MXPA01000902A - Acidos nucleicos que codifican un receptor acoplado con proteina-g que participa en transduccion sensorial - Google Patents
Acidos nucleicos que codifican un receptor acoplado con proteina-g que participa en transduccion sensorialInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a secuencias aisladas deácido nucléico y aminoácidos de receptores acoplados con proteína G específicos de células sensoriales, anticuerpos para dichos receptores, métodos para detectar losácidos nucléicos y los receptores y los métodos para seleccionar los moduladores de los receptores acoplados con proteína G específicos de células sensoriales.
Description
ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UN RECEPTOR ACOPLADO CON PROTEÍNA-G QUE PARTICIPA EN TRANSDUCCIÓN SENSORIAL
REFERENCIAS CRUZADAS CON REFERENCIA A LAS SOLICITUDES Esta solicitud reclama prioridad a USSN 60/095,464, presentada el Julio 28, 1998, y USSN 60/112,747, presentada el Diciembre 17, 1998, las cuales se incluyen en el presente por referencia en su totalidad.
DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO FEDERALMENTE PATROCINADAS Esta invención se hizo con apoyo del gobierno bajo la Concesión No. 5R01 DC03160, aprobada por los Institutos Nacionales Sanitarios. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona secuencias separadas de ácido nucleico y aminoácidos de receptores acoplados con proteína-G específicos de células sensoriales, anticuerpos para dichos receptores, métodos para detectar dichos ácidos nucleicos y receptores y métodos de selección pa?~a moduladores de receptores acoplados con proteína-G específica de células sensoriales.
• * ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La transducción de sabores es una de las formas más sofisticadas de quimiotransducción en animales ( ver, por ejemplo, Margolskee, BioEssays 15:645-650 (1993); Avent & Lindemann, J. Membrane Biol . 112:1-8 (1989)). La señalización de sabor se encuentra en todo el reino animal, desde el más simple de los metazoarios hasta el más complejo de les vertebrados; su propósito principal es proporcionar una respuesta confiable de señalización para ligandos no volátiles. Cada una de estas modalidades, sin embargo, tiene que ser mediada por distintas rutas de señalización mediadas por receptores o canales, que conducen a la despolarización de células receptoras, generación de un receptor o potencial de acción, y liberación de neurotransmisor en la sinapsis ce neuronas aferentes gustativas (ver, por ejemplo, Roper, Anrt. Rev. Neurosci . 12:329-353 (1989)). Se cree que los mamíferos tienen cinco modalidades básicas del gusto; dulce, amargo, agrio, salado y unami (el sabor del glutamato monosódico) (ver, por ejemplo, Kawamura & Kare, Introduction to Unami : A Basic Taste (1987); Kinnamon & Cummings, Ann . Rev. Physiol . 54:715-731 (1992); Lindemann, Physiol . Rev. 76:718-766 (1996); Stewart y colaboradores, Ar . J. Physiol . 272:1-26 (1997)). Extensos estudios psicofísicos en los humanos han informado que diferentes regiones de ]a lengua desarrollan diferentes preferencias gustativas (ver,
^üH^^^^^=3¡^?£ por ej emplo, Hoffmann, Menchen . Arch . Path . Anat . Physiol . 62:516-530 (1875); Bradley y colaboradores, Anatomical Record 212:246-249 (1985); Miller & Reedy, Physiol . Beba . 47: 1213-1219 (1990) ) . También, numerosos estudios fisiológicos en animales han demostrado que las células receptoras del gust.o pueden responder selectivamente a diferentes emisores de sabor (ver, por ejemplo, Akabas y colaboradores, Science 242:1047-1050 (1996); Gilbertson y colaboradores, J. Gen . Physiol . 100:803-24 (1992); Bernhardt y colaboradores, J. Physiol . 490:325-336 (1996); Cummings y colaboradores, J. Neurophysiol . 75:1256-1263 (1996)). En los mamíferos, las células receptoras del gusto se reúnen en papilas gustativas que se distribuyen en diferentes papilas en el epitelio de la lengua. Las papilas circunvaladas, se encuentran hasta atrás de la lengua, contienen cientos (ratones) a miles (humanos) de papilas gustativas que son particularmente sensibles a las sustanciéis amargas. Las papilas foliadas, localizadas en el borde lateral posterior de la lengua, contiene docenas a cientos de papilas gustativas y son sensibles particularmente a las sustancias agrias y amargas. Las papilas fungiformes que contienen una sola papila o algunas cuantas papilas gustativas se encuentran en la parte delantera de la lengua y se piensa que median mucho de la modalidad del sabor dulce.
$*&s ^ ^^¡&&&?^ Cada papila gustativa, defendiendo de la especie, contiene 50-150 células, incluyendo células precursoras, células de apoyo y células receptoras de sabor (por ejemplo, ver Lindmann, Phsiol . Rev. 76:718-766 (1996)). Las céluleis receptoras están provistas de nervios en su base mediante terminaciones de nervios aferentes que transmiten la información a los centros gustativos de la corteza a través de la sinapsis en el tallo del cerebro y el tálamo. Expliccir los mecanismos del proceso de señalización e información de células gustativas es crítico para entender la función, regulación y "percepción" del sentido del gusto. Aunque se sabe mucho acerca de la psicofísica y fisiología de la función de las células del gusto, se sabe muy poco acerca de las moléculas y los caminos que medióin estas respuestas de señalización sensorial (revisado por Gilbertson, Current Opn . In Neurobiol . 3:535-539 (1993)). Los estudios electrofisiológicos sugieren que los emisores de sabor agrio y salado modulan la función de la célula gustativa mediante entrada directa de iones H+ y Na+ a través de canales de membranas especializados en la superficie apical de la célula. En el caso de los compuestos agrios, se tiene la hipótesis de que la despolarización de céluleis gustativas resulta del bloqueo de H+ de los canales K+ (ver, por ejemplo, Kinnamon y colaboradores, Proc. Nat 'l Acad. Sci . USA 85: 7023-7027 (1998)) o la activación de canales sensibles al pH ( ver, por ejemplo, Gilbertson y colaboradores, J. Gen . Physiol . 100: 803-24 (1992)); I.a transducción de la sal puede ser parcialmente mediada por ..a entrada de Na+ vía los canales de Na+ sensibles a amiloridas (ver, por ejemplo, Heck y colaboradores, Nature 223: 403-405 (1984): Brand y colaboradores, ' Brain Res . 207-214 (1985); Avent y colaboradores, Nature 331: 351-354 (1988). Se cree que la transducción de lo dulce, amargo y unami está mediado por las rutas de señalización del receptor acoplado con proteína-G (GPCR) ( ver, por ejemplo, Striem y colaboradores, Biochem. J. 260:121-126 (1989); Chaudhari y colaboradores, J. Neuros . 16:3817-3826 (1996); Wong y colaboradores, Nature 381: 796-800 (1996)). De manera confusa, existen casi tantos modelos de rutas de señalización para la transducción dulce y amarga como la existencia de enzimas efectoras para cascadas de GPCR (por ejemplo, unidades secundarias de proteína-G, fosfodiestrasa de cGMP, C fosfolipasa, ciclaso de adenilato; ver, por ejemplo, Kinnamon & Margolskee, Curr. Opin . Neurobiol . 6:506-513 (1996)). Sin embargo, se sabe muy poco acerca de los receptores de membranas específicas envueltos en transducción de sabores, o muchas de las moléculas de señalización intracelular individuales activadas por las rutas de transducción de sabor individuales. La identificación de dichas moléculas es importante dado las numerosas aplicaciones farmacológicas y de la industria de la alimentación para antagonistas amargos, agonistas dulces y moduladores del sabor saldado y agrio. La identificación y separación de los receptores degustativos (incluyendo los canales de iones de degustación) , y las moléculas de señalización gustativa, tales como las unidades secundarias de proteína-G y lcis enzimas envueltas en transducción de señales, permitiría la modulación farmacológica y genética de las rutas de transducción gustativa. Por ejemplo, la disponibilidad de moléculas receptoras y de canales permitiría la selección de agonistas, antagonistas, agonistas inversas de alta afinideid y moduladores de la actividad celular gustativa. Dichos compuestos de modulación gustativa podrían entonces usarse €>n las industrias farmacéuticas y de alimentos para producir sabores especializados. Además, dichas moléculas especificáis de células gustativas pueden servir como herramientais invaluables en la generación de mapas topográficos de degustación que expliquen la relación entre las células gustativas de la lengua y las neuronas sensoriales del gusto que conducen a los centros del gusto en el cerebro.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención de ese modo proporciona por primera vez ácidos nucleicos de codificación de un receptor acoplado con proteína-G específico de células gustativas.
Estos ácidos nucleicos y los polipéptidos que éstos codifican se denominan "GPCR-B4" para el receptor acoplado con proteína-G ( "GPCR" ) B4. Estos GPCRs específicos de células degustativas son componentes de la ruta de transducción de degustación. En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico separado que codifica un receptor acoplado con proteína-G de transducción sensorial, el receptor comprende más de aproximadamente 70% de identidad aminoácida para una secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, o SEQ ID NO: 7. En una forma de realización, el ácido nucleico comprende una secuencia nucleótida de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 8. En otra forma de realización, el ácido nucleico es amplificado mediante iniciadores que selectivamente producen híbridos bajo condiciones estrictcLS de hibridación en la misma secuencia que los conjuntos de iniciadores degenerados que codifican secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste d : SAGGPMCFLM (SEQ ID NO: 5) y WMRYHGPYVF (SEQ ID NO: 6). En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico separado que codifica a un receptor acoplado con proteína-G de transducción sensorial, en donde el ácido nucleico específicamente produce híbridos bajo condiciones
altamente estrictas para un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO : 3 , SEQ ID N0:4, ó SEQ ID NO: 8. En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico separado que codifica un receptor acoplado con proteína-G de transducción sensorial, el receptor comprence más de aproximadamente 70% de identidad aminoácida para m polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:l, SEQ ID N0:2, ó SEQ ID NO : 7 , en donde el ácido nucleico selectivamente produce híbridos bajo condiciones cié hibridación moderadamente estrictas para una secuencia ¿le nucleótidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , ó SEQ ID NO : 8. En otro aspecto, la presente invención proporciona m ácido nucleico aislado que codifica un dominio extracelular de un receptor acoplado con proteína-G de transducción sensorial, el dominio extracelular tiene más de aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio extracelular de SEQ ID NO:l. En otro aspecto, la presente invención proporciona in ácido nucleico aislado que codifica un dominio transmembrana de un receptor acoplado con proteína-G de transducción sensorial, el dominio transmembrana comprende más ele aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio transmembrana de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7.
¡^^?¿^j»^¡ s¿s^ij^ En otro aspecto, la presenté invención proporciona un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial aislado, el receptor comprende más de aproximadamente 70% cié identidad de secuencia de aminoácido para una secuencia de aminoácidos de SED ID NO:l. En otra forma de realización, el receptor específicamente se une a anticuerpos policlonales generados contra SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7. En otra forma de realización el receptor tiene actividad de receptor acoplado con proteína-G. En otra forma de realización, e'l receptor tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7. En otra forma de realización, el receptor es de un humano, una rata o un ratón. En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende un dominio extracelular de un receptor acoplado con proteína-G de transducción sensorial, el dominio extracelular comprende más de aproximadamente 70% de la identidad de secuencia del aminoácido para el dominio extracelular de SEQ ID NO:l. En una forma de realización, el polipéptido codifica el dominio extracelular de SEQ ID NO:l. En otra forma de realización, el dominio extracelular está enlazado de manera covalente a un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende un dominio transmembrana de un receptor acoplado con proteína-G de transducción sensorial, el dominio transmembrana comprende más de aproximadamente 70% de la identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio transmembrana de SEQ ID NO:l. En una forma de realización, el polipéptido codifica el dominio transmembrana de SEQ ID NO:l. En otra forma de realización, el polipéptido comprende además un dominio citoplásmico que comprende más de aproximadamente 70% de la identidad del aminoácido para el dominio citoplásmico de SEQ ID NO:l. En otra forma de realización, el polipéptico codifica el dominio citoplásmico de SEQ ID NO : 1. En otra forma de realización el dominio transmembrana está unido ce manera covalente a un polipéptido heterólogo, formando in polipéptido quimérico. En otra forma de realización, el polipéptido quimérico tiene actividad de receptor acoplado con proteína-G. En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que selectivamente se une al receptor que comprende más de aproximadamente 70% de la identidad de secuencia de aminoácidos para una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , ó SEQ ID NO : 7. ////En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un ácido
aá^^^^^^i^i^ nucleico que codifica a un polipéptido que comprende más de aproximadamente 70% de la identidad de secuencia de aminoácidos para una secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, ó SEQ ID NO : 7. En otros aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped transfectada con el vector de expresión. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un compuesto que modula señalizacicn sensorial en células sensoriales, el método comprende los pasos de: (i) poner en contacto el compuesto con in polipéptido que comprende un dominio extracelular de in receptor acoplado con proteína-G de transducción sensorial , el dominio extracelular comprende más de aproximadamente 7C% de la identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio extracelular de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7; y (ii) determinar el efecto funcional del compuesto en e'l dominio extracelular. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un compuesto que modula J.a señalización sensorial en las células sensoriales, el método comprende los pasos de: (i) poner en contacto al compuesto e;n un polipéptido que comprende un dominio extracelular de un receptor acoplado con proteína-G con transducción sensoria]., el dominio transmembrana comprende de más de aproximadamente 70% de la identidad de secuencia del aminoácido para el dominio extracelular de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , ó SEQ ID NO: 3; y (ii) determinar el efecto funcional del compuesto en el dominio transmembrana. En una forma de realización, el polipéptido es un receptor acoplado con proteína-G con transducción sensorial, el receptor comprende más de aproximadamente 70% de identidad de aminoácido para un polipéptido que codifica SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: , ó SEQ ID NO: 7. En otra forma de realización, el polipéptido comprende un dominio extracelular que está unido de manera covalente a un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico. En otra forma de realización, el polipéptido tiene actividad del receptor acoplado ccn proteína-G. En otra forma de realización, el dominio extracelular está unido a una fase sólida, ya sea de manera covalente o no covalente. En otra forma de realización, el efecto funcional se determina midiendo los cambios en AMPc , IP3 intracelular, o Ca2+. En otra forma de realización, el efecto funcional es un efecto químico. En otra forma ce realización, el efecto funcional es un efecto químico. E!n otra forma de realización, el efecto funcional se determira midiendo la unión del compuesto al dominio extracelular. E¡n otra forma de realización, el polipéptido es recombinante. Ein otra forma de realización, el polipéptido se expresa en una célula o membrana celular. En otra forma de realización, la célula es una célula eucariótica.
«gé&£&^ En una forma de realización, el polipéptido comprende un dominio transmembrana que está enlazado de manera covalente a un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para hacer un receptor acoplado con proteína-G con transducción sensorial, el método comprende el paso de expresar el receptor desde un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica al receptor, en donde la secuencia de aminoácido del receptor comprende más de aproximadamente 70% de la identidad de aminoácido para un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , ó SEQ ID NO : 7. En un aspecto, la presente invención proporciona ?n método para hacer una célula recombinante que comprende m receptor acoplado con proteína-G con transducción sensorial , el método comprende el paso para transducir la célula con in vector de expresión que comprende un ácido nucleico qte codifica al receptor, en donde la secuencia de aminoácido de'l receptor comprende más de aproximadamente 70% de la identidad de aminoácido para un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para elaborar un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica a un receptor
___t?j__^¿S¡_jí____ acoplado con proteína-G con transducción sensorial, el métoco comprende el paso de ligar a un vector de expresión un ácido nucleico que codifica al receptor, en donde la secuencia del aminoácido del receptor comprende más de aproximadamente 70% 5 de la identidad del aminoácido para un polipéptido que tiere una secuencia de SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , ó SEQ ID NO : 7. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS No aplica DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 10 I . Introducción La presente invención proporciona por primera v z ácidos nucleicos que codifican un receptor acoplado con proteína-G especifico de células gustativas. Estos ácidos nucleicos y los receptores que éstos codifican son
denominados como "GPCR" para receptor acoplado con proteínai- G, y se designan como GPCR-B4. Estos GPCR específicos de células gustativas son componentes de la ruta de transducción de degustación ( ver, por ejemplo, Ejemplo II) . Estos ácidos nucleicos proporcionan medidores valiosos para la
identificación de células gustativas, ya que los ácidos nucleicos se expresan específicamente en las célulaLS gustativas. Por ejemplo, medidores para polipéptidos de GPCR y proteínas se pueden usar para identificar subconjuntos de células gustativas tales como células foliadas y células
circunvalados o células específicas de receptores gustativos,
por ejemplo, dulce, agrio, salado y amargo. También sirven como herramientas para la generación de mapas topográficos de degustación que explican la relación entre las células gustativas de la lengua y las neuronas sensoriales del gusto que conducen a los centros de degustación en el cerebro . Además, los ácidos nucleicos y las proteínas que éstos codifican se pueden usar como medidores para analizar cuidadosamente los comportamientos inducidos por la degustación. La invención también proporciona métodos de selección de moduladores, por ejemplo, activadores, inhibidores, estimuladores, intensificadores, agonista y antagonistas, de estos nuevos GPCR de células gustativas. Dichos moduladore'S de transducción degustativa son útiles para la modulación farmacológica y genética de las rutas de señalización degustativa. Estos métodos de selección se pueden usar para identificar antagonistas y agonistas de alta afinidad de actividad celular degustativa. Estos compuestos modulatorios pueden entonces usarse por las industrias de alimentos y farmacéuticas para producir sabores especializados. De este modo, la invención proporciona ensayos para modulación degustativa, donde el GPCR-B4 actúa como una molécula informadora directa o indirecta para el efecto de los moduladores sobre la transducción degustativa. Los GPCR se pueden usar en ensayos, por ejemplo, para medir cambios en la concentración de iones, el potencial de las membranas, e'l flujo de corriente, el flujo de iones, la trascripción, la transducción de señales, las interacciones entre receptores y ligandos, las concentraciones de segundos mensajeros, m vi tro, in vivo, y ex vivo . En una forma de realización, el GPCR-B4 se puede usar como una informador indirecto vía la unión a una segunda molécula informadora tal como la proteína verde fluorescente ( ver, por ejemplo, Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15:961-964 (1997). En otra forma de realización, los GPCR-B4 se expresan de manera recombinan e en las células, y la modulación de la transducción degustativa vía la actividad del GPCR se ensaya midiendo los cambios en los niveles de Ca2+ ( ver Ejemplo II) . Los métodos de ensayo de los moduladores de transducción degustativa incluyen ensayos de unión de ligandos in vi tro usando GPCR-B4, porciones de los mismos tales como el dominio extracelular, o proteínas quimericéis que comprenden uno o más dominios de GPCR-B4, expresión de GPCR-B4 de oocito; expresión de GPCR-B4 de célula de cultivo de tejido; activación transcripcional de GPCR-B ; fosforilación y desfosforilación de GPCRs; unión de proteína-G a los GPCRs; ensayos que unen ligandos; voltaje potencial de membrana y cambios de conductancia; ensayos de flujo iónico; cambios en los segundos mensajeros intracelulares tales como AMPc y trifosfato de inositol; cambios en los
__|______^^_______^_____3___¡____-niveles de calcio intracelular; y liberación de neurotransmisores . Finalmente, la invención proporciona los métodos para detectar expresión de ácido nucleico y proteína de GPCR-B , permitiendo la investigación de la regulación de transducción degustativa y la identificación específica de las células receptores degustativas . GPCR-B4 también proporciona útiles medidores de ácidos nucleicos para investigaciones ce paternidad y forenses. GPCR-B4 es útil como medidor de ácidos nucleicos para identificar poblaciones secundarias de células receptoras degustativas tales como células receptoras degustativas foliadas, fungiforme, y circunvalados. Los receptores de GPCR-B4 también se pueden usar para generar anticuerpos monoclonales y policlonales útiles par-a identificar a las células receptoras degustativas. Éstas e.e pueden identificar usando técnicas tales como la trascripción inversa y la amplificación de ARNm, aislamientos del AF_N total o poli A+ ARN, northern blotting, dot blotting, hibridación in si tu, protección de Rnasa, digestión Si , series de microchips de ADN de medición, western blots, y similares . Funcionalmente, GPCR-B4 representa un receptor acoplado con proteína-G de siete transmembranas que participa en la transducción degustativa, que interactúa con una proteína-G para mediar transducción de señales degustativas ( ver, por ejemplo, Fong, Cell Signal 8:217 (1996); Balwin, Curr. Opin . Cell Biol . 6:180 (1994)). Estructuralmente, la secuencia de nucleótidos ce GPCR-B4 ( ver, por ejemplo, SEQ ID NO:3-4 y 8, separados ce rata, ratón y humano respectivamente) codifica un polipéptico de aproximadamente 842 aminoácidos con un peso molecular pronosticado de aproximadamente 97 kDa y un margen pronosticado de 92-102 kDa ( ver, por ejemplo, SEQ ID NO: 1-2 y 7, aislado de rata, ratón y humano) . Genes de GPCR-E.4 relacionados de otras especies comparten por lo menos aproximadamente 70% de la identidad de aminoácido sobre ura región de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos en longitud, opcionalmente 50 a 100 aminoácidos en longitud. El GPCR-B4 se expresa específicamente en las células foliadas y fungiformes, con poca expresión en las células receptoras degustativas circunvalados de la lengu . El GPCR-B4 es una secuencia moderadamente rara encontrada e'n aproximadamente 1/150,000 ADNcs de una biblioteca de ADNc circunvalados con iniciador de oligo-dT (ver Ejemplo I) . La presente invención también proporciona variante'S polimórficas del GPCR-B4 representado en SEQ ID NO:.: variante #1, en donde un residuo de isoleucina es substituido por un residuo de ácido de leucina en la posición de¡l aminoácido 8; variante #2, en donde un residuo de ácido aspártico es substituido por un residuo de ácido glutámico en la posición de aminoácido 26; y variante #3, en donde un residuo de glicina es substituido por un residuo de alanina en la posición de aminoácido 46. Regiones específicas de la secuencia de nucleótidos y 5 aminoácidos de GPCR-B4 se pueden usar para identificar variantes polimórficas, homólogos interespecies, y alelos cié GPCR-B4. Esta identificación se puede hacer in vi tro, por ejemplo, bajo condiciones estrictas de hibridación o PCR (usando iniciadores que codifican SEQ ID NO: 5-6) y dando
secuencia o usando la información de las secuencias en un sistema de cómputo para comparación con otras secuencias de nucleótidos. Típicamente, la identificación de variantes polimórficas y alelos de GPCR-B4 se hace comparando una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 25 aminoácidos o
más, por ejemplo, 50-100 aminoácidos. La identidad de'l aminoácido de aproximadamente por lo menos 70% o máei, opcionalmente 80% ó 90-95% o más típicamente demuestra que una proteína es una variante polimórfica, homologa interespecies, o alelo de GPCR-B4. La comparación de
secuencias se puede realizar usando cualesquiera de los algoritmos de comparación de secuencias discutidos a continuación. Los anticuerpos que se unen específicamente al GPCR-B4 o a una región conservada del mismo también se puede;n usar para identificar alelos, homólogos interespecies y 5 variantes polimórficas .
,& Las variantes polimórficas, los homólogos mterespecies y los alelos de GPCR-B4 se confirman examinando la expresión específica de las células degustativas del polipéptido de GPCR-B4 putativo. Típicamente, el GPCR-B4 qte tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1-2 ó 7 se uea como un control positivo en comparación con la proteína ce GPCR-B4 putativa para demostrar la identificación de ura variante polimórfica o alelo de GPCR-B4. Se espera que las variantes polimórficas, los alelos y los homólogos interespecies conserven la estructura de siete transmembranas de un receptor acoplado con proteína-G. La información de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de GPCR-B4 puede también usarse para construir modelos de polipéptidos específicos de células degustativas en un sistema de cómputo. Estos modelos se usan subsecuentemente para identificar compuestos que pueden activar o inhibir el GPCR-B4. Dichos compuestos que modulan la actividad del GPCR-B4 se pueden usar para investigar el papel del GPCR-B4 en la transducción degustativa. El aislamiento del GPCR-B4 por primera v z proporciona un medio para ensayar inhibidores y activadores de transducción de gusto de receptores acoplados de proteína -G. El GPCR-B4 biológicamente activo es útil para hacer pruebas en los inhibidores y activadores del GPCR-B4 como transductores de gusto usando la expresión in vivo e in vi tro que mide por ejemplo, la activación transcripcional del GPCP- B4 ; la unión de los ligandos; la fosforilación y desfosforilación; la unión a las proteínas-G; la activación de proteínas-G; la fijación de moléculas reguladoras; cambios 5 de voltaje, potencial de membranas y conductancia; flujo iónico; segundos mensajeros intracelulares tales como AMPc y trifosfato de inositol; niveles de calcio intracelular; y liberación de neurotransmisores. Dichos activadores e inhibidores identificados usando GPCR-B4, se pueden usar para
estudiar más la transducción de sabor e identificar a los agonistas y antagonistas específicos de gusto. Dichos activadores e inhibidores son útiles como agentes farmacéuticos y alimenticios para personalizar los sabores. Los métodos para detectar los ácidos nucleicos de
GPCR B4 y la expresión de GPCR-B4 también 'son útiles para identificar la células degustativas y crear mapas topológicos de la lengua y la relación de las células receptoras degustativas de la lengua con las neuronas sensoriales degustativas en el cerebro. La localización de cromosomas de
los genes que codifican el GPCR-B4 humano se puede usar para identificar enfermedades, mutaciones y características ocasionados por y asociados con GPCR-B4.
II. Definiciones Tal como se usa en el presente, los siguientes términos tienen los significados que se les aplica a menos que se especifique de otro modo. "Células receptoras degustativas" son las células neuroepiteliales que se organizan en grupos para formar papilas gustativas de la lengua, por ejemplo, células foliadas, fungiformes, y circunvaladas (ver, por ejemplo, Roper y colaboradores, Ann . Rev. Neurosci . 12:329-353 (1989) ) . "GPCR-B4" también denominado "TR2", se refiere al receptor acoplado con proteína-G que se expresa específicamente en las células receptoras degustativas tales como las células foliadas, fungiformes, y circunvaladas ( ver, por ejemplo, Hoon y colaboradores, Cell 96:541-551 (1999), en el presente incluidas por referencia en su totalidad. Dichas células gustativas se pueden identificar debido a que expresan moléculas específicas tales como Gustducina, una proteína-G específica de células gustativas (McLaughin y colaboradores, Nature 357:563-569 (1992). Las células receptoras del gusto también se pueden identificar sobre las base de la morfología ( ver, por ejemplo, Roper, ver arriba) . El GPCR-B4 tiene la capacidad para actuar como receptor para la transducción del gusto, como se describe en el Ejemplo II.
fesaAfe- .
El GPCR-B4 codifica los GPCRs con regiones de siete transmembranas que tienen "actividad de receptores acoplados con proteína-G", por ejemplo, éstos se unen a las proteínas-G en respuesta a los estímulos extracelulares y fomentan la producción de segundos mensajeros tales como IP3, AMPc, y Ca2+ vía la estimulación de enzimas tales como fosfolipasa C y ciclaso de adenilato (para una descripción de la estructura y función de los GPCRs, ver, por ejemplo, Fong, ver arriba) . El términos GPCR-B4 por lo tanto denomina a las variantes polimórficas, los alelos, mutantes y los homólogos interespecies que: (1) tienen aproximadamente 70% de la identidad de secuencia de aminoácido, opcionalmente casi 7? , 80, 85, 90 ó 95% de la identidad de secuencia de aminoácido para SEQ ID NO: 1-2 y 7 sobre una ventana de aproximadamente 25 aminoácidos, opcionalmente 50-100 aminoácidos; (2) se une'n a anticuerpos que surgen contra una sustancia imunógena que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NOS: 1-2 y 7 y variantes modificadas de manera conservadora de los mismos; (3) específicamente producen híbridos (con un tamaño de por lo menos aproximadamente 500, opcionalmente en por lo menos casi 900 nucleótidos) bajo condiciones estrictas de hibridación para una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 3 -4 y 8, y variantes conservadoramente modificadas de los mismos; o (4) se amplifican mediante iniciadores que específicamente producen híbridos bajo condiciones estrictas de hibridación para la misma secuencia como unos conjuntos de iniciadores degenerados que codifican SEQ ID NOS: 5-6. Topológicamente, los GPCR sensoriales tienen un "dominio extracelular" de terminal-N, un "dominio transmembrana" comprende regiones de siete transmembranas y lazos correspondientes citoplásmicos y extracelulares, y un "dominio citoplásmico" de terminal-C (ver, por ejemplo, Hoon y colaboradores, Cell 96:541-551 (1999); Buck & Axel, Cell 65:175-187 (1991)). Estos dominios pueden identificarse estructuralmente usando métodos conocidos para los expertos en la técnica, tales como programas de análisis de secuencias que identifican dominios hidrofóbicos e hidrofílicos (ver, por ejemplo, Kyte & Doolittle, J. Mol . Biol . 157:105-132 (1982) ) . Dichos dominios son útiles para hacer proteínas quiméricas y para ensayos in vi tro de la invención. "Dominio extracelular" denomina al dominio de GPCR-E4 que sale de la membrana celular y se une al ligando extracelular. Esta región empieza en el N-término y termir.a aproximadamente en el ácido glutámico conservado en la posición de aminoácido 563 más o menos aproximadamente 20 aminoácidos. La región que corresponde a aminoácidos 1-580 de SEQ ID NO:l (nucleótidos 1-1740, con el nucleótido 1 empezando en el codón de metionina iniciadora ATG) es una forma de realización de un dominio extracelular que eie
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extiende ligeramente en el dominio transmembrana. Esta forma de realización es útil para ensayos in vi tro que unen ligandos, tanto en fase soluble como en sólida. "Dominio transmembrana" , comprende regiones de siete transmembranas más los lazos correspondientes citoplásmicos y extracelulares, se refiere al dominio de GPCR-B4 que empieza aproximadamente en el residuo de ácido glutámico conservado en la posición de aminoácido 563 más o menos aproximadamente 20 aminoácidos y termina aproximadamente en el residuo de aminoácido de tirosina conservada en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos. "Dominio citoplásmico" denomina al dominio de GPCR-E4 que empieza en el residuo de aminoácido de tirosina conservada en la posición 812 más o menos aproximadamente 10 aminoácidos y continúa al C-término del polipéptido. "Muestra biológica" se usa en el presente como una muestra de tejido o líquido biológico que contiene GPCR-B4 o ácido nucleico que codifica a la proteína GPCR-B4. Dichas muestras incluyen, pero no se limitan, al tejido aislado de humanos, ratones y ratas, en particular, ton. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para fines histológicos . Una muestra biológica se obtiene típicamente de un organismo eucariótico, tal como insectos, protozoarios, aves, peces, reptiles y de preferencia mamíferos tales como rata, ratór., vaca, perro, conejillo de indias o conejo y de preferencia un primate tales como chimpancés o humanos. Los tejidos incluyen tejido de lengua, papilas degustativas aisladas y tejido de teste . "Actividad GPCR" se refiere a la habilidad de un GPCR para transducir una señal. Dicha actividad se puede medir en una célula heteróloga, acoplando un GPCR (o un GPCR quimérico) ya sea a una proteína-G o a una proteína-G promiscua tal como Gal5, y una enzima tal como PLC, y medir los aumentos en el calcio intracelular usando (Offermans & Simón, J. Biol . Chem. 270:15175-15180 (1995)). La actividad receptora se puede medir efectivamente registrando cambies inducidos en ligandos en [Caa+] i usando tintes fluorescentes indicadores de Ca2+ y reproducción de imágenes fluorométricae . Opcionalmente los polipéptidos de la invención se incluyen en la transducción sensorial, opcionalmente transducción ce sabor en células gustativas. La frase "efectos funcionales" en el contexto de los ensayos para pruebas de compuestos que modulan transducción de sabor con mediación de GPCR-B4 incluye la determinación ¿le cualquier parámetro que está directa o indirectamente bajo la influencia del receptor, por ejemplo, efectos funcionales, físicos y químicos. Esto incluye la unión de ligandos, los cambios en el flujo iónico, el potencial de las membranas, e'l flujo de corriente, la trascripción, la fijación de proteínas-G, fosforilación o defosforilación de GPCR, transducción de señales, interacciones de ligandos y receptores, concentraciones de segundos mensajeros (por ejemplo, AMPc, IP3, o Ca2+ intracelular), in vi tro, in vivo y ex vivo y también incluye otros efectos fisiológicos tales como aumentos o reducciones de liberación de neurotransmisores u hormonas . "Determinar el efecto funcional" quiere decir ensayos para un compuesto que aumenta o reduce un parámetro que está directa o indirectamente bajo la influencia de GPCR-B4, por ejemplo, efectos funcionales físicos y químicos. Dichos efectos funcionales se pueden medir por cualquier medio conocido para los expertos, por ejemplo, cambios en características espectroscópicas (por ejemplo, índice de fluorescencia, absorbencia, y refractivo) , propiedades hidrodinámicas (por ejemplo, forma) , cromatográficas o de solubilidad, fijación provisional, tintes sensibles al voltaje, corrientes de células enteras, emanación de radioisótopos, marcadores inducibles, expresión de GPCR-B4 ce oocitos; expresión de GPCR-B4 de células de cultivo ce tejido; activación transcripcional de GPCR-B4; ensayos de unión de ligandos; cambios de voltaje potencial de membranas y conductancia, ensayos de flujo iónico; cambios en segundos mensajeros intracelulares tales como AMPc y trifosfato de
__^_l________s___^___Wg_ inositol (IP3); cambios en niveles intracelulares de calcio; liberación de neurotransmisores y similares. "Inhibidores" , "activadores" , y "moduladores" de GPCR-B4 se usan de manera intercambiable para denominar a las moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras identificadas usando ensayos in vi tro e in vivo para transducción degustativa, por ejemplo, ligandos, agonista, antagonistas, y sus homólogos y miméticos. Los inhibidores son compuestos que, por ejemplo, se unen a, parcial o totalmente bloquean la estimulación, reducen, previenen, retardan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan de manera descendente la transducción degustativa, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son compuestos que, por ejemplo, se unen a, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, mejoran la activación de, sensibilizan o regulan de manera ascendente la transducción degustativa, por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen compuestos que, por ejemplo, alteran la interacción de un receptor con: proteínas extracelulares que unen activadores o inhibidores (por ejemplo, ebnerina y otros miembros de la familia portadora de hidrofóbicos) ; proteínas-G; quinasas (por ejemplo, homólogos de la quinasa rodopsina y de las quinasas receptoras beta adrenérgicas que participan en la desactivación y desensibilización de un receptor) ; y proteínas parecidas a arrestina, que también desactivan y
t-a-y.»»..«»-desensibilizan los receptores. Los moduladores incluyen versiones genéticamente modificadas de GPCR-B4, por ejemplc, con actividad alterada, así como versiones que ocurren ccn naturalidad y ligandos sintéticos, antagonistas, agonistas, moléculas químicas pequeñas y equivalentes. Dichos ensayes para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplc, expresar el GPCR-B4 en células o membranas celulares, aplicar los compuestos moduladores putativos, y después determinar los efectos funcionales sobre la transducción degustativa , como se describe anteriormente. Las muestras o ensayos q?e comprenden GPCR-B4 que reciben tratamiento con un activador1, inhibidor o modulador potencial se comparan con las muestras control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar la extensión de la inhibición. Las muestras de control (sin tratamiento con inhibidores) reciben un valor de activida.d relativo de GPCR-B4 de 100%. La inhibición de GPCR-B4 se logra cuando el valor de la actividad de GPCR-B4 relativa ail control es de aproximadamente 80%, opcionalmente 50% ó 25-0%. La activación de GPCR-B4 se logra cuando el valor de la actividad de GPCR-B4 relativa al control es de 110%, opcionalmente 150%, y opcionalmente 200-500%, ó 1000-3000% más alto. GPCR-B4 "biológicamente activos" denomina al GPCR-B4 que tiene la actividad de GPCR descrita anteriormente:, incluido en transducción degustativa en células receptoras gustativas . Los términos "aislado" , "purificado" o "biológicamente puro" denominan al material que está 5 sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan como se descubre en su estado original . La pureza y homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas analíticas químicas tales como el electroforesis de gel de poliacrilamida o cromatografía
líquida de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación se purifica sustancialmente. En particular, un ácido nucleico de GPCR-B4 aislado se separa de configuraciones de lectura abierta que flanquean el gen de GPCR-B4 y codifican las proteínas
distintas a GPCR-B4. El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína da origen a esencialmente una banda en un gel electroforético . Particularmente, significa que el ácido nucleico o la proteína es por lo menos 85% purc , opcionalmente por lo menos 95% puro, y opcionalmente por lo
menos 99% puro. "Ácido nucleico" denomina a los deoxiribonucleótidos o a los ribonucleótidos y los polímeros de los mismos ya sea en forma de filamento único o doble filamento. El término incluye ácidos nucleicos que contienen análogos de
nucleótidos conocidos o residuos o enlaces modificados de
sÉB^tógg espina dorsal, que son sintéticos, se producen naturalmente o se producen de manera no natural, que tienen propiedades de fijación similares según la referencia de ácido nucleico y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos mencionados. Ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatoei, quiralmetilfosfonatos, 2-0-metil ribonucleótidos, y ácidos peptidonucléicos (PNAs) . A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente variantes conservativamente modificadas de la misma (por ejemplo, substituciones de codones degenerados) y secuenciais complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las substituciones de codones degenerados se pueden obtener generando secuencias en donde la tercera posición de uno o más de los codones seleccionados (o todos) se substituye con residuos de base mezclada y/o de deoxinosina (Batzer y colaboradores, Nucleic Acid Res . 19:5081 (1991); Ohtsuka y colaboradores, J. Biol . Chen . 260:2605-2608 (1985); Rossolini y colaboradores, Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa de manera intercambiable con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido, y polinucleótido . Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente para mencionar a
un polímero de residuos aminoácidos. Los términos aplican a los polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácido naturales y polímero de aminoácido no naturales. El término "aminoácido" denomina a los aminoácidos naturales y sintéticos, así como a los análogos de los aminoácidos y a los miméticos de los aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se originan naturalmente. Los aminoácidos que se producen naturalmente son aquellos codificados por el código genético, así corro aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, per ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, y O-fosfoserina . Los análogos de los aminoácidos hacen referencia a les compuestos que tienen la misma estructura química básica q?e el aminoácido que se produce naturalmente, es decir, un carbón que está ligado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, ?n grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina , norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Estos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o elementos principales de péptidos modificados , pero que conservan la misma estructura química básica que los aminoácidos que se producen naturalmente. Los miméticos de los aminoácidos hacen referencia a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar al aminoácido producido naturalmente. Los aminoácidos se pueden referir en el presente ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura de Bioquímicos IUPAC-IUB. Los nucleótidos de igual manera se pueden mencionar por medio de sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. "Variantes conservadoramente modificadas" aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas denominan a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticos o esencialmente idénticos, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticcs codifican a cualquier proteína determinada. Por ejemplo, les codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican al aminoácido alanina. De ese modo, en cada posición donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones ce ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son ura especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que ordinariamente es el único codón para metionina, y TGG, que comúnmente es el único codón para triptofan) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido se encuentra implícita en cada secuencia descrita. Con respecto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que substituciones individuales, supresiones o adiciones a una secuencia de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos o proteínas que altera, agrega o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservadoramente modificada" en donde la alteración resulta en la substitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. En la técnica se conocen muy bien tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Dichas variantes conservadoramente modificadas son además de y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos interespecies y los alelos de la invención.
Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son substituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A) , Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Licina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofan (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) , y 8) Cisteína (C) , Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). Las estructuras macromoleculares tales como estructuras de polipéptidos se pueden describir en términos de varios niveles de organización. Para una discusión general de esta organización, ver, por ejemplo, Alberts y colaboradores, Molecular Biology of the Cell (3rd ed. , 1994) y Cantor y Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980) . "Estructura primaria" denomina a la secuencia de aminoácidos de un péptido particular. "Estructura secundaria" denomina a estructuras localmente ordenadas, tridimensionales dentro de un polipéptido. Estas estructuras se conocen comúnmente como dominios. Los dominios son porciones de un polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido y son típicamente de 50 a 350 aminoácidos de largo. Los Dominios típicos se hacen de secciones de organización menor tal como estiramientos de ß-sheet y a-hélices. "Estructura terciaria" denomina a la estructura tridimensional completa de un monómero de polipéptido. "Estructura cuaternaria" denomina a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes. Los términos anisotrópicos también son conocidos como términos de energía. Una "marcador" o una "porción detectable" es una composición que se puede detectar por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, marcadores útiles incluyen 3 P, tintes fluorescentes, reactivos de electrones densos, enzimas (por ejemplo, como comúnmente se usa en un ELISA) , biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas para los que ant o 7 se pueden detectar, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en el péptido y usarlo para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido) . Un "probador de ácido nucleico marcado oligonucleótido" es uno que está unido, ya sea de manera covalente a través de un ligando o una unión química, o de manera no covalente, a través de uniones iónicas de van de: Waals, electrostáticas o de hidrógeno a un marcador de manera que la presencia del medidor se puede detectar al percibir la presencia del marcador unida al medidor.
Como se usa en el presente, un "medidor de ácido nucleico u oligonucleótido" se define como un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico objetivo de secuencia complementaria a través de uno o más tipos de uniones químicos, normalmente a través de apareamiento de bases complementarias, por lo general, a través de formación de uniones de hidrógeno. Como se usa en el presente, un medidor puede incluir bases naturales (es decir, A, G, C ó T) modificadas (7-deazaguanosina, inosina, etc). Además, las bases en un medidor pueden estar unidas por un ligamiento distinto a la unión fosfodiéster, siempre que éste no interfiera con la hibridación. De ese modo, por ejemplo, los medidores pueden ser ácidos nucleicos de péptido en donde las bases constituyentes están unidas por uniones de peptidil en lugar de libramientos de fosfodiéster. Un experto entenderá que los medidores pueden unir secuencias meta que carecen de complementariedad completa con la secuencia del medidor dependiendo de la severidad y las condiciones de hibridación. Los medidores se marcan opcionalmente de manera directa como con isótopos, cromóforos, lumíforos, cromógenos o indirectamente se marcan tal como con biotina a la que un estreptavidín complejo puede unirse más tarde. Al ensayar para detectar la presencia o ausencia del medidor, se puede detectar la presencia o ausencia de la secuencia o subsecuencia de selección.
J*je É£iif..? - El término "recombinante" cuando se usa ccn referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado por la introducción de ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula se deriva de una célula así modificada. De ese modo, por ejemplo, las células recombinantes manifiestan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o manifiesta genes nativos que de otro modo se manifiestan anormalmente, bajo manifestado o no manifestado en absoluto.
El término "heterólogo" cuando se usa por referencia a porciones de un ácido nucleico indica que éste comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación una con otra en naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de manera recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados arreglados para hacer un nuevo ácido nucleico funcional, per ejemplo, un promotor desde una fuente y una región ce codificación desde otra fuente. De manera similar, ura proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión) .
Un "promotor" se define como una organización de secuencias de control de ácidos nucleicos que dirige la trascripción de un ácido nucleico. Como se usa en el presente, un promotor incluye secuencias necesarias de ácido nucleico cerca del sitio de inicio de la trascripción, tal como, en el caso de una polimerasa II tipo promotor, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos distales estimuladores o represores, que se puede'n localizar hasta en varios miles de pares de bases desde e'l sitio de inicio de la trascripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que se encuentra activo bajo las condiciones más ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que se encuentra activo bajo la regulación ambiental o de desarrollo. El término "unido operativamente" hace mención de un ligamiento funcional entre una secuencia de control de expresión de ácidos nucleicos (tal como un promotor, una organización de sitios que se une¡n al factor de trascripción) y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, en donde la secuencia de control de expresión dirige a la trascripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. Un "vector de expresión" es una construcción ele ácidos nucleicos, generada de manera recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácidos nucleicos especificados que permiten la trascripción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El vector de expresión puede ser parte de un virus, plasmidio, virus o
?Sa¿x.~í.&E-. aB^ta fragmento de ácido nucleico. Típicamente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico que va a ser trascrito con ligamiento operable a un promotor. Los términos "idéntico" o tanto por ciento "ele identidad" , en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hace mención a dos o más secuencieis o subsecuencias que son la misma o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (es decir, 70% de identidad, opcionalmente 75? , 80%, 85%, 90% ó 95% de identidad sobre una región especificada) , cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide usando uno de los siguiente's algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual . Dichas secuencias se dice entonces que son "substancialmente idénticas". Esta definición también hace mención al cumplimiento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es por lo menos casi 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o de preferencia aún mejor sobre una región que es 75 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.
Para comparación de secuencias, típicamente una frecuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cueil se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, las coordenadas de las subsecuencias se designan, si es necesario, y los parámetros del programa del algoritmo de secuencias se designan. Se pueden usar los parámetros predeterminados del programa, o parámetros alternativos q?e se designan. El algoritmo de separación de secuencias entonces calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba relativas a la secuencia de referencia, con base a los parámetros del programa. Una "ventana de comparación", como se usa en el presente, incluye la referencia a un segmento de cualquier número de las posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste desde 20 a 600, normalmente casi 50 a aproximadamente 200, pero más comúnmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en donde una secuencia se puede comparar a una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que dos secuencias se alinean de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son muy conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación puede conducirse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl . Math . 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación homologa de Needleman & Wunsch, -7. Mol . Biol . 48:443 (1970), mediante la búsqueda para método de similitud de Pearson & Lipman, Proc . Nat ' l . Acad. Sci . USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas ele estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) , o mediante la alineación manual e inspección visual ( consul tar, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y colaboradores , suplemento de las ediciones de 1995) ) . Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILELP crea una alineación de secuencias múltiples desde un grupo ce frecuencias relacionadas usando alineaciones progresivas de parejas para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencias. Éste también delinea un árbol o dendograma q?e muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng & Doolittle, J. Mol . Evol . 35:351-360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5,000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación de parejas de dos secuencias muy similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo se alinea entonces a la siguiente secuencia más relacionada o al grupo de secuencias alineadas. Dos racimos de secuencias se alinean por medio de una extensión simple de la alineación
de parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas, de parejas. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y designando los parámetros de programa. Al usar PILEUP, ura secuencia de referencias se compara con otras secuencias ce prueba para determinar el porcentaje de relación de la identidad de secuencias usando los siguientes parámetros : peso predeterminado de brechas (3.00), peso predeterminado ce longitud de la brecha (0.10), y brechas finales ponderados. PILEUP puede obtenerse a partir del paquete de software ce análisis de secuencias de GCG, por ejemplo, versión 7.0 (Devereaux y colaboradores, Nuc. Acids . Res . 12:387-355 (1984) . Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de las secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y colaboradores, Nuc . Acids Res . 25:3389-3402 (1997) y Altschul y colaboradores, J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990), respectivamente. El software para llevar a cabo análisis de BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica (http: //www. nebí .nlm.nih.gov/) . Este algoritmo incluye identificar primero pares de secuencias de alta puntuacicn
J?i^^?fc (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que cualquiera coincide o satisface alguna marca T del umbral con valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T hace referencia al umbral de marcas en palabras del entorno (Altschul y colaboradores, consul ta r arriba) . Estos aciertos iniciales de palabras de entorro actúan como semillas para iniciar las búsquedas y encontrar HSP más largos que los contienen. Los aciertos de palabras ee extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como la puntuación de alineación acumulativa pueda ser aumentada. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación recompensa para un par de residuos coincidentee ; siempre >0) y N (puntuación de sanción para residuos no coincidentes; siempre <0) . Para secuencias de aminoácidos, una matriz de puntuación se usa para calcular la puntuacicn acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de la alineación acumulativa decae por la cantidad X de su máximo valer obtenido; la puntuación acumulativa va a cero o abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos ccn puntuación negativa; o el final de cualquier secuencia es alcanzada. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11 , una expectativa (E) ó 10, M=5, N=-4 y una comparación ce ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa 5 BLASTP usa como valores predeterminados una longitud ce palabra de 3, y expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 ( consul tar Henikoff & Henikoff, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectative (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas
hebras. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias ( consul tar, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc . Nat 'l . Acad. Sci . USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada
por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad per la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótides o aminoácidos ocurriría por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia
si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia es mejor que aproximadamente 0.2, de preferencia menor q?e aproximadamente 0.01, y más preferiblemente menor q?e aproximadamente 0.001.
*^tó^^^^^ á^*j^ aÉ musoS ^ Un indicativo de que dos secuencias de acidéis nucleicos o polipéptidos son substancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es el reactivo inmunológicamente cruzado con los anticuerpos que se producen contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Así, ?n polipéptido es idéntico de manera típicamente substancial a un segundo polipéptido, por ejemplo, donde los dos péptidc-s difieren solamente por substituciones moderadas. Otro-indicativo de que dos secuencias de ácidos nucleicos sen substancialmente idénticas es que las dos moléculas de sus complementos hibridizan una a otra bajo condiciones estrictas, como se describe a continuación. Otro indicativo más de que dos secuencias de ácidos nucleicos sc*? substancialmente idénticas es que pueden usarse los mismcs iniciadores para amplificar la secuencia. La fase "selectivamente (o específicamente) hibridiza" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula solamente para una secuencia de nucleótidc-s en particular bajo condiciones estrictas de hibridacicn cuando la secuencia está presente en una mezcla compleja (per ejemplo ADN ó ARN celular o de biblioteca total) . La frase "condiciones estrictas de hibridación" denomina a las condiciones bajo las que un medidcr hibridizará a su subsecuencia meta, típicamente en una mezcla
fe-.'-J * Jafi compleja de ácido nucleico, pero no para otras secuencias. Las condiciones estrictas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas hibridizan específicamente a temperaturas más altas . Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hibridization wi th Nucleic Probes (Técnicas en Bioquímica y Biología Molecular - Hibridación con Medidores Nucleicos") , "Generalidades de los principies de hibridación de la estrategia de los ensayos para acides nucleicos" (1993) . Generalmente, las condiciones estrictas ee seleccionan para que sean aproximadamente 5-10°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en un pH definido de intensidad iónica. El Tm es la temperatura (bajo la intensidad iónica definida, pH y concentración nucleica a la que el 50% de los medidores complementarios para el objetivo hibridizan para la secuencia objetivo en equilibrio (cuando las secuencias objetivo están presentes en exceso, en Tm, 50% de los medidores se ocupan en equilibrio) . Las condiciones estrictas serán aquéllas en q?e la concentración de sal sea menor que aproximadamente 1.0 M de ion sódico, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M concentración de ion sódico (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura sea menor a aproximadamente 30°C para los medidores cortos (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por
^^¡^i^^^^gá^*?r lo menos casi 60 °C para medidores largos (por ejemplc , mayores que 50 nucleótidos) . Las condiciones estrictas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizadores tales como la formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es por lo menos dos veces hibridación de fondo, opcionalmente 10 veces hibridación de fondo. Ejemplos de condiciones estrictas de hibridación pueden ser las siguientes: 50% formamida, 5x SSC, y 1% SDS, en incubación a 42 °C, ó 5x SSC, 1% de SDS, en incubación a 65°C, con lavado en 0.2x SSC, y 0.1% de SDS a 65°C. Los ácidos nucleicos que no se hibridizan entre sí bajo condiciones estrictas siguen siendo substancialmente idénticos si los polipéptidos que éstos codifican sc>n substancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuanco una copia de un ácido nucleico se crea usando la máxima degeneración de codón permitida por el código genético. Ein dichos casos, los ácidos nucleicos hibridizan típicamente bajo condiciones de hibridación moderadamente estricta . Ejemplos de "condiciones de hibridación moderadamente estrictas" incluyen una hibridación en un compensador de 40% formamida, 1 M NaCl , 1% de SDS a 37 °C, y un lavado en IX SSC a 45°C. Una hibridación positiva es por lo menos dos veces ele fondo. Los expertos reconocerán de inmediato que las condiciones de hibridación y lavado alternativas se pueden utilizar para proporcionar condiciones de similar rigor. "Anticuerpo" denomina a un polipéptido que comprende una región estructural de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que específicamente une y reconoce una antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon, y mu, así como los innumerables genes de la región variable de inmunoglobulina. Cadenas ligeras ee clasifican ya sea kappa o lambda. Cadenas pesadas ee clasifican como gama, mu, alfa, delta ó épsilon, que en eu momento definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, Ig , IgD e IgE, respectivamente. Un ejemplo de la unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una cadena "ligera"
(aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada"
(aproximadamente 50-70 kDa) . El término N de cada cadera define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de los antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) denominan a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.
Los anticuerpos existen, por ejemplo, corno inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bie:n caracterizados producidos por digestión con variéis peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina asimila un anticuerpo debajo de los ligandos de disulfida en la región de la articulación para producir F(ab)'2, un dimero de Fatb que en sí mismo es una cadena ligera de disulfuros VH-CH1. El F(ab)' puede reducirse bajo condiciones suaves para irrumpir el ligamiento de disulfuros en la región de articulación, por lo tanto, convirtiendo el dimero F(ab) '2 en un monómero ele
Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de articulación ( consul tar Fundamental Immunology
(Inmunología Fundamental ) (Paul ed. , 3d. ed. 1993). Aunque varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de 1 a digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos se pueden sintetizar de novo ya se?a químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Así, el término anticuerpo, como se usa en el presente, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos o por la modificación de los anticuerpos completos, o por aquellos sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante¡s (es decir, Fv de cadena singular) o aquellos identificados utilizando bibliotecas de exposición de fagos ( consul tar, por ejemplo, McCafferty y colaboradores . , Nature (Naturaleza) 348:552-554 (1990) ) .
Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, cualquier técnica puede usarse ( consul tar, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature (Naturaleza) 256:495-497 (1975) ; Kozbor y colaboradores , Immunology Today (Inmunologí a Hoy) 4:72 (1983); Colé y colaboradores, páginas 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy (Anticuerpos Monoclonales y Terapia Contra el Cáncer) 1985)) . Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de los Estados Unidos 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos para los polipéptidos de esta invención. También, los ratones transgénicos u otros organismos tale'S como otros mamíferos, pueden ser utilizados para expresaír anticuerpos humanizados. Alternativamente, la tecnología de exhibición de fagos puede usarse para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heterométricos que unen específicamente a los antígenos seleccionados ( consul tar, por ejemplo,
McCafferty y colaboradores, Nature (Naturaleza) 348:552-5E>4
(1990) ; Marks y colaboradores , Biotechnology (Biotecnología)
:779-783 (1992) ) . Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en donde (a) la región constante, o una porción de la misma, es alterada, reemplazada o intercambiada de maneara que el sitio que se une al antígeno (región variable) es enlazado a una región constante de una clase diferente o alterada, función efectora y/o especies, o a una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una toxina de enzima, ura hormona, un factor de crecimiento, un fármco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, es alterada, 5 cambiada o intercambiada con una región variable que tiere una especificidad diferente o alterada de antígeno. Un anticuerpo "anti-GPCR-B4" es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que une específicamente ?n polipéptido modificado por el gen GPCR-B4, ADNc o ura 10 subsecuencia del mismo. El término "inmunoensayo" es un ensayo que usa ?n anticuerpo para unir específicamente un antígeno. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades ligandos específicas de un anticuerpo particular para aislar,
seleccionar y/o cuantificar el antígeno. La frase "específicamente (o selectivamente) une a ?n anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunoreactivo a con, "cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción ligando que es 20 determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otras sustancias biológicas. Así, bajo condiciones de inmunoensayo designada, los anticuerpos especificados se unen a una proteína en particular en por lo menos dos veces el fondo y no se unen substancialmente en una 25 cantidad significativa a otras proteínas presentes en la
-MteaxsS&sué. ,„?.. b muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo dicheis condiciones puede requerir un anticuerpo que es seleccionado por su especificidad para una proteína en particular. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales creados para GPCR-B4 ce especies específicas tales como rata, ratón o humano ee pueden seleccionar para obtener solamente aquellcs anticuerpos policlonales que son específicamente inmunoreactivos con GPCR-B4 y no con otras proteínas, excepto por variantes polimórficas y alelos de GPCR-B4. Esta selección se puede lograr restando anticuerpos que reaccionan en cruz con moléculas de GPCR-B4 de otras especies. Una varieidad de formatos de inmunoensayos se pueden usar para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos ccn una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA de fase sólida se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína ( consul tar, por ejemplo, Harlow & Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual (Anticuerpos, Un Manual de Laboratorio ) (1988) , para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se pueden usar para determinar la inmunoreactividad específica) . Típicamente, una reacción específica o selectiva será por lo menos dos veces señal o ruido de fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces de fondo .
La frase "selectivamente se asocia con" se refiere a la habilidad de un ácido nucleico para "selectivamente hibridizar" con otro como se define anteriormente, o la habilidad de un anticuerpo para "selectivamente (o específicamente) ) unirse a una proteína, como se defiré anteriormente . Por "célula huésped" se quiere dar a entender que una célula contiene un vector de expresión y soporta la replicación o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procarióticas tales como E. coli , o células eucarióticas tales como células de yeso, insecto, anfibio o mamífero tal como CHO, HeLa y similares, por ejemplo, células cultivadas, explantes y células in vivo . III. Aislamiento del Ácido Nucleico que codifica a GPCR-B4 A . Métodos generales de ADN recombinante Esta invención se fundamenta en técnicas de rutina e-n el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que revelan los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook y colaboradores , Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Clonación Molecular, Un Manual de Laboratorio) (2a edición, 1989) ,- Kriegler, Gene Transfer and Expresión : A Laboratory Manual (Transferencia y Expresión Genética : Un Manual de Laboratorio) (Ausubel y colaboradores',, eds. , 1994) ) .
Para los ácidos nucleicos, los tamaños se determinan ya sea en kilobases (kb) o pares de bases (bp) . Éstos sc>n estimados derivados de agarosa o electroforésis de gel de acrilamida, de ácidos nucleicos secuenciados, o de secuencias de ADN publicadas. Para las proteínas, los tamaños se proporcionan en kilodaltones (kDa) o en números de residuos de aminoácidos. Los tamaños de las proteínas se calculan a partir de la electroforésis de gel, de las proteínas secuenciadas, de las secuencias de aminoácidos derivados o de secuencias de proteínas derivadas. Los oligonucleótidos que no son comercialmente disponibles pueden ser químicamente sintetizados de acuerdo con el método triéster de fosforamidita de fase sólida q?e primero se describió en Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. (Cartas de Tetrahedrón) . 22:1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado, como se describe en Van Devanter y colaboradores, Nucleic Acids Res . (Investigación de Ácidos Nucleicos) 12:6159-6168 (1984). La purificación de los oligonucleótidos se lleva a cabo por la electroforésis ce gel de acrilamida natural o por HPLC con intercambio ce aniones en Pearson & Reanier, J. Chro . 255:137-149 (1983). La secuencia de los genes clonados y lC'S oligonucleótidos sintéticos se puede verificar después de q?e se usa la clonación, por ejemplo, el método de terminación ce cadena para secuenciar plantillas de doble hebra de Wallace y colaboradores, Gene (Gen) 16:21-26 (1981). B . Métodos de clonación para el aislamiento de secuencias de nucleótidos que codifican GPCR-B4 En general, las secuencias de ácido nucleico q?e codifican a GPCR-B4 y los homólogos de las secuencias de ácidos nucleicos relacionados son clonados a partir de bibliotecas de ADNc y ADN genómico mediante hibridación ccn un medidor, o aisladas usando técnicas de amplificación ccn iniciadores de oligonucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de GPCR-B4 se aislan típicamente de las bibliotecas de acides nucleicos de mamíferos (genómicos o ADNc) hibridizando con ?n medidor de ácido nucleico, la secuencia de ésta puede derivarse de SEQ ID NOS: 3 -4 y 8. Un tejido adecuado de GPCR-B4 ARN y ADNc se puede aislar en el tejido de lengua, opcionalmente tejidos de papilas gustativas o células gustativas individuales. Las técnicas de amplificación usando iniciadores también se pueden usar para amplificar y separar a GPCR-B4 del ADN ó ARN. Los iniciadores degenerativos que codifican las siguientes secuencias de aminoácidos también se pueden usar para amplificar una secuencia de GPCR-B4 : SEQ ID NOS: 5-6
( consul tar, por ejemplo, Dieffenfach & Dveksler, PCR Primez :
A Laboratory Manual (Iniciador PCR : Un Manual de Laboratorio) (1995) ) . Estos iniciadores se pueden usar, por ejemplo, para
______!dt« amplificar, ya sea la secuencia de longitud completa o un medidor de uno a varios cientos de nucleótidos, que entonces se usan para prospectar una biblioteca de mamíferos para GPCR-B4 de longitud completa. 5 Los ácidos nucleicos que codifican a GPCR-B4 también pueden aislarse de las bibliotecas de expresión usando les anticuerpos como medidores. Dichos anticuerpos policlonales o monoclonales se pueden producir usando la secuencia de SEQ ID NOS: 1-2 y 7. 10 Las variantes polimórficas, los alelos y lc>s homólogos interespecies de GPCR-B4 que son substancialmente idénticos a GPCR-B4 se pueden aislar usando medidores ce ácidos nucleicos de GPCR-B4, y oligonucleótidos bajo condiciones de hibridación estrictas, prospectando
bibliotecas. De manera alternativa, las bibliotecas c.e expresión se pueden usar para clonar GPCR-B4 y variantes polimórficas, alelos y homólogos interespecies del GPCR-B , detectando los homólogos expresados inmunológicamente con anticuerpos de suero inmune o purificados hechos contra GPCR- 20 B4 que también reconocen y selectivamente se unen al homólogo de GPCR-B4. Para hacer una biblioteca de ADNc, se debe elegir una fuente que sea rica en GPCR-B4 ARNm, por ejemplo, tejido de lengua o papilas gustativas aisladas. El ARNm se hace
entonces a ADNc usando transcriptasa invertida, ligada en un
_¡_i_!^__?__|;_¡__=?___. J& í vector recombinante, y transfecta en un huésped recombinante para propagación, prospección y clonación. Los métodos para hacer y prospectar bibliotecas ADNc son muy conocidas ( consul tar, por ejemplo, Gubler & Hoffman, Gene (Gen) 25:263-269 (1983); Sambrook y colaboradores, consul tar arriba ; Ausubel y colaboradores , consul tar arriba) . Para una biblioteca genómica, el ADN se extrae del tejido y se corta mecánicamente o se asimila enzimáticamente para producir fragmentos de aproximadamente 12-20 kb. Lc>s fragmentos son entonces separados mediante centrifugación gradiente de los tamaños no deseados y se construyen en vectores lambda bacteriófagos. Estos vectores y fagos ee empacan in vi tro . Los fagos recombinantes se analizan mediante hibridación de placas como se describe en Benton & Davis, Science (Ciencia) 196:180-182 (1977). La hibridación de colonias se lleva a cabo como se describe generalmente en Grunstein y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA, (Procedimiento de la Academia Nacional de Ciencias, EUA) , 72:3961-3965 (1975) . Un método alternativo para separar ácido nucleico ¿?e
GPCR-B4 y sus homólogos combina el uso de iniciadores ele oligonucleótidos sintéticos y la amplificación de una plantilla ARN ó ADN ( consul tar las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 4,683,195 y 4,683,202; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Protocolos PCR: Una Gula para Métodos y Aplicaciones) (Innis y colaboradores, edición 1990) ) . Los métodos tales como reacción en cadena de polimerasas (PCR) y reacción en cadena de ligasas (LCR) se pueden usar para amplificar secuencias de ácidos nucleicos de GPCR-B4 directamente de ARNm, de ADNc, de bibliotecas genómicas o bibliotecas ADNc. Los oligonucleótidos degenerados se pueden diseñar para amplificar los homólogos de GPCR-B4 usando las secuencias proporcionadas en el presente. Los sitios de endonucleasas de restricción se pueden incorporan en los iniciadores. La reacción en cadena de las polimerasas u otros métodos de amplificación in vi tzo pueden ser útiles por ejemplo, para clonar las secuencias de ácidos nucleicos que se codifican para proteínas que deben expresarse, para hacer ácidos nucleicos que se usarán corro medidores para detectar la presencia del GPCR-B4 que codifica ARNm en muestras fisiológicas, para secuenciar acides nucleicos o para otros fines. Los genes amplificados por la reacción de PCR pueden purificarse a partir de los geles de agarosa y clonarse en un vector apropiado. La expresión genética de GPCR-B4 también se puede analizar mediante técnicas conocidas, por ejemplc>, trascripción inversa y amplificación de ARNm, aislamiento ce ARN total o poli A+ ARN, northern blotting, dot blottinc , hibridación in si tu, protección de Rnasa, sondeo ce organizaciones de microchips de ADN y similares. En otra forma de realización, la tecnología de análisis de oligonucleótidos de alta densidad (por ejemplo, GeneChip™) se usa para identificar homólogos y variantes polimórficas de los GPCRs de la invención. En el caso donde los homólogos que se están identificando están ligados a una enfermedad conocida, éstos se pueden usar con GeneChip™ como una herramienta de diagnóstico para detectar la enfermedad en una muestra biológica, consul tar, por ejemplo, Gunthand y colaboradores, AIDS Res . Hum. Retroviruses ( 14:869-876 (1998) ; Kozal y colaboradores , Nat . Med. (Medicina Natural ) 2:753-759 (1996); Matson y colaboradores, Anal . Biochem. (Bioquímica Analógica) 224:110-106 (1995); Lockhart y colaboradores, Nat. Biotechnol . (Biotecnología Natural ) 14:1675-1680 (1996); Gingeras y colaboradores, Genome Res . (Investigación Genómica) 8:435-448 (1998): Hacia y colaboradores, Nucleic Acids Res . (Investigación de Ácidos Nucleicos) 26:3865-3866 (1998). Oligonucleótidos sintéticos se pueden usar para construir genes de GPCR-B4 recombinantes para usar como medidores o para expresión de proteína. Este método ee realiza usando una serie de oligonucleótidos superpuestc>s generalmente de 40-120 bp de longitud, representando tanto a las hebras sensoras como las no sensoras del gen. Estos fragmentos de ADN son entonces templados, ligados y clonados . Alternativamente, se pueden usar técnicas de amplificación
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usadas con iniciadores precisos para amplificar una subsecuencia específica del ácido nucleico de GPCR-B4. La subsecuencia específica se liga entonces en un vector de expresión. El ácido nucleico que codifica el GPCR-B4 se clona típicamente en vectores intermedios antes de transformarse en células procarióticas o eucarióticas para replicación y/o expresión. Estos vectores intermedios son típicamente vectores procarióticos, por ejemplo, plásmidos o vectores de transferencia. Opcionalmente, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas quiméricas comprenden GPCR-B4 o dominios del mismo que pueden hacerse de acuerdo a técnicas regulares. Por ejemplo, un dominio tal como dominio que une al ligando, un dominio extracelular, un dominio transmembrana (por ejemplo, uno que comprende las regiones de siete transmembranas y corresponde a lazos extracelulares y citosólicos) , el dominio transmembrana y un dominio citoplástico, un sitio activo, una región de asociación de unidad secundaria, etc., pueden ligarse covalentemente a una proteína heteróloga. Por ejemplo, un dominio extracelular se puede ligar a un dominio transmembrana de GPCR heterólogo, o un dominio extracelular de GPCR heterólogo se puede ligar a un dominio transmembrana. Otras proteínas heterólogas de elección incluyen, por ejemplo, proteína verde fluorescente, ß-gal, receptcr glutamato y la presecuencia rodopsina. C. Expresión en procariotas y eucariotas Para obtener expresión de alto nivel de un gel clonado o ácido nucleico clonado, tal como de los ADNc que codifican a GPCR-B4, se subclona típicamente el GPCR-B4 en ?n vector de expresión que contiene un promotor fuerte para conducir la trascripción, un terminador de trascripción/ traducción y si es para un ácido nucleico que codifica ura proteína, un sitio que une un ribosoma para iniciación translacional . Los promotores de bacteriales adecuados sen bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores y Ausubel y colaboradores . Sistemas de expresión bacterial para expresar la proteína de GPCR-E14 disponibles en, por ejemplo, E. coli , Bacillus sp. , y Salmonella (Palva y colaboradores, Gene (Gen) 22:229-225 (1983); Mosbach y colaboradores, Nature (Naturaleza) 302:542-545 (1983) . Estuches para dichos sistemas de expresión puede'n conseguirse comercialmente. Los sistemas de expresión eucariótica para células de mamíferos, levadura, y células de insectos son muy conocidos en la técnica y también pueden conseguirse comercialmente. En una forma de realización, e¡l vector de expresión eucariótica es un vector adenoviral, un vector asociado con adenos, o un vector retroviral. El promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular. El promoter se coloca opcionalmente aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de trascripción heteróloga que la del sitio de inicio de trascripción en su ambiente natural. Corro se sabe en la técnica, sin embargo, alguna variación en esta distancia puede arreglarse sin pérdida de la función del promotor. Además del promotor, el vector de expresión típicamente contiene una unidad de trascripción o cásete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del GPCR-B4 que codifica el ácido nucleico en células huésped. Un cásete de expresión típico que de ese modo contiene un promotor ligado de manera funcional a la secuencia de ácido nucleico que codifica el GPCR-B4 y las señales requeridas para la poliadenilación eficiente de la trascripción, los sitios que se unen al ribosoma, y la terminación de la traducción. La secuencia ce ácido nucleico que codifica el GPCR-B4 puede típicamente estar ligado a una secuencia de polipéptidos de señales segmentables fomentar la secreción de la proteína codificada por la célula transformada. Esos polipéptidos de señaléis incluían, entre otros, los polipéptidos de señales de-1 activador plasminógeno de tejidos, la insulina y el factor ele crecimiento de las neuronas, y esterasa de hormonas juveniles de Heliothis virescens . Los elementos adicionales del cásete pueden incluir estimuladores y, si se usa ADN genómico como el gen estructural, intrones con sitios funcionales de dador y aceptador de empalmes. Además de la secuencia promotora, el cásete de 5 expresión también contiene una región de terminación de trascripción descendente del gen estructural para proporcionar terminación eficiente. La región de terminación se puede obtener del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse de diferentes genes. 10 El vector de expresión particular usado para transportar la información genética a la célula no es en particular importante. Cualesquiera de los vectores convencionales usados para expresión en células eucarióticas o procarióticas pueden usarse. Los vectores de expresión
bacterial estándar incluyen plasmidios tales como plasmidics con base de pBR322, pSKF, PET23D y sistemas de expresión per fusión tales como GST y LacZ. También se pueden agregar marcadores de epítope a las proteínas recombinantes para proporcionar métodos convenientes de separación, por ejemplo,
c-myc. Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucarióticos se usan típicamente e'n vectores de expresión eucariótica, por ejemplo, vectores SV40, vectores de virus papiloma y vectores derivados de
virus Epstein-Barr. Otros ejemplos de vectores eucarióticos
*^^^^ g^^^^^^¡^^j¡>*tá£yg^_ incluyen pMSG, pAV009/A+, pMT01?/A+, pMAMneo-5, baculovir?s pDSVE, y cualquier otro vector que permite la expresión de las proteínas bajo la dirección del primer promotor SV40, el último promotor SV40, el promotor de metalotioneína, el promotor del virus del tumor mamario murina, el promotor del virus sarcona Rous, el promotor de polihedrina u otrcs promotores que han mostrado ser efectivos para expresión en células eucarióticas. Algunos sistemas de expresión tienen marcadores q?e proporcionan amplificación de genes tales como quinasa de timidina, fosfotransferasa de higromicina B, y reductasa de dihidrofolato. Alternativamente, los sistemas de expresión de alto rendimiento que no incluyen amplificación de genes también son adecuados, tales como usar un vector baculovir?s en células de insectos, con un GPCR-B4 que codifica la secuencia bajo la dirección del promotor de polihedrina u otros promotores de baculovirus potentes . Los elementos que típicamente se incluyen en les vectores de expresión también incluyen un replicón q?e funciona en E. coli , un gen que codifica la resistencia antibiótica para permitir la selección de bacterias q?e alojan los plasmidios recombinantes, y los sitios de restricción única en regiones no esenciales del plasmidio para permitir la inserción de las secuencias eucarióticas. E!l gen de resistencia antibiótica particular elegido no es importante, cualesquiera de los muchos genes de resistencia conocidos en la técnica es adecuado. Las secuencias procarióticas se eligen opcionalmente de manera que no interfieran con la replicación del ADN en células eucarióticas, si es necesario. Los métodos de transfección estándar se usan para producir líneas de células de bacteria, mamífero, levadura o insectos que expresan grandes cantidades de proteína de GPCR-B4 , que después son purificadas usando técnicas estándar ( consul tar, por ejemplo, Colley y colaboradores, J. Biol . Chem. (Boletín de Química Biológica) 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purif ication (Guía para Purificación de Proteína) en Methods in Enzimology (Métodos en Enzimología) , volumen 182 (Deutscher, edición 1990) . La transformación de las células eucarióticas y procarióticas se realiza de acuerdo a las técnicas estándar ( consul tar, por ejemplo,
Morrison, J. Bact . (Boletín de Bacteriología) 132:349-351
(1977) ; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology
(Métodos en Enzimología) 101:347-362 (Wu y colaboradores., edición 1983) . Se puede usar cualesquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias de nucleótidos extraños en células huésped. Éstas incluyen el uso de transfección de fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electrofóresis, liposomas, microinyección, vectores de
. -abe»,..
plasma, vectores virales y cualquier otro método bien conocido para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped ( consul tar, por ejemplo, Sambrook y colaboradores , 5 consul tar arriba) . Es necesario que solamente se use el procedimiento de ingeniería genético particular capaz de tener éxito al introducir por lo menos un gen en la célula huésped que puede ser capaz de expresar el GPCR-B4. Después de que el vector de expresión se introdujo en
las células, las células trasnfectadas se cultivan bajo condiciones de expresión favorable de GPCR-B4, que se recupera del cultivo usando técnicas estándar a continuación identificadas . IV. Purificación de GPCR-B4 15 Ya sea el GPCR-B4 natural o el recombinante puede purificarse para uso en ensayos funcionales. Opcionalmente', se purifica el GPCR-B4 recombinante. El GPCR-B4 natural se purifica, por ejemplo, de tejido mamífero tal como tejido de lengua, y cualquier otra fuente de un GPCR-B4 homólogo. Eli
GPCR-B4 recombinante se purifica de cualquier sistema de expresión bacterial o eucariótica adecuada, por ejemplo, células de CHO o células de insecto. El GPCR-B4 se puede purificar a la pureza substancial mediante técnicas estándar, incluyendo precipitación
selectiva con substancias tales como substrato de amonio; la
__^_____g¡ ffiSfe &&^^s=i¿ sá^ cromatografía en columna, los métodos de inmunopurificación y otros ( consul tar, por ejemplo, Scopes, Protein Purif ication : Principies and Practice (Purificación de Proteínas : Principios y Prácticas) (1982); Número de Patente de los Estados Unidos 4,673,641; Ausubel y colaboradores, consul tar arriba,- y Sambrook y colaboradores , consultar arriba) . Un número de procedimientos se pueden emplear cuando el GPCR-B4 recombinante está siendo purificado. Por ejemplo, las proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular establecidas se pueden fundir de forma reversible a GPCR-B4. Con el ligando apropiado, el GPCR-B4 puede ser absorbido selectivamente a una columna de purificación y después liberado de la columna en una forma relativamente pura. La proteína fundida es entonces removida mediante actividad enzimática. Finalmente, el GPCR-B4 podría purificarse usando columnas de inmunoafinidad. A. Purificación de GPCR-B4 a partir de células recombinantes Las proteínas recombinantes se expresan mediante células de bacteria o eucarióticas transformadas tales corro células de CHO o células de insecto en grandes cantidades, típicamente después de la inducción del promotor; pero la expresión puede ser constitutiva. La inducción del promoter con IPTG es un ejemplo de un sistema promotor inducible. Las células se aumentan de acuerdo a los procedimientos estándar
Mffffl*WMI en la técnica. Células frescas o congeladas se usan para aislamiento de la proteína. Las proteínas expresadas en bacteria pueden formar agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Varios protocolos son adecuados para la purificación de los cuerpos de inclusión de GPCR-B4. Por ejemplo, la purificación de cuerpos de inclusión típicamente incluye la extracción, separación y/o purificación de los cuerpos de inclusión mediante disrupción de células bacteriales, por ejemplo, por medio de incubación de una sustancia regulador de 50 mM de TRIS/HCL pH 7.5, 50 mM NaCl , 5 mM MgCl2, 1 mM DDT, 0.1 M ATP, y 1 mM PMSF. La suspensión de células se puede hacer mediante lisis usando 2 ó 3 pasadas a través de una Presa Francesa, como homogeneización usando un Politrón (Brinkman Instruments) o llevando a cabo sonicación en hielo. Métodos alternativos para hacer lisis de bacterias son conocidos para los expertos en la técnica ( consul tar, por ejemplo, Sambrook, y colaboradores, consul tar arriba; Ausubel y colaboradores, consul tar arriba) . Si es necesario, los cuerpos de inclusión se solubilizan, y la suspensión de células por medio de lisis se centrífuga típicamente para remover la bacteria insoluble deseada. Las proteínas que formaban los cuerpos de inclusión pueden renaturalizar mediante dilución o diálisis con un regulador compatible. Los solventes adecuados incluyen, pero
-a-tf-, ^..
no se limitan a la urea (desde aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M) , formamida (por lo menos aproximadamente 80%a, base de volumen/volumen) , y hidroclorido de guanidina (desde aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M) . Algunos solventes que son capaces de solubilizar proteínas formadoras de agregados, por ejemplo SDS (dodecilsulfonato de sodio) , 70% de ácido fórmico, son inapropiados para usarse en este procedimiento debido a la posibilidad de desnaturalización irreversible de las proteínas, acompañados por una falta de inmunogenicidad y/o actividad. Aunque el clorhidrato de guanidina y los agentes similares son desnaturalizantes, esta desnaturalización no es irreversible y la renaturalizacicn puede ocurrir al remover (por ejemplo, mediante diálisis) o diluir el desnaturalizante, permitiendo la nueva formación de la proteína inmunológicamente y/o biológicamente activa . Otros reguladores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica. El GPCR-B4 se separa de otras proteínas c-e bacteria mediante técnicas de separación, por ejemplo, con resina de agarosa de Ni-NTA. Alternativamente, es posible purificar el GPCR-B4 ele periplasma de bacteria. Después de la lisis de la bacteria., cuando el GPCR-B4 se exporta en el periplasma de la bacterial, la fracción periplásmica de la bacteria se puede aisleir mediante shock osmótico frío además de otros métodos conocidos en la técnica. Para aislar las proteínais recombinantes del periplasma, las células bacteriales se centrifugan para formar una perla. La perla se vuelve a suspender en un regulador que contiene 20% de sacarosa. Para hacer la lisis en las células, la bacteria se centrífuga y la perla se vuelve a suspender en 5 mM de MgS04 frío en hielo y se mantiene en un baño de hielo durante aproximadamente 10 minutos. La suspensión de la célula se centrífuga y el flotante se decanta y se guarda. Las proteínas recombinantes presentes en el supernatante pueden separarse de las proteínas huésped mediante técnicas estándar de separación bien conocidas para los expertos. B. Técnicas de separación de proteínas estándar para purificar GPCR-B4 Fraccionamiento de solubilidad A menudo como un paso inicial, particularmente si la mezcla de proteínas es compleja, un fraccionamiento de sales inicial puede separar muchas de las proteínas de células huésped no deseadas (o proteínas derivadas del medio de cultivo de células) de la proteína recombinante de interés. La sal preferida es el sulfato de amonio. El sulfato de amonio precipita las proteínas reduciendo efectivamente la cantidad de agua en la mezcla de proteínas. Las proteíneis entonces se precipitan sobre la base de su solubilidad. Mientras más hidrofóbica es una proteína, es más probable que se precipite en concentraciones bajas de sulfato de amonio.
Un protocolo típico incluye la adición del sulfato de amonio saturado a una solución de proteínas de manera que la concentración resultante del sulfato de amonio se encuentre entre 20-30%. Esta concentración precipitará a las proteínas 5 más hidrofóbicas. El precipitado se descarta entonces (a menos que la proteína de interés sea hidrofóbica) y se agrega el sulfato de amonio al supernatante a una concentración que se sabe precipita la proteína de interés. El precipitado entonces se solubiliza en el regulador y si es necesario se
retira el exceso de sal, ya sea a través de diálisis o de diafiltración. Otros métodos que tienen como base la solubilidad de proteínas, tales como precipitación en etancl frío, son muy conocidos por los expertos en la técnica y pueden usarse para fraccionar las mezclas de proteínas
complejas. Filtración del diferencial de tamaño El peso molecular de GPCR-B4 se puede usar para aislarlo de las proteínas de mayor o menor tamaño usanclo Ultrafiltración a través de las membranas de diferentes
tamaños de poro (por ejemplo, membranas de Amicón o Miliporos) . Como un primer paso, la mezcla de proteínas se ultrafiltra a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un corte de peso molecular inferior que el peso molecular de la proteína de interés. El retentado de la
Ultrafiltración es entonces ultrafiltrado contra una membrana
-?¿-a con un corte molecular mayor del peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana en el filtrado. El filtrado puede entonces pasar por la cromatografía como se describe a continuación. Cromatografía en columna El GPCR-B4 también se puede separar de otras proteínas sobre la base de su tamaño, carga de superficie neta, hidrofobicidad, y afinidad por los ligandos. Además, los anticuerpos que surgen contra las proteínas se pueden conjugar con las matrices de columna y las proteínas inmunopurificadas . Todos estos métodos son muy conocidos en la técnica. Será aparente para un experto que las técnicas cromatográficas se pueden realizar en cualquier escala y usando equipo de muchos fabricantes diferentes (por ejemplo, Pharmacia Biotech) . V. Detección inmunológica de GPCR-B4 Además de la detección de genes GPCR-B4 y expresión de genes usando la tecnología de hibridización de áciclo nucleico, también se pueden usar los inmunoensayos para detectar el GPCR-B4, por ejemplo, para identificar las células receptoras de sabor y las variantes de GPCR-B4. Los inmunoensayos se pueden utilizar para analizar cuantitativa y cualitativamente GPCR-B4. Una visión general de la tecnología aplicable se puede encontrar en Harlow & Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual (Anticuerpos : Un Manual de Laboratorio) (1998) . A . Anticuerpos para GPCR-B4 Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales reaccionan específicamente con GPCR-B4 son conocidos por los expertos en la técnica (consul tar, por ejemplo, Goligan, Current Protocols in Immunology (Protocolos Actuales en Inmunología) (1991) ; Harlow & Lanee; consultó'r arriba; Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice (Anticuerpos Monoclonales : Principios y Prácticas)
(2a Edición, 1986) ; y Kohler & Milstein, Nature .Naturaleza'.
256:495-497 (1975). Dicha técnica incluye la preparación de anticuerpos mediante la selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores fago o similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales mediante la inmunización de conejos o ratones ( consul tar, por ejemplo, Huse y colaboradores, Science (Ciencia) 246:1275-1281 (1989); Ward y colaboradores, Nature (Naturaleza) 341:544-546 (1989)). Se puede utilizar un número de GPCR-B4 que comprende inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con GPCR-B . Por ejemplo, el GPCR-B4 recombinante o un fragmento antigénico del mismo se separan como se describe en el presente. La proteína recombinante se puede expresar en células eucarióticas o procarióticas como se describe antes, y purificarse como se describe generalmente antes. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales. Alternativamente, un derivado péptido sintético de las 5 secuencias reveladas en el presente y conjugadas para una proteína portadora puede usarse como inmunógeno. La proteína natural también puede usarse ya se en forma pura o impura . El producto es entonces inyectado en un animal capaz de producir anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales o policlonales
pueden ser generados, para uso subsecuente en inmunoensayos para medir la proteína. Los métodos de producción de los anticuerpcs policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. Una cepa endocriada de ratones (por ejemplo, ratones BALB/C)
o conejos se inmuniza con la proteína usando un adyuvante estándar, tal como el adyuvente de Freund, y un protocolo ce inmunización estándar. La respuesta inmune del animal para la preparación inmunógena se monitorea tomando pruebas de sangre y determinando la concentración de reactividad para GPCR-B4. 20 Cuando se obtienen concentraciones apropiadamente altas de anticuerpo para el inmunógeno, la sangre e:e recolecta del animal y se preparan los antisueros. Si se desea, se pueden hacer fraccionamientos adicionales de los antisueros para enriquecer los anticuerpos que reaccionan a
la proteína ( consul tar Harlow & Lañe, consul tar arriba) .
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante varias técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Brevemente, las células del baso de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, comúnmente por fusión con una célula mieloma ( consul tar Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol . 6:511-519 (1976)). Métodos alternativos de inmortalización incluyen transformación con el Virus Epstein Barr, oncógenos o retrovirus, u otros métodos muy conocidos en la técnica. Las colonias que se producen de células inmortalizadas únicas sen seleccionadas para producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas para el antígeno, y la producción de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células se puede mejorar mediante diversas técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Alternativamente, se puede aislar las secuencias del ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento que se une al mismo seleccionando una biblioteca de ADN ele las células humanas B de acuerdo con el protocolo generail delineado por Huse y colaboradores, Science (Cienciéi) 246:1275-1281 (1989) . Los anticuerpos monoclonales y los sueros policlonales se recolectan y titulan contra la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un
soporte sólido. Típicamente, los antisueros policlonales cc>n una concentración de 104 o mayor se seleccionan y prueban para observar su reactividad cruzada contra proteínas ro GPCR-B4 o incluso otras proteínas relacionadas de otrc'S 5 organismos, usando un inmunoensayo ligando competitivo. LC'S antisueros policlonales y los anticuerpos monoclonales específicos usualmente se unirán con un K_ de por lo menc>s aproximadamente 0.1 mM, más usualmente por lo menos aproximadamente 1 µM, opcionalmente por lo menos
aproximadamente 0.1 µM o mayor, opcionalmente 0.01 µM o mayor . Una vez que los anticuerpos específicos de GPCR-B4 están disponibles, GPCR-B4 puede detectarse mediante una variedad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de
procedimientos inmunológicos y de inmunoensayos, consulteir Basic and Clinical Immunology (Inmunología Básica y Clínica) (Stites & Terrs, eds., 7th ed. 1991). Más aún, los inmunoensayos de la presente invención se pueden realizar en cualesquiera de las diversas configuraciones, que se hain
revisado expresamente en Enzyme Immunoassay (Inmunoensayos Enzimáticos) (Maggio, ed. , 1980) ; y Harlow & Lañe, consul tar arriba . B . Ensayos de unión inmunológica Los GPCR-B4 se pueden detectar y cuantificar
utilizando cualquier número de muy reconocidos ensayos de
-<--Bi-&a¿--£._. -jaaaa-is.^a unión inmunológica ( consul tar, por ejemplo, Patente de lc>s Estados Unidos 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; y 4,837,168). Para una revisión de los inmunoensayos generales, ver también Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology (Métodos en Biología Celular: Anticuerpos en Biología Celular) , volumen 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunolosy (Inmunología Básica y Clínica) (Sites & Terr. Eds., 7th ecl. 1991) . Los ensayos de unión inmunológica (o inmunoensayos) típicamente usan un anticuerpo que se une a una proteína o antígeno de elección (en este caso el GPCR-B4 o subsecuencia antígena del mismo) . El anticuerpo (por ejemplo, anti- GPCR-B4) se puede producir mediante cualquier número de medios muy conocidos para los expertos en la técnica y como se describe a continuación. Los inmunoensayos también usan a menudo un agente marcador para unirse específicamente a y etiquetar el complejo formado por el anticuerpo y el antígeno. El agente marcador puede en sí mismo ser una de las mitades que comprende el complejo de anticuerpo/antígeno. De ese modo, e:l agente marcador puede ser un polipéptido de GPCR-B4 marcado o un anticuerpo anti-GPCR-B4 marcado. Alternativamente, el agente marcador puede ser una tercera porción, tal como un anticuerpo secundario, que específicamente se une al complejo del anticuerpo- GPCR-B4 (un anticuerpo secundario es típicamente específico a los anticuerpos de las especies de
"T donde se deriva el primer anticuerpo. Otras proteínas con capacidad de unirse específicamente a regiones constantes ce inmunoglobulina, tales como la proteína A o la proteína G también se pueden usar como agente marcador. Estas proteínas muestran una fuerte reactividad no inmunogénica con regiones constantes de inmunoglobulina de una variedad de especies ( consul tar, por ejemplo, Kronval y colaboradores , J. Immunol . (Boletín de Inmunología) 111:1401-1406 (1973); Akerstrom y colaboradores, J. Immunol . (Boletín de Inmunología) 135:258 -2542 (1985)) . El agente marcador puede ser modificado con una porción detectable, tal como la biotina, a la que otra molécula puede unirse específicamente, tal como estreptavidina. Una variedad de porciones detectables son mejor conocidas para los expertos en la técnica. Durante los ensayos, pueden ser necesarios los pasos de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Los pasos de incubación pueden variar desde aproximadamente 5 segundos a varias horas, opcionalmente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. S n embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato del ensayo, antígeno, el volumen de la solución, las concentraciones y similares. Usualmente, los ensayos se realizarán a temperatura ambiente, aunque pueden conducirse sobre un margen de temperatura, tales como 10°C a 40°C.
Formatos de ensayos no competitivos Los inmunoensayos para detectar el GPCR-B4 en las muestras pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en donde la cantidad de antígeno se mide directamente, en un ensayo "sandwich" preferido, por ejemplo, los anticuerpos de anti -GPCR-B4 se pueden unir directamente a un substrato sólido e-n el que son inmovilizados. Estos anticuerpos inmovilizados después capturan el GPCR-B4 presente en la muestra de prueba. El GPCR-B4 es así inmovilizado y después unido por un agente marcador, tal como un segundo anticuerpo de GPCR-B4 que porta una etiqueta. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede carecer de etiqueta, pero puede, en su momento, ser ligado por un tercer anticuerpo marcado específico a los anticuerpos de las especies de donde se deriva el segundo anticuerpo. El segundo o tercer anticuerpo típicamente se modifica con una porción detectable, tal como biotina, a la que otra molécula se une específicamente, por ejemplo, estreptavidina, para proporcionar una porción detectable. Formatos de ensayos competitivos En ensayos competitivos, la cantidad de GPCR-B4 presente en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un GPCR-B4 conocido, agregado (exógeno) desplazado (sacado de la competencia) de un anticuerpo ant:.-GPCR-B4 por el GPCR-B4 desconocido presente en una muestra.
-A r Jt? wrt-ate>*£ 3¿te & En un ensayo de competencia, una cantidad conocida de GPCR-B4 se agrega a una muestra y la muestra entonces entra en contacto con un anticuerpo que específicamente se une al GPCR-B4. La cantidad de GPCR-B4 exógeno unido al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de GPCR-B4 presente en la muestra. En una forma de realización particularmente preferida, el anticuerpo es inmovilizado sobre un sustrato sólido. La cantidad del GPCR-B4 unido al anticuerpo puede determinarse ya sea midiendo la cantidad de GPCR-B4 presente en un complejo de GPCR-B4/anticuerpo, o alternativamente midiendo la cantidad de la proteína restante no compleja. La cantidad del GPCR-B4 se puede detectar proporcionando una molécula GPCR-B4 marcada. Un ensayo de inhibición de haptenos es otro ensavo competitivo preferido. En este ensayo, el GPCR-B4 conocidc', se inmoviliza en un sustrato sólido. Una cantidad conocida ele anticuerpo de anti-GPCR-B4 se agrega a la muestra, y la muestra entonces entra en contacto con el GPCR-E14 inmovilizado. La cantidad de anticuerpo de anti-GPCR-B4 unido al GPCR-B4 inmovilizado conocido es inversamente proporcionail a la cantidad de GPCR-B4 presente en la muestra. De nuevo, la cantidad del anticuerpo inmovilizado se puede detectaír observando ya sea la fracción inmovilizada de anticuerpos o la fracción del anticuerpo que permanece en la solución. La detección puede ser directa cuando se marca el anticuerpo o indirecta mediante la subsecuente adición de una porción etiquetada que específicamente se une al anticuerpo como ee describe a continuación. Determinaciones de reactividad cruzada Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva también se pueden usar para determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, una proteína codificada por lo mencs parcialmente por SEQ ID NOS: 1-2, y 7 puede ser inmovilizada a un soporte sólido. Las proteínas (por ejemplo, proteínas y homólogos GPCR-B4 se agregan al ensayo que compite por la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La habilidad de las proteínas agregadas para competir en la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la habilidad del GPCR-B4 codificado por SEQ ID NO: 1-2 ó 7 para competir con ella misma. El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores, se calcula usando cálculos regulares. Estos antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteína agregadas señaladas anteriormente se seleccionan y se reúnen en lotes. La inmunoabsorción con las proteínas agregadas consideradas, por ejemplo homólogos distantemente relacionados. Los antisueros inmunoabsorbidos y combinados se usem entonces en un inmunoensayo de unión competitiva como se describe anteriormente para comparar una segunda proteínei, siendo tal vez un alelo o una variante polimórfica de GPCR-B4 a la proteína inmunogénica (es decir, GPCR-B4 de SEQ ID NOS: 1-2 ó 7) . A fin de hacer esta comparación, se ensayan las dos proteínas cada una a una amplia variedad de concentraciones y la cantidad de cada proteína requerida para 5 inhibir 50% del ligando de los antisueros a la proteína inmovilizada se determina. Si la cantidad de la segunda proteína requerida para inhibir 50% del ligando es menor a 10 veces la cantidad de la proteína codificada por SEQ ID NOS : 1 - 2, ó 7 que es requerida para inhibir 50% del ligandC',
entonces la segunda proteína se dice que se ure específicamente a los anticuerpos policlonados generados para un inmunógeno GPCR-B4. Otros formatos de ensayo El análisis Western blot (inmunoblot) se usa para
detectar y cuantificar la presencia de GPCR-B4 en la muestra . La técnica comprende generalmente la separación de las proteínas de muestra por medio de electrofóresis de gel sobre la base del peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado, tal como filtro de
nitrocelulosa, un filtro de nylon o un filtro de nylon derivado) e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente a GPCR-B4. Los anticuerpos de anti-GPCR- B4 se unen específicamente al GPCR-B4 en el soporte sólido. Estos anticuerpos pueden marcarse directamente o
alternativamente pueden detectarse posteriormente usando
anticuerpos marcados (por ejemplo, anticuerpos antiratón ce oveja marcada) que se unen específicamente a los anticuerpcs anti-GPCR-B4. Otros formatos de ensayo incluyen los inmunoensaycs liposomas (LIA) , que usan liposomas designados para unir moléculas específicas (por ejemplo, anticuerpos) y liberar reactivos o marcadores encapsulados. Los químicos liberadC'S son entonces detectados de acuerdo a las técnicas normales
( consul tar, Monroe y colaboradores, Amer. Clin . Prod . Rev. 5:34-41 (1986) ) . Reducción de ligadura no específica Un experto en la técnica apreciará que a menudo es deseable minimizar la ligadura no específica en los inmunoensayos. Particularmente, cuando el ensayo incluye un antigeno o anticuerpo inmovilizado en un substrato sólido es deseable minimizar la cantidad de ligadura no específica para el sustrato. Los medios para reducir dicha ligadura o específica son bien conocidos por los expertos en la técnicei. Típicamente, está técnica incluye recubrimiento del sustrato con una composición proteinásea. En particular, lais composicioes con proteínas tales como albúmina de suero bovino (BSA) , lecha sin grasa en polvo, y gelatina se usan ampliamente siendo la preferida la leche en polvo.
Marcadores El marcador particular o el grupo detectable usado en el ensayo no es un aspecto importante de la invención, siempre y cuando no interfiera de manera significativa con la 5 ligadura específica del anticuerpo usado en el ensayo. El grupo detectable puede ser cualquier material que tiene una propiedad física o química detectable. Dichos marcadores detectables han sido bien desarrollados en el campo de les inmunoensayos y, en general, la mayoría de cualquier marcador
útil en dichos métodos puede aplicarse a la siguiente invención. Así, un marcador es una composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la presente invención incluyen unas
perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS™) , los tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina y similares) , radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C ó 32P) , enzimas (por ejemplo, peroxidasa de horse radish, fosfatasa alcalina y otros
comúnmente usados en un ELISA) , y marcadores colorimétricos, tales como oro coloidal o hierbas de color o perlas de plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc. ) . El marcador puede acoplarse directamente o
indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo a
los métodos conocidos en la técnica. Como se indica anteriormente, se puede usar una gran variedad de marcadores., dependiendo de la elección del marcador de la sensibilidad requerida, facilidad de conjugación con el compuesto, los requisitos de estabilidad, la instrumentación disponible y las disposiciones de eliminación. Con frecuencia, los marcadores no radioactivos se usan mediante medios indirectos. Generalmente, una molécula ligando (por ejemplo, biotina) se liga covalentemente a la molécula. El ligando entonces se une a una molécula de otrais moléculas (por ejemplo, estreptavidina), que se detecta inherentemente o se une covalentemente a un sistema de señal , tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimiluminiscente . Los ligandos y sus objetivos se pueden usar en cualquier combinación adecuada con los anticuerpos que reconocen el GCPR-B4, o los anticuerpos secundarios que reconocen el anti-GCPR-B4. Las moléculas también se pueden conjugar directamente a los compuestos generadores de señales, por ejemplo, mediante conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como los marcadores serán principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, estearasas y glicosidasas, u oxidotasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimiluminiscentes incluyen luciferina, y 2,3- dihidrofatalazinedionas, por ejemplo, lummol . Para una revisión de varios sistemas productores de marcadores o señales que se pueden usar, consultar la Patente de les 5 Estados Unidos Número 4,391,904. Los medios para detectar los marcadores son m?y conocidos por los expertos en la técnica. Así, por ejemplc>, cuando el marcador es un marcador radioactivo, los medicas para detección incluyen un contador de escintilación o
película fotográfica como en autoradiografía. Cuando 'l marcador es un marcador fluorescente, ésta puede detectarse excitando el fluorocromo con la longitud de onda de luz apropiada y detectando la fluorescencia resultante. La fluorescencia se puede detectar visualmente, por medio de
película fotográfica, por el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos acoplados de carga o por foto ultiplicadores y equivalentes. De manera similar, los marcadores enzimáticios se pueden detectar proporcionando los substratos apropiados para la enzima y detectar el producto
de reacción resultante. Finalmente, los marcadores colirimétricos sencillos se pueden detectar tan so..o observando el color asociado con el marcador. Así, varios ensayos de flotadores de varilla, el dorado conjugado a menudo parece rosa, mientras que varias perlas conjugadas
parecen tener el color de la perla.
Algunos formatos de ensayo no requieren el uso de componentes marcados. Por ejemplo, los ensayos de aglutinación se pueden usar para ¡detectar la presencia de los anticuerpos meta. En este caso, las partículas recubiertas 5 con antígeno se aglutinan mediabte muestras que comprenden los anticuerpos meta. En este formato, ninguno de los componentes necesita estar marcado y la presencia del anticuerpo meta se detecta mediante la sencilla inspección visual . 10 VI. Ensayos para moduladores de ¡GCPR-B4 Ensayos para actividad de GCPR-B4 GCPR-B4 y sus alelos y i variantes polimórficas sen receptores acoplados con proteínas G que participan en transducción de sabores. La actividad de los polipéptidos 15 GCPR-B4 se puede evaluar usando! una variedad de ensayos in vi tro y in vivo para determinar los efectos funcionales, químicos y físicos, por ejemplo, medir la ligadura de ligando (por ejemplo, ligadura de ligiando radioactivo) , segundos mensajeros (por ejemplo, AMPc, cGMP, IP3, DAG, ó Ca2+) , flujo 20 iónico, niveles de fosforilación, niveles de trascripción, niveles de neurotransmisores, similares. Además, dichos ensayos se pueden usar para I probar los inhibidores y activadores de GCPR-B4. Los moduladores también pueden ser versiones genéticamente alteradas de GCPR-B4. Dichos
£&§ ti to¡£^a3 ?mesB-*is. -»¡3»fc 8aÜ »l »- ,- >Ja.
moduladores de actividad de transducción gustativa son útiles para especificar sabores. El GCPR-B4 del ensayo se seleccionará de ?n polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NOS: 1-2, ó 7 o 5 la variante moderadamente modificada de la misma . Alternativamente, el GCPR-B4 del ensayo se derivará de una eucariota e incluye una subsecuencia de aminoácidos que tiere la identidad de secuencia de aminoácido SEQ ID NOS: 1-2, ó 7. Generalmente, la identidad de secuencias de aminoácidos será 0 por lo menos de 70%, opcionalmente por lo menos 85°;, opcionalmente por lo menos 90-95%. Opcionalmente, e'l polipéptido de los ensayos comprenderá un dominio de GCPR-B , tal como un dominio extracelular, dominio transmembranéi, dominio citoplásmico, dominio que une el ligando, dominio de 5 asociación de subunidades, sitio activo, y equivalentes. El GCPR-B4 o un dominio del mismo se puede unir covalentemente a una proteína heteróloga para crear una proteína quimérica que se usa en los ensayos descritos en el presente. Los moduladores de la actividad de GCPR-B4 son probados usando polipéptidos de GCPR-B4 como se describe anteriormente, ya sea recombinante o natural. La proteína se puede aislar, expresada en una célula, expresada en una membrana derivada de una célula, expresada en tejido o en un animal, ya sea recombinante o natural. Por ejemplo, rebanadas de lengua, células disociadas de una lengua, células
transformadas o membranas pueden usarse. La modulación se prueba usando uno de los ensayos in vi tro o in vivo descritos en el presente. La transducción de sabores también se puede examinar in vi tro con reacciones solubles o en estado sólido, 5 usando una molécula quimérica tal como un dominio extracelular de un receptor ligado covalentemente a ?n dominio de transducción de señal heteróloga, o un dominio extracelular heterólogo ligado covalentemente a un dominio transmembrana y/o citoplásmico de un receptor. Además, los
dominios que se unen a ligandos de la proteína de interés ee pueden usar en reacciones in vi tro en estado soluble o sólic para ensayar la unión de ligando. La unión de ligando al GCPR-B4, un dominio, o proteína quimérica se puede probar en solución, en una
molécula de dos capas, unida a una fase sólida, en un lípiclo de capa única, o en vesículas. La ligadura de un modulador puede ser probada usando, por ejemplo, cambios en características espectroscópicas (por ejemplo, índice de fluorescencia, absorbancia, o refractivo) propiedades
hidrodinámicas (por ejemplo, forma) cromatográficas o de solubilidad. Las interacciones de la proteína G del receptor también pueden examinarse. Por ejemplo, la unión de I.a proteína G al receptor o su liberación del mismo puede
examinarse. Por ejemplo, en ausencia de GTP, un activador
conducirá la formación de un complejo compacto, y después seleccionar los inhibidores observando en la disociación del complejo del receptor/proteína G. En la presencia de GTP, la liberación de la subunidad alfa de la proteína G de las otras dos subunidades de proteína G sirve como un criterio de activación. Una proteína G activada o inhibida en su momento alterará las propiedades de las enzimas meta, los canales y otras proteínas del efector. Los ejemplos clásicos son la activación de fosfodiesterasa GMPc por transducina en el sistema visual, ciclasa de adenilato, la proteína G estimuladora, fosfolipasa C por Gq y otras proteínas G cognadas, y la modulación de diversos canales por Gi y otras proteínas G. Las consecuencias descendentes también se pueden examinar tal como la generación de glicerol de diacilo e IP3 por fosfolipasa C, y en turno, para la movilización del calcio por IP3. Los receptores activados de GPCR se vuelven sustratc>s para las quinasas que fosforilan el extremo de la terminal C del receptor (y posiblemente otros sitios también). Así, los activadores fomentarán la transferencia de 32P del GTP con marcador gama para el receptor, que puede ser ensayado con un contador de escintilación. La fosforilación del extremo de la terminal C fomentará la unión de las proteínas similares a arrestina e interferirán con la ligadura de las proteínas G.
La ruta de las quinasas/arrestina jugará un papel clave en la desensibilización de muchos receptores de GPCR. Por ejemplc, los compuestos que modulan la duración en que un receptor de sabor permanece activo serían útiles como medios para prolongar un sabor deseado o interrumpir uno desagradable . Para una revisión general de transducción de señales de GPCR y los métodos para ensayar la transducción de señales , consul tar, por ejemplo, Methods in Enzimology (Métodos en Enzimología) , volúmenes 237 y 238 (1994) y volumen 96 (1983); Bourne y colaboradores, Nature (Naturaleza) 10:349:117-27 (1991); Bourne y colaboradores, Nature (Naturaleza) 348:125-32 (1990) ; Pitcher y colaboradores , Annu . Rev. Biochem . (Revisión de Anuario de Bioquímica) 67:653-92 (1998) . Las muestras o ensayos que reciben tratamiento con un inhibidor o activador potencial de GCPR-B4 se comparan a las muestras control sin el compuesto de prueba, para examinar la extensión de la modulación. Las muestras control (s n tratamiento con activadores o inhibidores) se asignan al valor relativo de la actividad de GCPR-B4 de 100. La inhibición de GCPR-B4 se logra cuando el valor de la actividad de GCPR-B4 relativo al control es de aproximadamente 90%, opcionalmente 50%, opcionalmente 25-0%. La activación de GCPR-B4 se logra cuando el valor de actividad de GCPR-B4 relativo al control es de 110%, opcionalmente 150%, 200-500% ó 1,000-2000%.
Los cambios en el flujo iónicos se pueden evaluar determinando los cambios en la polarización (es decir, potencial eléctrico) de la célula o la membrana que expresa GCPR-B4. Un medio para determinar los cambios en la polarización celular es midiendo los cambios en la corriente (por lo mismo midiendo los cambios en la polarización) ccn técnicas de pinza con voltaje y pinza de conexión provisional, por ejemplo, el modo "de célula unida", el moco "de adentro hacia afuera" y el modo "célula completa" ( consul tar, por ejemplo, Ackerman y colaboradores , New Engl .
J. Med. (Boletín Médico de Nueva Inglaterra) 336 : 1575-15S'5
(1997)). Las corrientes en toda la célula se determinan convenientemente usando la metodología estándar ( consul tar, por ejemplo, Mail y colaboradores, Pflugers . Archiv. 391:85 (1981). Otro análisis conocido incluye: ensayos de flujo iónico radiomarcado y ensayos de fluorescencia usando tinte:s sensibles al voltaje ( consul tar, por ejemplo, Vestergarrd-Bogind y colaboradores, J. Pharmacol . Meth . (Boletín de Método Farmacológico) 25:185-193 (1991); Holevinsky y colaboradores , J. Membrane Biology (Boletín de Biología de Membrana) 137:59-70 (1994)). Generalmente, los compuestos que van a probarse se presentan en el margen de 1 pM hasta 100 mM. Los efectos de los compuestos de prueba en la función de los polipéptidos se pueden medir examinando cualesquiera de los parámetros arriba descritos. Cualquier cambio fisiológico adecuado que afecta la actividad de GPCR se puede usar para evaluar la influencia de un compuesto de prueba sobre los polipéptidos de esta invención. Cuando las 5 consecuencias funcionales se determinan usando células o animales intactos, también se puede medir una variedad de efectos, tales como liberación de transmisores, liberación de hormonas, cambios trascripcionales, tanto para marcadores genéticos conocidos como no caracterizados (por ejemplc,
northern blots) , cambios en el metabolismo de la célula tales como crecimiento de célula o cambios de pH, y cambios en segundos mensajeros intracelulares como Ca2+, IP3 ó AMPc. Los ensayos preferidos para receptores acoplados ccn proteína G incluyen células que son cargadas con iones o
tintes sensibles al voltaje para reportar la actividad receptora. Los ensayos para determinar la actividad de dichc>s receptores también pueden usar agonistas y antagonistas conocidos para otros receptores acoplados con proteína G como controles negativos o positivos para evaluar la actividad de
los compuestos examinados. En ensayos para identificar los compuestos moduladores (por ejemplo, agonistas, antagonistas, los cambios en el nivel de iones en el citoplasma o el voltaje en la membrana se monitorearán usando un indicador fluorescente de voltaje sencillo a los iones o de membrana,
respectivamente. Entre los indicadores sensibles a los iones
y los medidores de voltaje que se pueden emplear están les que se revelan en los Catálogos de Medidores Moleculares de 1977. Para los receptores acoplados con proteínas G, las proteínas G promiscuas tales como Gal5 y Galß se pueden usar en el ensayo de elección (Wikie y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . USA (Procedimiento de la Academia Nacional de Ciencias EUA) 88:10049-10053 (1991)). Dichas proteínas G promiscuas permiten el acoplamiento de un amplio rango de receptores . La activación de receptores típicamente inicia eventos intracelulares subsecuentes, por ejemplo, aumentos en los segundos mensajeros tales como IP3, que libera memorias intracelulares de iones de calcio. La activación de alguncs receptores acoplados con proteínas G estimula la formación ele trifosfato de inositol (IP3) a través de hidrólisis mediacla con fosfolipasa C de fosfatidilinositol (Berridge & Irvine, Nature (Naturaleza) 312:315-21 (1984)). IP3 en turno estimula la liberación de las memorias intracelulares de iones de calcio. Así, un cambio en los niveles de iones de calcio citoplásmicos, o un cambio en niveles de segundos mensajeros tales como IP3 se pueden usar para evaluar la función de los receptores acoplados con proteína G. Las células que expresan a dichos receptores acoplados con proteína G pueden mostrar niveles aumentados de calcio citoplásmico como resultado de la contribución, tanto de las memorias intracelulares como
. i vía activación de canales de iones, en cuyo caso, puede ser conveniente aunque no necesario, conducir dichos ensayos en reguladores libres de calcio, opcionalmente suplementados ccn un agente quelante tal como EGTA, para distinguir la respuesta de fluorescencia resultante de la liberación del calcio de las memorias internas. Otros ensayos pueden incluir la determinación de la actividad de los receptores que, cuando se activan, dan como resultado un cambio en el nivel de los nucleótidos cíclicc'S intracelulares, por ejemplo, AMPc ó cGMP, activando o inhibiendo las enzimas tales como la ciclasa de adenilatC'. Existen canales de iones de compuertas de nucleótidc>s cíclicos como por ejemplo, canales de células fotorreceptoras de varilla y canales de neuronas olfactorias que son permeables a los cationes tras la activación mediante unión de AMPc ó cGMP ( consul tar, por ejemplo, Altenhofen y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimiento de la Academia Nacional de Ciencias EUA) 88:9868-9872 (1991) y Dhallan y colaboradores, Nature (Naturaleza) 347-184-187 (1990)). En casos donde la activación del receptor resulta en una disminución en los niveles de nucleótidos cíclicos, puede ser preferible exponer las células a los agentes que aumentan los niveles de nucleótidos cíclicos intracelulares, por ejemplo, forskolina, antes de agregar un compuesto activador de receptores a las células en el ensayo. Las células para
este tipo de ensayo se pueden elaborar por cotransfección de una célula huésped con ADN que codifica un canal de iones encajados de nucleótidos cíclicos, la fosfatasa del GCPR y el ADN que codifica un receptor, por ejemplo, ciertos receptores 5 de glutamato, receptores de acetilcolina muscarínica, receptores de dopamina, receptores de serotonina, y similares) , que, cuando se activan, ocasiona un cambio en les niveles de nucleótidos cíclicos en el citoplasma. En una forma de realización preferida, la actividad
de GCPR-B4 se mide expresando GCPR-B4 en una célula heteróloga con una proteína G promiscua que enlaza el receptor a una ruta de transducción de señal C de fosfolipaea ( consul tar Offermanns & Simón, J. Biol . Chem. (Boletín de Biología Química) 270:15175-15180 (1995); consul tar también
Ejemplo II) . Opcionalmente, la línea de la célula es HEK-2S'3 (que no expresa naturalmente a GCPR-B4) y la proteína G promiscua es Gal5 (Offermanns & Simón, consul tar arriba) . La modulación de la transducción de sabor se examina midiendo los cambios en los niveles de Ca2+ intracelulares, que cambiam
en respuesta a la modulación de la ruta de transducción de señal de GCPR-B4 vía la administración de una molécula que se asocia con GCPR-B4. Los cambios en los niveles de Ca2+ se miden opcionalmente usando tintes indicadores fluorescentes para Ca2+ y creación de imágenes fluorométricas .
En una forma de realización, los cambios en AMPc ó cGMP intracelular pueden medirse inmunoensayos. El método descrito en Offermanns & Simón, J. Biol . Chem . (Boletín de Biología Química) 270:15175-15180 (1995) se puede usar para determinar el nivel de AMPc. También, el método descrito en Felley-Bosco, y colaboradores, Am. J. Resp . Cell and Mol . Biol . 11:159-164 (1994) se puede usar para determinar el nivel de cGMP. Además, un estuche de ensayo para medir AMPc y/o cGMP se describe en la Patente de los Estados Unidos 4,115,538, que se incluye en la presente por referencia. En otra forma de realización, la hidrólisis de inositol de fosfatidil (Pl) se puede analizar de acuerdo a la Patente de los Estados Unidos 5,436,128, que se incluye en el presente por referencia. Brevemente, el ensayo incluye etiquetar las células con 3H-mioinositol durante 48 horas o más. Las células marcadas reciben tratamiento con m compuesto de prueba para una hora. Las células tratadas reciben lisis y se extraen en agua con cloroformo y metanol después de lo cual los fosfatos de inositol fueron separados mediante cromatografía de cambio de iones y se cuantificaron por conteo de escintilación. La estimulación de los pliegues se determina calculando la relación de cpm en la presencia del agonista para cfm en la presencia del control de:l regulador. Asimismo, la inhibición del pliegue se determina calculando la relación de cpm en la presencia del antagonista
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para cpm en la presencia del control de regulador (que puede o no contener un agonista) . En otra forma de realización, los niveles de trascripción se pueden medir para evaluar los efectos de un 5 compuesto de prueba en la trasducción de señales. Una célula huésped que contiene la proteína de interés entra en contacto con un compuesto de prueba durante el tiempo suficiente para efectuar cualesquiera interacciones, y después el nivel de la expresión del gen se mide. La cantidad de tiempo para
efectuar dichas interacciones puede determinarse empíricamente, tal como corriendo un curso de tiempo y midiendo el nivel de trascripción como una función de tiempo . La cantidad de trascripción puede medirse usando cualquier método adecuado conocido por los expertos en la técnica. Per
ejemplo, la expresión ARNm de la proteína de interés puece detectarse usando northern blots o sus productos polipéptidcs pueden identificarse usando inmunoensayos. Alternativamente', los ensayos con base en trascripciones que usan en relator pueden usarse como se describe en la Patente de los Estados
Unidos Número 5,436,128, que se incluye en el presente por referencia. Los genes relatores pueden ser, por ejemplo, acetiltransferasa de cloranfenicol, luciferaza de luciérnagas, luciferaza bacterial, ß-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Además, la proteína de interés se puede
usar como un relatador indirecto vía la unión a un segundo
relatador como una proteína fluorescente verde ( consul tar, por ejemplo, Mistili & Spector, Nature Biotechnology (Biotecnología Natural) 15:961-964 (1997)). La cantidad de trascripción se compara entonces a la cantidad de trascripción en la misma célula en ausencia del compuesto de prueba, o se puede comparar con la cantidad de trascripción en una célula substancialmente idéntica que carece de la proteína de interés. Una célula substancialmente idéntica se puede derivar de las células de las que la célula recombinante fue preparada pero que no han sido modificadas mediante introducción de ADN heterólogo. Cualquier diferencia en la cantidad de la trascripción indica que el compuesto ce prueba ha alterado de alguna manera la actividad de la proteína de interés. B . Moduladores Los compuestos probados como moduladores de GCPR-B4 puede ser cualquier compuesto químico pequeño, o una entideid biológica, tal como una proteína, azúcar, ácido nucleico o lípido. Alternativamente, los moduladores pueden se;r versiones genéticamente alteradas de GCPR-B4. Típicamente, los compuestos de prueba serán moléculas químicas pequeñas y péptidos. Esencialmente, cualquier compuesto químico se puede usar como un modulador potencial o ligando en los ensayos de la invención, aunque con mayor frecuencia se usan compuestos que puedan disolverse en soluciones acuosas u orgánicas (especialmente con bases de DMSO) . Los ensayos están diseñados para seleccionar grandes bibliotecas de substancias químicas mediante la automatización de los pasos del ensayo y proporcionando compuestos de cualquier fuente conveniente 5 para ensayos, que se corren típicamente en paralelo (por ejemplo, en formatos de microvalorador sobre placas microvaloradoras en ensayos roboticos) . Se apreciará q?e existen muchos proveedores de compuestos químicos, incluyendo Sigma (St. Louis, MO) , Aldrich (St. Louis, MO) , Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO) , Fluka Chemika-Biochemica Analítica (Bucrs Switzerland) y equivalentes. En una forma de realización preferida, los métodos efe selección de alto rendimiento incluyen el suministro de una biblioteca combinatoria de químicos o péptidos que contiene
un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (modulador potencial o compuestos de ligando) . Dichas "bibliotecas de químicos combinatorios" o "bibliotecas de ligandos" se seleccionan entonces en uno o más ensayos (como se describe en el presente, para identificar esos elementos
de la biblioteca (especies o subclases particulares de químicos) que demuestran una actividad característica conveniente. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos guía" convencionales o pueden en sí mismos ser usados como terapéuticos potenciales o reales.
-•^ejtet *_*?8tf? Una biblioteca de químicos combinatorios es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica, combinando un número de "bloques de construcción" de químicos tales como los 5 reactivos. Por ejemplo, una biblioteca de químicos combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipéptidcs se forma combinando un conjunto de bloques de construcción de químicos (aminoácidos) en cada forma posible para una longitud determinada de compuestos (es decir, el número de
aminoácidos en un compuesto polipéptido) . Millones ce compuestos químicos se pueden sintetizar a través de dicha mezcla combinatoria de bloques de construcción de químicos. La preparación y selección de las bibliotecas de químicos combinatorios es bien conocida para los expertos en
la técnica. Dichas bibliotecas de químicos combinatorios incluyen, pero no se limitan a, bibliotecas de péptidos ( consul tar, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos 5,010,175, Furka, Int . J. Pept . Prot . Res . 37:487-493 (1991) y Houghton y colaboradores, Nature (Naturaleza) 354:84-88
(1991) ) . También se pueden generar otras químicas para generar bibliotecas con diversidad de químicos. Dichas químicas, incluyen, pero no se limitan a: peptoides (por ejemplo, la Publicación de PCT Número 91/19735) , péptidos codificados (es decir, Publicación de PCT Número 93/20242) ,
biooligómeros aleatorios (es decir, Publicación de PCT Número
_H______________________________§ WO 92/00091) , benzodiacepinas (es decir, Patente de los Estados Unidos Número 5,288,514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimiento de 5 la Academia Nacional de Ciencias EUA) 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinilogos (Hagihara y colaboradores , J. Amer. Chem . Soc . 114:6568 (1992)), peptidomiméticos sin peptidil con andamiajes de glucosa (Hirschmann y colaboradores, J. AMER . Chem . Soc . 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas
análogas de pequeñas bibliotecas de compuestos (Chen y colaboradores, J. AMER . Chem. Soc . 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho y colaboradores, Sicence (Ciencia) 261:1303 (1993)), y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell y colaboradores, J. Org. Chem. 59:658 (1994)), bibliotecas de
ácidos nucleicos (consul tar, Ausubel, Berger y Sambrook, consul tar arriba todos) , bibliotecas de ácido nucleicos de péptido ( consultar, por ejemplo, la Patente de los Estadcs Unidos 5,539,083), bibliotecas de anticuerpos ( consul tar, por ejemplo, Vaughn y colaboradores , Nature Biotechnology
(Biotecnología Natural) 14 (3) : 309-314 (1996) y PCT/US96/10287) , bibliotecas de carbohidratos ( consultar, por ejemplo, Liang y colaboradores, Science (Ciencia) , 274:1520- 1522 (1996) y la Patente de los Estados Unidos 5,593,853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (consultar, por
ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, 18 de enero, página 33
(1993) ; isoprenoides, Patente de los Estados Unidos 5,569,588; tiazolidinonas y metatiazonas, Patente de los Estados Unidos 5,549,974; pirrolidinas, Patentes de los Estados Unidos 5,525,735 y 5,519,134; compuestos de 5 morfolino, Patente de los Estados Unidos 5,506,337; benzodiazepinas, 5,288,514 y similares). Los dispositivos para la preparación de las bibliotecas combinatorias se pueden conseguir comercialmente ( consul tar, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem
Tech, Louisville NY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA) . Además, las numerosas bibliotecas combinatorias pueden ellas mismas conseguirse comercialmente ( consul ta r, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St .
Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.). C. Ensayos de al to rendimiento de estado sólido y soluble En una forma de realización, la invención proporciona ensayos solubles usando moléculas tales como un dominio que
se une al ligando, un dominio extracelular, un dominio transmembrana (por ejemplo, uno que comprende siete regiones de transmembrana y lazos citosólicos) , el dominio transmembrana y un dominio citoplásmico, un sitio activo, una región de asociación de subunidades, etc.; un dominio que se
enlaza covalentemente a una proteína heteróloga para crear
^j¡ &26^^^^^^^^fe£8^^^^^^^^^é j una molécula quimérica; GCPR-B4; o una célula o tejido que expresa a GCPR-B4, ya sea de manera natural o recombinante. En otra forma de realización, la invención proporciona ensayos in vi tro con base en fases sólidas en un formato de alto rendimiento, donde el dominio, la molécula quimérica, el GCPR-B4 o la célula o tejido que expresa a GCPR-B4 se une a un sustrato de fases sólida. En los ensayos de alto rendimiento de la invención, es posible seleccionar hasta varios miles de moduladores diferentes o ligandos en un solo día. En particular, cada pozo de una placa microevaluadora se puede usar para realizar un ensayo separado contra un modulador potencial seleccionado, o si los efectos de los tiempos de concentración o incubación van a observarse, cada 5-10 pozos se puede probar un modulador único. De este modo, una sola placa microevaluadora estándar puede examinar aproximadamente 100 (por ejemplo 96) moduladores. Si se usan 1536 placas de pozo, entonces una sola placa puede examinarse fácilmente de aproximadamente 100- aproximadamente 1500 compuestos diferentes. Es posible examinar varias placas diferentes por día; las selecciones de ensayos para hasta aproximadamente 6,000 - 20,000 diferentes compuestos es posible usando los sistemas integrados de la invención. Más recientemente, se han desarrollado los enfoques microfluídicos para manipulación de reactivos, por ejemplo, por Calipsr Technologies (Palo Alto, CA) . La molécula de interés puede ser unida al componente de estado sólido, directa o indirectamente, vía ligamiento covalente o no covalente, por medio de un marcador. El marcador puede ser cualquiera de una variedad de componentes . En general, una molécula que une al marcador (un aglutinan e de marcador) se fija a un soporte sólido, y la molécula de interés marcada (por ejemplo, la molécula de interés de transducción de sabor) se une al soporte sólido mediante la interacción del marcador y el aglutinante del marcador. Un número de marcadores y aglutinantes de marcadores se pueden usar, con base a interacciones moleculares bien conocidas descritas en la literatura. Por ejemplo, cuando un marcador tiene un aglutinante natural, por ejemplo, biotina, proteína A o proteína G, éste puede ser usado en conjunción con aglutinantes apropiados de marcadores (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región de Fc de una inmunoglobulina, etc.). Los anticuerpos para las moléculas con aglutinantes naturales tales como la glutina también son aglutinantes de marcadores ampliamente disponibles y apropiados; consul tar, SIGMA ImmunoChemicals 1998 catalogue SIGMA, St. Louis, MO) . Similarmente, cualquier compuesto hapténico o antigénico puede usarse en combinación con un anticuerpo
apropiado para formar una pareja de marcador/aglutinante de marcador. Miles de anticuerpos específicos pueden conseguirse comercialmente y muchos anticuerpos adicionales se describen en la literatura. Por ejemplo, en una configuración común, e'l marcador es un primer anticuerpo y el aglutinante de marcador es un segundo anticuerpo que reconoce al primer anticuerpo. Además, las interacciones de anticuerpos-antígenos, las interacciones receptores-ligandos también son apropiadas como parejas de marcador y aglutinante de marcador. Por ejemplc», los agonistas y antagonistas de los receptores de membrana celular (por ejemplo, interacciones de receptores-ligandos de células tales como transferrina, c-kit, ligandos virales receptores, receptores de citosina, receptores de quemocinai, receptores de interleuquina, receptores de inmunoglobulina y anticuerpos, la familia cadereina, la familia integrina, la familia selectina y similares; consultar, por ejemplo, Pigott & Power, The Adhesión Molecule Facts Book I (1993) . Similarmente, las toxinas y los venenos, los epítopes virales, hormonas (por ejemplo, opiates, esteroides, etc.), los receptores intracelulares (por ejemplo, los que median los efectos de varios ligandos pequeños, incluyendo los esteroides, la hormona tiroidea, retinoides y vitamina D; péptidos) , fármacos, lectinas, azúcares, ácidos nucleicos
(tanto en configuraciones de polímeros lineales cono cíclicos) , oligosacáridos, proteínas, fosfolípidos y anticuerpos pueden todos interactuar con diversos receptores de células. Los polímeros sintéticos, tales como poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileneiminas, sulfuros de poliarileno, polisiolxanos, polimidas y poliacetatos también pueden formar un marcador o un aglutinante de marcador apropiado. Muchos otros pares de marcador/aglutinante marcador también son útiles en sistemas para ensayos descritos en el presente, como podrá apreciar un experto al revisar esta invención. Ligandos comunes tales como péptidos, poliéteres y similares también pueden servir como marcadores e incluyen secuencias de polipéptidos, tales como secuencias poli gli de entre aproximadamente 5 y 2000 aminoácidos. Estos ligadores flexibles son conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, los ligadores de polietilenglicol están disponibles de Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama. Estos ligadores opcionalmente tienen ligamientos de amidas, ligamentos sulfidrilo, o ligamentos heterofuncionales. Los aglutinantes de marcador se fijan a los substratos sólidos usando cualquier variedad de métodos actualmente disponibles. Los substratos sólidos se derivan comúnmente o funcionalizan mediante la exposición de toda o una porción del substrato para un reactivo químico que fija un grupo químico a la superficie que es reactiva con una
____ |____¡ porción del aglutinante del marcador. Por ejemplo, los grupos que son adecuados para unirse a una larga porción de cadena incluirán los grupos aminas, hidroxilo, tilo y carboxilo. Los aminoalquilsilanos y los hidroxialquilsilanos se pueden usar para funcionalizar una variedad de superficies, tales corno superficies de vidrio. La construcción de tales organizaciones de biopolímeros de fase sólida se describe en la literatura. Consul tar, por ejemplo, Merrifield, J". Am. Chem. Soc . 85:2149-2154 (1963) (que describe la síntesis de los componentes o péptidos de fase sólida) ; Geysen y colaboradores, J. Immun . Meth . 102:259-274 (1987) (que describe la síntesis de varias secuencias de péptidos en discos de celulosa) ; Fodor y colaboradores , Science
(Ciencia) , 251:767-777 (1991); Sheldon y colaboradores, Clinical Chemistry (Química Clínica) 39 (4) : 718-719 (1993); y Kozal y colaboradores, Nature Medicine (Medicina Natural) 2(7) :753759 (1996) (todos describiendo organizaciones de biopolímeros fijados a sustratos sólidos) . Los enfoques no químicos para fijar los aglutinantes de marcador a los sustratos incluyen otros métodos comunes, tales como el calor, reticulación mediante radiación ultravioleta, y similares. D. Ensayos con base a computadora Otro ensayo más para los compuestos que modulan . '.a actividad de GCPR-B4 incluye el diseño de fármacos asistido por computadora, en el que un sistema de cómputo se usa para generar una estructura tridimensional de GCPR-B4 con base en la información estructural codificada por la secuencia de aminoácidos . La secuencia de aminoácidos introducida interactúa directamente y activamente con el algoritmo preestablecido en un programa de cómputo para produc:.r modelos estructurales secundarios, terciarios y cuaternarios de la proteína. Los modelos de la estructura técnica se examinan entonces para identificar las regiones de la estructura que tiene la habilidad de ligar, por ejemplo, ligandos. Estas regiones se usan entonces para identificar los ligandos que se unen a la proteína. El modelo estructural tridimensional de la proteína se genera introduciendo secuencias de aminoácidos proteínicos de por lo menos 10 residuos de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos correspondientes que codifican un polipéptido de GCPR-B4 en el sistema de cómputo. La secuencia de aminoácidos del polipéptido del ácido nucleico que codifica al polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-2, ó 7 ó SEQ ID NOS: 3 -4, ó 8 y versiones moderadamente modificadas de las mismas. La secuencia de aminoácido representa la secuencia primaria o subsecuencia de la proteína, que codifica la información estructural de la proteína. Por lo menos 10 residuos de la frecuencia de aminoácidos (o una secuencia de nucleótidos que codifica a 10 aminoácidos se introducen en el sistema de cómputo desde los teclados, substratos legibles por computadora que incluyen, pero no se limitan a, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, disquetes magnéticos, cintas, cartuchos y chips) , medios óptimos que (por ejemplo, CD ROM) , información distribuida mediante sitios de internet, y por RAM. El modelo estructural tridimensional de la proteína se genera entonces mediante la interacción de la secuencia de aminoácidos y el sistema de cómputo, usando un software conocido para los expertos en la técnica. La secuencia de aminoácidos representa una estructura primaria que codifica la información necesaria para formar la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína de interés. El software busca ciertos parámetros codificados por la secuencia primaria para generar el modelo estructural . Estos parámetros se denominan "términos de energía" , y principalmente incluyen potenciales electrostáticos, potenciales hidrofóbicos, superficies accesibles a solventes y enlace de hidrógeno. Los términos de energía secundaria incluyen los potenciales de van der Waals. Las moléculas biológicas forman las estructuras que minimizan los términos de energía de modo acumulativo. Por lo tanto, el programa de cómputo está usando estos términos codificados por la primera estructura o secuencia de aminoácidos para crear el modelo estructural secundario.
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La estructura terciaria de la proteína codificada por la estructura secundaria se forma entonces sobre la base de los términos de energía de la estructura secundaria. El usuario en este punto puede introducir variables adicionales tales como si la proteína está limitada en la membrana o es soluble, su ubicación en el cuerpo, y su ubicación celular, por ejemplo, citoplásmica, superficial o nuclear. Estáis variables, junto con los términos de energía de la estructura secundaria se usan para formar el modelo de la estructura terciaria. Al modelar la estructura terciaria, el programa de cómputo iguala las superficies hidrofóbicas de la estructura secundaria con superficies parecidas e hidrofílicas de estructura secundaria con similares. Una vez que la estructura ha sido generada, regiones que se unen a ligandos potenciales son identificadas por e:l sistema de cómputo. Las estructuras tridimensionales para ligandos potenciales se generan introduciendo secuencias de aminoácidos o nucleótidos o fórmulas químicas de compuestos, como se describe anteriormente. La estructura tridimensionail del ligando potencial se compara entonces con la de la proteína GCPR-B4 para identificar los ligandos que se unen eil GCPR-B4. La afinidad de unión entre la proteína y los ligandos se determina usando los términos de energía para determinar qué ligandos tienen una probabilidad mejorada de unirse a la proteína.
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Los sistemas de cómputo también se usan para seleccionar las mutaciones, variantes polimórficas, alelos y homólogos interespecies de los genes de GCPR-B4. Dichas mutaciones se pueden asociar con estados de enfermedades o características genéticas. Como se describió anteriormente, GeneChip™ y la tecnología relacionada también puede usarse para seleccionar las mutaciones, variantes polimórficas, alelos y homólogos interespecies. Una vez que se identifican las variantes, los ensayos de diagnóstico pueden usarse para identificar a los pacientes que tienen dichos genes con mutación. La identificación de los genes GCPR-B4 con mutación incluye la recepción de la entrada de una primera secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que codifican a GCPR-B4, seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-2, y 7, ó SEQ ID NOS: 3 -4, y 8 y versiones moderadamente modificadas de las mismas. La secuencia se introduce en el sistema de cómputo como se describe anteriormente. La primera secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos se compara entonces con una segunda secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que tiene una identidad substancial con la primera secuencia. La segunda secuencia se introduce en el sistema de cómputo de la manera que se describe anteriormente. Una vez que la primera y segunda secuencias se comparan, las diferencias de nucleótidos o aminoácidos en las secuencias se identifican. Dichas secuencias pueden representar diferencias alélicas e;n
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genes de GCPR-B4 y mutaciones asociadas con estados de enfermedad y características genéticas. VIII. Equipos GCPR-B4 y sus homólogos son una herramienta útil para identificar células receptoras de sabores, para determinaciones de forense y de paternidad, y para examinatr la transducción gustativa. Los reactivos específicos de GCPR-B4 que específicamente hibridizan el ácido nucleico de GCPR-B4 , tales como medidores e iniciadores de GCPR-B4, y reactivos específicos de GCPR-B4 que específicamente se unen a la proteína de GCPR-B4, por ejemplo, los anticuerpos de GCPR-B4 se usan para examinar la expresión de las células gustativas y la regulación de la transducción gustativas. Los ensayos de ácidos nucleicos para la presencia ele ADN GCPR-B4 y ARN en una muestra que incluyen numerosas técnicas conocidas para los expertos, tales como Southern analysis, dot blots, protección RNasa, análisis Sl, técnicas de amplificación tales como PCR y LCR e hibridación in si tv . En la hibridación in si tu, por ejemplo, el ácido nucleico meta es liberado de su medio ambiente celular de manera q?_e esté disponibles para hibridación dentro de la célula mientras se preserva la morfología celular para eu interpretación y análisis subsecuentes (consultar Ejemplo 1) . Los siguientes artículos proporcionan una generalidad de la técnica de hibridación in si tu : Singer y colaboradores,
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Biotechniques (Biotécnicas) 4:230-250 (1986); Haase y colaboradores, Methods in Virology (Métodos en Virología) , volumen VII, páginas 189-226 (1984); y Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach (Hames y colaboradores, eds. 1987) . Además, la proteína de GCPR-B4 se puede detectaír con varias técnicas de inmunoensayo descritas anteriormente:. La muestra de prueba se prepara típicamente tanto con un control positivo (por ejemplo, una muestra que expresa GCPR-B4 recombinante) como un control negativo. La presente invención también proporciona equipos para seleccionar moduladores de GCPR-B4. Estos equipos se pueden preparar de materiales y reactivos de inmediata disposición. Por ejemplo, los equipos pueden comprende'r cualesquiera o más de los siguientes materiales: GCPR-B , tubos de reacción, instrucciones para actividad de prueba ele GCPR-B4. Opcionalmente, el equipo contiene GCPR-E14 biológicamente activo. Una gran variedad de equipos y componentes se pueden preparar de acuerdo con la presente invención, dependiendo del usuario del equipo y las necesidades particulares del mismo. IX. Administración y composiciones farmacéuticas Los moduladores de sabor pueden administrase directamente al sujeto mamífero para modulación de sabor in vi tro . La administración se realiza por cualesquiera de las rutas normalmente usadas para introducir un compuesto modulador en contacto último con el tejido que va a recib.r el tratamiento, opcionalmente la lengua o la boca. Los moduladores de sabor se administran de cualquier manera adecuada, opcionalmente con portadores farmacéuticamente aceptables. Los métodos adecuados para administrar dichos moduladores están disponibles y son muy conocidos por los expertos en la técnica, y, aunque puede usarse más de una ruta para administrar una composición particular, una ruta particular puede a menudo proporcionar una reacción más inmediata y efectiva que otra. Los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se está administrando, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una gram variedad de fórmulas adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (consul tar, por ejemplo, Remington ' s Pharmaceutical Sciences (Ciencias Farmacéuticas de Remington) , 17th ed. 1985)). Los moduladores de sabor, solos o en combinación con otros componentes adecuados, pueden prepararse en fórmulas de aerosol (es decir, pueden "nebulizarse" ) para se:r administrados por vía de inhalación. Las fórmulas de aerosol se pueden colocar en vehículos presurizados aceptables, tales como diclorofluorometano, propano, nitrógeno y similares.
Fórmulas adecuadas para la administración incluye:n soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostatos y solutos que presentan la fórmula isotómica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes portadoras, solubilizadores, agentes de espesamiento, estabilizadores y preservativos. En la práctica de esta invención, las composiciones se pueden administrar', por ejemplo, oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal , intravesical o intratecalmente . Opcionalmente, lais composiciones se administran oral o nasalmente. Las fórmulas de los compuestos pueden ser presentados en recipientes sellados de dosis única o multidosis, tales como ampolletas y frascos. La soluciones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos estériles, granulos, tabletas de la clase previamente descrita. Los moduladores también pueden se:r administrados como parte de alimentos o fármacos preparados.
La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para efectuar una respuesta benéfica en el sujeto con el tiempo. La dosis será determinada por la eficiencia de los moduladores de sabor empleados en particular y la condición del sujeto, así como el peso corporal o el área de la superficie del área que va a recibir tratamiento. El tamaño de la dosis también será deteriorado por la existencia, naturaleza y extensión de
_^2&|^gjá^^^^^ cualquier efecto lateral adverso que acompañe la administración de un compuesto particular o vector en un sujeto particular. Para determinar la cantidad efectiva del modulador que va a administrarse, un médico puede evaluar los niveles circulantes de plasma de nodulador, las toxicidades ele nodulador y la producción de anticuerpos antimoduladores. Ein general, la dosis equivalente de un modulador es ele aproximadamente 1 mg/kg a 10 mg/kg para un sujeto típico. Para administración, los moduladores de sabor de la presente invención se pueden administrar a una velocidad determinada por LD-50 de un modulador, y los efectcs laterales del inhibidor en varias concentraciones, como e¡e aplica a la masa y la salud general del sujeto. La administración se puede realizar vía dosis únicas o divididas . Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incluyen en el presente por referencia como si cada publicación individual o solicitud ele patente fueran específica individualmente indicadas para incluirse por referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalle por medio de ilustración y ejemplo para fines de claridad y entendimiento, será fácilmente aparente para un experto en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta
•iaa",:abfc-< -s&^> invención que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin salirse del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexadas. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan corno ilustración solamente y no como limitación. Los expertos en la técnica reconocerán de inmediato una variedad de parámetros no importantes que podrían cambiarse o modificarse para producir resultados esencialmente similares. Ejemplo 1: Clonación y expresión de GCPR-B4 Bibliotecas ADNc hechas de células individuales circunvaladas y fungiformes se usaron para aislar los ácidos nucleicos de GPCR de la invención. Las papilas foliadas y fungiformes solas se aislaron de la lengua de rata (10 papilas cada una) y la primera hebra de ADN se preparó de cada papila usando métodos de construcción de bibliotecas de una sola células ( consul tar, por ejemplo, Bernhardt, y colaboradores, J. Physiol . (Boletín de Fisiología) 490:325-336 (1996); Dulac & Axel, Cell (Célula) 83:195-206 (1995)). Se ensayó con 20 poblaciones diferentes de ADNc para detectar las positivas para un marcador de receptor de gusto (TCP #1, también conocido corno clon 27-59; consultar solicitud de patente, documento de abogado número 02307E-084200 , presentado el 28 de febrero de 1998) para asegurar que el ADNc provenía de células
-----ii-B receptoras de gusto. Los ADNc también fueron seleccionados con GCPR-B3, un clon de receptor adecuado con proteína G (consultar USSN 60/094,465, presentado el 28 de julio de 1998) . Tres papilas positivas se identificaron y usaron como una fuente de ADNc para amplificaciones de PCR usanc iniciadores degenerativos designados para codificar motives altamente conservados entre receptores VR/mGluR/CaST/ GCPE -B3. Iniciadores preferidos llegaron del área entre los dominios transmembrana 6 y 7: [N/N] FNEAK (SEQ ID NO : 9) y PKCY[I/V]I (SEQ ID NO: 10). Los productos de PCR degenerado fueron subclonados en vector Bluescript como fragmentos Hiñe i y 52 productos de PCR eran secuencias. Veinte de estes productos correspondían a GCPR-B3. 8 de los productes codificaron una secuencia nueva de e GCPR-B4. Los homólogos de interespecies de ratón de GCPR-E fueron aislados usando los clones GCPR-B4 de rata con les medidores para bibliotecas genómicas y de ADNc. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de GCPR-B4 ee proporcionan, respectivamente, en SEQ ID NO: 1-2, y 7 y SEQ ID NO: 3 -4, y 8. La expresión específica de la célula del gusto de GCPR-B4 se confirma usando los clones como medidores de hibridación in si tu para las secciones de tejidos de lengua. Todos los clones demuestran expresión específica o preferencial en las papilas gustativas.
^Hss^^^^ Ejemplo II: GPCR es un receptor de transducción de sabor La distribución topográfica distintiva de GCPR-B4 y la representación conductual de la traducción de amargo sugieren una correlación entre los sitios de expresión de B4 (papilas circunvaladas, pero no fungiformes o geschmackstreifen) y la sensibilidad a lo amargo. Para determinar la selectividad de ligandos de GCPR-B4, se usó la expresión en células heterólogas. Una cuestión para la expresión GPCR en células heterólogas es determinar cómo acoplar el GPCR a una proteína G y una ruta de señalización apropiada. En este ejemplo, se usó la subunidad Gal5 de proteína G, que se acopla promiscuamente a una gran variedaid de GPCR para la ruta de señalización mediada con fosfolipaesa C (Offermans & Simón, J. Biol . Chem. (Boletín de Biología Química) 270:15175-15180 (1995)). En consecuencia, la actividad del receptor se puede medir efectivamente registrando los cambios inducidos por los ligandos en [Ca21-] usando tintes indicadores fluorescentes de Ca2+ y reproducción de imágenes fluorométricas. Para asegurar la expresión de GCPR-B4 en la membrana plasmática, una variedad de líneas de células y vectores de expresión fueron probados. Como control para estos estudios!, las células fueron trasnfectadas con un receptor de ?-opiod de mamífero; este receptor no se acopla normalmente a PLC, así que todos los cambios inducidos por el agonista en [Ca2+|_ reflejan el acoplamiento a través de Gal5. Una línea HEK-293 que expresa el antigeno SV40 T fue cotransfectada con un TK -Gal5, CMV-?-opiod y un vector episomal pEAK-10 (Edge Biosystems) que contiene una construcción EFla- [B4-GPCR] . Las eficiencias de transfección se determinaron usando construcciones CMV-GFP. Las células de control que expresan ?-opiod/Gal5 responden sólidamente a DAMGO (un agonista y-opiod) , pero no responde a los emisores de sabor dulce o amargo, o a los agonistas no relacionados (no aparecen les datos) . Estas respuestas dependen de Gal5, y tienen ala resolución apropiada temporal, con inicio rápido siguiendo la aplicación del estímulo. Notablemente, las células expresan B4/Gal5 ó B4/Gal5/?-opiod responden al bien caracterizado feniltiocarbamida (PTC) , de emisor de gusto amargo pero no a cualquiera de numerosos endulzantes naturales o artificiales. Esta actividad depende completamente del receptor B4 , y ocurre en concentraciones fisiológicamente pertinentes de PTC (300 µM- 5 mM) . Estos resultados sugieren que GPCR-B4 participa en la transducción de sabores amargos, y proporciona un sisterra experimentalmente tratable para futuros experimentos, incluyendo los estudios de especificidad y selectividad de emisores de sabor, la definición de la trayectoria de señalización de sabor amargo original, y tal es el entendimiento de la base molecular de los estudios
,¿V-»-_>.> ta,-. —¡^^ psicofísicos humanos que demuestran las diferencias dramáticas en degustación de PTC entre "degustadores" y "no degustadores" .
Secuencia aminoácida de la rata GPCR B4 ID Sec. No. 1 MGPQARTLCLLSLLLHVLPKPGKLVENSDFHLAGDYLLGGLFTLHANVKSISHLSYLQVP 5 KCNEFTMKVLGYNLMQAMRFAVEEINNC?SLLPGVLLGYEMVDVCYLSNNIHPGLYFL7.Q DDDLLPILKDYSQYMPHVVAVIGPDNS?SAITVSNILSHFLIPQITYSAISDKLRDKRI-tF PSMLRTVPSATHHIEAMVQLMVHFQWNWIVVLVSDDDYGRENSHLLSQRLTKTSDICIAF QEVLPIPESSQVMRSEEQRQLDNILDKLRRTSARWWFSPELSLYSFFHEVLRWNFTGF VWIASESWAIDPVLHNLTELRHTGTFLGVTIQRVSIPGFSQFRVRRDKPGYPVPNTTNI,R
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CVFKMARRLPSAYSFWMRYHGPYVFVAFITAIKVALVVGNMLATTINPIGRTDPDDPNIM ILSCHPNYRNGLLFNTSMDLLLSVLGFSFAYMGKELPTNYNEAKFITLSMTFSFTSSISL CTFMSVHDGVLVTIMDLLVTVLNFLAIGLGYFGPKCYMILFYPERNTSAYFNSMIQGYTM RKS
Secuencia aminoácida del ratón GPCR B4 ID Sec. No. 2 MGPQARTLHLLFLLLHALPKPVMLVGNSDFHLAGDYLLGGLFTLHANVKSVSHLSYLQVP KCNEYNMKVLGYNLMQAMRFAVE?INNCSSLLPGVLLGYEMVDVCYLSNNIQPGLYFLSQ IDDFLPILKDYSQYRPQWAVIGPDNSESAITVSNILSYFLVPQVTYSAITDKLQDKRRF PAMLRTVPSATHHIEAMVQLMVHFQWNWIWLVSDDDYGRENSHLLSQRLTNTGDICIAF 25 QEVLPVPEPNQAVRPEEQDQLDNILDKLRRTSARVWIFSPELSLHNFFREVLRWNFTGF VWIASESWAIDPVLHNLTELRHTGTFLGVTIQRVSIPGFSQFRVRHDKPGYRMPNETSLR TTCNQDCDACMNITESFNNVLMLSGERWYSVYSAVYAVAHTLHRLLHCNQVRCTKQIVY PWQLLREIWHVNFTLLGNQLFFDEQGDMPMLLDIIQWQWGLSQNPFQSIASYSPTETRLr YISNVSWYTPNNTVPISMCSKSCQPGQMKKPIGLHPCCFECVDCPPDTYLNRSVDEFNCL 30 SCPGSMWSYKNNIACFKRRLAFLEWHEVPTIVVTILAALGFISTLAILLIFWRHFQTPM^ RSAGGPMCFLMLVPLLLAFGMVPV?VGPPTVFSCFCRQAFFTVCFSVCLSCITVRSFQIV" CVFKMARRLPSAYGFWMRYHGPYVFVAFITAVKVALVAGNMLATTIN IGRTDPDDPNI I ILSCHPNYRNGLLFNTSMDLLLSVLGFSFAYVGKELPTNYNEAKFITLSMTFSFTSSISL
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Secuencia de nucleótiuo ae la rata GPCR B4 ID Sec. Nb. 3 CACTTTGCTGTCATGGGTCCCCAGGCAAGGACACTCTGCTTGCTGTCTCTCCTGCTGCAT GTTCTGCCTAAGCCAGGCAAGCTGGTAGAGAACTCTGACTTCCACCTGGCCGGGGACTAC CTCCTGGGTGGCCTCTTTACCCTCCATGCCAACGTGAAGAGCATCTCCCACCTCAGCTAC CTGCAGGTGCCCAAGTGCAATGAGTTCACCATGAAGGTGTTGGGCTACAACCTCATGC2G GCCATGCGTTTCGCTGTGGAGGAGATCAACAACTGTAGCTCCCTGCTACCCGGCGTGCIG CTCGGCTACGAGATGGTGGATGTCTGTTACCTCTCCAACAATATCCACCCTGGGCTCTAC TTCCTGGCACAGGACGACGACCTCCTGCCCATCCTCAAAGACTACAGCCAGTACATGCCC CACGTGGTGGCTGTCATTGGCCCCGACAACTCTGAGTCCGCCATTACCGTGTCCAACATT CTCTCTCATTTCCTCATCCCACAGATCACATACAGCGCCATCTCCGACAAGCTGCGGGAC AAGCGGCACTTCCCTAGCATGCTACGCACAGTGCCCAGCGCCACCCACCACATCGAGGCC ATGGTGCAGCTGATGGTTCACTTCCAATGGAACTGGATTGTGGTGCTGGTGAGCGACGAC GATTACGGCCGCGAGAACAGCCACCTGTTGAGCCAGCGTCTGACCAAAACGAGCGACAT2 TGCATTGCCTTCCAGGAGGTTCTGCCCATACCTGAGTCCAGCCAGGTCATGAGGTCCGAG GAGCAGAGACAACTGGACAACATCCTGGACAAGCTGCGGCGGACCTCGGCGCGCGTCGTG GTGGTGTTCTCGCCCGAGCTGAGCCTGTATAGCTTCTTTCACGAGGTGCTCCGCTGGAAi: TTCACGGGTTTTGTGTGGATCGCCTCTGAGTCCTGGGCTATCGACCCAGTTCTGCATAAC CTCACGGAGCTGCGCCACACGGGTACTTTTCTGGGCGTCACCATCCAGAGGGTGTCCATC CCTGGCTTCAGTC?GTTCCGAGTGCGCCGTGACAAGCCAGGGTATCCCGTGCCTAACACG ACCAACCTGCGGACGACCTGCAACCAGGACTGTGACGCCTGCTTGAACACCACCAAGTCC TTCAACAACATCCTTATACTTTCGGGGGAGCGCGTGGTCTACAGCGTGTACTCGGCAGTT TACGCGGTGGCCCATGCCCTCCACAGACTCCTCGGCTGTAACCGGGTCCGCTGCACCAAC3 CAAAAGGTCTACCCGTGGCAGCTACTCAGGGAGATCTGGCACGTCAACTTCACGCTCCTG GGTAACCGGCTCTTCTTTGACCAACAAGGGGACATGCCGATGCTCTTGGACATCATCCAG TGGCAGTGGGACCTGAGCCAGAATCCCTTCCAAAGCATCGCCTCCTATTCTCCCACCAGC: AAGAGGCTAACCTACATTAACAATGTGTCCTGGTACACCCCCAACAACACGGTCCCTGTC: TCCATGTGTTCCAAGAGCTGCCAGCCAGGGCAAATGAAAAAGTCTGTGGGCCTCCACCCT TGTTGCTTCGAGTGCTTGGATTGTATGCCAGGCACCTACCTCAACCGCTCAGCAGATGAG TTTAACTGTCTGTCCTGCCCGGGTTCCATGTGGTCCTACAAGAACGACATCACTTGCTTC CAGCGGCGGCCTACCTTCCTGGAGTGGCACGAAGTGCCCACCATCGTGGTGGCCATACTC! GCTGCCCTGGGCTTCTTCAGTACACTGGCCATTCTTTTCATCTTCTGGAGACATTTCCAC CTGGCGTTTGGGATGGTGCCCGTGTATGTGGGGCCCCCCACGGTCTTCTCATGCTTCTGC CGACAGGCTTTCTTCACCGTCTGCTTCT^pATCTGCCTATCCTGCATCACCGTGCGCTCC TTCCAGATCGTGTGTGTCTTCAAGATjÉcCAGACGCCTGCCAAGTGCCTACAGTTTTTGG ATGCGTTACCACGGGCCCTATGTCTTCGTGGCCTTCATCACGGCCATCAAGGTGGCCCTG GTGGTGGGCAACATGCTGGCCACCACCATCAACCCCATTGGCCGGACCGACCCGGATGAC CCCAACATCATGATCCTCTCGTGCCACCCTAACTACCGCAACGGGCTACTGTTCAACAC'C AGCATGGACTTGCTGCTGTCTGTGCTGGGTTTCAGCTTCGCTTACATGGGCAAGGAGCIG CCCACCAACTACAACGAAGCCAAGTTCATCACTCTCAGCATGACCTTCTCCTTCACCTCC TCCATCTCCCTCTGCACCTTCATGTCTGTGCACGACGGCGTGCTGGTCACCATCATGGAC CTCCTGGTCACTGTGCTCAACTTCCTGGCCATCGGCTTGGGATACTTTGGCCCCAAGTGT TACATGATCCTTTTCTACCCGGAGCGCAACACCTCAGCCTATTTCAATAGCATGATCCAG GGCTACACCATGAGGAAGAGCTAGCTCCGCCCACCGGCCTCAGCAGCAGAGCCCCCGGCC ACGTTAATGGTGTTCCTCTGCCATTCTCTGCAGCGTAGCTATTTTTACCCACATAGCGCT TAAAATACCCATGATGCACTCTCCCCCGACCCCCAAGCCATTTCACTGGCCAGGACCTAC CACCCACTTATAGATGAAACCACCAAGGCGCCCTATGGGGCTCCAAGGATGGCCTACCA TGCCATCTGGTGGTCACAGTGAGCACATGCGGGCCGTGGCCCATGGCTCCCAGCCAGCTG GTGGCTAGTGGCTGTGAGGCCAGATGTCTGTGTATCTGAGTTCCTGGGAAGCAGAGACTG GGGCTCCTGTGTTCTAATGGTCAGATGGGCATCATGGGCCCTTCATTATTGCTTACGAAT AAACTTCCCTCCGGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Secuencia de nucleótido del ratón GPCR B4 ID Sec. No. 4 ATGGGACCCCAGGCGAGGACACTCCATTTGCTGTTTCTCCTGCTGCATGCTCTGCCTAAG CCAGTCATGCTGGTAGGGAACTCCGACTTTCACCTGGCTGGGGACTACCTCCTGGGTGGC CTCTTTACCCTCCATGCCAACGTGAAGAGTGTCTCTCACCTCAGCTACCTGCAGGTGCCC AAGTGCAATGAGTACAACATGAAGGTGTTGGGCTACAACCTCATGCAGGCCATGCGATTC GCCGTGGAGGAAATCAACAACTGTAGCTCTTTGCTGCCCGGCGTGCTGCTCGGCTACGAG ATGGTGGATGTCTGCTACCTCTCCAACAATATCCAGCCTGGGCTCTACTTCCTGTCACAG ATAGATGACTTCCTGCCCATCCTCAAAGACTACAGCCAGTACAGGCCCCAAGTGGTGGCT GTTATTGGCCCAGACAACTCTGAGTCTGCCATCACCGTGTCCAACATTCTCTCCTACTTC CTCGTGCCACAGGTCACATATAGCGCCATCACCGACAAGCTGCAAGACAAGCGGCGCTTC: CCTGCCATGCTGCGCACTGTGCCCAGCGCCACCCACCACATCGAGGCCATGGTGCAACTCÍ ATGGTTCACTTCCAGTGGAACTGGATCGTGGTGCTGGTGAGCGATGACGATTATGGCCGA GAGAACAGCCACCTGCTGAGCCAGCGTCTGACCAACACTGGCGACATCTGCATTGCCTTC
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TSSVSLCTFMSAYSGVLVTIVDLLVTVIJNLLAISLGYFGPKCYMILFYPERNTPAYFNSM IQGYTMRRD
Secuencia de nucleótido del humano GPCR B4 ID Sec. No.8 ATCACCTACAGCGCCATCAGCGATGAGCTGCGAGACAAGGTGCGCTTCCCGGCTTTGCTG CGTACCACACCCAGCGCCGACCACCACGTCGAGGCCATGGTGCAGCTGATGCTGCACTTC CGCTGGAACTGGATCATTGTGCTGGTGAGCAGCGACACCTATGGCCGCGACAATGGCCAG CTGCTTGGCGAGCGCGTGGCCCGGCGCGACATCTGCATCGCCTTCCAGGAGACGCTGCCC ACACTGCAGCCCAACCAGAACATGACGTCAGAGGAGCGCCAGCGCCTGGTGACCATTGTG GACAAGCTGCAGCAGAGCACAGCGCGCGTCGTGGTCGTGTTCTCGCCCGACCTGACCCTG TACCACTTCTTCAATGAGGTGCTGCGCCAGAACTTCACGGGCGCCGTGTGGATCGCCTCC GAGTCCTGGGCCATCGACCCGGTCCTGCACAACCTCACGGAGCTGGGCCACTTGGGCACC TTCCTGGGCATCACCATCCAGAGCGTGCCCATCCCGGGCTTCAGTGAGTTCCGCGAGTGG GGCCCACAGGCTGGGCCGCCACCCCTCAGCAGGACCAGCCAGAGCTATACCTGCAACCAG GAGTGCGACAACTGCCTGAACGCCACCTTGTCCTTCAACACCATTCTCAGGCTCTCTGGG GAGCGTGTCGTCTACAGCGTGTACTCTGCGGTCTATGCTGTGGCCCATGCCCTGCACAGC CTCCTCGGCTGTGACAAAAGCACCTGCACCAAGAGGGTGGTCTACCCCTGGCAGCTGCTT GAGGAGATCTGGAAGGTCAACTTCACTCTCCTGGACCACCAAATCTTCTTCGACCCGCAA GGGGACGTGGCTCTGCACTTGGAGATTGTCCAGTGGCAATGGGACCGGAGCCAGAATCCC TTCCAGAGCGTCGCCTCCTACTACCCCCTGCAGCGACAGCTGAAGAACATCAAGACATCT CTGCACACCGTCAACAACACGATCCCTATGTCCATGTGTTCCAAGAGGTGCCAGTCAGGG CAAAAGAAGAAGCCTGTGGGCATCCACGTCTGCTGCTTCGAGTGCATCGACTGCCTTCCC GGCACCTTCCTCAACCACACTGAATGCCCGAATAACGAGTGGTCCTACCAGAGTGAGACC
GCCCTGCTGGCCGCCCTGGGCTTCCTCAGCACCCTGGCCATCCTGGTGATATTCTGGAGG CACTTCCAGACACCCATAGTTCGCTCGGCTGGGGGCCCCATGTGCTTCCTGATGCTGACA CTGCTGCTGGTGGCATACATGGTGGTCCCGGTGTACGTGGGGCCGCCCAAGGTCTCCACC TGCCTCTGCCGCCAGGCCCTCTTTCCCCTCTGCTTCACAATTTGCATCTCCTGTATCGCC GTGCGTTCTTTCCAGATCGTCTGCGCCTTCAAGATGGCCAGCCGCTTCCCACGCGCCTAC AGCTACTGGGTCCGCTACCAGGGGCCCTACGTCTCTATGGCATTTATCACGGTACTCAAA ATGGTCATTGTGGTAATTGGCATGCTGGCACGGCCTCAGTCCCACCCCCGTACTGACCCC GATGACCCCAAGATCACAATTGTCTCCTGTAACCCCAACTACCGCAACAGCCTGCTGTTC AACACCAGCCTGGACCTGCTGCTCTCAGTGGTGGGTTTCAGCTTCGCCTACATGGGCAAA GAGCTGCCCACCAACTACAACGAGGCCAAGTTCATCACCCTCAGCATGACCTTCTATTTC ACCTCATCCGTCTCCCTCTGCACCTTCATGTCTGCCTACAGCGGGGTGCTGGTCACCATC GTGGACCTCTTGGTCACTGTGCTCAACCTCCTGGCCATCAGCCTGGGCTACTTCGGCCCC AAGTGCTACATGATCCTCTTCTACCCGGAGCGCAACACGCCCGCCTACTTCAACAGCATG ATCCAGGGCTACACCATGAGGAGGGACTAG
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Claims (31)
- REIVINDICACIONES 1. Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el receptor comprende más de 70% aproximadamente de identidad aminoácida para una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO : 7.
- 2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codifica a un receptor que específicamente se une a los anticuerpos policlonales generados contra SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7.
- 3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codifica un receptor que tiene actividad de receptor de proteína acoplada G.
- 4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codifica un receptor que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7.
- 5. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de: nucleótidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, ó SEQ ID NO : 8.
- 6. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico es de un humano, un ratón o una rata.
- 7. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico es amplificado por iniciadores que selectivamente se utilizan bajo condiciones estrictas de irrigación para la misma secuencia mientras el iniciador regenerado configura secuencias de aminoácidos codificadoras seleccionadas del grupo que consiste de: 5 SAGGPMCFLM (SEQ ID NO: 5) y WMRYHGPYVF (SEQ ID NO: 6)
- 8. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codifica un receptor que tiene un peso molecular de aproximadamente 92 kDa a aproximadamente 10 102 kDa. ,
- 9. Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, en donde el ácido nucleico se hibridiza bajo condiciones altamente estrictas para un ácido nucleico que tiene la 15 secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0:4, ó SEQ ID NO: 8.
- 10. Un ácido nucleico aislado que codifica un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el receptor comprende más de aproximadamente 70% de identidad aminoácida para un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ 20 ID N0:1, SEQ ID NO : 2 , ó SEQ ID NO : 7 , en donde el ácido nucleico selectivamente se hibridiza bajo condiciones moderadamente estrictas de hibridación para una secuencia nucleótida de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, ó SEQ ID NO : 8.
- 11. Un ácido nucleico aislado que codifica un dominio 25 extracelular de un receptor acoplado con proteína G de *-^ - ----- Hj--___pj___-_|* _ trnsducción sensorial, el dominio extracelular tiene rrTsa de aproximadamente 70% dee identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio extracelular de SEQ ID NO : 1.
- 12. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 11, en donde el ácido nucleico codifica el dominio extracelular unido a un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo formando un polipéptido quimérico.
- 13. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 11, en donde el ácido nucleico codifica al dominio extracelular de SEQ ID N0:1.
- 14. Un ácido nucleico aislado que codifica un dominio transmembrana de un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el dominio transmembrana comprende más de aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio transmembrana de SEQ ID NO: 1.
- 15. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico codifica el dominio transmembrana ligado a un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico.
- 16. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico codifica el dominio transmembrana de SEQ ID NO:l.
- 17. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico codifica además un dominio citoplástico que comprende más de aproximadamente 70% de identidad aminoácida para el dominio citoplástico de SEQ ID NO : 1.
- 18. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico codifica el dominio citoplástico de SEQ ID NO : 1.
- 19. Un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial aislado, el receptor comprende más de aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos para una secuencia de amioácidos de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7.
- 20. El receptor aislado de la reivindicación 19, en donde el receptor específicamente se une a anticuerpos policlonales generados contra SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7.
- 21. El receptor aislado de la reivindicación 19, en donde tiene actividad receptora acoplado con proteína G.
- 22. El receptor aislado de la reivindicación 19, en donde el receptor tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO : 2 , ó SEQ ID NO: 7.
- 23. El receptor aislado de la reivindicación 19, en donde el receptor es de un humano, una rata o un ratón.
- 24. Un polipéptido aislado que comprende un dominio extracelular de un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el dominio extracelular comprende más de aproximadamente 70% de identidad secuencia de aminoácidos para el dominio extracelular de SEQ ID NO:l.
- 25. El polipéptido aislado de la reivindicación 24, en donde el polipéptido codifica el dominio extracelular de SEQ ID NO: 1.
- 26. El polipéptido aislado de la reivindicación 24, en donde el dominio extracelular está ligado covalentemente a un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico.
- 27. El polipéptido aislado que comprende un dominio transmembrana de un sensor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el dominio transmembrana comprende más de aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio transmembrana de SEQ ID NO:l.
- 28. El polipéptido aislado de la reivindicación 27, en donde el polipéptido codifica el dominio transmembrana de SEQ ID NO:l.
- 29. El polipéptido aislado de la reivindicación 27, que además comprende un dominio citoplástico que comprende más de aproximadamente 70% de identidad de aminoácido para el dominio citoplástico de SEQ ID NO:l.
- 30. El polipéptido aislado de la reivindicación 29, en donde el polipéptido decodifica el dominio citoplásmico de SEQ ID NO:l.
- 31. El polipéptido aislado de la reivindicación 27, en donde el dominio transmembrana está ligado covalentemente a un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico , 32. El polipéptido aislado de la reivindicación 31, en donde el polipéptido quimérico tiene actividad receptora 5 acoplado con proteína G. 33. Un anticuerpo que selectivamente se une al receptor de la reivindicación 19, 34. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1. 10 35. Una célula huésped transfectada con el vector de la reivindicación 34 36. Un método para identificar un compuesto que modula señalización sensorial en células sensoriales, el método comprende los pasos de : 15 (i) poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende un dominio extracelular de un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el dominio extracelular comprende más de aproximadamente 70? de identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio 20 extracelular de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7; y (ii) determinar el efecto funcional descompuesto en el dominio extracelular. 37. El método de la reivindicación 36, en donde eL polipéptido es un receptor acoplado con proteína G de 25 transducción sensorial, el receptor comprende rriás de __=______________¡=_¡____a aproximadamente 70% de identidad aminoácida para un polipéptido que codifica SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO: 7. 38. El método de la reivindicación 37, en donde el polipéptido comprende un dominio extracelular que está ligado covalentemente a un polipéptido heterólogo, formando un polipéptido quimérico 39. El método de la reivindicación 37 ó 38, en donde el polipéptido tiene actividad receptora acoplado con proteína G 40. El método de la reivindicación 36, en donde el dominio extracelular está ligado a una fase sólida 41. El método de la reivindicación 40, en donde el dominio extracelular está ligado covalentemente a una fase sólida. 42. El método de la reivindicación 37 ó 38, en donde el efecto funcional se determina midiendo los cambios er. AMPc, IP3, ó Ca2+ intracelular. 43. El método de la reivindicación 36, en donde el efecto funcional es un efecto químico. 44. El método de la reivindicación 36, en donde el efecto funcional es un efecto químico. 45. El método de la reivindicación 36, en donde el efecto funcional se determina midiendo el ligamento deL compuesto al dominio extracelular 46. El método de la reivindicación 36, en donde el polipéptido es recombinante. 47. El método de la reivindicación 36, en donde el polipéptido es de una rata, un ratón o un humano. 48. El método de la reivindicación 37, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO : 2 , ó SEQ ID NO : 7. 49. El método de la reivindicación 37 ó 38, en donde el polipéptido se expresa en una célula o membrana celular. 50. El método de la reivindicación 49, en donde la célula es una célula eucariótica. 51. Un método para identificar un compuesto que modula señalización sensorial en células sensoriales, el método comprende los pasos de : (i) poner en contacto el compuesto con un polipéptido que comprende un dominio transmembrana de un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el dominio transmembrana comprende más de aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos para el dominio transmembrana de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, ó SEQ ID NO: 7; y (ii) determinar el efecto funcional deL compuesto de el dominio transmembrana. -gj_¿|¡?¿ ¿^^^& 52. El método de la reivindicación 51, en donde el polipéptido quimérico tiene actividad de receptora acoplado con proteína G. 54. El método de la reivindicación 51, en donde el efecto funcional se determina midiendo los cambios en AMPc, IP3, ó Ca2+ intracelular. 55. El método de la reivindicación 51, en donde el efecto funcional es un efecto químico. 56. El método de la reivindicación 51, en donde el efecto funcional es un efecto físico. 57. El método de la reivindicación 51, en donde el polipéptido es recombinante. 58. El método de la reivindicación 51, en donde el polipéptido es de una rata, un ratón o un humano. 59. El método de la reivindicación 51 ó 52, en donde el polipéptido se expresa en una célula o membrana celular. 60. El método de la reivindicación 59, en donde la célula es una célula eucariótica. 61. Un método para preparar un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el método comprende el paso para expresar el receptor a partir de un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica al receptor, en donde la secuencia del ácido nucleico del receptor comprende más de aproximadamente 70% de identidad de aminoácido para un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2 , ó SEQ ID NO: 7. 62. Un método para preparar una célula recombinante que comprende un receptor acoplado con proteína G de transmisión sensorial, el método comprende el paso de transducción de la célula con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica al receptor, en donde la secuencia de aminoácidos del receptor comprende más de aproximadamente 70% de identidad de aminoácido para un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO : 7. 63. Un método para hacer un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica a un receptor acoplado con proteína G de transducción sensorial, el método comprende el paso de ligar a un vector-de expresión un ácido nucleico que codifica al receptor, en donde la secuencia de aminoácidos del receptor comprende más de aproximadamente 70% de identidad aminoácida para un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, ó SEQ ID NO : 7. - -««*—«»• f- --
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