CN117384286A - 针对gpa33的单域抗体及其衍生蛋白和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫学领域，涉及针对GPA33的单域抗体及其衍生蛋白和应用。所述的单域抗体由重链构成，重链包括SEQ ID NO:41‑SEQ ID NO:47任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:48‑SEQ ID NO:55任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:56‑SEQ ID NO:68任意一条所示的重链CDR3。相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对GPA33的单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且能阻断特定细胞释放细胞因子，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有较好的成药性。

Description

针对GPA33的单域抗体及其衍生蛋白和应用
技术领域
本发明涉及生物技术或免疫学技术领域，涉及针对GPA33的单域抗体及其衍生蛋白和应用。
背景技术
结直肠癌是西方国家最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症死亡的主要原因。2018年统计数据显示，世界癌症并发人数为1810万，死亡人数为960万，其中肠癌治愈率为6.1％，死亡率为9.2％。由于近年来微播散性结直肠癌对传统疗法产生了高耐药性，新型治疗方法及药物的开发亟不可待。产生较少的免疫原性、构建人源化或嵌合抗体，以减少患者的免疫反应；允许抗体重复使用、更特异的抗原识别是我们追求的目标。
GPA33(Cell surface A33 antigen，Swiss Prot数据库收录号：Q99795)是一个分子量为35.6kDa的I型单次跨膜蛋白，由319个氨基酸组成，其糖基化修饰位置在1-235个氨基酸之间，位于细胞膜外。GPA33是一种细胞表面分化抗原，属于免疫球蛋白超家族。GPA33等位基因定位于染色体1q24上，包含7个外显子，基因组DNA总长为37787bp。
GPA33呈现组织特异性表达。其特异性的表达于胃肠上皮组织，主要分布于黏膜上皮细胞，在其他组织中含量较低。虽然目前关于GPA33的功能还不完全清楚，但肿瘤疾病学研究发现GPA33在超过95％的结直肠癌中高表达。由于GPA33的表达具有很高的肠组织特异性，其不仅为肠道肿瘤检测提供一个指标，对研究肠道肿瘤的发生和进展都起着重要作用。
早在2009年就有法国研究人员发现PPARγ配体以时间和浓度依赖的方式上调GPA33的mRNA和蛋白水平。研究人员利用DNA芯片技术，在HT29-Cl.16E细胞中发现GPA33基因是PPARγ的靶基因；对不同人结肠癌细胞(包括HT29-Cl.16E，Caco2和SW1116等)施用PPARγ激动剂GW7845都显示二者之间呈现为正相关。其中涉及的主要机制是PPARγ的活化可诱导KLF4的表达；KLF4于GPA33的启动子结合从而增加GPA33的表达。
GPA 33与骨关节炎也有一定相关性。目前临床上对于骨关节炎的诊断主要基于影像学的检查。但骨关节炎在早期没有或很少有症状，只在发生继发炎症、疼痛、影响关节的活动时，才会就医。此时关节损伤发生已久。开发用于早期骨关节炎诊断的方法是亟待解决的问题。2018年有研究报道GPA33基因在正常滑膜组织和骨关节炎滑膜组织中的表达存在显著差异，据此可将GPA33用于开发诊断骨关节炎的产品。实验人员使用荧光定量PCR技术发现相较于正常滑膜组织，骨关节炎滑膜组织中GPA33基因表达含量高了10倍左右。此外，使用免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序也得到了相同的实验结果。相比传统手段基因诊断更及时、灵敏，降低骨关节炎死亡率。
免疫失调指的是自身免疫反应对自身的组织和器官造成了损伤，并出现了症状。2021年有研究报道，使用质谱和流式细胞术测定了GPA33在人血白细胞亚群中的表达模式。结果显示GPA33在B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和先天淋巴细胞中均有表达，其中CD4+T细胞表达显著。原始T细胞和CXCR5+调节性T细胞表达高水平的GPA33，原始CD4+T细胞表达中等水平的GPA33。GPA33的表达模式一定程度上凸显了CD4+中枢记忆T细胞人群的功能异质性。GPA33+CD4+中枢记忆T细胞完全未分化，真正的中枢记忆T细胞缺乏即时效应功能，而GPA33+中枢记忆T细胞表现出快速效应功能。GPA33在传统CD4+T细胞中的表达显示其在未分化状态定位、自我保护中发挥一定作用。同时，也有研究结果表明，GPA33能够识别人类tTreg细胞，并为分离这些细胞提供一种更安全、更有效的过继细胞治疗策略。Treg细胞可以在胸腺发育过程中产生(tTreg细胞)，也可以来源于成熟的常规CD4+T细胞(pTreg细胞)。小鼠研究表明，tTreg细胞具有很强的保守性，而pTreg细胞可以还原为传统的CD4+T细胞。蛋白质组学和转录组学的研究结果显示GPA33在人类Treg细胞的一个子群上表达。GPA33在tTreg细胞发育过程中获得较晚，在TGF-β诱导的Treg细胞中不表达。GPA33能够识别人类血液中缺乏产生效应细胞因子(IL-2,IFN-γ，IL-17)能力的Treg细胞。GPA33高表达的Treg细胞普遍优先表达标记tTreg细胞的转录因子Helios，所以即使在没有雷帕霉素的情况下，也能在体外强劲、稳定地扩增。扩增后的GPA33高表达Treg细胞具有抑制性，无法产生促炎细胞因子。
目前，针对GPA33的靶向临床药物不多。Servier公司和Macro Genics公司开发过一种双亲和重靶向的可招募T细胞的双特异性抗体(DART)。DARTs是由一种抗体的VH和另一种抗体的VL链相连。第二种抗体的VH与第一种抗体的VL相连组成的类双特异性抗体，通过额外的二硫键稳定形成DART。MGD007是一种DART蛋白，旨在引导T细胞靶向表达GPA33的结肠癌，2014年7月已进入I期临床试验阶段(代号NCT02248805)。MGD007在结构上融合了一个Fc区，因而具有较长的血清半衰期。有相关异种移植研究显示，低至4μg/kg时，肿瘤生长受到抑制。CD8+和CD4+T细胞介导GPA33表达的肿瘤细胞裂解，活性增加，颗粒酶和穿孔素增加。值得注意的是，抑制的T细胞群也可以被用来介导表达GPA33的肿瘤细胞的裂解。伴随着CTL活性，T细胞的激活和扩张都以GPA33依赖的方式呈现。在食蟹猴中，4周、100μg/kg的剂量具有良好的耐受性，与含Fc分子的药代动力学一致。
还有一些实验室自主研发的抗体及相关技术也在不断地验证中。瑞士联邦理工学院在2020年发表的文献中提到利用噬菌体展示技术生成的一种GPA33抗体—A2会识别GPA33的“V”结构域，能均匀染色低分化、中分化和高分化的结肠腺癌样本。A2抗体是重组鼠IgG2a亚型，优先定位于免疫小鼠中GPA33转染的CT26小鼠结肠腺癌细胞，在肿瘤肿块内均匀分布，而其他抗体在肿瘤病变中呈现斑片状。A2在体外通过抗体依赖的细胞毒性有效地诱导杀伤GPA33表达的细胞，并能在体内抑制GPA33阳性小鼠CT26和C51肺转移瘤的生长。另一方面，基于抗体的显影剂作为实体肿瘤的辅助诊断工具也在不断开发中。四川大学研究人员通过将GPA33-scFv与人IgG1抗体的Fc片段融合，构建了抗GPA33的GPA33scFv-Fc抗体。GPA33-scFv-Fc特异性结合GPA33阳性的结直肠癌细胞和肿瘤组织。用近红外荧光探针CF750标记的GPA33-scFv-Fc静脉注射皮下GPA33阳性的LS174T肿瘤移植物小鼠后，利用光学成像系统可在24小时内动态记录肿瘤移植物的高对比度图像。还有科研人员从GPA33阳性的LIM1215细胞中分离出外泌体，并装载阿霉素；同时将GPA33抗体(GPA33Ab-US)包覆表面羧基超顺磁氧化铁纳米颗粒(US)，期望这些纳米颗粒表面的GPA33抗体能够与GPA33阳性的外泌体结合并形成复合物靶向GPA33阳性的结肠癌细胞。结果表明，GPA33Ab-US-Exo/Dox在LIM1215细胞中具有良好的亲和力和抗增殖作用。另有体内研究表明，GPA33Ab-US-Exo/Dox具有良好的肿瘤靶向能力，能够抑制肿瘤生长，延长小鼠的生存期，降低心脏毒性。
总之，本领域仍需要能够与GPA33高亲和力结合，特别是GPA33&CD3特异性的抗体。
纳米抗体是抗体界的新宠，由于分子量小，可以通过简单的分子克隆技术获得双价、三价或双特异性抗体。纳米抗体由于其分子小的特点，不论在原核表达系统(大肠杆菌)，还是真核表达系统(CHO细胞、293细胞等)中进行都可以达到很高的产量。纳米抗体的迅速发展成为在抗体药物开发方面一股潜力无限的力量，代表着从今以后的抗体药物的重要发展方向。
纳米抗体与靶结合位点具有很高的亲和力和良好的穿透能力，使得它更容易与受体靶向结合，渗入到血管少的组织内。同时鉴于纳米抗体的低免疫原性，将纳米抗体对小鼠反复给药，经检测，没有引起任何体液或细胞免疫。另外，纳米抗体可以用于构建多种分子结构，从而可以进行一些分子辅助治疗。
发明内容
本发明的目的是提供针对GPA33的单域抗体及其衍生蛋白和应用，前述的单域抗体及其衍生蛋白具备与GPA33蛋白的强结合能力，且能介导细胞内化或ADCC作用。
单域抗体作为单克隆抗体的一类，其比传统单抗的亲和力普遍更高，稳定性更好，并且它也具备传统单抗的优点。因此，本发明利用上述优势，获得针对GPA33的单域抗体，经过原核表达即具备与GPA33蛋白的强结合能力，真核表达后发现其能介导细胞内化或ADCC作用，具有一定的成药性。
本发明的第一方面，提供了针对GPA33的单域抗体，所述的单域抗体由重链构成，重链包括SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:47任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:48-SEQ IDNO:55任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:56-SEQ ID NO:68任意一条所示的重链CDR3。
具体地，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述(1)-(20)的一种：
(1)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:62所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
(4)SEQ ID NO:45所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
(5)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:52所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
(6)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
(7)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:61所示的CDR3；
(8)SEQ ID NO:42所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:66所示的CDR3；
(9)SEQ ID NO:42所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:67所示的CDR3；
(10)SEQ ID NO:42所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:65所示的CDR3；
(11)SEQ ID NO:44所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:64所示的CDR3；
(12)SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:54所示的CDR2，SEQ ID NO:59所示的CDR3；
(13)SEQ ID NO:41所示的CDR1，SEQ ID NO:48所示的CDR2，SEQ ID NO:68所示的CDR3；
(14)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3；
(15)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:57所示的CDR3；
(16)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:51所示的CDR2，SEQ ID NO:56所示的CDR3；
(17)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:56所示的CDR3；
(18)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:58所示的CDR3；
(19)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:55所示的CDR2，SEQ ID NO:58所示的CDR3；
(20)SEQ ID NO:45所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:58所示的CDR3。
以上(1)-(20)的CDR组合依次与SEQ ID NO.1-20分别对应。
上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80％同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85％同源性”，更优选为“至少90％同源性”，更优选为“至少95％同源性”，最优选为“至少98％同源性”。
在优选实施例中，所述的单域抗体的序列还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；
框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:69-72所示的FR1或FR1的变体，所述FR1的变体在所述FR1中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:73-77所示的FR2或FR2的变体，所述FR2的变体在所述FR2中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:78-89所示的FR3或FR3的变体，所述FR3的变体在所述FR3中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:90-91所示的FR4或FR4的变体，所述FR4的变体在所述FR4中包含至多3个氨基酸的替换。
在一个实施方案中，所述针对GPA33的单域抗体与选自SEQ ID NO：1-20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且能够特异性结合GPA33蛋白。
在另一个优选实施例中，所述针对GPA33的单域抗体与选自SEQ ID NO：1-20的氨基酸序列具有至少95％序列同源性，并且能够特异性结合GPA33蛋白。
本发明的第二方面是提供针对GPA33的单域抗体，所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-20所示，或者所述单域抗体与SEQ ID NO.1-20的氨基酸序列具有至少95％序列同源性。
在一个实施方案中，编码所述针对GPA33的单域抗体的核酸分子与选自SEQ IDNO：21-40的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且其编码的针对GPA33单域抗体能够特异性结合GPA33蛋白。
优选的，所述单域抗体的编码序列分别如SEQ ID NO.21-40所示，或者与SEQ IDNO.21-40具有至少95％序列同源性。
本发明的第三方面是提供前述的针对GPA33的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。
本发明的第四个方面是提供编码前述的针对GPA33单域抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：21-40所示，或者与SEQ ID NO.21-40具有至少95％序列同源性。
本发明的第五个方面是提供一种表达载体，其包含编码前述的单域抗体或者前述的Fc融合抗体的核苷酸分子或者前述的核苷酸分子。
本发明的第六个方面是提供一种宿主细胞或非人生物体，其可以表达出前述的针对GPA33的单域抗体，或其包含前述的表达载体。
本发明还提供一种产生针对GPA33的单域抗体或其Fc融合抗体的方法，包括步骤：(a)在适合产生单域抗体或其Fc融合抗体的条件下，培养前述的宿主细胞，从而获得含所述针对GPA33单域抗体或其Fc融合抗体的培养物；(b)从所述培养物中分离或回收所述的针对GPA33单域抗体或其Fc融合抗体；以及(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的针对GPA33单域抗体或其Fc融合抗体。
本发明的第七个方面是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有：(i)如前述的针对GPA33的单域抗体、或前述的针对GPA33的单域抗体的Fc融合抗体；以及(ii)一种或几种药学上可接受的赋型剂。
本发明还提供前述的针对GPA33的单域抗体在制备抑制GPA33基因表达的药物或抗肿瘤药物或者抗关节炎药物中的用途。抑制GPA33基因表达的药物可适用于GPA33基因高表达的任何病症。优选的，所述的肿瘤包括但不限于结直肠癌。所述的关节炎可以为骨关节炎。
本发明还提供针对GPA33的单域抗体在制备介导细胞内化或者ADCC作用的药物中的应用。
本发明还提供前述的针对GPA33的单域抗体、或前述的针对GPA33的单域抗体的Fc融合抗体的用途，用于制备试剂、检测板或试剂盒(例如ELISA试剂盒)；其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中GPA33蛋白的存在和/或含量。
所述的单域抗体为VHH，其仅包含抗体重链，不包含抗体轻链。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明使用生物基因工程技术筛选出特异性针对GPA33的单域抗体，这些抗体初步亲和力明显，并且阻断特定细胞释放细胞因子的效果优异，通过原核表达即具有良好的结合活性，具有较好的成药性，还具有以下优势：
(1)本发明得到的单域抗体，表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本。
(2)本发明得到的单域抗体，其抗体的多组合形式改造简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应。
(3)本发明得到单域抗体，其亲和力范围更为宽泛，在未进行亲和力成熟之前，其亲和力范围可以从nM级别至pM级别，为后期不同用途的抗体提供多个选择。
附图说明
图1人源重组GPA33蛋白SDS-PAGE分析图；
图2VHH序列插入率分析；
图3靶向GPA33淘选的文库富集情况；
图4GPA33靶点部分原核表达抗体SDS-PAGE；
图5GPA33靶点部分真核表达抗体SDS-PAGE；
图6GPA33靶点抗体抗原结合活性；
图7GPA33靶点工具抗体抗原结合活性；
图8GPA33靶点抗体种属交叉反应抗原结合活性；
图9GPA33靶点纳米抗体的ADCC活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
单域抗体(sdAb，也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3)。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。
如本文所用，术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同源性。
本发明中，与本发明公开的CDR1-3的序列同源性高的序列，也可以得到针对GPA33的纳米抗体。
在一些实施例中，与(1)-(20)中的序列具有“至少80％同源性”的序列，或者“至少85％同源性”、“至少90％同源性”、“至少95％同源性”、“至少98％同源性”的序列都可以实现发明目的(即衍生蛋白)。
在一些实施例中，与SEQ ID NO：1-20中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下(a)-(d)组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：(a)极性带负电残基及其不带电酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
(b)极性带正电残基：His、Arg、Lys；(c)芳香族残基：Phe、Trp、Tyr；(d)脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：
Asp被Glu取代；Asn被Gln或His取代；Glu被Asp取代；Gln被Asn取代；His被Asn或Gln取代；Arg被Lys取代；Lys被Arg、Gln取代；Phe被Met、Leu、Tyr取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Phe、Trp取代；Ala被Gly或Ser取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Gly被Ala或Pro取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Leu被Ile或Val取代；Ile被Leu或Val取代；Val被Ile或Leu取代；Cys被Ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在CDR1-3区，而框架区序列FR1-4并非是不可改变的，FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本专利是通过基因工程技术制备目标蛋白以及目标蛋白的截短体形式，然后将获得的抗原蛋白免疫内蒙古阿拉善双峰驼，通过多次免疫后，获得骆驼的外周血淋巴细胞或者脾细胞，通过基因工程的方式，将驼源抗体可变区编码序列重组到噬菌体展示载体中，通过噬菌体展示技术筛选出针对抗原蛋白的特异性抗体，并进一步检测其与抗原结合的能力以及在包括自身免疫疾病治疗中的应用。
现将上述技术方案拆分详解，以具体实施例的方式描述：
实施例1：人源GPA33重组胞外结构域蛋白的制备：
本专利中用到的人源重组胞外结构域蛋白为公司自己表达纯化获得，人源重组GPA33蛋白的表达载体设计方案具体如下：
(1)在NCBI中检索获得GPA33的编码序列，其收录号为NM_005814.2，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为NP_005805.1，Uniprot ID为Q99795。
(2)分别通过TMHMM和SMART网站对NP_005805.1对应的氨基酸序列进行蛋白跨膜区和胞外端的分析。
(3)分析结果显示GPA33蛋白的胞外端为1-235位氨基酸，其中1-21位为该蛋白的信号肽。
(4)利用基因合成的方式将编码GPA33蛋白的22-235位氨基酸的核苷酸序列克隆到载体pcDNA3.4中。
(5)将构建好的载体进行Sanger测序，比对原始序列，确认无误后，将该重组质粒进行批量抽提，去除内毒素，转染悬浮293F进行目的蛋白的表达、纯化，纯化后GPA33重组蛋白的SDS-PAGE分析结果如图1所示，纯化后的蛋白纯度高达90％，满足动物免疫的需求。
实施例2：针对GPA33蛋白的单域抗体文库的构建：
将1mg实施例1中纯化获得的人源重组GPA33蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，免疫一只内蒙古阿拉善双峰驼，每周免疫一次，共连续免疫7次，除首次免疫外，其余六次均是用1mg GPA33蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合进行动物免疫，该免疫过程是为了集中刺激骆驼使其产生针对GPA33蛋白的抗体。
动物免疫结束后，抽取骆驼外周血淋巴细胞150mL，并提取细胞的RNA。利用提取的总RNA合成cDNA，并通过套式PCR反应以cDNA为模板扩增VHH(抗体重链可变区)。
然后利用限制性内切酶分别酶切pMECS载体和VHH片段，然后将酶切后的片段和载体链接。将连接后的片段电转化至感受态细胞TG1中，构建GPA33蛋白的噬菌体展示文库并测定库容，文库的库容大小约为1×109，同时，通过菌落PCR鉴定检测文库在目的片段的正确插入率，结果如图2所示。
结果显示，从文库中随机挑选的30个菌落进行PCR扩增后，有28个克隆可以扩增出大小为600bp(预测大小)的条带，有2个克隆扩增出条带不正确，故正确插入率为28÷30×100％≈93.3％。
实施例3：针对GPA33蛋白的单域抗体筛选：
取200μL实施例2中的重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体。
将稀释在100mM pH8.3的NaHCO3中的GPA33蛋白500μg偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔(培养基对照)；第二天加入200μL的3％的脱脂乳，室温封闭2h；封闭结束后，加入100μl扩增后噬菌体文库(大约2×1011个噬菌体颗粒)，室温作用1h；作用1小时后，用PBS+0.05％Tween-20洗15遍，以洗掉未结合的噬菌体。
用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与GPA33蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复1轮，逐步得到富集，当富集倍数达到10倍以上时，富集效果如图3所示。
图3中，P/N＝生物淘选中阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数/阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数，该参数在富集发生后会逐渐增大；I/E＝生物淘选中每轮加入阳性孔的噬菌体总量/生物淘选中每轮从阳性孔洗脱出的噬菌体总量，该参数在富集发生后会逐渐趋近于1。
实施例4：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选针对GPA33的特异性阳性克隆:
根据上述实施例3中的筛选方法对抗GPA33蛋白的单域抗体进行3轮筛选，抗GPA33蛋白的噬菌体富集因子达到10以上，筛选结束后，从筛选获得的阳性克隆中挑选384个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的2×TY培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜。
利用渗透涨破法获得粗提抗体；将GPA33重组蛋白分别释至100mM pH8.3的NaHCO3中并将100μg蛋白在酶标板(ELISA板)中4℃包被过夜。将获得的抗体粗提液取100μL转移至加入抗原的ELISA板上，室温孵育1h；用PBST洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的Mouse Anti-HA tag Antibody(HRP)(鼠抗HA辣根过氧化物酶标记抗体，ThermoFisher)，在室温孵育1h；用PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入终止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值。
当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2和CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对GPA33蛋白的单域抗体(SEQ ID NO.1-20以及未示出序列的1G9、1H5、1H7、2A10、2A3、3C6、3F7、3H10、4B3、4B5、2D5、2G5、3B6等其它单域抗体)。
其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。
20种单域抗体的CDR、FR序列如表1-6所示。
表3 20种单域抗体的CDR3序列
表4 20种单域抗体的FR1序列
表5 20种单域抗体的FR2序列
表6 20种单域抗体的FR3序列
单域抗体的氨基酸序列SEQ ID NO.1-20依次与单域抗体1A2、2H6、4F11、1E10、3C4、1A9、1D7、1B12、4E2、4C4、2B2、2E2、4F7、3G9、2C2、1A6、2A4、1A3、2A12、4B9一一对应。
4F7单域抗体的FR4序列为SEQ ID NO：90，其余19种单域抗体的FR4序列均为SEQID NO：91。
实施例5：GPA33蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达
将实施例4中测序分析所获得不同克隆株的质粒(pMECS-VHH)电转化到大肠杆菌HB2151中，并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。
接种1mL的过夜培养菌种至330mLTB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入1M IPTG，28℃摇床培养过夜；离心，收集大肠杆菌，利用渗透涨破法，获得抗体粗提液；
通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，纯化后部分的单域抗体，如图4所示，包括VHH1～18。
VHH1-18对应氨基酸序列SEQ ID NO.1-18的单域抗体，即VHH1-18分别对应：1A2、2H6、4F11、1E10、3C4、1A9、1D7、1B12、4E2、4C4、2B2、2E2、4F7、3G9、2C2、1A6、2A4、1A3。
实施例6：GPA33蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建
(1)将实施例4中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中：将实施例4中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列；
(2)通过序列合成的方式将密码子优化后的上述核苷酸序列(SEQ ID NO:21-40)合成至本公司设计改造的载体RJK-V4-hFC中得到重组真核表达载体，该载体的改造方法如实施例10所述；
(3)将步骤(2)构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒抽提，去除内毒素；
(4)将抽提后的质粒再进行序列测序鉴定；
(5)将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达,通过实施例7或8的方法将VHH的Fc蛋白表达后并通过实施例9的方法纯化上述抗体。
实施例7：GPA33蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养ExpiCHO-STM细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中；使细胞浓度达到约4×106-6×106活细胞/mL；
(2)在转染前一天，将ExpiCHO-STM细胞稀释浓度至3.5×106活细胞/mL，使细胞过夜培养；
(3)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×106-10×106活细胞/mL；
(4)用预热至37℃新鲜的ExpiCHOTM表达培养基将细胞稀释至6×106个活细胞/mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的ExpiCHOTM表达培养基的500mL摇瓶中；
(5)使轻轻颠倒混匀ExpiFectamineTMCHO试剂，用3.7mL OptiPROTM培养基稀释ExpiFectamineTMCHO试剂，回荡或混匀；
(6)用冷藏的4mL OptiPROTM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀；所述的质粒DNA为GPA33蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体，由实施例6制得；
(7)将ExpiFectamine CHO/质粒DNA复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶；
(8)将细胞在37℃、8％CO2、加湿的空气中震荡培养；
(9)转染后第1天(18-22小时后)添加600μl ExpiFectamineTMCHO Enhancer和24mLExpiCHO feed。
(10)在转染后约8天(细胞活率低于70％)收集上清。
实施例8：GPA33蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮293F细胞中的表达
重组单域抗体表达实验流程(以500mL摇瓶为例)：
(1)转染前3天以2.5×105/mL细胞传代和扩大培养293F细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120mL(终体积)的OPM-293 CD05 Medium培养基的500mL摇瓶中。使细胞浓度达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(2)转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106活细胞/mL。
(3)用预热的OPM-293 CD05 Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100mL(终体积)的培养基的500mL摇瓶中。
(4)用4mL Opti-MEM培养基稀释PEI(1mg/mL)试剂，回荡或吹打混匀；用4mL Opt-MEM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀，并用0.22μm的滤头过滤。室温孵育5min。
(5)将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中，颠倒混匀。将PEI/质粒DNA复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
(6)将细胞在37℃、5％CO2、120rpm震荡培养。
(7)转染后第24h、72h添加5mL OPM-CHO PFF05补料。
(8)在转染后约7天(细胞活率低于70％)收集蛋白表达上清。
实施例9：人源Fc重组单域抗体的纯化
(1)将实施例7或8中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；
(2)将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源Fc与Protein A结合的能力，使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化；
(3)将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；
(4)通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；
(5)用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统；
(6)将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液，进行中和；
(7)将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行SDS-PAGE分析，确定蛋白纯度在95％以上，且浓度在0.5mg/mL以上后，低温保存备用，部分抗体的SDS-PAGE结果如图5所示。图5中，1-7分别是单域抗体1A2、1A3、1A6、1E10、2A4、2A12、2B2。
实施例10：纳米抗体真核表达载体RJK-V4-hFc的构建
本发明中所使用的目标载体RJK-V4-hFC，为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG的重链编码序列(NCBIAccession No.:AB776838.1)中的Fc区段后改造而来的，即该载体包含了IgG重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下：
(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI；
(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS，Multiple Cloning Site)和6×His标签；
(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增；
(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段；
(5)将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒。
实施例11：GPA33蛋白的特异性单域抗体(原核表达)的结合量效曲线测定
(1)包被50μL 1μg/mL GPA33，4℃过夜。
(2)洗板；加入200μL5％牛奶，37℃封闭1h。
(3)将VHH稀释至2μg/mL，然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度。所述的VHH是实施例5得到的原核表达的GPA33蛋白的特异性单域抗体；
(4)洗板；加入50μL经步骤(3)稀释得到的单域抗体，两复孔，37℃孵育1h。
(5)洗板；加入50μL鼠抗HA标签-HRP二抗，37℃孵育30min。
(6)洗板(多洗几次)；加入50μL预先恢复常温的TMB，避光常温反应15min。
(7)加入50μL终止液(1N HCl)，酶标仪读数保存。
(8)绘制曲线，计算EC50，如图6所示，可见20种针对GPA33蛋白的单域抗体均对GPA33蛋白结合效力和特异性优异。
需要说明的是，图6中，例如4B9-1，2B5-2分别代表4B9单域抗体的第一次表达、2B5单域抗体的第二次表达。“-1”，“-2”符号仅仅是对表达次数进行的区分(4B9-1，2B5-2的序列分别与4B9及2B5相同)，该图中其他的“-1”，“-2”符号均为此目的。
实施例12：靶向人源GPA33的工具抗体(Tool antibody,Tab)的表达和纯化
Tab(MGD007)序列来自国际免疫遗传学数据库IMGT。
将搜索到的序列委托通用生物系统(安徽)有限公司进行哺乳动物细胞表达系统密码子优化，并克隆至pcDNA3.1载体。
经过抗性筛选，选择质粒阳性菌扩增，使用质粒中提试剂盒(Macherey Nagel,Cat#740412.50)抽提质粒。
按照每100mL细胞加入100μg质粒(40μg重链+60μg轻链)，使用PEI在293F细胞(培养基：FreeStyle 293Expression medium,Thermo,Cat#12338026+F-68,Thermo,Cat#24040032)中瞬转表达；
转染6～24h后加入5％体积的10％ Peptone(Sigma,Cat#P0521-100G)，8％ CO2130rpm培养约7～8天；
细胞活率降至50％时收取表达上清，使用ProteinA(GE，Cat#17-5438-02)重力柱纯化；
PBS透析后，使用Nanodrop测定浓度，SEC鉴定纯度，间接ELISA验证结合能力；
通过本方法获得的Tab，浓度不小于2mg/ml，纯度大于94％，与GPA33(ACRO，Cat#FO1-H52H1)结合EC50约为0.16nM，结果如图7所示。
实施例13：GPA33蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体的种属交叉结合量效曲线测定
(1)分别包被50μL，1μg/mL人、食蟹猴、小鼠GPA33，4℃过夜。
(2)洗板；加入200μL5％牛奶，37℃封闭1h。
(3)将VHH-hFc稀释至2μg/mL，然后5倍梯度稀释抗体共8个浓度梯度。这里的VHH-hFc是实施例8的GPA33蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体经实施例9纯化而得。
(4)洗板；加入50μL经步骤(3)稀释得到的单域抗体，两复孔，37℃孵育1h。
(5)洗板；加入50μL羊抗人IgG-HRP二抗，37℃孵育30min。
(6)洗板(多洗几次)；加入50μL预先恢复常温的TMB，避光常温反应15min。
(7)加入50μL终止液(1N HCl)，酶标仪读数保存。
(8)绘制曲线，计算EC50，如图8所示；其中hIgG指同型对照，不与任何靶标结合的免疫球蛋白分子，通过商品化购买得到；Tab由实施例12制得；可见本发明的20种针对GPA33的单域抗体对GPA33蛋白的种属交叉结合效力优异。
实施例14：人特异性针对GPA33的单域抗体以及工具抗体诱导的ADCC作用(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)：
将复苏后传代3-4代的Colo205细胞收集后分别按20000个每孔铺入96孔板；
将Tab、hIgG和VHH-hFc样品配置最高浓度为10μg/mL的溶液，并进行10倍梯度稀释，最终得到7个浓度；其中hIgG指同型对照，不与任何靶标结合的免疫球蛋白分子，通过商品化购买得到；Tab由实施例12制得；这里的VHH-hFc是实施例8的GPA33蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体经实施例9纯化而得；
将梯度稀释好的上述抗体溶液按细胞悬液的等体积加入细胞培养孔；
对于样品孔和E/T孔(抗体浓度为0)，收集Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIa细胞，按每孔20000个细胞加入细胞培养孔；
孵育6h后，用One-Glo试剂盒检测细胞杀伤，读取luminescence；
计算诱导倍数(Fold of Induction)＝(样品-BG)/(E/T-BG)
根据靶细胞杀伤率和浓度，进行四参数拟合，计算各抗体介导的ADCC作用的EC50浓度，结果如图9所示。可见本发明的20种单域抗体均能有效介导ADCC作用。
将上步骤中的混合液用流式细胞仪读取荧光值。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (9)

1.针对GPA33的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体由重链构成，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；
所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述(a)-(e)的一种：
(a)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:62所示的CDR3；
(b)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:51所示的CDR2，SEQ ID NO:56所示的CDR3；
(c)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:49所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3
(d)SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
(e)SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:52所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的针对GPA33的单域抗体，其特征在于：所述的抗体序列还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:69-72所示的FR1或FR1的变体，所述FR1的变体在所述FR1中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:73-77所示的FR2或FR2的变体，所述FR2的变体在所述FR2中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:78-89所示的FR3或FR3的变体，所述FR3的变体在所述FR3中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:90-91所示的FR4或FR4的变体，所述FR4的变体在所述FR4中包含至多3个氨基酸的替换。
3.针对GPA33的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1、16、6、2或5所示。
4.权利要求1-3任意一项所述的针对GPA33的单域抗体的Fc融合抗体或人源化抗体。
5.一种编码权利要求1-3任意一项所述的针对GPA33单域抗体的核苷酸分子，其特征在于：其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：21、36、26、22或25所示。
6.一种表达载体，其特征在于，其包含编码权利要求1-3任意一项所述的单域抗体或者权利要求4所述的Fc融合抗体的核苷酸分子或者权利要求5所述的核苷酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，其可以表达出权利要求1-3任意一项所述的针对GPA33的单域抗体，或其包含权利要求6所述的表达载体。
8.权利要求1-3任意一项所述的针对GPA33的单域抗体在制备抑制GPA33基因表达的药物或抗肿瘤药物或抗关节炎药物中的用途。
9.权利要求1-3任意一项所述的针对GPA33的单域抗体在制备介导细胞内化或ADCC作用的药物中的应用。
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