ES2250369T3 - Receptor acoplado a la proteina g. - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, comprendiendo el polipéptido codificado por el ácido nucleico más de 70% de identidad aminoacídica con una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6, en el que la expresión del polipéptido está regulada diferencialmente en células de cáncer de mama y tumores en comparación con células de epitelio mamario normales.

Description

Receptor acoplado a la proteína G.

Campo de la invención

La invención proporciona secuencias de ácido nucleico y aminoacídicas aisladas de cuatro nuevos receptores acoplados a proteína G que se amplifican en células de cáncer de mama, anticuerpos de dichos receptores, procedimientos de detección de dichos ácidos nucleicos y receptores, y procedimientos de examen de moduladores de receptores acoplados a proteína G.

Antecedentes de la invención

Los receptores acoplados a proteína G son receptores de superficie celular que transducen indirectamente señales extracelulares a efectores cadena abajo, que pueden ser proteínas de señalización intracelular, enzimas o canales, y cambios en la actividad de estos efectores median después eventos celulares posteriores. La interacción entre el receptor y el efector cadena abajo está mediada por una proteína G, una proteína heterotrimérica que se une a GTP. Los receptores acoplados a proteína G ("GPCR") tienen típicamente siete regiones transmembrana, junto con un domino extracelular y una cola citoplásmica en la terminación C. Estos receptores forman una gran superfamilia de moléculas receptoras relacionadas que desempeñan un papel clave en muchos procesos de señalización, tales como la transducción de señal sensorial y hormonal. Por ejemplo, se ha identificado una gran familia de GPCR olfatorios (véase, por ejemplo, Buck & Axel, Cell 65: 175-187 (1991)). La identificación adicional de los GPCR es importante para comprender el proceso normal de transducción de señal así como su implicación en procesos patológicos. Por ejemplo, los GPCR pueden utilizarse para diagnóstico de enfermedades, así como para el descubrimiento de fármacos. Por lo tanto, la identificación adicional de nuevos GPCR es de gran interés.

Una publicación de Carmeci et al. da a conocer detalles de un gen de GPR30, dicho gen tiene homología con la superfamilia de receptor acoplado a proteína G asociada a la expresión de receptor de estrógeno en cáncer de mama. Sin embargo, el receptor acoplado a proteína G dado a conocer en la presente memoria es distinto del que se identifica en la presente solicitud.

Todas las referencias a SEC Nº ID 1, 2, 3, 4, 7 y 8 en la memoria descriptiva se realizan sólo con fines informativos, y no se pretende que entren dentro del alcance de la invención reivindicada.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona por tanto por primera vez cuatro nuevos ácidos nucleicos que codifican receptores acoplados a proteína G que se amplifican y/o se sobreexpresan en células de cáncer de mama. Estos ácidos nucleicos y los polipéptidos que codifican se refieren como "receptores acoplados a proteína G amplificados en cáncer de mama" o "BCA-GPCR", concretamente, "BCA-GPCR-1", "BCA-GPCR-2", "BCA-GPCR-3" y "BCA-GPCR-4". Estos BCA-GPCR son componentes de rutas de transducción de señal en células, y pueden utilizarse para el diagnóstico de cáncer, en particular cánceres de mama, así como en ensayos de examen de compuestos terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos y antagonistas de BCA-GPCR-3 como productos terapéuticos del cáncer.

En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, comprendiendo el polipéptido codificado por el ácido nucleico más de 70% de identidad aminoacídica con una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, en el que el ácido nucleico hibrida específicamente en condiciones rigurosas de hibridación con un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica de SEC Nº ID 5.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, comprendiendo el polipéptido codificado por el ácido nucleico más de aproximadamente 70% de identidad aminoacídica con un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6, en el que el ácido nucleico hibrida selectivamente en condiciones moderadamente rigurosas de hibridación con una secuencia nucleotídica de SEC Nº ID 5.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de la invención, y una célula hospedadora que comprende el vector de expresión.

En una realización, el ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica de SEC Nº ID 5. En otra realización, el ácido nucleico es de un ser humano, un ratón o una rata. En otra realización, el ácido nucleico se amplifica por cebadores que hibridan específicamente en condiciones rigurosas de hibridación con la misma secuencia que los conjuntos cebadores seleccionados del grupo constituido por:

\vskip1.000000\baselineskip

ATGTTGGGGAACGTCGCCATC (SEC Nº ID 9) y

TCATCCACAGAGCCTCCAGAT (SEC Nº ID 10);

ATGGGAAAGGACAATCCAGTT (SEC Nº ID 11) y

CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA (SEC Nº ID 12);

ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC (SEC Nº ID 13) y

TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG (SEC Nº ID 14);

y

ATGGTGAGACATACCAATGAGAG (SEC Nº ID 15) y

CATAAAATATTTACTCCCAGAGCC (SEC Nº ID 16).

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado, comprendiendo el polipéptido más del 70% aproximadamente de identidad de secuencia aminoacídica con una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

En una realización, el polipéptido se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra la SEC Nº ID 6 o una porción inmunogénica de la misma. En otra realización, el polipéptido es de un ser humano, una rata o un ratón. En otra realización, el polipéptido tiene una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6 o una porción inmunogénica de la misma.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que se une a un polipéptido aislado, comprendiendo el polipéptido más de aproximadamente 70% de identidad de secuencia aminoacídica con una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

En otro aspecto la presente invención proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que modula la transducción de señal de un BCA-PCR, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (i) poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende más de 70% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6 y (ii) determinar el efecto funcional del compuesto sobre el polipéptido.

En una realización, el polipéptido está ligado a una fase sólida. En otra realización, el polipéptido está ligado covalentemente a una fase sólida.

En una realización, el efecto funcional se determina midiendo los cambios en el AMPc, IP3 o Ca^{2+} intracelular. En otra realización, el efecto funcional es un efecto químico o un efecto físico. En otra realización, el efecto funcional se determina midiendo la unión del compuesto al polipéptido.

En una realización, el polipéptido es recombinante. En otra realización, el polipéptido se expresa en una célula o membrana celular, por ejemplo, una célula o membrana celular eucariótica.

En una realización, el cáncer es cáncer de mama.

En otra realización, el compuesto es un antagonista de un polipéptido, comprendiendo el polipéptido más de 70% de identidad aminoacídica con la secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento del cáncer, comprendiendo el procedimiento las etapas de poner en contacto una célula cancerosa con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, uniéndose específicamente el anticuerpo a un polipéptido que comprende más de 70% de identidad aminoacídica con la secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

En una realización, el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende más de 70% de identidad aminoacídica con la secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de detección de la presencia de un ácido nucleico o polipéptido de BCA-GPCR en tejido humano, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (i) aislar una muestra biológica, (ii) poner en contacto la muestra biológica con un reactivo específico de BCA-GPCR que se asocia selectivamente con un ácido nucleico o polipéptido de BCA-GPCR y (iii) detectar el nivel de reactivo específico de BCA-GPCR que se asocia selectivamente con la muestra.

En una realización, el reactivo específico de BCA-GPCR se selecciona del grupo constituido por: anticuerpos específicos de BCA-GPCR, cebadores oligonucleotídicos específicos de BCA-GPCR y sondas de ácido nucleico específicas de BCA-GPCR.

En otra realización, el tejido es tejido de cáncer de mama.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un polipéptido receptor acoplado a proteína G, comprendiendo el procedimiento la etapa de expresar el polipéptido a partir de un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido, en el que la secuencia aminoacídica del polipéptido comprende más de aproximadamente 70% de identidad aminoacídica con un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una célula recombinante que comprende un polipéptido, comprendiendo el polipéptido la etapa de transducir la célula con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido, en el que la secuencia aminoacídica del polipéptido comprende más de aproximadamente 70% de identidad aminoacídica con un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Tumores de cáncer de mama y líneas celulares con copias amplificadas del gen BCA-GPCR-3.

Figura 2: Sobreexpresión de ARNm de BCA-GPCR-3 en líneas celulares de cáncer de mama.

Figura 3: Datos cuantitativos de la sobreexpresión de ARNm de BCA-GPCR-3 en líneas celulares de cáncer de mama.

Descripción detallada de la invención Introducción

La presente invención proporciona por primera vez ácidos nucleicos que codifican cuatro nuevos receptores acoplados a proteína G. Estos ácidos nucleicos y los receptores que codifican se designan individualmente como BCA-GPCR-1, 2, 3 y 4. Estos BCA-GPCR son componentes de rutas de transducción de señal y están asociados a una región genómica amplificada en células de cáncer de mama. Estos ácidos nucleicos proporcionan sondas valiosas para la identificación de células de cáncer de mama, ya que los ácidos nucleicos se amplifican específicamente en ciertas células de cáncer de mama o están muy cercanos (dentro de 100 kb) a regiones que se amplifican y/o sobreexpresan específicamente en células de cáncer de mama. Los ácidos nucleicos que codifican los BCA-GPCR de la invención pueden identificarse utilizando técnicas tales como transcripción inversa y amplificación de ARNm, aislamiento de ARN total o ARN poli A^{+}, transferencia Northern, transferencia en mancha, hibridación in situ, protección de ARNasa, digestión con S1, sondeo con matriz de microchips de ADN y similares.

Se ha determinado la localización cromosómica de los genes, y los cuatro genes están localizados en el cromosoma 1q44 en la siguiente orientación, partiendo del extremo centromérico, cadena 5' a 3': BCA-GPCR-1 (orientación 3'-5'); aproximadamente 40 kb; BCA-GPCR-2 (orientación 5' a 3'); aproximadamente 40 kb; BCA-GPCR-3 (orientación 3'-5'); aproximadamente 60 kb; BCA-GPCR-4 (orientación 5' a 3'), terminando en el extremo telomérico. Estos genes que codifican BCA-GPCR humanos pueden utilizarse para identificar enfermedades, mutaciones y características causadas por y asociadas a BCA-GPCR, tales como cáncer, por ejemplo, cáncer de mama. Los BCA-GPCR de la invención son también útiles para el diagnóstico del cáncer, en particular cáncer de mama.

El aislamiento de nuevos BCA-GPCR proporciona un medio para ensayar e identificar moduladores de la transducción de señal de receptor acoplado a proteína G, por ejemplo, activadores, inhibidores, estimuladores, potenciadores, agonistas y antagonistas. Dichos moduladores de la transducción de señal son útiles para la modulación farmacológica de rutas de señalización, por ejemplo, en células cancerosas tales como cáncer de mama. Dichos activadores e inhibidores identificados utilizando BCA-GPCR pueden utilizarse también para estudiar adicionalmente la transducción de señal. Por tanto, la invención proporciona ensayos para la modulación de la transducción de señal en los que los BCA-GPCR actúan como moléculas informadoras directas o indirectas del efecto de los moduladores sobre la transducción de señal. Los BCA-GPCR pueden utilizarse en ensayos in vitro, ex vivo e in vivo, por ejemplo, para medir cambios en la activación transcripcional de GPCR; unión de ligandos; fosforilación y desfosforilación; unión de GPCR a proteínas G; activación de proteína G; unión a moléculas reguladoras; cambios de voltaje, potencial de membrana y conductancia; flujo iónico; cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como AMPc y trifosfato de inositol; cambios en los niveles de calcio intracelular y liberación de neurotransmisores.

Los procedimientos de ensayo de moduladores de la transducción de señal incluyen ensayos de unión a ligando in vitro que utilizan BCA-GPCR, porciones de los mismos tales como el dominio extracelular, o proteínas quiméricas que comprenden uno o más dominios de un GPCR, expresión de GPCR en oocito o expresión de GPCR en célula de cultivo de tejido, de origen natural o recombinante; expresión en membrana de un GPCR, de origen natural o recombinante; expresión en tejido de un GPCR; expresión de un GPCR en un animal transgénico, etc.

Funcionalmente, los BCA-GPCR representan un receptor acoplado a proteína G con siete dominios transmembrana de la familia de receptores acoplados a proteína G, que interactúa con una proteína G para mediar la transducción de señal (véase, por ejemplo, Fong Cell Signal 8: 217 (1996); Baldwin, Curr. Opin. Cell Biol. 6: 180 (1994)). Los genes que codifican los BCA-GPCR están en el cromosoma 1q44 y están asociados a una región que se amplifica en células de cáncer de mama.

Estructuralmente, la secuencia nucleotídica de BCA-GPCR-1 humano (véase, por ejemplo, la SEC Nº ID 1), codifica un polipéptido con un peso molecular predicho de aproximadamente 31 kDa y un intervalo predicho de 26-36 kDa (véase, por ejemplo, la SEC Nº ID 2). Los genes del BCA-GPCR-1 relacionados de otras especies deben compartir al menos aproximadamente 70% de identidad aminoacídica con una región aminoacídica de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, opcionalmente de 50 a 100 aminoácidos de longitud.

La presente invención proporciona también variantes polimórficas del BCA-GPCR-1 descrito en la SEC Nº ID 1: la variante nº 1, en la que un resto de leucina está sustituido por un resto de ácido aspártico en la posición aminoacídica 7 desde la metionina; la variante nº 2, en la que un resto de ácido aspártico está sustituido por un resto de ácido glutámico en la posición aminoacídica 142 desde la metionina; y la variante nº 3, en la que un resto de glicina está sustituido por un resto de alanina en la posición aminoacídica 6 desde la metionina.

Estructuralmente, la secuencia nucleotídica del BCA-GPCR-2 humano (véase, por ejemplo, la SEC Nº ID 3) codifica un polipéptido con un peso molecular predicho de aproximadamente 37 kDa y un intervalo predicho de 32-42 kDa (véase, por ejemplo, la SEC Nº ID 4). Los genes de BCA-GPCR-2 relacionados de otras especies deben compartir al menos aproximadamente 70% de identidad aminoacídica con una región aminoacídica de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, opcionalmente 50 a 100 aminoácidos de longitud. El BCA-GPCR-2 se amplifica al menos aproximadamente 2-3 veces en un 15% de los tumores de mama primarios y líneas celulares tumorales.

La presente invención proporciona también variantes polimórficas del BCA-GPCR-2 descrito en la SEC Nº ID 4; la variante nº 1, en la que un resto de isoleucina está sustituido por un resto de leucina en la posición aminoacídica 9; la variante nº 2, en la que un resto de ácido glutámico está sustituido por un resto de ácido aspártico en la posición aminoacídica 19; y la variante nº 3, en la que un resto de glicina está sustituido por un resto de alanina en la posición aminoacídica 6.

Estructuralmente, la secuencia nucleotídica del BCA-GPCR-3 humano (véase, por ejemplo, la SEC Nº ID 5 expresada en placenta y testículos) codifica un polipéptido con un peso molecular predicho de aproximadamente 37 kDa y un intervalo predicho de 32-42 kDa (véase, por ejemplo, la SEC Nº ID 6). Los genes de BCA-GPCR-3 relacionados de otras especies deben compartir al menos aproximadamente 70% de identidad aminoacídica con una región aminoacídica de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, opcionalmente 50 a 100 aminoácidos de longitud. El BCA-GPCR-3 se amplifica al menos aproximadamente 3-7 veces en aproximadamente un 15% de los tumores de mama primarios y líneas celulares tumorales (véase la Figura 1). Además, los niveles de ARNm de BCA-GPCR-3 son elevados en líneas celulares de cáncer de mama tanto de tumores amplificados como no amplificados (véanse las Figuras 2-3).

La presente invención proporciona también variantes polimórficas del BCA-GPCR-3 descrito en la SEC Nº ID 6: la variante nº 1, en el que un resto de isoleucina está sustituido por un resto de leucina en la posición aminoacídica 8; la variante nº 2, en la que un resto de ácido glutámico está sustituido por un resto de ácido aspártico en la posición aminoacídica 73; y la variante nº 3, en la que un resto de glicina está sustituido con un resto de alanina en la posición aminoacídica 7.

Estructuralmente, la secuencia nucleotídica de BCA-GPCR-4 humano (véase, por ejemplo, la SEC Nº ID 7) codifica un polipéptido con un peso molecular predicho de aproximadamente 37 kDa y un intervalo predicho de 32-42 kDa (véase, por ejemplo, la SEC Nº ID 8). Los genes de BCA-GPCR-4 relacionados de otras especies deben compartir al menos aproximadamente 70% de identidad aminoacídica con una región aminoacídica de al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, opcionalmente 50 a 100 aminoácidos de longitud. El BCA-GPCR-4 se amplifica al menos aproximadamente 2-3 veces en un 15% de los tumores de mama primarios y líneas celulares tumorales.

La presente invención proporciona también variantes polimórficas del BCA-GPCR-4 descrito en la SEC Nº ID 8: la variante nº 1, en la que un resto de isoleucina está sustituido por un resto de leucina en la posición aminoacídica 7; la variante nº 2, en la que un resto de ácido aspártico está sustituido por un resto de ácido glutámico en la posición aminoacídica 13; y la variante nº 3, en la que un resto de glicina está sustituido por un resto de serina en la posición aminoacídica 10.

Pueden utilizarse regiones específicas del nucleótido BCA-GPCR y de secuencias aminoacídicas para identificar variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de BCA-GPCR. Esta identificación puede realizarse in vitro, por ejemplo, en condiciones rigurosas de hibridación o PCR (utilizando cebadores que hibridan con las SEC Nº ID 1, 3, 5 y 7, por ejemplo las SEC Nº ID 9-16) y secuenciando, o utilizando la información de secuencia en un sistema informático para comparación con otras secuencias nucleotídicas. Típicamente, la identificación de variantes polimórficas y alelos de un BCA-GPCR se realiza comparando una secuencia aminoacídica de aproximadamente 25 aminoácidos o más, por ejemplo, 50-100 aminoácidos. Una identidad aminoacídica de aproximadamente al menos 70% o más, opcionalmente 75%, 80%, 85% ó 90-95% o más demuestra típicamente que una proteína es una variante polimórfica, homólogo interespecie o alelo de un BCA-GPCR. La comparación de secuencia se realiza utilizando los algoritmos de comparación de secuencia BLAST y BLAST 2.0 con los parámetros por defecto, discutidos a continuación. Los anticuerpos que se unen específicamente a un BCA-GPCR o a una región conservada del mismo pueden utilizarse también para identificar alelos, homólogos interespecies o variantes polimórficas. Se espera que las variantes polimórficas, alelos y homólogos interespecies retengan la estructura de siete dominios transmembrana de un receptor acoplado a proteína G.

La información de secuencia nucleotídica y aminoacídica de BCA-GPCR puede utilizarse también para construir modelos de BCA-GPCR en un sistema informático. Estos modelos se utilizan posteriormente para identificar compuestos que pueden activar o inhibir los BCA-GPCR. Dichos compuestos que modulan la actividad de un BCA-GPCR pueden utilizarse para investigar el papel de los BCA-GPCR en la transducción de señal.

Definiciones

"BCA-GPCR" y "BCA-GPCR-1, 2, 3 ó 4" designan nuevos receptores acoplados a proteína G, cuyos genes están localizados en el cromosoma 1q44 y están asociados a una región del cromosoma que se amplifica en células de cáncer de mama. Los BCA-GPCR de la invención tienen siete regiones transmembrana y tienen "actividad receptora acoplada a proteína G", por ejemplo, se unen a proteínas G en respuesta a estímulos extracelulares y promueven la producción de segundos mensajeros tales como IP3, AMPc y Ca^{2+} mediante la estimulación de efectores cadena abajo tales como fosfolipasa C y adenilato ciclasa (para una descripción de la estructura y función de los GPCR véase, por ejemplo, Fong supra, y Baldwin, supra).

Topológicamente, los BCA-GPCR tienen un "dominio extracelular" N-terminal, un "dominio transmembrana" que comprende siete regiones transmembrana y los correspondientes bucles citoplásmico y extracelular, y un "dominio citoplásmico" C-terminal (véase, por ejemplo, Buck & Axel, Cell 65: 175-187 (1991)). Estos dominios pueden identificarse estructuralmente utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, tales como programas de análisis de secuencia que identifican los dominios hidrófobos e hidrófilos (véase, por ejemplo, Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). Dichos dominios son útiles para preparar proteínas quiméricas y para ensayos in vitro de la invención.

"Dominio extracelular" se refiere por lo tanto al dominio de un BCA-GPCR que sobresale de la membrana celular y a menudo se une a un ligando extracelular. Este dominio es a menudo útil para ensayos de unión a ligando in vitro, tanto en fase soluble como sólida.

"Dominio transmembrana" comprende siete regiones transmembrana más los correspondientes bucles citoplásmicos y extracelulares. Ciertas regiones del dominio transmembrana pueden estar implicadas también en la unión a ligando.

"Dominio citoplásmico" se refiere al dominio de un BCA-GPCR que sobresale en el citoplasma después de la séptima región transmembrana y continúa hasta la terminación C del polipéptido.

"Actividad GPCR" se refiere a la capacidad de un GPCR de transducir una señal. Dicha actividad puede medirse, por ejemplo en una célula heteróloga, acoplando un GPCR (o un GPCR quimérico) a una proteína G y un efector cadena abajo tal como PLC, y midiendo los aumentos del calcio intracelular (véase, por ejemplo, Offermans & Simon, J. Biol. Chem. 270: 15175-15180 (1995)). La actividad receptora puede medirse eficazmente registrando los cambios inducidos por ligando en la [Ca^{2+}]_{i} utilizando tintes indicadores fluorescentes de Ca^{2+} y formación fluorométrica de imágenes.

Los términos "BCA-GPCR" y "BCA-GPCR-1, 2, 3 ó 4" se refieren por lo tanto a variantes polimórficas, alelos, mutantes y homólogos interespecies y los dominios de BCA-GPCR de los mismos que (1) tienen aproximadamente 70% de identidad de secuencia aminoacídica, preferiblemente aproximadamente 75, 80, 85, 90 ó 95% o más de identidad de secuencia aminoacídica, con las SEC Nº ID 2, 4, 6 u 8 con una ventana de aproximadamente 25 aminoácidos, preferiblemente 50-100 aminoácidos, o (2) hibridan específicamente (con un tamaño de al menos aproximadamente 100, preferiblemente al menos aproximadamente 500 ó 1.000 nucleótidos) en condiciones rigurosas de hibridación con una secuencia SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7, y variantes modificadas conservativamente de las mismas. Este término se refiere también a un dominio de un BCA-GPCR, como se describe anteriormente, o una proteína de fusión que comprende un dominio de un BCA-GPCR ligado a una proteína heteróloga.

Una "célula hospedadora" es una célula de origen natural o célula transformada que contiene un vector de expresión y apoya la replicación o expresión del vector de expresión. Las células hospedadoras pueden ser células cultivadas, explantes, células in vivo y similares. Las células hospedadoras pueden ser células procarióticas tales como E. coli o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, anfibio o mamífero tales como CHO, HeLa y similares.

"Muestra biológica" como se utiliza en la presente memoria es una muestra de tejido o fluido biológico que contiene ácidos nucleicos o polipéptidos de nuevos BCA-GPCR. Dichas muestras incluyen, pero sin limitación, tejido aislado de seres humanos, ratones y ratas. Las muestras biológicas pueden incluir también secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Se obtiene típicamente una muestra biológica a partir de un organismo eucariótico, tal como insectos, protozoos, aves, peces, reptiles y preferiblemente un mamífero, tal como rata, ratón, vaca, perro, conejillo de Indias o conejo y, lo más preferiblemente, un primate tal como chimpancés o seres humanos.

La frase "efectos funcionales" en el contexto de los ensayos para ensayar compuestos que modulan la transducción de señal mediada por BCA-GPCR, incluye la determinación de cualquier parámetro que esté indirecta o directamente bajo la influencia de un BCA-GPCR, por ejemplo, un efecto funcional, físico o químico. Incluye la unión a ligando, cambios en el flujo iónico, potencial de membrana, flujo de corriente, transcripción, unión a proteína G, amplificación génica, expresión en células cancerosas, fosforilación o desfosforilación de GPCR, transducción de señal, interacciones receptor-ligando, concentraciones de segundo mensajero (por ejemplo, AMPc, GMPc, IP_{3} o Ca^{2+} intracelular) in vitro, in vivo y ex vivo, e incluye también otros efectos fisiológicos tales que aumenten o reduzcan la liberación de neurotransmisor u hormona.

Por "determinar el efecto funcional" se quiere indicar ensayos de un compuesto que aumenta o reduce un parámetro que está indirecta o directamente bajo la influencia de un BCA-GPCR, por ejemplo, efectos funcionales, físicos o químicos. Dichos efectos funcionales pueden medirse mediante cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas o de solubilidad, fijación de membrana, tintes sensibles al voltaje, corrientes de célula entera, descarga de radioisótopos, marcadores inducibles, activación transcripcional de BCA-GPCR; ensayos de unión a ligando; cambios de voltaje, potencial de membrana y conductancia; ensayos de flujo iónico; cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como AMPc y trifosfato de inositol (IP3); cambios en los niveles de calcio intracelular; liberación de neurotransmisor y similares.

"Inhibidores", "activadores" y "moduladores" de BCA-GPCR se utilizan intercambiablemente para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas utilizando ensayos in vitro e in vivo para la transducción de señal, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos y miméticos. Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen, bloquean parcial o totalmente la estimulación, reducen, evitan o retardan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente la transducción de señal, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencian la activación, sensibilizan o regulan positivamente la transducción de señal, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, por ejemplo, alteran la interacción de un polipéptido con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o inhibidor; proteínas G; subunidades alfa, beta y gamma de proteína G y quinasas. Los moduladores incluyen también versiones genéticamente modificadas de BCA-GPCR, por ejemplo, con actividad alterada, así como ligandos, antagonistas, agonistas, anticuerpos, moléculas químicas pequeñas y similares de origen natural y sintético. Dichos ensayos de inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, expresar BCA-GPCR in vitro en células o en membranas celulares, aplicar supuestos compuestos moduladores, y determinar después los efectos funcionales sobre la transducción de señal, como se describe anteriormente.

Las muestras o ensayos que comprenden BCA-GPCR que se tratan con un activador, inhibidor o modulador potencial se comparan con las muestras control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar la extensión de la inhibición. A las muestras control (no tratadas con inhibidores) se les asigna un valor de actividad BCA-GPCR relativa de 100%. La inhibición de un BCA-GPCR se consigue cuando el valor de actividad BCA-GPCR respecto al control es aproximadamente 80%, preferiblemente 50%, más preferiblemente 25-0%. La activación de un BCA-GPCR se consigue cuando el valor de actividad BCA-GPCR respecto al control (no tratado con activadores) es 110%, más preferiblemente 150%, más preferiblemente 200-500%) (concretamente, dos a cinco veces mayor respecto al control), más preferiblemente 1.000-3.000% mayor.

Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está sustancial o esencialmente exento de los componentes que lo acompañan normalmente cuando se encuentra en estado nativo. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente utilizando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada. En particular, un ácido nucleico de BCA-GPCR aislado está separado de los marcos de lectura abiertos que flanquean al gen de BCA-GPCR y codifican proteínas distintas de BCA-GPCR. El término "purificado" designa que un ácido nucleico o proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o proteína es al menos 85% puro, más preferiblemente al menos 95% puro, y lo más preferiblemente al menos 99% puro.

BCA-GPCR "biológicamente activo" se refiere a un BCA-GPCR que tiene actividad de transducción de señal y actividad receptora acoplada a proteína G, como se describe anteriormente.

"Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma mono- o bicatenaria. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos nucleotídicos conocidos o restos de la cadena principal o enlaces modificados que son de origen sintético, natural y no natural, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metilribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular abarca también implícitamente variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codón degeneradas pueden conseguirse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) está sustituida por restos de bases mixtas y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell Probes 8: 91-98 (1994)). El término ácido nucleico se utiliza intercambiablemente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a un polímero de restos aminoacídicos. Los términos se aplican a polímeros aminoacídicos en los que uno o más restos aminoacídicos son un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido de origen natural, así como polímeros aminoacídicos de origen natural y polímeros aminoacídicos de origen no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como a análogos aminoacídicos y miméticos aminoacídicos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos aminoacídicos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, concretamente, un carbono \alpha que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metilsulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos aminoacídicos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural.

Los aminoácidos pueden referirse en la presente memoria por sus símbolos de tres letras conocidos habitualmente o por los símbolos de una letra recomendados por la Biochemical Nomenclature Commission de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, igualmente, pueden referirse por sus códigos de una letra aceptados habitualmente.

"Variantes modificadas conservativamente" se aplica tanto a secuencias aminoacídicas como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes modificadas conservativamente se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias aminoacídicas idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia aminoacídica, hasta secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición en que una alanina esté especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente memoria que codifica un polipéptido describe también cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina y TGG que es normalmente el único codón para triptófano) puede modificarse proporcionando una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

En cuanto a las secuencias aminoacídicas, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" cuando la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas conservativamente son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la invención.

Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1)

alanina (A), glicina (G);

2)

ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);

3)

asparagina (N), glutamina (Q);

4)

arginina (R), lisina (K);

5)

isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V);

6)

fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W);

7)

serina (S), treonina (T); y

8)

cisteína (C), metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Las estructuras macromoleculares tales como estructuras polipeptídicas pueden describirse en términos de diversos niveles de organización. Para una discusión general de esta organización véanse, por ejemplo, Alberts et al., "Molecular Biology of the Cell" (3ª ed., 1994) y Cantor y Schimmel, "Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules" (1980). "Estructura primaria" se refiere a la secuencia aminoacídica de un péptido particular. "Estructura secundaria" se refiere a estructuras tridimensionales ordenadas localmente en un polipéptido. Estas estructuras son conocidas habitualmente como dominios. Los dominios son porciones de un polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido, y son típicamente de 25 a aproximadamente 500 aminoácidos de largo. Los dominios típicos están constituidos por secciones de menor organización tales como extensiones de lámina \beta y hélice \alpha. "Estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero polipeptídico. "Estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes. Los términos anisotrópicos son también conocidos como términos de energía.

Un "marcaje" o "un resto detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los marcajes útiles incluyen ^{32}P, tintes fluorescentes, reactivos electrónicamente densos, enzimas (por ejemplo, como se utilizan habitualmente en una ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcaje al péptido, y utilizarse para detectar anticuerpos reactivos específicamente con el péptido.

Una "sonda u oligonucleótido de ácido nucleico marcado" es aquel que está unido, covalentemente mediante un engarce o un enlace químico, o no covalentemente mediante enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno, a un marcaje, de tal modo que la presencia de la sonda puede detectarse detectando la presencia del marcaje unido a la sonda.

Como se utiliza en la presente memoria, "una sonda u oligonucleótido de ácido nucleico" se define como un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria mediante uno o más tipos de enlaces químicos, habitualmente mediante apareamiento de bases complementarias, habitualmente mediante formación de enlace de hidrógeno. Como se utiliza en la presente memoria, una sonda puede incluir bases naturales (concretamente, A, G, C o T) o bases modificadas (7-desazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases en una sonda pueden unirse mediante un enlace distinto de un enlace fosfodiéster, a condición de que no interfiera con la hibridación. Por tanto, por ejemplo, las sondas pueden ser ácidos nucleicos peptídicos en los que las bases constituyentes están unidas por enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster. Se entenderá por un experto en la técnica que las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de complementariedad completa con la secuencia de sonda dependiendo del rigor de las condiciones de hibridación. Las sondas se marcan preferiblemente de forma directa como con isótopos, cromóforos, lumíforos o cromógenos, o se marcan indirectamente tal como con biotina a la que puede unirse después un complejo de estreptavidina. Al ensayar la presencia o ausencia de la sonda, puede detectarse la presencia o ausencia de la secuencia o subsecuencia seleccionada.

El término "recombinante" cuando se utiliza con referencia, por ejemplo, a una célula o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo, o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativo, o que la célula deriva de una célula así modificada. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se expresan anormalmente, se infraexpresan o no se expresan en absoluto.

El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente por vía recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para preparar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región de codificación de otra fuente. De forma similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

Un "promotor" se define como una matriz de secuencias control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Como se utiliza en la presente memoria, un promotor incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción tales como, en el caso de un promotor de polimerasa de tipo II, un elemento TATA. Un promotor incluye también opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden localizarse del orden de varios miles de pares de bases desde el inicio del sitio de transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. El término "ligado operativamente" designa un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión de un ácido nucleico (tal como un promotor, o matriz de sitios de unión a factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en el que la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Un "vector de expresión" es un constructo de ácido nucleico, generado recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedadora. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico para transcribir ligado operativamente a un promotor.

Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de restos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales (concretamente, aproximadamente 70% de identidad, preferiblemente 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad frente a una región especificada, cuando se comparan y se alinean para la máxima correspondencia con una ventana de comparación, o región designada medida utilizando algoritmos de comparación de secuencia BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros por defecto como se describen a continuación, o mediante alineación manual e inspección visual. Se dice que dichas secuencia son "sustancialmente idénticas". Esta definición se refiere al cumplimiento de una secuencia de ensayo. Preferiblemente, la identidad existe frente a una región que es de al menos 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o más preferiblemente frente a una región que es de 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.

Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de ensayo y referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Pueden utilizarse los parámetros del programa por defecto, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula después las identidades de secuencia porcentuales para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de la serie de posiciones contiguas seleccionadas del grupo constituido por 20 a 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear óptimamente las dos secuencias. Los procedimientos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., ed., suplemento de 1995).

Son un ejemplo preferido de algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencia porcentual y la similitud de secuencia los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 se utilizan, con los parámetros descritos en la presente memoria, para determinar la identidad de secuencia porcentual para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente por el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar los pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando textos cortos de longitud W en la secuencia en cuestión, que coinciden o satisfacen cierta puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con un texto de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere como el umbral de puntuación del texto adyacente (Altschul et al. supra). Estos aciertos de texto adyacente iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largas que los contengan. Los aciertos de texto se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras pueda aumentarse la puntuación acumulada de alineamiento Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para secuencias nucleotídicas, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización por restos no coincidentes; siempre <0). Para las secuencias aminoacídicas, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulada de alineamiento se sale en la cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulada se va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de alguna secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias aminoacídicas, el programa BLASTP utiliza una longitud de texto por defecto de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)), alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza también un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma (P(N)) menor, que proporciona una indicación de la probabilidad de que ocurra una coincidencia entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma menor en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Es otro ejemplo de un algoritmo útil PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineamientos pareados progresivos para mostrar la relación y la identidad de secuencia porcentual. Representa también un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear el alineamiento. PILEUP utiliza una simplificación del procedimiento de alineamiento progresivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35; 351-360 (1987). El procedimiento utilizado es similar al procedimiento descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple empieza con el alineamiento pareado de dos de las secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento se alinea después con la secuencia más relacionada o agrupamiento de secuencias alineadas siguiente. Se alinean dos agrupamientos de secuencias mediante una simple extensión del alineamiento pareado de las dos secuencias individuales. Se consigue el alineamiento final mediante una serie de alineamientos parados progresivos. El programa funciona designando secuencias específicas y sus coordenadas aminoacídicas o nucleotídicas para regiones de comparación de secuencia y designando los parámetros de secuencia. Utilizando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar la relación de identidad de secuencia porcentual utilizando los siguientes parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos de extremo ponderados. PILEUP puede obtenerse del paquete de software de análisis de secuencia GCG, por ejemplo, la versión 7,0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984).

Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tenga reacción cruzada inmunológica con los anticuerpos creados frente al polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por tanto, típicamente un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo en sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos hibriden entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación. Aún otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que puedan utilizarse los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

La frase "hibrida selectiva (o específicamente) con" se refiere a la unión, formación de dúplex o hibridación de una molécula sólo con una secuencia nucleotídica particular en condiciones rigurosas de hibridación cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total o de biblioteca).

La frase "condiciones rigurosas de hibridación" se refiere a condiciones en las que una sonda hibridará con su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Se encuentra una guía extensa de la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, "Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan por ser aproximadamente 5-10ºC menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidos) a la que un 50% de las sondas complementarias con la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm un 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea menor de aproximadamente 1,0 M de ión sodio, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de ión sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, mayor de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas pueden conseguirse también con la adición de agentes desestabilizantes como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el nivel de fondo, preferiblemente 10 veces la hibridación de nivel de fondo. Pueden ser condiciones de hibridación rigurosa ejemplares las siguientes: 50% de formamida, 5 x SSC y 1% de SDS, incubando a 42ºC, o 5 x SSC, 1% de SDS, incubando a 65ºC, con lavado con 0,2 x SSC y 0,1% de SDS a 65ºC.

Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas son todavía sustancialmente idénticos su los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la degeneración de codón máxima permitida por el código genético. En dichos casos, los ácidos nucleicos hibridan típicamente en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas. Las "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" ejemplares incluyen una hibridación en un tampón de 40% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS a 37ºC, y un lavado con 1 x SSC a 45ºC. Una hibridación positiva es al menos dos veces el nivel de fondo. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridación y lavado alternativas para proporcionar condiciones de rigor similar.

"Anticuerpo" designa un polipéptido que comprende una región marco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se une específicamente a y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda, las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Una unidad estructural de inmunoglobulina ejemplar (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La terminación N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento de anticuerpo. Los términos cadena ligera variable (V_{L}) y cadena pesada variable (V_{H}) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.

Los anticuerpos existen, por ejemplo, en forma de inmunoglobulinas intactas o como una serie de fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas peptidasas. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra produciendo F(ab)'_{2}, un dímero de Fab que es por sí mismo una cadena ligera unida a V_{H}-C_{H}1 por un enlace disulfuro. El F(ab)'_{2} puede reducirse en condiciones suaves rompiendo el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiéndose así el dímero F(ab)'_{2} en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra (véase "Fundamental Immunology" (Paul ed., 3ª ed., 1993). Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarse de novo químicamente o utilizando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, como se utiliza en la presente memoria, incluye también fragmentos de anticuerpo producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros, o aquellos sintetizados de novo utilizando metodología de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena sencilla) o aquellos identificados utilizando bibliotecas de exposición en fago (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)).

Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, puede utilizarse cualquier técnica conocida en la técnica (véanse, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pág. 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE.UU. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos contra polipéptidos de esta invención. Además, pueden utilizarse ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados. Como alternativa, puede utilizarse la tecnología de exposición en fago para identificar anticuerpos y fragmentos de Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véanse, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779-783 (1992)).

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, está alterada, reemplazada o intercambiada de modo que el sitio de unión a antígeno (región variable) está unido a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o a una molécula enteramente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, está alterada, reemplazada o intercambiada por una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada.

Un anticuerpo "anti-BCA-GPCR" es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido codificado por un gen de BCA-GPCR, ADNc o una subsecuencia del mismo.

El término "inmunoensayo" es un ensayo que utiliza un anticuerpo para unir específicamente a un antígeno. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de unión específicas de un anticuerpo particular para aislar, dirigir y/o cuantificar el antígeno.

La frase "se une específica (o selectivamente)" a un anticuerpo o "inmunoreacciona específica (o selectivamente) con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, en las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular al menos a dos veces el nivel de fondo, y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos policlonales creados contra un BCA-GPCR particular para obtener sólo aquellos anticuerpos policlonales que sean específicamente inmunorreactivos con el BCA-GPCR, y no con otras proteínas, excepto por variantes polimórficas, ortólogos y alelos del BCA-GPCR. Esta selección puede conseguirse eliminando los anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con las moléculas de BCA-GPCR. Puede utilizarse una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow & Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" (1988) para una descripción de los formatos de imunoensayo y las condiciones que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica). Típicamente, una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal del nivel de fondo o ruido, y más típicamente más de 10 a 100 veces el nivel de fondo. Pueden prepararse también como se describe anteriormente anticuerpos que reaccionan sólo con un ortólogo de BCA-GPCR particular, por ejemplo, de especies específicas como rata, ratón o ser humano, eliminando los anticuerpos que se unen al mismo BCA-GPCR de otra especie.

La frase "se asocia selectivamente con" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico de "hibridar selectivamente" con otro como se define anteriormente, o a la capacidad de un anticuerpo de "unirse selectiva (o específicamente)" a una proteína, como se define anteriormente.

Aislamiento de ácidos nucleicos que codifican BCA-GPCR A. Procedimientos generales de ADN recombinante

Esta invención se basa en técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que dan a conocer los procedimientos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual" (2ª ed., 1989); Kriegler, "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual" (1990) y "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., ed., 1994)).

Para ácidos nucleicos, los tamaños se dan en kilobases (kb) o pares de bases (pb). Estos son estimaciones derivadas de elecroforesis en gel de agarosa o acrilamida de ácidos nucleicos secuenciados o de secuencias de ADN publicadas. Para proteínas, los tamaños se dan en kilodalton (kDa) o en número de restos aminoacídicos. Los tamaños de proteína se estiman a partir de electroforesis en gel, de proteínas secuenciadas, de secuencias aminoacídicas derivadas o de secuencias proteicas publicadas.

Los oligonucleótidos que no están comercialmente disponibles pueden sintetizarse químicamente según el procedimiento de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981), utilizando un sintetizador automático como se describe en Van Devanter, et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). La purificación de oligonucleótidos es mediante electroforesis en gel de acrilamida nativo o mediante HPLC de intercambio aniónico como se describe en Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983).

La secuencia de los genes clonados y los oligonucleótidos sintéticos puede verificarse después de la clonación utilizando, por ejemplo, el procedimiento de terminación de cadena para secuenciación de moldes bicatenarios de Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981).

B. Procedimientos de clonación para el aislamiento de secuencias nucleotídicas que codifican BCA-GPCR

En general, las secuencias de ácido nucleico que codifican BCA-GPCR y homólogos de secuencia de ácido nucleico relacionada, se clonan a partir de bibliotecas de ADNc y ADN genómico mediante hibridación con una sonda, o se aíslan utilizando técnicas de amplificación con cebadores oligonucleotídicos. Por ejemplo, las secuencias de BCA-GPCR se aíslan típicamente de bibliotecas de ácido nucleico de mamífero (genómico o ADNc) mediante hibridación con una sonda de ácido nucleico cuya secuencia puede derivarse de las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7. Los tejidos adecuados de los que pueden aislarse el ARN y ADNc de BCA-GPCR incluyen, por ejemplo, células de cáncer de mama, células epiteliales prostáticas normales, placenta o testículos.

Pueden utilizarse también técnicas de amplificación que utilizan cebadores para amplificar y aislar ácidos nucleicos de BCA-GPCR de ADN o ARN. Pueden utilizarse también los cebadores degenerados que codifican las siguientes secuencias aminoacídicas para amplificar una secuencia de un BCA-GPCR: SEC Nº ID 9-16 (véase, por ejemplo, Dieffenfach & Dveksler, "PCR Primer: A Laboratory Manual" (1995)). Estos cebadores pueden utilizarse, por ejemplo, para amplificar la secuencia completa o una sonda de uno a varios cientos de nucleótidos, que se utiliza después para examinar en una biblioteca de mamífero los BCA-GPCR completos.

Los ácidos nucleicos que codifican BCA-GPCR pueden aislarse también a partir de bibliotecas de expresión utilizando anticuerpos como sondas. Dichos anticuerpos policlonales o monoclonales pueden crearse utilizando la secuencia de SEC Nº ID 2, 4, 6 u 8.

Las variantes polimórficas, alelos y homólogos interespecies de BCA-GPCR que son sustancialmente idénticos a un BCA-GPCR pueden aislarse utilizando sondas de ácido nucleico de BCA-GPCR y oligonucleótidos en condiciones rigurosas de hibridación, mediante examen de bibliotecas. Como alternativa, las bibliotecas de expresión pueden utilizarse para clonar BCA-GPCR y variantes polimórficas, alelos y homólogos interespecies de BCA-GPCR, detectando los homólogos expresados inmunológicamente con antisueros o anticuerpos purificados formados contra BCA-GPCR, que reconocen y se unen selectivamente también al homólogo de BCA-GPCR.

Para preparar una biblioteca de ADNc, debería elegirse una fuente que sea rica en ARNm de BCA-GPCR. El ARNm se convierte después en ADNc utilizando transcriptasa inversa, se liga en un vector recombinante y se transfiere a un hospedador recombinante para propagación, examen y clonación. Los procedimientos para preparar y seleccionar bibliotecas de ADNc son bien conocidos (véanse, por ejemplo, Gubler & Hoffman, Gene 25: 263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra).

Para una biblioteca genómica, el ADN se extrae del tejido y se cizalla mecánicamente o se digiere enzimáticamente, proporcionando fragmentos de aproximadamente 12-20 kb. Después, se separan los fragmentos mediante centrifugación en gradiente de los tamaños indeseados y se construyen vectores de bacteriófago lambda. Estos vectores y el fago se empaquetan in vitro. Se analiza el fago recombinante mediante hibridación de placa como se describe en Benton & Davis, Science 196: 180-182 (1977). Se lleva a cabo la hibridación de colonias como se describe en general en Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 (1975).

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Un procedimiento alternativo de aislar ácidos nucleicos de BCA-GPCR y sus homólogos combina el uso de cebadores oligonucleotídicos sintéticos y la amplificación de un molde de ARN o ADN (véanse las patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202; "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" (Innis et al., eds., 1990)). Pueden utilizarse procedimientos tales como reacción en cadena con polimerasa (PCR) y reacción en cadena con ligasa (LCR) para amplificar secuencias de ácido nucleico de BCA-GPCR directamente de ARNm, de ADNc, de bibliotecas genómicas o de bibliotecas de ADNc. Los oligonucleótidos degenerados pueden designarse para amplificar homólogos de BCA-GPCR utilizando las secuencias proporcionadas en la presente memoria. Pueden incorporarse sitios de endonucleasa de restricción a los cebadores. Pueden ser también útiles la reacción en cadena con polimerasa u otros procedimientos de amplificación in vitro, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas que es van a expresar, para preparar ácidos nucleicos para uso como sondas para detectar la presencia de ARNm que codifica BCA-GPCR en muestras fisiológicas, para secuenciar ácido nucleico o con otros fines. Los genes amplificados por la reacción PCR pueden purificarse a partir de geles de agarosa y clonarse en un vector apropiado.

La expresión génica de BCA-GPCR puede analizarse también mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, transcripción inversa y amplificación de ARNm, aislamiento de ARN total o ARN poli A^{+}, transferencia Northern, transferencia en mancha, hibridación in situ, protección de ARNasa, sondeo con matriz de microchip y similares. En una realización, se utiliza tecnología de análisis de oligonucleótido de alta densidad (por ejemplo, GeneChip™) para identificar homólogos y variantes polimórficas de los GPCR de la invención. En el caso en que los homólogos que se están identificando estén ligados a una enfermedad conocida, pueden utilizarse con GeneChip™ como herramienta de diagnóstico en la detección de la enfermedad en una muestra biológica, véanse, por ejemplo, Gunthand et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 869-876 (1998); Kozal et al., Nat. Med. 2: 753-759 (1996); Matson et al., Anal. Biochem. 224: 110-116 (1995); Lockhart et al., Nat. Biotechnol. 14: 1675-1680 (1996); Gingeras et al., Genome Res. 8: 435-448 (1998); Hacia et al., Nucleic Acids Res. 26: 3865-3866 (1998).

Pueden utilizarse oligonucleótidos sintéticos para construir genes de BCA-GPCR recombinantes para uso como sondas o para expresión de proteína. Este procedimiento se realiza utilizando una serie de oligonucleótidos superpuestos de habitualmente 40-120 pb de longitud, que representan tanto las cadenas con sentido como sin sentido del gen. Estos fragmentos de ADN se asocian después, se ligan y se clonan. Como alternativa, pueden utilizarse técnicas de amplificación con cebadores precisos para amplificar una subsecuencia específica del ácido nucleico de BCA-GPCR. La subsecuencia específica se liga después en un vector de expresión.

El ácido nucleico que codifica un BCA-GPCR se clona típicamente en vectores intermedios antes de la transformación en células procarióticas o eucarióticas para replicación y/o expresión. Estos vectores intermedios son típicamente vectores procarióticos, por ejemplo, plásmidos o vectores lanzadera.

Opcionalmente, pueden prepararse ácidos nucleicos que codifican proteínas quiméricas que comprenden BCA-GPCR o dominios de los mismos según técnicas estándar. Por ejemplo, puede ligarse covalentemente un dominio tal como un dominio de unión a ligando, un dominio extracelular, un dominio transmembrana (por ejemplo, uno que comprende siete regiones transmembrana y los correspondientes bucles extracelulares y citosólicos), el dominio transmembrana y un dominio citoplásmico, un sitio activo, una región de asociación a subunidad, etc., con una proteína heteróloga. Por ejemplo, un dominio extracelular puede ligarse a un dominio transmembrana de GPCR heterólogo, o un dominio extracelular de GPCR heterólogo puede ligarse a un dominio transmembrana. Otras proteínas heterólogas de elección incluyen, por ejemplo, proteína fluorescente verde, luciferasa o \beta-gal.

C. Expresión en procariotas y eucariotas

Para obtener un alto nivel de expresión de un gen o ácido nucleico clonado, tal como los ADNc que codifican BCA-GPCR, se subclona típicamente un BCA-GPCR en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de transcripción/traducción y, si es un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión a ribosoma para el inicio traduccional. Los promotores bacterianos adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., y Ausubel et al.. Los sistemas de expresión bacterianos para expresar la proteína BCA-GPCR están disponibles, por ejemplo, en E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983). Los kits para dichos sistemas de expresión están comercialmente disponibles. Los sistemas de expresión eucarióticos para células de mamífero, células de levadura e insecto son bien conocidos en la técnica y están también comercialmente disponibles. En una realización, el vector de expresión eucariótico es un vector adenoviral, un vector adenoasociado o un vector retroviral.

El promotor utilizado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular. El promotor se dispone opcionalmente aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción heteróloga que del sitio de inicio de la transcripción en su estado natural. Sin embargo, como es conocido en la técnica, puede aceptarse cierta variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora.

Además del promotor, el vector de expresión contiene típicamente una unidad de transcripción o módulo de expresión que contiene todos los elementos adicionales necesarios para la expresión del ácido nucleico que codifica BCA-GPCR en células hospedadoras. Un módulo de expresión típico contiene por tanto un promotor ligado operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica un BCA-GPCR y las señales necesarias para una poliadenilación eficaz del transcripto, sitios de unión a ribosoma y terminación de la traducción. La secuencia de ácido nucleico que codifica un BCA-GPCR puede ligarse típicamente a una secuencia de péptido señal escindible para promover la secreción de la proteína codificada por la célula transformada. Dichos péptidos señal incluirían, entre otros, los péptidos señal del activador de plasminógeno en tejido, insulina y factor de crecimiento neuronal, y hormona esterasa juvenil de Heliothis virescens. Los elementos adicionales del módulo pueden incluir potenciadores y, si se utiliza ADN genómico como gen estructural, intrones con sitios donantes y aceptores de ayuste funcionales.

Además de una secuencia promotora, el módulo de expresión debe contener también una región de terminación de la transcripción cadena abajo del gen estructural para proporcionar una terminación eficaz. La región de terminación puede obtenerse a partir del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse a partir de diferentes genes.

El vector de expresión particular utilizado para transportar la información genética en la célula no es particularmente crítico. Puede utilizarse cualquiera de los vectores convencionales utilizados para expresión en células eucarióticas o procarióticas. Los vectores de expresión bacteriana estándar incluyen plásmidos tales como plásmidos basados en pBR322, pSKF, pET23D y sistemas de expresión de fusión tales como GST y LacZ. Pueden añadirse también marcajes epitópicos a proteínas recombinantes para proporcionar procedimientos adecuados de aislamiento, por ejemplo, c-myc.

Se utilizan típicamente vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucarióticos en los vectores de expresión eucarióticos, por ejemplo, vectores SV40, vectores de virus de papiloma y vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros vectores ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A^{+}, pMTO10/A^{+}, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano SV40, el promotor tardío SV40, el promotor de metalotioneína, el promotor de virus de tumor mamario de murina, el promotor de virus de sarcoma de Rous, el promotor de polihedrina u otros promotores mostrados eficaces para expresión en células eucarióticas.

Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan amplificación génica tales como timidina quinasa, higromicina B fosfotransferasa y dihidrofolato reductasa. Como alternativa, son también adecuados sistemas de expresión de alto rendimiento que no implican amplificación génica, tales como utilizar un vector de baculovirus en células de insecto, con una secuencia de codificación de BCA-GPCR en la dirección del promotor de polihedrina u otros promotores fuertes de baculovirus.

Los elementos que se incluyen típicamente en los vectores de expresión incluyen también un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica resistencia a antibiótico para permitir la selección de bacterias que albergan plásmidos recombinantes, y sitios de restricción únicos en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias eucarióticas. El gen de resistencia a antibiótico particular elegido no es crítico, cualquiera de los muchos genes de resistencia conocidos en la técnica es adecuado. Las secuencias procarióticas se eligen opcionalmente de tal modo que no interfieran con la replicación del ADN en células eucarióticas, si son necesarias.

Se utilizan procedimientos de transfección estándar para producir líneas celulares bacterianas, de mamífero, de levadura o de insecto que expresan grandes cantidades de proteína BCA-GPCR, que se purifica después utilizando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); "Guide to Protein Purification" en "Methods in Enzymology", vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). La transformación de células eucarióticas y procarióticas se realiza según técnicas estándar (véanse, por ejemplo, Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, "Methods in Enzymology" 101: 347-362 (Wu et al., ed., 1983).

Puede utilizarse cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducción de secuencias nucleotídicas extrañas en células hospedadoras. Estos incluyen el uso de transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, liposomas, microinyección, vectores plasmáticos, vectores virales y cualquiera de los otros métodos bien conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético extraño en una célula hospedadora (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Es sólo necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular utilizado pueda introducir con éxito al menos un gen en la célula hospedadora capaz de expresar un BCA-GPCR.

Después de introducir el vector de expresión en las células, se cultivan las células transfectadas en condiciones que favorecen la expresión de un BCA-GPCR, que se recupera del cultivo utilizando técnicas estándar identificadas a continuación.

Purificación de BCA-GPCR

Pueden purificarse BCA-GPCR de origen natural o recombinante para uso en ensayos funcionales. Opcionalmente, se purifican BCA-GPCR recombinantes. Los BCA-GPCR de origen natural se purifican, por ejemplo, a partir de cualquier tejido o célula adecuada que exprese BCA-GPCR de origen natural. Los BCA-GPCR recombinantes se purifican a partir de cualquier sistema de expresión bacteriano o eucariótico adecuado, por ejemplo, células CHO o células de insecto.

Puede purificarse un BCA-GPCR hasta una pureza sustancial mediante técnicas estándar, incluyendo precipitación selectiva con sustancias tales como sulfato de amonio; cromatografía en columna; procedimientos de inmunopurificación y otros (véanse, por ejemplo, Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice" (1982); patente de EE.UU. nº 4.673.641; Ausubel et al., supra, y Sambrook et al., supra).

Pueden emplearse una serie de procedimientos cuando se está purificando un BCA-GPCR recombinante. Por ejemplo, pueden fusionarse reversiblemente proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular establecidas con un BCA-GPCR. Con el ligando apropiado, puede adsorberse un BCA-GPCR selectivamente en una columna de purificación y después liberarse de la columna en forma relativamente pura. La proteína fusionada se retira después mediante actividad enzimática. Finalmente, podría purificarse un BCA-GPCR utilizando columnas de inmunoafinidad.

A. Purificación de BCA-GPCR a partir de células recombinantes

Las proteínas recombinantes se expresan mediante bacterias transformadas o células eucarióticas tales como células CHO o células de insecto en grandes cantidades, típicamente después de la inducción de promotor; pero la expresión puede ser constitutiva. La inducción de promotor con IPTG es un ejemplo de un sistema promotor inducible. Las células se hacen crecer según procedimientos estándar en la técnica. Se utilizan células frescas o congeladas para el aislamiento de proteína.

Las proteínas expresadas en bacterias pueden formar agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Son adecuados diversos protocolos para la purificación de los cuerpos de inclusión de BCA-GPCR. Por ejemplo, la purificación de los cuerpos de inclusión implica típicamente la extracción, separación y/o purificación de los cuerpos de inclusión mediante disrupción de células bacterianas, por ejemplo, mediante incubación en un tampón de Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 5mM, DTT 1 mM, ATP 0,1 mM y PMSF 1 mM. La suspensión celular puede lisarse utilizando 2-3 pasadas a través de una prensa French, homogeneizarse utilizando un Polytron (Brinkman Instruments) o someterse a sonicación en hielo. Los procedimientos alternativos de lisar bacterias son evidentes para los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra).

Si es necesario, los cuerpos de inclusión se solubilizan y la suspensión de célula lisada se centrifuga típicamente para retirar el material insoluble indeseado. Las proteínas que formaban los cuerpos de inclusión pueden renaturalizarse mediante dilución o diálisis con un tampón compatible. Los disolventes adecuados incluyen, pero sin limitación, urea (de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M), formamida (al menos aproximadamente al 80%, con base volumen/volumen) y clorhidrato de guanidina (de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M). Algunos disolventes que son capaces de solubilizar proteínas formadoras de agregados, por ejemplo SDS (dodecilsulfato de sodio) y ácido fórmico al 70%, son inapropiados para uso en este procedimiento debido a la posibilidad de desnaturalización irreversible de las proteínas, acompañada por falta de inmunogenicidad y/o actividad. Aunque el clorhidrato de guanidina y agentes similares son desnaturalizantes, esta desnaturalización no es irreversible y puede aparecer renaturalización tras la retirada (por diálisis, por ejemplo) de la disolución del desnaturalizante, permitiendo la reformación de proteína inmunológica y/o biológicamente activa. Son conocidos otros tampones adecuados por los expertos en la técnica. El BCA-GPCR se separa de otras proteínas bacterianas mediante técnicas de separación estándar, por ejemplo, con resina de Ni-NTA-agarosa.

Como alternativa, es posible purificar el BCA-GPCR a partir de periplasma bacteriano. Después de la lisis bacteriana, cuando se exporta el BCA-GPCR al periplasma bacteriano, puede aislarse la fracción periplásmica bacteriana mediante choque osmótico en frío, además de otros procedimientos conocidos en la técnica. Para aislar proteínas recombinantes del periplasma, se centrifugan las células bacterianas formando un sedimento. Se resuspende el sedimento en un tampón que contiene 20% de sacarosa. Para lisar las células, se centrifugan las bacterias y se resuspende el sedimento en MgSO_{4} 5 mM enfriado con hielo, y se mantiene en un baño de hielo durante aproximadamente 10 minutos. Se centrifuga la suspensión celular y el sobrenadante se decanta y se guarda. Las proteínas recombinantes presentes en el sobrenadante pueden separarse de las proteínas hospedadoras mediante técnicas de separación estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.

B. Técnicas estándar de separación de proteína para purificar BCA-GPCR Fraccionamiento por solubilidad

A menudo como etapa inicial, particularmente si la mezcla de proteínas es compleja, un fraccionamiento salino inicial puede separar muchas de las proteínas de célula hospedadora indeseadas (o proteínas derivadas del medio de cultivo celular) de la proteína recombinante de interés. El sulfato de amonio precipita proteínas al reducir eficazmente la cantidad de agua en la mezcla de proteínas. Las proteínas precipitan entonces basándose en su solubilidad. Cuanto más hidrófoba es una proteína, más probable es que precipite a concentraciones de sulfato de amonio menores. Un protocolo típico incluye añadir sulfato de amonio saturado a una solución de proteínas de modo que la concentración de sulfato de amonio resultante esté entre 20-30%. Esta concentración precipitará las proteínas más hidrófobas. Se desecha entonces el precipitado (a menos que la proteína de interés sea hidrófoba) y se añade sulfato de amonio al sobrenadante a una concentración conocida para precipitar la proteína de interés. Se solubiliza después el precipitado en tampón y se retira el exceso de sal, si es necesario, mediante diálisis o diafiltración. Otros procedimientos que se basan en la solubilidad de proteínas, tales como precipitación con etanol frío, son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden utilizarse para fraccionar mezclas complejas de proteínas.

Filtración diferencial por tamaño

El peso molecular de un BCA-GPCR puede utilizarse para aislarlo de proteínas de mayor y menor tamaño utilizando ultrafiltración a través de membranas de diferente tamaño de poro (por ejemplo, membranas Amicon o Millipore). Como primera etapa, se ultrafiltra la mezcla de proteínas a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un corte de peso molecular menor que el peso molecular de la proteína de interés. Se ultrafiltra después el retenido de la ultrafiltración frente a una membrana con un corte molecular mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana al filtrado. El filtrado puede cromatografiarse después como se describe a continuación.

Cromatografía en columna

Los BCA-GPCR pueden separarse también de otras proteínas basándose en su tamaño, carga neta superficial, hidrofobicidad y afinidad por ligandos. Además, pueden conjugarse anticuerpos creados contra proteínas con matrices de columna, e inmunopurificarse las proteínas. Todos estos procedimientos son bien conocidos en la técnica. Resultará evidente para un experto que las técnicas cromatográficas pueden realizarse a cualquier escala y utilizar equipos de muchos fabricantes diferentes (por ejemplo, Pharmacia Biotech).

Detección inmunológica de BCA-GPCR

Además de la detección de los genes de BCA-GPCR y la expresión génica utilizando tecnología de hibridación de ácido nucleico, pueden utilizarse también inmunoensayos para detectar BCA-GPCR, por ejemplo, para identificar células tales como células cancerosas, en particular células de cáncer de mama, y variantes de BCA-GPCR. Los inmunoensayos pueden utilizarse para analizar cualitativa o cuantitativamente BCA-GPCR. Puede encontrarse una revisión general de la tecnología aplicable en Harlow & Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual" (1988).

A. Anticuerpos contra BCA-GPCR

Son conocidos por los expertos en la técnica procedimientos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con BCA- GPCR (véanse, por ejemplo, Coligan, "Current Protocols in Immunology" (1991); Harlow & Lane, supra; Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" (2ª ed. 1986); y Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). Dichas técnicas incluyen preparación de anticuerpos mediante selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales inmunizando conejos o ratones (véanse, por ejemplo, Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)). Dichos anticuerpos pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, por ejemplo, en el tratamiento y/o la detección de cáncer de
mama.

Pueden utilizarse una serie de inmunógenos que comprenden BCA-GPCR para producir anticuerpos específicamente reactivos con BCA-GPCR. Por ejemplo, se aísla un BCA-GPCR recombinante o un fragmento recombinante del mismo como se describe en la presente memoria. La proteína recombinante puede expresarse en células eucarióticas o procarióticas como se describe anteriormente, y purificarse como se describe en general anteriormente. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Como alternativa, puede utilizarse como inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria y conjugado con una proteína vehiculante. La proteína de origen natural puede utilizarse también en forma pura o impura. El producto se inyecta después en un animal capaz de producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos monoclonales o policlonales, para uso posterior en inmunoensayos para medir la proteína.

Los procedimientos de producción de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. Se inmuniza una cepa consanguínea de ratones (por ejemplo, ratones BALB/C) o conejos con la proteína utilizando un coadyuvante estándar, tal como coadyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización estándar. La respuesta inmune del animal a la preparación inmunogénica es controlada tomando muestras de sangre y determinando la valoración de la reactividad frente a BCA-GPCR. Cuando se obtienen valoraciones apropiadamente altas de anticuerpo frente al inmunógeno, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Puede realizarse si se desea el fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecer en anticuerpos reactivos ante la proteína (véase Harlow & Lane, supra.).

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante diversas técnicas familiares para los expertos en la técnica. Brevemente, se inmortalizan células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, normalmente mediante fusión con una célula de mieloma (véase Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)). Los procedimientos alternativos de inmortalización incluyen transformación con virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros procedimientos bien conocidos en la técnica. En las colonias que surgen de células inmortalizadas individuales, se examina la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células puede potenciarse mediante diversas técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. Como alternativa, pueden aislarse secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo examinando una biblioteca de ADN de células B humanas según el protocolo general descrito por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989).

Los anticuerpos monoclonales y los sueros policlonales se recogen y se valoran frente a la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado en un soporte sólido. Típicamente, se seleccionan antisueros policlonales con una valoración de 10^{4} o mayor y se ensaya su reactividad cruzada frente a proteínas no BCA-GPCR o incluso otras proteínas relacionadas de otros organismos, utilizando un inmunoensayo de unión competitiva. Los antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales específicos se unirán habitualmente con una K_{d} de al menos aproximadamente 0,1 mM, más habitualmente al menos aproximadamente 1 \muM, opcionalmente al menos aproximadamente 0,1 \muM o mejor, y opcionalmente 0,01 \muM o mejor.

Una vez están disponibles anticuerpos específicos de BCA-GPCR, pueden detectarse los BCA-GPCR mediante una variedad de procedimientos de inmunoensayo. Para una revisión de los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo, véase "Basic and Clinical Immunology" (Stites & Terr ed., 7ª ed., 1991). Además, los inmunoensayos de la presente invención puede realizarse en cualquiera de diversas configuraciones, que se revisan extensamente en "Enzyme Immunoassay" (Maggio, Ed., 1980); y Harlow & Lane, supra.

B. Ensayos de unión inmunológica

Los BCA-GPCR pueden detectarse y/o cuantificarse utilizando cualquiera de una serie de ensayos de unión inmunológica bien reconocidos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 4.366.241, 4.376.110, 4.517.288 y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoensayos generales, véanse también "Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology", volumen 37 (Asai, ed. 1993); "Basic and Clinical Immunology" (Stites & Terr., ed., 7ª ed, 1991). Los ensayos de unión inmunológica (o inmunoensayos) utilizan típicamente un anticuerpo que se une específicamente a una proteína o antígeno de elección (en este caso, el BCA-GPCR o subsecuencia antigénica del mismo). El anticuerpo (por ejemplo, anti-BCA-GPCR) puede producirse mediante cualquiera de una serie de medios bien conocidos por los expertos en la técnica y como se describe anteriormente.

Los inmunoensayos utilizan a menudo un agente de marcaje para unirse específicamente y marcar el complejo formado por el anticuerpo y el antígeno. El agente de marcaje puede ser por sí mismo uno de los restos que comprende el complejo anticuerpo/antígeno. Por tanto, el agente de marcaje puede ser un polipéptido BCA-GPCR marcado o un anticuerpo anti-BCA-GPCR marcado. Como alternativa, el agente de marcaje puede ser un tercer resto, tal como un anticuerpo secundario, que se une específicamente al complejo anticuerpo/BCA-GPCR (un anticuerpo secundario es típicamente específico de anticuerpos de la especie de la que deriva el primer anticuerpo). Pueden utilizarse también como agente de marcaje otras proteínas capaces de unirse específicamente a regiones constantes de inmunoglobulina, tales como proteína A o proteína G. Estas proteínas exhiben una fuerte reactividad no inmunogénica con las regiones constantes de inmunoglobulina de una variedad de especies (véase, por ejemplo, Kronval et al., J. Immunol. 111. 1401-1406 (1973); Akerstrom et al., J. Immunol. 135: 2589-2542 (1985)). El agente de marcaje puede modificarse con un resto detectable, tal como biotina, con el que puede unirse específicamente otra molécula, tal como estreptavidina. Son conocidos por los expertos en la técnica una variedad de restos detectables.

A lo largo de los ensayos, pueden ser necesarias etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, opcionalmente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato de ensayo, del antígeno, del volumen de solución, de las concentraciones y similares. Habitualmente, los ensayos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque pueden realizarse en un intervalo de temperaturas, tal como 10ºC a 40ºC.

Formatos de ensayo no competitivo

Los inmunoensayos para detectar BCA-GPCR en muestras pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que la cantidad de antígeno se mide directamente. En un ensayo de "sándwich" preferido, por ejemplo, los anticuerpos anti-BCA-GPCR pueden unirse directamente a un sustrato sólido sobre el que se inmovilizan. Estos anticuerpos inmovilizados capturan después los BCA-GPCR presentes en la muestra de ensayo. El BCA-GPCR así inmovilizado se une después con un agente de marcaje, tal como un segundo anticuerpo de BCA-GPCR que porta un marcaje. Como alternativa, el segundo anticuerpo puede carecer de un marcaje, pero puede unirse, a su vez, a un tercer anticuerpo específico de anticuerpos de la especie de la que deriva el segundo anticuerpo. El segundo o tercer anticuerpo está típicamente modificado con un resto detectable, tal como biotina, al que se une otra molécula específicamente, por ejemplo estreptavidina, proporcionando un resto detectable.

Formatos de ensayo competitivo

En ensayos competitivos, la cantidad de BCA-GPCR presente en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un BCA-GPCR conocido añadido (exógeno) desplazado (eliminado por competición) de un anticuerpo anti-BCA-GPCR por el BCA-GPCR desconocido presente en una muestra. En un ensayo competitivo, se añade una cantidad conocida de BCA-GPCR a una muestra y se pone después la muestra en contacto con un anticuerpo que se une específicamente al BCA-GPCR. La cantidad de BCA-GPCR exógeno unida al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de BCA-GPCR presente en la muestra. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo se inmoviliza sobre un sustrato sólido. La cantidad de BCA-GPCR unida al anticuerpo puede determinarse midiendo la cantidad de BCA-GPCR presente en un complejo BCA-GPCR/anticuerpo o, como alternativa, midiendo la cantidad de proteína no complejada restante. La cantidad de BCA-GPCR puede detectarse proporcionando una molécula de BCA-GPCR marcada.

Un ensayo de inhibición de hapteno es otro ensayo competitivo preferido. En este ensayo, se inmoviliza el BCA-GPCR conocido sobre un sustrato sólido. Se añade una cantidad conocida de anticuerpo anti-BCA-GPCR a la muestra, y se pone en contacto la muestra después con el BCA-GPCR inmovilizado. La cantidad de anticuerpo anti-BCA-GPCR unido al BCA-GPCR inmovilizado es inversamente proporcional a la cantidad de BCA-GPCR presente en la muestra. De nuevo, la cantidad de anticuerpo inmovilizado puede detectarse detectando la fracción inmovilizada de anticuerpo o la fracción de anticuerpo que permanece en solución. La detección puede ser directa cuando el anticuerpo está marcado o indirecta mediante la posterior adición de un resto marcado que se une específicamente al anticuerpo como se describe anteriormente.

Determinaciones de reactividad cruzada

Los inmunoensayos en formato de unión competitiva pueden utilizarse también para determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, una proteína al menos parcialmente codificada por las SEC Nº ID 2, 4, 6 u 8 puede inmovilizarse en un soporte sólido. Se añaden proteínas (por ejemplo, proteínas BCA-GPCR y homólogas) al ensayo que compiten por la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas añadidas de competir por la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la capacidad de los BCA-GPCR codificados por las SEC Nº ID 2, 4, 6 u 8 de competir con la misma. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores utilizando cálculos estándar. Se seleccionan y combinan aquellos antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas añadidas enumeradas anteriormente. Se retiran opcionalmente los anticuerpos con reactividad cruzada de los antisueros combinados mediante inmunoabsorción con las proteínas consideradas añadidas, por ejemplo, homólogos relacionados distantemente.

Los anticuerpos inmunoabsorbidos y combinados se utilizan después en un inmunoensayo de unión competitiva como se describe anteriormente para comparar una segunda proteína, que se cree que es quizás un alelo o variante polimórfica de un BCA-GPCR, con la proteína inmunogénica (concretamente, los BCA-GPCR de SEC Nº ID 2, 4, 6 u 8). Para hacer esta comparación, se ensayan las dos proteínas cada una en un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína necesaria para inhibir un 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína necesaria para inhibir un 50% de la unión es menor de 10 veces la cantidad de proteína codificada por las SEC Nº ID 2, 4, 6 u 8 que es necesaria para inhibir un 50% de la unión, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a los anticuerpos policlonales generados contra un inmunógeno BCA-GPCR.

Otros formatos de ensayo

Se utiliza el análisis de transferencia Western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia de BCA-GPCR en la muestra. La técnica comprende generalmente separar las proteínas de muestra mediante electroforesis en gel basándose en el peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nailon o un filtro de nailon derivatizado) e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente a BCA-GPCR. Los anticuerpos anti-BCA-GPCR se unen específicamente al BCA-GPCR sobre el soporte sólido. Estos anticuerpos pueden marcarse directamente, o como alternativa pueden detectarse posteriormente utilizando anticuerpos marcados (por ejemplo, anticuerpos de oveja anti-ratón) que se unen específicamente a los anticuerpos anti-BCA-GPCR.

Otros formatos de ensayo incluyen inmunoensayos de liposomas (LIA), que utilizan liposomas diseñados para unirse a moléculas específicas (por ejemplo, anticuerpos) y liberan reactivos o marcajes encapsulados. Los productos químicos liberados se detectan después según técnicas estándar (véase Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41 (1986)).

Reducción de la unión no específica

Un experto en la técnica apreciará que a menudo es deseable minimizar la unión no específica en inmunoensayos. Particularmente, cuando el ensayo implica un antígeno o anticuerpo inmovilizado sobre un sustrato sólido, es deseable minimizar la cantidad de unión no específica al sustrato. Los medios de reducir dicha unión no específica son bien conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente, esta técnica implica recubrir el sustrato con una composición proteica. En particular, se utilizan ampliamente composiciones proteicas tales como albúmina de suero bovino (BSA), leche en polvo no grasa y gelatina, siendo la más preferida la leche en polvo.

Marcajes

El marcaje o grupo detectable particular utilizado en el ensayo no es un aspecto crítico de la invención, a condición de que no interfiera significativamente con la unión específica del anticuerpo utilizado en el ensayo. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Dichos marcajes detectables han sido bien desarrollados en el campo de los inmunoensayos y, en general, la mayoría de los marcajes útiles en dichos procedimientos puede aplicarse a la presente invención. Por tanto, un marcaje es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcajes útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS™), tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Tejas, rodamina y similares), radiomarcajes (por ejemplo, ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras utilizadas habitualmente en una ELISA), y marcajes colorimétricos tales como oro coloidal o perlas de vidrio o plástico coloreadas (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

El marcaje puede acoplarse directa o indirectamente con el componente deseado del ensayo según procedimientos bien conocidos en la técnica. Como se indica anteriormente, puede utilizarse una amplia variedad de marcajes, dependiendo la elección del marcaje de la sensibilidad necesaria, de la facilidad de conjugación con el compuesto, de requisitos de estabilidad, de la instrumentación disponible y de las provisiones de desecho.

Los marcajes no radiactivos se unen a menudo por medios indirectos. Generalmente, se une covalentemente una molécula de ligando (por ejemplo, biotina) a la molécula. Se une después el ligando a otra molécula (por ejemplo, estreptavidina), que es inherentemente detectable o está unida covalentemente a un sistema de señalización, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente o un compuesto quimioluminiscente. Los ligandos y sus dianas pueden utilizarse en cualquier combinación adecuada con anticuerpos que reconocen BCA-GPCR o anticuerpos secundarios que reconocen anti-BCA-GPCR.

Las moléculas pueden conjugarse también directamente con compuestos generadores de señal, por ejemplo, mediante conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como marcajes serán principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas u oxidasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina y 2,3-dihidroftalazindionas, por ejemplo, luminol. Para una revisión de los diversos sistemas de marcaje o productores de señal que pueden utilizarse, véase la patente de EE.UU. nº 4.391.904.

Los medios de detectar marcajes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por tanto, por ejemplo, cuando el marcaje es un marcaje radiactivo, los medios para detección incluyen un contador de centelleo o película fotográfica tal como en autorradiografía. Cuando el marcaje es un marcaje fluorescente, puede detectarse excitando el fluorocromo con luz de la longitud de onda apropiada, y detectando la fluorescencia resultante. La fluorescencia puede detectarse visualmente, mediante película fotográfica, mediante el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos acoplados a carga (CCD) o fotomultiplicadores y similares. De forma similar, los marcajes enzimáticos pueden detectarse proporcionando los sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Finalmente, los marcajes colorimétricos simples pueden detectarse simplemente observando el color asociado al marcaje. Por tanto, en varios ensayos de tira reactiva, el oro conjugado aparece rosa, mientras que diversas perlas conjugadas aparecen del color de la perla.

Algunos formatos de ensayo no requieren el uso de componentes marcados. Por ejemplo, los ensayos de aglutinación pueden utilizarse para detectar la presencia de anticuerpos diana. En este caso, las partículas recubiertas con antígeno se aglutinan por muestras que comprenden los anticuerpos diana. En este formato, ninguno de los componentes necesita estar marcado y la presencia del anticuerpo diana se detecta mediante simple inspección visual.

Ensayos de moduladores de BCA-GPCR A. Ensayos de actividad BCA-GPCR

Los BCA-GPCR y sus alelos y variantes polimórficas son receptores acoplados a proteína G que participan en la transducción de señal y están asociados a una región amplificada en células de cáncer de mama. La actividad de polipéptidos BCA-GPCR puede evaluarse utilizando una variedad de ensayos in vitro e in vivo para determinar los efectos funcionales, químicos y físicos, por ejemplo, medir la unión a ligando (por ejemplo, unión a ligando radiactivo), segundos mensajeros (por ejemplo, AMPc, GMPc, IP3, DAG o Ca^{2+}), flujo iónico, niveles de fosforilación, niveles de transcripción, niveles de neurotransmisor y similares. Además, dichos ensayos pueden utilizarse para ensayar los inhibidores y activadores de un BCA-GPCR. Los moduladores pueden ser también versiones genéticamente alteradas de un BCA-GPCR. Los ensayos de examen de la invención se utilizan para identificar moduladores que pueden utilizarse como productos terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos de BCA-GPCR y antagonistas de la actividad BCA-GPCR.

El BCA-GPCR del ensayo se seleccionará de un polipéptido que tenga una secuencia SEC Nº ID 2, 4, 6 u 8 o variante modificada conservativamente de la misma. Como alternativa, el BCA-GPCR de la invención derivará de un eucariota e incluirá una subsecuencia aminoacídica que tenga la identidad de secuencia aminoacídica SEC Nº ID 1-2 ó 7. Generalmente, la identidad de secuencia aminoacídica será al menos 70%, opcionalmente al menos 85%, opcionalmente al menos 90-95%. Opcionalmente, el polipéptido de los ensayos comprenderá un dominio de un BCA-GPCR, tal como un dominio extracelular, dominio transmembrana, dominio citoplásmico, dominio de unión a ligando, dominio de asociación de subunidad, sitio activo y similares. Tanto un BCA-GPCR como un dominio del mismo pueden ligarse covalentemente a una proteína heteróloga creando una proteína quimérica utilizada en los ensayos utilizados en la presente memoria.

Los moduladores de la actividad BCA-GPCR se ensayan utilizando polipéptidos BCA-GPCR como se describen anteriormente, de origen recombinante o natural. La proteína puede aislarse, expresarse en una célula, expresarse en una membrana derivada de una célula, expresarse en tejido o en un animal, de origen recombinante o natural. Por ejemplo, pueden utilizarse células de cáncer de mama, células epiteliales prostáticas normales, placenta, tejido de testículos, células transformadas o membranas. La modulación se ensaya utilizando uno de los ensayos in vitro o in vivo descritos en la presente memoria. La modulación de señal puede examinarse también in vitro con reacciones solubles o en estado sólido, utilizando una molécula quimérica tal como un dominio extracelular de un receptor ligado covalentemente a un dominio de transducción de señal heterólogo, o un dominio extracelular heterólogo ligado covalentemente al dominio transmembrana y/o citoplásmico de un receptor. También puede examinarse la amplificación génica. Además, los dominios de unión a ligando de la proteína de interés pueden utilizarse en reacciones in vitro en estado soluble o sólido para el ensayo de unión a ligando.

En la unión a ligando de BCA-GPCR, puede ensayarse un dominio o proteína quimérica en solución, en una membrana bicapa, unido a una fase sólida, en una monocapa lipídica o en vesículas. La unión de un modulador puede ensayarse utilizando, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas o de solubilidad.

Las interacciones receptor-proteína G pueden examinarse también. Por ejemplo, puede examinarse la unión de la proteína G al receptor o su liberación del receptor. Por ejemplo, en ausencia de GTP, un activador conducirá a la formación de un complejo compacto de una proteína G (las tres subunidades) con el receptor. Este complejo puede detectarse de una serie de modos, como se observa anteriormente. Dicho ensayo puede modificarse para buscar inhibidores. Se añade un activador al receptor y a la proteína G en ausencia de GTP, se forma un complejo compacto y después se examinan los inhibidores observando la disociación del complejo receptor-proteína G. En presencia de GTP, la liberación de la subunidad alfa de la proteína G de las otras dos subunidades de proteína G sirve como criterio de activación.

Una proteína G activada o inhibida alterará a su vez las propiedades de los efectores cadena abajo tales como proteínas, enzimas y canales. Los ejemplos clásicos son la activación de GMPc fosfodiesterasa mediante transducina en el sistema visual, de adenilato ciclasa por la proteína G estimulatoria, de fosfolipasa C por Gq y otras proteína G semejantes, y la modulación de diversos canales por Gi y otras proteínas G. Las consecuencias cadena abajo pueden examinarse también, tales como la generación de diacilglicerol e IP3 por la fosfolipasa C y, a su vez, la movilización de calcio por IP3.

Los receptores GPCR activados se convierten en sustratos para quinasas que fosforilan la cola C-terminal del receptor (y posiblemente también otros sitios). Por tanto, los activadores promoverán la transferencia de ^{32}P desde GTP marcado en gamma al receptor, que puede ensayarse con un contador de centelleo. La fosforilación de la cola C-terminal promoverá la unión de proteínas similares a arrestina e interferirá con la unión de proteínas G. La ruta quinasa/arrestina desempeña un papel clave en la desensibilización de muchos receptores GPCR. Para una revisión general de la transducción de señal de GPCR y de procedimientos de ensayo de la transducción de señal, véanse, por ejemplo, "Methods in Enzymology", vol. 237 y 238 (1994) y el volumen 96 (1983); Bourne et al., Nature 10: 349; 117-127 (1991); Bourne et al., Nature 348; 125-132 (1990); Pitcher et al., Annu. Rev. Biochem. 67: 653-692 (1998).

Las muestras o ensayos que se tratan con un inhibidor o activador potencial de BCA-GPCR se comparan con muestras control sin el compuesto de ensayo para examinar la extensión de la modulación. A las muestras control (no tratadas con activadores o inhibidores) se les asigna un valor de actividad relativa BCA-GPCR de 100. La inhibición de un BCA-GPCR se consigue cuando el valor de actividad BCA-GPCR respecto al control es aproximadamente 90%, opcionalmente 50%, opcionalmente 25-0%. La activación de un BCA-GPCR se consigue cuando el valor de actividad BCA-GPCR respecto al control es 110%, opcionalmente 150%, 200-500% o 1.000-2.000%.

Los cambios en el flujo iónico pueden evaluarse determinando los cambios en la polarización (concretamente potencial eléctrico) de la célula o membrana que expresa un BCA-GPCR. Un medio de determinar los cambios en la polarización celular es midiendo los cambios en la corriente (midiendo así los cambios en la polarización) con técnicas de fijación de voltaje y registro zonal, por ejemplo, el modo "unido a célula", el modo "de dentro afuera" y el modo "de célula entera" (véase, por ejemplo, Ackerman et al., New Engl. J. Med. 336: 1575-1595 (1997)). Las corrientes de célula entera se determinan convenientemente utilizando la metodología estándar (véase, por ejemplo, Hamil et al., Pflugers Archiv. 391: 85 (1981). Otros ensayos conocidos incluyen: ensayos de flujo iónico radiomarcado y ensayos de fluorescencia utilizando tintes sensibles al voltaje (véanse, por ejemplo, Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol. 88: 67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol. 4: 269-277 (1997); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth. 25: 185-193 (1991); Holevinsky et al., J. Membrane Biology 137: 59-70 (1994)). Generalmente, los compuestos que se van a ensayar están presentes en el intervalo de 1 pM a 100 mM.

Los efectos de los compuestos de ensayo sobre la función de los polipéptidos pueden medirse examinando cualquiera de los parámetros descritos anteriormente. Puede utilizarse cualquier cambio fisiológico adecuado que afecte la actividad GPCR para evaluar la influencia de un compuesto de ensayo sobre los polipéptidos de esta invención. Cuando se determinan las consecuencias funcionales utilizando células o animales intactos, puede medirse también una variedad de efectos tales como liberación de transmisor, liberación de hormona, cambios transcripcionales en marcadores genéticos tanto conocidos como no caracterizados (por ejemplo, transferencias Northern), cambios en el metabolismo celular tales como crecimiento celular o cambios de pH, y cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como Ca^{2+}, IP3 o AMPc.

Los ensayos preferidos para receptores acoplados a proteína G incluyen células que se cargan con tintes sensibles a iones o voltaje para informar de la actividad receptora. Los ensayos para determinar la actividad de dichos receptores pueden utilizar también agonistas y antagonistas conocidos de otros receptores acoplados a proteína G como controles negativos o positivos para evaluar la actividad de los compuestos ensayados. En ensayos para identificar los compuestos moduladores (por ejemplo, agonistas, antagonistas), se controlarán los cambios en el nivel de iones en el citoplasma o el voltaje de membrana utilizando un indicador sensible a iones o fluorescente del voltaje de membrana, respectivamente. Entre los indicadores sensibles a iones y las sondas de voltaje que pueden emplearse están los dados a conocer en el catálogo de Molecular Probes 1997. Para receptores acoplados a proteína G, pueden utilizarse proteínas G promiscuas tales como G\alpha15 y G\alpha16 en el ensayo de elección (Wilkie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10049-10053 (1991)). Dichas proteínas G promiscuas permiten el acoplamiento de un amplio intervalo de receptores con rutas de transducción en células heterólogas.

La activación de receptor inicia típicamente eventos intracelulares posteriores, por ejemplo, aumentos en los segundos mensajeros tales como IP3, que libera los almacenes intracelulares de iones calcio. La activación de ciertos receptores acoplados a proteína G estimula la formación de trifosfato de inositol (IP3) mediante la hidrólisis mediada por fosfolipasa C de fosfatidilinositol (Berridge & Irvine, Nature 312: 315-321 (1984)). El IP3 estimula a su vez la liberación de los almacenes de ión calcio intracelular. Por tanto, un cambio en los niveles de ión calcio citoplásmico, o un cambio en los niveles de segundo mensajero tales como IP3, puede utilizarse para evaluar la función receptora acoplada a proteína G. Las células que expresan dichos receptores acoplados a proteína G pueden exhibir niveles de calcio citoplásmico aumentados como resultado de la contribución tanto de los almacenes intracelulares como por la activación de canales iónicos, en cuyo caso puede ser deseable, aunque no necesario, realizar dichos ensayos en tampón exento de calcio, opcionalmente suplementado con un agente quelante tal como EGTA, para distinguir la respuesta de fluorescencia resultante de la liberación de calcio de los almacenes internos.

Otros ensayos pueden implicar la determinación de la actividad de receptores que, cuando se activan, dan como resultado un cambio en el nivel de nucleótidos cíclicos intracelulares, por ejemplo, AMPc o GMPc, activando o inhibiendo efectos cadena abajo tales como adenilato ciclasa. Hay canales iónicos controlados por nucleótidos cíclicos, por ejemplo, canales de células fotoreceptoras de bastoncillo y canales neuronales olfatorios, que son permeables a cationes tras la activación mediante unión de AMPc o GMPc (véanse, por ejemplo, Altenhofen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9868-9872 (1991) y Dhallan et al., Nature 347: 184-187 (1990)). En casos en que la activación del receptor da como resultado una reducción de los niveles de nucleótido cíclico, puede ser preferible exponer las células a agentes que aumenten los niveles de nucleótido cíclico intracelular, por ejemplo, forscolina, antes de añadir un compuesto activador de receptor a las células en el ensayo. Las células para este tipo de ensayo pueden prepararse mediante cotransfección de una célula hospedadora con ADN que codifica un canal iónico controlado por nucleótido cíclico, GPCR fosfatasa y ADN que codifica un receptor (por ejemplo, ciertos receptores de glutamato, receptores de acetilcolina muscarínicos, receptores de dopamina, receptores de serotonina y similares) que, cuando se activan, causan un cambio en los niveles de nucleótido cíclico en el citoplasma.

En una realización, pueden medirse los cambios en el AMPc o GMPc intracelular utilizando inmunoensayos. El procedimiento descrito en Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. 270: 15175-15180 (1995) puede utilizarse para determinar el nivel de AMPc. Además, el procedimiento descrito en Felley-Bosco et al., Am. J. Res. Cell and Mol. Biol. 11: 159-163 (1994) puede utilizarse para determinar el nivel de GMPc, Además, se describe un kit de ensayo para medir AMPc y/o GMPc en la patente de EE.UU. 4.115.538, incorporada a la presente memoria como referencia.

En otra realización, la hidrólisis de fosfatidilinositol (PI) puede analizarse según la patente de EE.UU. 5.436.128, incorporada a la presente memoria como referencia. Brevemente, el ensayo implica el marcaje de células con ^{3}H-mioinositol durante 48 h o más. Se tratan las células marcadas con un compuesto de ensayo durante una hora. Se lisan las células tratadas y se extraen con cloroformo-metanol-agua, después de lo cual se separaron los fosfatos de inositol mediante cromatografía de intercambio iónico y se cuantificaron mediante recuento de centelleo. Se determina la estimulación en veces calculando la relación de cpm en presencia de agonista con los cpm en presencia de control tampón. Igualmente, se determina la inhibición en veces calculando la relación de cpm en presencia de antagonista con las cpm en presencia de tampón control (que puede contener o no un agonista).

En otra realización, pueden medirse los niveles de transcripción para evaluar los efectos de un compuesto de ensayo sobre la transducción de señal. Una célula hospedadora que contiene la proteína de interés se pone en contacto con un compuesto de ensayo durante un tiempo suficiente para efectuar cualquier interacción, y después se mide el nivel de expresión génica. La cantidad de tiempo para efectuar dichas interacciones puede determinarse empíricamente, tal como realizando un curso cronológico y midiendo el nivel de transcripción en función del tiempo. La cantidad de transcripción puede medirse utilizando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica por ser adecuado. Por ejemplo, la expresión de ARNm de la proteína de interés puede detectarse utilizando transferencias Northern o sus productos polipeptídicos pueden identificarse utilizando inmunoensayos. Como alternativa, pueden utilizarse ensayos basados en la transcripción utilizando genes informadores como se describe en la patente de EE.UU. 5.436.128, incorporada a la presente memoria como referencia. Los genes informadores pueden ser, por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa, luciferasa de luciérnaga, luciferasa bacteriana, \beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Además, la proteína de interés puede utilizarse como informador indirecto mediante unión a un segundo informador tal como proteína fluorescente verde (véase, por ejemplo, Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15: 961-964 (1997)).

La cantidad de transcripción se compara después con la cantidad de transcripción en la misma célula en ausencia del compuesto de ensayo, o puede compararse con la cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica que carece de la proteína de interés. Una célula sustancialmente idéntica puede derivar de las mismas células de las que se preparó la célula recombinante, pero que no se habían modificado mediante la introducción de ADN heterólogo. Cualquier diferencia en la cantidad de transcripción indica que el compuesto de ensayo ha alterado en cierta manera la actividad de la proteína de interés.

B. Moduladores

Los compuestos ensayados como moduladores de BCA-GPCR pueden ser cualquier compuesto químico pequeño, o una entidad biológica, por ejemplo una macromolécula tal como una proteína, azúcar, ácido nucleico o lípido. Como alternativa, los moduladores pueden ser versiones genéticamente alteradas de un BCA-GPCR. Típicamente, los compuestos de ensayo serán moléculas químicas pequeñas y péptidos. Puede utilizarse esencialmente cualquier compuesto químico como modulador o ligando potencial en los ensayos de la invención, aunque lo más a menudo se utilizan compuestos que puedan disolverse en soluciones acuosas u orgánicas (especialmente basadas en DMSO). Los ensayos se diseñan para examinar grandes bibliotecas químicas automatizando las etapas de ensayo y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente para los ensayos, que se realizan típicamente en paralelo (por ejemplo, en formatos de microvaloración en placas de microvaloración en ensayos robotizados). Se apreciará que existen muchos suministradores de compuestos químicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerland) y similares.

En una realización preferida, los procedimientos de selección de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca química o peptídica combinatoria que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos moduladores o de ligando potenciales). Dichas "bibliotecas químicas combinatorias" o "bibliotecas de ligando" se examinan después en uno o más ensayos, como se describe en la presente memoria, para identificar aquellos miembros de la biblioteca (especies químicas o subclases particulares) que exhiben una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos líder" convencionales o pueden utilizarse por sí mismos como productos terapéuticos potenciales o reales.

Una biblioteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generada mediante síntesis química o síntesis biológica, combinando una serie de "bloques de construcción" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, se forma una biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipéptido combinando un conjunto de bloques de construcción químicos (aminoácidos) en cada forma posible para una longitud de compuesto dada (concretamente, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Pueden sintetizarse millones de compuestos químicos mediante dicho mezclado combinatorio de bloques de construcción químicos.

La preparación y examen de bibliotecas químicas combinatorias es bien conocido por los expertos en la técnica. Dichas bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero sin limitación, bibliotecas de péptidos (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.010.175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991) y Houghton et al., Nature 354: 84-88 (1991)). Pueden utilizarse también otras químicas para generar bibliotecas de diversidad química. Dichas químicas incluyen, pero sin limitación: peptoides (por ejemplo, publicación PCT nº WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, publicación PCT nº WO 93/20242), biooligómeros aleatorios (por ejemplo, publicación PCT nº WO 92/00091), benzodiazepinas (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con esqueleto de glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261: 1303 (1993)) y/o peptidilfosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)), bibliotecas de ácidos nucleicos (véanse Ausubel, Berger y Sambrook, todos supra), bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véanse, por ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996) y el documento PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (véase, por ejemplo, Liang et al., Science, 274: 1520-1522 (1996) y la patente de EE.UU. 5.593.853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véase, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, 18 ene, página 33 (1993); isoprenoides, patente de EE.UU. 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, patente de EE.UU. 5.549.974; pirrolidinas, patentes de EE.UU. 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, patente de EE.UU. 5.506.337; benzodiazepinas, 5.288.514 y similares).

Están comercialmente disponibles dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias (véanse, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Además, están comercialmente disponibles por sí mismas numerosas bibliotecas combinatorias (véanse, por ejemplo, ConGenex, Princeton, NJ, Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).

C. Ensayos de alto rendimiento en estado sólido y soluble

En una realización, la invención proporciona ensayos solubles que utilizan moléculas tales como un dominio tal como un dominio de unión a ligando, un dominio extracelular, un dominio transmembrana (por ejemplo, uno que comprende siete regiones transmembrana y bucles citosólicos), el dominio transmembrana y un dominio citoplásmico, un sitio activo, una región de asociación a subunidad, etc.; un dominio que está ligado covalentemente a una proteína heteróloga para crear una molécula quimérica; un BCA-GPCR; o una célula o tejido que expresa un BCA-GPCR, de origen natural o recombinante. En otra realización, la invención proporciona ensayos in vitro basados en fase sólida en un formato de alto rendimiento, en los que el dominio, molécula quimérica, BCA-GPCR o célula o tejido que expresa un BCA-GPCR se une a un sustrato en fase sólida.

En los ensayos de alto rendimiento de la invención, es posible examinar hasta varios miles de moduladores o ligandos diferentes en un solo día. En particular, cada pocillo de una placa de microvaloración puede utilizarse para realizar un ensayo separado frente a un modulador potencial seleccionado o, si van a observarse los efectos de la concentración o el tiempo de incubación, cada 5-10 pocillos pueden ensayar un solo modulador. Por tanto, una placa de microvaloración estándar individual puede ensayar aproximadamente 100 (por ejemplo 96) moduladores. Si se utilizan placas de 1.536 pocillos, entonces una sola placa puede ensayar fácilmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.500 compuestos diferentes. Es posible ensayar varias placas diferentes cada día; es posible ensayar exámenes de hasta aproximadamente 6.000-20.000 compuestos diferentes utilizando los sistemas integrados de la invención.

La molécula de interés puede unirse al componente en estado sólido, directa o indirectamente, mediante enlace covalente o no covalente, por ejemplo, mediante un marcaje. El marcaje puede ser cualquier de una variedad de componentes. En general, se fija una molécula que se une al marcaje (un ligante de marcaje) a un soporte sólido, y se une la molécula marcada de interés (por ejemplo, la molécula de transducción de señal de interés) al soporte sólido mediante interacción del marcaje y del ligante de marcaje.

Pueden utilizarse una serie de marcajes y ligantes de marcaje basados en interacciones moleculares conocidas bien descritas en la bibliografía. Por ejemplo, cuando un marcaje tiene un ligante natural, por ejemplo, biotina, proteína A o proteína G, puede utilizarse junto con ligantes de marcaje apropiados (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región Fc de una inmunoglobulina, etc.). Los anticuerpos de moléculas con ligantes naturales tales como biotina son también ligantes de marcaje ampliamente disponibles y apropiados; véase el catálogo SIGMA 1998 de SIGMA Immunochemicals, St. Louis, MO).

De forma similar, puede utilizarse cualquier compuesto hapténico o antigénico en combinación con un anticuerpo apropiado para formar un par marcaje/ligante de marcaje. Están comercialmente disponibles miles de anticuerpos específicos y se describen muchos anticuerpos adicionales en la bibliografía. Por ejemplo, en una configuración común, el marcaje es un primer anticuerpo y el ligante de marcaje es un segundo anticuerpo que reconoce al primer anticuerpo. Además de las interacciones anticuerpo-antígeno, las interacciones receptor-ligando son también apropiadas como pares de marcaje y ligante de marcaje. Por ejemplo, agonistas y antagonistas de receptores de membrana celular (por ejemplo, interacciones receptor celular-ligando tales como transferrina, c-kit, ligandos de receptor viral, receptores de citoquina, receptores de quimioquina, receptores de interleuquina, receptores de inmunoglobulina y anticuerpos, la familia de cadherina, la familia de integrinas, la familia de selectina y similares; véase, por ejemplo, Pigott & Power, "The Adhesion Molecule Facts Book I" (1993)). De forma similar, toxinas y venenos, epítopos virales, hormonas (por ejemplo, opiáceos, esteroides, etc), receptores intracelulares (por ejemplo que median los efectos de diversos ligandos pequeños, incluyendo esteroides, hormona tiroidea, retinoides y vitamina D; péptidos), fármacos, lectinas, azúcares, ácidos nucleicos (tanto configuraciones poliméricas lineales como cíclicas), oligosacáridos, proteínas, fosfolípidos y anticuerpos pueden interactuar todos con diversos receptores celulares.

Polímeros sintéticos tales como poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, poliarilensulfuros, polisiloxanos, poliimidas y poliacetatos pueden forman también un marcaje o ligante de marcaje apropiado. Son también útiles muchos otros pares marcaje/ligante de marcaje en sistemas de ensayo descritos en la presente memoria, como resultará evidente para un experto tras la revisión de esta memoria descriptiva.

Engarces comunes tales como péptidos, poliéteres y similares pueden servir también como marcajes, e incluyen secuencias polipeptídicas tales como secuencias poliGly de entre aproximadamente 5 y 200 aminoácidos. Dichos engarces flexibles son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los engarces poli(etilenglicol) están disponibles en Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama. Estos engarces tienen opcionalmente enlaces amida, enlaces sulfhidrilo o enlaces heterofuncionales.

Los ligantes de marcaje se fijan a sustratos sólidos utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos disponibles actualmente. Los sustratos sólidos se derivatizan o funcionalizan habitualmente exponiendo todo o una porción del sustrato a un reactivo químico que fija un grupo químico a la superficie que es reactivo con una porción del ligante de marcaje. Por ejemplo, los grupos que son adecuados para unión a una porción de cadena más larga incluirían grupos amina, hidroxilo, tiol y carboxilo. Pueden utilizarse aminoalquilsilanos e hidroxialquilsilanos para funcionalizar una variedad de superficies, tales como superficies de vidrio. La construcción de dichas matrices biopoliméricas en fase sólida está bien descrita en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963) (que describe la síntesis en fase sólida de, por ejemplo, péptidos); Geysen et al., J. Immun. Meth. 102: 259-274 (1987) (que describe la síntesis de componentes en fase sólida sobre puntas); Frank & Doring, Tetrahedron 44: 6031-6040 (1988) (que describe la síntesis de diversas secuencias peptídicas sobre discos de celulosa); Fodor et al., Science, 251: 767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4): 718-719 (1993); y Kozal et al., Nature Medicine 2(7): 753-759 (1996) (que describen todos matrices de biopolímeros fijados a sustratos sólidos). Los enfoques no químicos para fijar ligantes de marcaje a sustratos incluyen otros procedimientos comunes, tales como calor, entrecruzamiento por radiación UV y similares.

D. Matrices informatizadas

Aún otro ensayo para compuestos que modulan la actividad BCA-GPCR implica el diseño de fármacos asistido por ordenador, en el que se utiliza un sistema informático para generar una estructura tridimensional de BCA-GPCR basada en la información estructural codificada por la secuencia aminoacídica. La secuencia aminoacídica de entrada interacciona directa y activamente con un algoritmo preestablecido en un programa informático, proporcionando modelos estructurales secundarios, terciarios y cuaternarios de la proteína. Se examinan después los modelos de estructura proteica para identificar regiones de la estructura que tengan la capacidad de unir, por ejemplo, ligandos. Estas regiones se utilizan después para identificar ligandos que se unen a la proteína.

El modelo estructural tridimensional de la proteína se genera introduciendo secuencias aminoacídicas proteicas de al menos 10 restos aminoacídicos o las correspondientes secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido BCA-GPCR en el sistema informático. La secuencia aminoacídica del polipéptido o el ácido nucleico que codifica el polipéptido se selecciona del grupo constituido por las SEC Nº ID 1-8 y versiones modificadas conservativamente de las mismas. La secuencia aminoacídica representa la secuencia primaria o subsecuencia de la proteína, que codifica la información estructural de la proteína. Se introducen al menos 10 restos de la secuencia aminoacídica (o una secuencia nucleotídica que codifica 10 aminoácidos) en el sistema informático con teclados de ordenador, sustratos legibles informáticamente que incluyen, pero sin limitación, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, disquetes magnéticos, cintas, cartuchos y chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), información distribuida por sitios de Internet y por RAM. El modelo estructural tridimensional de la proteína se genera después mediante la interacción de la secuencia aminoacídica y el sistema informático, utilizando software conocido por los expertos en la técnica.

La secuencia aminoacídica representa una estructura primaria que codifica la información necesaria para formar la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína de interés. El software observa ciertos parámetros codificados por la secuencia primara para generar el modelo estructural. Estos parámetros se refieren como "términos de energía", e incluyen principalmente potenciales electrostáticos, potenciales hidrófobos, superficies accesibles a disolvente y enlaces de hidrógeno. Los términos de energía secundarios incluyen potenciales de van der Waals. Las moléculas biológicas forman estructuras que minimizan los términos de energía de modo acumulativo. El programa informático utiliza por lo tanto estos términos codificados por la estructura primaria o secuencia aminoacídica para crear el modelo estructural secundario.

La estructura terciaria de la proteína codificada por la estructura secundaria se forma después basándose en los términos de energía de la estructura secundaria. El usuario puede introducir en este punto variables adicionales tales como si la proteína está unida a membrana o es soluble, su localización en el cuerpo y su localización celular, por ejemplo, citoplásmica, superficial o nuclear. Estas variables, junto con los términos de energía de la estructura secundaria, se utilizan para formar el modelo de estructura terciaria. Al modelizar la estructura terciaria, el programa informático hace coincidir las caras de estructura secundaria hidrófoba con similares, y las caras de estructura secundaria hidrófila con similares.

Una vez se ha generado la estructura, se identifican las regiones de unión a ligando potencial por el sistema informático. Se generan estructuras tridimensionales para los ligandos potenciales introduciendo las secuencias aminoacídicas o nucleotídicas o fórmulas químicas de los compuestos, como se describe anteriormente. La estructura tridimensional del ligando potencial se compara después con la de la proteína BCA-GPCR para identificar ligandos que se unen a BCA-GPCR. Se determina la afinidad de unión entre la proteína y los ligandos utilizando términos de energía para determinar qué ligandos tienen una probabilidad potenciada de unión a la proteína.

Los sistemas informáticos se utilizan también para examinar mutaciones, variantes polimórficas, alelos y homólogos interespecies de genes de BCA-GPCR. Dichas mutaciones pueden estar asociadas a estados patológicos o características genéticas. Como se describe anteriormente, puede utilizarse también GeneChip® y tecnología relacionada para examinar mutaciones, variantes polimórficas, alelos y homólogos interespecies. Una vez se identifican las variantes, pueden utilizarse ensayos de diagnóstico para identificar pacientes que tienen dichos genes mutados. La identificación de los genes de BCA-GPCR mutados implica recibir la entrada de una primera secuencia de ácido nucleico o aminoacídica que codifica un BCA-GPCR, seleccionado del grupo constituido por las SEC Nº ID 1-8 y versiones modificadas conservativamente de las mismas. La secuencia se introduce en el sistema informático como se describe anteriormente. Se compara entonces la primera secuencia de ácido nucleico o aminoacídica con una segunda secuencia de ácido nucleico o aminoacídica que tiene identidad sustancial con la primera secuencia. Se introduce la segunda secuencia en el sistema informático de la manera descrita anteriormente. Una vez se comparan la primera y segunda secuencias, se identifican las diferencias nucleotídicas o aminoacídicas entre las secuencias. Dichas secuencias pueden representar diferencias alélicas en genes de BCA-GPCR, y mutaciones asociadas a estados patológicos y características genéticas.

Kits

Los BCA-GPCR y sus homólogos son una herramienta útil para identificar células tales como células cancerosas, para determinaciones forenses y de paternidad, para diagnóstico de enfermedades tales como cáncer, por ejemplo cáncer de mama, y para examinar la transducción de señal. Los reactivos específicos de BCA-GPCR que hibridan específicamente con ácidos nucleicos de BCA-GPCR, tales como sondas y cebadores de BCA-GPCR, y los reactivos específicos de BCA-GPCR que se unen específicamente a una proteína BCA-GPCR, por ejemplo, anticuerpos de BCA-GPCR, se utilizan para examinar la regulación de la transducción de señal.

Los ensayos de ácido nucleico para la presencia de ADN y ARN de BCA-GPCR en una muestra incluyen numerosas técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica, tales como análisis Southern, análisis Northern, transferencia en mancha, protección de ARNAsa, análisis por S1, técnicas de amplificación tales como PCR y LCR e hibridación in situ. En la hibridación in situ, por ejemplo, se libera el ácido nucleico diana de su entorno celular de tal modo que está disponible para hibridación en la célula, conservando la morfología celular para la posterior interpretación y análisis (véase el ejemplo I). Los siguientes artículos proporcionan una revisión de la técnica de la hibridación in situ: Singer et al., Biotechniques 4: 230-250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, vol. VII, pág. 189-226 (1984); y "Nucleic Acid Hibrydization: A Practical Approach" (Hames et al., ed. 1987). Además, la proteína BCA-GPCR puede detectarse con las diversas técnicas de inmunoensayo descritas anteriormente. La muestra de ensayo se compara típicamente tanto con un control positivo (por ejemplo, una muestra que expresa un BCA-GPCR recombinante) como con un control negativo.

La presente invención proporciona también kits para examinar moduladores de BCA-GPCR. Dichos kits pueden prepararse a partir de materiales y reactivos disponibles fácilmente. Por ejemplo, dichos kits pueden comprender uno o más de los siguientes materiales: un BCA-GPCR, tubos de reacción e instrucciones para ensayar la actividad BCA-GPCR. Opcionalmente, los kits contienen BCA-GPCR biológicamente activo. Pueden prepararse una amplia variedad de kits y componentes según la presente invención, dependiendo del usuario pretendido del kit y de las necesidades particulares del usuario.

Administración y composiciones farmacéuticas

Pueden administrarse moduladores de BCA-GPCR directamente al sujeto mamífero para la modulación de la transducción de señal in vivo, por ejemplo, para el tratamiento de un cáncer tal como cáncer de mama. La administración es mediante cualquiera de las vías utilizada normalmente para introducir un compuesto modulador en contacto último con el tejido que se va a tratar. Los moduladores de BCA-GPCR se administran de cualquier manera adecuada, opcionalmente con vehículos farmacéuticamente aceptables. Los procedimientos adecuados de administración de dichos moduladores están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica y, aunque puede utilizarse más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular puede proporcionar a menudo una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se esté administrando, así como por el procedimiento particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17ª ed., 1985)).

Los moduladores de BCA-GPCR, solos o en combinación con otros componentes adecuados, pueden prepararse en formulaciones de aerosol (concretamente, pueden "nebulizarse") para administrarse por inhalación. Las formulaciones de aerosol pueden disponerse en propelentes a presión aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que vuelven la formulación isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. En la práctica de esta invención, pueden administrarse composiciones, por ejemplo, por vía oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intravesical o intratecal. Opcionalmente, las composiciones se administran por vía oral o nasal. Las formulaciones de compuestos pueden presentarse en envases sellados monodosis o multidosis, tales como ampollas y viales. Las soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente. Los moduladores pueden administrarse también como parte de un alimento preparado o fármaco.

La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para efectuar una respuesta beneficiosa en el sujeto con el tiempo. Dichas dosis se administran profilácticamente o a un individuo que ya padece la enfermedad. Las composiciones se administran a un paciente en una cantidad eficaz para desencadenar una respuesta protectora o terapéutica eficaz en el paciente. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como "dosis terapéuticamente eficaz". La dosis se determinará por la eficacia de los moduladores de BCA-GPCR particulares (por ejemplo, antagonistas de GPCR y anticuerpos anti-GPCR) empleados y la afección del sujeto, así como por el peso corporal o el área superficial de la zona que se va a tratar. El tamaño de la dosis se determinará también por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto secundario adverso que acompañe a la administración de un compuesto o vector particular a un sujeto particular.

Al determinar la cantidad eficaz del modulador que se va a administrar, un médico puede evaluar los niveles plasmáticos en circulación del modulador, las toxicidades del modulador, etc., y la producción de anticuerpos anti-modulador. En general, la dosis equivalente de un modulador es de aproximadamente 1 ng/kg a 10 mg/kg para un sujeto típico.

Para administración, los moduladores de BCA-GPCR de la presente invención pueden administrarse a una tasa, determinada por la LD50 del modulador y los efectos secundarios del inhibidor a diversas concentraciones, aplicada a la masa y salud general del sujeto. La administración puede conseguirse mediante dosis individual o repartida.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse proporcionando resultados esencialmente similares.

Ejemplo I Identificación y clonación de nuevos BCA-GPCR

Se clonaron cuatro BCA-GPCR humanos, y sus secuencias de ácido nucleico se proporcionan en las SEC Nº ID 1, 3, 5 y 7. Las secuencias aminoacídicas deducidas se proporcionan en las SEC Nº ID 2, 4, 6 y 8. Los nuevos BCA-GPCR se designaron BCA-GPCR-1, 2, 3 y 4, respectivamente.

Estas secuencias pueden amplificarse a partir de ADNc o ADN genómico con condiciones PCR estándar utilizando los siguientes cebadores de PCR:

ATGTTGGGGAACGTCGCCATC (SEC Nº ID 9) y

TCATCCACAGAGCCTCCAGAT (SEC Nº ID 10) (BCA-GPCR-1);

ATGGGAAAGGACAATCCAGTT (SEC Nº ID 11) y

CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA (SEC Nº ID 12) (BCA-GPCR-2);

ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC (SEC Nº ID 13) y

TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG (SEC Nº ID 14) (BCA-GPCR-3);

y

ATGGTGAGACATACCAATGAGAG (SEC Nº ID 15) y

CATAAAATATTTACTCCCAGAGCC (SEC Nº ID 16) (BCA-GPCR-4).

Ejemplo II Expresión de ARNm y amplificación génica de BCA-GPCR-3 en células de cáncer de mama y tumores

Se midió la amplificación génica de BCA-GPCR-3 en líneas celulares de cáncer de mama y tumores según metodología estándar (véase la Figura 1).

Se examinó la expresión de ARNm de BCA-GPCR-3 en líneas celulares de cáncer de mama utilizando PCR-TI según metodología estándar (véanse las Figuras 2 y 3). Los niveles de ARNm de BCA-GPCR-3 fueron elevados en líneas de cáncer de mama tanto de tumores amplificados como no amplificados, un rasgo de oncogenes.

Secuencia de ácido nucleico BCA-GPCR-1: SEC Nº ID 1

1

Secuencia aminoacídica BCA-GPCR-1: SEC Nº ID 2

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2

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Secuencia de ácido nucleico BCA-GPCR-2: SEC Nº ID 3

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3

4

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Secuencia aminoacídica BCA-GPCR-2: SEC Nº ID 4

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5

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Secuencia de ácido nucleico BCA-GPCR-3: SEC Nº ID 5

6

Secuencia aminoacídica BCA-GPCR-3: SEC Nº ID 6

7

8

Secuencia de ácido nucleico BCA-GPCR-4: SEC Nº ID 7

9

Secuencia aminoacídica BCA-GPCR-4: SEC Nº ID 8

10

Claims (27)

1. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, comprendiendo el polipéptido codificado por el ácido nucleico más de 70% de identidad aminoacídica con una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6, en el que la expresión del polipéptido está regulada diferencialmente en células de cáncer de mama y tumores en comparación con células de epitelio mamario normales.

2. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, comprendiendo el polipéptido codificado por el ácido nucleico 90% o más de identidad aminoacídica con una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6, en el que la expresión del polipéptido está regulada diferencialmente en células de cáncer de mama y tumores en comparación con células de epitelio mamario normales.

3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico hibrida selectivamente con una secuencia nucleotídica de SEC Nº ID 5 en condiciones rigurosas de hibridación que comprenden 50% de formamida, 5 x SSC y 1% de SDS a 42ºC y condiciones de lavado que comprenden 0,2 x SSC y 0,1% de SDS a 65ºC.

4. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

5. Un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleotídica de SEC Nº ID 5.

6. El ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico es de un ser humano, un ratón o una rata.

7. El ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico se amplifica mediante cebadores que hibridan específicamente en condiciones rigurosas de hibridación con la misma secuencia que un conjunto cebador ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC (SEC Nº ID 13) y TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG (SEC Nº ID 14).

8. Un polipéptido aislado, comprendiendo el polipéptido más de 70% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6, en el que la expresión del polipéptido se regula diferencialmente en células de cáncer de mama y tumores en comparación con células de epitelio mamario normales.

9. El polipéptido aislado de la reivindicación 8, que comprende 90% o más identidad de secuencia aminoacídica con una secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

10. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6.

11. El polipéptido aislado de la reivindicación 8, 9 ó 10, en el que el polipéptido es de un ser humano, una rata o un ratón.

12. Un anticuerpo que se une selectivamente al polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

13. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

14. Una célula hospedadora transfectada con el vector de la reivindicación 13.

15. Un procedimiento de detección de la presencia de un ácido nucleico o polipéptido GPCR3 en una muestra biológica de un tejido humano, comprendiendo el procedimiento las etapas de.

(i)

aislar la muestra biológica,

(ii)

poner en contacto la muestra biológica con un reactivo específico que se asocia selectivamente con un ácido nucleico según la reivindicación 5 o un polipéptido según la reivindicación 10, y

(iii)

detectar el nivel de reactivo específico que se asocia selectivamente con la muestra.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el reactivo específico se selecciona del grupo constituido por: anticuerpos específicos, cebadores oligonucleotídicos específicos y sondas de ácido nucleico específicas.

17. El procedimiento de la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que el tejido es tejido de cáncer de mama.

18. Un procedimiento de preparación de un polipéptido, comprendiendo el procedimiento la etapa de expresar el polipéptido de un vector de expresión recombinante de la reivindicación 13.

19. Un procedimiento de preparación de una célula recombinante que comprende un polipéptido, comprendiendo el procedimiento la etapa de transducir la célula con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

20. Un ácido nucleico aislado que comprende al menos 100 nucleótidos contiguos de SEC Nº ID 5 o el complemento de la SEC Nº ID 5.

21. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 20, en el que el ácido nucleico comprende al menos 100 nucleótidos contiguos de SEC Nº ID 5 y se amplifica mediante un conjunto cebador de SEC Nº ID 13 y SEC Nº ID 14.

22. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende la subsecuencia aminoacídica de SEC Nº ID 6 que está codificada por un ácido nucleico que se amplifica mediante un conjunto cebador de SEC Nº ID 13 y SEC Nº ID 14.

23. Un vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 20-22.

24. Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de la reivindicación 23.

25. Un polipéptido aislado que comprende al menos 200 aminoácidos contiguos de la SEC Nº ID 6.

26. Un polipéptido aislado que comprende la región aminoacídica de la SEC Nº ID 6 desde el resto de metionina en la posición 22 hasta el resto de isoleucina en la posición 340.

27. Un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la reivindicación 25 ó 26.