ES2883176T3 - Anticuerpos monoclonales recombinantes y antígenos correspondientes para cánceres de colon y de páncreas - Google Patents

Anticuerpos monoclonales recombinantes y antígenos correspondientes para cánceres de colon y de páncreas Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en donde el anticuerpo: a) comprende las secuencias de CDR de cadena ligera GASENIYGALN (SEQ ID NO: 1), GASNLAD (SEQ ID NO: 2) y QNVLSSPYT (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQNFKG (SEQ ID NO: 8) y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11); b) comprende las secuencias de CDR de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QNVLSSPYT (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYSQKFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11); c) comprende las secuencias de CDR de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QQVLSSPYT (SEQ ID NO: 6), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQKFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11); o d) comprende las secuencias de CDR de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QQVLSSPYT (SEQ ID NO: 6), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQNFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11), en donde dicho anticuerpo se une específicamente a un antígeno de glicoproteína expresado sobre la superficie celular de los tejidos de cáncer de colon y páncreas.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales recombinantes y antígenos correspondientes para cánceres de colon y de páncreas Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los anticuerpos monoclonales y péptidos recombinantes y sus usos en procedimientos clínicos y científicos, incluidos los procedimientos de diagnóstico, especialmente cuando tales procedimientos implican la detección de antígenos asociados al carcinoma colorrectal y pancreático humano (“CPAA en sus siglas en inglés”), y la caracterización de los epítopos reconocidos por dichos anticuerpos monoclonales y péptidos recombinantes. La presente invención también proporciona anticuerpos y péptidos anti-CPAA en forma de compuestos de diagnóstico y/o composiciones farmacéuticas, útiles para los métodos de diagnóstico y/o terapéuticos de la presente invención para diagnosticar y/o tratar patologías asociadas al carcinoma colorrectal y pancreático.
Antecedentes de la invención
Según los datos más recientes de la Organización Mundial de la Salud, de un total de cincuenta y ocho millones de muertes en todo el mundo, el cáncer representó el trece por ciento de todas las muertes. Se prevé que aumenten las muertes por cáncer en el mundo, estimando que fallecerán nueve millones de personas por cáncer el año 2015 y que fallecerán más de once millones el año 2030. De todos los cánceres, el cáncer colorrectal es la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos, mientras que el cáncer de páncreas es el undécimo cáncer más común y la cuarta causa principal de muerte por cáncer tanto en hombres como en mujeres. Este sombrío escenario muestra la gran necesidad de nuevos diagnósticos y terapias para el cáncer.
La tecnología moderna, tal como la que implica el uso de hibridomas, ha puesto a disposición de investigadores y médicos fuentes de anticuerpos monoclonales potentes y altamente específicos útiles en procedimientos clínicos y diagnósticos generales. Por ejemplo, ahora existen anticuerpos terapéuticos aprobados por la FDA para el tratamiento del cáncer colorrectal, tales como AVASTIN® (bevacizumab, Genentech, Inc.), ERBITUX® (inyección de cetuximab, ImClone Sys. Inc./Merck/Bristol-Myers Squibb) y VECTIBIX® (panitumumab, Amgen Inc.).
Sin embargo, el desafío más importante en la lucha contra el cáncer sigue siendo la búsqueda del diagnóstico temprano. Cuanto más avanzado esté el cáncer cuando se diagnostica, menos probable es que la terapia sea eficaz. La Sociedad Estadounidense del Cáncer estima que noventa por ciento de los estadounidenses diagnosticados de cáncer de colon en fase 1 todavía están vivos cinco años después del diagnóstico, pero solo sesenta y ocho por ciento de los diagnosticados de cáncer en fase 3 todavía están vivos cinco años después del diagnóstico.
Por tanto, a pesar de los avances en la investigación del cáncer, sigue existiendo la necesidad de anticuerpos monoclonales recombinantes útiles para el diagnóstico y el tratamiento tempranos de los carcinomas de colon y páncreas.
Blumenthal et al. (2007; BMC Cancer; 7(1): 2) describen anticuerpos dirigidos a CEACAM5 y CEACAM6 que se unen a tipos de células no neoplásicas, incluido tejido de colon y pancreático no neoplásico.
Blumenthal et al. (2007; Cancer Research; 65(19): 8809-8817) describen la inhibición dirigida de CEACAM5 y CEACAM6 para disminuir la migración celular, la invasión celular y la adhesión celular.
Bjerner et al. (2002; Tumor Bio, 23(4): 249-261) describen la clasificación de un gran número de anticuerpos anti­ CEA en grupos basándose en sus características de unión al antígeno.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en donde el anticuerpo:
a) comprende las secuencias de CDR de cadena ligera GASENIYGALN (SEQ ID NO: 1), GASNLAD (SEQ ID NO: 2) y QNVLSSPYT (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQNFKG (SEQ ID NO: 8) y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11);
b) comprende las secuencias de Cd R de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QNVLSSPYT (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYSQKFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11);
c) comprende las secuencias de Cd R de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QQVLSSPYT (SEQ ID NO: 6), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQKFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11); o
d) comprende las secuencias de Cd R de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QQVLSSPYT (SEQ ID NO: 6), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQNFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11),
en donde dicho anticuerpo se une específicamente a un antígeno de glicoproteína expresado en la superficie celular de los tejidos de cáncer de colon y páncreas.
Un objeto de la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales recombinantes, o porciones de anticuerpos monoclonales recombinantes (péptidos) que tienen especificidad dirigida a antígenos y epítopos de antígenos asociados a carcinoma colorrectal y pancreático humano (CPAA). Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal recombinante o una porción del mismo, tal como un paratopo, que tenga especificidad por proteínas y péptidos CPAA, tal como un epítopo en esas proteínas o péptidos.
Un objeto adicional de la presente invención proporciona oligonucleótidos, tales como ADNc, cuyas secuencias de nucleótidos (genes) codifican parte o la totalidad de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos recombinantes mencionados anteriormente. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un gen que codifica la región variable de un anticuerpo monoclonal, que reconoce específicamente un CPAA, especialmente determinantes antigénicos o epítopos que existen comúnmente en un CPAa concreto.
Un objeto adicional de la presente invención proporciona un vector recombinante que comprende los genes anteriores. Un objeto adicional de la presente invención proporciona un transformante obtenido utilizando el vector recombinante anterior.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar anticuerpos recombinantes específicos para CPAA, en donde dichos anticuerpos están etiquetados con marcadores, haciéndolos fácilmente aislables y proporcionando versatilidad en el uso de dichos anticuerpos para fines de investigación, diagnóstico, y clínicos. Un aspecto adicional de la invención proporciona un anticuerpo quimérico que incluye las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo murino específico de CPAA conectado a las regiones constantes de inmunoglobulina humana gamma-1 y kappa, respectivamente. Otro objeto de la presente invención proporciona un anticuerpo recombinante completamente humanizado específico para CPAA. En un aspecto de esta realización, el anticuerpo recombinante completamente humanizado se optimiza para reducir su inmunogenicidad en seres humanos, mientras se mantiene su funcionalidad.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de uso de los anticuerpos recombinantes divulgados en la presente memoria para usos de investigación, diagnóstico, y clínicos. En particular, un objeto de la presente invención proporciona una herramienta de diagnóstico para la detección temprana de cánceres, quizás en pacientes sin síntomas de enfermedad. Otro aspecto proporciona una herramienta inmunohistoquímica para distinguir entre cánceres de páncreas lentos y agresivos.
Otro objeto de la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en el tratamiento del carcinoma colorrectal o pancreático. Tal tratamiento puede incluir métodos para promover la regresión tumoral o desencadenar la muerte de células transformadas que comprenden administrar a un paciente que lo necesite un anticuerpo, porción, fragmento, péptido o derivado del mismo que se unan a un antígeno CPAA, en donde dicho anticuerpo se administra en cantidad suficiente para promover la regresión del tumor o la muerte celular.
Otro objeto más de la presente invención proporciona métodos que tienen utilidad para diagnóstico y/o tratamiento in vitro de células, tejidos o patologías animales asociados a la presencia de CPAA, utilizando anticuerpos anti-CPAA y/o péptidos anti-CPAA. La presente invención también proporciona anticuerpos y péptidos anti-CPAA en forma de compuestos y/o composiciones farmacéuticas y/o de diagnóstico, útiles para los métodos de diagnóstico y/o terapéuticos de la presente invención para diagnosticar y/o tratar patologías relacionadas con CPAA.
La presente invención también está dirigida a un anticuerpo quimérico o humanizado anti-CPAA que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, comprendiendo cada una de las cadenas al menos parte de una región constante humana y al menos parte de una región variable (V) de origen no humano que tiene especificidad para un CPAA, uniéndose dicho anticuerpo con alta afinidad y/o alta avidez a un epítopo inhibidor y/o neutralizante de células asociadas a CPAA. La invención también incluye un fragmento o un derivado de tal anticuerpo, tales como una o más porciones de la cadena del anticuerpo, tales como las regiones constantes, de unión, diversidad o variables de la cadena pesada, o las regiones constantes, de unión o variables de la cadena ligera. Las porciones ilustrativas del anticuerpo son una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo, que definen la unión específica al CPAA.
Un objeto adicional de la invención consiste en caracterizar los péptidos CPAA identificados por los anticuerpos monoclonales o porciones de los mismos. Tales péptidos antigénicos pueden ser útiles para generar ligandos de unión a antígenos adicionales o utilizarse como vacunas u otros medios inmunoestimuladores.
También se describen métodos para fabricar y utilizar anticuerpos y péptidos anti-CPAA para diversas utilidades de la presente invención, tales como, pero no limitados a, métodos de hibridoma, recombinantes o sintéticos químicos para producir anticuerpos anti-CPAA o péptidos anti-CPAA de acuerdo con la presente invención; detectar CPAA en una solución o célula; inhibir una o más actividades biológicas de las células portadoras de CPAA in vitro, in situ o in vivo, incluida la destrucción muerte de tales células portadoras de CPAA. Por tanto, tal inhibición y destrucción pueden incluir métodos de tratamiento de la presente invención para aliviar síntomas o patologías que implican células portadoras de CPAA, tales como neoplasias malignas.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un trazado que muestra un perfil de elución por HPLC de la "vacuna" de Hollinshead, una preparación purificada de membranas de células de carcinoma colorrectal y pancreático.
La FIG. 2 presenta la secuencia de ADN de la cadena ligera kappa del anticuerpo murino 16C3. El codón de inició ATG putativo se indica en negrita/subrayado, y el codón de terminación TAG putativo se indica en cursiva/subrayado.
La FIG. 3 presenta la secuencia de ADN de la cadena pesada del anticuerpo IgG 16C3. El codón de inicio ATG putativo se indica en negrita/subrayado, y el codón de terminación TGA putativo se indica en cursiva/subrayado.
La FIG. 4 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera kappa del anticuerpo 16C3. Las regiones CDR se presentan en negrita/subrayado.
La FIG. 5 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de 16C3. Las regiones CDR se presentan en negrita/subrayado.
La FIG. 6 presenta varias cadenas ligeras variables de 16C3 humanizadas. 16C3 es la secuencia del anticuerpo murino, ven16C3 ha sido modificado superficialmente con secuencias marco humanas, cdr16C3 ha sido remodelado con aminoácidos de CDR humanas, abb16C3 representa el injerto de CDR abreviado, sdr16C3 representa cambios de aminoácidos que determinan el sitio y fra16C3 representa un enfoque "Frankenstein" para la remodelación la región variable mediante el uso de una combinación de varias "piezas" de regiones variables humanas. Los números reflejan la numeración de Kabat.
La FIG. 7 presenta varias cadenas pesadas variables 163 humanizadas. Las abreviaturas son idénticas a las de la FIG. 6.
La FIG. 8 es una radiografía de un análisis de transferencia Western de varias líneas celulares utilizando anticuerpo 16C3 contra el antígeno tumoral 16C3 no tratado. TU = muestra de tumor resecada del paciente (colorrectal); LS = LS174; CF = CFPAC-1; AS = ASPC-1; HT = HT29.
La FIG. 9 es una radiografía de una transferencia Western que representa el antígeno tumoral 16C3 tratado con proteasa V8. Tratamiento con proteasa V8 del antígeno 16C3 de la línea celular LS174 y detección del antígeno mediante transferencia Western. LS = antígeno no tratado; V81 = incubación con proteasa V8 durante 1 hora a temperatura ambiente (TA); V83 = incubación con proteasa V8 durante 3 horas a TA; V824 = incubación con proteasa V8 durante 24 horas a TA.
La FIG. 10 muestra una transferencia Western que representa el antígeno tumoral 16C3 tratado con PNGasa-F. El antígeno 16C3 de CFPAC-1 se trató con PNGasa-F (elimina la glicosilación ligada a N) durante varios períodos de tiempo. CFC = antígeno incubado durante 24 horas a TA sin enzima; CF = antígeno de control sin tratar; CF1 = antígeno tratado con enzima 1 hora a TA; CF5 = antígeno tratado con enzima durante 5 horas; CF24 = antígeno tratado con enzima durante 24 horas. La banda de alto peso molecular se ve afectada, pero la banda de bajo peso molecular no se ve afectada.
La FIG. 11 muestra una transferencia Western que representa el antígeno tumoral 16C3 expresado en varios extractos de tejido fetal utilizando el anticuerpo 16C3. Calles: 1 = intestino fetal, Fx III (Hem), 22/8/72; 2 = intestino fetal, Fx II (Hem), 22/8/72; 3 = intestino fetal, Fx III, 26/2/73; 4 = intestino fetal, Fx II, HB 1/11/72; 5 = intestino fetal, Fx III, 20/12/72; 6 = intestino fetal, Fx I, 24/6/75; 7 = intestino fetal, Fx I, 20/12/72; 8 = intestino fetal, Fx II, 3/1/73; 9 = Reg 2 y Reg 3A de intestino fetal, 3/8/74.
La FIG. 12 presenta las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo 16C3 humanizado optimizado. Los aminoácidos subrayados y en negrita indican CDR, V indica la unión péptido líder/extremo N terminal maduro y la unión del dominio variable/constante.
Descripción detallada de la invención
Se debe entender que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos concretos, etc., descritos en la presente memoria y, como tal, pueden variar. La terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones concretas únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que está definida únicamente por las reivindicaciones.
A menos que se defina de otro modo, los términos científicos y técnicos utilizados con relación a los anticuerpos descritos en la presente memoria tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Adicionalmente, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas con relación a, y los mecanismos de, cultivo de células y tejidos, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligo- o poli-nucleótidos descritos en la presente memoria son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica.
Se utilizan técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y los mecanismos de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Los mecanismos y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase p. ej., Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: LAB. MANUAL (3a ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001). Las nomenclaturas utilizadas con relación a los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en la presente memoria son los bien conocidos y de uso común en la técnica. Se utilizan técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y suministro farmacéutico y tratamiento de pacientes.
Aparte de los ejemplos operativos, o cuando se indique de otro modo, se debe entender que todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en la presente memoria están modificados en todos los casos por el término "aproximadamente".
La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales y péptidos recombinantes y sus usos en procedimientos clínicos y científicos, incluidos procedimientos de diagnóstico, especialmente cuando tales procedimientos implican la detección de antígenos asociados al carcinoma colorrectal y pancreático humano (CPAA) y la caracterización de los epítopos reconocidos por dichos anticuerpos monoclonales y péptidos recombinantes. La presente invención también proporciona anticuerpos y péptidos anti-CPAA en forma de compuestos de diagnóstico y/o composiciones farmacéuticas, útiles para los métodos de diagnóstico y/o terapéuticos de la presente invención para diagnosticar y/o tratar patologías asociadas al carcinoma colorrectal y pancreático. Uno de estos anticuerpos monoclonales anti-CPAA se ha caracterizado previamente, véase la Patente de Estados Unidos Núm. 7.314.622. Sin embargo, las proteínas de unión a antígenos descritas en la presente memoria son nuevas.
Generalmente, los anticuerpos monoclonales se utilizan como reactivos invaluables en el diagnóstico. De hecho, debido a sus altas especificidades, han desempeñado un papel importante en el desciframiento de las funciones de varias biomoléculas en rutas biosintéticas crípticas. Estos también se han convertido en los reactivos de elección para la identificación y caracterización de antígenos específicos de tumores y se han convertido en una herramienta valiosa en la clasificación del cáncer.
Con el advenimiento de los métodos de biología molecular y tecnología recombinante, es posible producir anticuerpos y moléculas similares a anticuerpos por medios recombinantes y generar así secuencias de genes que codifiquen secuencias de aminoácidos específicas que se encuentran en la estructura polipeptídica de los anticuerpos. Tales anticuerpos se pueden producir clonando las secuencias de genes que codifican las cadenas polipeptídicas de dichos anticuerpos o mediante síntesis directa de dichas cadenas polipeptídicas, con ensamblaje de las cadenas sintetizadas para formar estructuras tetraméricas activas (H2 L2) con afinidad por epítopos y determinantes antigénicos específicos. Esto ha permitido la rápida producción de anticuerpos que tienen secuencias características de anticuerpos neutralizadores de diferentes especies y fuentes.
Independientemente de la fuente de los anticuerpos, o de cómo se construyen de manera recombinante, o de cómo se sintetizan, in vitro o in vivo, utilizando animales transgénicos, cultivos de células grandes de laboratorio o tamaño comercial, utilizando plantas transgénicas, o por síntesis química directa sin emplear organismos vivos en ninguna etapa del procedimiento, todos los anticuerpos tienen una estructura tridimensional general similar. Esta estructura se proporciona a menudo como H2 L2 y se refiere al hecho de que los anticuerpos comprenden comúnmente dos cadenas ligeras (L) de aminoácidos y 2 cadenas pesadas (H) de aminoácidos. Ambas cadenas tienen regiones capaces de interactuar con una diana antigénica estructuralmente complementaria. Las regiones que interactúan con la diana se denominan regiones "variables" o "V" y se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de diferente especificidad antigénica. Las regiones variables de las cadenas H o L contienen las secuencias de aminoácidos capaces de unirse específicamente a las dianas antigénicas.
Como se emplea en la presente memoria, el término "región de unión a antígeno" se refiere a la porción de una molécula de anticuerpo que contiene los restos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad por el antígeno. La región del anticuerpo incluye los restos de aminoácidos "marco" necesarios para mantener la conformación adecuada de los restos de unión al antígeno.
Dentro de las regiones variables de las cadenas H o L que proporcionan las regiones de unión al antígeno hay secuencias más pequeñas denominadas "hipervariables" debido a su extrema variabilidad entre anticuerpos de diferente especificidad. Tales regiones hipervariables también se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o regiones "CDR". Estas regiones CDR explican la especificidad básica del anticuerpo para una estructura determinante antigénica concreta.
Las CDR representan tramos no contiguos de aminoácidos dentro de las regiones variables, pero, independientemente de la especie, se ha encontrado que las ubicaciones posicionales de estas secuencias críticas de aminoácidos dentro de las regiones variables de cadena pesada y ligera tienen ubicaciones similares dentro de las secuencias de aminoácidos de las cadenas variables. Las cadenas pesadas y ligeras variables de todos los anticuerpos tienen cada una tres regiones CDR, cada una no contigua a las demás (denominadas L1, L2, L3, H1, H2, H3) para las respectivas cadenas ligeras (L) y pesadas (H). Las regiones CDR aceptadas han sido descritas por Kabat et al., 252 J. Biol. Chem. 6609-16 (1977), y los bucles de CDR se pueden identificar aplicando estas reglas durante un examen de una secuencia lineal de aminoácidos. Sin embargo, las reglas para definir el bucle CDR-H3 pueden variar (véase el Capítulo 4, ANTIBODY ENGIN. METHODS & PROTOCOLOS, (Lo, ed. Humana Press, Totowa, NJ, 2004)), y los límites reales de algunos bucles de CDR-H3 pueden no identificarse sin técnicas experimentales tales como el dicroísmo circular, la resonancia magnética nuclear o la cristalografía de rayos X. En todas las especies de mamíferos, los péptidos de anticuerpos contienen regiones constantes (es decir, altamente conservadas) y variables, y, dentro de estas últimas, están las CDR y las llamadas "regiones marco" compuestas por secuencias de aminoácidos dentro de la región variable de la cadena pesada o ligera pero fuera de las c Dr .
Con respecto al determinante antigénico reconocido por las regiones CDR del anticuerpo, este también se denomina "epítopo". En otras palabras, epítopo se refiere a la porción de cualquier molécula susceptible de ser reconocida por un anticuerpo y de unirse al mismo (la región de unión del anticuerpo correspondiente puede denominarse paratopo). En general, los epítopos consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, por ejemplo, aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.
Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse a un anticuerpo que además es susceptible de inducir en un animal la producción de un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. Se pretende que la reacción específica mencionada anteriormente indique que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser provocados por otros antígenos.
Por tanto, el término "anticuerpo" incluye tanto moléculas de inmunoglobulina intactas como porciones, fragmentos, péptidos y derivados de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fsc, regiones CDR, paratopos o cualquier porción o secuencia peptídica del anticuerpo que sea capaz de unirse a un antígeno o epítopo. Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir de ese modo la molécula al anticuerpo.
El anticuerpo también incluye anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) contra anticuerpos que pueden marcarse en forma soluble o unida, así como fragmentos, porciones, regiones, péptidos o derivados de los mismos, proporcionados por cualquier técnica conocida, tales como, pero sin limitarse a, escisión enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes. Tales anticuerpos de la presente invención son capaces de unirse a porciones de CPAA o a células portadoras de CPAA. Los fragmentos o porciones de anticuerpo pueden carecer del fragmento Fc del anticuerpo intacto, eliminarse más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión inespecífica a tejido que un anticuerpo intacto. Se pueden producir ejemplos de fragmentos de anticuerpos a partir de anticuerpos intactos utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante escisión proteolítica con enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Ver, p. ej., Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983). Se pueden preparar porciones de anticuerpos mediante cualquiera de los métodos anteriores, o se pueden preparar expresando una porción de la molécula recombinante. Por ejemplo, la región o regiones CDR de un anticuerpo recombinante se pueden aislar y subclonar en el vector de expresión apropiado. Véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 6.680.053.
Secuencias de oligonucleótidos y aminoácidos del clon 16C3
La presente invención proporciona un nuevo anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un CPAA. Este anticuerpo monoclonal, identificado como "16C3", se refiere al número asignado a su clon de hibridoma. En la presente memoria, 16C3 también se refiere a la parte del anticuerpo monoclonal, el paratopo o las CDR, que se une específicamente a un epítopo de CPAA identificado como 16C3 debido a su capacidad para unirse al anticuerpo 16C3. Las diversas formas recombinantes y humanizadas de 16C3 descritas en la presente memoria pueden denominarse con el mismo nombre.
La presente invención incluye, dentro de su alcance, secuencias de ADN que codifican las regiones variables de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo anti-CPAA de la presente invención. En la Figura 2 se presenta una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 16C3. En la Figura 3 se presenta una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 16C3.
La presente invención incluye, dentro de su alcance, un péptido de la cadena ligera 16C3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la FIG. 4 y FIG. 12; y un péptido de la cadena pesada de 16C3 que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la FIG. 5 y FIG. 12. Adicionalmente, la presente invención incluye las regiones CDR representadas para la cadena ligera kappa de 16C3 que son los restos subrayados en la FIG. 4, que tiene los aminoácidos de CDR 1: GASENIYGALN (SEQ ID NO: 1); CDR 2: GASNLAD (SEQ ID NO: 2); y CDR 3: QNVLSSPYT (SEQ ID NO: 3); así como los aminoácidos de la cadena ligera subrayados en la FIG. 12, que incluyen CDR 1: QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4); CDR 2: GASNLAT (SEQ ID NO: 5); y CDR 3: QQVLSSPYT (SEQ ID NO: 6). La invención identifica de manera similar las regiones CDR para la cadena pesada, subrayadas en la FIG.
5, que incluyen los aminoácidos para CDR 1: GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7);
CDR 2: LISTYSGDTKYNQNFKG (SEQ ID NO: 8); y CDR 3: GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 9); así como los aminoácidos de la cadena pesada subrayados en la FIG. 12, que incluyen
CDR 1: GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7); CDR 2: LISTYSGDTKYNQNFQG; y
CDR 3: GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11).
También se incluyen regiones CDR2 de cadena pesada alternativas representadas en la Fig. 7; LISTYSGDTKYSQKFQG y LISTYSGDTKYNQKFQG.
También se incluye dentro del alcance de la invención cualquier secuencia de oligonucleótidos que codifique la secuencia de aminoácidos de 16C3 o un péptido de la misma. Debido a que el código genético está degenerado, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido en particular. Utilizando el código genético, se pueden identificar uno o más oligonucleótidos diferentes, cada uno de los cuales sería capaz de codificar el aminoácido. La probabilidad de que un oligonucleótido concreto constituya, de hecho, la secuencia que codifica XXX real se puede estimar considerando las relaciones de emparejamiento de bases anormales y la frecuencia con la que se utiliza realmente un codón concreto (para codificar un aminoácido concreto) en células eucarióticas o procarióticas que expresan un anticuerpo o porción anti-CPAA. Tales "reglas de uso de codones" son divulgadas por Lathe et al., 183 en J. Molec. Biol. 1-12 (1985)). Utilizando las "reglas de uso de codones" de Lathe, se identifica un único oligonucleótido, o un conjunto de oligonucleótidos, que contiene una secuencia de nucleótidos "más probable" teórica capaz de codificar secuencias anti-CPAA.
Aunque ocasionalmente una secuencia de aminoácidos puede ser codificada por un solo oligonucleótido, frecuentemente la secuencia de aminoácidos puede ser codificada por cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos similares. Es importante destacar que, mientras que todos los miembros de este conjunto contienen oligonucleótidos que son capaces de codificar el fragmento de péptido y, por lo tanto, potencialmente contienen la misma secuencia de oligonucleótidos que el gen que codifica el fragmento de péptido, solo un miembro del conjunto contiene la secuencia de nucleótidos que es idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen. Debido a que este miembro está presente dentro del conjunto y es capaz de hibridar con el ADN incluso en presencia de los otros miembros del conjunto, es posible emplear el conjunto de oligonucleótidos no fraccionado de la misma manera en que se emplearía un único oligonucleótido. para clonar el gen que codifica la proteína.
El oligonucleótido, o conjunto de oligonucleótidos, que contienen la secuencia teórica "más probable" capaz de codificar un péptido o anticuerpo anti-CPAA que incluyen una región variable o constante se utilizan para identificar la secuencia de un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos complementarios que es capaz de hibridar con la secuencia o conjunto de secuencias "más probables". Se puede emplear un oligonucleótido que contenga tal secuencia complementaria como sonda para identificar y aislar el gen anti-CPAA de la región variable o constante (Sambrook et al., 1989).
Se identifica un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos adecuados, que son capaces de codificar un péptido de 16C3 (o que son complementarios a tal oligonucleótido, o conjunto de oligonucleótidos) (utilizando el procedimiento descrito anteriormente), se sintetiza e hibrida por medios bien conocido en la técnica, contra un ADN o una preparación de ADNc obtenidos a partir de células que son capaces de expresar anticuerpos anti-CPAA o regiones variables o constantes de los mismos. Las moléculas de oligonucleótidos de hebra sencilla complementarias a las secuencias codificantes de péptidos de la región anti-CPAA "más probables" se pueden sintetizar utilizando procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véanse Belagaje et al., 254 J. Biol. Chem. 5765-80 (1979); Maniatis et al., en MOLEC. MECH. IN CONTROL OF GENE EXPRESION (Nierlich et al., Eds., Acad. Press, NY, 1976); Wu et al., 1978; Khorana, 203 Science 614-25 (1979).
Además, la síntesis de ADN se puede lograr mediante el uso de sintetizadores automáticos. Las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos son descritas por Sambrook et al., 1989, y por Hayrnes et al., en NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACTICAL APPROACH (IRL Press, DC 1985). Las condiciones de lavado de la hibridación pueden incluir solución de lavado de 0,2 x SSC/SDS al 0,1% e incubación con rotación durante 10 minutos a temperatura ambiente (lavado de baja rigurosidad), solución de lavado de 0,2 x SSC/SDS al 0,1% precalentada (42°C) e incubación con rotación durante quince minutos a 42°C (lavado de rigurosidad media) y solución de lavado de 0,1 x SSC/SDS al 0,1% precalentada (68°C) e incubación con rotación durante quince minutos a 68°C (lavado de rigurosidad alta). Véase Ausubel et al., AnTIBODIES: A LAB. MANUAL, (Harlow & Lane eds., Cold Spring Harbor Lab., 1988). Técnicas tales como, o similares a, las descritas anteriormente han permitido con éxito la clonación de genes para aldehído deshidrogenasas humanas (Hsu et al., 82 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 3771-75 (1985)), fibronectina (Suzuki et al., 4 Bur. Mol. Biol. Organ. J. 2519-24 (1985)), el gen del receptor de estrógeno humano (Walter et al., 82 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 7889-93 (1985)), activador de plasminógeno de tipo tisular (Pennica et al., 301 Nature 214-21 (1983)) y ADN complementario de fosfatasa alcalina de placenta humana a término (Keun et al., 82 Proc. Nat'l Acad Sci. USA 8715-19 (1985)).
Asimismo, se pretende que las regiones codificantes de anticuerpos para su uso en la presente invención también se puedan proporcionar alterando genes de anticuerpos existentes utilizando técnicas biológicas moleculares convencionales que dan como resultado variantes (agonistas) de los anticuerpos y péptidos descritos en la presente memoria. Tales variantes incluyen, pero no se limitan a, deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos o péptidos anti-CPAA.
Por ejemplo, una clase de sustituciones son las sustituciones de aminoácidos conservadas. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un péptido de anticuerpo anti-CPAA por otro aminoácido de características similares. Típicamente se observan como sustituciones conservativas los remplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los restos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los restos amida Asn y Gln, el intercambio de los restos alcalinos Lys y Arg, los reemplazos entre los restos aromáticos Phe, Tyr y similares. Las pautas concernientes a qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos se encuentran en Bowie et al., 247 Science 1306-10 (1990).
Los anticuerpos o péptidos anti-CPAA variantes o agonistas pueden ser completamente funcionales o pueden carecer de función en una o más actividades. Las variantes completamente funcionales contienen típicamente solo variaciones conservativas o variaciones en restos no críticos o en regiones no críticas. Las variantes funcionales también pueden contener la sustitución de aminoácidos similares que no dan como resultado ningún cambio o dan como resultado un cambio insignificante en la función. Alternativamente, tales sustituciones pueden afectar positiva o negativamente a la función hasta cierto punto. Las variantes no funcionales contienen típicamente una o más sustituciones, deleciones, inserciones, inversiones de aminoácidos no conservativas o un truncamiento o una sustitución, inserción, inversión o deleción en un resto crítico o región crítica.
Los aminoácidos que son esenciales para la función se pueden identificar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de exploración de alanina. Cunningham et al., 244 Science 1081-85 (1989). El último procedimiento introduce mutaciones únicas de alanina en cada resto de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se someten a prueba, a continuación, para determinar la actividad biológica, tal como la unión al epítopo o la actividad ADCC in vitro. Los sitios que son críticos para la unión ligandoreceptor también se pueden determinar mediante análisis estructural tal como cristalografía, resonancia magnética nuclear o marcaje de fotoafinidad. Smith et al., 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos et al., 255 Science 306-12 (1992).
Además, los polipéptidos contienen a menudo aminoácidos distintos de los veinte aminoácidos "naturales". Adicionalmente, muchos aminoácidos, incluidos los aminoácidos terminales, se pueden modificar mediante procedimientos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, o mediante mecanismos de modificación química bien conocidos en la técnica. Las modificaciones conocidas incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, anclaje covalente de flavina, anclaje covalente de un resto hemo, anclaje covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, anclaje covalente de un lípido o derivado de lípido, anclaje covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación.
Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica y se han descrito con gran detalle en la bibliografía científica. Varias modificaciones particularmente comunes, glicosilación, anclaje de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en la mayoría de los textos básicos, tales como Proteins -- Structure and Molecular Properties (2a ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman & Co., NY, 1993). Existen muchas revisiones detalladas disponibles sobre este tema, tal como por Wold, Posttranlational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, NY, 1983); Seifter et al. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); y Rattan et al. 663 Ann. NY Acad. Sci. 48-62 (1992).
Por consiguiente, los anticuerpos y péptidos de la presente invención también abarcan derivados o análogos en los que un resto de aminoácido sustituido es uno no codificado por el código genético, en los que se incluye un grupo sustituyente con pegilación como se mencionó anteriormente.
De manera similar, las adiciones y sustituciones en la secuencia de aminoácidos, así como las variaciones y modificaciones que se acaban de describir, pueden ser igualmente aplicables a la secuencia de aminoácidos del antígeno CPAA y/o epítopo o péptidos del mismo y, por tanto, están incluidas en la presente invención. Como se mencionó anteriormente, los genes que codifican el anticuerpo monoclonal según la presente invención son específicamente eficaces en el reconocimiento de CPAA.
Expresión recombinante de anticuerpos
Tradicionalmente, los anticuerpos monoclonales se han producido como moléculas nativas en líneas de hibridomas murinos. Además de esa tecnología, revisada a continuación, la presente invención proporciona la expresión de ADN recombinante de anticuerpos monoclonales. Esto permite la producción de anticuerpos humanizados, así como un espectro de derivados de anticuerpos y proteínas de fusión en una especie anfitriona de elección. Más recientemente, la producción de anticuerpos en bacterias, levaduras, animales transgénicos y huevos de gallina han surgido como alternativas prometedoras para los sistemas de producción basados en hibridomas. Las principales ventajas de los animales transgénicos son los altos rendimientos potenciales de fuentes renovables.
Una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un anticuerpo anti-CPAA, una porción o un polipéptido de la presente invención se puede recombinar con el ADN del vector de acuerdo con técnicas convencionales, que incluyen extremos romos o escalonados para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, rellenado de extremos cohesivos según corresponda, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y ligación con ligasas apropiadas. Las técnicas para tales manipulaciones son divulgadas, p. ej., por Maniatis et al., en MOLECULAR ClOn ING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 y 1989) y Ausubel, 1987, 1993, y se pueden utilizar para construir secuencias de ácido nucleico que codifican una molécula de anticuerpo monoclonal o una región de unión a antígeno de la misma.
Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora de la transcripción y la traducción y tales secuencias están "conectadas operablemente" a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Una conexión operable es una conexión en la que las secuencias de ADN reguladoras y la secuencia de ADN que se pretende expresar están conectadas de tal manera que permitan la expresión génica como péptidos anti-CPAA o porciones de anticuerpos en cantidades recuperables. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar de un organismo a otro, como es bien conocido en la técnica análoga. Véanse, p. ej., Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987-1993.
Por consiguiente, la presente invención abarca la expresión de un péptido o anticuerpo anti-CPAA, en células procarióticas o eucarióticas. Los anfitriones adecuados incluyen anfitriones bacterianos o eucarióticos que incluyen células de bacterias, levaduras, insectos, hongos, aves y mamíferos, ya sea in vivo, o in situ, o células anfitrionas con origen en mamíferos, insectos, aves o levaduras. La célula o tejido de mamífero puede tener origen humano, de primate, hámster, conejo, roedor, vaca, cerdo, oveja, caballo, cabra, perro o gato, pero se puede utilizar cualquier otra célula de mamífero.
Adicionalmente, mediante el uso de, por ejemplo, el sistema de ubiquitina hidrolasa de levadura, se puede lograr la síntesis in vivo de proteínas de fusión ubiquitina-polipéptido transmembrana. Las proteínas de fusión así producidas se pueden procesar in vivo o purificar y procesar in vitro, lo que permite la síntesis de un anticuerpo o polipéptido anti-CPAA de la presente invención con una secuencia del extremo amino especificada. Además, se pueden evitar los problemas asociados con la retención de restos de metionina derivados del codón de inicio en la expresión directa de levaduras (o bacterias). Sabin et al., 7(7) Bio/Technol. 705-09 (1989); Miller et al., 7(7) Bio/Technol. 698­ 704 (1989).
Se puede utilizar cualquiera de una serie de sistemas de expresión génica de levadura que incorporan elementos promotores y de terminación de los genes expresados activamente que codifican enzimas glicolíticas producidas en grandes cantidades cuando la levadura se cultiva en medios ricos en glucosa para obtener anticuerpos o péptidos anti-CPAA de la presente invención. Los genes glicolíticos conocidos también pueden proporcionar señales de control transcripcional muy eficaces. Por ejemplo, se pueden utilizar las señales del promotor y terminador del gen de la fosfoglicerato quinasa.
La producción de anticuerpos o péptidos anti-CPAA o derivados funcionales de los mismos en insectos se puede lograr, por ejemplo, infectando el insecto anfitrión con un baculovirus modificado genéticamente para expresar un polipéptido transmembrana mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase Ausubel et al., 1987, 1993.
En una realización, la secuencia de nucleótidos introducida se incorporará a un vector plasmídico o viral susceptible de replicación autónoma en el anfitrión receptor. Se puede emplear cualquiera de una amplia variedad de vectores para este propósito. Véase, p. ej., Ausubel et al., 1987, 1993. Los factores de importancia en la selección de un vector plasmídico o viral concreto incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector pueden ser reconocidas y seleccionadas entre aquellas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un anfitrión concreto; y si es deseable poder "transportar" el vector entre células anfitrionas de diferentes especies.
Los ejemplos de vectores procarióticos conocidos en la técnica incluyen plásmidos tales como los que pueden replicarse en E. coli (tales como, por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, nVX). Tales plásmidos son divulgados, por ejemplo, por Maniatis et al., 1989; Ausubel et al., 1987, 1993. Los plásmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127, etc. Tales plásmidos son divulgados por Gryczan, en THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982). Los plásmidos Streptomyces apropiados incluyen pIJ101 (Kendall et al., 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987)), y bacteriófagos de Streptomyces tales como $C31 (Chater et al., En SIXTH INT'L SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungría 1986). Los plásmidos de Pseudomonas son revisados por en John et al., en 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986); Izaki, 33 Jpn. J. Bacteriol.
729-42 (1978); y Ausubel et al., 1987, 1993.
Alternativamente, los elementos de expresión génica útiles para la expresión de ADNc que codifican anticuerpos o péptidos anti-CPAA incluyen, pero no se limitan a, (a) promotores de la transcripción viral y sus elementos potenciadores, tales como el promotor temprano de SV40 (Okayama et al., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)), LTR del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., 79 P.N.A.S. Estados Unidos 6777 (1982)) y LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (Grosschedl et al., 41 Cell 885 (1985)); (b) regiones de empalme y sitios de poliadenilación tales como los derivados de la región tardía de SV40 (Okayarea et al., 1983), y (c) sitios de poliadenilación tales como en SV40 (Okayama et al., 1983).
Los genes de ADNc de inmunoglobulina se pueden expresar como describen Liu et al., Más abajo, y Weidle et al., 51 Gene 21 (1987), utilizando como elementos de expresión el promotor temprano de SV40 y su potenciador, los potenciadores del promotor de la cadena H de inmunoglobulina de ratón, el corte y empalme de ARNm de la región tardía de SV40, la secuencia intermedia de S-globina de conejo, los sitios de poliadenilación de inmunoglobulina y S-globina de conejo y los elementos de poliadenilación de SV40.
Para genes de inmunoglobulina compuestos por parte de ADNc y parte de ADN genómico (Whittle et al., 1 Protein Engin. 499 (1987)), el promotor de la transcripción puede ser citomegalovirus humano, los potenciadores del promotor pueden ser citomegalovirus e inmunoglobulina de ratón/humana, y las regiones de poliadenilación y corte y empalme de ARNm pueden ser las secuencias de inmunoglobulina cromosómica nativas.
En una realización, para la expresión de genes de ADNc en células de roedores, el promotor de la transcripción es una secuencia de LTR viral, los potenciadores del promotor de la transcripción son el potenciador de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, y el potenciador de LTR viral o ambos, la región de corte y empalme contiene un intrón de más de 31 pb, y las regiones de poliadenilación y terminación de la transcripción se obtienen de la secuencia cromosómica nativa correspondiente a la cadena de inmunoglobulina que se está sintetizando. En otras realizaciones, las secuencias de ADNc que codifican otras proteínas se combinan con los elementos de expresión mencionados anteriormente para lograr la expresión de las proteínas en células de mamífero.
Cada gen fusionado se ensambla o se inserta en un vector de expresión. Las células receptoras capaces de expresar el producto génico de la cadena de inmunoglobulina quimérica se transfectan a continuación individualmente con un péptido anti-CPAA o un gen que codifica la cadena H quimérica o L quimérica, o se cotransfectan con un gen de la cadena H quimérica y L quimérica. Las células receptoras transfectadas se cultivan en condiciones que permiten la expresión de los genes incorporados y las cadenas de inmunoglobulina expresadas o los anticuerpos intactos o fragmentos se recuperan del cultivo.
En una realización, los genes fusionados que codifican el péptido anti-CPAA o las cadenas H y L quiméricas, o porciones de las mismas, se ensamblan en vectores de expresión separados que a continuación se utilizan para cotransfectar una célula receptora.
Cada vector puede contener dos genes seleccionables, un primer gen seleccionable diseñado para la selección en un sistema bacteriano y un segundo gen seleccionable diseñado para la selección en un sistema eucariótico, en donde cada vector tiene un par de genes diferente. Esta estrategia da como resultado vectores que primero dirigen la producción y permiten la amplificación de los genes fusionados en un sistema bacteriano. Los genes así producidos y amplificados en un anfitrión bacteriano se utilizan posteriormente para cotransfectar una célula eucariótica y permitir la selección de una célula cotransfectada que porta los genes transfectados deseados.
Los ejemplos de genes seleccionables para su uso en un sistema bacteriano son el gen que confiere resistencia a la ampicilina y el gen que confiere resistencia al cloranfenicol. Los genes seleccionables para su uso en transfectantes eucarióticos incluyen el gen de la xantina guanina fosforribosil transferasa (designado gpt) y el gen de la fosfotransferasa de Tn5 (designado neo).
Selección de células que expresan gpt se basa en el hecho de que la enzima codificada por este gen utiliza xantina como sustrato para la síntesis de nucleótidos de purina, mientras que la enzima endógena análoga no puede hacerlo. En un medio que contiene (1) ácido micofenólico, que bloquea la conversión de monofosfato de inosina en monofosfato de xantina, y (2) xantina, solo las células que expresan el gen gpt puede sobrevivir. El producto de neo bloquea la inhibición de la síntesis de proteínas por el antibiótico G418 y otros antibióticos de la clase de la neomicina.
Estos dos procedimientos de selección se pueden utilizar simultánea o secuencialmente para seleccionar la expresión de genes de la cadena de inmunoglobulina introducidos en dos vectores de ADN diferentes en una célula eucariótica. No es necesario incluir diferentes marcadores seleccionables para células eucarióticas; se pueden cotransfectar un vector de cadena H y uno de L, cada uno de los cuales contiene el mismo marcador seleccionable. Después de la selección de las células apropiadamente resistentes, la mayoría de los clones contendrán copias integradas de los vectores de las cadenas H y L y/o péptidos anti-CPAA.
Alternativamente, los genes fusionados que codifican las cadenas H y L quiméricas se pueden ensamblar en el mismo vector de expresión.
Para la transfección de los vectores de expresión y la producción del anticuerpo quimérico, la línea celular receptora puede ser una célula de mieloma. Las células de mieloma pueden sintetizar, ensamblar y secretar inmunoglobulinas codificadas por genes de inmunoglobulina transfectados y poseen el mecanismo de glicosilación de la inmunoglobulina. Por ejemplo, la célula receptora es la célula de mieloma productora de Ig recombinante SP2/0 (ATCC Núm. CRL 8287). Las células SP2/0 producen solo inmunoglobulina codificada por los genes transfectados. Las células de mieloma se pueden cultivar en cultivo o en la cavidad peritoneal de un ratón, donde se puede obtener inmunoglobulina secretada a partir del líquido ascítico. Otras células receptoras adecuadas incluyen células linfoides tales como linfocitos B de origen humano o no humano, células de hibridoma de origen humano o no humano, o células de heterohibridoma interespecie.
El vector de expresión que porta una construcción de anticuerpo quimérico o humanizado o polipéptido anti-CPAA de la presente invención se puede introducir en una célula anfitriona apropiada mediante cualquiera de una variedad de medios adecuados, incluidos medios bioquímicos como transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio y aplicación con policationes tales como dietilaminoetil (DEAE) dextrano, y medios mecánicos tales como electroporación, microinyección directa y bombardeo con microproyectiles. Johnston et al., 240 Science 1538 (1988).
Otra forma de introducir ADN en las células linfoides es mediante electroporación. Potter et al., 81 P.N.A.S. Estados Unidos 7161 (1984); Yoshikawa et al., 77 Jpn. J. Cancer Res. 1122-33 (1986). En este procedimiento, las células receptoras se someten a un pulso eléctrico en presencia del ADN que se debe incorporar. Típicamente, después de la transfección, se deja que las células se recuperen en medio completo durante aproximadamente 24 horas y a continuación se siembran en placas de cultivo de 96 pocillos en presencia del medio selectivo. La selección con G418 se realiza utilizando de aproximadamente 0,4 mg/ml a 0,8 mg/ml de G418. La selección con ácido micofenólico utiliza aproximadamente 6 pg/ml más aproximadamente 0,25 mg/ml de xantina. Se espera que la técnica de electroporación produzca frecuencias de transfección de aproximadamente 10"5 a aproximadamente 10"4 para células Sp2/0. En el método de fusión de protoplastos, la lisozima se utiliza para quitar las paredes celulares del exudado catarral que alberga el plásmido recombinante que contiene el gen del anticuerpo quimérico. Los esferoplastos resultantes se fusionan con células de mieloma con polietilenglicol. Los genes de inmunoglobulina de la presente invención también se pueden expresar en células de mamíferos no linfoides o en otras células eucarióticas, tales como levaduras, o en células procarióticas, en particular bacterias.
La levadura proporciona ventajas sustanciales sobre las bacterias para la producción de cadenas H y L de inmunoglobulina. Las levaduras llevan a cabo modificaciones peptídicas postraduccionales, incluida la glicosilación. Actualmente existen varias estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y plásmidos de alto número de copias que se pueden utilizar para la producción de las proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce secuencias líder de productos génicos de mamíferos clonados y secreta péptidos que portan secuencias líder (es decir, prepéptidos). Hitzman et al., XIa Inte'l Conference of Yeast, Genetics y Molec. Biol. (Montpelier, Francia, 1982).
Los sistemas de expresión génica de levadura se pueden evaluar de forma rutinaria para determinar los niveles de producción, secreción y estabilidad de péptidos, anticuerpo y anticuerpos murinos y quiméricos o humanizados ensamblados, fragmentos y regiones de los mismos anti-CPAA. Se puede utilizar cualquiera de una serie de sistemas de expresión génica de levadura que incorpora elementos promotores y de terminación de los genes expresados activamente que codifican enzimas glicolíticas producidas en grandes cantidades cuando las levaduras se cultivan en medios ricos en glucosa. Los genes glicolíticos conocidos también pueden proporcionar señales de control de la transcripción muy eficaces. Por ejemplo, se pueden utilizar las señales del promotor y terminador del gen de la fosfoglicerato quinasa (PGK). Se pueden adoptar varios enfoques para evaluar plásmidos de expresión óptimos para la expresión de ADNc de inmunoglobulina clonados en levadura. Véase II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed., IRL Press, 1985).
Las cepas bacterianas también se pueden utilizar como anfitriones para la producción de moléculas de anticuerpos o péptidos descritos por esta invención. Se pueden utilizar cepas K12 de E. coli tales como W3110 de E. coli (ATCC 27325) y otras enterobacterias como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y diversas especies de Pseudomonas.
Los vectores plásmidos que contienen replicones y secuencias de control que se obtienen de especies compatibles con una célula anfitriona se utilizan en conexión con estos anfitriones bacterianos. El vector porta un sitio de replicación, así como genes específicos que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Se pueden tomar varios enfoques para evaluar los plásmidos de expresión para la producción de anticuerpos, fragmentos y regiones murinos y quiméricos o humanizados o cadenas de anticuerpos codificadas por los ADNc de inmunoglobulina clonados en bacterias (véanse Glover, 1985; Ausubel, 1987, 1993; Sambrook, 1989; Colligan, 1992-1996).
Se pueden cultivar células de mamífero anfitrionas in vitro o in vivo. Las células de mamífero proporcionan modificaciones postraduccionales a las moléculas de proteína de inmunoglobulina, incluida la eliminación del péptido líder, el plegamiento y ensamblaje de las cadenas H y L, la glicosilación de las moléculas de anticuerpo y la secreción de la proteína de anticuerpo funcional.
Las células de mamífero que pueden ser útiles como anfitriones para la producción de proteínas de anticuerpos, además de las células de origen linfoide descritas anteriormente, incluyen células de origen fibroblástico, tales como las células Vero (ATCC CRL 81) o CHO-K1 (ATCC CRL 61).
Muchos sistemas de vectores están disponibles para la expresión de genes de cadena H y L de péptidos anti-CPAA clonados en células de mamíferos (véase Glover, 1985). Se pueden seguir diferentes enfoques para obtener anticuerpos H2 L2 completos. Como se comentó anteriormente, es posible coexpresar cadenas H y L en las mismas células para lograr la asociación intracelular y la conexión de las cadenas H y L en anticuerpos H2 L2 tetraméricos completos y/o péptidos anti-CPAA. La coexpresión se puede producir utilizando los mismos plásmidos o diferentes plásmidos en el mismo anfitrión. Los genes para las cadenas H y L y/o los péptidos anti-CPAA se pueden colocar en el mismo plásmido, que a continuación se transfecta a las células, seleccionando así directamente las células que expresan ambas cadenas. Alternativamente, las células se pueden transfectar primero con un plásmido que codifica una cadena, por ejemplo, la cadena L, seguido de la transfección de la línea celular resultante con un plásmido de la cadena H que contiene un segundo marcador seleccionable. Las líneas celulares que producen péptidos y/o moléculas H2 L2 anti-CPAA a través de cualquier ruta se podrían transfectar con plásmidos que codifiquen copias adicionales de péptidos, cadenas H, L o H más L junto con marcadores seleccionables adicionales para generar líneas celulares con propiedades mejoradas, tales como una mayor producción de moléculas de anticuerpo H2 L2 ensambladas o estabilidad mejorada de las líneas celulares transfectadas.
Además, las plantas han surgido recientemente como sistemas de expresión de corriente principal alternativos convenientes, seguros y económicos para la producción de anticuerpos recombinantes, que se basan en el cultivo a gran escala de microbios o células animales. Los anticuerpos se pueden expresar en cultivos de células vegetales o en plantas cultivadas de forma convencional. La expresión en plantas puede ser sistémica, limitada a plastidios subcelulares o limitada a semillas (endospermos). Véanse, p. ej., la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20030167531; las Patentes de Estados Unidos Núm. 6.080.560 y Núm. 6.512.162; y el documento WO 0129242. Varios anticuerpos derivados de plantas han alcanzado fases avanzadas de desarrollo, incluidos los ensayos clínicos (véase, p. ej., Biolex, Pittsboro, NC).
Tecnología de hibridoma
En la presente memoria se describe una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que tiene un alto grado de especificidad y afinidad por CPAA. La presente invención se refiere también a variantes y mutantes de las líneas celulares de hibridoma caracterizadas en detalle anteriormente, que aparecen espontáneamente o que pueden producirse artificialmente utilizando métodos conocidos y que aún tienen las propiedades características del material de partida, es decir, todavía son capaces de producir los anticuerpos según la invención o derivados de los mismos y secretarlos al medio circundante.
También se describen en la presente memoria métodos para la producción de dichas líneas celulares de hibridoma y métodos para la producción de dichos anticuerpos monoclonales. Se debe entender que los clones y subclones de líneas celulares de hibridoma son hibridomas que se producen a partir del clon de partida mediante clonación repetida y que todavía tienen las características del clon de partida que son esenciales para la invención.
Más específicamente, las moléculas de ácido nucleico, proteína o péptido de la invención se pueden utilizar para desarrollar anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen a CPAA. Para la preparación de los anticuerpos que se unen a CPAa de la presente invención, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, se puede utilizar la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (256 Nature 495-497 (1975)). Véanse también la Patente de Estados Unidos Núm. 4.376.110; Ausubel et al., 1988; CURR. PROT. INMUNOL. (Colligan et al., Eds., Greene Pub. Assoc. & Wiley Interscience NY, 1992-1996).
Otra ruta ventajosa para crear anticuerpos humanos de alta afinidad y/o alta avidez implica el cebado con antígenos de esplenocitos humanos nativos in vitro, transferencia de los esplenocitos cebados con antígeno in vitro resultantes a un donante inmunodeprimido, p. ej., un ratón SCID, reforzando con antígeno al donante inmunodeprimido, aislando células B secretoras de anticuerpos humanos (secretoras de IgG) del donante y transformando con VEB las células secretoras de anticuerpos humanos aisladas, como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm.
6.537.809.
Anticuerpos quiméricos humanizados y completamente humanizados
Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos que comprenden anticuerpos en parte humanos y en parte de ratón, en los que la región constante de los anticuerpos humanos se clona en regiones variables de cadenas ligeras y pesadas de ratón. En algunos casos, se conserva 70% de las secuencias humanas. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos en los que quizás se conserva 90% del marco del anticuerpo humano, y se combinan sólo con las regiones determinantes de la complementariedad murinas. Los anticuerpos completamente humanizados también se contemplan en la presente invención.
En la presente memoria se proporcionan anticuerpos murinos o murino-humano o humano-humano recombinantes que se unen a un epítopo 16C3 incluido en los restos de aminoácidos de CPAA, y se pueden producir utilizando técnicas conocidas basadas en las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria. Véanse, p. ej., Ausubel et al., 1987, 1992 y 1993; Sambrook et al., 1989. Por ejemplo, un anticuerpo puede humanizarse injertando las CDR deseadas en un marco humano de acuerdo con la Patente Europea EP0239400.
El ADN que codifica un anticuerpo anti-CPAA de la presente invención puede ser ADN genómico o ADNc que codifica al menos una de las regiones constantes de la cadena pesada (Hc), la región variable de la cadena pesada (Hv), la región variable de la cadena ligera (Lv) y las regiones constantes de la cadena ligera (Lc). Una alternativa conveniente al uso de fragmentos de genes cromosómicos como fuente de ADN que codifica el segmento de unión al antígeno de la región V murina es el uso de ADNc para la construcción de genes de inmunoglobulina quiméricos.
Véanse p. ej., Liu et al. 84 P.N.A.S., EE. UU. 3439 (1987); 139 J. Immunol. 3521 (1987). El uso de ADNc requiere que los elementos de expresión génica apropiados para la célula anfitriona se combinen con el gen para lograr la síntesis de la proteína deseada. El uso de secuencias de ADNc es ventajoso sobre las secuencias genómicas (que contienen intrones), ya que las secuencias de ADNc se pueden expresar en bacterias u otros anfitriones que carecen de sistemas de corte y empalme de ARN apropiados.
Por ejemplo, se puede proporcionar un ADNc que codifica segmentos de unión a antígenos de las regiones V y C murinas que tienen actividad anti-CPAA utilizando métodos conocidos basados en el uso de las secuencias de ADN presentadas en la FIG. 2 - FIG. 5. Se pueden utilizar sondas que se unen a una parte de las secuencias de ADN presentadas en la FIG. 2 o FIG. 3 para aislar ADN de hibridomas que expresan anticuerpos, fragmentos o regiones anti-CPAA, como se presentan en la presente memoria, de acuerdo con la presente invención, mediante métodos conocidos.
Los oligonucleótidos que representan las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos que se unen a CPAA, presentados en la FIG. 2 y FIG. 3 son útiles para escrutar la presencia de genes homólogos y para la clonación de tales genes que codifican regiones variables o constantes de un anticuerpo anti-CPAA. Tales sondas normalmente se unen a secuencias de ADN (ADNc, ADN genómico o cualquier otro ADN) que codifican las secuencias de aminoácidos subrayadas en la FIG. 4 y FIG. 5 de las regiones CDR de cadena ligera o cadena pesada que se unen a un epítopo de CPAA. Tales técnicas para sintetizar tales oligonucleótidos son bien conocidas. Véanse, p. ej., Wu et al., 21 Prog. Nucl. Acids Res. Molec. Biol. 101-41 (1978); Ausubel et al., 1987, 1993.
En una forma alternativa de clonación de un polinucleótido que codifica una región variable o constante anti-CPAA, se prepara una biblioteca de vectores de expresión clonando ADN o ADNc (de una célula capaz de expresar un anticuerpo anti-CPAA o región variable o constante) en una vector de expresión. A continuación, la biblioteca se escruta en busca de miembros capaces de expresar una proteína que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo anti-CPAA, tal como A2 o cA2, y que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de codificar péptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos que los anticuerpos anti-CPAA o fragmentos de los mismos. En esta realización, el ADN, tal como el ADNc, se extrae y purifica de una célula que es capaz de expresar un anticuerpo o fragmento anti-CPAA. El ADNc purificado se fragmenta (mediante cizallamiento, digestión con endonucleasas, etc.) para producir una reserva de fragmentos de ADN o de ADNc. Los fragmentos de ADN o de ADNc de esta reserva se clonan a continuación en un vector de expresión para producir una biblioteca genómica de vectores de expresión cuyos miembros contienen cada uno un fragmento de ADN o de ADNc clonado único, tal como en una biblioteca de fagos lambda, expresión en células procarióticas (p. ej., bacterias) o células eucarióticas, (p. ej., mamífero, levadura, insecto u hongo). Véanse, p. ej., Ausubel, 1987, 1993; Harlow, 1988; Colligan, 1992­ 1996; Nyyssonen et al. 11 Bio/Tecnology 591-95 (1993); Marks et al., 11 Bio/Technology 1145-49 (1993).
Una vez que se aísla el ácido nucleico que codifica tales regiones anti-CPAA variables o constantes, el ácido nucleico se puede expresar de manera apropiada en una célula anfitriona, junto con otro ácido nucleico que codifica la cadena pesada o ligera constante o variable, para proporcionar anticuerpos monoclonales recombinantes que se unen a CPAA con actividad inhibidora. Tales anticuerpos pueden incluir una región variable anti-CPAA murina o humana que contiene un resto del marco que tiene restos determinantes de complementariedad que son responsables de la unión del antígeno. En una realización, una cadena ligera o pesada variable anti-CPAA codificada por un ácido nucleico como se describió anteriormente se une a un epítopo de al menos cinco aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de tales cadenas ligeras o pesadas variables anti-CPAA están subrayadas en la FIG. 4, FIG. 5 y FIG. 12.
Los genes humanos que codifican las regiones constantes (C) de los anticuerpos, fragmentos y regiones murinos y quiméricos de la presente invención se pueden obtener de una biblioteca de hígado fetal humano, mediante métodos conocidos. Los genes de las regiones C humanas se pueden obtener de cualquier célula humana, incluidas las que expresan y producen inmunoglobulinas humanas. La región Ch humana se puede obtener de cualquiera de las clases o isotipos conocidos de cadenas H humanas, incluyendo y, M, a, 8 o £, y subtipos de las mismas, tales como G1, G2, g 3 y G4. Dado que el isotipo de la cadena H es responsable de las diversas funciones efectoras de un anticuerpo, la elección de la región Ch estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como la fijación del complemento o la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Por ejemplo, la región Ch se obtiene de y1 (IgG1), y3 (IgG3), y4 (IgG4) o m (IgM). La región Cl humana se puede obtener a partir de cualquier isotipo de la cadena L humana, kappa o lambda.
Los genes que codifican las regiones C de inmunoglobulina humana se obtienen a partir de células humanas mediante técnicas de clonación convencionales (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987, 1993). Los genes de la región C humana están fácilmente disponibles a partir de clones conocidos que contienen genes que representan las dos clases de cadenas L, las cinco clases de cadenas H y las subclases de las mismas. Se pueden preparar fragmentos de anticuerpos quiméricos, tales como F(ab')2 y Fab, diseñando un gen de cadena H quimérico que esté apropiadamente truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción de la cadena H de un fragmento F(ab')2 incluiría secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y región bisagra de la cadena H, seguido de un codón de terminación de la traducción para producir la molécula truncada.
Generalmente, los anticuerpos, fragmentos y regiones murinos, humanos o murinos y quiméricos de la presente invención se producen clonando segmentos de ADN que codifican las regiones de unión a antígeno de las cadenas H y L de un anticuerpo específico contra CPAA, y uniendo estos segmentos de ADN a segmentos de ADN que codifican regiones CH y CL, respectivamente, para producir genes que codifican inmunoglobulina murina, humana o quimérica.
Así, en una realización, se crea un gen quimérico fusionado que comprende un primer segmento de ADN que codifica al menos la región de unión a antígeno de origen no humano, tal como una región V reordenada funcionalmente con el segmento de unión (J), conectado a un segundo segmento de ADN que codifica al menos una parte de una región C humana.
Por lo tanto, para el ADNc que codifica las regiones V y C del anticuerpo, el método de producción del anticuerpo quimérico de acuerdo con la presente invención implica varias etapas, que se describen a continuación:
1. aislamiento de ARN mensajero (ARNm) de la línea celular que produce un anticuerpo anti-CPAA y de anticuerpos adicionales opcionales que suministran regiones constantes pesadas y ligeras; clonación y producción de ADNc a partir del mismo;
2. preparación de una biblioteca de ADNc de longitud completa a partir de ARNm purificado a partir del cual los segmentos génicos de la región V y/o C apropiados de los genes de las cadenas L y H pueden: (i) identificarse con sondas apropiadas, (ii) secuenciarse y (iii) hacerse compatibles con un segmento del gen C o V de otro anticuerpo para un anticuerpo quimérico;
3. Construcción de secuencias codificantes de cadenas H o L completas mediante conexión de los segmentos génicos de la región V específicos clonados con el gen de la región C clonado, como se describió anteriormente;
4. Expresión y producción de cadenas L y H en anfitriones seleccionados, incluidas células procarióticas y eucarióticas para proporcionar anticuerpos murino-murino, humano-murino, humano-humano o murino humano.
Una característica común de todos los genes de las cadenas H y L de inmunoglobulina y sus ARNm codificados es la región J. Las regiones J de las cadenas H y L tienen secuencias diferentes, pero existe un alto grado de homología de secuencia (más de 80%) entre cada grupo, especialmente cerca de la región C. Esta homología se explota en este método y las secuencias consenso de las regiones J de las cadenas H y L se pueden utilizar para diseñar oligonucleótidos para su uso como cebadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para la conexión posterior de los segmentos de la región V a los segmentos de la región C humana.
Los vectores de ADNc de la región C preparados a partir de células humanas se pueden modificar mediante mutagénesis dirigida al sitio para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana. Por ejemplo, se puede clonar la región C de la cadena kappa humana completa (Ck) y la región C gamma-1 humana completa (CY-i). En este caso, el método alternativo basándose en clones de la región C genómica como fuente de los vectores de la región C no permitiría que estos genes se expresen en sistemas bacterianos donde las enzimas necesarias para eliminar las secuencias intermedias están ausentes. Los segmentos de la región V clonados se escinden y se ligan a los vectores de la región C de la cadena L o H. Alternativamente, la región Cy-i humana se puede modificar introduciendo un codón de terminación generando así una secuencia de genes que codifica la porción de la cadena H de una molécula Fab. Las secuencias codificantes con las regiones V y C conectadas se transfieren a continuación a vehículos de expresión apropiados para la expresión en anfitriones apropiados: procarióticos o eucarióticos.
Se dice que dos secuencias de ADN codificantes están "conectadas operablemente" si la conexión da como resultado una secuencia traducible continuamente sin alteración o interrupción del marco de lectura del triplete. Una secuencia codificante de ADN está conectada operablemente a un elemento de expresión génica si la conexión da como resultado la función adecuada de ese elemento de expresión génica para producir la expresión de la secuencia codificante.
Los vehículos de expresión incluyen plásmidos u otros vectores. Entre estos se encuentran los vehículos que portan una secuencia de la cadena Ch o Cl humana funcionalmente completa que tiene sitios de restricción apropiados diseñados para que cualquier secuencia de la cadena Vh o Vl con extremos cohesivos apropiados se pueda insertar fácilmente en ella. Los vehículos que contienen secuencias de la cadena Ch o Cl humana sirven por tanto como intermedios para la expresión de cualquier cadena H o L completa deseada en cualquier anfitrión apropiado.
Un anticuerpo quimérico, tal como ratón-humano o humano-humano, se sintetizará típicamente a partir de genes dirigidos por los promotores de genes cromosómicos nativos de las regiones V de las cadenas H y L de ratón utilizadas en las construcciones; el corte y empalme se producen normalmente entre el sitio donador de corte y empalme en la región J del ratón y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región C humana y también en las regiones de corte y empalme que aparecen dentro de la región C humana; la poliadenilación y la terminación de la transcripción se producen en sitios cromosómicos nativos aguas abajo de las regiones codificantes humanas. Véase la Patente de Estados Unidos Núm. 6.835.823.
Los "anticuerpos completamente humanizados" contra CPAA también se contemplan en la presente invención. Los anticuerpos completamente humanizados son moléculas que contienen tanto la región variable como la constante de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos completamente humanizados se pueden utilizar potencialmente para uso terapéutico, donde se requieren tratamientos repetidos para enfermedades crónicas y recurrentes tales como enfermedades autoinmunitarias. Un método para la preparación de anticuerpos completamente humanos consiste en la "humanización" del sistema inmunológico humoral del ratón, es decir, la producción de cepas de ratón capaces de producir Ig humana (Xenomice), mediante la introducción de loci de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en los que los genes de Ig endógenos han sido inactivados. Los loci de Ig son extremadamente complejos en términos tanto de su estructura física como de los procesos de reordenamiento y expresión de genes necesarios para producir finalmente una amplia respuesta inmunitaria. La diversidad de anticuerpos se genera principalmente por reordenamiento combinatorio entre diferentes genes V, D y J presentes en los loci de Ig. Estos loci también contienen los elementos reguladores intercalados, que controlan la expresión de anticuerpos, la exclusión alélica, el cambio de clase y la maduración de la afinidad. La introducción de transgenes de Ig humana no reordenados en ratones ha demostrado que la maquinaria de recombinación del ratón es compatible con genes humanos. Además, se pueden obtener hibridomas que secretan hu-mAb específicos de antígeno de varios isotipos mediante inmunización con Xenomice con antígeno. Se conocen en la técnica anticuerpos completamente humanizados y métodos para su producción. Véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 7.276.239 y Núm. 6.835.823.
La presente invención se refiere a la producción de un anticuerpo humanizado, que se prepara mediante un procecedimiento que comprende mantener un anfitrión transformado con un primer vector de expresión que codifica la cadena ligera del anticuerpo humanizado y con un segundo vector de expresión que codifica la cadena pesada del anticuerpo humanizado en condiciones tales que se exprese cada cadena y se aislar el anticuerpo humanizado formado por ensamblaje de las cadenas así expresadas. El primer y segundo vector de expresión pueden ser el mismo vector. La invención se refiere adicionalmente a: una secuencia de ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo humanizado; un vector de expresión que incorpora dicha secuencia de ADN; y un anfitrión transformado con dicho vector de expresión.
Los expertos en la técnica pueden poner en práctica la generación de un anticuerpo humanizado a partir de las secuencias proporcionadas en la presente memoria sin una experimentación indebida. En un enfoque, existen cuatro etapas generales empleadas para humanizar un anticuerpo monoclonal, véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.585.089; Núm. 6.835.823; y Núm. 6.824.989. Estas son: (1) la determinación de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida; (2) el diseño del anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo utilizar durante el proceso de humanización; (3) las metodologías/técnicas de humanización actuales; y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado.
Con respecto a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos predichas, existen dos métodos generales para clonar los ADNc de dominio variable de cadena ligera y pesada de un anticuerpo dado: (a) mediante una biblioteca de ADNc convencional, o (b) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ambos métodos son ampliamente conocidos, véase, p. ej., la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm.
20030166871. Dada la secuencia de nucleótidos de los ADNc, es muy sencillo traducir esta información a la secuencia de aminoácidos predicha de los dominios variables del anticuerpo. En el presente caso, las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C3 se muestran en la FIG. 2 y FIG. 3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos predichas de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C3 se muestran en la FIG. 4 y FIG. 5, respectivamente.
Con respecto al diseño del anticuerpo humanizado, existen varios factores a considerar al decidir qué secuencia de anticuerpo humano utilizar durante la humanización. La humanización de las cadenas ligeras y pesadas se considera de forma independiente entre sí, pero el razonamiento es básicamente similar para cada una. Este proceso de selección se basa en el siguiente fundamento: la especificidad y afinidad del antígeno de un anticuerpo dado está determinada principalmente por la secuencia de aminoácidos de las CDR de la región variable. Los restos del marco de dominios variables tienen poca o ninguna contribución directa. La función principal de las regiones marco es mantener las CDR en su orientación espacial adecuada para reconocer el antígeno. Por tanto, es muy probable que la sustitución de las CDR de roedor tales como las subrayadas en la FIG. 4 o FIG. 5 en un marco de dominio variable humano dé como resultado la retención de su orientación espacial correcta si el marco de dominio variable humano es altamente homólogo al dominio variable de roedor del que se originaron. Por lo tanto, se puede elegir un dominio variable humano que sea altamente homólogo al dominio o dominios variables de roedor.
Se puede seleccionar una secuencia de dominio variable de anticuerpo humano adecuada de la siguiente manera:
1. Utilizando un programa informático, buscar en todas las bases de datos de proteínas (y ADN) disponibles aquellas secuencias de dominios variables de anticuerpos humanos que sean más homólogas a los dominios variables de anticuerpos de roedores. El resultado de un programa adecuado es una lista de las secuencias más homólogas al anticuerpo de roedor, el porcentaje de homología con cada secuencia y un alineamiento de cada secuencia con la secuencia de roedor. Esto se realiza de forma independiente para las secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada. Los análisis anteriores se realizan más fácilmente si solo se incluyen secuencias de inmunoglobulina humana.
2. Enumerar las secuencias del dominio variable del anticuerpo humano y compararlas para determinar la homología. Principalmente, la comparación se realiza sobre la longitud de las CDR, excepto la CDR3 de la cadena pesada, que es bastante variable. Las cadenas pesadas humanas y las cadenas ligeras Kappa y Lambda se dividen en subgrupos; 3 subgrupos de cadena pesada, 4 subgrupos de cadena Kappa, 6 subgrupos de cadena lambda. Los tamaños de CDR dentro de cada subgrupo son similares, pero varían entre subgrupos. Normalmente es posible hacer coincidir una CDR de anticuerpo de roedor con uno de los subgrupos humanos como una primera aproximación de homología. Los anticuerpos que portan CDR de longitud similar se comparan a continuación en cuanto a homología de secuencia de aminoácidos, especialmente dentro de las CDR, pero también en las regiones marco circundantes. El dominio variable humano que es más homólogo se elige como marco para la humanización.
Las metodologías y técnicas de humanización reales también están al alcance de los expertos en la técnica. Por lo tanto, se puede preparar una secuencia de ADN que codifique el anticuerpo reformado deseado comenzando con el ADN humano cuyas CDR se desea reformar. La secuencia de aminoácidos del dominio variable de roedor que contiene las CDR deseadas se compara con la de la secuencia del dominio variable del anticuerpo humano elegida. Los restos en el dominio variable humano están marcados y necesitan cambiarse al resto correspondiente en el roedor para hacer que la región variable humana incorpore las CDR del roedor. También puede haber restos que necesiten ser sustituidos, añadidos o eliminados de la secuencia humana.
Se sintetizan oligonucleótidos que se pueden utilizar para mutagenizar el marco del dominio variable humano para que contenga los restos deseados. Estos oligonucleótidos pueden tener cualquier tamaño conveniente. Normalmente, la longitud de uno solo está limitada por las capacidades del sintetizador particular que se tiene disponible. El método de mutagénesis in vitro dirigida por oligonucleótidos es bien conocido en la técnica.
Alternativamente, la humanización se puede lograr utilizando la metodología de reacción en cadena de la polimerasa recombinante (PCR) de la Patente de Estados Unidos Núm. 5.858.725. Utilizando esta metodología, una CDR se puede cortar y empalmar entre las regiones marco de un anticuerpo humano. En general, la técnica de la Patente de Estados Unidos Núm. 5.858.725 se puede realizar utilizando un molde que comprende dos regiones marco humanas, AB y CD, y entre ellas, la c Dr que debe ser reemplazada por una CDR donadora. Los cebadores A y B se utilizan para amplificar la región marco CD. Sin embargo, los cebadores B y C también contienen cada uno, en sus extremos 5', una secuencia adicional correspondiente a toda o al menos parte de la secuencia de CDR donadora. Los cebadores B y C se solapan en una longitud suficiente para permitir la reasociación de sus extremos 5' entre sí en condiciones que permitan realizar una PCR. Por tanto, las regiones amplificadas AB y CD pueden experimentar corte y empalme de genes mediante extensión solapante para producir el producto humanizado en una única reacción.
Alternativamente, la humanización se puede lograr mediante la síntesis química de los ADN que codifican las proteínas de inmunoglobulina humanizadas, o fragmentos de las mismas, y utilizando técnicas convencionales de biología molecular para amplificar y subclonar los genes sintéticos en un vector de expresión apropiado. En este caso, se sintetizan y purifican químicamente múltiples oligonucleótidos efectores y antisentido con secuencias solapantes que abarcan la región codificante completa de los genes del anticuerpo humanizado. A continuación, los oligonucleótidos se mezclan entre sí de manera que los oligonucleótidos de la hebra efectora solapantes puedan reasociarse con sus compañeros de hebra antisentido, y el gen completo se puede amplificar hasta una cantidad suficiente utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. Los genes diana pueden a continuación clonarse en un plásmido de expresión utilizando enzimas de restricción convenientemente diseñadas.
En la FIG. 6, FIG. 7 y FIG. 12 se presentan varias secuencias de cadena ligera y pesada para el anticuerpo 16C3 humanizado, diseñadas de acuerdo con diversas técnicas como se describe en la presente memoria. Más específicamente, se presentan cinco diseños diferentes para convertir el anticuerpo 16C3 murino en un anticuerpo humanizado terapéuticamente útil. Los diseños se basan en información estructural sobre secuencias de anticuerpos humanas y murinas conocidas. Por ejemplo, refiriéndose a la FIG. 6 y FIG. 7, "ven16C3" se ha modificado superficialmente con secuencias marco humanas, "cdr16C3" se ha remodelado con aminoácidos de CDR humanas, "abb16C3" representa injerto de CDR abreviado, "sdr16C3" representa cambios de aminoácidos que determinan el sitio y "fra16C3" representa un enfoque "Frankenstein" para remodelar la región variable mediante el uso de una combinación de varias "piezas" de regiones variables humanas. Se utilizaron secuencias de IgG de la línea germinal humana para las secuencias marco.
Además, como se describe en los ejemplos siguientes, un anticuerpo humanizado recombinante puede optimizarse adicionalmente para disminuir la inmunogenicidad potencial, a la vez que se mantiene la actividad funcional, para la terapia en seres humanos. A este respecto, actividad funcional significa un polipéptido capaz de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con un anticuerpo 16C3 de la invención. Tales actividades funcionales incluyen actividad biológica y capacidad para unirse a un ligando para un polipéptido 16C3. Además, un polipéptido que tiene actividad funcional significa que el polipéptido exhibe una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a la actividad de un polipéptido 16C3 de la presente invención, incluidas las formas maduras, según se mide en un ensayo concreto, tal como, por ejemplo, un ensayo biológico, con o sin dependencia de la dosis. En caso de que exista dependencia de la dosis, no es necesario que sea idéntica a la de los polipéptidos 16C3, sino sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con los polipéptidos 16C3 de la presente invención (es decir, el polipéptido candidato exhibirá una actividad mayor, o no más de aproximadamente 25 veces menos, aproximadamente 10 veces menos o aproximadamente 3 veces menos de actividad con respecto a los polipéptidos 16C3 de la presente invención).
El anticuerpo 16C3 humanizado optimizado, designado H16C3-Abb*, comprende los restos de aminoácido que se muestran en la FIG. 12. Obsérvese que algunos de los restos de aminoácido dentro de las CDR del anticuerpo se han cambiado a partir de los presentes en las CDR murinas originales. Las diferentes CDR se consideran ejemplos de variantes entre sí, que tienen equivalencia funcional, dentro del alcance de la presente solicitud.
Después de las reacciones de mutagénesis para remodelar el anticuerpo, los ADN mutagenizados pueden conectarse a un ADN apropiado que codifique una región constante de cadena ligera o pesada, clonarse en un vector de expresión y transfectarse a células anfitrionas, tales como células de mamífero. Estas etapas se pueden realizar de forma rutinaria. Por tanto, se puede preparar un anticuerpo reformado mediante un procedimiento que comprende:
(a) preparar un primer vector de expresión replicable que incluye un promotor adecuado conectado operablemente a una secuencia de ADN que codifica al menos un dominio variable de una cadena pesada o ligera de Ig, comprendiendo el dominio variable regiones marco de un anticuerpo humano y las CDR necesarias para el anticuerpo humanizado de la invención;
(b) preparar un segundo vector de expresión replicable que incluye un promotor adecuado conectado operablemente a una secuencia de ADN que codifica al menos el dominio variable de una cadena ligera o pesada de Ig complementaria, respectivamente;
(c) transformar una línea celular con el primer o ambos vectores preparados; y
(d) cultivar dicha línea celular transformada para producir dicho anticuerpo alterado.
La secuencia de ADN en la etapa (a) puede codificar tanto el dominio variable como cada dominio constante de la cadena del anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado se puede preparar utilizando cualquier sistema de expresión recombinante adecuado. La línea celular que se transforma para producir el anticuerpo alterado puede ser una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) o una línea celular de mamífero inmortalizada, que es ventajosamente de origen linfoide, tal como una línea celular de mieloma, hibridoma, trioma o cuadroma. La línea celular también puede comprender una célula linfoide normal, tal como una célula B, que ha sido inmortalizada por transformación con un virus, tal como el virus de Epstein-Barr. Por ejemplo, la línea celular inmortalizada es una línea celular de mieloma o un derivado de la misma.
Las células CHO utilizadas para la expresión de los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden ser deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr) y, por tanto, dependientes de timidina e hipoxantina para su crecimiento. Véase Urlaub et al., 77 P.N.A.S. Estados Unidos 4216-20 (1980). La línea celular ChO dhfr parental se transfecta con el ADN que codifica el anticuerpo y dhfr que permite la selección de transfectantes de células CHO de fenotipo dhfr positivo. La selección se lleva a cabo cultivando las colonias en medios desprovistos de timidina e hipoxantina, cuya ausencia impide que las células no transfectadas crezcan y que las células transformadas vuelvan a rescatar la ruta del folato y eviten así el sistema de selección. Estos transfectantes normalmente expresan niveles bajos del ADN de interés en virtud de la cointegración del ADN de interés transfectado y el ADN que codifica dhfr. Los niveles de expresión del ADN que codifica el anticuerpo se pueden aumentar mediante amplificación utilizando metotrexato (MTX). Este fármaco es un inhibidor directo de la enzima dhfr y permite el aislamiento de colonias resistentes que amplifican su número de copias del gen dhfr lo suficiente como para sobrevivir en estas condiciones. Dado que las secuencias de ADN que codifican dhfr y el anticuerpo están estrechamente vinculadas en los transfectantes originales, suele haber una amplificación concomitante y, por lo tanto, una mayor expresión del anticuerpo deseado. Otro sistema de expresión para utilizar con CHO o células de mieloma es el sistema de amplificación de glutamina sintetasa (GS) descrito, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.122.464. Este sistema implica la transfección de una célula con ADN que codifica la enzima GS y con ADN que codifica el anticuerpo deseado. A continuación, se seleccionan las células que crecen en medio sin glutamina y, por tanto, se puede suponer que han integrado el ADN que codifica GS. A continuación, estos clones seleccionados se someten a inhibición de la enzima GS utilizando metionina sulfoximina (Msx). Las células, para sobrevivir, amplificarán el ADN que codifica GS con la amplificación concomitante del ADN que codifica el anticuerpo.
Aunque la línea celular utilizada para producir el anticuerpo humanizado puede ser una línea celular de mamífero, se puede utilizar alternativamente cualquier otra línea celular adecuada, tal como una línea celular bacteriana o una línea celular de levadura. Por ejemplo, en casos que no requieran modificación postraduccional in vivo (tales como los casos en los que no se requiere glicosilación), se prevé que se puedan utilizar cepas bacterianas derivadas que E. coli. Se comprueba la funcionalidad del anticuerpo obtenido. Si se pierde la funcionalidad, es necesario volver a la etapa (2) y alterar el marco del anticuerpo.
Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención se pueden recuperar y purificar mediante técnicas conocidas, p. ej., cromatografía de inmunoabsorción o inmunoafinidad, métodos cromatográficos tales como HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel o cualquier combinación de estos. Véase en general, Scopes, PROT. PURIF. (Springer-Verlag, Nueva York, 1982). Las inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90% a 95% de homogeneidad son ventajosas, al igual que aquellas con 98% a 99% o más de homogeneidad, particularmente para usos farmacéuticos. Una vez purificado, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, un anticuerpo humanizado se puede utilizar a continuación, terapéuticamente o para desarrollar y realizar procedimientos de ensayo, tinciones inmunofluorescentes y similares. Véase en general, Vol. I y II Immunol. Meth. (Lefkovits & Pernis, eds., Acad. Press, NY, 1979 y 1981).
Bibliotecas de fagos y sistemas de expresión recombinante alternativos
Junto con las técnicas de producción anteriores, sistemas in vitro tales como métodos de presentación en fagos de anticuerpos y péptidos de anticuerpos completamente humanos, se están obteniendo ahora muchos de los beneficios de los anticuerpos humanos en forma diagnóstica y terapéutica.
El anticuerpo recombinante y sus secuencias de la presente invención permiten la construcción de una miríada de derivados y moléculas de unión a ligando con actividad de unión anti-PCAA. Por ejemplo, las CDR pueden recombinarse con una biblioteca de anticuerpos tal como la biblioteca de scFV humano n-CoDeR para crear fragmentos de anticuerpos altamente específicos y funcionales. Véase Moore, 426 Nature, 725-31 (2003).
También se puede crear una biblioteca de anticuerpos completamente humanos o porciones de los mismos siguiendo los métodos de clonación basados en la escisión específica del sitio de los ADN de hebra sencilla como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20030232333.
Otra molécula de unión a ligando que se puede construir a partir de la información de la secuencia de ADN contenida en la presente memoria, y el conocimiento asociado obtenido sobre los epítopos de PCAA proporcionado por la invención en la presente memoria, implica la construcción de lipocalinas ANTICALINS®, un grupo extenso de proteínas pequeñas y robustas que generalmente están implicada en el transporte o almacenamiento fisiológico de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Varias lipocalinas naturales se encuentran en tejidos humanos o líquidos corporales. A pesar de la baja homología de secuencia mutua, las lipocalinas comparten un barril p estructuralmente conservado que sostiene cuatro bucles en un extremo, que forman la entrada a un bolsillo de unión. Los bucles exhiben grandes diferencias conformacionales entre lipocalinas individuales y dan lugar a una variedad de especificidades de ligandos naturales. Esta arquitectura de proteínas recuerda a las inmunoglobulinas, con sus bucles hipervariables sobre un marco rígido. A diferencia de los anticuerpos o de algunos fragmentos de anticuerpos, las lipocalinas están compuestas por una sola cadena polipeptídica con 160 a 180 restos de aminoácido, que son apenas más grandes que un solo dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro bucles que forma el bolsillo de unión muestra plasticidad estructural y tolera una variedad de cadenas laterales. Por tanto, el sitio de unión se puede reformar para reconocer moléculas diana prescritas de diferente forma con alta afinidad y especificidad. Las lipocalinas ANTICALINS® se han diseñado para reconocer compuestos de tipo hapteno, péptidos y proteínas diana, p. ej. dominios extracelulares de los receptores de la superficie celular. También se han preparado con éxito proteínas de fusión con enzimas y también proteínas de unión biespecíficas (las denominadas proteínas de unión biespecíficas DUOCALINS®, Pieris AG, Freising-Weihenstephan, Alemania). Se han realizado experimentos preclínicos. Véase, p. ej., Korndórfer et al., 330 J. Mol. Biol. 385-96 (2003).
Otro tipo de anticuerpo con aplicación a la invención descrita en la presente memoria incluye las inmunoglobulinas de camélido que poseen cadenas pesadas funcionales y carecen de cadenas ligeras. Estos anticuerpos se ensamblan a partir de genes gamma V y C exclusivos. Se han clonado y adaptado utilizando tecnología de presentación en fagos para producir fragmentos de anticuerpos de dominio único específicos de antígeno con alta estabilidad intrínseca. Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20030088074.
Otro derivado relevante aprovecha la nueva tecnología para proporcionar fragmentos de anticuerpos producidos por bacterias que pueden entrecruzar moléculas efectoras de antígeno y anticuerpo (moléculas de la región Fc), llamadas fragmentos de anticuerpo PEPBODIES™. Véase la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20040101905. Por lo tanto, las moléculas de unión que comprenden el sitio de unión a antígeno del sitio anti-PCAA están fusionadas genéticamente a péptidos que presentan una o más de las funciones efectoras asociadas con la región Fc, y proporcionan funciones tales como la interacción con los receptores celulares y la activación del complemento.
Las nuevas moléculas de receptor de antígeno (IgNAR) de los tiburones también se pueden considerar una molécula de anticuerpo "derivada". El NAR es un dímero unido por enlaces disulfuro de dos cadenas de proteínas, cada una de las cuales contiene un dominio variable y cinco constantes, y funciona como un anticuerpo. Nuttall et al., 270 Eur. J. Biochem., 3543-54 (2003). Las secuencias del anticuerpo de unión a PCAA de la presente invención se pueden construir en la región variable NAR para crear una biblioteca in vitro que incorpora las regiones CDR sintéticas. Esto da como resultado un reactivo de unión de dominio único.
Uno de los avances recientes en la biología de las células cancerosas implica el descubrimiento de líneas de células progenitoras que pueden exhibir marcadores de células cancerosas. Por ejemplo, se han identificado las células progenitoras del epitelio pancreático humano y se han hecho crecer en cultivo. Estas células se pueden utilizar a continuación para la generación de antígenos útiles, entre otros, para el desarrollo de anticuerpos monoclonales. Patente de Estados Unidos Núm. 6.436.704. Por tanto, el anticuerpo de unión a PCAA se puede utilizar para identificar células progenitoras. Estas células progenitoras se pueden utilizar como inmunógeno que se administra a un receptor heterólogo, tal como un ratón, para la obtención de líneas adicionales de anticuerpos de unión a PCAA. En conclusión, las secuencias de oligonucleótidos y aminoácidos proporcionadas en la presente memoria permiten una miríada de posibles moléculas con actividad de unión a CPAA, y el alcance de la presente invención no está limitado por los métodos para conseguir esas moléculas.
Derivados de anticuerpos
Un "derivado" de un anticuerpo contiene radicales químicos adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Las modificaciones covalentes de la proteína se incluyen dentro del alcance de esta invención. Tales modificaciones se pueden introducir en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácido elegidos como diana del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales o restos terminales seleccionados. Por ejemplo, la derivatización con agentes bifuncionales, bien conocida en la técnica, es útil para entrecruzar el anticuerpo o fragmento con una matriz de soporte insoluble en agua o con otros portadores macromoleculares.
Los derivados también incluyJe 1n25 an 1t3i1cuerp 1os mon 1o4clonales ma 3r5cados radia 11c1tivamente 3' que están marcados, 1 por ejemplo, con yodo radiactivo ( I, I), carbono ( C), azufre ( S), indio ( In), tritio ( H) o similares; productos conjugados de anticuerpos monoclonales con biotina o avidina, con enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucoamilasa, ácido carboxílico anhidrasa, acetilcolina esterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa; y también productos conjugados de anticuerpos monoclonales con agentes bioluminiscentes (tales como luciferasa), agentes quimioluminiscentes (tales como ésteres de acridina) o agentes fluorescentes (tales como ficobiliproteínas). Un ejemplo de un derivado del anticuerpo de la invención es un producto conjugado anticuerpo-fármaco de molécula pequeña, tal como un producto conjugado de anticuerpo-maitansinoide, que muestra actividad citotóxica. Véase la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20040039176. La evaluación preclínica ha demostrado que este producto conjugado actúa como un profármaco activado por tumores que exhibe una potente actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto. A continuación, se analizan otros derivados de anticuerpos citotóxicos.
Otro anticuerpo bifuncional derivado de la presente invención es un anticuerpo biespecífico, generado combinando partes de dos anticuerpos separados que reconocen dos grupos antigénicos diferentes. Esto se puede lograr mediante técnicas de entrecruzamiento o recombinantes. Además, se pueden añadir radicales al anticuerpo o una porción del mismo para aumentar la semivida in vivo (p. ej., alargando el tiempo de eliminación del torrente sanguíneo. Tales mecanismos incluyen, por ejemplo, la adición de radicales PEG (también denominada pegilación) y son bien conocidos en la técnica. Véase Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm.
20030031671.
Ab anti-idiotipo
Además de los anticuerpos anti-CPAA monoclonales o quiméricos, la presente invención también está dirigida a un anticuerpo antiidiotípico (anti-Id) específico para el anticuerpo anti-CPAA de la invención. Un anticuerpo anti-Id es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con la región de unión a antígeno de otro anticuerpo. El anticuerpo específico para CPAA se denomina anticuerpo idiotípico o Id. El anti-Id se puede preparar inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (p. ej., cepa de ratón) como fuente del anticuerpo Id con el anticuerpo Id o la región de unión a antígeno del mismo. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante y producirá un anticuerpo anti-Id. El anticuerpo anti-Id también se puede utilizar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal más, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al anticuerpo original que indujo el anti-Id. Por tanto, mediante el uso de anticuerpos contra los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad.
Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales generados contra CPAA según la presente invención se pueden utilizar para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Se pueden utilizar células de bazo de tales ratones inmunizados para producir hibridomas anti-Id que secretan mAb anti-Id. Adicionalmente, los mAb anti-Id se pueden acoplar a un portador tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) y utilizar para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del mAb original específico para un epítopo de CPAA.
Idiotipos, Antiidiotipos
Además, se pueden utilizar anticuerpos contra CPAA, sus análogos, porciones, fragmentos, péptidos o derivados de los mismos para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Las células del bazo de tales ratones inmunizados se utilizan para producir hibridomas anti-Id que secretan anticuerpos monoclonales anti-Id. Adicionalmente, los anticuerpos anti-Id se pueden acoplar a un portador tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) y utilizar para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del anticuerpo monoclonal original específico para un epítopo de CPAA, o análogos, fragmentos y derivados del mismo. Los anticuerpos anti-Id tienen por tanto sus propios epítopos idiotípicos o "idiotopos" estructuralmente similares al epítopo que se está evaluando.
Un anticuerpo antiidiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Se puede preparar un anticuerpo Id inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (p. ej., cepa de ratón) como fuente del mAb con el mAb para el que se está preparando un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo contra estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.699.880 y Núm. 6.835.823. El anticuerpo anti-Id también se puede utilizar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal más, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-Id. Por tanto, mediante el uso de anticuerpos contra los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad.
Análogos estructurales de anticuerpos anti-CPAA y péptidos anti-CPAA
Los análogos estructurales de los anticuerpos y péptidos anti-CPAA de la presente invención se proporcionan mediante etapas de métodos conocidos basándose en las enseñanzas y guías presentadas en la presente memoria.
El conocimiento de las estructuras tridimensionales de las proteínas es fundamental para comprender cómo funcionan. Las estructuras tridimensionales de cientos de proteínas están actualmente disponibles en las bases de datos de estructuras de proteínas (en contraste con los miles de secuencias de proteínas conocidas en las bases de datos de secuencias). El análisis de estas estructuras muestra que pertenecen a clases de motivos reconocibles. Por tanto, es posible modelar una estructura tridimensional de una proteína basándose en la homología de la proteína con una proteína relacionada de estructura conocida. Se conocen muchos ejemplos en los que dos proteínas que tienen una homología de secuencia relativamente baja pueden tener estructuras o motivos tridimensionales muy similares.
En los últimos años ha sido posible determinar las estructuras tridimensionales de proteínas de hasta aproximadamente 15 kDa mediante resonancia magnética nuclear (RMN). La técnica requiere una solución concentrada de proteína pura: no se necesitan cristales ni derivados isomorfos. Mediante este método se han determinado las estructuras de varias proteínas. Los detalles de la determinación de la estructura por RMN son bien conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., Wuthrich, NMR OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS (Wiley, N.Y., 1986); Wuthrich, 243 Science 45-50 (1989); Clore et al., 24 Critical Rev. Biochem. Molec. Biol. 479-564 (1989); Cooke et al., 8 Bioassays 52-56 (1988).
Al aplicar este enfoque, se recopila una variedad de conjuntos de datos de RMN H12D para anticuerpos anti-CPAA y/o péptidos anti-CPAA de la presente invención. Estos son de dos tipos principales. Un tipo, COSY (Espectroscopia Correlacionada) identifica resonancias de protones que están conectados por enlaces químicos. Estos espectros proporcionan información sobre los protones que están conectados por tres o menos enlaces covalentes. NOESY (espectroscopia de mejora nuclear Overhauser) identifica protones que están cerca en el espacio (menos de 0,5 nm). Después de la asignación del sistema de espín completo, NOESY define la estructura secundaria. Los picos cruzados (efectos de Overhauser nucleares o NOE) se encuentran entre los restos que son adyacentes en la secuencia primaria del péptido y se pueden observar para los protones a menos de 0,5 nm de distancia. Los datos recopilados de NOE secuenciales combinados con constantes de acoplamiento de protones de amida y NOE de aminoácidos no adyacentes que son adyacentes a la estructura secundaria, se utilizan para caracterizar la estructura secundaria de los péptidos. Además de predecir la estructura secundaria, los NOE indican la distancia a la que se encuentran los protones en el espacio tanto en la secuencia de aminoácidos primaria como en las estructuras secundarias. Las predicciones de la estructura terciaria se determinan, después de considerar todos los datos, mediante una extrapolación de "mejor ajuste".
Los tipos de aminoácidos se identifican primero utilizando conectividades a través de enlace. A continuación, se asignan aminoácidos específicos utilizando conectividades a través de espacio a restos vecinos, junto con la secuencia de aminoácidos conocida. Después, la información estructural se tabula y es de tres tipos principales: el NOE identifica pares de protones que están cerca en el espacio, las constantes de acoplamiento brindan información sobre los ángulos diedros y los protones amida que se intercambian lentamente brindan información sobre la posición de los enlaces de hidrógeno. Las restricciones se utilizan para calcular la estructura utilizando un tipo de cálculo de geometría de distancia seguido de refinamiento utilizando dinámica molecular restringida. La salida de estos programas de ordenador es una familia de estructuras que son compatibles con los datos experimentales (es decir, el conjunto de restricciones de distancia por pares <0,5 nm). Cuanto mejor esté definida la estructura por los datos, mejor se podrá superponer la familia de estructuras (es decir, mejor será la resolución de la estructura). En las estructuras mejor definidas mediante RMN, la posición de gran parte de la cadena principal (es decir, los átomos de amida, Ca y carbonilo) y las cadenas laterales de los aminoácidos que se encuentran enterrados en el núcleo de la molécula se pueden definir con tanta claridad como en las estructuras obtenidas por cristalografía. Sin embargo, las cadenas laterales de los restos de aminoácidos expuestos en la superficie suelen estar menos definidas. Esto probablemente refleja el hecho de que estos restos superficiales son más móviles y no pueden tener una posición fija. (En una estructura cristalina, esto podría verse como una densidad electrónica difusa).
Por tanto, de acuerdo con la presente invención, el uso de datos espectroscópicos de RMN se combina con el modelado informático para llegar a análogos estructurales de al menos porciones de anticuerpos y péptidos anti-CPAA basados en una comprensión estructural de la topografía. Utilizando esta información, un experto en la técnica sabrá cómo lograr análogos estructurales de anticuerpos o péptidos anti-CPAA, tales como sustituciones de aminoácidos basadas racionalmente que permitan la producción de péptidos en los que se modula la afinidad o avidez de unión de CPAA de acuerdo con los requisitos del uso terapéutico o diagnóstico esperado de la molécula, por ejemplo, el logro de una mayor especificidad para la unión de CPAA.
Alternativamente, los compuestos que tienen las características estructurales y químicas adecuadas como agentes terapéuticos y de diagnóstico anti-CPAA proporcionan análogos estructurales con afinidad selectiva por CPAA. Estudios de modelado molecular de compuestos de unión a CPAA, tales como receptores de CPAA, anticuerpos anti-CPAA u otras moléculas de unión a CPAA, utilizando un programa tal como MacroModel® (Schrodinger, LLC, NY), Insight®II y Discover® (Accelrys Software Inc., Burlington, MA), proporcionan tales requisitos espaciales y orientación de los Ab y/o péptidos anti-CPAA de acuerdo con la presente invención. Tales análogos estructurales de la presente invención proporcionan, por tanto, actividad anti-CPAA cualitativa y cuantitativa selectiva in vitro, in situ y/o in vivo.
Aplicaciones de diagnóstico
La presente invención también proporciona los anticuerpos y péptidos anti-CPAA anteriores para su uso en métodos de diagnóstico in vitro para detectar CPAA en pacientes que se sabe o se sospecha que tienen carcinoma de páncreas o colon. En otro aspecto de la invención, los anticuerpos pueden detectar marcadores moleculares en células morfológicamente normales para proporcionar un escrutinio de detección temprana de individuos libres de enfermedad.
Los anticuerpos y/o péptidos anti-CPAA de la presente invención son útiles para inmunoensayos que detectan o cuantifican CPAA, o anticuerpos anti-CPAA, en una muestra. Un inmunoensayo para CPAA típicamente comprende incubar una muestra clínica o biológica en presencia de un anticuerpo o polipéptido anti-CPAA de alta afinidad (o alta avidez) marcado detectablemente de la presente invención capaz de unirse selectivamente a CPAA y detectar el péptido o anticuerpo marcado que se unen en una muestra. Se conocen bien en la técnica varios procedimientos de ensayo clínico. Véase, p. ej., IMMUNOASSAYS FOR THE 80'S (Voller et al., Eds., Univ. Park, 1981). Tales muestras incluyen biopsia de tejido, sangre, suero y muestras fecales, o líquidos recogidos de la vía colorrectal después de un enema, colonoscopia o solución laxante oral y sometidos a análisis ELISA como se describe a continuación.
Por tanto, un anticuerpo o polipéptido anti-CPAA se puede fijar a nitrocelulosa u otro soporte sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. A continuación, el soporte se puede lavar con tampones adecuados seguido de tratamiento con el péptido o anticuerpo específico de CPAA marcado detectablemente. El soporte en fase sólida se puede lavar a continuación con el tampón una segunda vez para eliminar el péptido o anticuerpo no unidos. La cantidad de marca unida sobre el soporte sólido se puede detectar a continuación mediante etapas de métodos conocidos.
"Soporte en fase sólida" o "portador" se refieren a cualquier soporte capaz de unirse a péptidos, antígenos o anticuerpos. Los soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno (PVDF), dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble hasta cierto punto o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener prácticamente cualquier configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse a CPAA o un anticuerpo anti-CPAA. Por tanto, la configuración del soporte puede ser esférica, como en una cuenta, o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie exterior de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana, tal como una hoja, placa de cultivo, tira reactiva, etc. Por ejemplo, los soportes pueden incluir cuentas de poliestireno. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros portadores adecuados para la unión de anticuerpos, péptidos o antígenos, o pueden determinar los mismos mediante experimentación rutinaria.
Las etapas métodos bien conocidos pueden determinar la actividad de unión de un lote dado de péptido y/o anticuerpo anti-CPAA. Los expertos en la técnica pueden determinar las condiciones operativas y óptimas del ensayo mediante experimentación de rutina.
El marcaje detectable de un péptido y/o anticuerpo específico de CPAA se puede lograr ligando una enzima para su uso en un inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). La enzima ligada reacciona con el sustrato expuesto para generar un radical químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que se pueden utilizar para marcar de forma detectable los anticuerpos específicos de CPAA de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfaglicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparraginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa.
Al marcar radiactivamente los anticuerpos específicos de CPAA, es posible detectar CPAA mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA). Véase Work et al., LAB. TECHNIQUES AND BIOCHEM. IN MOLEC. BIO. (Núm. Holland Pub. Co., NY, 1978). El isótopo radiactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención incluyen: 3H, 125I, 131I, 35S, 14C, y 125I.
También es posible marcar los anticuerpos específicos de CPAA con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado con fluorescencia se expone a la luz de la longitud de onda adecuada, su presencia se puede detectar a continuación debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescente más comúnmente utilizados se encuentran isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.
Los anticuerpos específicos de CPAA también se pueden marcar de forma detectable utilizando metales emisores de fluorescencia tales como 125Eu, u otros de la serie de lantánidos. Estos metales se pueden anclar al anticuerpo específico de CPAA utilizando grupos quelantes de metales tales como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
Los anticuerpos específicos de CPAA también se pueden marcar de forma detectable mediante acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado quimioluminiscentemente se determina a continuación detectando la presencia de la luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster oxalato.
Asimismo, se puede utilizar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo, porción, fragmento, polipéptido o derivado específico de CPAA de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para el marcaje son luciferina, luciferasa y aequorina. La detección del anticuerpo, porción, fragmento, polipéptido o derivado específico de CPAA se puede lograr mediante un contador de centelleo, por ejemplo, si la marca detectable es un emisor gamma radiactivo, o mediante un fluorómetro, por ejemplo, si el marcador es un material fluorescente. En el caso de una marca enzimática, la detección se puede realizar mediante métodos colorométricos que emplean un sustrato para la enzima. La detección también se puede lograr mediante la comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de manera similar.
Para los propósitos de la presente invención, el CPAA que se detecta mediante los ensayos anteriores puede estar presente en una muestra biológica. Se puede utilizar cualquier muestra que contenga CPAA. Por ejemplo, la muestra es un fluido biológico como, por ejemplo, sangre, suero, linfa, orina, heces, exudado inflamatorio, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, un extracto de tejido o producto homogeneizado, y similares. La invención no se limita a ensayos que utilizan sólo estas muestras, sin embargo, es posible que un experto en la técnica, a la luz de la presente memoria descriptiva, determine las condiciones adecuadas que permitan el uso de otras muestras.
La detección in situ se puede lograr retirando una muestra histológica de un paciente y proporcionando la combinación de anticuerpos marcados de la presente invención a tal espécimen. El anticuerpo (o porción del mismo) se puede proporcionar aplicando o superponiendo el anticuerpo marcado (o porción) a una muestra biológica. Mediante el uso de tal procedimiento, es posible determinar no solo la presencia de CPAA sino también la distribución de CPAA en el tejido examinado. Utilizando la presente invención, los expertos en la técnica percibirán fácilmente que se puede modificar cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) para lograr tal detección in situ.
El anticuerpo, fragmento o derivado de la presente invención se pueden adaptar para su utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como ensayo de "dos sitios" o "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) se une a un soporte sólido que es insoluble en el líquido que se está analizando y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado detectablemente para permitir la detección y/o cuantificación del Complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.
Los ensayos inmunométricos típicos incluyen ensayos "directos" en los que el anticuerpo unido a la fase sólida se pone en contacto primero con la muestra que se está probando para extraer el CPAA de la muestra mediante la formación de un complejo binario de anticuerpo en fase sólida-CPAA. Después de un período de incubación adecuado, el soporte sólido se lava para eliminar el resto de la muestra de fluido, incluido el CPAA que no ha reaccionado, si lo hubiera, y a continuación se pone en contacto con la solución que contiene una cantidad conocida de anticuerpo marcado (que funciona como una "molécula informadora"). Después de un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme un complejo con el CPAa unido al soporte sólido a través del anticuerpo no marcado, el soporte sólido se lava una segunda vez para eliminar el anticuerpo marcado que no ha reaccionado. Este tipo de ensayo sándwich directo puede ser un simple ensayo "sí/no" para determinar si CPAA está presente o se puede volver cuantitativo comparando la medida de anticuerpo marcado con la obtenida para una muestra patrón que contiene cantidades conocidas de CPAA. Estos ensayos de "dos sitios" o "sándwich" son descritos por Wide, in RADIOIMMUNE ASSAY METHOD, 199-206 (Kirkham, ed., Livingstone, Edimburgo, 1970). Otros tipos de ensayos "sándwich", que también pueden ser útiles con CPAA, son los denominados ensayos "simultáneos" e "inversos". Un ensayo simultáneo implica una única etapa de incubación en donde el anticuerpo unido al soporte sólido y el anticuerpo marcado se añaden a la muestra que se está sometiendo a prueba al mismo tiempo. Una vez completada la incubación, se lava el soporte sólido para eliminar el resto de la muestra de fluido y el anticuerpo marcado no complejado. A continuación, se determina la presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido como se haría en un ensayo sándwich "directo" convencional.
En el ensayo "inverso", se utiliza la adición escalonada en primer lugar de una solución de anticuerpo marcado a la muestra de fluido seguida de la adición de anticuerpo no marcado unido a un soporte sólido después de un período de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava de manera convencional para liberarla del resto de la muestra que se está sometiendo a prueba y la solución de anticuerpo marcado sin reaccionar. La determinación del anticuerpo marcado asociado con un soporte sólido se determina a continuación como en los ensayos "simultáneos" y "directos". En una realización, se puede utilizar una combinación de anticuerpos de la presente invención específicos para epítopos separados para construir un ensayo inmunorradiométrico sensible de tres sitios.
Además, los anticuerpos ilustrativos se pueden utilizar para la tipificación de células T, para aislar células o fragmentos específicos que portan CPAA, para la preparación de vacunas o similares. Los anticuerpos se pueden utilizar para detectar cuantitativa o cualitativamente el CPAA en una muestra o para detectar la presencia de células que expresan el CPAA. Esto se puede lograr mediante técnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado con fluorescencia (véase más abajo) junto con microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o detección fluorométrica. Para fines de diagnóstico, los anticuerpos pueden estar marcados o no marcados. Los anticuerpos no marcados se pueden utilizar combinados con otros anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que son reactivos con el anticuerpo humanizado, tales como anticuerpos específicos para regiones constantes de inmunoglobulina humana. Alternativamente, los anticuerpos se pueden marcar directamente. Se puede emplear una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos, flúoros, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, ligandos (particularmente haptenos), etc. Se encuentran disponibles y son bien conocidos para los expertos en la técnica numerosos tipos de inmunoensayos, como los comentados anteriormente.
Los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden emplear histológicamente, como en inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica, para la detección in situ del CPAA de la presente invención. La detección in situ se puede lograr retirando un espécimen histológico de un paciente y proporcionando el anticuerpo marcado de la presente invención a tal espécimen. El anticuerpo (o fragmento) se puede proporcionar aplicando o superponiendo el anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica. Mediante el uso de tal procedimiento, es posible determinar no solo la presencia de CPAA sino también su distribución en el tejido examinado. Utilizando la presente invención, los expertos en la técnica percibirán fácilmente que se puede modificar cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como los procedimientos de tinción) para lograr tal detección in situ.
Es importante destacar que los anticuerpos de la presente invención pueden ser útiles para diagnosticar la capacidad de invasión de ciertos tipos de cáncer colorrectal y pancreático. Más específicamente, el anticuerpo de la presente invención puede identificar CPAA presente en pacientes con cánceres lentos que crecen durante varios años en contraposición a cánceres agresivos que progresan mucho más rápido. Por tanto, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionar una importante herramienta inmunohistoquímica.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en matrices de anticuerpos, muy adecuadas para medir perfiles de expresión génica, incluida la modificación postraduccional y también útiles para detectar moléculas más pequeñas tales como hormonas peptídicas y carbohidratos. Recientemente se han empleado varios enfoques para determinar la idoneidad y eficacia de las matrices de anticuerpos. En algunos casos, se han utilizado anticuerpos presentados en fagos para preparar las matrices, y la detección y el análisis se realizan mediante SELDI (desorción/ionización láser mejorada en la superficie) o en un formato de alto rendimiento mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas basándose en filtros (ELISA). Otros ejemplos de sistemas de detección incluyen etiquetas fluorescentes y nanoelectrodos, y para matrices más pequeñas, resonancia de plasmón de superficie y espectrometría de masas MALDI-TOF (desorción/ionización mediante láser asistida por matriz-tiempo de vuelo). El análisis de proteomas también se puede realizar generando en primer lugar una matriz de antígenos unidos seguido de la captura y detección de anticuerpos con un ligando de afinidad tal como Proteína L o Proteína A unida a una sonda de detección.
Un tercer enfoque implica el establecimiento de cuadrículas de alta densidad de bacterias que contienen genes de anticuerpos sobre un filtro seguido de la interacción con otro filtro que contiene un ligando de afinidad o el antígeno anclado con una sonda de detección tal como ELISA. Este método elimina la necesidad de manipulación de líquidos, y se pueden realizar escrutinios paralelos de decenas de miles de anticuerpos contra múltiples antígenos para identificar en última instancia proteínas que se expresan diferencialmente. Un último método implica la posibilidad de sintetizar anticuerpos directamente en el chip utilizando química combinatoria. Sin embargo, la tecnología actual se esfuerza un poco por sintetizar incluso los dominios de anticuerpos de unión a antígenos que consisten en un mínimo de l2o aminoácidos, a menos que se utilicen elementos esenciales de polipéptidos presintetizados para crear un marco de anticuerpos seguido de la adición de aminoácidos individuales.
También se describen métodos de escrutinio para determinar las actividades anti-CPAA. Específicamente, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 6, el anticuerpo de la presente invención está asociado con la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCc ). Los compuestos anti-CPAA que se pueden seleccionar del grupo que consiste en anticuerpos, o fragmentos o porciones de los mismos, péptidos, compuestos peptidomiméticos o compuestos organomiméticos que desencadenan la muerte de células portadoras de CPAA in vitro, in situ o in vivo están abarcados por la presente invención. Los métodos de escrutinio que se pueden utilizar para determinar la actividad ADCC de un compuesto anti-CPAA pueden incluir ensayos in vitro o in vivo. Tales ensayos in vitro pueden incluir un ensayo de citotoxicidad de CPAA, tal como un radioinmunoensayo, que determina una disminución en la muerte celular por contacto con CPAA, tal como CPAA de chimpancé o humano en forma aislada o recombinante, en donde la presencia concurrente de un compuesto neutralizante de CPAA reduce el grado o tasa de muerte celular.
Kits de diagnóstico
También se pueden suministrar kits para su uso con los anticuerpos en cuestión en la protección o detección de una actividad celular o para determinar la presencia de un antígeno seleccionado. Por tanto, se puede proporcionar un anticuerpo de la presente invención, normalmente en forma liofilizada en un recipiente, ya sea solo o junto con anticuerpos adicionales específicos para el tipo de célula deseado. Los anticuerpos, que pueden estar conjugados con una marca o toxina, o no conjugados, se incluyen en los kits con tampones, tales como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizadores, biocidas, proteínas inertes, p. ej., albúmina sérica o similares. Generalmente, estos materiales estarán presentes en menos de 5% en peso basándose en la cantidad de anticuerpo activo, y normalmente presente en una cantidad total de al menos aproximadamente 0,001% en peso basándose de nuevo en la concentración de anticuerpos. Con frecuencia, será deseable incluir un excipiente o diluyente inerte para diluir los ingredientes activos, donde el excipiente puede estar presente en aproximadamente 1% a 99% en peso de la composición total. Cuando se emplea un segundo anticuerpo capaz de unirse al anticuerpo primario en un ensayo, normalmente estará presente en un vial separado. El segundo anticuerpo se conjuga típicamente con una marca y se formula de manera análoga a las formulaciones de anticuerpos descritas anteriormente. El kit también incluirá un conjunto de instrucciones de uso.
Aplicaciones farmacéuticas
Los anticuerpos o péptidos anti-CPAA de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, en el tratamiento de carcinomas colorrectales o pancreáticos. Más específicamente, la invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables y, como ingrediente activo, un anticuerpo o péptido según la invención. El componente de suministro de la inmunotoxina es un anticuerpo humanizado según la presente invención. También se prevén inmunoglobulinas intactas o sus fragmentos de unión, tales como Fab. Típicamente, los anticuerpos en las inmunotoxinas serán de los isotipos IgA, IgM o IgG humanos, pero se pueden utilizar otras regiones constantes de mamíferos según se desee. La composición también puede comprender una inmunotoxina según la invención. El anticuerpo humanizado, la inmunotoxina y las composiciones farmacéuticas de los mismos de esta invención son útiles para la administración parenteral, p. ej., por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa.
Los anticuerpos y/o péptidos anti-CPAA de la presente invención se pueden administrar como agentes terapéuticos individuales o combinados con otros agentes terapéuticos. Se pueden administrar solos, pero generalmente se administran con un portador farmacéutico seleccionado basándose en la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica convencional.
Para la administración parenteral, los anticuerpos o péptidos anti-CPAA se pueden formular como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el portador puede ser una solución del anticuerpo o un cóctel del mismo disuelto en un portador aceptable, tal como un portador acuoso, tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa o albúmina de suero humano al 5%, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. También se pueden utilizar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijados. Estas soluciones son estériles y generalmente no contienen materia particulada. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes reguladores y tamponadores del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. La concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente, por ejemplo, desde menos de aproximadamente 0,5%, normalmente en o al menos aproximadamente 1% hasta tanto como 15% o 20% en peso y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo concreto de administración seleccionado. El vehículo o polvo liofilizado pueden contener aditivos que mantengan la isotonicidad (p. ej., cloruro de sodio, manitol) y estabilidad química (p. ej., tampones y conservantes). La formulación se esteriliza mediante técnicas de uso común.
Por tanto, se podría preparar una composición farmacéutica típica para inyección intramuscular para que contuviera 1 ml de agua tamponada estéril y 50 mg de anticuerpo. Se podría preparar una composición típica para infusión intravenosa que contuviera 250 ml de solución de Ringer estéril y 150 mg de anticuerpo. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15a ed., Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980).
Los anticuerpos de esta invención se pueden liofilizar para su almacenamiento y reconstituir en un portador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con inmunoglobulinas convencionales. Se puede emplear cualquier técnica de liofilización y reconstitución adecuada. Los expertos en la técnica apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a diversos grados de pérdida de actividad del anticuerpo (p. ej., con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG) y es posible que los niveles de uso deban ajustarse para compensar.
Las composiciones que contienen los presentes anticuerpos de tipo humano o un cóctel de los mismos se pueden administrar para la prevención de la recurrencia y/o tratamientos terapéuticos para una enfermedad existente. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, un texto de referencia convencional en este campo de la técnica. Por ejemplo, una composición parenteral adecuada para la administración por inyección se prepara disolviendo 1,5% en peso de ingrediente activo en una solución de cloruro de sodio al 0,9%. Los péptidos y/o anticuerpos anti-CPAA de esta invención se pueden adaptar para determinar la eficacia terapéutica en virtud de su capacidad para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o apoptosis, y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra las células que tienen CPAA asociado con su superficie. Para estas actividades, se puede utilizar una fuente endógena o una fuente exógena de células efectoras (para la ADCC) o componentes del complemento (para la CDC).
En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente que ya padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener o aliviar parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la neoplasia maligna y del estado general del propio sistema inmunológico del paciente, pero generalmente oscilan entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 200 mg de anticuerpo por dosis, siendo las dosificaciones de 5 mg a 25 mg por paciente las que se utilizan con más frecuencia. Debe tenerse en cuenta que los materiales de la invención se pueden emplear generalmente en estados de enfermedad graves, a menudo en situaciones mortales o potencialmente mortales. En tales casos, en vista de la minimización de sustancias extrañas y la menor probabilidad de rechazos de "sustancias foráneas" que se logran con los presentes anticuerpos de tipo humano de esta invención, es posible y el médico a cargo puede considerar deseable administrar excesos sustanciales de estos anticuerpos.
La dosificación administrada variará, por supuesto, dependiendo de factores conocidos tales como las características farmacodinámicas del agente concreto y su modo y vía de administración; edad, salud y peso del receptor; naturaleza y alcance de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento y efecto deseado. Por lo general, una dosis diaria, semanal o quincenal de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 100 mg/m2 a 250 mg/m2 de peso corporal suministrados durante un período de 4 horas a 6 horas.
Como ejemplo no limitante, el tratamiento de patologías relacionadas con CPAA en seres humanos o animales se puede proporcionar como una dosis diaria, semanal o quincenal de péptidos, anticuerpos monoclonales quiméricos y/o murinos de la presente invención anti-CPAA en un intervalo de dosificación de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, por día, semanalmente o quincenalmente.
Los ejemplos de anticuerpos para uso terapéutico humano son anticuerpos murinos y quiméricos de alta afinidad (estos también pueden ser de alta avidez), y fragmentos, regiones y derivados que tienen una potente actividad anti-CPAA in vivo, según la presente invención.
Las formas de dosificación (composición) adecuadas para la administración interna contienen generalmente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg de ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo normalmente estará presente en una cantidad de aproximadamente 0,5% - 95% en peso basándose en el peso total de la composición.
Se pueden llevar a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones con niveles de dosis y patrones seleccionados por el médico a cargo. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deberían proporcionar una cantidad del anticuerpo o de los anticuerpos de esta invención suficiente para tratar eficazmente al paciente.
Los anticuerpos también se pueden utilizar como composiciones administradas por separado junto con agentes quimioterapéuticos o inmunosupresores. Típicamente, los agentes incluirán ciclosporina A o un análogo de purina (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina o similares), pero también se pueden utilizar numerosos agentes adicionales (p. ej., ciclofosfamida, prednisona, etc.) bien conocidos por los expertos en la técnica.
Un anticuerpo de la presente invención puede formar parte de una inmunotoxina. Las inmunotoxinas se caracterizan por dos componentes y son útiles para destruir células seleccionadas in vitro o in vivo. Un componente es un agente citotóxico que usualmente es fatal para una célula cuando se adhiere o se absorbe. El segundo componente, conocido como el "vehículo de suministro", proporciona un medio para suministrar el agente tóxico a un tipo de célula concreto, tal como las células que comprenden un carcinoma. Los dos componentes se unen comúnmente químicamente mediante cualquiera de una variedad de procedimientos químicos bien conocidos. Por ejemplo, cuando el agente citotóxico es una proteína y el segundo componente es una inmunoglobulina intacta, la conexión puede ser por medio de agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales, p. ej., SPDP, carbodiimida, glutaraldehído o similares. La producción de diversas inmunotoxinas es bien conocida en la técnica y se puede encontrar, por ejemplo, en Thorpe et al., Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, en MONOCLONAL ANTIBIODIES IN CLIN. MED. 168-90 (Acad. Press, 1982).
Es adecuada una variedad de agentes citotóxicos para su uso en inmunotoxinas. Los fármacos citotóxicos interfieren en los p1rocesos celulares críticos, 21 i2nclu 1id31a l 1a88 síntesi 9s0 de ADN, ARN y J 1 proteínas. Los âgentes citotóxicos 1 pueden incluir radionúclidos, que incluyen Bi, I, Re, y Y; varios fármacos quimioterapéuticos, tales como vindesina, metotrexato, adriamicina y cisplatino; y proteínas citotóxicas tales como proteínas inhibidoras de ribosomas como proteína antiviral de hierba carmín, exotoxina A de Pseudomonas, ricina, toxina diftérica, cadena A de ricina, etc., o un agente activo en la superficie celular, tal como las enzimas fosfolipasas (p. ej., fosfolipasa C). Véase en general, Olsnes & Phil, Quimeric Toxins, 25 Pharmac. Ther. 335-81 (1982); MONOCLONAL ANTIBIODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, 159-79, 224-66 (Baldwin & Byers eds., Acad. Press, 1985).
Los anticuerpos o péptidos y derivados se pueden utilizar terapéuticamente como productos inmunoconjugados. Véase Dillman, 111 Ann. Internal Med. 592-603 (1989). Tales anticuerpos o polipéptidos se pueden acoplar a proteínas citotóxicas, que incluyen, pero no se limitan a, ricina-A, toxina de Pseudomonas y toxina de Difteria. Las toxinas conjugadas con anticuerpos u otros ligandos o péptidos son bien conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Olsnes et al., 10 Immunol. Today 291-95 (1989). Las toxinas vegetales y bacterianas típicamente destruyen las células al interrumpir la maquinaria sintética de proteínas. Los fármacos citotóxicos que se pueden conjugar con péptidos y/o anticuerpos anti-CPAA y, posteriormente, utilizar para la terapia in vivo incluyen, pero no se limita a, daunorrubicina, doxorrubicina, metotrexato y Mitomicina C. Para una descripción de estas clases de fármacos que son bien conocidos en la técnica, y sus mecanismos de acción, véase Goodman & Gilman's PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (8a Ed., Macmillan Pub. Co., 1990).
Además, el anticuerpo de la presente invención se puede suministrar combinado con agentes quimioterapéuticos tales como oxaliplatino, irinotecán, topotecán, leucovorina, carmustina, vincristina, fluorouracilo, estreptozocina y gemcitabina. Se han utilizado combinaciones de otros anticuerpos y tales compuestos en pacientes con cáncer colorrectal avanzado. Véase, p. ej., la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20020187144. Los anticuerpos y/o péptidos anti-CPAA de esta invención se pueden utilizar ventajosamente combinados con otros anticuerpos monoclonales o murinos y quiméricos, fragmentos y regiones, o con linfocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos, etc., que sirven para aumentar el número o la actividad de células efectoras que interactúan con los anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo de la presente invención se puede administrarse conjuntamente con anticuerpos monoclonales humanos reactivos con otros marcadores en las células responsables de la enfermedad. Por ejemplo, los marcadores de células T adecuados pueden incluir aquellos agrupados en los denominados "Cúmulos de diferenciación", como fueron denominados por el First International Leukocyte Differentiation Workshop, en LEUKOCYTE TYPING (Bernard et al., eds., Springer-Verlag, NY, 1984).
El antígeno 16C3
El antígeno al que se une el anticuerpo 16C3 parece expresarse en algunas, pero no en todas, las líneas de células tumorales humanas cultivadas, en algunos, pero no en todos los tejidos del tracto digestivo embrionario humano normal y en la mayoría de los tejidos tumorales de colon y páncreas. Como se detalla en los Ejemplos, a continuación, tras la transferencia Western de diversas muestras de tumor, el anticuerpo 16C3 reconoció tanto una especie de péptido de ~200 kDa como una especie de péptido de ~110 kDa. La intensidad de la tinción, que puede reflejar la cantidad de cada especie de proteína de una muestra concreta, parece diferir entre las muestras de tumores colorrectales y las muestras de tumores pancreáticos. El antígeno 16C3 parece expresarse en la mayoría de los tejidos tumorales de colon y páncreas y puede tener un origen oncofetal. El antígeno 16C3 se expresa en la superficie celular y es una glicoproteína. Puede haber dos especies relacionadas del mismo antígeno que reconoce el anticuerpo 16C3, y la cantidad relativa de cada especie difiere entre los tejidos tumorales de colon y páncreas. La unión del antígeno 16C3 por transferencia Western no se interrumpe por el tratamiento con detergentes tales como SDS y NP-40, o agentes reductores tales como ditiotreitol y 2-mercaptoetanol; lo que sugiere que la unión al epítopo específico no depende de la conformación y que el anticuerpo 16C3 puede reconocer un epítopo lineal en el CPAA. Además, el epítopo 16C3 no se ve afectado por el tratamiento con proteasa V8, tripsina o PNGasa-F, aunque se modificó la migración general del antígeno inmunorreactivo en SDS-PAGE, lo que refleja la modificación por proteólisis y desglicosilación. El tratamiento con hidróxido de sodio en una reacción química de eliminación beta pareció dar como resultado una pérdida de inmunorreactividad, lo que sugiere que el epítopo 16C3 puede implicar una modificación de la glicosilación ligada a O, o estar adyacente a un resto de glicosilación ligado a O. Otros estudios definen el epítopo preciso con el que reacciona el anticuerpo contra 16C3.
La caracterización del epítopo 16C3 también puede conducir a la identificación del gen o genes para el CPAA, por ejemplo, puede proporcionar un objetivo para los antagonistas de la traducción u otros medios de bloqueo de la expresión, o una comprensión de la actividad del CPAA de manera que puede convertirse en una diana para antagonistas, particularmente moléculas pequeñas o anticuerpos, que bloquean la actividad funcional (tal como, por ejemplo, la unión del receptor por su ligando o ligandos afines; función de transporte; función de señalización). Vacuna contra el cáncer
En la presente memoria se describe una vacuna contra el cáncer. Por "vacuna" se entiende un agente utilizado para estimular el sistema inmunológico de un organismo vivo. A este respecto, la respuesta inmunitaria puede proporcionar profilaxis o puede proporcionar un efecto positivo en un organismo enfermo, por ejemplo, aliviando una afección existente. Específicamente, una vacuna contra el cáncer está destinada a tratar terapéuticamente una neoplasia maligna existente y/o prevenir la progresión o metástasis de una neoplasia maligna existente.
Es ampliamente conocido que se puede lograr una inmunoterapia activa específica utilizando antígenos asociados a tumores. De hecho, se demostró que las preparaciones antigénicas iniciales semipurificadas utilizadas para obtener el anticuerpo monoclonal que ha permitido la invención adicional presentada en la presente memoria proporcionan inmunidad protectora específica, activa y duradera en seres humanos. Hollinshead et al., 1985. En ese momento, los pacientes habían sido sometidos a resección tumoral y a continuación fueron vacunados con material antigénico obtenido a partir de las membranas tumorales en una cantidad de 200 |jg, 300 |jg o 500 |jg en dispersiones de 0,2 ml mezcladas con 0,2 ml adicionales de coadyuvante de Freund. Se demostró que las dosificaciones de 300 jg administradas mensualmente durante tres meses eran seguras.
Con los anticuerpos recombinantes descritos en la presente memoria, ahora es posible definir un antígeno o péptidos epitópicos de CPAA altamente purificados que sean adicionalmente adecuados para una vacuna contra estos cánceres. Por ejemplo, 16C3 se puede utilizar para unirse a muestras de tejido o células a partir de las cuales la proteína CPAA y su secuencia de aminoácidos correspondiente pueden identificarse mediante cualquier número de técnicas conocidas. El epítopo se puede cartografiar adicionalmente y la naturaleza molecular se puede determinar con exquisito detalle. Véanse, p. ej., Baerga-Oritz et al., 11 Protein Sci. 1300-08 (2002); Jemmerson y Paterson, 4 BioTechniques 18-31 (1986).
Una técnica alternativa para identificar péptidos antigénicos eficaces implica el uso del anticuerpo o péptido contra 16C3 para escrutar una biblioteca de expresión (tal como una biblioteca de presentación de fagos) en busca de proteínas miméticas, o mimotopos, que son reconocidos por el anticuerpo. Esta técnica se ha utilizado para identificar péptidos antigénicos que han provocado respuestas inmunitarias protectoras in vivo. Véase Beenhouwer et al., 169 J. Immunol. 6992-99 (2002); véase también la Patente de Estados Unidos Núm. 5.837.550; Visvanathan et al., 48 Artritis & Rheumatism, 737-45 (2003); Sato et al., 371 Biochem. J. 603-08 (2003). Obsérvese que esta técnica se ha utilizado para identificar miméticos de proteínas de antígenos de carbohidratos y glicoproteínas, las versiones de proteínas que se ha encontrado que son más inmunogénicas que las contrapartes de carbohidratos naturales. De hecho, se pueden aislar miméticos que son ventajosos sobre los antígenos conocidos debido a factores que incluyen la capacidad de producción, la seguridad, la semivida u otros problemas.
La proteína inmunogénica de CPAA se puede preparar y suministrar, por ejemplo, como una vacuna subcutánea o mucosa sola, o asociada con un coadyuvante o portador o como parte de un coadyuvante o producto conjugado de proteína. Se contempla el suministro por micropartículas de liposomas, partículas similares a virus, vacunas de ADN, vectores recombinantes vivos tales como S. typhimurium, y posiblemente ISCOM. Todos estos sistemas son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden poner en práctica sin una experimentación indebida. Véase, p. ej., Michalek et al., en MUCOSAL INMUNOLOGY (Mestecky et al., Eds., Elsevier, 2005).
Además, el péptido CPAA se puede conjugar genética o químicamente con un portador toxoide, tal como toxoide de cólera, entérico o de ricina. Véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 6.846.488. Otro portador proteico ventajoso obtenido a partir de una bacteria es el portador proteico PorB. Véase p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 6.613.336. Otro coadyuvante de la mucosa basado en proteínas prometedor es la proteína flagelina de S. typhimurium. La proteína CPAA se puede administrar conjuntamente con la proteína flagelina (FljB) mediante, por ejemplo, la ruta intranasal de la mucosa. También se presenta una plataforma de proteínas ventajosa que comprende el antígeno central de la hepatitis de pato en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20040219164.
La CPAA también se puede suministrar como una vacuna de ADN para la expresión in vivo de la construcción inmunogénica. Por ejemplo, se pueden utilizar micropartículas catiónicas para suministrar el casete de expresión de ADN en la vacunación intranasal. Tales sistemas han inducido una respuesta inmunitaria tras, por ejemplo, el suministro intranasal de una vacuna que comprende ADN que codifica la proteína gag del VIH-1. Michalek et al., 2005. El péptido inmunogénico CPAA se puede suministrar a través de un casete de expresión de ADN que posteriormente se expresa in vivo.
Además, la preparación inmunogénica se puede utilizar para "cargar" células dendríticas obtenidas del donante. ex vivo, que a continuación se devuelven al paciente, donde se dirigen a los órganos linfoides y montan una respuesta inmunitaria eficaz. Véanse, p. ej., Liau et al., 9(6) Neurosurg. Focus, e8 (2000); Baar, 4(2) Oncologist 140-44 (1999). Este enfoque de vacuna ha estado en ensayos en seres humanos para tratar, por ejemplo, el melanoma y el cáncer de cerebro. Se puede encontrar más información en línea, por ejemplo, en el sitio de la red de los Institutos Nacionales de Salud para ensayos clínicos. Alternativamente, se puede suministrar una vacuna de ADN como se describe anteriormente a través de un parche cutáneo a las células de Langerhans, que a continuación maduran a células dendríticas y se alojan en los órganos linfoides. Patente de Estados Unidos Núm. 6.420.176.
El suministro de las composiciones inmunogénicas descritas en la presente memoria puede ser mediante inyección parenteral, subcutánea o intramuscular, inyección intravenosa, intestinal, intradérmico, medianet intubación o vacunación nasal, oral o rectal. La vacuna también se puede suministrar por vía tópica, incluso intranasal, sobre la amígdala palatina, o suministro a las glándulas salivales. En otras palabras, se puede administrar una vacuna al paciente mediante cualquier técnica conocida o convencional.
La invención se describirá ahora con más detalle mediante ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Preparación de antígeno asociado a carcinoma pancreático y colorrectal (CPAA) a partir de especímenes de tumores humanos.
Se obtuvo una preparación de antígeno inmunogénico asociado a tumor a partir de membranas de carcinoma colorrectal reunidas de acuerdo con el método descrito por Hollinshead et al., 56 Cancer 480 (1985); Patente de Estados Unidos Núm. 5.688.657. Este material antigénico se purificó en la medida en que las fracciones de la membrana estaban libres de antígenos HL-A y se separaron de gran parte de las fracciones de glicoproteínas no inmunogénicas.
Se prepararon suspensiones de células tumorales en solución salina a partir de especímenes frescos de quirófano. Las suspensiones de células individuales, obtenidas por picado de tumores sólidos, se centrifugaron durante 10 min. a 400x g y se retuvo el sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se volvió a centrifugar. El material de la membrana se examinó mediante microscopía electrónica para asegurarse de que solo estaba presente el material de la membrana (y no células intactas), y se midió el contenido de proteína mediante el método de Lowry. A continuación, el material de la membrana se sometió a sonicación secuencial de baja frecuencia y se resuspendió como una reserva soluble de proteínas de membrana. Los productos sometidos a sonicación solubles se separaron mediante filtración en gel sobre Sephadex-6200. Se recogieron fracciones de 2 ml y se registró el perfil de absorbancia a 220 nm y 280 nm. Se reunieron las fracciones que comprendían picos de proteínas individuales y las reservas se concentraron mediante ultrafiltración Diaflo. Las fracciones IB y IIA de Sephadex-G200, como definieron Hollinshead et al., 1985, se purificaron adicionalmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en gradiente. Se sometieron a prueba las fracciones para determinar su capacidad para provocar reacciones de hipersensibilidad cutánea retardada positivas en pacientes con carcinoma colorrectal. Se dijo que aquellas fracciones con actividad inmunogénica contenían antígenos asociados al carcinoma colorrectal y se emplearon como inmunógenos y agentes de escrutinio en la preparación de anticuerpos monoclonales.
Mediante PAGE en gradiente, se identificó y aisló un antígeno de doble banda distinto del antígeno carcinoembrionario. Gold et al., 122 J. Exp. Med. 467-81 (1965); Hollinshead et al., 1985; Hollinshead et al., 1 (7658) Lancet 1191-1195 (1970); Hollinshead et al., 177 Science 887-89 (1972). Las bandas que comprendían este antígeno migraron a 6,3 cm y 6,6 cm de distancia del tinte de seguimiento. El análisis bioquímico del antígeno indicó que esta proteína era una glicoproteína. El peso molecular del antígeno se estimó basándose en la movilidad electroforética de la transferrina (6,4 cm-6,5 cm), un producto aislado tiene un peso molecular de 76,5 kDa. Los antígenos semipurificados se estudiaron en detalle, incluidas las evaluaciones de los anticuerpos séricos, la inmunidad mediada por células y la supervivencia del paciente. Hollinshead et al., Abstract, Ann. Meeting Am. Soc'y Clin. Oncol., Washington, DC (1990); Hollinhead et al., 56 Proc. 6° Int'l Conf. Adjuvant Therapy Cancer (Salmon, ed., W.B. Saunders Inc., Phila., PA, 1990). Se realizaron estudios adicionales para evaluar el uso de inmunoquimioterapias combinadas. Hollinshead et al., 1990a; Hollinshead et al., 1990b; Hollinshead, 7 Sein. Surg. Oncol. 199-210 (1991); Hollinshead et al., 10(1) J. Exper. Clin. Cancer 43-53 (1991); véanse también Hollinshead & Herberman, Proc. 2° Int'l Symp. Cancer Detection & Prevent. 616-20, (Bolonia, Italia, 1973); Hollinshead, Experience with combo. immuno-chemotherapy of colon cancer: steps pertinent to successful therapy based upon dosage & timing of admin. of 5-FU. NIH Workshop on Levamasole: Mechanism of anti-tumor action (Bethesda, MD, 11 de junio de 1990); Hollinshead, 7 Semin. Surg. Oncol., 199-210 (1991); Hollinshead, 8(153) Clin. Exper. Metastasis 89 (1990).
Ejemplo 2. Inmunización y preparación de hibridomas.
Se obtuvieron anticuerpos monoclonales contra antígenos asociados a carcinoma colorrectal y pancreático humano mediante la producción y clonación de híbridos resultantes de la fusión de células de mieloma de ratón Sp2/0-Ag14 con células de bazo de ratones BALB/c que habían sido inmunizados con el CPAA descrito anteriormente. Los clones híbridos se establecieron y reaccionaron fuertemente con el CPAA y con una línea celular de carcinoma de colon (LS174T) cuando se sometieron a ensayo mediante ELISA.
Inmunización y fusión celular: Se inmunizaron ratones BALB/c mediante inyección intraperitoneal de 100 |jg de CPAA emulsionado en adyuvante completo de Freund. El CPAA se preparó como describe Hollinshead en pruebas clínicas. Cuatro semanas después, se realizó una segunda inmunización con 50 jg de CPAA emulsionado en coadyuvante incompleto de Freund. Catorce días después, los ratones recibieron una inyección de refuerzo intraperitoneal de 50 jg de CPAA emulsionado en coadyuvante incompleto de Freund. Los ratones se sacrificaron tres días después y se preparó una suspensión unicelular de esplenocitos. La fusión celular se realizó mediante la incubación de 5e7 células de bazo de ratón con 10e7 células de mieloma sP2/0-Ag14 en polietilenglicol al 40% (PM = 1500).
Escrutinio de clones de hibridoma: se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para detectar clones de hibridoma que producen anticuerpos específicos para PCAA. El extracto de membrana de células tumorales de colon (10 ng/pocillo de LS174T o HT-29) sirvió como fuente sustituta de antígenos de cáncer de colon y se inmovilizó sobre microplacas de poliestireno. Se dejó que los anticuerpos presentes en los sobrenadantes de prueba se unieran a los antígenos inmovilizados durante una hora. La presencia de los mAb murinos unidos se detectó con anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa, específicos para inmunoglobulina de ratón. Se lavaron los pocillos y a continuación se añadió el sustrato cromogénico para fosfatasa alcalina (pNPP). Los pocillos que mostraban reacciones de color que producían absorbancias mayores o iguales a 0,500 unidades se puntuaron como positivos. Los controles negativos dieron valores de 0,01 a 0,09 unidades de absorbancia. Los pocillos de hibridoma que puntuaron como positivos mediante ELISA se seleccionaron para la expansión y repetición del procedimiento de clonación celular mediante el método de clonación por dilución limitante. La selección de células de hibridoma productoras de mAb positivas se determinó mediante ELISA. Las células monoclonales positivas se expandieron en cultivo y se congelaron alícuotas de las células en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
Ejemplo 3. Isotipo del mAb 16C3.
Las inmunoglobulinas murinas se expresan a partir de genes separados que codificaban la cadena pesada (55 kD) y la cadena ligera (25 kD - 29 kD). Hay cuatro cadenas pesadas de la subclase IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) y dos cadenas ligeras (Kappa, Lambda) que pueden reorganizarse para producir el repertorio de inmunoglobulinas murinas.
El isotipo del mAb 16C3 se determinó utilizando el kit de isotipificación de ratón de Southern Biotechnology, Inc. Se determinó que el mAb 16C3 era una cadena pesada de IgG1 y una cadena ligera Kappa.
Ejemplo 4. Secuencias de ADN únicas codifican el Anticuerpo 16C3.
La secuencia lineal de aminoácidos de un mAb identifica su singularidad, en comparación con las secuencias conocidas de todos los demás mAb descritos. La secuencia lineal de aminoácidos se puede determinar determinando primero la secuencia lineal del ADN que codifica la molécula polipeptídica. Se determinó la secuencia de ADN que codifica el mAb 16C3 y el marco de lectura abierto se tradujo en la secuencia de aminoácidos utilizando la tabla de uso de codones de mamíferos universales, describiendo así la identidad de secuencia lineal de la molécula 16C3.
Los cebadores de oligonucleótidos utilizados para la clonación de la cadena de la cadena pesada de IgG1 murina y la cadena ligera kappa se obtuvieron de la publicación Rapid cloning of any rearranged mouse immunoglobulin variable genes, Dattamajumdar et al., 43 Immunogenetics 141-51 (1996).
Aislamiento del ácido nucleico de 16C3: Se aisló ácido ribonucleico (ARN) de las células de hibridoma productoras de 16C3 utilizando el kit RNeasy-Midi (Núm. de catálogo 74104, Qiagen, Valencia, CA) como describe el fabricante. Se centrifugaron cuatro millones de células en un tubo cónico y las células se lisaron para liberar los ácidos nucleicos nucleares y citosólicos, incluido el ARN. A continuación, se purificó el ARN del producto lisado utilizando las columnas de centrifugación RNeasy. Finalmente, el ARN se eluyó con agua y se analizó para determinar rendimiento y la pureza por absorbancia a 260 nm y 280 nm utilizando un espectrofotómetro. El ARN aislado se almacenó a -80°C.
Preparación del ADNc: En primer lugar, el ARN (2 jg ) se transcribió de forma inversa a ADNc utilizando una mezcla de desoxinucleótido trifosfato dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), tampón de síntesis de ADNc, inhibidor de ARNasa, enzima transcriptasa inversa y oligo(dT)20. La reacción de síntesis de ADNc se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante en el kit Superscript III de Invitrogen (Núm. de catálogo 18080-051). El ADNc diana (cadena pesada de IgG1 de ratón y cadena ligera Kappa) se amplificó con fines de secuenciación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) siguiendo las instrucciones recomendadas por el kit Accuprime Pfx DNA polymerase de Invitrogen (Núm. de catálogo 12344-024) utilizando el método directo y cebadores inversos descritos anteriormente tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. La mezcla se sometió a 94°C durante 2 min, seguido de treinta ciclos de: 15 seg. a 94°C, 30 seg. a 58°C, 30 seg. a 68°C, que estuvieron seguidos a continuación por 10 min. a 68°C. Después, los fragmentos de ADN de cadena ligera y pesada amplificados se sometieron a electroforesis en un gel NuSieve 3:1 más agarosa al 4% (Lonza-Rockland, Núm. de catálogo 54925). Las bandas de ADN diana se escindieron del gel y a continuación se purificaron de la agarosa utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Núm. de catálogo 28704, Qiagen).
Secuenciación y análisis de ADN: El ADN diana amplificado que representa las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo 16C3 se clonó con TOPO para la secuenciación de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Núm. de catálogo de Invitrogen K4530-20). Se seleccionaron varios clones de TOPO y se sometieron a secuenciación de ADN. Se obtuvieron secuencias de longitud completa para el anticuerpo 16C3 utilizando el kit RACE 5'/ 3' de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Applied Sci., Núm. de Catálogo 03-353). Las secuencias de ADN obtenidas se tradujeron en tres marcos de lectura y se determinó que el marco sin codones de parada y que se alineó de manera homóloga con otras cadenas pesadas y ligeras murinas era el marco de lectura genuino. La secuencia de ADN se utilizó como secuencia de consulta para buscar en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (todas las secuencias de GenBank RefSeq Nucleotides EMBL DDBJ PDB). La búsqueda BLAST arrojó hasta quince entradas de la base de datos con similitud de secuencia de nucleótidos con la secuencia de consulta de 16C3. Ninguna de las secuencias de ADN era idéntica a la secuencia de ADN de 16C3, lo que demuestra la singularidad del mAb 16C3 descrito en la presente memoria. Ejemplo 5. Singularidad del anticuerpo 16C3 confirmada por la búsqueda en la base de datos BLAST
Las secuencias del mAb 16C3 se sometieron a una búsqueda BLAST (herramienta básica de búsqueda de alineamiento local) en la base de datos de proteínas y ácidos nucleicos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), que forma parte de la Biblioteca Nacional de Medicina de los Institutos Nacionales de Salud. El examen de las secuencias similares encontradas por esta búsqueda BLAST con secuencias de consulta de la cadena pesada del mAb 16C3 o de la cadena ligera del mAb 16C3 indicó que tanto la cadena pesada del mAb 16C3 como las regiones variables de la cadena ligera son secuencias únicas. Por tanto, las secuencias de cadena pesada y ligera del mAb 16C3 representan una molécula de anticuerpo nueva y única.
Ejemplo 6. Unión celular específica de mAb 16C3.
El mAb 16C3 producido por el hibridoma se purificó mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de proteína L-agarosa. El mAb 16C3 purificado se caracterizó por inmunofluorescencia indirecta, utilizando varias células tumorales identificadas en la Tabla 1, a continuación. Todas las líneas de células tumorales se obtuvieron de la ATCC. Las células se incubaron con mAb 16C3 purificado diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a 4°C. Las células se lavaron e incubaron con un mAb anti-ratón de cabra marcado con fluoresceína. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS y se examinaron mediante citometría de flujo utilizando un soporte lógico de análisis Becton-Dickinson FACSCalibur™ y CellQuest. Los resultados aparecen en la Tabla 1 (datos FACS). Los datos demuestran la unión específica de mAb 16C3 a líneas de células tumorales colorrectales y pancreáticas, pero no a líneas celulares tumorales de próstata o escamosas.
Tabla 1. Datos FACS de mAb 16C3: unión a líneas de células tumorales
% Tinción celular (mfi)
Línea de células tumorales
Solo FITC-Ab Rockland 16C3-E12
LS174T Colorrectal 0,94 (15) 40,56 (59)
HT-29 Colorrectal 0,84 (10) 90,99 (78)
CFPAC-1 Pancreático 0,83 (14) 96,19 (323)
AsPC-1 Pancreático 2,68 (30) 69,90 (36)
22Rv-1 Próstata 2,74 (61) 1,62 (30)
PC-3 Próstata 0,28 (20) 2,44 (22)
H226 Escamoso 0,90 (18) 0,62 (14)
SiHa Escamoso 1,07 (19) 1,08 (20)
Ejemplo 6. Actividad ADCC de 16C3 que demuestra citotoxicidad antitumoral.
Un mAb terapéuticamente útil, específico para un antígeno tumoral inmunogénico, puede tener al menos una de las siguientes propiedades: (a) alta especificidad del tejido tumoral, (b) ausencia de reactividad cruzada con tejido humano normal, y (c) actividad biológica asociada con la destrucción de tumores, tal como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). La actividad ADCC del mAb 16C3 se probó en líneas de carcinoma SW1463 de colon y CFPAC-1 y AsPC-1 pancreático como células diana. La línea celular de melanoma, SK-MEL, sirvió como control de especificidad. La ADCC se sometió a ensayo utilizando un ensayo de liberación de 111In de 4 horas convencional empleando PBMC humanas normales como células efectoras, y los resultados se muestran como el porcentaje de liberación de isótopos (% de lisis) en la Tabla 2 (datos de ADCC). En comparación con el anticuerpo de control negativo, UPC-10, los datos indican una modesta actividad destructora del anticuerpo IgG1 murino, pero, lo que es más importante, la actividad destructora es aparentemente específica para las líneas tumorales de colon y páncreas. La actividad destructora de un anticuerpo puede aumentar con un anticuerpo humanizado o quimerizado que tiene secuencias marco humanas que incluyen la región Fc, que interactúa con células efectoras humanas en este ensayo de ADCC.
Tabla 2. Ensayo ADCC con mAb 16C3 murino
% de Actividad ADCC Específica (± ETM)
Diana Tumoral Razón Efector:Dia MAb16C3 UPC-10
50:1 4,1 ± 0,4 1,6 ± 0,3 SW1463 (adeno colorrectal)
25:1 5,2 ± 0,3 -0,2 ± 0,1
50:1 11,1 ± 2,7 0,2 ± 0,6 CFPAC-1 (adeno pancreático)
25:1 1,4 ± 0,7 -0,2 ± 0,3
50:1 16,1 ± 0,8 0,9 ± 0,3 AsPC-1 (adeno pancreático)
25:1 10,6 ± 1,0 0,4 ± 0,2
50:1 -3,0 ± 0,2 -0,5 ± 0,2 SK-MEL (melanoma)
25:1 -3,3 ± 0,1 -2,0 ± 0,2
Células diana marcadas 111In, se utilizaron anticuerpos a 5 pg/pocillo, se utilizaron PBMC humanas activadas con IL-2 como células efectoras, incubación de 4 horas a 37°C antes de la recolección.
Ejemplo 7. Análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS del anticuerpo 16C3
La configuración nativa de la inmunoglobulina gamma murina (IgG1) se compone de cuatro polipéptidos, con dos polipéptidos cada uno de una cadena pesada y una cadena ligera. Una cadena pesada (55 kDa) se asocia con una cadena ligera (25 kDa-29 kDa) y este dímero está conectado a un dímero idéntico mediante enlaces disulfuro para completar la macromolécula tetramérica funcional. La molécula de IgG se puede disociar en sus cadenas pesada y ligera componentes y separar por tamaño en una matriz de gel de poliacrilamida en presencia de un reactivo desnaturalizante (SDS, dodecilsulfato de sodio) y un agente para reducir el puente disulfuro que conecta los dos heterodímeros (DTT, ditiotreitol). La electroforesis en gel es un método analítico común que se utiliza para definir la masa molecular de materiales proteináceos, tales como los anticuerpos.
El mAb 16C3 purificado se sometió a análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en presencia de agente reductor (DTT). Se mezclaron cinco microgramos de mAb 16C3 purificado con DTT y 4X tampón de muestras que contenía SDS, glicerol y colorante azul de bromofenol. La mezcla se calentó a 95°C durante 2 min, se enfrió en hielo, a continuación, se cargó en un gel de poliacrilamida en gradiente de SDS (gradiente 4% - 20%) y se sometió a corriente eléctrica para separar las especies moleculares desnaturalizadas en la preparación de mAb 16C3. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con colorante azul de Coomassie para visualizar las proteínas en el gel, se destiñó con agua y se secó entre láminas de plástico poroso. Los datos demuestran dos bandas de proteínas de masa molecular de 55 kDa, que representa la cadena pesada, y 28 kDa, que representa las especies moleculares de la cadena ligera. Estos datos muestran que el material purificado corresponde a los tamaños moleculares conocidos para las proteínas de cadena pesada y ligera de IgG1 murina.
Ejemplo 8. Tinción inmunohistoquímica con mAb 16C3 y tejidos malignos humanos.
La especificidad de la unión al antígeno mostrada por el mAb 16C3 se midió mediante tinción inmunohistoquímica de varias muestras de tejido humano, de especímenes tanto de cáncer como normales. Se tiñeron muestras de tejido humano fresco congelado y en parafina con Mab 16C3 de ratón purificado (IgG1), a 5 pg/mL, a continuación, se detectaron utilizando un anticuerpo secundario IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa. La intensidad de la tinción se indica en la Tabla 3, lo que refleja un sistema de clasificación de 0-4: 0 indica que no hay reactividad cruzada; 4 que indica una reactividad cruzada muy alta con el antígeno o una alta expresión del antígeno en un espécimen determinado.
Tabla 3. Tinción inmunohistoquímica que indica la especificidad de 16C3.
Método de preparación de muestras número de positivos/total intensidad de la tinción Parafina-Cáncer de colon 31/33 3+, 4+
Parafina-Colon normal 0/18 0
Parafina-Cáncer de páncreas 17/18 3+, 4+
Parafina-Páncreas normal 0/8 0
Parafina-Cáncer de colon 2/2 2+, 3+ Parafina-Adenocarcinoma de pulmón 2/2 1+, 2+
Parafina-Cáncer de ovario mucinoso 2/2 2+, 3+ Parafina-Colangiocarcinoma de Hígado 2/2 1
Parafina-Cáncer de estómago 2/2 3+, 4+
Parafina-Cáncer de útero-cuello uterino 2/2 1+, 2+
Parafina-Cáncer de útero-endometrio 0/2 0
Parafina-Cáncer de próstata 0/40 0
Parafina-Cáncer de ovario seroso 0/2 0
Parafina-Cáncer de vejiga de células transicionales 0/2 0
Parafina-Cáncer de riñón 0/2 0
Parafina-Cáncer de pulmón-escamoso 0/2 0
Parafina-Cáncer de riñón 0/2 0
(continuación)
Método de preparación de muestras intensidad de la tinción
Figure imgf000033_0001
Parafina-Cáncer de pulmón-escamoso 0/2 0
Parafina-Esófago-Escamoso 0/2 0
Parafina-Hígado-Hepatoma 0/2 0
Parafina-Tiroides, papilar 0/2 0
Parafina-Tiroides, folicular 0/2 0
Parafina-mama, ductal 0/2 0
Parafina-Piel-Escamoso 0/2 0
Parafina-Estómago, anillo de sello 0/2 0
Parafina-Piel-Escamoso 0/2 0
Parafina-Estómago, anillo de sello 0/2 0
Parafina-varios normales 0/54 0
Cáncer de colon congelado fresco 2/3 2+, 3+
Colon normal congelado fresco 0/2 0
Cáncer de páncreas congelado fresco 2/3 2+, 3+ Páncreas normal congelado fresco 0/2 0
Considerados colectivamente, estos datos demuestran más de 90% de especificidad de unión a los tejidos cancerosos de colon (35/38) y páncreas (19/21), mientras que no hubo reactividad cruzada con ningún tejido humano normal (0 de 58 sometidos a prueba). También hubo cierta reactividad cruzada con otros tipos de tumores, incluido el adenocarcinoma de pulmón (2/2), el cáncer de ovario mucinoso (2/2), el colangiocarcinoma de hígado (2/2), el cáncer de estómago (2/2) y el cáncer de cuello uterino (2/2). Estos datos pueden indicar una reactividad cruzada general con un antígeno presente en los adenocarcinomas.
Ejemplo 9. Humanización de anticuerpo monoclonal 16C3 murino.
Para mejorar la utilidad como fármaco terapéutico para tratar neoplasias malignas humanas, se puede convertir un anticuerpo monoclonal de ratón en un anticuerpo quimerizado o humanizado, de modo que el fármaco se pueda administrar tanto repetidamente como con menor toxicidad. Se sabe en la técnica que la administración de una proteína murina a veces puede dar como resultado respuestas inmunitarias y tóxicas masivas a la proteína foránea. Por tanto, un anticuerpo humanizado puede resultar más eficaz para terapias humanas.
La humanización de anticuerpos de ratón para aplicaciones terapéuticas es bien conocida, y anteriormente se discutieron varias técnicas para preparar mAb humanizados. Por ejemplo, de acuerdo con el enfoque Frankenstein, las regiones marco humanas se identifican por tener una homología de secuencia sustancial con cada región marco del anticuerpo no humano relevante, y las CDR del anticuerpo no humano se injertan en la composición de las diferentes regiones marco humanas. Véase la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm.
20060088522. Un método relacionado también útil para la preparación de anticuerpos de la invención se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20030040606.
Se diseñaron cinco secuencias alternativas diferentes para convertir el anticuerpo 16C3 murino en un anticuerpo humanizado, terapéuticamente útil. Los diseños se basaron en información estructural sobre secuencias conocidas de anticuerpos murinos y humanos. Cada una de estas regiones variables se fusionó en marco a un anticuerpo de marco IgG1 humano conocido que se ha utilizado comúnmente para otros anticuerpos terapéuticos tales como CC49 y CC83. Los genes se sintetizaron químicamente, se verificaron las secuencias y a continuación se clonaron los insertos de genes de cadena pesada y ligera en un plásmido de expresión de mamífero bajo el control del promotor de CMV. Cabe señalar que los diseños de cadenas ligeras variantes para VEN16C3 y CDR16C3 son idénticos, por lo que solo se sintetizó un gen de cadena ligera especificado por este diseño de secuencia. Los plásmidos que codificaban cada cadena pesada y cadena ligera se co-transfectaron a células 293T humanas utilizando métodos y reactivos convencionales basados en lipofectamina.
Las secuencias de mAb humanizadas mostradas en la FIG. 6 (secuencias de cadenas ligeras) y la FIG. 7 (secuencias de cadena pesada) representan formas terapéuticas potenciales del anticuerpo 16C3 para su uso en el tratamiento de la neoplasia maligna humana. Se utilizaron secuencias de IgG de la línea germinal humana para las secuencias marco. Las abreviaturas son las siguientes: 16C3 es la secuencia del anticuerpo murino, ven16C3 se ha modificado superficialmente con secuencias marco humanas, cdr16C3 se ha remodelado con aminoácidos de CDR humanas, abb16C3 representa injerto de CDR abreviado, sdr16C3 representa cambios de aminoácidos que determinan el sitio y fra16C3 representa un enfoque "Frankenstein" para remodelar la región variable mediante el uso de una combinación de varias "piezas" de regiones variables humanas. La numeración es una numeración de Kabat.
Ejemplo 10. Unión celular específica de mAb 16C3 de ratón recombinante
El mAb 16C3 de ratón producido por el hibridoma se purificó mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de proteína L-agarosa. El mAb 16C3 de ratón recombinante producido por células de ovario de hámster chino (CHO) se purificó mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de proteína A-Sepharose. Las preparaciones de 16C3 purificadas, o los sobrenadantes de células transfectadas, se caracterizaron por inmunofluorescencia indirecta utilizando células tumorales LS174T colorrectales humanas o AsPC-1 pancreáticas como se muestra a continuación. Las células se incubaron con 16C3 purificado (de ratón o humanizado) diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a 4°C. Las células se lavaron e incubaron con un anticuerpo de inmunoglobulina de cabra anti-ratón marcado con fluoresceína. A continuación, las células se lavaron con PBS y se examinaron mediante citometría de flujo utilizando un soporte lógico de análisis Becton-Dickinson FACScalibur y CellQuest. Los datos demuestran una unión muy similar de 16C3 de ratón derivado de CHO recombinante y derivado de hibridoma a líneas de células tumorales colorrectales y pancreáticas, pero no a líneas celulares tumorales de próstata o escamosas.
Tabla 4. Unión de datos FACS de Hibridoma frente a 16C3 de ratón recombinante a líneas tumorales Muestra de anticuerpo % De unión a células tumorales LS174T (MFI) Control de IgG-FITC anti-ratón de cabra 1,63 (43)
M16C3 purificado, de H12 hib. 525, 2 ug 43,11 (118)
M16C3 purificado, de H12 hib. 712, 2 ug 43,56 (113)
M16C3 purificado, de H12 hib. 713, 2 ug 37,79 (110)
M16C3 purificado, de H12 hib. 840, 2 ug 35,72 (92)
M16C3 purificado, de rec-CHO, 1019, 2 ug 41,45 (112)
M16C3 purificado, de rec-CHO, 1115, 2 ug 42,51 (114)
M16C3 purificado, de rec-CHO, 1220, 2 ug 37,46 (110)
Muestra de anticuerpo % De células AsPC-1 teñidas (mfi)
Control FITC anti-ratón de cabra 1,01 (8)
control de hibridoma 16C3 de ratón, 712, 1 ug 89,50 (138)
control de hibridoma 16C3 de ratón, 713, 5 uL 81,42 (34)
Rec-CHO m16C3 supe #1 82,66 (28)
Rec-CHO m16C3 supe #2 83,86 (27)
Rec-CHO m16C3 supe #3 79,50 (18)
Rec-CHO m16C3 supe #4 83,08 (25)
Ejemplo 11. Tinción inmunohistoquímica de tejidos humanos utilizando anticuerpo 16C3 de ratón recombinante La especificidad de la unión al antígeno mostrada por el anticuerpo 16C3 se midió mediante tinción inmunohistoquímica de varias muestras de tejido humano, de especímenes tanto de cáncer como normales. Se tiñeron micromatrices de tejido, tejidos incluidos en parafina y muestras de tejido humano fresco congelado con anticuerpo 16C3 de ratón purificado (IgG1), a 5 ug/ml, y a continuación se detectaron utilizando un anticuerpo secundario anti- IgG de ratón conjugado con peroxidasa. La intensidad de la tinción se indica mediante un sistema de clasificación de 0-4, donde 0 indica que no hay reactividad cruzada y 4 indica una reactividad cruzada muy alta con el antígeno o una alta expresión del antígeno en un espécimen determinado. Se sometieron a prueba tanto el anticuerpo 16C3 derivado de hibridoma como el anticuerpo 16C3 recombinante. Los resultados se resumen en las tablas siguientes:
Tabla 5. Tinción con 16C3 de ratón purificado a partir de células de hibridoma.
Muestra de tejido humano Número de positivos/número de teñidos Intensidad de tinción Cáncer de colon 17/18 3 a 4
Met. del cáncer de colon 18/18 3 a 4 Cáncer de páncreas 28/33 1 a 3 Varios otros tejidos cancerosos 8/18 1 a 3 Colon, páncreas y otros tejidos normales 0/74
Tabla 6. Tinción con 16C3 de ratón recombinante purificado a partir de células CHO.
Figure imgf000036_0001
Cáncer de colon 45/45 2 a 3 Cáncer de páncreas 24/30 1 a 3 Varios otros tejidos cancerosos 116/191 débil a 4 Colon, páncreas y otros tejidos normales 22/50 débil a 2
Considerados colectivamente, estos datos demuestran más de 95% de especificidad de unión a cánceres de colon (80/81), aproximadamente 80-85% de especificidad de unión a cánceres de páncreas (52/63) y 40-60% de especificidad de unión a otros tipos de cáncer (predominantemente adenocarcinomas). Hubo alguna reactividad cruzada con un pequeño subconjunto de tejidos normales, más notablemente tejidos pulmonares y ováricos, y la reactividad cruzada general fue de aproximadamente 44% (22/50). Curiosamente, todos los tejidos humanos normales que reaccionaron de forma cruzada con el anticuerpo 16C3 se realizaron con el anticuerpo producido de forma recombinante (no se observó reactividad cruzada con tejidos humanos normales con el hibridoma producido 16C3), lo que sugiere que la reactividad cruzada puede estar relacionada con un artefacto del procedimiento de producción de células CHO en lugar de estar relacionado con el propio anticuerpo.
Ejemplo 12. Prueba de variantes humanizadas de 16C3
En la FIG. 5 y FIG. 6 se presentan cinco diseños diferentes para convertir el anticuerpo 16C3 murino en un anticuerpo humanizado terapéuticamente útil. 16C3 recombinante humanizado se expresó en células 293T, cotransfección de cinco variantes en el experimento de matriz. Los sobrenadantes de la transfección transitoria se normalizaron a 2 ng/ml y a continuación se diluyeron para estimar la afinidad en comparación con el 16C3 de ratón recombinante purificado, a continuación, se sometieron a prueba para determinar el potencial de unión del antígeno a las células tumorales pancreáticas AsPC-1 mediante FACS y se compararon con el anticuerpo 16C3 de ratón recombinante. Los datos mostrados en la Tabla 7 demuestran que cada una de las cinco variantes de cadena pesada podría plegarse adecuadamente con cada una de las cuatro cadenas ligeras variantes para dar como resultado una actividad de unión al antígeno. La unión de cada combinación de cadena pesada y cadena ligera humanizada fue comparable a la unión del anticuerpo 16C3 de ratón original. Los datos muestran que la humanización de la inmunoglobulina 16C3 mediante cualquiera de los cinco métodos diferentes no alteró el sitio de reconocimiento del antígeno del anticuerpo resultante. La unión de cada uno fue valorable con la cantidad de anticuerpo, demostrando cada combinación perfiles de titulación similares.
Tabla 7. Datos de FACS de 16C3 humanizado recombinante.
Muestra de anticuerpo % De unión a células tumorales AsPC-1 (MFI) Control de anti-IgG-FITC de ratón de cabra 1,55 (70)
RECm16C3 cntl., 100 ng 61,66 (228) RECm16C3 cntl., 20 ng 47,91 (69) RECm16C3 cntl., 4 ng 4,26 (52)
RECm16C3 cntl., 0,8ng 1,28 (615)
Control de anti-IgG-FITC humana de conejo 2,05 (59)
(Cadena pesada/Cadena ligera)
Rh16C3 supe 8: VEN/VEN-100uL 68,14 (1090)
Rh16C3 supe 8: VEN/VEN-20uL 65,93 (240)
Rh16C3 supe 8: VEN/VEN-4uL 46,11 (65)
Rh16C3 supe 10: VEN/ABB-100uL 64,19 (549)
Rh16C3 supe 10: VEN/ABB-20uL 62,24 (122)
Rh16C3 supe 10: VEN/ABB-4uL 22,10 (52)
Rh16C3 supe 11: VEN/SDR-100uL 67,99 (808)
Rh16C3 supe 11: VEN/SDR-20uL 66,45 (191)
Rh16C3 supe 11: VEN/SDR-4uL 32,30 (57)
Rh16C3 supe 12: VEN/FRA-100uL 67,22 (674)
Rh16C3 supe 12: VEN/FRA-20uL 64,11 (143)
Rh16C3 supe 12: VEN/FRA-4uL 25,65 (51)
(continuación)
Muestra de anticuerpo % De unión a células tumorales AsPC-1 (MFI) Rh16C3 supe 14: CDR/VEN-100uL 62,66 (568)
Rh16C3 supe 14: CDR/VEN-20uL 59,92 (112)
Rh16C3 supe 14: CDR/VEN-4uL 16,89 (49)
Rh16C3 supe 16: CDR/ABB-100uL 64,49 (254)
Rh16C3 supe 16: CDR/ABB-20uL 49,61 (73)
Rh16C3 supe 16: CDR/ABB-4uL 5,85 (70)
Rh16C3 supe 17: CDR/SDR-100uL 68,02 (376)
Rh16C3 supe 17: CDR/SDR-20uL 54,78 (89)
Rh16C3 supe 17: CDR/SDR-4uL 10,21 (53)
Rh16C3 supe 18: CDR/FRA-100uL 61,54 (557)
Rh16C3 supe 18: CDR/FRA-20uL 57,34 (98)
Rh16C3 supe 18: CDR/FRA-4uL 17,55 (51)
Rh16C3 supe 20: ABB/VEN-100uL 65,72 (374)
Rh16C3 supe 20: ABB/VEN-20uL 57,34 (89)
Rh16C3 supe 20: ABB/VEN-4uL 6,39 (54)
Rh16C3 supe 22: ABB/ABB-100uL 66,31 (318)
Rh16C3 supe 22: ABB/ABB-20uL 50,30 (78)
Rh16C3 supe 22: ABB/ABB-4uL 7,63 (50)
(continuación)
Muestra de anticuerpo % De unión a células tumorales AsPC-1 (MFI) Rh16C3 supe 23: ABB/SDR-100uL 66,33 (293)
Rh16C3 supe 23: ABB/SDR-20uL 52,12 (75)
Rh16C3 supe 23: ABB/SDR-4uL 6,58 (59)
Rh16C3 supe 24: ABB/FRA-100uL 65,15 (403)
Rh16C3 supe 24: ABB/FRA-20uL 57,63 (98)
Rh16C3 supe 24: ABB/FRA-4uL 12,29 (50)
Rh16C3 supe 26: SDR/VEN-100uL 67,94 (495)
Rh16C3 supe 26: SDR/VEN-20uL 62,15 (140)
Rh16C3 supe 26: SDR/VEN-4uL 12,69 (59)
Rh16C3 supe 28: SDR/ABB-100uL 66,58 (314)
Rh16C3 supe 28: SDR/ABB-20uL 54,71 (87)
Rh16C3 supe 28: SDR/ABB-4uL 8,59 (51)
Rh16C3 supe 29: SDR/SDR-100uL 67,95 (503)
Rh16C3 supe 29: SDR/SDR-20uL 61,56 (114)
Rh16C3 supe 29: SDR/SDR-4uL 15,87 (56)
Rh16C3 supe 30: SDR/FRA-100uL 65,87 (702)
Rh16C3 supe 30: SDR/FRA-20uL 64,45 (156)
Rh16C3 supe 30: SDR/FRA-4uL 29,29 (53)
(continuación)
Muestra de anticuerpo % De unión a células tumorales AsPC-1 (MFI) Rh16C3 supe 32: FRA/VEN-100uL 66,03 (585)
Rh16C3 supe 32: FRA/VEN-20uL 63,64 (147)
Rh16C3 supe 32: FRA/VEN-4uL 22,69 (52)
Rh16C3 supe 34: FRA/ABB-100uL 67,38 (395)
Rh16C3 supe 34: FRA/ABB-20uL 58,89 (99)
Rh16C3 supe 34: FRA/ABB-4uL 12,30 (51)
Rh16C3 supe 35: FRA/SDR-100uL 68,01 (465)
Rh16C3 supe 35: FRA/SDR-20uL 61,35 (114)
Rh16C3 supe 35: FRA/SDR-4uL 14,23 (59)
Rh16C3 supe 36: FRA/FRA-100uL 67,88 (432)
Rh16C3 supe 36: FRA/FRA-20uL 59,15 (99)
Rh16C3 supe 36: FRA/FRA-4uL 8,68 (53)
Ejemplo 13. Optimización y prueba de anticuerpo 16C3 humanizado recombinante.
Adicionalmente, las herramientas de análisis in silico son útiles para predecir epítopos potenciales de células T en una proteína. Tales algoritmos son útiles para diseñar proteínas recombinantes mejoradas con una menor probabilidad de inmunogenicidad en seres humanos. Para aprovechar esta tecnología predictiva, se analizaron las cinco variantes de genes de cadena pesada y cadena ligera de 16C3 humanizados y se demostró que albergan uno o más epítopos de células T predichos que posiblemente podrían inducir una respuesta inmunogénica en seres humanos con ciertos haplotipos de HLA. Tal análisis se puede realizar utilizando un soporte lógico tal como Epimer o EpiMatrix, herramientas de mapeo de epítopos in silico, o mediante un proveedor comercial, tal como Antitope, Ltd. (Cambridge, Reino Unido). En un intento de eliminar estos epítopos de células T para disminuir la posible inmunogenicidad de un posible anticuerpo 16C3 terapéutico, se realizaron mutaciones puntuales específicas para eliminar los epítopos de células T y reemplazar aminoácidos específicos que darían como resultado una molécula de anticuerpo completamente funcional, pero menos inmunogénica. La secuencia de proteínas del anticuerpo 16C3 humanizado optimizado se muestra en la FIG. 12, indicando los aminoácidos en negrita las CDR, e indicando "/" la unión péptido líder/extremo N terminal maduro y la unión de dominio variable/constante.
Los genes para el anticuerpo h16C3-Abb* se prepararon mediante mutagénesis de los genes variantes existentes para producir las secuencias de ADN deseadas. A continuación, los genes de cadena ligera y pesada de h16C3-Abb* se clonaron en un plásmido de expresión de mamífero y se transfectaron a células CHO. Se sometió a prueba la unión de los sobrenadantes de varios clones resultantes a células tumorales LS174T (colon) y CFPAC-1 (páncreas) mediante FACS, con anti-IgG-FITC humano de conejo como control. Los datos presentados en la Tabla 8 demuestran que los diseños de genes optimizados y humanizados de 16C3 (H16C3) dieron como resultado un anticuerpo con muy buena actividad de reconocimiento de antígenos. Este diseño concreto de h16C3-Abb* representa un anticuerpo con alta actividad de unión con inmunogenicidad y/o toxicidad potencialmente bajas como anticuerpo terapéutico para su uso en cánceres que expresan el antígeno diana.
Tabla 8. Resultado del experimento FACS sobre sobrenadantes de transfección de 16C3-Abb* humanizados. Muestra de Anticuerpo % de unión a células LS174T (mfi) % de unión a células CFPAC-1 (mfi) Control 3,49 (33) 2,10 (20)
H16C3-Abb*supe 1 54,40 (374) 98,62 (411)
H16C3-Abb*supe 2 51,10 (299) 97,70 (299)
H16C3-Abb*supe 3 55,20 (402) 98,60 (486)
H16C3-Abb*supe 4 53,75 (333) 98,68 (371)
H16C3-Abb*supe 5 56,24 (407) 99,14 (447)
La actividad ADCC de h16C3-Abb* se sometió a prueba contra líneas de carcinoma pancreático CFPAC-1 y AsPC-1 como células diana. La línea celular de melanoma, SK-MEL, sirvió como control de la especificidad de las células tumorales. La ADCC se analizó utilizando un ensayo de liberación de 111In durante cuatro horas convencional empleando PBMC humanas normales como células efectoras, y los resultados se muestran como el porcentaje de liberación de isótopos (% de lisis) a continuación. En comparación con el anticuerpo de control negativo UPC-10, los datos indican una actividad de destrucción específica del anticuerpo por el anticuerpo 16C3 humanizado. La actividad destructora pareció ser específica para las líneas tumorales pancreáticas ya que no se observó lisis contra las células de control negativo de melanoma. Estos datos muestran que la actividad destructora de un anticuerpo podría modificarse mediante la humanización del anticuerpo 16C3 de ratón. En comparación con el anticuerpo 16C3 de ratón, el anticuerpo 16C3 humanizado demostró una actividad de destrucción superior, probablemente debido a la región Fc humana que podría interactuar de manera más eficaz que la región Fc de ratón con células efectoras humanas.
Tabla 9. Ensayo de ADCC con anticuerpo h16C3-Abb*
Diana tumoral Razón % De actividad específica de ADCC (± % De actividad específica de ADCC Efector:Diana ETM) h16C3-Abb* (± ETM) UPC-10 control AsPC-1 100 32,2 ± 0,56 0,4 ± 0,38 (páncreas) 50 18,4 ± 2,67 -0,1 ± 0,54
25 14,4 ± 1,66 0,2 ± 0,36
CFPAC-1 100 48,7 ± 3,22 1,9 ± 0,26 (páncreas) 50 40,9 ± 4,11 2,6 ± 0,49
25 19,4 ± 2,07 2,1 ± 0,20
(continuación)
Diana tumoral Razón % De actividad específica de ADCC % De actividad específica de ADCC (±
Efector:diana (± ETM) h16C3-Abb * ETM) control UPC-10 SK-MEL 100 0,1 ± 1,28 -0,6 ± 0,18 (melanoma) 50 -1,2 ± 0,78 -1,8 ± 0,34
25 0,1 ± 0,2 -1,1 ± 0,83
Células diana marcadas con 111In, anticuerpos utilizados a 5 pg/pocillo, PBMC humanas activadas con IL-2 utilizadas como células efectoras, incubación de 4 horas a 37°C antes de la recolección.
Ejemplo 14. Caracterización del CPAA reconocido por 16C3
Se examinaron varias características del antígeno al que se une el anticuerpo 16C3 en transferencias Western utilizando varios tratamientos. Los datos de la Tabla 10 demuestran que el antígeno 16C3 está presente en algunas, pero no en todas, las células tumorales colorrectales y pancreáticas cultivadas. Es importante destacar que el antígeno 16C3 está presente en extractos de tejido fetal derivados de tracto digestivo e intestino. Los especímenes positivos de la Fracción I representan productos eluidos (Fracción I) de rondas de cromatografía en columna Sephadex G-200 utilizando tejidos embrionarios disecados y sometidos al método Hollinshead de extracción y purificación de proteínas de membrana. Los especímenes de tumor colorrectal se obtuvieron de procedimientos quirúrgicos. Los tejidos se trituraron y se sometieron a extracción de proteína total con detergentes. La Tabla 10 muestra los datos de la expresión del antígeno tumoral 16C3 en diversas células tumorales mediante transferencia Western de estos extractos celulares. Estos datos sugieren que el antígeno tumoral 16C3 se puede expresar durante la fase embrionaria de la vida, así como en el cáncer. La expresión del antígeno 16C3, por lo tanto, podría estar regulada evolutivamente para que se exprese durante el desarrollo del tejido embrionario y nuevamente durante el desarrollo del cáncer.
Tabla 10. Expresión del antígeno tumoral 16C3 en diversas células tumorales.
Línea celular Antígeno 16C3
SW1116 (colorrectal) Positivo (PM ~ 220 kDa)
SW480 (colorrectal) negativo
SW1463 (colorrectal) negativo
COLO-205 (colorrectal) Positivo (PM ~ 220 kDa)
CALU-1 (pulmón) negativo
PANC-1 (páncreas) negativo
PR-22 (próstata) negativo
HT-29 (colorrectal) Positivo (PM ~ 220 kDa y 110 kDa)
LS174T (colorrectal) Positivo (PM ~ 220 kDa y 110 kDa minoritario CFPAC-1 (páncreas) Positivo (PM ~ 220 kDa y 110 kDa)
ASPC-1 (páncreas) Positivo (PM ~ 220 kDa y 110 kDa)
(continuación)
Línea celular Antígeno 16C3
Preparación de tejido humano
Tracto digestivo fetal, Fracción I, 20/12/72 Positivo (PM ~ 220 kDa y 110 kDa)
Intestino fetal, Fracción I, 24/6/75 Positivo (PM ~ 220 kDa y 110 kDa)
Tejidos tumorales colorrectales, resecados Positivo (PM ~ 220 kDa y 110 kDa)
Se realizó una descripción cualitativa del antígeno tumoral 16C3 expresado por líneas de células tumorales colorrectales y pancreáticas utilizando análisis de transferencia Western después de varios tratamientos químicos. Estos hallazgos se presentan en la FIG. 8 - FIG.11, y Tabla 11, a continuación.
Tabla 11. Análisis de transferencia Western después de varios tratamientos químicos. Característica Línea de células tumorales
LS174T CFPAC ASPC-1 Semicuantificación de la expresión Mediante Transferencia Mediante Transferencia Mediante Transferencia de antígeno en sobrenadante Western Western Western
(LS174 se expresa como 100%)
Cantidad relativa 100% Cantidad relativa 300% Cantidad relativa ~30% Semicuantificación de la expresión Mediante Transferencia Mediante Transferencia Mediante T ransferencia de antígeno en sedimento celular Western Western Western
(LS174 se expresa como 100%)
Cantidad relativa 100% Cantidad relativa 200% Cantidad relativa 80% Razón de presencia en el 100/20 100/20
sedimento celular frente al
sobrenadante
Figure imgf000043_0001
~ PM en gel SDS según lo ~ 200 kDa y 110 kDa ~ 200 kDa y 110 kDa ~200 kDa y 110 kDa determinado mediante (componente minoritario)
transferencia western
Efecto de los agentes reductores Sin efecto sobre la
DDT o 2-ME antigenicidad o el peso o so molecular
Figure imgf000043_0002
Figure imgf000043_0003
Tratamiento con glicosidasa La antigenicidad no se ve afectada por el tratamiento con glicosidasa, pero la PNGasa F redujo el peso molecular de la banda de 200 kDa a ~ 130 kDa. La banda inferior (110 kDa) no se ve afectada por la PNGasa F
Eliminación beta utilizando NaOH Pérdida de antigenicidad
Tratamiento con tripsina durante Antigenicidad no afectada pero reducción del peso No realizado
24 horas a 25°C o 37°C molecular (banda ancha difusa)
Tratamiento con proteasa V8 La antigenicidad no se ve afectada, pero reducción No realizado
24 horas a 25°C del peso molecular (banda ancha difusa)

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en donde el anticuerpo:
a) comprende las secuencias de CDR de cadena ligera GASENIYGALN (SEQ ID NO: 1), GASNLAD (SEQ ID NO: 2) y QNVLSSPYT (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQNFKG (SEQ ID NO: 8) y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11);
b) comprende las secuencias de Cd R de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QNVLSSPYT (SEQ ID NO: 3), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYSQKFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11);
c) comprende las secuencias de Cd R de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QQVLSSPYT (SEQ ID NO: 6), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQKFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11); o
d) comprende las secuencias de Cd R de cadena ligera QASENIYGALN (SEQ ID NO: 4), GASNLAT (SEQ ID NO: 5) y QQVLSSPYT (SEQ ID NO: 6), y las secuencias de CDR de cadena pesada GYTFTDYAMH (SEQ ID NO: 7), LISTYSGDTKYNQNFQG y GDYSGSRYWFAY (SEQ ID NO: 11),
en donde dicho anticuerpo se une específicamente a un antígeno de glicoproteína expresado sobre la superficie celular de los tejidos de cáncer de colon y páncreas.
2. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que comprende:
(a) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPASLSASV GETVTITCGASENIYGALNWYQRKQGKSPQLLIYGASNLADGMSSRFSGSGS GRQYSLKISSLHPD-DVATYYCQNVLSSPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 16) y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos
Q V QLQQS GPE V VRPG V S YKIS CKGS G YTFT
D Y AMHW VKQS H AKS LE WIGLIS T Y S GD TKYN QNFKGK ATMT VD KS S NT AY
MELARLTSEDSAIYYCARGDYSGSRYWFAYWGQGTLYTVSA (SEQ ID NO:
22) ;
(b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCGASENIYGALNWYQRKPGKSPKLLIYGASNLADGMPSRFSGSGSG RQYT LTISSLQPEDVATYY-CQNVLSSPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 17) y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos
QV QLV QS GAE VKKPGAS VKVSCKGS GYT
FTDYAMHWVRQAPGQRLEWIGLISTYSGDTKYNQNFKGKATMTVDKSASTA
YMELS S LRS EDT A V Y Y C ARGD Y S GS R YWF A YW GQGT LVT V S S (SEQ ID NO:
23) ;
(c) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCGASENIYGALNWYQRKPGKSPKLLIYGASNLADGMPSRFSGSGSG RQYT LTISSLQPEDVATYY-CQNVLSSPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 18) y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos
Q V QLV QS GAE VKKPGAS VK V S CKGS G YTF
TDYAMHWVRQAPGQGLEWIGLISTYSGDTKYNQNFKGKATMTVDTSISTAY
MELS RLRS DDT AI Y Y C ARGD Y S GS R YWFA YW GQGTL VT V S S (SEQ ID NO:
24) ;
(d) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCQASENIYGALNWYQRKPGKSPKLLIYGASNLATGMPSRFSGSGSGT DYTFTISSLQPEDIATYYC-QNVLSSPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 19) y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos:
Q Y QL V QS G AE YKKPG AS YKY S CKAS G YTF
TD Y AMHW VRQ APGQRLEWMGLIS T YS GDT KY S QKFQGRVTMT VDKS ASTA
YMELS S LRS EDT A V Y Y C ARGD Y S GS R YWF A YW GQGTL VT V S S (SEQ ID NO:
25) ;
(e) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCQASENIYGALNWYQRKPGKSPKLLIYGASNLATGMPSRFSGSGSGR QYTFTISSLQPEDIATYYC-QQVLSSPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 20) y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos
Q V QL V QS G AE VKKPG AS VKV S CKAS G YTF
TD Y AMHW VRQ APGQRLEWIGLIS T YS GDTK YN QKF QGKATMT VDKS ASTA
YMELS S LRS EDT A V Y Y C ARGD Y S GS R YWF A YWGQGTL VT V S S (SEQ ID NO:
26) ;
(f) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCGASENIYGALNWYQRKPGKSPNLLIYGASNLADGMPSRFSGSGSG RQYTLTISSLQPEDVATYY-CQNVLSSPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 21) y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos
QVQLVQS GAEVKKPGAS VKVSCKGS GYT
FTDYAMHWVRQVHAQGLEW1GLISTYSGDTKYNQNFKGKATMTVDKSTST
A YMELS S LRS EDT A V YY C ARGD Y S GS RYWFA Y WGQ GTLV T V S S (SEQ ID
NO: 27); o
(G) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos MGVPTQLLLLWLTV VVVRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIYGALNWYQRKPGKSPKLLI YGASNLATGMPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQVLSSPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO: 28) y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos MGWSCIIFFL
VATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAP GQRLEWMGLISTYSGDTKYNQNFQGRVTMTVDKSASTAYMELSSLRSEDTA VYYCARGDYSGSRYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSR-WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 29).
3. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es
a) un anticuerpo monoclonal de ratón, o
b) un anticuerpo quimérico que comprende las regiones constantes kappa y gamma-1 de inmunoglobulina humana.
4. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho fragmento es un Fab, Fab' o (F(ab)')2.
5. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo está conjugado con un radical químico adicional, preferiblemente una marca detectable o un fármaco quimioterapéutico, opcionalmente en donde el radical químico adicional es
a) una marca radiactiva,
b) un agente fluorescente,
c) un metal que emite fluorescencia,
d) un agente bioluminiscente,
e) un agente quimioluminiscente,
f) un producto conjugado de fármaco de molécula pequeña,
g) un agente citotóxico,
h) un fármaco quimioterapéutico, opcionalmente
en donde el anticuerpo forma parte de una inmunotoxina.
6. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, en donde el anticuerpo presenta actividad ADCC.
7. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde opcionalmente el ácido nucleico comprende la secuencia codificante.
gcggggcagcctcacacagaacacacacagatatgggtgtacccactcagctcctgttgctgtggcttacagtcgtagttgt
cagatgtgacatccagatgactcagtctccagcttcactgtctgcatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtggagcaa
gtgagaatatttacggtgctttaaattggtatcagcggaaacagggaaaatctcctcagctcctgatttatggcgcaagtaattt
ggcagatggcatgtcatcgaggttcagtggcagtggatctggtagacagtattctctcaagatcagtagcctgcatcctgac
gatgttgcaacgtattactgtcaaaatgtattaagtagtccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacggg
ctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttga
acaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttgga
ctgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataa
cagctatacctgtgaggccactcacaagacaccaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttagagaca
aaggtcctgagacgccaccaccagctccccagctccatcctatcttcccttctaaggtcttggaggcttccccacaagcgac
ctaccactgttgcggtgctccaaacctcctccccacctccttctcctcctcctccctttccttggcttttatcatgctaatatttgca
gaaaatattcaataaagtgagtctttgcacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa (SEQ ID NO: 12), o acgcgggacacagtagtctctacagtcacaggagtacacaggacattgccatgggttggagctgtatcatcttctttctggta gcaacagctacaggtgtgcactcccaggtccagctgcagcagtctgggcctgaggtggtgaggcctggggtctcagtga agatttcctgcaagggttccggctacacattcactgattatgctatgcactgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctcgag tggattggacttattagtacttacagtggtgatacaaagtacaaccagaactttaagggcaaggccacaatgactgtagacaa atcctccaacacagcctatatggaacttgccagattgacatctgaggattctgccatctattactgtgcaagaggggattattc cggtagtaggtactggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacgacacccccatctgtct atccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagcc agtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactc tgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcag caccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtct tcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaag gatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagca gttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagg gtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgta caccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaaga cattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggc tcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatga gggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatgatcccagtgtccttggagccctctggcc ctacaggactttgacacctacctccacccctccctgtataaataaagcacccagcactgcctcgggaccctgcataaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa (SEQ ID NO: 13),
opcionalmente en donde el ácido nucleico comprende adicionalmente secuencias de ADN reguladoras que permiten la expresión de genes de dicho ácido nucleico.
9. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 8.
10. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 9.
11. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento del carcinoma colorrectal o pancreático.
12. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el diagnóstico de cáncer colorrectal o pancreático.
13. El uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 6 en la fabricación de un medicamento para su uso en un método de tratamiento de carcinoma colorrectal o pancreático.
14. Un kit de diagnóstico que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende un conjunto de instrucciones de uso.
15. Un método de diagnóstico in vitro de carcinoma pancreático o colorrectal en un sujeto que comprende:
(a) incubar una muestra clínica o biológica de un sujeto en presencia de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho anticuerpo está marcado, ya sea directa o indirectamente, y
(b) detectar el anticuerpo que está unido en la muestra, en donde opcionalmente la marca es un agente fluorescente, un metal que emite fluorescencia, un agente bioluminiscente o un agente quimioluminiscente, u opcionalmente
en donde el anticuerpo se detecta indirectamente, preferiblemente utilizando un anticuerpo secundario.
16. El método de la reivindicación 15, en donde
(i) el anticuerpo se detecta mediante inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), preferiblemente ELISA, opcionalmente en donde la detección es mediante ELISA, y en donde la muestra es una biopsia de tejido, sangre, suero, muestra fecal o líquido recogidos del tracto colorrectal después de la administración de un enema o laxante oral; o
(ii) el método comprende un método histológico.
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