JP6576831B2 - 結腸癌及び膵臓癌の診断ならびに治療のための、ヒト化モノクローナル抗体及び使用方法 - Google Patents

結腸癌及び膵臓癌の診断ならびに治療のための、ヒト化モノクローナル抗体及び使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月２８日に、「ＨＵＭＡＮＩＺＥＤ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＦＯＲ ＴＨＥ ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ ＡＮＤ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＯＦ ＣＯＬＯＮ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＳ ＣＡＮＣＥＲ」（代理人案件番号７７６８５．０００３００）という標題で出願された、米国仮特許出願第６１／７４７，０６７号の利益を主張し、その全体において、参照により本明細書に援用される。
本出願は、ファイル名称「４３２８２ｏ３０１３．ｔｘｔ」（サイズは、１１２，４２７バイト。１２月２７日に作成。参照によりその全体で本明細書に援用される）を有する、生物配列表のテキストファイルを、その開示の一部として含有する。
前立腺癌、肺癌、及び結腸直腸癌は、男性で最も多い癌である。肺癌、前立腺癌、肝臓癌、及び結腸直腸癌は、男性における癌による死亡の主因となっている。乳癌、肺癌、及び結腸直腸癌は、女性で最も多い癌である。肺癌、乳癌、及び結腸直腸癌は、女性における癌による死亡の主因となっている。たとえば、米国だけでも毎年、４３，０００を超える人々が膵臓癌と診断されている。ここ二十年の間に、癌の検出及び癌の治療に関し、多くの進展があったが、癌の早期検出及び治療に対する現時点の選択肢は限られている。
癌の検出及び生存率において、医学は進歩しているが、癌の罹患率及び死亡率を減少させるための、早期検出戦略及び治療レジメンが求められている。モノクローナル抗体は、癌治療の改善に有効であることが証明されており、ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標）（オファツムマブ）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（トシツモマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）（パニツムマブ）、及び、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブ）が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を受けている。多くの他のモノクローナル抗体が単剤療法として、または他の療法との併用で現在臨床試験中であり、癌治療に対し、期待できる結果を示している。
本発明は、ヒト化３１．１モノクローナル抗体（ＮＥＯ−３００抗体）を開示するものである。これらのヒト化３１．１モノクローナル抗体（ＮＥＯ−３００抗体）は、癌の検出及び治療のための方法において用いられても良い。
１つの実施形態において、Ａ３３抗原に結合する単離抗体、またはその抗体断片は、配列番号７４、７５、７６、もしくは７７のアミノ酸配列、または、そこに包含される可変領域のうちの１つを含有する重鎖配列を少なくとも１つ含有しても良い。
１つの実施形態において、Ａ３３抗原に結合する単離抗体、またはその抗体断片は、配列番号７８、７９、８０、８１、８２、または８３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する重鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ、含有しても良い。
１つの実施形態において、Ａ３３抗原に結合する単離抗体、またはその抗体断片は、配列番号８４、８５、８６、８７のアミノ酸配列、またはそこに含まれる可変領域のうちの１つを含有する軽鎖配列を少なくとも１つ含有しても良い。
１つの実施形態において、Ａ３３抗原に結合する単離抗体、またはその抗体断片は、配列番号８８、８９、９０、９１、９２、または９３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ、含有しても良い。
たとえば、Ａ３３抗原に結合する単離抗体、またはその抗体断片は、配列番号７４のアミノ酸配列を含有する重鎖、及び、配列番号８４の軽鎖アミノ酸配列を含有しても良く、または、配列番号７５のアミノ酸配列を含有する重鎖、及び、配列番号８５の軽鎖アミノ酸配列を含有しても良く、または、配列番号７６のアミノ酸配列を含有する重鎖、及び、配列番号８６の軽鎖アミノ酸配列を含有しても良く、または、配列番号７７のアミノ酸配列を含有する重鎖、及び、配列番号８７の軽鎖アミノ酸配列を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９、８０、８１、または８２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する重鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する重鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８０のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する重鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する重鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する重鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号８８、８９、または９０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９１または９２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する軽鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号８８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する軽鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号８９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する軽鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号９０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する軽鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号８８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する軽鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号８９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する軽鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号９０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する軽鎖を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９、８０、８１または８２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び、配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する重鎖、ならびに、配列番号８８、８９、または９０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９１または９２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）に包含されるＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）に包含されるＣＤＲを含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７のアミノ酸１〜１１８）の可変鎖を含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７のアミノ酸１〜１０７）の可変軽鎖を含有する軽鎖、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）の重鎖ポリペプチド、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）の軽鎖ポリペプチド、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、前記重鎖を少なくとも１つ、及び、前記軽鎖を少なくとも１つ、含有しても良い。他の実施形態において、抗体は、前記重鎖ＣＤＲを少なくとも１つ、及び、前記軽鎖ＣＤＲを少なくとも１つ、含有しても良い。他の実施形態において、抗体は、前記重鎖ＣＤＲを少なくとも２つ、及び前記軽鎖ＣＤＲを少なくとも２つ、含有しても良い。他の実施形態において、抗体は、前記重鎖ＣＤＲを少なくとも３つ、及び前記軽鎖ＣＤＲを少なくとも３つ、含有しても良い。
他の実施形態において、抗体は、配列番号７４、７５、７６もしくは７７のアミノ酸配列、または、その中に含有される可変領域のうちの１つを含有する重鎖配列を少なくとも１つ；配列番号７８、７９、８０、８１、８２または８３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有するＣＤＲ配列を少なくとも１つ；配列番号８４、８５、８６もしくは８７のアミノ酸配列、または、その中に含有される可変領域のうちの１つ、を含有する軽鎖配列を少なくとも１つ；及び／または、配列番号８８、８９、９０、９１、９２または９３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ、含有しても良い。
他の実施形態において、重鎖は、配列番号７８のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７９、８０、８１、または８２のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ２を少なくとも１つ；及び、配列番号８３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ３を少なくとも１つ、含有しても良い。
他の実施形態において、軽鎖は、配列番号８８、８９、または９０のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ１を少なくとも１つ、配列番号９１または９２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ２を少なくとも１つ；及び、配列番号９３のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ３、を含有しても良い。
他の実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号１０、１１、１２、または１３のアミノ酸配列に特異的に結合する。
１つの実施形態において、抗体または抗体断片は、組換え体であっても良い。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、抗腫瘍活性を有している。他の実施形態において、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または、抗原に結合することができる抗体の一部である。
１つの実施形態において、抗体は、定常ドメインを含有しても良い。定常ドメインは、たとえば、ＡＤＣＣ、またはＣＤＣ等のエフェクター機能を促進しても良い。たとえば、定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３定常ドメインを含有しても良く、または、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３定常ドメインからなるものであっても良い。前記定常ドメインは、たとえばＡＤＣＣまたはＣＤＣ等のエフェクター機能の１以上を増強するために改変されても良い。
１つの実施形態において、抗体または断片は、標識物、細胞毒性剤、治療剤、もしくは免疫抑制剤に直接的、または間接的に結合されていても良い。他の実施形態において、抗体は、組成物中で、抗体、標識、細胞毒性剤、治療剤または免疫抑制剤と混合されていても良い。
他の実施形態において、抗体は、抗体、標識物、細胞毒性剤、治療剤、または免疫抑制剤と、同時に、または連続的に、組み合わせて投与されても良い。
他の実施形態において、標識物は、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射性標識であっても良い。
他の実施形態において、常磁性標識は、アルミニウム、マンガン、プラチナ、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムであっても良い。
他の実施形態において、細胞毒性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質合成を阻害する部分であっても良く、放射性核種、またはリボソーム阻害タンパク質であっても良い。
他の実施形態において、細胞毒性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、ビンデシン、メトトレキサート、アドリアマイシン、シスプラチン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、緑膿菌外毒素Ａ、リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、または細胞毒性ホスホリパーゼ酵素であっても良い。
他の実施形態において、治療剤は、リンホカインまたは増殖因子であっても良い。
他の実施形態において、免疫抑制剤は、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、アゾチプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、タクロリムス、またはシロリムスであっても良い。
１つの実施形態において、本発明により、Ａ３３抗原に結合する抗体、またはその抗体断片を含有する組成物が提示される。他の実施形態において、抗体は、配列番号７４、７５、７６、もしくは７７、または、その中に包含される可変領域のうちの１つのアミノ酸配列を含有する重鎖配列を少なくとも１つ；配列番号７８、７９、８０、８１、８２、または８３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有するＣＤＲ配列を少なくとも１つ；配列番号８４、８５、８６、８７のアミノ酸配列、またはその中に包含される可変領域のうちの１つ、を含有する軽鎖配列を少なくとも１つ；及び、配列番号８８、８９、９０、９１、９２、または９３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ、含有しても良い。他の実施形態において、重鎖は、配列番号７８のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７９、８０、８１、または８２のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ２を少なくとも１つ；及び、配列番号８３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ３を少なくとも１つ、含有しても良い。他の実施形態において、軽鎖は、配列番号８８、８９、または９０のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ１を少なくとも１つ、配列番号９１または９２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ２を少なくとも１つ；及び、配列番号９３のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ３、を含有しても良い。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列に特異的に結合する。他の実施形態において、組成物はさらに、薬学的に受容可能な担体を含有しても良い。
１つの実施形態において、診断キットは、Ａ３３抗原またはその断片に結合する抗体を含有しても良い。他の実施形態において、抗体は、配列番号７４、７５、７６、もしくは７７のアミノ酸配列を含有する重鎖配列を少なくとも１つ、または、その中に包含される可変領域のうちの１つ；配列番号７８、７９、８０、８１、８２、または８３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有するＣＤＲ配列を少なくとも１つ；配列番号８４、８５、８６、８７のアミノ酸配列、またはその中に包含される可変領域のうちの１つ、を含有する軽鎖配列を少なくとも１つ；及び、配列番号８８、８９、９０、９１、９２、または９３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ、含有しても良い。他の実施形態において、重鎖は、配列番号７８のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７９、８０、８１、または８２のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ２を少なくとも１つ；及び、配列番号８３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ３を少なくとも１つ、含有しても良い。他の実施形態において、軽鎖は、配列番号８８、８９、または９０のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ１を少なくとも１つ、配列番号９１または９２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ２を少なくとも１つ；及び、配列番号９３のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ３、を含有しても良い。他の実施形態において、抗体または抗体断片は、配列番号１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列に特異的に結合する。他の実施形態において、抗体は、固相支持体に直接、または間接的に固定されても良い。他の実施形態において、固相支持体は、ビーズ、試験管、シート、培養皿、または試験紙であっても良い。他の実施形態において、固相支持体は、アレイであっても良い。
１つの実施形態において、癌を治療する方法は、Ａ３３抗原に結合する抗体、またはその抗体断片の有効量を、それを必要とする患者に対して投与することを含んでも良い。他の実施形態において、腫瘍の増殖を減速させるための方法は、Ａ３３抗原に結合する抗体、またはその抗体断片の有効量を、それを必要とする患者に対して投与することを含んでも良い。他の実施形態において、腫瘍細胞を殺傷する方法は、Ａ３３抗原に結合する抗体、またはその抗体断片の有効量を、それを必要とする患者に対して投与することを含んでも良い。他の実施形態において、対象における腫瘍退縮を促進するための方法は、Ａ３３抗原に結合する抗体、またはその抗体断片の有効量を、それを必要とする患者に対して投与することを含んでも良い。
１つの実施形態において、癌を治療するための組成物は、Ａ３３抗原に結合する抗体、またはその抗体断片を含有しても良い。他の実施形態において、腫瘍増殖を減速させる組成物は、Ａ３３抗原に結合する抗体、またはその抗体断片の有効量を含有しても良い。他の実施形態において、腫瘍細胞を殺傷するための組成物は、Ａ３３抗原に結合する抗体またはその抗体断片の有効量を含有しても良い。他の実施形態において、対象における腫瘍退縮を促進するための組成物は、Ａ３３抗原に結合する抗体またはその抗体断片の有効量を含有しても良い。
１つの実施形態において、本発明により、癌を治療するための薬剤の調製における、Ａ３３抗原に結合する抗体またはその抗体断片の使用が提示される。他の実施形態において、本発明により、腫瘍増殖を減速させるための薬剤の調製における、Ａ３３抗原に結合する抗体またはその抗体断片の使用が提示される。他の実施形態において、本発明により、腫瘍細胞を殺傷するための薬剤の調製における、Ａ３３抗原に結合する抗体またはその抗体断片の使用が提示される。他の実施形態において、本発明により、腫瘍退縮を促進するための薬剤の調製における、Ａ３３抗原に結合する抗体またはその抗体断片の使用が提示される。
他の実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌であっても良い。他の実施形態において、癌は、膵臓癌または結腸直腸癌であっても良い。他の実施形態において、抗体は、他の抗体、リンホカイン、または造血増殖因子と組み合わせて投与されても良い。他の実施形態において、剤は、抗体と同時、または抗体と連続して投与されても良い。他の実施形態において、癌は、ステージ１、２、３、または４の癌であっても良い。他の実施形態において癌は、転移していても良い。他の実施形態において、患者は、検出可能なレベルの３１．１．エピトープを発現している。他の実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍生検サンプル、または血液、糞便、尿、もしくはリンパ液中で検出されても良い。他の実施形態において、患者は、癌のリスクがある者であっても良い。他の実施形態において、患者は、症状が現れていない患者であっても良い。
１つの実施形態において、（ａ）検証サンプルを、３１．１．エピトープに結合する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片と接触させること、及び、（ｂ）抗体−エピトープ複合体を分析すること、を含む、３１．１．エピトープを検出する方法であって、ここで、前記エピトープの存在は癌の指標でありうる。
１つの実施形態において、（ａ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を患者に投与することであって、ここで、３１．１エピトープに結合する前記抗体は標識されていても良く、及び、（ｂ）３１．１エピトープの存在を検出すること、を含む、患者における３１．１エピトープの存在の検出方法であって、ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標でありうる。
他の実施形態において、抗体またはその抗体断片は、標識物に結合されていても良い。他の実施形態において、標識物は、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射性標識であっても良い。他の実施形態において、常磁性標識は、アルミニウム、マンガン、プラチナ、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムであっても良い。他の実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌であっても良い。
他の実施形態において、患者は、癌のリスクのある者であっても良い。他の実施形態において、患者は、症状の現れていない患者であっても良い。他の実施形態において、検証サンプルは、癌のリスクのある患者から得られても良い。他の実施形態において、検証サンプルは、症状の無い患者から得られても良い。
他の実施形態において、抗体は、固形支持体に付着していても良い。他の実施形態において、固形支持体は、ビーズ、試験管、シート、培養皿、または試験紙であっても良い。他の実施形態において、固形支持体は、アレイであっても良い。
他の実施形態において、サンプルは、組織生検、リンパ、尿、脳脊髄液、羊水、炎症性滲出液、血液、血清、糞便、または消化管から採取された液体であっても良い。
他の実施形態において、抗体−エピトープ複合体は、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、側方流動アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及びプロテインＡ免疫アッセイからなる群から選択されるアッセイにより検出されても良い。
他の実施形態において、当該方法は、結腸直腸ポリープを検出しても良い。他の実施形態において、当該方法はさらに、腫瘍の存在に対する、追加の検証を含有しても良い。他の実施形態において、当該方法は、良性腫瘍を検出しても良い。他の実施形態において、当該方法は、悪性腫瘍を検出しても良い。他の実施形態において、当該方法は、転移性腫瘍を検出しても良い。他の実施形態において、当該方法は、非転移性腫瘍を検出しても良い。他の実施形態において、当該方法は、３１．１エピトープを含有する細胞マーカーを発現する、前癌性細胞を検出しても良い。
他の実施形態において、当該方法は、前記エピトープの画像化を含有しても良い。他の実施形態において、当該画像化は、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ＣＣＤ低照度モニタリングシステム、Ｘ線、ＣＴスキャン、シンチグラフィー、光音響画像化、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波、常磁性画像化、及び、内視鏡光コヒーレンス断層撮影、からなる群から選択されても良い。
１つの実施形態において、抗体作製法は、（ａ）３１．１エピトープを用いて動物を免疫化すること、（ｂ）前記動物の脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製すること、（ｃ）ミエローマ細胞と脾臓細胞を融合させること、（ｄ）融合後の細胞を、ハイブリドーマ選択培地中で培養すること、（ｅ）得られたハイブリドーマを培養すること、（ｆ）特定の抗体産生をスクリーニングすること、及び、（ｇ）所望される抗体を産生するハイブリドーマを選択すること、を含んでも良い。
１つの実施形態において、組成物は、以下のうちの少なくとも２つを含有しても良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
１つの実施形態において、癌を治療するための組成物は、以下のうちの少なくとも２つを含有しても良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
１つの実施形態において、腫瘍増殖を減速させるための組成物は、以下のうちの少なくとも２つを含有しても良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
１つの実施形態において、腫瘍細胞を殺傷するための組成物は、以下のうちの少なくとも２つを含有しても良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
１つの実施形態において、腫瘍退縮を促進するための組成物は、以下のうちの少なくとも２つを含有しても良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
他の実施形態において、組成物は、前記抗体のうち３つを含有しても良い。
１つの実施形態において、癌を治療するための方法は、以下のうち少なくとも２つを含有しうる組成物の有効量を、その必要のある患者に投与することを含んでも良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
１つの実施形態において、腫瘍増殖を減速させるための方法は、以下のうち少なくとも２つを含有しうる組成物の有効量を、その必要のある患者に投与することを含んでも良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
１つの実施形態において、腫瘍退縮を促進するための方法は、以下のうち少なくとも２つを含有しうる組成物の有効量を、その必要のある患者に投与することを含んでも良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
１つの実施形態において、腫瘍細胞を殺傷するための方法は、以下のうち少なくとも２つを含有しうる組成物の有効量を、その必要のある患者に投与することを含んでも良い：（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
１つの実施形態において、腫瘍関連ＮＰＣ−１エピトープを検出する方法は、（ａ）その必要のある患者に対する、以下のうち少なくとも２つを含有しうる組成物と検証サンプルを接触させること：（ｉ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；（ｉｉ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、（ｉｉｉ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、ならびに、（ｂ）抗体−エピトープ複合体を分析することを含んでも良く、ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標である。
１つの実施形態において、患者における、癌と関連したエピトープの存在を検出する方法は、（ａ）以下のうち少なくとも２つを含有しうる組成物を前記患者に投与すること：（ｉ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する標識化抗体またはその抗体断片；（ｉｉ）１６Ｃ３エピトープに結合する標識化抗体またはその抗体断片、及び、（ｉｉｉ）３１．１エピトープに結合する標識化抗体またはその抗体断片、ならびに、（ｂ）前記抗体により結合されたエピトープの存在を検出することを含み、ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標である。
他の実施形態において、当該方法は、前記抗体のうちの３つを投与することを含んでも良い。さらなる実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌であっても良い。
さらなる実施形態において、ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片は、重鎖及び軽鎖を含有しても良く、ここで、前記重鎖は、配列番号１９、２０、２９、３０、３６、及び３７のアミノ酸配列からなる群から選択され、任意選択的に、配列番号２１、２２、２３、３１、３２、３３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有しても良く；及び、軽鎖は、配列番号１４、１５、２４、２５、３４、及び３５からなる群から選択され、任意選択的に、配列番号１６、１７、１８、２６、２７、及び２８のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有しても良い。
さらなる実施形態において、１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片は、重鎖及び軽鎖を含有しても良く、ここで、前記重鎖は、配列番号４３、４４、５３、５４、５５、５６、５７、６３、及び６４のアミノ酸配列からなる群から選択され、任意選択的に、配列番号４５、４６、４７、６５、６６、及び６７のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有しても良く；及び、軽鎖は、配列番号３８、３９、４８、４９、５０、５１、５２、５８、及び５９からなる群から選択され、任意選択的に、配列番号４０、４１、４２、６０、６１、及び６２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有しても良い。
さらなる実施形態において、３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片は、重鎖及び軽鎖を含有しても良く、ここで、前記重鎖は、配列番号６９、７２、７３、７４、７５、７６、及び７７のアミノ酸配列、またはその中に包含される可変領域のうちの１つからなる群から選択され、任意選択的に、配列番号７８、７９、８０、８１、８２，及び８３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有しても良く；及び、軽鎖は、配列番号６８、７０、７１、８４、８５、８６またはその中に包含される可変領域のうちの１つ、及び８７からなる群から選択され、任意選択的に、配列番号８８、８９、９０、９１、９２、及び９３のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有しても良い。
本発明により、３１．１エピトープを含有する単離ポリペプチドが開示される。１つの実施形態において、３１．１エピトープは、解糖系酵素による治療に対し、感受性ではなくても良い。他の実施形態において、Ａ３３抗原は、前記３１．１エピトープを含有しても良い。他の実施形態において、３１．１エピトープは、非線状なエピトープであっても良い。さらなる実施形態において、３１．１エピトープは、配列番号１０、１１、１２、または１３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含有しても良い。
本発明により、配列番号１０、１１、１２、または１３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含有する腫瘍特異的抗原が提示される。他の実施形態において、エピトープは、配列番号１０、１１、１２、または１３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含有しても良い。さらなる実施形態において、エピトープは、任意選択的に、配列番号１０、１１、１２、または１３のアミノ酸配列を含有する非線状なエピトープであっても良い。
３１．１エピトープを含有する腫瘍特異的抗原。他の実施形態において、腫瘍特異的抗原は、配列番号１０、１１、１２、または１３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含有しても良い。
本発明のさらなる態様は、以下の項において記述される。
第１項 配列番号７４、７５、７６、もしくは７７のアミノ酸配列、またはその中に包含される可変領域のうちの１つ、を含有する重鎖配列を少なくとも１つ含有する、Ａ３３抗原に結合する単離抗体またはその抗体断片。
第２項 配列番号７８、７９、８０、８１、８２、または８３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する重鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有する、Ａ３３抗原に結合する単離抗体またはその抗体断片。
第３項 配列番号８４、８５、８６、８７のアミノ酸配列、またはその中に包含される可変領域のうちの１つ、を含有する軽鎖配列を少なくとも１つ含有する、Ａ３３抗原に結合する単離抗体またはその抗体断片。
第４項 配列番号８８、８９、９０、９１、９２、または９３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する、軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有する、Ａ３３抗原に結合する単離抗体またはその抗体断片。
第５項 前記抗体が、前記重鎖または重鎖可変領域を少なくとも１つ、及び、前記軽鎖または軽鎖可変領域を少なくとも１つ含有する、第１項〜第４項のいずれか１項に記載の抗体。
第６項 前記抗体が、前記重鎖ＣＤＲのうち少なくとも１つ、及び、前記軽鎖ＣＤＲのうち少なくとも１つ含有する、第１項〜第５項のいずれか１項に記載の抗体。
第７項 前記抗体が、前記重鎖ＣＤＲのうち少なくとも２つ、及び、前記軽鎖ＣＤＲのうち少なくとも２つ、を含有する、第１項〜第６項のいずれか１項に記載の抗体。
第８項 前記抗体が、前記重鎖ＣＤＲのうち少なくとも３つ、及び、前記軽鎖ＣＤＲのうち少なくとも３つ、を含有する、第１項〜第７項のいずれか１項に記載の抗体。
第９項 前記抗体が、配列番号７４、７５、７６または７７のアミノ酸配列を含有する重鎖配列を少なくとも１つ；配列番号７８、７９、８０、８１、８２または８３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有するＣＤＲ配列を少なくとも１つ；配列番号８４、８５、８６または８７のアミノ酸配列を含有する軽鎖配列を少なくとも１つ；及び、配列番号８８、８９、９０、９１、９２または９３のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ、含有する、第１項〜第８項のいずれか１項に記載の抗体。
第１０項 前記重鎖は、配列番号７８のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７９、８０、８１、または８２のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ２を少なくとも１つ；及び、配列番号８３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ３を少なくとも１つ、含有する、第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の抗体。
第１１項 前記軽鎖は、配列番号８８、８９、または９０のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ１を少なくとも１つ、配列番号９１または９２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ２を少なくとも１つ；及び、配列番号９３のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ３、を含む、第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の抗体。
第１２項 前記抗体または抗体断片は、配列番号１０、１１、１２、または１３のアミノ酸配列に特異的に結合する、第１項〜第１１項のいずれか１項に記載の抗体。
第１３項 前記抗体または断片は、組換え体である、第１項〜第１２項のいずれか１項に記載の抗体。
第１４項 前記抗体または断片は、抗腫瘍活性を有する、第１項〜第１２項のいずれか１項に記載の抗体。
第１５項 前記断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または、抗原に結合することができる抗体の一部である、第１項〜第１２項のいずれか１項に記載の抗体。
第１６項 前記抗体または断片は、標識物、細胞毒性剤、治療剤、または免疫抑制剤に直接的に、もしくは間接的に連結されており、及び／または、前記抗体は、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣを促進し、及び／または、前記抗体は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３アイソタイプである、第１項〜第１５項のいずれか１項に記載の抗体。
第１７項 前記抗体は、組成物中で、抗体、標識物、細胞毒性剤、治療剤、または免疫抑制剤と混合されている、第１項〜第１５項のいずれか１項に記載の抗体。
第１８項 前記抗体は、抗体、標識物、細胞毒性剤、治療剤、もしくは免疫抑制剤と同時に、または連続的に組み合わせて投与される、第１項〜第１５項のいずれか１項に記載の抗体。
第１９項 前記標識物は、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射性標識である、第１６、１７、または１８項に記載の抗体。
第２０項 前記常磁性標識は、アルミニウム、マンガン、プラチナ、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムである、第１９項に記載の抗体。
第２１項 前記細胞毒性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはタンパク質合成を阻害する部分、放射性核種、またはリボソーム阻害タンパク質である、第１６、１７、または１８項に記載の抗体。
第２２項 前記細胞毒性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、ビンデシン、メトトレキサート、アドリアマイシン、シスプラチン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、緑膿菌外毒素Ａ、リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、または細胞毒性ホスホリパーゼ酵素である、第２１項に記載の抗体。
第２３項 前記治療剤は、リンホカインまたは増殖因子である、第１６、１７、または１８項に記載の抗体。
第２４項 前記免疫抑制剤は、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、アゾチプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、タクロリムス、またはシロリムスである、第１６、１７、または１８項に記載の抗体。
第２５項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有する組成物。
第２６項 前記組成物がさらに薬学的に受容可能な担体を含有する、第２５項に記載の組成物。
第２７項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有する診断キット。
第２８項 抗体が固相支持体に直接、または間接的に固定されている、第２７項に記載のキット。
第２９項 前記固相支持体がビーズ、試験管、シート、培養皿、または試験紙である、第２８項に記載のキット。
第３０項 前記固相支持体がアレイである、第２９項に記載のキット。
第３１項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
第３２項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、腫瘍増殖を減速させる方法。
第３３項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、腫瘍細胞を殺傷する方法。
第３４項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、対象における腫瘍退縮を促進する方法。
第３５項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含有する、癌を治療するための組成物。
第３６項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の有効量を含有する、腫瘍増殖を減速させるための組成物。
第３７項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の有効量を含有する、腫瘍細胞を殺傷するための組成物。
第３８項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の有効量を含有する、対象における腫瘍退縮を促進させるための組成物。
第３９項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の、癌を治療するための薬剤の調製における使用。
第４０項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の、腫瘍増殖を減速させるための薬剤の調製における使用。
第４１項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の、腫瘍細胞を殺傷するための薬剤の調製における使用。
第４２項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の、腫瘍退縮を促進するための薬剤の調製における使用。
第４３項 前記癌が、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌である、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第４４項 前記癌が、膵臓癌または結腸直腸癌である、第４３項に記載の組成物、使用または方法。
第４５項 前記抗体が、他の抗体、リンホカインまたは造血増殖因子と組み合わせて投与される、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第４６項 前記剤が、抗体と同時に、または連続して投与される、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第４７項 前記癌が、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌である、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第４８項 前記癌が、ステージ１、２、３または４の癌である、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第４９項 前記癌が、転移している、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第５０項 前記患者が、検出可能なレベルの３１．１エピトープを発現している、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第５１項 前記腫瘍抗原が、腫瘍生検サンプル、または血液、糞便、尿もしくはリンパ液中で検出される、第５０項に記載の組成物、使用、または方法。
第５２項 前記患者は、癌のリスクがある、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第５３項 前記患者は、症状が現れていない患者である、第３１〜４２項のいずれか１項に記載の組成物、使用、または方法。
第５４項 （ａ）３１．１エピトープと結合する、第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片と、検証サンプルを接触させること、及び、
（ｂ）抗体−エピトープ複合体を分析すること、
を含有し、ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標である、３１．１エピトープを検出する方法。
第５５項 （ａ）第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を前記患者に投与することであって、ここで、前記抗体は、３１．１エピトープと結合するよう標識されており、及び、
（ｂ）３１．１エピトープの存在を検出すること、
を含有し、ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標である、患者における３１．１エピトープの存在を検出する方法。
第５６項 前記抗体または断片は、標識に結合されている、第５４または５５項に記載の方法。
第５７項 前記標識物は、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射性標識である、第５６項に記載の方法。
第５８項 前記常磁性標識は、アルミニウム、マンガン、プラチナ、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムである、第５７項に記載の方法。
第５９項 前記癌が、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌である、第５４または５５項に記載の方法。
第６０項 前記患者は、癌のリスクがある、第５４〜５９項のいずれか１項に記載の方法。
第６１項 前記患者は、症状が現れていない患者である、第５４〜５９項のいずれか１項に記載の方法。
第６２項 前記検証サンプルは、癌のリスクがある患者から得られる、第５４〜５９項のいずれか１項に記載の方法。
第６３項 前記検証サンプルは、症状の現れていない患者から得られる、第５４〜５９項のいずれか１項に記載の方法。
第６４項 前記抗体は、固形支持体に付着されている、第５４〜５９項のいずれか１項に記載の方法。
第６５項 前記固形支持体は、ビーズ、試験管、シート、培養皿、または試験紙である、第６４項に記載の方法。
第６６項 前記固形支持体は、アレイである、第６５項に記載の方法。
第６７項 前記サンプルは、組織生検、リンパ、尿、脳脊髄液、羊水、炎症性滲出液、血液、血清、糞便、または消化管から採取された液体である、第５４〜６６項のいずれか１項に記載の方法。
第６８項 前記抗体−エピトープ複合体は、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、側方流動アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及びプロテインＡ免疫アッセイからなる群から選択されるアッセイにより検出される、第５４〜６６項のいずれか１項に記載の方法。
第６９項 前記方法は、結腸直腸ポリープを検出する、第５４〜６８項のいずれか１項に記載の方法。
第７０項 前記方法はさらに、腫瘍の存在に対する追加の検証を含有する、第５４〜６８項のいずれか１項に記載の方法。
第７１項 前記方法は、良性腫瘍を検出する、第７０項に記載の方法。
第７２項 前記方法は、悪性腫瘍を検出する、第７０項に記載の方法。
第７３項 前記方法は、転移性腫瘍を検出する、第７０項に記載の方法。
第７４項 前記方法は、非転移性腫瘍を検出する、第７０項に記載の方法。
第７５項 前記方法は、３１．１エピトープを含有する細胞マーカーを発現する、前癌性細胞を検出する、第５４〜７４項のいずれか１項に記載の方法。
第７６項 前記方法は、前記エピトープの画像化を含有する、第５４〜７５項のいずれか１項に記載の方法。
第７７項 前記画像化は、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ＣＣＤ低照度モニタリングシステム、x線、ＣＴスキャン、シンチグラフィー、光音響画像化、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波、常磁性画像化、及び、内視鏡光コヒーレンス断層撮影、からなる群から選択される、第７６項に記載の方法。
第７８項
（ａ）３１．１エピトープを用いて動物を免疫化すること、
（ｂ）前記動物の脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製すること、
（ｃ）ミエローマ細胞と脾臓細胞を融合させること、
（ｄ）融合後の細胞を、ハイブリドーマ選択培地中で培養すること、
（ｅ）得られたハイブリドーマを培養すること、
（ｆ）特定の抗体産生をスクリーニングすること、及び、
（ｇ）所望される抗体を産生するハイブリドーマを選択すること、
を含む、抗体を作製する方法。
第７９項 以下のうちの少なくとも２つを含有する組成物：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第８０項 以下のうちの少なくとも２つを含有する、癌を治療するための組成物：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第８１項 以下のうちの少なくとも２つを含有する、腫瘍増殖を減速させるための組成物：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第８２項 以下のうちの少なくとも２つを含有する、腫瘍細胞を殺傷するための組成物：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第８３項 以下のうちの少なくとも２つを含有する、腫瘍退縮を促進するための組成物：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第８４項 前記組成物は、前記抗体のうちの３つを含有する、第７９〜８３項のいずれか１項に記載の組成物。
第８５項 前記癌は、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌である、第７９〜８３項のいずれか１項に記載の組成物。
第８６項 ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片が、重鎖及び軽鎖を含有し、ここで、前記重鎖は、任意選択的に、配列番号２１、２２、２３、３１、３２、３３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する、配列番号１９、２０、２９、３０、３６、及び３７のアミノ酸配列からなる群から選択され；及び、軽鎖は、任意選択的に、配列番号１６、１７、１８、２６、２７、及び２８のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有する、配列番号１４、１５、２４、２５、３４、及び３５からなる群から選択される、第７９〜８３項のいずれか１項に記載の組成物。
第８７項 １６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片が、重鎖及び軽鎖を含有し、ここで、前記重鎖は、任意選択的に、配列番号４５、４６、４７、６５、６６、及び６７のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する、配列番号４３、４４、５３、５４、５５、５６、５７、６３、及び６４のアミノ酸配列からなる群から選択され；及び、軽鎖は、任意選択的に、配列番号４０、４１、４２、６０、６１、及び６２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有する、配列番号３８、３９、４８、４９、５０、５１、５２、５８、及び５９からなる群から選択される、第７９〜８３項のいずれか１項に記載の組成物。
第８８項 ３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片は、重鎖及び軽鎖を含有し、ここで、前記重鎖は、任意選択的に、配列番号７８、７９、８０、８１、８２、及び８３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する、配列番号６９、７２、７３、７４、７５、７６、及び７７のアミノ酸配列からなる群から選択され；及び、軽鎖は、任意選択的に、配列番号８８、８９、９０、９１、９２、及び９３のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有する、配列番号６８、７０、７１、８４、８５、８６及び８７からなる群から選択される、第７９〜８３項のいずれか１項に記載の組成物。
第８９項 以下のうちの少なくとも２つを含有する組成物の有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を治療する方法：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第９０項 以下のうちの少なくとも２つを含有する組成物の有効量を、その必要のある対象に投与することを含む、腫瘍の増殖を減速させる方法：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第９１項 以下のうちの少なくとも２つを含有する組成物の有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、対象における腫瘍の退縮を促進する方法：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第９２項 以下のうちの少なくとも２つを含有する組成物の有効量を、その必要のある患者に投与することを含む、腫瘍細胞を殺傷する方法：
（ａ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｂ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｃ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片。
第９３項
（ａ）その必要のある患者に対する、以下のうち少なくとも２つを含有する組成物と検証サンプルを接触させること：
（ｉ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｉｉ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｉｉｉ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、ならびに、
（ｂ）抗体−エピトープ複合体を分析することであって、ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標である、
ことを含む、腫瘍関連ＮＰＣ−１エピトープを検出する方法。
第９４項 （ａ）その必要のある患者に対して、以下のうち少なくとも２つを含有する組成物を前記患者に投与すること：
（ｉ）ＮＰＣ−１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片；
（ｉｉ）１６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、及び、
（ｉｉｉ）３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片、ならびに、
（ｂ）前記抗体に結合されたエピトープの存在を検出することであって、ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標である、
ことを含む、患者における癌関連エピトープの存在を検出する方法。
第９５項 前記方法は、前記抗体のうち３つを投与することを含む、第８９〜９４項のいずれか１項に記載の方法。
第９６項 前記癌は、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌である、第８９〜９４項のいずれか１項に記載の方法。
第９７項 ＮＰＣ−１エピトープに結合する前記抗体またはその抗体断片は、重鎖及び軽鎖を含有し、ここで、前記重鎖は、任意選択的に、配列番号２１、２２、２３、３１、３２、３３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する、配列番号１９、２０、２９、３０、３６、及び３７のアミノ酸配列からなる群から選択され；及び、軽鎖は、任意選択的に、配列番号１６、１７、１８、２６、２７、及び２８のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有する、配列番号１４、１５、２４、２５、３４、及び３５からなる群から選択される、第８９〜９４項のいずれか１項に記載の方法。
第９８項 １６Ｃ３エピトープに結合する抗体またはその抗体断片が、重鎖及び軽鎖を含有し、ここで、前記重鎖は、任意選択的に、配列番号４５、４６、４７、６５、６６、及び６７のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する、配列番号４３、４４、５３、５４、５５、５６、５７、６３、及び６４のアミノ酸配列からなる群から選択され；及び、軽鎖は、任意選択的に、配列番号４０、４１、４２、６０、６１、及び６２のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有する、配列番号３８、３９、４８、４９、５０、５１、５２、５８、及び５９からなる群から選択される、第８９〜９４項のいずれか１項に記載の方法。
第９９項 ３１．１エピトープに結合する抗体またはその抗体断片は、重鎖及び軽鎖を含有し、ここで、前記重鎖は、任意選択的に、配列番号７８、７９、８０、８１、８２、及び８３のアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有する、配列番号６９、７２、７３、７４、７５、７６、及び７７のアミノ酸配列からなる群から選択され；及び、軽鎖は、任意選択的に、配列番号８８、８９、９０、９１、９２、及び９３のアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲ配列を少なくとも１つ含有する、配列番号６８、７０、７１、８４、８５、８６及び８７からなる群から選択される、第８９〜９４項のいずれか１項に記載の方法。
第１００項 第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする単離核酸。
第１０１項 ベクターまたは宿主細胞中に含有されている、第１００項に記載の単離核酸。
第１０２項 細胞、またはセルフリーの翻訳システム中で、第１００項に記載の核酸を発現すること、及び、任意選択的に前記抗体を精製すること、を含む、第１〜２４項のいずれか１項に記載の抗体を作製する方法。
図１Ａは、ヒト化ＮＥＯ−３０３モノクローナル抗体の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。ｃｄｒ３１．１、ａｂｂ３１．１及びｓｄｒ３１．１に対する可変領域は、太字で示されている。示された４つの抗体重鎖の各々に対し、可変領域は、約１１８アミノ酸の長さであり、配列「ＱＩＱ」のＮ末端に始まり、「ＶＳＳ」の配列で終わる。図１Ｅは、配列番号７４〜７７のアミノ酸配列間の配列アライメントを表し、ＣＤＲ（下線）（ＣＤＲアミノ酸配列はまた、配列番号７８〜８３に別々に提示されている）を含む。これら４つの重鎖配列間の配列の差異は、ＣＤＲ２領域内にある。図１Ａは、配列番号７４のポリペプチドを示す。図１Ｂは、配列番号７５のポリペプチドを示す。図１Ｃは、配列番号７６のポリペプチドを示す。図１Ｄは、配列番号７７のポリペプチドを示す。 図１Ｂは、ヒト化ＮＥＯ−３０３モノクローナル抗体の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。ｃｄｒ３１．１、ａｂｂ３１．１及びｓｄｒ３１．１に対する可変領域は、太字で示されている。示された４つの抗体重鎖の各々に対し、可変領域は、約１１８アミノ酸の長さであり、配列「ＱＩＱ」のＮ末端に始まり、「ＶＳＳ」の配列で終わる。図１Ｅは、配列番号７４〜７７のアミノ酸配列間の配列アライメントを表し、ＣＤＲ（下線）（ＣＤＲアミノ酸配列はまた、配列番号７８〜８３に別々に提示されている）を含む。これら４つの重鎖配列間の配列の差異は、ＣＤＲ２領域内にある。図１Ａは、配列番号７４のポリペプチドを示す。図１Ｂは、配列番号７５のポリペプチドを示す。図１Ｃは、配列番号７６のポリペプチドを示す。図１Ｄは、配列番号７７のポリペプチドを示す。 図１Ｃは、ヒト化ＮＥＯ−３０３モノクローナル抗体の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。ｃｄｒ３１．１、ａｂｂ３１．１及びｓｄｒ３１．１に対する可変領域は、太字で示されている。示された４つの抗体重鎖の各々に対し、可変領域は、約１１８アミノ酸の長さであり、配列「ＱＩＱ」のＮ末端に始まり、「ＶＳＳ」の配列で終わる。図１Ｅは、配列番号７４〜７７のアミノ酸配列間の配列アライメントを表し、ＣＤＲ（下線）（ＣＤＲアミノ酸配列はまた、配列番号７８〜８３に別々に提示されている）を含む。これら４つの重鎖配列間の配列の差異は、ＣＤＲ２領域内にある。図１Ａは、配列番号７４のポリペプチドを示す。図１Ｂは、配列番号７５のポリペプチドを示す。図１Ｃは、配列番号７６のポリペプチドを示す。図１Ｄは、配列番号７７のポリペプチドを示す。 図１Ｄは、ヒト化ＮＥＯ−３０３モノクローナル抗体の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。ｃｄｒ３１．１、ａｂｂ３１．１及びｓｄｒ３１．１に対する可変領域は、太字で示されている。示された４つの抗体重鎖の各々に対し、可変領域は、約１１８アミノ酸の長さであり、配列「ＱＩＱ」のＮ末端に始まり、「ＶＳＳ」の配列で終わる。図１Ｅは、配列番号７４〜７７のアミノ酸配列間の配列アライメントを表し、ＣＤＲ（下線）（ＣＤＲアミノ酸配列はまた、配列番号７８〜８３に別々に提示されている）を含む。これら４つの重鎖配列間の配列の差異は、ＣＤＲ２領域内にある。図１Ａは、配列番号７４のポリペプチドを示す。図１Ｂは、配列番号７５のポリペプチドを示す。図１Ｃは、配列番号７６のポリペプチドを示す。図１Ｄは、配列番号７７のポリペプチドを示す。 図１Ｅは、それぞれ、配列番号７４、７５、７６及び７７のアライメントを示す。 Ａ〜Ｄは、ヒト化ＮＥＯ−３０３モノクローナル抗体の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。ｃｄｒ３１．１、ａｂｂ３１．１及びｓｄｒ３１．１に対する可変領域は、太字で示されている。示された４つの抗体軽鎖の各々に対し、可変領域は、約１０７アミノ酸の長さであり、配列「ＳＩＶ」または「ＳＩＱ」のＮ末端に始まり、「ＥＩＫ」または「ＥＬＫ」の配列で終わる。図２Ｅは、配列番号８４〜８７のアミノ酸配列間の配列アライメントを表し、ＣＤＲ（下線）（ＣＤＲアミノ酸配列はまた、配列番号８８〜９３に別々に提示されている）を含む。これら４つの軽鎖配列間の配列の差異は、ＣＤＲ１領域内、ならびに、フレームワーク１（ＦＲ１）領域（第一アミノ酸から、ＣＤＲ１配列開始点のちょうど前のアミノ酸までの長さにわたる）、及びフレームワーク４（ＦＲ４）領域（ＣＤＲ３配列に対するＣ末端の第一アミノ酸に始まり、可変ドメインの末端にまでわたる）にある。図２Ａは、配列番号８４のポリペプチドを示す。図２Ｂは、配列番号８５のポリペプチドを示す。図２Ｃは、配列番号８６のポリペプチドを示す。図２Ｄは、配列番号８７のポリペプチドを示す。 図２Ｅは、それぞれ、配列番号８４、８５、８６及び８７のアライメントを示す。 １７．７Ａ（対照）、マウス３１．１、及び、ＮＥＯ−３０１抗体に対する、エフェクター細胞と腫瘍細胞の比率を示す。 腫瘍の増殖に対して、３０日間にわたり、ヒトＩｇＧは効果を有さなかったことを表す、腫瘍増殖の対照実験を示す。 ３０日間にわたる、キメラＮＥＯ−３０１の単独投与（単剤療法）を行った後の腫瘍増殖を示している。 ３０日間にわたる、ヒトエフェクター細胞とキメラＮＥＯ−３０１の投与［ＰＭＮＣ（多形核細胞）（併用療法）］を行った後の、腫瘍増殖を示している。 ＃５及び＃６と名付けられた、２つのヒト化３１．１抗体のクマシーブルー染色を示す（非還元条件及び還元条件下）。 ＃５及び＃６と名付けられた、２つのヒト化３１．１抗体（ならびに、それらのビオチニル化形態）を用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 ＃１１及び＃１６と名付けられた、２つのヒト化３１．１抗体のクマシーブルー染色を示す（非還元条件及び還元条件下）。 ＃１１及び＃１６と名付けられた、２つのヒト化３１．１抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 ＃１１及び＃１６と名付けられた、ＡｓＰＣ−１細胞（膵臓癌細胞株）を染色するための、２つのヒト化３１．１抗体を用いて得られたフローサイトメトリーの結果を示す。 ヒト化３１．１、＃１１及び＃１６による、肝臓へ転移した凍結結腸癌サンプルの免疫組織化学染色の結果を示す。 ヒト化３１．１抗体、＃１６（各群の最も左のバー）、＃６（各群の左から２番目のバー）、キメラ３１．１（各群の左から３番目のバー）、及びヒトＩｇＧ対照（各群の最も右のバー）のＡＤＣＣ機能を示す。 ＡｓＰＣ−１（膵臓癌）異種移植モデルにおける、ヒト化３１．１抗体＃１６（下のライン）の抗腫瘍効果を示す（ヒトＩｇＧ対照（上のライン）と比較）。抗体は、０、３、及び６日目に注射し、ＰＭＢＣは、１、４、及び７日目に注射した。平均腫瘍サイズは、ヒト化３１．１抗体＃１６を注射したマウスにおいて著しく減少した。
本明細書に記述される発明を完全に理解できるよう、以下に詳細な説明を記す。本発明の様々な実施形態が詳細に記述され、及び、提示された実施例によりさらに解説される。
定義
他で定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者により普遍的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと類似した、または均等な方法及び材料を本発明において用いることができ、または本発明の検証に用いることができるが、適切な方法及び材料が本明細書に記述される。材料、方法及び実施例は、解説の目的のためのみであり、限定の意図は無い。
本明細書及び以下のクレーム全体を通じ、「一つの（ａ、ａｎ、及びｔｈｅ）」の意味には、文脈上で他であると明確に示されない限り、複数の意味を含む。
本明細書において、「アミノ酸」とは、天然型アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに、アミノ酸アナログ及び、天然型アミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸模倣体を広く指す。天然型アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、及び、後に修飾されるアミノ酸（たとえば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリン等）である。アミノ酸アナログとは、天然型アミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物を指す（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合された炭素）（たとえば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム等）。そのようなアナログは、修飾Ｒ基（たとえば、ノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、天然型アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然型アミノ酸と類似した様式で機能する化合物を指す。
本明細書において、「抗体」とは、エピトープに適合及び認識する、特異的な形状を有する、ポリペプチド鎖含有分子構造を広く指し、１以上の非共有結合的な相互作用が、当該分子構造とエピトープの間の複合体を安定化する。典型的な抗体分子は、イムノグロブリンであり、全ての源（たとえば、ヒト、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ニワトリ等）由来の、全てのイムノグロブリンのタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）が、「抗体」であるとみなされる。抗体としては、限定されないが、キメラ抗体、ヒト抗体、及び他の非ヒト哺乳類抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キャメルボディ、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ（サメ由来の一本鎖抗体）、小モジュラー免疫薬品（ＳＭＩＰ）、及び抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）が挙げられる。多くの抗体コード配列が報告されており；それ以外も、当分野公知の方法により明らかにされるであろう。Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １４（１１）： ２９０１-９； Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７４（６５１８）： １６８-１７３； Ｎｕｔｔａｌｌ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３８（４）： ３１３-２６； Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６３（６４２８）： ４４６-８； Ｇｉｌｌ， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７（６）： ６５３-８を参照のこと。
本明細書において、「抗原」とは、抗体により結合されることができる分子、または分子の一部を広く指し、それらはさらに、当該抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するよう、動物を誘導することができる。抗原は、１つのエピトープを有していても良く、または、２以上のエピトープを有していても良い。本明細書において言及されている特異的反応とは、抗原が、高い選択性で、対応する抗体を反応し、及び、他の抗原により惹起されうる他の抗体の大多数とは反応しない、ことを指す。抗原は、腫瘍特異的（たとえば、膵臓及び結腸癌の新生細胞により発現されている）であっても良い。
本明細書において、「癌」とは、腫瘍の悪性増殖をもたらす、異常で制御不能な細胞分裂により特徴付けられる、任意の腫瘍性疾患を広く指す。
本明細書において、「キメラ抗体」とは、定常領域またはその一部が改変されている抗体分子を広く指し、抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能及び／または種の定常領域、または、キメラ抗体に新たな機能を付与する、全く異なる分子（たとえば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤等）に連結されており；または、可変領域もしくはその一部が、異なる抗原特異性もしくは改変された抗原特異性を有する可変領域に改変、置換または交換されている抗体分子を広く指す。
本明細書において、「保存的修飾変異体」とは、アミノ酸及び核酸の両方に適用され、及び、特定の核酸配列に関しては、同一のアミノ酸配列または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す、保存的修飾変異体を広く指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードには縮重があるため、多数の機能的に同一な核酸が、所与のタンパク質をコードする。そのような核酸変異体は、「サイレントな変異体」であり、保存的修飾変異体の１種である。本明細書において、ポリペプチドをコードする各核酸配列は、可能性のある各核酸のサイレントな変異体も記載しているものとする。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び、通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変し、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。
本明細書において、「相補性決定領域」、「超可変領域」、または「ＣＤＲ」とは、抗体の軽鎖または重鎖の可変領域に存在する、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１以上を広く指す。Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ” Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤを参照のこと。これらの表現には、Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ． （１９８３） “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ” Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、において定義される超可変領域、または、抗体の３次元構造における超可変ループが含まれる。ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ （１９８７） Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１-９１７。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域により近接して保持され、及び、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲの中には、抗体−抗原相互作用においてＣＤＲにより用いられる重要な接触残基である、選択決定性領域（ＳＤＲ）として記述されている、選択アミノ酸がある。Ｋａｓｈｍｉｒｉ （２００５） Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６： ２５-３４。
本明細書において、「対照量」とは、マーカーの検証量に対し比較される、任意の量または任意の範囲の量であるマーカーを広く指す。たとえば、マーカーの対照量は、特定の疾患または状態を有する患者における、または、そのような疾患または状態を有していないヒトにおける、マーカーの量であっても良い。対照量は、絶対量（たとえば、μｇ／ｍｌ）または相対量（たとえば、相対シグナル強度）のいずれであっても良い。
本明細書において、「示差的に存在する」とは、疾患または状態のうちの１つを有していない患者から得られた比較可能なサンプルと比較した、疾患または状態を有している患者から得られたサンプル中に存在するマーカーの質または量における差異を広く指す。たとえば、もし１つのサンプル中の核酸断片の量（たとえば、ハイブリダイゼーション及び／またはＮＡＴベースアッセイにより測定される）が、他のサンプル中の核酸断片の量とは有意に異なる場合、２つのサンプルの間には任意的に、示差的に存在しうる。１つのサンプル中のポリペプチドの量が、他のサンプル中のポリペプチドの量とは有意に異なる場合、ポリペプチドは、示差的に存在する。もしマーカーが１つのサンプル中で検出可能であり、他方では検出不可能である場合、そのようなマーカーは、示差的に存在するとみなされる。任意的に、相対的に低量での上方制御は、マーカーとして機能しうる。
本明細書において、「診断の」とは、病的状態の存在または性質を特定することを広く指す。診断方法は、感度及び特異度が異なる。診断アッセイの「感度」は、テストが陽性である、罹患者のパーセンテージである（「真の陽性」の割合）。アッセイにより検出されなかった罹患者は、「偽陰性」である。罹患しておらず、アッセイにおいてテストが陰性である対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を引いたものであり、ここで、「偽陽性」率は、テストが陽性であり、罹患していない者の比率として定義される。特定の診断方法は、疾患の確定診断を行えないが、当該方法により診断の一助となる陽性の示唆が得られれば十分である。
本明細書において、「診断」とは、疾患または症状の分類、疾患の重篤度の決定、疾患の進行のモニタリング、疾患の転帰の予測、及び／または、回復見込みの予測、を広く指す。「検出する」という用語もまた、任意選択的に前述のいずれかを包含しうる。本発明による疾患の診断は、一部の実施形態においては、対象から得られた生物学的サンプル中の、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを測定することにより影響されても良く、ここで、測定されたレベルは、疾患に罹りやすい傾向、または疾患の存在の有無と相関しうる。「対象から得られた生物学的サンプル」はまた、任意選択的に、対象から物理的に採取されていないサンプルを含有しうる。
本明細書において、「有効量」とは、疾患治療のために患者に投与された際に、そのような疾患の治療に十分に有効である、化合物、抗体、抗原または細胞の量を広く指す。有効量は、予防に有効な量、及び／または、防御に有効な量であっても良い。有効量は、減少させるために有効な量、兆候／症状の出現を防ぐために有効な量、兆候／症状の出現の重篤度を減少させるために有効な量、兆候／症状の出現を消去するために有効な量、兆候／症状の発生が現れるのを減速させるために有効な量、兆候／症状の発生が現れるのを防ぐために有効な量、及び／または、兆候／症状の発生を有効に予防する量であっても良い。「有効量」は、疾患及びその重篤度、ならびに、治療される患者の年齢、体重病歴、感受性、及び従前から存在した疾患により変化しうる。「有効量」という用語は、本発明の目的に対し、「治療有効量」と同じ意味である。
本明細書において、「発現ベクター」とは、本発明の核酸配列を、任意の細胞（原核細胞、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞を含む）において、構造的に、または誘導的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現させる目的のための、任意の組換え発現システムを広く指す。当該用語には、線状または環状の発現システムが含まれる。当該用語には、エピソーム状態を保持する発現システム、または、宿主ゲノムに組み込む発現システムが含まれる。発現システムは、自己複製能力を有していてもいなくても（すなわち、細胞中で一過性の発現を誘導する）良い。当該用語には、組換え核酸の転写に必要最低限の要素のみを含有する組換え発現カセットが含まれる。
本明細書において、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」とは、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内にあるフレームワーク領域のうちの１つ以上を広く指す。Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤを参照のこと。これらの表現には、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内にあるＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列領域が含まれる。
本明細書において、「異種の」とは、自然界では同じような相互関係が存在しない、２以上のサブシークエンスを核酸が含有することを表す、核酸の部分を広く指す。たとえば、新たな機能性核酸を作製するよう配置された無関係の遺伝子由来の２以上の配列（たとえば、１つの源由来のプロモーターと、他の源由来のコード領域）を有する核酸は通常、遺伝子組換えにより産生される。同様に、異種タンパク質とは、自然界では同じような相互関係が存在しない、２以上のサブシークエンスをタンパク質が含有することを表す（たとえば、融合タンパク質）。
本明細書において、「高いアフィニティ」とは、標的抗原に対し、少なくとも１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−９Ｍ、よりさらに好ましくは少なくとも１０−１０ＭのＫＤを有する抗体を広く指す。たとえば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高いアフィニティ」の結合とは、少なくとも１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−８ＭのＫＤを有する抗体を指す。
本明細書において、「相同性」とは、核酸配列と基準核酸配列の間の類似性の程度、または、ポリペプチド配列と基準ポリペプチド配列の間の類似性の程度を広く指す。相同性は、部分的であっても、完全性のものであっても良い。完全な相同性とは、核酸またはアミノ酸の配列が同一であることを表す。部分的に相同な核酸配列またはアミノ酸配列とは、基準核酸配列または基準アミノ酸配列に対し、同一ではないものである。相同性の程度は、配列の比較により決定されうる。「配列同一性」という用語は、「相同性」と相互交換可能に用いられうる。
本明細書において、「宿主細胞」とは、発現ベクターを含有する細胞、及び、発現ベクターの複製または発現をサポートする細胞を広く指す。宿主細胞は、たとえば大腸菌等の原核細胞であっても良く、または、たとえば酵母、昆虫細胞（たとえば、ＳＦ９）、両生類細胞、もしくは哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３）等の真核細胞、培養細胞、外殖片、及びｉｎ ｖｉｖｏ細胞であっても良い。
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」とは、鎖が互いに逆平行の状態で配置された際に、相補的なヌクレオチドの間で水素結合が形成されることによる、相補的（部分的な相補性を含む）なポリヌクレオチド鎖の物理的な相互作用を広く指す。
本明細書において、「Ｋ−ａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を広く指し、一方で、本明細書において、「Ｋｄｉｓｓ」または「Ｋｄ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。本明細書において、「ＫＤ」という用語は、解離定数を指すことが意図され、ＫｄとＫａの比率から得られ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体に対するＫＤ値は、当分野で確立されている方法を用いて測定することができる。
本明細書において、「イムノアッセイ」とは、抗原に特異的に結合する抗体を用いるアッセイを広く指す。イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、及び／または、定量するための、特定の抗体の特異的結合特性の使用により、特徴付けられる。
本明細書において、「単離された」とは、自然に発生する元の環境から採取され、自然な環境からヒトの手により改変された物質を広く指す。単離された物質は、たとえば、ベクターシステムに含まれる外来性核酸、宿主細胞内に包含される外来性核酸、または、元の環境から採取され、ヒトの手により改変された任意の物質（たとえば、単離抗体）であっても良い。
本明細書において、「標識物」または「検出可能な部分」とは、分光、光化学、生化学、免疫化学、化学、または他の物理的な手段により検出可能な組成物を広く指す。
本明細書において、「低いストリンジェンシー」、「中程度のストリンジェンシー」、「高いストリンジェンシー」、または「非常に高いストリンジェンシー条件」とは、核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を広く指す。ハイブリダイゼーション反応を行うガイダンスは、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （５ｔｈ Ｅｄ．） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ、にある。具体的なハイブリダイゼーション条件の例としては、限定されないが、（１）約４５℃、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で低いストリンジェンシーハイブリダイゼーションの後、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２度洗浄を行う（洗浄の温度は、低いストリンジェンシー条件に対しては、５５℃まで上げることができる）；（２）約４５℃、６Ｘ ＳＳＣ中で中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の後、６０℃、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で１回以上洗浄を行う；（３）約４５℃、６Ｘ ＳＳＣ中で高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の後、６５℃、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄を行う；及び、（４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳであり、次いで、６５℃、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄を行う、が挙げられる。
本明細書において、「哺乳類」とは、ありとあらゆる哺乳類の温血脊椎動物を広く指し、ヒトが含まれ、皮膚を毛髪が覆い、メスは子供を育てるための乳を産生する乳腺があることが特徴である。哺乳類の例としては、限定されないが、アルパカ、アルマジロ、カピバラ、ネコ、ラクダ、チンパンジー、チンチラ、ウシ、イヌ、ロバ、ヤギ、ゴリラ、ハムスター、ウマ、ヒト、キツネザル、リャマ、マウス、非ヒト霊長類、ブタ、ラット、ヒツジ、トガリネズミ、リス、バクが挙げられる。哺乳類としては、限定されないが、ウシ科、イヌ科、ウマ科、ネコ科、ネズミ科、ヒツジ科、ブタ科、霊長類及びげっ歯類が挙げられる。哺乳類としてはまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｕｓｅｕｍ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ， Ｓｍｉｔｈｓｏｎｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣにより維持されるＭａｍｍａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄに列記されるありとあらゆるものが挙げられる。
本明細書において、「核酸」または「核酸配列」とは、一本鎖、または二本鎖の形態にある、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを広く指す。当該用語には、核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）（天然型ヌクレオチドの公知のアナログを含む）が包含される。当該用語はまた、合成主鎖を有する核酸様構造を包含する。他で示されない限り、特定の核酸配列は、黙示的に、その保存的修飾変異体（たとえば、縮重コドン置換体）及び相補配列、ならびに明示的に示された配列を包含する。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと相互交換可能に用いられる。
本明細書において、「操作可能に連結された」とは、２つのＤＮＡ断片によりコードされたアミノ酸配列が、フレーム内に収まるように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを広く指す。
本明細書において、「パラトープ」とは、抗原を認識する抗体の一部を広く指す（たとえば、抗体の抗原結合部位）。パラトープは、抗体のＦｖ領域の小さい領域（たとえば、１５〜２２アミノ酸）であっても良く、ならびに、抗体の重鎖及び軽鎖の一部を含有しても良い。Ｇｏｌｄｓｂｙ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｇｅｎｓ （Ｃｈａｐｔｅｒ ３） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （５ｔｈ Ｅｄ．） Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、５７-７５ページを参照のこと。
本明細書において、「患者」とは、疾患状態の治療または緩和の必要がある任意の動物、または、疾患状態の発生または再発を防ぐ必要がある任意の動物を広く指す。また、本明細書において、「患者」とは、リスク因子を有する、既往歴がある、感受性がある、症状、兆候を有する、すでに診断されている、リスクがある、または、疾患の患者群の一員である、任意の動物を広く指す。患者は、たとえばヒトまたは獣医学的な患者（たとえば、ペット、家畜、珍獣、または動物園動物等）の臨床患者であっても良い。「対象」という用語は、「患者」という用語と相互交換可能に用いられても良い。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は相互交換可能に用いられ、及び、アミノ酸残基のポリマーを広く指す。当該用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然型アミノ酸もしくは天然型アミノ酸ポリマーのアナログまたは模倣体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。当該用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然型アミノ酸ならびに天然型アミノ酸ポリマー及び非天然型アミノ酸ポリマーの人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。ポリペプチドは、修飾されても良い（たとえば、糖タンパク質を形成するために、糖質残基を追加する）。「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、糖タンパク質及び非糖タンパク質を含む。
本明細書において、「プロモーター」とは、核酸の転写を指示する核酸配列のアレイを広く指す。本明細書において、プロモーターには、転写開始部位の近くに必要な核酸配列が含まれ、たとえば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合は、ＴＡＴＡエレメントである。プロモーターはまた、任意選択的に、遠位エンハンサー、またはリプレッサーエレメントを含み、それらは、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置するときもある。「構造的」プロモーターとは、ほとんどの環境条件下、及び発現条件下で、活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境の制御下または発現制御の下で、活性であるプロモーターである。
本明細書において、「予防有効量」とは、疾患の予防のために患者に投与された際、または、疾患の再発防止のために患者に投与された際に、そのような疾患予防または再発予防に十分に有効な化合物の量を広く指す。予防有効量は、兆候及び／または症状の発生を防ぐのに有効な量であっても良い。「予防有効量」は、疾患及びその重篤度、ならびに、治療される患者の年齢、体重、既往歴、疾患傾向、従前から存在する状態により変化しうる。
本明細書において、「予防」とは、兆候及び／または症状が患者に存在していない、寛解期にある、または、患者に以前に存在していた場合の、一連の療法を広く指す。予防には、患者において、疾患の治療の後で発生する疾患を防ぐことも含まれる。さらに、予防には、疾患を発現する可能性がある患者を治療すること、特に、疾患に感受性のある患者を治療することが含まれる（たとえば、患者群のメンバー、リスク因子を有する者、または、疾患を発症するリスクがある者）。
本明細書において、「組換え体」とは、細胞、核酸、タンパク質、またはベクター等の産物を広く指し、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくは異種タンパク質の導入により修飾されていること、または、天然核酸もしくはタンパク質の改変により修飾されていること、または、細胞が、そのように修飾された細胞から誘導されていることを示す。ゆえに、たとえば、組換え細胞は、天然型（非組換え型）の細胞では存在しない遺伝子を発現しているか、または、異常に発現される、発現に達しない、または全く発現しない天然型遺伝子を発現する。
本明細書において、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」、または、「特異的に（または選択的に）免疫反応する」、または「特異的に相互作用する、または結合する」とは、広くタンパク質またはペプチド（または他のエピトープ）を指し、一部の実施形態においては、異種タンパク質群または他の生物学的物質中で、タンパク質の存在を決定付ける結合反応を広く指す。たとえば、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の抗体は、特定のタンパク質に対し、バックグラウンド（非特異的シグナル）よりも少なくとも２倍高く結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に対し、有意な量では実質的に結合しない。通常、特異的反応または選択的反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より一般的には、バックグラウンドの約１０〜１００倍超である。
本明細書において、「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」とは、従来的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋまたは他の非従来的な型のいずれかにより他の核酸配列と水素結合（複数含む）を形成することができる核酸を広く指す。核酸分子と、その相補配列に対する結合自由エネルギーは、核酸の関連機能（たとえば、ＲＮＡｉ活性）を進展させるために十分なものである。核酸分子に対する結合自由エネルギーの測定は、当分野に公知である。たとえば、Ｔｕｒｎｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＣＳＨ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ＬＩＩ： １２３-３３； Ｆｒｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＰＮＡＳ ８３： ９３７３-７７； Ｔｕｒｎｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０９： ３７８３-８５を参照のこと。相補性割合は、第二の核酸配列と水素結合（たとえば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の連続した残基の割合を指す（たとえば、１０のうちの少なくとも約５、６、７、８、９、１０であれば、それぞれ、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性である）。「完全に相補的」または１００％の相補性は、核酸配列の連続残基の全てが、第二の核酸配列中の連続残基の同一数と水素結合を形成することを広く指す。「実質的に相補的」とは、少なくとも約９０％の相補性を示すポリヌクレオチド鎖を指す（たとえば、非相補性であるために選択された、オーバーハング等のポリヌクレオチド鎖の領域は除く）。特異的結合には、特異的結合が所望される条件下（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療処置の場合には、生理学的条件下。または、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合には、アッセイが行われる条件下）で、オリゴマー化合物と標的ではない配列との非特異結合を回避するために十分な程度の相補性が必要とされる。標的ではない配列は通常、少なくとも５ヌクレオチド異なっても良い。
本明細書において、「兆候」とは、疾患の任意の異常な指標を広く指し、患者の検査で発見可能であり；疾患の主体的指標である症状とは対照的に、疾患の客観的指標である。
本明細書において、「固形支持体」、「支持体」、及び「基盤」とは、他の物質が付着することができる固形構造または半固形構造をもたらす任意の物質を広く指し、限定されないが、平滑な支持体（たとえば、金属、ガラス、プラスチック、シリコン及びセラミック表面）ならびに、ざらつきのある、多孔質の物質が挙げられる。
本明細書において、「対象」とは、本発明に従い治療されることが適したものを広く指し、限定されないが、鳥類及び哺乳類の対象が挙げられ、及び、好ましくは、哺乳類である。本発明の哺乳類としては、限定されないが、イヌ科、ネコ科、ウシ属、ヤギ科、ウマ科、ヒツジ科、ブタ科、げっ歯類（たとえば、ラット及びマウス）、ウサギ目、霊長類、ヒトが挙げられる。本発明に従い治療される必要のある哺乳類の対象はいずれも、適している。両方の性のヒト対象、及び、任意の発育段階にあるヒト対象（すなわち、新生児、乳児、幼児、青年、成人）を、本発明に従い、治療することができる。本発明はまた、動物対象、特に、たとえば獣医学的な目的、ならびに薬剤スクリーニング及び薬剤開発の目的に対しては、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類対象に実施されても良い。「対象」は、「患者」と相互交換可能に用いられる。
本明細書において、疾患の「症状」とは、患者に経験される、正常な構造、機能、または感覚とは逸脱した任意の病的な現象であり、疾患の指標を広く指す。
本明細書において、「療法」、「治療の」、「治療を行うこと」、または「治療」は、疾患の治療、疾患もしくはその臨床症状の発現の防止または減少、及び／または、疾患の緩和、疾患もしくはその臨床症状の軽減をもたらすことを広く指す。療法には、予防、治療、医薬、減少、緩和、ならびに／または、疾患、疾患の兆候及び／もしくは症状の軽減をもたらすことを包含する。療法には、疾患兆候及び／または症状の進行を示す患者（たとえば、腫瘍の増殖、転移等）において、兆候及び／または症状を緩和することが包含される。療法にはまた、「予防」が包含される。療法の目的に対し、「減少した」という用語は、兆候及び／または症状における臨床上、重要な減少を広く指す。療法には、兆候及び／または症状（たとえば、腫瘍の増殖、転移等）の再発またはぶり返しを治療することが含まれる。療法には、限定されないが、任意のときに兆候及び／または症状が発現しないようにすること、ならびに、存在する兆候及び／または症状を減少させること、ならびに、存在する兆候及び／または症状を除外することが包含される。療法には、慢性疾患を治療すること（維持）及び、急性疾患を治療することが含まれる。たとえば、治療には、兆候及び／または症状（たとえば、腫瘍の増殖、転移等）の再発もしくはぶり返しを治療または予防することが含まれる。
本明細書において、「可変領域」または「ＶＲ」とは、抗原に対する抗体の結合に直接関与する、抗体中の軽鎖及び重鎖の各対内のドメインを広く指す。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと一列に並び、及び、軽鎖可変ドメインは、重鎖の改変ドメインと一列に並んでいる。
本明細書において、「ベクター」とは、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージＤＮＡ、または宿主細胞内で自発的に複製することができる他のＤＮＡ分子を広く指し、１つ、または少数の制限酵素エンドヌクレアーゼ認識部位の特徴を有し、そのＤＮＡ配列は、ベクターの本質的な生物機能を失わせること無く、決定可能な様式で切断されることができ、複製及びクローニングを行うためにＤＮＡを挿入することができる。ベクターはさらに、ベクターで形質転換された細胞の特定における使用に適したマーカーを含有しても良い。
前記技術及び手順は、通常、当分野に公知の標準的な方法に従い実施され、本明細書に引用及び検討される、より具体的な参照文献及び様々な概説中に記述されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｌａｂ． Ｍａｎｕａｌ ［３ｒｄ Ｅｄ］ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。標準的な技術を、ＤＮＡ組換え、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養、及び形質転換（たとえば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に用いることができる。酵素反応及び精製の技術は、メーカーの説明書に従い行っても良く、または、本明細書に記述される、当分野で通常に行われているように、実施されても良い。本明細書に記述される、分析化学、合成有機化学、ならびに、医療及び薬化学の技術、ならびに実験手法に関連して用いられている専門用語は、公知であり、当分野に普遍的に用いられている。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤調製、製剤、及び送達、及び患者の治療に用いることができる。
Ａ３１．１エピトープを含有するＡ３３抗原
本発明により、ヒト化３１．１モノクローナル抗体が開示される。これらヒト化モノクローナル抗体は、癌の検出及び治療のための方法に用いられても良い。
３１．１抗体は、ヒト結腸癌組織及びヒト膵臓癌組織と反応性を有する抗体である。３１．１抗体の抗原は、ヒトＡ３３抗原であり、免疫沈降された抗原のウェスタンブロット、質量分析、ドットブロット、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡにより示されている。３１．１抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるマウス組換えＡ３３、及びＩＨＣ染色におけるＡ３３とは交差反応しない。３１．１エピトープは、合成洗剤による崩壊に対し感受性であり、ウェスタンブロットにおける還元条件下では陰性の結合結果であったため、非線状である。ＬＳ１７４Ｔヒト結腸腫瘍細胞のＩＰ（免疫沈降）から得た質量分析により特定されたＡ３３アミノ酸配列及びペプチドの全長を、以下に示す。

1 MVGKMWPVLW TLCAVRVTVD AISVETPQDV LRASQGKSVT LPCTYHTSTS SREGLIQWDK
61 LLLTHTERVV IWPFSNKNYI HGELYKNRVS ISNNAEQSDA SITIDQLTMA DNGTYECSVS
121 LMSDLEGNTK SRVRLLVLVP PSKPECGIEG ETIIGNNIQL TCQSKEGSPT PQYSWKRYNI
181 LNQEQPLAQP ASGQPVSLKN ISTDTSGYYI CTSSNEEGTQ FCNITVAVRS PSMNVALYVG
241 IAVGVVAALI IIGIIIYCCC CRGKDDNTED KEDARPNREA YEEPPEQLRE LSREREEEDD
301 YRQEEQRSTG RESPDHLDQ (配列番号１０)
強調部分は、ＬＳ１７４Ｔ ３１．１のＩＰから得た質量分析により特定されたペプチド配列である（トータルのＡ３３配列の３９％を占める）。ＡＳ３３は、Ａ３３タンパク質と反応する、従前に報告されているモノクローナル抗体である。３１．１抗体は、ＬＳ１７４Ｔ、及び、全長Ａ３３ｃＤＮＡを発現する遺伝子組換えＣＨＯ細胞株（Ａ３３−ＣＨＯ）から得た３１．１のＩＰタンパク質中の抗原を検出することができるが、非還元条件下のウェスタンブロット中では両方の細胞株由来のＡＳ３３ ＩＰタンパク質はできなかった。ＡＳ３３は、３１．１中の抗原、ならびに、ＬＳ１７４Ｔ及びＡ３３−ＣＨＯ組換え細胞から得たＡＳ３３ＩＰタンパク質に結合する。実験結果から、３１．１抗体は、市販のＡＳ３３抗体と比較し、Ａ３３抗原の異なるエピトープに結合することが示唆される。
それゆえ、本明細書に記述される、ヒト化３１．１抗体は、以下のペプチド配列中に包含されるＡ３３抗原中の非線状（たとえば、立体的）エピトープを認識する可能性がある（太字で示されているのは３１．１エピトープ）。

VRLLVLVPPSKPECGIEGETIIGNNIQLTCQSKEGSPTPQYSWKRYNILNQEQPLAQPASGQPVSLK (配列番号１２)
さらに、８ｍｅｒ及び１０ｍｅｒ重複ペプチドアレイ分析のデータ、及びＰＨ．Ｄファージディスプレイバイオパンニングのデータから、Ａ３３抗原上の３１．１エピトープは、Ａ３３抗原のおよそ１６８〜１８６残基（ＳＰＴＰＱＹＳＷＫＲＹＮＩＬＮＱＥＱＰ、配列番号９４）に位置している可能性があること；及び、ジスルフィド結合が、同じ３１．１エピトープ構造に必要とされること、が示唆される。これらのデータから、残基Ａｓｎ１７９で、Ａｓｐへと、遺伝子組換えでＡ３３ｃＤＮＡに点変異を誘導することによって、哺乳類細胞へのトランスフェクション及び変異組換えＡ３３タンパク質の発現の後、３１．１抗体の結合が減少することを示す、米国特許出願公開第２００８／００３１８７３号において従前に報告されたことが支持される。
ゆえに、本発明により、結腸癌及び膵臓癌及び他の癌により発現されるＡ３３抗原（たとえば、３１．１エピトープ）に結合する抗体、及び、臨床におけるその使用、及び科学的手法におけるその使用（診断法を含む）が開示される。Ａ３３抗原（たとえば、３１．１エピトープ）に結合するＮＥＯ−３００抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてＮＥＯ−３０１抗体が効果的に腫瘍の進行を阻害することから、診断及び治療の、癌に対する標的特異的ツールとしての両方に有用である。さらに、Ａ３３抗原は、膵臓、結腸及び他の癌に対する特異的マーカーであり、生検組織ならびに、対象の血清及び糞便サンプルで測定することができる。さらに、ＮＥＯ−３０１抗体が、ヒト膵臓癌及び結腸癌の存在ならびに進行に関する組織バイオマーカーとして有用であり、また、たとえば子宮癌及び肺癌等の他の癌の特定しうることが免疫組織化学的実験によって示された。ＷＯ２０１１／１６３４０１もまた参照のこと。
Ａ３３抗原ポリペプチド
Ａ３３は、癌特異的抗原である。Ａ３３抗原は、小腸及び結腸上皮で発現されている細胞表面糖タンパク質である。Ａ３３抗原は、ＣＡＲ及びＪＡＭを含むイムノグロブリンスーパーファミリーのタイトジャンクション関連タンパク質と相同性を有している。Ａ３３抗原は、結腸腫瘍の９５％で発現されているが、正常な腸管または他の器官では発現されていない。Ａｃｋｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５７（７）： １０１７-１０２７； Ｇａｒｉｎｃｈｅｓａ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． ９（３）： ４６５-７１。
本発明により、Ａ３３抗原ポリペプチド上の３１．１エピトープに選択的に結合するヒト化抗体が提示される。Ａ３３抗原を含有する例示的なポリペプチドは、配列番号１０に提示される。全長Ａ３３タンパク質由来のＡ３３アミノ酸配列はさらに、Ａ３３抗原のＮＥＯ−３００抗体結合に関与する領域を含有するが（たとえば、配列番号１０、１１、１２、または１３）、本明細書で検討されるように、３１．１エピトープは、非線状であると考えられる（たとえば、立体的）。ＷＯ２０１１／１６３４０１もまた参照のこと。
Ａ３３抗原を少なくとも１つ含有するポリペプチドをコードする核酸は、標準的な分子生物学的技法を用いて修飾されても良く、それにより、限定されないが、アミノ酸配列中に欠失、付加及び置換を含みながら、Ａ３３抗原の特異的抗原性（たとえば、Ａ３３抗原は、３１．１抗体により結合される）を保持しているＡ３３抗原を少なくとも１つ含有する変異体ポリペプチドが産生される。さらに、Ａ３３抗原を少なくとも１つ含有する変異体ポリペプチドは、Ａ３３抗原の抗原性を保持していても良い（たとえば、対象に免疫化を行うことで、Ａ３３抗原に対する特異的免疫応答をそれぞれ惹起する）。Ａ３３抗原ポリペプチドは、「癌ワクチン」として有用な抗原組成物を製造するために、薬学的な担体と共に製剤化されても良い（たとえば、Ａ３３抗原に対する特異的免疫応答を惹起する医薬組成物であり、対象に免疫化を行った後、抗腫瘍抗体を産生させる）。
本明細書に記述されるＡ３３抗原ポリペプチドは、それを発現するよう改変された細胞から精製されても良い（たとえば、組換え体）。Ａ３３抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクターに挿入され、次いで、適切な宿主細胞に形質転換（またはトランスフェクト）され、及び／または、トランスジェニック動物で発現されても良い。そのように発現されたＡ３３抗原ポリペプチドを、次いで、当分野公知の方法により単離しても良い。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ［３ｒｄ Ｅｄ．］ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
本発明のポリペプチドは、たとえば、標準的な固相技術を用いることにより生化学的に合成されても良い。これらの方法としては、全固相合成、部分的固相合成法、断片濃縮、従来的な溶液合成が挙げられる。これらの方法は、好ましくは、ペプチドが比較的短い（すなわち、１０ｋＤａ）場合、及び／または、組換え法では生成できず（すなわち、核酸配列にコードされていない）、それゆえに異なる化学法を用いる場合に、使用される。固相ペプチド合成法は、当分野に公知であり、Ｓｔｅｗａｒｔ （１９８４） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ［２ｎｄ Ｅｄ．］ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ Ｂｅｎｏｉｔｏｎ （２００５） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓにより詳述される。合成ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製されても良く、及び、その組成物は、アミノ酸配列解析を介して確認されても良い。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９９２） ［２ｎｄ Ｅｄ．］ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ； Ａｇｕｉｌａｒ （２００４） ［Ｅｄ．］ ＨＰＬＣ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ； Ｓｉｍｐｓｏｎ （２００２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ［２ｎｄ Ｅｄ．］ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
本発明のポリペプチドを大量に必要な場合には、本発明のポリペプチドは、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （２００２） “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ （ＢＥＶｓ） ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ； Ｈａｔｔｉ−Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ （２００３） ［Ｅｄｓ］ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ； Ａｈｍｅｄ （２００４） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、に記述されるような組換え法を用いて生成されても良い。さらなる組換え法としては、たとえば、Ｂｉｔｔｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３： ５１６-５４４， Ｓｔｕｄｉｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５： ６０-８９， Ｂｒｉｓｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１０： ５１１-５１４， Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６： ３０７-３１１， Ｃｏｒｕｚｚｉ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３： １６７１−１６８０、及び、Ｂｒｏｇｌｉ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４： ８３８-８４３， Ｇｕｒｌｅｙ， ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６： ５５９-５６５、及び、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，４２１-４６３ページにより記述される。
ポリペプチドの単離
本発明により、Ａ３３抗原ポリペプチドの単離法もまた開示される。たとえば、関連細胞株または腫瘍サンプルを癌患者から得ても良い。合成洗剤中でホモジナイゼーション及び可溶化した後、抗原はクロマトグラフィーにより精製される。サイズ排除クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーをこれに用いても良く、及び、ＮＥＯ−３００抗体結合と併せて用いても良い。たとえば、Ａ３３抗原ポリペプチドは、固形支持体上に固定され、シンプルに抗原吸着、洗浄、及び固相支持体から溶出されても良い（たとえば、樹脂、磁性ビーズに連結される）。次いで、溶出されたタンパク質を、抗原の存在、特徴解析及び同定のためのさらなる実験に用いても良い。Ｗａｌｋｅｒ （２００２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ［２ｎｄ Ｅｄ．］ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒ （２００３） ［Ｅｄ．］ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
このように単離された抗原を、標準的な薬学的賦形剤及び担体基質を用いた医薬調製に用いても良い。たとえば、生理学的なＮａＣｌ溶液に溶解した精製抗原のｉｎ ｖｉｖｏ投与。
さらに、本発明のＡ３３抗原ポリペプチドは、ハイスループットスクリーニングの一部として、活性の特定における抗原として供されても良い。ハイスループットスクリーニング法は当分野の当業者に公知である。Ｗｅｌｌｓ （２００２） Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ。
ＮＥＯ−３００抗体は、Ａ３３抗原上の３１．１エピトープに結合する
本発明により、限定されないが、モノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体を含む、Ａ３３抗原に選択的に結合するヒト化抗体が開示される（たとえば、ＮＥＯ−３００モノクローナル抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３））。Ａ３３抗原に選択的に結合する抗体を、薬学的担体及び追加の抗体（たとえば、限定されないが、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３を含むＮＥＯ−３００モノクローナル抗体）と共に、組成物中に混合されても良い。たとえば、ＮＥＯ−３０１モノクローナル抗体は、結腸腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞に対する特異的結合を示し、結腸腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞に対する強い細胞毒性（たとえば、ＡＤＣＣ活性）を示す。Ａｒｌｅｎ， ｅｔ ａｌ． （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ３， ２０１０） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １： ２０９-２２２。例示的な抗体を、表１に示す。
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抗体は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一な軽鎖ポリペプチドを含有しても良く（軽鎖）、及び、分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一な重鎖を含有しても良い（重鎖）。Ｅｄｅｌｍａｎ （１９７１） Ａｎｎ． ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９０： ５を参照のこと。４つの鎖は、「Ｙ」の構造中でジスルフィド結合により連結され、ここで、軽鎖は、「Ｙ」構造の口で始まる重鎖をひとくくりにする。「Ｙ」構造の「枝」部分は、Ｆａｂ領域とされ；「Ｙ」構造の幹の部分は、Ｆｃ領域とされる。アミノ酸配列の方向性は、「Ｙ」構造の頂上にあるＮ末端から、各鎖の底のＣ末端へと向かう。Ｎ末端は、抗原に対する特異性を有し、それを惹起する可変領域が保有され、及び、およそ約１００アミノ酸の長さであり、抗体毎に、軽鎖及び重鎖の間に若干の変異が存在する。
可変領域は、各鎖の中で、鎖の残りの長さにわたる定常領域に連結され、抗体の特定のクラスのうちでは、抗体の特異性（すなわち、抗原惹起部分ではない）で変化することは無い。イムノグロブリン分子のクラスを決定する、定常領域のクラスは５つの主要なクラスがある（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥであり、γ、μ、α、δ及びε重鎖定常領域に相当）。定常領域またはクラスにより、引き続く抗体のエフェクター機能（補体活性化（Ｋａｂａｔ （１９７６） Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ［２ｎｄ Ｅｄ．］ ｐａｇｅｓ ４１３-４３６； Ｈｏｌｔ， Ｒｉｎｅｈａｒｔ， Ｗｉｎｓｔｏｎ）、及び、他の細胞性応答（Ａｎｄｒｅｗｓ， ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １-１８； Ｋｏｈｌ， ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４８： １８７））が決定される一方で、可変領域は、反応する抗原を決定する。軽鎖は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）のいずれかとして分類される。各重鎖のクラスは、カッパまたはラムダの軽鎖のいずれかと共に調製されうる。軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合し、２つの重鎖の「しっぽ」の部分は、ハイブリドーマまたはＢ細胞のいずれかによりイムノグロブリンが産生された際に、ジスルフィド共有結合により互いに結合される。
そのような条件下での、抗体の特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性に対し選択された抗体が必要とされうる。たとえば、ラット、マウス、またはヒト等の特定の種由来の精子塩基性タンパク質に対して生じたポリクローナル抗体を選択して、精子塩基性タンパク質と特異的に免疫応答するが、他のタンパク質とは応答しない（ただし、精子塩基性タンパク質の多型変異体及び対立遺伝子は除く）ポリクローナル抗体のみを得ることができる。この選択は、他の種由来の精子塩基性タンパク質分子と交差反応する抗体を差し引くことにより行うことができる。様々なイムノアッセイの方法を用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択しても良い。たとえば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、タンパク質と特異的に免疫応答する抗体を選択するために日常的に用いられている。たとえば、特異的免疫応答を測定するために用いることができるイムノアッセイ法及び条件に関する記述については、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ （１９９８） ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。典型的な特異性反応または選択性反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの約１０〜１００倍超である。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫化された動物の血清から得られる異種の抗体分子群である。Ａ３３抗原に選択的に結合するポリクローナル抗体は、当分野で周知の方法により作製されても良い。たとえば、Ｈｏｗａｒｄ ＆ Ｋａｓｅｒ （２００７） Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に同一な抗原に対する特異性の抗体群を含有し、その群には、実質的に類似のエピトープ結合部位が存在する。モノクローナル抗体は、当分野の当業者に公知の方法により得ても良い。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５-４９７； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，３７６，１１０； Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ［Ｅｄｓ．］ （２０１１） ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ．；及びＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ （１９９８） ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ｃｏｌｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００５） ［Ｅｄｓ．］ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹを参照のこと。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ及びそれらの任意のサブクラスを含む、任意のイムノグロブリンクラスであっても良い。本発明の抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで培養されても良い。及び、Ａ３３抗原に選択的に結合するＡ３３抗原抗体（たとえば、例示的な軽鎖は配列番号６８に記述され、重鎖は配列番号６９に記述され、及び、さらなる例示的な軽鎖は、配列番号７０、７１に記述され、及び、重鎖は配列番号７２、７３に記述される）。ＷＯ２０１１／１６３４０１もまた参照のこと。ＷＯ０２／０７４２５１、及び、ＷＯ２００６／００４９５０に記述される３１．１モノクローナル抗体は、Ａ３３抗原に対する特異性を示す。３１．１モノクローナル抗体は、結腸腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞に対する結合特異性、及び、結腸腫瘍細胞及び膵臓腫瘍細胞に対する強い細胞毒性（たとえば、ＡＤＣＣ活性）もまた示す。Ａｒｌｅｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１０年１１月３日） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １： ２０９-２２２。Ａ３３抗原に選択的に結合する例示的なヒト化ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、例示的な重鎖は、配列番号７４〜７８のアミノ酸配列に記述され、及び、軽鎖は、配列番号８４〜８７のアミノ酸配列に記述される）。
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キメラ抗体
キメラ抗体は、異なる動物由来である異なる部分を有する分子であり、たとえば、マウス抗体由来の可変領域と、ヒトイムノグロブリン定常領域を有するものが挙げられ、主に、応用の際の免疫原性を減少させるため、及び、産生量を増加させるために用いられる（たとえば、マウスモノクローナル抗体のほうが、ハイブリドーマからの産生量が高いが、免疫原性はヒトの方が高い場合には、ヒトマウスキメラモノクローナル抗体が用いられる）。キメラ抗体及びその製造方法は当分野に公知である。Ｃａｂｉｌｌｙ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３２７３-３２７７； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ６８５１-６８５５， Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６４３-６４６； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８-２７０； Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７３４９４（１９８６）；ＷＯ８６／０１５３３（１９８６）； Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １８４１８７ （１９８６）； Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ７３４９４ （１９８６）； Ｓａｈａｇａｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： １０６６-１０７４； Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ３４３９-３４４３； Ｓｕｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ２１４-２１８； Ｂｅｔｔｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １０４１-１０４３； ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ （１９９８） ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；米国特許第５，６２４，６５９号を参照のこと。例示的なキメラ抗体としては、限定されないが、Ａ３３抗原と選択的に結合するＮＥＯ−３０１（３１．１Ｃ）が挙げられる（例示的な軽鎖は配列番号６８に示され、及び、重鎖は、配列番号６９に示される）。ＷＯ２０１１／１６３４０１もまた参照のこと。
ヒト化抗体
ヒト化抗体は、よりヒトに似たイムノグロブリンドメインを含有し、動物由来抗体の相補性決定領域のみを組み込むために、操作される。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を検証し、それらをヒト抗体鎖の構造に適合させることにより行うことができる。たとえば、米国特許第６，１８７，２８７号を参照のこと。同様に、ヒト化抗体を製造する他の方法が当分野に公知である。たとえば、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号；第６，０５４，２９７号；第６，１８０，３７０号；第６，４０７，２１３号；第６，５４８，６４０号；第６，６３２，９２７号及び第６，６３９，０５５号；Ｊｏｎｅｓ， ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２-５２５； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３-３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： １５３４-３６； ａｎｄ Ｚｈｉｑｉａｎｇ Ａｎ （２００９） ［Ｅｄ．］ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃを参照のこと。例示的なヒト化抗体としては、限定されないが、Ａ３３抗原に選択的に結合するＮＥＯ−３０２（たとえば、例示的な軽鎖は、配列番号７０〜７１に示され、及び、重鎖は、配列番号７２〜７３に示される）、及び、Ａ３３抗原に選択的に結合するＮＥＯ−３０３（たとえば、例示的な軽鎖は、配列番号７８〜８３の重鎖ＣＤＲ配列を有する配列番号７４〜７７に示され、及び、重鎖は、配列番号８８〜９３の軽鎖ＣＤＲ配列を有する配列番号８４〜８に示される）が挙げられる。
抗体断片
イムノグロブリン（または、その組換え体のカウンターパート）全体に加え、エピトープ結合部位（たとえば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の断片）を含有するイムノグロブリン断片を合成しても良い。「断片」または最小イムノグロブリンは、組換えイムノグロブリン法を用いて設計されても良い。たとえば、本発明における使用のための「Ｆｖ」イムノグロブリンは、融合された可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を合成することにより製造されても良い。抗体の組み合わせもまた興味の対象であり、たとえば、二重特異性抗体は、２つの異なるＦｖ特異性を有している。イムノグロブリンの抗原結合断片としては、限定されないが、ＳＭＩＰ（小分子免疫薬品）、キャメルボディ、ナノボディ、及びＩｇＮＡＲが挙げられる。
抗イディオタイプ抗体
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と通常関連するユニークな決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗体源として同じ種及び遺伝子型（たとえばマウス株）の動物を、抗Ｉｄが調製される抗体を用いて免疫化することにより調製されても良い。免疫化された動物は、これらイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することにより、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、応答する。たとえば、米国特許第４，６９９，８８０号を参照のこと。抗Ｉｄ抗体はまた、さらに他の動物における免疫応答を誘導するための「免疫原」として用いられても良く、いわゆる、抗−抗Ｉｄ抗体が産生される。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元の抗体とエピトープ的に同一であっても良い。ゆえに、抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性を有する抗体を発現する他のクローンを特定することが可能となる。ＷＯ２０１１／１６３４０１を参照のこと。
遺伝子操作抗体及び修飾抗体
本発明の抗体はさらに、修飾抗体を遺伝子操作するために、抗体開始物質由来のＶＨ及び／またはＶＬ配列のうちの１以上を有する抗体を用いて調製されても良く、その修飾抗体は、開始抗体とは異なる特性を有しうる。抗体は、１つ、または両方の可変領域内（すなわち、ＶＨ及び／またはＶＬ）（たとえば、１以上のＣＤＲ領域内、及び／または、１以上のフレームワーク領域内）の１以上の残基を修飾することにより遺伝子操作されても良い。さらに、またはあるいは、抗体は、たとえば抗体のエフェクター機能（複数含む）を改変するために、定常領域（複数含む）内の残基を修飾することにより、遺伝子操作されても良い。
実施されうる、可変領域の遺伝子操作の１種は、ＣＤＲ移植である。抗体は、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して主に標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりもさらに個々の抗体間で多様性に富んでいる。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然型抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然型抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である。たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３-３２７； Ｊｏｎｅｓ， ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２-５２５； Ｑｕｅｅｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６： １００２９-１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号；及び第６，１８０，３７０号を参照のこと。
適切なフレームワーク配列は、公共のＤＮＡデータベースまたは公表文献（生殖細胞の抗体遺伝子配列を含む）から得ても良い。たとえば、ヒト重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子に対する生殖細胞ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞配列データベース（インターネット上で利用可能）、ならびに、Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１-３２４２； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） “Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７： ７７６-７９８；及びＣｏｘ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４： ８２７-８３６、に見出される。
他のタイプの可変領域修飾は、ＶＨ及び／もしくはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２ならびに／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより対象の抗体の１以上の結合特性（たとえば、アフィニティ）を改善させることである。部位指向性変異誘導またはＰＣＲ介在性変異誘導を実施して、変異（複数含む）を導入しても良く、対象の抗体結合に対する効果、または他の機能的特性は、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的修飾（本明細書で検討される）が導入されても良い。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であっても良いが、好ましいのは置換である。また通常、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５残基以下が改変される。
本発明の遺伝子操作された抗体としては、たとえば、抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対して変異がなされたものが挙げられる。通常、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。たとえば、１つの方法は、対応する生殖細胞配列へ、１以上のフレームワーク残基を「戻り変異」することである。さらに具体的には、体細胞変異を経ている抗体は、その抗体が誘導された生殖細胞配列とは異なるフレームワーク残基を含有している可能性がある。その抗体が誘導された生殖細胞配列と抗体フレームワーク配列を比較することにより、そのような残基を特定することができる。
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内への修飾に加え、またはその代わりに、本発明の抗体を遺伝子操作して、通常は、１以上の抗体の機能的特性（たとえば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／または抗体依存性細胞毒性等）を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含有させても良い。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾されても良く（たとえば、１以上の化学部分を抗体に付着させても良い）、または、１以上の抗体の機能的特性を再度改変するために、修飾を行い、その糖鎖付加を改変しても良い。そのような実施形態については、以下に詳述する。Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従っている。
ヒンジ領域のシステイン残基の数を変える（たとえば、増加または減少）ために、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾しても良い。たとえば、米国特許第５，６７７，４２５号を参照のこと。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、たとえば、重鎖及び軽鎖のアセンブリを促進するために、または、抗体の安定性を増加もしくは減少させるために改変しても良い。
抗体のＦｃヒンジ領域を変異させ、抗体の生物学的半減期を短縮させても良い。より具体的には、１以上のアミノ酸変異をＦｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのインターフェース領域に導入し、天然型ＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌタンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合が損なわれるようにしても良い。たとえば、米国特許第６，１６５，７４５号を参照のこと。
抗体は、その生物学的半減期を延長させるために修飾することができる。様々な方法が可能である。たとえば、以下の変異のうちの１以上を導入しても良い：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。米国特許第６，２７７，３７５号を参照のこと。あるいは、生物学的半減期を延長させるために、ＣＨ１またはＣＬ領域内を改変し、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループ由来のサルベージ受容体結合エピトープを含有させても良い。たとえば、米国特許第５，８６９，０４６号及び第６，１２１，０２２号を参照のこと。
Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能（複数含む）を変えるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することにより改変することができる。たとえば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２から選択される１以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクターリガンドに対するアフィニティは変化するが、元の抗体の抗原結合活性は保持させることができる。アフィニティが改変されるエフェクターリガンドは、たとえば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であっても良い。米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号を参照のこと。
以下の位置で１以上のアミノ酸を修飾することにより、Ｆｃ領域を修飾し、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を抗体が介在する活性を増加させても良く、及び／または、Ｆｃｙ受容体に対する抗体のアフィニティを増加させても良い：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９。ＷＯ００／４２０７２を参照のこと。さらに、Ｆｃ□ＲＩ、Ｆｃ□ＲＩＩ、Ｆｃ□ＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位は、マッピングされており、結合が改善された変異体がある。Ｓｈｉｅｌｄｓ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６： ６５９１-６６０４を参照のこと。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４及び３３９の位置での特定の変異により、Ｆｃ□ＲＩＩＩに対する結合が改善されることが示されている。さらに、以下の組み合わせの変異により、Ｆｃ□ＲＩＩＩ結合が改善されることが示されている：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、及び、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。
抗体の糖鎖付加を修飾しても良い。たとえば、非グリコシル化抗体が作製されても良い（すなわち、糖鎖付加が無い抗体）。糖鎖付加は、たとえば、抗原に対する抗体のアフィニティを増加させるために改変しても良い。そのような炭水化物修飾は、たとえば、抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位を改変することにより行うことができる。たとえば、１以上のアミノ酸置換を行って１以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を除去し、それによって、その部位の糖鎖付加が除去される。そのような非グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティを増加させることができる。たとえば、米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号を参照のこと。
さらに、またはあるいは、改変型の糖鎖付加を有する抗体を作製しても良い（たとえば、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体、または、バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体）。そのような改変グリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ活性が増加することが示されている。そのような炭水化物修飾は、たとえば、改変グリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることで行うことができる。改変グリコシル化機構を有する細胞は当分野に公知であり、本発明の抗体を発現させる宿主細胞として用いることができ、それにより、改変グリコシル化を有する抗体を産生することができる。たとえば、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、及び、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ， ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４-２２； ＥＰ １，１７６，１９５；ＷＯ２００３／０３５８３５； Ｓｈｉｅｌｄｓ， ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７： ２６７３３-２６７４０；ＷＯ９９／５４３４２； Ｕｍａｎａ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７： １７６-１８０；及び、Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ， ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４： ５５１６-２３、を参照のこと。
抗体は、たとえば、抗体の生物学的（たとえば、血清）半減期を延長させるためにペグ化されていても良い。抗体をペグ化するために、抗体、またはその抗体断片を通常、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（たとえば、ＰＥＧの反応性エステル、またはＰＥＧのアルデヒド誘導体）と、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着するような条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または反応性水溶性ポリマーアナログ）と、アシル化反応またはアルキル化反応を行うことにより、行われる。
本発明により、本明細書に記載される抗体、抗体断片、二重特異性抗体、ＳＭＩＰ、キャメルボディ、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ、ポリペプチド、可変領域、及びＣＤＲと実質的に同一な変異体及び均等物もまた開示される。これらは、たとえば、保存的置換変異（すなわち、類似のアミノ酸による１以上のアミノ酸置換）を含有しても良い。たとえば、保存的置換とは、アミノ酸を、同じ一般分類の他のアミノ酸と置換することを指す（たとえば、１つの酸性アミノ酸と、他の酸性アミノ酸。１つの塩基性アミノ酸と他の塩基性アミノ酸。または、１つの中性アミノ酸と他の中性アミノ酸）。
抗体を遺伝子操作する方法
本明細書に開示されるＶＨ及びＶＬを有する抗体を用いて、ＶＨ及び／またはＶＬ配列を修飾することにより、または、それに付加されている定常領域（複数含む）を修飾することにより、新たな変異抗体を作製することができる。ゆえに、本発明の変異抗体の構造特性を用いて、本発明の抗体の機能的特性（たとえば、Ａ３３抗原への結合等）を少なくとも１つ保持している構造関連変異抗体が作製される。たとえば、１つのＮＥＯ−３００変異抗体の１以上のＣＤＲ領域、またはその変異物を、公知のフレームワーク領域及び／または他のＣＤＲと遺伝子操作的に組み合わせ、本明細書に記載される本発明の追加の遺伝子操作されたＮＥＯ−３００抗体（たとえば、Ａ３３抗原に結合する抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３））を作製しても良い。遺伝子組換え法に対する開始物質は、本明細書に提示されるＶＨ及び／またはＶＫ配列のうちの１以上、または、そのＣＤＲ領域の１以上であっても良い。遺伝子操作された抗体を作製するために、本明細書に提示されるＶＨ及び／またはＶＫ配列のうちの１以上、または、そのＣＤＲ領域の１以上を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現する）必要性は無い。むしろ、配列（複数含む）に包含される情報を開始物質として用いて、元の配列（複数含む）から「第二世代」の配列（複数含む）を作製し、次いで、その「第二世代」の配列（複数含む）を調製し、タンパク質として発現させる。標準的な分子生物学的技法を用いて、改変抗体配列を調製及び発現しても良い。
改変抗体配列（複数含む）によりコードされた抗体は、本方法により産生され、本明細書に提示される配列を有するＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）の機能的特性のうちの１つ、一部、または全てを保持していても良く、その機能的特性としては、特定のＫＤレベル以下でＡ３３変異型抗原に結合すること、及び／または、免疫細胞活性を調節すること、及び／または、所望される標的細胞（たとえば、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、及び肝臓癌等）に選択的に結合すること、が挙げられる。改変抗体の機能的特性は、当分野で利用可能な標準的なアッセイ、及び／または、本明細書に提示される標準的なアッセイを用いて評価されても良い。
変異をランダムに、または選択的に、ＮＥＯ−３００抗体コード配列全体に沿って、または部分的に導入しても良く、ならびに、得られた修飾ＮＥＯ−３００抗体またはＮＥＯ−３００抗体を、結合活性及び／または他の所望される機能的特性に関しスクリーニングしても良い。ＷＯ２００２／０９２７８０及びＷＯ２００３／０７４６７９を参照のこと。
動物を用いたＮＥＯ−３００抗体の作製
Ａ３３抗原に選択的に結合する本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０２及びＮＥＯ−３０３）であっても良い。Ａ３３抗原指向性のそのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスのシステムよりもヒトの免疫システムの一部を有する、トランスジェニックマウス、またはトランスクロモゾミックマウスを用いて作製することができる。これらトランスジェニックマウス、またはトランスクロモゾミックマウスとしては、本明細書において、ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）及びＫＭ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）としてそれぞれ呼称されるマウスが挙げられ、及び、本明細書において、「ヒトＩｇマウス」と集合的に呼称される。ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ．Ｉｎｃ．）は、非再配列ヒト重鎖（□及び□）ならびにヒト□軽鎖イムノグロブリン配列を、内因性□及び□□鎖遺伝子座を不活化する標的化変異と共にコードするヒトイムノグロブリン遺伝子小遺伝子座を含有する。たとえば、Ｌｏｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）： ８５６-８５９を参照のこと。従って、マウスは、マウスＩｇＭまたは□の発現が減少し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及びヒト軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を経て、高いアフィニティのヒトＩｇＧ□モノクローナルを産生する。Ｌｏｎｂｅｒｇ （１９９４） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３： ４９-１０１； Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ （１９９５） Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３： ６５-９３、及び、Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ （１９９５） Ａｎｎ． ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７６４： ５３６-５４６。ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）の調製及び使用、ならびに、そのマウスにより担持される遺伝子修飾については、Ｔａｙｌｏｒ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０： ６２８７-６２９５； Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５： ６４７-６５６； Ｔｕａｉｌｌｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ３７２０-３７２４； Ｃｈｏｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４： １１７-１２３； Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． １２： ８２１-８３０； Ｔｕａｉｌｌｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： ２９１２-２９２０； Ｔａｙｌｏｒ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６： ５７９-５９１；及び、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ８４５-８５１に詳述される。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第５，８７７，３９７号；第５，６６１，０１６号；第５，８１４，３１８号；第５，８７４，２９９号；第５，７７０，４２９号；及び第５，５４５，８０７号；ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９７／１３８５２；ＷＯ９８／２４８８４；ＷＯ９９／４５９６２；及び、ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと。
本発明のヒトＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）は、導入遺伝子及び導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）上にヒトイムノグロブリン配列を担持するマウス（たとえば、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を担持するマウス）を用いて惹起されても良い。本明細書において、そのようなマウスは「ＫＭ ｍｉｃｅ（登録商標）」と呼称され、ＷＯ０２／４３４７８に詳述されている。
さらに、ヒトイムノグロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物システムが当分野で利用可能であり、本発明のＮＥＯ−３００抗体を惹起するために用いることができる。たとえば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ （Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．）と呼称される別の遺伝子導入システムを用いても良い；そのようなマウスは、たとえば、米国特許第５，９３９，５９８号；第６，０７５，１８１号；第６，１１４，５９８号；第６，１５０，５８４号及び第６，１６２，９６３号に記述されている。
さらに、ヒトイムノグロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモゾミック動物システムが当分野で利用可能であり、本発明のＮＥＯ−３００抗体を惹起するために用いることができる。たとえば、ヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体の両方を担持するマウス（「ＴＣマウス」と呼称される）を用いても良い。Ｔｏｍｉｚｕｋａ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ７２２-７２７を参照のこと。さらに、ヒト重鎖及び軽鎖の導入染色体を担持するウシが当分野で報告されており（Ｋｕｒｏｉｗａ， ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０： ８８９-８９４）、本発明のＮＥＯ−３００抗体の惹起にこれを用いても良い。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒトイムノグロブリン遺伝子ライブラリのスクリーニングのために、ファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。そのようなヒト抗体単離のためのファージディスプレイ法は当分野で確立されている。たとえば、米国特許第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５８０，７１７号；第５，９６９，１０８号；第６，１７２，１９７号；第５，８８５，７９３号；第６，５２１，４０４号；第６，５４４，７３１号；第６，５５５，３１３号；第６，５８２，９１５号；及び第６，５９３，０８１号を参照のこと。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫化でヒト抗体応答が誘導されるよう、ヒト免疫細胞を再構成させたＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。たとえば、米国特許第５，４７６，９９６号及び第５，６９８，７６７号を参照のこと。
本発明のヒト抗体を惹起させるためにヒトＩｇマウスが用いられる場合、そのマウスは、精製された、または富化されたＡ３３抗原ポリペプチド調製物を用いて免疫化されても良い（Ｌｏｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）： ８５６-８５９； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ８４５-８５１；ＷＯ９８／２４８８４及びＷＯ０１／１４４２４に記述される）。好ましくは、マウスは、最初の注射時、６〜１６週齢である。たとえば、Ａ３３抗原の精製または組換え調製物（５〜５０□ｇ）を用いて、ヒトＩｇマウスを腹腔内注射で免疫化しても良い。
様々な抗原による前免疫については、腹腔内注射で完全フロイントアジュバントに溶解した抗原を用いて最初に免疫化し、次いで、１週おきで（総数で６まで）、不完全フロイントアジュバントに溶解した抗原を用いてＩＰで免疫化した場合に、トランスジェニックマウスは応答することが示されている。しかしながら、フロイント以外のアジュバントもまた有効であることが判明している。さらに、アジュバント無しの全細胞も、高い免疫原性があることが判明している。免疫応答は、眼窩後血液により得られた血漿サンプルを用いた一連の免疫化プロトコールの間モニターされても良い。血漿は、ＥＬＩＳＡ（以下に記述される）によりスクリーニングされても良く、及び、十分な力価のＮＥＯ−３００ヒトイムノグロブリンを有するマウスを融合に用いても良い。マウスは、殺処分され、脾臓が採取される３日前に抗原を用いて静脈内注射でブーストされても良い。各免疫化に対し、２〜３回注射を行うことが必要となることが予測される。通常、６〜２４匹のマウスが、各抗原に対して免疫化される。ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２系統の両方が、通常用いられる。さらに、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２導入遺伝子の両方が、２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する一匹のマウスへと共に導入されても良い。あるいは、またはさらに、ＫＭ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）系統を用いても良い。
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化マウス由来の脾臓細胞及び／またはリンパ節細胞を単離し、適切な不死化細胞株（たとえば、マウスミエローマ細胞株）と融合しても良い。得られたハイブリドーマは、抗原特異的抗体の産生に対し、スクリーニングされても良い。たとえば、免疫化マウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、６分の１の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）に、５０％ＰＥＧとともに融合しても良い。細胞を、平底マイクロタイタープレートに、およそ２Ｘ１０−５で播種し、次いで、選択培地（２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１Ｘ ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは、融合の２４時間後に添加される）を含有）中で２週間インキュベーションしても良い。およそ２週後、ＨＡＴがＨＴで置き換えられた培地中で細胞を培養しても良い。次いで、個々のウェルをＥＬＩＳＡによりヒトモノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体に対してスクリーニングしても良い。広範なハイブリドーマの増殖が発生した時点で、培地は通常、１０〜１４日後でありうる。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再度スクリーニングを行い、及び、もしヒトＩｇＧが陽性であれば、限界希釈により少なくとも２度、モノクローナル抗体をサブクローニングしても良い。次いで、安定したサブクローンをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、特徴解析のための組織培養培地中で少量の抗体を産生させても良い。
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のための２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させても良い。上清をろ過し、プロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）を用いたアフィニティクロマトグラフィーを行う前に濃縮しても良い。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動によりチェックし、純度を高めるために高速液体クロマトグラフィーを行っても良い。緩衝溶液をＰＢＳへと交換しても良く、及び、濃度は、１．４３の減衰係数を用いてＯＤ２８０により測定しても良い。モノクローナル抗体を分注し、−８０℃で保存しても良い。
ＮＥＯ−３００抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明により、本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体をコードするヌクレオチドもまた開示される。本発明はまた、異なるコドン使用頻度で、変異が特徴の改変配列（たとえば、天然型または人工導入のいずれか、ランダムまたは標的化した様式のいずれかで、１以上のヌクレオチドが欠失、挿入、または置換されている）、類似ポリペプチドをコードするＮＥＯ−３００抗体配列を少なくとも１つ含有するポリヌクレオチドを開示する。また本発明には、本発明のポリヌクレオチドに特有の配列領域を含有する、相同の核酸配列（たとえば、本発明のポリヌクレオチド配列の一部を形成する）が包含される。
本発明はまた、抗体及びその断片を作製する方法を開示する。抗体を製造する方法は当分野の当業者に公知である。たとえば、キメラ抗体を製造する方法は、当分野に公知である。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１： ８６５１-５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８-２７０； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ， ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６４３-４６、を参照のこと。
たとえば、抗体または抗原結合断片は、遺伝子操作により製造されても良い。この技法において、他の方法と同様、抗体産生細胞は、所望の抗原または免疫原に対し感作されている。抗体産生細胞から単離されたメッセンジャーＲＮＡは、ＰＣＲ増幅を用いたｃＤＮＡの作製のための鋳型として用いられる。ベクターのライブラリ（各々、当初の抗原特異性を保持した１つの重鎖遺伝子及び１つの軽鎖遺伝子を含有する）は、増幅イムノグロブリンｃＤＮＡの適切な断片を発現ベクターへと挿入することにより作製される。コンビナトリアルライブラリは、重鎖遺伝子ライブラリと軽鎖遺伝子ライブラリを組み合わせることにより構築される。これにより、重鎖と軽鎖が共発現されるクローンのライブラリがもたらされる（Ｆａｂ断片または抗体分子の抗原結合断片を模倣する）。これら遺伝子を担持するベクターを、宿主細胞へ共トランスフェクトする。抗体遺伝子合成がトランスフェクト宿主に導入された際、重鎖及び軽鎖のタンパク質が自己アセンブリして、抗原または免疫原を用いたスクリーニングにより検出されうる活性抗体を産生する。
本発明の他の態様は、Ａ３３抗原に結合する本発明の抗体をコードする核酸分子に関連する。核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しても良い。核酸は、標準的な技法（アルカリ／ＳＤＳ処置、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当分野公知の他の方法）を用いて、他の細胞成分または他の混入物（たとえば、他の細胞性核酸またはタンパク質）から精製することにより単離されても良い。Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃを参照のこと。本発明の核酸は、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡであっても良く、及び、イントロン配列を含有してもしなくても良い。核酸は、ｃＤＮＡ分子であっても良い。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技法を用いて得ても良い。ハイブリドーマ（たとえば、以下に詳述されるヒトイムノグロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）により発現された抗体に対しては、ハイブリドーマにより作製された抗体の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲ増幅法またはｃＤＮＡクローニング法により得ても良い。イムノグロブリン遺伝子ライブラリから得た抗体（たとえば、ファージディスプレイ法を用いた）に対しては、抗体をコードする核酸は、ライブラリから採取しても良い。
具体的には、たとえば、１つ以上の選択されたコドンの３番目の位置が、混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することにより、縮重コドン置換を行うことができる。Ｂａｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９： ５０８１； Ｏｈｔｓｕｋａ， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０： ２６０５-０８； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８： ９１-９８。
ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られた時点で、これらＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技法によりさらに操作しても良い（たとえば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｎ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子へと転換する）。これら操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、他のタンパク質（たとえば、抗体定常領域または柔軟性のあるリンカー等）をコードする他のＤＮＡ断片へと操作可能に連結されている。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に連結することにより、全長重鎖遺伝子へと転換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野に公知であり（たとえば、Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１-３２４２を参照のこと）、及び、これら領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅法により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ4、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域であっても良いが、しかし、最も好ましいのはＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に対しては、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子へと操作可能に連結しても良い。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に、ＶＬをコードするＤＮＡを操作可能に連結することにより、全長軽鎖遺伝子へと（ならびに、Ｆａｂ軽鎖遺伝子として）転換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野に公知であり（たとえば、Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１-３２４２を参照のこと）、及び、これら領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅法により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダの定常領域であっても良いが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬコードＤＮＡ断片を、たとえばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３等の柔軟なリンカーをコードする他の断片へと操作可能に連結し、ＶＨ及びＶＬ配列が、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーにより連結された状態で、連続した一本鎖タンパク質として発現されるようにしても良い。たとえば、Ｂｉｒｄ， ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３-４２６； Ｈｕｓｔｏｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９-５８８３； ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８： ５５２-５５４を参照のこと。
本発明はまた、ＮＥＯ−３００抗体のポリペプチドのホモログをコードする核酸を包含し、そのホモログは、本明細書に記述されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の相同性であっても良い（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアをデフォルトのパラメータを用いて測定）。本発明にはまた、上述のポリヌクレオチドの断片及び、たとえば天然型または人工誘導のいずれか、ランダムまたは標的化された様式のいずれかで、１以上の核酸が欠失、挿入または置換された等の変異を有するポリペプチドが包含される。
核酸分子は、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）、または、前記核酸分子の機能性断片をコードしても良い。前記核酸の「機能性断片」とは、前記ＮＥＯ−３００抗体をコードする遺伝子またはｃＤＮＡの断片が挙げられ、それら断片は、発現され、Ａ３３抗原に結合することができるＮＥＯ−３００抗体を産生することができる。ゆえに、たとえば、本発明に従うＮＥＯ−３００抗体の断片は、Ａ３３抗原に対する結合に寄与するアミノ酸残基に相当する。本発明の本体用にはまた、別々にスプライスされたアイソフォーム、及び、本発明に従う核酸の転写開始物が含まれる。本発明に従う核酸分子にはまた、本発明に従うＮＥＯ−３００抗体をコードする上述の核酸分子の断片、誘導体及び対立遺伝子多形が包含される。ＮＥＯ−３００抗体の断片をコードする核酸を作製するための方法及び材料は当分野に公知である。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ［３ｒｄ Ｅｄ．］ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
本発明の抗体及びその断片はまた、当分野の当業者に公知の標準的な技術を用いて、抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列及びオペロンを含有する発現ベクターを構築することにより、産生されても良く、抗体特異性に必要なＣＤＲをコードするＤＮＡ配列が、非ヒト細胞源由来である一方、抗体鎖の残りの部分をコードするＤＮＡ配列は、ヒト細胞源由来である。さらに、本発明は、上述の本発明の核酸分子を含有するベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、及び、遺伝子操作法で普遍的な他のベクターに関する。ベクターに含有される核酸分子は、真核細胞及び原核細胞における転写を確実とする制御因子に連結されていても良い。
さらに、同一性とは、関係する核酸分子の間、またはそれらにコードされるタンパク質の間に存在する機能的及び／または構造的な同等性を広く指すものである。上述の分子と相同であり、及びこれら分子の誘導体を構成する核酸分子は、通常、修飾体を構成し、同じ生物学的機能を遂行する、これら分子の変異体である。同時に、変異体が自然発生する（たとえば、他種由来の配列に存在しうる）、または、それらが変異体であり、ここで、これら変異体は、自然法則に従い発生、または実在の突然変異により導入されている。変異体はまた、合成製造された配列であっても良い。対立遺伝子変異体は、天然型変異体及び、合成製造された変異体または組換えＤＮＡ技術により製造された変異体の両方であっても良い。遺伝子コードの縮重に起因し、本発明に従う核酸分子から逸脱した核酸分子は、誘導体の特殊形態を構成する。
本発明の範囲には、ＮＥＯ−３００抗体自身のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列が含まれる。遺伝子コードは縮重されているため、２以上のコドンを用いて、特定のアミノ酸をコードしても良い。遺伝子コードを用いて１以上の異なるヌクレオチドが特定されても良い（それら各々は、アミノ酸をコードすることができる）。事実、特定のヌクレオチドが、配列をコードする実際のコドンを構成する確率は、異常な塩基対の関係性及び、Ａ３３抗原を発現する真核細胞または原核細胞において特定のコドンが（特定のアミノ酸をコードするために）実際に用いられた頻度を考慮することにより推測される。そのような「コドン使用ルール」は、Ｌａｔｈｅ， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １８３： １-１２に開示されている。
本発明のＮＥＯ−３００抗体またはその断片もしくは変異体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）の単離及び発現は、本明細書に開示されているＮＥＯ−３００抗体の核酸配列に基づき構築されたプローブとプライマーを用いて、確立されているクローニング手順を行うことにより、行うことができる。また、関連ＮＥＯ−３００抗体の配列は、本明細書に開示される配列、及び、公知のコンピューターベースの探索技術（たとえば、ＢＬＡＳＴ配列解析）を用いて、ヒトまたは他種のゲノムデータベースから特定することができる。本明細書に開示される偽遺伝子を用いて、機能的対立遺伝子または関連遺伝子を特定しても良い。
次いで、これら配列の機能的発現のために、発現ベクターを用いて宿主細胞に感染またはトランスフェクトしても良い。これら遺伝子及びベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで作製及び発現されても良い。当業者であれば、本発明のベクター内の遺伝子及び核酸の発現または活性を調節する（たとえば、プロモーター、エンハンサー）ことにより、改変が所望される表現型及び核酸発現の制御が行うことができることを認識している。発現もしくは活性を増加または減少させるための任意の公知の方法を用いることができる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列は、たとえば酵素合成または固相合成等の当分野公知の任意のオリゴヌクレオチド合成法により作製されても良い。固相合成を行うための機器及び試薬は、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。そのような合成のための任意の他の手段を用いても良く；ポリヌクレオチドの実際の合成は、当業者の実施可能な範囲内にある。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ［３ｒｄ Ｅｄ．］ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｓｗａｍｙ （２００８） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒａｓｔｏｇｉ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ （２００５） ［Ｅｄ．］ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ： Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌｕｍｅ ２８８ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；及び、Ｒａｐｌｅｙ （２０００） ［Ｅｄ．］ Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。次いで、相補鎖を合成し、適切な条件下でそれら鎖を共にアニーリングすること、または、適切なプライマー配列とＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を添加すること、のいずれかにより、二本鎖ＤＮＡ断片を得ても良い。
配列中に変異を導入するため、サブクローニングを行うため、プローブを標識するため、配列解析を行うため、ハイブリダイゼーションを行うために、核酸を操作するための技術は、たとえば、科学文献及び特許文献に記述されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （２００１） （Ｅｄｓ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） ［Ｅｄ．］ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ＮＹを参照のこと。
ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強さ（たとえば、ポリヌクレオチド間の結合の強さ）は、ポリヌクレオチド間の相補性の程度、及び、関与する条件のストリンジェンシー（塩濃度、他の成分の存在（たとえば、ポリエチレングリコールの存在の有無）、ハイブリダイズする鎖のモル濃度、及びポリヌクレオチド鎖のＧ＋Ｃ含有量、等の条件により影響を受ける）を含む、当分野公知の多くの因子により影響を受け、それら全てにより、形成されたハイブリッドの特徴的な溶解温度（Ｔｍ）がもたらされる。核酸ハイブリダイゼーションの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （２００１） （Ｅｄｓ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ［３ｒｄ Ｅｄ．］ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、及びＨａｙｒｎｅｓ， ｅｔ ａｌ． （１９８５） ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ＤＣ）、に開示されている。ハイブリダイゼーションの洗浄条件としては、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄溶液及び室温で１０分間、回転させながらのインキュベーション（低ストリンジェンシー洗浄）、前もって温められた（４２℃）０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄溶液及び４２℃で１５分間、回転させながらのインキュベーション（中程度のストリンジェンシー洗浄）、及び、前もって温められた（６８℃）０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄溶液及び６８℃で１５分間、回転させながらのインキュベーション（高ストリンジェンシー洗浄）が挙げられる。Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） ［Ｅｄ．］ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃを参照のこと。
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）をコードする核酸を増幅させても良い。本明細書に開示される核酸は、増幅技術を用いてクローン化及び定量測定されても良い。また、増幅技術は当分野に公知であり、たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ （１９９０） ［Ｅｄ．］ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．； Ｉｎｎｉｓ （１９９５） ［Ｅｄ．］ ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ．）；リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ （１９８９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４： ５６０； Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： １０７７； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ （１９９０） Ｇｅｎｅ ８９： １１７）；転写増幅（Ｋｗｏｈ （１９８９） ＰＮＡＳ ８６： １１７３）；自己配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ （１９９０） ＰＮＡＳ ８７： １８７４）； Ｑ Ｂｅｔａ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｓｍｉｔｈ （１９９７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５： １４７７−９１））；自動化Ｑベータレプリカーゼ増幅アッセイ（Ｂｕｒｇ （１９９６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ １０： ２５７−７１）；及び他のＲＮＡポリメラーゼ介在法（たとえば、ＮＡＳＢＡ， Ｃａｎｇｅｎｅ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ）が挙げられる。また、Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２： ３０７-１６； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （２００１） （Ｅｄｓ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） ［Ｅｄ．］ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ［３ｒｄ Ｅｄ．］ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号； Ｓｏｏｋｎａｎａｎ （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３： ５６３-６４を参照のこと。
縮重プライマー対を設計するパラダイムは当分野に公知である。たとえば、ＣＯｎｓｅｎｓｕｓ−ＤＥｇｅｎｅｒａｔｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ （ＣＯＤＥＨＯＰ）戦略コンピュータープログラムは、容易にアクセス可能であり、たとえば本明細書に提示されるＮＥＯ−３００抗体配列等の関連タンパク質配列のセットで開始するハイブリッドプライマー予測のためのＢｌｏｃｋＭａｋｅｒマルチプル配列アライメントサイトから直接リンクされている。たとえば、Ｒｏｓｅ （１９９８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６： １６２８-３５； Ｓｉｎｇｈ （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４： ３１８-１９を参照のこと。
本明細書に開示されるＮＥＯ−３００抗体と実質的に同一である、多型変異体、対立遺伝子及び種間ホモログは、本明細書に記述される核酸プローブを用いて単離することができる。あるいは、発現ライブラリを用いて、Ａ３３抗原ポリペプチドに対し作製された精製抗体または抗血清（Ａ３３抗原ホモログに対しても認識及び選択結合する）を用いて、発現ホモログを免疫学的に検出することにより、ＮＥＯ−３００抗体、ならびにその多型変異体、対立遺伝子及び種間ホモログのポリペプチドをクローニングしても良い。
ＮＥＯ−３００抗体をコードする核酸は、適切な（完全または縮重）プライマー対を用いて、適切な核酸配列を増幅する（たとえば、ＰＣＲ）ことにより作製されても良い。増幅された核酸は、任意の細胞もしくは組織またはＮＥＯ−３００抗体発現細胞由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡであっても良い。宿主細胞中で異種配列を発現する方法は当分野に公知である。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ［３ｒｄ Ｅｄ．］ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
ＮＥＯ−３００抗体を含有する融合タンパク質
転座配列と融合された本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体をコードする核酸を含有するハイブリッドタンパク質コード配列が構築されても良い。これら核酸配列は、転写制御因子または翻訳制御因子（たとえば、転写開始配列及び翻訳開始配列、プロモーター及びエンハンサー、転写ターミネーター、翻訳ターミネーター、ポリアデニル化配列、ならびに、ＤＮＡのＲＮＡへの転写に有用な他の配列）に操作可能に連結されていても良い。組換え発現カセット、ベクター、及び導入遺伝子の構築において、プロモーター断片を用いて、全ての所望される細胞または組織中で、所望される核酸を直接発現させても良い。
融合タンパク質は、Ｃ末端またはＮ末端の転座配列を含有しても良い。さらに、融合タンパク質は、追加の因子（たとえば、タンパク質検出、精製、または他の適用のための）を含有しても良い。検出補助ドメイン及び精製補助ドメインとしては、たとえば、金属キレートペプチド（たとえば、ポリヒスチジン管、ヒスチジン−トリプトファンモジュール、または、固定金属上での精製を可能とする他のドメイン）；マルトース結合タンパク質、固定イムノグロブリン上での精製を可能とするプロテインＡドメイン；または、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ．）で使用されるドメインが挙げられる。
たとえば第Ｘａ因子（たとえば、Ｏｔｔａｖｉ， （１９９８） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８０： ２８９-９３を参照のこと）、サブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ（たとえば、Ｐｏｌｙａｋ （１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １０： ６１５-１９を参照のこと）；エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）等の、転座ドメイン（効率的な細胞膜発現のため）と、他の新たに翻訳されたポリペプチドの間の開裂可能なリンカー配列の含有は、精製補助に有用である。たとえば、ある構築物は、６つのヒスチジン残基と、それに続くチオレドキシン、エンテロキナーゼ開裂部位（たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４： １７８７-９７を参照のこと）、及びＣ末端転座ドメインに連結された核酸配列をコードするポリペプチドを含有しても良い。ヒスチジン残基により、検出及び精製が促進され、一方で、エンテロキナーゼ開裂部位により、融合タンパク質の残りの部分から所望のタンパク質を精製するための手段がもたらされる。融合タンパク質をコードするベクターに関する技術及び融合タンパク質の応用は、科学文献及び特許文献に記述されている。たとえば、Ｋｒｏｌｌ （１９９３） ＤＮＡ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２： ４４１-５３を参照のこと。
ＮＥＯ−３００抗体の組換え発現のためのシステム
ベクターには、標的宿主細胞内で外来性タンパク質を発現させるための操作を容易にする因子が含有されている。形質転換のための配列操作及びＤＮＡ産生は、最初に、細菌宿主（たとえば、大腸菌）で簡便に行われ、及び、通常、ベクターは、そのような操作を容易にするための配列（細菌の複製起点及び適切な細菌選択マーカー）を含有している。選択マーカーは、選択培養培地中で増殖した形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存することができない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素に対する抵抗性を寄与するタンパク質、栄養欠乏を補うタンパク質、または、複合培地からは得ることができない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。酵母の形質転換に対する例示的なベクター及び方法は、当分野に公知である。たとえば、Ｂｕｒｋｅ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
対象の配列をコードするポリペプチドは、酵母細胞中でポリペプチドの発現をもたらす転写制御配列及び翻訳制御配列に操作可能に連結されていても良い。これらベクターの構成要素としては、限定されないが、以下のうちの１以上が挙げられる：エンハンサー因子、プロモーター、及び転写終末配列。ポリペプチド分泌のための配列もまた、含有されても良い（たとえば、シグナル配列）。
リガンド結合領域コード配列を含有する発現ベクター（個々の発現ベクターとして、または発現ベクターのライブラリとして、のいずれか）が、細胞のゲノムに導入されても良く、または細胞の細胞質もしくは核に導入されても良く、及び、科学文献及び特許文献に記載されているような様々な標準方法により発現されても良い。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （２００１） ［Ｅｄｓ．］ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） ［Ｅｄ．］ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃを参照のこと。
核酸は、細胞中で安定して発現される、または一過性に発現される発現カセット、ベクター、またはウイルス中で発現されても良い（たとえば、エピソーム発現システム）。選択マーカーが発現カセット及びベクターに組み込まれ、形質転換細胞及び配列上で選択可能な表現型がもたらされても良い。たとえば、選択マーカーは、エピソーム維持及び複製のためにコードすることができ、宿主ゲノムへの組み込みは必要ない。たとえば、マーカーは、抗生物質抵抗性（たとえば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン）または除草剤抵抗性（たとえば、クロロスルフロンまたはＢａｓｔａ）をコードしても良く、それにより、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を選択することができる。たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） ［Ｅｄ．］ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．；及びＷａｌｋｅｒ ＆ Ｐａｐｌｅｙ （２００９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ［５ｔｈ Ｅｄ．］ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照のこと。ネオマイシンまたはハイグロマイシンの様な基質に対する抵抗性を付与する選択マーカー遺伝子は組織培養においてのみ使用することができるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで選択可能なマーカーとして化学抵抗性遺伝子もまた使用される。
本発明のポリヌクレオチドを細胞で発現させるために、本発明に従う核酸構築物（上述の核酸配列のうちの１つの少なくともコード領域を含有し、及びさらに、ｃｉｓ活性制御因子を少なくとも１つ含有する）を用いても良い。好ましくは、本発明の核酸構築物により使用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞群で活性を有するものである。プロモーターは、それらが操作可能に連結されている特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する、構造遺伝子（通常、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンに対し上流（５’）に位置する非翻訳配列である。そのようなプロモーターはいくつかに分類される：誘導性、構造性、及び抑圧性プロモーター（たとえば、リプレッサーの非存在に反応し、転写レベルを増加させる）。誘導性プロモーターは、培養条件における何らかの変化に反応し、その制御下にあるＤＮＡからの転写レベルを増加させることができる（たとえば、温度の変化または栄養素の有無）。例示的な細胞型特異的及び／または組織特異的プロモーターは当分野に公知である。Ｂｅｒｎａｒｄｉ （２００３） ［Ｅｄ．］ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｖｏｌｕｍｅ ３８ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．Ｖを参照のこと。本発明の核酸構築物はさらに、エンハンサーを含有することができ、それらは、プロモーター配列と隣接、または離れていても良く、及び、それらからの転写を上方制御する機能があっても良い。
第二の発現ベクターは、当業者に公知の同じ標準的な手段を用いて製造されても良く、前記発現ベクターは、抗体特異性に必要なＣＤＲをコードするＤＮＡ配列は非ヒト細胞源由来（好ましくは、ウサギＢ細胞源）であり、抗体鎖の残りの部分をコードするＤＮＡ配列はヒト細胞源由来である、抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列及びオペロンを含有する。
本発明の核酸構築物はさらに、適切な選択マーカー及び／または複製起点を含有しても良い。好ましくは、使用される核酸構築物は、シャトルベクターであり、大腸菌（ここで、当該構築物は適切な選択マーカーと複製起点を含有している）の両方で増殖することができ、細胞での増殖に適合性があり、または、選択された遺伝子及び組織の組み込みに適合性がある。本発明に従う構築物は、たとえば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス、または人工染色体であっても良い。
適切な構築物の例としては、限定されないが、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ＰｚｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏが挙げられ、それらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ． （Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ．）から市販されている。レトロウイルスベクターとパッケージングシステムの例としては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）に販売されているものがあり、Ｒｅｔｒｏ−ＸベクターｐＬＮＣＸ及びｐＬＸＳＮが挙げられ、それらにより、複数のクローニング部位へのクローニングが可能となり、導入遺伝子はＣＭＶプロモーターから転写される。たとえばｐＢａｂｅ等のＭｏ−ＭｕＬＶ由来のベクターもまた、挙げられ、導入遺伝子は５’ＬＴＲプロモーターから転写される。
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形態で、本発明の核酸を含有しており、つまり、組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１以上の制御配列（発現される核酸配列に操作可能に連結されている）を含有している。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結された」とは、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とさせる様式で（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおいて、または、ベクターが宿主細胞に導入された場合には宿主細胞において）、制御配列（複数含む）に連結されていることを意味することが意図される。
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御因子（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡに記述されている。制御配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構造発現を指示するもの、及び、ある宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（たとえば、組織特異的制御配列）が挙げられる。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルといった因子に依存することを認識しているであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記述される核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドが産生されることができる。
本発明の組換え発現ベクターは、真核細胞及び原核細胞で変異体タンパク質を産生するよう設計されていても良い。たとえば、本発明のタンパク質は、たとえば大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞（たとえば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞、または哺乳類細胞中で発現されても良い。適切な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡにさらに検討されている。あるいは、組換え発現ベクターは、たとえば、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼ等を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳されても良い。
原核生物でのタンパク質発現は多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構造性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを有する大腸菌で行われる。融合ベクターは、その中にコードされているタンパク質に多くのアミノ酸を、その組換えタンパク質のアミノ末端またはＣ末端に付加する。そのような融合ベクターは通常、３つの目的に対し役立つものである：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させる；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させる；及び、（ｉｉｉ）アフィニティ精製においてリガンドとして働き、組換えタンパク質の精製を補助する。多くの場合、融合発現ベクターには、融合部分と組換えタンパク質のジャンクションにタンパク質分解性の開裂部位が導入されており、それにより融合タンパク質の精製の後で、融合部分から組換えタンパク質を分離させることが可能となる。そのような酵素、及び同系列の認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビン、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ＴＥＶ及びエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ （１９８８） Ｇｅｎｅ ６７： ３１-４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ．）、及び、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、それぞれ、標的組換えタンパク質に対し、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、または、プロテインＡを融合する。
組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において、核酸の発現を指示することができるものでも良い（たとえば、組織特異的制御因子を用いて、核酸を発現させる）。組織特異的制御因子は当分野に公知である。効率的なタンパク質産生のために、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、所望される宿主の発現に最適化された発現制御配列の制御下に置かれることが好ましい。たとえば、配列は、最適化された転写制御配列、及び／または、翻訳制御配列を含有しても良い（たとえば、改変Ｋｏｚａｋ配列）。
大腸菌における組換えタンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解により開裂する能力を損なった宿主細菌中でタンパク質を発現することである。たとえば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ． １８５： １１９-１２８を参照のこと。他の戦略は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変し、各アミノ酸に対する個々のコドンを、大腸菌で優先的に用いられるようにすることである。たとえば、Ｗａｄａ， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０： ２１１１-２１１８を参照のこと。本発明の核酸配列のそのような改変は、標準的なＤＮＡ合成法により行うことができる。コドンバイアスを解決するための他の戦略としては、ＢＬ２１−ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲｏｓｅｔｔａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いることであり、これらの株には、稀な大腸菌ｔＲＮＡ遺伝子の追加コピーが含有されている。
本発明のタンパク質をコードする発現ベクターは、酵母発現ベクターであっても良い。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６： ２２９-２３４）， ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ （１９８２） Ｃｅｌｌ ３０： ９３３-９４３）、ｐＪＲＹ８８ （Ｓｃｈｕｌｔｚ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅ ５４： １１３-１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）、及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）が挙げられる。
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であっても良い。たとえば、本発明のタンパク質は、たとえば大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞、酵母、植物または哺乳類細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞等）で産生されても良い。他の適切な宿主細胞も当業者に公知である。
本発明のポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞中で産生されても良い。培養昆虫細胞（たとえば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３： ２１５６-２１６５）、及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ （１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０： ３１-３９）が挙げられる。さらに他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類細胞中で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２９： ８４０）及び、ｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６： １８７-１９５）、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＵＢ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。哺乳類細胞で用いた場合、発現ベクターの制御機能は多くの場合、ウイルス性制御因子によりもたらされる。たとえば、普遍的に用いられているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ、シミアンウイルス４０由来のものである。原核細胞及び真核細胞の両方に適した他の発現システムとしては、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （２００１） （Ｅｄｓ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。
発現ベクターは、トランスフェクトされた宿主細胞を産生させるために当分野で公知の標準的な技術により宿主細胞へとトランスフェクトされ、前記トランスフェクトされた宿主細胞は、前記抗体ポリペプチドを産生させるための当業者に公知の標準的な技術により培養される。
宿主細胞は、上述の２つの発現ベクター（第一の発現ベクターは、オペロン及び軽鎖由来ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有し、及び、第二のベクターは、オペロン及び重鎖由来ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する）を用いて共トランスフェクトされても良い。２つのベクターは、異なる選択マーカーを含有するが、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの発現は実質的に等量となることが好ましい。あるいは、単一のベクターを用いても良く、当該ベクターは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードするＤＮＡを含有する。重鎖及び軽鎖に対するコード配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または両方を含有しても良い。
ベクターが構築されうる一般的な方法、宿主細胞を産生するために必要とされるトランスフェクト法、ならびに、前記宿主細胞から抗体及びその断片を産生するために必要とされる培養方法は全て、標準的な技術である。好ましくは、抗体を産生するために用いられる細胞株は哺乳類細胞株であるが、たとえば大腸菌由来細菌株、または酵母細胞株等の、任意の他の適切な細菌細胞株を用いても良い。
ベクターＤＮＡは、標準的な形質転換技術またはトランスフェクト技術を介して、真核細胞または原核細胞へと導入されることができる。本明細書において、「形質転換」及び「トランスフェクト」という用語は、外来性核酸（たとえばＤＮＡ）を宿主細胞へと導入するための、様々な当分野に認知されている技術を指し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （２００１） ［Ｅｄｓ．］ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、及び他の実験マニュアルに見出される。
宿主細胞の外来性ヌクレオチド配列を導入するための任意の公知の方法を用いても良い。リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルス性ベクター、及び、クローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来性遺伝物質を宿主細胞へと導入するための任意の他の公知の方法の使用が挙げられる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （２００１） （Ｅｄｓ．） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、及び、Ｗａｌｋｅｒ ＆ Ｐａｐｌｅｙ （２００９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ［５ｔｈ Ｅｄ．］ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照のこと。用いられる特定の遺伝子操作技術としては、ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片を発現することができる宿主細胞に、核酸分子を少なくとも１つ首尾良く導入できることが唯一の必須条件である。
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションに関しては、用いられた発現ベクター及びトランスフェクト技術によっては、細胞の小さな分画のみが、外来性ＤＮＡをそのゲノム内に組み込みうることが知られている。これら要素を特定及び選択するために、選択マーカーをコードする遺伝子（たとえば、抗生物質に対する抵抗性）を、通常、対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。様々な選択マーカーが、薬剤（たとえば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラスチシジン及びメトトレキサート等）に対する抵抗性を寄与するものを含有している。選択マーカーをコードしている核酸は、本発明のコードタンパク質と同じベクター上で宿主細胞に導入されても良く、または、別のベクター上で導入されても良い。導入核酸を安定的にトランスフェクトされている細胞は、薬剤選択により特定することができる（たとえば、選択マーカー遺伝子が組み込まれている細胞は生存するが、それ以外の細胞は死亡する）。
本発明の宿主細胞（たとえば、培養中の原核宿主細胞または真核宿主細胞）を用いて、本発明のタンパク質を産生（すなわち、発現）しても良い。従って、本発明により、本発明の宿主細胞を用いた、本発明のタンパク質の製造方法がさらに開示される。１つの実施形態において、当該方法には、本発明の宿主細胞（本発明のタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、適切な培地中で培養し、本発明のタンパク質が産生されること、が含まれる。他の実施形態において、当該方法にはさらに、宿主細胞または培地から、本発明のタンパク質を単離することが含まれる。
発現ベクターが細胞に導入された後、トランスフェクトされた細胞を、受容体、断片、または対象の変異体の発現に好ましい条件下で培養し、次いで、標準的な技術を用いて培養物からそれらを回収する。そのような技術の例は、当分野に公知である。たとえば、ＷＯ００／０６５９３を参照のこと。同様に、産生された時点で、抗体は、当分野に標準的な方法（たとえば、直交流ろ過、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティカラムクロマトグラフィ）に従い精製されても良い。
たとえば、本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体の産生については、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の両方の挿入が可能なベクターと、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクトを用いて、産生を最適化しても良い。我々が使用したプラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶは、我々のキメラモノクローナル抗体が高発現されるように設計されている。ベクターは、重鎖及び軽鎖の遺伝子を受け入れるクローニング部位を有しており、ヒトＣＭＶの下流にそれらを挿入する。ベクターにより、バイオリアクター培地中で、１０００ｍｇ／Ｌを超えるレベルで抗体が産生され、２５０〜５００ｍｇの治療用量が産生される。プラスミドベクターは、エンハンサー欠損ＳＶ４０早期プロモーターにより指示される、ｄｈｆｒ発現ユニットを担持しても良い。ベクターは、ほぼ血清フリーの培地（１．０μｇ／ｍｌのメトトレキサート（ＭＴＸ）を補充されている）中で、ＣＨＯ−Ｄ−ＳＦＭ（ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）欠損チャイニーズハムスター卵巣）細胞へと挿入されても良い。産生の最後、抗体の最終精製の前に、細胞は血清フリー培地に馴化されても良い。
標識物
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその断片は、翻訳後修飾を受け、たとえば化学的リンカー、検出部分（たとえば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、化学発光部分、細胞毒性剤、放射性物質、または機能性部分等）等のエフェクター部分を添加されても良い。
様々な実体（たとえば、リガンド等）を、当分野公知のオリゴヌクレオチドに連結しても良い。リガンドは、天然型分子、または組換えもしくは合成分子を含んでも良い。例示的なリガンドとしては、限定されないが、アバジン（ａｖａｄｉｎ）、ビオチン、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｍＰＥＧ、カチオン性基、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、アプタマー、イムノグロブリン（たとえば、抗体）、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、糖、親油性分子（たとえば、ステロイド、胆汁酸、コレステロール、コール酸、及び脂肪酸）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、ビタミン補因子、リポ多糖体、ホルモン及びホルモン受容体、レクチン、炭水化物、多価炭水化物、放射性標識化マーカー、蛍光色素、及びそれらの誘導体が挙げられる。たとえば、米国特許第６，１５３，７３７号、第６，１７２，２０８号、第６，３００，３１９号、第６，３３５，４３４号、第６，３３５，４３７号、第６，３９５，４３７号、第６，４４４，８０６号、第６，４８６，３０８号、第６，５２５，０３１号、第６，５２８，６３１号、及び、第６，５５９，２７９号を参照のこと。
さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させるために、ＮＥＯ−３００抗体に部分を付加しても良い（たとえば、血流から排出されるまでの時間を延長することにより）。そのような技術としては、たとえば、ＰＥＧ部分の付加（ペグ化とも呼ばれる）が挙げられ、当分野に公知である。米国特許出願公開第２００３／００３１６７１号を参照のこと。
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片は、非ランダムな化学的相互作用、または物理的相互作用を通じて、固形標識と関連した際に、基質に「付加」されても良い。付加は、共有結合を介したものであっても良い。しかしながら、付加は、共有結合または永続的なものである必要は無い。「スペーサー分子」または「リンカー群」を通じて標識に物質を付加しても良い。そのようなスペーサー分子とは、生物学的物質に付着する第一の部分と、標識物に付着する第二の部分を有する分子である。ゆえに、標識物に付着した際、スペーサー分子は、標識物と生物学的物質を分離するが、両方に付着されている。生物学的物質を標識物に付着させる（たとえば、標識する）方法は当分野に公知であり、限定されないが、化学的カップリングが挙げられる。
検出可能な標識物
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、翻訳後修飾を受け、たとえば化学的リンカー、検出可能な標識物（たとえば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、及び化学発光標識物）または機能性標識物（たとえば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒素、細胞毒性剤、及び放射性物質等）のエフェクター標識物を付加されても良い。酵素のさらなる例としては、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、□−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼが挙げられる。蛍光物質のさらなる例としては、限定されないが、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、ジクロロトリアジニルアミン、フィコエリトリン、及び塩化ダンシルが挙げられる。化学発光標識物のさらなる例としては、限定されないが、ルミノールが挙げられる。生物発光物質のさらなる例としては、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられる。放射性物質のさらなる例としては、限定されないが、ビスマス−２１３（２１３Ｂｓ）、炭素−１４（１４Ｃ）、炭素−１１（１１Ｃ）、塩素−１８（Ｃｌ１８）、クロム−５１（５１Ｃｒ）、コバルト−５７（５７Ｃｏ）、コバルト−６０（６０Ｃｏ）、銅−６４（６４Ｃｕ）、銅−６７（６７Ｃｕ）、ジスプロシウム−１６５（１６５Ｄｙ）、エルビウム−１６９（１６９Ｅｒ）、フッ素−１８（１８Ｆ）、ガリウム−６７（６７Ｇａ）、ガリウム−６８（６８Ｇａ）、ゲルマニウム−６８（６８Ｇｅ）、ホルミウム−１６６（１６６Ｈｏ）、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素−１２３（１２４Ｉ）、ヨウ素−１２４（１２４Ｉ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、イリジウム−１９２（１９２Ｉｒ）、鉄−５９（５９Ｆｅ）、クリプトン−８１（８１Ｋｒ）、鉛−２１２（２１２Ｐｂ）、ルテニウム−１７７（１７７Ｌｕ）、モリブデン−９９（９９Ｍｏ）、窒素−１３（１３Ｎ）、酸素−１５（１５Ｏ）、パラジウム−１０３（１０３Ｐｄ）、リン−３２（３２Ｐ）、カリウム−４２（４２Ｋ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８８（１８８Ｒｅ）、ルビジウム−８１（８１Ｒｂ）、ルビジウム−８２（８２Ｒｂ）、サマリウム−１５３（１５３Ｓｍ）、セレニウム−７５（７５Ｓｅ）、ナトリウム−２４（２４Ｎａ）、ストロンチウム−８２（８２Ｓｒ）、ストロンチウム−８９（８９Ｓｒ）、硫黄３５（３５Ｓ）、テクネチウム−９９ｍ（９９Ｔｃ）、タリウム−２０１（２０１Ｔｌ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン−１３３（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム−１６９（１６９Ｙｂ）、イッテルビウム−１７７（１７７Ｙｂ）、及び、イットリウム−９０（９０Ｙ）が挙げられる。
細胞毒性剤
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、細胞毒性剤（限定されないが、メトトレキサート、アミノプテリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン；アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ミトマイシンＣ、ロムスタチン（ＣＣＮＵ）、１−メチルニトロソウレア、シクロトスファミド、メクロレタミン、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、ｃｉｓ−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、及びカルボプラチン（パラプラチン）等）；アントラサイクリン（ダウノルビシン（以前には、ダウノマイシン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、デトルビシン、カルミノマイシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、及びビサントレンを含む）；抗生物質（ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ブレオマイシン、カリチアマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ）を含む）；ならびに、抗分裂剤（たとえば、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、及びビンブラスチン））に連結されていても良い。他の細胞毒性剤としては、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、リシン、緑膿菌外毒素、ゲムシタビン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（Ｏ，Ｐ’−（ＤＤＤ））、インターフェロン、及びこれら細胞毒性剤の混合物が挙げられる。
さらなる細胞毒性剤としては、限定されないが、たとえばカルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、カリケアミシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ミトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＥＧＦＲアンタゴニスト、プラチン、タキソール、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ロイコボリン、ステロイド、シクロホスファミド、メルファラン、ビンカアルカロイド（たとえば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）、ムスチン、チロシンキナーゼ阻害物質、放射線治療、性ホルモンアンタゴニスト、選択性アンドロゲン受容体モジュレーター、選択性エストロゲン受容体モジュレーター、ＰＤＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−１アンタゴニスト、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１２またはＩＬ−２）、ＩＬ−１２Ｒアンタゴニスト、毒素結合モノクローナル抗体、腫瘍抗原特異的モノクローナル抗体、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、抗ＣＤ２０抗体、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、オクレリズマブ、オファツムマブ、ＤＸＬ６２５、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。植物及び細菌由来の毒性酵素（たとえばリシン、ジフテリア毒素、及び緑膿菌毒素）をヒト化抗体またはその抗原結合断片に連結し、細胞型特異的殺傷剤を作製しても良い。Ｙｏｕｌｅ， ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５４８３； Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４５３９； Ｋｒｏｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５４１９。他の細胞毒性剤としては、細胞毒性リボヌクレアーゼが挙げられる。米国特許第６，６５３，１０４号を参照のこと。
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、α粒子またはβ粒子を放出する放射性核種に結合されていても良い（たとえば、放射性免疫結合物）。そのような放射性アイソトープとしては、限定されないが、たとえばリン−３２（３２Ｐ）、スカンジウム−４７（４７Ｓｃ）、銅−６７（６７Ｃｕ）、ガリウム−６７（６７Ｇａ）、イットリウム−８８（８８Ｙ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、サマリウム−１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム−１７７（１７７Ｌｕ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８８（１８８Ｒｅ）等のベータ放射体、及び、たとえば、アスタチン−２１１（２１１Ａｔ）、鉛−２１２（２１２Ｐｂ）、ビスマス−２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス−２１３（２１３Ｂｉ）またはアクチニウム−２２５（２２５Ａｃ）等のアルファ放射体が挙げられる。
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片に標識物を結合するための方法は当分野に公知であり、たとえば、Ｈｕｎｔｅｒ， ｅｔ ａｌ （１９６２） Ｎａｔｕｒｅ １４４： ９４５； Ｄａｖｉｄ， ｅｔ ａｌ． （１９７４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３： １０１４； Ｐａｉｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ４０： ２１９；及び、Ｎｙｇｒｅｎ （１９８２） Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ， ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ， ３０： ４０７に記述される方法がある。
投与または混合のための第二の剤
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその断片は、限定されないが、抗体、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、化学発光部分、細胞毒性剤、放射性物質、または機能性部分を含む部分と、同時または連続的に併せて、または混合されて、投与されても良い。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）と混合される、または併せて投与される抗体の例としては、限定されないが、ＮＰＣ−１（ＮＥＯ−１００）、１６Ｃ３（ＮＥＯ−２００）、及び／または、３１．１（ＮＥＯ−３００）抗体が挙げられる。ＮＰＣ−１（ＮＥＯ−１００）抗体は、ＭＵＣ５ＡＣ（配列番号１〜４）上のＮＰＣ−１エピトープに選択的に結合する。１６Ｃ３（ＮＥＯ−２００）抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５／６（配列番号５〜９）上の１６Ｃ３−１エピトープに選択的に結合する。本明細書において検討されるように、３１．１（ＮＥＯ−３００）抗体は、Ａ３３抗原（配列番号１０〜１３）上の３１．１エピトープに選択的に結合する。ＷＯ２０１１／１６３４０１もまた参照のこと。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）と混合される、または併せて投与されるモノクローナル抗体の例としては、限定されないが、ＮＰＣ−１抗体（ＮＰＣ−１抗原に選択的に結合する。例示的な軽鎖は、配列番号１６、１７、１８に示されるＣＤＲと共に配列番号１４、１５に提示され、及び、重鎖は、配列番号２１、２２、２３に示されるＣＤＲと共に配列番号１９、２０に提示され、例示的な軽鎖は、配列番号２６、２７、２８に示されるＣＤＲと共に配列番号２４、２５に示され、及び、重鎖は、配列番号３１、３２、３３に示されるＣＤＲと共に配列番号２９、３０に提示され、及び、例示的な軽鎖は配列番号３４、３５に示され、及び、重鎖は、配列番号３６、３７に示される）；１６Ｃ３抗原に選択的に結合する１６Ｃ３抗体（たとえば、例示的な軽鎖は、配列番号４０、４１、４２に示されるＣＤＲと共に配列番号３８、３９に提示され、及び、重鎖は、配列番号４５、４６、４７に示されるＣＤＲと共に配列番号４４，４５に提示され、さらなる例示的な軽鎖は、配列番号４８、４９、５０、５１、５２に提示され、及び、重鎖は、配列番号５３、５４、５５、５６、５７に提示され、及び、例示的な軽鎖は配列番号６０、６１、６２に示されるＣＤＲと共に配列番号５８、５９に提示され、及び重鎖は、配列番号６５、６６、６７に示されるＣＤＲとともに配列番号６３、６４に提示される）、及び、Ａ３３抗原に選択的に結合するＡ３３抗原抗体（たとえば、例示的な軽鎖は配列番号６８に提示され、及び、重鎖は配列番号６９に提示され、ならびに、さらなる例示的な軽鎖は配列番号７１に提示され、及び重鎖は配列番号７３に提示される）が挙げられる。また、ＷＯ２０１１／１６３４０１を参照のこと。ＷＯ０２／０７４２５１及びＷＯ２００６／００４９５０に記述される３１．１モノクローナル抗体は、Ａ３３抗原に対する特異性を示す。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）と混合される、または併せて投与されるヒト化抗体の例としては、限定されないが、ＮＰＣ−１抗原に選択的に結合するＮＥＯ−１０３（たとえば、例示的な軽鎖は配列番号３４〜３５に提示され、及び重鎖は配列番号３６〜３７に提示される）、１６Ｃ３抗原に選択的に結合する１６Ｃ３（ｈ１６Ｃ３）（たとえば、例示的な軽鎖は配列番号３８〜５２に提示され、及び、重鎖は配列番号５３〜５７に提示される）；１６Ｃ３抗原に選択的に結合するＮＥＯ−２０１（ｈ１６Ｃ３−Ａｂｂ＊）（たとえば、例示的な軽鎖は、配列番号６０〜６２に示されるＣＤＲとともに配列番号５９に提示され、重鎖は配列番号６５〜６７に示されるＣＤＲと共に配列番号６４に提示される）；及び、Ａ３３抗原に選択的に結合するＮＥＯ−３０２（例示的な軽鎖は配列番号７０〜７１に提示され、及び重鎖は７２〜７３に提示される）が挙げられる。ＷＯ２０１１／１６３４０１もまた参照のこと。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）と混合される、または併せて投与されるキメラ抗体の例としては、限定されないが、ＮＰＣ−１抗原に選択的に結合するＮＥＯ−１０１（ＮＰＣ−１Ｃ）（たとえば、例示的な軽鎖は、配列番号１６〜１８に示されるＣＤＲと共に配列番号１４、１５に提示され、及び重鎖は配列番号２１〜２３に示されるＣＤＲと共に配列番号１９、２０に提示される）；ＮＰＣ−１抗原に選択的に結合するＮＥＯ−１０２（たとえば、例示的な軽鎖は、配列番号２６〜２８に示されるＣＤＲと共に配列番号２４、２５に提示され、及び重鎖は、配列番号３１〜３３に示されるＣＤＲと共に配列番号２９、３０に提示される）；及び、Ａ３３抗原に選択的に結合するＮＥＯ−３０１（３１．１Ｃ）（例示的な軽鎖は配列番号６８に提示され、及び重鎖は配列番号６９に提示される）が挙げられる。ＷＯ２０１１／１６３４０１もまた参照のこと。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）は、抗体軽鎖（配列番号１４、２４、及び３４）、抗体重鎖（配列番号１５、２５、及び３５）を含有する、配列番号１４、１９、２４、２９、３４及び３６（それぞれ、配列番号１５、２０、２５、３０、３５、及び３７のポリペプチドをコードする）に提示されるＮＰＣ−１抗原に結合する抗体に対するポリペプチドをコードする核酸と混合され、または併せて投与されても良い。さらに、例示的なＮＰＣ−１抗体ポリペプチドは、ヒト化軽鎖（配列番号７１）及びヒト化重鎖（配列番号３６）を含有する。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）は、抗体軽鎖（配列番号３８、及び５８）、抗体重鎖（配列番号４３、及び６３）を含有する、配列番号３８、４３、５８、及び１００（それぞれ、配列番号３９、４４、５９、及び１０１のポリペプチドをコードする）に提示される１６Ｃ３抗原に結合する抗体に対するポリペプチドをコードする核酸と混合され、または併せて投与されても良い。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）は、抗体軽鎖（配列番号７０）、抗体重鎖（配列番号７２）を含有する、配列番号７０及び７２（それぞれ、配列番号７１及び７３のポリペプチドをコードする）に提示されるＡ３３抗原に結合する抗体に対するポリペプチドをコードする核酸と混合され、または併せて投与されても良い。
抗体及び抗体断片と共に投与される、または混合されるリガンドは、天然型分子、または組換えもしくは合成分子を含有しても良い。例示的なリガンドとしては、限定されないが、アバジン（ａｖａｄｉｎ）、ビオチン、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｍＰＥＧ、カチオン性基、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、アプタマー、イムノグロブリン（たとえば、抗体）、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、糖、親油性分子（たとえば、ステロイド、胆汁酸、コレステロール、コール酸、及び脂肪酸）、ビタミンＡ，ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、ビタミン補因子、リポ多糖体、ホルモン及びホルモン受容体、レクチン、炭水化物、多価炭水化物、放射性標識化マーカー、蛍光色素、及びそれらの誘導体が挙げられる。たとえば、米国特許第６，１５３，７３７号、第６，１７２，２０８号、第６，３００，３１９号、第６，３３５，４３４号、第６，３３５，４３７号、第６，３９５，４３７号、第６，４４４，８０６号、第６，４８６，３０８号、第６，５２５，０３１号、第６，５２８，６３１号、及び、第６，５５９，２７９号を参照のこと。
検出可能な標識物
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、たとえば化学的リンカー、検出可能な標識物（たとえば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、及び化学発光標識物）または機能性標識物（たとえば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒素、細胞毒性剤、及び放射性物質等）の標識物と同時に、もしくは連続的のいずれかで投与されても良く、または混合されても良い。酵素のさらなる例としては、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、□−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼが挙げられる。蛍光物質のさらなる例としては、限定されないが、ローダミン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、ジクロロトリアジニルアミン、フィコエリトリン、及び塩化ダンシルが挙げられる。化学発光標識物のさらなる例としては、限定されないが、ルミノールが挙げられる。生物発光物質のさらなる例としては、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられる。放射性物質のさらなる例としては、限定されないが、ビスマス−２１３（２１３Ｂｓ）、炭素−１４（１４Ｃ）、炭素−１１（１１Ｃ）、塩素−１８（Ｃｌ１８）、クロム−５１（５１Ｃｒ）、コバルト−５７（５７Ｃｏ）、コバルト−６０（６０Ｃｏ）、銅−６４（６４Ｃｕ）、銅−６７（６７Ｃｕ）、ジスプロシウム−１６５（１６５Ｄｙ）、エルビウム−１６９（１６９Ｅｒ）、フッ素−１８（１８Ｆ）、ガリウム−６７（６７Ｇａ）、ガリウム−６８（６８Ｇａ）、ゲルマニウム−６８（６８Ｇｅ）、ホルミウム−１６６（１６６Ｈｏ）、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素−１２３（１２４Ｉ）、ヨウ素−１２４（１２４Ｉ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、イリジウム−１９２（１９２Ｉｒ）、鉄−５９（５９Ｆｅ）、クリプトン−８１（８１Ｋｒ）、鉛−２１２（２１２Ｐｂ）、ルテニウム−１７７（１７７Ｌｕ）、モリブデン−９９（９９Ｍｏ）、窒素−１３（１３Ｎ）、酸素−１５（１５Ｏ）、パラジウム−１０３（１０３Ｐｄ）、リン−３２（３２Ｐ）、カリウム−４２（４２Ｋ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８８（１８８Ｒｅ）、ルビジウム−８１（８１Ｒｂ）、ルビジウム−８２（８２Ｒｂ）、サマリウム−１５３（１５３Ｓｍ）、セレニウム−７５（７５Ｓｅ）、ナトリウム−２４（２４Ｎａ）、ストロンチウム−８２（８２Ｓｒ）、ストロンチウム−８９（８９Ｓｒ）、硫黄３５（３５Ｓ）、テクネチウム−９９ｍ（９９Ｔｃ）、タリウム−２０１（２０１Ｔｌ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン−１３３（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム−１６９（１６９Ｙｂ）、イッテルビウム−１７７（１７７Ｙｂ）、及び、イットリウム−９０（９０Ｙ）が挙げられる。
細胞毒性剤
ＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、細胞毒性剤（限定されないが、メトトレキサート、アミノプテリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン；アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ミトマイシンＣ、ロムスタチン（ＣＣＮＵ）、１−メチルニトロソウレア、シクロトスファミド、メクロレタミン、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、ｃｉｓ−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、及びカルボプラチン（パラプラチン）等）；アントラサイクリン（ダウノルビシン（以前には、ダウノマイシン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、デトルビシン、カルミノマイシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、及びビサントレンを含む）；抗生物質（ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ブレオマイシン、カリチアマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ）を含む）；ならびに、抗分裂剤（たとえば、ビンカアルカロイド、ビンクリスチン、及びビンブラスチン））と同時または連続的に投与されても良く、または混合されても良い。他の細胞毒性剤としては、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、リシン、緑膿菌外毒素、ゲムシタビン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（Ｏ，Ｐ’−（ＤＤＤ））、インターフェロン、及びこれら細胞毒性剤の混合物が挙げられる。
さらなる細胞毒性剤としては、限定されないが、たとえばカルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、カリケアミシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ミトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＥＧＦＲアンタゴニスト、プラチン、タキソール、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ロイコボリン、ステロイド、シクロホスファミド、メルファラン、ビンカアルカロイド（たとえば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）、ムスチン、チロシンキナーゼ阻害物質、放射線治療、性ホルモンアンタゴニスト、選択性アンドロゲン受容体モジュレーター、選択性エストロゲン受容体モジュレーター、ＰＤＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ−１アンタゴニスト、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１２またはＩＬ−２）、ＩＬ−１２Ｒアンタゴニスト、毒素結合モノクローナル抗体、腫瘍抗原特異的モノクローナル抗体、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、抗ＣＤ２０抗体、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、オクレリズマブ、オファツムマブ、ＤＸＬ６２５、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。植物及び細菌由来の毒性酵素（たとえばリシン、ジフテリア毒素、及び緑膿菌毒素）をヒト化抗体またはその抗原結合断片に連結し、細胞型特異的殺傷剤を作製しても良い。Ｙｏｕｌｅ， ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５４８３； Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４５３９； Ｋｒｏｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ５４１９。他の細胞毒性剤としては、細胞毒性リボヌクレアーゼが挙げられる。米国特許第６，６５３，１０４号を参照のこと。
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、α粒子またはβ粒子を放出する放射性核種と同時または連続的に投与されても良く、または混合されても良い（たとえば、放射性免疫結合物）。そのような放射性アイソトープとしては、限定されないが、たとえばリン−３２（３２Ｐ）、スカンジウム−４７（４７Ｓｃ）、銅−６７（６７Ｃｕ）、ガリウム−６７（６７Ｇａ）、イットリウム−８８（８８Ｙ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、サマリウム−１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム−１７７（１７７Ｌｕ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８８（１８８Ｒｅ）等のベータ放射体、及び、たとえば、アスタチン−２１１（２１１Ａｔ）、鉛−２１２（２１２Ｐｂ）、ビスマス−２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス−２１３（２１３Ｂｉ）またはアクチニウム−２２５（２２５Ａｃ）等のアルファ放射体が挙げられる。
基盤
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）は、基盤に付着しても良い。当分野に公知の多くの基盤（たとえば、固形支持体）が、本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片との使用に適している。基盤は、チャンネルまたは他の構造を含有するように改変されても良い。Ｆｕｎｇ （２００４） ［Ｅｄ．］ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｒａｙｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｋａｍｂｈａｍｐａｔｉ （２００４） ［Ｅｄ．］ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照のこと。
基盤物質としては、限定されないが、アクリル、アガロース、ホウケイ酸ガラス、カーボン（たとえば、カーボンナノファイバーシートまたはペレット）、酢酸セルロース、セルロース、セラミック、ゲル、ガラス（たとえば、無機ガラス、制御孔ガラス、修飾ガラス、ソーダ石灰、または官能基化ガラス）、ラテックス、磁性ビーズ、膜、金属、半金属、ニトロセルロース、ＮＹＬＯＮ（登録商標）、光ファイバー束、有機ポリマー、紙、プラスチック、ポリアクロイルモルホリド、ポリ（４−メチルブテン）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルブチレート）、ポリアクリルアミド、ポリブチレン、ポリカルボネート、ポリエチレン、ポリエチレングリコールテレフタレート、ポリホルムアルデヒド、ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン、多糖、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニル酢酸、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリビニルピロリジノン、レーヨン、樹脂、ゴム、半導体物質、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、シリカ、シリコン、スチレンコポリマー、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、及び、様々な他のポリマー、が挙げられる。
基盤は平たんである必要は無く、球状形態（たとえばビーズ）または円筒状形態（たとえば、ファイバー）を含む、任意のタイプの形態を含むことができる。固形支持体に付着される物質は、固形支持体の任意の位置に付着されても良い（たとえば、多孔固形支持体物質の内側部分に付着されても良い）。
基盤体は、ビーズ、ボックス、カラム、シリンダー、ディスク、ディッシュ（たとえば、ガラスディッシュ、ＰＥＴＲＩディッシュ）、ファイバー、フィルム、フィルター、マイクロタイタープレート（たとえば、９６ウェルのマイクロタイタープレート）、マルチブレードスティック、網、ペレット、プレート、リング、棒、ロール、シート、スライド、スティック、トレイ、チューブまたはバイアルの形態であっても良い。基盤は、単一の別々の物体（たとえば、１つのチューブ、１つのビーズ）であっても良く、任意の数の複数の基盤体（たとえば、１０本のチューブのラック、数個のビーズ）、またはそれらの組み合わせ（たとえば、複数のマイクロタイタープレート、ビーズが充填されたカラム、ビーズで充填されたマイクロタイタープレートを含むトレイ）であっても良い。
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）は、非ランダムな化学的相互作用または物理的相互作用を通じて、固形基盤と関連した際に、基盤に「付着」されても良い。付着は、共有結合を介したものであっても良い。しかしながら、付着は、共有結合または永続的なものである必要は無い。「スペーサー分子」または「リンカー基」を通じて基盤に物質を付着しても良い。そのようなスペーサー分子とは、生物学的物質に付着する第一の部分と、基盤に付着する第二の部分を有する分子である。ゆえに、基盤に付着した際、スペーサー分子は、基盤と生物学的物質を分離するが、両方に付着はされている。生物学的物質を基盤に付着させる（たとえば、標識する）方法は当分野に公知であり、限定されないが、化学的カップリングが挙げられる。
固相合成反応のための、固相を支持し、及び含有する、たとえばマイクロタイタープレート等のプレートを用いても良い。マイクロタイタープレートは、固相として用いられるビーズを内包しても良い。本明細書において、「粒子」または「マイクロ粒子」または「ナノ粒子」または「ビーズ」または「マイクロビーズ」または「ミクロスフィア」とは、様々な形態またはサイズのいずれかを有するマイクロ粒子の物質を意味する。形態は通常、球状であるが、球状である必要は無く、たとえば、円筒状、多面体であっても良い。当業者に認識されているように、粒子は、その用途に応じて、様々な物質を含有しても良い（限定されないが、架橋デンプン、デキストラン、セルロース、タンパク質、有機ポリマー（たとえばポリスチレン及びメチルスチレン等のスチレンポリマーならびに他のスチレンコポリマーを含む）、プラスチック、ガラス、セラミックス、アクリルポリマー、磁気反応性物質、コロイド、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタニウム、ナイロン、ラテックス及びＴＥＦＲＯＮ（登録商標）を含む）。たとえば、“Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ” ｆｒｏｍ Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｆｉｓｈｅｒｓ， ＩＮを参照のこと。
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、本明細書に記述される任意の形態の基盤に付着されても良い（たとえば、ビーズ、カラム、シリンダー、ディスク、ディッシュ（ガラスディッシュ、ＰＥＴＲＩディッシュ）、ファイバー、フィルム、フィルター、マイクロタイタープレート（たとえば、９６ウェルのマイクロタイタープレート）、マルチブレードスティック、網、ペレット、プレート、リング、棒、ロール、シート、スライド、スティック、トレイ、チューブまたはバイアル）。特に、粒子またはビーズは、ゲル化物質の成分であっても良く、または、たとえば様々な合成プラスチックから作製されるラテックスビーズ等の別の成分であっても良い（たとえば、ポリスチレン）。標識（たとえば、ストレプトアビジン）が基盤（たとえば、ビーズ）に結合されていても良い。
医薬組成物
「医薬組成物」とは、哺乳類への投与に適した化学的組成物または生物学的組成物を指す。そのような組成物は、多くの経路（限定されないが、口腔内、経皮、硬膜外、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、鼻内、眼内、腹腔内、髄腔内、くも膜下、静脈内、経口、非経口、浣腸または座薬を介して直腸内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、舌下、経皮、及び経粘膜を含む）のうちの１以上を介した投与に対し、特に製剤化されても良い。さらに、投与は、注射、粉末、液体、ゲル、液滴、または他の投与手段により行われても良い。
「薬学的賦形剤」または「薬学的に受容可能な賦形剤」は、活性治療剤が処方される担体（通常は液体）である。本発明の１つの実施形態において、活性治療剤は、本明細書に記述されるヒト化抗体またはその１以上の断片である。通常、賦形剤は、製剤に対し何も薬理学的活性をもたらさないものであるが、化学的及び／または生物学的安定性、ならびに放出特性をもたらすものであっても良い。例示的な製剤は、たとえば、Ｇｒｅｎｎａｒｏ （２００５） ［Ｅｄ．］ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ［２１ｓｔ Ｅｄ．］に見出される。
医薬組成物は通常、滅菌され、製造及び保管条件下で安定でなければならない。本発明からは、医薬組成物が凍結乾燥された形態で存在することが予期される。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高濃度の薬剤に適した秩序だった他の構造として処方されても良い。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であっても良い。本発明からはさらに、医薬組成物中に安定化剤が包含されることが予期される。
本発明のＮＥＯ−３００抗体及びその断片（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）は、様々な剤型の医薬組成物へと処方されても良い。本発明の医薬組成物を調製するために、少なくとも１つのＡ３３抗原、抗ＮＰＣ−１抗体、抗１６Ｃ３抗体、または他のＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片を活性成分として、医薬処方の当分野の当業者に公知の技術に従い、適切な担体及び添加剤と共にしっかりと混合しても良い。Ｇｒｅｎｎａｒｏ （２００５） ［Ｅｄ．］ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ［２１ｓｔ Ｅｄ．］を参照のこと。たとえば、本明細書に記述される抗体は、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水中で処方され、５．０ｍｇ／ｍＬの透明無色の液体溶液として、供給されても良い。
同様に、液体調製のための組成物は、適切な担体及び添加剤（限定されないが、水、アルコール、油、グリコール、保存剤、香味剤、着色剤、及び懸濁剤が挙げられる）とともに溶液、エマルション、分散液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを含有する。非経口投与のための典型的な調製物は、たとえば滅菌水または非経口投与に受容可能な油（限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、ラッカセイ油、またはゴマ油が挙げられる）等の担体と共に活性成分を含有し、溶解度または保存を補助する目的で、他の添加剤が含有されても良い。溶液の場合、粉末に凍結乾燥され、次いで、使用直前に再構成される。分散液及び懸濁液に対しては、適切な担体及び添加剤としては、水性ゴム、セルロース、ケイ酸塩、または油が挙げられる。
列挙された実施形態の各々に対し、本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片は、様々な剤型で投与されても良い。当業者に公知の生物学的に受容可能な任意の剤型、及びそれらの組み合わせが予期される。そのような剤型の例としては、限定されないが、再構成可能な粉末、エリキシル、液体、溶液、懸濁液、エマルション、粉末、顆粒、粒子、マイクロ粒子、分散可能な顆粒、カシェー、吸入、エアロゾル吸入、パッチ、粒子吸入、移植、デポ移植、注射剤（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内が挙げられる）、点滴、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
多くの場合、等張剤（糖類、ポリアルコール（たとえば、マンニトール、ソルビトール）または塩化ナトリウム）を組成物中に含有することが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物中に吸収を延長させる剤を含有させることにより行われる（たとえば、モノステアリン酸塩及びゼラチン）。さらに、本明細書に記述される化合物は、徐放製剤中に処方されても良い（たとえば、徐放ポリマーを含有する組成物中に）。ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片は、急速な放出から化合物を保護する担体とともに調製されても良い（たとえば、移植及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む制御放出製剤）。生分解性、生物適合性のポリマーを用いても良い（たとえば、エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸、ポリグリコールコポリマー（ＰＬＧ））。多くのそのような製剤の調製方法が当業者に公知である。
当業者であれば、たとえば、本明細書の開示及びＧｏｏｄｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ［１２ｔｈ Ｅｄ．］； Ｈｏｗｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ： Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ［２ｎｄ Ｅｄ．］；及び、Ｇｏｌａｎ， （２００８） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ ［２ｎｄ Ｅｄ．］にある教示により導かれる、日常的な業務を介して、効果的な投与量及び投与頻度を決定することができるであろう。また、Ｇｒｅｎｎａｒｏ （２００５） ［Ｅｄ．］ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ［２１ｓｔ Ｅｄ．］を参照のこと。
投与経路
本明細書に記述される組成物は、以下の経路のうちの任意のもので投与されても良い：口腔内、経皮、硬膜外、点滴、吸入、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、筋肉内、鼻内、眼内、腹腔内、髄腔内、くも膜下、静脈内、経口、非経口、経肺、浣腸または座薬を介して直腸内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、舌下、経皮、及び経粘膜。好ましい投与経路は、静脈内注射または点滴である。投与は、局所であっても良く、組成物は、疾患部位（複数含む）（たとえば、腫瘍）に直接、近接して、局所的に、近くに、その部位で、周囲で、もしくは近辺に投与され、または、全身であっても良く、組成物は、患者に投与され、広く全身を巡り、それにより疾患部位（複数含む）に到達する。局所投与（たとえば、注入）は、疾患を包囲し、及び／もしくは、疾患により影響を受ける細胞、組織、器官及び／もしくは臓器系、ならびに／または、疾患の兆候及び／もしくは症状が活性状態である、または発生しそうである場所（たとえば、腫瘍部位））に投与することにより行うことができる。投与は、特定の場所に効果を有する局所であっても良く、組成物は、その作用が望ましい場所に直接適用される（たとえば、腫瘍部位）。
列挙される実施形態の各々に対し、組成物は、当分野公知の様々な剤型で投与されても良い。当業者に公知の、任意の生物学的に受容可能な剤型、及びその組み合わせが予期される。そのような剤型の例としては、限定されないが、チュアブル錠、素早く溶解する錠剤、発泡錠、再構成可能な粉末、エリキシル、液体、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、多層錠、二層錠、カプセル、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、カプレット、トローチ、チュアブルトローチ、ビーズ、粉末、ガム、顆粒、粒子、マイクロ粒子、分散性顆粒、カシェー、ビデ、座薬、クリーム、局所剤、吸入、エアロゾル吸入、パッチ、粒子吸入、移植、デポ移植、摂取剤、注射剤（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）、点滴、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
混合により含有することができる他の化合物としては、たとえば、医学的に不活性な成分（たとえば、固形希釈剤及び液体希釈剤）があり、たとえば、ラクトース、デキストロースサッカロース、セルロース、デンプンまたは、錠剤もしくはカプセルに対してのリン酸カルシウム、軟カプセルに対してのオリーブオイルもしくはオレイン酸エチル、及び、懸濁液もしくはエマルションに対しての水または植物油；たとえばシリカ、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、及び／または、ポリエチレングリコール等の潤滑剤；たとえばコロイド粘土等のゲル化剤；たとえばトラガカントガムまたはアルギン酸ナトリウム等の増粘剤、たとえばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン等の結合剤；たとえばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはデンプングリコール酸ナトリウム等の崩壊剤；泡立ち混合物；染料；甘味料；レシチン、ポリソルベートまたはラウリルサルフェート等の湿潤剤；及び、他の治療的に受容可能な補足成分（たとえば、保湿剤、保存剤、緩衝剤及び抗酸化剤）等があり、それらは、そのような製剤に対する公知の添加剤である。
経口投与に対する液体分散液は、シロップ、エマルション、溶液または懸濁液であっても良い。シロップは、担体として、たとえばサッカロースまたは、グリセロール及び／またはマンニトール及び／またはソルビトールを有するサッカロース等を含有しても良い。懸濁液及びエマルションは、たとえば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコール等の担体を含有しても良い。
さらなる実施形態において、本発明により、１以上の本発明の抗体及びその断片の有効量を含有する薬剤投与単位を含有する、１以上の容器を含有するキットが提示される。キットは、説明書、指示書、ラベル、市場情報、警告、または情報パンフレットを含有しても良い。
投与量
本発明の任意の実施形態に従う治療用組成物における、ＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）の量は、たとえば疾患状態、年齢、性別、体重、既往歴、リスク因子、疾患に罹りやすい傾向、投与経路、既存の治療レジメ（たとえば、他の医薬との相互作用の可能性）、及び、個々の重量等の因子に従い変化しうる。投薬レジメは、最適な治療応答を得るために調製されても良い。たとえば、単回のボーラス投与で投与されても良く、数回に分割された用量が経時的に投与されても良く、または、用量は、治療状況の緊急性により示されるように、比例的に増加または減少させても良い。
投与のしやすさ、及び用量の統一性から、用量単位形態で、非経口組成物を処方することは特に有益である。本明細書に用いられる用量単位形態とは、治療される哺乳類対象に対し統一された投与量として適合させた、物理的に別々の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的担体と関連し、所望される治療効果を得られると算出された、既定の抗体及びその断片の量を含有する。本発明の用量単位形態に関する仕様は、抗体及びその断片のユニークな特性、ならびに得られる特定の治療効果、ならびに、個々における感受性の処置に関し、そのような抗体及びその断片の組み合わせに関する当分野固有の禁止事項によって、及び、直接基づいて、決定される。本発明の抗体及びその断片または適切なその医薬組成物が有効である、哺乳類（たとえば、ヒト）における疾患の治療に対する治療用途において、本発明の抗体及びその断片は、有効量で投与されても良い。本発明に対し適切な調剤は、組成物、医薬組成物、または本明細書に記述される任意の他の組成物であっても良い。
調剤は、単回投与、二回の投与、三回の投与、四回の投与、及び／または、五回の投与として投与されても良い。調剤は、単独で、同時に、及び連続的に投与されても良い。
剤型は、当業者に公知の任意の放出形態であっても良い。本発明の組成物は、活性成分が即効で放出されるよう、または、活性成分が放出制御されるよう、処方されても良い。徐放または制御放出の調製において、活性成分の放出は、長時間にわたり（たとえば、４〜２４時間）、血液レベルが治療範囲内に維持され、しかし毒性レベルよりは下回るような速度でなされても良い。好ましい剤型としては、即時放出、持続放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）、パルス放出、可変放出、制御放出、持続放出（ｔｉｍｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）、徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌａｓｅ）、遅延放出、長時間作用、及びそれらの組み合わせが挙げられ、当分野に公知である。
組成物の薬理活性は、当分野公知の標準的な薬理学的モデルを用いてモニターされても良いことを認識されたい。さらに、ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物は、部位特異的送達のために適切なポリマーマトリクスまたは膜中に組み込まれても良く、またはカプセル化されても良く、または、部位特異的送達を有効にすることができる特異的標的化剤で機能化されても良い。これらの技術は、他の薬剤デリバリー法と同様に、当分野に公知である。特定の状況に対する最適用量の決定は、当業者の能力範囲内にある。たとえば、Ｇｒｅｎｎａｒｏ （２００５） ［Ｅｄ．］ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ［２１ｓｔ Ｅｄ．］を参照のこと。
治療方法
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）は、癌の治療方法、腫瘍退縮を促進させる方法、腫瘍細胞を殺傷する方法、Ａ３３抗原発現腫瘍細胞に対する免疫応答を活性化する方法（たとえば、細胞毒性免疫応答）、樹状細胞を活性化する方法、または抗原特異的免疫を活性化する方法において用いられても良く、当該方法には、それを必要とする対象に対し、ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片の有効量を投与することが含まれる。さらに、本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片は、癌の治療、腫瘍退縮の促進、腫瘍細胞の殺傷、Ａ３３抗原発現腫瘍細胞に対する免疫応答の活性化（たとえば、細胞毒性免疫応答）、樹状細胞の活性化、または抗原特異的免疫応答の活性化における使用のための、本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片の有効量を含有する医薬の製造に用いられても良い。本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片は、癌の治療、腫瘍退縮の促進、腫瘍細胞の殺傷、Ａ３３抗原発現腫瘍細胞に対する免疫応答の活性化（たとえば、細胞毒性免疫応答）、樹状細胞の活性化、または抗原特異的免疫応答の活性化に対する、本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片の有効量を含有する組成物を製造するために、薬学的に受容可能な担体と混合されても良い。
本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片により治療される癌は、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌であっても良い。癌は、ステージ１、２、３または４の癌であっても良い。癌は転移していても良い。患者は、癌に罹患している哺乳類（たとえば、ヒト）であっても良く、ここで、腫瘍細胞はＡ３３抗原、異常なＡ３３抗原を発現しているか、及び／または、Ａ３３抗原を発現する新生細胞の腫瘍形成がある。Ａ３３抗原を阻害または減少させるために十分な量は、疾患を改善するために十分な量であり、癌の進行または腫瘍量のいずれかの減少としてモニターされても良い。たとえば、転移性癌の治療のために、その必要のある患者に対して、最小限のＨＡＭＡ及び高レベルのＡＤＣＣを伴うＮＥＯ−３００抗体が、２００〜４００ｍｇの投与量で２週毎に静脈内投与されても良い。
患者は、検出可能レベルのＡ３３抗原を発現していても良い（たとえば、腫瘍生検サンプル中、または血液、糞便、尿もしくはリンパ液中に検出される）。さらに、患者は、癌のリスクがあるか、または症状の無い患者であっても良い。本明細書に記述される方法は、たとえばヒト細胞等の細胞に対し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで用いられても良い。あるいは、当該方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ（たとえば、治療）プロトコールの一部として、対象に存在する細胞に対して行われても良い。
ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片は、追加の化学療法剤、細胞毒性剤、抗体（たとえば、３１．１モノクローナル抗体）、リンホカイン、または造血増殖剤と混合されても良い。ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片はまた、他の抗体、リンホカイン、細胞毒性剤（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質合成を阻害する部分、放射性核種、またはリボソーム阻害タンパク質、たとえば、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、ビンデシン、メトトレキサート、アドリアマイシン、シスプラチン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、緑膿菌外毒素Ａ、リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、または細胞毒性ホスホリパーゼ酵素等）、免疫抑制剤（たとえば、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、アゾチプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、タクロリムスまたはシロリムス）、または造血増殖因子と組み合わせて投与されても良い。ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片は、化学発光標識、常磁性標識（たとえば、アルミニウム、マンガン、プラチナ、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウムまたはガリウム）、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射性標識で標識されても良い。本明細書に記述される方法において、第二の剤は、抗体と同時、または連続的に投与されても良い。
本明細書に記述される抗原、抗体及び核酸は、癌の治療における使用のための組成物の製造に用いられても良く、及び、限定されないが、固形癌及び軟性腫瘍（たとえば、食道癌、腎臓癌、乳癌、甲状腺癌、脾臓癌、子宮癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、胃癌、子宮頸癌、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膀胱癌、頭頸部癌、肝臓癌、膵臓癌、メラノーマ、骨肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、奇形癌、神経芽細胞腫、グリオーマ、グリア芽腫及び悪性血液疾患（たとえば、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性ミエローマ、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫）等）を含む癌の治療方法に用いられても良く、ここで、当該癌は、侵襲性または転移性である。
本発明により、第二の抗増殖性疾患療法を受けうる対象に対し、ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、膵臓癌または結腸癌を有する対象を治療する方法が開示される。第二の抗増殖性疾患療法の例としては、化学療法、放射線治療、免疫療法、光線療法、寒冷療法、毒素療法、ホルモン治療、または外科手術が挙げられる。ゆえに、本発明により、標準的な抗癌療法と併用した、本発明方法及び組成物の使用が予期される。治療を受ける患者は、どの年齢であっても良い。当業者であれば、ＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片と併用して用いることができる他の抗癌療法の存在及び開発を認識しうるであろう。
投与量の決定は、当業者の有する技術のレベルの範囲内にある。ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、急性期治療のために、１週間かそれ未満（多くの場合、１〜３日間）にわたり投与されても良く、または、数か月または数年にわたって慢性期治療に用いられても良い。通常、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片の治療有効量は、検出されるＡ３３抗原において、臨床的に重要な変化を生じさせるために十分な量、癌の進行を遅らせるために十分な量、または腫瘍サイズを減少させるために十分な量である。
診断方法
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、Ａ３３抗原の存在の有無を検出する診断方法に用いられても良い。ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、（ａ）試験サンプルと、Ａ３３抗原に結合する抗体またはその抗体断片とを接触させること、及び、（ｂ）抗体−エピトープ複合体を分析することであって、ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標であること、を含む方法において用いられても良い。さらに、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、（ａ）Ａ３３抗原に結合する標識化モノクローナル抗体またはその抗体断片を患者に投与すること、及び、（ｂ）Ａ３３抗原の存在を検出することであって、ここで、前記エピトープの存在は癌の指標であること、を含む、患者におけるＡ３３抗原の存在を検出するための方法において用いられても良い。抗体−エピトープ複合体は、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、側方流動アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及びプロテインＡ免疫アッセイにより検出されても良い。サンプルは、組織生検、リンパ、尿、脳脊髄液、羊水、炎症性滲出液、血液、血清、糞便、または消化管から採取された液体であっても良い。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、Ａ３３抗原の存在の有無を検出する診断方法において用いられても良く、ここで、前記抗原の存在は、癌（限定されないが、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌が挙げられる）の指標である。診断方法は、癌のリスクがある患者、または症状の無い患者に用いられても良い。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、組換え体であっても良い。Ａ３３抗原に選択的に結合する抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープ、または、抗原に結合することができる抗体の一部であっても良い。ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、キメラ、ヒト化、抗イディオタイプ、一本鎖、二機能性、または共特異性であっても良い。Ａ３３抗原に選択的に結合する抗体、またはその断片は、標識物（限定されないが、化学発光標識、常磁性標識（たとえば、アルミニウム、マンガン、プラチナ、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウム）、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射性標識が挙げられる）に結合されていても良い。
さらに、ＮＥＯ−３００抗体またはその抗原結合断片は、たとえばアレイ等の固相支持体（たとえば、ビーズ、試験管、シート、培養皿、または試験紙等）に付着されていても良い。
本発明方法は、結腸直腸ポリープを検出しても良い。本発明方法はさらに、限定されないが、良性腫瘍、悪性腫瘍、転移性腫瘍、及び非転移性腫瘍を含む腫瘍の存在に対する追加の検証を含有しても良い。たとえば、本診断方法は、Ａ３３抗原を含む細胞マーカーを発現する前癌性細胞を検出しても良い。
本発明方法は、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ＣＣＤ低照度モニタリングシステム、Ｘ線、ＣＴスキャン、シンチグラフィー、光音響画像化、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波、常磁性画像化、及び、内視鏡光コヒーレンス断層撮影による、Ａ３３抗原の画像化を含有しても良い。
本発明はまた、患者由来の核酸サンプルの採取、癌特異的Ａ３３配列について比較することを含む前記核酸の分析、を含有する、癌のリスクの遺伝的診断を行う方法が提示され、ここで、もし患者の核酸サンプルが、癌特異的Ａ３３配列を合致した場合、当該患者は、癌を発病するリスクがある。
Ａ３３抗原は、癌のバイオマーカーとして用いられても良い。生物学的サンプル（たとえば、対象の血清、生検腫瘍細胞、または糞便サンプル等）中のＡ３３抗原の検出は、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片を用いて行われても良い。たとえば、生物学的サンプル（たとえば、腫瘍、血清または糞便サンプル）が対象から採取され、次いで、Ａ３３抗原が測定され（たとえば、ＥＬＩＳＡまたはＰＣＲによる）、及び、正常対象由来の対応するサンプルと比較される。測定方法は、たとえば、アンチセンスＡ３３抗原ＤＮＡまたはｃＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、超ハイスループットスクリーニング、ナノストリング法、マイクロアレイ、ローリングサイクル増幅、近接介在性ライゲーション、ＰＣＲ，ｑＲＴ−ＰＣＲ ＣｈＩＰ、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ、またはＡ３３抗原結合抗体等の任意の核酸検出方法が挙げられる。比較的高レベルのＡ３３抗原は、膵臓癌または結腸癌の存在及び／または重篤度を示唆するものであり、及び、転移または癌の予後が良くないことを示唆しうる。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片を、診断方法のために、ＳＱＵＩＤ（Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｅｖｉｃｅ）において用いても良い。ＳＱＵＩＤ法は、酸化鉄のナノ粒子を抗体に付着させ、次いでそれを患者に注入することを含む。もし腫瘍が存在する場合、ナノ粒子が結合した抗体は、腫瘍細胞上のＡ３３抗原を認識し、結合する。たとえば、Ｈａｏ， ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ４３： ４７４００４を参照のこと。ＳＱＵＩＤ法において、患者は、次いで、超電導量子干渉装置（ＳＱＵＩＤ）中の高感度磁気コイルで囲まれる。磁場を生成し、金属ナノ粒子の全てを１つの方向に並べる。磁場が壊れた際に、ナノ粒子は、元の状態に緩和しながら、電磁シグナルを放出する。シグナルの強度を測定することにより、多くの金属粒子がどのように存在しているか、ゆえに、多くの腫瘍細胞がどのように存在しているか、患者の中で、腫瘍細胞がどこに位置しているかが判明する。たとえば、Ｓｈａｏ， ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １： １４２-１５４を参照のこと。
サンプル及びサンプルの取得
本明細書に記述される方法において用いられるサンプルは、対象（患者）から採取されても良く、限定されないが、体液または分泌物（限定されないが、血液、血清、尿、血漿、前立腺液、精液、皮膚、呼吸器、腸管及び泌尿器の外分泌物、涙、脳脊髄液、痰、唾液、乳、腹水、胸膜液、嚢胞液、乳管系の分泌物（及び／またはその洗浄液）、気管支肺胞洗浄液、生殖系の洗浄液、ならびに、身体または身体のシステムの任意の他の部分の洗浄液）；単離細胞（複数含む）または組織（複数含む）を含む任意の器官のサンプル、が挙げられ、ここで、当該細胞または組織は、限定されないが、肺、結腸、卵巣及び／または乳房組織から選択される器官から採取されても良く；糞便もしくは組織サンプルまたはそれらの任意の組み合わせから採取されても良い。一部の実施形態において、当該用語は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞培養抗生物質のサンプルが包含される。診断アッセイを行う前に、サンプルは、任意選択的に、適切な希釈物質を用いて希釈されても良い。
多くの抗体の組織採取法または液体採取法を用いて、対象由来の生物学的サンプルを採取し、対象における、目的マーカーのＤＮＡ、ＲＮＡ及び／またはポリペプチドレベルを測定しても良い。組織採取法または液体採取法の例としては、限定されないが、微細針生検、針生検、コア針生検、及び外科生検（たとえば、脳生検）、及び洗浄液採取が挙げられる。用いた方法に拘わらず、生検／サンプルが採取された時点で、マーカーのレベルを測定しても良く、それにより、診断を行うことができる。
Ａ３３抗原の検出
本発明により、生物学的サンプル中の本発明のＡ３３抗原の検出を行う方法が提示され、当該方法には、生物学的サンプルと本発明のＡ３３抗原を特異的に認識する抗体を接触させること、及び、前記相互作用を検出することが含まれ、ここで、相互作用の存在と、生物学的サンプル中のＡ３３抗原の存在は相関している。
本明細書に記述されるＡ３３抗原は、疾患の診断、及び／または、状態を示唆するマーカーの非限定的な例である。本発明の各マーカーは、様々な用途（限定されないが、癌（たとえば、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌、肺癌または乳癌）の予後診断、予測、スクリーニング、早期診断、進行状態の測定、治療選択、及び治療モニタリング等が挙げられる）に対し、単独で用いても、組み合わせで用いても良い。
本明細書に記述される方法を用いて検出されうる癌としては、限定されないが、非固形腫瘍及び固形腫瘍、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、肝臓癌、膵臓癌が挙げられ、ここで、当該癌は、侵襲性または転移性であっても良い。
本発明のＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、様々な用途（限定されないが、癌（たとえば、非固形腫瘍及び固形腫瘍、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、肝臓癌、膵臓癌等であり、ここで、当該癌は、侵襲性または転移性であっても良い）の予後診断、予測、スクリーニング、早期診断、進行状態の測定、治療選択及び治療モニタリングが挙げられる）に対し、単独で、または組み合わせて用いられても良い。そのような組み合わせは、任意選択的に、マーカーの任意の副次的な組み合わせ、及び／または、たとえば公知のマーカー等の、少なくとも１つの他のマーカーを特徴とする組み合わせ、を含有しても良い。さらに、そのような組み合わせは、任意選択的に、及び好ましくは、本明細書に記述される任意の他のマーカー、及び／または、任意の他の公知のマーカー、及び／または、任意の他のマーカーと、本明細書に記述される任意のマーカーの間の比率を定量的または半定量的に測定することに関し、上述のように用いられても良い。
本発明のマーカーは、任意選択的に、肺癌に対し、公知のマーカー（限定されないが、ＮＰＣ−１、１６Ｃ３、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ベータ２−マイクログロブリン、ＣＡ１９−９、ＴＰＡ、及び／または、本明細書に記述される変異マーカーに対する公知のタンパク質との組み合わせ、が挙げられる）と組み合わせて、または単独で用いられても良い。
本発明のマーカーは、任意選択的に、卵巣癌に対し、公知のマーカー（限定されないが、ＮＰＣ−１、１６Ｃ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５（ムチン１６）、ＣＡ７２−４ＴＡＧ、ＣＡ−５０、ＣＡ ５４−６１、ＣＡ−１９５、及び、ＣＡ−１２５と組み合わせたＣＡ１９−９、ならびに／または、本明細書に記述される変異マーカーに対する公知のタンパク質との組み合わせ、が挙げられる）と組み合わせて、または単独で用いられても良い。
本発明のマーカーは、任意選択的に、結腸癌に対し、公知のマーカー（限定されないが、ＮＰＣ−１、１６Ｃ３、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、及び／または、本明細書に記述される変異マーカーに対する公知のタンパク質との組み合わせ、が挙げられる）と組み合わせて、または単独で用いられても良い。
通常、対象から得られた生物学的サンプル中のマーカーのレベルは、健常者から得られた同様のサンプル中の同じマーカーのレベルとは異なっている（すなわち、増加または減少している）（生物学的サンプルの例は本明細書に記述されている）。
正常組織とは対照的なマーカーの発現増加、及び／または、増幅、及び／または、発現減少の検出と並行して、同じ起源の正常な組織中の同じマーカーのレベルの測定が行われても良い。
本発明により、たとえば、非固形腫瘍及び固形腫瘍、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、肝臓癌、膵臓癌等（ここで、当該癌は、侵襲性または転移性であっても良い）等の癌の診断方法、診断用途、診断デバイス、及び診断アッセイもまた開示される。任意選択的に、複数のマーカーを、本発明と共に用いても良い。複数のマーカーは、任意選択的に、本明細書に記述されるマーカー、及び／または、１以上の公知のマーカーを含有しても良い。次いで、複数のマーカーは、好ましくは、疾患または状態と相関する。たとえば、そのような相関関係比較は、任意選択的に、複数のマーカーの各々の濃度を測定すること、及び、各マーカーの濃度を個々に閾値レベルと比較すること、を含んでも良い。任意選択的に、もしマーカーの濃度が閾値を超える、または下回る場合（実施したマーカー及び／または診断テストによる）、マーカー濃度は、疾患または状態と相関している。任意選択的に、及び好ましくは、複数のマーカーの濃度は、疾患または状態と相関している。
あるいは、そのような相関関係比較は、任意選択的に、複数のマーカーの各々の濃度を測定すること、複数のマーカーの各々の濃度に基づいた単一指標値を算出すること、及び、指標値と閾値を比較すること、を含んでも良い。また、そのような相関関係比較は、任意選択的に、マーカーのうちの少なくとも１つにおける一時的な変化を測定することを含んでも良く、ここで、当該一時的な変化は、相関関係比較の工程において用いられる。
そのような相関関係比較は、任意選択的に、複数のマーカーのうち少なくとも「Ｘ」個が、既定範囲の外側の濃度を有するか、及び／または閾値を上回るかもしくは下回るか否か（上述）を測定することを含んでも良い。「Ｘ」個の値は、任意選択的に、１つのマーカー、複数のマーカー、または全てのマーカーであっても良く；あるいは、またはさらに、「Ｘ」個の任意のマーカーを計算に入れるよりもむしろ、複数のマーカーのうちの１以上の特定のマーカーが、任意選択的に、疾患または状態と相関することが必要とされても良い（範囲及び／または閾値による）。
相関関係比較は、任意選択的に、２つのマーカーに対するマーカー濃度の比率が、範囲外及び／または閾値を上回るもしくは下回るか否かを測定することを含んでも良い。任意選択的に、もし比率が閾値レベルを上回るもしくは下回る、及び／または、範囲の外側にある場合、比率は、疾患または状態に相関している。任意選択的に、２以上のこれら相関関係の組み合わせを、単一パネルと共に用いても良く、及び／または、複数のパネル間の相関関係比較に用いても良い。任意選択的に、本発明方法は、正常対照と比較した際に、少なくとも７０％の感度、少なくとも８５％の特異度で、疾患または状態を識別する。本明細書において、感度は、存在する陽性サンプルの総数のうちの、陽性（疾患）として検出されたサンプルの数に相関する；特異度は、存在する陰性サンプルの総数のうちの、真の陰性（疾患ではない）として検出されたサンプルの数に相関している。好ましくは、本発明方法は、正常対照と比較した際に、少なくとも８０％の感度、少なくとも９０％の特異度で、疾患または状態を識別する。より好ましくは、本発明方法は、正常対照と比較した際に、少なくとも９０％の感度、少なくとも９０％の特異度で、疾患または状態を識別する。さらにより好ましくは、本発明方法は、疾患または状態の症状を模倣する症状を示している対象と比較した際に、少なくとも７０％の感度、少なくとも８５％の特異度で、疾患または状態を識別する。
マーカーパネルは、当分野で公知の多くの方法で分析されても良い。たとえば、パネルの各要素は、「正常」値と比較されても良く、または、特定の転帰を示す値と比較されても良い。特定の診断／予後予測は、各マーカーとこの値の比較に依存しても良い；あるいは、もしマーカーのサブセットのみが正常範囲の外側にある場合、このサブセットは、特定の診断／予後予測の指標であっても良い。また、当業者であれば、診断マーカー、鑑別診断マーカー、予後予測マーカー、発現時間マーカー、疾患または状態識別マーカーは、単一アッセイまたはデバイスにおいて組み合わされても良いことを認識するであろう。また、マーカーは通常、たとえば、異なる目的（複数含む）に対する異なる閾値、またはマーカーへ異なる重みづけ係数を適用することにより、複数の目的に対して用いることができる。
パネルは、以下の目的に対するマーカーを含有しても良い：疾患の診断；疾患の診断ならびに疾患が急性相にあるかどうかの示唆及び／または疾患の急性発作が発生しているかどうかの示唆；疾患の診断ならびに疾患が非急性相にあるかどうかの示唆及び／または疾患の非急性発作が発生しているかどうかの示唆；急性相と非急性相、または急性発作と非急性発作の組み合わせが発生しているかどうかの示唆；疾患の診断及び、今後の良くない転帰の予後予測；疾患の診断及び、今後急性相と非急性相、または急性発作と非急性発作の予後予測（たとえば癌に対しては、その進行は、たとえば転移の発生または再発が挙げられる）。
上述の診断にはまた、任意選択的に、他の疾患（非固形腫瘍及び固形腫瘍、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、肝臓癌、膵臓癌等が挙げられ、ここで、当該癌は、１以上の類似のまたは同一の症状を特徴としうるものであっても良く、侵襲性または転移性であっても良い）から鑑別するための、疾患の鑑別診断が含まれても良い。
指標（複数含む）の存在の単なる有無により、１以上の診断または予後予測の指標は、疾患または症状と相関している。他の実施形態において、診断または予後予測の指標（複数含む）の閾値レベルは確立されていても良く、患者サンプル中の指標（複数含む）のレベルは、シンプルに、閾値レベル（複数含む）と比較されても良い。診断及び／または予後予測テストの感度及び特異度は、テストの分析的な「質」だけに依存するのではなく、何が異常な結果となるかの定義にも依存する。実際には、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ曲線（または、「ＲＯＣ」曲線）は、通常、「正常」群と「疾患」群におけるその相対頻度に対して可変値をプロットすることにより、及び／または、処置の前後及び／または処置中に対象から得た結果を比較することにより、算出される。
Ａ３３抗原は、癌（たとえば、非固形腫瘍及び固形腫瘍、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、肝臓癌、膵臓癌等であり、ここで、当該癌は、侵襲性または転移性であっても良い）の検出に対するバイオマーカーとして特徴付けられても良い。
本発明は、任意選択的に、及び好ましくは、本明細書に記述されるＡ３３抗原に相当する核酸配列によりコードされる任意のアミノ酸配列、またはその抗体断片を包含する。そのようなアミノ酸配列、またはその抗体断片に関連する任意のオリゴペプチドまたはペプチドもまた、任意選択的に（さらに、またはあるいは）、バイオマーカーとして用いられても良い。
本発明により、ＮＡＴベースのアッセイを用いた、生物学的サンプル中の本発明のポリヌクレオチドを検出する方法が提示され、当該方法には、単離核酸分子またはおよそ最小の長さのオリゴヌクレオチドを、生物学的サンプル中の核酸物質にハイブリダイズすること、及び、ハイブリダイズされた複合体を検出することが含まれ；ここで、ハイブリダイズされた複合体の存在は、生物学的サンプル中のポリヌクレオチドの存在と相関する。方法またはアッセイの非限定的な例を本明細書に開示する。本発明はまた、そのような診断方法またはアッセイに基づいたキットに関するものである。
さらに、本発明のＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片を用いて、膵臓癌及び結腸癌に対する特異的なマーカーとしてＡ３３抗原上の３１．１エピトープを検出しても良く、ならびに、本明細書に記述されるように、生検組織中及び対象の血清中及び対象の糞便サンプル中で測定されても良い。さらに、結腸直腸癌の検出に用いられる診断方法としては、限定されないが、糞便潜血検査（ＦＯＢＴ）、結腸内視鏡検査、大腸ＣＴ検査（仮想結腸内視鏡検査）（結腸内視鏡検査と同じ感度で、６ｍｍの直径よりも大きい結腸直腸の病変部位を検出する）、ファイバースコープＳ状結腸鏡検査、二重造影バリウム中腸検査、及び直腸内触診が挙げられる。Ｗｉｎａｗｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ａｍ Ｊ． Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２： ５９４-６４２； Ｂｌｕｍ （１９９５） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃ． ３１： １３６９-７２； Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ ＆ Ｓａｎｄｌｅｒ （２００２） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４６： ３４６-４４； Ｂｒｕｚｚｉ （２００２） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４６： １６７２-７４；及びＬａｇｈｉ， ｅｔ ａｌ． （２００２） Ａｍ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． １８３： １２４-３１。
免疫アッセイ
Ａ３３抗原に結合するＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、サンプル中のマーカーを、定性的に検出または定量的に検出し、及び分析するための免疫アッセイに用いられても良い。この方法には、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片を提供すること；サンプルと抗体を接触させること；及び、サンプル中のマーカーに結合された抗体の複合体の存在を検出すること、が含まれる。
Ａ３３抗原は、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片を用いた、多くの公知の免疫学的結合アッセイのうちの任意のものを用いて、検出及び／または定量されても良い。有用なアッセイとしては、たとえば、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロットまたはスロットブロットアッセイが挙げられる。たとえば、米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；及び、第４，８３７，１６８号を参照のこと。通常、対象から得たサンプルは、Ａ３３抗原に特異的に結合する抗体と接触されても良い。
任意選択的に、抗体は、抗体とサンプルを接触させる前に、洗浄及び引き続く複合体の単離を容易にするために、固形支持体に固定されても良い。固形支持体の例としては、限定されないが、ガラス、マイクロタイタープレート等の形態のプラスチック、スティック、ビーズ、またはマイクロビーズが挙げられる。抗体は、固形支持体に付着されても良い。
サンプルと抗体をインキュベートした後、混合物を洗浄し、形成された抗体−マーカー複合体を検出しても良い。これは、洗浄された混合物と検出試薬をインキュベートすることにより行うことができる。あるいは、サンプル中のマーカーは、間接アッセイを用いて検出されても良く、ここで、たとえば、第二の標識化抗体を用いて結合されたマーカー特異的抗体を検出するか、及び／または、競合アッセイもしくは阻害アッセイ（たとえば、マーカーの別のエピトープに結合するモノクローナル抗体が、混合物と同時にインキュベートされる）で検出する。
アッセイの間中、インキュベーションの工程及び／または洗浄の工程が、試薬の各組み合わせの後に必要とされる。インキュベーションの工程は、約５秒〜数時間の間で変化しても良く、好ましくは、約５分〜約２４時間である。しかしながら、インキュベーションの時間は、アッセイの形式、マーカー、溶液の量、濃度に依存する。通常、アッセイは、大気温度で行われるが、広い範囲の温度で行われても良い（たとえば、１０〜４０℃）。
イムノアッセイを用いて、対象由来のサンプル中のマーカーの検証量を測定しても良い。第一に、サンプル中のマーカーの検証量は、上述のイムノアッセイ法を用いて検出されても良い。もしサンプル中にマーカーが存在する場合、上述の適切なインキュベーション条件下で、マーカーに特異的に結合する抗体と、抗体−マーカー複合体が形成される。抗体−マーカー複合体の量は、任意選択的に、標準と比較することにより測定されても良い。上述のように、マーカーの検証量は、測定単位が対照の量及び／またはシグナルと比較することができるのであれば、完全単位で測定される必要は無い。いくつかのイムノアッセイが当分野に公知であり、本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は、そのようなイムノアッセイ（限定されないが、放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、速報流動アッセイ、磁性イムノアッセイ、イムノブロット、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、免疫組織化学的分析、及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる）で用いられても良い。Ｗｉｌｄ， （２００８） ［Ｅｄ．］ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ［３ｒｄ Ｅｄ．］ Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照のこと。
放射性イメージング法
Ａ３３抗原に結合するＮＥＯ−３００抗体及びその抗原結合断片は、癌（膵臓癌及び結腸直腸癌を含む）を診断するため、または腫瘍の進行をモニターするための放射性イメージング法に用いられても良い。これら方法としては、限定されないが、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。これら技術の両方が、非侵襲性であり、様々な組織事象及び／または機能を検出及び／または測定するために用いることができる（たとえば、癌性細胞の検出）。ＳＰＥＣＴは、任意選択的に、同時に２つの標識と共に用いられても良い。米国特許第６，６９６，６８６号を参照のこと。
商業的応用及び方法
本発明はさらに、市販できる量をもたらすための、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片の製造に関して開示する。ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は大量生産されても良く、もし必要であれば保存され、及び、病院、臨床医、または他の医療機関に供給されても良い。
ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断の製造、保管及び流通方法は、本明細書に記述される方法により行われても良い。製造の後、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片は回収され、精製され、及び任意選択的に、患者の治療の前に保存されても良い。たとえば、患者が、膵臓癌、結腸直腸癌、食道癌、口腔癌、または乳癌の兆候を示した時点で、ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片が注文され、適宜に提供されても良い。従って、本発明は、市販スケールに抗体が達するよう、Ａ３３抗原を製造する方法、Ａ３３抗原に選択的に結合する抗体及びその抗原結合断片を含有する医薬組成物、ならびに、Ａ３３抗原に選択的に結合する抗体及びその抗原結合断片を病院及び臨床医に提供する方法（すなわち、製造、任意選択的に保存、及び販売すること）に関するものである。ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１、ＮＥＯ−３０２、ＮＥＯ−３０３）またはその抗原結合断片の製造は、市販用途のためにスケールアップされても良い。
本発明はまた、販売のために調製物を流通するための流通システムを確立することを含有する医薬ビジネスを行う方法について開示するものであり、または、医薬品を売買するための販売グループを確立することを含んでも良い。
本明細書において言及されている全ての公表文献（たとえば、非特許文献）、特許、特許出願公開、及び特許出願は、本発明が関与する当分野の当業者のレベルを示唆するものである。そのような公表文献（たとえば、非特許文献）、特許、特許出願公開、及び特許出願は全て、各個々の公表文献、特許、特許出願公開、及び特許出願が具体的に、及び個々に参照により援用されることが示されているのと同程度まで、参照により本明細書に援用される。
以下に、本発明を概説する。以下の実施例を参照することにより、より理解が容易になるが、本発明のある態様及び実施形態を解説する目的のためのみであり、本発明を限定するものではない。
実施例１ Ａ３３抗原の特徴解析
３１．１抗体は、ヒトの結腸癌組織及び膵臓癌組織に反応性であり、Ａ３３抗原に結合すると考えられているが、そのエピトープは不明である。３１．１．抗体により結合される抗原を確認及び特定するために、３１．１抗体の結合に関する様々な条件下で、Ａ３３抗原を検証した。本明細書に検討されるように、３１．１抗体は、ヒトＡ３３抗原に結合することが確認された（ウェスタンブロット、免疫沈降（ＩＰ）、質量分析、ドットプロット、フローサイトメトリー、及びＥＬＩＳＡにより確認された）。さらに、エピトープは合成洗剤に対して感受性であり、ウェスタンブロットにおける還元条件下では陰性の結合結果であったため、非線状である。
対照
Ａ３３抗原発現細胞株は、Ａ３３の全長ｃＤＮＡを含有するベクターをＡ３３陰性ＣＨＯ細胞株へとトランスフェクトすることにより作製した。Ａ３３発現ＣＨＯ細胞が選択され、陽性対照細胞として使用された（Ａ３３−ＣＨＯ）。Ａ３３抗原に結合するＡＳ３３抗体は、ハイブリドーマ細胞から精製された。Ａ３３−ＣＨＯ細胞及びＡＳ３３抗体は、本実験において陽性対照抗体として用いられた。
３１．１抗体は、フローサイトメトリーにおいて、用量依存的にＡ３３−ＣＨＯに結合するが、元々のＣＨＯ細胞には結合しない。異なる濃度の３１．１−ビオチン抗体を、１００□ｌのＡ３３−ＣＨＯまたはＣＨＯ細胞に、９６ウェルプレート、ＰＢＳの１Ｘ１０６細胞／ｍｌで添加し、室温で３０分、インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１００□ｌの希釈したストレプトアビジン−ＦＩＴＣを細胞に添加し、さらに室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、Ｇｕａｖａ Ｅａｓｙｃｙｔｅ機器のＧｕａｖａ ＥｘｐｒｅｓｓＰｒｏプログラムにより分析した。ヒトＩｇＧ−ビオチンをアイソタイプ対照として用いた。結果から、用量依存的に３１．１抗体がＡ３３−ＣＨＯ細胞に結合することが示された。
３１．１抗体は、ＬＳ１７４Ｔ及びＡ３３−ＣＨＯ由来の３１．１ ＩＰ タンパク質中の抗原を検出することができるが、ウェスタンブロットの非還元条件下では、両方の細胞由来のＡＳ３３ＩＰタンパク質中の抗原は検出できない。ＡＳ３３は、ＬＳ１７４Ｔ及びＡ３３−ＣＨＯ由来の３１．１及びＡＳ３３ＩＰタンパク質中の抗原に結合する。しかしながら、３１．１は、ウェスタンブロッティングによる還元条件下では３１．１ＩＰタンパク質を検出できなかったことから、３１．１エピトープは非線状または立体構造であることが推測される。
３１．１抗体はまた、ＤｏｔＢｌｏｔにより特異的に３１．１ＩＰタンパク質を検出することができる。２□ｌの３１．１ＩＰタンパク質をニトロセルロース紙に添加した。紙を空気乾燥した後、ブロック及び洗浄した紙とともに３１．１−ビオチンを３０分間、室温でインキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰを洗浄した紙とさらに３０分間、室温でインキュベートした。洗浄した紙をＥＣＬ試薬と１分間、サランラップ（登録商標）で覆いながらインキュベートし、暗室でＸ線フィルムに曝した。
３１．１抗体捕捉ヒト組換えＡ３３は、サンドイッチＥＬＩＳＡにてＡＳ３３抗体により検出された。プレートを、１０□ｇ／ｍｌの３１．１で、１時間、３７℃でコートし、１％スキムミルク、５ｍＭのＥＤＴＡ−ＴＢＳでブロックした；ＴＢＳＴで洗浄した後、ヒト組換えＡ３３抗原をプレートに添加し、１時間、室温でインキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、異なる濃度のＡＳ３３ビオチンをプレートに添加し、１時間、室温でインキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰを洗浄したプレートに添加し、さらに１時間、室温でインキュベートした。ＴＭＢを２０分間、室温で洗浄したプレートに添加した。反応を停止させるために１ＮのＨＣＬを添加した後、ただちに４５０ｎｍでプレートを読み取った。結果から、３１．１捕捉Ａ３３抗原は、ＡＳ３３抗体で検出することができる抗原を含有していることが示され、このことから、３１．１及びＡＳ３３抗体は、Ａ３３抗原の異なるエピトープを標的としていることが示唆される。
Ａ３３抗原の特徴解析
熱処理：５μｌ（マイクロリットル）のｄｄＨ２Ｏ希釈ＬＳ１７４Ｔ ３１．１ＩＰタンパク質（１：１希釈）をＰＣＲチューブに移す；全部で５本のチューブである。４本のチューブを、前もって１００℃に温めておいたＰＣＲマシンのウェルへと置き、１本のチューブをそれぞれ、５、１５、３０及び６０分の時間で回収した。加熱していないチューブは、０分である。
プロテアーゼ消化：３μｌのプロテアーゼＥ（１ｍｇ／ｍｌ）またはｄｄＨ２Ｏと、３μｌのＬＳ１７４Ｔ ＩＰタンパク質を混合し、３７℃で２４時間、混合部物をインキュベートする。ｄｄＨ２Ｏ処置は、対照として用いた。過ヨウ素酸酸化に関しては、２μｌの４０ｍＭ過ヨウ素酸酸化物（５０ｍＭの酢酸ナトリウムに溶解）と、２μｌのＬＳ１７４Ｔ ３１．１ＩＰタンパク質を混合し、室温で６０分間、混合物をインキュベートした。５０ｍＭの酢酸ナトリウムは、消化緩衝液対照として用いた。２ＭＥ及びＤＴＴ処置に対しては、１μｌの２−ＭＥまたは１μｌのＤＴＴ（１Ｍ）を４μｌのＬＳ１７４Ｔ ３１．１ＩＰタンパク質へと添加し、９５℃で５分間、混合物をインキュベートした。ｄｄＨ２Ｏは対照として用いた。
処置サンプルは、ＤｏｔＢｌｏｔにより検証した。２μｌの処置された３１．１ＩＰタンパク質をニトロセルロース紙に添加した。紙を空気乾燥した後、ブロック及び洗浄した紙とともに３１．１−ビオチンを３０分間、室温でインキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰを洗浄した紙とともに３０分間、室温でインキュベートした。洗浄した紙をＥＣＬ試薬と１分間、サランラップ（登録商標）で覆いながらインキュベートし、暗室でＸ線フィルムに曝した。ＬＳ１７４Ｔ ３１．１ＩＰタンパク質は、本ＤｏｔＢｌｏｔ実験の陽性対照として用いた。結果から、３１．１抗原は熱抵抗性であり（９９℃、５分）、ならびに、プロテアーゼ、過ヨード酸化、及び還元試薬（２−ＭＥ及びＤＴＴ）の処置に対し感受性であることが示された。３１．１抗原は、タンパク質であり、ジスルフィド結合が、３１．１抗体により認識される構造の維持には必要であることが示唆された。
３１．１抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡ及びＩＨＣ染色において、マウス組換えＡ３３と交差反応しない。ウェスタンブロット実験から、３１．１標的抗原は、約３７〜５０ｋＤの分子量を有していることが示唆される。さらに、ＬＳ１７４Ｔ由来の３１．１ＩＰタンパク質の質量分析の結果から、Ａ３３が、標的タンパク質である可能性が示唆された。３１．１ＩＰタンパク質サンプルは、２つの４〜１５％のプレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離された。３７ｋＤと５０ｋＤの間のバンドを１つのゲルから質量分析のために切り出し、もう一つのゲルは３１．１−ビオチンのプローブを用いたウェスタンブロットに使用した。
Ａ３３抗原上の３１．１エピトープの特定
以下は全長Ａ３３アミノ酸配列及びＬＳ１７４Ｔ ＩＰタンパク質由来のペプチドであり、強調されている部分は、３１．１モノクローナル抗体により結合されるＬＳ１７４Ｔ ３１．１ＩＰ由来のペプチド配列を示す（Ａ３３の全配列の３９％の範囲が特定された）（予測３１．１エピトープは太字）。

1 MVGKMWPVLW TLCAVRVTVD AISVETPQDV LRASQGKSVT LPCTYHTSTS SREGLIQWDK
61 LLLTHTERVV IWPFSNKNYI HGELYKNRVS ISNNAEQSDA SITIDQLTMA DNGTYECSVS
121 LMSDLEGNTK SRVRLLVLVP PSKPECGIEG ETIIGNNIQL TCQSKEGSPT PQYSWKRYNI
181 LNQEQPLAQP ASGQPVSLKN ISTDTSGYYI CTSSNEEGTQ FCNITVAVRS PSMNVALYVG
241 IAVGVVAALI IIGIIIYCCC CRGKDDNTED KEDARPNREA YEEPPEQLRE LSREREEEDD
301 YRQEEQRSTG RESPDHLDQ (配列番号１０)
３１．１抗体はＬＳ１７４Ｔ及びＡ３３−ＣＨＯ由来の３１．１ＩＰタンパク質中の抗原を検出したが、非還元条件下のウェスタンブロットにおいては、両細胞由来のＡＳ３３ＩＰタンパク質中の抗原を検出しなかった。ＡＳ３３は、ＬＳ１７４Ｔ及びＡ３３−ＣＨＯ由来の３１．１及びＡＳ３３ＩＰタンパク質中の抗原に結合したことから、３１．１及びＡＳ３３抗体は、Ａ３３抗原の異なるエピトープを標的としていることが示唆される。３１．１抗体は還元条件下で３１．１ＩＰタンパク質を検出しないので、３１．１抗体のエピトープは非線状エピトープであることが示唆される。
ゆえに、３１．１抗体により結合されるＡ３３抗原上のエピトープは、９９℃、５分間、１５分まで熱抵抗性であることが判明したが、結合は、加熱の３０〜６０分後に消失した。３１．１抗原をさらに、プロテアーゼ処置及び過ヨウ素酸酸化処置により特徴解析を行った。結果から、３１．１抗原はプロテアーゼ及び過ヨウ素酸酸化に感受性のタンパク質であることが示唆される。３１．１抗原は、ウェスタンブロット及びドットブロットにおいて、２−メルカプトエタノール及びＤＴＴ（両方とも公知の還元剤）に対し感受性であることが判明している。それゆえ、Ａ３３抗原上の３１．１抗体により結合される３１．１エピトープは、ウェスタンブロット及びドットブロットにおいて、２−ＭＥ及びＤＴＴを用いた還元条件下でバンドが消失したことから、非線状エピトープであると考えられる。
３１．１抗体に結合されるＡ３３抗原上のエピトープは、脱グリコシル化に対して感受性ではないことが、Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ及びノイラミニダーゼを用いた処理により判明した。対照的に、ＮＰＣ−１抗原は、シアリダーゼ及びノイラミニダーゼ処理の両方に対し感受性である。脱グリコシル化の結果から、３１．１エピトープへの３１．１抗体の結合に、糖部分は関与していないことが示唆される。
実施例２ 免疫原性腫瘍特異的タンパク質に対するモノクローナルＮＥＯ３００抗体
本明細書に記述されるＮＥＯ−３０１抗体は、実施例１に記述されるヒトの癌において発現される免疫原性腫瘍タンパク質（Ｔｕｍｏｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎｓ／ＴＳＡ）に対して開発された。本明細書に記述されるＮＥＯ−３０１抗体は、診断マーカーとしてＡ３３の早期認識に用いられても良く、及び、主にＡＤＣＣを介して腫瘍を崩壊させるため、そのマーカーを標的とするよう用いられても良い。本明細書に記述されるＮＥＯ−３００抗体は、結腸直腸癌及び膵臓癌の検出及び治療に用いられても良い（たとえば、ＮＥＯ−３００抗体は、癌及び膵臓腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する）。ＮＥＯ−３００抗体、すなわち、マウス３１．１は、大部分がＩｇＧ２ａ抗体であると思われた。ＮＥＯ−３０１抗体に、キメラ化（ＮＥＯ−３０１）及びヒト化（ＮＥＯ−３０２）を施した。得られたモノクローナル抗体は、キメラ化またはヒト化の後に、ＣＨＯ細胞で発現された際、そのアイソタイプをＩｇＧ１へとスイッチした。これらキメラ化モノクローナル抗体は、腫瘍増殖の制御において有効性を増しただけではなく、ＨＡＭＡ反応の発現を最小化した。腫瘍細胞膜上で発現されている公知の確定した免疫原性タンパク質の標的化という点において、ＮＥＯ−３００抗体（キメラ化ＮＥＯ−３００）は特異的であり、正常組織に対する交差反応は無く、静脈内投与された際の毒性は比較的低く、腫瘍細胞群を速やかに攻撃し（ｉｎ ｖｉｔｒｏで４〜６時間）、異種移植片を、投与の数日以内に破壊した（ｉｎ ｖｉｖｏ）。さらに、たとえばＧＭＣＳＦ及びＩＬ−２（融合タンパク質）等の免疫賦活物質とＮＥＯ−３００抗体を混合させること、または、ＮＥＯ−３００抗体とα放射体及びβ放射体を結合することが可能である。
治療用の高用量で静脈内投与された際に、キメラ化ＮＥＯ−３００抗体またはヒト化ＮＥＯ−３００抗体（たとえば、ＮＥＯ−３０１）は、ＩＶ投与の数時間以内に腫瘍の破壊を誘導することができる。それらは１０日を超える半減期で循環し、１０：１を超える局在性指標を示す（腫瘍に固定されたモノクローナル抗体の濃度は、循環系に留まっているものよりも１０倍以上高い）。
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の測定に使用される方法
４時間の５１Ｃｒまたは１１１Ｉｎリリースアッセイを用いて、抗体依存性細胞毒性を測定した。標的細胞（結腸癌、膵臓癌、または肺扁平上皮癌細胞株のいずれか）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） ｉｎ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤから入手した。標的細胞は、２００μＣｉの５１クロム酸ナトリウム、または、同等の放射性標識されたインジウム（０．２ｍｌのウシ胎児血清に溶解）を用いて、１時間、標識した。標識細胞（１ｘ１０４／５０μｌ）を、エフェクター単核細胞を含有する９６Ｕ底ウェルアッセイプレートに添加した。エフェクターと標的細胞の比率は、１００、５０及び２５であり、ＮＥＯ−３０１モノクローナル抗体の存在下で分析し、通常のＩｇＧモノクローナル抗体（濃度は２．５〜５．０μｇ／ウェル）と比較した。プレートは、５％ＣＯ２を含有する湿潤な環境下で、３７℃、４時間、インキュベートした。Ｓｋａｔｒｏｎ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｆｒａｎｍｅｓを用いたガンマ測定のために上清を回収した。実験は、３重で行った。特異的溶解を算出した。５．０□ｇ／ウェルのＮＥＯ−３０１抗体が最適な結果をもたらし、及び、１００：１のＥ：Ｔ比が、４〜６時間にわたり、最も高い範囲で腫瘍の破壊をもたらしたことが判明した。自然放出は、培地のみでインキュベートした標的細胞から放出された放射能を測定することにより決定された。放出可能なトータルの放射能は、２．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処置した後に得た。データを表形式にする他の方法は、「溶解単位」を単位としたものである。１溶解単位は、６時間で５×１０３の標的細胞群が溶解するために必要とされる細胞数として定義し、その単位を算出する。次いで、溶解単位の値は、平均±平均の標準誤差として表される。ＭＴＴアッセイは、細胞増殖（細胞の成長）を測定するための、標準的な比色アッセイ（色の変化を測定するアッセイ）を用いた抗体細胞毒性に対する類似の実験テストである。紫色のホルマザンへと酸化された黄色のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）の量（図を参照）を、分光光度計側により測定した。この酸化は、ミトコンドリアの還元酵素が活性である場合にのみ発生し、ゆえに、転換は、生きている細胞の数に直接関連している。剤で処置した細胞中の紫色のホルマザンの産生は、対照細胞における産生と比較して測定され、用量応答曲線を作成することができる。
これらの方法により、染色機能の強度、及び、関連細胞表面の標的抗原を発現している反応細胞の％を正確に定量するための機能が提供される。モノクローナル抗体の結合は、実験される腫瘍群で変化するが、ＮＥＯ−３０１抗体の組み合わせによって、優れた応答をもたらすよう、腫瘍認識を最適化することができることが示されている。ＡＤＣＣは、ＮＥＯ−３０１抗体が、５０〜６０％以上の腫瘍細胞破壊率と関連していたことを示す、腫瘍細胞毒性に対するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイとして用いた。このプロセスは、４〜６時間にわたり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発生していたことが判明した。腫瘍細胞の破壊率は、クロムまたはインジウムのリリースアッセイにより検証した。
糖の能力分析において、結腸癌細胞においてアポトーシスを誘導するＣＡ１７．１Ａ等のモノクローナル抗体が、ＮＥＯ−３０１（Ａ３３抗原上の３１．１エピトープと結合する）と比較された。結果は図３に示す。
いくつかの腫瘍型及び対照に対するＡＤＣＣ応答の特異性を評価するために、ＮＥＯ−３０１、ＣＡ１９．９（膵臓腫瘍ならびに一部の結腸直腸病変において活性を示す糖モノクローナル抗体）及びＵＰＣ−１０（対照として用いたミエローマ抗体）を、膵臓癌細胞株及び結腸癌細胞株の溶解活性に対し検証した。
Figure 0006576831
Figure 0006576831
ＮＥＯ−３０１（キメラ化ＮＥＯ−３００）により惹起される臨床応答に対する可能性を評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルを設計した。マウスにおいて、完全に樹立された腫瘍に対する抗体の効果を評価するために、治療状況を用いた。対照動物（ヌードマウス）は、ヒト結腸腺癌または膵臓腺癌（ＡＴＣＣより入手）のいずれかを２百万個、動物の後肢に注射することによりプライムした。腫瘍増殖の発現及び進行に対し、各動物（７匹／群）を実験した。注射の１０日後、臨床腫瘍質量は直径で２〜３ｃｍから発現し、１０〜１５日以内に、各動物は跛行し、機能に困難を有するまで進行した。数週後、各動物は、末期前の様相を呈した。次いで、確立された腫瘍質量の退縮を示すことによる、モノクローナル抗体の腫瘍増殖制御の能力を検証するため、実験を繰り返した。群を分け、脚に皮下注射によって上述の２百万個の癌細胞を投与した。実験の１０日目に、１つの群において、ヒトエフェクター細胞と非特異的ヒトＩｇＧを４００μｇ、腹腔内投与で与えた。これは、エフェクター細胞の存在下で、増殖ヒト腫瘍に対しアポトーシスを誘導するＩｇＧ非特異的活性を除外するための陰性対照として行われた。抗体の２回目の注射は、１１日目に行われた。腫瘍細胞を投与された第二群には、エフェクター細胞の潜在的な利益を伴わない、治療抗体ＮＥＯ−３０１を投与した。この第二群は、ＮＫ細胞活性以外の何らかの別のメカニズムが腫瘍破壊を誘導するかどうかを評価するために行われた。第三群は、モノクローナル抗体と、ヒトエフェクター細胞の両方の腹腔内投与を受けた。適切なモノクローナル抗体が無い場合、ヒトエフェクター細胞と非特異的ヒトＩｇＧを併用しても、腫瘍増殖に影響が無いこと、及び、動物の大腿に現れた塊は増殖を続けたことが容易に明らかになった。エフェクター細胞無しに投与された治療モノクローナル抗体は、腫瘍増殖を何らかの能力で制御したことから、「第二の」、しかしＡＤＣＣよりも劣るメカニズムが作用したことが示唆される。ＮＥＯ−３００抗体は、アネキシンＶ結合により特徴付けられるアポトーシスを誘導するＴＲＡＩＬリガンドとして二番目に作用しうる。より詳細な動物実験を行い、ＮＥＯ−３０１抗体単独、及びエフェクター細胞と組み合わせた場合の、ＡＤＣＣにおける初期機能を含む、多くの異なる手段を介した腫瘍破壊誘導を評価した。図４、５及び６を参照のこと。
アネキシンＶ結合により特徴付けられるアポトーシス誘導に対するＮＥＯ−３０１の効果を検証した。細胞が死亡するとき、アポトソームによりＤＮＡが破壊される直前、ホスホイノシチルセリンが腫瘍細胞膜表面に移送され、そこで蛍光シグナルでタグ化されたアネキシンＶに結合する。
図４ ＮＥＯ−３０１モノクローナル抗体の代わりに通常のＩｇＧを用いた対照を表す。
図５ ＮＥＯ−３０１モノクローナル抗体をヒトエフェクター細胞の非存在下で投与した際に観察された腫瘍増殖の減速を表す。
図６ ヒトエフェクター細胞と組み合わせて投与されたＮＥＯ−３０１モノクローナル抗体の、ヒト腫瘍増殖の減速に対する能力を示す。
処置及び未処置の膵臓癌細胞を、アネキシンＶ結合の程度に対して比較することで、ホスホイノシチルセリンの細胞膜外側への移動が結果として認められた。未処置群は約１８．２２％のアポトーシス率であったことが、検証データから示された。処置群では、アポトーシス細胞は、３６．８３％にまで増加した。
ＶＥＧＦ発現に対するＮＥＯ−３０１の効果を検証し、これら表面増殖因子のレベルにおける有意な減少は、ハーセプチンで見られるものと類似していることが示された（表６）。
Figure 0006576831
これらの結果に基づくと、単独または化学療法剤と組み合わせたＮＥＯ−３００抗体は、標準的な化学療法には不応な癌の治療に有用である可能性がある。さらに、ＮＥＯ−３００抗体は、たとえばＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）等の哺乳類細胞株において、１０００ｍｇ／Ｌのバイオリアクター液（ウシ胎児血清を含有しない）を超えて産生することができる。両プラスミドベクターは、エンハンサー欠損ＳＶ４０早期プロモーターにより誘導されるｄｈｆｒ発現ユニットを担持している。ベクターは、ほぼ血清フリーの培地（１□ｇ／ｍｌのＭＴＸを補充されている）中で、ＣＨＯ−Ｄ−ＳＦＭ（ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）欠損チャイニーズハムスター卵巣）へと挿入される。産生の最後、細胞は、抗体の最終精製の前に、血清フリー培地へ適応されなければならない。
ＮＥＯ−３０１（キメラ化ＮＥＯ−３００）を用いた、膵臓癌から肝臓への転移に対する、１人の患者の実験において、ＨＡＭＡ応答は、処置前レベルとは対照的に、最小限の上昇となった。２５〜５０ｍｇＩＶでのキメラ化モノクローナル抗体の２回の投与の後、Ｃａ１９．９に対する血清マーカーは、３０００Ｕから３００Ｕへと低下した。治療前のＨＡＭＡは、モノクローナル抗体の投与前、５ｎｇ／ｍｌであったが、第二及び最終投与の２週後、７ｎｇ／Ｌに上昇した。さらに、ＮＥＯ−３０１抗体は、最小のＨＡＭＡ応答及び高レベルのＡＤＣＣを示している。ゆえに、約２００〜４００ｍｇのＮＥＯ−３００抗体用量が、患者に対し２週毎、Ｉ．Ｖ．で投与され、及び、転移性膵臓癌または結腸直腸癌の制御に有効でありうる。
実施例３
本実施例において、前述の実施例におけるキメラ化３１．１抗体（ＮＥＯ−３０１）のヒト化を記述する。ヒト化は、治療目的または診断目的でヒトにｉｎ ｖｉｖｏで用いられた際の免疫応答誘導のリスクが低い抗体を産生するために行われた。
４つのヒト化重鎖配列を作製し（図１Ａ〜Ｄに示す）、４つの軽鎖配列を作製した（図２Ａ〜Ｄに示す）。それぞれに対するコード配列を合成し、ＰｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにサブクローニングした。
３１．１スクリーニング方法
ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、ｒＨ−ＧＰＡ３３結合ＥＬＩＳＡ、細胞フローサイトメトリー（ＬＳ１７４ＴまたはＡｓＰＡＣ１）、ＩＨＣ染色（ＬＳ１７４Ｔ ＦＦＰＥ、腫瘍ＦＦＰＥ、及び凍結腫瘍切片）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色をスクリーニングに用いた。培養上清中の抗体をカラム中のプロテインＡ／Ｇ精製により精製し、３回透析した後にＰＢＳ緩衝液中に溶解した。抗体の分注物を、保存のために−２０℃に維持した。
異なる設計のヒト化３１．１ＨＣ及びＬＣの組み合わせを含有する１６の抗体を、さらにＡ−３１．１構築物、キメラ３１．１、及びマウス３１．１と共に検証した（以下の表５に示される）。各組み合わせは、Ｅｘｐｉ２９３発現システムキット（Ｇｉｂｃｏ， ｃａｔ＃ Ａ１４６３５）を用いることによる一過性のトランスフェクションによって産生した。２ｍＬの一過性トランスフェクション物から採取した６日間培養上清を、それら抗体の機能の検証のための最初のスクリーニングに使用した；キメラ３１．１ ロット＃３３１０を、標準として使用した。ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、ｒＨ−ＧＰＡ３３結合ＥＬＩＳＡ、ＬＳ１７４Ｔ細胞フローサイトメトリー、ＬＳ１７４Ｔ ＦＦＰＥ切片に対するＩＨＣ染色及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色法を、最初のスクリーニングに用いた。異なる組み合わせ由来の抗体産生及びスクリーニング結果を、表５に要約する。３１．１Ｃａｔａｌｅｎｔ ロット＃３３１０は、キメラ３１．１であり、陽性対照として用いられている。
Figure 0006576831
Ａ−３１．１及びキメラ化３１．１を除き、ヒト化ＩｇＧの産生は、１６５．５ｕｇ／ｍＬ〜８２６．２ｕｇ／ｍＬで変化した。１０２ｕｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを得た。ｒＨＧＰＡ３３結合ＥＬＩＳＡ及びＬＳ１７４Ｔフローサイトメトリーにより検証されたキメラ化３１．１ロット３３１０と同等の結合能力が、４つの異なるＬＣとｃｄｒ−ＨＣ、ａｂｂ−ＨＣ及びｖｅｎ−ＨＣの組み合わせに認められた（ｓｄｒ−ＨＣを除く）。
ＬＳ１７４Ｔ ＦＦＰＥ組織ブロック上の陽性の染色は、ａｂｂ−ＨＣおよびａｂｂ−ＬＣからの上清を除き、少数の上清において低い再現性をもって得られた。
最初のスクリーニング結果に基づいて、抗体＃５（ａｂｂ３１．１−ＨＣ＋ｃｄｒ３１．１−ＬＣ、すなわち、配列番号７５及び８４）及び抗体＃６（ａｂｂ３１．１−ＨＣ−ａｂｂ３１．１−ＬＣ、すなわち、配列番号７５及び８５）を、さらなる特徴解析に選択した。追加の抗体は、２４０ｍＬ量の一過性トランスフェクション（各々、１２０ｍＬＸ２のフラスコ）により産生した。＃５と＃６を選択した理由は、両抗体とも、比較的高い抗体産生量があり、中程度のｒＨ−ＧＰＡ３３結合で、及びフローサイトメトリーにおけるＭＦＩで、ＦＦＰＥ ＬＳ１７４Ｔ切片に対し、ＩＨＣ染色が行われたからである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色は、精製抗体＃５と＃６、及びビオチニル化＃５と＃６の純度及び完全性を検証するために用いた。図７に示されるように、これら抗体は非還元条件下（左）では良い純度であり、全ての検証された抗体について、還元条件下（右）では、軽鎖及び重鎖の完全性が示された。
ヒト化３１．１＃５、＃６及びビオチニル化＃５、＃６の機能は、ｒＨ−ＧＰＡ３３結合 ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーにより検証された。キメラ化３１．１及びマウス３１．１は対照として用いた。結合ＥＬＩＳＡから得られた結果を図８に示す。ｈ３１．１＃５とキメラ３１．１は、結合ＥＬＩＳＡにおいて同じ結合能力であり、膵臓細胞株（ＡｓＰＣ−１）及び結腸癌細胞株（ＬＳ１７４Ｔ）の両方でのフローサイトメトリーにより確認された。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける両機能からの結果を表６に要約する。
Figure 0006576831
ＩＨＣ染色は、ビオチニル化ｈ３１．１＃５及び＃６で行われた。キメラ３１．１と同様に、結腸癌及び小腸癌ＦＦＰＥ組織ブロックに対する結合は無かった。
ｈ３１．１特徴解析及び機能解析の第二ラウンドを検証した後、＃５において凝集があったこと、及び、ＦＦＰＥ組織ブロックに対するＩＨＣ染色における３１．１の結合は無かったことが確認された。一過性トランスフェクションの第三ラウンドを実行し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方での機能解析に十分な量のヒト化３１．１を産生した。
＃１１及び＃１６の組み合わせからのｈ３１．１の機能解析
動物実験を含む完全な機能分析を行うための十分な量のヒト化３１．１物質を得るために、結合ＥＬＩＳＡにおける高アフィニティ及びフローサイトメーターに基づき、重鎖と軽鎖ベクターのｈ３１．１抗体＃１６の組み合わせ（ｖｅｎ３１．１−ＨＣ＋ｖｅｎ３１．１−ＬＣ、すなわち、配列番号７７及び８７）を選択し、４８０ｍＬの一過性トランスフェクションに用いた（２４０ｍＬＸ２のフラスコ）。一過性トランスフェクションの第一ラウンドから得た結果により、対照として、３１．１抗体＃１１（ｓｄｒ３１．１−ＨＣ＋ｓｄｒ３１．１−ＬＣ、すなわち、配列番号７６及び８６）を、一過性トランスフェクションに用いた；結合ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーにおける結合活性を伴わない、高産生量を得た。
プロテインＡ／Ｇ精製の後、ｈ３１．１抗体＃１１及びｈ３１．１抗体＃１６において凝集は観察されなかった。トータルで１４９．６ｍｇのｈ３１．１抗体＃１６（４．４ｍｇ／ｍＬｘ３４ｍＬ）及び１２１ｍｇのｈ３１．１抗体＃１１（５．５ｍｇ／ｍＬｘ２２ｍＬ）が産生された。抗体の純度及び完全性は図９に示す；左は非還元条件、右は還元条件である。マウス３１．１及びキメラ３１．１ロット＃３３１０は基準として用いた。
ｒＨ−ＧＰＡ３３結合ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーにおいて、ヒト化ｈ３１．１抗体３１．１＃１６と、キメラ化３１．１抗体ロット＃３３１０は、同等の用量依存性結合アフィニティが観察された（ＥＬＩＳＡの結果は図１０に、フローサイトメトリーの結果は表７に示す）。
Figure 0006576831
フローサイトメトリーによる、ＡｓＰＣ−１細胞への代表的な３１．１結合を図１１に示す（濃度は５０００ｎｇ／ｍＬ（最も右の曲線）、１８５ｎｇ／ｍＬ（左から３番目の曲線）、及び２０．６ｎｇ／ｍＬ（左から２番目の曲線）、及びヒトＩｇＧ対照（赤、最も左））。
マウス３１．１、キメラ化３１．１、及びヒト化３１．１を用いたＦＦＰＥ腫瘍組織切片のＩＨＣ染色は陽性が無かったことから、我々の従前の発見が裏付けられた。ＩＨＣ染色の陽性は、これら３つの抗体を凍結腫瘍切片に適用した際に観察された。同等の結果は、マウス３１．１、キメラ化３１．１、及びヒト化３１．１抗体＃１６、ヒト化３１．１抗体＃１１を陰性対照として用いた中でも観察された。生データ、図、及び結果の要約を表８及び図１２に列記する。
Figure 0006576831
キメラ化抗体３１．１と併せて、抗体＃６及び抗体＃１６の組み合わせ由来のｈ３１．１の腫瘍殺傷機能は、陰性対照としてヒトＩｇＧを、標的細胞として膵臓癌細胞株ＡｓＰＣ−１を用いたＡＤＣＣアッセイにより検証した。図１３に示されるように、同様の腫瘍特異的溶解が、キメラ化３１．１と比較して、抗体＃１６及び＃６から得られたことから、３１．１のヒト化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの３１．１の結合機能及びＡＤＣＣ機能に悪影響を与えないことが示唆される。
Ｈ３１．１のｉｎ ｖｉｖｏのＡＤＣＣ機能を、ｈ３１．１抗体＃１６を用いてＡｓＰＣ−１異種移植マウスモデルで検証した。有意な腫瘍体積の減少は、ＰＢＭＣ注射の後の３つの抗体注射の後、７日以内に、Ｈ ＩｇＧ及びＰＭＢＣの注射と比較して、６日目から２３日目までにｐ値（０．０４７から０．００３に変化）と共に得られた（図１４）。
全ての公表文献、特許及び特許出願は、各個々の公表文献、特許、特許出願が具体的に、及び個々に参照によりその全体で援用されることが示されているのと同程度まで、参照によりその全体で本明細書に援用される。
当業者であれば、日常的な実験を超えずに、本明細書に記述される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識、または確定することができるであろう。そのような均等物は、以下のクレームに包含されることが意図される。

Claims (21)

  1. 以下を含有するＡ３３抗原に結合する、単離抗体またはその断片：
    ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含有する重鎖、及び配列番号８７の軽鎖アミノ酸配列、
    ｂ）配列番号７４のアミノ酸配列を含有する重鎖、及び配列番号８４の軽鎖アミノ酸配列、
    ｃ）配列番号７５のアミノ酸配列を含有する重鎖、及び配列番号８５の軽鎖アミノ酸配列、
    ｄ）配列番号７６のアミノ酸配列を含有する重鎖、及び配列番号８６の軽鎖アミノ酸配列、
    ｅ）配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８２、７９、８０、または８１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する重鎖、ならびに、配列番号８８、８９、または９０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９１または９２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９３のＣＤＲ３アミノ酸配列、を含有する軽鎖、
    ｆ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｇ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｈ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｉ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｊ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｋ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｌ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｍ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｎ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｏ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｐ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｑ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｓｅｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｒ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｓ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｔ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｕ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）に包含される３つのＣＤＲを含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）に包含される３つのＣＤＲを含有する軽鎖、
    ｖ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７７のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８７のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｗ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７４のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８４のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｘ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７４のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８５のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｙ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７４のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８６のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｚ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７４のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８７のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ａａ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７５のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８４のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｂｂ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７５のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８５のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｃｃ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７５のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８６のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｄｄ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７５のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８７のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｅｅ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７６のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８４のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｆｆ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７６のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８５のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｇｇ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７６のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８６のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｈｈ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７６のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８７のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｉｉ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７７のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８４のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｊｊ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７７のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８５のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｋｋ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣの可変鎖（配列番号７７のアミノ酸１〜１１８）を含有する重鎖、及び、抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣの可変軽鎖（配列番号８６のアミノ酸１〜１０７）を含有する軽鎖、
    ｌｌ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）の軽鎖ポリペプチド、
    ｍｍ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）の軽鎖ポリペプチド、
    ｎｎ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）の軽鎖ポリペプチド、
    ｏｏ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）の軽鎖ポリペプチド、
    ｐｐ）抗体ｃｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７４）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）の軽鎖ポリペプチド、
    ｑｑ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）の軽鎖ポリペプチド、
    ｒｒ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）の軽鎖ポリペプチド、
    ｓｓ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）の軽鎖ポリペプチド、
    ｔｔ）抗体ａｂｂ３１．１−ＨＣ（配列番号７５）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）の軽鎖ポリペプチド、
    ｕｕ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）の軽鎖ポリペプチド、
    ｖｖ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）の軽鎖ポリペプチド、
    ｗｗ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）の軽鎖ポリペプチド、
    ｘｘ）抗体ｓｄｒ３１．１−ＨＣ（配列番号７６）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｖｅｎ３１．１−ＬＣ（配列番号８７）の軽鎖ポリペプチド、
    ｙｙ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｃｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８４）の軽鎖ポリペプチド、
    ｚｚ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ａｂｂ３１．１−ＬＣ（配列番号８５）の軽鎖ポリペプチド、または、
    ａａａ）抗体ｖｅｎ３１．１−ＨＣ（配列番号７７）の重鎖ポリペプチド、及び抗体ｓｄｒ３１．１−ＬＣ（配列番号８６）の軽鎖ポリペプチド。
  2. 配列番号１０、１１、１２、または１３のうちの１以上のアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１に記載の単離抗体またはその断片。
  3. 抗腫瘍活性を有し、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ３抗体であり、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ、パラトープもしくは抗原に結合することができる抗体の一部であり、標識物、細胞毒性剤、治療剤もしくは免疫抑制剤に直接的、または間接的に結合されている、及び／または、前記抗体は、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣを強化する、及び／または、抗体、標識物、細胞毒性剤、治療剤、もしくは免疫抑制剤と組成物中で混合され、抗体、標識物、細胞毒性剤、治療剤、もしくは免疫抑制剤と組み合わせて同時にまたは連続的に投与される、請求項１または２に記載の単離抗体またはその断片。
  4. （ｉ）前記標識物は、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、または放射性標識であり；（ｉｉ）前記標識物は、アルミニウム、マンガン、プラチナ、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムであり；（ｉｉｉ）前記細胞毒性剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質合成を阻害する部分、放射性核種、リボソーム阻害タンパク質、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、ビンデシン、メトトレキサート、アドリアマイシン、シスプラチン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、緑膿菌外毒素Ａ、リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、または細胞毒性ホスホリパーゼ酵素であり；（ｉｖ）前記治療剤は、リンホカインまたは増殖因子であり；及び／または、（ｖ）前記免疫抑制剤は、シクロスポリン、レフルノミド、メトトレキサート、アゾチプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、タクロリムスまたはシロリムスである、請求項３に記載の単離抗体またはその断片。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を含有する組成物。
  6. 薬学的に受容可能な担体をさらに含有する、請求項５に記載の組成物。
  7. 癌を予防または治療するための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または組成物の使用。
  8. （ｉ）前記医薬は、他の抗体、リンホカイン、または造血増殖因子と組み合わせて同時に、または連続的に、使用するための医薬であり；（ｉｉ）前記抗体は、患者において癌の増殖または複製を減速させ、患者において癌細胞を殺傷し、及び／または、患者において、腫瘍退縮を促進するものであり；（ｉｉｉ）前記癌は、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌であり；（ｉｖ）前記癌は、ステージ１、２、３、または４であり；（ｖ）前記癌は転移性であり；（ｖｉ）前記患者は、検出可能なレベルの３１．１エピトープを発現しており；及び／または（ｖｉｉ）前記患者は、癌のリスクがあるか、または症状を有していない、請求項７に記載の使用。
  9. 腫瘍サンプル、リンパ、尿、脳脊髄液、羊水、炎症性滲出部、血液、血清、糞便、または消化管から採取した液体中の３１．１エピトープを検出し、それにより、前記腫瘍が、前記抗体に結合する細胞を含有することを決定することをさらに含む、請求項７または８に記載の使用。
  10. （ａ）３１．１エピトープと結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片と、検証サンプルを接触させること、及び、
    （ｂ）抗体−エピトープ複合体を検出すること、
    を含む、３１．１エピトープ検出方法であって、
    ここで、前記エピトープの存在は、癌の指標である、前記方法。
  11. 前記検証サンプルが、癌のリスクのある患者及び／または症状を有していない患者から得られる、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記方法が、結腸直腸ポリープ、良性腫瘍、悪性腫瘍、転移性腫瘍、非転移性腫瘍、及び／または、前癌性細胞を検出する、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記抗体または断片が、標識物、化学発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、蛍光標識、生物発光標識、放射性標識、アルミニウム、マンガン、プラチナ、酸素、ランタン、ルテチウム、スカンジウム、イットリウム、またはガリウムに結合されている、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記癌が、肺癌、乳癌、膵臓癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、または肝臓癌である、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記抗体−エピトープ複合体は、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、側方流動アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫組織化学アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及びプロテインＡ免疫アッセイからなる群から選択されるアッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏで検出される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法に使用するための組成物であって、３１．１エピトープと結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含み、工程（ａ）は、前記患者に抗体を投与することを含む、前記組成物。
  17. 前記抗体−エピトープ複合体は、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、ＣＣＤ低照度モニタリングシステム、Ｘ線、ＣＴスキャン、シンチグラフィー、光音響画像化、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波、常磁性画像化、及び、内視鏡光コヒーレンス断層撮影からなる群から選択される方法によりｉｎ ｖｉｖｏで検出される、請求項１６に記載の組成物。
  18. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体もしくはその断片、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする単離核酸。
  19. 前記核酸が、ベクターまたは宿主細胞内に含有されている、請求項１８に記載の単離核酸。
  20. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の作製方法であって、前記抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする核酸を細胞またはセルフリー翻訳システム中で発現させることを含む、前記方法。
  21. 前記抗体を精製することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
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