ES2289817T3 - Acidos nucleicos que codifican un receptor acoplado a proteinas e implicado en la transduccion sensorial. - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

Description

Ácidos nucleicos que codifican un receptor acoplado a proteínas e implicado en la transducción sensorial.

Declaración sobre investigación y desarrollo subvencionados por el gobierno federal de EE.UU

Esta invención se llevó a cabo con apoyo financiero del Gobierno de EE.UU. con el nº de Subvención 5R01 DC03160, adjudicada por el Instituto Nacional de Salud. El Gobierno de EE.UU. tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Campo de la invención

La invención proporciona secuencias aisladas de ácidos nucleicos y aminoácidos de receptores, acoplados a proteínas G, específicos de las células sensoriales, anticuerpos para dichos receptores, métodos para detectar dichos ácidos nucleicos y receptores, y métodos para escrutar moduladores de los receptores acoplados a proteínas G específicos de las células sensoriales.

Fundamento de la invención

La transducción del gusto es una de las formas más sofisticadas de la quimiotransducción en animales (véase, por ejemplo, Margolskee, BioEssays 15:645-650 (1993); Avenet & Lindernann, J. Membrane Biol. 112:1-8 (1989)). Las señalizaciones gustativas se encuentran en todo el reino animal, desde los simples metazoos hasta el más complejo de los vertebrados; su finalidad principal es proporcionar una respuesta señalizadora fiable a los ligandos no volátiles. Se cree que cada una de estas modalidades es mediada por distintas vías de señalización a través de receptores o canales, que conducen a la despolarización de las células receptoras, a la generación de un receptor o acción potencial y a la liberación de un neurotransmisor en las sinapsis de las neuronas aferentes gustativas (véase, por ejemplo, Roper, Ann. Rev. Neurosci. 12:329-353 (1989)).

Se cree que los mamíferos tienen cinco modalidades gustativas básicas: dulce, amargo, agrio, salado y "unami" (el sabor del glutamato monosódico) (véase, por ejemplo, Kawamura & Kare, Introduction to Unami: A Basic Taste (1987); Kinnamon & Cummings, Ann. Rev. Physiol. 54:715-731(1992); Lindemann, Physiol. Rev. 76:718-766 (1996); Stewart et al., Am. J. Physiol. 272:1-26 (1997)). Amplios estudios psicofísicos en seres humanos han demostrado que diferentes regiones de la lengua presentan diferentes preferencias gustativas (véase, por ejemplo, Hoffmann, Menchen. Arch. Path. Anat. Physiol. 62:516-530 (1875); Bradley et al., Anatomical Record 212: 246-249 (1985); Miller & Reedy, Physiol. Behav. 47:1213-1219 (1990)). También, numerosos estudios fisiológicos en animales han mostrado que las células receptoras pueden responder selectivamente a diferentes sabores (véase, por ejemplo, Akabas et al., Science 242:1047-1050 (1988); Gilbertson et al., J. Gen. Physiol. 100:803-24(1992);Bernhardt et al., J. Physiol. 490:325-336(1996); Cummings et al., J. Neurophysiol. 75:1256-1263(1996)).

En los mamíferos, las células receptoras del gusto están agrupadas en botones gustativos que están distribuidos en diferentes papilas en el epitelio de la lengua. Las papilas circunvalares, encontradas en la zona más posterior de la lengua, contienen cientos (en ratones) a miles (en seres humanos) de botones gustativos y son particularmente sensibles a las sustancias amargas. Las papilas foliares, localizadas en el borde lateral posterior de la lengua, contiene docenas a cientos de botones gustativos y son particularmente sensibles a las sustancias agrias y amargas. Las papilas fungiformes que contienen uno solo o algunos botones gustativos se encuentran en la punta de la lengua y se cree que median mucho de la modalidad sabor dulce.

Cada botón gustativo, dependiendo de la especie, contiene 50-150 células, incluyendo las células precursoras, las células de soporte y las células receptoras del gusto (véase, por ejemplo, Lindemann, Physiol. Rev. 76:718-766(1996)). Las células receptoras están provistas de nervios en su base por las terminaciones nerviosas aferentes que transmiten información a los centros gustativos de la corteza cerebral a través de la sinapsis en el tronco encefálico y el tálamo. La comprensión de los mecanismos de señalización de las células gustativas y del procesamiento de la información son críticos para entender la función, regulación y "percepción" del sentido del gusto.

Aunque mucho se sabe sobre la psicofísica y fisiología de la función de las células gustativas, muy poco se conoce sobre las moléculas y vías que median estas respuestas de señalización sensorial (revisado por Gilbertson, Current Opn. in Neurobiol. 3:532-539 (1993)). Estudios electrofisiológicos sugieren que los sabores agrio y salado modulan la función de las células gustativas por la entrada directa de iones H^{+} y Na^{+} a través de canales especializados de las membranas en la superficie apical de la célula. En el caso de compuestos ácidos, existe la hipótesis de que la despolarización de las células gustativas resulta del bloqueo por H^{+} de los canales de K^{+} (véase, por ejemplo, Kinnamon et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:7023-7027 (1988)) o de la activación de los canales sensibles al pH (véase, por ejemplo, Gilbertson et al., J. Gen. Physiol. 100:803-24(1992));la transducción del salado puede ser mediada parcialmente por la entrada de Na^{+} por medio de los canales de Na sensibles a la amilorida (véase, por ejemplo, Heck et al., Science 223:403-405 (1984); Brand et al., Brain Res. 207-214 (1985); Avenet et al., Nature 331: 351-354(1988)).

Se cree que la transducción de los gustos dulce, amargo y unami está mediada por las vías de señalización del receptor acoplado a proteínas G (en lo sucesivo GPCR, de la expresión inglesa G-Protein-Coupled Receptor) (véase, por ejemplo, Striem et al., Biochem. J. 260:121-126 (1989); Chaudhari et al., J. Neuros. 16:3817-3826(1996); Wong et al., Nature 381: 796-800(1996)). Confusamente, existen casi tantos modelos de vías de señalización para la transducción de los gustos dulce y amargo como enzimas efectoras para las cascadas del GPCR (por ejemplo, subunidades de las proteínas G, cGMP-fosfodiesterasa, fosfolipasa C, adenilato-ciclasa; véase, por ejemplo, Kinnamon & Margolskee, Curr. Opin. Neurobiol. 6:506-513 (1996)). Sin embargo, poco se sabe sobre los receptores específicos de las membranas implicados en la transducción de los gustos, ni de muchas de las moléculas individuales de señalización intracelular activadas por las vías de transducción del gusto individual. La identificación de dichas moléculas es importante dadas las numerosas aplicaciones farmacológicas y en la industria alimentaria para antagonistas amargos, agonistas dulces y moduladores de los gustos salado y agrio.

La identificación y aislamiento de los receptores gustativos (incluyendo los canales iónicos gustativos) y de las moléculas de señalización del gusto, tales como las subunidades de las proteínas G y las enzimas implicadas en la transducción de la señal, permitirían la modulación farmacológica y genética de las vías de transducción del gusto. Por ejemplo, la disponibilidad del receptor y de las moléculas de los canales permitiría el escrutinio de agonistas, antagonistas, agonistas inversos de alta actividad y moduladores de la actividad de las células gustativas. Dichos compuestos moduladores del gusto podrían usarse entonces en las industrias farmacéuticas y alimentarias para personalizar el sabor. Además, dichas moléculas específicas de las células gustativas pueden servir como herramientas inestimables en la generación de mapas topográficos gustativos que ilustren la relación entre las células gustativas de la lengua y las neuronas sensoriales gustativas que conducen a los centros gustativos del cerebro.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona así por primera vez ácido nucleicos que codifican un receptor acoplado a proteínas G específicos de las células gustativas. Estos ácido nucleicos y los polipéptidos que codifican se denominan "GPCR-B4" para el receptor acoplado a proteínas G ("GPCR") B4. Estos GPCR específicos de las células gustativas son componentes de la vía de transducción del gusto.

En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

En una realización, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3. En otra realización, el ácido nucleico es amplificado por cebadores que se hibridan selectivamente en condiciones de hibridación restringidas a la misma secuencia que los conjuntos de cebadores degenerados que codifican las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SAGGPMCFLM (SEQ ID NO:5) y WMRYHGPYVF (SEQ ID NO:6).

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, en el que el ácido nucleico se hibrida específicamente en condiciones muy restringidas a un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:3.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:1, en el que el ácido nucleico se hibrida selectivamente en condiciones moderadamente restringidas a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un receptor acoplado a proteínas G para transducción sensorial aislado, presentando dicho receptor una identidad de secuencia de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

En una realización, el receptor se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra SEQ ID NO:1. En otra realización, el receptor tiene actividad de receptor acoplado a proteínas G. En otra realización, el receptor tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. En otra realización, el receptor es de rata.

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une selectivamente a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedante transfectada con el vector de expresión.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un compuesto que modula la señalización sensorial en células sensoriales, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende un receptor acoplado a proteínas G para transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de secuencia de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; y (ii) determinar el efecto funcional del compuesto sobre el receptor.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un compuesto que modula la señalización sensorial en células sensoriales, comprendiendo dicho método las etapas de: (i) poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende un receptor acoplado a proteínas G para transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de secuencia de aminoácidos mayor que aproximadamente 80% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; y (ii) determinar el efecto funcional del compuesto sobre el receptor.

En una realización, el polipéptido es un receptor acoplado a proteínas G para transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con un polipéptido que codifica la SEQ ID NO:1. En otra realización, el polipéptido comprende el receptor acoplado a proteínas G para transducción sensorial que está unido covalentemente a un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico. En otra realización, el polipéptido tiene una actividad de receptor acoplado a proteínas G. En otra realización, el receptor está unido a una fase sólida, de modo covalente o no covalente. En otra realización, el efecto funcional se determina midiendo los cambios en cAMP, IP3 ó Ca^{2+} intracelular. En otra realización, el efecto funcional es un efecto químico. En otra realización, el efecto funcional se determina midiendo la unión del compuesto con el dominio extracelular. En otra realización, el polipéptido es recombinante. En otra realización, el polipéptido se expresa en una célula o membrana celular. En otra realización, la célula es una célula eucariota.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un receptor acoplado a proteínas G para transducción sensorial, comprendiendo dicho método la etapa de expresar el receptor a partir de un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica el receptor, en el que la secuencia de aminoácidos del receptor presenta una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, la presente invención proporciona un vides a método para preparar un célula recombinante que comprende un receptor acoplado a proteínas G para transducción sensorial, comprendiendo dicho método la etapa de transducción de la célula con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el receptor, en el que la secuencia de aminoácidos del receptor presenta una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente el 70% con un polipéptido que tienen una secuencia de SEQ ID NO:1.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor acoplado a proteínas G para transducción sensorial, comprendiendo dicho método la etapa de ligar a un vector de expresión un ácido nucleico que codifica el receptor, en el que la secuencia de aminoácidos del receptor presenta una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:1.

Descripción detallada de la invención I. Introducción

La presente invención proporciona por primera vez ácidos nucleicos que codifican un receptor acoplado a proteínas G específico de las células gustativas. Estos ácidos nucleicosy los receptores que codifican se denominan "GPCR" para el receptor acoplado a proteínas G, y se designan GPCR-B4. Estos GPCR específicos de las células gustativas son componentes de la vía de transducción del gusto (véase, por ejemplo, Ejemplo II). Estos ácidos nucleicos proporcionan sondas valiosas para la identificación de células gustativas, ya que los ácidos nucleicos se expresan específicamente en las células gustativas. Por ejemplo, las sondas para los polipéptidos y proteínas del GPCR pueden usarse para identificar subconjuntos de células gustativas, tales como células foliares y células circunvalares, o células receptoras del gusto específicas, por ejemplo, dulce, agrio, salado y amargo. Sirven también como herramientas para la generación de mapas topográficos del gusto que expliquen la relación entre las células gustativas de la lengua y las neuronas sensoriales del gusto que conducen a los centros gustativos del cerebro. Además, los ácido nucleicos y las proteínas que codifican pueden usarse como sondas para diseccionar los comportamientos inducidos por el gusto.

La invención también proporciona métodos para escrutar moduladores, por ejemplo, activadores, inhibidores, estimuladores, mejoradores, agonistas y antagonistas, de estos nuevos GPCR de las células gustativas. Dichos moduladores de la transducción del gusto son útiles para modulación farmacológica y genética de las vías de señalización del gusto. Estos métodos de escrutinio pueden usarse para identificar agonistas y antagonistas de alta afinidad de la actividad de las células gustativas. Estos compuestos moduladores pueden usarse luego en las industrias alimentarias y farmacéuticas para personalizar el sabor. Por tanto, la invención proporciona valoraciones para la modulación del gusto, en las que los GPCR-B4 actúan como moléculas informadoras directas o indirectas del efecto de los moduladores sobre la transducción del gusto. Los GPCR pueden usarse en valoraciones, por ejemplo, para medir cambios en la concentración iónica, potencial de las membranas, flujo de corriente, flujo iónico, transcripción, transducción de señales, interacciones receptor-ligando, concentraciones del segundo mensajero, in vitro, in vivo y ex vivo. En una realización, puede usarse GPCR-B4 como informador indirecto por la unión a una segunda molécula informadora, tal como la proteína fluorescente verde (véase, por ejemplo, Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15:961-964(1997)). En otra realización, los GPCR B-4 se expresan de modo recombinante en células y la modulación de la transducción del gusto
por medio de la actividad de GPCR se valora midiendo los cambios en los niveles de Ca^{2+} (véase el Ejemplo II).

Los métodos de valoración para los moduladores de la transducción del gusto incluyen valoraciones de unión a ligandos in vitro usando GPCR-B4, porciones de los mismos, tal como el dominio extracelular o proteínas quiméricas que comprenden uno o más dominios de GPCR-B4; expresión de GPCR-B4 en oocitos; expresión de GPCR-B4 en células de cultivo tisular; activación de la transcripción de GPCR-B4; fosforilación y desfosforilación de los GPCR; unión de proteínas G a los GPCR; valoraciones de la unión a ligandos; cambios de voltaje, del potencial de la membrana y de laconductancia; valoraciones del flujo iónico; cambios en los segundos mensajeros intracelulares, tales como cAMP y trifosfato deinositol; cambios en los niveles intracelulares de calcio; y liberación de los neurotransmisores.

Por último, la invención proporciona métodos para detectar la expresión de ácidos nucleicos y proteínas en GPCR-B4, permitiendo la investigación de la regulación de la transducción del gusto y la identificación específica de las células receptoras del gusto. El GPCR-B4 también proporciona sondas útiles de ácidos nucleicos para investigaciones forenses y de paternidad. El GPCR-B4 es útil como una sonda de ácidos nucleicos para identificar subpoblaciones de células receptoras del gusto, tales como células receptoras del gusto foliares, fungiformes y circunvalares. Los receptores GPCR-B4 también pueden usarse para generar anticuerpos monoclonales y policlonales útiles para identificar las células receptoras del gusto. Las células receptoras del gusto pueden identificarse usando técnicas tales como transcripción inversa y amplificación de mRNA, aislamiento de RNA total o de RNA poli A, transferencia Northern, transferencia de puntos, hibridación in situ, protección con RNasa, digestión con S1, disposiciones de micromatrices (microchips) de DNA para sondeo, transferencia Western y similares.

Funcionalmente, el GPCR-B4 representa un receptor acoplado a proteínas G de siete regiones transmembránicas implicado en la transducción del gusto, que interaccionan con una proteína G para mediar la transducción de la señal del gusto (véase, por ejemplo, Fong, Cell Signal 8:217 (1996); Baldwin, Curr. Opin. Cell Biol. 6:180 (1994)).

Estructuralmente, la secuencia de nucleótidos de GPCR-B4 (véase la SEQ ID NO:3, aislada de rata) codifica un polipéptido de aproximadamente 842 aminoácidos con un peso molecular predicho de aproximadamente 97 kDa y un intervalo predicho de 92-102 kDa (véase, SEQ ID NO:1, aislada de rata). Los genes de GPCR-B4 relacionados de otras especies (véase, por ejemplo, SEQ ID NOS:4 y 8, aislados de ratón y seres humanos respectivamente) comparten una identidad de aminoácidos de al menos aproximadamente 70% con una región de aminoácidos de al menos aproximadamente 25 aminoácidos, opcionalmente con una longitud de 50 a 100 aminoácidos (véase, por ejemplo, SEQ ID NOS:4 y 8, aisladas de ratón y seres humanos). El GPCR-B4 se expresa específicamente en células foliares y fungiformes, con menor expresión en células circunvalares de la lengua receptoras del gusto. El GPCR-B4 es una secuencia moderadamente rara encontrada en aproximadamente 1/150.000 cDNA de una genoteca de cDNA circunvalar cebada con oligo-dT (véase Ejemplo I).

La presente invención también proporciona variantes polimorfas del GPCR-B4 representado en SEQ ID NO:1: variante nº 1, en la que un residuo ácido de leucina está sustituido por un residuo de isoleucina en la posición del aminoácido 8;variante nº 2, en la que un residuo de ácido glutámico está sustituido por un residuo de ácido aspártico en la posición del aminoácido 26; y variante nº 3, en la que un residuo de alanina está sustituido por un residuo de glicina en la posición del aminoácido 46.

Pueden usarse regiones específicas de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de GPCR-B4 para identificar variantes polimorfas, homólogos entre especies y alelos de GPCR-B4. Esta identificación puede realizarse in vitro, por ejemplo, en condiciones de hibridación restringidas o PCR (utilizando cebadores que codifican las SEQ ID NOS:5-6) y secuenciando o usando la información de las secuencias en un sistema de ordenadores para comparación con otras secuencias de nucleótidos. Típicamente, la identificación de las variantes polimorfas y los alelos de GPCR-B4 se realiza comparando una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 25 aminoácidos o más, por ejemplo, 50-100aminoácidos.Una identidad de aminoácidos de aproximadamente al menos 70% o superior, opcionalmente 80% o 90-95% o superior, demuestra típicamente que una proteína es una variante polimorfa, un homólogo entre especies o un alelo de GPCR-B4. La comparación de secuencias puede realizarse usando cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias descritos a continuación. También pueden usarse anticuerpos que se unen específicamente a GPCR-B4 o a una de sus regiones conservadas para identificar alelos, homólogos entre especies y variantes polimorfas.

Las variantes polimorfas, los homólogos entre especies y los alelos de GPCR-B4 se confirman examinando la expresión específica en células gustativas del supuesto polipéptido de GPCR-B4. Típicamente, el GPCR-B4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1-2 o 7 se usa como control positivo en comparación con la supuesta proteína de GPCR-B4 para demostrar la identificación de una variante polimorfa o alelo de GPCR-B4. Se espera que las variantes polimorfas, los alelos y los homólogos entre especies retengan la estructura de siete regiones transmembránicas de un receptor acoplados a proteínas G.

La información de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de GPCR-B4 puede utilizarse también para construir modelos de polipéptidos específicos de células gustativas en un sistema de ordenadores. Estos modelos se usan posteriormente para identificar compuestos que pueden activar o inhibir GPCR-B4. Dichos compuestos que modulan la actividad de GPCR-B4 pueden usarse para investigar el papel de GPCR-B4 en la transducción del gusto.

El aislamiento de GPCR-B4 por primera vez proporciona un medio para valorar inhibidores y activadores de la transducción del gusto por el receptor acoplado a proteínas G. El GPCR-B4 biológicamente activo es útil para analizar inhibidores y activadores de GPCR-B4 como transductores del gusto usando expresión in vivo e in vitro que mida, por ejemplo, la activación transcripcional de GPCR-B4; la unión a ligandos; la fosforilación y desfosforilación; la unión a proteínas G; la activación de proteínas G; la unión a moléculas reguladoras; los cambios de voltaje, de potencial de membranas y de conductancia; el flujo iónico; los segundos mensajeros intracelulares, tales como cAMP y trifosfato de inositol; los niveles intracelulares de calcio; y la liberación del neurotransmisor. Dichos activadores e inhibidores identificados usando GPCR-B4, pueden utilizarse para nuevos estudios sobre la transducción del gusto y para identificar agonistas y antagonistas gustativos específicos. Dichos activadores e inhibidores son útiles como agentes farmacéuticos y alimentarios para personalizar sabores.

Los métodos para detectar ácido nucleicos de GPCR-B4 y la expresión de GPCR-B4 son también útiles para identificar las células gustativas y crear mapas topológicos de la lengua y la relación de las células receptoras del gusto de la lengua con las neuronas sensoriales del gusto en el cerebro. Puede utilizarse la localización en cromosomas de los genes que codifican GPCR-B4 humano para identificar enfermedades, mutaciones y rasgos causados por GPCR-B4 y asociados a él.

II. Definiciones

Como se usa en la presente memoria, salvo indicación contraria, los siguientes términos y expresiones tienen los siguientes significados atribuidos a ellos.

"Células receptoras del gusto" son células neuroepiteliales que están organizadas en grupos formando los botones gustativos de la lengua, por ejemplo, células foliares, fungiformes y circunvalares (véase, por ejemplo, Roper et al., Ann. Rev. Neurosci. 12:329-353 (1989)).

"GPCR-B4", también llamado "TR2", se refiere a un receptor acoplado a proteínas G que se expresa específicamente en células receptoras del gusto, tales como células foliares, fungiformes y circunvalares (véase, por ejemplo, Hoon et al., Cell 96:541-551 (1999). Dichas células gustativas pueden identificarse debido a que expresan moléculas específicas, tales como Gustducina, una proteína G específica de las células gustativas (McLaughin et al., Nature 357:563-569 (1992)). Las células receptoras del gusto pueden también identificarse basándose en su morfología (véase, por ejemplo, Roper, supra). El GPCR-B4 tiene la capacidad de actuar como receptor para la transducción del gusto, como se describe en el Ejemplo II.

El GPCR-B4 codifica los GPCR con siete regiones transmembránicas que tienen "actividad del receptor acoplado a proteínas G", por ejemplo, se unen a proteínas G en respuesta a estímulos extracelulares y promueven la producción de segundos mensajeros, tales como IP3, cAMP y Ca^{2+} por estimulación de enzimas, tales como fosfolipasa C y adenilato-ciclasa (para la descripción de la estructura y función de los GPCR, véase, por ejemplo, Fong, supra, y Baldwin, supra).

El término GPCR-B4 se refiere por consiguiente a variantes polimorfas, alelos, mutantes y homólogos entre especies que: (1) presentan una identidad de secuencias de aminoácidos de aproximadamente70%, opcionalmente una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 75, 80, 85, 90 o 95% con la SEQ ID NO:1; (2) se unen a anticuerpos producidos contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1; (3) se hibridan específicamente en condiciones de hibridación restringidas a una secuencia de SEQ ID NO:3; o(4) son amplificados por cebadores que se hibridan específicamente en condiciones de hibridación restringidas a la misma secuencia como un conjunto de cebadores degenerados que codifican SEQ ID NOS:5-6.

Topológicamente, los GPCR sensoriales tienen una "dominio extracelular" en el extremo N, un "dominio transmembránico" que comprende siete regiones transmembránicas y bucles citoplásmicos y extracelulares correspondientes, y un "dominio citoplásmico" en el extremo C (véase, por ejemplo, Hoon et al., Cell 96:541-551 (1999); Buck & Axel, Cell 65:175-187 (1991)). Estos dominios pueden ser identificados estructuralmente usando métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como programas de análisis de secuencias que identifican dominios hidrófobos e hidrófilos (véase, por ejemplo, Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)). Dichos dominios son útiles para preparar proteínas quiméricas y para valoraciones in vitro.

"Dominio extracelular" se refiere por consiguiente al dominio de GPCR-B4 que sobresale de la membrana celular y se une al ligando extracelular. Esta región comienza en el extremo N y termina aproximadamente en el ácido glutámico conservado en la posición del aminoácido 563 más o menos aproximadamente 20 aminoácidos. La región correspondiente a los aminoácidos 1-580 de la SEQ ID NO:1 (nucleótidos 1-1740, comenzando el nucleótido en el codón ATG metionina/iniciador) es una realización de un dominio extracelular que se extiende ligeramente en el dominio transmembránico. Esta realización es útil para las valoraciones de unión a ligandos in vitro, tanto en fase soluble como sólida.

"Dominio transmembránico", que comprende siete regiones transmembránicas más los bucles citoplásmico y extracelular correspondientes, se refiere al dominio de GPCR-B4 que comienza aproximadamente en el residuo de ácido glutámico conservado en la posición del aminoácido 563 más o menos aproximadamente 20 aminoácidos y termina aproximadamente en el residuo de aminoácido tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos.

"Dominio citoplásmico" se refiere al dominio de GPCR-B4 que comienza en el residuo de aminoácido tirosina conservado en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos y continúa hasta el extremo C del polipéptido.

"Muestra biológica" como se usa en la presente memoria es una muestra de tejido o fluido biológico que contiene GPCR-B4 o ácido nucleico que codifica la proteína GPCR-B4. Dichas muestras incluyen, aunque sin estar limitadas a ellas, tejido aislado de seres humanos, ratones y ratas, en particular de la lengua. Las muestras biológicas pueden incluir también secciones de tejidos, tales como secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Una muestra biológica se obtiene típicamente a partir de un organismo eucariota, tales como insectos, protozoos, aves, peces, reptiles y preferiblemente un mamífero tal como rata, ratón vaca, perro, cobaya o conejo y más preferiblemente un primate tal como chimpancés o seres humanos. Los tejidos incluyen tejidos de la lengua, botones gustativos aislados y tejidos testiculares.

"Actividad de GPCR" se refiere a la capacidad de un GPCR para transducir una señal. Dicha actividad puede medirse en una célula heteróloga, acoplando un GPCR (o un GPCR quimérico) a una proteína G o a una proteína G promiscua, tal como G\alpha15, y una enzima, tal como PLC, y medir el aumento de calcio intracelular usando el método de Offermans & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995). Laactividad del receptor puede medirse eficazmente registrando los cambios inducidos por el ligando en [Ca^{2+}]_{i} usando colorantes fluorescentes indicadores de Ca^{2+} y formación fluorométrica de imágenes. Opcionalmente, los polipéptidos de la invención están implicados en la transducción sensorial, opcionalmente en la transducción del gusto en células gustativas.

La frase "efectos funcionales" en el contexto de las valoraciones para analizar compuestos que modulan la transducción del gusto mediada por GPCR-B4 incluye la determinación de cualquier parámetro que esté indirecta o directamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Incluye la unión a ligandos, los cambios en el flujo iónico, el potencial de la membrana, el flujo de corriente, la transcripción, la unión a proteínas G, la fosforilación o desfosforilación de GPCR, la transducción de la señal, las interacciones receptor-ligando, las concentraciones del segundo mensajero (por ejemplo, cAMP, IP3, o Ca^{2+} intracelular), in vitro, in vivo y ex vivo e incluye también otros efectos fisiológicos, tales como aumentos o disminuciones de la liberación de neurotransmisores u hormonas.

Por "determinación del efecto funcional" se entiende valoraciones para un compuesto que aumenta o disminuye un parámetro que está indirecta o directamente bajo la influencia de GPCR-B4, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Dichos efectos funcionales pueden medirse por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas, o propiedades de solubilidad, pinzamiento zonal de membrana, colorantes sensibles al voltaje, corrientes de células completas, eflujo de radioisótopos, marcadores inducibles, expresión de GPCR-B4 en oocitos; expresión de GPCR-B4 en células de cultivo de tejidos; activación transcripcional de GPCR-B4; valoraciones de unión a ligandos; cambios de voltaje, potencial de la membrana y conductancia; valoraciones del flujo iónico; cambios en los segundos mensajeros intracelulares, tales como cAMP y trifosfato de inositol (IP3); cambios en los niveles intracelulares de calcio; liberación de neurotransmisores, y similares.

"Inhibidores", "activadores" y "moduladores" de GPCR-B4 se usan de modo intercambiable con referencia a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas usando valoraciones in vitro e in vivo para la transducción del gusto, por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos y miméticos. Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen, parcial o totalmente, para bloquear la estimulación, disminuir, evitar, activar el retraso, inactivar, desensibilizar o regular descendentemente la transducción del gusto, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen para estimular, aumentar, abrir, activar, facilitar, mejorar la activación, sensibilizar o regular ascendentemente la transducción del gusto, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, por ejemplo, alteraran la interacción de un receptor con: proteínas extracelulares que se unen a activadores o inhibidores (por ejemplo, ebnerina y otros miembros de la familia de soportes hidrófobos); proteínas G; quinasas (por ejemplo, homólogos de rodopsina-quinasa y receptores beta adrenérgicos-quinasa que están implicados en la desactivación y desensibilización de un receptor); y proteínas similares a la arrestina, que también desactivan y desensibilizan receptores. Los moduladores incluyen versiones genéticamente modificadas de GPCR.-B4, por ejemplo, con la actividad alterada, así como ligandos, antagonistas, agonistas y pequeñas moléculas químicas sintéticas y naturales, y similares. Dichas valoraciones para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, expresar GPCR-B4 en células o membranas celulares, aplicar supuestos compuestos moduladores y a continuación determinar los efectos funcionales en la transducción del gusto, como se ha descrito antes. Las muestras o valoraciones que comprenden GPCR-B4 que son tratadas con un activador, inhibidor o modulador potencial se comparan con muestras control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el grado de inhibición. A las muestras control (no tratadas con inhibidores) se les asigna un valor de actividad de GPCR-B4 relativo del 100%. La inhibición de GPCR-B4 se consigue cuando el valor de actividad de GPCR-B4 con relación al control es aproximadamente 80%, opcionalmente 50% o 25-0%. La activación de GPCR-B4 se consigue cuando el valor de la actividad de GPCR-B4 con relación al control es 110%, opcionalmente 150%, opcionalmente 200-500% o superior a
1000-3000%.

GPCR-134 "biológicamente activo" se refiere a GPCR-B4 que tiene la actividad de GPCR que se ha descrito antes, implicado en la transducción del gusto en células receptoras del gusto.

Las expresiones "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refieren a un material que está sustancial o esencialmente exento de componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquidos de alta resolución. Una proteína que es la especie predominante en una preparación se purifica sustancialmente. En particular, se separa un ácido nucleico de GPCR-B4 aislado de marcos de lectura abiertos que flanquean el gen de GPCR-B4 y codifican proteínas distintas de GPCR-B4. El término "purificado" significa que un ácido nucleico o proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. Particularmente, se entiende que el ácido nucleico o proteína tiene una pureza de al menos 85%, opcionalmente de al menos 95% y opcionalmente al menos 99%.

"Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma monocatenaria o de doble cadena. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de cadena principal modificados, sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2-O-metil-ribonucleótidos, ácidos péptido-nucleicos (abreviadamente en lo sucesivo PNA por la expresión inglesa peptide-nucleic acid).

Salvo indicación contraria, una secuencia de ácidos nucleicos particular abarca también implícitamente sus variantes modificadas de forma conservadora (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, pueden conseguirse sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) está sustituida por residuos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa de forma intercambiable con gen, cDNA, mRNA, oligonucleótido y polinucleótido.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de modo intercambiable en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es una forma mimética química artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y formas miméticas de aminoácidos que actúan de manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que son modificados posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono \alpha que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina-metil-sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Las formas miméticas de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que actúan de manera similar a un aminoácido natural.

Los aminoácidos pueden denominarse en la presente memoria por sus símbolos de tres letras usualmente conocidos o por símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Igualmente, los nucleótidos, pueden denominarse por sus códigos de una letra usualmente aceptados.

La expresión "variantes modificadas de modo conservador" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, la expresión variantes modificadas de modo conservador se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, hasta secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos codifica cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA,GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Así, en cada posición en la que una alanina viene especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de modo conservador. Cada secuencia de ácidos nucleicos de la presente memoria que codifica un polipéptido describe también cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que generalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que generalmente es el único codón para el triptófano) puede modificarse proporcionando una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos o proteínas que alteran, añadan o supriman un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de modo conservador", en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. En la técnica son muy conocidas tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Dichas variantes modificadas de modo conservador son además, y no excluyen, variantes polimorfas, homólogos entre especies y alelos de la invención.

\newpage

Los siguientes ocho grupos contiene cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre ellos:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparraguina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (1), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Las estructuras macromoleculares, tales como estructuras polipeptídicas, pueden describirse en términos de diversos niveles de organización. Para un estudio general de esta organización, véase, por ejemplo, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3ªed., 1994) y Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). "Estructura primaria" se refiere a la secuencia deaminoácidos de un péptido particular. "Estructura secundaria" se refiere a estructuras tridimensionales ordenadas localmente dentro de un polipéptido. Estas estructuras se conocen generalmente como dominios. Los dominios son porciones de un polipéptido que forma una unidad compacta del polipéptido y típicamente tienen una longitud de 50 a 350 aminoácidos. Los dominios típicos están formados por secciones de menor organización, tales como tramos de lámina \beta y hélices \alpha. "Estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa de un monómero polipéptidico. "Estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes. Los términos anisótropos se conocen también como términos de energía.

Un "marcador" o un "resto detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, marcadores útiles incluyen ^{32}P,colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usan generalmente en ELISA); biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en el péptido y usarse para detectar anticuerpos reactivos específicamente con el péptido).

Una "sonda de ácidos nucleicos u oligonucleótidos marcados" es la que está unida, covalentemente o por medio de un enlazador o un enlace químico, o no covalentemente, por medio de enlaces iónicos, de van der Waals, electrostáticos o de hidrógeno a un marcador, tal que la presencia de la sonda pueda ser detectada al detectar la presencia del marcador unidos a la sonda.

Como se usa en la presente memoria una "sonda u oligonucleótido de ácidos nucleicos" se define como un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria por medio de uno o más tipos de enlaces químicos, usualmente por apareamiento de bases complementarias, generalmente con la formación de enlaces de hidrógeno. Como se usa en la presente memoria, una sonda puede incluir bases naturales (es decir, A, G, C o T) o modificadas (7-desazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases en una sonda pueden unirse por un enlace distinto de un enlace de fosfodiéster, siempre que no interfiera con la hibridación. Así, por ejemplo, las sondas pueden ser ácidos nucleicos peptídicos en los que las bases constituyentes están unidas por enlaces peptídicos en lugar de por enlaces de fosfodiéster. Los expertos en la técnica entenderán que las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de la complementariedad completa dependiendo la secuencia de la sonda de la restricción de las condiciones de hibridación. Las sondas están marcadas directamente con isótopos, cromóforos, lumíforos, cromógenos o indirectamente con biotina a la que puede unirse más tarde un complejo de estreptavidina. Valorando la presencia o ausencia de la sonda, puede detectarse la presencia o ausencia de la secuencia o subsecuencia seleccionada.

El término "recombinante" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleicoo proteína natural o porque la célula procede de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma natural (no recombinante) de la célula o expresan genes naturales que se expresan anormalmente de otro modo, se sub-expresan o no se expresan en absoluto.

El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más sub-secuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para formar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificadora de otra fuente. Igualmente, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más sub-secuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

Un "promotor" se define como una disposición de secuencias de control de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en la presente memoria, un promotor incluye secuencias necesarias de ácidos nucleicos próximas al sitio de iniciación de la transcripción, tal como, en el caso de un promotor tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos mejoradores o represores distales, que pueden estar situados varios miles de pares de bases desde el sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental y de desarrollo. La expresión "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia control de expresión de ácidos nucleicos (tal como un promotor, o disposición de sitios de unión al factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, en el que la secuencia control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Un "vector de expresión" es una construcción de ácidos nucleicos, generada recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos específicos de ácidos nucleicos que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedante. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico que ha de ser trascrito operativamente unido a un promotor.

El término "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o sub-secuencias iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos iguales (es decir, identidad de 70%, opcionalmente identidad de 75%, 80%, 85%, 90% o 95% con una región especificada), cuando se comparan o alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región señalada, tal como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineamiento manual e inspección visual. Se dice entonces que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición se refiere también al cumplimiento de una secuencia de ensayo. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos, o más preferiblemente en una región que tiene una longitud de 75-100 aminoácidos o nucleótidos.

Para comparación de las secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de las sub-secuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de las secuencias. Pueden usarse parámetros del programa por defecto o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula a continuación el porcentaje de identidades de las secuencias para las secuencias de ensayo en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de uno cualquiera de los números en posiciones contiguas seleccionados del grupo que consiste en 20 a 600, generalmente alrededor de 50 a alrededor de 200, más generalmente alrededor de 100 a alrededor de 150 en el que puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después que las dos secuencias son alineadas óptimamente. Los métodos de alineamiento de secuencias para su comparación son muy conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para su comparación puede realizarse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homologías deNeedleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda de un método de semejanza de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por aplicaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o por alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. suplemento 1995)).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento múltiple de secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos por pares para mostrar la relación y porcentaje de la identidad de secuencias. También representa gráficamente un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupaciones usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una con una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación se alinea a continuación con la siguiente secuencia más relacionada o agrupación de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias se alinean por una simple extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se consigue por una serie de alineamientos progresivo por pares. El programa se realiza designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencia y designando los parámetros del programa. Usando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencias usando los siguientes parámetros: ponderación de los huecos por defecto (3.00), ponderación de la longitud de los huecos por defecto (0.10) y huecos finales ponderados. PILEUP puede obtenerse con un paquete de programas informáticos de análisis de secuencias GCG, por ejemplo, versión 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395(1984).

Otro ejemplo de algoritmo adecuado para determinar el porcentaje de identidad de las secuencias y la semejanza de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que han sido descritos por Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (en los sucesivo HSP, del inglés High Scoring Sequence Pairs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia dudosa, que coincide o satisface alguna puntuación umbral valorada positivamente T cuando se alinea una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se define como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., supra). Estos impactos de palabras (word hits) vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar las búsqueda para encontrar HSP mayores que los contengan. Los impactos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia siempre y cuando pueda aumentarse la puntuación acumulativa de alineamiento. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los impactos de palabras en cada dirección se detiene cuando: disminuye la puntuación acumulativa de alineamiento en una cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa llega a cero o inferior, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se consigue el final de cada secuencia. Los parámetros W, T y X de los algoritmos BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabras (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabras de 3, una expectativa (E) de 10 y los alineamiento (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1.989))de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza también un análisis estadístico de la semejanza entre dos secuencias (véase, por ejemplo., Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la semejanza proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que ocurra por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleicose considera semejante a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01, y más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene una reacción cruzada inmunológicamente reactiva con el anticuerpos producido contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Así, un polipéptido típicamente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones restringidas, como se describe a continuación. Todavía otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que pueden usarse los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

La frase "se hibrida selectivamente (o específicamente) a" se refiere a la unión, formación de dúplex o hibridación solamente de una molécula a una secuencia de nucleótidos particular en condiciones de hibridación restringidas cuando la secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, DNA o RNA celular o de genoteca total).

La frase "condiciones de hibridación restringidas" se refiere a condiciones en las que una sonda se hibridaría a su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no hasta otras secuencias. Las condiciones restringidas dependen de las secuencias y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a mayores temperaturas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays'' (1993). En general, las condiciones restringidas se seleccionan de forma que sean aproximadamente 5-10ºC inferiores a la temperatura de fusión térmica (T_{m}) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. T_{m} es la temperatura (a fuerza iónica, pH y concentración de ácidos nucleicos definidos) a la que hibrida el 50% de las sondas complementarias a la diana hasta la secuencia diana en equilibrio (puesto que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Condiciones restringidas serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente ion sodio 1,0 M, típicamente alrededor de una concentración de ion sodio de 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, superior a 50 nucleótidos). Condiciones restringidas pueden también conseguirse con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. Por hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos el doble de la hibridación fundamental, opcionalmente 10 veces la hibridación fundamental. Las condiciones de hibridación restringidas ilustrativas pueden ser las siguientes: formamida al 50%, 5 x SSC y SDS al 1%, incubación a 42ºC, o, 5 x SSC, SDS al 1%, incubación a 65ºC, con lavado en 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC.

Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones restringidas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración máxima de codones permitida por el código genético. En dichos casos, los ácidos nucleicos se hibridan típicamente en condiciones de hibridación moderadamente restringidas. Las "condiciones de hibridación moderadamente restringidas" ilustrativas incluyen una hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCI 1M, SDS al 1% a 37ºC y un lavado una vez en SSC a 45ºC. Una hibridación positiva es al menos el doble de la hibridación fundamental. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones alternativas de hibridación y lavado para proporcionar condiciones de restricción similares.

"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región marco de un gen de inmunoglobulina o sus fragmentos que se une específicamente y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes de las inmunoglobulinas kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la multitud de genes de las regiones variables de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se denominan kappa o lambda. Las cadenas pesadas se denominan gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ilustrativa comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. Las expresiones cadena ligera variable (V_{L}) y cadena pesada variable (V_{H}) se refieren a las cadenas ligeras y pesadas respectivamente.

Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión (hidrólisis) con diversas peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina hidroliza un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra produciendo F(ab)'_{2}, un dímero de Fab que en si mismo es una cadena ligera unida a V_{H}-C_{H}1 por un enlace disulfuro. El F(ab)'_{2} puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo con ello el dímero F(ab)'_{2} en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra (véase, Fundamental Immunology (Paul ed., 3ª ed. 1993). Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, los expertos en la técnica apreciaran que dichos fragmentos pueden sintetizarse de novo químicamente o utilizando metodología de DNA recombinante. Así, el término anticuerpo, como se usa en la presente memoria, incluye también fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo usando metodología de DNA recombinante (por ejemplo, Fv monocatenario) o los identificados usando genotecas de presentación de fagos (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).

Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, puede usarse cualquier técnica conocida (véase, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983);Cole et al., pp. 77-96en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)).Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (Patente de EE.UU. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos para los polipéptidos de esta invención. También pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos, tales como mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente, puede usarse tecnología de presentación de fagos para identificar anticuerpos y fragmentos de Fab heterómeros que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)).

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una de sus porciones, está alterada, sustituida o intercambiada de modo que el sitio de unión al antígeno (región variable) está unido a una región constante de una función y/o especie efectora de clase diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor del crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una de sus porciones, está alterada, sustituida o intercambiada por una región variable que tiene una especificidad antígena diferente o alterada.

Un anticuerpo "anti-GPCR-B4" es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido codificado por el gen de GPCR-B4, cDNA, o una de sus sub-secuencias.

El término "inmunoensayo" es un ensayo que usa un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de unión específicas de un anticuerpo particular para aislar, dirigir y/o cuantificar el antígeno.

La frase "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con", con referencia a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heteróloga de proteínas y otras sustancias biológicas. Así, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular al menos el doble que la señal fundamental y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en dichas condiciones puede requerir que se seleccione un anticuerpo por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos policlonales producidos para GPCR-B4 de especies específicas, tales como rata, ratón o seres humanos, para obtener sólo los anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos con GPCR-B4 y no con otras proteínas, excepto para variantes polimorfas y alelos de GPCR-B4. Esta selección puede conseguirse retirando anticuerpos que tienen reacción cruzada con moléculas de GPCR-B4 de otras especies. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayos para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se usan habitualmente para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayos que pueden usarse para determinar una inmunorreactividad específica). Típicamente, una reacción específica o selectiva será al menos el doble que una señal fundamental o ruido y más típicamente más de 10 a 100 veces dicha señal.

La frase "selectivamente asociado con" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para "hibridarse selectivamente" con otro como se ha definido antes, o la capacidad de un anticuerpo para "unirse selectiva (o específicamente)" a una proteína, como se ha definido antes.

Por "célula hospedante" se entiende una célula que contiene un vector de expresión y soporta la replicación o expresión del vector de expresión. Las células hospedantes pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levadura, insectos, anfibios o mamíferos, tales como CHO, HeLa y similares, por ejemplo, células cultivadas, explantes y células in vivo.

III. Aislamiento del ácido nucleico que codifica GPCR-B4 A. Métodos generales de DNA recombinante

Esta invención se refiere a técnicas habituales en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).

En el caso de los ácidos nucleicos, los tamaños se expresan en kilobases (kb) o pares de bases (pb). Estos valores se estiman por electroforesis en gel de agarosa o de acrilamida, de ácidos nucleicos secuenciados, o de secuencias de DNA publicadas. En el caso de proteínas, los tamaños se expresan en kilodaltones (kDa) o número de residuos de aminoácidos. Los tamaños de las proteínas se estiman por electroforesis en gel, de proteínas secuenciadas, de secuencias de aminoácidos derivados, o de secuencias de proteínas publicadas.

Los oligonucleótidos que no está disponibles comercialmente pueden sintetizarse químicamente de acuerdo con el método del triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado, como ha sido descrito por Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168(1984). La purificación de los oligonucleótidos se realiza por electroforesis en gel de acrilamida o por HPLC de intercambio aniónico como se ha descrito por Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983).

La secuencia de los genes clonados y de los oligonucleótidos sintéticos puede verificarse después de la clonación usando, por ejemplo, el método de terminación de la cadena para la secuenciación de moldes de doble cadena de Wallace et al., Gene 16:21-26 (1981).

B. Métodos de clonación para el aislamiento de secuencias de nucleótidos que codifican GPCR-B4

En general, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican GPCR-B4 y los homólogos de secuencias de ácidos nucleicos afines son clonados de genotecas de cDNA y DNA genómicos por hibridación con una sonda, o aislados usando técnicas de amplificación con cebadores oligonucleotídicos. Por ejemplo, las secuencias de GPCR-B4 se aíslan típicamente de genotecas de ácidos nucleicos (genómicos o cDNA) de mamíferos por hibridación con una sonda de ácido nucleico, cuya secuencia puede proceder de SEQ IDNO:3. Un tejido adecuado del que pueden aislarse el RNA y el cDNA de GPCR-B4 es el tejido de la lengua, opcionalmente los tejidos de los brotes gustativos o de las células gustativas individuales.

Para amplificar y aislar DNA o RNA de GPCR-B4 pueden también usarse técnicas de amplificación que usan cebadores. También pueden usarse los cebadores degenerados que codifican las siguientes secuencias de aminoácido para amplificar una secuencia de GPCR-B4: SEQ ID NOS:5-6 (véase, por ejemplo, Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual (1995)). Estos cebadores pueden usarse, por ejemplo, para amplificar la longitud completa de la secuencia o una sonda de uno a varios cientos de nucleótidos, que se usan a continuación para escrutar una genoteca de mamíferos para la longitud completa de GPCR-B4.

Los ácidos nucleicos que codifican GPCR-B4 también pueden aislarse de las genotecas de expresión usando anticuerpos como sondas. Dichos anticuerpos policlonales o monoclonales pueden producirse usando la secuencia de SEQ ID NO:1.

Las variantes polimorfas, alelos y homólogos entre especies de GPCR-B4 que son sustancialmente idénticas a GPCR-B4 pueden aislarse usando sondas de ácidos nucleicos de GPCR-B4, y oligonucleótidos en condiciones de hibridación restringidas, escrutando genotecas. Alternativamente, las genotecas de expresión pueden usarse para clonar GPCR-B4 y variantes polimorfas, alelos y homólogos entre especies de GPCRB4, detectando los homólogos expresados inmunológicamente con antisueros o anticuerpos purificados producidos contra GPCR-B4, que también reconocen y se unen selectivamente al homólogo de GPCR-B4.

Para preparar una genoteca de cDNA, debe elegirse una fuente que sea rica en mRNA de GPCR-B4, por ejemplo, tejido de lengua o botones gustativos aislados. A continuación se transforma mRNA en cDNA usando transcriptasa inversa, se liga a un vector recombinante y se transfecta a un hospedante recombinante para su propagación, escrutinio y clonación. Los métodos para preparar y escrutar genotecas de cDNA son muy conocidos (véase, por ejemplo, Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra).

Para una genoteca genómica, se extrae el DNA del tejido y se cizalla mecánicamente o se hidroliza enzimáticamente proporcionando fragmentos de aproximadamente 12-20 kb. A continuación se separan los fragmentos por centrifugación en gradiente de los tamaños deseados y se construyen (insertan) en vectores bacteriófagos lambda. Estos vectores y fagos se empaquetan in vitro. Los fagos recombinantes se analizan por hibridación en placa como han descrito Benton & Davis, Science 196:180-182 (1977). La hibridación de colonias se efectúa como han descrito en general Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72:3961-3965 (1975).

Un método alternativo para aislar ácido nucleico de GPCR-B4 y sus homólogos combina el uso de cebadores oligonucleotídicos sintéticos y la amplificación de un molde de RNA o DNA (véase, las Patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (lnnis et al., eds, 1990)). Pueden usarse métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) para amplificar secuencias de ácidos nucleicos de GPCR-B4 directamente a partir de genotecas de mRNA, de cDNA, genómicas o genotecas de cDNA. Pueden diseñarse oligonucleótidos degenerados para amplificar homólogos de GPCR-B4 usando las secuencias proporcionadas en la presente memoria. En los cebadores pueden incorporarse sitios de endonucleasas de restricción. También pueden ser útiles la reacción en cadena de la polimerasa u otros métodos de amplificación in vitro, por ejemplo, para clonar secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas que se van a expresar, para preparar ácidos nucleicos para usar como sondas en la detección de la presencia de mRNA que codifica GPCR-B4 en muestras fisiológicas, para la secuenciación de ácidos nucleicos o para otros fines. Los genes amplificados por la reacción PCR pueden purificarse en geles de agarosa y clonarse en un vector apropiado.

La expresión del gen de GPCR-B4 también puede analizarse por técnicas conocidas, por ejemplo, transcripción inversa y amplificación de mRNA, aislamiento de RNA total o poli A^{+} RNA, transferencia Northern, transferencia de puntos, hibridación in situ, protección con RNasa, disposiciones en microchip de DNA para sondeo y similares. En una realización, se usa la tecnología de análisis de oligonucleótidos de alta densidad (por ejemplo, GeneChip^{TM}) para identificar homólogos y variantes polimorfas de los GPCR de la invención. En el caso en el que los homólogos identificados estén relacionados con una enfermedad conocida, pueden usarse con GeneChip^{TM} como herramienta de diagnóstico para detectar la enfermedad en una muestra biológica, véase, por ejemplo, Gunthand et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 869-876 (1998); Kozal et al., Nat. Med. 2:753-759 (1996); Matson et al., Anal. Biochem. 224:110-106 (1995); Lockhart et al., Nat. Biotechnol. 14:1675-1680 (1996); Gingeras et al., Genome Res. 8:435-448 (1998); Hacia et al., Nucleic Acids Res. 26:3865-3866 (1998).

Pueden usarse oligonucleótidos sintéticos para construir genes de GPCR-B4 recombinantes para usar como sondas o para la expresión de proteínas.Este método se realiza usando una serie de oligonucleótidos solapantes con una longitud generalmente de 40-120 pb, que representan tanto las cadenas con sentido como sin sentido del gen. Estos fragmentos de DNA se reasocian a continuación, se ligan y se clonan. Alternativamente, pueden usarse técnicas de amplificación con cebadores precisos para amplificar una subsecuencia específica del ácido nucleico de GPCR-B4. A continuación se liga la subsecuencia específica a un vector de expresión.

El ácido nucleico que codifica GPCR-B4 se clona típicamente en vectores intermedios antes de la transformación en células procariotas o eucariotas para su replicación y/o expresión. Estos vectores intermedios son típicamente vectores procariotas, por ejemplo, plásmidos o vectores lanzadera.

Opcionalmente, los ácidos nucleicos que codifican proteínas quiméricas que comprenden GPCRB4 o sus dominios pueden prepararse de acuerdo con técnicas estándares. Por ejemplo, un dominio tal como un dominio de unión a ligandos, un dominio extracelular, un dominio transmembránico (por ejemplo, uno que comprende siete regiones transmembránicas y bucles extracelulares y citosólicos correspondientes), el dominio transmembránico y un dominio citoplásmico, un sitio activo, una región de asociación de subunidades, etc., pueden unirse covalentemente a una proteína heteróloga. Por ejemplo, un dominio extracelular puede unirse a un dominio transmembránico de GPCR heterólogo, o un dominio extracelular de GPCR heterólogo puede unirse a un dominio transmembránico. Otras proteínas heterólogas alternativas incluyen, por ejemplo, proteína de fluorescencia verde, \beta-gal, receptor de glutamato y la pre-secuencia de rodopsina.

C. Expresión en células procariotas y eucariotas

Para obtener una expresión de alto nivel de un gen o ácido nucleico clonado, tales como los cDNA que codifican GPCR-B4, se sub-clona típicamente GPCR-B4 en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción y en el caso de un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión a ribosomas para la iniciación de la traducción. Los promotores bacterianos adecuados son muy conocidos en la técnica y han sido descritos por Sambrook et al. y Ausubel et al. Los sistemas de expresión bacteriana para expresar la proteína GPCR-B4 están disponibles en, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545(1983). Los kits para dichos sistemas de expresión están disponibles comercialmente. Los sistemas de expresión eucariotas para células de mamíferos, levaduras y células de insectos son muy conocidos en la técnica y también están disponibles comercialmente. En una realización, el vector de expresión eucariota es un vector adenoviral, un vector adeno-asociado o un vector
retroviral.

El promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular. El promotor se coloca opcional y aproximadamente a la misma distancia del sitio de iniciación de la transcripción heteróloga que desde el sitio de iniciación de la transcripción en su posición natural. Sin embargo, como se sabe en la técnica, puede realizarse alguna variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora.

Además del promotor, el vector de expresión contiene típicamente una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del ácido nucleico que codifica GPCR-B4 en células hospedantes. Un casete de expresión típico contiene por tanto un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica GPCR-B4 y las señales requeridas para la poliadenilación eficaz de los sitios de unión a ribosomas transcritos y la terminación de la traducción. La secuencia de ácido nucleico que codifica GPCR-B4 puede ser unida típicamente a una secuencia peptídica de señal escindible para promover la secreción de la proteína codificada por la célula transformada. Dichos péptidos señal incluirían, entre otros, los péptidos señal de activador plasminógeno tisular, insulina y factor del crecimiento neuronal y la esterasa de la hormona juvenil de Heliothis virescens. Más elementos del casete pueden incluir mejoradores y, si se usa DNA genómico como gen estructural, intrones con sitios donadores y aceptores para empalme funcional.

Además de la secuencia promotora, el casete de expresión debe contener también una región de terminación de la transcripción situada en la región que se extiende hacia el extremo 3' (donwstream) del gen estructural para proporcionar una terminación eficiente. La región de terminación puede obtenerse a partir del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse a partir de diferentes genes.

El vector de expresión particular usado para transportar la información genética a la célula no es particularmente crítico. Puede usarse cualquiera de los vectores convencionales usados en la expresión en células eucariotas o procariotas. Los vectores de expresión bacteriana típicos incluyen plásmidos, tales como plásmidos basados en pBR322, pSKF, pET23D, y sistemas de expresión con fusión, tales como GST y LacZ. También pueden añadirse a las proteínas recombinantes marcadores epitópicos para proporcionar métodos convenientes de aislamiento, por
ejemplo, c-myc.

Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas se usan típicamente en vectores de expresión eucariotas, por ejemplo, vectores SV40, vectores del virus del papiloma y vectores procedentes del virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucariotas ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A^{+}, pMTO10/A^{+}, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV40, el promotor tardío de SV40, el promotor de metalotioneína, el promotor del virus de tumores mamarios de múridos, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor de polihedrina u otros promotores eficaces para la expresión en células eucariotas.

Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan la amplificación de genes, tales como timidina-quinasa, higromicina B-fosfotransferasa y dihidrofolato-reductasa. Alternativamente, también son adecuados los sistemas de expresión de alto rendimiento que no implican la amplificación de genes, tales como los que utilizan un vector de baculovirus en células de insectos, con una secuencia que codifica GPCR-B4 bajo la dirección del promotor de polihedrina u otros promotores fuertes de baculovirus.

Los elementos que están incluidos típicamente en los vectores de expresión constan también de un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica resistencia a antibióticos para permitir la selección de bacterias que alojan plásmidos recombinantes y sitios de restricción únicos en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias eucariotas. El gen particular de resistencia a antibióticos elegido no es crítico, son adecuados cualquiera de los muchos genes conocidos en la técnica. Las secuencias de procariotas se eligen opcionalmente de tal modo que no interfieran con la replicación del DNA en células eucariotas, si es necesario.

Se aplican métodos de transfección típicos para producir líneas celulares bacterianas, de mamíferos, de levadura o de insectos que expresan grandes cantidades de proteína GPCR-B4, que se purifican a continuación usando técnicas estándares (véase, por ejemplo, Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622(1989); Guide to Protein Purification, en Methods in Enzymology, vol. 182(Deutscher, ed., 1990)). La transformación de células eucariotas y procariotas se efectúa de acuerdo con técnicas estándar (véase, por ejemplo, Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983).

Puede usarse cualquiera de los procedimientos muy conocidos para introducir secuencias de nucleótidos extrañas en células hospedantes. Dichas técnicas incluyen el uso de transfección con fosfato cálcico, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, liposomas, microinyección, vectores plasmáticos, vectores virales y cualquiera de los otros métodos bien conocidos para introducir DNA genómico clonado, cDNA, DNA sintético u otro material genético extraño en una célula hospedante (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Sólo es necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular usado sea capaz de introducir con éxito al menos un gen en la célula hospedante capaz de expresar GPCR-B4.

Después que se introduce el vector de expresión en las células, las células transfectadas se cultivan en condiciones que favorezcan la expresión de GPCR-B4, que se recupera del cultivo por técnicas estándar identificadas a continuación.

IV. Purificación de GPCR-B4

El GPCR-B4 natural o recombinante puede purificarse para su utilización en valoraciones funcionales. Opcionalmente, se purifica el GPCR-B4 recombinante. El GPCR-B4 natural se purifica, por ejemplo, a partir de tejido de mamíferos, tal como tejido de la lengua, y cualquier otra fuente de un homólogo de GPCR-B4. El GPCR-B4 recombinante se purifica a partir de cualquier sistema de expresión bacteriano o eucariota adecuado, por ejemplo, células CHO o células de insectos.

El GPCR-B4 puede purificarse hasta una pureza sustancial por técnicas estándares, que incluyen precipitación selectiva con sustancias tales como sulfato de amonio; cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación y otros (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (1982);Patente de EE.UU. Nº. 4.673.641; Ausubel et al., supra; and Sambrook et al., supra).

Cuando se purifica GPCR-B4 recombinante pueden emplearse varios procedimientos. Por ejemplo, proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular pueden fusionarse reversiblemente con GPCR-B4. Con el ligando apropiado, el GPCR-B4 puede ser adsorbido selectivamente por una columna de purificación y ser liberado a continuación de la columna en una forma relativamente pura. A continuación se separa la proteína fusionada por actividad enzimática. Por último podría purificarse GPCR-B4 usando columnas de inmunoafinidad.

A. Purificación de GPCR-B4 procedente de células recombinantes

Las proteínas recombinantes son expresadas por células bacterianas o eucariotas, tales como células CHO o células de insectos, en grandes cantidades, típicamente después de inducción por un promotor; pero la expresión puede ser constitutiva. La inducción por un promotor con IPTG es un ejemplo de un sistema inducible por un promotor. Las células se cultivan de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica. Las células tal cual o congeladas se usan para el aislamiento de la proteína.

Las proteínas expresadas en bacterias pueden formar agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Para la purificación de cuerpos de inclusión de GPCR-B4 son adecuados diversos protocolos. Por ejemplo, la purificación de los cuerpos de inclusión implica típicamente extracción, separación y/o purificación de los cuerpos de inclusión por lisado de las células bacterianas, por ejemplo, por incubación en un tampón de TRIS/HCL a pH 7,5 (50 mM), NaCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, DTT 1 mM, ATP 0,1 mM y PMSF 1 mM. La suspensión celular puede someterse a lisis por medio de 2-3 pases por una Prensa Francesa, homogeneizarse con un Polytron (Brinkman Instruments) o tratarse con ultrasonidos en hielo. Para los expertos en la técnica serán evidentes otros métodos alternativos de lisado de bacterias (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra).

Si es necesario, los cuerpos de inclusión se solubilizan y la suspensión celular lisada se centrifuga típicamente para separar la materia insoluble no deseada. Las proteínas que forman los cuerpos de inclusión pueden renaturalizarse por dilución o diálisis con un tampón compatible. Los disolventes adecuados incluyen, aunque sin estar limitados a ellos, urea (de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M), formamida (al menos aproximadamente 80%, base volumen/volumen) e hidrocloruro de guanidina (de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M). Algunos disolventes que son capaces de solubilizar proteínas formadoras de agregados, por ejemplo, SDS (dodecilsulfato de sodio), ácido fórmico al 70%, son inapropiados para usar en este procedimiento debido a la posibilidad de desnaturalización irreversible de las proteínas, además de por una falta de inmunogenicidad y/o actividad. Aunque el hidrocloruro de guanidina y agentes similares son sustancias desnaturalizantes, esta desnaturalización no es irreversible y la renaturalización puede ocurrir por eliminación (por ejemplo, por diálisis) o dilución de la sustancia desnaturalizante, permitiendo de nuevo la formación de la proteína inmunológica y/o biológicamente activa. Los expertos en la técnica conocen otros tampones adecuados. El GPCR-B4 se separa de otras proteínas bacterianas por técnicas de separación estándares, por ejemplo, con resina de Ni-NTA-agarosa.

Alternativamente, es posible purificar GPCR-B4 a partir del periplasma bacteriano. Después de lisis de las bacterias, cuando GPCR-B4 es exportado al periplasma de las bacterias, la fracción periplásmica de las bacterias puede aislarse por choque osmótico en frío además de por otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Para aislar proteínas recombinantes del periplasma, se centrifugan las células bacterianas formando un sedimento. El sedimento se vuelve a poner en suspensión en un tampón que contiene sacarosa al 20%. Para lisar las células, se centrifugan las bacterias y el sedimento se vuelve a poner en suspensión en MgSO_{4} 5 mM enfriado con hielo y se mantienen en un baño de hielo durante aproximadamente 10 minutos. Se centrifuga la suspensión celular y el líquido sobrenadante se decanta y conserva. Las proteínas recombinantes presentes en el líquido sobrenadante pueden separarse de las proteínas hospedantes por técnicas de separación estándares muy conocidas por los expertos.

B. Técnicas de separación de proteínas estándar para la purificación de GPCR-B4 Fraccionamiento por solubilidad

Con frecuencia como una etapa inicial, particularmente si la mezcla proteínica es compleja, un fraccionamiento inicial de sales puede separar muchas de las proteínas de las células hospedantes no deseadas ( o proteínasprocedentes del medio de cultivo celular) de la proteína recombinante de interés. La sal preferida es sulfato de amonio. El sulfato de amonio precipita proteínas reduciendo eficazmente la cantidad de agua en la mezcla proteínica. Entonces precipitan las proteínas en base a su solubilidad. Cuanto más hidrófoba es una proteína, más probablemente precipitará a menores concentraciones de sulfato de amonio. Un protocolo típico incluye añadir sulfato de amonio saturado a una solución de proteínas de modo que la concentración de sulfato de amonio resultante esté entre 20-30%. Esta concentración precipitará las proteínas más hidrófobas. A continuación se desecha el precipitado (salvo que la proteína de interés sea hidrófoba) y se añade al líquido sobrenadante sulfato de amonio hasta una concentración conocida para que precipite la proteína de interés. A continuación se solubiliza el precipitado en el tampón y se elimina el exceso de sal si es necesario, por diálisis o diafiltración. Otros métodos que se basan en la solubilidad de las proteínas, tal como la precipitación en etanol frío, son muy conocidos por los expertos en la técnica y pueden usarse para fraccionar mezclas proteínicas complejas.

Filtración diferencial por tamaños

El peso molecular de GPCR-B4 puede usarse para aislarlo de proteínas de mayor y menos tamaño usando ultrafiltración a través de membranas de diferente tamaño de poros (por ejemplo, membranas Amicon o Millipore). Como primera etapa, se ultrafiltra la mezcla proteínica a través de una membrana con un tamaño de poros que tenga un valor de corte de peso molecular inferior al peso molecular de la proteína de interés. El material retenido en la ultrafiltración se somete a una nueva ultrafiltración a través de una membrana con un valor de corte de peso molecular mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana al filtrado. El filtrado puede ser cromatografiado entonces como se describe a continuación.

Cromatografía en columna

El GPCR-B4 puede separarse también de otras proteínas basándose en su tamaño, carga superficial neta, hidrofobicidad y afinidad por los ligandos. Además, anticuerpos producidos contra las proteínas pueden ser conjugados a matrices en columna e inmunopurificarse las proteínas. Todos estos métodos son muy conocidos en la técnica. Para los expertos en la técnica será evidente que las técnicas cromatográficas pueden realizarse a cualquier escala y utilizar equipos de muchos fabricantes diferentes (por ejemplo, Pharmacia Biotech).

V. Detección inmunológica de GPCR-B4

Además de la detección de genes de GPCR-B4 y la expresión de genes utilizando tecnología de hibridación de ácidos nucleicos, también se puede utilizar inmunoensayos para detectar GPCR-B4, por ejemplo, para identificar las células receptoras del gusto y variantes de GPCR-B4. Los inmunoensayos pueden usarse para analizar cualitativa o cuantitativamente GPCR-B4. Una revisión general de la tecnología aplicable puede encontrarse en Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988).

A. Anticuerpos para GPCR-B4

Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen específicamente con GPCR-B4 son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed. 1986); y Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975). Dichas técnicas incluyen la preparación de anticuerpos por selección de anticuerpos de genotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fago o similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales por inmunización de conejos o ratones (véase, por ejemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546(1989)).

Pueden usarse diversos GPCR-B4 que comprende inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con GPCR-B4. Por ejemplo, se aísla como se ha descrito antes GPCR-B4 recombinante o uno de sus fragmentos antigénicos. La proteína recombinante puede expresarse en células eucariotas o procariotas como se ha descrito antes y purificarse como se ha descrito en general antes. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Alternativamente, puede usarse como inmunógeno una péptido sintético derivado de las secuencias descritas en la presente memoria y conjugado a una proteína portadora. La proteína natural puede usarse también en forma pura o impura. A continuación se inyecta el producto en un animal capaz de producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos monoclonales o policlonales, para uso subsiguiente en inmunoensayos para medir la proteína.

Los métodos de producción de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. Una cepa endogámica de ratón (por ejemplo, ratones BALB/C) o conejos se inmuniza con la proteína usando un adyuvante estándar, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización estándar. La respuesta inmune del animal a la preparación inmunógena es monitorizada tomando muestras de sangre y determinando el título de reactividad a GPCR-B4. Cuando se obtienen títulos de anticuerpos apropiadamente elevados para el inmunógeno, se extrae sangre del animal y se preparan antisueros. Si se desea puede realizarse un fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecer los anticuerpos reactivos a la proteína (véase, Harlow & Lane, supra).

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por diversas técnicas familiares para los expertos en la técnica. En resumen, se inmortalizan células del bazo procedentes de un animal inmunizado con un antígeno deseado, generalmente por fusión con una célula de mieloma (véase, Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976)). Métodos alternativos de inmunización incluyen la transformación con virus de Epstein-Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos muy conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de las células individuales inmortalizadas son escrutadas para la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas para el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células puede mejorarse por diversas técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un hospedante vertebrado. Alternativamente, pueden aislarse secuencias de DNA que codifican un anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos de unión escrutando una genoteca de DNA de linfocitos B humanos de acuerdo con el protocolo general descrito por Huse et al., Science 246:1275-1281(1989).

Los anticuerpos monoclonales y los sueros policlonales se recogen y titulan contra la proteína inmunógena en un inmunoensayo, pro ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Típicamente, se seleccionan antisueros policlonales con un título de 10^{4} o superior y se analiza su reactividad cruzada contra proteínas no-GPCR-B4 o incluso otras proteínas relacionadas procedentes de otros organismos, usando un inmunoensayo de unión competitivo. Los antisueros policlonales específicos y los anticuerpos monoclonales se unirán generalmente con una K_{d} de al menos aproximadamente 0,1 mM, más generalmente al menos alrededor de 1 \muM, opcionalmente al menos alrededor de 0,1 \muM o mejor, y opcionalmente 0,01 \muM o mejor.

Una vez que están disponibles los anticuerpos específicos de GPCR-B4, puede detectarse GPCR-B4 por una variedad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo, véase Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7ª ed. 1991). Por otra parte, los inmunoensayos de la presente invención pueden realizarse en cualquiera de las diversas configuraciones, que son revisadas ampliamente en Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980); y por Harlow & Lane, supra.

B. Ensayos inmunológicos de unión

El GPCR-B4 puede detectarse y/o cuantificarse usando diversos ensayos inmunológicos de unión muy reconocidos (véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoensayos generales, véase también Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37(Asai,ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7ª ed. 1991). Los ensayos inmunológicos de unión (o inmunoensayos) utilizan típicamente un anticuerpo que se une específicamente a una proteína o antígeno elegido (en este caso el GPCR-B4 o sus sub-secuencias antigénicas). El anticuerpo (por ejemplo, anti-GPCR-B4) puede producirse por cualquiera de diversos medios muy conocidos por los expertos en la técnica y descritos anteriormente.

Los inmunoensayos utilizan también con frecuencia un agente marcador para unirse específicamente y marcar el complejo formado por el anticuerpo y el antígeno. El agente marcador puede ser él mismo uno de los restos que comprende el complejo anticuerpo/antígeno. Así, el agente marcador puede ser un polipéptido de GPCR-B4 marcado o un anticuerpo anti-GPCR-B4 marcado. Alternativamente, el agente marcador puede ser un tercer resto, tal como un anticuerpo secundario, que se une específicamente al complejo anticuerpo/GPCR-B4 (un anticuerpo secundario es típicamente específico para los anticuerpos de las especies de las que procede el primer anticuerpo). Pueden usarse también como agente marcador otras proteínas capaces de unirse específicamente a regiones constantes de las inmunoglobulinas, tales como la proteína A o la proteína G. Estas proteínas presentan una fuerte reactividad no-inmunógena con las regiones constantes de la inmunoglobulinas de una variedad de especies (véase, por ejemplo, Kronval et al., J. Immunol. 111:1401-1406 (1973); Akerstrom et al., J. Immunol. 135:2589-2542 (1985)). El agente marcador puede modificarse con un resto detectable, tal como biotina, al que puede unirse específicamente otra molécula, tal como estreptavidina. Una variedad de restos detectables son muy conocidos por los expertos
en la técnica.

En los ensayos, pueden requerirse etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar desde aproximadamente 5 segundos hasta varias horas, opcionalmente desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato de ensayo, el antígeno, el volumen de solución, las concentraciones y similares. Generalmente, los ensayos se realizaran a temperatura ambiente, aunque pueden realizarse en un intervalo de temperaturas, tales como 10ºC a 40ºC.

Formatos de ensayos no competitivos

Los inmunoensayos para detectar GPCR-B4 en muestras pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que se mide directamente la cantidad de antígeno. En un ensayo "sándwich" preferido, por ejemplo, los anticuerpos anti-GPCR-B4 pueden unirse directamente a un sustrato sólido en el que quedan inmovilizados. Estos anticuerpos inmovilizados capturan a continuación el GPCR-B4 presente en la muestra de ensayo. El GPCR-B4 así inmovilizado se une a continuación a un agente marcador, tal como un segundo anticuerpo de GPCR-B4 que lleva un marcador. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede carecer de marcador, pero puede, a su vez, estar unido a un tercer anticuerpo marcado específico de los anticuerpos de las especies de las que procede el segundo anticuerpo. El segundo o tercer anticuerpo está modificado típicamente con un resto detectable, tal como biotina, al que está unida específicamente otra molécula, por ejemplo, estreptavidina, para proporcionar un resto detectable.

Formatos de ensayos competitivos

En los ensayos competitivos, la cantidad de GPCR-B4 presente en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un GPCR-B4 añadido (exógeno) conocido desplazado de un anticuerpo anti-GPCR-B4 por el GPCR-B4 desconocido presente en una muestra. En un ensayo competitivo, se añade a una muestra una cantidad conocida de GPCR-B4 y la muestra se pone a continuación en contacto con un anticuerpo que se une específicamente a GPCR-B4. La cantidad de GPCR-B4 exógeno unido al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de GPCR-B4 presente en la muestra. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo está inmovilizado en un sustrato sólido. La cantidad de GPCR-B4 unida al anticuerpo puede determinarse midiendo la cantidad de GPCR-114 presente en un complejo GPCR B4/anticuerpo o alternativamente midiendo la cantidad de proteína no complejada remanente. La cantidad de GPCR-B4 puede detectarse proporcionando una molécula de GPCR-B4 marcada.

Otro ensayo competitivo preferido es un ensayo de inhibición con haptenos. En este ensayo el GPCR-B4 conocido se inmoviliza en un sustrato sólido. Se añade a la muestra una cantidad conocida de anticuerpo anti-GPCR-B4 y a continuación se pone en contacto la muestra con el GPCR-B4 inmovilizado. La cantidad de anticuerpo anti-GPCR-B4 unida al GPCR-B4 conocido inmovilizado es inversamente proporcional a la cantidad de GPCR-B4 presente en la muestra. De nuevo, puede evaluarse la cantidad de anticuerpo inmovilizado detectando la fracción inmovilizada de anticuerpo o la fracción del anticuerpo que permanece en solución. La detección puede ser directa cuando el anticuerpo está marcado o indirecta por la adición subsiguiente de un resto marcado que se une específicamente al anticuerpo como se ha descrito anteriormente.

Determinaciones por reactividad cruzada

Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva pueden también usarse para determinaciones por reactividad cruzada. Por ejemplo, una proteína codificada al menos parcialmente por SEQ ID NO:1 puede ser inmovilizado en un soporte sólido. Se añaden proteínas (por ejemplo, proteínas GPCR-B4 y homólogos) al ensayo que compiten por la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas añadidas para competir por la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la capacidad de GPCR-B4 codificado por SEQ ID NO:1 para competir consigo mismo. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada de las proteínas anteriores por cálculos estándares. Se seleccionan los antisueros con una reactividad cruzada inferior al 10% con cada una de las proteínas añadidas antes citadas y se mezclan. Los anticuerpos que han reaccionado cruzadamente se separan opcionalmente de la mezcla de antisueros por inmunoabsorción con las proteínas consideradas añadidas, por ejemplo, homólogos poco relacionados.

Los antisueros inmunoabsorbidos y mezclados se usan a continuación en un inmunoensayo de unión competitivo como se ha descrito antes para comparar una segunda proteína, que se cree quizás que es un alelo o variante polimorfa de GPCR-B4, con la proteína inmunógena (es decir, GPCR-B4 de SEQ ID NO:1). Para realizar esta comparación, se analiza cada una de estas dos proteínas en un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida para inhibir el 50% de unión es inferior a 10 veces la cantidad de la proteína codificada por SEQ ID NO:1 que se requiere para inhibir el 50% de unión, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a los anticuerpos policlonales generados para un inmunógeno GPCR-B4.

Otros formatos de ensayo

El análisis de inmunotransferencia Western se usa para detectar y cuantificar la presencia de GPCR-B4 en la muestra. La técnica comprende generalmente separar proteínas de muestra por electroforesis en gel basándose en el peso molecular, transfiriendo las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nilón o un filtro de nilón derivatizado) e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente a GPCR-B4. Los anticuerpos anti-GPCR-B4 se unen específicamente al GPCR-B4 en el soporte sólido. Estos anticuerpos pueden ser marcados directamente o alternativamente pueden ser detectados posteriormente usando anticuerpos marcados (por ejemplo, anticuerpos anti-ratón de oveja marcados) que se unen específicamente a los anticuerpos anti-GPCR-B4.

Otros formatos de ensayo incluyen inmunoensayos con liposomas (abreviadamente LIA, por la expresión inglesa Liposome Immunoassays), que usan liposomas diseñados para unirse a moléculas específicas (por ejemplo, anticuerpos) y liberar reactivos o marcadores encapsulados. A continuación se detectan los productos químicos liberados de acuerdo con técnicas estándares (véase, Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41 (1986)).

Reducción de uniones no específicas

Los expertos en la técnica apreciarán que con frecuencia es deseable minimizar uniones no específicas en los inmunoensayos. Particularmente, cuando el ensayo implica un antígeno o anticuerpo inmovilizado en un sustrato sólido es deseable minimizar la cantidad de uniones no específicas al sustrato. Los medios para reducir dichas uniones no específicas son muy conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente, esta técnica implica revestir el sustrato con una composición proteínica. En particular, se usan ampliamente composiciones proteínicas, tales como albúmina de suero bovino (BSA), leche en polvo desnatada y gelatina, siendo la más preferida la leche en polvo.

Marcadores

El marcador o grupo detectable particular usado en el ensayo no es un aspecto crítico de la invención, siempre que no interfiera significativamente con la unión específica del anticuerpo usado en el ensayo. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Dichos marcadores detectables están muy desarrollados en el campo de los inmunoensayos y, en general, la mayoría de los marcadores útiles en dichos métodos pueden aplicarse en la presente invención. Así, un marcador es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Marcadores útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS^{TM}), colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina y similares), radiomarcadores (por ejemplo, ^{3}H, ^{125}I,S,^{14}C o ^{32}P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otros usados generalmente en un ELISA) y marcadores colorimétricos, tales como oro coloidal o vidrio coloreado o perlas de plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

El marcador puede acoplarse directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con métodos muy conocidos en la técnica. Como se ha indicado antes, puede usarse una amplia variedad de marcadores, dependiendo la elección del marcador de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el compuesto, los requisitos de estabilidad, la instrumentación disponible y las disposiciones para su desecho.

Los marcadores no radiactivos se unen frecuentemente por medios indirectos. Generalmente, una molécula de ligando (por ejemplo, biotina) se une covalentemente a la molécula. A continuación el ligando se une a otra molécula (por ejemplo, estreptavidina), que es inherentemente detectable o se une covalentemente a un sistema de señales, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente o un compuesto quimioluminiscente. Los ligandos y sus dianas pueden usarse en cualquier combinación adecuada con anticuerpos que reconocen GPCR-B4 o anticuerpos secundarios que reconocen anti-GPCR-B4.

Las moléculas también pueden conjugarse directamente a compuestos generadores de señales, por ejemplo, por conjugación con una enzima o fluoróforo. Enzimas de interés como marcadores serán principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas u oxidotasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina y 2,3-dihidroftalazindionas, por ejemplo, luminol. Para una revisión de diversos sistemas productores de señales o marcaje que pueden usarse, véase la Patente de EE.UU. Nº. 4.391.904.

Los medios para detectar marcadores son muy conocidos en la técnica. Así, por ejemplo, cuando el marcador es un marcador radiactivo, los medios para su detección incluyen un contador de centelleo o película fotográfica como en una auto-radiografía. Cuando el marcador es un marcador fluorescente, puede detectarse excitando el fluorocromo con la longitud de onda de luz apropiada y detectar la fluorescencia resultante. La fluorescencia puede ser detectada visualmente, por medio de una película fotográfica, por el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos de cargas acopladas (abreviadamente CCD, del inglés Charge Coupled Devices) o fotomultiplicadores y similares. Igualmente, los marcadores enzimáticos pueden detectarse proporcionando los sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Por último los marcadores colorimétricos sencillos pueden detectarse observando simplemente el color asociado con el marcador. Así, en diversos ensayos con tiras reactivas, el oro conjugado aparece con frecuencia rosa, mientras que diversas perlas conjugadas muestran el color de la
perla.

Algunos formatos de ensayo no requieren el uso de componentes marcados. Por ejemplo, los ensayos de aglutinación pueden usarse para detectar la presencia de los anticuerpos diana. En este caso, las partículas revestidas con el antígeno son aglutinadas por muestras que comprenden los anticuerpos diana. En este formato, ninguno de los componentes necesita ser marcado y la presencia del anticuerpo diana se detecta por simple inspección visual.

VI. Ensayos de moduladores de GPCR-B4 A. Ensayos de la actividad de GPCR-B4

El GPCR-B4 y sus alelos y variantes polimorfas son receptores acoplados a proteínas G que participan en la transducción del gusto. La actividad de los polipéptidos GPCR-B4 puede valorarse usando una variedad de ensayos in vitro e in vivo para determinar los efectos funcionales, químicos y físicos, por ejemplo, midiendo la unión a los ligandos (por ejemplo, unión a ligandos radiactivos), segundos mensajeros (por ejemplo, cAMP, cGMP, IP_{3}, DAG o Ca^{2+}), flujo iónico, niveles de fosforilación, niveles de transcripción, niveles de neurotransmisores y similares. Además, dichos ensayos pueden usarse para analizar inhibidores y activadores de GPCR-B4. Los moduladores pueden ser también versiones genéticamente alteradas de GPCR-134. Dichos moduladores de la actividad de la transducción del gusto son útiles para personalizar los sabores.

\newpage

El GPCR-B4 del ensayo se seleccionará de un polipéptido que tenga una secuencia de SEQ ID NO:1, o una de sus variantes modificada de modo conservador. Alternativamente, el GPCR-B4 del ensayo procederá de una célula eucariota e incluirá una subsecuencia de aminoácidos que presente cierta identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1. En general, la identidad de secuencias de aminoácidos será al menos 70%, opcionalmente al menos 85%, opcionalmente al menos 90-95%. Opcionalmente, el polipéptido de los ensayos comprenderá un dominio de GPCR-B4, tal como un dominio extracelular, dominio transmembránico, dominio citoplásmico, dominio de unión a ligandos, dominio de asociación a subunidades, sitios activos y similares. El GPCR-B4 puede estar unido covalentemente a una proteína heteróloga para crear una proteína quimérica usada en los ensayos descritos en la presente memoria.

Los moduladores de la actividad de GPCR-B4 se analizan usando polipéptidos de GPCR-B4 como se ha descrito antes, recombinantes o naturales. La proteína puede aislarse, expresarse en una célula, expresarse en una membrana procedente de una célula, expresarse en un tejido o un animal, recombinante o natural. Por ejemplo, pueden usarse rodajas de lengua, células disociadas de una lengua, células transformadas o membranas. La modulación se analiza usando uno de los ensayos in vitro o in vivo descritos en la presente memoria. La transducción del gusto puede también examinarse in vitro con mezclas de reacción solubles o en estado sólido, usando una molécula quimérica, tal como un dominio extracelular de un receptor unido covalentemente a un dominio heterólogo de la transducción de la señal o a un dominio extracelular heterólogo unido covalentemente al dominio transmembránico y/o citoplásmico de un receptor. Además, los dominios unidos a ligandos de la proteína de interés pueden usarse in vitro en mezclas de reacción solubles o en estado sólido para analizar la unión de ligandos.

La unión de ligandos a GPCR-B4, un dominio o una proteína quimérica puede analizarse en solución, en una membrana bicapa, unido a una fase sólida, en una monocapa lipídica o en vesículas. La unión de un modulador puede analizarse usando, por ejemplo, cambios en las características espectroscópicas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, índice de refracción), propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, forma), cromatográficas o de solubilidad.

También pueden examinarse la interacciones receptor-proteína G. Por ejemplo, puede examinarse la unión de la proteína G al receptor o su liberación del receptor. Por ejemplo, en ausencia de GTP, un activador conducirá a la formación de un fuerte complejo de una proteína G (las tres subunidades) con el receptor. Este complejo puede detectarse por una variedad de modos, como se ha citado antes. Dicho ensayo puede modificarse para la búsqueda de inhibidores. Añadir un activador al receptor y a la proteína G en ausencia de GTP, formar un fuerte complejo y a continuación escrutar los inhibidores buscando la disociación del complejo receptor- proteína G. En presencia de GTP, la liberación de la subunidad alfa de la proteína G de las otras dos subunidades de la proteína G sirve como criterio de activación.

Una proteína G activada o inhibida alterará a su vez las propiedades de las enzimas, canales y otras proteínas efectoras diana. Los ejemplos clásicos son la activación de cGMP-fosfodiesterasa por transducina en el sistema visual, adenilato-ciclasa por la proteína G estimuladora, fosfolipasa C por Gq y otras G proteínas cognadas y la modulación de diversos canales por Gi y otras proteínas G. También pueden examinarse las secuencias que se extienden en dirección al extremo 3' (downstream), tal como la generación de diacilglicerol e IP3 por fosfolipasa C, y a su vez, la movilización de calcio por IP3.

Los receptores GPCR activados se convierten en sustratos para las quinasas que fosforilan la cola del extremo C del receptor (y posiblemente también otros sitios). Así, los activadores promoverán la transferencia de ^{32}P desde el GTP marcado con radiación gamma al receptor, que puede analizarse con un contador de centelleo. La fosforilación de la cola del extremo C promoverá la unión de proteínas similares a arrestina e interferirá con la unión de proteínas G. La vía quinasa/arrestina juega un papel clave en la desensibilización de muchos receptores GPCR. Por ejemplo, los compuestos que modulan la duración que un receptor gustativo permanece activo serían útiles como medio para prolongar un gusto deseado o interrumpir uno desagradable. Para una revisión general de la transducción de la señal de GPCR y los métodos de valoración de la transducción de la señal, véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, vols. 237 y 238 (1994) y volumen 96 (1983); Bourne et al., Nature 10:349:117-27(1991);Bourne et al., Nature 348:125-32(1990); Pitcher et al., Annu. Rev, Biochem. 67:653-92 (1998).

Las muestras o ensayos que se tratan con un inhibidor o activador potencial de GPCR-B4 se comparan con las muestras control sin el compuesto de ensayo, para examinar el grado de modulación. A las muestras control (no tratadas con activadores o inhibidores) se les asigna un valor de actividad de GPCR-B4 relativo de 100. La inhibición de GPCR-B4 se consigue cuando el valor de la actividad de GPCR-B4 con relación al control es aproximadamente 90%, opcionalmente 50%, opcionalmente 25-0%. La activación de GPCR-B4 se consigue cuando el valor de la actividad de GPCR-B4 con relación al control es 110%, opcionalmente 150%, 200-500% o 1000-2000%.

Los cambios en el flujo iónico pueden evaluarse determinando los cambios en la polarización (es decir, potencial eléctrico) de la célula o membrana que expresa GPCR-B4. Un medio para determinar los cambios en la polarización celular es medir los cambios en la corriente (midiendo con ello los cambios en la polarización) con técnicas de fijación de voltaje y pinzamiento zonal, por ejemplo, la configuración "cell-attached" (estudio de las corrientes en la zona de membrana delimitada por los bordes de la pipeta), la configuración "inside-out" (registro de la corriente de una vesícula previamente extraída de la membrana dejando el interior celular en el lado externo de la pipeta), la configuración "whole cell" (registro de la corriente en toda la célula, la pipeta abre un orificio en la membrana) (véase, por ejemplo, Ackerman et al., New Engl. J. Med. 336:1575-1595 (1997)). Las corrientes en toda la célula se determinan convenientemente usando la metodología estándar (véase, por ejemplo., Hamil et al., PFlugers. Archiv. 391:85(1981). Otros ensayos conocidos incluyen: ensayos de flujos iónicos radiomarcados y ensayos de fluorescencia usando colorantes sensibles al voltaje (véase, por ejemplo, Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol. 88:67-75(1988);Gonzales & Tsien, Chem. Biol, 4:269-277 (1997); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth. 25:185-193 (1991);Holevinsky et al., J. Membrane Biology 137:59-70 (1994)).En general, los compuestos de ensayo están presentes en el intervalo de 1 pM a 100 mM.

Los efectos de los compuestos de ensayo sobre la función de los polipéptidos pueden medirse examinando cualquiera de los parámetros antes descritos. Puede usarse cualquier cambio fisiológico adecuado que afecte a la actividad de GPCR para evaluar la influencia de un compuesto de ensayo sobre los polipéptidos de esta invención. Cuando se determinan las consecuencias funcionales usando células intactas o animales, puede medirse también una variedad de efectos, tales como liberación de transmisores, liberación de hormonas, cambios de la transcripción en marcadores genéticos tanto conocidos como no caracterizados (por ejemplo, inmunotransferencia Northern), cambios en el metabolismo celular, tales como cambios en el crecimiento celular o pH, y cambios en los segundos mensajeros intracelulares, tales como Ca^{2+}, IP3 o cAMP.

Los ensayos preferidos para los receptores acoplados a proteínas G incluyen células que están cargadas con colorantes sensibles a los iones o al voltaje para informar de la actividad del receptor. Los ensayos para determinar la actividad de dichos receptores pueden usar también agonistas y antagonistas conocidos para otros receptores acoplados a proteínas G como controles negativos o positivos para evaluar la actividad de los compuestos de ensayo. En ensayos para identificar los compuestos moduladores (por ejemplo, agonistas, antagonistas), los cambios en el nivel de iones en el citoplasma o del voltaje de la membrana se monitorizarán usando un indicador fluorescente sensible a los iones o del voltaje de la membrana, respectivamente. Entre los indicadores sensibles a los iones y las sondas de voltajes que pueden emplearse están los descritos en el Molecular Probes 1997 Catalog (Catálogo de sondas moleculares, 1997). Para receptores acoplados a proteína G, en el ensayo de elección pueden usarse proteínas G promiscuas, tales como G\alpha15 y G\alpha16, (Wilkie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:10049-10053 (1991)). Dichas proteínas G promiscuas permiten el acoplamiento de una amplia gama de receptores.

La activación del receptor inicia típicamente episodios celulares subsiguientes, por ejemplo, aumentos en los segundos mensajeros, tal como IP3, lo que libera las reservas celulares de iones calcio. La activación de algunos receptores acoplados a proteínas G estimula la formación de trifosfato de inositol (IP3) por hidrólisis mediada por fosfolipasa C de fosfatidilinositol (Berridge & Irvine, Nature 312:315-21(1984)). El IP3 estimula a su vez la liberación de las reservas intracelulares de iones calcio. Así, puede usarse un cambio en los niveles citoplásmicos de calcio o un cambio en los niveles del segundo mensajero, tal como IP3 para evaluar la función del receptor acoplado a proteínas G. Las células que expresan dichos receptores acoplados a proteínas G pueden presentar mayores niveles citoplásmicos de calcio como resultado de la contribución tanto de las reservas intracelulares como por medio de la activación de los canales iónicos, en cuyo caso puede ser deseable aunque no necesario realizar dichos ensayos en un tampón exento de calcio, opcionalmente suplementado con un agente quelante, tal como EGTA, para distinguir la respuesta a la fluorescencia que resulta de la liberación de calcio de las reservas internas.

Otros ensayos pueden implicar la determinación de la actividad de los receptores que, cuando se activan, dan como resultado un cambio en el nivel intracelular de nucleótidos cíclicos, por ejemplo, cAMP o cGMP, activando o inhibiendo enzimas tales como la adenilato-ciclasa. Existen canales iónicos dependientes de nucleótidos cíclicos, por ejemplo, canales de células fotorreceptoras en forma de bastón y canales de neuronas olfativas que son permeables a cationes por activación por unión de cAMP o cGMP (véase, por ejemplo, Altenhofen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9868-9872 (1991) y Dhallan et al., Nature 347:184-187 (1990)). En casos en los que la activación del receptor da como resultado una disminución en los niveles de nucleótidos cíclicos, puede ser preferible exponer las células a agentes que aumentan los niveles intracelulares de nucleótidos cíclicos, por ejemplo, forskolina, antes de añadir a las células de ensayo un compuesto activador de los receptores. Las células para este tipo de ensayo pueden prepararse por co-transfección de una célula hospedante con DNA que codifica un canal iónico dependiente de nucleótidos cíclicos, GPCR-fosfatasa y DNA que codifica unreceptor (por ejemplo, ciertos receptores de glutamato, receptores muscarínicos de acetilcolina, receptores de dopamina, receptores de serotonina y similares), que, cuando se activan, provocan un cambio en los niveles de nucleótidos cíclicos en el citoplasma.

En una realización preferida, la actividad de GPCR-B4 se mide expresando GPCR-B4 en una célula heteróloga con una proteína G promiscua que une el receptor a una vía de transducción de la señal de fosfolipasa C (véase, Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995); véase, también el Ejemplo II). Opcionalmente la línea celular es HEK-293 (que no se expresa de forma natural GPCR-B4) y la proteína G promiscua es G\alpha15 (Offennanns & Simon, supra). La modulación de la transducción del gusto se analiza midiendo los cambios en los niveles intracelulares de Ca^{2+}, los cuales cambian en respuesta a la modulación de la vía de transducción de la señal de GPCR-B4 por la administración de una molécula que se asocia con GPCR-B4. Los cambios en los niveles de Ca^{2+} se miden opcionalmente usando colorantes fluorescentes indicadores de Ca^{2+} y formación de imágenes fluorimétricas.

En una realización, los cambios en cAMP o cGMP intracelulares pueden medirse por inmunoensayos. Puede aplicarse el método descrito por Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995)para determinar el nivel de cAMP. También, puede aplicarse el método descrito por Felley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. 11:159-164 (1994) para determinar el nivel de cGMP. Además, en la Patente de EE.UU. 4.115.538 se describe un kit de ensayo para medir cAMP y/o cGMP.

En otra realización, puede analizarse la hidrólisis de fosfatidilinositol (PI) de acuerdo con la Patente de EE.UU. 5.436.128. En resumen, el ensayo implica el marcaje de células con ^{3}H-mioinositol durante 48 horas o más. Las células marcadas se tratan con un compuesto de ensayo durante una hora. Las células tratadas se lisan y extraen en cloroformo-metanol-agua después de lo cual se separaron los fosfatos de inositol por cromatografía de intercambio iónico y se cuantificaron por recuento con centelleo. La estimulación del plegamiento se determina calculando la relación entre el cpm en presencia de agonista y el cpm en presencia del control tampón. Igualmente, la inhibición del plegamiento se determina calculando la relación entre el cpm en presencia de antagonista y el cpm en presencia del control tampón (que puede contener o no un agonista).

En otra realización, pueden medirse los niveles de transcripción para evaluar los efectos de un compuesto de ensayo sobre la transducción de la señal. Una célula hospedante que contiene la proteína de interés se pone en contacto con un compuesto de ensayo durante un tiempo suficiente para que se efectúe cualquier interacción y a continuación se mide el nivel de expresión del gen. La cantidad de tiempo para efectuar dichas interacciones puede determinarse empíricamente, tal como dejando que transcurra cierto tiempo y midiendo el nivel de transcripción en función del tiempo. La cantidad de transcripción puede medirse usando cualquier método que los expertos en la técnica consideren adecuado. Por ejemplo, la expresión de mRNA de la proteína de interés pude detectarse con inmunotransferencia Northern o sus productos polipeptídicos pueden identificarse usando inmunoensayos. Alternativamente, pueden usarse ensayos basados en la transcripción que utilizan un gen informador, como se ha descrito en la Patente de EE.UU. 5.436.128. Los genes informadores pueden ser, por ejemplo, cloranfenicol-acetiltransferasa, luciferasa de luciérnaga, luciferasa bacteriana, \beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Además, la proteína de interés puede usarse como un informador indirecto por medio de la unión a un segundo informador, tal como una proteína fluorescente (véase, por ejemplo, Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15:961-964 (1997)).

La cantidad de transcripción se compara luego con la cantidad de transcripción en la misma célula en ausencia del compuesto de ensayo o puede compararse con la cantidad de transcripción en una célula sustancialmente idéntica a la que le falta la proteína de interés. Una célula sustancialmente idéntica puede proceder de las mismas células a partir de las cuales se preparó la célula recombinante pero que no había sido modificada por introducción de DNA heterólogo. Cualquier diferencia en la cantidad de transcripción indica que el compuesto de ensayo tiene de algún modo alterada la actividad de la proteína de interés.

B. Moduladores

Los compuestos ensayados como moduladores de GPCR-B4 pueden ser cualquier pequeño compuesto químico o una entidad biológica, tal como una proteína, azúcar, ácido nucleico o lípido. Alternativamente, los moduladores pueden ser versiones genéticamente alteradas de GPCR-B4. Típicamente, los compuestos de ensayo serán pequeñas moléculas químicas y péptidos. Esencialmente en los ensayos de la invención puede usarse cualquier compuesto químico como modulador o ligando potencial, aunque más frecuentemente se usan compuestos que pueden estar disueltos en soluciones acuosas u orgánicas (especialmente basados en DMSO). Los ensayos se diseñan para escrutar grandes colecciones de compuestos químicos (quimiotecas) automatizando las etapas de ensayo y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente para los ensayos, que se realizan en paralelo (por ejemplo, en formatos de microtitulación en microplacas en ensayos robóticos). Se apreciará que existen muchos suministradores de compuestos químicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerland) y similares.

En una realización preferida, los métodos de escrutinio de alto rendimiento implican proporcionar una colección de compuestos químicos o péptidos combinatoria que contenga gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos moduladores o ligandos potenciales). Dichas "colecciones de compuestos químicos combinatorias" o "quimiotecas de ligandos" se escrutan a continuación en uno o más ensayos, como se describe en la presente memoria, para identificar los miembros de las colecciones (especies o subclases químicas particulares) que presentan una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos principales (cabezas de serie)" convencionales o pueden usarse ellos mismos como productos terapéuticos potenciales o reales.

Una colección de compuestos químicos combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica, combinando varios "bloques de construcción o módulos" químicos, tales como reactivos. Por ejemplo, una colección de compuestos químicos combinatoria lineal, tal como una colección de polipéptidos se forma combinando un conjunto de módulos químicos (aminoácidos) de cada modo posible para obtener una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Millones de compuestos químicos pueden ser sintetizados por dicha mezcla combinatoria de módulos químicos.

La preparación y escrutinio de colecciones de compuesto químicos combinatorias son muy conocidos por los expertos en la técnica. Dichas colecciones de compuestos químicos combinatorias incluyen, aunque sin estar limitadas a ellas, colecciones de péptidos (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 5.010.175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)y Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)). También pueden usarse otras sustancias químicas para generar colecciones de variedades químicas. Dichas sustancias químicas incluyen, aunque sin estar limitadas a ellas: peptoides (por ejemplo, Nº de publicación PCT WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, Nº de publicación PCT WO 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (por ejemplo, Nº de publicación PCT WO 92/00091), benzodiazepinas (por ejemplo, Pat. de EE.UU. Nº 5.288.514), diversómeros, tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568(1992)), peptidomiméticos no peptídicos con armazón de glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), productos de síntesis orgánicas análogas de colecciones de pequeños compuestos (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661(1994)), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261:1303(1993)), y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658(1994)), genotecas de ácidos nucleicos (véase, Ausubel, Berger and Sambrook, todos supra), genotecas de ácidos nucleicos peptídicos(véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 5.539.083), colecciones de anticuerpos (véase, por ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287), colecciones de hidratos de carbono (véase, por ejemplo, Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) y la Patente de EE.UU. 5.593.853), colecciones de pequeñas moléculas orgánicas (véase, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, Jan 18, pp. 33 (1993); isoprenoides, Patente de EE.UU. 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de EE.UU. 5.549.974; pirrolidinas, Patentes de EE.UU. 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, Patente de EE.UU. 5.506.337; benzodiazepinas, 5.288.514 y similares).

Están disponibles comercialmente dispositivos para la preparación de quimiotecas combinatorias (véase, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Además, numerosas colecciones combinatorias están ellas mismas disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).

C. Ensayos en estado sólido y en estado soluble con alto rendimiento

En una realización la invención proporciona ensayos en estado soluble utilizando moléculas tales como un dominio, un dominio unido a un ligando, un dominio extracelular, un dominio transmembránico (por ejemplo, uno que comprenda siete regiones transmembránicas y bucles citosólicos), el dominio transmembránico y un dominio citoplásmico, un sitio activo, una región de asociación de subunidades, etc.; un dominio que está unido covalentemente a una proteína heteróloga para crear una molécula quimérica; GPCR-B4; o una célula o tejido que expresa GPCR-B4, natural o recombinante. En otra realización, la invención proporciona ensayos in vitro basados en fase sólida en un formato de alto rendimiento, en el que el dominio, la molécula quimérica, el GPCR-B4, o la célula o tejido que expresan GPCR-B4 está unido a un sustrato en fase sólida.

En los ensayos de alto rendimiento de la invención, es posible escrutar hasta varios miles de moduladores o ligandos diferentes en un sólo día. En particular, puede usarse cada pocillo de una placa de microtitulación para realizar un ensayo separado de un modulador potencial seleccionado o si ha de observarse los efectos del la concentración o el tiempo de incubación, cada 5-10 pocillos puede analizar un sólo modulador. Así, una sola placa de microtitulación estándar puede analizar aproximadamente 100 (por ejemplo, 96) moduladores. Si se usan placas de 1536 pocillos, entonces una sola placa puede analizar fácilmente desde aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 compuestos diferentes. Es posible analizar diversas placas diferentes al día; es posible que el ensayo escrute hasta aproximadamente 6.000-20.000 compuestos diferentes usando los sistemas integrados de la invención. Más recientemente, se han desarrollado procedimientos con microfluidos para la manipulación de los reactivos, por ejemplo, por Caliper Technologies (Palo Alto, CA).

La molécula de interés puede unirse al componente en estado sólido, directa o indirectamente, por medio de un enlace covalente o no covalente, por ejemplo, por medio de una etiqueta (tag). La etiqueta puede ser cualquiera de una variedad de componentes. En general, una molécula que se une a la etiqueta (un agente de unión a la etiqueta) se fija a un soporte sólido y la molécula etiquetada de interés (por ejemplo, la molécula de transducción del gusto de interés) se une al soporte sólido por interacción de la etiqueta y el agente de unión a la etiqueta.

Pueden usarse varias etiquetas y agentes de unión a la etiqueta, basados en las interacciones moleculares conocidas bien descritas en la bibliografía. Por ejemplo, cuando una etiqueta tiene un agente de unión natural, por ejemplo, biotina, proteína A, o proteína G, puede usarse junto con los agentes de unión a la etiqueta apropiados (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región Fc de una inmunoglobulina, etc.).Losanticuerpos para moléculas con agentes de unión naturales, tal como la biotina, son agentes de unión a la etiqueta apropiados y ampliamente disponibles (véase, SIGMA Immunochemicals 1998 catálogo SIGMA, St. Louis MO).

Igualmente, puede usarse cualquier compuesto hapténico o antígeno en combinación con un anticuerpo apropiado para formar una pareja de etiqueta/agente de unión de la etiqueta. Miles de anticuerpos específicos están comercialmente disponibles y muchos anticuerpos más están descritos en la bibliografía. Por ejemplo, en una configuración común, la etiqueta es un primer anticuerpo y el agente de unión a la etiqueta un segundo anticuerpo que reconoce al primer anticuerpo. Además de las interacciones anticuerpo-antígeno, también son apropiadas las interacciones receptor-ligando como parejas de la etiqueta y agente de unión a la etiqueta. Por ejemplo, agonistas y antagonistas de receptores de membranas celulares (por ejemplo, interacciones receptor celular-ligando, tales como transferrina, c-kit, ligandos de receptores virales, receptores de citoquina, receptores de quimioquina, receptores de interleuquina, receptores de inmunoglobulina y anticuerpos, la familia de la cadhereína, la familia de la integrina, la familia de la selectina y similares; véase, por ejemplo, Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book (1993)). Igualmente, toxinas y venenos, epítopos virales, hormonas (por ejemplo, opiáceos, esteroides, etc.), receptores intracelulares (por ejemplo, que median los efectos de diversos ligandos pequeños, incluyendo esteroides, hormona tiroidea, retinoides y vitamina D; péptidos), fármacos, lectinas, azúcares, ácidos nucleicos (configuraciones polímeras tanto lineales como cíclicas), oligosacáridos, proteínas, fosfolípidos y anticuerpos pueden interactuar todos con diversos receptores celulares.

Los polímeros sintéticos, tales como poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, poli(sulfuros de arileno), polisiloxanos, poliimidas y poliacetatos pueden formar también una etiqueta o agente de unión a la etiqueta apropiado. Otras muchas parejas de etiqueta/agente de unión a la etiqueta son también útiles en los sistemas de ensayo descritos en la presente memoria, como deducirán los expertos de la revisión de esta descripción.

Los fragmentos enlazadores usuales, tales como péptidos, poliéteres y similares pueden servir también como etiquetas, e incluyen secuencias de polipéptidos, tales como secuencias de poli-gly de entre aproximadamente 5 y 200 aminoácidos. Dichos fragmentos enlazadores flexibles son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos enlazadores de poli(etilenglicol) los comercializa Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Estos fragmentos enlazadores tienen opcionalmente enlaces amídicos, enlaces sulfhídricos o enlaces heterofuncionales.

Los agentes de unión a la etiqueta se fijan a sustratos sólidos usando cualquiera de una variedad de métodos normalmente disponibles. Los sustratos sólidos se derivatizan o funcionalizan usualmente exponiendo todo o una porción del sustrato a un reactivo químico que fija un grupo químico a la superficie que es reactiva con una porción del agente de unión a la etiqueta. Por ejemplo, grupos que son adecuados para la unión a una porción de cadena más larga incluirían aminas, grupos hidroxilo, tiol y carboxilo. Los aminoalquilsilanos e hidroxialquilsilanos pueden usarse para funcionalizar una variedad de superficies, tal como superficies de vidrio. La construcción de dichas disposiciones biopolímeras en fase sólida está descrita en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) (que describe la síntesis en fase sólida de, por ejemplo, péptidos); Geysen et al., J. Immun. Meth. 102:259-274 (1987)(que describe la síntesis de componentes en fase sólida sobre alfileres); Frank & Doring, Tetrahedron 44:6031-6040 (1988)(que describe la síntesis de diversas secuencias peptídicas sobre discos de celulosa); Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991);Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4):718-719 (1993); y Kozal et al., Nature Medicine 2(7):753-759 (1996)(que describen todos las disposiciones de biopolímeros fijadas a sustratos sólidos). Los procedimientos no químicos para fijar los agentes de unión a la etiqueta a los sustratos incluyen otros métodos usuales, tales como calor, reticulación por radiación UV y similares.

D. Ensayos informatizados

Incluso otro ensayo para compuestos que modulan la actividad de GPCR-B4 implica el diseño de fármacos asistido por ordenador, en el que se usa un sistema informático para generar una estructura tridimensional de GPCR-B4 basada en la información estructural codificada por la secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos introducida interactúa directa y activamente con un algoritmo preestablecido en un programa informático proporcionando modelos estructurales secundarios, terciarios y cuaternarios de la proteína. A continuación se examinan los modelos de la estructura proteínica para identificar las regiones de la estructura que tienen capacidad de unirse, por ejemplo, a ligandos. Estas regiones se usan a continuación para identificar los ligandos que se unen a la proteína.

El modelo estructural tridimensional de la proteína es generado introduciendo secuencias de aminoácidos de la proteínade al menos 10 residuos de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos correspondientes que codifican un polipéptido GPCR-B4 en el sistema informático. La secuencia de aminoácidos del polipéptido del ácido nucleico que codifica el polipéptido se selecciona de SEQ lD NO:1 o SEQ lD NO:3 y sus versiones modificadas de modo conservador. La secuencia de aminoácidos representa la secuencia o subsecuencia primaria de la proteína, que codifica la información estructural de la proteína. Al menos 10 residuos de la secuencia de aminoácidos (o una secuencia de nucleótidos que codifica 10 aminoácidos) se introducen en el sistema informático por el teclado del ordenador, los sustratos legibles por el ordenador que incluyen, aunque sin estar limitados a ellos, los medios de conservación electrónicos (por ejemplo, disquetes magnéticos, cintas, cartuchos y chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), información distribuida por sitios de internet y por RAM. El modelo estructural tridimensional de la proteína se genera a continuación por la interacción de la secuencia de aminoácidos y el sistema informático, usando programas conocidos por los expertos en la técnica.

La secuencia de aminoácidos representa una estructura primaria que codifica la información necesaria para formar la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína de interés. El programa informático parece en ciertos parámetros codificado por la secuencia primaria para generar el modelo estructural. Estos parámetros se denominan "términos energéticos" e incluyen principalmente potenciales electrostáticos, potenciales hidrófobos, superficies accesibles a los disolventes y enlaces por puentes de hidrógeno. Los términos energéticos secundarios incluyen potenciales de van der Waals. Las moléculas biológicas forman las estructuras que minimizan los términos energéticos de modo acumulativo. El programa informático usa por consiguiente estos términos codificados por la estructura primaria o secuencia de aminoácidos para crear el modelo estructural secundario.

A continuación se forma la estructura terciaria de la proteína codificada por la estructura secundaria en base a los términos energéticos de la estructura secundaria. En este punto el usuario pueden introducir variables adicionales, tales como si la proteína está unida a una membrana o soluble, su situación en el organismo y su situación celular, por ejemplo, citoplásmica, superficial o nuclear. Estas variables junto con los términos energéticos de la estructura secundaria se usan para formar el modelo de la estructura terciaria. Al realizar el modelo de la estructura terciaria, el programa informático equipara las caras hidrófobas de la estructura secundaria con otras similares y las caras hidrófilas de la estructura secundaria con otras similares.

Una vez que se ha generado la estructura, se identifican por el sistema informático las regiones potenciales de unión a ligandos. Las estructuras tridimensionales para los ligandos potenciales se generan introduciendo las secuencias de aminoácidos o nucleótidos o las fórmulas químicas de los compuestos, como se ha descrito anteriormente. A continuación se compara la estructura tridimensional del ligando potencial con la de la proteína GPCR-B4 para identificar los ligandos que se unen a GPCR-B4. La afinidad de unión entre la proteína y los ligandos se determina usando términos energéticos para determinar que ligandos tienen mayor probabilidad de unión a la proteína.

Los sistemas informáticos también se usan para escrutar mutaciones, variantes polimorfas, alelos y homólogos entre especies de los genes de GPCR-B4. Dichas mutaciones pueden asociarse con estados morbosos o rasgos genéticos. Como se ha descrito antes, puede usarse GeneChip^{TM} y tecnología relacionada para escrutar mutaciones, variantes polimorfas, alelos y homólogos entre especies. Una vez que se identifican las variantes, pueden usarse ensayos de diagnóstico para identificar pacientes que tienen dichos genes mutados. La identificación de los genes de GPCRB4 mutados implica permitir la entrada de una primera secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que codifica GPCR-B4, seleccionado de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 y sus versiones modificadas de modo conservador. La secuencia se introduce en el sistema informático como se ha descrito antes. A continuación se compara la primera secuenciade ácidos nucleicos o aminoácidos con una segunda secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que presenta una identidad sustancial con la primera secuencia. La segunda secuencia se introduce en el sistema informático como se ha descrito antes. Una vez comparadas la primera y la segunda secuencias, se identifican las diferencias de nucleótidos o aminoácidos entre las secuencias. Dichas secuencias pueden representar diferencias de alelos en los genes de GPCR-B4 y las mutaciones asociadas a estados morbosos y rasgos genéticos.

VIII. Kits

El GPCR-B4 y sus homólogos son herramientas útiles para identificar las células receptoras del gusto, para la medicina forense y determinaciones de la paternidad y para examinar la transducción del gusto. Reactivos específicos del GPCR-B4 que se hibridan específicamente al ácido nucleico de GPCR-B4, tales como sondas y cebadores de GPCR-B4, y reactivos específicos de GPCR-B4 que se unen específicamente a la proteína GPCR-B4, por ejemplo, anticuerpos de GPCR-B4, se usan para examinar la expresión de las células gustativas y la regulación de la transducción del gusto.

Los ensayos de los ácidos nucleicos para determinar la presencia del DNA y RNA de GPCR-B4 en una muestra incluyen numerosas técnicas que son conocidas por los expertos, tales como análisis Southern, análisis Northern, inmunotransferencias de puntos, protección con RNasa, análisis S1, técnicas de amplificación, tales como PCR y LCR e hibridación in situ. En la hibridación in situ, por ejemplo, el ácido nucleico diana es liberado de su medio celular de tal modo que esté libre para la hibridación en la célula conservando la morfología celular para la interpretación y el análisis subsiguientes (véase el Ejemplo I). El siguiente artículo proporciona una revisión de la técnica de hibridación in situ: Singer et al., Biotechniques 4:230-250(1986); Haase et al., Methods in Virology, vol. VII, pp. 189-226(1984); y Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Hames et al., eds. 1987). Además, la proteína GPCR-B4 puede ser detectada por las diversas técnicas de inmunoensayos antes descritas. Típicamente se compara la muestra de ensayo tanto con un control positivo (por ejemplo, una muestra que expresa GPCR-B4 recombinante) como con un control negativo.

La presente invención proporciona también kits para escrutar moduladores de GPCR-B4. Dichos kits pueden prepararse a partir de materiales y reactivos fácilmente disponibles. Por ejemplo, dichos kits pueden comprender uno cualquiera o más de los siguientes materiales: GPCR-B4, tubos de reacción e instrucciones para analizar la actividad de GPCR-B4. Opcionalmente, el kit contiene GPCR-B4 biológicamente activo. Puede prepararse una amplia variedad de kits y componentes de acuerdo con la presente invención, dependiendo del usuario al que va destinado el kit y de las necesidades particulares del usuario.

IX. Administración y composiciones farmacéuticas

Los moduladores del gusto pueden administrarse directamente al mamífero para la modulación del gusto in vivo. La administración se efectúa por cualquiera de las vías usadas normalmente para introducir un compuesto modulador en contacto máximo con el tejido que ha de tratarse, opcionalmente la lengua o la boca. Los moduladores del gusto se administran de cualquier manera adecuada, opcionalmente con vehículos farmacéuticamente aceptables. Están disponibles métodos adecuados para la administración de dichos moduladores y son muy conocidos por los expertos en la técnica, y aunque puede usarse más de una vía para la administración de una composición particular, una vía particular puede con frecuencia proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que ha de administrarse, así como por el método particular usado para administrar dicha composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. 1985)).

Los moduladores del gusto, solos o en combinación con otros componentes adecuados pueden prepararse en formulaciones en aerosol (es decir, pueden ser "nebulizados") para ser administrados por inhalación. Las formulaciones en aerosol pueden colocarse en gases propulsores a presión adecuados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

\newpage

Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen isotónica la formulación, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de puesta en suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. En la práctica de esta invención, las composiciones pueden administrarse por ejemplo, por vía oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intravesicular o intratecal. Opcionalmente, las composiciones se administran por vía oral o nasal. Las formulaciones de los compuestos pueden presentarse en envases cerrados uni-dosis o multi-dosis, tales como ampollas y viales. Las soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos, granulados y comprimidos de la clase anteriormente descrita. Los moduladores pueden también administrarse como parte de un alimento o fármaco preparado.

La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para provocar una respuesta beneficiosa en el sujeto con el paso del tiempo. La dosis se determinará por la eficacia de los moduladores particulares del gusto empleados y el estado del sujeto, así como su peso y el área superficial de la zona que ha de tratarse. La magnitud de la dosis se determinará también por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que acompaña la administración de un compuesto particular o vector en un sujeto
particular.

Para determinar la cantidad eficaz del modulador que ha de administrarse el médico puede evaluar los niveles de plasma circundantes del modulador, la toxicidad del modulador y la producción de anticuerpos anti-modulador. En general, la dosis equivalente de un modulador es de aproximadamente 1 ng/kg a 10 mg/kg para un sujeto
normal.

En cuanto a la administración, los moduladores del gusto de la presente invención pueden administrarse a un régimen determinado por la DL-50 del modulador y los efectos secundarios del inhibidor a diversas concentraciones, aplicados a la masa y salud global del sujeto. La administración puede realizarse en una sola dosis o en dosis divididas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Los siguientes Ejemplos se proporcionan sólo como ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para obtener resultados esencialmente similares.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo I Clonación y expresión de GPCR-B4

Se usaron genotecas de cDNA obtenidas de células individuales circunvalares y fungiformes de rata para aislar los ácido nucleicos de GPCR de la invención.

Se aislaron papilas individuales foliares y fungiformes de lengua de rata (10 papilas cada una) y se preparó cDNA de la primera cadena de cada papila usando métodos de construcción de genotecas de células individuales (véase, por ejemplo, Bernhardt et al., J. Physiol. 490:325-336 (1996); Dulac & Axel, Cell 83:195-206 (1995)). Se analizaron 20 poblaciones diferentes de cDNA para determinar las positivas a un marcador de un receptor gustativo (TCP Nº 1, conocido también como clon 27-59; véase expediente del agente de patentes de número de la solicitud 02307E-084200, presentada el 28 de julio de 1998) para garantizar que el cDNA provenía de células receptoras del gusto. También se escrutaron los cDNA con GPCR-B3, un clon receptor acoplado a proteínas G (véase, la Solicitud de Patente de EE.UU. USSN 60/094.465, presentada el 28 de Julio de 1998). Se identificaron tres papilas positivas y se usaron como fuente de cDNA para las amplificaciones por PCR usando cebadores degenerados diseñados para codificar los restos altamente conservados entre receptores VR/mGIuR/CaST/GPCR-B3. Los cebadores preferidos procedían de la zona entre los dominios transmembránicos 6 y 7: [Y/N]FNEAK (SEQ ID NO:9) y PKCY[I/V](SEQ ID NO:10). Los productos de PCR degenerados se sub-clonaron en un vector Bluescript como fragmentos HindIII y 52 productos de PCR eran secuencias. Veinte de estos productos correspondían a GPCR-B3. 8 de los productos codificaban una secuencia nueva de GPCR-B4.

Los homólogos entre especies de ratón de GPCR-B4 se aislaron usando los clones de GPCR-B4 de rata como sondas para las genotecas genómicas y de cDNA. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de GPCR-B4 se proporcionan, respectivamente, en SEQ ID NO:1-2y 7 y SEQ ID NO:3-4 y 8.

La expresión específica de las células gustativas de GPCR-B4 se confirma usando los clones como sondas para la hibridación in situ a secciones del tejido de la lengua. Todos los clones demuestran expresión específica o preferencial en los botones gustativos.

Ejemplo II El GPCR es un receptor de la transducción del gusto

La distribución topográfica distintiva del GPCR-B4 y la representación del comportamiento de la transducción del sabor amargo sugiere una correlación entre los sitios de expresión de B4 (papilas circunvalares, pero no fungiformes o geschmackstreifen) y la sensibilidad al sabor amargo. Para determinar la selectividad para ligandos de GPCR-B4, se usó la expresión en células heterólogas. Una cuestión para la expresión de GPCR en células heterólogas es determinar como se acopla el GPCR a una proteína G y una vía de señalización apropiada. En este Ejemplo, se usó la subunidad G\alpha15 de la proteína G, que acopla promiscuamente una amplia gama de GPCR a la vía de señalización mediada por la fosfolipasa C (Offermans & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175-15180 (1995)). En consecuencia, la actividad del receptor puede medirse eficazmente registrando los cambios inducidos por ligandos en [Ca^{2+}]_{i} usando colorantes fluorescentes indicadores de Ca^{2+} y formación de imagen fluorimétrica.

Para garantizar la expresión de GPCR-B4 en la membrana del plasma, se analizó una variedad de líneas celulares y vectores de expresión. Como control para estos estudios, se transfectaron las células con un receptor \gamma-opioide de mamífero; este receptor no se acopla normalmente a PLC, por tanto todos los cambios inducidos por agonistas en [Ca^{2+}]_{i}
reflejan el acoplamiento a través de G\alpha15. Una línea HEK-293 que expresa el antígeno T de SV40 se co-transfectó con TK-G\alpha15, CMV-\gamma-opioide y un vector episómico pEAK-10 (Edge Biosystems) que contiene una construcción EF1a-[B4-GPCR]. Las eficacias de la transfección se determinaron usando construcciones CMV-GFP. Las células de control que expresan \gamma-opioide/G\alpha15 responden enérgicamente a DAMGO (un agonista \gamma-opioide), pero no responden a los sabores dulce o amargo, ni a los agonistas no relacionados (datos no mostrados). Estas respuestas dependen de G\alpha15 y presentan una resolución temporal apropiada, con un comienzo rápido después de la aplicación del estímulo. Principalmente, las células que expresan B4/G\alpha15 o B4/G\alpha15/\gamma-opioide responden a la feniltiocarbamida (PTC) de sabor amargo bien caracterizado, pero no a cualquiera de los diversos edulcorantes naturales o artificiales. Esta actividad es enteramente dependiente del receptor B4 y se produce a concentraciones fisiológicamente importantes de PTC (300 \muM-5 mM).

Estos resultados sugieren que el GPCR-B4 está implicado en la transducción del gusto amargo y proporciona un sistema experimentalmente tratable para futuros experimentos, incluyendo estudios de la especificidad y selectividad de los agentes gustativos, la definición de la vía de señalización del sabor amargo natural y quizás la comprensión de la base molecular de estudios psicofísicos humanos que demuestran las drásticas diferencias en el sabor de PTC entre "catadores" y "no catadores".

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por la solicitante es solamente para la conveniencia de los lectores. No forma parte del documento de Patente Europea. Incluso aunque se ha tenido mucho cuidado en compilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad a este respecto.

\global\parskip0.970000\baselineskip

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 4946778 A [0082]

\bullet WO 9320242 A [0170]

\bullet US 4683195 A [0099]

\bullet WO 9200091 A [0170]

\bullet US 4683202 A [0099]

\bullet US 5288514 A [0170] [0170]

\bullet US 4673641 A [0116]

\bullet US 5539083 A [0170]

\bullet US 4366241 A [0132]

\bullet US 9610287 W [0170]

\bullet US 4376110 A [0132]

\bullet US 5593853 A [0170]

\bullet US 4517288 A [0132]

\bullet US 5569588 A [0170]

\bullet US 4837168 A [0132]

\bullet US 5549974 A [0170]

\bullet US 4391904 A [0146]

\bullet US 5525735 A [0170]

\bullet US 4115538 A [0163]

\bullet US 5519134 A [0170]

\bullet US 5436128 A [0164] [0165]

\bullet US 5506337 A [0170]

\bullet US 5010175 A [0170]

\bullet US 09446598 P [0198]

\bullet W0 9119735 A [0170]

\global\parskip1.000000\baselineskip

Bibliografía que no pertenece a patentes citada en la descripción

\bulletMARGOLSKEE. BioEssays, 1993, vol. 15, 645-650 [0003]

\bulletAVENET; LINDEMANN. J. Membrane Bol, 1989, vol. 112, 1-8 [0003]

\bulletROPER. Ann. Rev. Neurosci, 1989, vol. 12, 329-353 [0003]

\bulletKAWAMURA; KARE. Introduction to Unami: A Basic Taste, 1987 [0004]

\bulletKINNAMON; CUMMINGS. Ann. Rev. Physiol, 1992, vol. 54, 715-731 [0004]

\bulletLINDEMANN. Physiol. Rev, 1996, vol. 76, 718-766 [0004] [0006]

\bulletSTEWART et al. Am. J. Ph ysiol., 1997, vol. 272, 1-26 [0004]

\bulletHOFFMANN. Menchen. Arch. Path. Anat. Physiol, vol. 62, 516-530 [0004]

\bulletBRADLEY et al. Anatomical Record, 1985, vol. 212, 246-249 [0004]

\bulletMILLER; REEDY. Physiol. Behav, 1990, vol. 47, 1213-1219 [0004]

\bulletAKABAS et al. Science, 1988, vol. 242, 1047-1050 [0004]

\bulletGILBERTSON et al. J. Gen. Physiol., 1992, vol. 100, 803-24 [0004] [0007]

\bulletBERNHARDT et al. J. Physiol, 1996, vol. 490, 325-336 [0004] [0198]

\bulletCUMMINGS et al. J. Neurophysiol, 1996, vol. 75, 1256-1263 [0004]

\bulletGILBERTSON. Current Opn. in Neúrobiol, 993, vol. 3, 532-539 [0007]

\bulletKINNAMON et al. Proa Nat'l Acad. Sci, 1988, vol. 85, 7023-7027 [0007]

\bulletHECK et al. Science, 1984, vol. 223, 403-405 [0007]

\bulletBRAND et al. Brain Res, 1985, 207-214 [0007]

\bulletAVENET et al. Naiure, 1988, vol. 331, 351-354 [0007]

\bulletSTRIEM et al. Biochem. J., 1989, vol. 260, 121-126 [0008]

\bulletCHAUDHARI et al. J. Neuros, 1996, vol. 16, 3817-3826 [0008]

\bulletWONG et al. Nature, 1996, vol. 381, 796-800 [0008]

\bulletKINNAMON; MARGOLSKEE. Curr. Opin. Neurobiol, 1996, vol. 6, 505-513 [0008]

\bulletMISTILI; SPECTOR. Nature Biotechnology, 1997, vol. 15, 961-964 [0027] [0165]

\bulletFONG. Cell Signal, 1996, vol. 8, 217 [0030]

\bulletBALDWIN. Curr, Opin. Cell Biol,. 1994, vol. 6, 180 [0030]

\bulletROPER et al. Ann. Rev. Neurosci, 1989, vol. 12, 329-353 [0039]

\bulletHOON et al. Cell, 1999, vol. 96, 541-551 [0040] [0043]

\bulletMCLAUGHIN et al. Nature, 1992, vol. 357, 563-569 [0040]

\bulletBUCK; AXEL Cell, 1991, vol. 65, 175-187 [0043]

\bulletKYTE; DOOLITTLE. J. Mol. Biol., 1982, vol. 157, 105-132 [0043]

\bulletOFFERMANS; SIMON, J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 15175-15180 [0047]

\bulletBATZER et al. Nucleic Acid Res., 1991, vol. 19, 5081 [0054]

\bulletOHTSUKA et al. J. Biol. Chem., 1985, vol. 260, 2605-2608 [0054]

\bulletROSSOLINI et al. Mol. Cell. Probes, 1994, vol. 8, 91-98[0054]

\bulletALBERTS et al. Molecular Biology of the Cell. 1994 [0061]

\bulletCANTOR; SCHIMMEL Biophysical Chemistry. The Conformation of Biological Macromolecules, 1980, vol. I [0061]

\bulletSMITH; WATERMAN. Adv. Appl. Math, 1981, vol. 2, 482 [0071]

\bulletNEEDLEMAN; WUNSCH. J. Mol. Biol, 1970, vol. 48, 443 [0071]

\bulletPEARSON; LIPMAN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 2444 [0071]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. 1995 [0071]

\bulletFENG; DOOLITTLE. J. Mol. Evol, 1987, vol. 35, 351-360[0072]

\bulletHIGGINS; SHARP. CABIOS, 1989, vol. 5, 151-153 [0072]

\bulletDEVEREAUX et al. Nuc. Acids Res., 1984, vol. 12, 387-395[0072]

\bulletALTSCHUL et al. Nuc. Acids Res, 1977, vol. 25, 3389-3402 [0073]

\bulletALTSCHUL et al. J. Mal. Biol., 1990, vol. 215, 403-410 [0073]

\bulletHENIKOFF; HENIKOFF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 89, 10915 [0073]

\bulletKARLIN; ALTSCHUL Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 5873-5787 [0074]

\bulletTIJSSEN. Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 1993 [0077]

\bulletMCCAFFERTY et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0081] [0082]

\bulletKOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495-497 [0082] [0126]

\bulletKOZBOR et al. Immunology Today, 1983, vol. 4, 72 [0082]

\bulletCOLE et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985, 77-96 [0082]

\bulletMARKS et al. Biotechnology, 1992, vol. 10, 779-783 [0082]

\bulletHARLOW; LANE. Antibodies, A Laboratory Manual, 1988 [0086]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 1989 [0089]

\bulletKRIEGLER. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, 1990 [0089]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. 1994 [0089]

\bulletBEAUCAGE; CARUTHERS. Tetrahedron Letts., 1981, vol. 22, 1859-1862 [0091]

\bullet VAN DEVANTER. Nucleic Acids Res., 1984, vol. 12, 6159-6168[0091]

\bulletPEARSON; REANIER. J. Chrom, 1983, vol. 255, 137-149[0091]

\bulletWALLACE et al, Gene, 1981, vol. 16, 21-26 [0092]

\bulletDIEFFENFACH; DVEKSLER. PCR Primer: A Laboratory Manual, 1995 [0094]

\bulletGUBLER; HOFFMAN. Gene, 1983, vol. 25, 263-269 [0097]

\bulletBENTON; DAVIS. Science, 1977, vol. 196, 180-182 [0098]

\bulletGRUNSTEIN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1975, vol. 72, 3961-3965 [0098]

\bullet PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 1990 [0099]

\bulletGUNTHAND et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1998, vol. 14, 869-876 [0100]

\bulletKOZAL et al. Nat. Med., 1996, vol. 2, 753-759 [0100]

\bulletMATSON et al. Aral. Biochem., 1995, vol. 224, 110-106 [0100]

\bulletLOCKHART et al. Nat. Biotechnol, 1996, vol. 14, 1675-1680 [0100]

\bulletGINGERAS et al. Genome Res, 1998, vol. 8, 435-448 [0100]

\bulletHACIA et al. Nucleic Acids Res., 1998, vol. 26, 3865-3866 [0100]

\bulletPALVA et al. Gene, 1983, vol. 22, 229-235 [0104]

\bulletMOSBACH et al. Nature, 1983, vol. 302, 543-545 [0104]

\bulletCOLLEY et al. J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, 17619-17622 [0112]

\bullet Guide to Protein Purification. Methods in Enzymology. 1990, vol. 182 [0112]

\bulletMORRISON. J. Bact, 1977, vol. 132, 349-351 [0112]

\bulletCLARK-CURTISS; CURTISS et al. Methods in Enzymology, 1983, vol. 101, 347-362 [0112]

\bulletSCOPES. Protein Purification: Principles and Practice, 1982 [0116]

\bulletHARLOW; LANE. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 [0125]

\bulletCOLIGAN. Current Protocols in Immunology, 1991 [0126]

\bulletHARLOW; LANE; GODING. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 1986 [0126]

\bulletHUSE et al. Science, 1989, vol. 246, 1275-1281 [0126] [0129]

\bulletWARD et al. Nature, 1989, vol. 341, 544-546 [0126]

\bulletKOHLER; MILSTEIN. Eur. J. Immunol., 1976, vol. 6, 511-519 [0129]

\bullet Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology. 1993, vol. 37 [0132]

\bulletKRONVAL et al. J. ImmunoL, 1973, vol. 111, 1401-1406 [0133]

\bulletAKERSTROM et al. J. Immunol., 1985, vol. 135, 2589-2542 [0133]

\bulletMONROE et al. Amer. Clin. Prod. Rev, 1986, vol. 5, 34-41 [0141]

\bulletMethods in Enzymology, 1994, vol. 96, 237, [0155]

\bulletBOURNE et al. Nature, 1991, vol. 10 (349), 117-27 [0155]

\bulletBOURNE et al. Nature, 1990, vol. 348,125-32 [0155]

\bulletPITCHER et al. Annu. Rev. Biochem., 1998, vol. 67, 653-92 [0155]

\bulletACKERMAN et al. New Engl. J. Med, 1997, vol. 336, 1575-1595 [0157]

\bulletHAMIL et al. PFlugers. Archie, 1981, vol. 391, 85 [0157]

\bulletVESTERGARRD-BOGIND et al. J. Membrane Biol, 1988, vol. 88, 67-75 [0157]

\bulletGONZALES; TSIEN. Chem. Biol., 1997, vol. 4, 269-277 [0157]

\bulletDANIEL et al. J. PharmacoL Meth, 1991, vol. 25, 185-193 [0157]

\bulletHOLEVIN SKY et al. J. Membrane Biology, 1994, vol. 137, 59-70 [0157]

\bulletWILKIE et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 10049-10053 [0159]

\bulletBERRIDGE; IRVINE. Nature, 1984, vol. 312, 315-21 [0160]

\bulletALTENHOFEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1991, vol. 88, 9868-9872 [0161]

\bulletDHALLAN et al. Nature, 1990, vol. 347, 184-187 [0161]

\bulletOFFERMANNS; SIMON. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 15175-15180 [0162] [0163]

\bulletFELLEY-BOSCO et al. Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol, 1994, vol. 11, 159-164 [0163]

\bulletFURKA. Int. J. Pept. Prof. Res, 1991, vol. 37, 487-493 [0170]

\bulletHOUGHTON et al. Nature, 1991, vol. 354, 84-88 [0170]

\bulletHOBBS et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6909-6913 [0170]

\bulletHIRSCHMANN et al. J. Amer. Chem. Sac, 1992, vol. 114, 9217-9218 [0170]

\bulletCHEN et al. J. Amer. Chem. Sac, 1994, vol. 116, 2661 [0170]

\bulletCHO et al. Science, 1993, vol. 261, 1303 [0170]

\bulletCAMPBELL et al. J Org. Chem., 1994, vol. 59, 658 [0170]

\bulletVAUGHN et al. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14(3), 309-314 [0170]

\bulletLIANG et al. Science, 1996, vol. 274, 1520-1522 [0170]

\bullet benzodiazepines. Baum C&EN,18 January 1993, 33 [0170]

\bulletMERRIFIELD. J. Am. Chem. Soc., 1963, vol. 85, 2149-2154 [0179]

\bulletGEYSEN et al. J. Immun. Meth., 1987, vol. 102, 259-274 [0179]

\bulletFRANK; DORING. Tetrahedron, 1988, vol. 44, 60316040 [0179]

\bulletFODOR et al. Science, 1991, vol. 251, 767-777 [0179]

\bulletSHELDON et al. Clinical Chemistry, 1993, vol. 39(4), 718-719 [0179]

\bulletKOZAL et al. Nature Medicine, 1996, vol. 2 (7), 753759 [0179]

\bulletSINGER et al. Biotechniques, 1986, vol. 4, 230-250 [0187]

\bulletHAASE et al. Methods in Virology, 1984, vol. VII, 189-226 [0187]

\bullet Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach. 1987 [0187]

\bullet Remington's Pharma:eutical Sciences. 1985 [0190]

\bulletDULAC; AXEL. Cell, 1995, vol. 83, 195-206 [0198]

\bulletOFFERMANS; SIMON. J. Biol. Chem, 1995, vol. 270, 15-175-15180 [0201]

\global\parskip0.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de aminoácidos de GPCR-B4 de rata - SEQ ID NO:1

1

Secuencia de aminoácidos de GPCR-B4 de ratón - SEQ ID NO:2

2

\newpage

Secuencia de nucleótidos de GPCR-B4 de rata - SEQ ID NO:3

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de nucleótidos de GPCR-B4 de ratón - SEQ ID NO:4

5

6

\newpage

Secuencia de aminoácidos de GPCR-B4 humano - SEQ ID NO:7

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de nucleótidos de GPCR-B4 humano - SEQ ID NO:8

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> The Regents of the University of California

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Ácidos nucleicos que codifican un receptor acoplado a proteínas G implicado en la transducción sensorial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> N81520 DMG PJC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 99938846.5 (PCT/US99/17104)

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 27-07-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/095.464

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 28-07-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/112.747

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 17-12-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 843

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos del receptor acoplado a proteínas G (GPCR)-B4 de rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 843

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos del receptor acoplado a proteínas G (GPCR)-B4 de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2993

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de nucleótidos del receptor acoplado a proteínas G (GPCR)-B4 de rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2532

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de nucleótidos del receptor acoplado a proteínas G (GPCR)-B4 de ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos codificada por un cebador degenerado usado para amplificar el GPCR-B4 específico de células del gusto

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos codificada por un cebador degenerado usado para amplificar el GPCR-B4 específico de células del gusto

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Met Arg Tyr His Gly Pro Tyr Val Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 669

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos del receptor acoplado a proteínas G (GPCR)-B4 humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2010

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de nucleótidos del receptor acoplado a proteínas G (GPCR)-B4 humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos codificada por cebadores degenerados usados para la amplificación por PCR de restos altamente conservados en la zona entre los dominios transmembranales 6 y 7 de los receptores VR/mGluR/CaST/GPCR-B3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Tyr o Asn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Phe Asn Glu Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos codificada por cebadores degenerados usados para la amplificación por PCR de restos altamente conservados en la zona entre los dominios transmembranales 6 y 7 de los receptores VR/mGluR/CaST/GPCR-B3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Ile o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Cys Tyr Xaa Ile}

Claims (37)

1. Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico codifica un receptor que se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra la SEQ ID NO:1.

3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico codifica un receptor que tiene una actividad de receptor acoplado a proteínas G.

4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el ácido nucleico codifica un receptor que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

5. La secuencia de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

6. El ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico es de rata.

7. El ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ácido nucleico es amplificado por cebadores que se hibridan selectivamente en condiciones de hibridación restringidas a la misma secuencia que los conjuntos de cebadores degenerados que codifican secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

SAGGPMCFLM (SEQ ID NO:5) y WMRYHGPYVF (SEQ ID NO:6).

8. El ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ácido nucleico codifica un receptor que tiene un peso molecular entre aproximadamente 92 kDa y aproximadamente 102 kDa.

9. Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, en el que el ácido nucleico se hibrida específicamente en condiciones muy restringidas a un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:3, en el que las condiciones comprenden formamida al 50%, 5 x SSC y SDS al 1%, incubación a 42ºC o 5 x SSC, SDS al 1%, incubación a 65ºC, con lavado en 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC.

10. Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, en el que el ácido nucleico se hibrida selectivamente en condiciones de hibridación moderadamente restringidas a una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

11. Un receptor aislado acoplado a proteínas G para la transducción sensorial codificado por un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un receptor aislado acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, que presenta una identidad de secuencias de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

13. El receptor aislado de la reivindicación 12, en el que el receptor se une específicamente a anticuerpos policlonales generados contra SEQ ID NO:1.

14. El receptor aislado de la reivindicación 12 ó 13, en el que el receptor posee una actividad de receptor acoplado a proteínas G.

15. El receptor aislado de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el que el receptor tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

16. El receptor aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que el receptor es de rata.

17. Un anticuerpo que se une selectivamente al receptor de SEQ ID NO:1.

18. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

19. Una célula hospedante transfectada con el vector de la reivindicación 18.

\newpage

20. Un método para identificar un compuesto que modula la señalización sensorial en las células sensoriales, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i)

poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de secuencias de aminoácidos mayor que aproximadamente 70% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y

(ii)

determinar el efecto funcional del compuesto sobre el receptor.

21. Un método para identificar un compuesto que modula la señalización sensorial en las células sensoriales, comprendiendo dicho método las etapas de:

(i)

poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de secuencias de aminoácidos mayor que aproximadamente 80% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y

(ii)

determinar el efecto funcional del compuesto sobre el receptor.

22. El método de la reivindicación 20 ó 21, en el que el polipéptido es un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, presentando dicho receptor una identidad de secuencias de aminoácidos mayor que aproximadamente 90% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

23. El método de la reivindicación 20 ó 21, en el que el polipéptido comprende un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial que está unido covalentemente a un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico.

24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el polipéptido tiene una actividad de receptor acoplado a proteínas G.

25. El método de la reivindicación20, en el que el receptor está unido a una fase sólida.

26. El método de la reivindicación 25, en el que el receptor está unido covalentemente a una fase sólida.

27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que el efecto funcional se determina midiendo los cambios en cAMP, IP3 o Ca^{2+} intracelular.

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que el efecto funcional es un efecto químico.

29. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que el efecto funcional es un efecto físico.

30. El método de la reivindicación 20, en el que el efecto funcional se determina midiendo la unión del compuesto al receptor.

31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 30, en el que el polipéptido es recombinante.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 31, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

33. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que el polipéptido se expresa en una célula o membrana celular.

34. El método de la reivindicación 33, en el que la célula es una célula eucariota.

35. Un método para preparar un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, comprendiendo dicho método la etapa de expresar el receptor a partir de un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

36. Un método para preparar una célula recombinante que comprende un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, comprendiendo dicho método la etapa de transducir la célula con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

37. Un método para preparar un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor acoplado a proteínas G para la transducción sensorial, comprendiendo dicho método la etapa de ligar a un vector de expresión el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.