CN1422281A - 新型g蛋白偶联受体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在乳腺癌细胞中扩增的四种新型G蛋白偶联受体的分离的核酸和氨基酸序列、针对这些受体的抗体、检测这些核酸和受体的方法以及筛选G蛋白偶联受体的调节剂的方法。

Description

新型G蛋白偶联受体

相关申请参考

本申请要求2000年3月14日递交的USSN09/524,730的权益，在此以其全文引作参考。关于根据联邦政府资助的研发项目提出的发明权的声明

非适用

发明领域

本发明提供了在乳腺癌细胞中扩增的四种新型G蛋白偶联受体的分离的核酸和氨基酸序列、针对这些受体的抗体、检测这些核酸和受体的方法以及筛选G蛋白偶联受体的调节剂的方法。

发明背景

G蛋白偶联受体是间接地将胞外信号转导给下游效应物的细胞表面受体，这些效应物可以是胞内的信号蛋白、酶或通道，然后，这些效应物活性的变化介导了随后的细胞事件。受体和下游效应物的相互作用是G蛋白介导的，G蛋白是结合GTP的异源三体蛋白。G蛋白偶联受体(“GPCR”)通常具有七个跨膜区以及胞外区和C末端的胞质尾区。这些受体形成了相关受体分子大的超家族，这些受体分子在许多信号过程，如感觉传导和激素信号转导中起关键作用。例如，嗅觉GPCR的大家族已经得到鉴定(参见，例如Buck和Axel，Cell 65：175-187(1991)。进一步鉴定GPCR对于理解正常的信号转导过程以及它参与的病理过程是重要的。例如，GPCR可以用于疾病的诊断和药物的发现。所以进一步鉴定新型GPCR是非常有趣的。

发明概述

本发明首次提供了编码G蛋白偶联受体的四种新型核酸，所述G蛋白偶联受体在乳腺癌细胞中扩增和/或过度表达。这些核酸和它们编码的多肽称为“乳腺癌扩增G蛋白偶联受体”或“BCA-GPCR”，即“BCA-GPCR-1”、“BCA-GPCR-2”、“BCA-GPCR-3”和“BCA-GPCR-4”。这些BCA-GPCR是细胞中信号转导途径成分，可以用于诊断癌症，特别是乳腺癌，以及用于治疗化合物的筛选分析，例如用于治疗癌症。例如，针对BCA-GPCR-3的抗体和拮抗物可以用于癌症的治疗。

在一个方面，本发明提供了编码G蛋白偶联受体多肽的分离的核酸，由所述核酸编码的所述多肽含有与氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8有70％以上的氨基酸同一性。

在另一方面，本发明提供了编码G蛋白偶联受体多肽的分离的核酸，其中该核酸在严格杂交条件下与具有核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核酸特异性杂交。

在另一方面，本发明提供了编码G蛋白偶联受体多肽的分离的核酸，由所述核酸编码的所述多肽与氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多肽有约70％以上的氨基酸同一性，其中该核酸在适度严格杂交条件下与核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7选择性杂交。

在另一方面，本发明提供了含有编码本发明G蛋白偶联受体的分离的核酸的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

在一个实施方案中，核酸含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列。在另一实施方案中，该核酸来自人、小鼠或大鼠。在另一个实施方案中，该核酸通过在严格杂交条件下与和选自下组的引物对相同的序列特异性杂交的引物扩增：

ATGTTGGGGAACGTCGCCATC(SEQ ID NO：9)和

TCATCCACAGAGCCTCCAGAT(SEQ ID NO：10)；

ATGGGAAAGGACAATCCAGTT(SEQ ID NO：11)和

CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA(SEQ ID NO：12)；

ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC(SEQ ID NO：13)和

TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG(SEQ ID NO：14)；

和

ATGGTGAGACATACCAATGAGAG(SEQ ID NO：15)和

CATAAAATATTTACTCCCAGAGCC(SEQ ID NO：16)

在另一方面，本发明提供了分离G蛋白偶联受体多肽，该多肽含有与氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8有约70％以上的氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，该多肽与针对SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或它们的免疫原部分所产生的多克隆抗体特异性结合。在另一个实施方案中，多肽是来自人、大鼠或小鼠。在另一个实施方案中，多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或它们的免疫原部分。

在一个实施方案中，多肽具有G蛋白偶联受体的活性。

在另一方面，本发明提供了与分离G蛋白偶联受体多肽结合的抗体，该多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8有约70％以上的氨基酸序列同一性。

在另一方面，本发明提供鉴定调节BCA-PCR的信号转导的化合物的方法，该方法包括如下步骤：(i)将化合物与多肽接触，所述多肽与氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8有70％以上的氨基酸序列同一性；和(ii)在多肽的基础上确定化合物的功能效应。

在一个实施方案中，多肽与固相连接。在另一个实施方案中，多肽与固相共价连接。

在一个实施方案中，通过检测胞内cAMP、IP3或Ca²⁺的变化确定功能效应。在另一个实施方案中，功能效应是化学效应或物理效应。在另一个实施方案中，功能效应是通过检测化合物和多肽的结合来确定的。

在一个实施方案中，多肽是重组的。在另一个实施方案中，多肽是在细胞或细胞膜例如真核细胞或细胞膜中表达的。

在另一个方面中，本发明提供了治疗癌症的方法，所述方法包括下列步骤：将癌细胞与治疗有效量的经如上所述的方法鉴定的化合物接触。

在一个实施方案中，癌是乳腺癌。

在另一个实施方案中，化合物是多肽的拮抗剂，所述多肽具有与氨基酸序列SEQ ID NO：6有70％以上的氨基酸同一性。

在另一个方面中，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法包括下列步骤：将癌细胞与治疗有效量的抗体接触，所述抗体与多肽特异性结合，所述多肽与氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8有70％以上的氨基酸同一性。

在一个实施方案中，抗体与多肽特异性结合，所述多肽与氨基酸序列SEQ ID NO：6有70％以上的氨基酸同一性。

在另一方面中，本发明提供了在人组织中检测BCA-GPCR核酸或多肽存在的方法，该方法包括下列步骤：(i)分离生物样品，(ii)将生物样品与选择性结合BCA-GPCR核酸或多肽的BCA-GPCR特异试剂接触；和(iii)检测选择性结合样品的BCA-GPCR特异试剂的水平。

在一个实施方案中，BCA-GPCR特异试剂选自下组：BCA-GPCR特异抗体、BCA-GPCR特异寡核苷酸引物和BCA-GPCR特异核酸探针。

在另一个实施方案中，组织是乳腺癌组织。

在另一方面，本发明提供了制备G蛋白偶联受体多肽的方法，该方法包括下列步骤：从含有编码该多肽的核酸的重组表达载体中表达多肽，其中多肽的氨基酸序列与具有氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多肽有约70％以上的氨基酸同一性。

在另一方面，本发明提供了制备含有G蛋白偶联受体多肽的重组细胞的方法，该方法包括下列步骤：用含有编码多肽核酸的表达载体转导细胞，其中多肽的氨基酸序列与具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多肽有约70％以上的氨基酸同一性。

附图简述

图1：BCA-GPCR-3基因拷贝扩增的乳腺癌肿瘤和细胞系；

图2：在乳腺癌细胞系中BCA-GPCR-3mRNA过度表达；

图3：在乳腺癌细胞系中BCA-GPCR-3mRNA过度表达的定量数据。

发明详述

前言

本发明第一次提供了编码四种新型G蛋白偶联受体的核酸。这些核酸和他们编码的受体分别命名为BCA-GPCR-1、2、3和4。这些BCA-GPCR是信号转导途径的成分，并且与乳腺癌细胞中扩增的基因组区域相关。这些核酸对于鉴定乳腺癌细胞提供了有价值的探针，因为这些核酸在某些乳腺癌细胞中特异性扩增，或是非常靠近(在100kb内)或是在乳腺癌细胞中特异性扩增和/或过度表达的区域。可以用如逆转录和mRNA扩增、总RNA或poly A⁺ RNA的分离、RNA印迹法、斑点印迹法、原位杂交、核糖核酸酶保护、SI消化、探测DNA微芯片阵列等技术来鉴定编码本发明BCA-GPCR的核酸。

这些基因在染色体上的座位已经确定，所有四个基因都定位在染色体1q44上，方向如下：从着丝粒端开始，5’到3’链：BCA-GPCR-1(3’-5’方向)；约40kb；BCA-GPCR-2(5’-3’方向)；约40kb；BCA-GPCR-3，(3’-5’方向)；约60kb；BCA-GPCR-4(5’-3’方向)，在端粒端结束。这些编码人BCR-GPCR的基因可以用于鉴定由BCA-GPCR引起并相关的疾病、突变和特征，如癌症，例如乳腺癌。本发明的BCA-GPCR也用于癌症的诊断，尤其是乳腺癌的诊断。

新型BCA-GPCR的分离提供了测试和鉴定G蛋白偶联受体信号转导的调节剂的方法，这些调节剂例如激活剂、抑制剂、刺激剂、增强子、激动剂和拮抗剂。这些信号转导的调节剂可以用于信号途径的药物调节，例如，在癌细胞如乳腺癌中。用BCA-GPCR鉴定的激活剂和抑制剂也可以用于进一步研究信号转导。所以，本发明提供了信号转导调节的分析，其中BCA-GPCR在调节剂对信号转导的效应中充当直接或间接的报道分子。BCA-GPCR可以用于体外和体内的分析，例如用于检测GPCR转录激活的变化、配体结合、磷酸化和脱磷酸化、GPCR与G蛋白的结合、G蛋白的激活、调节分子结合、电压，膜位和电导变化、离子流通量、细胞内第二信使如cAMP和肌醇三磷酸的变化、细胞内钙水平的变化和神经递质的释放。

分析信号转导的调节剂的方法包括体外配体结合分析，该分析利用了BCA-GPCR、其部分如胞外结构域或含有一种或多种GPCR结构域的嵌合蛋白、天然存在的或重组的卵母细胞GPCR的表达或组织培养细胞GPCR表达、天然存在或重组的GPCR的膜表达、GPCR的组织表达、转基因动物中的GPCR的表达等。

从功能上来说，BCA-GPCR代表了G蛋白偶联受体家族的七个跨膜的G蛋白偶联受体，他们与G蛋白相互作用以介导信号转导(参见，例如Fong，Cell Signal 8：217(1996)；Baldwin，Curr.Opin.Cell Biol.6：180(1994))。编码BCA-GPCR的基因是在染色体1q44上，并且与在乳腺癌细胞中扩增的区域相关。

从结构上来说，人BCA-GPCR-1的核苷酸序列(参见，例如SEQ IDNO：1)编码分子量预测约为31kDa和预测范围为26-36kDa的多肽(参见，例如SEQ ID NO：2)。来自其他种类的相关GPCR-1基因在至少25个氨基酸长度，或者50-100个氨基酸长度的氨基酸区域应该享有至少约70％的氨基酸同一性。

本发明也提供了在SEQ ID NO：1中描述的BCA-GPCR-1的多态变体：变体#1，其中在从甲硫氨酸开始的氨基酸位置7，用亮氨酸取代亮氨酸残基；变体#2，其中在从甲硫氨酸开始的氨基酸位置142，用天冬氨酸残基取代谷氨酸残基；和变体#3，其中在从甲硫氨酸开始的氨基酸位置6，用甘氨酸残基取代丙氨酸残基。

从结构上来说，人BCA-GPCR-2的核苷酸序列(参见，例如SEQ IDNO：3)编码了分子量预测约37kDa和预测范围为32-42kDa的多肽(参见，例如SEQ ID NO：4)。来自其他种类的相关BCA-GPCR-2基因在至少约25个氨基酸长度或者50-100个氨基酸长度的氨基酸区域应该享有至少约70％的氨基酸同一性。BCA-GPCR-2在15％的原发性乳腺瘤和肿瘤细胞系中扩增了至少约2-3倍。

本发明也提供了SEQ ID NO：4中描述的BCA-GPCR-2的多态变体：变体#1，其中在氨基酸位置9用异亮氨酸残基取代亮氨酸残基；变体#2，其中在氨基酸位置19用谷氨酸残基取代天冬氨酸残基；和变体#3，其中在氨酸位置6用甘氨酸残基取代丙氨酸残基。

从结构上来看，人BCA-GPCR-3的核苷酸序列(参见，例如在胎盘和睾丸中表达的SEQ ID NO：5)编码了分子量预测约为37kDa和预测范围为32-42kDa的多肽(参见，例如SEQ ID NO：6)。来自其他种类的相关BCA-GPCR-3基因在至少约25个氨基酸长度或者50-100个氨基酸长度的氨基酸区域应该享有至少约70％的氨基酸同一性。BCA-GPCR-3在约15％的原发性乳腺瘤和肿瘤细胞系中扩增至少约3-7倍(参见图1)。另外，在两个已扩增和未扩增肿瘤的乳腺癌细胞系中BCA-GPCR-3 mRNA的水平提高了(参见图2-3)。

本发明也提供了SEQ ID NO：6中描述的BCA-GPCR-3的多态变体：变体#1，其中在氨基酸位置8用异亮氨酸残基取代亮氨酸残基；变体#2，其中在氨基酸位置73用谷氨酸残基取代天冬氨酸残基；和变体#3，其中在氨基酸位置7用甘氨酸残基取代丙氨酸残基。

从结构上来看，人BCA-GPCR-4的核苷酸序列(参见，例如SEQ IDNO：7)编码了分子量预测约37kDa和预测范围为32-42kDa的多肽(参见，例如SEQ ID NO：8)。来自其他种类的相关BCA-GPCR-4基因在至少约25个氨基酸长度或者50-100个氨基酸长度的氨基酸区域应该享有至少约70％的氨基酸同一性。BCA-GPGR-4在15％的原发性乳腺瘤和肿瘤细胞系中扩增了至少约2-3倍。

本发明也提供了SEQ ID NO：8描述的BCA-GPCR-4的多态变体：变体#1，其中在氨基酸位置7用异亮氨酸残基取代亮氨酸残基；变体#2，其中在氨基酸位置13用天冬氨酸残基取代谷氨酸残基；和变体#3，其中在氨基酸位置10用甘氨酸残基取代丝氨酸残基。

可以用BCA-GPCR核苷酸和氨基酸序列的特异区域鉴定多态变体、种间同系物和BCA-GPCR的等位基因。鉴定可以在体外进行，例如在严格杂交条件下或PCR(利用与SEQ ID NO：1、3、5和7杂交的引物，例如SEQ ID NO：9-16)和测序，或利用计算机系统将序列信息和其他核苷酸序列进行比较。通常，BCA-GPCR的多态变体和等位基因的鉴定是通过比较约25个氨基酸或更多，例如50-100个氨基酸的氨基酸序列来进行的。氨基酸的同一性至少约为70％或以上，或者75％、80％、85％或90-95％或以上通常可证明蛋白是BCA-GPCR的多态变体、种间同系物或等位基因。序列比较可以利用如下所述的BLAST和BLAST2.0序列比较算法和缺省参数来进行。与BCA-GPCR或其保守区特异性结合的抗体也可以用于鉴定等位基因，种间同系物和多态变体。多态变体、等位基因和种间同系物预料保留七个G蛋白偶联受体的跨膜结构。

BCA-GPCR核苷酸和氨基酸序列的信息也可用于计算机系统中构建BCA-GPCR模型。这些模型随后用于鉴定可以激活和抑制BCA-GPCR的化合物。这些调节BCA-GPCR活性的化合物可用于研究BCA-GPCR在信号转导中的作用。定义

“BCA-GPCR”和“BCA-GPCR-1、2、3或4”指新型G蛋白偶联受体，定位于染色体1q44并且与在乳腺癌细胞中扩增的染色体区域相关的基因。本发明的BCA-GPCR具有七个跨膜区并具有“G蛋白偶联受体活性”，例如，它们应答胞外刺激而结合G蛋白和通过刺激下游效应物如磷脂酶C和腺苷酸环化酶来促进第二信使如IP3、cAMP和Ca²⁺的生产(GPCR结构和功能的描述参见，例如Fong，同上和Baldwin，同上)。

从拓扑学上看，BCA-GPCR具有N末端“胞外结构域”、含有7个跨膜区和对应胞质和胞外环的“跨膜结构域”以及C末端的“胞质结构域”(参见，例如Buck和Axel，Cell 65：175-187(1991))。这些结构域可以用本领域技术人员已知的方法，如鉴定疏水和亲水区域的序列分析程序来鉴定(参见，例如Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157：105-132(1982))。这些结构域可以用于制备嵌合蛋白和本发明的体外分析。

“胞外结构域”是指从细胞膜中突出并且经常与细胞外配体结合的BCA-GPCR结构域。该结构域经常用于可溶和固相的体外配体结合鉴定。

“跨膜结构域”包括七个跨膜区，外加对应的胞质和胞外环。跨膜结构域的某些区域也可能参与配体的结合。

“胞质结构域”指在第7个跨膜区后突入细胞质并且连续到多肽C末端BCA-GPCR中的结构域。

“GPCR活性”是指GPCR转导信号的能力。此活性可以例如在异源细胞中通过将GPCR(或嵌合GPCR)与G蛋白和下游效应物如PLC偶联，然后检测胞内钙水平的增加来检测(参见，例如Offermans和Simon，J.Biol.Chem.270：15175-15180(1995))。利用荧光Ca²⁺指示染料和荧光计成象，通过记录[Ca²⁺]中配体诱导的变化可有效检测受体的活性。

术语“BCA-GPCR”和“BCA-GPCR-1、2、3或4”是指多态变体、等位基因、突变体和种间同系物及其BCA-GPCR结构域，它们(1)与SEQ ID NO：2、4、6或8，在约25个氨基酸优选50-100个氨基酸的窗口上约有70％的氨基酸序列同一性，优选约75、80、85、90或95％或更高的氨基酸序列的同一性；(2)与针对免疫原产生的抗体结构，所述免疫原含有SEQ ID NO：2、4、6或8的氨基酸序列及其保守修饰变体；或(3)在严格杂交条件下与序列SEQ ID NO：1、3、5或7及其保守修饰变体特异性杂交(大小至少为100，优选至少约500或1000个核苷酸)。该术语也称为如上所述的BCA-GPCR结构域，或含有与异源蛋白连接的BCA-GPCR结构域的融合蛋白。

“宿主细胞”是含有表达载体并且支持表达载体复制或表达的天然存在的细胞或转化细胞。宿主细胞可以是培养细胞、外植体、体内细胞等。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞如CHO、Hela等。

本发明所用的“生物样品”是指含有新型BCA-GPCR核酸或多肽的生物组织或流体的样品。这些样品包括但不限于从人、小鼠和大鼠中分离的组织。生物样品也可包括组织切片如为组织学目的而取出的冷冻切片。生物样品通常获自真核生物，如昆虫、原生动物、鸟类、鱼类、爬行动物，和优选哺乳动物如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或兔，以及最优选灵长类动物如黑猩猩或人。优选的组织包括例如正常的前列腺上皮组织、胎盘和睾丸组织。

短语“功能效应”在测试调节BCA-GPCR介导的信号转导的化合物实验中包括确定间接或直接受到BCA-GPCR影响的任何参数，例如功能性、物理或化学效应。其包括配体结合、离子流通量的变化、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、基因扩增、癌细胞中的表达、GPCR的磷酸化或脱磷酸化、信号转导、受体-配体的相互作用、体外、体内和离体的第二信使浓度(例如cAMP、cGMP、IP3或胞内Ca²⁺)，也可以包括其他生理效应如神经递质或激素释放的增加或降低。

“确定功能效应”是指分析化合物的效应，所述化合物增加或减少直接或间接受到BCA-GPCR影响的参数，如功能效应、物理效应和化学效应。这些功能性效应可以用本领域技术人员已知的方法测定，如利用光谱特征的变化(如荧光、吸光率、折射率)、流体动力学(如形态)、色谱或溶解特性、膜片钳、电压敏感染料、全细胞电流、放射性同位素流、可诱导标记、BCA-GPCR转录激活、配体结合分析、电压、膜电位和电导率变化、离子流通量分析、胞内第二信使如cAMP和肌醇三磷酸(IP3)的变化、胞内钙水平的变化、神经递质的释放等。

BCA-PGCR的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”交互使用，意指经过对信号转导采用体外和体内测定所鉴定的抑制、激活或调节的分子，例如配体、激动剂、拮抗剂和它们的同系物和模拟物。抑制剂是例如结合、部分或全部阻断刺激、降低、预防、延迟活化、失活、脱敏或负调节信号转导的化合物，如拮抗剂。激活剂是例如结合、刺激、增加、打开、激活、促进、增强活化、致敏或上调节信号转导的化合物，如兴奋剂。调节剂包括例如改变多肽与胞外蛋白相互作用的化合物，所述胞外蛋白结合激活剂或抑制剂、G蛋白、G蛋白α、β和γ亚基以及激酶。调节剂也包括经遗传修饰的BCA-GPCR版本，例如具有活性改变以及天然发生和合成配体、拮抗剂、激动剂、抗体、化学小分子等的BCA-GPCR。对抑制剂和激活剂的这些分析包括例如，在细胞或细胞膜中体外表达BCA-GPCR，利用公认的调节剂化合物，然后如上所述确定对信号转导的功能效应。

含有BCA-GPCR的样品或分析，经潜在激活剂、抑制剂或调节剂处理后，与没有抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品比较，从而检测抑制程度。将对照样品(未用抑制剂处理)的相对BCA-GPCR活性值赋值100％。当BCA-GPCR活性值相对于对照约为80％，优选50％，更优选25-0％时，实现BCA-GPCR的抑制。当BCA-GPCR活性值相对于对照(未用激活剂处理)为110％，更优选150％，更优选200-500％(即相对于对照高出2-5倍)或更优选1000-3000％以上时，实现BCA-GPCR的活化。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯”是指实质上或基本上没有如天然状态所发现的通常相伴的成分的物质。纯度和同质性的确定通常采用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高压液相色谱。存在于制剂中的优势种类蛋白是基本纯的。具体而言，分离的BCA-GPCR核酸从位于BCA-GPCR基因侧翼并编码除BCA-GPCR以外的蛋白的可读框中分离。术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中基本产生一条带。具体地，其表示核酸或蛋白的纯度至少85％，优选至少95％以及最优选至少99％。

“生物活性的”BCA-GPCR指如上所述的具有信号转导活性和G蛋白偶联受体活性的BCA-GPCR。

“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其多聚体。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，其可以是合成、天然存在和非天然存在，与标准核酸具有相似的结合特性，并且以与标准核苷酸相似的方式代谢。这些类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酸酰胺、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸盐、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。

除非另有所指，特定核酸序列也暗含其保守修饰的变体(如简并密码子替换)和互补序列，以及明示的序列。具体而言，通过生成序列可实现简并密码子替换，在所述序列中，一个或多个选定的(或全部)密码子的第3个位置用混合的碱基和/或脱氧肌苷残基替换(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸交互使用。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本发明中可交互使用，用来指氨基酸残基的多聚体。这些术语适用于这样的氨基酸多聚体，即其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸多聚体和非天然存在的氨基酸多聚体。

术语“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的一些化合物，即与氢结合的α碳、羧基基团、氨基基团和R基团，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指其结构与氨基酸一般化学结构不同，但其作用方式类似于天然存在的氨基酸的一些化合物。

氨基酸在本发明中可参照共知的三字母符号或参照用IUPAC-IUB生化命名委员会建议的单字母符号。同样，核苷酸也可以参照普遍接受的单字母密码表示。

“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定核酸序列，保守性修饰变体是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者指基本相同的核酸序列，如果该核酸不编码氨基酸序列。由于遗传密码简并，很多功能性相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在每个由密码子所规定的丙氨酸的位置上，可将密码子改变成任何所述的对应密码子，而不改变所编码的多肽。这些核酸变化称为“沉默替换”或“沉默变异”，其是一类“保守性修饰变异”。本发明所述的每个编码多肽的多核苷酸序列也描述每种可能的沉默变异，除了另有标注以外。因此，沉默替换是每个编码氨基酸的核酸序列暗含的特征。专业技术人员将认识到通过标准技术将核酸中各个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子AUG和色氨酸的唯一密码子TGG以外)可经修饰产生功能性相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变异在各个描述的序列中是暗含的。

至于氨基酸序列，专业技术人员将认识到核酸、肽、多肽或蛋白序列中个别替换、缺少或添加，可变更、添加或缺失编码序列中单一氨基酸或小百分比的氨基酸，是保守性修饰变体，其中变更导致用化学相似的氨基酸替换某种氨基酸。保守替换表提供了功能相似的氨基酸，为本领域所熟知。这些保守修饰变体除上述之外，不排除本发明的多态变体、种内同系物以及等位基因。

下列8组中每组都含有对另一氨基酸是保守替换的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)

(参见，如Creighton，Proteins(1984))。

根据各层次结构，可描述如多肽结构的大分子结构。对此结构的综述，参见，如Albets等，Molecular Biology ofthe Cell(第3版，1994)以及Cantor和Schimmel，Biophysical Chemistry Part I：TheConformation of Biological Macromolecules(1980)。“一级结构”指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指多肽内局部有序的三维结构。这些结构通常被认作结构域。结构域是形成多肽的紧密单元多肽部分，长度通常有25-约500个氨基酸。典型的结构域由次级结构如β-折叠和α-螺旋部分组成。“三级结构”指多肽单体完整的三维结构。“四级结构”指由独立的三级单元非共价缔合组成的三维结构。各向异性术语也称为能量术语。

“标记”或“可检测部分”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的组合物。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子密试剂、酶(如在ELISA中通常所用的酶)、生物素、地高辛配基或肝素和可检测ant或7的蛋白，如将放射性标记掺入所述肽，并用于检测与所述肽特异性反应的抗体。

“标记核酸探针或寡核苷酸”是一种通过接头或化学键共价结合，或通过离子、范德华、静电或氢键非共价与标记结合的核酸或寡核苷酸，这样通过检测与探针结合的标记的存在就可检测探针的存在。

如本发明所用的“核酸探针或寡核苷酸”定义为通过一种或多种类型的化学键，通常互补碱基配对或形成氢键，能够与互补序列的靶核酸结合的核酸。如本发明所用的探针可包括天然碱基(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外，探针中的碱基可通过除磷酸二酯键以外的键连接，只要其不干扰杂交。因此，例如，探针可以是肽核酸，其中组成型碱基通过肽键连接而非以磷酸二酯键连接。本领域专业技术人员将会理解，探针可与探针序列缺乏完全互补性的靶序列结合，取决于杂交条件的严格性。探针任选直接标记，如用同位素、生色团、发光团、色原标记，或间接标记，如采用后来可与链亲和素复合体结合的生物素标记。通过对探针存在与否的分析，人们可检测选择序列或亚序列的存在与否。

术语“重组”当用于涉及例如细胞或核酸、蛋白或载体时表示细胞、核酸、蛋白或载体已被异源核酸或蛋白的导入或天然核酸或蛋白的变更所修饰，或表示细胞是经过如此修饰的细胞衍生来的。因此，例如重组细胞表达细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或者表达那些异常表达、低水平表达或根本不表达的天然基因。

术语“异源”当用于有关核酸部分时表示核酸包含两种或更多种自然界中相互之间未发现关系相同的亚序列。例如，通常核酸经重组产生，具有两种或更多种来自不相关基因的序列，这些不相关基因排列成新的功能性核酸，例如来自一种源的启动子和来自另一种源的编码区。同样，异源蛋白表示蛋白包含自然界中相互之间未发现关系相同的两种或多种亚序列(如融合蛋白)。

“启动子”定义为指导核酸转录的核酸控制序列的排列。如本发明所用的启动子包括在靠近转录起始位点的必需核酸序列，例如在聚合酶II启动子情况下的TATA元件。启动子也任选包括远端的增强子或阻遏元件，其可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对。“组成型”启动子在大多数环境和发育条件下是活泼的。“可诱导”启动子在环境或发育调节下是活泼的。术语“可操作连接”是指介于核酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点的排列)和第二核酸序列之间的功能键合，其中表达控制序列指导与第二序列相对应的核酸转录。

“表达载体”是核酸构建体，由重组或合成产生，具有一系列指定核酸元件，这些元件允许特定核酸在宿主细胞中的转录。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的部分。表达载体通常包括与启动子可操作连接、有待转录的核酸。

术语“相同的”或百分数的“同一性”在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，指两种或更多种序列或亚序列是相同的，或具有规定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即当在比较窗口和指定区域上对最大对应性进行比较和序列对比时，在指定区域上有约70％同一性，优选75％、80％、85％、90％或95％同一性，正如利用BLAST或BLAST2.0序列比较算法和下述的缺省参数或通过手工对比和肉眼观察所测定。这些序列可以说是“基本相同的”。该定义也指测试序列的补码(compliment)。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及那些具有替换的序列。如下所述，优选算法可说明间隙等。同一性优选存在于长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域，更优选在长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

对于序列比较，通常把一种序列充当标准序列来比较测试序列。当利用序列比较算法时，将测试和标准序列都输入计算机，如果需要，设定亚序列座标，然后设定序列算法程序参数。可采用缺省的程序参数，或者设定选择参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于标准序列的序列同一性百分数。

如本发明所用，“比较窗口”包括涉及任何一个数目的邻接位置的区段，数目选自20-600，通常约50-约200，更通常是约100-约150，其中在两个序列最佳对比后，可将一个序列与相同数目邻接位置的标准序列比较。序列对比比较方法是本领域熟知的。通过Smith和Waterman在Adv.Appl.Math.2：482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch在J.Mel.Biol.48：443(1970)中的同源性序列对比算法、Pearson和Lipman在Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)中的相似性方法的研究、这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传基因软件包GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或通过手工对比和肉眼观察(参见，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编，1995年增刊)，可以进行最佳序列对比比较。

适于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的优选例子是BLAST和BLAST2.0算法，其在Altschul等，Nuc.Acids Res.25：2389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中分别有描述。采用BLAST和BLAST2.0以及本发明所述的参数对本发明的核酸和蛋白的序列同一性百分数进行确定。BLAST分析的软件可以公开地从国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。该算法包括通过鉴定欲查询序列中的短长度W字码首先鉴定高得分序列对(HSP)，与数据库序列中相同长度的字码进行对比时，它们可匹配或满足一些正的阈值分T。T称为邻近字码得分阈值(Altschul等，同上)。这些初始邻近字码命中作为起始检索的种子以发现含有它们的更长的HSP。字码命中可沿着各个序列在两个方向上延伸，直到累积对比得分增加。对于核苷酸序列，累积得分可以利用参数M(匹配残基对的奖分；总是大于0)和N(错配残基的罚分；总是小于0)来计算。对于氨基酸序列，采用得分矩阵计算累积得分。当累积对比得分以数量X从其最大获得值下降时；当由于积累了一个或多个负的得分残基对比，累积得分趋向零或以下时；或当每个序列达到终点时，各方向的字码命中就暂时终止。BLAST算法参数W、T和X决定了序列对比的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)采用字码长度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4作为缺省参数，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用字码长度3和期望值(E)10作为缺省参数，以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))采用对比(B)50、期望值(E)、10、M＝5、N＝-4作为参数，并比较两条链。

BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个测量值是最小概率和(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然出现的概率的指征。例如，如果在测试核酸和标准核酸的比较中，最小概率和小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，那么该核酸就可视为与标准序列相似。

有用算法的另一个例子是PILEUP。PILEUP利用了渐进式成对的序列对比，从一组相关序列产生多个序列对比以表明相互的关系和序列同一性百分数。PILEUP还绘出了世系图或树状图(dendogram)，表示用于产生序列对比的成簇关系。PILEUP简化了Feng和Doolittle在J.Mol.Evol.，35：351-360(1987)中所述的渐进式序列对比方法。该方法与Higgins和Sharp在CABIOS 5：151-153(1989)中所述的方法相似。该程序可以对比多至300个序列，每个序列最大长度为5000个核苷酸或氨基酸。多重序列对比程序是从两个最相似的序列成对对比开始的，产生了两个已对比序列的簇。然后将这簇与下一个最相关序列或已对比序列的簇进行对比。通过两个单个序列成对对比的简单延伸可以对比两个序列簇。通过一系列渐进式成对序列对比可以完成最后的对比。通过设定序列比较区域指定的序列和它们的氨基酸或核苷酸座标和设定程序参数可以运行程序。利用PILEUP，将标准序列和其他测试序列比较，可以确定序列同一性关系百分数，其中利用了下面的参数：缺省间距权值(3.00)、缺省间距长度权值(0.10)和权值末端间距。PILEUP可以从GCG序列分析软件包例如7.0版本得到(Devereaux等，Nuc.Aciols Res.，12：387-395(1984))。

两个核酸序列或多肽基本相同的指征如下文所述是由第一核酸编码的多肽可以与针对由第二核酸编码的多肽所产生的抗体发生免疫交叉反应。所以，这个多肽通常与第二多肽基本相同，例如两个肽只有靠保守取代来区别。两个核酸序列基本相同的另一个指征是两个分子或它们的互补分子在严格条件下相互杂交，如下文所述。两个核酸序列基本同源的另一个指征是可以利用相同的引物扩增序列。

短语“选择性(或特异性)杂交”指分子在严格杂交条件下只与特定核苷酸序列结合、转接或杂交，当该序列以复合体混合物(如总细胞或文库DNA或RNA)存在时。

短语“严格杂交条件”通常是指在核酸复合体混合物中，探针与其靶亚序列杂交而不与其他序列杂交的条件。严格条件取决于序列，并且在不同环境下有所区别。序列越长，特异性杂交的温度越高。在Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid assays”(1993)中可以找到核酸杂交的详尽的指南。一般而言，在规定的离子强度和pH下，所选择的严格条件比特异序列的热熔点(T_m)低约5-10℃。T_m是指在探针与靶序列杂交平衡时有50％的探针与靶互补(在规定离子强度、pH和核酸浓度下)的温度(靶序列过量存在，在T_m杂交平衡时，有50％的探针被占用)。严格条件是在pH7.0-8.3时，盐浓度小于约1.0M钠离子，通常约0.01到1.0M钠离子浓度(或其他盐)，以及对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度至少约30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)至少约60℃。严格条件也可加入去稳定试剂如甲醛来达到。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少两倍于背景，任选10倍于背景杂交。严格杂交条件的例子如下：50％甲醛、5×SSC和1％SDS，42℃温育，或5×SSC、1％SDS，65℃温育，并用0.2×SSC和0.1％SDS，65℃洗涤。

如果核酸所编码的多肽基本相同，那么在严格条件下该核酸仍然是基本同源的，它们相互不发生杂交。例如，当采用遗传密码允许的最大密码子简并性创建核酸拷贝时，就会出现这种情形。在这些情况中，核酸通常在适度严格杂交条件下杂交。“适度严格杂交条件”的例子包括在40％甲醛、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中37℃杂交，以及用1×SSC 45℃洗涤。阳性杂交至少两倍于背景。普通技术人员将容易地认识到选择性杂交和洗涤条件可用于提供相似严格性的条件。

“抗体”是指含有来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，该多肽可特异性结合和识别抗原。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和mu恒定区的基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链可分类为κ或λ。重链可分类为γ、mu、α、δ或ε，它们依次分别定义免疫球蛋白类别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

免疫球蛋白(抗体)结构单元的例子包括四聚体。各个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对都具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的N末端限定了一个主要负责抗原识别的约100-110或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体例如可作为完整的免疫球蛋白存在，或作为用各种肽酶消化产生的特征清晰的许多片段存在。所以，例如胃蛋白酶在绞链区中二硫键以下消化抗体以产生F(ab)’₂，F(ab)’₂是Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与V_H-C_H1连接的轻链。在温和条件下可断裂绞链区中的二硫键，还原F(ab)’₂，从而将F(ab)’₂二聚体转变成Fab’单体。Fab’单体基本上是带有部分绞链区的Fab(参见Fundamental Immunology(Paul编，第三版，1993年)。当各种抗体片段依据完整抗体的消化来限定时，技术人员将懂得这些片段可用化学方法或采用重组DNA方法重新合成。因此，如本文所用的术语抗体也包括由修饰整个抗体所产生的抗体片段，或采用重组DNA方法重新合成的那些抗体片段(例如单链Fv)，或采用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见，例如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。

对于单克隆或多克隆抗体的制备，可以利用本领域已知的任何技术(参见，例如Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，第77-96页，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy(1985))。生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可适用于生产本发明多肽的抗体。同样，转基因小鼠或其他生物体如其他哺乳动物可用于表达人源化抗体。或者，噬菌体展示技术可用于鉴定与选定抗原特异性结合的抗体和异数的Fab片段(参见，例如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10：779-783(1992))。

“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，从而使抗原结合位点(可变区)连接到不同类别或改变类别的恒定区、效应物官能团和/或物种上，或连接到给嵌合抗体赋予新特性的完全不同的分子上，如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替代或交换。

“抗-BCA-GPCR”抗体是与由BCA-GPCR基因、cDNA或其亚序列编码的多肽特异性结合的抗体或抗体片段。

术语“免疫测定”是利用抗体特异性结合抗原的分析。免疫测定是利用特定抗体的特异性结合特性为特征来分离、靶击和/或定量抗原。

短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)免疫反应”当涉及蛋白或肽时，指在异源蛋白群体和其他生物制品中确定蛋白存在的结合反应。因此，在设定的免疫测定条件下，指定抗体与特定蛋白结合至少两倍于背景，并基本上不与样品中存在的其他蛋白有显著量的结合。在这些条件下，与抗体的特异性结合可要求选择对特定蛋白有特异性的抗体。例如，对特定BCA-GPCR产生的多克隆抗体可被选择获得只与BCA-GPCR而不与其他蛋白发生特异性免疫反应，除了BCA-GPCR的多态变体、直向同源物和等位基因之外。减去与BCA-GPCR分子发生交叉反应的抗体可完成这种选择。各种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择与蛋白特异性免疫反应的抗体(参见，例如Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual (1988)，描述了可用于确定特异免疫反应性的免疫测定形式和条件)。特异性或选择性反应通常至少两倍于背景信号或噪声，更通常是背景的10倍到100倍以上。如上所述，通过减去与来自另一物种相同的BCA-GPCR结合的抗体，也可制备只与特定BCA-GPCR直向同源物反应的抗体，所述直向同源物来自特异物种，如大鼠、小鼠或人。

术语“选择性相关”指核酸与如上定义的另一核酸“选择性杂交”的能力，或指抗体“选择性(或特异性)结合”蛋白的能力，如上定义。

编码BCA-GPCR核酸的分离

A.一般重组DNA方法

本发明依赖于重组遗传学领域中的常规技术。基础版本公开了本发明采用的一般方法，包括Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Mannual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transfer andExpression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等编，1994年)。

对于核酸，其大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)表示。这些大小的估计来自于琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、测序核酸或公布的DNA序列。对于蛋白，大小是以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数表示。蛋白大小的估计来自凝胶电泳、测序蛋白、衍生的氨基酸序列或公布的蛋白序列。

根据Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letts.22：1859-1862(1981)中首先描述的固相亚磷酸胺三酯方法，采用自动合成仪可化学合成市场上不能得到的寡核苷酸，正如Van Devanter等在Nucleic AcidsRes.12：6159-6168(1984年)中所述。通过纯聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过如Pearson和Reanier在J.Chrom.255：137-149(1983)中所述的离子交换HPLC可进行寡核苷酸的纯化。

采用例如Wallace等在Gene 16：21-26(1981)中所述的对双链模板测序的链终止方法，在克隆后可证实克隆基因和合成寡核苷酸的序列。

B.分离编码BCA-GPCR的核苷酸序列的克隆方法

一般而言，编码BCA-GPCR的核酸序列和相关核酸序列同系物可通过与探针杂交从cDNA和基因组DNA文库中克隆，或采用带有寡核苷酸引物的扩增技术分离。例如，BCA-GPCR序列通常通过与核酸探针杂交从哺乳动物核酸(基因组或cDNA)文库中分离，所述核酸探针的序列可衍生自SEQ ID NO：1、3、5或7。BCA-GPCR的RNA和cDNA可从中分离的合适组织包括如乳腺癌细胞、正常前列腺上皮细胞、胎盘或睾丸。

利用引物的扩增技术也可以用于从DNA或RNA中扩增和分离BCA-GPCR核酸。编码下面氨基酸序列的简并引物也可以用于扩增BCA-GPCR序列：SEQ ID NO：9-16(参见，例如Dieffenfach和Dveksler，PCR Primer：A Laboratory Manual(1995))。这些引物可以用于例如扩增全长序列或一个到数百个核苷酸探针，然后用于筛选全长BCA-GPCR的哺乳动物文库。

也可以抗体作为探针从表达文库中分离编码BCA-GPCR的核酸。使用序列SEQ ID NO：2、4、6或8可产生这些多克隆或单克隆抗体。

使用BCA-GPCR核酸探针和寡核苷酸，在严格杂交条件下，通过筛选文库可分离与BCA-GPCR基因基本相同的多态变体、等位基因和种间同系物。或者，通过采用抗BCA-GPCR的抗血清或纯化抗体免疫检测表达的同系物，所述抗血清或纯化抗体也识别和选择性结合BCA-GPCR同系物，利用表达文库来克隆BCA-GPCR多态变体、等位基因和种间同系物。

为了制备cDNA文库，应选择富含BCA-GPCR mRNA的源，例如从大脑，或乳腺癌或肺癌细胞中分离的细胞。然后使用逆转录酶将mRNA制成cDNA，连接到重组载体上，并转染入重组宿主中用于繁殖、筛选和克隆。制备和筛选cDNA文库的方法是众所周知的(参见，例如Gubler和Hoffman，Gene 25：263-269(1983)；Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。

对于基因组文库，将DNA从组织或细胞中抽提出来，通过机械剪切或酶消化产生约12-20kb的片段。然后梯度离心，从不需要的大小片段中分离出所需的片段，并且构建在λ噬菌体载体中。这些载体和噬菌体在体外包装。通过如Benton和Davis在Science 196：180-182(1977)中所述的噬菌斑杂交可分析重组噬菌体。如Grunstein等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA.72：3961-3965(1975)中通常描述的进行菌落杂交。

分离BCA-GPCR核酸及其同系物的另一种方法是将合成的寡核苷酸引物的利用和RNA或DNA模板的扩增相结合(参见，美国专利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Innis等编，1990))。聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)的方法可用于直接从mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库中扩增BCA-GPCR基因的核酸序列。使用本文提供的序列可设计简并寡核苷酸来扩增BCA-GPCR同系物。引物中能掺入限制性内切酶位点。聚合酶链式反应或其他体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达蛋白的核酸序列，制备核酸探针，用于检测生理样品中编码BCA-GPCR mRNA的存在、核酸测序或其他目的。通过PCR反应扩增的基因可从琼脂糖凝胶中纯化并克隆到适当的载体中。

BCA-GPCR的基因表达可通过本领域已知的技术分析，例如mRNA的逆转录和PCR扩增、总RNA或poly A⁺RNA的分离、RNA印迹、斑点印迹、原位杂交、核糖核酸酶保护、探针DNA微芯片阵列等。在一个实施方案中，高密度的寡核苷酸分析技术(例如GeneChip^TM)用于鉴定本发明GPCR的同系物和多态变体。在BCA-GPCR与已知疾病例如癌症相连的情况下，它们可采用GeneChip^TM作为诊断工具以检测生物样品中的疾病，参见，例如Gunthand等，AIDSRes.Hum.Retroviruses 14：869-876(1998)；Kozal等，Nat.Med.2：753-759(1996)；Matson等，Anal.Biochem.224：110-106(1995)；Lockhart等，Nat.Biotechnol.14：1675-1680(1996)；Gingeras等，Genome Res.8：435-448(1998)；Hacia等，Nucleic Acids Res.26：3865-3866(1998)。

可采用合成的寡核苷酸构建重组BCA-GPCR基因，用作探针或用于蛋白表达。该方法的操作采用一系列长度通常为40-120bp的表示基因有义和无义链的重叠寡核苷酸进行。然后将这些DNA片段退火、连接和克隆。或者，利用扩增技术和精确引物扩增BCA-GPCR核酸的特异亚序列。然后将特异亚序列连接到表达载体中。

通常将编码BCA-GPCR的核酸在转化到原核或真核细胞用于复制和/或表达之前先克隆到中间载体上。这些中间载体通常是原核载体，例如质粒或穿梭载体。

根据标准技术，可任选制备编码包含BCA-GPCR或其结构域的嵌合蛋白的核酸。例如，如配体结合结构域、胞外结构域、跨膜结构域(例如包含7个跨膜结构域和对应的胞外和胞质环的一种结构域)、跨膜结构域和胞质结构域、活性位点、亚基缔合区域等的结构域可共价于异源蛋白连接。例如，胞外结构域可连接到异源GPCR跨膜结构域，或异源GPCR胞外结构域可连接到跨膜结构域。其他选择的异源蛋白包括例如，绿色荧光蛋白、荧光酶或β-gal。

C.原核和真核生物中表达

为了获得高水平表达的克隆基因或核酸，如编码BCA-GPCR的cDNA，通常将BCA-GPCR序列亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，以及如果核酸编码蛋白还含有用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域熟知的，并例如在Sambrook等和Ausubel等中有描述。表达BCA-GPCR的细菌表达系统可利用例如大肠杆菌、芽孢杆菌和沙门氏菌(Palva等，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302：543-545(1983))。这些表达系统的试剂盒可以从市场上得到。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域熟知的，并且也可以从市场上得到。在一个实施方案中，真核表达载体是腺病毒载体、腺病毒相关载体或逆转录病毒载体。

用于指导异源核酸表达的启动子取决于特定应用。启动子任选定位在距离异源转录起始位点与其天然座位中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，正如本领域已知，这种距离可允许有一些变化而无需丧失启动子的功能。

除启动子以外，表达载体通常含有转录单位或表达盒，所述表达盒在宿主细胞中含有编码BCA-GPCR核酸的表达所需要的所有其他元件。因此，表达盒通常含有与编码BCA-GPCR的核酸序列可操作连接的启动子以及含有转录物有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。编码BCA-GPCR的核酸序列能与可切割的信号肽序列连接，以促进转染细胞中编码蛋白的分泌。这些信号肽还包括来自组织溶酶原激活剂的信号肽、胰岛素和神经元生长因子以及绿夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶。表达盒的其他元件可包括增强子，以及如果基因组DNA被用作结构基因，还包括带有功能拼接供体的内含子和受体位点。

除启动子序列以外，表达盒也应含有结构基因下游的转录终止区，以提供有效的终止。终止区可从与启动子序列相同的基因中获得，或可从不同的基因中获得。

用于将遗传信息输入细胞中的特定表达载体不是特别关键。可以利用在真核和原核细胞中表达的任何常规载体。标准的细菌表达载体包括质粒如以pBR322为基础的质粒、pSKF、pET23D，还包括融合表达系统如GST和LacZ。在重组蛋白中也可以加入表位标记，以提供分离常规方法，如c-myc。

通常将含有来自真核生物病毒的调节元件的表达载体用于真核表达载体中，如SV40载体、乳头状瘤病毒载体和衍生自EB病毒的载体。真核载体的其他例子包括pMSG、pAV009/A⁺、pMTO10/A⁺、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和任何其他载体，所述其他载体允许在CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中显示有效表达的启动子的指导下表达蛋白。

一些表达系统具有提供基因扩增的标记，如新霉素、胸腺嘧啶核苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。或者，不参与基因扩增的高产表达系统也是合适的，如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，其带有在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子指导下的编码BCA-GPCR的序列。

通常包括在表达载体中的元件也包括大肠杆菌中发挥功能的复制子、编码抗生素抗性的基因以允许选择含有重组质粒的细菌，和质粒非必需区域中独特的限制位点允许插入真核序列。特定抗生素抗性基因的选择并非关键，本领域已知的许多抗性基因任何一个都合适。如果需要，可以任选原核序列，这样它们就不干扰真核细胞中DNA的复制。

可使用标准转染方法生产细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，所述细胞系可表达大量的BCA-GPCR，然后采用标准技术纯化蛋白(参见，例如Colley等，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)；Guide toProtein Purification，in Methods in Enzymology，Vol.182(Deutscher编，1990年))。根据标准技术操作真核和原核细胞的转化(参见，例如Morrison，J.Bact.132：349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss，Methodsin Enzymology 101：347-362(Wu等编，1983年))。

任何用于在宿主细胞中导入外源核苷酸序列的熟知方法都可被采用。这些方法包括使用的试剂如Superfect(Qiagen)、脂质体、磷酸钙转染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、原生质体融合、电穿孔、微注射、质粒载体、病毒载体和任何其他熟知的在宿主细胞中导入克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传物质的方法(参见，例如Sambrook等，同上)。所用的特定遗传工程方法只需要能在表达BCA-GPCR的宿主细胞中成功导入至少一种基因。

在表达载体导入细胞后，在有利于BCA-GPCR表达的条件下培养转染细胞，再使用下文所鉴定的标准技术从培养物中回收BCA-GPCR。

BCA-GPCR的纯化

天然存在或重组的BCA-GPCR纯化后可用于功能分析、结合分析、诊断分析和其他应用中。天然存在的BCA-GPCR例如从哺乳动物组织，如血液和淋巴组织，或从任何其他来源的BCA-GPCR同系物中纯化出来。重组BCA-GPCR从任何适当的细菌或真核表达系统例如CHO细胞或昆虫细胞中纯化出来。

通过标准技术可将BCA-GPCR纯化至基本纯，这些标准技术包括但不限于用如硫酸铵这样的物质进行选择性沉淀、柱层析、免疫纯化方法和其他方法(参见，例如Scopes，Protein Purification：Principlesand Practice(1982)；美国专利4,673,641；Ausubel等，同上；和Sambrook等，同上)。

当重组BCA-GPCR正被纯化时，可使用许多方法。例如，可将具有分子粘着特性的蛋白与BCA-GPCR可逆性融合。利用适当的配体，可将BCA-GPCR选择性地吸附到纯化柱上，从柱中再以相对纯的形式分离出来。然后用酶除去融合蛋白。最后使用免疫亲和柱可纯化BCA-GPCR。

A.来自重组细胞的BCA-GPCR的纯化

通常在启动子诱导后，重组蛋白被转化的细菌或真核细胞，如CHO细胞或昆虫细胞，大量表达，但表达可能是组成型的。用IPTG诱导启动子是可诱导启动子系统的一个例子。根据本领域标准方法可使细胞生长。新鲜或冷冻细胞用于蛋白分离。

细菌中表达的蛋白可形成不溶的团聚体(“包含体”)。有若干方案适用于纯化BCA-GPCR包含体。例如，包含体的纯化通常包括细菌细胞破裂，例如在50mM Tris/HCl pH7.5、50mM NaCl、5mM MgCl₂、1mM DTT、0.1mM ATP和1mM PMSF的缓冲液中温育，然后抽提、分离和/或纯化包含体。细胞悬浮液可通过French Press采用2-3个通道裂解，用Polytron(Brinkman Instruments)匀浆或在冰上超声处理。对本领域技术人员来说，采用任一个方法裂解细菌都是显而易见的(参见，例如Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。

如果需要，包含体可被溶解，通常将裂解细胞悬浮液离心，以除去不需要的不溶物质。用配伍的缓冲液稀释或透析后可将形成包含体的蛋白复性。适当的溶剂包括但不限于脲(从约4M到约8M)、甲醛(至少约80％v/v)和盐酸胍(从约4M到约8M)。由于蛋白可能不可逆变性，并伴随出现免疫原性和/或活性缺乏，因此，能溶解团聚体形成的蛋白的一些溶剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)和70％甲酸在本方法中是不适用的。虽然盐酸胍和类似试剂是变性剂，但是这种变性也不是不可逆的，在去除(例如通过透析)或稀释变性剂后可发生复性，允许重新形成免疫原性和/或生物活性的蛋白。其他合适的缓冲液是本领域技术人员已知的。使用标准分离技术，例如采用Ni-NTA琼脂糖树脂，能将BCA-GPCR从其他细菌蛋白中分离出来。

或者，从细菌周质中纯化BCA-GPCR是可能的。细菌裂解后，当把BCA-GPCR排出到细菌的周质中时，除了本领域技术人员已知的其他方法以外，通过冷渗透休克可分离细菌周质部分。为了从周质中分离重组蛋白，细菌细胞离心形成沉淀。在含有20％蔗糖的缓冲液中重悬浮沉淀。为了裂解细胞，细菌离心后将沉淀再悬浮于冰冷的5mMMgSO₄并在冰浴中保持约10分钟。离心细胞悬浮液，倾析上清液并保存。通过本领域技术人员熟知的标准分离技术可从宿主蛋白中分离上清液中存在的重组蛋白。

B.纯化BCA-GPCR的标准蛋白分离技术

可溶性分级分离

通常作为起始步骤，特别是如果蛋白混合物是复合体时，初始盐分级分离可从目的重组蛋白中分离出许多不需要的宿主细胞蛋白(或来源于细胞培养基的蛋白)。优选盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效减少蛋白混合物中的水量沉淀蛋白。然后根据它们的溶解度，蛋白沉淀。蛋白越疏水，越有可能在较低的硫酸铵浓度下沉淀。方案通常包括在蛋白溶液中加入饱和硫酸铵，以使硫酸铵浓度介于20-30％之间。该浓度将沉淀大多数疏水蛋白。丢弃沉淀(除非目的蛋白是疏水的)，再在上清液中加入硫酸铵至目的蛋白沉淀已知的浓度。然后以缓冲液溶解沉淀，如果需要，通过透析或渗滤除去过量的盐。依赖蛋白溶解度的其他方法如冷乙醇沉淀，是本领域技术人员熟知的，也可用于分级分离复合蛋白混合物。

大小差别过滤

使用超滤方法，通过孔径大小不同的膜(例如Amicon或Millipore膜)，依据BCA-GPCR的分子量，可将其从更大和更小的蛋白中分离出来。作为第一步，将蛋白混合物通过一定孔径大小的膜超滤，此膜的截留分子量小于目的蛋白的分子量。将超滤存留液再次对膜超滤，此膜的截留分子量大于目的蛋白的分子量。重组蛋白将通过膜进入滤出液中。然后如下所述层析分离滤出液。

柱层析

BCA-GPCR也可根据大小、表面静电荷、疏水性和对异源分子的亲和性从其他蛋白中分离。另外，针对蛋白所产生的抗体可以与柱基质结合，然后免疫纯化蛋白。所有这些方法都是本领域熟知的。对专业技术人员来说，层析技术可在任何规模并使用来自许多不同制造商的设备来进行是显而易见的(例如Pharmacia Biotech)。

BCA-GPCR的免疫检测

除了利用核酸杂交技术检测BCA-GPCR基因和基因表达外，技术人员也可以利用免疫测定检测BCA-GPCR，例如，鉴定细胞，如癌细胞，特别是乳腺癌细胞，和BCA-GPCR的变体。免疫测定可用于定性或定量分析BCA-GPCR。此实用技术的综述可在Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(1988)中找到。

A.针对BCA-GPCR的抗体

与BCA-GPCR特异性反应的多克隆和单克隆抗体的生产方法对本领域技术人员来说是已知的(参见，例如Coligan，Current Protocolsin Immunology(1991)；Harlow和Lane，同上；Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice(第二版，1986)；以及Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975))。这些技术包括通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体文库中筛选抗体来制备抗体，以及通过免疫兔或小鼠来制备多克隆和单克隆抗体(参见，例如Huse等，Science 246：1275-1281(1989)；Ward等，Nature 341：544-546(1989))。这些抗体可用于治疗和诊断应用，例如用于乳腺癌的治疗和/或检测中。

许多包含BCA-GPCR的免疫原可用于生产与BCA-GPCR特异性反应的抗体。例如，如本发明所述分离重组BCA-GPCR或其抗原片段。如上文所述，重组蛋白可在真核或原核细胞中表达和纯化。重组蛋白是生产单克隆或多克隆抗体的优选免疫原。或者，从本发明公开的序列衍生并与载体蛋白结合的合成肽可用作免疫原。天然存在的蛋白也可以纯的或不纯的形式采用。然后将产物注射到能产生抗体的动物体内。可生成单克隆或多克隆抗体，随后用于免疫测定以检测蛋白。

多克隆抗体的生产方法是本领域技术人员已知的。使用标准佐剂如弗氏佐剂和标准免疫方案将蛋白免疫纯种品系的小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔子。动物对免疫原制剂的免疫应答通过采集测试血并测定BCA-GPCR的反应性效价来监控。当所获得的针对免疫原的抗体效价适当高时，从动物中收集血液，并制备抗血清。如果需要，可进一步进行抗血清的分级分离以富集与蛋白反应的抗体(参见Harlow和Lane，同上)。

通过各种本领域技术人员熟悉的技术可获得单克隆抗体。简而言之，从以所需抗原免疫的动物中产生的脾细胞通常与骨髓瘤细胞的融合而永生化(参见Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976))。永生化的其他方法包括用EB病毒、致癌基因或逆转录病毒转化或其他本领域熟知的方法。为了生产对抗原所需的特异性和亲和性的抗体，筛选来自单个永生化细胞的菌落，并且由这些细胞产生的单克隆抗体的产量可通过各种技术包括给脊椎动物宿主的腹膜腔注射来提高。或者，根据Huse等在Science 246：1275-1281(1989)中概括的一般方案，通过从人B细胞中筛选DNA文库可分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。

收集单克隆抗体和多克隆血清，并在免疫测定中滴定免疫原蛋白，例如采用固定在固相支持物上的免疫原进行的固相免疫测定。通常，选择效价为10⁴或更高的多克隆抗血清，采用竞争性结合免疫测定方法，测试它们针对非BCA-GPCR或甚至针对来自其他生物体的相关蛋白的交叉反应性。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体通常以一定的K_d结合，K_d至少约0.1mM，更常见至少约1μM，或者至少约0.1μM或更少，和任选0.01μM或更少。

一旦得到BCA-GPCR特异抗体，单个BCA-GPCR就可通过各种免疫测定方法进行检测。对于一般免疫测定的综述，也参见Methods inBiology：Antibodies in Cell Biology，volume 37(Asai编1993)；Basicand Clinical Immunology(Stites和Terr编，第7版，1991年)。另外，本发明的免疫测定可用于若干结构的任一结构的检测。这些在EnzymeImmunoassay(Maggio编，1980)；以及Harlow和Lane，同上中有广泛综述。

B.免疫结合测定

利用众多熟知的免疫结合测定法中的任一种，可检测和/或定量BCA-GPCR(参见，例如美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。对于一般免疫测定的综述可以参见Methods in CellBiology：Antibodies in Cell Biology，第37卷(Asai编，1993年)；Basic andClinical Immunology(Stites和Terr编，第7版，1991年)。免疫学结合测定(或免疫测定)通常利用与选择的蛋白或抗原特异性结合的抗体(在此情况下是BCA-GPCR或其抗原亚序列)。抗体(例如抗-BCA-GPCR)可采用本领域技术人员许多已知方法的任一种和如上所述方法生产。

免疫测定也经常利用标记介质来特异性结合和标记由抗体和抗原形成的复合体。标记介质本身可以是含有抗体/抗原复合体的一个部分。因此，标记介质可以是标记的BCA-GPCR或标记的抗-BCA-GPCR抗体。或者，标记介质可以是第三部分，如与抗体/BCA-GPCR复合体特异性结合的第二抗体(第二抗体通常是特异于衍生第一抗体的物种的抗体)。能特异性结合免疫球蛋白恒定区的其他蛋白如蛋白A或蛋白G也可用作标记介质。这些蛋白与来自各种物种的免疫球蛋白恒定区表现出强的非免疫原反应性(参见，例如Kronval等，J.Immunol.111：1401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.135：2589-2542(1985))。标记介质可用可检测部分如生物素进行修饰，生物素可特异性结合另一分子如链亲和素。各种可检测部分是本领域技术人员熟知的。

测定全程中，在试剂各个结合后，都需要温育和/或洗涤步骤。温育步骤的时间可从约5秒到几小时内变化，任选从约5分钟到约24小时。然而，温育时间将根据测定形式、抗原、溶液体积、浓度等发生变化。测定一般在室温下进行，尽管它们可在如10℃到40℃的温度范围进行。

非竞争测定形式

检测样品中BCA-GPCR的免疫测定可以是竞争性的也可以是非竞争性的。非竞争免疫测定是直接测定抗原量的测定。在一个优选“三明治”的测定中，例如抗-BCA-GPCR抗体可直接与固体底物结合，并固定在其上。这些固定的抗体捕获测试样品中存在的BCA-GPCR。因此，固定的BCA-GPCR被如携有标记的第二BCA-GPCR抗体的标记介质结合。或者，第二抗体可缺少标记，但它可依次被标记的第三抗体结合，所述第三抗体特异于衍生第二抗体物种的抗体。第二或第三抗体通常用可检测部分如生物素修饰，而生物素又与另一分子如链亲和素特异性结合从而提供可检测部分。

竞争测定形式

在竞争测定中，通过测定已知的加入(外源)BCA-GPCR与抗-BCA-GPCR抗体的结合被样品中存在的未知BCA-GPCR所取代(竞争占用)的量，可间接检测样品中存在的BCA-GPCR量。在一个竞争测定中，样品中加入已知量的BCA-GPCR，然后将样品与和BCA-GPCR特异性结合的抗体接触。与抗体结合的外源BCA-GPCR量与样品中存在的BCA-GPCR浓度成反比。在特定的优选实施方案中，抗体固定于固相底物上。通过测定BCA-GPCR/抗体复合体中存在的BCA-GPCR量，或者通过测定剩余未复合的蛋白量可以确定与抗体结合的BCA-GPCR量。通过提供标记BCA-GPCR分子可检测BCA-GPCR量。

半抗原抑制测定是另一优选的竞争测定。在此测定中，将已知BCA-GPCR固定在固相基质上。样品中加入已知量的抗-BCA-GPCR抗体，然后将样品与固定的BCA-GPCR接触。与已知固定的BCA-GPCR结合的抗-BCA-GPCR抗体量与样品中存在的BCA-GPCR量成反比。通过检测抗体的固定部分或溶液中剩余的抗体部分可再次检测固定抗体的量。如果抗体是标记的，可直接检测，或者通过如上文所述的随后加入与抗体特异性结合的标记部分进行间接检测。

交叉反应性的确定

以竞争结合形式的免疫测定也可用于交叉反应性的确定。例如，可将至少部分由SEQ ID NO：2、4、6或8编码的蛋白固定于固相支持物上。将与固定抗原竞争结合抗血清的蛋白(例如BCA-GPCR和同系物)加入到测定中。把外加蛋白与固定化蛋白竞争结合抗血清的能力和由SEQ ID NO：2、4、6或8编码的BCA-GPCR与自身竞争的能力比较。利用标准算法计算上面蛋白的交叉反应性的百分数。选择与上面列出的各个外加蛋白交叉反应性小于10％的抗血清并合并。通过用外加假定的蛋白例如远缘相关的同系物进行免疫吸附可从合并的抗血清中任选除去交叉反应的抗体。

然后将免疫吸附和合并的抗血清用于如上所述竞争结合的免疫测定中，从而把认为也许是BCA-GPCR的等位基因或多态变体的第二蛋白与免疫原蛋白(即SEQ ID NO：2、4、6或8的BCA-GPCR)进行比较。为了进行此比较，在宽范围的浓度下分别测定两个蛋白，并确定抑制50％的抗血清与固定蛋白结合所需的各个蛋白量。如果抑制50％的结合所需的第二蛋白量比抑制50％的结合所需的由SEQ ID NO：2、4、6或8编码的蛋白量小10倍，那么就说第二蛋白与针对BCA-GPCR免疫原所产生的多克隆抗体特异性结合。

其他测定形式

蛋白质印迹(免疫印迹)分析可用于检测和定量样品中BCA-GPCR的存在。此技术一般包括通过凝胶电泳根据分子量分离样品蛋白，将分离的蛋白转移到适当的固相支持物上(如硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜或衍生的尼龙滤膜)，和把样品和特异性结合BCA-GPCR的抗体一起温育。抗-BCA-GPCR抗体在固相支持物上与BCA-GPCR特异性结合。这些抗体可直接标记，或者可随后采用与抗-BCA-GPCR抗体特异性结合的标记抗体(例如，标记的羊抗小鼠抗体)进行检测。

其他测定形式包括脂质体免疫测定(LIA)，其采用设计成结合特异分子(例如抗体)并释放胶囊化的试剂或标记的脂质体。然后根据标准技术检测释放的化学成分(参见Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.5：34-41(1986))。

非特异性结合的减少

本领域技术人员懂得通常理想的是使免疫测定中的非特异结合最小化。具体而言，当测定包括固定于固相基质上的抗原或抗体时，需要使与基质非特异结合的量最小化。减少这种非特异结合的方法是本领域技术人员熟知的。该技术通常包括用蛋白组合物包被基质。具体而言，广泛使用蛋白组合物，如牛血清白蛋白(BSA)、无脂奶粉和明胶，以奶粉最优选。

标记

只要不显著干扰测定中所用的抗体的特异性结合，测定中所用的特定标记或可检测基团不是本发明的关键方面。可检测基团可以是具有可检测物理或化学特性的任何物质。这些可检测标记已在免疫测定领域发展成熟，一般而言，这些方法中有用的大多数标记都可适用于本发明。因此，标记是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学方法可检测的任何组合物。本发明中有用的标记包括磁珠(例如DYNABEADS^TM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、Texas红、罗丹明等)、放射性标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他ELISA中常用的酶)，以及比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。

根据本领域熟知的方法，标记可直接或间接与测定所需的成分偶联。如上所示，可使用多种标记，标记选择依据所要求的灵敏度、与化合物结合的容易程度、稳定性要求、可用仪器和防护条件。

非放射性标记通常用间接方法附着。配体分子(例如生物素)一般与分子共价结合。然后配体与另一分子(例如链亲和素)结合，此分子或是固有可检测的，或与信号系统如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物共价结合。配体及其靶可与识别BCA-GPCR的抗体或识别抗-BCA-GPCR的第二抗体以任意适当组合方式使用。

这些分子也可以例如通过与酶或荧光团结合直接与产生信号的化合物结合。作为标记的目的酶主要是水解酶，具体是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶，尤其是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素和2，3-二氢二氮杂萘酮(dihydrophthalazinediones)，例如发光氨。可利用的各种标记或信号产生系统的综述参见美国专利4,391,904。

检测标记的方法是本领域技术人员熟知的。因此，例如当标记是放射性标记时，检测的方法包括闪烁计数器或放射白显影中的光学胶片。当标记是荧光标记时，可通过用适当波长的光激发荧光染料并检测产生的荧光。荧光检测可通过肉眼、照相胶片方法、电子检测器如电荷偶联装置(CCD)或光电倍增管等进行。通过给酶提供合适的底物并检测形成的反应产物可相似地检测酶标记。最后，通过观察与标记相关的颜色可容易地检测简单的比色标记。因此，在各种量尺的测定中，结合金经常显示粉红色，而不同的结合珠显示不同的珠的颜色。

有些测定形式不需要使用标记成分。例如凝集测定可用于检测靶抗体的存在。在此情况下，抗原包被的颗粒为包含靶抗体的样品所凝集。以此形式，没有成分需要标记，靶抗体的存在通过简单的肉眼观察进行检测。

对BCA-GPCR调节剂的测定

A.对BCA-GPCR活性的测定

BCA-GPCR和它们的等位基因和多态变体是参与信号转导并且与乳腺癌细胞中扩增的区域相关的G蛋白偶联受体。BCA-GPCR多肽的活性可以利用各种体外和体内试验来评估，以确定功能性、化学和物理效应，例如测定配体结合(例如放射性配体结合)、第二信使(例如cAMP、cGMP、IP₃、DAG、或Ca²⁺)、离子流通量、磷酸化水平、转录水平、神经递质水平等。另外，这些测定可用于测试BCA-GPCR的抑制剂和激活剂。调节剂还可以是BCA-GPCR遗传上改变的版本。本发明用于鉴定调节剂的筛选测定可用作治疗化合物，例如针对BCA-GPCR的抗体和BCA-GPCR活性的拮抗剂。

该测定中的BCA-GPCR选自具有序列SEQ ID NO：2、4、6或8的多肽或其保守修饰的变体。或者，该测定的BCA-GPCR将从真核生物中衍生并且包括与SEQ ID NO：1-2或7具有氨基酸序列同一性的氨基酸亚序列。通常，氨基酸序列同一性至少是70％，任选至少是85％，任选至少是90-95％。或者，该测定的多肽任选包括BCA-GPCR的结构域，如胞外结构域、跨膜结构域、胞质结构域、配体结合结构域、亚基结合结构域、活性位点等。BCA-GPCR或其结构域可以与异源蛋白共价连接，产生用于如本发明所述测定中的嵌合蛋白。

采用如上所述的BCA-GPCR多肽测试BCA-GPCR活性的调节剂，BCA-GPCR多肽或是重组或是天然存在的。蛋白可被分离并在细胞、从细胞衍生的膜、组织或动物中表达，所述蛋白或是重组或是天然存在的。例如，可以利用乳腺癌细胞、正常前列腺上皮细胞、胎盘、睾丸组织、转化细胞或膜。利用一种如本文所述的体外或体内测定可以测试调节。利用嵌合分子，如与异源信号转导结构域共价连接的受体胞外结构域、或与受体的跨膜和/或胞质结构域共价连接的异源胞外结构域，也可在体外用可溶性或固态反应检测信号转导。还可以检测基因扩增。另外，目的蛋白的配体结合结构域可以在体外用于可溶或固态反应中，从而测定配体结合。

在溶液、双层膜、附着于固相、脂单层或小泡中可以测试与BCA-GPCR、结构域或嵌合蛋白的配体结合。利用例如光谱特性(例如荧光、吸光率、折射率)、流体动力学(例如形态)、色谱或可溶性特性中的变化可测试调节剂的结合情况。

也可以检测受体-G-蛋白的相互用。例如，可以检测G蛋白和受体的结合或该蛋白从受体中的释放。例如，在没有GTP时，激活剂将导致形成G蛋白(都是3个亚基)与受体的紧密复合体。这个复合体可以用如上所示的各种方法来检测。这种试验可以改变成搜寻抑制剂。没有GTP时，在受体和G蛋白中加入激活剂形成了紧密的复合体，然后通过观察受体-G蛋白复合体的解离筛选抑制剂。有GTP时，从其他两个G蛋白亚基中释放G蛋白的α亚基作为激活标准。

激活或抑制的G蛋白将依次改变下游效应物如蛋白、酶和通道的特性。典型的例子是可见系统中转导素对cGMP磷酸二酯酶的激活、刺激性G蛋白对腺苷酸环化酶的激活、Gq和其他同源G蛋白对磷酸酯酶C的激活，以及Gi和其他G蛋白对不同通道的调节。也可以检测下游的结果，如通过磷酸酯酶C产生二酰基甘油和IP3，和依次检测由IP3引起的钙转移。

活化的GPCR受体变成激酶的底物，所述激酶使受体的C末端尾(以及可能的其他位点)磷酸化。所以，激活剂将能促进³²P从γ标记的GTP转移到受体，这可以用闪烁计数器测定。C末端尾的磷酸化将能促进类似抑制蛋白的蛋白结合，并将干扰G蛋白的结合。激酶/抑制蛋白途径在许多GPCR受体的脱敏中起关键作用。对GPCR信号的转导和测试信号转导的方法的综述参见，例如Methods in Enzymology，第237卷和238卷(1994)和第96卷(1983)；Bourne等，Nature 10：349：117-27(1991)；Bourne等，Nature 348：125-32(1990)；Pitcher等，Annu.Rev.Biochem.67：653-92(1998)。

把用潜在BCA-GPCR抑制剂或激活剂处理的样品或测定与没有测试化合物的对照样品比较，以便检验调节程度。对照样品(未用激活剂或抑制剂处理)的相对BCA-GPCR活性值设定为100。当BCA-GPCR的活性值相对于对照是约90％，任选50％，任选25-0％时，就达到了BCA-GPCR的抑制。当BCA-GPCR的活性值相对于对照是110％，任选150％、200-500％或1000-2000％时，就达到了BCA-GPCR的激活。

通过确定表达BCA-GPCR细胞或膜的极化(即电位)的变化可以评估离子流通量的变化。确定细胞极化变化的一个方法是用电压钳和膜片钳技术测定电流变化(从而测量极化的变化)，例如“细胞附着”方式，“内翻外”方式和“全细胞”方式(参见，例如Ackerman等，NewEngl.J.Med.336：1575-1595(1997))。全细胞电流利用标准方法可方便地确定(参见，例如Hamil等，Pflugers.Archiv.391：85(1981))。其他已知的测定包括：放射性标记的离子流通量测定和用电压敏感染料的荧光测定(参见，例如Vestergarrd-Bogind等，J.Membrane Biol.88：67-75(1988)；Gonazales和Tsien，Chem.Biol.4：269-277(1997)；Daniel等，J.Pharmacol.Meth.，25：185-193(1991)；Holevinsky等，J.MembraneBiology 137：59-70(1 994))。通常，待测化合物存在的范围从1pM到100mM。

通过检验如上所述的任何参数可测定测试化合物对多肽功能的影响。任何影响BCA-GPCR活性的适当生理变化都可用于评估测试化合物对本发明的多肽的影响。当利用完整细胞或动物确定其功能效果时，人们也可测定各种效应，例如递质释放，激素释放，已知和未鉴别遗传标记(如RNA印迹)的转录变化，细胞代谢的变化如细胞生长或pH变化，以及胞内第二信使如Ca²⁺、IP3或cAMP的变化。

对G蛋白偶联受体的优选测定方法包括用离子或电压敏感染料加载细胞，以便报道受体活性。确定这些受体的测定也可以用其他G蛋白偶联受体的激动剂和拮抗剂作为阴性或阳性对照，以便评估测试化合物的活性。在鉴定调节性化合物(例如激动剂、拮抗剂)的测定中，利用离子敏感性或膜电压荧光的指示剂分别监控细胞质中的离子水平或膜电压的变化。可用的离子敏感性指示剂和电压探针在MolecularProbes 1997年目录中公开。对于G蛋白偶联受体，混栖G蛋白如Gα15和Gα16可用于选择测定中(Wilkie等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 88：10049-10053(1991))。这些混栖G蛋白允许将大范围的受体与信号转导途径在异源细胞中偶联。

受体激活通常启动随后的胞内事件如第二信使如IP3的增加，其释放胞内储藏的钙离子。对一些G蛋白偶联受体的激活刺激了通过磷酸酯酶C介导的磷脂酰肌醇水解形成肌醇三磷酸酯(IP3)(Berridge和Irvine，Nature，312：315-21(1984))。然后IP3刺激胞内储藏的钙离子的释放。所以，细胞质钙离子水平的变化或第二信使如IP3水平的变化可用于评估G蛋白偶联受体的功能。表达这些G蛋白偶联受体的细胞可表现出细胞质钙水平的提高，这是胞内储藏和通过离子通道激活共同作用的结果，在这种情况下，虽然无需在任选补充有螯合剂如EGTA的无钙缓冲液中进行这些测定，但需要区分从内部储藏释放钙而产生的荧光应答信号。

其他测定可包括确定受体的活性，当受体受激时，通过激活或抑制下游效应物如腺苷酸环化酶，导致细胞内环核苷酸如cAMP或cGMP水平的变化。环核苷酸门控的离子通道是存在的，例如棒光受体细胞通道和嗅觉神经元通道，这些通道通过结合cAMP或cGMP受激后可渗透阳离子(参见，例如Altenhofen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：9868-9872(1991)和Dhallan等，Nature.347：184-187(1990))。在受体激活导致环核苷酸水平下降的情况下，测定中激活受体的化合物加入细胞之前，将细胞暴露给与提高胞内环核苷酸水平的试剂例如毛喉素是优选的。对这种类型测定的细胞可以用编码环核苷酸门控的离子通道、GPCR磷酸酶的DNA和编码受体的DNA共转染宿主细胞进行制备，所述受体(例如某些谷氨酸受体、毒蝇碱性乙酰胆碱受体、多巴胺受体、羟色胺酸受体等)激活时引起细胞质中环核苷酸水平变化。

在一个实施方案中，利用免疫测定可测定胞内cAMP或cGMP的变化。Offermanns和Simon在J.Biol.Chem.，270：15175-15180(1995)中描述的方法可用于确定cAMP的水平。同样，Felley-Bosco等在Am.J.Resp.Cell和Mol.Biol.11：159-164(1994)中描述的方法可用于确定cGMP的水平。另外，引入本文作为参考的美国专利4,115,538描述了检测cAMP和/或cGMP的测定试剂盒。

在另一个实施方案中，根据引入本文作为参考的美国专利5,436,128可以分析磷脂酰肌醇(PI)。简而言之，该测定包括用³H-肌醇标记细胞48小时或更多。用测试化合物处理标记细胞1小时。裂解处理细胞，并在氯仿-甲醇-水中萃取，然后用离子交换层析分离肌醇磷酸，并且用闪烁计数器定量。通过计算存在激动剂时的cpm和存在缓冲液对照时的cpm的比例来确定刺激倍数。同样，通过计算存在拮抗剂时的cpm和存在缓冲液对照(可以含有或不含有激动剂)时的cpm的比例来确定抑制倍数。

在另一个实施方案中，可以测定转录水平来评估测试化合物对信号转导的影响。将含有目的蛋白的宿主细胞与测试化合物接触足够的时间以便发生相互作用，然后检测基因表达的水平。凭经验确定发生这些相互作用的时间，如经过一个时间过程然后测定作为时间函数的转录水平。利用本领域技术人员已知的任何适当方法可以检测转录量。例如，利用RNA印迹可以检测目的蛋白的mRNA表达，或利用免疫测定鉴定它们的多肽产物。或者，利用报道基因可使用基于转录的测定，如美国专利5,436,128所述，文献引入本文作为参考。报道基因可以是如氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。另外，目的蛋白通过附着于第二报道分子如绿荧光蛋白可用作间接的报道分子(参见，例如Mistili和Spector，Nature Biotechnology 15：961-964(1997))。

然后，将转录量与相同细胞中没有测试化合物的转录量比较，或者将它与基本相同缺乏目的蛋白的细胞中的转录量比较。基本相同的细胞可以从相同细胞中衍生，由此制备了没有经过导入异源DNA而修饰的重组细胞。转录量中的任何差异指示测试化合物以某种方式已经改变了目的蛋白的活性。

B.调节剂

作为BCA-GPCR调节剂，测试化合物可以是任何小的有机或无机化学化合物或生物学实体，例如蛋白、糖、核酸或脂。测试化合物通常是小化学分子和肽。尽管可用的大多数化合物常常溶解在水或有机(特别是基于DMSO)溶液中，但基本上任何化合物都可用作本发明测定中潜在的调节剂或结合化合物。通过使测定步骤自动化并给测定方法提供任何方便来源的化合物，设计测定方法对大的化学品文库进行筛选，通常测定平行进行(例如以自动化测定中微量滴定板上的微滴形式)。人们可意识到有许多化学化合物的供应商，包括Sigma(St.Louis，MO)、Aldrich(St.Louis，MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs Switzerland)等。

在一个优选的实施方案中，高通量的筛选方法包括提供含有大量潜在治疗化合物(潜在调节剂或结合化合物)的组合化学品或肽文库。然后如本发明所述，在一个或多个测定中，筛选这些“组合化学品文库”或“配体文库”，以便对展示所需特征活性的那些文库成员(特别是化学物种或亚类)进行鉴定。经鉴定的化合物可充当常规的“引导化合物”或自身可用作潜在或真正的治疗剂。

组合化学品文库是各种各样的化学化合物的集合，所述化合物由化学合成或生物合成通过组合许多化学“构件”如试剂产生。例如，多肽文库的线性组合化学品文库是通过对给定化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数目)以各种可能的方式组合一系列化学构件(氨基酸)而形成的。通过化学构件的如此组合混合可合成数百万的化合物。

组合化学品文库的制备和筛选是本领域技术人员熟知的。这些组合化学品文库包括但不限于肽文库(参见，例如美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，Nature354：84-88(1991))。也可使用产生化学多样性文库的其他化学物质。这些化学物质包括但不限于类肽(例如PCT公开号WO 91/19735)、编码肽(例如PCT公开号WO 93/20242)、无规则的生物寡聚体(例如PCT公开号WO 92/00091)、苯二氮平(benzodiazepines)(例如美国专利号5,288,514)、如海因、苯二氮平(benzodiazepines)和二肽的多变聚体(diversomers)(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A 90：6909-6913(1993))、联乙烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))、带有葡萄糖支架的非肽的肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、小化合物文库的类似有机合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))、寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science 261：1303(1993))，和/或肽基磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))、核酸文库(参见Ausubel、Berger和Sambrook，全部同上)、肽核酸文库(参见，例如美国专利号5,539,083)、抗体文库(参见，例如Vaughn等，Nature Biotechnology14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见，例如Liang等，Science 274：1520-1522(1996)和美国专利号5,593,853)、有机小分子文库(参见，例如苯二氮平(benzodiazepines)，Baum C和EN，1月18日，第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利号5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和间噻唑烷酮(metathiazanones)，美国专利号5,549,974；吡咯烷，美国专利号5,525,735和5,519,134；吗啉化合物，美国专利号5,506,337；苯二氮平(benzodiazepines)，美国专利号5,288,514等)。

制备组合文库的设备可从市场上得到(参见，例如357MPS、390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。另外，许多组合文库本身也可从市场得到(参见，例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3DPharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD等)。

C.固态和溶性高通量测定

在一个实施方案中，本发明提供了溶性测定，利用如N末端或C末端结构域的分子，所述分子是单独的或与异源蛋白共价连接产生的嵌合分子。在另一实施方案中，本发明提供以高通量形式基于固相的体外测定，其中结构域、嵌合分子、BCA-GPCR，或表达BCA-GPCR的细胞或组织附着到固相基质上。

在本发明的高通量测定中，一天筛选多达数千个不同的调节剂是可能的。具体而言，各个微量滴定板的孔都可用于针对选定的潜在调节剂进行单独测定，或者如果需要观察浓度或温育时间的作用，那么每5-10个孔可测试一个调节剂。因此，一个标准微量滴定板可分析约100个(即96个)调节剂。如果使用1536个孔的平板，那么一个平板可容易地测定约100至约1500个不同的化合物。每天测定若干个不同的平板是可能的，利用本发明的综合系统，可对多达6000-20000个不同的化合物进行测定筛选。最近，已开发出试剂操作的显微流体方法。

通过共价或非共价键例如通过标记，可将目的分子与固态成分直接或间接结合。标记可以是各种成分的任一种。一般而言，结合标记的分子(标记结合物)固定于固相支持物上，目的标记分子(例如目的信号转导分子)通过标记和标记结合物的相互作用而附着于固相支持物上。

根据文献中清楚描述的已知分子的相互作用，可使用许多标记和标记结合物。例如，当标记具有天然结合物时，例如生物素、蛋白A或蛋白G，其可与适当标记结合物(抗生物素蛋白、链亲和素、中性抗生物素蛋白、免疫球蛋白的Fc区域等)结合使用。针对带有如生物素的天然结合物的分子的抗体和适合的标记结合物也是广泛得到的(参见SIGMA Immunochemicals 1998目录，SIGMA，St.Louis MO)。

任意半抗原性或抗原性化合物相似地可与适当抗体结合使用，以形成标记/标记结合物对。成千上万的特异抗体都可从市场上得到，并且其他许多抗体在文献中都有描述。例如，在一个共同的构型中，标记是第一抗体，标记结合物是识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用，受体-配体相互作用也适于作为标记和标记-结合物对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如细胞受体-配体的相互作用，如铁传递蛋白、c-试剂盒、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整合蛋白家族、选择蛋白家族等；参见，例如Pigott和Power，The AdhesionMolecule Facts Book I(1993)。同样，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如阿片剂、类固醇等)、胞内受体(例如介导各种小配体的作用，包括类固醇、甲状腺激素、视黄素和维生素D；肽)、药物、凝集素、蔗糖、核酸(线性和环多聚体构型)、寡糖、蛋白、磷脂和抗体都可以与各种细胞受体相互作用。

如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙酰亚胺、聚亚芳基硫、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸的合成多聚体也可形成适当的标记或标记结合物。许多其他的标记/标记结合物对在本发明所述的测定系统中也是有用的，正如专业技术人员在参阅本发明内容后将是清楚的。

如肽、聚醚等的常见接头也可用作标记，包括如介于约5-200个氨基酸的聚甘氨酸序列的多肽序列。这些活接头是本领域技术人员已知的。例如，聚乙二醇接头可从Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama得到。这些接头任选具有酰胺键、硫氢键或杂官能团键。

利用目前任意可得的各种方法，将标记结合物固定于固相基质上。固相基质通常通过将全部或部分基质暴露给化学试剂而被衍生或功能化，所述化学试剂是将化学基团固定于与部分标记结合物反应的表面上。例如，适于附着较长链部分的基团包括胺、羟基、硫醇和羧基基团。氨烷基硅烷和羟烷基硅烷可用于使各种表面功能化，如玻璃表面。构建这些固相生物多聚体阵列在文献中已有清楚描述，参见，例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102：259-274(1987)(描述了在针状物上固相成分的合成)；Frank和Doring，Tetrahedron 44：60316040(1988)(描述了在纤维素圆形物上各种肽序列的合成)；Fodor等，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)：718-719(1993)；和Kozal等，Nature Medicine 2(7)：753759(1996)(全部描述了固定于固相基质的生物多聚体阵列)。将标记结合物固定于底物的非化学途径包括其他常用方法，如热、紫外辐射交联等。

D.基于计算机分析

对调节BCA-GPCR活性的化合物的另一测定包括计算机辅助药物设计，其中根据由氨基酸序列编码的结构信息，计算机系统用于生成BCA-GPCR的三维结构。输入的氨基酸序列与计算机程序中预先设立的算法直接和主动地相互作用，产生蛋白的二级、三级和四级结构模型。然后检验蛋白结构的模型以便鉴定具有结合能力的结构区。

将这些区域再用于鉴定与蛋白结合的配体。

将至少10个氨基酸残基的蛋白氨基酸序列或编码BCA-GPCR的对应核酸序列输入计算机系统，产生蛋白的三维结构模型。编码多肽的核苷酸序列或其氨基酸序列选自SEQ ID NO：1-8及其保守修饰版本。氨基酸序列表示蛋白的一级序列或亚序列，其编码蛋白的结构信息。至少10个残基的氨基酸序列(或编码10个氨基酸的核苷酸序列)通过计算机键盘和计算机可读介质输入到计算机系统中，所述计算机可读介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、胶卷和芯片)、光介质(例如CDROM)、通过互联网和RAM传播的信息。然后通过氨基酸序列和计算机系统的相互作用，使用本领域技术人员已知的软件，生成蛋白的三维结构模型。

氨基酸序列表示编码信息的一级结构，所述信息对形成目的蛋白的二级、三级和四级结构是必须的。软件能阅读由一级序列编码的某些参数以生成结构模型。这些参数称为“能量术语”，其主要包括静电电位、疏水性电位、溶剂可达的表面和氢键。二级能量术语包括范德华电位。生物分子以累积方式形成使能量术语最小化的结构。所以计算机程序利用由一级结构或氨基酸序列编码的这些术语来产生二级结构模型。

然后，在二级结构能量术语基础上形成由二级结构编码的蛋白的三级结构。此时用户可以输入其他变量，如蛋白是否是膜结合的或可溶性的、其在体内和细胞内的定位，如细胞质、表面或核中。这些变量和二级结构的能量术语一起用于形成三级结构模型。在制作三级结构模型中，计算机程序匹配同样的二级结构疏水表面和同样的二级结构亲水表面。

一旦结构已生成，由计算机系统来鉴定潜在的调节剂结合区。如上所述，通过输入氨基酸或核苷酸序列或化合物的化学式，可生成潜在调节剂的三维结构。再将潜在调节剂的三维结构与BCA-GPCR的三维结构比较，以鉴定结合BCA-GPCR的配体。采用能量术语确定蛋白和化合物之间的结合亲和性，从而确定哪些化合物具有提高的与蛋白结合的可能性。

计算机系统也用于筛选BCA-GPCR基因的突变、多肽变体、等位基因和种间同系物。这些突变可与疾状况态或遗传特征相关。如上所述，GeneChip^TM和相关技术也可用于筛选突变、多态变体、等位基因和种间同系物。一旦变体得到鉴定，诊断测定就可用于鉴定具有这些突变基因的患者。鉴定突变的BCA-GPCR基因包括分别接受选自SEQ ID NO：1-8及其保守修饰版本、编码BCA-GPCR的第一核酸或氨基酸序列输入。如上所述，将序列输入到计算机系统。再将第一核酸或氨基酸序列同与第一序列基本相同的第二核酸或氨基酸序列比较。以上述方式将第二序列输入到计算机系统中。一旦将第一和第二序列比较后，就可鉴定序列间核苷酸或氨基酸的差异。这些序列可表示BCA-GPCR基因中等位基因差异以及与疾状况态和遗传特性相关的突变。

试剂盒

BCA-GPCR及其同系物是鉴定细胞如癌细胞、法医和亲子鉴定，诊断如癌症的疾病，例如乳腺癌，以及测定信号转导的有用工具。与BCA-GPCR核酸，如BCA-GPCR探针和引物，特异性杂交的BCA-GPCR特异试剂以及与BCA-GPCR蛋白如BCA-GPCR抗体特异性结合的BCA-GPCR特异试剂可用于测定信号转导的调节。

用于检测样品中BCA-GPCR DNA和RNA存在的核酸测定方法包括许多本领域专业技术人员已知的技术，如Southern分析、Northern分析、斑点印迹、核糖核酸酶保护、S1分析、如PCR和LCR的扩增技术和原位杂交。在原位杂交中，例如将靶核酸从其细胞环境中释放出来，以用于细胞内杂交，而保存细胞形态用于随后的说明和分析。下列文献提供了原位杂交的技术综述：Singer等，Biotechniques 4：230-250(1986)；Haase等，Methods in Virology，第VII卷，第189-226页(1984)；和Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(Hames等编，1987)。另外，使用上述的各种免疫测定技术可检测BCA-GPCR。通常将测试样品与阳性对照(例如表达重组BCA-GPCR的样品)和阴性对照比较。

本发明还提供了筛选BCA-GPCR或核酸的调节剂的试剂盒。这些试剂盒可从容易得到的材料和试剂中制备。例如，这些试剂盒可包含下列任何一个或多个材料：BCA-GPCR核酸或蛋白、反应管和测试BCA-GPCR活性的说明书。试剂盒任选含有生物活性的BCA-GPCR。根据本发明，根据试剂盒的目的用途和用户的特定要求，可制备各种试剂盒和成分。

给药和药物组合物

BCA-GPCR调节剂可直接给哺乳动物受试对象施用，用于调节体内信号转导，例如用于癌症如乳腺癌的治疗。给药可通过任意途径实现，所述途径正常用于将调节剂化合物导入与待治疗组织的最终接触。BCA-GPCR调节剂以任何适当方式施用，任选与可药用载体一起施用。施用这些调节剂的合适方法是可用的并且是本领域技术人员熟知的，虽然有一个以上途径可用于施用特定组合物，但特定途径经常能比其他途径提供更直接和更有效的反应。

由即将施用的特定组合物以及施用组合物所用的特定方法可部分确定可药用载体。因此有许许多多各种各样的本发明药物组合物的适合的配方(参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985))。

BCA-GPCR调节剂单独或与其他适当成分组合可制成通过吸入给药的汽雾剂(即它们可被“汽雾化”)。汽雾剂能放置于可加压的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷和氮等。

适于给药的制剂包括水溶液和非水溶液、等渗无菌溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、细菌抑制剂和让制剂等渗的溶质，和可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的非水无菌悬浮液。在本发明的实践中，例如通过口服、局部、静脉内、腹膜内、膀胱内、鞘内可施用组合物。组合物任选口服或鼻内施用。化合物制剂可以单剂量或多剂量的密封容器呈现，如安瓿和小瓶。溶液和悬浮液可从前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂中制备。调节剂也可作为部分制备的食物或药物被施用。

在本发明情况下，给患者施用的剂量应足以在一段时间中给受试对象产生有益的应答。这些剂量可以预防性地施用或给已患病的个体施用。给患者施用组合物的量应足以在患者中引发有效的保护或治疗应答。足够实现此目的的量定义为“治疗有效量”。剂量将由所使用的特定BCA-GPCR调节剂(例如GPCR拮抗剂和抗GPCR抗体)的功效和受试对象的状况以及体重或待治疗区的表面积来确定。剂量的大小也将由伴随特定受试对象中特定化合物或载体的施用而带来的状况、性质和任何副作用程度来确定。

在确定待施用调节剂的有效量时，医生可评估调节剂的血浆循环水平、调节剂的毒性和抗调节剂抗体的产生。一般而言，调节剂剂量对通常的受试对象是约1ng/kg-10mg/kg。

对于给药，如同适合受试对象的体重和整体健康程度一样，本发明调节剂的施用可由调节剂的LD-50和各种浓度下抑制剂的副作用所确定的速度进行。给药剂量可以一次或分次完成。

本说明书引用的所有出版物和专利申请都引入本文作为参考，如同各个出版物或专利申请是特异和单个地引作参考一样。

尽管为了清楚理解目的，上述发明通过说明和例子已在一定程度上进行了详细描述，但对本领域普通专业技术人员来说，按照本发明的教导，在不脱离本发明权利要求书的实质和范围内，可以很明显做出某些变化和修饰。

实施例

下列实施例仅以说明而非限制方式提供。本领域的那些专业技术人员可容易识别能产生基本相似结果的各种被改变或修饰的非关键参数。实施例I：鉴定和克隆新型BCA-GPCR

克隆了四种人BCA-GPCR，它们的核酸序列提供在SEQ ID NO：1、3、5和7中。推导的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：2、4、6和8中。将新型BCA-GPCR分别命名为BCA-GPCR-1、-2、-3和-4。

这些序列可利用下列PCR引物和标准的PCR条件从cDNA或基因组DNA中进行扩增：

ATGTTGGAACGTCGCCATC(SEQ ID NO：9)和

TCATCCACAGAGCCTCCAGAT(SEQ ID NO：10)(BCA-GPCR-1)

ATGGGAAAGGACAATCCAGTF(SEQ ID NO：11)和

CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA(SEQ ID NO：12)；(BCA-GPCR-2)

ATGGAAATAGCCAATGTGAGTIC(SEQ ID NO：13)和

TAAATITGCGCCAGCTTGCCTG(SEQ ID NO：14)；(BCA-GPCR-3)

和

ATGGTGAGACATACCAATGAGAG(SEQ ID NO：15)和

CATAAAATATITACTCCCAGAGCC(SEQ ID NO：16)(BCA-GPCR-4)。实施例II：在乳腺癌细胞和肿瘤中BCA-GPCR-3的mRNA表达和基因扩增

根据标准方法学测定乳腺癌细胞系和肿瘤中BCA-GPCR-3的基因扩增(参见图1)。

根据标准方法学，利用RT-PCR测定在乳腺癌细胞系中表达的BCA-GPCR-3mRNA。在来自扩增和非扩增肿瘤的癌细胞系中，BCA-GPCR-3的mRNA水平即致癌基因标记提高了。

序列表BCA-GPCR-1核酸序列：SEQ ID NO：1AGTGCCAGAAAATGCCGCAACATGAAAAGTGACAACCATAGCTCTTAGGGGACTCCCCTAAAGCCTTCATCCTTCTGGGTGTGTCTGACAGGCCGTGGCTGGAACTCCCTCTCTTTGTGGTCCTCCTGCTGTCCTATGTGCTGGCCATGTTGGGGAACGTCGCCATCATCCTGGCATCCCGGGTGGATCCTCAACTCCACAGCCCCATGTACATCTTCCTCAGTCACCTGTCCTTCCTGGACCTCTGCTACACCACCACGACAGTCCCTCAGATGCTGGTCAACATGGGCAGTTCCCAGAAGACCATCAGCTATGGAGGCTGCACTGTGCAATATGCAGTCTTCCACTGGCTGGGATGCACGGAGTGCATCGTCCTGGCCGCCATGGCCCTGGACCGCTACGTGGCCAGCTGCAAGCCCCTGCACTATGCCGTTCTCATGCACCGTGCTCTCTGTCAGCAGCTCGTGGCTCTGGCCTGGCTCAGTGGCTTCGGCAACTCCTTCGTGCAGGTGGTCCTGACGGTGCAATTGCCATTCTGCGGGCGGCAGGTGCTGAACAACTTTTTCTGTGAGGTGCCGGCCGTGATCAAGCTGTCGTGTGCTGACACCGCTATGAATGACACCATACTGGCTGTGCTGGTGGCCTTCTTCGTGTTGGTGCCCCTGGCTCTCATCCTTCTCTCCTATGGCTTTATTGCCCGGGCAGTGCTCAGGATCCAGTCCTCCAAGGGACGACACAAGGCCTTTGGGACGTGTTCCTCCCACCTGATGATCGTCTCCCTCTTCTACCTACCTGCGATTTACATGTATCTGCAGCCCCCTTCCAGCTACTCCCAAGAGCAGGGCAAATTTATTTCTCTCTTCTATTCCATAATCACCCCCACTCTCAATCCCTTCACCTACACCCTGAGAAATAAAGATATGAAGGGGGCTCTGAGGAGACTTCTGGCCAGGATCTGGAGGCTCTGTGGATGATGAGGACATGAGATGTAGCATCTCCATCAATTAAAGAACACAGCACAAGTCTATTGTGCACBCA-GPCR-1氨基酸序列：SEQ ID NO：2(LLGDSPKAFILLGVSDRPWLELPLFVVLLLSYVLA)MLGNVAIILASRVDPQLHSPMYIFLSHLSFLDLCYTTTTVPQMLVNMGSSQKTISYGGCTVQYAVFHWLGCTECIVLAAMALDRYVASCKPLHYAVLMHRALCQQLVALAWLSGFGNSFVQVVLTVQLPFCGRQVLNNFFCEVPAVIKLSCADTAMNDTILAVLVAFFVLVPLALILLSYGFIARAVLRIQSSKGRHKAFGTCSSHLMIVSLFYLPAIYMYLQPPSSYSQEQGKFISLFYSIITPTLNPFTYTLRNKDMKGALRRLLARIWRLCGBCA-GPCR-2核酸序列：SEQ ID NO：3GGCAAATGGCTCTCTTAACTTCACAGACCTGTAAATGGAAATTGGAGAGTGCCAGATCATCTGCATGTGCCCCCTTATCTAATTCTTTGGTTGTTTCTCTGTAATAGCTGGTGGATTATGGGAAAGGACAATGCCAGTTACCTACAGGCATTCATCCTGGTGGGCTCTTCTGATCGGCCTGGACTGGAGAAAATTCTCTTTGCTGTTATCTTGATCTTCTGCATCCTGACCCTGGTGGGCAACACTGCCATCATCCTCTTGCTGGTCATGGATGTCAGGCTCCACACACCCATGTACTTCTTTCTTGGGAATCTGTCTTTCTTAGATCTCTGCTTTACAGCAAGCATTGCCCCTCAGCTGCTGTGGAACCTGGGGGGTCCAGAGAAGACCATCACCTACCACGGCTGTGTGGCCCAACTCTACATCTACATGATGCTGGGCTCCACCGAGTGCGTCCTCCTGGTTGTCATGTCCCATGACCGCTATGTGGCCGTCTGCCGGTCCCTGCACTACATGGCAGTCATGCGCCCACATCTCTGCCTGCAGCTGGTGACTGTGGCCTGGTGCTGTGGCTTCCTAAACTCCTTCATCATGTGTCCTCAGACGATGCAGCTCTCCCGGTGTGGACGTCGCAGGGTGGACCACTTCCTGTGTGAGATGCCTGCTCTTATTGCCATGTCTTGTGAGGAAACCATGCTGGTAGAAGCGATTCACCTTTGCCCTGGGGGTGGCTCTCCTCCTGGTGCCGCTCTCCCTCATCCTCATCTCTATGGCGTGATTGCAGCCGCGGTGCTGAGGATGAAGTCAGCAGCAGGGCGAAAGAAAGCCTTCCACACCTGCTCTTCTCACCTCACAGTGGTCTCTCTCTTCTACGGAACCATCATCTACGTGTACCTGAAGCCGGCCAACAGCTACTCCCAAGATCAGGGGAAGTTCCTGACTCTCTTCTACACCATCGTCATTCCCAGCATCAACCCCCTCATCTACACTTTGAGGAACAAGGATGTGAAGGGGACCATGAAGAAACTTCTGGGGTGGGAGAAAGGGGCTGGGGAGCCTCAACGAGGGGAACACTCTAGTAATGTAGACAGTTTGCTGGAGTTACTCTCTTAGATGTGTCTGTGGCCATGTGGAGAACTAATATTCAAGGAGTAGAGTGAACGCGGGTGGGAAAATGCTTTCGAGTTTGACCCCGTCCTCTGCCCTCTGGATGTGAAGTGGTTTCCTTCTGTTTGAAGTTGCCTGCTTCAGGATATCTCTGCTGTATCTTGCACTTTCCTTGTCTTTTTGATTTATCCACAACTGCTGGGGACTTACAAAACTAATTCAATCACCCAAAGGCACTGGGCAGTCTGCAGATTATGTCATGGATGTCAAATAAAAATTGAGACAACATGaaaaaaaaaaaaaaBCA-GPCR-2氨基酸序列：SEQ ID NO：4MGKDNASYLQAFILVGSSDRPGLEKILFAVILIFCILTLVGNTAIILLLVMDVRLHTPMYFFLGNLSFLDLCFTASIAPQLLWNLGGPEKTITYHGCVAQLYIYMMLGSTECVLLVVMSHDRYVAVCRSLHYMAVMRPHLCLQLVTVAWCCGFLNSFIMCPQTMQLSRCGRRRVDHFLCEMPALIAMSCEETMLVEAIHLCPGGGSPPGAALPHPHLYGVIAAAVLRMKSAAGRKKAFHTCSSHLTVVSLFYGTIIYVYLKPANSYSQDQGKFLTLFYTIVIPSINPLIYTLRNKDVKGTMKKLLGWEKGAGEPQRGEHSSNVDSLLELLSBCA-GPCR-3核酸序列：SEQ ID NO：5GATTGTGTCTCTAAAAAAGAATAACATAAAATGAACTAAAATACACTTTTAATGTTTGCTAACTGATGTAATTGCTTCATGTCTCATGCCCTGTATGCCCTGTGCTCTTCCCACAGGTGGCCTTTTGCCCCACCCCCAGCATACAATGATGGAAATAGCCAATGTGAGTTCTCCAGAAGTCTTTGTCCTCCTGGGCTTCTCCGCACGACCCTCACTAGAAACTGTCCTCTTCATAGTTGTCTTGAGTTTTTACATGGTATCGATCTTGGGCAATGGCATCATCATTCTGGTCTCCCATACAGATGTGCACCTCCACACACCTATGTACTTCTTTCTTGCCAACCTCTCCTTCCTGGACATGAGCTTCACCACGAGCATTGTCCCACAGCTCCTGGCTAACCTCTGGGGACCACAGAAAACCATAAGCTATGGAGGGTGTGTGGTCCAGTTCTATATCTCCCATTGGCTGGGGGCAACCGAGTGTGTCCTGCTGGCCACCATGTCCTATGACCGCTACGCTGCCATCTGCAGGCCACTCCATTACACTGTCATTATGCATCCACAGCTTTGCCTTGGGCTAGCTTTGGCCTCCTGGCTGGGGGGTCTGACCACCAGCATGGTGGGCTCCACGCTCACCATGCTCCTACCGCTGTGTGGGAACAATTGCATCGACCACTTCTTTTGCGAGATGCCCCTCATTATGCAACTGGCTTGTGTGGATACCAGCCTCAATGAGATGGAGATGTACCTGGCCAGCTTTGTCTTTGTTGTCCTGCCTCTGGGGCTCATCCTGGTCTCTTACGGCCACATTGCCCGGGCCGTGTTGAAGATCAGGTCAGCAGAAGGGCGGAGAAAGGCATTCAACACCTGTTCTTCCCACGTGGCTGTGGTGTCTCTGTTTTACGGGAGCATCATCTTCATGTATCTCCAGCCAGCCAAGAGCACCTCCCATGAGCAGGGCAAGTTCATAGCTCTGTTCTACACCGTAGTCACTCCTGCGTTGAACCCACTTATTTACACCCTGAGGAACACGGAGGTGAAGAGCGCCCTCCGGCACATGGTATTAGAGAACTGCTGTGGCTCTGCAGGCAAGCTGGCGCAAATTTAGAGACTCCAGTGCCTTCTGAGAAGGAAGATCAAGTTTACATCGAGCAAAGTGACCTTGGAAGACAGGGCACTTGGGATGTCGTTTTTCTTCTAATATTGTTTGAGCTCAAGGTAGATGGAAATCTGAAAGGAGTGTGCTCATGCCATTTCCAGACCAAGAAAACACATTTATTATTTGCTAATTATCATAGTTTTGTTCAATTGCGTTGTTGGTTTTTGCTATATATACACATGTTGACTGTCABCA-GPCR-3氨基酸序列：SEQ ID NO：6MPCMPCALPTGGLLPHPQHTMMEIANVSSPEVFVLLGFSARPSLETVLFIVVLSFYMVSILGNGIIILVSHTDVHLHTPMYFFLANLSFLDMSFTTSIVPQLLANLWGPQKTISYGGCVVQFYISHWLGATECVLLATMSYDRYAAICRPLHYTVIMHPQLCLGLALASWLGGLTTSMVGSTLTMLLPLCGNNCIDHFFCEMPLIMQLACVDTSLNEMEMYLASFVFVVLPLGLILVSYGHIARAVLKIRSAEGRRKAFNTCSSHVAVVSLFYGSIIFMYLQPAKSTSHEQGKFIALFYTVVTPALNPLIYTLRNTEVKSALRHMVLENCCGSAGKLAQIBCA-GPCR-4核酸序列：SEQ ID NO：7ATTGTCACTCATTTAACCCTATGTGATGTGTTATCTTTCTCAGCTATGCCTCAGCCTTGGGGAACACACTTTACATATGGGGATGGTGAGACATACCAATGAGAGCAACCTAGCAGGTTTCATCCTTTTAGGGTTTTCTGATTATGCTCAGTTACAGAAGGTTCTATTTGTGCTCATATTGATTCTGTATTTACTAACTATTTTGGGGAATACCACCATCATTCTGGTTTCTCGTCTGGAACCCAAGCTTCATATGCCGATGTATTTCTTCCTTTCTCATCTCTCCTTCCTGTACCGCTGCTTCACCAGCAGTGTTATTCCCCAGCTCCTGGTAAACCTGTGGGAACCCATGAAAACTATCGCCTATGGTGGCTGTTTGGTTCACCTTTACAACTCCCATGCCCTGGGATCCACTGAGTGCGTCCTCCCGGCTCTGATGTCCTGTGACCGCTATGTGGCTGTCTGCCGTCCTCTCCATTACACTGTCTTAATGCATATCCATCTCTGCATGGCCTTGGCATCTATGGCATGGCTCAGTGGAATAGCCACCACCCTGGTACAGTCCACCCTCACCCTGCAGCTGCCCTTCTGTGGGCATCGCCAAGTGGATCATTTCATCTGCGAGGTCCCTGTGCTCATCAAGCTGGCTTGTGTGGGCACCACGTTTAACGAGGCTGAGCTTTTTGTGGCTAGTATCCTTTTCCTTATAGTGCCTGTCTCATTCATCCTGGTCTCCTCTGGCTACATTGCCCACGCAGTGTTGAGGATTAAGTCAGCTACCGGGAGACAGAAAGCATTCGGGACCTGCTTCTCCCACCTGACAGTGGTCACCATCTTTTATGGAACCATCATCTTCATGTATCTGCAGCCAGCCAAGTAGTAGATCCAGGGACCAGGGCAAGTTTGTTTCTCTCTTCTACACTGTGGTACCCGCATGCTTAACCCTCTTATTTATACCTTGAGGATCAAGGAGGTGAAAGGGGCATTAAAGAAAGTTCTAGCAAAGGCTCTGGGAGTAAATATTTTATGATTATTAAAAAAAAATTTAAGTGACACTGTGATGAABCA-GPCR-4氨基酸序列：SEQ ID NO：8MCYLSQLCLSLGEHTLHMGMVRHTNESNLAGFILLGFSDYAQLQKVLFVLILILYLLTILGNTTIILVSRLEPKLHMPMYFFLSHLSFLYRCFTSSVIPQLLVNLWEPMKTIAYGGCLVHLYNSHALGSTECVLPALMSCDRYVAVCRPLHYTVLMHIHLCMALASMAWLSGIATTLVQSTLTLQLPFCGHRQVDHFICEVPVLIKLACVGTTFNEAELFVASILFLIVPVSFILVSSGYIAHAVLRIKsATGRQKAFGTCFSHLTVVTIFYGTIIFMYLQPAKSRSRDQGKFVSLFYTVVTRMNPLIYTLRIKEVKGALKKVLAKALGVNIL

Claims (41)

1.编码G蛋白偶联受体多肽的分离的核酸，由所述核酸编码的所述多肽与氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8有70％以上的氨基酸同一性。

2.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸编码了与多克隆抗体特异性结合的多肽，所述多克隆抗体针对氨基酸序列SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8而产生。

3.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸编码具有G蛋白偶联受体活性的多肽。

4.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多肽。

5.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸含有核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7。

6.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸是来自人、小鼠或大鼠。

7.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸通过在严格杂交条件下与和选自下组引物对相同序列特异性杂交的引物扩增：

ATGTTGGGGAACGTCGCCATC(SEQ ID NO：9)和

TCATCCACAGAGCCTCCAGAT(SEQ ID NO：10)；

ATGGGAAAGGACAATCCAGTT(SEQ ID NO：11)和

CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA(SEQ ID NO：12)；

ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC(SEQ ID NO：13)和

TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG(SEQ ID NO：14)；

和

ATGGTGAGACATACCAATGAGAG(SEQ ID NO：15)和

CATAAAATATTTACTCCCAGAGCC(SEQ ID NO：16)。

8.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸编码约介于25-35kDa或约介于32-42kDa分子量的多肽。

9.编码G蛋白偶联受体多肽的分离的核酸，其中所述核酸在严格杂交条件下与具有核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7的核酸特异性杂交。

10.编码G蛋白偶联受体多肽的分离的核酸，由所述核酸编码的所述多肽与具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多肽有约70％以上的氨基酸同一性，其中所述核酸在适度严格杂交条件下与核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5或SEQ ID NO：7选择性杂交。

11.分离G蛋白偶联受体多肽，所述多肽包含与氨基酸序列SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8有约70％以上的氨基酸序列同一性。

12.权利要求11所述的分离多肽，其中所述多肽与针对SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8产生的多克隆抗体特异性结合。

13.权利要求11所述的分离多肽，其中所述多肽具有G蛋白偶联受体活性。

14.权利要求11所述的分离多肽，其中所述多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8。

15.权利要求11所述的分离多肽，其中所述多肽来自人、大鼠或小鼠。

16.与权利要求11所述的多肽选择性结合的抗体。

17.含有权利要求1所述的核酸的表达载体。

18.用权利要求17所述的载体转染的宿主细胞。

19.鉴定调节信号转导的化合物的方法，所述方法包括下列步骤：

(i)将化合物与和氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8有70％以上氨基酸序列同一性的多肽接触，和

(ii)确定化合物对多肽的功能效应。

20.权利要求19所述的方法，其中所述多肽具有G蛋白偶联受体的活性。

21.权利要求19所述的方法，其中所述多肽与固相连接。

22.权利要求21所述的方法，其中所述多肽与固相共价连接。

23.权利要求19所述的方法，其中所述功能效应的确定是测定胞内cAMP、IP3或Ca²⁺的变化。

24.权利要求19所述的方法，其中所述功能效应是化学效应。

25.权利要求19所述的方法，其中所述功能效应是物理效应。

26.权利要求19所述的方法，其中所述功能效应的确定是检测化合物与多肽的结合。

27.权利要求19所述的方法，其中所述多肽是重组的。

28.权利要求19所述的方法，其中所述多肽来自大鼠、小鼠或人。

29.权利要求19所述的方法，其中所述多肽含有氨基酸序列SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8。

30.权利要求19所述的方法，其中所述多肽在细胞或细胞膜中表达。

31.权利要求30所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。

32.治疗癌症的方法，所述方法包括将癌细胞与治疗有效量的抗体接触的步骤，所述抗体与和氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8有70％以上氨基酸同一性的多肽特异性结合。

33.权利要求34所述的方法，其中所述抗体与和氨基酸序列SEQID NO：6有70％以上氨基酸同一性的多肽特异性结合。

34.治疗癌症的方法，所述方法包括将含有G蛋白偶联受体的癌细胞与治疗有效量化合物接触的步骤，所述化合物采用权利要求19所述的方法鉴定。

35.权利要求34所述的方法，其中所述癌是乳腺癌。

36.权利要求34所述的方法，其中所述化合物是多肽拮抗剂，所述多肽与氨基酸序列SEQ ID NO：6有70％以上的氨基酸同一性。

37.检测人组织中存在BCA-GPCR核酸或多肽的方法，所述方法包括下列步骤：

(i)分离生物样品；

(ii)将生物样品与和BCA-GPCR核酸或多肽选择性相关的BCA-GPCR特异试剂接触；和

(iii)检测与样品选择性相关的BCA-GPCR特异试剂的水平。

38.权利要求37所述的方法，其中所述BCA-GPCR特异试剂选自：BCA-GPCR特异抗体、BCA-GPCR特异寡核苷酸引物和BCA-GPCR特异核酸探针。

39.权利要求37所述的方法，其中所述组织是乳腺癌组织。

40.制备G蛋白偶联受体多肽的方法，所述方法包括从含有编码所述多肽的核酸的重组表达载体中表达所述多肽的步骤，其中所述多肽的氨基酸序列包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多肽有约70％以上的氨基酸同一性。

41.制备包含G蛋白偶联受体多肽的重组细胞的方法，所述方法包括用含有编码多肽的核酸的表达载体转导细胞的步骤，其中所述多肽的氨基酸序列与具有氨基酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6或SEQ ID NO：8的多肽有约70％以上的氨基酸同一性。

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