mmol)、苯胺(33mg，0.36mmol)、Pybop(187mg，0.36mmol)和三乙胺(0.05mL，0.36mmol)混合于DMF(1mL)中。65℃下，将反应搅拌4小时。使反应冷却至室温，然后用乙酸乙酯(2mL)稀释。有机相用饱和碳酸氢钠溶液(2x，2mL)，然后用饱和NaCl溶液(1ml)洗涤。将有机相萃取，用无水Na2SO4干燥，并过滤。粗产物再次悬浮于MeOH(1mL)，并通过反相HPLC(5-95％乙腈于H2O；16分钟梯度)纯化。将纯级分合并，并在旋转蒸发仪上除去溶剂以获得白色固体2-(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二氧代咪唑烷-4-基)-N-苯基乙酰胺(50％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.18(s，3H)，2.40(s，3H)，2.72(m，1H)，3.14-3.13(d，1H，J＝4Hz)，4.54-4.51(d，J＝8Hz1H)，5.04(s，2H)，6.53(bs，1H)，7.15-7.13(m，1H)，7.33-7.22(m，2H)，7.47-7.45(d，J＝8Hz，2H)，7.78(bs，1H)，7.09(s，1H)，8.05(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.75μM的IC50。
实施例10-49：N-苄基-2-(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二氧代咪唑烷-4-基)乙酰胺
按照实施例10-48由3-(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二氧代咪唑烷-4-基)乙酸(实施例10-44)和苄胺制备。收率：30％。 1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.18(s，3H)，2.41(s，3H)，2.56-2.52(m，1H，J＝16Hz)，2.56-2.52(m，1H)，3.00-2.96(m，1H)，4.45-4.44(d，J＝5.6Hz，2H)，5.04(s，2H)，5.96(bs，1H)，6.36(bs，1H)，7.36-7.25(m，5H)，7.90(s，1H，8.05(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.3μM的IC50。
实施例10-50：2-(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二氧代咪唑烷-4-基)-N-(3-甲氧基苄基)乙酰胺
按照实施例10-48由3-(1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，5-二氧代咪唑烷-4-基)乙酸(实施例10-44)和(3-甲氧基苯基)甲胺制备。收率：50％。LC/MS；计算值453；实测值453.1显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.7μM的IC50。
实施例10-51：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基咪唑烷-2，4-二酮
在室温下，3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)(50mg，0.182mmol)和碳酸铯(60mg，0.185mmol) 在氮气气氛下混合于DMF(1mL)中，持续15分钟。然后，加入碘甲烷(14mg，0.185mmol)，并将反应继续搅拌额外的2小时。加入H2O(2mL)，然后产物用乙酸乙酯(1mL，2x)萃取。收集有机相，并用饱和碳酸氢钠溶液(2ml，2x)洗涤，干燥，并过滤。在氮气流下除去溶剂，然后在高真空下进一步干燥以获得白色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基咪唑烷-2，4-二酮(42mg，80％)。收率：80％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.18(s，3H)，2.41(s，3H)，3.06(s，3H)，3.95(s，2H)，5.05(s，2H)，7.89(s，1H)，8.05(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.58μM的IC50。
实施例10-52：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，5，5-三甲基咪唑烷-2，4-二酮
将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-甲基咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-41)(50mg，0.173mmol)和60％NaH(8mg，0.190mmol)在DMF(1mL)中混合30分钟。加入MeI(0.04mL，0.190mmol)，并将反应搅拌额外的4小时。反应用1N HCl酸化，并用乙酸乙酯(2mL)稀释。将有机相干燥，过滤，并在氮气流下除去溶剂。将粗产物再次悬浮于MeOH(1mL)，并通过反相HPLC(5至95％乙腈于H2O中：16分钟梯度)纯化。将纯级分合并，并真空除去溶剂以获得白色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，5，5-三甲基咪唑烷-2，4-二酮(25mg，50％)。1HNMR(CDCl3，(CDCl3，400MHz)：δ1.45(s，6H)，2.19(s，3H)，2.42(s，3H)，2.94(s，3H)，5.05(s，2H)，7.92(s，1H)，8.08(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.80μM的IC50。
实施例10-53：1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和苄基溴制备.收率：40％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.18(s，3H)，2.42(s，3H)，3.84(s，2H)，4.61(s，2H)，5.06(s，2H)，7.40-7.27(m，5H)，7.92(s，1H)，8.08(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.09μM的IC50。
实施例10-54：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(吡啶-2-基甲基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮和2-(溴甲基)吡啶制备。收率：50％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.19(s，3H)，2.41(s，3H)，4.12(s，2H)，4.71(s，2H)，5.05(s，2H)，7.72-7.23(m，4H)，7.92(s，1H)8.08(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.68μM的IC50。
实施例10-55：1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮和4-(氯甲基)-3，5-二甲基异噁唑制备。收率：50％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：2.19(s，3H)，2.27(s，3H)，2.43-2.42(d，J＝5.2Hz，6H)， 3.82(s，2H)，4.40(s，2H)，5.05(s，2H)，7.92(s，1H)，8.05(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.04μM的IC50。
实施例10-56：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-(3-甲氧基苄基)咪唑烷-2，4-二酮
室温下，将盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(400mg，2.08mmol)、碳酸二吡啶-2-基酯(450mg，2.08mmol)和三乙胺(0.290mL，2.08mmol)在二氯甲烷(7mL)中搅拌12小时。将反应真空浓缩以获灰白色固体4-((4-异氰酸基-1H-吡唑-1-基)甲基)-3，5-二甲基异噁唑，定量收率。加入乙醇(1mL)，以及2-氨基-3-(3-甲氧基苯基)丙酸甲酯(68mg，0.327mmol)和三乙胺(0.064mL，0.461mmol)。将反应回流搅拌12小时，然后使之冷却至室温。在氮气流下除去溶剂。将粗产物再次悬浮于MeOH(1mL)，并通过反相HPLC(5至95％乙腈于H2O中：16分钟梯度)纯化。将纯级分合并，并真空除去溶剂以获得白色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-(3-甲氧基苄基)咪唑烷-2，4-二酮。收率：50％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.19(s，3H)，2.41(s，3H)，3.34-3.33(d，J＝3.2Hz，1H)，3.31-3.29(d，J＝8Hz，1H)，3.76(s，3H)，4.33-4.30(m，1H)，5.05(s，2H)，5.95(bs，1H)，7.25-7.21(t，1H)，6.82-6.78(m，3H)，7.85(s，1H)，7.99(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.13μM的IC50。
实施例10-57：5-(环己基甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-56由盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例10-41a)和2-氨基-3-环己基丙酸甲酯制备。收率：30％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.06-0.95(m，2H)，1.29-1.15(m，3H)，1.60-1.50(1H)1.77-1.67(7H)，1.91-1.85(m，1H)，2.19(s，3H)，2.41(s，3H)，4.19-4.15(m，1H)，5.05(s，2H)，6.01(bs，1H)，7.91(s，1H)，8.05(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.96μM的IC50。
实施例10-58：5-(环戊基甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-56由盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例10-41a)和2-氨基-3-环戊基丙酸甲酯制备。收率：50％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.20-1.14(m，3H)，1.68-1.55(m，6H)，2.04-1.92(m，2H)，2.19(s，3H)，2.42(s，3H)，4.14-4.11(m，1H)，5.05(s，2H)，5.52(bs，1H)，7.90(s，1H)，8.06(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.31μM的IC50。
实施例10-59：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-(4-羟基苄基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-56由盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例10-41a)和2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸甲酯制备。收率：50％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.41(s，3H)，2.85(s，3H)，3.26-3.25(d，1H，J＝4 Hz)，3.23-3.22(d，J＝4Hz，1H)4.31-4.28(m，1H)，5.04(s，2H)，5.77-5.74(bs，1H)，7.07-7.04(d，J＝12Hz，2H)，6.75-6.73(d，J＝8Hz，2H)，7.06(s，1H)，7.97(s，1H)，9.43(bs，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.33μM的IC50。
实施例10-60：5-(3，4-二羟基苄基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-56由盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例10-41a)和2-氨基-3-(3，4-二羟基苯基)丙酸甲酯制备。收率：50％。MS M+H计算值398.1；实测值398.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.51μM的IC50。
实施例10-61：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-异丁基咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-41由盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例10-41a)和2-异氰酸基-4-甲基戊酸乙酯制备。收率：50％。1HNMR(CDCl3，400MHz)：δ1.01-0.98(m，8H)，1.87-1.82(m，1H)，2.19(s，3H)，2.41(s，3H)，4.13-4.12(t，1H)，(5.05(s，2H)，5.70(bs，1H)，7.90(s，1H)，8.05(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.0μM的IC50。
实施例10-62：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-异丙基咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-41由盐酸1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(实施例10-41a)和2-异氰酸基-3-甲基丁酸乙酯制备。收率：30％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.96-0.94(d，3H，J＝7.2Hz)，1.09-1.07(d，3H，J＝8Hz)，2.19(s，3H)，2.26-2.22(m，1H)，2.40(s，3H)，4.02(s，1H)，5.05(s，2H)，5.53(bs，1H)，7.90(s，1H)，8.05(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.1μM的IC50。
实施例10-63：(Z)-5-亚苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
185℃下，将在冰醋酸(3mL)中的3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)(275mg，1mmol)、苯甲醛(140mg，1.3mmol)和醋酸钠(205mg，2.5mmol)在微波反应器中辐射7小时。当冷却后，混合物用H2O(100mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，50mL)萃取。合并的有机萃取物用饱和碳酸钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。固体产物用乙酸乙酯/己烷(1/1)研磨，并在高真空下干燥以获得淡黄色固体(Z)-5-亚苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(173mg，48％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ2.14(s，3H)，2.40(s，3H)，6.59(s，1H)，5.20(s，2H)，7.33-7.40(m，3H)，7.66(s，2H)，7.81(s，1H)，8.21(s，1H)，11.01(bs，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.34μM的IC50。
实施例10-64：4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
室温下，将4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-1-羧酸乙酯(3.2g，8.8mmol)在MeOH/1N NaOH水溶液(100mL)的(1/1)混合物中搅拌30分钟。混合物用1N HCl水溶液(150mL)酸化，用乙酸乙酯(3x，100mL)萃取，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得黄色固体4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(2.3g，89％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.18(s，3H)，2.44(s，3H)，3.05(s，3H)，5.17(s，2H)，7.94(s，1H)，8.13(s，1H)。
实施例10-64a：4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-1-羧酸乙酯
将氯甲酸乙酯(1.3g，12mmol)加入到N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基肼羧酰胺(实施例10-64b)(2.5g，9mmol)和三乙胺(1.2g，12mmol)在乙腈(100ml)中的混合物中。将混合物回流1小时，冷却，然后用1N HCl水溶液(150mL)稀释，并用乙酸乙酯(3x，75mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。固体用乙酸乙酯/己烷(1/3)研磨，在高真空下干燥以获得白色固体4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-甲基-3，5-二氧代-1，2，4-三唑烷-1-羧酸乙酯(3.2g，94％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，2.13(s，3H)，2.40(s，3H)，3.24(s，3H)，4.30(t，J＝7.2Hz，2H)，5.21(s，2H)，7.73(m，1H)，8.16(s，1H)。
实施例10-64b：N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1- 甲基肼羧酰胺
在回流温度下，将1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)(1.25g，5.3mmol)在甲苯(30mL)中搅拌40分钟。将混合物冷却至室温，并加入甲基肼(0.3mL，260mg，5.6mmol)，并将混合物回流30分钟。将反应冷却至室温后，在旋转蒸发仪上除去溶剂，并且固体产物用乙酸乙酯/己烷(2/5)研磨，并在高真空下干燥以获得白色固体N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基肼羧酰胺(1.1g，79％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.09(s，3H)，2.36(s，3H)，2.98(s，3H)，4.61(s，2H)，5.02(s，2H)，7.42(s，1H)，7.72(m，1H)，8.78(s，1H)。
实施例10-65：1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
将4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-64)(785mg，2.7mmol)溶解于乙腈(50mL)。加入三乙胺(1g，10mmol)和苄基溴(510mg，3mmol)，并将反应在室温下搅拌12小时。然后，混合物在旋转蒸发仪上浓缩，溶解于甲醇(5mL)，并通过反相HPLC(5-95％乙腈于H2O中：25分钟梯度)纯化。收集纯级分，并浓缩，并且产物在乙醇中重结晶以获得白色固体1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(210mg，， 20％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：δ2.13(s，3H)，2.39(s，3H)，3.09(s，3H)，4.81(s，2H)，5.18(s，2H)，7.30-7.35(m，5H)，7.76(s，1H)，8.18(s，1H)。MSM+H计算值381.1；实测值381.1。熔点：124-126℃。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.02μM的IC50。
实施例10-66：1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
按照实施例10-65由4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-64)和1-(2-溴乙基)-4-氟苯制备。收率：14％。1HNMR(CDCl3，400MHz)：.δ2.18(s，3H)，2.40(s，3H)，2.87(t，J＝6.8Hz，2H)，3.14(s，3H)，3.83(t，J＝7.2Hz，2H)，5.03(s，2H)，6.95(t，J＝8.4Hz，2H)，7.14(t，J＝8Hz，2H)，7.77(s，1H)，7.95(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.01μM的IC50。
实施例10-67：4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基-2-(2-苯氧基乙基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
按照实施例10-65由4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-64)和(2-溴乙氧基)苯制备。收率：20％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.13(s，3H)，2.40(s，3H)，3.15(s，3H)，3.99(t，J＝4.4Hz，2H)，4.13(t，J＝4.8Hz，2H)，5.20(s，2H)，6.80(d，J＝8 Hz，2H)，6.90(t，J＝7.1Hz，1H)，7.22(t，J＝8Hz，2H)，7.75(s，1H)，8.17(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.031μM的IC50。
实施例10-68：4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
将1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(实施例10-1a)(1g，4.1mmol)在甲苯(100mL)中回流1小时。将反应冷却至室温，并加入肼羧酸乙酯(0.45g，43mmol)。将反应加热至回流，并搅拌1小时，然后冷却，并在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物溶解于乙醇(100ml)，并加入碳酸钾(100mg)。将混合物回流12小时，然后过滤，冷却至室温，并用乙酸(大约7滴)中和。在旋转蒸发仪上除去溶剂，并且产生的固体用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨以获得灰白色固体4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(0.98g，85％)。1H NMR(CDCl3，400MHzδ2.18(s，3H)，2.41(s，3H)，4.98(s，2H)7.16(s，1H)，7.38(s，1H)。
实施例10-69：4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2-二甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
室温下，将4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-68)(100mg，0.36mmol)、碘甲烷(141mg，1mmol)和碳酸铯(325mg，1mmol)在乙腈/DMF(5mL)的2/1混合物中搅拌2小时。混合物用1N HCl水溶液(100mL)稀释，然后用乙酸乙酯(3x，50mL) 萃取。合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，浓缩，并将粗残留物溶解于MeOH，并通过反相HPLC(5至95％乙腈于H2O中：25分钟梯度)纯化。收集纯级分，并浓缩以获得澄清半固体4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2-二甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(89mg，80％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.18(s，3H)，2.41(s，3H)，3.22(s，6H)，5.04(s，2H)，7.88(s，1H)，8.03(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.6μM的IC50。
实施例10-70：1，2-二苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
按照实施例10-65由4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2-二甲基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-69)和苄基溴制备。收率：69％。1H NMR(CDCl3，400MHz)：.δ2.14(s，3H)，2.36(s，3H)，4.65(s，4H)，4.99(s，2H)，7.06-7.08(m，4H)，7.19-7.25(m，6H)，7.86(s，1H)，8.02(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.8μM的IC50。
实施例10--71：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-((6-(羟基甲基)吡啶-2-基)甲基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮和6-溴甲基-2-吡啶甲醇制备。收率：35％。MS M+H计算值397.2；实测值397.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有 0.72μM的IC50。
实施例10-72：1-((3，4-二甲氧基吡啶-2-基)甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-5由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮和盐酸3，4-二甲氧基-2-氯甲基吡啶制备。收率：26％。MSM+H计算值360.2；实测值360.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.0μM的IC50。
实施例10-73：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-((6-(四氢呋喃-2-基)甲基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮和四氢糠基溴制备。收率：28％。MS M+H计算值427.2；实测值427.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.4μM的IC50。
实施例10-74：1-(环己基甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和溴甲基环己烷制备。收率：20％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ0.88(q，J＝10.4Hz，2H)，1.09-1.19(m，3H)，1.58-1.65(m，6H)，2.12(s，3H)，2.38(s，3H)，3.13(d，J＝7.2Hz，2H)，4.06(s，2H)，5.17(s，2H)，7.75(s，1H)，8.14(s，1H)。MS M+H计算值372.2；实测值372.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.28μM的IC50。
实施例10-75：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-((6-甲氧基吡啶-2-基)甲基)咪唑烷-2，4-二酮
将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(100mg，0.4mmol)、(6-甲氧基-吡啶-2-基)-甲醇(实施例10-75a)(101mg，0.7mmol)、三丁基膦(147mg，0.7mmol)和1，1””-氮杂双(N，N-二甲基甲酰胺)(125mg，0.7mmol)溶解于THF(5mL)，并在室温下搅拌15小时。反应用盐水(100mL)稀释，并用乙酸乙酯(2x，100mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物溶解于甲醇(5mL)中，并通过HPLC(5至95％乙腈于H2O中：25分钟梯度)纯化。将纯级分合并，浓缩，然后再次溶解于乙酸乙酯/己烷(1∶9)中。在5℃下，将溶液冷却15小时，其中形成白色固体。收集沉淀以获得白色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-((6-甲氧基吡啶-2-基)甲基)咪唑烷-2，4-二酮(5mg，4％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.11(s，3H)，2.37(s，3H)， 3.74(s，3H)，4.17(s，2H)，4.54(s，2H)，5.17(s，2H)，6.69(d，J＝7.6Hz，1H)，6.96(d，J＝6.8Hz，1H)，7.67(d，J＝6.8Hz，1H)，7.76(s，1H)，8.17(s，1H)。MS M+H计算值397.2；实测值397.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.23μM的IC50。
实施例10-75a：(6-甲氧基吡啶-2-基)甲醇
将在无水甲醇(20mL)中的甲基-6-甲氧基吡啶-2-羧酸酯(2g，11.96mmol)在氮气下冷却至0℃，并将硼氢化钠(1.36g，35.89mmol)缓慢加入到该溶液。将该反应保持在0℃下搅拌30分钟，然后使之升至室温，持续1小时。反应用水淬灭，并在旋转蒸发仪上浓缩。反应用盐水(100mL)稀释，并用二氯甲烷/2-丙醇溶液(2∶1)(3x，150mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩以获得油状(6-甲氧基吡啶-2-基)甲醇(500mg，30％)。MS M+H计算值140.1；实测值140.1。
实施例10-76：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-甲氧基苯乙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例6)和2-甲氧基苯乙基溴制备。收率：52％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.11(s，3H)，2.38(s，3H)，2.80(t，J＝7.2Hz，2H)，3.51(t，J＝7.2Hz，2H)，3.75(s，3H)，4.03(s，2H)，5.17(s，2H)，6.85(t，J＝7.2Hz，1H)，6.95(d，J＝8.4Hz，1H)，7.16-7.21(m，2H)，7.73(s，1H)，8.13(s，1H)。MS M+H计算值410.2；实测值410.1。熔点：97-98℃。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.14μM的IC50。
实施例10-77：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-氟苯乙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和3-氟苯乙基溴制备。收率：22％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.11(s，3H)，2.38(s，3H)，2.80(t，J＝7.2Hz，2H)，3.57(t，J＝7.2Hz，2H)，4.06(s，2H)，5.17(s，2H)，6.85(dt，J＝8.4，2.0Hz，1H)，7.11(t，J＝8.4Hz，2H)，7.32(q，J＝7.8Hz，1H)，7.73(s，1H)，8.12(s，1H)。MS M+H计算值398.2；实测值398.1。熔点：110-111℃。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.06μM的IC50。
实施例10-78：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-苯乙基咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和苯乙基溴制备。收率：37％。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.11(s，3H)，2.38(s，3H)，2.83(t，J＝6.4Hz，2H)，3.55(t，J＝7.4Hz，2H)，4.03(s，2H)，5.17(s，2H)，7.18-7.30(m，5H)，7.73(s，1H)，8.13(s，1H)。MS M+H计算值380.2；实测值380.1。熔点：95-96℃。 显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.14μM的IC50。
实施例10-79：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(4-甲氧基苯乙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和4-甲氧基苯乙基溴制备。收率：32％。 1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ2.11(s，3H)，2.38(s，3H)，2.78(t，J＝7.4Hz，2H)，3.50(t，J＝7.4Hz，2H)，3.69(s，3H)，4.02(s，2H)，5.16(s，2H)，6.84(d，J＝8.4Hz，2H)，7.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.73(s，1H)，8.12(s，1H)。MS M+H计算值410.18；实测值410.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.04μM的IC50。
实施例10-80：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-萘-1-基)乙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和1-(2-溴乙基)萘制备。收率：20％。MSM+H计算值430.18；实测值430.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有1.27μM的IC50。
实施例10-81：1-(2-氯苯乙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和2-氯苯乙基溴制备。收率：25％。MSM+H计算值414.13；实测值414.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.25μM的IC50。
实施例10-82：1-(3-氯苯乙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和3-氯苯乙基溴制备。收率：27％。MSM+H计算值414.13；实测值414.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.20μM的IC50。
实施例10-83：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(2-氟苯乙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4- 基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和2-氟苯乙基溴制备。收率：24％。MSM+H计算值398.16；实测值398.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.13μM的IC50。
实施例10-84：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(4-氟苯乙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和4-氟苯乙基溴制备。收率：34％。MSM+H计算值398.16；实测值398.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.01μM的IC50。
实施例10-85：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-甲氧基苯乙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和3-甲氧基苯乙基溴制备。收率：34％。MS M+H计算值410.18；实测值410.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.16μM的IC50。
实施例10-86：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(4-羟基苯乙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和4-羟基苯乙基溴制备。收率：31％。MS M+H计算值396.16；实测值396.1。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.41μM的IC50。
实施例10-87：1-(3，4-二甲氧基苯乙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和3，4-二甲氧基苯乙基溴制备。收率：36％。MS M+H计算值440.19；实测值440.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.26μM的IC50。
实施例10-88：1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2-酮
室温下，将1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2-酮(实施例10-88a)(50mg，0.19mmol)和60％氢化钠(8mg，0.21mmol)在DMF(3mL)中搅拌15分钟，然后冷却至0℃。将苄基溴(33mg，0.19mmol) 加入到混合物中，然后使之升至室温，持续2小时。反应用甲醇淬灭，并在旋转蒸发仪上浓缩。反应用盐水(50mL)稀释，并用二氯甲烷(2x，50mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化以获得白色固体1-苄基-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2-酮(21mg，31％)。MS M+H计算值352.17；实测值352.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.71μM的IC50。
实施例10-88a：1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2-酮
0℃下，将1-(2-氯乙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)1H-吡唑-4-基)脲(实施例10-88b)(115mg，0.39mmol)和60％氢化钠(17mg，0.42mmol)在DMF(2mL)中搅拌15分钟，然后使之升至室温，并搅拌2小时。反应用甲醇淬灭，并在旋转蒸发仪上浓缩。反应用盐水(50mL)稀释，并用二氯甲烷(2x，50mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化以获得白色固体1-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2-酮(98mg，97％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.10(s，3H)，2.37(s，3H)，3.35-3.39(m，2H)，3.61(d，J＝8.8Hz，1H)，3.63(d，J＝10.4Hz，1H)，5.07(s，2H)，6.71(s，1H)，7.42(s，1H)，7.74(s，1H)。MS M+H计算值262.12；实测值262.1。
实施例10-88b：1-(2-氯乙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)脲
65℃下，将在乙腈(5mL)中的1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(419mg，2.18mmol)和异氰酸2-氯乙酯(230mg，2.18mmol)加热16小时。将反应冷却至室温，并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化，干燥，并用乙酸乙酯/己烷(1/9)研磨以获得黄色固体(1-(2-氯乙基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)1H-吡唑-4-基)脲(258mg，40％)。MS M+H计算值298.10；实测值298.1
实施例10-89：1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-(甲氧基甲基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
按照实施例10-91由1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-91a)和溴甲醚制备。收率：18％。MS M+H计算值411.17；实测值411.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.02μM的IC50。
实施例10-90：1-((1，3-二甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮
将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(10a)(200mg，0.7mmol)、4-(氯甲基)-1，3-二甲基-1H-吡唑(144mg，1mmol)和碳酸铯(325mg，1mmol)溶解于2mL DMF中，并在165℃下在微波反应器中辐射5分钟。将反应冷却至室温，并通过过滤除去盐沉淀。获得含有 粗产物的澄清溶液，并通过HPLC(10至95％乙腈/水；25分钟)纯化以获得淡棕色固体1-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(150mg，53％)。12.09HNMR(DMSO，400MHz)：δ(s，3H)，2.14(s，3H)，2.20(s，3H)，3.70(s，3H)，3.99(s，2H)，4.55(s，2H)，5.19(s，2H)，6.06(s，H)，7.77(s，H)，8.17(s，H)，。MS M+H计算值384.2；实测值384.2。熔点：145-146℃。
实施例10-91：1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-乙基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
80℃下，将在DMF(5mL)中的1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(100mg，0.27mmol)、溴乙烷(149mg，1.36mmol)和碳酸铯(355mg，1.1mmol)加热15小时。将反应冷却至室温，用盐水(50mL)稀释，并用乙酸乙酯(2x，50mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤，并在旋转蒸发仪上浓缩。残留物通过HPLC(5至95％乙腈于H2O中：25分钟梯度)纯化以获得油状1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-乙基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(40mg，37％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)：.δ0.97(t，J＝7.2Hz，3H)，2.13(s，3H)，2.39(s，3H)，3.58(q，J＝6.8Hz，2H)，4.80(s，2H)，5.18(s，2H)，7.28-7.36(m，5H)，7.77(s，1H)，8.19(s，1H)。MS M+H计算值395.18；实测值395.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.04μM的IC50。
实施例10-91a：1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
100℃下，将在乙腈(50mL)中的1-苄基-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)肼羧酰胺(2.00g，5.88mmol)、氯甲酸乙酯(6.38g，58.77mmol)和三乙胺(1.78g，17.63mmol)加热48小时。将混合物冷却至80℃，加入1M NaOH(水溶液)(5mL)，并将反应混合物搅拌1小时。将反应冷却至室温，并在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物溶解于二氯甲烷，并过滤以除去盐，并将溶液浓缩以获得黄色油状1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(1.28g，60％)。MS M+H计算值367.14；实测值367.2。
实施例10-91b：1-苄基-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)肼羧酰胺
将在甲苯(70mL)中的1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基-1H-吡唑-4-羰基叠氮化物(2.79g，11.33mmol)加热回流4小时以原位获得4-((4-异氰酸基-1H-吡唑-1-基)甲基)-3，5-二甲基异噁唑。将苄基肼二盐酸盐(2.44g，12.45mmol)和三乙胺(2.29g，22.64mmol)加入到混合物。将混合物在100℃下加热额外的4小时。将反应冷却至室温，用乙酸乙酯(150mL)稀释，并通过硅藻土过滤。然后，母液用盐水(150mL)洗涤，然后有机层用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残留物通过硅胶柱色谱(100％至90％二氯甲烷于甲醇中：30分钟梯度)纯化以获得油状1-苄基-N-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)肼羧酰胺(2.00g，52％)。MS M+H计算值341.16；实测值341.2。
实施例10-92：1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4- 基)-2-(2-甲氧基乙基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
按照实施例10-91由1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-91a)和2-溴乙基甲基醚制备。收率：20％。MS M+H计算值425.19；实测值425.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.06μM的IC50。
实施例10-93：1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2-丙基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
按照实施例10-91由1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-91a)和1-溴丙烷制备。收率：38％。MS M+H计算值409.19；实测值409.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.06μM的IC50。
实施例10-94：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1-(3-苯基丙基)咪唑烷-2，4-二酮
按照实施例10-52由3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮(实施例10-1)和(3-溴丙基)苯制备。收率：36％。MS M+H计算值394.2；实测值394.2。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.26μM的IC50。
实施例10-95：1-苄基-2-丁基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮
按照实施例10-91由1-苄基-4-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-1，2，4-三唑烷-3，5-二酮(实施例10-91a)和1-溴丁烷制备。收率：22％。MS M+H计算值423.21；实测值423.15。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.41μM的IC50。
实施例10-96：3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苄基氨基甲酸叔丁酯
将3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)咪唑烷-2，4-二酮 (实施例10-1)(070mg，0.254mmol)、3-(羟基甲基)苄基氨基甲酸叔丁酯(0.254mmol，60mg)、偶氮二羧酸二乙酯(0.50mmol，86mg)和P-tBu3(125mL，0.50mmol)在THF(1mL)中搅拌4小时。反应用乙酸乙酯(1.5mL)稀释，并用饱和碳酸氢钠溶液(2x，1.5mL)洗涤。收集有机相，并且在氮气流下浓缩混合物。粗产物通过柱色谱在硅胶上使用乙酸乙酯作为洗脱液纯化。将纯级分合并，并在旋转蒸发仪上除去溶剂以获得白色固体3-((3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-2，4-二氧代咪唑烷-1-基)甲基)苄基氨基甲酸叔丁酯(112mg，90％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.44(s，9H)，2.19(s，3H)，2.42(s，3H)，3.48(bs，1H)，3.84(s，2H)，4.31-4.30(d，J＝6Hz，1H)，4.60(s，2H)，4.87(bs，1H)，5.06(s，2H)，7.36-7.16(m，4H)，7.92(s，1H)，8.08(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有0.90μM的IC50。
实施例10-97：3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-(羟基甲基)咪唑烷-2，4-二酮
将4-((4-异氰酸基-1H-吡唑-1-基)甲基)-3，5-二甲基异噁唑(实施例10-1)(784mg，3.6mmol)、丝氨酸甲酯盐酸盐(672mg，4.32mmol)和三乙胺(1mL，7.2mmol)在甲苯(16mL)中回流8小时。使反应冷却至室温，然后在旋转蒸发仪上浓缩溶液。产物通过反相HPLC(5至95％乙腈于H2O中：16分钟梯度)纯化以获得白色固体3-(1-((3，5-二甲基异噁唑-4-基)甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-(羟基甲基)咪唑烷-2，4-二酮(60mg，25％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)：.δ(s，3H)，2.40(s，3H)，3.13-3.07(m，1H)，3.94-3.93(d，J＝4Hz，2H)，4.21-4.19(t，J＝4Hz，1H)，5.03(s，2H)，6.68(bs，1H)，7.87(s，1H)，7.99(s，1H)。显示标题化合物抑制hT2R08苦味受体，并具有3μM的IC50。
实施例11.对于具有hT2R43和hT2R44基因的“非品尝者”形式的人，hT2R8引起糖精的苦味。
图6显示在表达hT2R43、hT2R44和hT2R8的变体的转染细胞中，糖精对受体活性的剂量响应关系和效应。在体外测定中，hT2R8对糖精的响应低于“品尝者”hT2R43-W35和hT2R44-W35等位基因，但高于“非品尝者”hT2R43-S35和hT2R44-R35等位基因。Pronin等人，Curr.Biol.17：1403-8(2007)。根据基因型分型分析，选择具有“品尝者”等位基因(hT2R43-W35和/或hT2R44-W35)的五个个体和具有“非品尝者”等位基因(hT2R43-S35和hT2R44-R35)的五个个体。向每个受试者提供6对溶液，并要求确定各对中哪个样品的味道更苦。以下表8中显示的结果表明hT2R8阻断剂Cpd-D减少具有hT2R43和hT2R44“非品尝者”等位基因的人的糖精的苦味，但对具有那些基因的“品尝者”等位基因的人无影响。
表8：味觉测试结果
通过本发明提供的和/或适合用于本发明的方法的其他示例性化合物 包括下式的化合物。
在第一方面，提供了结构式(I)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar1是5或6元芳基、杂芳基或环烷基环；
m是0、1、2或3；
R1是SO2；C＝O；C＝S；或C＝NOR4；
X选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R1′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
或可选地，X和/或至少一个R1′与它们所键合的原子一起形成芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基环，其中所述环任选地稠合于另一芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂 烷基环；
R4-R8独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基和取代的杂芳基烷基，或可选地，R5和R6、R6和R7、R7和R8与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；
A和B独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基；且
b是0、1或2；
在第二方面，本发明提供了以下显示的结构式(II)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar1、Ar2和Ar3独立地是5或6元芳基、杂芳基或环烷基环；
m是0、1、2或3；
n和p独立地是0、1、2、3或4；
r和t独立地是0、1或2；
Y和Z独立地选自由以下组成的组：CR6R7、C＝O、C＝S、C＝NOR6、O、NR6和S(O)b；
R1选自由以下组成的组：SO2、C＝O、C＝S和C＝NOR4；
X可选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂 烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、-OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
X优选地选自由以下组成的组：氢、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、S(O)bR6、CONR6R7、-CO2R6、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)。
每个R1′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R2′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)和P(O)(OR5)(OR6)；
每个R3′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
或可选地，X和/或R1’中的至少一个与它们所键合的原子一起形成芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基环，其中所述环任选地稠合于另一芳基、取代的芳 基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基环；
R4-R8独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基，或可选地，R5和R6、R6和R7、R7和R8与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；
b是0、1或2。
在另一个方面中，本发明提供了具有以下所示的结构式(III)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar1、Ar2和Ar3独立地是5或6元芳基、杂芳基或环烷基环，且Ar2和Ar3可任选地被省略；
m是0、1、2或3；
n和p独立地是0、1、2、3或4；
每个R1′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R2′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳 基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R3′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
R5-R8独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基，或可选地，R5和R6、R6和R7、R7和R8与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；
b是0、1或2。
在又一个方面中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一个方面中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在相关的方面中，提供了结构式(IV)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar4和Ar5独立地是5或6元芳基或杂芳基环；
W选自由以下组成的组：CR6R7、C＝O、C＝S；C＝NOR6；O、NR6、S、SO、SO2和(CH2)n；
n是0、1、2或3；
G选自由以下组成的组：CR6R7、C＝O、C＝S、C＝NOR6和S(O)b；
R20选自由以下组成的组：氢、芳基烯基、杂芳基烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基-烷基、烯基、环烷基、环烯基和取代的衍生物；
R21选自由以下组成的组：芳基烯基、杂芳基烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基-烷基、烯基、环烷基、环烯基和取代的衍生物；
R6和R7独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基，或可选地，R6和R7与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；且
b是0、1或2。
在另一个相关的方面中，提供了结构式(V)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
Ar4和Ar5独立地是5或6元芳基或杂芳基环；
n是0、1、2或3；
R21选自由以下组成的组：芳基烯基、杂芳基烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基-烷基、烯基、环烷基、环烯基和取代的衍生物；
R35选自由氢、烷基和取代的烷基组成的组。
在另外其他的实施方案中，本发明提供了结构式(VI)的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中：
R30选自由以下组成的组：芳基烯基、杂芳基烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基-烷基、烯基、环烷基、环烯基和取代的衍生物；
R35选自由氢、烷基和取代的烷基组成的组。
在另外其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中每个R独立地是Cl、MeO、CN、EtO、OH、Me、-SO2Me、F或H，且
n是0、1、2、3或4。
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中每个R独立地是MeO或OH，且
n是0、1、2、3或4。
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
其中R是H、Me、Et、OCOMe、CH2OH、OMe或Ph。
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物：
在又一其他的实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物：
在一方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Ar6和Ar7彼此独立地相同或不同，为5或6元芳基或5或6元杂芳基；
Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R36和R37彼此独立地相同或不同，为H、烷基，或
R36和R37与它们所连接的原子一起形成任选地取代的5或6元杂环；且
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基。
在一个方面中，本发明的化合物含有五元杂环。在一个实施方案中，五元杂环是乙内酰脲或取代的或未取代的环脲。
在一个实施方案中，所述乙内酰脲是下式的乙内酰脲，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Ar6和Ar7彼此独立地相同或不同，为5或6元芳基或5或6元杂芳基；
Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；且
R39和R40彼此独立地相同或不同，为H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基、卤代烷基，或R39和R40与它们所连接的碳原子一起形成C＝O基团或取代的或未取代的烯基。
在另一个方面中，本发明的化合物含有五元杂环，其为尿唑。在一个实施方案中，所述尿唑是下式的尿唑，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Ar6和Ar7彼此独立地相同或不同，为5或6元芳基或5或6元杂芳基；
Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；且
R41是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基。
在另一个方面中，本发明的化合物含有6元杂环。在一个实施方案中，所述6元杂环是下式的6元杂环，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；且
R42、R43、R44、R45和R46彼此独立地相同或不同、为H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或R42和R43或R45和R46与各自所连接的碳原子一起形 成C＝O基团。
在又一个方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
M1是N或CR49，其中R49是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR50，其中R50是H或取代的或未取代的烷基；
R36和R37彼此独立地相同或不同，为H、烷基，或R36和R37与它们所连接的原子一起形成任选地取代的5或6元杂环；且
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；
R47是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；且
R48是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代。
在又一个方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
T1是C＝O，且Q是CR51R52或NR51，其中R51和R52彼此独立地相同或不同，为H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基、卤代烷基，或R51和R52与它们所连接的碳原子一起形成C＝O基团或取代的或未取代的烯基；
M1是N或CR49，其中R49是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR50，其中R50是H或取代的或未取代的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；
R47是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基或卤代；且
R48是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基或卤代。
在又一个方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
在又一个方面中，本发明涉及下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药：
在又一个方面中，本发明涉及制备下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药的方法：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
T2是C＝S、C＝O或S(O)2；
R53是取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的芳基烷基；
M1是N或CR54，其中R54是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR55，其中R55是H或取代的或未取代的烷基；
R56是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基或卤代；且
R57是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基或卤代；
其中所述方法包括将式
的化合物与式
的化合物反应，
其中R56、R57和Alk如上文定义，且J是离去基团；
其中M1和M2如上文定义；
以获得具有NO2基团的下式的化合物
还原NO2基团以获得具有NH2基团的化合物；且
将具有NH2基团的化合物与下式的化合物反应：
其中J2是离去基团，且T2和R53如上文定义。
在又一个方面中，本发明涉及制备下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药的方法：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R51和R52彼此独立地相同或不同，为H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基、卤代烷基，或R51和R52与它们所连接的碳原子一起形成取代的或未取代的烯基；
M1是N或CR49，其中R49是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR50，其中R50是H或取代的或未取代的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；
R47是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基或卤代；且
R48是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基或卤代；
其中所述方法包括加热下式的化合物：
其中R47、R48、Alk、M1和M2如上文定义；
以将-CON3基团转化成-N＝C＝O基团，且随后与下式的化合物反应：
其中J3是离去基团，且R38、R51和R52如上文定义。
在又一个方面中，本发明涉及制备下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物或前药的方法：
其中Alk是由杂原子任选地中断的烷基；
R52是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基、卤代烷基；
M1是N或CR49，其中R49是H或取代的或未取代的烷基；
M2是N或CR50，其中R50是H或取代的或未取代的烷基；
R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取 代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂芳基烷基，或卤代烷基；
R47是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；且
R48是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基，或卤代；
其中所述方法包括加热下式的化合物：
其中R47、R48、Alk、M1和M2如上文定义；
以将-CON3基团转化成-N＝C＝O基团，且随后与下式的肼反应：
其中R38如上文定义。
在又一个方面中，本发明涉及制备下式的化合物，或其盐、水合物、溶剂化物或N-氧化物的方法：
其中：
Ar1、Ar2和Ar3独立地是5或6元芳基、杂芳基或环烷基环，且Ar2 和Ar3可任选地被省略；
m是0、1、2或3；
n和p独立地是0、1、2、3或4；
每个R1′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R2′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
每个R3′独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、酰基、取代的酰基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基、取代的杂芳基烷基、CN、NO2、OR6、S(O)bR6、NR6R7、CONR6R7、CO2R6、NR6CO2R7、NR6CONR7R8、NR6CSNR7R8、NR6C(＝NH)NR7R8、SO2NR5R6、NR5SO2R6、NR5SO2NR6R7、B(OR5)(OR6)、P(O)(OR5)(OR6)和P(O)(R5)(OR6)；
R5-R8独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基，或可选地，R6和R7、R7和R8与它们所键合的原子一起形成环杂烷基或取代的环杂烷基环；
b是0、1或2；
其中所述方法包括使式
的化合物与式
的化合物反应，其中J是离去基团；
以获得产物；且
将产物与下式的化合物反应：
其中J是离去基团。
嵌合G蛋白和hT2R基因和多肽的序列
视紫红质标签的蛋白质序列(SEQ ID NO：1)
MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVRSPFEAPQYYLAEPW
G16gust44的蛋白质序列(SEQ ID NO：2)
MARSLTWRCCPWCLTEDEKAAARVDQEINRILLEQKKQDRGELKLLLLGPGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSEEERKGFRPLVYQNIFVSMRAMIEAMERLQIPFSRPESKHHASLVMSQDPYKVTTFEKRYAAAMQWLWRDAGIRACYERRREFHLLDSAVYYLSHLERITEEGYVPTAQDVLRSRMPTTGINEYCFSVQKTNLRIVDVGGQKSERKKWIHCFENVIALIYLASLSEYDQCLEENNQENRMKESLALFGTILELPWFKSTSVILFLNKTDILEEKIPTSHLATYFPSFQGPKQDAEAAKRFILDMYTRMYTGCVDGPEGSNLKKEDKEIYSHMTCATDTQNVKFVFDAVTDIIIKENLKDCGLF
hT2R8序列：
DNA-(SEQ ID NO：3)
ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACTAGGAATATTGGGGAATGGATACAT
TGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAGTTGACTACATCCTTACCAATTTAGTTATCG
CCAGAATTTGTTTGATCAGTGTAATGGTTGTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAACCCAGATGTTTATACAAAAAATAAA
CAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATGTGGATTACCACCTGCCTTAATGTCTTCTA
TTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAAATTGATATGGTGGTGCACTGGATCC
TGCTGGGATGCTTTGCCATTTCCTTGTTGGTCAGCCTTATAGCAGCAATAGTACTGAGTTGTGATTATAGGTTTCATGCA
ATTGCCAAACATAAAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGTAAAATACCATACTTTGAACCCTTaACTCTCTTTAA
CCTGTTTGCAATTGTCCCATTTATTGTGTCACTGATATCATTTTTCCTTTTAGTAAGATCTTTATGGAGACATACCAAGC
AAATAAAACTCTATGCTACCGGCAGTAGAGACCCCAGCACAGAAGTTCATGTGAGAGCCATTAAAACTATGACTTCATTT
ATCTTCTTTTTTTTCCTATACTATATTTCTTCTATTTTGATGACCTTTAGCTATCTTATGACAAAATACAAGTTAGCTGT
GGAGTTTGGAGAGATTGCAGCAATTCTCTACCCCTTGGGTCACTCACTTATTTTAATTGTTTTAAATAATAAACTGAGGC
AGACATTTGTCAGAATGCTGACATGTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA
蛋白质-(SEQ ID NO：4)
MFSPADNIFIILITGEFILGILGNGYIALVNWIDWIKKKKISTVDYILTNLVIARICLISVMVVNGIVIVLNPDVYTKNK
QQIVIFTFWTFANYLNMWITTCLNVFYFLKIASSSHPLFLWLKWKIDMVVHWILLGCFAISLLVSLIAAIVLSCDYRFHA
IAKHKRNITEMFHVSKIPYFEPLTLFNLFAIVPFIVSLISFFLLVRSLWRHTKQIKLYATGSRDPSTEVHVRAIKTMTSF
IFFFFLYYISSILMTFSYLMTKYKLAVEFGEIAAILYPLGHSLILIVLNNKLRQTFVRMLTCRKIACMI
hT2R14序列：
DNA-(SEQ ID NO：5)
ATGGGTGGTGTCATAAAGAGCATATTTACATTCGTTTTAATTGTGGAATTTATAATTGGAAATTTAGGAAATAGTTTCAT
AGCACTGGTGAACTGTATTGACTGGGTCAAGGGAAGAAAGATCTCTTCGGTTGATCGGATCCTCACTGCTTTGGCAATCT
CTCGAATTAGCCTGGTTTGGTTAATATTCGGAAGCTGGTGTGTGTCTGTGTTTTTCCCAGCTTTATTTGCCACTGAAAAA
ATGTTCAGAATGCTTACTAATATCTGGACAGTGATCAATCATTTTAGTGTCTGGTTAGCTACAGGCCTCGGTACTTTTTA
TTTTCTCAAGATAGCCAATTTTTCTAACTCTATTTTTCTCTACCTAAAGTGGAGaGTTAAAAAGGTGGTTTTGGTGCTGC
TTCTTGTGACTTCGGTCTTCTTGTTTTTAAATATTGCACTGATAAACATCCATATAAATGCCAGTATCAATGGATACAGA
AGAAACAAGACTTGCAGTTCTGATTCAAGTAACTTTACACGATTTTCCAGTCTTATTGTATTAACCAGCACTGTGTTCAT
TTTCATACCCTTTACTTTGTCCCTGGCAATGTTTCTTCTCCTCATCTTCTCCATGTGGAAACATCGCAAGAAGATGCAGC
ACACTGTCAAAATATCCGGAGACGCCAGCACCAAAGCCCACAGAGGAGTTAAAAGTGTGATCACTTTCTTCCTACTCTAT
GCCATTTTCTCTCTGTCTTTTTTCATATCAGTTTGGACCTCTGAAAGGTTGGAGGAAAATCTAATTATTCTTTCCCAGGT
GATGGGAATGGCTTATCCTTCATGTCACTCATGTGTTCTGATTCTTGGAAACAAGAAGCTGAGACAGGCCTCTCTGTCAG
TGCTACTGTGGCTGAGGTACATGTTCAAAGATGGGGAGCCCTCAGGTCACAAAGAATTTAGAGAATCATCTTGA
蛋白质-(SEQ ID NO：6)
MGGVIKSIFTFVLIVEFIIGNLGNSFIALVNCIDWVKGRKISSVDRILTALAISRISLVWLIFGSWCVSVFFPALFATEK
MFRMLTNIWTVINHFSVWLATGLGTFYFLKIANFSNSIFLYLKWRVKKVVLVLLLVTSVFLFLNIALINIHINASINGYR
RNKTCSSDSSNFTRFSSLIVLTSTVFIFIPFTLSLAMFLLLIFSMWKHRKKMQHTVKISGDASTKAHRGVKSVITFFLLY
AIFSLSFFISVWTSERLEENLIILSQVMGMAYPSCHSCVLILGNKKLRQASLSVLLWLRYMFKDGEPSGHKEFRESS
尽管以上的详细描述已经描述了本发明的几种实施方案，但是应理解，以上描述仅为示例，且不限制公开的发明。本发明仅由以下的权利要求限制。

Claims (8)

1.一种下式的化合物，或其盐：
其中Alk是C1-4烷基；
M1是CR49，其中R49是H；
M2是CR50，其中R50是H；
R47是C1-4烷基；
R48是C1-4烷基；并且
其中G是C＝O；Q是NR51，其中R51为H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基或者取代的或未取代的芳基烷氧基，其中所述芳基选自苯基，所述环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基和环己基，并且其中当被取代时，所述取代基选自卤代基团、烷基基团、羟基、烷氧基基团，及其组合；以及R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基烷基或者取代的或未取代的芳基烷氧基，其中所述芳基是苯基，并且其中当被取代时，所述取代基选自卤代基团、烷基基团、羟基、烷氧基基团，及其组合；或者
其中G是C＝O；Q是CR51R52，其中R51和R52彼此独立地相同或不同，为H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基或者取代的或未取代的芳基烷氧基，其中所述环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基和环己基，并且所述芳基是苯基；以及R38是H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基烷基、取代的或未取代的杂环烷基烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的杂芳基酰氨基烷基、取代的或未取代的芳基烷基、取代的或未取代的芳基烷氧基、取代的或未取代的杂芳基或者取代的或未取代的杂芳基烷基，其中所述芳基选自苯基和萘基，所述杂芳基选自吡啶基、呋喃基、噁唑基和咪唑基，所述环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基和环己基，所述杂环烷基是其环中的至少一个碳原子被杂原子所取代的环烷基，该环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基和环己基，并且该杂原子选自O或N；当被取代时，所述取代基选自卤代基团、全氟代烷基基团、全氟代烷氧基基团、烷基基团、羟基基团、氧代基团、巯基基团、烷基硫基团、烷氧基基团、氨基基团、烷基氨基基团和二烷基氨基基团、氨基甲酰基基团、烷基羰基基团、羧基基团、烷氧基羰基基团、烷基氨基羰基基团、二烷基氨基羰基基团、烷基磺酰基基团、氰基基团、芳基硫基团、硝基基团、酮基基团、酰基基团、磺酰基基团及其组合；
其中所述烷基是C1-4烷基。
2.权利要求1的化合物，其中所述Alk是亚甲基基团。
3.下式的化合物，或其盐：
4.下式的化合物，或其盐：
5.下式的化合物，或其盐：
6.一种组合物，该组合物包括权利要求1-5中的任一项所述的一种或多种化合物或其盐、和一种或多种药学上可接受的载体。
7.权利要求6的组合物，该组合物是人或动物摄取的食物、饮料或药物。
8.食物、饮料或药物组合物，其具有苦味，其中所述的苦味通过添加有效量的权利要求1－5中的任一项所述的化合物或其盐来减少或消除。
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