CN1434921A - T2r味觉受体及其编码基因 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了新鉴定的哺乳动物味觉细胞特异性G蛋白耦联受体及编码这些受体的基因。尤其描述了被认为参与苦味味觉感受的T2R G蛋白耦联受体及编码相同受体的基因,以及分离这些基因和分离和表达这些受体的方法。本发明同时描述了表征哺乳动物特定味觉元的味觉感知的方法,以及产生能够在哺乳动物中引发预定味觉感知的新分子或分子组合的方法,和刺激一种或多种味觉的方法。
Description
涉及申请的交叉参考
本申请要求以下两个申请的优先权,即2000年4月7日申请的U.S.Ser.No.60/195,532和2000年11月13日申请的U.S.Ser.No.60/247,014,这两者专利申请此处全文引用作为参考。
发明领域
本发明涉及最近鉴定的哺乳动物化学感受G蛋白耦联受体、这些受体的家族和编码这些受体的基因和cDNA。本发明尤其涉及最近鉴定的在味觉信号发生上活跃的哺乳动物化学感受G蛋白耦联受体、这些受体的家族、编码这些受体的基因和cDNA,并涉及在分析、发现味觉调节子时这类受体、基因和cDNA的使用方法。
背景技术
味觉系统提供了关于外界化学组分的感受信息。味觉转换是动物化学触发的感受中最复杂的形式之一,整个动物界,从后生动物(metazoans)到最复杂的脊椎动物都普遍存在。通常认为哺乳动物有五种基本味觉形式:甜、苦、酸、咸和鲜(umami,谷氨酸钠的味道)。
每种不同的味觉形式被认为是由截然不同的传导途径来介导的。这些途径被认为是由受体介导,例如代谢趋向性(metabotropic)受体或变力(inotropic)受体,这些受体表达于味觉受体细胞亚类(subsets)中。例如,一些受体被认为是由G蛋白耦联受体介导的,而其它味觉被认为是由通道蛋白介导的(例如参见,Kawamura等,鲜味入门:一种基本味道(Introduction to Umami:A Basic Taste)(1987);Kinnamon等,生理学年度综述(Ann.Rev.Physiol.),54:715-31(1992);Lindemann,生理学综述(Physiol.Rev.),76:718-66(1996);Stewart等,美国生理学杂志(Am.J.Physiol.),272:1-26(1997))。
在哺乳动物中,味觉受体细胞被组装成味蕾,这些味蕾广泛分布在舌上皮细胞的不同乳头中。轮廓乳头位于舌的最后部,包含成百上千个味蕾。与此相对照的是,位于舌后侧面的叶状乳头含有几十到几百个味蕾。此外,位于舌前部的菌状乳头,仅有一个或几个味蕾。
根据不同种类,每个味蕾含有50-150个细胞,包括前体细胞、支持细胞和味觉受体细胞。例如参见,Lindemann,生理学综述(Physiol.Rev.),76:718-66(1996)。受体细胞基部布满传入神经末梢,通过脑干和丘脑的突触,这些神经末梢将信息传递给大脑皮层的味觉中枢。阐明味觉细胞信号发生和信息处理的机制对于理解味觉的功能、调节和感知是非常重要的。
大量动物生理学研究表明味觉受体细胞可能对不同化学刺激选择性地产生反应(例如参见,Akabas et al.,Sc ience,242:1047-50(1988);gilbertson et al.,J.Gen.Physiol.,100:803-24(1992);Bernhardtet al.,J.Physiol.,490:325-36(1996);Cummings et al.,J.Neurophysiol.,75:1256-63(1996))。特别是,表达这些受体的细胞在暴露在特定化学刺激下,通过去极化产生动作电位从而引发味觉感受。通常认为动作电位在尝觉传入神经元突触处触发了神经递质的释放,从而启动了神经途径上的信号发生,由此介导味觉感知(例如参见,Roper,神经科学年度综述(Ann.Rev.Neurosci.),12:329-53(1989))。虽然如此,目前对于味觉感受由何种方式引发仍了解甚少(例如参见,Margolskee,BioEssays,15:645-50(1993);Avenet等J.MembraneBiol.,112:1-8(1989))。
如上所述,味觉受体特异性地识别能够引发特定味觉感受的分子。这些分子在此处也被称作“味觉元(tastant)”。许多味觉受体属于7-跨膜受体超家族(Hoon等,细胞(Cell)96:451(1999);Adler等,细胞100:693(2000)),同样也被认为是G蛋白耦联受体(GPCR)。G蛋白耦联受体控制许多生理功能,如内分泌功能、外分泌功能、心率、脂解作用、糖代谢和跨膜信号发生。许多这类受体的生物化学分析和分子克隆已经揭示了关于这些受体功能的许多基本原理。
例如,美国专利号5,691,188描述了如何在配体(ligand)与GPCR结合后,这个受体可能发生构象改变,从而导致G蛋白激活。G蛋白包含三个亚基:一个与脒基核苷酸结合的α亚基,一个β亚基和一个γ亚基。G蛋白在两种形式中循环,取决于GDP和GTP是否结合到α亚基上。GDP结合上之后,G蛋白以异三体(heterotrimer)形式存在:即Gαβγ复合物。当GTP结合后,α亚基从异三体上解离,剩下Gβγ复合物。当Gαβγ复合物在细胞膜上与激活的G蛋白耦联受体结合时,GTP交换结合GDP的速度加快,结合的Gα亚基从Gαβγ复合物中解离的速度亦随之加快。游离Gα亚基和Gβγ复合物因此能够传递一个信号到多种信号传导途径下游环节。这些事件形成不同细胞信号现象多样性的基础,包括例如味觉和/或嗅觉被认为是神经学感受感知的信号现象。
众多的人类和其它真核化学感受受体全部或部分序列现在都已清楚。(例如参见,Pilpel,Y和Lancet,D,蛋白质科学(Protein Science),8:969-977(1999);Mombaerts,P.,神经科学年度综述,22:487-50(1999);EP0867508A2,US 5874243,WO 92/17585,WO 95/18140,WO 97/17444,WO 99/67282)。尽管人们对于味觉细胞功能的精神物理学和生理学了解很多,但对于介导感受信号反应的分子和途径缺乏了解。新型味觉受体和味觉信号发生分子的鉴定和分离能够产生化学和遗传调节味觉传导途径的新方法。例如,如果有受体和通道蛋白,就能够筛选味觉活性的高亲和力激动剂、拮抗剂、反向激动剂和调节剂。这些味觉调节化合物在药品和食品工业十分有益,它们可以改进多种消费品的味道,或阻断一些令人不快的味道,如某些产品的苦味。
发明概述
本发明部分强调更好理解化学感受受体和化学刺激之间相互作用的必要性。因此,本发明提供新型味觉受体和使用这些受体的方法以及编码该类受体的基因和cDNA等等,来鉴定能用于调节味觉传导的分子。
本发明尤其涉及一种最近发现的G蛋白耦联受体家族,和编码这些受体的基因和cDNA。这些受体被认为主要参与苦味味觉传导,但同样也可能参与从其它味觉形式的信号转换。
本发明提供了哺乳动物包括人类中味觉感知的描述方法和/或预知味觉感知的方法。优选地,这些方法可以通过使用这些受体和使用编码此处所述受体的基因来完成。
为此,本发明的一个目的就是提供一种哺乳动物G蛋白受体新家族,在此称为T2R,T2R在味觉感知中具有活性。本发明的另一个目的是提供能够保留味觉元结合活性的这些T2R的片段和变体(variants)。
本发明的另一个目的是提供编码这种T2R及其片段或变体的核酸序列或分子。
本发明的另一个目的仍是提供表达载体,其中包含编码这种T2R或其片段或变体的核酸序列,这些序列可操作性地连接到至少一种调节序列如启动子、增强子或参与正向或负向基因转录和/或翻译的其它序列。
本发明的另一个目的仍是提供功能性表达至少一种T2R或其片段或变体的人类或非人类细胞。
本发明的另一个目的仍是提供T2R融合蛋白质或多肽,包含至少一种这种T2R中的至少一个片段。
本发明的另一个目的是提供一种分离的编码T2R多肽的核酸分子,该分子包含一个核酸序列,其与选自下列的核酸序列至少50%,优选75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同:SEQ ID NO:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19和23和其保守性修饰的变体序列。
本发明的另一个目的是提供一种分离的核酸分子,该分子包含一个核酸序列,其编码一条多肽,其氨基酸序列与选自下列的氨基酸序列至少35%到50%,优选60%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同:SEQ ID NO:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,24和其保守性修饰的变体序列,其中该片段长度至少是20,优选40,60,80,100,150,200或250个氨基酸。任选地,片段可以是能结合抗-T2R抗体的抗原性片段。
本发明的另一个目的是提供分离的多肽,其包含所述片段的变体,其中最多在10,优选5,4,3,2或1个氨基酸残基处存在变异。
本发明的另一个目的是提供这些T2R的激动剂拮抗剂,或其片段或变体。
本发明的另一个目的是提供哺乳动物包括人类中味觉感知的展示方法和/或预知味觉感知的方法。优选地,这些方法可以通过使用此处所述的T2R受体或其片段或变体,和使用编码该T2R的基因或其片段或变体来完成。
本发明的另一个目的是提供能够在哺乳动物中引发特定味觉感知的新型分子或分子组合。这些分子或组合可以由以下方法得到:对于已知分子或分子组合确定其在哺乳动物中的味觉感知值;对于一种或多种未知分子或分子组合确定其在哺乳动物中的味觉感知值;比较一种或多种未知组合物和一种或多种已知组合物在哺乳动物中的味觉感知值;选择能够引发哺乳动物特定味觉感知的分子或分子组合;和合并两种或多种未知分子或分子组合形成分子或分子组合,其能够引发一种特定的哺乳动物味觉感知。合并步骤产生单独分子或分子组合,其能够引发特定的哺乳动物味觉感知。
本发明的另一个目的是提供筛选一种或多种化合物以鉴定是否存在哺乳动物可察觉的味道的方法,包括:把上述所指的一种或多种化合物与至少一种公开的T2R、其片段或变体接触的步骤,其中优选地哺乳动物是人。
本发明的另一个目的是提供一种刺激味觉的方法,包括以下步骤:对于此处所述多数T2R中的每一个,或其变体的片段,优选地人类T2R来说,确定T2R与味觉元相互作用程度;合并多个化合物,其中每个化合物都有与一种或多种T2R预先确定的相互作用,以达到一起提供模仿味觉模式的受体-刺激样式。通过在此描述的任何一个结合或报告试验可以确定味觉元与T2R的作用。多数化合物然后可以合并形成混合物。需要的话,多数化合物中的一种或多种可以共价结合。结合后的化合物基本上刺激至少50%、60%、70%、75%、80%或90%或全部可以实质上由味觉元刺激的受体。
本发明的另一个方面是提供一种方法,其中针对多数T2R、或其片段或变体,对多数标准化合物进行测试,以确定每一个T2R和每一标准化合物的相互作用程度,由此产生每一标准化合物的受体刺激模式。这些受体刺激模式可以存储在数据存储介质上的相关数据库中。本方法还可以包括提供一个味觉的所希望的受体刺激模式;将所希望的受体刺激模式与相关数据库比较;并确定能够与所希望的受体刺激模式最密切相匹配的一种或多种标准化合物组合。本方法还进一步包括将标准化合物组合成一种或多种已经确定的组合物来刺激味觉。
本发明的另一个目的是提供展示哺乳动物对特定物质的味觉感知的方法,包括以下步骤:提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个T2R中每一个的刺激量,其中n大于或等于4,n大于或等于12;n大于或等于24,或n大于或等于40;从该值中产生味觉感知的定量表示法。T2R可能是一个在此公开的味觉受体,或其片段或变体,表示法可能包含一个点或n维空间的体积,可能包含一个图或一个谱,或可能包含一个定量表示法矩阵。同样,提供的步骤可能包括将多数重组产生的T2R、或其片段或变体与试验组合物接触,并定量测量该组合物与该受体的作用。
本发明的一个相关目的是提供一种预测哺乳动物味觉感知的方法(该感知是由一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生未知的味觉感知),包括以下步骤:提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个T2R中每一个的刺激量,其中n大于或等于4,n大于或等于12;n大于或等于24,或n大于或等于40;对于一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生已知的味觉感知;并针对在哺乳动物中产生已知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,从该值中产生哺乳动物味觉感知的定量表示法,提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个T2R中每一个的刺激量,其中n大于或等于4,n大于或等于12;n大于或等于24,或n大于或等于40;对于一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生未知的味觉感知;针对在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,从该值中产生一个哺乳动物味觉感知的定量表示法,通过比较哺乳动物对一种或多种分子或分子组合产生未知味觉感知的定量表示法和哺乳动物对一种或多种分子或分子组合产生已知味觉感知的定量表示法,预测哺乳动物的味觉感知,该味觉感知是由一种或多种分子或分子组合产生的未知味觉感知。本方法使用的T2R可能包括在此公开的味觉受体、或其片段或变体。
发明详述
本发明因此提供分离的编码味觉细胞特异性G蛋白耦联受体(“GPCR”)核酸分子,和它们编码的多肽。这些核酸分子和它们编码的多肽是味觉细胞特异性GPCR T2R家族成员。更进一步地,最近鉴定的编码候选苦味味觉受体的T2R基因家族(数据库登录号为AF227129-AF227149和AF240765-AF240768)促进了在公共核苷酸序列数据库中寻找和鉴定相关基因。本发明涉及最近鉴定的这个家族的成员。有关T2R家族更详尽的信息可参阅Adler等,Cell,100:693-702(2000)和Chandrashekar等,Cell,100:703-11(2000),在此全文引用以上两者以供参考。
本发明的编码T2R蛋白和多肽的核酸可以按照WO 00/35374公开的方法,从多种来源经遗传工程化、扩增、合成、和/或重组表达方法分离,该专利在此全文引用用以供参考。
本发明尤其提供编码味觉细胞特异性G蛋白耦联受体新家族的核酸。这些核酸和编码受体在此处被称为味觉细胞特异性G蛋白耦联受体(“GPCR”)的“T2R”家族成员。通常认为味觉细胞特异性GPCR是味觉传导途径的组分,特别是苦味味觉传导途径的组分,参与物质的味觉检测,如苦味物质、6-正-丙基硫代尿嘧啶(PROP)、八乙酸蔗糖酯(soa)、十一乙酸蜜三糖酯(rua)、denatonium、甘氨酸铜(copper glycinate)和奎宁。但是,T2R可能还与其它味觉形式有关。
此外,通常认为T2R家族成员可能与其它T2R家族成员、其它味觉细胞特异性GPCR或其组合结合发挥作用,由此影响化学感受的味觉传导。例如,一般认为T2R家族成员在相同味觉受体细胞型中可能共同表达,共表达的受体可能物理上相互作用,形成异二聚体(heterodimeric)味觉受体。或者,共同表达的受体均有可能单独与同一类型配体结合,而它们的组合结合可能会导致一种特异感知的味觉。
本发明也提供筛选这些味觉细胞特异性GPCR调节子的方法,如活化子(activator)、抑制子(inhibitor)、刺激子(stimulator)、增强子、激动剂和拮抗剂等。这些味觉传导调节子对于味觉信号发生途径的药理和遗传调节等十分有用。这些筛选方法可用于鉴定味觉细胞活性的高亲和力激动剂和拮抗剂。这些调节化合物然后能用于食品和药物工业来定制味道,例如降低或掩盖食品和药品的苦味。
因此,本发明提供味道调节的验定法,其中T2R家族成员作为调节子对味觉传导影响的直接或间接报告分子。例如GPCR可用于例如在体内、体外和离体(ex vivo)测量配体结合、离子浓度、膜电位、电流、离子流量、转录、信号传导、受体配体相互作用、第二信使浓度等变化的试验中。在一个实施方案中,T2R家族成员可以通过与第二报告分子如绿色荧光蛋白质结合而作为间接报告子(reporter)(例如参见,Mistili&Spector,Nature Biotechnology,15:961-964(1997))。在另一个实施方案中,T2R家族成员在细胞中重组表达,可以通过测量Ca2+水平和其它细胞内信息如cAMP、cGMP或IP3的变化来分析GPCR活性对味觉传导的调节。
在优选的实施方案中,T2R多肽在真核细胞内表达,与促进质膜运输(trafficking)或成熟并定向通过分泌途径的异源序列一起表达为嵌合受体。在优选的实施方案中,该异源序列是视紫红质序列,例如视紫红质N端片段。这种嵌合T2R受体可以在任何真核细胞如HEK-293细胞中表达。优选地,这些细胞包含功能性G蛋白,例如Gα15,该蛋白能够使嵌合受体与细胞内信号发生途径耦联或与信号蛋白如磷脂酶C耦联。可以用任何标准方法检测这些细胞中的嵌合受体的活化,例如通过检测细胞中FURA-2依赖的荧光来检测细胞内钙的变化。如果宿主细胞不表达合适的G蛋白,它们可以用编码混栖G蛋白的基因(例如美国专利申请号US 60/243,770中所描述的)转染。该专利申请在此全文引用作为参考。
分析味觉传导调节子的方法包括体外配体结合试验,其中使用:T2R多肽,其部分,如细胞外结构域、跨膜区或其组合、或包含T2R家族成员一种或多种T2R家族成员结构域的嵌合蛋白;卵母细胞、原代细胞或组织培养细胞表达T2R基因,或表达T2R片断或融合蛋白,例如视紫红质融合蛋白;T2R家族成员磷酸化和去磷酸化;结合到GPCR上的G蛋白;拘捕素(arrestin)结合;内部化(internalization);配体结合试验;电压、膜电位和电阻变化;离子流量试验;细胞内第二信使如cGMP、cAMP和三磷酸肌醇的变化;细胞内Ca2+水平的变化;神经递质释放。
此外,本发明提供检测T2R核酸和蛋白质表达的方法,用来进行味觉传导调节和味觉受体细胞的特异性鉴定的研究。T2R家族成员也提供亲子和法医鉴定有益的核酸探针。T2R基因也可作为用以鉴定味觉受体细胞,如叶状、菌状、轮廓、geschmackstreifen和会厌味觉受体细胞,特别是苦味味觉感受的味(转)导素(gustducin)表达细胞的有用的核酸探针。而且,该核酸和它们编码的多肽可用作仔细研究味觉诱导的行为的探针。
T2R多肽也可用于制备鉴定味觉受体细胞的单克隆和多克隆抗体。可以使用如下技术如mRNA反转录和扩增、总RNA或多聚A+RNA的提取、Nothern印迹、点印迹、原位杂交、RNA酶保护、S1酶切、探明DNA微芯片阵列、Western印迹等进行味觉受体细胞的鉴定。
T2R基因和其编码的多肽包括相关的味觉细胞特异性G蛋白耦联受体家族。在基因组内,这些基因以单独形式存在或位于几个基因簇(cluster)中的一个之内。位于人类基因组区域12p13的一个基因簇包含至少24个基因,而位于7q33的另一基因簇包含至少7个基因。总之,从不同生物体内共鉴定了60多种截然不同的T2R家族成员,包括几个推定的假基因(pseudogenes)。据估计人类基因组可能包括大约40种不同的T2R基因,编码大约30种功能性人类受体。
已经把一些T2R基因和原先定位的参与苦味味觉控制的位点联系起来。例如,人类T2R1位于人5p15间隔,其中已经精确定位了一个能够影响品尝PROP物质的能力的基因座(参阅Reed等,Am.J.Hum.Genet.,64:1478-80(1999))。另外,位于人类基因组区域12p13的基因簇,与小鼠6号染色体的一个区域相关,已证实其含有很多苦味味觉基因,通常认为这些基因影响如八乙酸蔗糖酯、十一乙酸蜜三糖酯、放线(菌)酮和奎宁的味觉感受或感知(例如参见,Lush等,Genet.Res.,6:167-74(1995))。这些联系显示T2R基因参与不同物质特别是苦味物质的味觉检测。另外,小鼠T2R5对放线(菌)酮具有特异性感受,因此人们假设mT2R5基因的突变可产生放线(菌)酮-非-感受的表型。同样,人类T2R4和小鼠T2R8能够对denatonium和PROP特异性反应。
从功能上讲,T2R基因包含7种相关的跨膜G蛋白耦联受体的家族,其被认为参与味觉传导,可能与G蛋白相互作用以介导味觉信号传导(例如参见,Fong,Cell Signal,8:217(1996);Baldwin,Curr.Opin.CellBiol.,6:180(1994))。特别是认为T2R以配体特异的方式与G蛋白味(转)导素相互作用。
从结构上来说,T2R家族成员核苷酸序列可能编码相关多肽家族,所述多肽包含一个细胞外结构域、7个跨膜域和一个胞质结构域域。来自其它物种的相关T2R家族基因与SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19和23,或其保守性修饰变体中至少有50个核苷酸长度,可选地100、200、500或更多核苷酸长度的区域,至少有20-30%核苷酸序列相同;或编码多肽与SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20和24,或其保守性修饰变体中的至少约25个氨基酸,任选地50到100个氨基酸的区域,至少大约30-40%氨基酸序列相同。已知T2R基因选择性表达于舌、上颚上皮、叶状乳头、geschmackstreifen和会厌味觉受体细胞亚类。与此相反,研究表明T2R基因较少表达于菌状乳头。而且,已知T2R基因在味(转)导素-阳性细胞内选择性表达。
已经鉴定了T2R家族成员特征性的几个共有氨基酸序列或结构域。具体而言,已经发现T2R家族成员通常包含与T2R跨膜区I、T2R跨膜区II、T2R跨膜区III、T2R跨膜区IV、T2R跨膜区V和T2R跨膜区VII至少大约有50%,可选地55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%,或更高的一致性的序列。通过同一性、特异杂交或扩增、或与针对结构域产生的抗体的特异结合,这些保守的结构域因而可用于鉴定T2R家族的成员。这些T2R跨膜区具有下列氨基酸序列:
T2R家族共有序列1:
E(F/A)(I/V/L)(V/L)G(I/V)(L/V)GN(G/T)FI(V/A)LVNC(IM)DW(SEQ ID NO:25)
T2R家族共有序列2:
(D/G)(F/L)(I/L)L(T/I)(G/A/S)LAISRI(C/G/F)L(SEQ ID NO:26)
T2R家族共有序列3:
NH(L/F)(S/T/N)(L/I/V)W(F/L)(A/T)T(C/S/N)L(S/N/G)(I/V)(SEQ ID NO:27)
T2R家族共有序列4:
FY(F/C)LKIA(N/S)FS(H/N)(P/S)(L/I/V)FL(W/Y)LK(SEQ ID NO:28)
T2R家族共有序列5:
LLI(I/F/V)SLW(K/R)H(S/T)(K/R)(Q/K)(M/I)(Q/K)(SEQ ID NO:29)
T2R家族共有序列6:
HS(F/L)(I/V)LI(L/M)(G/S/T)N(P/S/N)KL(K/R)(Q/R)(SEQ IDNO:30)
人类T2R核苷酸和氨基酸序列的特异区可用于鉴定人类或其它物种的多态变体或等位基因或同源体(homologs)。这些鉴定可以体外进行,例如在严谨杂交条件或PCR(例如,使用编码T2R的上述共有序列的引物)和测序,或通过在一个计算机系统中使用这些序列信息用以和其它核苷酸序列进行比较。一般来说,可以通过比较大约25个氨基酸或更多,如50-100个氨基酸的序列来鉴定T2R家族成员的多态变体或等位基因。氨基酸相同性大约30-40%,可选地50-60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%,或95-99%或更高通常表明蛋白质是T2R家族成员的多态变体,或等位基因,或是同源体或直向进化同源物(ortholog)。序列相同性可由下面公开的方法计算。如果额外存在至少一处与原先鉴定的T2R家族共有序列完全等同或至少有75%的相同性的保守序列,几乎可以肯定又一阳性T2R基因属于T2R家族。序列比较由下述任何一种序列比较算法实现。特异性结合T2R多肽或其中保守区的抗体也可用于鉴定T2R蛋白的等位基因、种间同源体和多态变体。
通过检验推定的T2R多肽的味觉细胞的特异性表达可以确认多态变体,或等位基因,和相关T2R同源体或直向进化同源物。通常,具有在此公开的氨基酸序列的T2R多肽可作为与推定的T2R多肽比较的阳性对照,以证明T2R家族成员的等位基因或同源体的鉴定。这类同源体或等位基因同样具有G蛋白耦联受体的7个跨膜结构。
T2R家族成员的核苷酸和氨基酸序列信息还可以用来在计算机系统中构建味觉细胞特异性多肽模型。这些模型然后可用于鉴定可激活或抑制T2R受体蛋白的化合物。这些调节T2R家族成员活性的化合物可用于研究T2R基因和多肽在味觉传导中的作用。
T2R家族成员的分离提供了分析味觉传导抑制子和活化子的方法。使用测量如配体结合;磷酸化和去磷酸化;G蛋白结合;G蛋白激活;调节分子结合;电压、膜电位和电导变化;离子流量;细胞内第二信使如cAMP、cGMP和IP3;和细胞内钙水平等的的体内(基于动物的试验)和体外测定法,可以利用生物活性的T2R蛋白质测试作为味觉传导子(transducer),特别是苦味味觉传导子的T2R抑制子和激活剂。使用T2R家族成员鉴定的这些活化子和抑制子可用于味觉传导的进一步研究和鉴定特异性味觉激动剂和拮抗剂。这些活化子和抑制子作为药品和食品调味剂十分有益,例如可以降低食品或药品中的苦味。
本发明同样提供分析方法,特别是高通量分析方法,用来鉴定与T2R多肽相互作用和/或调节T2R多肽的分子。在众多方法中,可使用T2R家族成员的独特部分,例如细胞外、跨膜、或细胞内结构域或区。在众多的实施方案中,细胞外结构域、跨膜区或其组合可以结合固体基质,并用来例如分离配体、激动剂、反向激动剂、拮抗剂、或任何其它能够结合到T2R多肽和/或调节T2R多肽细胞外域或跨膜区活性的分子。
在一个特定的实施方案中,T2R多肽的区域,例如细胞外、跨膜或细胞内区域,与异源多肽融合,由此形成嵌合多肽,如具有GPCR活性的嵌合多肽。这些嵌合多肽十分有用,例如可用于鉴定T2R多肽的配体、激动剂、反向激动剂、拮抗剂或其它调节子的试验中。另外,这些嵌合多肽还可用于产生具有新的配体结合专一性、调节模式、信号传导途径或其它此类性质的新型味觉受体,或用于产生具有新的配体结合专一性、调节模式、信号转导途径等的组合特性的新型味觉受体。同样T2R核酸和T2R多肽的表达可用于产生舌部拓扑图,该图可潜在地用于研究舌味觉受体细胞和脑部味觉感受神经元之间的关系。特别是检测T2R的方法可潜在地用于鉴定对苦味物质敏感的味觉细胞。编码人T2R基因的染色体定位同样可潜在地用于鉴定由T2R家族成员引起或与T2R家族成员相关的疾病、突变和性状。
总体上讲,本发明提供分离的T2R家族成员核酸分子和它们编码的味觉受体。本发明不但还包括核酸和具有特定氨基酸序列的多肽序列,而且还包括片段,特别是,例如40,60,80,100,150,200,或250个核苷酸,或更多核苷酸的片段,以及例如10,20,30,50,70,100,或150个氨基酸,或更多氨基酸的蛋白质片段。
预想的各种保守性突变和替换都在本发明范围内。例如,利用已知的包括PCR、基因克隆、cDNA定位突变、宿主细胞转染和体外转录重组基因技术方法进行氨基酸替换都将在本领域技术人员的水平之内。由此可以筛选到功能活性的变体。
更加特别的是,此处公开的核酸序列的特异性区域和它们编码的多肽,可能用于鉴定序列的多态变体、种间同源体和等位基因。该鉴定可以体外如在严谨杂交条件下,进行PCR和测序,或使用在计算机系统中的序列信息与其它核酸序列比较。在单一物种种群内T2R基因的不同等位基因对于确定种群成员间等位基因序列差异是否与味觉感知差异有关也十分有益。
本发明的核酸分子通常是无内含子(intronless)型,并编码通常具有大约300个残基长的推定的T2R蛋白质,经过疏水作图分析预测,其包含7个跨膜区,表明它们属于G蛋白耦联受体(7TM)超家族。除了总体结构相似性之外,此处鉴定的每一个T2R都具有T2R家族成员的特征性序列标志。特别是所有序列包含与上述鉴定的T2R家族共有序列非常相近的匹配。结合所有上述提到鉴定的基因和编码的蛋白质的结构特征,明显提示它们代表T2R受体家族的新成员。
同样可以推测T2R受体和它们的基因可单独或与其它类型味觉受体组合,用于开发检测系统和试验方法,用于化学鉴定被这些受体特异性识别的不同类型的分子,以及用于诊断和研究目的。
本发明的核酸序列和实施本发明中使用的其它核酸,不管是RNA、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合子(hybrids),可以从多种来源中分离、经遗传工程化、扩增、和/或重组表达。可以使用任何重组表达系统,包括哺乳动物细胞,还包括如细菌、酵母、昆虫或植物系统。
A.T2R多肽的鉴定
本发明T2R蛋白和多肽的氨基酸序列可以通过编码核酸序列的推定翻译得到鉴定。这些多种多样的氨基酸序列和编码核酸序列可以按照许多方法互相比较或与其它序列比较。在一个特定的实施方案中,此处公开的假基因可用于在本领域已知的基因组数据库中鉴定功能性等位基因或相关基因。
例如在序列比较中,通常一条序列作为参考序列,与另外的试验序列进行比较。当使用序列比较算法时,将试验和参考序列输入计算机,必要时指定亚序列坐标,并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数,如下面就BLASTN和BLASTP程序所述,或指定替代参数。序列比较算法然后根据程序参数计算试验序列相对于参考序列的百分比序列相同性。
此处所用的“比较窗口”包括参考任何毗邻位置数的区段,(选自20到600,通常大约50到大约200,更经常是大约100到大约150),其中经过两个序列优化比对后,可以将序列与相同号码的邻近位置的参考序列比较。比对序列以进行比较的方法在本领域已经广为人知。可以例如通过使用Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法,通过Needleman&Wunsch,J Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法,使用Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)相似性搜寻方法,通过这些算法的计算机化实施方案GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA in Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575 Science,Dr.,Madison,WI),或使用手工比对和肉眼观察(例如参见,Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等.,eds.1995增刊))的方法进行比较序列的优化比对。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法优选的实施例是BLAST和BLAST2.0算法,其分别由Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等,J Mol.Biol.,215:403-410(1990)描述。执行BLAST分析的软件已经可以从国家生物工程信息中心(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开得到。该算法包括首先通过确定查询序列W长度中的短字来确定高分序列对(HSPs),当与数据库中一个序列的相同长度的字比对时,其或是匹配或是符合一些阳性值阈值分数T。T此处是指邻近字分数阈值(Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等,J Mol.Biol.,215:403-410(1990))。这些初始的邻近字值(word hit)作为种子,以启动搜索寻找包含它们的更长的HSPs。沿着序列向两边延伸该字值,直到累积比对分数能被增加。对于核苷酸序列,用参数M(一对匹配残基的奖励分数;总是>0)和N(错配残基的惩罚分数;总是<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列,使用计分矩阵来计算累积分数。字值向每个方向的延伸当出现下列情形即停止:累积比对分数X量从其最大获得值下降;由于一种或多种负分数残基比对结果导致累积分数变为0或以下;或到达了序列任一末端。BLAST算法参数W,T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默认值为字长(W)为11,预期值(E)为10,M=5,N=-4和两条链的比较。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用的默认值为字长为3,预期值(E)为10,和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,PNAS,89:10915(1989))中比对(B)为50,预期值(E)为10,M=5,N=-4和两条链的比较。
另一个有益的算法实施例是PILEUP。PILEUP从一组相关序列中产生多重序列比对结果,它使用渐进的、配对比对方式来显示关系和序列同一性百分比。它也能画出一个所谓的“树”或“树状图”来显示聚类关系用以产生比对(例如参见图2)。PILEUP使用一个简化了的Feng&Doolittle的渐进式比对方法,J Mol.Evol.35:351-360(1987)。该方法与Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)描述的方法相似。该程序可以比对多达300条序列,每条的最大允许长度为5000个核苷酸或氨基酸。多重比对程序由两条最相似序列的配对比对开始,产生两条比对序列的簇(cluster)。该簇然后与下一个最相关序列或比对序列的簇比对。通过两条单独序列配对比对的简单延伸,两个簇序列就被比对了。通过一系列渐进式、配对比对,完成最后的比对。通常指定序列比较区的特异序列和它们的氨基酸或核苷酸坐标及程序参数后,运行程序。使用PILEUP,将参考序列与其它试验序列比较,使用如下参数来确定百分序列同一关系:默认缺口加权(3.00),默认缺口长度加权(0.10)和末端缺口加权。PILEUP可以从GCG序列分析软件包中获得,例如版本7.0(Devereaux等,Nuc.Acids Res.12:387-395(1984))。使用BLASTP算法将这些蛋白质序列与公开数据库中所有已知的蛋白质比较,显示它们与T2R家族成员有很高的同源性,每一个T2R家族序列与至少一种已知的该家族成员有至少大约50%,和优选地至少55%、至少60%、至少65%,和最优选地70%的氨基酸同一性。
B.定义
除非另有所指,此处使用的下列术语各自具有描述给它们的意义。
“味觉细胞”包括神经上皮细胞,其成组后形成舌的味蕾,例如叶状、菌状和轮廓细胞(例如参见,Roper等,Ann.Rev.Neurosci.12:329-353(1989))。味觉细胞同样也见于上颚和其它组织,如食管和胃。
“T2R”指G蛋白耦联受体家族中的一种或多种成员,这些受体在舌和上颚上皮的味觉细胞中选择性表达,如叶状、geschmackstreifen、会厌、菌状和轮廓细胞,以及食管和胃细胞中表达(例如参见,Adler等,Cell,100:693-702(2000))。该家族同样也被称作“SF家族”(例如参见,PCT/US00/24821,在此全文引用以作参考)。这些味觉细胞可以被鉴定,因为它们表达特异性分子如味(转)导素,味觉细胞特异性G蛋白,或其它味觉特异性分子(McLaughin等,Nature,357:563-69(1992))。味觉受体细胞也可以通过形态学(例如参见,Roper,如前)来鉴定。T2R家族成员具有作为味觉传导受体的能力。T2R家族成员也被称作“GR”家族,对于尝觉(gustatory)受体,或称“SF”家族。
“T2R”核酸编码拥有7个跨膜区的GPCR家族,其具有“G蛋白耦联受体活性”,例如在一些酶如磷脂酶C和腺苷酸环化酶的刺激下,它们可以响应外界刺激而与G蛋白结合并促进产生第二信使如IP3、cAMP、cGMP和Ca2+(关于GPCR结构和功能的描述,参见例如,Fong,如前,和Baldwin,如前)。这些核酸编码的蛋白质表达于味觉细胞,特别是与苦味味觉元反应的表达味(转)导素的味觉细胞。一个单独的味觉细胞可能包括多种截然不同的T2R多肽。
术语“T2R”家族因此包括具有以下特征的多态变体、等位基因、突变体和同源体:(1)与SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24在一个大约25个氨基酸,可选地50-100个氨基酸的窗口上相比,具有大约30-40%氨基酸序列同一性,更加特异地大约40,50,60,70,75,80,85,90,95,96,97,98,或99%的氨基酸序列同一性;(2)特异性地结合针对某个免疫原(包含选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24,和其保守性修饰的变体的氨基酸序列)产生的抗体;(3)在严谨条件下可以特异性地与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19和23,和其保守性修饰的变体的序列进行杂交(大小至少大约100,可选地至少大约500-1000个核苷酸);(4)包括与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列至少有大约40%同一性的序列;或(5)能被引物扩增,该引物在严谨杂交条件下可以与编码SEQ ID NOS:25-30的简并引物的相同序列进行杂交。
如上所述,虽然T2R基因在蛋白质和DNA水平表现出实质的序列差异,但所有迄今分离的T2R基因均包含一定的共有序列,特别是与先前鉴定的T2R共有序列(SEQ ID NOS:25-30)等同或具有或至少有70-75%同一性的区域。
从拓扑结构上来说,某些化学感受GPCR具有“N端结构域”、“细胞外结构域”、包含7个跨膜区和相关胞浆和细胞外环的“跨膜结构域”,“胞浆区”和“C端结构域”(例如参见,Hoon等,Cell,96:541-551(1999);Buck&Axel,Cell,65:175-187(1991))。使用本领域技术人员已知的方法可以从结构上鉴定这些区域,例如鉴定亲水和疏水结构域的序列分析程序(参见例如,Stryer,Biochemistry,(3rd ed.1988);另见任何一款基于因特网的序列分析程序,例如可以在dot.imgen.bcm.tmc.edu上可以找到的程序)。这些区域对于制备嵌合蛋白和本发明的体外试验,例如配体结合试验十分有用。
“细胞外结构域”因而指从细胞膜向外突出并暴露到细胞外一边的T2R多肽的结构域。这些区域一般包括暴露到细胞外一边的“N端结构域”,以及暴露到细胞外一边的跨膜结构域的细胞外环,即跨膜区2和3之间、跨膜区4和5之间、跨膜区6和7之间的细胞外环。“N端结构域”区起始于N末端并延伸至靠近跨膜区起始部位。这些细胞外区对于体外可溶性和固相配体结合试验十分有益。另外,下面描述的跨膜区还可以与细胞外区组合或单独地参与配体结合,因而对于体外配体结合试验也十分有用。
“跨膜结构域”包括7个“跨膜区”,是指位于胞浆膜内的T2R多肽的结构域,并同样可能包括相关胞浆(细胞内)和细胞外环,同样被称作跨膜“区”(regions)。使用由Kyte&Doolittle,J.Mol.Biol.,157:105-32(1982),或Stryer(如前)描述的标准方法,可以对7个跨膜区和细胞外和胞浆环进行鉴定。
“胞浆结构域”是指朝向细胞内部的T2R的结构域,例如“C端结构域”和跨膜结构域的细胞内环,例如跨膜区1和2之间、跨膜区3和4之间、跨膜区5和6之间的细胞内环。“C端结构域”是指跨越最后跨膜结构域末端和蛋白质的C末端的区域,它通常位于细胞胞浆内。
术语“7-跨膜受体”指属于跨膜蛋白超家族的多肽,它拥有7个结构域,横穿胞浆膜7次(因此,这7个区被称作跨膜”或“TM”结构域TM I至TM VII)。嗅觉家族和某些味觉受体均属于这个超家族。7-跨膜受体多肽具有相似和特征性的一级、二级和三级结构,下面将会详细介绍。
术语“配体结合区”是指从化学感受受体衍生出的序列,或从味觉受体衍生出的序列,其基本上引入了跨膜结构域II到VII(TM II到VII)。该区可以结合配体,特别是味觉元。
术语“胞浆膜转位结构域”或简称“转位结构域”指与示例转位结构域(5’-MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV;SEQID NO:31)功能相当的多肽结构域。这些多肽结构域,当掺入到多肽编码序列的氨基端时能够有效地把杂合(“融合”)蛋白“伴随(chaperone)”或“转位”至胞浆膜。这个特定的“转位结构域”最初是从人视紫红质受体多肽(一种7跨膜受体)的氨基端衍生出来。另外一个转位结构域是从牛视紫红质中衍生出来,对于协助转位作用十分有益。视紫红质衍生序列在将7-跨膜融合蛋白转位至胞浆膜非常有效。
“功能等价”是指在相似条件下,结构域将新翻译的蛋白质转位至胞浆膜的能力和效率与示例序列SEQ ID NO:31一样有效;用此处描述的方法可以测量和比较相对效率(用定量方式)。属于本发明范围内的结构域可以通过常规筛选它们在细胞(哺乳动物、蟾蜍等)中将新合成多肽转位至胞浆膜的效率与20个氨基酸长度的转位域SEQ ID NO:31一样的方式进行鉴定。
在测试能够调节T2R家族成员介导的味觉传导化合物的试验中,短语“功能性效果”包括确定任何一个间接或直接受受体影响的参数,例如功能性、物理和化学效果。它包括体内、体外和离体(ex vivo)时配体结合,离子流量、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号传导、受体配体作用、第二信使浓度(如cAMP、cGMP、IP3,或细胞内Ca2+)等指标的变化,还包括其它生理学效果例如神经递质或激素释放的增加或减少等。
“确定功能性效果”是指检验增加或减少间接或直接受T2R家族成员影响的参数的化合物,例如功能性、物理和化学效果。这些功能性效果可用本领域技术人员已知的任何手段进行测量,例如光谱特征(例如荧光、吸收、折射率)、流体动力学(如形状),色谱的或溶解性、膜片钳试验(patch clamping)、电压敏感性染色、全细胞电流、放射性同位素流出、可诱导标志物、卵母细胞T2R基因表达的变化;组织培养细胞的T2R表达;T2R基因的转录激活;配体结合试验;电压,膜电位和电导变化;离子流量试验;细胞内第二信使如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)的变化;细胞内钙水平的变化和神经递质释放等。
T2R基因或蛋白质的“抑制子”、“活化子”和“调节子”可交替使用,是指利用体内、体外味觉传导试验鉴定的抑制性、激活性和调节性的分子,例如配体、激动剂、拮抗剂和它们的同源体和模拟物(mimetics)。例如抑制子是指例如结合后能够部分或完全阻断刺激、降低、防止、延迟激活、负向调节信号传导或使之失活、脱敏的化合物,如拮抗剂。活化子是指例如结合后能够刺激、增加、打开、激活、促进、增强活化、正向调节信号传导或使之增敏的化合物,如激动剂。调节子包括例如能够改变受体与以下物质作用的化合物:能够结合活化子或抑制子的细胞外蛋白质(例如ebnerin和其它疏水载体家族成员);G蛋白;激酶(例如参与受体去激活和脱敏的视紫红质激酶和β肾上腺素能受体激酶类似物);和同样能够使受体去活化和脱敏的拘捕素(arrestin)。调节子包括遗传修饰的T2R家族成员,例如活性改变的成员,以及天然产生的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小分子化合物等。
这些抑制子和活化子的试验包括,例如,在细胞或细胞膜内表达T2R家庭成员,在有或无味觉元如苦味味觉元的情况下,应用推定的调节子化合物,然后确定对上述味觉传导的功能性影响。包含T2R家族成员的样品或试验经过潜在的活化子、抑制子或调节子处理后,与不用抑制子、活化子或调节子的对照样品比较,以试验调节的程度。对照样品(未经调节子处理)指定为100%的相对T2R活性值。当T2R活性值相对于对照大约有80%活性,可选地50%或25-0%时,就判定获得了对T2R的抑制。当T2R活性值相对于对照有110%活性,可选地150%、可选地200-500%或1000-3000%时,就判定获得了T2R的活化。
此处所用术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”是指不含其它不同化合物的状态(这些不同化合物与本发明化合物在自然状态下是结合在一起的)。优选地,以给定样品的重量计,“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”是指该组合物占样品的0.5%、1%、5%、10%或20%,最优选地至少50%或75%的质量。在一个优选的实施方案中,这些术语用来指(以重量计)至少占指定样品95%的质量的本发明化合物。当涉及核酸或蛋白质时,此处所用术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”核酸和蛋白质是指不同于哺乳动物体、特别是人体内天然的纯化状态或浓度的一种纯化状态或浓度。大于哺乳动物体特别是人体内天然的纯化状态或浓度任何程度的纯化或浓度,包括(1)从其它相关结构或化合物中纯化出来了或(2)与哺乳动物体、特别是人体内非正常相关的结构和化合物结合,均属于“分离的”定义范畴。此处描述的核酸或蛋白质或核酸或蛋白质种类可根据本领域技术人员已知的多种方法和过程分离,或与自然状态下无关联的结构和化合物相连。
当涉及核酸或多肽时,此处所用术语“分离的”是指一种纯化状态或浓度,其不同于哺乳动物体、特别是人体内天然产生的状态或浓度。大于哺乳动物体、特别是人体内天然产生的状态或浓度任何程度的纯化或浓度,包括(1)从其它天然产生的相关结构或化合物中纯化出来,或(2)与机体内无正常关联的结构和化合物相结合均属于此处所用“分离的”定义范畴。此处描述的核酸或多肽可根据本领域技术人员已知的多种方法和过程分离,或与自然下无正常关联的结构和化合物结合。
此处所用术语“扩增”是指如下详述的为产生或检测重组子或天然表达的核酸的任何合适的扩增方法学的应用。例如,本发明提供方法和试剂(例如,特异性寡核苷酸引物对),用于体内或体外扩增(例如,通过聚合酶链反应PCR)本发明天然表达的(例如,基因组或mRNA)或重组(例如,cDNA)核酸(例如,本发明的味觉元结合序列)。
术语“表达载体”是指用来在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中、体内或体外、组成性或诱导表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括游离状态或已整合至宿主细胞基因组中的表达系统。该表达系统可具有自我复制或不具有自我复制(即在细胞内引发短暂的表达)的能力。本术语包括仅含有重组核酸转录所需的的最小元件的重组表达“盒。”
术语“文库”指一种含有不同核酸或多肽分子的混合制剂,例如重组产生的感受区文库,特别是由简并引物对扩增核酸产生的味觉受体配体结合区文库,或分离的含有扩增的配体结合区的载体集合,或每个细胞都随机转染了至少一个编码味觉受体的载体的细胞混合物。
术语“核酸”或“核酸序列”指或者是单链或者是双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。该术语包括核酸,即含有天然核苷酸已知类似物的寡核苷酸。该术语还包括有合成主链的核酸样结构。
除非另有所指,特定的核酸序列也暗指其保守性修饰的变体(例如,简并密码子替换)和互补序列,以及清楚指出的序列。特别是,简并密码子替换可以通过产生其中一个或多个待定密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列来实现(Batzer等,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991);Ohtsuka等,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985);Rossolini等,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸(polynucleotide)交替使用。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”此处可交替使用,是指氨基酸残基多聚物。本术语适用于序列中一种或多种氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚物,以及天然产生的氨基酸多聚物和非天然产生的氨基酸多聚物。
此处描述的“转位结构域”、“配体结合结构域”和嵌合受体组分也包括具有与示例序列基本一致的结构和活性的“类似物(analogs)”或“保守性变体”和“模拟物(mimetics)”(“肽模拟物”)。因此,术语“保守性变体”或“类似物”或“摸拟物”指具有修饰过氨基酸序列的多肽,这类修饰基本上不影响多肽的(保守性变体的)在此描述的结构和/或活性。这包括氨基酸序列的保守性修饰变异,即替换、增加或缺失对于蛋白质活性无关紧要的氨基酸残基,或使用相同属性的残基进行氨基酸替换(例如酸性、碱性、正电、负电、极性或非极性等),以至于替换关键的氨基酸也基本上不影响结构和/或活性。
更具体而言,“保守性修饰的变体”对氨基酸和核酸序列都适用。至于特定核酸序列,保守性修饰变体是指编码同样或基本同样氨基酸序列的核酸,或当核酸并不编码氨基酸序列时,是指与它基本相同的序列。由于遗传密码子的简并性,大量功能性相同的核酸分子编码任意特定的蛋白质。
例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此,在由密码子决定的丙氨酸每一个位置,密码子可以改变为由所述的任何不改变编码多肽的密码子。
这些核酸变异是“沉默变异”,是一种保守性修饰的变异。此处的每一条编码多肽的核酸序列也描述了该核酸的每一个可能的沉默变异。本领域技术人员可以判断核酸中的每个密码子(除了通常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG,和通常情况下是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)都可以被修饰而产生功能完全相同的分子。因此,编码多肽的核酸的每一个沉默变异隐含在每个描述的序列中。
能够提供功能相似的氨基酸保守性替换表在本领域众所周知。例如,一个选择保守性替换的示例性指南包括(原始残基,其后是示例替换):ala/gly或ser;arg/lys;asn/gln或his;asp/glu;cys/ser;gln/asn;gly/asp;gly/ala或pro;his/asn或gln;ile/leu或val;leu/ile或val;lys/arg或gln或glu;met/leu或tyr或ile;phe/met或leu或tyr;ser/thr;thr/ser;trp/tyr;tyr/trp或phe;val/ile或leu。另一示例指南使用下列六组,每组包含保守性互相替换的氨基酸:1)丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),赖氨酸(I);5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),缬氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);(参见例如,Creighton,Proteins,W.H.Freeman和Company(1984);Schultz和Schimer,Principles of Protein Structure,Springer-Vrlag(1979))。本领域的技术人员会理解上述确定的替换并不是唯一的可能保守性替换。例如,出于某种原因,人们可能将所有带电的氨基酸互为保守性替换体,不管它们是正电还是负电。另外,在编码序列中的个别替换、缺失或增加从而导致变化、增加或缺失单一氨基酸或小部分氨基酸同样也被认为是“保守性修饰变异。”
术语“模拟物”和“肽模拟物”指合成的化学化合物,它具有本发明多肽的基本上同样结构和/或功能特征,例如转位结构域、配体结合区或嵌合受体。模拟物既可以是完全由化学合成的非天然氨基酸类似物组成,或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。该模拟物同样可以具有任意量的天然氨基酸保守性替换,只要这种替换也同样基本上不改变类似物的结构和/或活性即可。
与本发明中属于保守性变体的多肽一样,可利用常规试验确定模拟物是否属于本发明的范围,即它的结构和/或活性基本上没有被改变。多肽模拟物组合物可包括任何非天然结构组分的组合,其通常来源于三个结构基团:a)非天然酰胺键(“肽键”)的残基连接基团;b)非天然残基替代天然产生的氨基酸残基;或c)可诱导二级结构模仿的残基,即能够诱导或稳定二级结构例如β转角、γ转角、β折叠片和α螺旋构象等的残基。当多肽的所有残基或一些残基是通过化学手段而非天然肽键加入的时,该多肽就可以被鉴定为模拟物。单独的肽模拟物残基可以通过肽键、其它的化学键或耦联手段连接,诸如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N,N’-双环己基碳二酰亚胺(DCC)或N,N’-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)。可以成为传统酰胺键(“肽键”)的替代物连接基团包括,例如酮亚甲基(例如-C(=O)-CH2-替换成-C(=O)-NH-)、氨甲基(CH2-NH)、乙烯基、烯烃基(CH=CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(参见例如,Spatola,Chemistry andBiochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,pp267-357,Marcell Dekker,Peptide Backbone Modifications,NY(1983))。包含所有或部分非天然残基替代天然产生残基的多肽也可以被鉴定为模拟物;非天然残基在科学和专利文献中有详尽描述。
“标记”或“可检测的部分”是可以被光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测到的组分。例如有用标记包含32P、荧光素、电子致密试剂、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、地高辛、或半抗原和可被检测(例如通过在肽中掺入放射标记)或用来检测可特异性与肽反应的抗体的蛋白质。
“标记的核酸探针或寡核苷酸”是指一个或者是通过接头或是通过化学键而共价结合,或者是通过离子、范德华力、静电、或氢键等非共价结合而结合了标记的核酸或寡核苷酸,这样通过检测探针上结合的标记就可以检测探针的存在。
此处所用的“核酸探针或寡核苷酸”被定义为能通过一种或多种形式的化学键结合到互补序列的靶核酸上的核酸(一般是通过氢键形式的互补碱基配对来实现)。此处所指的探针可以包括天然的(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷酸,次黄嘌呤等)。另外,探针中的碱基可以由非磷酸二酯键的连键连接,只要它不影响杂交即可。因此,例如,探针可以是其组成碱基由肽键连接而非磷酸二酯键连接的肽核酸。本领域的技术人员应当理解,根据杂交条件的严谨性,探针可以结合不完全与之互补的靶序列。探针任选地被直接标记上同位素、发色物质、荧光物质、色原体,或被间接标记上如可被链霉亲和素复合物结合的生物素。通过分析探针的有无,人们可以检测选择序列或亚序列的有无。
当针对核酸的一部分使用术语“异源的”时,是指该核酸包含两个或更多在天然状态下互相没有相同的关系的亚序列。例如,核酸通常是重组产生的,具有两个或更多非相关基因序列重组在一起形成一个新的功能性核酸分子,例如,一个来源的启动子和另一个来源的编码区。同样,异源蛋白质指该蛋白包含两个或多个天然状态下不以相同相互关系存在的亚序列(例如,融合蛋白质)。
“启动子”是核酸序列阵列,其能指导核酸转录。此处所用的启动子包括在转录起始位置附近的必要的核酸序列,例如在聚合酶II型启动子的情况下是TATA元件。启动子可选地包括远端增强子或阻遏子元件,其可能位于离转录起始位点多达几千个碱基对的地方。“组成性”启动子是在大多数环境和发育条件下都具有活性的启动子。“可诱导”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“可操作性连接”是指核酸表达调控序列(例如启动子,或转录因子结合位点排列)和另一核酸序列之间的功能性连接,其中表达调控序列指导对应于第二序列的核酸转录。
此处所用的“重组”是指合成或其它体外操作的多核苷酸(例如,“重组多核苷酸”),以及使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中产生基因产物的方法,或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组手段”也包括将来源不同、具有不同编码区或结构域或启动子序列的核酸连接至一个表达盒或载体中用来表达,例如可诱导的或组成性表达包含本发明转位结构域和使用本发明的引物扩增的核酸序列的融合蛋白。
短语“选择性(或特异性)与……杂交”指在严谨杂交条件下,分子仅与特定的存在于复合混合物中(例如,总细胞或文库DNA或RNA)的核苷酸序列结合、形成双螺旋或杂交。
短语“严谨杂交条件”指在这样的条件下,探针仅与通常存在于核酸复合混合物中的靶序列杂交,而不与其它序列杂交。严谨条件是序列依赖性的并且在不同情况下会有所不同。长序列在高温下才具有杂交特异性。有关核酸杂交更详尽的指南参见Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes,“Overview of Principles of Hybridization and theStrategy of Nucleic Acid Assays”(1993)。通常,在特定的离子强度pH下,选择的严谨条件比特定序列的热溶解点(thermal melting point,Tm)低大约5-10℃。Tm是指达到平衡后(靶序列过剩,在Tm下,平衡条件下50%的探针被饱和)与靶序列互补的探针中有50%与靶序列发生杂交时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件意味着其盐浓度小于大约1.0M钠离子,通常大约0.01至1.0M钠离子(或其它盐)浓度(pH7.0至8.3),对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度至少大约30℃、对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度至少大约60℃。加入一些破坏稳定的试剂如甲酰胺也可以形成严谨条件。为了选择性或特异性的杂交,阳性信号至少是背景值的两倍,可选地10倍于背景值。示例严谨条件如下:50%甲酰胺、5×SSC和1%SDS,42℃温育,或者5×SSC和1%SDS,65℃温育,使用0.2×SSC和0.1%SDS在65℃下漂洗。这类杂交和漂洗步骤可以进行例如1,2,5,10,15,30,60分钟或更长时间。
如果核酸编码的多肽是基本相关的话,在严谨条件下互不杂交的核酸仍是基本上相关的。例如,利用遗传密码允许下的最大密码子简并性产生核酸拷贝时就会发生这种情况。在这些情况下,核酸通常在中等严谨杂交条件下杂交。示例的“中等严谨杂交条件”包括在具有40%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS缓冲液中,37℃下的杂交,使用1×SSC在45℃漂洗。这类杂交和漂洗步骤可以进行例如1,2,5,10,15,30,60分钟或更长时间。阳性杂交至少是背景值的两倍。本领域的普通技术人员应该很容易认识到其它杂交和漂洗条件可以用以提供相似严谨程度的条件。
“抗体”指包含免疫球蛋白基因或其片段的框架区域的多肽,其可以特异性地与抗原结合和识别。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、Δ、ε和μ恒定区基因,以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链归类为γ、μ、α、Δ和ε,它们因此分别确定了免疫球蛋白种类,即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例的免疫球蛋白(抗体)结构单位包括四聚体(tetramer)。每个四聚体由两对相同的多肽链组成,每个多肽链对具有一条“轻”链(大约25kDa)和一条“重”链(大约50-70kDa)。每条链的N末端确定了一个大约100至110或更多个氨基酸的可变区,主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指的就是这些轻链和重链。
“嵌合抗体”是指抗体分子,其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换,以至于抗原结合位点(可变区)与类别、效应物功能和/或种类不同或被改变的恒定区相连,或与能够赋予嵌合抗体新的特性的完全不同的分子(如酶、毒素、激素、生长因子和药物等)相连接;或(b)可变区或其部分被改变、替换或交换成具有不同或改变了抗原特异性的可变区。
“抗T2R抗体”是一种可以特异性结合T2R基因、cDNA或其亚序列编码的多肽的抗体或抗体片段。
术语“免疫试验”是使用抗体特异性结合抗原的试验。免疫试验的特征是使用特定抗体的特异性结合特性来分离、定向和/或量化抗原。
当涉及到蛋白质或肽时,短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“特异性(或选择性)与……发生免疫反应”是指结合反应,其可以在异源蛋白质和其它生物物质群中确定目的蛋白质的存在。因此,在指定的免疫试验条件下,指定抗体与特定蛋白质的结合至少是背景值的两倍,并且基本上不与样品中存在的其它蛋白质发生明显的结合。这些条件下与抗体的特异性结合可能要求针对其对某个特定蛋白质的特异性进行了选择的抗体。
例如,可选择针对特定物种如大鼠、小鼠、或人T2R家族成员产生的多克隆抗体以获得那些仅与T2R多肽或其免疫原成分而不与其它蛋白质(T2R多肽直向进化同源物或多态变体和等位基因除外)发生特异性免疫反应的多克隆抗体。这种选择过程可以通过去除与其它物种T2R分子或其它T2R分子有交叉反应的抗体来完成。也可以选择仅识别T2R GPCR家族成员而非其它GPCR家族的抗体。有多种免疫试验形式可以用于选择特异性地与特定蛋白质发生免疫反应的抗体。例如,固相ELISA免疫试验一般用来选择特异性与特定蛋白质发生免疫反应的抗体(例如参见,Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,(1988),其中有关可用于确定特异性免疫反应的免疫试验形式和条件的描述)。通常,特异性或选择性反应至少是背景值或噪声的两倍,更优选地大于背景10至100倍。
短语“与……选择性结合”指核酸与上述其它核酸“选择性杂交”的能力,或抗体与上述蛋白质“选择性结合”的能力。
术语“表达载体”指目的是在任何细胞,包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞中,体内或体外组成性或诱导表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括游离状态或已整合至宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统具有自我复制或不具有自我复制的能力,即在细胞内引发短暂的表达。该术语包括重组表达“盒”,其仅包括重组核酸转录所需的最小元件。
“宿主细胞”是指包含表达载体和支持表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌,或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞,如CHO、Hela和HEK-293及其它,例如培养的细胞、外植体(explants)和体内细胞等。
C.T2R的分离和表达
本发明T2R或其片段或变体的分离和表达可通过使用基于本申请公开的T2R核酸序列构建的探针或引物的已知克隆方法来实施。使用此处公开的序列和已知的基于计算机的搜索技术,如BLAST序列搜索技术,同样可以从人或其它物种基因组数据库中鉴定出相关的T2R序列。在特定的实施方案中,此处公开的假基因可用于鉴定功能性等位基因或相关基因。
然后可以使用表达载体感染或转染宿主细胞用来功能性表达这些序列。可以在体内或体外制备和表达这些基因和载体。本领域技术人员应知道,通过调节本发明载体内基因和核酸(例如,启动子、增强子等)的表达或活性,可以得到改变和控制核酸表达的理想表型。可以使用描述成可用于增加或降低表达或活性的任何已知的方法。本发明的实践可以与本领域任何已知的方法或方案相结合,这些方法或方案在科学和专利文献中有详尽描述。
另外,这些核酸分子可用已知的化学合成方法体外合成。例如以下描述的方法,Carruthers,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411-418(1982);Adams,Am.Chem.Soc.105:661(1983);Belousov,Nucleic Acids Res.25:3440-3444(1997);Frenkel,Free Radic.Biol.Med.19:373-380(1995);Blomers,Biochemistry 33:7886-7896(1994);Narang,Meth.Enzymol.68:90(1979);Brown,Meth.Enzymol.68:109(1979);Beaucage,Tetra.Lett.22:1859(1981);U.S.PatentNo.4,458,066。然后或者通过合成互补链,并在适合条件下使之退火,或通过用合适的引物序列及用DNA聚合酶加入互补链的方法可以获得双链DNA片段。
核酸操作技术,例如产生序列突变、亚克隆、探针标记、测序、杂交等技术,在科学和专利文献中有详尽描述。参见例如,Sambrook,ed.,Molecular Cloning:a Laboratory Manual(2nd ed.),Vols.1-3,ColdSpring Harbor laboratory(1989);Ausubel,ed.,Current Protocolsin Molecular Biology,Jon Wiley&Sons,Inc.,New York(1997);Tijssen,ed.,Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology:Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Theoryand Nucleic Acid Preparation,Elsevier,N.Y.(1993)。
核酸、载体、衣壳(capsids)、多肽等可以通过任何一个本领域技术人员众所周知的方法来分析和定量。这些方法包括如分析生物化学方法例如核磁共振(NMR)、光谱、放射、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)和超滤层析等,多种免疫学方法例如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫试验(RIAs)、酶联免疫吸附试验(ELISAs)、免疫荧光试验、Southern分析、Northern分析、点印迹分析、凝胶电泳(例如:SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶物质或信号放大方法、放射标记、液体闪烁计数和亲和层析等。
寡核苷酸探针可以用来扩增编码T2R配体结合区域的核酸片段。此处描述的核酸同样可以利用扩增技术进行克隆或定量测量。扩增方法是本领域众所周知的方法,包括例如聚合酶链反应、PCR(Innis ed.,PCRProtocols,a Guide to Methods and Applications,Academic Press,N.Y.(1990);Innis ed.,PCR Strategies,Academic Press,Inc.,N.Y.(1995)、连接酶链反应(LCR)参见例如(Wu,Genomics 4:560(1989);Landegren,Sciencee 241:1077,(1988);Barringer,Gene 89:117(1990));转录扩增(Kwoh,PNAS,86:1173(1989));自我维持序列复制(Guatelli,PANS,87:1874(1990));Q-β复制酶扩增(Smith,J.Clin.Microbiol.35:1477-1491(1997));自动Q-β复制酶扩增试验(Burg,Mol.Cell.Probes 10:257-271(1996))和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)等,同样参见,Berger,Methods Enzymol.152:307-16(1987);Sambrook;Ausubel;U.S.Patent NOs.4,683,195和4,683,202;Sooknanan,Biotechnology13:563-64(1995)。
一旦扩增后,即按照本领域已知的方法,使用常规分子生物学方法,将核酸分子单独或以文库形式按照所需克隆到任意一个载体上;体外扩增核酸的克隆方法参见如U.S.Pat.No.5,426,039的描述。为了协助扩增序列的克隆,可以将限制性酶切位点“内置”(built into)到PCR引物对中。例如Pst I和Bsp E1位点被设计到本发明的示例引物对中。这些独特的限制性位点的序列能使得连接时相对于它们所剪接入的7-膜受体“供体”编码序列而言读框一致(配体结合区编码序列位于7-膜多肽内部,因此,如果想在限制酶切位点的下游翻译构建体(construct),应该避免出框的结果;如果插入的配体结合区基本上包含大部分跨膜V II区,这就不是必要的)。引物可以设计成保留有“供体”7-膜受体的原始序列。或者,引物可以编码保守性替换的(例如疏水性残基换成疏水性残基,参见下面的讨论)或功能上无影响的替换(例如,不干扰胞浆膜插入、不导致肽酶引起的裂解、不导致受体非正常折叠等)的氨基酸残基。
引物对可以设计成选择性扩增T2R蛋白的配体结合区域。对于不同配体这些区域可能变化很大。因此,对一种配体可能是最小的结合区域,对于另一个潜在配体来说可能具有很大的局限性。因此,需要扩增不同大小、包含不同结构域结构的配体结合区域;例如,7-跨膜T2R的跨膜(TM)结构域II至VII,III至VII,III至VI或II至VI,或其变体(例如,只是特定结构域的亚序列,混合结构域的顺序等)。
由于许多7-膜T2R蛋白质的结构域结构和序列是已知的,本领域技术人员可以很容易地选择结构域侧翼和内部结构域序列作为模型序列来设计简并扩增引物对。例如,使用引物对进行PCR扩增可以产生编码结构域区II至VII的核酸序列。为了扩增包含跨膜结构域I(TM I)序列的核酸序列,可以从编码上面描述的T2R家族共有序列1的氨基酸序列的核酸中设计简并引物。这样的简并引物可用于产生掺入了TM I至TM III,TM I至TM IV,TM I至TM V,TM I至TM VI或TM I至TM VII的结合区域。基于此处所提供的T2R家族其它共有序列可以设计其它的简并引物。这样的简并引物可用于产生掺入TM III至TM IV,TM III至TM V,TM III至TM VI或TM III至TM VII的结合区域
设计简并引物的范例在本领域已众所周知。例如,共义-简并杂合寡核苷酸引物(CODEHOP)策略计算机程序可以由http://blocks.fhcrc.org/codehop.html处获得,引物可直接连接到Blockmaker多序列比对地址进行杂合引物预测,其由一套相关蛋白质序列开始,如已知的味觉受体配体结合区域(例如参见,Rose,NucleicAcids Res.26:1628-1635(1998);Singh,Biotechniques 24:318-319(1998))。
合成寡核苷酸引物对的手段在本领域已众所周知。可以使用“天然”碱基对或合成碱基对。例如,使用人工核苷酸碱基能够提供操作引物序列、产生更加复杂的扩增产物复合混合物的多样途径。人工核苷酸碱基多种家族通过内部键旋转,能够采取多种氢键取向,从而提供简并分子识别的手段。这些类似物掺入PCR引物的单一位点将导致扩增产物复杂文库的产生。例如参见,Hoops,Nucleic Acids Res.25:4866-4871(1997)。非极性分子同样可以用来模仿天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键形状模拟物可以对胸腺嘧啶非极性形状的模拟物有效和选择性地复制(例如参见,Morales,Nat.Struct.Bioo.5:950-954(1998))。例如两个简并碱基可以是嘧啶碱基6H,8H-3,4-二羟基嘧啶并[4,5-c][1,2]嗪-7-酮或嘌呤碱基N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤(例如参见,Hill,Proc.Natl.Acad.Sci,USA 95:4258-4263(1998))。本发明简并引物的范例是掺入核碱基类似物5’-二甲氧三苯甲基-N-苯甲酰基-2’-脱氧胞嘧啶和3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(参见如下所述序列中的“P”)。这种嘧啶类似物与嘌呤,包括A和G残基形成氢键。
此处公开的味觉受体基本上是等同的多态变体、等位基因和种间同源体,可以使用下述的核酸探针分离。或者,通过检测与针对T2R多肽产生的抗血清或纯化抗体发生免疫反应的表达同源体(该表达的同源体同样可以识别和选择性结合到T2R同源体上),表达文库可以用于克隆T2R多肽和其多态变体、等位基因和种间同源体。
编码味觉受体的配体结合区域的核酸可以使用适当引物对(匹配或简并引物)扩增(如PCR)适当核酸序列得到。扩增的核酸可以是来自任何细胞或组织的基因组DNA或味觉受体表达细胞衍生出来的mRNA或cDNA。
在一个实施例中,可以构建出包含有编码融合了转位序列的T2R的核酸的杂合蛋白质编码序列。同样可以提供包含转位基元(motif)和其它化学感受受体,特别是味觉受体家族的味觉元结合区的杂合T2R。这些核酸序列可以被可操作地连接至转录或翻译控制元件中,例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、聚腺苷酸化序列、和其它对DNA转录成RNA有用的序列等。在重组表达盒、载体和转基因动物构建过程中,可以利用启动子片段指导在所有目的细胞或组织中表达目的核酸。
在另外一个实施例中,融合蛋白可能包括C末端或N末端转位序列。此外,融合蛋白可以包括额外的元件,如用于蛋白质检测、纯化或其它应用的元件。促进检测和纯化的结构域包括,如金属鳌合肽如聚组氨酸列串、组氨酸色氨酸组件或其它可以在固定金属上纯化的结构域等;麦芽糖结合蛋白;可以在固定的免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域;或FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域(Immunex Corp,SeattleWA)。
在转位结构域(为了有效的胞浆膜表达)和新翻译的多肽其余部分之间,包含一个可裂解连接物序列如Xa因子(例如参见,Ottavi,Biochimie 80:289-293(1998))、枯草杆菌素(subtilisin)蛋白酶识别基元(例如参见,Polyak,Protein Eng.10:615-619(1997))、肠激酶(Invitrogen,San Diego,CA)等对促进纯化可能有利。例如,一个构建体可以包括一条多肽编码核酸序列(与6个组氨酸残基连接,后跟一个是肠激酶裂解位点的硫氧还蛋白,(例如参见,Williams,Biochemistry34:1787-1797(1995)),和一个C末端转位结构域。组氨酸残基可促进检测和纯化,而肠激酶裂解位点提供了从剩余融合蛋白中纯化目的蛋白的手段。有关编码融合蛋白的载体技术和融合蛋白应用的技术科学和专利文献中已有详细描述,例如参见,Kroll,DNA Cell.Biol.12:441-53(1993)。
包含配体结合区编码序列的表达载体(不管是单独表达载体还是表达载体文库)可以引入细胞的基因组或胞浆或细胞核,通过科学和专利文献中描述的多种多样的常规方法表达目的序列。例如参见,Roberts,Nature 328:731(1987);Berger如前;Schneider,Protein Expr.Purif.6435:10(1995);Sambrook;Tijssen;Ausubel生物试剂和试验器材厂家提供的产品信息手册也会提供有关生物学方法的信息。载体可以从天然状态分离,从诸如ATCC或GenBank文库获得,或通过合成或重组方法制备。
核酸可以在细胞内稳定或短暂表达(例如游离体表达系统)的表达盒、载体或病毒中表达。选择标志物可以掺入到表达盒和载体中,从而赋予转化细胞和序列以可选择的表型。例如,选择标记物可以编码游离体维持和复制,所以就不必整合至宿主基因组了。例如,标志物可能编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如chlorosulfuron或Basta),以选择转化了目的DNA序列的细胞(例如参见,Blondelet-Rouault,Gene 190:315-317(1997);Aubrecht,J.Pharmacol.Exp.Ther.281:992-997(1997))。赋予新霉素或潮霉素这类底物的抗性的可选择标志物基因仅能用于组织培养,而化学抗性基因可以作为体内或体外的选择性标记物。
嵌合核酸序列可以编码在任何7跨膜多肽内部的T2R配体结合区。因为7跨膜受体多肽具有相似的一级序列及二级和三级结构,结构域(例如细胞外结构域、TM结构域、胞浆结构域等)可以很容易地通过序列分析鉴定。例如,同源性模建、傅立叶分析和螺旋周期检测可用于鉴定有7跨膜受体序列的7个结构域。快速傅立叶转换(FFT)算法可用于评估代表被分析序列疏水性和可变性概况的显性周期。周期检测增强和α螺旋周期指数可由如Donnelly,Protein Sci.2:55-70(1993)的方法完成。其它算法和模建算法在本领域已众所周知(例如参见,Peitsch,Receptors,Channels 4;161-164(1996);kyte&Doolittle,J.Md.Bio.,157:105-132(1982);Cronet,Protein Eng.6:59-64(1993);http://bioinfo.weizman.ac.il/)。
本发明不但包括具有指定核酸和氨基酸序列的核酸分子和多肽,还同样包括其片段,特别是如40、60、80、100、150、200或250个核苷酸、或更多核苷酸的片段,以及如10、20、30、50、70、100或150个氨基酸、或更多氨基酸的多肽片段。可选地,核酸片段可编码能够与针对T2R家族成员产生的抗体结合的抗原性多肽。此外,本发明的蛋白质片段可选地是能够与针对T2R家族成员产生的抗体结合的抗原性片段。
本发明另外还包括嵌合蛋白,其包含此处公开的至少一种T2R多肽中的至少10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多序列,并耦联至额外的氨基酸序列(该序列代表另一个GPCR、优选地7跨膜超家族成员的全部或部分)。这些嵌合子可直接从本发明受体和另一个GPCR获得,或组合两种或多种本发明受体获得。在一个实施例中,嵌合子的一部分对应于本发明T2R多肽的跨膜结构域,或是从该跨膜结构域衍生出来。在另外一个实施例中,嵌合子的一部分对应于此处描述的T2R多肽的一个或多个跨膜区,或是从中衍生出来,而嵌合子剩余部分来自另一个GPCR。嵌合受体在本领域众所周知,制备嵌合受体的技术和用于掺入的G蛋白耦联受体结构域和片段的选择及界定也是本领域众所周知。因此,本领域技术人员的知识可容易用于这种嵌合受体的制备。使用这种嵌合受体可以提供例如一种在此特别描述的受体的味觉选择性特征,并与另一个受体的信号传导特征相耦联,如现有技术实验系统中已知的一种受体。
例如,象配体结合区域、细胞外结构域、跨膜结构域、胞浆结构域、N端结构域、C端结构域或其任意组合的区域,可以共价地连接至异源蛋白质上。如T2R跨膜区可连接至异源GPCR跨膜结构域,或异源GPCR细胞外结构域可连接至T2R跨膜区。其它可选异源蛋白质包括,如绿色荧光蛋白、β-gal、谷氨酸受体和视紫红质N末端等。
表达本发明的T2R、片段或变体的宿主细胞也处在本发明范围之内。为了获得克隆的基因或核酸(例如编码本发明的T2R、片段或变体的cDNA)的高水平表达,本领域技术人员通常是将目的核酸序列亚克隆至含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子、并且对于编码蛋白质的核酸分子来说,还有翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。适合的细菌启动子本领域众所周知,例如参见Sambrook等的描述。但是,细菌或真核表达系统都可以使用。
可以使用任何已知将外源核苷酸序列引入宿主细胞的方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、polybrene、原生质体融合、电穿孔、脂质体、微注射、胞浆载体、病毒载体和其它任何已知的将克隆基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传物质引入宿主细胞的方法(例如参见,Sambrook等)。只要保证特定遗传工程方法能够成功地将至少一条核酸分子引入能表达目的T2R、片段或变体的宿主细胞即可。
将表达载体引入到细胞中后,被转染的细胞在适合目的受体、片段或变体表达的条件下培养,然后使用标准技术从培养物中回收。此类技术的实施例本领域众所周知。例如参见WO 00/06593,此处以与本公开内容具有一致性的方式引用。
D.T2R的免疫检测
除了使用核酸杂交技术检测T2R基因和基因表达以外,同样可以使用免疫试验检测T2R,例如鉴定味觉受体细胞和T2R家族成员的变体。免疫试验可用以定性或定量分析T2R。此技术应用的总体概述参见Harlow&Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1988)。
1.针对T2R家族成员的抗体
产生可以与T2R家族成员特异性反应的单克隆抗体和多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的方法(例如参见,Coligan,CurrentProtocols in Immunology(1991);Harlow&Lane,如前;Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2d ed.1986);andKohler&Milstein,Nature,256:495-497(1975))。此类技术包括通过从噬菌体或类似载体的重组抗体文库中选择抗体来制备相应抗体,以及通过免疫家兔或小鼠来制备单克隆抗体和多克隆抗体(例如参见,Huse等,Science,246:1275-1281(1989);Ward等,Nature,341:544-546(1989))。
许多包含T2R的免疫原可用于产生与T2R家族成员特异性反应的抗体。例如,重组T2R蛋白,或其抗原性片段,可用此处描述的方法分离。合适的抗原性区域包括,例如用于鉴定T2R家族成员的上述公开的共有序列。重组蛋白质可以使用上面描述的方法在真核或原核细胞中表达,和使用本领域已知的方法纯化。重组蛋白质是优选的免疫原,用于产生单克隆或多克隆抗体。或者,从此处公开的序列衍生出的合成肽,与载体蛋白缀合后可用作免疫原。天然产生的蛋白质也可以纯净的或非纯净形式使用。产物然后被注射进能够产生抗体的动物。可得到单克隆或多克隆抗体,用于后续测量蛋白质的免疫试验。
更具体而言,产生多克隆抗体的方法本领域技术人员众所周知。例如,使用标准佐剂例如弗氏佐剂和标准免疫程序,用T2R多肽免疫近交系小鼠(例如BALB/C小鼠)或家兔。然后可通过采血和确定与T2R的反应滴度来监测动物对免疫原制备物的免疫反应。当获得合适的针对免疫原的抗体高滴度后,可采集动物血液并制备抗血清。如果需要,可以通过抗血清进一步分级分离来富集与T2R多肽反应的抗体(参见Harlow&Lane,如前)。
可通过本领域技术人员熟知的多种技术得到单克隆抗体。简单地讲,通常经过与骨髓瘤融合,使目的抗原免疫的动物脾细胞永生化(参见kohler&Milstein,Eur.J.Immunol.,6:511-519(1976))。永生化的另一个方法包括使用E-B病毒(Epstein BarrVirus)、癌基因、反转录病毒转化、或本领域已知的其它方法。对由单个永生化细胞形成的克隆筛选,选出能够产生针对抗原具有所需特异性和亲和性的抗体的克隆。通过多种技术可以提高这些细胞产生单克隆抗体的产量,包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔内。或者,按照Huse等,Science,246:1275-1281(1989)概述的一般方法,通过筛选人B细胞的核酸文库,可以分离编码单克隆抗体或其结合片段的核酸序列。
通常收集单克隆抗体和多克隆血清并在免疫试验中用免疫原蛋白滴定,例如固相免疫试验,其中免疫原固定在固相支持物上。通常,选择具有104或更高滴度的多克隆抗血清,并使用竞争结合免疫试验,测试它们与非T2R蛋白质、或甚至其它T2R家族成员、或其它生物体的其它相关蛋白质的交叉反应。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体一般结合的Kd会至少大约0.1mM,更经常地至少大约1pM,可选地至少大约0.1pM或更好,并且可选地0.01pM或更好。
一旦得到T2R家族成员特异性抗体,各T2R蛋白质可用一系列免疫试验方法来检测。有关免疫学和免疫试验程序的综述,参见Stites&Terreds.,Basic and Clinical Immunology(7th ed.1991)。而且,本发明的免疫试验可以由几种形式来完成,这些形式在Maggio,ed.,EnzymeImmunoassay(1980)和Harlow&Lane(如前)中详述。
2.免疫学结合试验
T2R蛋白质可用任何一个已知的免疫学结合试验检测和/或定量(例如参见US Patents 4,366,241;4,376,110;4,517,288;和4,837,168)。对于一般性免疫试验的综述,参见细胞生物学方法:抗体在细胞生物学中的应用(Methods in Cell biology:Antibodies in Cell Biology,volume 37,Asai,ed.1993);基础和临床免疫学(Basic and ClinicalImmunology,Stiters&Terr,eds.,7th ed.1991)。免疫学结合试验(或免疫试验)通常使用能够特异性与所选蛋白质或抗原(本专利申请中是T2R家族成员或其抗原性亚序列)结合的抗体。抗体(例如抗-T2R)可以使用本领域技术人员已知的多种手段和如上所述的各种方法产生。
免疫试验也经常使用标记物,其可特异性地结合和标记抗原抗体复合物。标记物本身可能是包含抗体/抗原复合物的一个部分。因此,标记物可以是标记的T2R多肽或标记的抗-T2R抗体。或者,标记物可以是一个第三部分,如第二抗体,其能够特异性地结合抗体/T2R复合物(第二抗体通常特异性结合产生第一抗体的物种的抗体)。其它能够特异结合免疫球蛋白恒定区的蛋白质,如蛋白A或蛋白G同样可用作标记物。这些蛋白质表现出与许多物种的免疫球蛋白恒定区强烈的非免疫原性反应活性(例如参见,Kronval等,J.Immunol.,111:1401-1406(1973);Akerstrom等,J.Immunol.,135:2589-2542(1985))。可用可检测部分修饰标记物,如生物素,其可与另外的分子特异结合,如链霉亲和素。多种可检测部分为本领域技术人员所熟知。
贯穿整个试验,每结合一个试剂都需要孵育和/或漂洗步骤。孵育步骤从5秒钟到几个小时,可选地从大约5分钟到大约24小时。但是,孵育时间将取决于试验形式、抗原、溶液体积、浓度等。一般情况下试验在室温下进行,尽管它们可以在一个温度范围内进行,如10℃到40℃。
a.非竞争试验形式
检测样品中T2R蛋白质的免疫试验既可以是竞争性的也可以是非竞争性的。非竞争性免疫试验是其中的抗原量被直接测定。例如在一个优选的“夹心”(sandwich)试验中,抗-T2R抗体可直接结合在其固定的固相支持物上。这些固定化抗体然后可捕获试验样品中的任何T2R蛋白质。T2R蛋白质因此被固定,然后结合标记物,例如带有标记的第二T2R抗体。或者,该第二抗体可能没有标记,但是它可以结合标记了的第三抗体,该第三抗体对产生第二抗体的物种的抗体具有特异性。该第二抗体或第三抗体通常用可检测部分修饰,例如生物素,其可和另外的分子特异性结合,如链霉亲和素,以提供可检测部分。
b.竞争性试验形式
在竞争性试验中,通过测量用样品中存在的未知的T2R蛋白质从抗-T2R抗体中去除(竞争去除)已知的外加的(外源的)T2R蛋白质的量,间接测量样品中存在的T2R蛋白质的量。在一个竞争性试验中,将已知量的T2R蛋白质加入到样品中,样品然后与能特异结合T2R的抗体接触。与抗体结合的外源T2R蛋白质的量与样品中T2R蛋白质浓度成反比。在一个特别优选的实施方案中,抗体被固定在一个固相底物上。与抗体结合的T2R蛋白质的量可以通过测量T2R/抗体复合物中T2R蛋白质的量,或通过测量剩余未形成复合物的蛋白质的量来确定。通过提供标记的T2R分子可以检测T2R蛋白质的量。
半抗原抑制试验是另一种优选的竞争性试验。在这个试验中已知T2R蛋白质固定在固相底物上。将已知量的抗T2R抗体加入到样品中,样品然后与固定的T2R接触。抗-T2R抗体结合到已知的固定化T2R蛋白质的量与样品中存在的T2R蛋白质的量成反比。同样,固定化抗体的量可以通过检测抗体固定化部分或溶液中剩余抗体部分来检测。抗体被标记时可直接检测,或随后加入一个如上所述的特异结合抗体的标记部分进行间接检测。
c.交叉反应测定
竞争结合形式的免疫试验也可用来测定交叉反应。例如,由在此公开的核酸序列至少部分编码的蛋白质可以固定在固相支持物上。蛋白质(例如T2R多肽和其同源物)加入到试验体系中,与固定的抗原竞争结合抗血清。将加入蛋白质的与固定蛋白质竞争结合抗血清的竞争能力,与在此公开的核酸序列编码的T2R多肽与自己竞争的能力相比较。使用标准计算法计算上述蛋白质的交叉反应百分比。与每一个上述加入蛋白质交叉反应小于10%的抗血清被选择出来并合并在一起。通过加入特定蛋白质,例如远源同源物进行免疫吸收,交叉反应抗体可任选地从合并抗血清中去除。另外,含有可用于鉴定T2R家族成员的代表共有序列的氨基酸序列的肽,可用于测定交叉反应性。
免疫吸收的和合并的抗血清然后用于进行如上所述的竞争结合免疫试验,用以第二蛋白质(该蛋白质被认为可能是T2R家族成员的等位基因或多态变体)和免疫原蛋白质(即由在此公开的核酸序列编码的T2R多肽)的比较。为了实现这个比较,该两种蛋白质都要在一个宽范围浓度内进行试验,确定抑制抗血清与固定的蛋白质50%结合需要的每一种蛋白质的量。如果抑制50%结合需要的第二蛋白质量小于在此公开核酸序列编码的蛋白质抑制50%结合需要的量10倍,那么该第二蛋白质就被认为能够特异性地结合由T2R免疫原产生的多克隆抗体。
针对T2R共有序列的抗体也可用于制备仅与T2R家族的GPCR特异性结合,而不与其它家族的GPCR结合的抗体。例如,特异性结合特定T2R家族成员的多克隆抗体可以通过使用其它T2R家族成员扣除交叉反应性抗体来制备。物种特异性多克隆抗体可以通过类似途径获得。例如人T2R1特异性抗体的制备,可以通过扣除例如与大鼠T2R1或小鼠T2R1直向进化同源物序列交叉反应的抗体来实现。
d.其它试验形式
Western印迹(免疫印迹)分析可用于检测和定量样品中存在的T2R蛋白质。该技术一般包括通过基于分子量的凝胶电泳分离样品蛋白质、将分离开的蛋白质转移到合适的固相支持物上(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜或衍生尼龙膜)、将样品与特异结合T2R蛋白质的抗体孵育。抗-T2R多肽抗体然后特异性与固相支持物上的T2R多肽结合。这些抗体可能直接被标记,或随后被特异结合抗-T2R抗体的标记抗体所检测(例如标记的绵羊抗小鼠抗体)。
另外,试验形式包括脂质体免疫试验(LIA),其利用设计成结合特定分子(如抗体),并释放出封装好的试剂或标志物的脂质体。释放出的试剂然后可利用标准技术检测(参见Monroe等,Amer.Clin.Prod.Rev.,5:34-41(1986))。
e.非特异结合的降低
本领域技术人员应当领会,免疫试验中经常希望降低非特异性的结合。特别是当试验涉及固定在固相基质上的抗原或抗体时,希望降低非特异结合到固相基质上的量。降低非特异结合的手段本领域众所周知。一般来讲,该技术涉及使用蛋白质性质的组分来包被基质。特别是象牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、明胶这样的组分被广泛应用,最优选的方案是使用奶粉。
f.标记物(labels)
试验中使用的特定标记物或可检测基团不是本发明的关键因素,只要它不显著影响试验中抗体的特异性结合即可。可检测基团可以是任何具有可检测的物理或化学性质的物质。这类可检测标记在免疫试验领域发展完善,并且通常情况下,这些方法中有用的大多数标记物都可以应用于本发明。因此,标记物是指任何能用光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学的、光学的或化学的手段检测到的组分。本发明有用的标记物包括磁珠(如DYNABEADSTM)、荧光染料(如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红(Texas red)、罗丹明等)、放射标记物(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、和显色标记物如胶体金或彩色玻璃或塑料珠(如聚苯烯、聚丙烯、乳胶等)。
按照本领域已知的方法,标记物可以直接或间接耦联至试验中目的组分上。如上所述,根据所需要的灵敏度、与化合物缀合的难易度、所需稳定性、现有仪器、和废物处理条款,可以使用各种各样的标记物。
非放射标记物通常使用间接法标记。一般来讲,配基分子(如生物素)共价结合至分子上。该配基然后结合另外一个分子(如链霉亲和素),该分子本身可被检测或共价连接至一个信号系统如可检测酶、荧光化合物、或化学发光化合物上。配基和它们的靶标可以与识别T2R蛋白的抗体、或识别抗-T2R的二抗以任意适当的组合使用。
分子也可以直接缀合至信号产生化合物上,例如与酶或荧光团缀合。作为标记物的目的酶主要是水解酶,特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化酶(oxidotase),特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰化合物、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素(luciferin),和2,3-二氢吩嗪二酮类(2,3-dihydrophthalazinediones),例如鲁米诺。可能使用的多种标记或信号发生系统参见U.S.Patent No.4,391,904的综述。
检测标记物的方法本领域众所周知。因此,例如当标记物是放射标记物时,检测手段包括闪烁计数器或感光膜放射自显影。当标记物是荧光标记物时,可以通过合适波长的光激发荧光团并检测产生的荧光。荧光可以肉眼观察,通过感光膜,或通过电子检测器如电荷耦联装置(CCDs)或光电倍增器等检测。类似地,在提供酶的合适底物后,可以通过检测反应产物来检测酶标记物。最后,简单的显色标记物可以通过简单观察与标记物相关的颜色来实现。因此,在一系列试纸条(dipstick)试验中,缀合的金通常显示粉红色,而各种缀合的小珠显示各自小珠本身的颜色。
一些试验形式不需要使用标记的组分。例如,凝集试验可用于检测靶抗体存在与否。在该试验中,抗原包被颗粒与包含靶抗体的样品发生凝集。在该形式中,参与组分均无需标记,通过肉眼简单观测就能判定靶抗体的有无。
E.味觉调节子的检测
确定一种试验化合物是否能够在体内和体外特异性结合本发明的T2R多肽的方法和组合物如下所述。可以监测细胞生理学的许多指标来评价配体结合自然产生的或嵌合的T2R的效果。这些试验可以在表达T2R多肽的完整细胞上进行,在通透化的细胞上进行,或在通过标准方法产生的膜成分上进行。
味觉受体结合味觉元并引发化学刺激转换成电信号。激活的或抑制的G蛋白继而改变靶标酶、通道、或其它效应蛋白质的性质。一些例子如通过视觉系统的转导素而引起cGMP磷酸二酯酶的活化、由刺激性G蛋白引起的腺苷酸环化酶、由Gq或其它同类G蛋白引起的磷脂酶C的激活化、和由Gi和其它G蛋白引起的不同通道的调节等。下游结果也能检验,如由磷脂酶C引发二酯酰甘油和IP3的产生,继而也可以检验由IP3引发的钙迁移。
试验中的T2R蛋白或多肽通常从具有SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列,或其片段或保守性修饰变体序列的多肽中选择出来。
或者,试验中的T2R蛋白或多肽可以从真核宿主细胞衍生而来,其包含具有与SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24,或其保守性修饰变体相同的氨基酸序列的氨基酸亚序列。一般来讲,氨基酸序列的相同性至少30%,优选地30-40%,更具体地50-60、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。可选地,试验中的T2R蛋白或多肽可以包含T2R多肽的区域,如细胞外结构域、跨膜区、胞浆结构域、配体结合结构域等。可选地,T2R多肽或其一部分,可以共价连接至异源蛋白质,以产生可用于此处描述的试验的嵌合蛋白质。
可以使用如上所述的T2R蛋白质或多肽,不管是重组的还是天然产生的,来测试T2R活性的调节子。可以分离、在细胞中表达、在由细胞衍生出的膜上表达、在动物或组织中表达重组的或者是天然产生的T2R蛋白和多肽。例如,舌切片、从舌上分离下来的细胞、转化的细胞或膜都可以使用。可以使用此处描述的体内或体外试验中的一种来测试调节作用。
1.体外结合试验
使用T2R多肽或嵌合分子,例如共价连接至异源信号传导结构域的T2R的细胞外结构域、跨膜区或其组合;或共价结合至T2R蛋白或多肽的跨膜和/或胞浆结构域的异源细胞外结构域和/或跨膜区,利用可溶性的或固相反应,可以在体外检验味觉传导。此外,可以利用T2R多肽配体结合区,在体外可溶或固相反应中以试验其配体结合。在多数实施方案中,嵌合受体可以被制成包含T2R多肽的全部或一部分,以及促进T2R定位到膜上的序列,诸如视紫红质,如视紫红质蛋白的N端片段。
T2R蛋白质、配体结合区或嵌合蛋白质与配体的结合,可以在溶液、双层膜(附着到固相上)、脂单层、或囊泡中检测。调节子的结合可以利用如光谱特征(例如荧光、吸收、折射指数)变化、流体力学(如形状)、层析或溶解性进行测试。
T2R-G蛋白的相互作用也能被检验。例如,G蛋白与T2R多肽的结合,或它从多肽上的释放都能被检验。在没有GTP的情况下,活化子(activator)将导致G蛋白(全部三个亚基)和T2R的紧密复合物的形成。该复合物可用上述的多种方法检测。这种试验修饰后可用于寻找抑制子(inhibitors),例如在没有GTP的情况下,将活化子加入G蛋白和T2R的紧密复合物中,然后通过观察T2R-G蛋白复合物的解离从而筛选抑制子。在GTP存在的情况下中,G蛋白α亚基从其它两个G蛋白亚基的释放可作为活化标准。
在本发明另一个实施方案中,可以使用GTPγS试验。如上所述,在GPCR的活化下,G蛋白复合物的Gα亚基被刺激,将结合的GDP交换成为GTP。配体介导的G蛋白交换活性的刺激可以通过在生物化学试验测量,其中测定在推测配体存在情况下加入的放射标记GTPγ35S与G蛋白的结合。一般情况下,含有目的化学感受受体的膜与G蛋白复合物相混合。将潜在抑制子和/或活化子和GTPγS加入到试验中,测量GTPγS与G蛋白的结合。可以通过液体闪烁计数或其它本领域已知的手段(包括闪烁接近试验(scintillation proximity assay,SPA))测量结合作用。在另一种试验形式中,可使用荧光标记的GTPγS。
在一个特别优选的实施方案中,T2R-味(转)导素相互作用可作为T2R受体活化的函数检测。例如,小鼠T2R5与味(转)导素显示出强烈的放线(菌)酮依赖性耦联。T2R受体与味(转)导素的这种配体依赖耦联可作为标志物用来鉴定T2R家族任何成员的调节物(modifier)。
2.荧光偏振试验
在另一实施方案中,基于荧光偏振(“FP”)的试验可用于检测和监测配体结合。荧光偏振试验是测量平衡结合、核酸杂交、和酶活性的实验室通用技术。荧光偏振试验是均一性的,因为它不需要分离步骤如离心、过滤、层析、沉淀或电泳等。这些试验在溶液中直接实时进行,不需要一个固定化阶段。偏振值可重复测量,在加入试剂后测量速度非常快,所以不会破坏样品。一般情况下,本技术可用于测量低至匹摩尔(picomolar)到微摩尔(micromolar)水平荧光基团(fluorophore)的偏振值。本节描述了怎样简单定量地将荧光偏振应用于测量本发明T2R多肽配体的结合。
当荧光标记分子被平面偏振光激发,就发出具有一定偏振程度的光,偏振程度与其分子旋转成反比。大的荧光标记分子在激发态(对于荧光素来说为4纳秒)保持一定程度的稳定性,在激发和发射之间光的偏振保持一定程度的恒定。小的荧光标记分子在激发态快速旋转,在激发和发射之间光的偏振变化显著。因此,小分子偏振值较低而大分子偏振值较高。例如,一个单链荧光素标记的寡核苷酸具有相对较低的偏振值,但当它与互补链杂交后就具有较高的偏振值。当使用FP来检测和监测可能激活或抑制本发明化学感受受体的味觉元结合作用时,可以使用荧光标记的味觉元或自发荧光味觉元。
荧光偏振(P)被定义为:
其中∏是与激发光平面平行的发射光强度,⊥是与激发光平面垂直的发射光强度。P,作为一个光强度的比值,是一个没有单位的数字。例如,Beacon和Beacon2000TM系统可以与这些试验结合使用。这类系统通常用毫偏振单位来表达偏振值(1偏振单位=1000mP单位)。
分子旋转和尺寸之间的关系由Perrin方程式描述。概括地讲,Perrin方程式认为偏振与旋转弛豫(rotational relaxation)时间成正比关系,该时间是一个分子旋转过大约68.5°角所需要的时间。旋转弛豫时间按下列方程式与粘度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)、和气体常数(R)有关:
旋转弛豫时间对于小分子如荧光素非常小(≈1纳秒),对于大分子如免疫球蛋白非常大(≈100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定,旋转弛豫时间,也即偏振,与分子体积直接相关。分子体积的变化可能是由于与其它分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或荧光标记分子的构象变化等引起。例如,荧光偏振已被用于测量大分子荧光素标记的聚合物的酶促裂解,如用蛋白酶、DNA酶和RNA酶引起的裂解。它也同样被用于测量蛋白质/蛋白质相互作用、抗体/抗原结合、和DNA/蛋白质结合的平衡结合作用。
3.固相和可溶性高通量试验
在另一实施方案中,本发明提供了使用T2R多肽,或表达T2R多肽的细胞或组织的可溶性试验。在另一实施方案中,本发明以高通量形式提供了基于固相的体外试验,其中T2R多肽、或表达T2R多肽的细胞或组织附着在固相底物上。
在本发明的高通量试验中,在一天内筛选多达几千个不同的调节子或配体是可能的。特别是微孔板的每一个孔都可以用于进行针对选择的潜在调节子的单独的试验,或者如果是观察浓度或孵育时间效果,每5-10个孔可以测试一个调节子。因此,一个标准微孔板可以试验大约100个(例如96个)调节子。如果使用1536孔板,那么一个板可以轻松分析1000到大约1500个不同化合物。也可以在每个平板孔中分析多种化合物。另外每天都可以分析几个不同的微孔板,使每天分析大约6,000-20,000种化合物成为可能;最近又发展了试剂操作的微流体方法。
目的分子可以直接或间接通过共价或非共价键如经由一个标记物(tag)结合到固态组分上。标记物可以是任何的各种各样的组分。一般来讲,将可结合标记物的分子(标记物结合物)固定在一个固相支持物上,通过标记物和标记物结合物的相互作用,标记了的目的分子(如味觉传导目的分子)就固定在了固相支持物上。
根据文献描述的已知分子相互作用,可以使用许多标记物和标记物结合物。例如,当一个标记物具有一个天然结合物,例如生物素、蛋白A、或蛋白G,它就可以与适当的标记物结合物(亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、免疫球蛋白的Fc区等)结合使用。针对具有天然结合物的分子如生物素的抗体也可被广泛应用,并是合适的标记物结合物(参见,SigmaImmunochemicals 1998 Catalogue,Sigma,St.Louis MO)。
类似地,任何半抗原或抗原性化合物都可与适当抗体结合形成标记物/标记物结合物对。几千种特异性抗体都已商业化并且文献中还描述了许多其它的抗体。例如,在一个常见方法中,标记物是第一抗体,标记物结合物是特异识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用外,受体-配体相互作用也可以作为合适的标记物和标记物结合物对。例如,细胞膜受体激动剂和拮抗剂(例如,细胞受体-配体相互作用如转铁蛋白、c-盒、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整联蛋白家族、选择蛋白(selectin)家族等,例如参见,Pogott&Power,The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。类似地,毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(例如鸦片、类固醇等)、细胞内受体(例如,介导各种小配体作用的物质,包括类固醇、甲状腺激素、类维生素A和维生素D,和肽)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体等都可以与不同细胞受体相互作用。
合成聚合物如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲类、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳撑硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯(polyacetates)同样可以形成合适的标记物或标记物结合物。许多其它的标记物/标记物结合物对同样对于在此描述的试验系统十分有益,在浏览本公开专利时这对本领域技术人员是显而易见的。
一般接头如肽、聚醚等同样可以作为标记物,并且包括多肽序列,例如大约5到200个氨基酸的聚甘氨酸序列。这类弹性接头对于本领域技术人员来说是已知的。例如,聚(乙二醇)接头可以从ShearwaterPolymers,Inc.Huntsville,Alabama得到。这些接头可选地具有酰胺键、巯基键或异功能键等。
标记物结合物可以使用现有的各种方法固定到固相底物上。通常固相底物的全部或部分暴露于化学试剂(将能与标记物结合物的一部分发生反应的化学基团固定到表面)中以完成其衍生或功能化。例如,适合附着在长链部分上的基团可包括胺、羟基、硫醇和羧基基团。氨基烷基硅烷(aminoalkylsilanes)和羟烷基硅烷(hydroxyalkylsilanes)可用于一系列表面的功能化,例如玻璃表面。构建此类固相生物聚合膜阵列的方法文献中均有详细描述。例如参见,Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)(描述了固相如肽的合成);Geysen等,J.Immun.Meth.,102:259-274(1987)(描述了在针上固相组分的合成);Frank&Doring,Tetrahedron,44:6031-6040(1988)(描述了在纤维素盘上合成多种肽序列);Fodor等,Science,251:767-777(1991);Sheldon等,Clinical Chemistry,39(4):718-719(1993);和Kozal等,NatureMedicine,2(7):753-759(1996)(均描述了固定在固相支持物上的生物聚合物排列)。固定标记物结合物到底物上的非化学方法包括其它常用方法,如加热、UV辐射交联等。
4.基于计算机的试验
另外一种测定调节T2R多肽活性的化合物的试验涉及计算机辅助化合物设计,其中计算机系统在氨基酸序列编码的结构信息基础上,用于产生T2R多肽的三维结构。输入的氨基酸序列与计算机系统中预先建立的算法直接并积极相互作用,产生出蛋白质的二级、三级和四级结构模型。然后检验蛋白质结构模型,来确定具有结合例如配体的能力的结构区域。这些区域然后用于鉴定可结合该蛋白质的配体。
通过输入至少有10个氨基酸残基的蛋白质氨基酸序列或相应的编码T2R多肽的核酸序列到计算机系统中,产生蛋白质三维结构模型。编码T2R多肽的核酸序列,或其氨基酸序列,可以是此处公开的任何序列和其保守性修饰的变体。
氨基酸序列代表了蛋白质的一级序列或亚序列,其编码蛋白质的结构信息。将至少10个残基的氨基酸序列(或编码10个氨基酸的核苷酸序列)通过键盘、计算机可读的底物(包括但并不局限于,电子存储介质(如磁盘、磁带、盒带(cartridges)、和芯片)、光学介质(如CD ROM))、由因特网和RAM发布的信息输入到计算机系统中。然后通过氨基酸序列与计算机系统的相互作用,使用本领域技术人员已知软件,产生该蛋白质的三维结构模型。
氨基酸序列代表了一级结构,其编码形成目的蛋白质的二级、三级和四级结构必要的信息。本软件根据一级序列编码的某些参数来产生结构模型。这些参数被称为“能量参数”,主要包括静电电势、疏水电势、溶剂可接近性表面、和氢键形成。二级能量参数包括范德华电势。生物分子形成以一种累积形式使该能量参数值最小化的结构。计算机程序然后使用这些由一级结构或氨基酸序列编码的参数值来产生二级结构模型。
在二级结构能量参数的基础上,形成由二级结构编码的蛋白质的三级结构。用户此时可以输入另外的变量,如该蛋白质是膜结合的或是可溶性的、在机体内的定位、它的细胞内定位如胞浆、表面或细胞核等。这些变量以及二级结构能量参数用来产生三级结构模型。在三级结构模建中,计算机程序将二级结构疏水面和类似物匹配,以及将二级结构亲水面和类似物匹配。
一旦产生了结构,计算机就会鉴定出潜在的配体结合区域。通过输入如上所述的氨基酸或核苷酸序列或化合物化学结构式,可产生潜在配体的三维结构。然后将潜在配体的三维结构与T2R多肽的三维结构相比较,从而鉴定结合该蛋白质的配体。通过能量参数确定蛋白质和配体间的结合亲和性,由此可以确定哪些配体具有增加的与该蛋白质结合的概率。
计算机系统同样可用于筛选T2R基因的突变、多态变体、等位基因、和种间同源体。这类突变可能与疾病状态或遗传性状相关。如上所述,基因芯片(GeneChipTM)和相关技术同样可用于筛选突变、多态变体、等位基因、和种间同源体。一旦变体被鉴定,可以用诊断试验确定具有突变的基因的患者。突变T2R基因的鉴定涉及接收T2R基因或其保守性修饰变体的第一核酸或氨基酸序列的输入。序列用如上所述的方法输入计算机系统。该第一核酸或氨基酸序列然后与同第一序列基本相同的第二核酸或氨基酸序列比较。第二序列用如上所述的方法输入计算机系统。一旦比较了第一和第二序列,就能确定两序列中核苷酸或氨基酸的差异。这些序列能够代表不同的T2R基因中的等位基因差异、与疾病状态和遗传性状相关的突变。
5.基于细胞的结合试验
在优选的实施方案中,T2R蛋白或多肽在真核细胞中表达为嵌合受体,其带有异源的、能够促进其成熟和定向通过分泌途径的伴侣序列。在优选的实施方案中,该异源序列是视紫红质序列,如视紫红质的N端片段。这类嵌合T2R蛋白质可在任何真核细胞中表达,如HEK-293细胞。优选地,这些细胞包含功能性G蛋白,例如Gα15,其可以耦联嵌合受体至细胞内信号发生途径上,或耦联至信号发生蛋白如磷脂酶C上。细胞内这类嵌合受体的活化可以用标准方法检测,如通过检测细胞内的FURA-2依赖性荧光来检测细胞内钙的变化。
激活的GPCR受体变成激酶的底物,激酶能够使受体C端尾部磷酸化(也可能是其它位置)。因此,激活子能促进32P从γ标记的GTP到受体的转移,其可用闪烁计数器分析。C端尾部磷酸化能促进捕获素(arrestin)样蛋白的结合,从而干扰G蛋白的结合。激酶/捕获素途径在许多GPCR的脱敏中起着重要的作用。例如,调节味觉受体保持活性的持续期的化合物可用于延长目的味道或去除一个不愉快的味道。GPCR信号传导和分析信号传导的方法的一般性综述参见,Methods in Enzymology,vols.237 and 238(1994)and volume 96(1983);Bourne等,Nature,10:349:117-27(1991);Bourne等,Nature,348:125-32(1990);Pitcher等,Annu.Rev.Biochem.,67:653-92(1998)。
通过比较由推定的调节子处理过的T2R多肽的反应和未处理过的对照样品的反应从而分析T2R调节作用。这类推定的T2R调节子可包括抑制或活化T2R多肽活性的味觉元。在一个实施方案中,对照样品(未用活化子或抑制子处理)的T2R相对活性值被指定为100。当T2R活性值相对于对照为大约90%,可选地50%或25-0%时,就获得对T2R多肽的抑制。当T2R活性值相对于对照为110%,可选地150%、200-500%或1000-2000%时,就获得对T2R多肽的活化。
离子流量变化可通过确定表达T2R多肽的细胞或膜的离子偏振(即电势)变化来评价。确定细胞偏振变化的一个手段就是用电压-钳(voltage-clamp)和补丁-钳(patch-clamp)技术(例如参见,“细胞附着”模式、“内-外”模式、和“全细胞”模式,如Ackerman等,New Engl.JMed.,336:1575-1595(1997)))测量电流变化(从而检测偏振的变化)。全细胞电流可用已知的标准方法很方便地测量到。其它已知的试验包括:放射标记的离子流量试验和使用电压敏感性染料的荧光试验(例如参见,Vestergarrd-Bogind等,J.Membrane Biol.,88:67-75(1988);Gonzales&Tsien,Chem.Biol.,4:269-277(1997);Daniel等,J.Pharmacol.Meth.,25:185-193(1991);Holevinsky等,J.MembraneBiol.,137:59-70(1994))。一般来讲,待测试化合物的存在浓度为从1pM到100mM。
待测试化合物对于T2R多肽功能的效果可以通过检验如上所述的任何一个参数来测量。任何影响GPCR活性的适当的生理学变化都可用于评价一个待测试化合物对本发明T2R多肽的影响。当使用完整细胞或动物确定功能结果时,同样可测量一系列效果如递质释放、激素释放、已知和未鉴定遗传标志物的转录变化(例如Northern印迹)、细胞代谢变化如细胞生长或pH变化、和细胞内第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的变化等。
优选的分析GPCR的试验包括载有离子或电压敏感性染料,能够报告受体活性的细胞。确定这类受体活性的试验同样可使用其它G蛋白耦联受体已知的激动剂和拮抗剂作为阴性或阳性对照,来评价待测化合物的活性。在鉴定调节活性化合物(例如激动剂、拮抗剂)的试验中,胞浆内离子水平或膜电位的变化可以分别使用离子敏感或膜电位荧光指示剂来监测。可能使用到的离子敏感指示剂和电压探头在Molecular Probes1997 Catalot中有描述。对于GPCR,混栖G蛋白如Gα15和Gα16可用于选择实验(Wilkie等,PNAS,88:10049-10053(1991))。这类混栖G蛋白允许广泛的受体分子的耦联。
受体活化通常启动随后的细胞内事件,如第二信使如IP3的增加,其能够释放细胞内钙离子库存。一些GPCR的活化通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇水解作用刺激三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge&Irvine,Nature,312:315-21(1984))。IP3继而刺激细胞内钙离子库存的释放。因此胞浆钙离子水平变化,或第二信使如IP3水平的变化可用于评价GPCR的功能。表达这类GPCR的细胞可能会因为细胞内库存释放和通过离子通道活化而表现出胞浆钙离子水平增加,在这种情况下尽管不是十分必要但也应尽量在没有钙离子的缓冲液中进行该试验,可选地在溶液中加入一种鳌合剂如EGTA,用来区分由内部库存钙释放引起的荧光反应。
其它试验可包括确定受体活性,其活化后,通过活化或抑制酶如腺苷酸环化酶导致细胞内环核苷酸如cAMP或cGMP水平的变化。环核苷酸门控离子通道如锥状光受体细胞通道和嗅觉神经元通道,在结合cAMP或cGMP而活化下,对阳离子具有通透性(例如参见,Altenhofen等,PNAS,88:9868-9872(1991)and Dhallan等,Nature,347:184-187(1990))。在受体活化导致环核苷酸水平降低的情况下,可优选在加入受体激活化合物到试验细胞之前,将细胞暴露在能够增加细胞内环核苷酸水平的试剂如毛喉素中。用于这种类型的试验中的细胞可通过用编码环核苷酸门控离子通道、GPCR磷酸酶的DNA和编码受体(例如某些谷氨酸受体、蕈毒碱性乙酰胆碱受体、多巴胺受体、五羟色胺受体等)的DNA共转染宿主细胞而制备,其在活化后将引起胞浆内环核苷酸水平的变化。
在优选的实施方案中,通过在异源细胞(具有将受体连接至磷脂酶C信号传导途径上的混栖G蛋白)中表达T2R基因,测量T2R多肽的活性(参见Offermanns&Simon,J.Biol.Chem.,270:15175-15180(1995))。可选地该细胞系是HEK-293(其在天然状态下不表达T2R基因),混栖G蛋白是Gα15(Offermanns&Simon,如前)。通过测量细胞内Ca2+水平(其通过吸收与T2R多肽结合的分子,响应于T2R信号传导途径的调节作用而变化)的变化来分析味觉传导的调节。Ca2+水平的变化可选地由荧光Ca2+指示剂染料和荧光成像技术来测量。
在一个实施方案中,可以使用免疫试验测量细胞内的cAMP或cGMP的变化。Offermanns&Simon,J.Biol.Chem.,270:15175-15180(1995)描述的方法可以用于确定cAMP水平。同样,Felley-Bosco等,Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.,11:159-164(1994)描述的方法可以用于确定cGMP水平。此外,测量cAMP和/或cGMP的试验试剂盒见美国专利4,115,538,在此引用作为参考。
在另一个实施方案中,可以按照U.S.Patent 5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)水解,在此引用作为参考。简单地讲,该试验涉及用3H-肌醇标记细胞48小时或更长时间。标记后的细胞用待测化合物处理1小时。处理后的细胞裂解并用氯仿-甲醇-水抽提,其后通过离子交换层析分离磷酸肌醇,用闪烁计数定量。计算存在激动剂时的cpm和存在缓冲液对照时的cpm的比率,确定刺激作用倍数。类似地,计算存在拮抗剂时的cpm和存在缓冲液对照(可能含有或不含有激动剂)时的cpm的比率,可以确定抑制作用倍数。
在另一个实施方案中,可测量转录水平用于评价待测化合物对信号传导的影响。可将包含T2R多肽的宿主细胞与待测化合物接触足够长的时间以实现任何相互作用,然后测量目的蛋白的基因表达水平。实现这些相互作用的时间可以凭经验确定,例如执行一个时间进程并且测量转录水平作为时间的函数。转录量可以使用本领域技术人员已知的合适的方法测量。例如,目的蛋白mRNA的表达可以通过Northern印迹检测或利用免疫试验鉴定其多肽产物来检测。或者,可使用利用报告基因的基于转录的试验,参见U.S.Patent 5,436,128的描述,在此引用作为参考。报告基因可以是,例如氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶、3’-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。此外,经过附着在第二报告子如绿色荧光蛋白后,目的蛋白可以间接用作报告子(例如参见,Mistili&Spector,NatureBiotechnology,15:961-964(1994))。
然后将转录量与在缺少待测化合物时相同细胞内的转录量相比较,或者与缺少T2R多肽的基本相同细胞的转录量相比较。基本相同的细胞可以从用于制备重组细胞的相同细胞衍生而来,但是未被引进异源DNA修饰。转录量的任何差异意味着待测化合物在一定程度上改变了目的T2R多肽的活性。
6.表达味觉受体的转基因非人类动物
表达一种或多种本发明T2R多肽的非人类动物同样可用于试验。这种表达可用于确定试验化合物在体内是否可以特异性地结合至哺乳动物T2R多肽,具体方法是将用编码T2R多肽或其配体结合区域的核酸稳定或瞬时转染的非人类动物与待测化合物接触,并确定该动物是否通过特异性结合多肽而对待测化合物起反应。
使用本发明的载体转染或感染过的动物对于鉴定和鉴别可结合特异性或一组受体的味觉元/配体的试验特别有用。这类经载体感染、能表达人类化学感受受体序列的动物,可用于体内筛选味觉元和分析味觉元对细胞生理学(如对味觉神经元)、对CNS或行为的影响。
单独或作为文库形式感染/表达核酸和载体的手段本领域众所周知。各种各样个体细胞、器官、或整个动物的参数可用多种手段来测量。通过用感染剂如腺病毒表达载体投递,可在动物味觉组织中表达例如本发明的T2R序列。
内源性化学感受受体基因可保持有功能,并且野生型(天然的)活性仍然存在。在其它情况下,当需要所有的化学感受受体活性都是由引入的异源杂合受体引起时,优选使用敲除品系(knockout line)。构建非人类转基因动物,特别是转基因小鼠,和产生转化细胞的重组构建体的选择和制备的方法本领域众所周知。
构建“敲除”细胞和动物基于的前提是,通过将干扰待抑制基因的一部分DNA序列的新DNA序列引入到基因组中,可以降低或完全消除哺乳动物细胞中特定基因的表达水平。同样,“基因诱捕插入”(gene trapinsertion),可用于破坏宿主基因,小鼠胚胎干细胞(ES)可用于产生敲除的转基因动物(例如参见,Holzschu,Transgenic Res.6:97-106(1997))。异源序列的插入通常由互补核酸序列间的同源重组实现。异源序列是待修饰靶基因的一部分,例如外显子、内含子或转录调节序列,或任何可影响靶基因表达水平的基因组序列;或其组合。多能胚胎干细胞中经过同源重组的基因打靶可以允许对目的基因组序列进行精确修饰。任何技术都可用于产生、筛选、繁殖敲除动物,例如参见Bijvoet,Hum.Mol.Genet.7:53-62(1998);Moreadith,J.Mol.Med.75:208-216(1997);Tojo,Cytotechnology 19:161-165(1995);Mudgett,MethodsMol.Biol.48:167-184(1995);Longo,Transgenic Res.6:321-328(1997);U.S.Patents NOs.5,616,491;5,464,764;5,631,153;5,487,992;5,627,059;5,272,071;WO 91/09955;WO 93/09222;WO96/29411;WO 95/31560;WO 91/12650。
本发明的核酸同样可作为产生“敲除”人细胞及其后代的试剂。类似地,本发明的核酸同样可作为产生小鼠“敲入(knock-ins)”的试剂。人或大鼠T2R基因序列可以替换小鼠基因组中的直向进化同源T2R。通过这个途径,可产生表达人或大鼠T2R的小鼠。该小鼠然后可用于分析人或大鼠T2R的功能,和鉴定这类T2R的配体。
F.调节子
作为T2R家族成员调节子测试的化合物可以是任何小的化学化合物,或生物学实体如蛋白质、糖、核酸或脂。或者,调节子可以是T2R家族成员的遗传变体。一般情况下,试验化合物可以是小的化学分子和肽。基本上任何化学化合物都可以作为本发明试验中的潜在调节子或配体,尽管在大多数情况下化合物溶解于水或有机溶剂(特别是基于DMSO的)中。通过自动化试验步骤,及从任何方便的来源中提供化合物用于试验,这些试验可用于筛选大的化学文库,这些试验通常是平行方式进行(例如在机器试验中在微量滴定板上以微量滴定方式进行)。应当认识到有很多化学化合物供应商,包括Sigma(St.Louis,MO),Aldrich(St.Louis,MO),Sigma-Aldrich(St.Louis,MO),Fluka Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs,Switzerland)等。
在一个实施方案中,高通量筛选方法涉及提供包含大量潜在治疗性化合物(潜在调节子或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后在一种或多种上述试验中筛选这类“组合化学文库”或“配体文库”,来鉴定这些显示所需特征性活性的文库成员(特别是化学种类或亚类)。因此鉴定的化合物可以作为常规的“引导化合物(lead compounds)”或本身就可作为潜在或真正的消费品。
组合化学文库是不同化学化合物(由化学合成或生物合成产生的)的集合,通过大量化学“构造部件(building blocks)”如试剂组合而成。例如,线性组合化学文库如多肽文库是由一系列化学构造部件(氨基酸)用各种可能方式以指定化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数目)组合而形成。通过这种化学构造部件的组合混合可以合成出数百万个化学化合物。
组合化学文库的制备和筛选本领域技术人员众所周知。这类组合化学文库包括肽文库,但并不局限于肽文库(例如参见,U.S.Patent5,010,175,Furka,Int.J.Pept.Prot.Res.,37:487-493(1991)andHoughton等,Nature,354:84-88(1991))。同样可以用其它产生化学多样文库的化学物质。这些化学物质包括,但并不局限于:类肽(例如WO91/19735)、编码的肽(例如WO 93/20242)、随机生物寡聚物(PCT例如WO 92/00091)、苯并二氮杂(例如U.S.Pat.No.5,288,514)、乙内酰脲和苯并二氮杂以及二肽的异聚物(diversomers)(Hubbs等,PNAS90:6906-6913(1993))、联乙烯(vinylogous)多肽(Hagihara等,J.Amer.Chem.Soc.,114:6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽性肽模仿物(nonpeptidal petidomimetics)(Hirschmann等,J.Amer.Chem.Soc.,114:9217-9218(1992))、类似的有机合成小分子化合物文库(Chen等,J.Amer.Chem.Soc.,116:2661(1994))、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等,Science,261:1303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等,J.Org.Chem.,59:658(1994))、核酸文库(Ausubel,Berger and Sambrook,均如前)、肽核酸文库(U.S.Patent 5,539,083)、抗体文库(Vaughn等,Nature Biotechnology,14(3):309-314(1996)and PCT/US96/10278)、糖类文库(Liang等,Science,274:1520-1522(1996)and U.S.Patent 5,593853),有机小分子文库(苯并二氮杂,Baum,C&EN,Jan 18,page 33(1993);噻唑烷酮(thiazolidinones)和metathiazanones,U.S.Patent 5,549,974;pynrolidines,U.S.Patents 5,525,735和5,519,134;吗啉代化合物,U.S.Patent5,506,337;苯并二氮杂,5,288,514等)。
制备组合文库的装置已经商品化(例如参见,357 MPS,390 MPS(Advanced Chem Tech,Loui svilleKY),Symphony(Rainin,Woburn,MA),433A(Applied Biosystems,Foster City,CA),9050 Plus(Millipore,Bedford,MA))。另外,许多组合文库本身也已经商品化(例如参见,ComGenex,Princeton,NJ;Tripos,Inc.,St.Louis,MO;3DPharmaceuticals,Exton,PA;Martek BioSciences;Columbia,MD等)。
本发明的一个方面是,T2R调节子可用于任何食用产品、糖果、药物组合物或其成分中,从而以所需的方式调节产品、组合物或成分的味道。例如,可以加入能够增强苦味感觉的T2R调节子以增加产品或组合物的苦味,而可加入能阻断苦味感觉的T2R调节子以改善产品与组合物的味道。
G.描述和预测味觉感受的方法
本发明同样优选地提供在哺乳动物特别是人类中描述味觉感知和/或预测味觉感知的方法。优选地,这些方法可以通过使用在此公开的这些受体和使用此处公开的编码该T2R多肽的基因来完成。
本发明还包括一种筛选一种或多种化合物以检测是否存在可被哺乳动物察觉到的味道的方法,包括:把上述所指的一种或多种化合物与公开的受体接触,优选地其中哺乳动物是人。本发明同样可以包括展示哺乳动物对特定味道的味觉感知的方法,包括以下步骤:提供代表该脊椎动物n种味觉受体中每一种的定量刺激的X1到Xn值,其中n大于或等于4;从这些值中产生出一个味觉感知的定量描述。味觉受体可以是此处公开的味觉受体,描述可能包含一个点或n维空间的一个体积,可能包含一个图或一个谱,还可能包含一个定量描述矩阵。同样,提供的步骤可能包括将多数重组产生的味觉受体与待测组合物接触,定量测量该组合物与该受体的作用。
本发明同样涵盖预测在哺乳动物中产生未知的味觉感知的一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的味觉感知的方法,包括以下步骤:对于在哺乳动物中产生已知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个味觉受体中每一个的刺激量,其中n大于或等于4;对于一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生已知的味觉感知,从该值中产生出一个味觉感知的定量描述,对于在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,提供X1到Xn值代表该脊椎动物n个味觉受体中每一个的刺激量,其中n大于或等于4;对于一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生未知的味觉感知,从该值中产生出一个味觉感知的定量描述,预测一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的未知味觉感知,方法是将在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中引起的定量的描述与在哺乳动物中产生已知味觉感知的一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中引起的定量的描述相比较。本方法中所用味觉受体可以包括此处公开的味觉受体。
在另一个实施方案中,通过确定如上所述的已知分子或分子组合在哺乳动物中的味觉感知值;确定如上所述的一种或多种未知分子或分子组合在哺乳动物中的味觉感知值;将一种或多种未知组合物在哺乳动物中的味觉感知值和一种或多种已知组合物在哺乳动物中的味觉感知值相比较;选择能够引发哺乳动物特定味觉感知的分子或分子组合;并合并两个或更多未知分子或分子组合以形成能够引发哺乳动物中预定味觉感知的分子或分子组合,从而获得在哺乳动物中引发预定味觉感知的新型分子或分子组合。合并步骤产生能够在哺乳动物中引发特定味觉感知的单种分子或分子组合。
本发明的另一个实施方案是提供刺激味觉的方法,包括以下步骤:对于克隆的味觉受体群,优选的是人类受体群中的每一个,确定受体与味觉元的相互作用程度;合并各自具有与一种或多种所述受体预先确定的相互作用的化合物群,其用量是在一起能提供模拟味觉元作用图的受体-刺激作用图。通过在此描述的任何一种结合或报告子试验可以确定味觉元与味觉受体的相互作用。该多数化合物然后可以合并以形成一种混合物。如果需要,该多数化合物中的一种或多种可以共价结合。组合后的化合物基本上刺激至少75%、80%或90%的基本上由味觉元刺激的受体。
在本发明另一个优选实施方案中,针对多数味觉受体测试多数标准化合物,来确定每一个受体和每一个标准化合物的相互作用程度,因此针对每一个标准化合物产生受体刺激图。然后这些受体刺激图可以存储在存在于数据存储介质上的相关数据库中。本方法可进一步包括提供味觉的所需受体刺激图;比较所需受体刺激图与相关数据库;确定与所需的受体刺激图最密切匹配的一种或多种标准化合物组合。本方法还可进一步包括将标准化合物组合成一种或多种已经确定的组合形式来刺激味觉。
H.试剂盒
T2R基因和它们的同源体是鉴定味觉受体细胞、法医学和亲子鉴定、检验味觉传导的有利工具。能够特异性与T2R核酸杂交的T2R家族成员特异性试剂,如T2R探针和引物,以及能够特异性结合T2R蛋白质的T2R特异性试剂,例如T2R抗体,可以用于检验味觉细胞表达和味觉传导调节。
确定样品中T2R家族成员DNA和RNA是否存在的核酸试验包括本领域众所周知的许多技术,例如Southern分析、Northern分析、点印迹、RNA酶保护、S1分析、扩增技术如PCR、和原位杂交。例如在原位杂交中,靶核酸从它的细胞内环境中释放出来,以便能在细胞内进行杂交,同时保持细胞形态,利于随后的解释和分析。以下文章提供了原位杂交的概况:Singer等,Biotechniques,4:230-250(1986);Haase等,Methodsin Virology,vol.VII,189-226(1984);和Names等,eds.,NucleicAcid Hybridization:A Practical Approach(1987)。另外,T2R蛋白质可以使用如上描述的各种免疫试验技术来检测。测试样品通常同时与阳性对照(例如,表达重组T2R蛋白质的样品)和阴性对照比较。
本发明同样提供了筛选T2R家族成员调节子的试剂盒。这些试剂盒可以从现成材料和试剂中制备。例如,这些试剂盒可以包含以下材料中的任何一种或多种:T2R核酸或蛋白质、反应试管、测试T2R活性的指南等。可选地,试剂盒包含功能性T2R多肽。按照本发明可以制备多种试剂盒和组分,这取决于试剂盒的特定用户和用户的特殊需求。
实施例
下面的实施例概括了本发明中的分离的核酸分子,和与核酸分子概念性翻译相应的多肽序列。此处提供的蛋白质序列中,单字母X或Xaa指二十种常见氨基酸残基中的任意一种。此处提供的DNA序列中,单字母N或n代表四种常见核苷酸碱基A、T、C、G中的任意一种。
hT2R51全长cDNA(BAC AC011654)(SEQ ID NO:1)ATGTTGACTCTAACTCGCATCCGCACTGTGTCCTATGAAGTCAGGAGTACATTTCTGTTCATTTCAGTCCTGGAGTTTGCAGTGGGGTTTCTGACCAATGCCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGGCACTGAGCAACAGTGATTGTGTGCTGCTGTGTCTCAGCATCAGCCGGCTTTTCCTGCATGGACTGCTGTTCCTGAGTGCTATCCAGCTTACCCACTTCCAGAAGTTGAGTGAACCACTGAACCACAGCTACCAAGCCATCATCATGCTATGGATGATTGCAAACCAAGCCAACCTCTGGCTTGCTGCCTGCCTCAGCCTGCTTTACTGCTCCAAGCTCATCCGTTTCTCTCACACCTTCCTGATCTGCTTGGCAAGCTGGGTCTCCAGGAAGATCTCCCAGATGCTCCTGGGTATTATTCTTTGCTCCTGCATCTGCACTGTCCTCTGTGTTTGGTGCTTTTTTAGCAGACCTCACTTCACAGTCACAACTGTGCTATTCATGAATAACAATACAAGGCTCAACTGGCAGATTAAAGATCTCAATTTATTTTATTCCTTTCTCTTCTGCTATCTGTGGTCTGTGCCTCCTTTCCTATTGTTTCTGGTTTCTTCTGGGATGCTGACTGTCTCCCTGGGAAGGCACATGAGGACAATGAAGGTCTATACCAGAAACTCTCGTGACCCCAGCCTGGAGGCCCACATTAAAGCCCTCAAGTCTCTTGTCTCCTTTTTCTGCTTCTTTGTGATATCATCCTGTGTTGCCTTCATCTCTGTGCCCCTACTGATTCTGTGGCGCGACAAAATAGGGGTGATGGTTTGTGTTGGGATAATGGCAGCTTGTCCCTCTGGGCATGCAGCCATCCTGATCTCAGGCAATGCCAAGTTGAGGAGAGCTGTGATGACCATTCTGCTCTGGGCTCAGAGCAGCCTGAAGGTAAGAGCCGACCACAAGGCAGATTCCCGGACACTGTGCTGA(SEQ ID NO:1)hT2R51概念性翻译(BAC AC011654)(SEQ ID NO:2)MLTLTRIRTVSYEVRSTFLFISVLEFAVGFLTNAFVFLVNFWDVVKRQALSNSDCVLLCLSISRLFLHGLLFLSAIQLTHFQKLSEPLNHSYQAIIMLWMIANQANLWLAACLSLLYCSKLIRFSHTFLICLASWVSRKISQMLLGIILCSCICTVLCVWCFFSRPHFTVTTVLFMNNNTRLNWQIKDLNLFYSFLFCYLWSVPPFLLFLVSSGMLTVSLGRHMRTMKVYTRNSRDPSLEAHIKALKSLVSFFCFFVISSCVAFISVPLLILWRDKIGVMVCVGIMAACPSGHAAILISGNAKLRRAVMTILLWAQSSLKVRADHKADSRTLC(SEQ ID NO:2)hT2R54全长cDNA(BAC AC024156)(SEQ ID NO:3)ATGACTAAACTCTGCGATCCTGCAGAAAGTGAATTGTCGCCATTTCTCATCACCTTAATTTTAGCAGTTTTACTTGCTGAATACCTCATTGGTATCATTGCAAATGGTTTCATCATGGCTATACATGCAGCTGAATGGGTTCAAAATAAGGCAGTTTCCACAAGTGGCAGGATCCTGGTTTTCCTGAGTGTATCCAGAATAGCTCTCCAAAGCCTCATGATGTTAGAAATTACCATCAGCTCAACCTCCCTAAGTTTTTATTCTGAAGACGCTGTATATTATGCATTCAAAATAAGTTTTATATTCTTAAATTTTTGTAGCCTGTGGTTTGCTGCCTGGCTCAGTTTCTTCTACTTTGTGAAGATTGCCAATTTCTCCTACCCCCTTTTCCTCAAACTGAGGTGGAGAATTACTGGATTGATACCCTGGCTTCTGTGGCTGTCCGTGTTTATTTCCTTCAGTCACAGCATGTTCTGCATCAACATCTGCACTGTGTATTGTAACAATTCTTTCCCTATCCACTCCTCCAACTCCACTAAGAAAACATACTTGTCTGAGATCAATGTGGTCGGTCTGGCTTTTTTCTTTAACCTGGGGATTGTGACTCCTCTGATCATGTTCATCCTGACAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAACGACCCCAGCATGGAGGCTCACATGGGGGCCATCAAAGCTATCAGCTACTTTCTCATTCTCTACATTTTCAATGCAGTTGCTCTGTTTATCTACCTGTCCAACATGTTTGACATCAACAGTCTGTGGAATAATTTGTGCCAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCAGCCACTCAATTCTACTGATTCAAGATAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGCTTCAGCTTCGACTTCATCTTTACCCAAAAGAGTGGACTCTGTGA(SEQ ID NO:3)hT2R54概念性翻译(BAC AC024156)(SEQ ID NO:4)MTKLCDPAESELSPFLITLILAVLLAEYLIGIIANGFIMAIHAAEWVQNKAVSTSGRILVFLSVSRIALQSLMMLEITISSTSLSFYSEDAVYYAFKISFIFLNFCSLWFAAWLSFFYFVKIANFSYPLFLKLRWRITGLIPWLLWLSVFISFSHSMFCINICTVYCNNSFPIHSSNSTKKTYLSEINVVGLAFFFNLGIVTPLIMFILTATLLILSLKRHTLHMGSNATGSNDPSMEAHMGAIKAISYFLILYIFNAVALFIYLSNMFDINSLWNNLCQIIMAAYPASHSILLIQDNPGLRRAWKRLQLRLHLYPKEWTL(SEQ IDNO:4)hT2R55全长cDNA(BAC AC024156)(SEQ ID NO:5)ATGGCAACGGTGAACACAGATGCCACAGATAAAGACATATCCAAGTTCAAGGTCACCTTCACTTTGGTGGTCTCCGGAATAGAGTGCATCACTGGCATCCTTGGGAGTGGCTTCATCACGGCCATCTATGGGGCTGAGTGGGCCAGGGGCAAAACACTCCCCACTGGTGACCGCATTATGTTGATGCTGAGCTTTTCCAGGCTCTTGCTACAGATTTGGATGATGCTGGAGAACATTTTCAGTCTGCTATTCCGAATTGTTTATAACCAAAACTCAGTGTATATCCTCTTCAAAGTCATCACTGTCTTTCTGAACCATTCCAATCTCTGGTTTGCTGCCTGGCTCAAAGTCTTCTATTGTCTTAGAATTGCAAACTTCAATCATCCTTTGTTCTTCCTGATGAAGAGGAAAATCATAGTGCTGATGCCTTGGCTTCTCAGGCTGTCAGTGTTGGTTTCCTTAAGCTTCAGCTTTCCTCTCTCGAGAGATGTCTTCAATGTGTATGTGAATAGCTCCATTCCTATCCCCTCCTCCAACTCCACGGAGAAGAAGTACTTCTCTGAGACCAATATGGTCAACCTGGTATTTTTCTATAACATGGGGATCTTCGTTCCTCTGATCATGTTCATCCTGGCAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAGGGACCCCAGCATGAAGGCTCACATAGGGGCCATCAAAGCCACCAGCTACTTTCTCATCCTCTACATTTTCAATGCAATTGCTCTATTTCTTTCCACGTCCAACATCTTTGACACTTACAGTTCCTGGAATATTTTGTGCAAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCGGCCACTCAGTACAACTGATCTTGGGCAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGTTTCAGCACCAAGTTCCTCTTTACCTAAAAGGGCAGACTCTGTGA(SEQ IDNO:5)hT2R55概念性翻译(BAC AC024156)(SEQ ID NO:6)MATVNTDATDKDISKFKVTFTLVVSGIECITGILGSGFITAIYGAEWARGKTLPTGDRIMLMLSFSRLLLQIWMMLENIFSLLFRIVYNQNSVYILFKVITVFLNHSNLWFAAWLKVFYCLRIANFNHPLFFLMKRKIIVLMPWLLRLSVLVSLSFSFPLSRDVFNVYVNSSIPIPSSNSTEKKYFSETNMVNLVFFYNMGIFVPLIMFILAATLLILSLKRHTLHMGSNATGSRDPSMKAHIGAIKATSYFLILYIFNAIALFLSTSNIFDTYSSWNILCKIIMAAYPAGHSVQLILGNPGLRRAWKRFQHQVPLYLKGQTL(SEQ ID NO:6)hT2R61全长cDNA(BAC AC018630)(SEQ ID NO:7)ATGATAACTTTTCTACCCATCATTTTTTCCAGTCTGGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCACTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAACTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTAATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTGATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTACCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACTTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGTTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATGAGATTGTGCGGACAAAAGAATTTGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAATTGAAGAGTGCAATGTACTTTTCAAATATGACTGTAACCATGGTAGCAAACTTAGTACCCTTCACTCTGACCCTACTATCTTTTATGCTGTTAATCTGTTCTTTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGAAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTTTGGCAAATGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGACTTCATCTCCATAG(SEQ ID NO:7)hT2R61概念性翻译(BAC AC018630)(SEQ ID NO:8)MITFLPIIFSSLVVVTFVIGNFANGFLALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFNSVEVRTTAYNIWAVINHFSNWLATTLSIFYLLKIANFSNFIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACHLFVINMNEIVRTKEFEGNMTWKIKLKSAMYFSNMTVTMVANLVPFTLTLLSFMLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKALQTVISFLLLCAIYFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKALRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVFWQMRYWVKGEKTSSP(SEQ ID NO:8)hT2R63全长cDNA(BAC AC0 18630)(SEQ ID NO:9)ATGATGAGTTTTCTACACATTGTTTTTTCCATTCTAGTAGTGGTTGCATTTATTCTTGGAAATTTTGCCAATGGCTTTATAGCACTGATAAATTTCATTGCCTGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCCTCAGCTGATCAAATTATTGCTGCTCTGGCAGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTAATATTATTACATTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAACTTCATCTAATTTAAAAGTAATAATTTTTATTTCTAATGCCTGGGCAGTAACCAATCATTTCAGCATCTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATCGTCAATTTCTCCAGACTTATTTTTCATCACTTAAAAAGGAAGGCTAAGAGTGTAGTTCTGGTGATAGTGTTGGGGTCTTTGTTCTTTTTGGTTTGTCACCTTGTGATGAAACACACGTATATAAATGTGTGGACAGAAGAATGTGAAGGAAACGTAACTTGGAAGATCAAACTGAGGAATGCAATGCACCTTTCCAACTTGACTGTAGCCATGCTAGCAAACTTGATACCATTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTACTCTCTGTGTAAACATCTGAAGAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGATCCACATAAAAGCTCTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCATATTACTTGCCATTTACTTTCTGTGTCTAATCATATCGTTTTGGAATTTTAAGATGCGACCAAAAGAAATTGTCTTAATGCTTTGCCAAGCTTTTGGAATCATATATCCATCATTCCACTCATTCATTCTGATTTGGGGGAACAAGACGCTAAAGCAGACCTTTCTTTCAGTTTTGTGGCAGGTGACTTGCTGGGCAAAAGGACAGAACCAGTCAACTCCATAG(SEQ ID NO:9)hT2R63概念性翻译(BAC AC018630)(SEQ ID NO:10)MMSFLHIVFSILVVVAFILGNFANGFIALINFIAWVKRQKISSADQIIAALAVSRVGLLWVILLHWYSTVLNPTSSNLKVIIFISNAWAVTNHFSIWLATSLSIFYLLKIVNFSRLIFHHLKRKAKSVVLVIVLGSLFFLVCHLVMKHTYINVWTEECEGNVTWKIKLRNAMHLSNLTVAMLANLIPFTLTLISFLLLIYSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKIHIKALQTVTSFLILLAIYFLCLIISFWNFKMRPKEIVLMLCQAFGIIYPSFHSFILIWGNKTLKQTFLSVLWQVTCWAKGQNQSTP(SEQ ID NO:10)hT2R64全长cDNA(BAC AC018630)(SEQ ID NO:11)ATGACAACTTTTATACCCATCATTTTTTCCAGTGTGGTAGTGGTTCTATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGCGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAGATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAATTGGTATTCAACTGTGTTTAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATGTCTGGGCAGTAACCGGCCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGCTGTTGGGGCCTTTACTATTTTTGGCTTGTCAACTTTTTGTGATAAACATGAAAGAGATTGTACGGACAAAAGAATATGAAGGAAACTTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAGTGCAGTGTACCTTTCAGATGCGACTGTAACCACGCTAGGAAACTTAGTGCCCTTCACTCTGACCCTGCTATGTTTTTTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTTTTTCCTCTTGTTATGTGCCGTTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGCGGCAAGTGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTCCATAG(SEQ ID NO:11)hT2R64概念性翻译(BAC AC018630)(SEQ ID NO:12)MTTFIPIIFSSVVVVLFVIGNFANGFIALVNSIERVKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVFNPAFYSVEVRTTAYNVWAVTGHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACQLFVINMKEIVRTKEYEGNLTWKIKLRSAVYLSDATVTTLGNLVPFTLTLLCFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKALQTVIFFLLLCAVYFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVLRQVRYWVKGEKPSSP(SEQ ID NO:12)hT2R65全长cDNA(BAC AC018630)(SEQ ID NO:13)ATGATGTGTTTTCTGCTCATCATTTCATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATGTTGCCAATGGCTTCATAGCCCTAGTAAATGTCATTGACTGGGTTAACACACGAAAGATCTCCTCAGCTGAGCAAATTCTCACTGCTCTGGTGGTCTCCAGAATTGGTTTACTCTGGGTCATGTTATTCCTTTGGTATGCAACTGTGTTTAATTCTGCTTTATATGGTTTAGAAGTAAGAATTGTTGCTTCTAATGCCTGGGCTGTAACGAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAGCCTCAGCATATTTTGTTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTCTCTCCACCTAAAGAAGAGAATTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGTTGGGGCCCTTGGTATTTCTGATTTGTAATCTTGCTGTGATAACCATGGATGAGAGAGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGAAATGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAATGCAATACACCTTTCAAGCTTGACTGTAACTACTCTAGCAAACCTCATACCCTTTACTCTGAGCCTAATATGTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTTTGTAAACATCTCAAGAAGATGCGGCTCCATAGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCATATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCATGTTATTTGCCATTTACTTTCTGTGTATAATCACATCAACTTGGAATCTTAGGACACAGCAGAGCAAACTTGTACTCCTGCTTTGCCAAACTGTTGCAATCATGTATCCTTCATTCCACTCATTCATCCTGATTATGGGAAGTAGGAAGCTAAAACAGACCTTTCTTTCAGTTTTGTGGCAGATGACACGCTGA(SEQ ID NO:13)hT2R65概念性翻译(BAC AC018630)(SEQ ID NO:14)MMCFLLIISSILVVFAFVLGNVANGFIALVNVIDWVNTRKISSAEQILTALVVSRIGLLWVMLFLWYATVFNSALYGLEVRIVASNAWAVTNHFSMWLAASLSIFCLLKIANFSNLISLHLKKRIKSVVLVILLGPLVFLICNLAVITMDERVWTKEYEGNVTWKIKLRNAIHLSSLTVTTLANLIPFTLSLICFLLLICSLCKHLKKMRLHSKGSQDPSTKVHIKALQTVTSFLMLFAIYFLCIITSTWNLRTQQSKLVLLLCQTVAIMYPSFHSFILIMGSRKLKQTFLSVLWQMTR(SEQ ID NO:14)hT2R67全长cDNA(BAC AC018630)(SEQ ID NO:15)ATGATAACTTTTCTATACATTTTTTTTTCAATTCTAATAATGGTTTTATTTGTTCTCGGAAACTTTGCCAATGGCTTCATAGCACTGGTAAATTTCATTGACTGGGTGAAGAGAAAAAAGATCTCCTCAGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAATTGGTTTGCTCTGGGCATTATTATTAAATTGGTATTTAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAATTAAGAATTACTTCTTATAATGCCTGGGTTGTAACCAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAACCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTCTTTTTCTTCATTTAAAGAGGAGAGTTAGGAGTGTCATTCTGGTGATACTGTTGGGGACTTTGATATTTTTGGTTTGTCATCTTCTTGTGGCAAACATGGATGAGAGTATGTGGGCAGAAGAATATGAAGGAAACATGACTGGGAAGATGAAATTGAGGAATACAGTACATCTTTCATATTTGACTGTAACTACCCTATGGAGCTTCATACCCTTTACTCTGTCCCTGATATCTTTTCTGATGCTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGAGAAGGATCGCAAGATCTCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTCTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTTCTTTCTATTCCTAATCGTTTCGGTTTGGAGTCCTAGGAGGCTGCGGAATGACCCGGTTGTCATGGTTAGCAAGGCTGTTGGAAACATATATCTTGCATTCGACTCATTCATCCTAATTTGGAGAACCAAGAAGCTAAAACACACCTTTCTTTTGATTTTGTGTCAGATTAGGTGCTGA(SEQ ID NO:15)hT2R67概念性翻译(BAC AC018630)(SEQ ID NO:16)MITFLYIFFSILIMVLFVLGNFANGFIALVNFIDWVKRKKISSAKQILTALAVSRIGLLWALLLNWYLTVLNPAFYSVELRITSYNAWVVTNHFSMWLAANLSIFYLLKIANFSNLLFLHLKRRVRSVILVILLGTLIFLVCHLLVANMDESMWAEEYEGNMTGKMKLRNTVHLSYLTVTTLWSFIPFTLSLISFLMLICSLCKHLKKMQLHGEGSQDLSTKVHIKALQTLISFLLLCAIFFLFLIVSVWSPRRLRNDPVVMVSKAVGNIYLAFDSFILIWRTKKLKHTFLLILCQIRC(SEQ ID NO:16)hT2R71全长cDNA(BAC AC073264)(SEQ ID NO:17)ATGCAAGCAGCACTGACGGCCTTCTTCGTGTTGCTCTTTAGCCTGCTGAGTCTTCTGGGGATTGCAGCGAATGGCTTCATTGTGCTGGTGCTGGGCAGGGAGTGGCTGCGATATGGCAGGTTGCTGCCCTTGGATATGATCCTCATTAGCTTGGGTGCCTCCCGCTTCTGCCTGCAGTTGGTTGGGACGGTGCACAACTTCTACTACTCTGCCCAGAAGGTCGAGTACTCTGGGGGTCTCGGCCGACAGTTCTTCCATCTACACTGGCACTTCCTGAACTCAGCCACCTTCTGGTTTTGCAGCTGGCTCAGTGTCCTGTTCTGTGTGAAGATTGCTAACATCACACACTCCACCTTCCTGTGGCTGAAGTGGAGGTTCCCAGGGTGGGTGCCCTGGCTCCTGTTGGGCTCTGTCCTGATCTCCTTCATCATAACCCTGCTGTTTTTTTGGGTGAACTACCCTGTATATCAAGAATTTTTAATTAGAAAATTTTCTGGGAACATGACCTACAAGTGGAATACAAGGATAGAAACATACTATTTCCCATCCCTGAAACTGGTCATCTGGTCAATTCCTTTTTCTGTTTTTCTGGTCTCAATTATGCTGTTAATTAATTCTCTGAGGAGGCATACTCAGAGAATGCAGCACAACGGGCACAGCCTGCAGGACCCCAGCACCCAGGCTCACACCAGAGCTCTGAAGTCCCTCATCTCCTTCCTCATTCTTTATGCTCTGTCCTTTCTGTCCCTGATCATTGATGCCGCAAAATTTATCTCCATGCAGAACGACTTTTACTGGCCATGGCAAATTGCAGTCTACCTGTGCATATCTGTCCATCCCTTCATCCTCATCTTCAGCAACCTCAAGCTTCGAAGCGTGTTCTCGCAGCTCCTGTTGTTGGCAAGGGGCTTCTGGGTGGCCTAG(SEQ ID NO:17)hT2R71概念性翻译(BAC AC073264)(SEQ ID NO:18)MQAALTAFFVLLFSLLSLLGIAANGFIVLVLGREWLRYGRLLPLDMILISLGASRFCLQLVGTVHNFYYSAQKVEYSGGLGRQFFHLHWHFLNSATFWFCSWLSVLFCVKIANITHSTFLWLKWRFPGWVPWLLLGSVLISFIITLLFFWVNYPVYQEFLIRKFSGNMTYKWNTRIETYYFPSLKLVIWSIPFSVFLVSIMLLINSLRRHTQRMQHNGHSLQDPSTQAHTRALKSLISFLILYALSFLSLLIDAAKFISMQNDFYWPWQLAVYLCISVHPFILIFSNLKLRSVFSQLLLLARGFWVA(SEQ ID NO:18)hT2R75全长cDNA(SEQ ID NO:19)ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTACATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCAGTCTCCAGAGTTGGTTTACTCTGGGTATTAGTATTAAATTGGTATGCAACTGAGTTGAATCCAGCTTTTAACAGTATAGAAGTAAGAATTACTGCTTACAATGTCTGGGCAGTAATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTATTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATCAGATTATATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAACTGAGGAGTGCAATGTACCTTTCAAATACAACGGTAACCATCCTAGCAAACTTAGTTCCCTTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAAAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCATGAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATCATGTCAGTTTGGAGTTTTGAGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCGAAGCTATTGCATTCAGCTATCCTTCAACCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGTGGCATGTGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTTCATAG (SEQ ID NO:19)hT2R75概念性翻译(SEQ ID NO:20)MITFLPIIFSILIVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLVLNWYATELNPAFNSIEVRITAYNVWAVINHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMNQIIWTKEYEGNMTWKIKLRSAMYLSNTTVTILNLVPFTLTLISFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSMKVHIKALQTVTSFLLLCAIYFLSIIMSVWSFESLENKPVFMFCEAIAFSYPSTHPFILIWGNKKLKQTFLSVLWHVRYWVKGEKPSSS(SEQ ID NO:20)hT2R59假基团(BAC AC018630)(SEQ ID NO:21)ATGGTATATTTTCTGCTCATCATTTTATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATTTTTCCAATGGCTTCATAGCTCTAGTAAATGTCATTGACTGGGTTAAGACACGAAAGATCTCCTCAGCTGACCAAATCCTCACTGCTCTGGTGGTCTCCAGAATTGGTTTACTCTGGGTCATATTATTACATTGGTATGCAAATGTGTTTAATTCAGCTTTATATAGTTCAGAAGTAGGAGCTGTTGCTTCTAATATCTCAGCAATAATCAACCATTTCAGCATCTGGCTTGCTGCTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTCCACCTAAAGAAGAGAATTAGGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGTTGGGTCCCTTGGTATTTTTGATTTGTAATCTTGCTGTGATAACCATGGATGACAGTGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGAAATGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAATGCAATACACCTTTCAAACTTGACTGTAAGCACACTAGCAAACCTCATACCCTTCATTCTGACCCTAATATGTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGCATAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCTCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTCATGTTATATGCCATTTACTTTCTGTATCTAATCACATTAACCTGGAATCTTTGAACACAGCAGAACAAACTTGTATTCCTGCTTTGCCAAACTCTTGGAATCATGTATCCTTCATTCCACTCATTCTTCCTGATTATGGGAAGCAGGAAACTAAAACAGACGTTTCTTTCAGTTTTATGTCAGGTCACATGCTTAGTGAAAGGACAGCAACCCTCAACTCCATAG(SEQ ID NO:21)hT2R69假基因(BAC AC018630)(SEQ ID NO:22)ATGATATGTTTTCTGCTCATCATTTTATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATGTTGCCAATGGCTTCATAGCTCTAGTAGGTGTCCTTGAGTGGGTTAAGACACAAAAGATCTCATCAGCTGACCAAATTTCTCACTGCTCTGGTGGTGTCCAGAGTTGGTTTACTCTGGGTCATATTATTACATTGGTATGCAACTGTGTTTAATTTGGCTTCACATAGATTAGAAGTAAGAATTTTTGGTTCTAATGTCTCAGCAATAACCAAGCATTTCAGCATCTGGGTGTTACTAGCCTCAGCATATTTCATTTGCTCAAGACTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTCCACCTAAAGAAAAGGATTAAGAATGTTGGTTTGGTGATGCTGTTGGGGCCCTTGGTATTTTTCATTTGTAATCTTGCTCTGATAACCACGGGTGAGAGTGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGAAATTTGTCTTGGATGATCAAATTGAGGAATGCAATACAGCTTTCAAACTTGACTGTAACCATGCCAGCAAACGTCACACCCTGCACTCTGACACTAATATCTTTTCTGCTGTTAATCTATTCTCCATGTAAACATGTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAACATCTCAGCACCAAGGTGCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTTATGTTATTTGCCATTTACTTTCTGTGTCTAATCACATCAACTTGGAATCCTAGGACTCAGCAGAGCAAACTTGTATTCCTGCTTTACCAAACTCTTGGATTCATGTATCTTTTGTTCCACTCATTCATCCTGACTATGGGAAGTAGGAAGCCAAAACAGACCTTTCTTTCAGCTTTGTGA(SEQ ID NO:22)mT2R33全长cDNA(BAC AC020619)(SEQ ID NO:23)ATGACCTCCCCTTTCCCAGCTATTTATCACATGGTCATCATGACAGCAGAGTTTCTCATCGGGACTACAGTGAATGGATTCCTTATCATTGTGAACTGCTATGACTTGTTCAAGAGCCGAACGTTCCTGATCCTGCAGACCCTCTTGATGTGCACAGGGCTGTCCAGACTCGGTCTGCAGATAATGCTCATGACCCAAAGCTTCTTCTCTGTGTTCTTTCCATACTCTTATGAGGAAAATATTTATAGTTCAGATATAATGTTCGTCTGGATGTTCTTCAGCTCGATTGGCCTCTGGTTTGCCACATGTCTCTCTGTCTTTTACTGCCTCAAGATTTCAGGCTTCACTCCACCCTGGTTTCTTTGGCTGAAATTCAGAATTTCAAAGCTCATATTTTGGCTGCTTCTGGGCAGCTTGCTGGCCTCTCTGGGCACTGCAACTGTGTGCATCGAGGTAGGTTTCCCTTTAATTGAGGATGGCTATGTCCTGAGAAACGCAGGACTAAATGATAGTAATGCCAAGCTAGTGAGAAATAATGACTTGCTCCTCATCAACCTGATCCTCCTGCTTCCCCTGTCTGTGTTTGTGATGTGCACCTCTATGTTATTTGTTTCTCTTTACAAGCACATGCACTGGATGCAAAGCGAATCTCACAAGCTGTCAAGTGCCAGAACCGAAGCTCATATAAATGCATTAAAGACAGTGACAACATTCTTTTGTTTCTTTGTTTCTTACTTTGCTGCCTTCATGGCAAATATGACATTTAGAATTCCATACAGAAGTCATCAGTTCTTCGTGGTGAAGGAAATCATGGCAGCATATCCCGCCGGCCACTCTGTCATAATCGTCTTGAGTAACTCTAAGTTCAAAGACTTATTCAGGAGAATGATCTGTCTACAGAAGGAAGAGTGA(SEQ IDNO:23)mT2R33概念性翻译(BAC AC020619)(SEQ ID NO:24)MTSPFPAIYHMVTMTAEFLIGTTVNGFLIIVNCYDLFKSRTFLILQTLLMCTGLSRLGLQIMLMTQSFFSVFFPYSYEENIYSSDIMFVWMFFSSIGLWFATCLSVFYCLKISGFTPPWFLWLKFRISKLIFWLLLGSLLASLGTATVCIEVGFPLIEDGYVLRNAGLNDSNAKLVRNNDLLLINLILLLPLSVFVMCTSMLFVSLYKHMHWMQSESHKLSSARTEAHINALKTVTTFFCFFVSYFAAFMANMTFRIPYRSHQFFVVKEIMAAYPAGHSVIIVLSNSKFKDLFRRMICLQKEE(SEQ ID NO:24)
虽然前面详尽的叙述已经描述了本发明的几个实施方案,但必需认识到以上的描述只是对本发明的说明,而不是限定。本发明仅由下面的权利要求来限定。
Claims (137)
1.分离的核酸分子,其选自:
(i)分离的核酸分子,其包含选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核苷酸序列,或含有至少75个核苷酸的其片段;
(ii)分离的cDNA或由其转录出的不溶性RNA,其编码包含选自SEQID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽,或其编码所述肽的至少25个连续氨基酸的片段;
(iii)分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列,或其包含其至少100个连续核苷酸的片段具有至少20-30%的序列相同性;
(iv)分离核酸分子,其编码与具有选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽在氨基酸水平上具有至少40%的序列相同性的多肽,或编码至少其50个连续氨基酸残基的分离的核酸分子;
(v)编码味觉受体或其片段的分离的核酸分子,其在严谨杂交条件下,能够与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列特异地杂交;以及
(vi)(i)或(ii)中的分离的核酸分子的变体,其在编码区包含至少一处替换、缺失或加入突变。
2.权利要求1中的分离的核酸分子,其选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23,或含有其至少75个连续核苷酸的片段。
3.权利要求1中的分离的核酸分子,其编码具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽,或其编码所述多肽的至少25个连续氨基酸残基的片段。
4.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列,或其包含任何所述序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少30%的序列相同性。
5.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列,或其包含任何所述序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少40-60%的序列相同性。
6.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列,或其包含任何所述序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少70%的序列相同性。
7.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列,或其包含任何所述序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少80%的序列相同性。
8.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列,或其包含任何所述序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少90%的序列相同性。
9.权利要求1的分离的核酸分子,其编码与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40个连续氨基酸的片段有至少95%序列相同性的多肽。
10.权利要求1的分离的核酸分子,其编码与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40个连续氨基酸的片段有至少96%序列相同性的多肽。
11.权利要求1的分离的核酸分子,其编码与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40个连续氨基酸的片段有至少97%序列相同性的多肽。
12.权利要求1的分离的核酸分子,其编码与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40个连续氨基酸的片段有至少98%序列相同性的多肽。
13.权利要求1的分离的核酸分子,其编码与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽或其包含其中至少40个连续氨基酸的片段有至少99%序列相同性的多肽。
14.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列具有至少20-30%的序列相同性,或与包含所述核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少30%的序列相同性;并且进一步包含至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
15.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列具有至少40-60%的序列相同性,或与包含所述核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少40-60%的序列相同性;并且进一步包含至少一种编码与选自SEQ IDNOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
16.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列具有至少70%的序列相同性,或与包含所述核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少70%的序列相同性;并且进一步包含至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
17.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列具有至少80%的序列相同性,或与包含所述核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少90%的序列相同性;并且进一步包含至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
18.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列具有至少85%的序列相同性,或与包含所述核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少85%的序列相同性;并且进一步包含至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
19.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列具有至少90%的序列相同性,或与包含所述核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少90%的序列相同性;并且进一步包含至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
20.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列具有至少95%的序列相同性,或与包含所述核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少95%的序列相同性;并且进一步包含至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
21.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列具有大约95-99%的序列相同性,或与包含所述核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有大约95-99%的序列相同性;并且进一步包含至少一种编码与选自SEQ IDNOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
22.编码功能性味觉受体的分离的核酸分子,其包含至少100个核苷酸长度的部分,所述的部分与选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核酸序列的至少具有100个连续核苷酸的部分具有至少40%的序列相同性。
23.权利要求22的核酸分子,其是嵌合核酸分子,其中所述的嵌合核酸分子是通过组合至少两种不同的G蛋白耦联受体的部分而产生的。
24.权利要求23的嵌合核酸分子,其中所述的两种不同的G蛋白耦联受体是味觉受体。
25.权利要求23的嵌合核酸分子,其中所述的嵌合核酸分子包含至少200个与所述核酸序列之一的一部分有至少40%相同性的连续核苷酸。
26.权利要求1的分离的核酸分子,其直接或间接附着到编码可检测多肽的核酸序列上。
27.权利要求26的核酸分子,其中所述的可检测多肽是绿色荧光蛋白,或其片段或变体。
28.分离的核酸分子,其编码与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的多肽或其包含所述多肽的至少40个连续氨基酸的片段具有大约30-40%序列相同性的多肽,所述多肽直接或间接附着在可以协助所述的多肽在细胞表面的表达和/或转位的序列上。
29.分离的核酸分子,其编码与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的多肽或其包含所述多肽的至少40个连续氨基酸的片段具有大约50%序列相同性的多肽,所述多肽直接或间接附着在可以协助所述的多肽在细胞表面的表达和/或转位的序列上。
30.分离的核酸分子,其编码与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的多肽或其包含所述多肽的至少40个连续氨基酸的片段具有大约60%序列相同性的多肽,所述多肽直接或间接附着在可以协助所述的多肽在细胞表面的表达和/或转位的序列上。
31.分离的核酸分子,其编码与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的多肽或其包含所述多肽的至少40个连续氨基酸的片段具有至少70%序列相同性的多肽,所述多肽直接或间接附着在可以协助所述的多肽在细胞表面的表达和/或转位的序列上。
32.分离的核酸分子,其编码与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的多肽或其包含所述多肽的至少40个连续氨基酸的片段具有至少80%序列相同性的多肽,所述多肽直接或间接附着在可以协助所述的多肽在细胞表面的表达和/或转位的序列上。
33.分离的核酸分子,其编码与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的多肽或其包含所述多肽的至少40个连续氨基酸的片段具有至少90%序列相同性的多肽,所述多肽直接或间接附着在可以协助所述的多肽在细胞表面的表达和/或转位的序列上。
34.分离的核酸分子,其编码与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的多肽或其包含所述多肽的至少40个连续氨基酸的片段具有至少95%序列相同性的多肽,所述多肽直接或间接附着在可以协助所述的多肽在细胞表面的表达和/或转位的序列上。
35.分离的核酸分子,其编码与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的多肽或其包含所述多肽的至少40个连续氨基酸的片段具有大约95-99%序列相同性的多肽,所述多肽直接或间接附着在可以协助所述的多肽在细胞表面的表达和/或转位的序列上的片段。
36.权利要求1中的分离的核酸分子,其可操作性地连接至组成性启动子上。
37.权利要求1中的分离的核酸分子,其可操作性地连接至可调节的启动子上。
38.权利要求1中的分离的核酸分子,其直接或间接附着到编码伴侣蛋白或其片段的核酸序列上。
39.分离的核酸分子,其包含编码具有选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽中至少60个连续氨基酸的片段的核苷酸序列。
40.权利要求39中的分离的核酸分子,其中所述核苷酸序列编码至少100个氨基酸。
41.权利要求39中的分离的核酸分子,其中所述核苷酸序列编码至少150个氨基酸。
42.权利要求39中的分离的核酸分子,其中所述核苷酸序列编码至少200个氨基酸。
43.权利要求39中的分离的核酸分子,其中所述核苷酸序列编码至少250个氨基酸。
44.权利要求39中的分离的核酸分子,其中所述多肽是T2R多肽。
45.权利要求39中的分离的核酸分子,其中所述的片段特异性结合选自6-正丙基硫代尿嘧啶、八醋酸蔗糖酯、十一醋酸蜜三糖酯、denatonium、甘氨酸铜和奎宁的配体。
46.权利要求1中的分离的核酸分子,其包含选自SEQ ID NOS:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,和23的核苷酸序列。
47.包含权利要求1中的核酸序列的表达载体。
48.权利要求47中的表达载体,其为哺乳动物、酵母、细菌或昆虫表达载体。
49.用权利要求1中的至少一种核酸序列转染或转化的细胞。
50.权利要求49中的细胞,其中细胞是哺乳动物细胞。
51.权利要求50中的哺乳动物细胞,其中的细胞是人细胞。
52.权利要求49中的细胞,其中的细胞是酵母或昆虫细胞。
53.权利要求50中的哺乳动物细胞,其选自味觉细胞、中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞和骨髓瘤细胞。
54.固相,其包含至少一种权利要求1中的分离的核酸序列。
55.固相,其附着在包含至少一种权利要求1的序列的不同核酸序列的阵列上。
56.权利要求54的固相,其包含至少4种不同的编码功能性味觉受体或其片段或变体的核酸序列的阵列。
57.权利要求54的包含核酸阵列的固相,其包含至少10种不同的编码功能性味觉受体的核酸序列。
58.权利要求54包含核酸阵列的固相,其包含至少50种不同的编码功能性味觉受体或其片段或变体的核酸序列。
59.权利要求54包含核酸阵列的固相,其包含至少100种不同的编码功能性味觉受体或其片段或变体的核酸序列。
60.分离的多肽或融合蛋白,其选自:
(i)包含选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽;
(ii)包含与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列有至少50%序列相同性的多肽;
(iii)包含与至少40个氨基酸长的(i)中多肽的片段具有至少75%序列相同性的氨基酸序列的多肽;
(iv)嵌合多肽,其包含至少40个氨基酸长的(i)或(ii)中多肽的一部分,和至少另外一种G蛋白耦联受体的一部分;以及
(v)(i)中的多肽的变体,其与所述的多肽不同之处在于至少有一处替换、增加或缺失修饰。
61.权利要求60中的分离的多肽,其中该多肽与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列的多肽或其至少200个氨基酸的片段具有至少60%序列相同性。
62.权利要求60中的分离的多肽,其中该多肽与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列的多肽或其至少200个氨基酸的片段具有至少65%序列相同性。
63.权利要求60中的分离的多肽,其中该多肽与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列的多肽或其至少200个氨基酸的片段具有至少75%序列相同性。
64.权利要求60中的分离的多肽,其中该多肽与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列的多肽或其至少200个氨基酸的片段具有至少75%序列相同性。
65.权利要求60中的分离的多肽,其中该多肽与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列的多肽或其至少200个氨基酸的片段具有至少80%序列相同性。
66.权利要求60中的分离的多肽,其中该多肽与具有选自SEQ IDNOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列的多肽或其至少200个氨基酸的片段具有至少90%序列相同性。
67.权利要求60(v)中的变体,其包含至少5处保守性氨基酸替换。
68.权利要求60(v)中的变体,其包含至多5处保守性氨基酸替换。
69.权利要求60(v)中的变体,其包含5-7处保守性替换修饰。
70.权利要求60(v)中的变体,其包含3-4处保守性替换修饰。
71.权利要求60(v)中的变体,其包含1或2处保守性替换修饰。
72.固相,其直接或间接固定了至少一种权利要求60的分离的多肽,或在细胞表面表达所述多肽的细胞。
73.权利要求72中的固相,其包含固定化的至少4种不同的权利要求60中的多肽或在细胞表面表达所述多肽的细胞。
74.权利要求72中的固相,其包含固定化的至少16种不同的权利要求60中的多肽或在细胞表面表达所述多肽的细胞。
75.权利要求72中的固相,其包含固定化的至少25种不同的权利要求48中的多肽或在细胞表面表达所述多肽的细胞。
76.检测味觉受体基因表达的方法,其包括(a)将至少一种样品与权利要求1中的核酸分子杂交,以及(b)通过阳性杂交信号检测味觉受体基因的表达。
77.筛选文库的方法,其包括(a)将文库与权利要求1中的核酸分子杂交以及(b)通过阳性杂交信号在文库中检测一个或多个味觉受体克隆。
78.包含权利要求1中的核酸分子的重组多核苷酸,其直接或间接附着在异源核酸分子上。
79.包含权利要求1中的核酸分子的表达载体,其中该核酸分子可操作性地连接至驱动其表达的异源核酸分子上。
80.转染或转化的细胞,其包括被引入到宿主细胞或其后代的权利要求78中的重组多核苷酸。
81.转基因的非人类生物体,其包括被引入到非人类宿主生物体的细胞或其后代中的权利要求78中的重组多核苷酸。
82.制备重组多核苷酸的方法,其包括将权利要求1中的核酸分子连接至异源核酸上。
83.权利要求82中的方法,其中所述的异源核酸包含翻译的和/或转录的调节区。
84.制备转染细胞的方法,其包括将权利要求78中的重组多核苷酸引入到宿主细胞,或繁殖已经引入重组多核苷酸的宿主细胞。
85.检测推定的配体与味觉受体特异性结合的方法,其包括(a)将推定的配体与已经引入了权利要求79的表达载体的细胞接触,其中味觉受体因而由所述的细胞表达,和(b)直接或间接检测推定的配体和味觉受体之间的特异性结合。
86.制备转基因非人类生物体的方法,其包括将权利要求78中的重组多核苷酸引入到宿主非人类生物体细胞,或繁殖已经引入了重组多核苷酸的宿主非人类生物体。
87.分离的多肽分子,其包括具有选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽的至少60个连续氨基酸的片段。
88.权利要求87中分离的多肽分子,其中所述的片段包含至少100个氨基酸。
89.权利要求87中分离的多肽分子,其中所述的片段包含至少150个氨基酸。
90.权利要求87中分离的多肽分子,其中所述的片段包含至少200个氨基酸。
91.权利要求87中分离的多肽分子,其中所述的片段包含至少250个氨基酸。
92.权利要求87中分离的多肽分子,其中所述的片段是T2R多肽。
93.权利要求87中分离的多肽分子,其中所述的片段特异性结合与苦味物质相关联的味觉元,所述的苦味物质选自6-正丙基硫代尿嘧啶、八醋酸蔗糖酯、十一醋酸蜜三糖酯、denatonium、甘氨酸铜和奎宁。
94.包含权利要求87的多肽和异源肽结构域的重组多肽。
95.权利要求94的重组多肽,其中所述的异源肽结构域包括G蛋白耦联受体的跨膜区。
96.权利要求94的重组多肽,其包括具有味觉受体配体结合区的7跨膜受体,其中所述的味觉受体配体结合区是至少两种不同味觉受体的嵌合体。
97.检测配体和味觉受体特异性结合的方法,其包括(a)将配体与权利要求87的多肽接触,和(b)直接或间接检测配体和味觉受体之间的特异性结合。
98.抗体或抗体片段,其特异性结合具有选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的氨基酸序列的多肽。
99.检测权利要求98的抗体和味觉受体特异性结合的方法,其包括(a)将抗体与可能含有味觉受体的样品接触,和(b)检测两者之间的特异性结合。
100.权利要求99的方法,其中通过抗体与样品中细胞的特异性结合,将该细胞鉴定为味觉细胞。
101.从化学化合物文库中筛选参与味觉感受的化合物的方法,其包括将所述的文库中的化合物与至少一种权利要求87中的多肽接触,并鉴定特异性结合至少一种所述多肽的化合物。
102.权利要求101的方法,其中所述的文库是组合化学文库。
103.权利要求101的方法,其中所述的文库是肽文库。
104.权利要求101的方法,其中所述的文库是肽、编码肽、苯(并)二氮杂、变构体(diversomer)、乙烯类(vinylogous)多肽、非肽类肽模拟物(peptidominetic)、或小分子有机化合物文库。
105.权利要求101的方法,其中所述的文库是化合物的随机组合。
106.权利要求101的方法,其中所述的化合物是通过高通量筛选法筛选。
107.权利要求101的方法,其中所述的筛选法是由能够表达至少一种所述多肽的动物细胞或组织来完成。
108.细胞或非人类动物试验,用于鉴定与T2R多肽相互作用的分子,包括:
获得表达至少一种功能性T2R多肽或包含功能性T2R多肽的嵌合多肽,以及可选地表达至少一种功能性G蛋白的细胞或非人类动物;
将所述的细胞或非人类动物与欲筛选是否具有调节T2R多肽的能力的分子接触;并
检测是否有调节作用发生。
109.权利要求108的方法,其中调节作用基于细胞内钙水平的变化来检测。
110.权利要求108的方法,其中调节作用通过测量32P从γ标记的GTP到T2R多肽的转移来检测。
111.权利要求108的方法,其中调节作用基于与已知的能够调节特定T2R多肽的对照化合物进行比较来确定。
112.权利要求108的方法,其中G蛋白是Gα15或Gα16或其它混栖G蛋白。
113.权利要求108的方法,其中调节作用由检测细胞内环核苷酸水平是否发生变化来确定。
114.权利要求108的方法,其中调节作用基于将细胞与筛选的化合物接触后,预定的靶蛋白的转录水平来确定。
115.权利要求108的方法,其中所述的筛选的化合物基于T2R多肽或其片段的氨基酸序列的预测或实际的三维结构,通过计算机辅助化合物设计而合成。
116.权利要求108的方法,其中调节T2R多肽的化合物是基于它们是否能与T2R多肽特异性结合来鉴定。
117.权利要求108的方法,其中调节作用指T2R多肽功能的抑制。
118.权利要求108的方法,其中调节作用指T2R多肽功能的增强。
119.用于描述一种或多种哺乳动物中的一种或多种味觉感知的方法,其包括:
提供X1到Xn值代表所述哺乳动物的n个味觉受体中每一个的刺激量;和
从所述的值中产生味觉感知的定量表示法,其中至少一种所述的味觉受体是味觉受体多肽,其具有与选自SEQ ID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列有至少约75%相同性的序列。
120.权利要求119的方法,其中所述的描述包含点或n维空间的体积。
121.权利要求119的方法,其中所述的描述包含图或图谱。
122.权利要求119的方法,其中所述的描述包含定量描述矩阵。
123.权利要求119的方法,其中所述的提供步骤包括将多个重组产生的味觉受体与试验组合物接触,并定量测量所述的组合物与所述的受体的相互作用。
124.预测哺乳动物中由一种或多种分子或分子组合产生的味觉感知的方法,包括:
针对在哺乳动物中产生已知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,提供X1到Xn值,代表所述的哺乳动物n个味觉受体中每一个的刺激量,
针对在哺乳动物中产生已知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,从所述的值中产生哺乳动物味觉感知的定量表示法;
针对在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合,提供X1到Xn值,代表所述的哺乳动物n个味觉受体中每一个的刺激量;
针对在哺乳动物中产生未知味觉感知的所述一种或多种分子或分子组合,从所述的值中产生哺乳动物味觉感知的定量表示法;和
通过将由在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中产生的味觉感知的定量表示法和由在哺乳动物中产生已知味觉感知的所述一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中的味觉感知的定量表示法,预测由在哺乳动物中产生未知味觉感知的一种或多种分子或分子组合在哺乳动物中所产生的味觉感知,
其中至少一种所述的味觉受体是味觉受体多肽,其具有与选自SEQID NOS:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,和24的序列至少75%相同性的序列。
125.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列具有至少20-30%的序列相同性,或其与包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少30%的序列相同性;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
126.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列具有至少40-60%的序列相同性,或其与包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少40-60%的序列相同性;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
127.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列具有至少70%的序列相同性,或其与包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少70%的序列相同性;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
128.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列具有至少80%的序列相同性,或其与包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少90%的序列相同性;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
129.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列具有至少85%的序列相同性,或其与包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少85%的序列相同性;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
130.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列具有至少90%的序列相同性,或其与包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少90%的序列相同性;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
131.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列具有至少95%的序列相同性,或其与包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有至少95%的序列相同性;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
132.分离的核酸分子,其与选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列具有大约95-99%的序列相同性,或其与包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段具有大约95-99%的序列相同性;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
133.分离的核酸分子,其具有选自SEQ ID NOS:21和22的核酸序列,或其包含所述的核酸序列的至少100个连续核苷酸的片段;并且其进一步包括至少一种编码与选自SEQ ID NOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列具有至少70%相同性的多肽的序列。
134.筛选文库的方法,其包括(a)将文库与权利要求125的分离的核酸分子杂交和(b)通过阳性杂交信号在文库中检测一个或多个味觉受体克隆。
135.检测G蛋白耦联受体多肽基因在细胞中表达的方法,其包括:
将所述的细胞和在严谨杂交条件下与权利要求125的分离的核酸分子杂交的核酸分子接触;并
为了检测所述的G蛋白耦联受体多肽基因的表达而检测杂交。
136.从哺乳动物基因组中筛选味觉信号发生中有活性的G蛋白耦联受体多肽的编码序列的方法,包括:
(i)将所述的哺乳动物基因组与至少一种基本由编码选自SEQ IDNOS:25,26,27,28,29,和30的共有序列的核酸序列组成的简并引物,或至少一种由权利要求125的分离的核酸分子衍生而来的简并引物接触;
(ii)在聚合酶、游离核苷酸和辅因子存在下,扩增包含至少一种引物序列的所述基因组序列;并
(iii)检测扩增的包含G蛋白耦联受体多肽基因的序列的存在。
137.生物化学试验,用于鉴定对在味觉信号发生中有活性的G蛋白耦联受体有结合特异性的味觉元配体,包括:
(i)将一种或多种权利要求87的多肽与G蛋白和GTPγS制备物,以及一种或多种推定的味觉元配体或包含一种或多种推定的味觉元配体的组合物接触;并且
(ii)通过测量GTPγS与G蛋白的结合,检测对在所述的味觉信号发生中有活性的G蛋白耦联受体具有结合特异性的味觉元配体的结合。
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