JP5039027B2 - 結腸癌および膵臓癌のための、組換え型モノクローナル抗体および対応する抗原 - Google Patents
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Description
本願は、2005年4月15日に出願された、「Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers」という名称の、米国仮特許出願第60/671,481号に関連し、35U.S.C§119(e)の下その利益を主張する。
本発明は、組換え型モノクローナル抗体およびペプチドならびに診断手順を含む臨床的および科学的手順、特にこのようなプロセスが、ヒト結腸直腸癌および膵癌関連抗原(CPAA)の検出ならびに前記組換え型モノクローナル抗体およびペプチドにより認識されたエピトープの特性決定を含む手順におけるこれらの使用の分野に関する。本発明はまた、結腸直腸癌および膵癌に関連する病理を診断および/または治療するための、本発明の診断法および/または治療法に有用な診断用化合物および/または医薬組成物の形態の抗CPAA抗体およびペプチドを提供する。
世界保健機構からの最新のデータによれば、2000年に世界中で1000万人が前記の癌と診断され、600万人がこの癌で死亡した。さらに、統計は世界中で、癌の発生率が増加傾向にあることを示している。例えば、アメリカでは、予測によると今日生存している人々の40パーセントが、その一生のある時点で何らかの形の癌と診断されるであろうと示唆している。2010年までに、その数は50パーセントまで増加するであろう。すべての癌の中で、結腸直腸癌はアメリカにおける癌関連死因の第2位であるが、膵癌は、11番目に頻度の高い癌で、男女共に癌死因の第4位である。この厳しいシナリオは、新規の癌の診断法および治療法に対する甚大な需要を示している。
本発明の目的は、ヒト結腸直腸癌および膵癌関連抗原(CPAA)の抗原ならびにエピトープに対して特異性を有する、組換え型モノクローナル抗体または組換え型モノクローナル抗体の部分(ペプチド)を提供することである。したがって、本発明の目的は、CPAAタンパク質およびペプチドに特異性を有する組換え型モノクローナル抗体またはその部分を提供することである。
本発明は、本明細書に記載されている特定の方法、プロトコル、および試薬などに限定されず、変化し得ることを理解すべきである。本明細書において使用される用語は特定の実施形態を説明する目的のみで使用され、請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
本発明は、その範囲内に、本発明の抗CPAA抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列を含む。NPC−1の軽鎖の可変領域をコードする核酸配列を図2に示す(配列番号1)。NPC−1の重鎖の可変領域をコードする核酸配列を図4に示す(配列番号4)。
従来は、モノクローナル抗体は、マウスのハイブリドーマ株で天然の分子として産生されてきた。以下に概説したこの技術に加えて、本発明はモノクローナル抗体の組換えDNAの発現を提供する。これは選択した宿主種での抗体誘導体および融合タンパク質の諸形態に加えてヒト化抗体の産生も可能にする。より最近では、細菌、酵母、トランスジェニック動物および鶏卵での抗体産生が、ハイブリドーマに基づく産生系の有望な代替手段として出現している。トランスジェニック動物の主な利点は、再生可能な資源からの潜在的な高収量である。
本発明は、CPAAに対する高度な特異性と親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。本発明は、また自然発生的に生じるかまたは既知の方法を用いて人工的に産生でき、依然として出発物質の特性を有する、つまり依然とし本発明による抗体またはこれらの誘導体を産生でき、周囲の培地にそれらを分泌できる、上記の詳しい説明で特徴づけられるハイブリドーマ細胞株の改変体および変異体に関する。
本発明の抗体は、ヒト抗体由来の定常領域が、マウス由来のLおよび重鎖可変領域にクローニングされた一部ヒトならびに一部マウス抗体から成るキメラ抗体を含む。場合によっては、ヒト配列の70%が保持されている。ヒト化抗体は、ヒト抗体フレームワークのおおよそ90%が保持され、マウスの相補性決定領域のみと組み合わせたキメラ抗体である。本発明で、完全ヒト化抗体もまた意図される。
1.抗CPAA抗体を産生する細胞株から、ならびにHおよびL定常領域を供給する任意の別の抗体からのメッセンジャーRNA(mRNA)の分離;クローニングおよびそれからのcDNA産生;
2.軽鎖および重鎖遺伝子の適切なVおよび/またはC領域遺伝子セグメントが、(i)適切なプローブで同定し得る、(ii)配列決定し得る、および(iii)キメラ抗体用の他の抗体由来のCまたはV遺伝子セグメントに適合するようにし得る、精製mRNA由来の完全長cDNAライブラリーの調製;
3.上記のように、クローニングした特異的な可変領域遺伝子セグメントを、クローニングしたC領域遺伝子に連結することによる完全な重鎖または軽鎖コード配列の作製;
4.マウス−マウス、ヒト−マウス、ヒト−ヒトまたはヒトマウス抗体を提供するための原核および真核細胞を含む選択した宿主での軽鎖および重鎖の発現および産生。
1.コンピュータプログラムを用いて、げっ歯類抗体可変ドメインに対して最も高い相同性を示すヒト抗体可変ドメイン配列に関するすべての利用可能なタンパク質(およびDNA)データベースを検索する。適切なプログラムのアウトプットは、げっ歯類抗体に最も相同性を示す配列、各配列に対するパーセント相同性、およびげっ歯類配列に対する各配列のアラインメントのリストである。これは、それぞれ独立して重鎖および軽鎖可変ドメイン配列の双方に対して行われる。ヒト免疫グロブリン配列のみが含まれる場合、上記の分析はより容易に達成される。
1.少なくともIgHまたは軽鎖の可変ドメイン、ヒト抗体由来のフレームワーク領域を含む可変ドメインならびに本発明のヒト化抗体に必要なCDRをコードするDNA配列に作動可能に連結された適切なプロモーターを含む、第1の複製可能な発現ベクターの調製;
2.少なくとも相補的IgLまたは重鎖の可変ドメインそれぞれをコードするDNA配列に作動可能に連結された適切なプロモーターを含む、第2の複製可能な発現ベクターの調製;
3.第1のまたは両方の調製したベクターを用いて細胞株を形質転換すること;および
4.前記形質転換細胞株を培養して、前記変更した抗体を産生することを含むプロセスにより調製することができる。
上記の産生技術、完全ヒト抗体のファージディスプレイ方法などのin vitro系および抗体ペプチドに加えて、診断薬および治療薬としての両方でヒト抗体の利点の多くが現在理解されている。
抗体の「誘導体」は、通常はタンパク質の一部でないさらなる化学的部分を含む。タンパク質の共有結合による修飾も、本発明の範囲内に含まれる。抗体の標的にしたアミノ酸残基と、選択した側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化剤とを反応することによって、このような修飾を分子に導入できる。例えば、当分野では周知である二官能性薬剤を用いる誘導体化は、抗体またはフラグメントを、非水溶性支持マトリックスまたは他の巨大分子の担体に架橋結合するために有用である。
モノクローナルまたはキメラ抗CPAA抗体に加えて、本発明はまた、本発明の抗CPAA抗体特異的抗イディオタイプ(抗Id)抗体に関する。抗Id抗体は、一般に別の抗体の抗原結合領域に関連する特有な決定基を認識する抗体である。CPAA特異的抗体は、イディオタイプ抗体またはId抗体と呼ばれる。Id抗体またはそれらの抗原結合領域を有するId抗体の供給源として、同種で同じ遺伝子型の動物(例えば、マウス系統)を免疫して、抗Idを調製できる。免疫された動物は、免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識して応答し、抗Id抗体を産生する。抗Id抗体はまた、さらに別の動物で、いわゆる抗抗Id抗体を産生する免疫応答を誘発するための「免疫原」として用いることもできる。抗抗Idは、抗Idを誘発した本来の抗体にエピトープ的に同一であり得る。したがって、mAbのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いて、同一特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することができる。
さらに、CPAAに対する抗体、その類似体、それらの部分、フラグメント、ペプチドまたは誘導体を、BALB/cマウスなどの適切な動物で、抗Id抗体を誘発すために用いることができる。このような免疫されたマウス由来の脾臓細胞を、抗Idモノクローナル抗体を分泌する抗Idハイブリドーマを産生するために用いる。さらに抗Id抗体を、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの担体に結合することができ、別のBALB/cマウスを免疫するために用いることができる。これらのマウス由来の血清は、CPAA、またはそれらの類似体、フラグメントおよび誘導体のエピトープに特異的な本来のモノクローナル抗体の結合特性を有する抗抗Id抗体を含む。したがって抗Id抗体は、それ自体のイディオタイプエピトープまたは評価するエピトープに構造的に類似する「イディオトープ」を有する。
本発明の抗CPAA抗体の構造類似体およびペプチドは、本明細書で示された教示とガイダンスに基づく既知の方法のステップにより提供される。
本発明はまた、膵臓もしくは結腸癌が判明したかまたは疑いのある患者におけるCPAAを検出する診断用の上記の抗CPAA抗体およびペプチドを提供する。本発明のもう1つの態様では、抗体は形態学的に正常な細胞で分子マーカーを検出して、無症候個体の早期発見スクリーニングを提供できる。
キットは、細胞活性に対する予防あるいは検出または選択した抗原の存在に関する対象抗体の使用に提供することもできる。したがって、本発明の抗体は通常、単独または所望の細胞型に特異的な別の抗体との組合せのいずれかで、容器入りの凍結乾燥形態で提供できる。標識または毒素に結合していてもよく、結合していなくてもよい抗体を、トリス、リン酸、炭酸などの緩衝液、安定剤、生物致死剤、血清アルブミンなどの不活性タンパク質等と共にキットに含む。一般にこれらの物質は、活性抗体量に対して5重量%未満存在し、そして通常抗体濃度に対して少なくとも約0.001重量%の合計量で存在する。しばしば活性成分を希釈するために不活性増量剤または賦形剤を含むことが望ましく、この場合賦形剤は組成物全体の約1%〜99重量%で存在することができる。第1抗体に結合できる第2抗体をアッセイで用いる場合、通常これは別々のバイアル中に存在する。一般的に第2抗体は標識と結合し、上記抗体の製剤形態と類似の様式で製剤化する。このキットは、一般に1組の使用説明書も含む。
本発明の抗CPAA抗体またはペプチドは、例えば癌および関連症状の治療に用いることができる。より詳細には、本発明はさらに、薬学的に許容し得る担体または希釈剤および、活性成分として、本発明の抗体またはペプチドを含む医薬組成物を提供する。免疫毒素の送達成分は、本発明によるヒト化抗体である。完全な免疫グロブリンまたはFabなどのこれらの結合フラグメントもまた想定される。典型的には、免疫毒素の抗体は、ヒト免疫グロブリンA、IgMまたはIgGアイソタイプであるが、所望により他の哺乳動物の定常領域を利用できる。本発明による組成物は、免疫毒素を含むこともできる。本発明のヒト化抗体、免疫毒素およびそれらの医薬組成物は、非経口的に、すなわち皮下、筋肉内または静脈内に投与するのに有用である。
本発明の他の態様では、癌ワクチンを提供する。「ワクチン」とは、生物の免疫系を刺激するために用いる作用剤を意味する。この点に関して、免疫応答は、予防を提供できるか、または疾患を有する生物において、例えば既存の状態を軽減することによるプラスの効果を提供することができる。詳細には、癌ワクチンは、既存の悪性疾患を治療的に処置することおよび/または既存の悪性疾患の進行または転移を妨げることを意味する。
ヒト腫瘍標本由来の膵臓および結腸直腸癌関連抗原(CPAA)の調製
免疫原性腫瘍関連抗原組織標本は、Hollinsheadら、56巻 Cancer 480頁(1985年)、米国特許第5,688,657号によって記載された方法に従って、プールした結腸直腸癌細胞膜から得た。この抗原物質を、膜分画がHL−A抗原を含まず、非免疫原性糖タンパク質分画の多くから分離される程度にまで精製した。
免疫およびハイブリドーマの調製
ヒト結腸直腸および膵臓癌関連抗原(CPAA)に対するモノクローナル抗体は、マウス骨髄腫細胞Sp2/0−Ag14と上記のCPAAで免疫したBALB/cマウス由来の脾臓細胞との融合で得られたハイブリッドの産生とクローニングにより得た。ハイブリッドクローンが確立され、ELISAアッセイで、CPAAならびに2つの結腸癌細胞株(SW480およびSW620)と強く反応した。
Hollinshead in clinical trials(Hollinsheadら、1985年)に記載のように、完全フロインドアジュバントで乳化した上記のCPAAの50μgを腹腔内注射してBALB/cマウスを免疫した。10日後、マウスに生理食塩水中で同量のCPAAの静脈へのブースター注射を行った。マウスを3日後に屠殺し、単一脾細胞懸濁液を調製した。細胞融合は、40%のポリエチレングリコール(MW=1500)中で、5e7のマウス脾臓細胞を、10e7のsP2/0−Ag14骨髄腫細胞とインキュベートすることにより実施した。
Tsangら、77巻 JNCI 1175頁(1986年)により記載された酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)を、CPAAに特異的な抗体を産生するハイブリドーマクローンの検出に用いた。CPAA(100ng/ウェル)を、ポリスチレンマイクロプレート上に固定した。テストする上清に存在する抗体を、固定化抗原に1時間結合させた。結合したマウスmAbsの存在を、マウス免疫グロブリンに特異的なペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて検出した。ウェルを洗浄し、次いでペルオキシダーゼの色原体基質、O−フェニルジアミンを添加した。0.500単位より大きいかまたは等しい吸光度を生ずる呈色反応を示すウェルを、陽性と記録した。陰性対照は、0.01〜0.09吸光度単位の値を与えた。ELISAにより陽性判定されるハイブリドーマのウェルを、増殖のために選択し、限界希釈クローニング法により細胞クローニング手順を繰り返した。mAb産生陽性のハイブリドーマ細胞の選択は、ELISAにより判定した。陽性モノクローナル細胞を培養で増殖させ、細胞のアリコートを長期貯蔵のために液体窒素で凍結した。
NPC−1モノクローナル抗体のアイソタイプ
マウス免疫グロブリンは、重鎖(55kD)および軽鎖(25〜29kD)をコードする別々の遺伝子から発現する。再構成してマウスの免疫グロブリンのレパートリーを生成できる、IgGサブクラスの4つの重鎖(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)および2つの軽鎖(カッパ、ラムダ)が存在する。
DNA配列およびNPC−1抗体のユニーク性
mAbの直鎖アミノ酸配列は、本出願人の知るすべての配列と比較して、特有であるとしてNPC−1を同定した。最初にポリペプチド分子をコードするDNAの直鎖状配列を決定することで、直鎖アミノ酸配列を決定した。NPC−1mAbをコードするDNA配列を決定し、オープンリーディングフレームを、ユニバーサル哺乳類コドン使用頻度表を用いてアミノ酸配列に翻訳し、これによってNPC−1分子の直鎖配列のアイデンティティを示した。
製造業者の指示に従い市販のRNeasy−Midiキット(カタログ番号74104、Qiagen)を用いて、NPC−1を産生しているハイブリドーマ細胞からRNAを分離した。400万のハイブリドーマ細胞を、円錐チューブ中で遠心分離し、細胞を溶解して、核およびRNAを含む細胞基質の核酸を遊離した。次いで、RNAをRNeasyスピンカラムを用いて、溶解物から精製した。次にRNAを水で溶出し、分光光度計を用いて260nmおよび280nmの吸光度により、収量および純度を分析した。RNAは−80℃で保存した。
デオキシヌクレオチド三リン酸エステルdNTP混合液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、cDNA合成緩衝液、RNA分解酵素阻害剤、逆転写酵素、およびNPC−1アイソタイプのH(IgG1)およびL(カッパ)鎖に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、最初にRNA(2μg)をcDNAに逆転写した。試薬は、5’/3’ RACE Kit(カタログ番号03−353、Roche Applied Sciences)で提供された。反応を、55℃で60分間進行した後、85℃で5分進行した。次いでcDNAを、スピンカラム(カタログ番号1−732−668、Roche Applied Sciences)で精製し、37℃で30分間、dATPおよびターミナルトランスフェラーゼを用いてポリアデニル化した。ポリアデニル化試薬は、5’/3’RACE kit(Roche Applied Sciences)で提供された。最後に、目標のDNA(マウスIgG1 重鎖およびカッパ軽鎖)を、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって、以下の反応で定めるように増幅した、すなわち、ポリAテールのcDNA鋳型、オリゴdTアンカープライマー、dNTP混合液、反応緩衝液、Expand High Fidelity Polymerase酵素、およびIgG 重鎖またはカッパ軽鎖のいずれにも特異的なオリゴヌクレオチドで配列決定のために増幅した。PCR用の試薬は、市販品(カタログ番号1−732−641、Roche Applied Sciences)として入手した。混合液を、94℃2分間、次いで94℃、15秒間、55℃、30秒間、72℃、40秒間を10サイクル、続いて94℃、15秒間、55℃、30秒間、72℃、60秒間を25サイクルに付した。これに続いて反応液を、72℃で7分間インキュベートした後、4℃に冷却した。次いで、増幅した重鎖および軽鎖のDNAフラグメントを、1%アガロースゲルで精製した。目標のDNAバンドをゲルから切り出した後、QIAquickゲル抽出キット(カタログ番号28704、Qiagen)を用いて、アガロースから精製した。
増幅した目標のDNAを、ジデオキシヌクレオチド取り込み方法を用いる配列決定反応に付した。IgG1 重鎖およびカッパ軽鎖の全配列を、前述したプライマーおよびApplied Biosystems(BigDye Terminator V1.1 Cycle Sequencing kit,Part 4346776)の試薬を用いて決定した。自動化した配列決定分析は、ABI−377およびABI−310 DNA配列決定装置を用いて実施した。DNA配列は3つの読み枠およびストップコドンのない読み枠に翻訳され、他のマウスの重鎖および軽鎖に相同的に整列配置した配列は、本当の読み枠であると決定された。軽鎖に対するcDNA配列を、図2(配列番号1)に示し、対応するアミノ酸配列を図3(配列番号3)に示す。重鎖のcDNA配列を、図4(配列番号4)に示し、対応するアミノ酸配列を、図5(配列番号6)に示す。軽鎖の可変、定常、およびCDR領域を図6に示し、重鎖の可変、定常、およびCDR領域を図7に示す。
NPC−1の特異的細胞結合
ハイブリドーマにより産生されたNPC−1mAbは、プロテインL−アガロースマトリックスを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したNPC−1は、下記の表1の同定された種々の腫瘍細胞を用いて、当分野では周知の間接免疫蛍光法によって特徴づけた。すべての腫瘍細胞株はATCCから得た。細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)中に希釈した精製NPC−1と共に、4℃で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フルオレセイン標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。次いで細胞をPBSで3回洗浄し、Becton−Dickinson FACScaliburおよびCellQuest解析ソフトウェアを用いてフローサイトメトリーで検査した。結果を表1(FACSデータ)に記載する。データは、NPC−1の結腸直腸および膵臓腫瘍細胞株に対する特異的結合を示すが、卵巣または乳癌細胞株に対しては特異的結合を示さない。
抗腫瘍性細胞毒性を示すNPC−1のADCC活性
免疫原性腫瘍抗原に特異的な治療上有用なモノクローナル抗体は、1つまたは複数の以下の特性を有し得る。すなわち、(a)高い腫瘍組織特異性、(b)正常ヒト組織に対する交差反応性の欠如、および(c)腫瘍の破壊に関連する生物活性、例えば抗体依存性細胞毒性(ADCC)を有し得る。NPC−1のADCC活性を、標的細胞として結腸LS174Tおよび膵臓CFPAC−1癌系でテストした。卵巣細胞株OVCAR−3を特異性対照とした。ADCCは、エフェクター細胞として正常ヒトPBMCを用い、通常の4時間のインジウム−111遊離アッセイを用いてアッセイして、結果を表2(ADCCデータ)にパーセント同位元素放出(%細胞溶解)として示す。
NPC−1のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
マウス免疫グロブリンガンマ(IgG1)の天然の構成は、それぞれ重鎖および軽鎖の2つのポリペプチドを有する4つのポリペプチドを含んでいる。1つの重鎖(55キロダルトン)は、1つの軽鎖(25〜29キロダルトン)と結合し、この二量体は、ジスルフィド結合を介して同一の二量体に結合して機能的な四量体巨大分子を完成する。IgG分子は、その成分の重鎖および軽鎖に解離でき、変性剤(SDS、ドデシル硫酸ナトリウム)および2つのヘテロ二量体を結合するジスルフィド架橋を還元する試薬(DTT、ジチオスレイトール)の存在下で、ポリアクリルアミドゲルマトリックス上でサイズにより分離できる。ゲル電気泳動は、抗体などのタンパク様物質の分子量の決定に用いる一般的な分析法である。
キメラ化NPC−1(NPC−1Chi)抗体を用いる前臨床的抗腫瘍効力研究デザイン
4〜6カ月齢の胸腺欠損ヌードマウスを、この研究で用いる。LS174T結腸直腸腫瘍細胞およびAsPC−1ヒト膵臓腫瘍細胞を、腫瘍モデルとして用いる。マウスの側腹皮下に2e6個の腫瘍細胞を移植することにより、腫瘍を樹立する。固形腫瘍は10〜14日で約200mm3に増殖し、この時点でマウスを再度ケージ分けし、10(n=10)の試験群に無作為に分ける。マウスの腹腔内に、NPC−1Chiおよびヒトエフェクター細胞(PBMC)を、合計3サイクルの注射のために3日毎に注射する。マウスの全身の健康状態を毎日観察し、腫瘍を週2回、約28〜40日間、デジタルカリパスで測定する。2000mm3を超える腫瘍体積を有する対照マウスを、ローカルIACUCガイドラインに従ってCO2吸入または頚椎脱臼により犠牲にする。腫瘍増殖をプロットし、統計分析をANOVAを用いて実施する。
キメラ化NPC−1Chi(NPC−1Chi)抗体を用いる前臨床薬理学毒性試験デザイン
2つのマウス系統を、この試験に用いる。第1のものは、腫瘍を有する動物における薬物代謝−薬物動態(DMPK)を調べるための、および腫瘍部位で抗体の局在化を調べるための、皮下AsPC−1膵臓腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスである。第2のモデルは、免疫能力のある動物におけるDMPK反応を調べるための、腫瘍を持たない正常マウスである。4〜6カ月齢マウスが本試験で使われる。マウス側腹皮下に2e6個の腫瘍細胞を移植することにより、AsPC−1膵臓腫瘍が樹立される。固形腫瘍は、10〜14日で約200mm3に増殖し、この時点でマウスを再度ケージ分けし、8(n=4/群/時点)の試験群に無作為に分ける。研究の1日目に、血液および血清の治療前の分析のためにマウスから採血する。研究の1日目に、すべてのマウスに、NPC−1Chiまたは対照IgGを腹腔内注射する。さらに腫瘍を有するヌードマウスの腹腔内に、ヒトエフェクター細胞または生理食塩水を注射する。研究の4日目(注射後72時間)に、群当たり4匹のマウスをDMPK分析のために犠牲にする。研究の日11目に、残存する群当たり4匹のマウスをDMPK分析のために犠牲にする。DMPK分析は、血液試験(全血球計算/分画)、血清分析(AST、ALT、BILI、CPK、CK、CREAT、CBAリンホカインビーズ分析)、組織的分析(肝臓、脾臓、膵臓、肺、腎臓のH&E染色)、およびNPC−1の局在および定量の免疫組織化学的分析を含む。数値は、t検定により群間で統計的に分析する。
NPC−1の第1相試験
mAb NPC−1のキメラバージョンを用いるこの試験で、4回週投与量の周期で与える3つの投与量レベル(1週間に10mg/M2、25mg/M2および50mg/M2)を検討する。すべての有意な腸管毒性を記録する。すべての患者で、便中の潜血をモニターする。結腸スコープを用いてすべての出血を調べ、患者の大腸粘膜のランダムなバイオプシーにより、特異的な異常を判定し得る。
マウスNPC−1抗体(NPC−1C)のキメラ化
癌患者を治療する治療薬としてモノクローナル抗体が用いられる場合、マウスの抗体を再設計して、ヒトにおける抗体の免疫原性を減少させることは、多くの場合有益である。すなわち、ヒトに対する100%マウス抗体の投与により、抗体の治療的価値を著しく減少させ、毒性を誘発する可能性のあるヒト抗マウス抗体反応(HAMA)が誘発されることが示された。ヒトでの使用を意図する免疫原性のより少ない抗体は、上記のように大部分のマウス免疫グロブリン配列を、ヒト免疫グロブリン配列で置換することにより作製され得る。このような置換により、ヒトでの使用を意図する治療薬の免疫原性および毒性が激減する。キメラ化は、マウス抗体の免疫原性を減少させる1つの方法であり、抗原認識特異性の維持に関して、最も保存的なアプローチである。キメラ化の過程では、マウス免疫グロブリン配列の約66%が、ヒト免疫グロブリンフレームワーク配列で置換される。意図する使用および結果として得られる抗体の作用機序に応じて、既知の特異的活性を有するヒト免疫グロブリンアイソタイプ(IgG1、IgG2など)を選択することができる。さらに、マウスのCDRループをヒト免疫グロブリンフレームワーク中のフレームワークに単に移植する、さほど保存的でないステップを実施することができる。このプロセスは、「CDR移植」または「ヒト化」として知られている。このプロセスは、90%〜95%のヒトタンパク質が存在する抗体をもたらす。あるいは、ラムダファージディスプレイまたは変更された抗原結合特異性を生じるヒト抗体のCDRループ中の特異的なアミノ酸の置換などの、さほど保存的でない方法でも、マウス抗体を「完全ヒト化」できる。
NPC−1Cの発現と精製
キメラ化抗体NPC−1Cを、pBF−dhfrと呼ばれる哺乳類の発現プラスミドDNAにクローニングした。得られたDNAを、NPC−1C−pBF−dhfrと名づけた。抗体を産生する安定なCHO細胞株を開発するために13−0(対抗する配向)および9T(縦列配向)の2つのクローンを選択した。プラスミドを、LB−アンピシリン(1リットル)中で増殖し、CsCl超遠心分離(2×)により精製して、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いてCHO−DG44細胞にトランスフェクトした。安定にNPC−1Cを発現するCHO細胞株を、メトトレキセート濃度を増加させる増殖法によって開発した。高レベルの機能的な抗体を発現するクローンを選択して増殖した。
NPC−1Cの腫瘍細胞結合特性
293Tの細胞の一過性トランスフェクションにより産生されるキメラNPC−1C mAbを、プロテインA−セファロースマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したNPC−1Cは、下記の表3に列挙した種々の腫瘍細胞を用いて、間接免疫蛍光法によって特性決定した。すべての腫瘍細胞株は、ATCCから得た。細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)に希釈した精製NPC−1Cと共に、4℃で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フルオレセイン標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。次いで細胞をPBSで洗浄し、Becton−Dickinson FACScaliburおよびCellQuest分析ソフトウェア用いて、フローサイトメトリーで調べた。結果を表3に記載する(FACSデータ)。データは、扁平上皮または前立腺腫瘍細胞株に対してではなく、一部の結腸直腸および膵臓腫瘍細胞株に対するNPC−1Cの選択的な結合を示す。表3のデータは、一般的にこのアッセイ形式でテストされる濃度より約16倍低い抗体濃度で作製されたことに留意されたい。したがって、最適化した抗体濃度を用いる典型的な細胞結合試験では、抗体の実際の細胞結合能力を過小評価している可能性があるNPC−1C抗体の最適用量以下の量を用いて、陽性に染色した細胞のパーセントおよび染色の強度(平均蛍光強度、mfi)をここでは報告する。
抗腫瘍細胞毒性を示すNPC−1CのADCC活性
免疫原性腫瘍抗原に対しての特異的な治療的に有用なmAbは、1つまたは複数の次の特性を有していなければならない。すなわち、(a)高い腫瘍組織特異性、(b)正常ヒト組織に対する交差反応がないこと、および(c)腫瘍の破壊に関与する生物活性、例えば抗体依存性細胞毒性(ADCC)を有していなければならない。NPC−1CのADCC活性を、標的細胞として結腸および膵癌系で試験した。黒色腫および前立腺腫瘍細胞株を、特異性対照として含めた。ADCCを、エフェクター細胞として活性化した正常ヒトPBMCを用いて、通常の4時間111インジウム放出アッセイを用いてアッセイし、結果をパーセント特異的同位元素放出(%細胞溶解)として表4(ADCCデータ)に示す。データは、NPC−1C抗体により特異的に媒介された結腸直腸および膵臓腫瘍細胞株の活発なin vitroでの殺傷を示している。対照的に、細胞毒性はアッセイで試験した黒色腫または前立腺腫瘍系統の対照に対しては測定されず、特異的なNPC−1C依存性の認識および結腸直腸および膵臓腫瘍細胞の殺傷を示した。表4のデータは、一般的にこのアッセイ形式で試験される濃度よりも、約16倍低い抗体濃度で作製されたことに留意されたい。最適用量以下のNPC−1Cの濃度を用いて、活発でかつ特異的な細胞毒性が観察されたが、これらのデータは、最適化された抗体濃度を用いる典型的なADCC実験における抗体の実際の細胞毒性の能力を過小評価している可能性がある。
特異的癌細胞結合を示すNPC−1Cによるヒト組織の免疫組織化学的染色
癌の診断およびモニターする抗体としての有用性を実証するために、NPC−1C抗体を、多数のヒト組織を特異的に染色する能力に関して試験した。これらの組織は、凍結およびパラフィンブロックの両方で、多数のサンプルを含むマイクロアレイのコレクションおよび個々のバイオプシー組織切片の両方で試験した。免疫組織化学的染色により、有用な研究または商品として抗体の適応性を明らかにすることができる。
Claims (15)
- 抗体の軽鎖が、
(a)配列番号1の核酸配列によってコードされるか、
(b)配列番号2の核酸配列によってコードされるか、
(c)配列番号3のアミノ酸配列を含むか、あるいは
(d)配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされ、
ならびに、抗体の重鎖が、
(e)配列番号4の核酸配列によってコードされるか、
(f)配列番号5の核酸配列によってコードされるか、
(g)配列番号6のアミノ酸配列を含むか、あるいは
(h)配列番号6のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされ、
ここで、軽鎖構成成分は、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR2、および/または配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR3を含み、
重鎖構成成分は、配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2、および/または配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - キメラ抗体である、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- それぞれヒト免疫グロブリンガンマ-1およびカッパ定常領域に結合した、請求項1または2に記載の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記フラグメントが、Fab、Fab’、F(ab’)2、またはFvである、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 細胞毒性剤に結合体化される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 標識に結合体化される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 標識が、蛍光物質、蛍光放出金属、生物発光物質、化学発光物質、または放射能標識である、請求項6に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 2つの軽鎖成分および2つの重鎖成分を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖または重鎖をコードする単離されたヌクレオチドであって、
該抗体の軽鎖をコードするヌクレオチドが、配列番号1の核酸配列、配列番号2の核酸配列、または配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
該抗体の重鎖をコードするヌクレオチドが、配列番号4の核酸配列、配列番号5の核酸配列、または配列番号6のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、ヌクレオチド。 - 請求項8に記載のヌクレオチドを含む、単離された発現ベクター。
- 請求項9に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 結腸直腸癌または膵癌関連症状の治療のための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を含む医薬組成物。
- 結腸直腸癌または膵癌を検出する方法であって、
(a)人体から採取された試験サンプルと、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させる工程、および
(b)該抗体またはその抗原結合フラグメントによって特異的に結合されるヒト結腸直腸癌または膵癌関連タンパク質抗原の発現をアッセイする工程を包含し、
該ヒト結腸直腸癌または膵癌関連タンパク質抗原の存在が、該結腸直腸癌または膵癌を示す、方法。 - 前記サンプルが、組織バイオプシー、血液、血清、大便サンプル、または浣腸または経口下剤溶液に続いて結腸直腸経路から集めた液体である、請求項12記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、結腸直腸癌または膵癌関連症状の診断のためのキット。
- 結腸直腸癌細胞および膵臓癌細胞に特異的にADCC活性を示す、請求項1記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
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