CN1309736C - 人类嗅觉cng亚基多肽、核酸序列及相关的检定法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的核酸序列，所述核酸序列编码人类嗅觉环核苷酸门控(CNG)通道亚基，以及相应多肽。本发明进一步涉及CNG通道在表征，筛选和鉴定能够调节人类嗅觉CNG通道的化合物中的应用。更具体的，本发明涉及在细胞中，优选哺乳动物细胞中，表达人类嗅觉CNG通道，以及所述细胞在基于细胞的高通量检定法中的应用，以鉴定增强或阻断人类嗅觉CNG功能的化合物。激活嗅觉CNG通道的化合物将增强嗅觉并可被用于制备对嗅觉功能减退个体来说更适口的食品。相反的，抑制嗅觉CNG通道的化合物将抑制嗅觉并可被用于阻断调节子。此外，本发明涉及基于细胞的嗅觉CNG通道检定法在鉴定G-蛋白质耦联受体(GPCRs)和其它能调节环核苷酸水平的蛋白质的调节子中的应用。

Description

人类嗅觉CNG亚基多肽、 核酸序列及相关的检定法

相关申请

[0001]本申请要求以下两个申请的优先权，即2001年7月6日申请的美国临时申请系列号No.60/303,140和2001年12月10日申请的美国临时申请系列号60/337,154，这两个专利申请全文引用于此处作为参考。

发明领域

[0002]本发明涉及分离的核酸序列，所述核酸序列编码人类嗅觉环核苷酸门控(CNG)通道亚基，以及相应多肽。本发明还进一步涉及人类CNG通道在表征(profile)，筛选和鉴定能够调节人类嗅觉CNG通道的化合物中的应用。更具体的，本发明涉及在细胞中，优选哺乳动物细胞中或昆虫细胞中，表达人类嗅觉CNG通道，以及所述细胞在基于细胞的高通量检定法中的应用，以鉴定增强或阻断人类嗅觉CNG功能的化合物。激活嗅觉CNG通道的化合物将增强嗅觉并可被用于制备对嗅觉功能减退个体来说更适口的食品。相反的，抑制嗅觉CNG通道的化合物将抑制嗅觉并可被用于阻断调节子。此外，本发明涉及基于细胞的嗅觉CNG通道检定法在鉴定G-蛋白质耦联受体(GPCRs)和其它能调节环核苷酸水平的蛋白质的调节子中的应用。

发明背景

[0003]增味剂(odorant)与嗅觉神经元顶纤毛上嗅觉受体的交互作用是我们感知气味的第一步。数量众多(例如人体内约为400)而且结构多样的具有嗅觉受体功能的视蛋白样GPCRs是我们能够觉察和分辨大量易挥发化合物的基础(Buck和Axel，(1991)，Fuchs等，(2001))。尽管人体内有数百种不同的嗅觉神经元细胞类型，而每种类型表达不同的嗅觉受体基因(Chess等，(1994)；Malnic等，(1999)；Touhara等，(1999))，但有证据表明嗅觉神经元中的信号传导涉及相同的下游信号传导通路，该通路涉及第二信使cAMP。很多增味剂都显示出能够引起嗅觉神经元中cAMP的增加(Breer，(1993))。另外，关于G_s样G蛋白G_olf(G_s-like G protein G_olf)(Jones和Reed，(1989)；Belluscio等，(1998))，III型腺苷酸环化酶(Bakalyar和Reed，(1990)；Wong等，(2000))，和嗅觉CNG通道亚基(Dhallan等，(1990)；Brunet等，(1996))的小鼠敲除研究表明上述这些信号分子在嗅觉信号传导中发挥专性作用。概括起来，嗅觉信号传导被确认为包含以下步骤：(1)嗅觉刺激激活嗅觉受体；(2)活化的嗅觉受体激活G_olf；(3)III型腺苷酸环化酶被G_olf激活并催化cAMP合成；(4)cAMP激活嗅觉CNG通道；(4)离子从活化的嗅觉CNG通道中流过，使得嗅觉神经元去极化并启动动作电位的发生(Gold，(1999))。

[0004]CNG通道由结构相关的亚基组成，包括6个跨膜片段和C-末端核苷酸结合域(Zagotta和Siegelbaum，(1996))。嗅觉神经元特异性CNG通道的第一个亚基，OCNC1，已经根据其与视网膜CNG通道亚基的同源性而从大鼠嗅觉cDNA中得以克隆鉴定(Dhallan等，(1990))。在传导性以及对cAMP和cGMP的敏感性方面，天然嗅觉CNG通道和异源表达的OCNC1通道之间的不一致引发了对其它CNG通道亚基的研究。  两个另外的亚基，OCNC2和β1b(杆状细胞光感受器CNG通道亚基的拼接变体)，随后从啮齿动物嗅觉cDNA中通过基于同源性的克隆方法得以鉴定(Liman和Buck，(1994)；Bradley等，(1994)；Sautter等，(1998)；Bonigk等，(1999))。组织化学实验表明这些分子在嗅觉神经元顶纤毛内选择性表达。嗅觉CNG亚基的异源联合表达可生成具有类天然特性的通道(Sautter等，(1998)；Bonigk等，(1999))。因此，嗅觉CNG通道可能由三种不同的亚基组成。(OCNC1也被称为CNG2、CNGC4、CNCα3，和嗅觉CNG通道α；OCNC2也被称为CNG5、CNCα4，和嗅觉CNG通道β；β1b也被称为CNCβ1b和CNG4.3)。

[0005]嗅觉CNG通道是嗅觉调节子的强制性靶位。首先，该通道位于嗅觉神经元的顶纤毛上，而且暴露于嗅上皮的外表面。因此，通道活化子无需穿过细胞膜。其次，嗅觉CNG通道可在异种细胞中功能性表达(Sautter等，(1998)；Bonigk等，(1999)；Qu等，(2000))。第三，基于钙成像的试验方法，其可用于采用自动化荧光装置的高通量筛选方法，该方法可用于测定CNG通道，因为该通道具有Ca²⁺可透过性。其实，钙成像已经用于记录原代培养物中嗅觉神经元的增味剂依赖性激活作用(Hirono等，(1992)；Ma和Shepherd，(2000))，而且基于钙染料的试验方法已经用于异种细胞中表达的大鼠OCNC1(Rich等，(2001))。第四，这些通道由环核苷酸门控，亦即，这些通道由小分子将其变构性激活。最后，一些小分子已被鉴定为可通过直接抑制CNG通道活性来调节嗅觉。(Kurahashi等，(1994))。而且能够激活非离子化作用受体离子通道的小分子已有大量先例，如L-型Ca²⁺通道的二氢吡啶激动剂(Hockerman等，(1997))。

[0006]啮齿动物嗅觉CNG通道已经在非洲爪蟾卵母细胞和HEK-293细胞中表达，而且通过直接测定包含CNG通道的膜的电特性对其进行了功能性特征描述(Sautter等，(1998)；Bonigk等，(1999)；Qu等，(2000))。但是，电生理学方法不适用于高通量筛选。为克服这一局限，本发明公开了一种基于细胞的荧光测定方法，所述方法适用于对嗅觉CNG通道调节子的自动化高通量筛选。该方法使用荧光钙或膜电位染料定量测定由腺苷酸环化酶活化子毛喉素所致cAMP水平升高后，流过在HEK-293细胞上表达的嗅觉CNG通道的离子流。另外，本发明鉴定出编码人类嗅觉CNG通道亚基的核酸序列，该序列在本发明以前未被鉴定过。

发明概述

[0007]本发明包括人类嗅觉CNG通道的分离的OCNC1，OCNC2和β1b亚基多肽，和编码所述多肽的核酸序列。本发明还包括表达所述核酸序列的手段，包括含有所述核酸序列的载体，和含有所述载体的宿主细胞。本发明进一步包括使用所述核酸，载体和宿主细胞来鉴定化合物的方法，所述化合物通过调节嗅觉CNG通道活性而调节嗅觉。而且，本发明公开的方法还适用于定量测定GPCRs和其它调节环核苷酸水平的蛋白质的活性。

[0008]在一个优选的实施方案中，表达人类嗅觉CNG通道的宿主细胞首先用能够增加cAMP的因子，如腺苷酸环化酶活化子毛喉素、磷酸二酯酶抑制剂IBMX、或膜可透过性环核苷酸类似物进行刺激。随后通过使用荧光钙螯合剂如fura-2(Abe等，(1992))、荧光钠螯合剂如绿色四乙酸钠盐(sodium green tetraacetate)(Molecular Probes)和Na⁺-敏感的染色试剂盒(Molecular Devices)、或膜电位染料如膜电位染色试剂盒(Molecular Devices)和Oxanol-香豆素试剂盒(Aurora Biosciences)来监测已处理细胞中的离子流从而定量测定嗅觉CNG通道的活化。嗅觉增强的嗅觉CNG通道活化子即可根据其增强对增高的cAMP的荧光效应的能力而被鉴定出来，而阻断嗅觉的通道拮抗剂可根据其减弱荧光效应的能力而被鉴定出来。所述鉴定方法通过使用自动荧光检测设备如Fluorometric Imaging Plate Reader( FLIPR，Molecular Devices)和Voltage Ion Probe Reader (VIPR，Aurora Biosciences)可用于化合物文库的高通量筛选。

发明目的和优选实施方案

[0009]本发明的一个目的是提供分离的核酸序列，所述核酸序列编码人类嗅觉CNG通道的OCNC1，OCNC2和β1b亚基，以及该核酸序列的变体和功能片段，突变体，及嵌合体；包括，例如拼接变体，等位基因变体，单核苷酸多态性(SNPS)和用重组或化学手段制备的突变性变体。

[0010]本发明的另一个目的是提供分离的人类嗅觉CNG通道的OCNC1、OCNC2和/或β1b亚基多肽及其功能片段，嵌合体和变体；包括，拼接变体，等位基因变体，用化学或重组方法制备的SNPS突变体和其非人类的灵长类动物的直向同源物(orthologs)。

[0011]本发明的另一个目的是生产一种细胞系，该细胞系表达功能性人类CNG通道多肽亚基或亚基组合。

[0012]本发明一个优选的目的是生产一种细胞系，该细胞系功能性表达人类OCNC1、OCNC2和β1b亚基多肽中的每种(优选地具有分别包含于SEQ ID NOS 9-11中的氨基酸序列)，或由DNA序列编码的功能体、嵌合体或突变体或所述每种亚基多肽的片段。

[0013]本发明更为优选的目的是提供一种表达功能性人类嗅觉CNG通道的哺乳动物细胞系，例如人胚肾细胞(HEK293 cells)，COS细胞，小鼠L细胞，嵌合仓鼠卵巢细胞，非洲绿猿肾细胞，LtK-细胞和BHK细胞。

[0014]本发明另一优选的目的是用所述细胞系鉴定通过调节嗅觉CNG通道活性来调节嗅觉的化合物。

[0015]本发明的另一个目的是用所述细胞系定量测定GPCRs和其它调节环核苷酸水平的蛋白质的活性。

[0016]本发明一个更具体的目的是稳定或瞬时表达功能性人类CNG通道的细胞系在如下检测方法中的应用，所述检测方法为首先用能够增高cAMP的因子，如腺苷酸环化酶活化子毛喉素、磷酸二酯酶抑制剂IBMX，、或膜可透过性环核苷酸类似物对CNG通道进行刺激，随后通过例如使用荧光钙螯合剂或荧光钠螯合剂测量离子流入细胞从而定量测定CNG通道的活化。

[0017]本发明另一个具体的目的是稳定或瞬时表达功能性人类CNG通道的细胞系在化合物文库高通量筛选方法中的应用，所述筛选方法采用自动化荧光检测设备如，Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR，Molecular Devices)和Voltage Ion Probe Reader(VIPR，Aurora Biosciences)。

[0018]具体的，本发明的一个目的是通过采用钙成像检测法来检测化合物对表达功能性人类嗅觉CNG通道的HEK-293所产生的效果从而鉴定调节气味感知的化合物。

[0019]本发明的另一个具体目的是提供高通量CNG平板检测方法，其中用细胞可透过性cAMP或cGMP(借助快速光分解进行传递)来激活人类CNG通道，且活化的CNG通道用于鉴定调节气味感知的化合物。

[0020]本发明一个更具体的目的是产生表达功能性人类嗅觉CNG通道的HEK-293、昆虫细胞或非洲爪蟾卵母细胞。

[0021]本发明另一个具体的目的是产生表达大鼠OCNC1、大鼠OCNC2和大鼠β1b基因中至少一个，优选为全部三个基因的人类直向同源物的HEK-293或昆虫细胞或非洲爪蟾卵母细胞。

[0022]本发明另一个具体的目的是产生表达对cAMP和cGMP敏感性增强的β1b蛋白质变体的HEK-293或昆虫细胞或非洲爪蟾卵母细胞。

[0023]本发明另一个具体的目的是提供一种挑选调节气味感知的化合物的平板检测方法，包括：

(v)提供表达功能性人类CNG通道的哺乳动物或昆虫细胞；

(vi)刺激所述细胞以增加细胞内cAMP/cGMP水平，从而激活CNG通道；

(vii)比较存在或不存在化合物时的阳离子流以获得其对CNG活性的调节效果；和

(viii)测试调节化合物对气味感知的效果。

附图说明

[0024]图1.包含三个大鼠嗅觉CNG通道亚基的直向同源物的人类基因组。横向同源物(paralogs)的成对序列相同性范围为30-50％，直向同源物为84-90％。该图显示与大鼠和人类CNG通道亚基的C-末端环核苷酸结合域相应的序列。本发明的人类OCNC1、OCNC2，和β1b嗅觉CNG通道亚基的序列分别为SEQ ID NOs：9-11；大鼠CNG通道亚基OCNC1、OCNC2和β1b在数据库序列中的登录号分别为NM012928，NM053496和AJ000515(分别为SEQ ID NOs：5-7)。

[0025]图2.hOCNC1的序列(SEQ ID NO：1)。该cDNA序列对应于包含在克隆基因组间区HSAF002992的hOCNC1等位基因。

[0026]图3.hOCNC2序列(SEQ ID NO：2)。该cDNA序列对应于包含在克隆基因组间区AC022762的hOCNC2等位基因。

[0027]图4.hβ1b的序列(SEQ ID NO：3)。该cDNA代表新的等位基因。

[0028]图5.嗅觉CNG通道活性依赖于亚基的组成。对用不同组合的人类嗅觉CNG通道亚基进行转染的，并用钙染料染色的细胞在加入50μM毛喉素后，于6分钟时检测到荧光强度增加。活性表示为8个独立反应的均值±标准误，并在加入钙离子导体离子霉素后6分钟时将其标准化为荧光的增加。OCNC1标为’1’，OCNC2为’2’，而β1b为’B’。

[0029]图6.基于膜电位的针对嗅觉CNG通道活性的荧光检测法效果很好。对用人类嗅觉CNG通道亚基的不同组合进行转染，并加载膜电位染料的细胞在加入毛喉素后，于6分钟时检测到荧光强度增加。活性表示为8个独立反应的均值±标准误，并在加入KC1后6分钟时将其标准化为荧光的增加。对两条剂量反应曲线显示了EC₅₀和Z系数值。OCNC1标为’1’，OCNC2为’2’，而β1b为’B’。

[0030]图7.基于钙的针对嗅觉CNG通道活性的荧光检测法的效果很好。对用不同组合的人类嗅觉CNG通道亚基进行转染的，并用膜电位染料(黑)或钙染料(灰)染色的细胞在加入毛喉素后，于6分钟时检测到荧光强度增加。活性表示为8个独立反应的均值±标准误，并在加入KC1或离子霉素后6分钟时将其标准化为荧光的增加。对四条剂量反应曲线显示了EC₅₀值。OCNC1标为’1’，OCNC2为’2’，而β1b为’B’。

[0031]图8.人类OCNC1[C458W/E581M]和β1b形成敏化的CNG通道。对用不同组合的人类嗅觉CNG通道亚基进行转染的，并用膜电位染料染色的细胞在加入毛喉素后，于6分钟时检测到荧光强度增加。活性表示为8个独立反应的均值±标准误，并在加入KC1后6分钟时将其标准化为荧光的增加。对两条剂量反应曲线显示了EC₅₀值和Z系数值。OCNC1标为’1’，OCNC1[C458W/E581M]为‘1*’，OCNC2为’2’，而β1b为’B’。

[0032]图9.嗅觉受体活性可在异种细胞中与人类嗅觉CNG通道耦联。用小鼠嗅觉受体mOREG、OCNC1[C458W/E581M]、OCNC2和β1b转染HEK-293细胞，用钙染料染色，并用嗅觉刺激物丁子香酚进行刺激。用荧光显微镜检测反应细胞的数目，并与G_α15和mOREG转染的反应性HEK-293细胞，mOREG转染的HEK-293细胞以及OCNC1[C458W/E581M]、OCNC2和β1转染的HEK-293细胞的反应细胞数进行比较。

[0033]图10.稳定表达的人类CNG通道亚基比瞬时表达的转染亚基对丁子香酚更敏感。在HEK-293中稳定或瞬时表达人类CNG亚基hOCNC1、hOCNC2和hβ1b，并用mOREG.瞬时转染。用多种浓度的丁子香酚刺激该细胞，并使用Fluo-4和荧光显微镜检测钙离子流。当采用hOCNC1[C458W/E581M]和β1b亚基时获得了类似的结果(数据未显示出)。

[0034]图11.稳定表达的野生型或强化的人类CNG通道亚基对受体介导的活化作用和腺苷酸环化酶活化化合物具有反应性。在图11(a)中，HEK-293细胞稳定表达hOCNC1、hOCNC2和β1b，或hOCNC1[C458W/E581M]和β1b，用多种浓度的β2受体配体异丙肾上腺素刺激该细胞，并在FLIPR-1上用Fluo-4检测钙离子流。在图11(b)中，HEK-293细胞稳定表达hOCNC1、hOCNC2和β1b，或hOCNC1[C458W/E581M]和β1b，用多种浓度的腺苷酸环化酶活化子毛喉素刺激该细胞，并在FLIPR-1上用Fluo-4检测钙离子流。

发明详述

[0035]在对本发明进一步详细描述以前，先给出如下定义。而其它使用的词语和术语则与相关领域技术人员所理解的一般含义一致。

定义

[0036]“功能性人类嗅觉CNG通道”是指由至少一个人类嗅觉CNG通道亚基、或其变体或片段组成的嗅觉神经元特异的CNG单位。所述CNG亚基包括OCNC1、OCNC2和β1b。功能性通道对细胞外阳离子是可充分透过的，从而在使用膜电位敏感荧光染料或钙敏感荧光染料的时候，产生细胞内阳离子可检测的改变。

[0037]“人类嗅觉CNG通道亚基”是指选自大鼠OCNC1、大鼠OCNC2和大鼠β1b的大鼠嗅觉多肽的人类直向同源物，或表现为具有与野生型人OCN1、人OCN2和人β1b的序列有至少60％，优选至少70％，更优选至少80-90％，更优选为至少90-99％序列相同性的DNA。在一个优选的实施方案中，人类直向同源物包括如图1中所示的序列或与其有至少80％，更优选为至少90％，更为优选的为至少95-99％相同性的其片段或变体。进一步的变体或片段可根据其独立表达或与其它CNG亚基联合表达而构建功能性嗅觉(钙可透过的)CNG亚基的能力来选取。

[0038]此处所用术语“纯化的”，“基本上纯化的”和“分离的”是指不含其它不相类似化合物的状态，这些不相类似的化合物与本发明化合物在自然状态下通常是结合在一起的，因此，以重量计，“纯化的”，“基本上纯化的”和“分离的”物质占给定样品质量的至少0.5％，1％，5％，10％或20％，最优选地至少50％或75％。在一个优选的实施方案中，这些术语用来指，以重量计，至少占指定样品95％质量的本发明化合物。当涉及核酸或蛋白质时，此处所用术语“纯化的”，“基本上纯化的”和“分离的”的核酸和蛋白质是指不同于哺乳动物体、特别是人体内天然状态的一种纯化状态或浓度。大于哺乳动物特别是人体内天然状态的任何程度的纯化程度或浓度，包括(1）从其它相联系结构或化合物中纯化出来的或(2)与哺乳动物体、特别是人体内非正常相联系的结构和化合物结合，均属于“分离的”定义范畴。此处描述的核酸或蛋白质或核酸或蛋白质类可根据本领域技术人员已知的多种方法和过程分离，或与自然状态下无关联的结构和化合物相联合。

[0039]术语“扩增”是指如下详述的为生产或检测重组体或天然表达的核酸的任何适用的扩增方法学的应用。例如本发明提供方法和试剂(例如简并寡核苷酸引物对)，用于体内或体外扩增(例如通过聚合酶链反应PCR)本发明天然表达的(例如基因组或mRNA)或重组(例如cDNA)核酸(例如本发明味觉结合序列)。

[0040]术语“表达载体”是指用来在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中体内或体外组成性或诱导表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统的载体。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括游离状态或已整合至宿主细胞基因组中的表达系统。该表达系统可具有自我复制或不具有自我复制(即在细胞内引发短暂表达)的能力。本术语包括仅含有重组核酸转录所需的最小元件的重组表达“盒”。

[0041]术语“文库”指一种含有不同核酸或多肽分子的混合制剂，例如重组产生的感觉(特别是嗅觉或味觉)受体配体结合域的文库(用简并引物扩增核酸得到)，或分离的含有扩增的感觉物(sensant)结合区的载体集合，或每个细胞都随机转染了至少一个编码味觉受体的载体的细胞混合物。

[0042]术语“核酸”或“核酸序列”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语包括核酸，即含有天然核苷酸的已知类似物的寡核苷酸。该术语还包括有合成主链的核酸样结构，参见下列文献，例如寡核苷酸及类似物，操作方法，F.Eckstein编，Oxford Univ.Press(1991)；反义策略，Annals of the N.Y.Academyof Sciences，Vol.600，Baserga等编(NYAS(1992))；Milligan(1993)J.Med.Chem.36：1923-1937；反义研究和应用(1993，CRCPress)，WO97/03211；WO96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry36：8692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev6：153-156。

[0043]术语“保守性变体”或“类似物(analog)”或“模拟物(mimetic)”是指修饰过氨基酸序列的多肽，这类修饰基本上不影响多肽的(保守性变体的)在此描述的结构和/或活性。这包括氨基酸序列的保守性修饰变异，即替换、增加或缺失对于蛋白质活性无关紧要的氨基酸残基，或使用相同属性的残基进行氨基酸替换(例如酸性、碱性、正电、负电、极性或非极性等)，以至于替换关键的氨基酸也基本上不影响结构和/或活性。能够提供功能相似的氨基酸的保守性替换表在本领域是众所周知的。

[0044] 例如一个选择保守替换的示例性指南包括(原始残基，其后是示例替换)：Ala/Gly或Ser；Arg/Lys；Asn/Gln或His；Asp/Glu；Cys/Ser；Gln/Asn；Gly/Asp；Gly/Ala或Pro；His/Asn或Gln；IIe/Leu或Val；Leu/IIe或val；Lys/Arg或Gln或Glu；Met/Leu或Tyr或Iie；Phe/Met或Leu或Tyr；Ser/Thr；Thr/Ser；Trp/Tyr；Tyr/Trp或Phe；Val/Ile或Leu。另一示例指南使用下列六组，每组包含保守性互相替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天东氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天东酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(I)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；(参见例如Creighton，Proteins，W.H.Freeman，(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag，(1979))。本领域的技术人员会理解上述确定的替换并不是唯一的可能保守性替换。例如由于某种原因，人们可能将所有带电的氨基酸互为保守性替换体，不管它们是正电还是负电。另外，在编码序列中的个别替换、缺失或增加从而导致变化、增加或缺失单一氨基酸或小部分氨基酸也同样被认为是“保守性修饰变异”。

[0045]术语“模拟物”和“肽模拟物”指合成的化学化合物，它具有本发明多肽的基本上同样结构和/或功能特征，例如转位结构域、感觉物结合区或嵌合受体。模拟物既可以是完全由化学合成的非天然氨基酸类似物组成，或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。该模拟物同样可以具有任意量的天然氨基酸保守性替换，只要这种替换也同样不改变类似物的结构和/或活性即可。对于本发明中多肽的保守性变体，可利用常规试验确定模拟物是否属于本发明的范围，即它的结构和/或活性基本上没有被改变。多肽模拟组合物可包括任何非天然结构组分的组合，其通常来源于三个结构基团：a)非天然酰胺键(“肽键”)的残基连接基团；b)非天然残基替代天然的氨基酸残基；或c)可诱导二级结构模拟的残基，即能够诱导或稳定二级结构例如β转角，γ转角，β折叠，α螺旋构象等的残基。当多肽的所有残基或一些残基是通过化学手段而非天然肽键连接时，该多肽就可以被鉴定为模拟物。单独的肽模拟物残基可通过肽键、其它化学键或耦联手段连接，诸如戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺，N，N’-双环己基碳二酰亚胺(DCC)或N，N’-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)。可以成为传统酰胺键(“肽键”)的替代物的连接基团包括，例如酮亚甲基(例如-C(＝O)-CH2-替换-C(＝O)-NH-)，氨亚甲基(CH₂-NH)，亚乙基，烯烃(CH＝CH)，醚(CH₂-O)，硫醚(CH₂-S)，四唑(CN4)，噻唑，retroamide，硫代酰胺，或酯(参见，例如Spatola，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins，Vol.7，pp267-357，″肽主链修饰″，Marcell Dekker，NY(1983))。包含所有或部分非天然残基替代天然残基的多肽也可以被鉴定为模拟物；非天然残基在科学和专利文献中有详尽描述。

[0046]此处所用“重组(体)”是指合成的或其它体外操作获得的多核苷酸(例如“重组多核苷酸”)，以及使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中产生基因产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组手段”也包括将来源不同、具有不同编码区或结构域或启动子序列的核酸连接至一个表达盒或载体中用来表达，例如可诱导性或组成性表达融合蛋白质，所述融合蛋白质包含本发明转位结构域和使用本发明的引物扩增的核酸序列。

[0047]术语“跨膜域”是指能完全横穿胞浆膜的多肽结构域。跨膜域的一般二级和三级结构，特别是7-跨膜受体如嗅觉受体的7个跨膜域，是本领域众所周知的。因此根据已知跨膜域序列，一级结构序列可被设计和预测，如下面详细描述的。

[0048]术语“CNG通道”亚基蛋白质或其片段、或编码“CNG通道”蛋白质的三个亚基中之一或其片段的核酸是指核酸和多肽、多态性变体、等位基因、突变体和种间同源体，其：(1)与包含在SEQ IDNO：1、2或3中的cDNA所编码的氨基酸序列具有高于大约80％的氨基酸序列相同性，85％、90％、优选的91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高氨基酸序列相同性，优选地，在至少大约25、50、100、200或500或更多氨基酸的区域上；或(2)特异性与抗体，例如多克隆抗体结合，所述抗体所针对的抗原包含由SEQ ID NO：1、2或3所编码的氨基酸序列或其免疫片段，和其保守性修饰变体；或(3)在严谨杂交条件下与反义链特异性地杂交，所述反义链与编码人类CNG蛋白质的核酸序列，例如SEQ ID NO：1、2或3或其互补体，和其保守性修饰变体相应；或(4)与SEQ ID NO：1、2或3或其互补体具有高于大约80％的序列相同性，85％、90％、优选的91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高核苷酸序列相同性，优选地，在至少大约25、50、100、200、500或1000或更多核苷酸的区域上；或(5)此处所述人类CNG的功能等价物，例如用对阳离子的反应中膜电位染料的可检测荧光来鉴定的。

[0049]功能等价的CNG通道蛋白质包括一级结构与以下那些已鉴定的不同，但具有用功能试验所确定的等价功能的亚基。“确定功能性效果”是指检验增加或减少间接或直接受CNG通道多肽影响的参数的化合物的效果，例如功能性、物理和化学效果。这些功能性效果包括，但不限于，离子流、膜电位、电流幅度和电压门控的变化，以及其它生物效应如任何标记基因的基因表达变化等。离子流可包括通过通道的任意离子，如，钠离子和锂离子及其类似物如放射性同位素。所述功能性效果可用任何对本领域技术人员来说已知的方法进行检测，例如通过使用双电极电生理学或电压敏感染料、或通过检测参数如分光镜特征(例如荧光、吸光率和折光指数)、流体力学(例如形状)、层析和可溶性特征的变化。

[0050]此处使用的CNG通道多核苷酸和多肽序列的“抑制子”、“活化子”和“调节子”是指利用CNG通道多核苷酸和多肽序列的细胞试验所鉴定的抑制性、激活性或调节性分子。抑制子是指例如结合、部分或完全阻断活性、降低、防止、延迟激活、使之失活、脱敏、或下调CNG通道蛋白质的活性或表达的化合物，如拮抗剂。“活化子”是指增加、打开、激活、促进、增强活化、使增敏、激动、或上调CNG通道蛋白质的活性的化合物。抑制子、活化子和调节子还包含遗传上修饰的CNG通道蛋白质，例如改变活性的遗传上修饰的CNG通道蛋白质，以及天然出现和合成的配体、拮抗剂、激动剂、肽、环肽、核酸、抗体、反义分子、核酶、有机小分子等。这些抑制子和活化子的试验包括，例如在细胞、细胞提取物或细胞膜内表达CNG通道蛋白质，应用推定的调节化合物，然后再确定对上述活性的功能性影响。

[0051]包含CNG通道蛋白质的样品或试验物经潜在的活化子、抑制子或调节子处理后，与不用抑制子、活化子或调节子处理的对照样品比较以检验激活，抑制或调节的程度

[0052]此处使用的术语“试验化合物”或“试验候选物”或“调节子”或其语法等价词是指用来检测其调节CNG通道活性能力的任何分子，可以是天然存在的或合成的，例如蛋白质、寡肽(例如长度为从约5到约25个氨基酸、优选的长度为从约10到20或12到18个氨基酸、优选的长度为12、15或18个氨基酸)、有机小分子、多糖、脂质(例如鞘脂)、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等。试验化合物可以是试验化合物文库的形式，如，组合或随机文库，其提供充分的多态性范围。试验化合物可选择性地连于融合陪伴物(partner)，例如靶向化合物、援救化合物(rescue compounds)、二聚化合物(dimerizationcompounds)、稳定化化合物(stabilizing compounds)，可寻址化合物(addressable compounds)和其它功能性部分。具有有用特性的新化学实体可常规地通过鉴定试验化合物(称为“引导化合物(leadcompound)”)生成引导化合物变体和评估这些变体化合物的特性和活性来生成，所述试验化合物具有某些需要的特性或活性，例如增强活性。优选地，高通量筛选(HTS)方法用于所述分析中。

[0053]“有机小分子”是指有机分子，可以是天然的也可以是合成的，其分子量大于约50道尔顿，小于约2500道尔顿，优选小于约2000道尔顿，优选地在约100至约1000道尔顿之间，更优选地在约200至约500道尔顿之间。

[0054]“生物样品”包括组织切片如活组织和尸解样品，和为组织学目的所取的冰冻切片。该样品包括血液、唾液、组织、培养细胞，例如原代细胞、外植体和转化细胞、粪便、尿等。生物样品一般获自真核生物，最优选的为哺乳动物如灵长类动物(例如黑猩猩或人类)、牛、狗、猫、啮齿目动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、兔、鸟类、爬行动物或鱼。

[0055]在关于两个或更多个核酸或多肽序列的描述中的术语“相同的”或“相同性”百分数是指两个或更多个序列或子序列，它们是相同的或其相同的氨基酸残基或核苷酸具有采用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用下述默认参数所进行测量的、或用手工比对和肉眼观察(参见，例如NCBI网站等)的特定百分数(即当在“比较窗口”或指定区域上比较和比对最大一致性时，在特定区域(例如核苷酸序列SEQID NO：1、2、或3)上具有约80％相同性，优选的85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的相同性)。该序列即被称为“基本相同的”。这一定义还指，或可被用于试验序列。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及那些具有替代的序列。如下所述，优选的算法能够考虑间隙等。优选地，相同性存在于长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地，存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

[0056]在序列比较中，通常将一条序列作为参考序列，而试验序列则与其进行比较。当使用序列比较算法时，将试验和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，使用默认程序参数，或指定替代参数。序列比较算法随后根据程序参数计算试验序列相对于参考序列的序列相同性百分比。

[0057]此处使用的“比较窗口”指包括任何毗邻位置数的区段，该数目选自20-600，通常大约50-200，更通常是大约100-150，其中在两个序列优化比对后，可在该区段范围内将序列与相同毗邻位置数的参考序列比较。比对序列以进行比较的方法在本领域已为众所周知。可以通过使用，例如Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法、上述这些算法的计算机化实施方案(GAP，BESTFIT，FASTA，和Wisconsin Genetics软件包中的TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr，Madison，WI)、或手工比对和肉眼观察(参见，例如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等，eds.1995增刊))的方法进行比较序列的优化比对。

[0058]适于确定序列相同性和序列相似性的算法优选的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别由Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)描述。BLAST和BLAST 2.0采用此处所描述的参数，用以确定本发明核酸和蛋白质序列相同性百分比。执行BLAST分析的软件可公开地从国家生物工程信息中心得到。该算法包括首先确定查询序列中W长度的短字来确定高分序列对(HSPs)，当与数据库中序列的相同长度的字比对时，其或是匹配或是满足一些阳性阈值分数T。T此处是指邻近字分数阈值(Altschul等，如前)。这些初始的邻近字命中值(wordhit)作为种子，以启动搜索寻找包含它们的更长的HSPs。字命中值沿着序列向两边延伸，只要累积比对分数能被增加。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是＞0)和N(错配残基的惩罚分数，总是＜0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用计分矩阵来计算累计分数。字命中值向每个方向的延伸当出现下列情形即停止：累计比对分数从其最大获得值下降X量；由于一种和多种负分数残基比对结果导致累计分数变为0或以下；或达到了序列任一末端。BLAST算法参数W，T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默认值为字长(W)为11，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认值为字长为3，预期值(E)为10和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))中比对(B)为50，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4和两条链的比较。

[0059]术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”此处可交换使用，是指氨基酸残基多聚物。本术语适用于序列中一种或多种氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚物，以及天然氨基酸多聚物和非天然氨基酸多聚物。

[0060]术语“氨基酸”是指天然和合成氨基酸，以及与天然氨基酸具有相同功能模式的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸指由遗传密码编码的，以及被修饰的氨基酸例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢原子结合的α碳原子，羧基基团，氨基基团和R基团，例如同型丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但仍保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构的化学化合物，但其功能模式与天然氨基酸相似。

[0061]此处的氨基酸可用普遍熟知的三字母代号指代，也可以用IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的单字母代号指代。同样的，核苷酸也可以用普通接受的单字母代码进行指代。

[0062]“保守性修饰的变体”对氨基酸和核酸序列都适用。对于特定核酸序列，保守性修饰变体是指编码相同和基本相同氨基酸序列的核酸，或当核酸并不编码氨基酸序列时，是指与它基本相同的序列。由于遗传密码子的简并性，大量功能相同的核酸分子编码任一给定的蛋白质。例如密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此在每一个由密码子决定的丙氨酸位置，密码子可以改变为任何所述相应的密码子，而不改变所编码的多肽。这些核酸改变是“沉默变异”，是一种保守性修饰的变异。此处的每一条编码多肽的核酸序列也包括了该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员可以判断核酸中的每个密码子(除了通常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG，和通常情况下是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)都可以被修饰而产生功能完全相同的分子。因此，在涉及表达产物时，编码多肽的核酸的每一个沉默变异都隐含在每个描述的序列中，但涉及实际的探针序列时，情况不是这样的。

[0063]关于氨基酸序列，本领域技术人员会认识到导致编码序列中变换、添加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个替换、缺失或添加就是“保守性修饰”，前提是这一变换导致氨基酸替换为化学相似的氨基酸。提供了功能性相似的氨基酸的保守性替换表是本领域熟知的。该保守性修饰变体并不排除本发明的多态变体，种间同源体和等位基因。

[0064]下列八组中每组包含互相保守性替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins，(1984))。如前所述，本发明包括能够表达ENaC亚基多肽的细胞，所述多肽具有与在适当试验(如下述全细胞钠电导试验)中应用的功能性等价物所公开的序列不同的一级结构。

[0065]大分子结构如多肽结构可在多种结构水平进行描述。对这一结构的概述，参见，例如Alberts等，Molecular Biology of the Cell(3rd ed.，(1994))和Cantor及Schimmel，Biophysical ChemistryPart I：The Conformation of Biological Macromolecules(1980)。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内局部区域有序的三维结构。这些结构作为结构域是众所周知的，例如跨膜域，孔域和胞浆尾域(cytoplasmic tail domains)。结构域是多肽的一部分，其构成多肽的致密单位，其长度一般为15到350个氨基酸。示例性的结构域包括细胞外结构域，跨膜域和胞浆结构域。典型的结构域由较小组织结构如几段β片层和α螺旋组成。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指由独立三级单位非共价联结所构成的三维结构。各向异性术语作为能量术语也是众所周知的。

[0066]特定的核酸序列还隐含地包含“拼接变体”。同样的，由核酸编码的特定蛋白质隐含地包含核酸拼接变体所编码的任何蛋白质。“拼接变体”，如名字所示，为选择性拼接基因的产物。在转录后，初始核酸转录子可被剪接从而不同的(交替的)核酸拼接产物编码不同的多肽。产生拼接变体的机制各异，但包含外显子交替拼接。通过通读转录来自同一核酸的可变多肽也包含在本定义内。拼接作用的任何产物，包括拼接产物的重组体形式，都包括于本定义中。

[0067]CNG通道核酸序列还包括单核苷酸多态性，其编码CNG通道亚基，所述亚基在用合适试验如此处所述的荧光试验检测时，其是此处所公开的人类CNG通道多肽的功能性等价物。

[0068]膜电位染料和电压敏感染料是指膜去极化中能够改变荧光特性的分子和分子组合。

[0069]“标记”或“可检测的部分”是可以被光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测到的物质。例如有用的标记包括³²P、荧光素染料、电子致密试剂、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、地高辛配基或半抗原和蛋白质，该半抗原和蛋白质可以通过例如在肽中整合放射性标记而变得可探测，或者用于检测与所述肽特异性反应的抗体。

[0070]当针对，如细胞、或核酸、蛋白质或载体使用术语“重组(体)”时，是指细胞、核酸、蛋白质或载体通过引入异源核酸或蛋白质、或天然核酸或蛋白质的变换而进行修改了或者指源自于经上述修饰的细胞的细胞。因此，例如，重组细胞表达天然细胞(非重组)中未发现的基因或表达那些非正常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。本发明中，其一般指用编码一个或多个人类CNG通道亚基的核酸序列转染的细胞。

[0071]当针对核酸的部分使用术语“异源性”时，是指该核酸包含两个或更多在天然状态下互相没有相同的关系的子序列。例如核酸通常是重组产生的，具有两个或更多来自非相关基因的序列重组在一起形成一个新的功能性核酸分子，例如一个来源的启动子和另一个来源的编码区。同样，异源蛋白质是指该蛋白包含两个或多个天然状态下不以相同相互关系存在的子序列(例如融合蛋白质)。当针对基因、cDNA、mRNA或蛋白质的细胞表达使用术语“异源性”时，是指该基因、cDNA、mRNA或蛋白质是在该细胞内非正常表达的或表达于细胞原始源以外的其它物种。

[0072]短语“严谨杂交条件”是指在这样的条件下，探针仅与通常存在于核酸复合混合物中的靶序列杂交，而不与其它序列杂交。严谨条件是序列依赖性的并且在不同的情况下会有所不同。长序列在高温下才具有杂交特异性。有关核酸杂交更详尽的指南参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“杂交原理和核酸试验策略的概述”(1993)。通常，在特定的离子强度pH下，选择的严谨条件比特定序列的热溶解点(Tm)低大约5-10℃。Tm值是指达到平衡后(靶序列过剩，在Tm下，平衡条件下50％的探针杂交)与靶序列互补的探针中有50％与靶序列发生杂交时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。加入一些破坏稳定的试剂如甲酰胺也可以形成严谨条件。对于选择性和特异性的杂交，阳性信号至少是背景值的两倍，优选10倍于背景杂交。示例性严谨条件如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，42℃温育，或者5×SSC和1％SDS，65℃温育，使用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下漂洗。

[0073]如果核酸编码的多肽是基本相同的话，在严谨条件下互不杂交的核酸仍是基本上相同的。例如利用遗传密码允许下的最大密码子简并性产生核酸拷贝时就会发生这种情况。在这些情况下，核酸通常在中等严谨杂交条件下杂交。示例的“中等严谨杂交条件”包括在具有40％甲酰胺、1 M NaCI、1％SDS的缓冲液中，37℃下的杂交，使用1×SSC在45℃下漂洗。阳性杂交至少是背景值的两倍。本领域的普通技术人员应该很容易认识到其它杂交和漂洗条件可以用来提供相似严谨程度的条件。很多文献中都提供了更多的确定杂交参数的指导，例如Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel等。

[0074]对PCR来说，约36℃的温度一般用于低严谨性扩增，但退火温度可根据引物长度在约32℃到48℃之间变化。对高严谨性PCR扩增而言，温度一般为约62℃，但退火温度的范围可根据引物长度和特异性选在约50℃到约65℃之间。高和低严谨性扩增的一般循环条件都包括30秒-2分钟，温度为90℃-95℃的变性期，持续30秒-2分钟的退火期，和大约72℃，1-2分钟的延伸期。低和高严谨性扩增反应的操作流程和指南可从如Innis等，PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)中获得。

[0075]“抗体”是指含有架构区的来自免疫球蛋白基因的多肽或其能特异性地结合和识别抗原的片段。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，它们因此分别确定了免疫球蛋白的种类，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和力上是最关键的。

[0076]特别地，该抗体包含能够特异性结合此处公开的人类CNG通道亚基多肽的抗体，或能够与所述CNG通道亚基多肽特异性结合的抗体混合物。

[0077]当涉及到蛋白质或肽时，短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“特异性(或选择性)与---发生免疫反应”是指结合反应，其可以在蛋白质和其它生物物质的异源群中确定目的蛋白质的存在。因此，在指定的免疫试验条件下，指定抗体与特定蛋白质的结合至少是背景值的两倍和更通常地大于背景值10到100倍。这些条件下与抗体的特异性结合要求针对其对某个特定蛋白质的特异性进行了选择的抗体。例如针对CNG通道亚基蛋白质或多态变体、等位基因、直向同源物和保守性修饰变体或拼接变体，或其部分的多克隆抗体可被选用以获得那些仅与CNG通道亚基蛋白质即OCNC1、OCNC2和β1b发生特异性免疫反应(所述通道亚基蛋白质具有由包含在SEQ ID NO.：1、2和3中的cDNAs所编码的氨基酸序列)，而不与其它蛋白质发生免疫反应的抗体。该选择过程可以通过去除与其它分子有交叉反应的抗体来完成。有很多种免疫试验形式可以用于选择特异性地与特定蛋白质发生免疫反应的抗体。例如固相ELISA免疫试验一般用来选择特应性与蛋白质发生免疫反应的抗体(参见，例如Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual(1988)，其中描述了可用于确定特异性免疫反应的免疫试验形式和条件)。

[0078]本发明包含分离的核苷酸序列，其编码人类OCNC1嗅觉CNG通道亚基，其中所述核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1至少约95％的相同性；分离的核苷酸序列，其编码人类OCNC2嗅觉CNG通道亚基，其中所述核苷酸序列具有与SEQ ID NO：2至少约95％的相同性；和分离的核苷酸序列，其编码人类β1b嗅觉CNG通道亚基，其中所述核苷酸序列具有与SEQ ID NO：3至少约95％的相同性。

[0079]更优选地，本发明包含分离的核苷酸序列，其在高严谨条件与SEQ ID NO：1-3杂交。术语“核苷酸序列”意指包含RNA和DNA二者，其具有任意数目的链，例如单链和双链。在本发明说明书和权利要求中涉及DNA、RNA、多肽或蛋白质的定语“分离的”或“纯化的”意指所指的DNA、RNA、多肽或蛋白质已从其天然细胞环境中分离出来，并且可用人工，即重组方法，以此种形式生产。高严谨条件为：杂交在6×SSC，5×Denhart’s溶液，0.5％SDS，2mM EDTA和1mM焦磷酸钠及65℃的条件下进行，随后用0.1×SSC和0.1％SDS在65℃下漂洗。

多肽

[0080]本发明还包括分离的多肽，其由本发明的核苷酸序列所编码，所述多肽包含人类嗅觉CNG通道亚基多肽，既可以是个别亚基多肽，也可以是亚基多肽相互之间和与其它蛋白质构成的复合物。本领域技术人员能够清楚的知道，根据三联体密码方案的简并性，相同的多肽可由不同的核苷酸序列所编码。因此，编码此处所述相同蛋白质的简并核酸也包含在本发明范围内。

多核苷酸和蛋白质变体

[0081]本发明还包含此处所述核苷酸和蛋白质亚基序列的变体和突变体，特别是那些包含了能够改变由这些亚基所构成的CNG通道活性的突变的序列。SEQ ID NOS 4和12中显示了一个特别优选的OCNC1突变体，其中所述序列与SEQ ID NOS 1和9是不同的，因为其在1374位具有半胱氨酸到色氨酸的改变，和/或在1741和1742位具有谷氨酸到甲硫氨酸的改变。

表达序列

[0082]本发明还包含分离的表达序列，其包含此处公开的核苷酸序列，其中CNG通道亚基的编码序列可操作性地与转录和翻译调节序列相连。该表达序列可包括天然编码序列联合天然启动子区。或者，表达构建物可通过编码序列可操作性地连于异源启动子区(例如为了在特定宿主细胞中表达)来构建。同样可以预想重组报告构建体，其中编码序列的部分或全部与编码可选择的或可筛选的标记物的报告基因相融合。“表达序列”或构建体可在缺少载体的情况下被转染至宿主细胞内，且可被整合到宿主细胞的染色体内。

表达载体

[0083]本发明还包括含有此处公开序列的表达载体，和含有该载体的宿主细胞。“表达载体”是指能够表达其含有的基因序列的载体。但是，本发明还包括其它含有此处公开序列的载体(和宿主细胞)，其中所述其它载体不是非要“表达”的载体，而是含有编码序列但不表达多肽的载体，例如作为增殖载体或基因测序的手段。

宿主细胞

[0084]本发明还包括除表达另一CNG通道亚基的表达构建体或载体以外，还含有本发明中至少一个表达构建体或载体的宿主细胞，其中表达的多肽与所述细胞表面相联并构建部分或完整功能性CNG通道。适用于本发明的宿主细胞包括人胚肾细胞(优选HEK-293)，COS细胞，小鼠L细胞，中国仓鼠卵巢细胞，非洲绿猿肾细胞，LtK-细胞和BHK细胞。本领域技术人员应清楚地知道在特定宿主细胞中表达所必需的序列，即，启动子，上游非翻译区，转录终止序列，载体增殖序列等，可根据所使用宿主细胞而变化，并可很容易地从现有技术中已知的且可获得的分子工具中进行选择。

嗅觉CNG通道试验

[0085]本发明还包括采用此处公开的核酸，蛋白质，载体和宿主细胞的试验。所述试验包括那些用于如下目的的试验，即为检测CNG通道活性或与CNG通道活性相关的蛋白质或第二信使的活性变化，亦即为鉴定配体或筛选小分子，所述配体或小分子可用于阻断或增强嗅觉信号传导。例如，本发明包括基于阳离子的试验，其用于监测CNG通道活性的变化，所述试验包括(1)将编码和表达至少一个人类嗅觉CNG通道亚基的一个或多个核酸引入宿主细胞，在细胞中所述至少一个CNG通道亚基构建功能性CNG通道；和(2)在存在和不存在不同刺激物的情况下定量测定所述CNG通道的活性变化，其中所述变化借助一个和多个细胞内阳离子水平的变化来测定。如这里所述，功能性CNG通道可通过表达全部三个亚基，或表达ONCN1和ONCN2，或单独表达ONCN1来构建。在这一意义上，“功能性”是指形成一个通道，细胞外阳离子能够通过该通道进入细胞，并且由于CNG的激活或抑制而造成的细胞内阳离子水平可被检测和定量。

[0086]在所述试验中，至少一个功能性人类嗅觉CNG通道亚基优选地由选自能够在高严谨条件下与SEQ ID NO：1杂交的序列组中的序列所编码。该亚基可单独表达或与其它嗅觉CNG通道亚基联合表达以构建功能性CNG通道，即由环核苷酸调节的阳离子通道。例如OCNC1亚基可与OCNC2和/或β1b亚基(特别是那些由本发明所述能在高严谨条件下分别与SEQ ID NO：2和3杂交的核酸所编码的)一起表达。CNG通道亚基的直向同源物，即来自其它物种的OCNC2和/或β1b亚基，也可以在本发明的试验中与人类CNG通道亚基(例如人类OCNC1亚基)一起表达，其中所述亚基联合表达可构建CNG通道的功能性嵌合体。

[0087]本发明所述试验可被用于鉴定能够调节嗅觉的嗅觉CNG通道调节子。在所述试验中，宿主细胞可首先用能引发CNG基础活化水平的因子，如毛喉素(或其它腺苷酸环化酶活化子)、IBMX(或其它cAMP磷酸二酯酶的抑制子)或cAMP或cGMP的膜可透过性类似物进行刺激。能直接活化嗅觉CNG通道的试剂同样可被使用，如能生成氧化氮的化合物，其通过S-亚硝化反应激活通道(Broillet，(2000))。随后通过使用荧光钙螯合剂如fura-2(Abe等，(1992))、荧光钠螯合剂如绿色四乙酸钠盐(Molecular Probes)和Na+-敏感的染色试剂盒(Molecular Devices)、或膜电位染料如膜电位染色试剂盒(Molecular Devices)和Oxanol-香豆素试剂盒(AuroraBiosciences)来监测经处理的细胞中的离子流入从而定量测定嗅觉CNG通道的活化。嗅觉增强的嗅觉CNG通道活化子即可根据其能强化对增高的cAMP的荧光反应的能力而被鉴定出来，而阻断嗅觉的通道拮抗剂可根据其减弱荧光效应的能力而被鉴定出来。嗅觉CNG通道还可以用作鉴定其它CNG通道调节子的代用品。

针对GPCRs和其它能调节cAMP水平的蛋白质的试验

[0088]本发明还包括针对能调节环核苷酸水平的蛋白质的试验。该试验包括那些目的在于检测由于环核苷酸水平变化所致CNG通道活性变化的试验。优选的，敏化的嗅觉CNG通道(利用亚基变体如OCNC1[C458W/E581M](SEQ ID NO：12))可用于增加这些试验的灵敏度。所述试验可用于定量测定与G蛋白耦联的能够调节腺苷酸环化酶或磷酸二酯酶的GPCRs的活性，并可通过高通量筛选用于鉴定GPCR调节子。

[0089]例如，编码G-蛋白耦联受体的核酸同样可被引入用于本发明试验中的宿主细胞内，如有需要还可加上编码一个或多个CNG通道亚基的核酸和编码G蛋白的核酸。适用的G-蛋白耦联受体包括，举几个例子：增味剂受体、味觉受体、犁鼻器(VNO)受体，μ鸦片受体、毒蕈碱性乙酰胆碱受体、肾上腺素能受体、5-羟色胺受体、多巴胺受体、血管紧张素受体、腺苷受体、缓激肽受体、metabotropic excitatoryamino acid receptors。在所述试验中，刺激物借助随后环核苷酸水平对CNG通道活性的效果，可作为G-蛋白耦联受体活性潜在调节子而被筛选。

[0090]当G蛋白耦联受体也在本发明试验细胞中表达时，G-蛋白耦联受体优选为嗅觉受体。所述细胞可用于筛选能够导致G蛋白受体活化(从而导致CNG活化)的刺激物，即与增味剂受体相互作用的增味剂配体。试验同样可以设计为：G蛋白耦联受体首先通过暴露于配体而被活化，且所述细胞可用于筛选能够导致所述受体活化而导致CNG活化作用增强的刺激物(即增味剂增强剂)。所述增强剂可在受体或CNG通道水平上发挥作用而增强CNG通道的活化。该增强剂同样可作用于腺苷酸或鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶或其它任何能够调节环核苷酸水平的蛋白质。或者，该细胞可用于筛选能够降低受体活化或降低借助受体的CNG通道活性活化而导致CNG活化降低的刺激物(即增味剂阻断剂)。

[0091]本发明还包含此处所述任一试验的更进一步包含使用对照细胞的变化形式。例如包含表达所需G蛋白耦联受体的试验还进一步包括如下步骤：(a)提供能表达所述至少一个CNG通道亚基以构建功能性CNG通道但不表达所述G-蛋白耦联受体的第二个宿主细胞；(b)在存在和不存在不同刺激物的情况下，检测所述第二个宿主细胞中的CNG通道活化的变化量；和(c)将所述第二个宿主中所述CNG通道的活化的所述变化量与表达所述G-蛋白耦联受体的所述细胞中所述CNG通道的活化变化量相比较。

鉴定参与感觉信号传递的蛋白质的编码核酸的试验

[0092]如下面更详细的描述，本发明还包含鉴定参与感觉反应的蛋白质，特别是与CNG通道发生和协作用的蛋白质的编码核酸的方法。例如来自对特定感觉信号发生反应的细胞的G蛋白耦联受体的编码核酸可用如下步骤鉴定：(1)将编码和表达至少一个人类嗅觉CNG通道亚基的一个或多个核酸引入宿主细胞，其中所述至少一个CNG通道亚基构建功能性CNG通道；和(2)将从目的细胞中分离的cDNAs或RNAs文库引入所述哺乳动物或非洲爪蟾宿主细胞内；和(3)将转染的宿主细胞暴露于已知的感觉配体以鉴定能表达可与配体结合的G蛋白耦联受体的宿主细胞。

高通量试验

[0093]本发明的试验特别包括高通量筛选试验。同时对多样品进行定量化检测的设备是本领域众所周知的。例如FluorometricImaging Plate Reader(FLIPR)可从Molecular Devices获得，其可用于细胞内钙或钠、膜电位和pH变化的单波长检测。设备和读取器可程序化设置以同时传递化合物至微量反应板的全部96孔，并在一秒内对微量反应板的全部96孔成像，因此就可改良为高通量的形式。氩离子激光刺激适用于检测特定变化的荧光指示剂染料，然后用连接的光学系统检测发射光。随后照相机系统对整个平板成像并在用户指定的时间间隔内将数据整合。

[0094]或者，如Aurora Biosciences的Voltage ion Probe Reader(VIPR)设备可用于对两个荧光分子间的荧光谐振能量传递(fluorescence resonance energy transfer FRET)的双波长检测。FRET是两个电激活状态的染料分子间的距离依赖性相互作用，其可被用于研究能够产生分子邻近变化的许多生物学现象，包括Na⁺，K⁺，Cl^-，Ca²⁺和配体门控离子通道的活性。Aurora Biosciences公司的电压传感器探针技术使用了膜结合供体分子和易动的、电压敏感的受体分子间的FRET以检测膜电位。VIPR读取器适用于96-孔和384-孔这二者形式。

[0095]本发明的高通量试验包括多种形式。例如一个可实施的用来同时检测或测量在至少两个或更多独立腔室中对至少两种或更多种潜在试验化合物发生响应的CNG通道活性的高通量试验，包括：(1)将编码和表达至少一个人类嗅觉CNG通道亚基的一个或多个核酸引入适用的宿主细胞中，其中所述至少一个CNG通道亚基构建功能性CNG通道，以便在直接或间接激活时，所述通道导致细胞内预先确定离子的浓度改变；(2)将所述宿主细胞转移至已被分隔开的培养容器中(在转染前或转染后)，所述容器有阵列排列的独立腔室；(3)用足以检测预先确定离子的浓度改变的离子敏感性荧光指示剂对所述细胞染色；(4)在所述两个或更多个独立腔室中加入一种或多种不同的试验化合物或试验化合物组合，其中所述试验化合物具有潜在的直接或间接活化CNG通道的能力；和(5)在至少两个或更多个所述腔室中通过检测或测定离子敏感性指示剂发射的荧光，以检测对所述CNG通道潜在活化响应的预先确定离子的浓度变化。该试验可用于同时检测至少两种上述样品，优选高通量形式优选地包括同时对至少5，更优选为10，更优选为50，更优选为100种和可能甚至几百或几千种样品的筛选。单通量中筛选样品的数量可以基于所使用的特定平板中的独立腔室数量，即24、96、384等。

[0096]本发明高通量试验的一个变化形式中，在所述至少两个腔室中加入所述试验化合物的同时，阵列中至少一个独立腔室可以加入已知的CNG通道活化子。该腔室可作为检测CNG通道活性的阳性对照。试验中还可包括含有适当阴性对照的腔室。可用于阳性对照的CNG通道已知活化子包括：毛喉素，IBMX，cAMP和cGMP的可透过性类似物和氧化氮(NO)-生成化合物(如S-亚硝基半胱氨酸-SNC)。

[0097]任何适用于高通量试验的细胞都可用于本发明的试验中。特别优选单层生长的细胞，因为这种细胞在用于荧光板读取器时可产生更加一致的结果。适用的细胞包括人胚肾细胞(HEK293细胞)，COS细胞，小鼠L细胞，中国仓鼠卵巢细胞，非洲绿猿肾细胞，LtK-细胞和BHK细胞。

分离和表达CNG通道亚基

[0098]本发明嗅觉CNG通道亚基或其片段或变体的分离和表达可用下述方法实施。基于图1所包含的序列，PCR引物可用于扩增嗅觉CNG通道亚基的编码核酸，这些核酸的文库从而得以产生。然后可以使用表达载体文库感染或转染宿主细胞以功能性表达这些文库。这些基因和载体可在体外或体内制备和表达。本领域技术人员应认识到，通过调节本发明载体内基因和核酸(例如启动子、增强子等)的表达或活性，可以得到改变和控制核酸表达的理想表型。可以使用被描述为可用于增加或降低表达或活性的任何已知方法。本发明可与本领域任何已知方法或方案结合实施，所述方法或方案在科学和专利文献中有详尽描述。

[0099]本发明的核酸序列和其它用于实施本发明的核酸，不论是RNA、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或是其杂交体，都可以通过基因工程、扩增和/或重组表达的方法从多种来源分离获得。可使用任何重组表达系统，除了哺乳动物细胞之外还包括，例如细菌、酵母、昆虫或植物系统。

[0100]或者，这些核酸可用已知的化学合成方法体外合成，例如下面所记载的方法：Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.105：661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.25：3440-3444(1997)；Frenkel，Free Radic.Biol.Med.19：373-380(1995)；Blommers，Biochemistry 33：7886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.68：90(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68：109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.22：1859(1981)；U.S.Patent No.4,458,066。随后，或者通过合成互补链，并在合适条件下退火使链结合，或通过使用DNA聚合酶及合适的引物序列来加入互补链的方法可以获得双链DNA片段。

[0101]核酸操作技术，如在序列中生成突变，亚克隆，探针标记，测序，杂交等技术均详细记载于科学和专利文献中。参见，例如Sambrook，ed，Molecular Cloning：a Laboratory manual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley & Sons，Inc，New York(1997)；Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I，Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。

[0102]核酸、载体、衣壳、多肽等可采用本领域技术人员众所周知的任一种方法来分析和定量。这些方法包括，例如分析生物化学方法，如，NMR，分光光度测定法，放射成像法，电泳，毛细管电泳，高效液相色谱(HPLC)，薄层层析(TLC)和超扩散层析(hyperdiffusionchromatography)；多种免疫方法，例如流体或凝胶沉淀素反应，免疫扩散，免疫电泳，放射免疫试验(RIA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫萤光试验，Southern分析，Northern分析，点印迹分析法，凝胶电泳(例如SDS-PAGE)，RT-PCR，定量PCR，其它核酸或靶物质或信号放大方法，放射性标记，闪烁计数和亲和层析。

[0103]寡核苷酸引物用于扩增编码嗅觉CNG通道亚基的核酸。此处描述的核酸同样可用扩增技术进行克隆或定量测量。使用示例性的简并引物对序列，本领域普通技术人员可选择和设计适用的寡核苷酸扩增引物。扩增方法在本领域中是熟知的，包括，例如聚合酶链反应，PCR(PCR Protocols，a Guide to Methods and Applications，ed.Innis.Academic Press，NY，(1990)和PCR Strategies，ed.Innis，Academic Press，NY，(1995))，连接酶链反应(LCR)(参见，例如Wu，Genomics 4：560，(1989)；Landegren，Science 241：1077，(1988)；Barringer，Gene 89：117，(1990))；转录扩增(参见，例如Kwoh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173，(1989))；和，自我维持序列复制(参见，例如Guatelli，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874，(1990))；Q-β复制酶扩增(参见，例如Smith，J.Clin.Microbiol.35：1477，(1997))；自动化Q-β复制酶扩增试验(参见，例如Burg，Mol.Cell.Probes 10：257，(1996))和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；同样参见Berger，Methods Enzymol.152：307，(1987)；Sambrook；Ausubel；U.S.专利Nos.4,683,195和4,683,202；Sooknanan，Biotechnology 13：563，(1995)。

[0104]一经扩增，即根据本领域已知的方法，使用常规分子生物学方法将核酸单独或以文库形式按照所需克隆到任意一个载体上；体外扩增核酸的克隆方法已被描述于，例如U.S.专利No.5,426,039中。为协助扩增序列的克隆，可将限制性酶切位点“置于PCR引物对中。

[0105]设计简并引物对的范例是本领域众所周知的。例如可由http：//blocks.fhcrc.org/codehop.html处获得COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer CODEHOP)策略计算机程序，该程序可直接连接到BlockMaker多序列比对位点进行杂合引物预测，其由一组相关蛋白质序列开始。(参见，例如Rose，Nucl.Acids Res.26：1628，(1998)；Singh，Biotechniques 24：318，(1998))。

[0106]合成寡核苷酸引物对的方法是本领域众所周知的。可以使用“天然”碱基对或合成碱基对。例如，使用人工核苷酸碱基能提供操作引物序列、产生更加复杂的扩增产物混合物的多样途径。人工核苷酸碱基多种家族通过内部键旋转，能够采取多种氢键取向，从而提供简并分子识别的手段。这些类似物掺入PCR引物的单一位点将导致扩增引物复杂文库的产生。参见，例如Hoops，Nucleic Acids Res.25：4866，(1997)。非极性分子同样可用来模仿天然碱基的形状。腺嘌呤的非氢键结合形状模拟物可以对胸腺嘧啶非极性形状模拟物有效的和选择性的复制(参见，例如Morales，Nat.Struct.Biol.5：950，(1998))。例如两个简并碱基可以是嘧啶碱基6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c][1，2]嗪-7-酮或嘌呤碱基N6-甲氧基-2，6二氨基嘌呤(参见，例如Hill，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：4258，(1998))。本发明简并引物的范例掺入了核苷酸类似物5’-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-2’-脱氧-胞嘧啶和3’-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(参加上述，序列中的术语“P”)。这种嘧啶类似物与嘌呤，包括A和G残基形成氢键。

[0107] 编码嗅觉CNG通道亚基的核酸通过使用简并引物对扩增(例如PCR)适当核酸序列而生成。扩增的核酸可以是来自任何细胞或组织的基因组DNA或来自表达嗅觉受体的细胞，例如嗅觉神经元或嗅上皮的mRNA或cDNA

[0108]从嗅觉细胞中分离DNAs的方法是本领域众所周知的，如上所述(组成型表达或诱导性表达人类嗅觉CNG通道的细胞可以用于筛选能阻断或调节嗅觉感受的化合物)。例如，可用嗅觉标记蛋白(OMP)鉴定细胞，嗅觉标记蛋白是一种丰富的胞浆内蛋白质，其几乎只在成熟的嗅觉感觉神经元内表达(参见，例如Buiakova，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9858，(1996)).Shirley，Eur.J.Biochem.32：485，(1983)记载了适用于体外嗅觉机制生物化学研究的大鼠嗅觉制剂。成年大鼠嗅觉受体神经元的培养物则记载于Vargas，Chem.Senses 24：211，(1999)中。同样，U.S.专利No.5,869,266中公开了培养人类嗅觉神经元用作神经毒性试验和筛选。Murrell，J.Neurosci.19：8260，(1999)则公开了对增味剂响应的培养基中分化的表达嗅觉受体的细胞，其通过钙流入来进行检测。

[0109]包含编码人类CNG通道亚基序列的杂合蛋白质的编码序列同样可与转位序列相融合。这些核酸序列同样可以被操作性的连接至转录或翻译控制元件中，例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、聚腺苷酸化序列和其它对DNA转录成RNA有用的序列等。在重组表达盒、载体和转基因生物构建过程中，可以利用启动子片段指导在所有组织中表达目的核酸。嗅觉细胞特异的转录元件同样可用于表达融合多肽受体，包括例如M4嗅觉受体编码区上游的6.7kb的区域。该区域足以指导野生型区域限制的嗅上皮中的表达以及内源性嗅觉受体的神经元内表达(Qasba，J.ONeurosci.18：227，(1998))。受体基因在感觉上皮的整个区域性限制区域内的小亚群神经元中正常表达。转录和翻译控制元件可从天然来源分离，从诸如ATCC或GenBank文库的来源获得，或通过合成或重组方法制备。

[0110]融合蛋白，具有C-末端或，更优选的，N-末端的转位序列，同样可包含此处所述的转位基元(motif)。但是，这些融合蛋白还可包含额外的元件，如用于蛋白检测、纯化或其它用途。促进检测和纯化的结构域包括，如金属螯合肽如聚组氨酸列串、或组氨酸-色氨酸组件或其它允许在固定金属上纯化的结构域等；麦芽糖结合蛋白；可以在固定的免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域；或FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域(Immunex Corp，Seattle WA)。

[0111]在转位结构域(为了有效的胞浆膜表达)和新翻译多肽的其余部分之间，包含一个可裂解连接物序列如Xa因子(参见，例如Ottavi，Biochimie 80：289，(1998))、枯草杆菌蛋白酶识别基元(参见，例如Polyak，Protein Eng.10：615，(1997))、肠激酶(Invitrogen，San Diego，CA)等，对促进纯化可能有利。例如，一个构建体可以包括一条编码多肽(与6个组氨酸残基连接，后跟一个硫氧还蛋白、肠激酶裂解位点(参见，例如Williams，Biochemistry 34：1787，1995)和一个氨基末端转位结构域)的核酸序列。组氨酸残基可促进检测和纯化，而肠激酶裂解位点提供了从剩余融合蛋白中纯化目的蛋白的手段。有关编码融合蛋白的载体技术和融合蛋白应用的技术在科学和专利文献中已有详尽描述，参见，例如Kroll，DNA Cell.Biol.12：441，(1993)。

[0112]包含嗅觉结合结构域编码序列的表达载体，不管是单独表达载体形式还是其文库形式，都可以引入细胞的基因组或胞浆或细胞核，并通过科学和专利文献中详尽描述的多种常规方法表达所述载体。参见，例如Roberts，Nature 328：731，(1987)；Berger，如前；Schneider，Protein Expr.Purif.6435：10，(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。生物试剂和试验器材厂家提供的产品信息也会提供有关生物学方法的信息。载体可从天然来源分离，从诸如ATCC或GenBank文库的来源获得，或通过合成或重组方法制备。

[0113]核酸可在细胞内稳定或瞬时表达(例如游离型表达系统)的表达盒、载体或病毒中表达。选择标记物可以整合到表达盒和载体中，从而赋予转化细胞和序列以可选择的表型。例如，选择标记物可以编码游离型维持和复制，所以就不必整合至宿主基因组中了。例如，标记物可编码抗生素抗性(氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如chlorosulfuron或Basta)，以选择转化了目的DNA序列的细胞(参见，例如Blondelet-Rouault，Gene 190：315，(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.281：992，(1997))。由于赋予对如新霉素或潮霉素这样的底物抗性的可选择性标志基因仅能用于组织培养，故化学抗性基因同样可用作体内和体外的选择性标记物。

[0114]本发明不但包括DNA和具有特定氨基酸序列的蛋白质，还同样包括DNA片段，特别是，例如40、60、80、100、150、200或250个核苷酸、或更多核苷酸的片段，以及例如10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多氨基酸的蛋白质片段。

[0115]本发明还包括嵌合蛋白质，其包含此处公开的至少一种感觉受体人类CNG通道亚基中的至少10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多的序列，和任选的其它多肽，例如另一受体亚基或报告多肽。嵌合受体在本领域众所周知，制备嵌合受体的技术和不同受体的结构域和片段的选择及界定也是本领域众所周知的。因此，本领域技术人员的知识可以很容易的用于这种嵌合受体的制备。使用这种嵌合受体可以提供例如一种在此特别描述的受体的嗅觉选择性特征，并与另一受体的信号传导特征相耦联，如现有技术实验系统中使用的一种已知的受体。

[0116]此处公开的与人类嗅觉CNG亚基基本上相同的多态变体、等位基因、和种间同源体可以使用根据图1中包含的序列所构建的核酸探针进行分离。或者，通过检测能与感觉受体来源的多肽产生的抗血清或纯化抗体发生免疫反应的表达同源物(该抗血源或纯化抗体同样可以识别和选择性结合到感觉受体同源物上)，表达文库可用于分离感觉受体和其多态变体、等位基因和种间同源体。

[0117]表达本发明的人类CNG通道亚基片段，或变体的宿主细胞也处在本发明范围之内。为了获得克隆的基因或核酸，例如编码CNG亚基片段或其变体的cDNAs的高水平表达，通常将目的核酸序列亚克隆至含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子(若对于编码蛋白质的核酸分子来说，还含有翻译起始的核糖体结合位点)的表达载体中。适用的原核和真核表达系统是本领域众所周知的，并记载于如Sambrook等中。

[0118]可以使用任何已知的将外源核苷酸序列引入宿主细胞的方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、polybrene、原生质体融合、电穿孔、脂质体、微注射、质粒载体、病毒载体和其它任何已知的将克隆基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传物质引入宿主细胞的方法(参见，例如Sambrook等)。唯一必要的是，特定遗传工程方法能够成功地将至少一条核酸分子引入到能表达目的嗅觉受体、片段或变体的宿主细胞中。

[0119]将表达载体引入到细胞中后，被转染的细胞在适合目的受体、片段或变体表达的条件下培养，然后使用标准技术从培养物中回收目的受体、片段或其变体。此类技术的实例是本领域众所周知的，参见，例如WO 00/06593，此处将其以与本公开内容具有一致性的方式引用。

感觉受体多肽的免疫检测

[0120]除了使用核酸杂交技术检测人类嗅觉CNG亚基基因和基因表达以外，同样可以使用免疫试验检测感觉受体，例如鉴定嗅觉受体细胞以及感觉受体家族成员的变体。免疫试验可用以定性或定量分析感觉受体。此技术应用的总体概述参见Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual(1988)。

针对人CNG嗅觉亚基的抗体

[0121]产生可以与人类嗅觉CNG亚基家族成员特异性反应的单克隆抗体和多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Coligan，Current Protocols in Immunology，1991；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，2d ed.，1986；Harlow和Lane，如前；以及Kohler和Milstein，Nature，256：495，1975)。此类技术包括通过从噬菌体或类似载体的重组抗体文库中选择抗体来制备相应抗体，以及通过免疫家兔或小鼠来制备单克隆抗体和多克隆抗体(参见，例如Huse等，Science，246：1275，1989；Ward等，Nature，341：544，1989)。

[0123]许多免疫原可用于产生与特定嗅觉CNG亚基家族成员特异性反应的抗体。例如重组CNG通道亚基蛋白质，或其抗原性片段，可用此处描述的方法分离。重组蛋白可用上面描述的方法在真核或原核细胞中表达，和使用本领域已知的方法纯化。重组蛋白质是优选的用于产生单克隆或多克隆抗体的免疫原。或者，从此处公开的序列衍生的合成肽，与载体蛋白质缀合后可用作免疫原。天然产生的蛋白质可以纯净的或非纯净的形式使用。产物然后被注射进能够产生抗体的动物。可得到单克隆或多克隆抗体，用于后续测量蛋白质的免疫试验。

[0124]产生多克隆抗体的方法为本领域技术人员众所周知。使用佐剂(例如弗氏佐剂)和周期性强化的标准免疫程序，小鼠、仓鼠、大鼠、豚鼠、家兔、山羊或鸡可被蛋白质免疫。然后可以通过采血和确定与感觉受体反应滴度来监测动物对免疫原制备物的免疫反应。当获得合适的针对免疫原的抗体高滴度后，可采集动物血液并制备抗血清。如有需要，可以通过抗血清进一步分级分离来富集与所述蛋白质反应的抗体(参见Harlow和Lane，如前)。

[0125]可通过本领域技术人员熟知的各种技术得到单克隆抗体。简单地讲，通常通过与骨髓瘤细胞融合，使目的抗原免疫的动物脾细胞永生化(参见Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol，6：511，1976)。永生化的另一个方法包括使用E-B病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、反转录病毒、或本领域已知的其它方法。对由单个永生化细胞形成的克隆筛选，选出能够产生针对抗原具有所需特异性和亲和性的抗体的克隆。通过多种技术可以提高这些细胞产生单克隆抗体的产量，包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔内。或者，按照Huse等，Science，246：1275，(1989)所概述的一般方法，通过筛选人B细胞的DNA文库，可以分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。

[0126]通常收集单克隆抗体或多克隆血清并在免疫试验中用免疫原滴定，例如固相免疫试验，其中免疫原固定在固相支持物上。通常，选择具有10⁴或更高滴度的多克隆抗血清，并使用竞争结合免疫试验，测试它们与非感觉受体蛋白质、或甚至其它感觉受体家族成员、或其它生物体的其它相关蛋白质的交叉反应。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体一般结合的Kd会至少大约0.1mM，更经常地至少大约1pM，可选地至少大约0.1pM或更好，并且可选地0.01pM或更好。

一旦得到人类CNG亚基特异性抗体，各嗅觉CNG通道亚基蛋白质可用一系列免疫试验方法来检测。有关免疫学和免疫试验程序的综述，参见Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr eds.，7th ed.，1991)。而且，本发明的免疫试验可以由几种形式来完成，这些形式在Enzyme Immunoassay(Maggio，ed.，1980)以及Harlow和Lane，(如前)中详述。

免疫学结合试验

[0127]CNG通道亚基蛋白质可用任何一个已知的免疫学结合试验检测和/或定量(参见，例如U.S.专利Nos.4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。对于一般性免疫试验的综述，参见细胞生物学方法：细胞生物学中的抗体(Methods in Cell Biology：Antibodies in Cell Biology，volume 37，Asai，ed.1993)；Basicand Clinical Immunology(Stites & Terr，eds，7th ed，1991)。免疫学结合试验(或免疫试验)通常使用能够特异性与所选蛋白质或抗原(本专利申请中是感觉受体家族成员或其抗原性子序列)结合的抗体。抗体(例如抗感觉受体)可以使用本领域技术人员已知的多种手段和如上所述的各种方法产生。

[0128]免疫试验也经常使用标记物，其可特异性地结合和标记抗原抗体复合物。标记物本身可能是包含抗体/抗原复合物的一个部分。因此，标记物可以是标记的感觉受体多肽或标记的抗感觉受体抗体。或者，标记物可以是一个第三部分，如第二抗体，其能够特异性地结合抗体/感觉受体复合物(第二抗体通常特异性结合产生第一抗体的物种的抗体)。其它能够特异结合免疫球蛋白质恒定区的蛋白质，如蛋白质A或蛋白质G同样可用作标记物。这些蛋白质表现出与许多物种的免疫球蛋白恒定区强烈的非免疫原性反应活性(参见，例如Kronval等，J.Immunol，111：1401，1973；Akerstrom等，J.Immunol，135：2589，1985)。可用可检测部分修饰标记物，如生物素，其可与另外的分子特异结合，如链霉亲和素。多种可检测部分为本领域技术人员所熟知。

[0129]贯穿整个试验，每结合一个试剂都需要孵育和/或漂洗步骤。孵育步骤从5秒钟到几个小时，可选地从大约5分钟到大约24小时。但是孵育时间将取决于试验形式、抗原、溶液体积、浓度等。一般情况下试验在环境温度下进行，尽管它们可以在一个温度范围内进行，如10℃到40℃。

非竞争试验形式

[0130]检测样品中蛋白质的免疫试验既可以是竞争性的也可以是非竞争性的。非竞争性免疫试验直接测定抗原量。例如在一个优选的“夹心(sandwich)”试验中，抗感觉受体抗体可直接结合在其固定的固相基质上。这些固定化抗体然后可捕获试验样品中的任何CNG通道亚基蛋白质。嗅觉通道亚基蛋白质因此被固定，然后结合标记物，例如带有标记的第二抗嗅觉通道亚基抗体。或者，该第二抗体可能没有标记，但是它可以结合标记了的第三抗体，该第三抗体对产生第二抗体的物种的抗体具有特异性。该第二抗体或第三抗体通常用可检测部分修饰，例如生物素，其可和另外的分子特异性结合，如链霉亲和素，以提供可检测部分。

竞争性试验形式

[0131]在竞争性试验中，通过测量用样品中存在的未知的CNG通道亚基蛋白质从抗CNG通道亚基抗体中去除(竞争去除)已知的外加的(外源的)感觉受体蛋白质的量，间接测量样品中存在的CNG通道亚基蛋白质。在一个竞争性试验中，将已知量的CNG通道亚基蛋白质加入到样品中，样品然后与能特异结合蛋白质亚基的抗体接触。与抗体结合的外源通道亚基蛋白质的量与样品中通道亚基蛋白质的浓度成反比。在一个特别优选的实施方案中，抗体被固定在一个固相基质上。与抗体结合的蛋白质的量可以通过测量亚基/抗体复合物中的蛋白质的量，或通过测量剩余未形成复合物的蛋白质的量来确定。通过提供标记的感觉受体分子可以检测蛋白质的量。

[0132]半抗原抑制试验是另一种优选的竞争性试验。在这个试验中已知通道亚基蛋白质固定在固相基质上。将已知量的抗感觉受体抗体加入样品中，样品然后与固定的感觉受体接触。抗CNG通道亚基抗体结合到已知的固定化CNG亚基蛋白质的量与样品中存在的CNG通道亚基蛋白质的量成反比。同样，固定化抗体的量可以通过检测抗体固定化部分或溶液中剩余抗体部分来检测。抗体被标记时可直接检测，或随后加入一个如上所述的特异结合抗体的标记部分进行间接检测。

交叉反应测定

[0133]竞争结合形式的免疫试验也可用来测定交叉反应。例如由在此公开的核酸序列至少部分编码的蛋白质可以固定在固相支持物上。蛋白质(例如CNG亚基蛋白质和其同源物)加入到试验体系中，与固定的抗原竞争结合抗血清。将加入蛋白质的与固定蛋白质竞争结合抗血清的竞争能力，与在此公开的核酸序列编码的CNG通道亚基多肽与自己竞争的能力相比较。使用标准计算法计算上述蛋白质的交叉反应百分比。与每一个上述加入蛋白质交叉反应小于10％的抗血清被选择出来并富集。通过加入特定蛋白质，例如远源同源物进行免疫吸收，交叉反应抗体可任选地从富集抗血清中去除。另外，含有可用于鉴定感觉受体家族成员并代表保守序列的氨基酸序列的肽，可用于测定交叉反应性。

[0134]免疫吸收的和富集的抗血清然后用于进行如上述的竞争结合免疫试验，以比较第二蛋白质(该蛋白质被认为可能是嗅觉CNG通道亚基家族成员的等位基因或多态变体)和免疫原蛋白质(即由在此公开的核酸序列编码的CNG通道亚基蛋白质)。为了实现这个比较，该两种蛋白质都要在一个宽范围浓度内进行试验，并确定抑制抗血清与固定的蛋白质50％结合需要的每一种蛋白质的量。如果抑制50％结合需要的第二蛋白质量小于在此公开的核酸序列所编码的蛋白质抑制50％结合需要量的10倍，那么该第二蛋白质就被认为能够特异性地结合由感觉受体免疫原产生地多克隆抗体。

其它试验形式

[0135]Western印迹(免疫印迹)分析可用于检测和定量样品中存在的嗅觉CNG通道亚基蛋白质。该技术一般包括通过基于分子量的凝胶电泳分离样品蛋白质、将分离开的蛋白质转移到合适的固相支持物上(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜或衍生尼龙膜)、将样品与特异结合感觉受体蛋白质的抗体孵育。抗CNG通道亚基多肽抗体然后特异性地与固相支持物上地CNG通道亚基多肽结合。这些抗体可能直接被标记，或随后通过使用特异结合抗CNG通道亚基的标记抗体而被检测(例如标记的绵羊抗小鼠抗体)

[0136]其它的试验形式包括脂质体免疫试验(LIA)，其利用设计成结合特定分子(如抗体)，并释放出封装好的试剂或标志物的脂质体。释放出的试剂然后可利用标准技术检测(参见Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev，5：34，1986)。

非特异结合的降低

[0137]本领域技术人员应当领会，免疫试验中经常希望降低非特异性的结合。特别是当试验涉及固定在固相基质上的抗原或抗体时，希望降低非特异结合固相基质的量。降低非特异结合的手段为本领域众所周知。一般来讲，该技术涉及使用蛋白质性质的组合物来包被基质。特别是象牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、明胶这样的组合物被广泛应用，最优选的方案是使用奶粉。

标记物

[0138]试验中使用的特定标记物或可检测基团不是本发明的关键因素，只要它不显著影响试验中抗体的特异性结合即可。可检测基团可以是任何具有可检测的物理或化学性质的物质。这类可检测标记在免疫试验领域发展完善，并且在通常情况下，这些方法中有用的大多数标记物都可以应用于本发明，因此，标记物是指任何能用光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学的、光学的或化学的手段检测到的组分。本发明有用的标记物包括磁珠(例如DYNABEADS^TM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红(Texas red)罗丹明等)、放射标记物(如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³³P或³²P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、和显色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料珠(如聚苯烯、聚丙烯、乳胶等)。

[0139]按照本领域已知的方法，标记物可以直接或间接耦联至试验中目的组分上。如上所述，根据所需要的灵敏度、与化合物缀合的难易度、所需稳定性、现有仪器、和废物处理规定，可以使用各种各样的标记物。

[0140]非放射标记物通常使用间接法标记。一般来讲，配基分子(如生物素)共价结合至分子上。该配基然后结合另外一个分子(如链霉亲和素)，该分子本身可被检测到或共价连接至一个信号系统如可检测酶、荧光化合物、或化学发光化合物上。配基和它们的靶标可以与识别感觉受体蛋白质的抗体、或识别抗感觉受体的二抗以任意适合的组合使用。

[0141]分子也可以直接缀合至信号产生化合物上，例如与酶或荧光团缀合。作为标记物的目的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化酶、特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素(luciferin)，和2，3-二氢二氮杂萘二酮类(dihydrophthalazinediones)，例如鲁米诺(luminol)。可能使用的多种标记或信号发生系统参见U.S.专利No.4,391,904的综述。检测标记物的方法本领域众所周知。因此，例如当标记物是放射标记物时，检测手段包括闪烁计数器或感光膜放射自显影。当标记物是荧光标记物时，可以通过合适波长的光激发荧光团并检测产生的荧光来探测。荧光可以肉眼观察，通过感光膜，或通过电子检测器如电荷耦联装置(CCDs)或光电倍增器等检测。类似地，在提供酶的合适底物后，可以通过检测反应产物来检测酶标记物。最后，简单的显色标记物可以通过简单观察与标记物相关的颜色来检测。因此，在一系列试纸条(dipstick)试验中，缀合的金通常显示粉红色，而各种缀合的小珠显示各自小珠本身的颜色。

[0142]一些试验形式不需要使用标记的组分。例如凝集试验可用于检测靶抗体存在与否。在该试验中，抗原包被颗粒与包含靶抗体的样品发生凝集。在该形式中，组分均无需标记，通过肉眼简单观测就能判定靶抗体的有无。

荧光偏振试验

[0143]在另一实施方案中，基于荧光偏振(“FP”)的试验可用于检测和监测配体结合。荧光偏振试验是测量平衡结合、核酸杂交、和酶活性的实验室通用技术。荧光偏振试验是均一性的，因为它不需要分离步骤如离心、过滤、层析、沉淀或电泳等。这些试验在溶液中直接实时进行，不需要一个固定化阶段。偏振值可重复测量，在加入试剂后测量速度非常快，所以不会破坏样品。一般情况下，本技术可用于测量低至皮摩尔(picomolar)到微摩尔(micromolar)水平荧光基团(fluorophores)的偏振值。本节描述了怎样简单定量地用荧光偏振测量本发明增味剂与受体的结合。

[0144]当荧光标记分子被平面偏振光激发，就发出具有一定偏振程度的光，偏振程度与其分子旋转成反比。大的荧光标记分子在激发态(对于荧光素来说为4纳秒)保持相对稳定，在激发和发射之间光的偏振保持相对恒定。小的荧光标记分子在激发态快速旋转，在激发和发射之间的光的偏振变化显著。因此，小分子偏振值较低而大分子偏振值较高。例如一个荧光素标记的单链寡核苷酸具有相对较低的偏振值，但当它与互补链杂交后就具有较高的偏振值。当使用FP来检测和监测可能激活或抑制本发明感觉受体的增味剂结合作用时，可以使用荧光标记的味觉元或自发荧光味觉元。

1.荧光偏振(P)被定义为：

$P=\frac{{\mathrm{Int}}_u-{\mathrm{Int}}_{\⊥}}{{\mathrm{Int}}_u+{\mathrm{Int}}_{\⊥}}$

[0145]其中II是与激发光平面平行的发射光强度，Int⊥是与激发光平面垂直的发射光强度。P，作为一个光强度的比值，是一个无量纲数字。例如Beacon和Beacon 2000^TM系统可以与这些试验结合使用。这类系统通常用毫偏振单位(millipolarization unit)来表达偏振值(1偏振单位＝1000mP单位)。

[0146]分子旋转和尺寸之间的关系由Perrin方程式描述，JolleyJ.Anal.Toxicol.5，236，(1981)中给出了关于这一方程式的详尽的解释。概括地讲，Perrin方程式认为偏振与旋转弛豫(rotationalrelaxation)时间直接成正比关系，该时间是一个分子旋转过大约68.5°角所需要的时间。旋转弛豫时间按下列方程式与粘度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)、和气体常数(R)有关：

[0147]旋转弛豫时间对于小分子如荧光素非常小(≈1纳秒)，对于大分子如免疫球蛋白非常大(≈100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定，旋转弛豫时间(进而偏振)与分子体积直接相关。分子体积的变化可能是由于与其它分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或荧光标记分子的构象变化等引起。例如荧光偏振已被用于测量大分子荧光素标记的聚合物的酶促裂解，如用蛋白酶、DNA酶和RNA酶引起的裂解。它也同样被用于测量蛋白质/蛋白质相互作用、抗体/抗原结合、和DNA/蛋白质结合的平衡结合作用。

固相和可溶性高通量试验

[0148]在高通量试验中，在一天内筛选多达几千个不同调节子或配体是可能的。特别是，微孔板的每一个孔都可以用于进行针对选择的潜在调节子的单独的试验，或者如果是观察浓度或孵育时间效果，每5-10个孔可以测试一个调节子。因此，一个标准微孔板可以试验大约100个(例如96个)调节子。如果使用1536孔板，那么一个板可以轻松分析1000到大约1500个不同的化合物。每天可以分析几个不同的板。使用本发明的整合系统，使筛选高达大约6,000-20,000种不同化合物成为可能；最近又发展了试剂操作的微流体方法。

[0149]目的分子可以直接或间接通过共价或非共价键如经由一个标签(tag)结合到固态组分上。标签可以是多种组分的任何一种。一般来讲，将可结合标签的分子(标签结合物)固定在一个固相支持物上，通过标签和标签结合物的相互作用，标签化了的目的分子(如目的味觉传导分子)就连接在了固相支持物上。

[0150]根据文献描述的已知分子相互作用，可以使用许多标签和标签结合物。例如当一个标签具有天然结合物时，例如生物素、蛋白A或蛋白G，它就可以与适当的标签结合物(亲和素、链霉亲和素、中性亲和素(neutravidin)、免疫球蛋白的Fc区等)结合使用。针对具有天然结合物的分子如生物素的抗体也可被广泛应用，并是合适的标签结合物(参见，SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue，SIGMA，St.Louis MO)。

[0151]类似地，任何半抗原或抗原性化合物都可与适当抗体结合形成标签/标签结合物对。几千种特异性抗体都已商业化并且文献中还描述了许多其它地抗体。例如在一个常见方法中，标签是第一抗体，标签结合物是特异性识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原作用外，受体-配体相互作用也可以作为合适的标签和标签结合物对。例如细胞膜受体激动剂和拮抗剂(例如细胞受体-配体相互作用如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整联蛋白家族、选择蛋白家族等，例如参见，Pigott & Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I 1993)。类似地，毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(例如阿片剂、类固醇等)、细胞内受体(例如介导各种小配体作用地物质，包括类固醇、甲状腺激素、类视黄醇和维生素D、和肽)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体都可以与不同细胞受体相互作用。

[0152]合成聚合物如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲类、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳撑硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯(polyacetates)同样可以形成合适的标签或标签结合物。许多其它的标签/标签结合物对同样对于在此描述的试验系统十分有益，在浏览本公开内容后这将变得十分明显。

[0153]一般接头如肽、聚醚等同样可以作为标签，并且包括多肽序列，例如大约5到200个氨基酸的聚甘氨酸序列。这类弹性接头对于本领域技术人员来说是已知的。例如聚(乙二醇)接头可以从Shearwater Polymers(Huntsville，AL)得到。这些接头可选地具有酰胺键、巯基键或异功能键等。

[0154]标签结合物可以使用现有的各种方法固定到固相基质上。通常固相基质的全部或部分暴露于化学试剂(将能与标签结合物的一部分发生反应的化学基团固定到表面)中以完成其衍生或功能化。例如适合附着在长链部分上的基因可包括胺、羟基、硫羟和羧基基团。氨基烷基硅烷和羟烷基硅烷可用于一系列表面的功能化，例如玻璃表面。构建此类固相生物聚合物阵列的方法在文献中均有详细描述。例如参见，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149，(1963)(描述了如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102：259，(1987)(描述了在针上固相组分的合成)；Frank & Doring，Tetrahedron 44：6031，(1988)(描述了在纤维素盘上合成多种肽序列)；Fodor等，Science 251：767，(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39：718，1993；和Kozal等，Nature Medicine，2：753，(1996)(均描述了固定在固相基质上的生物聚合物阵列)。固定标签结合物至基质的非化学方法包括其它常用方法，如加热、UV辐射交联等。

[0155]如前所述，构建表达根据本发明的功能性CNG通道的细胞系，所述通道在增味剂刺激后通过cAMP的增加或通过cAMP或cGMP的类似物得到活化。例如，在一个实施方案中，高通量的基于平板的CNG试验将通过在孔中加入刺激因子来发生和活化。其实例包括通过使用能够刺激腺苷酸环化酶的化合物如毛喉素、或通过使用能够阻断磷酸二酯酶的化合物如IMBX或通过使用膜可透过性cAMP和cGMP的类似物。

[0156]在另一高通量筛选方案中，细胞可透过性cAMP或cGMP可借助内部VV照射的快速光分解来传递以完成该变化。

基于细胞的功能试验

[0157]在优选的实施方案中，至少一个CNG通道亚基多肽在真核细胞中表达。该CNG通道可在任何真核细胞中表达，如HEK-293细胞。细胞内这类通道的活化可以用，如基于细胞内Ca²⁺的变化来检测。

[0158]通过比较用潜在的抑制子或活化子处理过的样品或试验物和未用试验化合物处理过的对照样品，从而分析调节程度。这类试验可以在存在已知的能够通过增加细胞内cAMP或cGMP水平而活化CNG通道的增味剂的情况下实施，且该增味剂依赖性活化作用的调节被监测。对照样品(未用活化子或抑制子处理)的感觉受体相对活性值被指定为100。当感觉受体活性值相对于对照为大约90％，可选地50％，可选地25-0％时，就获得抑制作用。当通道活性值相对于对照为110％，可选地150％、200-500％或1000-2000％时，就获得活化作用。

[0159]离子流量变化可通过确定表达感觉受体蛋白质的细胞或膜的离子极化(即电势)变化来评价。确定细胞极化变化的一个手段就是用电压-钳(voltage-clamp)和膜片钳(patch-clamp)技术，例如“细胞附着(cell-attached)”模式、“内-外(inside-out)”模式和“全细胞(whole cell)”模式(参见，例如Ackerman等，NewEngl.J.Med，336：1575，(1997))测量电流变化，从而检测极化的变化。全细胞电流可用已知的标准方法很方便地测量到。其它已知的试验包括：用放射标记的或荧光探针的电压敏感性染料(参见，例如Vestergarrd-Bogind等，J.Membrane Biol，88：67，(1988)；Gonzales & Tsien，Chem.Biol，4：269，(1997)；Daniel等，J.Pharmacol.Meth，25：185，(1991)；Holevinsky等，J.MembraneBiology，137：59，(1994))或钙敏感性染料如fluo-3、fluo-4或fura-2测量离子流的试验。一般地，待测化合物地存在浓度为从1pM到100mM。

[0160]在另一个实施方案中，可测量转录水平用于评价待测化合物对信号传导的影响。可将包含CNG通道亚基蛋白质的宿主细胞与待测化合物接触足够长的时间以实现任何相互作用，然后测量基因表达水平。实现这些相互作用的时间凭经验确定，例如执行一个时间进程实验并且测量转录水平作为时间的函数。转录量可以使用本领域技术人员已知的合适的方法测量。例如通道亚基蛋白质的mRNA的表达可以通过Northern印迹检测或利用免疫试验鉴定其多肽产物来检测。或者，可使用利用报告基因的基于转录的试验，参见U.S.专利No.5,436,128中的描述，在此引用作为参考。报告基因可以是，例如氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、’3-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。此外，通过附着在第二报告子如绿色荧光蛋白后，目的通道亚基蛋白质可以间接用作报告子(参见，例如Mistili & Spector，Nature Biotech.15：961，(1997))。

[0161]然后将转录量与在缺少待测化合物的相同细胞内的转录量相比较，或者与缺少目的通道亚基蛋白质的基本相同细胞的转录量相比较。基本相同的细胞可以从用于制备重组细胞的相同细胞衍生而来，但是未被引进异源DNA修饰。转录量的任何差异意味着待测化合物在一定程度上改变了CNG通道的活性。

表达人类嗅觉CNG通道亚基的转基因非人类动物

[0162]表达一种或多种本发明CNG通道亚基序列，特别是人类嗅觉CNG通道序列的非人类动物同样可用于试验。这种表达可用于确定试验化合物在体内是否可以特异性地激活哺乳动物嗅觉CNG通道，其通过以下步骤实现：将用编码嗅觉CNG通道地核酸稳定或瞬时转染的非人类动物与待测化合物接触，并确定该动物是否通过抑制或激活CNG通道而对待测化合物起反应。

[0163]感染/表达单独或作为文库形式的核酸和载体的手段为本领域众所周知。各种各样的个体细胞、器官或整个动物的参数可用多种手段来测量。例如纪录来自主嗅球或副嗅球的由刺激引起的波(嗅球反应)就是一种定量测量稳定嗅觉反应的有用手段。当电极置于嗅球表面时，就可以在几天的时间里记录稳定的反应(参见，例如Kashiwayanagi，Brain Res.Protoc.1：287，(1997))。在本研究中，通过四电极组从正对鼻中隔的内鼻甲骨上的嗅上皮中记录嗅电图。四电极组沿一个鼻甲骨的背-到-腹轴固定，或置于四个鼻甲骨的相应位置，并向骨顶端移动聚集在一起。同样参见，Scott，J.Neurophysiol.77：1950，(1997)；Scott，J.Neuro-physiol.75：2036，(1996)；Ezeh，J.Neurophysiol.73：2207，(1995)。在其它系统中，鼻上皮中的荧光变化可用染料di-4-ANEPPS进行测量，该染料用于大鼠鼻中隔和鼻甲的内侧表面(参见，例如Youngentob，J.Neuro-physiol.73：387，(1995))。细胞外的钾活性(aK)的测量同样可在体内实施。钾活性的增加可在粘液和鼻上皮的近端中测量(参见，例如Khayari，Brain Res.539：1，(1991)

[0164]本发明的嗅觉CNG通道序列例如可通过使用感染剂，例如腺病毒表达载体传递至动物鼻上皮中表达。重组腺病毒介导的并使用绿色荧光蛋白作为标记物的重组基因在嗅上皮中的表达已记载于，例如Touhara，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：4040，(1999)中。该内源CNG通道能保持功能和呈现野生型(天然)活性。在其它情况下，当希望通过引入外源杂合受体而抑制所有内源CNG通道活性时，优选使用基因敲除系。构建非人类转基因动物的方法，特别是构建转基因小鼠的方法，以及选择和制备用于生成转化细胞的重组构建体的方法是本领域众所周知的。

[0165]构建“敲除”细胞和动物基于的前提是，通过将打断待抑制基因的一部分DNA序列的新DNA序列引入到基因组中，可以降低或完全消除哺乳动物细胞中特定基因的表达水平。同样，“基因诱捕插入(gene trap insertion)”可用于破坏宿主基因，小鼠胚胎干细胞(ES)可用于产生敲除的转基因动物(参见，例如Holzschu，Transgenic Res6：97，(1997))。异源序列的插入通常由互补核酸序列间的同源重组实现。异源序列是待修饰靶基因的一部分，例如外显子、内含子或转录调节序列，或任何可影响靶基因表达水平的基因组序列；或其组合。多能胚胎干细胞中通过同源重组的基因打靶可以允许对目的基因组序列进行精确修饰。任何技术都可用于产生、筛选、繁殖敲除动物，例如参见Bijvoet，Hum.Mol.Genet.7：53，(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75：208，(1997)；Tojo，Cytotechnology 19：161，(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48：167，(1995)；Longo，Transgenic Res.6：321，(1997)；U.S.专利Nos.5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。

[0166]本核酸文库同样可用于产生“敲除”的人类细胞及其后代的试剂。

调节子

[0167]作为嗅觉CNG通道的调节子测试的化合物可以是任何小的化学化合物或生物学实体如蛋白质、糖、核酸或脂。通常，试验化合物是小的化学分子和肽。基本上任何化学化合物都可以作为本发明试验中的潜在调节子或配体，尽管在大多数情况下使用了溶解于水溶液或有机溶液(特别是基于DMSO的)中的化合物。通过自动化试验步骤，及从任何方便的来源中提供化合物用于试验，这些试验可用于筛选大的化学文库，这些试验通常是平行方式进行(例如在机器化试验中可以微量滴定板上的微量滴定方式进行)。应当认识到有很多化学化合物供应商，包括Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，Fluka Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs，Switzerland)等。

[0168]在一个优选的实施例中，高通量筛选方法涉及提供包含大量潜在治疗性化合物(潜在调节子或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后在一种或多种上述试验中筛选这类“组合化学文库”或“配体文库”，来鉴定那些显示所需要特征活性的文库成员(特定化学种类或亚类)。如此鉴定的化合物可以作为常规的“引导化合物(leadcompounds)”或本身就可作为潜在或真正的治疗剂。

[0169]组合物文库是不同化学化合物(由化学合成或生物合成产生的)的集合，通过大量化学“构造部件(building blocks)”如试剂组合而成。例如线性组合化学文库如多肽文库是由一系列化学构造部件(氨基酸)用各种可能方式以指定化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数目)组合而形成。通过这种化学构造部件的组合混合可以合成出数百万个化学化合物。

[0170]组合化学文库的制备和筛选为本领域技术人员众所周知。这类组合化学文库包括肽文库，但不局限于肽文库(参见，例如U.S.专利No.5,010,175；Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487，(1991)；和Houghton等，Nature 354：84，(1991))。同样可用其它产生化学多样文库的化学物质，这些化学物质包括，但不局限于：类肽(例如WO 91/19735)，编码的肽(例如WO 93/20242)，随机生物寡聚体(WO 92/00091)，苯并二氮杂卓(例如U.S.专利No.5,288,514)，异聚物(diversomers)，例如乙内酰脲、苯并二氮杂卓以及二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.90：6909，(1993))。插烯(vinylogous)多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568，(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽性肽模仿物(nonpeptidalpeptidomimetics)(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217，(1992))，小分子化合物文库的类似的有机合成(Chen等，J.Amer.Chem.Soc，116：2661，(1994))，寡聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等，Science 261：1303，(1993))，肽基磷酸酯(Campbll等，J.Org.Chem.59：658，(1994))，核酸文库(Ausubel，Berger和Sambrook，均如前)，肽核酸文库(U.S.专利No.5,539,083)，抗体文库(Vaughn等，Nature Biotechnology 14：309，(1996)和WO97/00271)，糖类文库(Liang等，Science 274：1520，(1996)和U.S.专利No.5,593,853)，有机小分子文库(苯并二氮杂卓，Baum，C & EN，page 33，Jan 18，(1993))；噻唑烷酮(thiazolidinones)和metathiazanones，U.S.专利No.5,549,974；pynrolidines，U.S.专利Nos.5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，U.S.专利No.5,506,337；苯并二氮杂卓，U.S.专利No.5,288,514等。

[0171]制备组合文库的装置已经商品化(参见，例如357 MPS，390MPS(Advanced Chem Tech，Louisville，KY)，Symphony(Rainin，Woburn，MA)，433A(Applied Biosystems，Foster City，CA)，9050Plus(Millipore，Bedford，MA))。另外，许多组合文库本身也已经商品化(参见，例如ComGenex，Princeton，NJ；Tripos，Inc，St.Louis，MO；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；MartekBiosciences；Columbia，MD；等)。

施用新的嗅觉调节子(增强子或阻断子)组合物

[0172]感觉调节子可被直接施用给哺乳动物(例如人类)以在体内调节感觉感知。施用可采取任何用于引入调节化合物与欲治疗的组织(例如鼻或舌)进行最终接触的正常途径。嗅觉调节子可采用任何适用的方式来施用，选择性地与合适的载体一起施用。施用所述调节子的适用方法对本领域技术人员来说是众所周知的并可得到的，尽管可采用超过一种途径来施用特定组合物，一种特定途径通常提供比其它途径更直接和更有效反应。可接受的载体至少部分由所施用组合物中的特定组分来确定(例如，稳定感觉物)，以及由施用组合物的特定方法来确定。因此，本发明的药物组合物可采用非常多的适用剂型(参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.1985)。

[0173]感觉调节子，单独地或与其它适用组分组合，可被制成气雾剂形式(即，它们可被“雾化”)  从而借助吸入得以施用。气雾剂可被置于合适的加压推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等，该推进剂能或不能导致感觉感知。其它可能的剂型包括干燥或液体形式、粉剂或片剂、极性(如，水)或非极性(如，醇)溶剂的溶液、乳剂或悬液、乳膏剂，胶剂、洗剂和糖浆。

[0174]施用的合适剂型包括水和非水溶液、等渗灭菌溶液(其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和能使剂型等渗的溶质)，和水和非水灭菌悬液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实施中，组合物可通过，如口腔、局部、静脉内，腹膜内、膀胱内或鞘内的途径来施用。或者，组合物通过口腔或鼻腔的途经施用。化合物剂型可为密封容器，如安瓿和小药水瓶中的单位剂量或多剂量形式。溶液和悬液可用前述的灭菌粉末、颗粒和片剂来制备。调节子还可以作为制备的药物、食品或化妆品的组成部分来施用。特别的，令人厌恶的气味或味道(例如，分别是硫味或苦味)可能就不会被感知到，因为其效果通过下列途径被减弱了，即通过加入能阻断同源配体与受体间结合的竞争性配体从而阻断了感觉配体和感觉受体间的结合，或通过抑制或减弱信号传导。相反的，令人愉快的气味或味道可被模拟或增强。原发(primary)感觉是优选的，因为活化细胞亚群很小而其效果限于投射入大脑的特定区域。但是仅能结合少量嗅觉受体(例如，具有小于5个不同配体结合结构域)的新嗅觉元(olfactory)或其组合物同样是有用的。

[0175]对哺乳动物(如，人类)的施用剂量应足以在施用期间于个体内产生有益的效果。该剂量应由所使用的特定感觉调节子的效力和个体的状态，以及体重或所治疗区域的表面积来确定。剂量的大小同样应由与特定化合物或载体在特定个体内施用时所伴随的任何副作用的存在，特性和范围来确定。在医生确定要施用的调节子的有效量的过程中，其或许会评估该感觉调节子的循环血浆中的水平、调节子毒性和抗调节子抗体的生成。通常，调节子对一般哺乳动物的剂量当量为，大约1ng/kg至10mg/kg。施用时，感觉调节子的施用速率可根据调节子的ED₅₀确定，以及所施用的不同浓度抑制子对哺乳动物的质量和总体健康所造成的副作用来确定。施用可通过单次或分次剂量完成。

试剂盒

[0176]人类嗅觉CNG基因，或其片段或变体是法医学、亲子鉴定中和为检验分离细胞中信号传导而鉴定表达所述通道的细胞的有力工具。能够特异性地与oCNG通道核酸杂交地嗅觉CNG通道家族成员特异性试剂，和特异性结合CNG通道亚基蛋白质地特异性试剂，例如抗CNG通道亚基抗体，可用于检验细胞表达和信号传导调节。例如一个或多个家族成员特异性试剂可用于检测与遗传性嗅觉缺失相关联的多态性或用于检测等位排斥。

[0177]确定样品中oCNG通道家族成员DNA和RNA是否存在的核酸试验包括本领域众所周知的许多技术，例如Southern分析、Northern分析、点印迹、RNA酶保护、S1分析、扩增技术如PCR和原位杂交。例如在原位杂交中，靶核酸从它的细胞内环境中释放出来，以便能在细胞内进行杂交，同时保持细胞形态，利于随后的解释和分析。以下文章提供了原位杂交的概述：Singer等，Biotechniques，4：230-250(1986)；Haase等Methods in Virology，vol.V11，pp.189-226(1984)；和Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(Names等，eds.(1987)。另外，通道亚基蛋白质可以使用如上描述的各种免疫试验技术来检测。测试样品通常同时与阳性对照(例如表达重组感觉受体蛋白质的样品)和阴性对照比较。

[0178]本发明同样提供了筛选嗅觉CNG通道新调节子的试剂盒。这些试剂盒可以从现成材料和试剂，及任一上述产品中制备。例如这些试剂盒可以包含以下材料的任何一种或多种：CNG通道编码核酸或蛋白质，反应试管、测试CNG通道活性的指南等。根据本发明可以制备多种试剂盒和组分，这取决于试剂盒的特定用户和用户的特殊需求。

[0179]下列实施例用以说明本发明，但不应理解为对本发明范围的任何限制。

                      实施例

[0180]实施例1克隆人类嗅觉CNG通道亚基

[0181]在本发明之前，人类嗅觉CNG通道亚基的序列是未知的。但是，对人类嗅觉神经元的电生理学分析却显示出其与大鼠通道具有功能相似性(Thurauf等，(1996))，而我们在人类DNA数据库中鉴定了三个大鼠亚基的直向同源物(图1-4)。我们使用RT-PCT确定了在人类嗅觉上皮mRNA中存在OCNC1和OCNC2，而这两个亚基的全长cDNAs已经通过对从商品获得的cDNA与来自基因组DNA的5’编码外显子的联合PCR扩增而得到克隆。在人类OCNC1编码序列的侧翼加入5’端Asc I和3’端Not I酶切位点，将该OCNC1 Asc I-Not I片段克隆入pEAK10表达载体(Edge Biosystems)以生成质粒SAV19311。在5’Asc I位点整合3个核苷酸的连接子序列以引入优化的翻译起始位点：GGCGCGCCgccATG(SEQ ID NO：8)，其中Asc I位点和起始ATG为大写字母，3个核苷酸的连接子为小写字母。

[0182]3’Not I位点直接加于终止密码子之后。人类OCNC2用类似方法克隆以生成质粒SAV1976。人类β1b同样克隆以生成质粒SAV2498；但是，分隔5’Asc I位点和起始ATG的3核苷酸连接子被删掉。

[0183]实施例2建立针对人类嗅觉CNG通道的高通量试验平台

[0184]采用基于脂质的方案，对HEK-293T细胞瞬时转染克隆的人类嗅觉CNG通道亚基。通过共转染RFP表达载体来监测转染率，一般大于70％。24小时后，收获细胞并转移至96孔板上。在另一个24小时后，用荧光钙或者膜电位染料对细胞染色1小时，漂洗，然后转移至应用板上流体学(on-board fluidics)的FLIPR自动化荧光板读取器上。

[0185]与模拟转染的细胞不同，用嗅觉CNG通道亚基转染的细胞在毛喉素刺激后，显示出增高的荧光性。而且，毛喉素效应的数量级为亚基依赖性的：OCNC1单独产生活性CNG通道，OCNC2(较小的程度)和β1b(较大的程度)强化OCNC1活性(图5)。膜电位染料能提供比钙染料更好的信噪比；但，无论使用上述何种染料对高通量筛选来说都是足够有力的(图6和7)。

[0186]实施例3发展基于CNG通道的GPCRs荧光试验

[0187]Rich等(2001）构建并表征了cAMP敏感性增强的鼠OCNC1CNG通道的一种突变体形式。我们制成了相应的hOCNC1[C460W/E583M]突变体(SEQ ID NO：12)-其由质粒SAV2480携带-并发现其与β1b联合能增加cAMP敏感性和并具有强有力的活性(图8)。该增加的敏感性显示了此人类嗅觉CNG通道变体可以作为cAMP生物传感器发挥作用，且可以发展出对GPCRs以及其它调节cAMP水平的蛋白质的基于完整细胞的荧光试验。

[0188]HEK-293细胞转染OCNC1[C458W/E581 FM]、OCNC2和β1b以及被丁子香酚活化激活的小鼠嗅觉受体mOREG(Kajiya等，2001)。转染细胞接种在多孔板上。48小时后，用钙染料对细胞染色1小时，随后漂洗，用荧光显微技术监测其对丁子香酚刺激的反应。丁子香酚引起转染细胞内荧光的增加；这一反应可能反映出由mOREG引发的内源性Gs和腺苷酸环化酶的依赖丁子香酚的活化作用，因为与单独转染CNG通道或单独转染mOREG的细胞相比较，可以确定这些反应具有CNG通道依赖性和mOREG依赖性(图9)。

[0189]实施例4开发稳定表达人类嗅觉CNG通道亚基OCNC1、OCNC2和β1b的细胞系

[0190]用三种人类嗅觉CNG通道亚基采用基于脂质的方案转染HEK-293细胞。转染72小时后加入适当选择性抗生素，并在选择步骤后3-5周的时间内回收单克隆。通过瞬时转染mOREG基因来筛选克隆活性，并在mOREG配体丁子香酚刺激后监测钙离子流入。

[0191]钙成像试验显示了对丁子香酚具有反应性的转染了人类CNG通道亚基的细胞的一些克隆。相反的，模拟转染细胞不具有可检测的对丁子香酚的反应。在超过20代后，表达和活性仍保持稳定。而且，稳定表达人类嗅觉CNG亚基的细胞对丁子香酚刺激具有更高的敏感性(图10)。因此，该构建的细胞系适用于针对CNG介导的钙传输的基于细胞的试验。

[0192]实施例5建立稳定表达人类嗅觉CNG通道亚基OCNC1[C458W/E581 M]和β1b的细胞系

[0193]用两种人类嗅觉CNG通道亚基OCNG1和β1b采用基于脂质的方案转染HEK-293细胞。转染72小时后加入适当选择性抗生素，并在选择步骤后3-5周的时间内回收单克隆。通过在细胞内瞬时转染mOREG基因，并在用mOREG配体丁子香酚刺激后监测钙离子流入来筛选克隆活性。

[0194]钙成像试验显示了对丁子香酚具有反应性的转染了人类CNG通道亚基的细胞的一些克隆。相反的，模拟转染细胞不具有可检测的对丁子香酚的反应。在超过20代后，表达和活性仍保持稳定。与转染野生型CNG亚基的细胞相反，转染OCNC1[C458W/E581 M]的细胞显示出对丁子香酚显著性的更高的反应。因此，该构建的细胞系适用于针对CNG介导的钙传输的基于细胞的试验。而且，该增高的敏感性使得细胞可用于对低亲和性激动剂或拮抗剂的筛选。

[0195]实施例6建立对稳定表达的人类嗅觉CNG通道亚基的高通量试验平台

[0196]在实验前24小时，将稳定表达人类嗅觉CNG通道的HEK-293细胞接种于FLIPR成像平板内，其中在平板上预先用基质凝胶(matrigel)涂覆了。用荧光钙染料对所述细胞染色1小时，漂洗，转移至应用板上流体力学的FLIPR自动化荧光板读取器。与其亲本细胞不同，稳定表达人类嗅觉CNG通道亚基的细胞在用异丙肾上腺素(isopeteranol)刺激β2受体后，表现出增高的荧光(图11a)。而且该细胞在用腺苷酸环化酶活化子毛喉素刺激后，同样显示出增高的荧光(图11b)。因此，该基于细胞的试验可用于高通量的应用。

[0197]实施例7建立对活性增强的、稳定表达的人类嗅觉CNG通道的高通量试验平台

[0198]在实验前24小时，将稳定表达活性增强的人类嗅觉CNG通道的HEK-293细胞接种于FLIPR成像平板内，其中在平板上预先用基质凝胶涂覆了。用荧光钙染料对所述细胞染色1小时，漂洗，转移至应用板上流体力学的FLIPR自动化荧光板读取器。与其亲本细胞和转染了野生型CHG亚基的细胞不同，稳定表达活性增强的人类嗅觉CNG通道亚基的细胞在用腺苷酸环化酶活化子毛喉素刺激后，显示出增高的荧光(图11b)。而且该细胞表现出与用异丙肾上腺素刺激β2受体后野生型CNG亚基相同的荧光(图11a)。因此，该基于细胞的试验可用于高通量的应用，特别是涉及低亲和性激动剂和拮抗剂的应用。

[0199]虽然通过实施例的方式对本发明进行了表述，但应将其理解为：此处使用的词汇只是说明性的词汇，而并非具有限制性含义的词汇。在所附的权利要求的范围内，在不超出本发明的更宽方面的范围和精神的情况下，可以作出改变。尽管此处引用特定手段、材料和实施方式对本发明进行描述，但应将其理解为本发明并不限于这些特定的公开。本发明可以扩展至所附权利要求内全部的等效结构、手段和用途。

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Claims (55)

1.一种细胞，其包含：编码人类OCNC1嗅觉CNG通道亚基的分离的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的多肽与SEQ ID NO：1所编码的多肽相同，或者与SEQ ID NO：1所编码的多肽相同，但是其编码的多肽中位点458的半胱氨酸变成了色氨酸和/或位点581的谷氨酰胺变成了甲硫氨酸；SEQ ID NO：3中所包含的编码β1b序列的核苷酸序列；和SEQ ID NO：2中所包含的编码OCNC2序列的核酸序列，其中当所述三个序列一起表达时，形成功能性的三聚体嗅觉环核苷酸门控(CNG)通道。

2.权利要求1的细胞，其中所述分离的OCNC1核苷酸序列具有在表达时能在位点458产生色氨酸的突变。

3.权利要求1的细胞，其中所述分离的OCNC1核苷酸序列还含有在表达时能在位点581产生甲硫氨酸的突变。

4.权利要求1的细胞，其中所述分离的OCNC1核苷酸序列包含在表达时能分别在位点458产生色氨酸和在位点581产生甲硫氨酸的两种突变。

5.一种CNG通道，其由权利要求1-4中任一项的细胞表达。

6.权利要求1-4中任一项的细胞，其选自MDCK、HEK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3和CHO细胞。

7.权利要求6的细胞，其是HEK293或HEK293T细胞。

8.权利要求1-4中任一项的细胞，其稳定地表达所述的每一种人类嗅觉CNG亚基。

9.权利要求1-4中任一项的细胞，其短暂地表达所述的每一种人类嗅觉CNG亚基。

10.一种基于哺乳动物细胞的高通量试验方法，其用于表征和筛选人类嗅觉环核苷酸门控(CNG)通道的推定的调节子，该方法包括：

(i)将权利要求1-4任一项的表达功能性嗅觉CNG离子通道的测试细胞与推定的CNG离子通道调节子化合物接触，其中所述测试细胞加载有膜电位荧光染料；和

(ii)监控存在推定的调节子化合物时测试细胞的荧光相对于不存在该调节子时的荧光的变化，从而确定所述化合物是否为人类CNG通道调节子。

11.权利要求10的试验方法，其中所述测试细胞选自MDCK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、SWISS3T3和CHO细胞。

12.权利要求11的试验方法，其中所述测试细胞是HEK293或HEK293T细胞。

13.权利要求11的试验方法，其中所述测试细胞接种于多孔检测平板的孔中。

14.权利要求13的试验方法，其中将所述推定的调节子化合物加至所述测试板的孔中。

15.一种基于细胞的高通量试验方法，其用于表征和筛选人类嗅觉环核苷酸门控(CNG)通道的推定的调节子，所述方法包括：

(i)将权利要求1-4中任一项的表达功能性嗅觉CNG通道的测试细胞或分离的细胞膜与推定的CNG通道调节子化合物接触；和

(ii)检测所述化合物对CNG通道功能是否具有调节作用。

16.权利要求15的试验方法，其中通过荧光测定法检测所述推定的CNG通道调节子的作用。

17.权利要求15的试验方法，其中通过电生理学方法检测所述推定的CNG通道调节子的作用。

18.权利要求15的试验方法，其中所述测试细胞选自MDCK、HEK293、HEK293T、BHK、COS、NIH3T3、SWISS3T3和CHO细胞。

19.权利要求18的试验方法，其中所述测试细胞是HEK293细胞。

20.权利要求18的试验方法，其中所述测试细胞是HEK293T细胞。

21.权利要求15的试验方法，其中所述测试细胞接种于多孔检测平板。

22.权利要求21的试验方法，其中所述测试细胞是分离的，并带有对荧光变化发生响应的膜电位染料。

23.权利要求22的试验方法，其中所述膜电位染料是荧光钙螯合剂或荧光钠螯合剂。

24.权利要求15的试验方法，其使用分离的测试细胞膜。

25.权利要求15的试验方法，其进一步包括使用腺苷酸环化酶活化子以提高细胞内cAMP。

26.权利要求15的试验方法，其进一步包括使用鸟苷酸环化酶活化子以提高细胞内cGMP。

27.权利要求15的试验方法，其进一步包括使用磷酸二酯酶抑制剂以提高细胞内cAMP或cGMP。

28.权利要求15的试验方法，其使用膜可透过性的环核苷酸类似物以激活嗅觉CNG通道。

29.权利要求15的试验方法，其中所述测试细胞还表达选自G蛋白偶联受体、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶的影响胞内环核苷酸水平的物质，或者调节胞内环核苷酸水平的其它物质。

30.权利要求29的试验方法，其用于鉴定调控某些部分的分子，所述部分能调节胞内环核苷酸水平，其中所述部分选自G蛋白偶联受体、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶或调节胞内环核苷酸水平的其它蛋白。

31.权利要求30的试验方法，其中所述测试细胞表达GPCR，并且所述试验方法鉴定所述GPCR的调节子。

32.权利要求31的试验方法，其中所述GPCR是嗅觉受体。

33.权利要求32的试验方法，其中所述GPCR是内源表达的。

34.权利要求33的试验方法，其中所述GPCR是通过重组手段引入的。

35.权利要求1-4中任一项的细胞，其中所述细胞还表达调节胞内环核苷酸水平的其它部分，所述部分选自G蛋白偶联受体、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶或调节胞内环核苷酸水平的其它蛋白。

36.权利要求35的细胞，其中所述环核苷酸选自cAMP和cGMP。

37.权利要求36的细胞，其中所述细胞是真核细胞。

38.权利要求37的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

39.权利要求38的细胞，其中所述细胞是人类细胞。

40.权利要求39的细胞，其中所述细胞是HEK293细胞。

41.监控环核苷酸激活的运输的方法，包括：

(i)将权利要求35-40中任一项的细胞与推定调节环核苷酸水平的化合物接触；和

(ii)监控胞内环核苷酸浓度的变化。

42.权利要求41的方法，其中所述化合物激活腺苷酸或鸟苷酸环化酶。

43.权利要求41的方法，其中所述化合物为毛喉素。

44.权利要求41的方法，其中所述化合物激活G-蛋白。

45.权利要求41的方法，其中所述化合物是异丙肾上腺素。

46.权利要求41的方法，其监控cAMP或gAMP水平。

47.权利要求41的方法，其监控胞内钙或钠。

48.一种基于其对环核苷酸激活的运输的作用来间接鉴定化合物的方法，所述化合物结合受体并活化G蛋白，所述方法包括：

(i)将权利要求35-40中任一项的细胞与推定结合受体并因此激活G蛋白的化合物接触；和

(ii)通过监控所述化合物对胞内离子浓度的作用来检测所述化合物是否调节所述受体。

49.权利要求48的方法，其中所述受体是所述细胞内源表达的。

50.权利要求48的方法，其中编码所述受体的核酸序列是通过重组手段引入所述细胞的。

51.权利要求49或50的方法，其中所述受体是GPCR。

52.权利要求51的方法，其中所述受体是β2肾上腺素能受体。

53.权利要求51的方法，其中所述GPCR是嗅觉受体。

54.权利要求53的方法，其中所述嗅觉受体是小鼠嗅觉受体mOREG。

55.权利要求51的方法，其中所述GPCR是被所述细胞稳定表达的。

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