CN117794568A - 抗gpa33多特异性抗体和其用途 - Google Patents

抗gpa33多特异性抗体和其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN117794568A
CN117794568A CN202180090807.7A CN202180090807A CN117794568A CN 117794568 A CN117794568 A CN 117794568A CN 202180090807 A CN202180090807 A CN 202180090807A CN 117794568 A CN117794568 A CN 117794568A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
immunoglobulin
antigen
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180090807.7A
Other languages
English (en)
Inventor
B·H·桑迪奇
M·王
N-K·V·张
S·拉森
S·切尔
D·维奇
M·艾哈迈德
H·徐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Memorial Sloan Kettering Cancer Center filed Critical Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Publication of CN117794568A publication Critical patent/CN117794568A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本公开总体上涉及可以与GPA33蛋白结合的免疫球蛋白相关组合物(例如，多特异性抗体或其抗原结合片段)。本发明技术的多特异性抗体在用于检测和治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症的方法中是有用的。

Description

抗GPA33多特异性抗体和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年11月18日提交的美国临时专利申请第63/115,326号的权益和优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明技术总体上涉及与GPA33蛋白特异性地结合的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)的制备和所述免疫球蛋白相关组合物的用途。具体地，本发明技术涉及与多特异性抗体结合的GPA33的制备和其在检测和治疗癌症中的用途。
政府支持声明
本发明是在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的授权号CA008748下由政府支持进行的。政府享有本发明中的某些权利。
背景技术
以下对本发明技术背景的描述仅帮助理解本发明技术而提供，并且不承认描述或构成本发明技术的现有技术。
GPA33是在超过95％的结直肠癌(CRC)中大量表达，在正常组织(结肠和肠上皮)中表达水平较低的跨膜糖蛋白。两种人源化IgG1抗体，huA33(路德维希癌症研究所(LudwigCancer Institute))(美国专利第6,342,587号)和KRN330(日本协和发酵麒麟制药公司(Kyowa Hakko Kirin Pharma,Inc.,Japan))，以及一种GPA33×CD3双特异性双亲和力再靶向(DART)抗体，MGD007(马里兰州罗克维尔市的宏观基因公司(Macrogenics Inc,Rockville,MD))(美国专利第9,932,400号)已经在人体中进行了测试(Bendell,J.C.等人,《新药临床试验(Invest New Drugs)》32(4):682-690(2014)；Infante,J.R.等人,《欧洲癌症杂志(Eur J Cancer.)》49(6):1169-1175(2013))。IgG1的毒性很小，但主要在稳定的疾病中观察到肿瘤应答，很可能是因为适度的ADCC和CMC活性。HuA33还作为直接放射性标记的抗体(Herbertson,R.A.等人,《核医学杂志(J Nucl Med)》55(4):534-539(2014))和在多步靶向(MST)(Cheal,S.M.等人,《欧洲核医学和分子成像杂志(Eur J Nucl Med MolImaging)》43(5):925-937(2016))[14]中被广泛研究。使用177Lu的MST显示了最大的前景，在临床前模型中实现了CRC的永久治愈，而没有引起临床或组织学毒性。然而，huA33是免疫原性的(Ritter,G.等人,《癌症研究(Cancer Res)》61(18):6851-9(2001))。
因此，迫切需要有效治疗GPA33相关恶性肿瘤的新型免疫球蛋白相关组合物。
发明内容
一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中：(a)所述VH包括SEQ ID NO:1-3中的任一个的氨基酸序列；和/或(b)所述VL包括SEQ ID NO:4-10中的任一个的氨基酸序列。所述抗体可以进一步包括选自由以下组成的组的同种型的Fc结构域：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE。在一些实施例中，所述抗体包括IgG1恒定区，所述IgG1恒定区包括一个或多个选自由N297A和K322A组成的组的氨基酸取代。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述抗体包括IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包括S228P突变。在某些实施例中，所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。在某些实施例中，所述抗体或抗原结合片段与包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列的GPA33多肽结合。在一些实施例中，所述表位是构象表位。
在本文所公开的双特异性抗体的任何和所有实施例中，所述双特异性抗体包括免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括两条相同的重链和两条相同的轻链，所述轻链是第一轻链和第二轻链，其中所述第一轻链通过肽连接子与第一单链可变片段(scFv)融合以产生第一轻链融合多肽，并且其中所述第二轻链通过肽连接子与第二scFv融合以产生第二轻链融合多肽，其中所述第一scFv与所述第一轻链的羧基端融合，并且其中所述第二scFv与所述第二轻链的羧基端融合。在一些实施例中，所述第一scFv和所述第二scFv相同，并且其中所述第一轻链融合多肽和所述第二轻链融合多肽相同。另外地或可替代地，在本发明技术的双特异性抗体的一些实施例中，所述免疫球蛋白与GPA33结合，并且所述第一scFv和所述第二scFv与CD3结合。
另一方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体包括：重链(HC)氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包括抗体，所述抗体包括：包含以下的重链(HC)氨基酸序列：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:79或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体；和/或包含以下的轻链(LC)氨基酸序列：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。在某些实施例中，所述抗体分别包括选自由以下组成的组的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:21(BC015(G3A H1L4))；SEQID NO:27和SEQ ID NO:25(BC016(G3A H3L3))；SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:59(BC369(G3AH1L4 huOKT3))；SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:61(BC373(G3A H1L4 huOT3 H2L2))；以及SEQID NO:64和SEQ ID NO:63(BC377(G3A H1L4 huOT3 H2L4))。
另一方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体分别包括选自由以下组成的组的第一HC氨基酸序列、第二HC氨基酸序列、第一LC氨基酸序列和第二LC氨基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66(HD152)；SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70(HD156)；SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:73和SEQID NO:74(HD160)；以及SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78(HD164)。
一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:4-10中的任一个至少95％或至少99％相同的VL序列；和/或(b)与SEQ IDNO:1-3中的任一个至少95％或至少99％相同的VH序列。
另一方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体包括与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:73或SEQ ID NO:77中存在的轻链序列至少95％或至少99％相同的轻链序列；和/或(b)与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:79中存在的重链序列至少95％或至少99％相同的重链序列。
在任何上述实施例中，所述抗体或抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。在本文所公开的双特异性抗体的任何和所有实施例中，所述双特异性抗体包括免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括两条相同的重链和两条相同的轻链，所述轻链是第一轻链和第二轻链，其中所述第一轻链通过肽连接子与第一单链可变片段(scFv)融合以产生第一轻链融合多肽，并且其中所述第二轻链通过肽连接子与第二scFv融合以产生第二轻链融合多肽，其中所述第一scFv与所述第一轻链的羧基端融合，并且其中所述第二scFv与所述第二轻链的羧基端融合。在一些实施例中，所述第一scFv和所述第二scFv相同，并且其中所述第一轻链融合多肽和所述第二轻链融合多肽相同。另外地或可替代地，在本发明技术的双特异性抗体的一些实施例中，所述免疫球蛋白与GPA33结合，并且所述第一scFv和所述第二scFv与CD3结合。
另外地或可替代地，在一些实施例中，所述抗体包括IgG1恒定区，所述IgG1恒定区包括一个或多个选自由N297A和K322A组成的组的氨基酸取代。在某些实施例中，本发明技术的抗体包括IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包括S228P突变。在任何上述实施例中，所述抗体与包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列的GPA33多肽结合。在一些实施例中，所述表位是构象表位。
一方面，本公开提供了一种多特异性抗体或抗原结合片段，所述多特异性抗体或抗原结合片段包括与选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19或29-58中的任一个的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，所述多特异性抗体或抗原结合片段包括选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19或29-58中的任一个的氨基酸序列。
一方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合片段，所述多特异性抗原结合片段包括第一多肽链，其中：所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的重链可变结构域；(ii)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(iii)所述第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；(iv)包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；(v)能够与第二表位特异性结合的第二免疫球蛋白的重链可变结构域；(vi)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(vii)所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域；(viii)包括氨基酸序列TPLGDTTHT的柔性肽连接子序列；以及(ix)自组装拆卸(SADA)多肽，其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
另一方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合片段，所述多特异性抗原结合片段包括第一多肽链，其中：所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；(ii)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(iii)所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域；(iv)包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；(v)能够与第二表位特异性结合的第二免疫球蛋白的重链可变结构域；(vi)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(vii)所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域；(viii)包括氨基酸序列TPLGDTTHT的柔性肽连接子序列；以及(ix)自组装拆卸(SADA)多肽；其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
在本文所公开的多特异性抗原结合片段的某些实施例中，所述SADA多肽包括四聚化、五聚化或六聚化结构域。在一些实施例中，所述SADA多肽包括p53、p63、p73、hnRNPC、SNA-23、Stefin B、KCNQ4和CBFA2T1中的任一个的四聚化结构域。另外地或可替代地，在一些实施例中，根据权利要求20至23中任一项所述的多特异性抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19或29-58的氨基酸序列。
一方面，本公开提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包括第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链彼此共价键合，所述第二多肽链和所述第三多肽链彼此共价键合，并且所述第三多肽链和所述第四多肽链彼此共价键合，并且其中：(a)所述第一多肽链和所述第四多肽链中的每一个在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；(ii)所述第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域；(iii)包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及(iv)与第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域连接的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域，或与第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域连接的所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域，其中所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域能够与第二表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；并且(b)所述第二多肽链和所述第三多肽链中的每一个在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与所述第一表位特异性结合的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域；以及(ii)所述第一免疫球蛋白的重链恒定结构域；并且其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-3，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:4-10。
在本文所描述的多特异性抗体或多特异性抗原结合片段的一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括催化抗体、免疫检查点抑制剂或免疫检查点激活剂。在本文所描述的多特异性抗体或多特异性抗原结合片段的任何和所有实施例中，所述抗体或抗原结合片段与以下结合：CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、CD32、CD64、TCRγ/δ、NKp46、KIR、PD-1、PD-L1、LAG3、CD28、B7H3、STEAP1、HER2、EGFR、CEA、CECAM5、转铁蛋白受体、FAP、NKG2D-配体、TRAIL、FasL、组织蛋白酶G、颗粒酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、DOTA(金属)络合物、苄基-DOTA(金属)络合物、变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、NOGADA-变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、星-DFO(金属)络合物、DFO(金属)络合物或小分子DOTA半抗原。小分子DOTA半抗原的实例包含：(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2；(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2；(ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2；(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2；(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2；(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；以及(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xx)BnDOTA；(xxi)DOTA；(xxii)BnDOTA-生物素；以及(xxiii)DOTA-生物素。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述多特异性抗体或多特异性抗原结合片段与T细胞、B细胞、髓系细胞、浆细胞或肥大细胞结合。
一方面，本公开提供了一种异二聚体多特异性抗体，所述异二聚体多特异性抗体包括第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链彼此共价键合，所述第二多肽链和所述第三多肽链彼此共价键合，并且所述第三多肽链和所述第四多肽链，并且其中：(a)所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-1)；(ii)所述第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域(CL-1)；(iii)包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及(iv)与第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域(VH-2)连接的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-2)，或与第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域(VL-2)连接的所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-2)，其中VL-2和VH-2能够与第二表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；(b)第二多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与所述第一表位特异性结合的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-1)；(ii)所述第一免疫球蛋白的第一CH1结构域(CH1-1)；以及(iii)所述第一免疫球蛋白的第一异二聚化结构域，其中所述第一异二聚化结构域不能与另一个第一异二聚化结构域一起形成稳定的同二聚体；(c)第三多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第三表位特异性结合的第三免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-3)；(ii)所述第三免疫球蛋白的第二CH1结构域(CH1-3)；以及(iii)所述第三免疫球蛋白的第二异二聚化结构域，其中所述第二异二聚化结构域包括不同于所述第一免疫球蛋白的所述第一异二聚化结构域的氨基酸序列或核酸序列，其中所述第二异二聚化结构域不能与另一个第二异二聚化结构域一起形成稳定的同二聚体，并且其中所述第三免疫球蛋白的所述第二异二聚化结构域被配置成与所述第一免疫球蛋白的所述第一异二聚化结构域一起形成异二聚体；(d)第四多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与所述第三表位特异性结合的所述第三免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-3)；(ii)所述第三免疫球蛋白的轻链恒定结构域(CL-3)；(iii)包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及(iv)与第四免疫球蛋白的互补重链可变结构域(VH-4)连接的所述第四免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-4)，或与第四免疫球蛋白的互补轻链可变结构域(VL-4)连接的所述第四免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-4)，其中VL-4和VH-4能够与第四表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；其中VL-1和/或VL-3包括选自SEQ IDNO:4-10中的任一个的VL氨基酸序列，并且其中VH-1和/或VH-3包括选自SEQ ID NO:1-3中的任一个的VH氨基酸序列。在一些实施例中，所述多特异性抗体与GPA33和以下中的至少一种结合：CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、CD32、CD64、TCRγ/δ、NKp46、KIR、PD-1、PD-L1、LAG3、CD28、B7H3、STEAP1、HER2、EGFR、CEA、CECAM5、转铁蛋白受体、FAP、NKG2D-配体、TRAIL、FasL、组织蛋白酶G、颗粒酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、DOTA(金属)络合物、苄基-DOTA(金属)络合物、变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、NOGADA-变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、星-DFO(金属)络合物、DFO(金属)络合物或小分子DOTA半抗原。小分子DOTA半抗原的实例包含：(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2；(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2；(ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2；(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2；(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2；(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；以及(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xx)BnDOTA；(xxi)DOTA；(xxii)BnDOTA-生物素；以及(xxiii)DOTA-生物素。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述多特异性抗体与T细胞、B细胞、髓系细胞、浆细胞或肥大细胞结合。在本文所描述的多特异性抗体或多特异性抗原结合片段的一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括催化抗体、免疫检查点抑制剂或免疫检查点激活剂。
在任何上述实施例中，本发明技术的抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
在本文所公开的任何含有多特异性抗体或抗原结合片段的SADA多肽中，当所述抗体或抗原结合片段静脉内或腹膜内施用于受试者时，所述抗体或抗原结合片段不会穿过肠上皮或肠腔。
一方面，本公开提供了一种重组核酸序列，所述重组核酸序列编码本文所描述的任何抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述重组核酸序列选自由以下组成的组：SEQID NO:12、14、16、18、20、22、24、26和28。
另一方面，本公开提供了一种宿主细胞或载体，所述宿主细胞或载体包括本文所公开的任何重组核酸序列。
一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括本发明技术的抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体，其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自由以下组成的组的药剂缀合：同位素、染料、发色团、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗体或抗原结合片段的任何和所有实施例。在一些实施例中，所述GPA33相关癌症是结直肠癌、T细胞白血病、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌或胃癌。所述GPA33相关癌症可以是具有MSI基因型或MSS基因型的结直肠癌。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述结直肠癌与KRAS G12D突变或p53突变相关。
另外地或可替代地，在所述方法的一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段与另外的治疗剂单独、依序或同时施用于所述受试者。另外的治疗剂的实例包含以下中的一种或多种：烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、细胞抑制生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、双膦酸盐治疗剂、T细胞或免疫调节/刺激抗体。
另一方面，本公开提供了一种用于在体内检测受试者的肿瘤的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段被配置成定位于表达GPA33的肿瘤并且用放射性同位素标记；以及(b)通过检测由所述抗体或抗原结合片段发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者的肿瘤的存在。在一些实施例中，所述受试者被诊断患有或疑似患有癌症。由所述抗体或抗原结合片段发射的放射性水平可以使用正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描检测。
另外地或可替代地，在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包括与放射性核素缀合的本发明技术的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述放射性核素是α颗粒发射同位素、β颗粒发射同位素、俄歇发射器(Auger-emitter)或其任何组合。β颗粒发射同位素的实例包含86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。在所述方法的一些实施例中，正常组织中的非特异性FcR依赖性结合被消除或减少(例如，通过Fc区中的N297A突变，其导致糖基化)。
本文还公开了用于检测和/或治疗GPA33相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种本发明技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所描述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能变体(例如，取代型变体)和使用说明书。在某些实施例中，所述免疫球蛋白相关组合物与一种或多种可检测标记偶联。在一个实施例中，所述一种或多种可检测标记包括放射性标记、荧光标记或显色标记。
另外地或可替代地，在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括次级抗体，所述次级抗体与本文所描述的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物特异性结合。在一些实施例中，所述次级抗体与至少一种选自由以下组成的组的可检测标记偶联：放射性标记、荧光标记或显色标记。
另一方面，本公开提供了一种用于选择受试者用于预靶向放射免疫疗法的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和与所述放射性标记的DOTA半抗原和GPA33抗原结合的本发明技术的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述复合物被配置成定位于表达由所述复合物的所述多特异性抗体或抗原结合片段识别的所述GPA33抗原的肿瘤；(b)检测由所述复合物发射的放射性水平；以及(c)当由所述复合物发射的所述放射性水平高于参考值时，选择所述受试者用于预靶向放射免疫疗法。
一方面，本公开提供了一种用于增加被诊断患有GPA33相关癌症的受试者的肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和识别所述放射性标记的DOTA半抗原和GPA33靶抗原并与其结合的本发明技术的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述复合物被配置成定位于表达由所述复合物的所述多特异性抗体或抗原结合片段识别的所述GPA33靶抗原的肿瘤。
另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和识别所述放射性标记的DOTA半抗原和GPA33靶抗原并与其结合的本发明技术的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述复合物被配置成定位于表达由所述复合物的所述多特异性抗体或抗原结合片段识别的所述GPA33靶抗原的肿瘤。
在本文所公开的方法的任何上述实施例中，所述复合物通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服、肿瘤内或鼻内施用。在本文所公开的方法的一些实施例中，所述受试者是人。另外地或可替代地，在本文所公开的方法的任何上述实施例中，所述放射性标记的DOTA半抗原包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu，并且任选地包括α颗粒发射同位素、β颗粒发射同位素或俄歇发射器。
一方面，本公开提供了一种用于增加被诊断患有GPA33相关癌症的受试者的肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗DOTA多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述抗DOTA多特异性抗体或抗原结合片段被配置成定位于表达GPA33靶抗原的肿瘤；以及(b)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置成与所述抗DOTA多特异性抗体或抗原结合片段结合。另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗DOTA多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述抗DOTA多特异性抗体或抗原结合片段被配置成定位于表达GPA33靶抗原的肿瘤；以及(b)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置成与所述抗DOTA多特异性抗体或抗原结合片段结合。在一些实施例中，本发明技术的方法进一步包括在施用所述放射性标记的DOTA半抗原之前，向所述受试者施用有效量的清除剂。
另外地或可替代地，在本文所公开的方法的任何上述实施例中，所述放射性标记的DOTA半抗原包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu，并且任选地包括α颗粒发射同位素、β颗粒发射同位素或俄歇发射器。在本文所公开的方法的任何上述实施例中，所述受试者是人。
一方面，本公开提供了一种离体武装T细胞，所述离体武装T细胞用有效量的本发明技术的抗GPA33多特异性抗体涂覆或与其复合，其中所述抗GPA33多特异性抗体包含CD3结合结构域。在一些实施例中，所述抗GPA33多特异性抗体是包括两条重链和两条轻链的免疫球蛋白，其中所述轻链中的每条轻链与单链可变片段(scFv)融合，并且其中所述抗GPA33多特异性抗体的至少一个scFv包括所述CD3结合结构域。本文还公开了一种用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的离体武装T细胞。
附图说明
图1示出了包括本文所描述的抗GPA33序列的两种双特异性抗体的设计。图1A示出了自组装自拆卸双特异性抗体(GPA33×DOTA SADA)的设计。图1B示出了IgG-[L]-scFv双特异性抗体(GPA33×DOTA IgG-[L]-scFv)的设计。
图2A-2D示出了纯化的TC170、TC171、TC213、BC015和BC016双特异性抗体的稳定性。图2A-2B表示了由正确大小的总蛋白质的相对分数(图2A)和抗体的浓度(图2B)指示的在重复的冷冻和解冻循环之后的克隆TC170和TC213的SEC-HPLC纯度。图2C-2D表示了由正确大小的总蛋白质的相对分数表示的克隆TC170、TC171、BC015和BC016在37℃下(图2C)或40℃(图2D)下的稳定性。
图3A示出了在25℃下通过表面等离子体共振(SPR)分析的BC155、BC015和BC016的结合动力学。图3B示出了在25℃下通过表面等离子共振(SPR)分析的TC159、TC160、TC170和TC171的结合动力学。
图4示出了TC170、TC171、TC213、TC234、TC235(图4A)；TC170、TC159、TC160(图4B)；以及BC015、BC016(图4C)通过FACS在抗体的系列浓度下与GPA33+肿瘤细胞系的结合。平均荧光强度(MFI)表示为几何平均值。
图5A-5D示出了使用体内小鼠模型的TC170和BC015的生物分布。将TC170(48小时之前，T＝-48小时)和BC015(24小时之前，T＝-24小时)静脉内施用于带有异种移植肿瘤(SW1222)的裸鼠。在BC015施用之后20小时，静脉内给予BC015处理的小鼠N-乙酰半乳糖胺树突清除剂(描述于Cheal,S.M.等人,《生物共轭化学(Bioconjug Chem)》31:501-506(2019)中)(4小时之前，T＝-4小时)。在T＝0时，在初始剂量的BC015和TC170的48小时之后，将[177Lu]DOTA(图5A)或[225Ac]变形杆菌属(描述于Cheal,S.M.等人,使用225Ac-变形杆菌属-DOTA对实体瘤进行α放射免疫疗法——治疗剂量下的安全性(Alpharadioimmunotherapy using 225Ac-proteus-DOTA for solid tumors–safety atcurative doses)《治疗诊断学(Theranostics)》,2020中)(图5B)有效载荷静脉内施用于小鼠。在24小时(T＝+24小时)之后，解剖小鼠并分离器官以测量每种放射性金属有效载荷的摄取。摄取值表示为每克组织注射剂量的标准化百分比。类似地，在带有异种移植肿瘤(SW1222)的裸鼠中比较了TC170的施用途径(图5C)。在T＝0时，在施用[225Ac]变形杆菌属有效载荷之前48小时(T＝-48小时)腹膜内或静脉内注射TC170。在24小时(T＝+24小时)之后，解剖小鼠并分离器官以测量每种放射性金属有效载荷的摄取。摄取值表示为每克组织注射剂量的标准化百分比。图5D中比较了腹膜内疾病的靶向，其中在用TC170或BC105治疗之后48小时，用1mCi的[177Lu]BnDOTA治疗带有腹膜内肿瘤(SW1222)的小鼠。在放射施用之前4小时，BC105处理的小鼠也用清除剂处理。条形图描绘了剂量施用之后24小时的活性。
图6A-6C示出了用TC170处理的小鼠或非人灵长类动物(NHP)的图像。图6A示出了静脉内施用(1)单独的[177Lu]DOTA(在T＝0时)，(2)BC015(在T＝-48小时时)、清除剂(在T＝-4小时)和[177Lu]DOTA(T＝0)，或(3)BC015(T＝-48)和[177Lu]DOTA(T＝0)的带有异种移植肿瘤(SW1222)的小鼠的SPECT图像。在注射[177Lu]DOTA(T＝24小时)之后24小时拍摄图像。图6B示出了带有腹膜内肿瘤并用TC170(T＝0)和[177Lu]BnDOTA(T＝48小时)处理的小鼠的SPECT图像。测量结果反映了SPECT成像的平均信号强度。图6C示出了注射有单独的[86Y]DOTA(A)、TC170和[86Y]DOTA(B，相隔24小时)或单独的GPA33 IgG-[L]-scFv和[86Y]DOTA(C，相隔24小时)的NHP的PET/CT图像。所有试剂通过静脉内施用。在施用[86Y]DOTA之后24小时获取图像。图像被归一化为相同的比例(SUV＝3)。摄取值(ID％)通过这些图像计算得出。
图6D示出了用1)仅BC015(N＝5)，2)仅TC170(N＝10)，3)BC015，清除剂和[225Ac]变形杆菌属有效载荷(N＝10)，或4)TC170和[225Ac]变形杆菌属有效载荷(N＝10)处理的带有异种移植肿瘤(SW1222)的小鼠的卡普兰-迈耶存活率曲线(Kaplan-Meier SurvivalCurve)。BC015在清除剂之前20小时和[225Ac]变形杆菌属有效载荷之前24小时腹膜内施用，而TC170在[225Ac]变形杆菌属有效载荷之前48小时腹膜内施用。进行卡普兰-迈耶存活率分析。
图7A示出了靶向T细胞上的肿瘤抗原GPA33和CD3的GPA33×CD3 SADA双特异性抗体的设计。
图7B示出了靶向T细胞上的肿瘤抗原GPA33和CD3的GPA33×CD3 IgG-[L]-scFv双特异性抗体的设计。
图8A示出了GPA33×HER2×CD3/DOTA SADA多特异性抗体的设计。
图8B示出了GPA33×HER2×CD3/DOTA IgG-[L]-scFv多特异性抗体的设计。
图9示出了本发明技术的抗GPA33抗体克隆的各种VH和VL配对在初始纯化之后、反复的冻融循环之后和在40℃下32天之后的产率和稳定性。
图10示出了如通过SPR分析确定的本发明技术的抗GPA33抗体克隆的各种VH和VL配对与GPA33蛋白的结合亲和力。
图11示出了如通过SPR分析确定的本发明技术的抗GPA33抗体克隆的各种VH和VL配对与GPA33+细胞系的结合亲和力。
图12示出了三个再人源化可变重免疫球蛋白结构域(VH)(SEQ ID NO:1-3)的氨基酸序列。VH-CDR1-3的氨基酸序列以下划线标出。
图13示出了七个再人源化可变轻免疫球蛋白结构域(VL)(SEQ ID NO:4-10)的氨基酸序列。VL-CDR1-3的氨基酸序列以下划线标出。
图14示出了GPA33×DOTASADA克隆TC170的氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出，并且GPA33抗原结合片段的VH-CDR1-3和VL-CDR1-3氨基酸序列以实线下划线标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53 SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图15示出了GPA33×DOTASADA克隆TC171的氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出，并且GPA33抗原结合片段的VH-CDR1-3和VL-CDR1-3氨基酸序列以实线下划线标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53 SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图16示出了GPA33×DOTA SADA克隆TC213的氨基酸和核酸序列(分别为SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出，并且GPA33抗原结合片段的VH-CDR1-3和VL-CDR1-3氨基酸序列以实线下划线标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53 SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图17示出了GPA33×DOTA SADA克隆TC234的氨基酸和核酸序列(分别为SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出，并且GPA33抗原结合片段的VH-CDR1-3和VL-CDR1-3氨基酸序列以实线下划线标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53 SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图18示出了GPA33×DOTASADA克隆TC235的氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出，并且GPA33抗原结合片段的VH-CDR1-3和VL-CDR1-3氨基酸序列以实线下划线标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53 SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图19示出了GPA33×DOTA IgG-[L]-scFv克隆BC015的轻链(LC)氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)。VL氨基酸序列以斜体标出，并且GPA33抗原结合片段的VL-CDR1-3氨基酸序列进一步以下划线标出。连接子的氨基酸序列以粗体标出。BC015在本文中可互换地称为BC177。
图20示出了GPA33×DOTAIgG-[L]-scFv克隆BC015的重链(HC)氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)。VH氨基酸序列以斜体标出，并且VH-CDR1-3氨基酸序列进一步以下划线标出。连接子的氨基酸序列以粗体标出。BC015在本文中可互换地称为BC177。
图21示出了GPA33×DOTA IgG-[L]-scFv克隆BC016的轻链(LC)氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26)。VL氨基酸序列以斜体标出，并且GPA33抗原结合片段的VL-CDR1-3氨基酸序列进一步以下划线标出。连接子的氨基酸序列以粗体标出。
图22示出了GPA33×DOTAIgG-[L]-scFv克隆BC016的重链(HC)氨基酸和核酸序列(分别为SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28)。VH氨基酸序列以斜体标出，并且VH-CDR1-3氨基酸序列进一步以下划线标出。连接子的氨基酸序列以粗体标出。
图23示出了GPA33×CD3 SADA克隆TC252-TC263的氨基酸序列(SEQ ID NO:29-40)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出，并且GPA33抗原结合片段的VH-CDR1-3和VL-CDR1-3氨基酸序列进一步以实线下划线标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53 SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图24示出了GPA33×HER2×DOTA SADA克隆TC264-TC267的氨基酸序列(SEQ IDNO:41-44)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图25示出了GPA33×HER2×CD3 SADA克隆TC268-TC279的氨基酸序列(SEQ IDNO:45-56)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图26示出了GPA33×CD276×DOTASADA克隆TC280的氨基酸序列(SEQ ID NO:57)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图27示出了GPA33×CD276×CD3 SADA克隆TC281的氨基酸序列(SEQ ID NO:58)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图28示出了GPA33×CD3 IgG-[L]-scFv克隆BC369(分别为SEQ ID NO:59-60)、BC373(分别为SEQ ID NO:61-62)以及BC377(分别为SEQ ID NO:63-64)的LC和HC氨基酸序列。VH和VL氨基酸序列以斜体标出。连接子的氨基酸序列以粗体标出。
图29示出了GPA33×HER2×DOTA IgG-L-scFv抗体HD152的第一LC、第二LC、第一HC和第二HC的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68)。
图30示出了GPA33×HER2×CD3 IgG-L-scFv抗体HD156的第一LC、第二LC、第一HC和第二HC的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72)。
图31示出了GPA33×HER2×CD3 IgG-L-scFv抗体HD160的第一LC、第二LC、第一HC和第二HC的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76)。
图32示出了GPA33×HER2×CD3 IgG-L-scFv抗体HD164的第一LC、第二LC、第一HC和第二HC的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80)。
图33示出了基于GPA33×DOTA IgG-[L]-scFv平台先前描述的克隆BC105的LC和HC氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出。连接子的氨基酸序列以粗体标出。
图34示出了基于GPA33×DOTA IgG-[L]-scFv平台先前描述的克隆BC155的LC和HC氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出。连接子的氨基酸序列以粗体标出。
图35示出了基于GPA33×DOTA SADA平台先前描述的克隆TC159的氨基酸序列(SEQID NO:104)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出，并且VH-CDR1-3和VL-CDR1-3氨基酸序列进一步以实线下划线标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图36示出了基于GPA33×DOTA SADA平台先前描述的克隆TC160的氨基酸序列(SEQID NO:105)。VH和VL氨基酸序列以斜体标出，并且VH-CDR1-3和VL-CDR1-3氨基酸序列进一步以实线下划线标出。连接子和间隔子的氨基酸序列以粗体标出。P53SADA多肽氨基酸序列以虚线下划线标出。
图37示出了克隆TC159、TC160、TC170和TC171在表达和纯化期间的抗体特性。
图38A示出了IgG-L-scFv双特异性抗体克隆BC105、BC155、BC015和BC016通过SPR与GPA33的结合亲和力。
图38B示出了SADA双特异性抗体克隆TC159、TC160、TC170、TC171、TC213、TC234和TC235通过SPR与GPA33的结合亲和力。
图39示出了SADA双特异性抗体克隆TC159、TC160、TC170、TC171、TC213、TC234和TC235与GPA33+细胞系的结合亲和力。
图40A-40B示出了225Ac-变形杆菌属DOTA PRIT与BC177、TC170和BC105在SW1222荷瘤雌性无胸腺裸鼠模型中的组织摄取(图40A)和抗肿瘤效果(图40B)。图40AC-40E示出了225Ac-变形杆菌属DOTA PRIT与BC177、TC170和BC105分别对白细胞(WBC)计数、血小板计数和红细胞(RBC)计数的影响。BC015在本文中可互换地称为BC177。
图41A-41B示出了用BC177+1mCi 177Lu-Bn-DOTA、TC170+1mCi 177Lu-Bn-DOTA或TC170+3mCi 177Lu-Bn-DOTA处理的SW1222荷瘤雌性无胸腺裸鼠的肿瘤消退和存活率。
图42A示出了来自分布研究1的225Ac-ABD(1μCi)在SW1222异种移植裸鼠中的生物分布。图42B示出了肿瘤与血液中225Ac ID/g％的比率。
图43A示出了来自分布研究2的177Lu-ABD(500μCi)在SW1222异种移植裸鼠中的生物分布。图43B示出了肿瘤与血液中177Lu ID/g％的比率。
图44示出了来自分布研究3的177Lu-ABD(1mCi)在无肿瘤裸鼠中的生物分布。
具体实施方式
应了解到，本发明的方法的某些方面、方式、实施例、变体和特征在以下以不同的详细水平进行了描述以便提供对本发明技术的实质上的理解。应理解，本公开不限于当然可以变化的特定用途、方法、试剂、化合物、组合物或生物系统。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。
本公开总体上提供了可以与GPA33多肽特异性结合的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)。本发明技术的免疫球蛋白相关组合物在用于检测或治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症的方法中是有用的。因此，本方法的各个方面涉及抗GPA33抗体的制备、表征和操作。本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可单独使用或与另外的治疗剂组合用于治疗癌症。在一些实施例中，免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在实践本发明的方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如Sambrook和Russell编辑(2001)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版；丛书Ausubel等人编辑(2007)《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》；丛书《酶学方法(Methods in Enzymology)》(纽约学术出版社公司(Academic Press,Inc.,N.Y.))；MacPherson等人(1991)《PCR 1：实用方法(PCR 1:A Practical Approach)》(牛津大学出版社的IRL出版社(IRL Press at Oxford University Press))；MacPherson等人(1995)《PCR 2：实用方法(PCR 2:A Practical Approach)》；Harlow和Lane编辑(1999)《抗体：实验室手册(Antibodies,ALaboratory Manual)》；Freshney(2005)《动物细胞培养：基础技术手册(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)》,第5版；Gait编辑(1984)《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》；美国专利第4,683,195号；Hames和Higgins编辑(1984)《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》；Anderson(1999)《核酸杂交》；Hames和Higgins编辑(1984)《转录和翻译(Transcription and Translation)》；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(IRL出版社(1986))；Perbal(1984)《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》；Miller和Calos编辑(1987)《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory))；Makrides编辑(2003)《基因转移和在哺乳动物细胞中的表达(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells)》；Mayer和Walker编辑(1987)《细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods inCell and Molecular Biology)》(伦敦学术出版社(Academic Press,London))；以及Herzenberg等人编辑(1996)《实验免疫学韦尔手册(Weir's Handbook of ExperimentalImmunology)》。用于检测和测量多肽基因表达产物水平(即，基因翻译水平)的方法在本领域是众所周知的，并且包含使用如抗体检测和定量技术等多肽检测方法。(还参见Strachan和Read,《人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)》,第二版(纽约约翰·威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.,NY),1999))。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。例如，提及“细胞”包含两种或更多种细胞的组合等等。通常，本文所使用的命名法以及下文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学以及核酸化学与杂交中的实验室程序是本领域中众所周知并且通常采用的那些。
如本文所使用的，提及数字的术语“约”是指通常包含在所述数字的任一方向上(大于或小于)在1％、5％或10％范围内的数字，除非另有说明或以其它方式从上下文中显而易见(除非此类数字小于可能值的0％或超过可能值的100％)。
如本文中所使用的，向受试者“施用”药剂或药物包含向受试者引入或递送化合物以发挥其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径来进行施用，包含但不限于口服、鼻内、胃肠外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、瘤内或局部施用。施用包含自我施用和由另一个人施用。
“佐剂”是指引起对免疫系统的刺激的一种或多种物质。在此上下文中，佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原或抗体的免疫应答。佐剂可以在疫苗施用之前、与疫苗组合或在疫苗施用之后施用于受试者。用作佐剂的化合物的实例包含铝化合物、油、嵌段聚合物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质(例如，维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、Quil A(皂甙)、细菌和真菌细胞壁组分(例如，脂多糖、脂蛋白和糖蛋白)、激素、细胞因子和共刺激因子。
如本文所使用的，术语“抗体”统称为免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包含例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在任何脊椎动物中，例如在如人、山羊、兔子和小鼠等哺乳动物以及非哺乳动物物种中的免疫应答期间产生的类似分子，如鲨鱼免疫球蛋白。如本文所使用的，“抗体”(包含完整的免疫球蛋白)和“抗原结合片段”与所关注的分子(或一组高度类似的所关注的分子)特异性结合，以基本上排除与其它分子的结合(例如，对所关注的分子的结合常数比对生物样品中的其它分子的结合常数大至少103M-1、大至少104M-1或大至少105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包含如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)等经基因工程化的形式。还参见《皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook)》,1994-1995(伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.))；Kuby,《免疫学杂志(J.,Immunology)》,第3版,纽约弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.,New York),1997。
更具体地，抗体是指包括特异性识别抗原的表位并与其结合的至少一个轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，所述重链和所述轻链中的每一个具有可变区，所述可变区被称为可变重(VH)区和可变轻(VL)区。VH区和VL区一起负责与由抗体识别的抗原结合。通常，免疫球蛋白具有由二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，λ(lambda)和κ(κ)。有五个决定抗体分子的功能活性的主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链和轻链含有恒定区和可变区(所述区也被称为“结构域”)。总而言之，重链可变区和轻链可变区与抗原特异性结合。轻链可变区和重链可变区含有被三个也被称为“互补决定区”或“CDR”的高变区中断的“框架”区。已经定义框架区和CDR的范围(参见Kabat等人,《免疫学关注的蛋白的序列(Sequences ofProteins ofImmunological Interest)》,美国卫生和人类服务部(U.S.Department ofHealth and Human Services),1991，所述文献通过引用并入本文)。Kabat数据库现在在线维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。因此，框架区用于形成支架，所述支架通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的朝向上。
CDR主要负责与抗原的表位结合。每个链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始按顺序编号，并且通常还由特定CDR所在的链鉴别。因此，VH CDR3位于发现其的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现其的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。与GPA33蛋白结合的抗体将具有特定的VH区和VL区序列，并且从而具有特定的CDR序列。具有不同特异性的抗体(即针对不同抗原具有不同组合位点)具有不同的CDR。尽管正是CDR因抗体的不同而有所不同，但是CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。如本文所使用的，“免疫球蛋白相关组合物”是指抗体(包含单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合。
如本文所使用的，术语“抗体相关多肽”是指包含单链抗体在内的抗原结合抗体片段，所述抗原结合抗体片段可以包括单独的或与以下多肽元件的全部或部分组合的可变区：抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。所述技术中还包含可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。可用于本发明方法的抗体相关分子，例如但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包括VL或VH结构域的片段。实例包含：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包括在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,《自然(Nature)》341:544-546,1989)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的实例包含：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；二体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所使用的“双特异性抗体”或“BsAb”是指可以同时与具有不同结构的两个靶标结合的抗体例如，两种不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位、或半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位。多种不同的双特异性抗体结构是本领域众所周知的。在一些实施例中，双特异性抗体中的每个抗原结合部分包含VH区和/或VL区；在一些此类实施例中，VH区和/或VL区是可见于特定单克隆抗体中的那些区。在一些实施例中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，每个抗原结合部分包含来自不同单克隆抗体的VH区和/或VL区。在一些实施例中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，其中两个抗原结合部分之一包含免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子具有含有来自第一单克隆抗体的CDR的VH区和/或VL区，并且其它抗原结合部分包含抗体片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab')2、Fd、Fv、dAB、scFv等)，所述抗体片段具有含有来自第二单克隆抗体的CDR的VH区和/或VL区。
如本文所使用的，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御机制，由此免疫系统的效应子细胞主动裂解如肿瘤细胞等靶细胞，所述靶细胞的膜表面抗原已由如抗GPA33抗体等抗体结合。
如本文所使用的，“抗原”是指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在或合成的化合物。在一些实施例中，靶抗原可以是多肽(例如，GPA33多肽)。还可以将抗原施用于动物以在动物中产生免疫应答。
术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白结构的片段，所述片段具有负责与抗原结合的多肽的一部分。可用于本发明技术的抗原结合片段的实例包含scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'和F(ab')2，但不限于此。使用本领域技术人员已知的常规技术获得任何上述抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性对片段进行筛选。
如本文所使用的，“结合亲和力”意指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或抗原肽)之间的总非共价相互作用的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域中已知的标准方法来测量，包含本文所描述的那些。低亲和力复合物含有通常倾向于容易从抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于保持与抗原结合更长时间的抗体。
如本文所使用的，术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料。生物样品可以包含从受试者分离的组织、细胞、细胞的蛋白质或膜提取物和生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。本发明技术的生物样品包含但不限于取自以下的样品：乳房组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头部或颈部、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑下垂体、肾组织、肌肉、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、毛发、口腔、皮肤、血清、血浆、CSF、精子、前列腺液、精液、尿液、粪便、汗液、唾液、痰液、粘液、骨髓、淋巴和泪液。生物样品还可以从内部器官的活检或癌症中获得。生物样品可以从受试者中获得用于诊断或研究，或者可以从非患病个体中获得，作为对照或用于基础研究。样品可以通过标准方法获得，包含例如静脉穿刺和外科手术活检。在某些实施例中，生物样品是通过穿刺活检获得的组织样品。
如本文所使用的，术语“CDR移植”意指通过来自具有期望抗原特异性的“供体”抗体的CDR“移植物”替代“受体”抗体的至少一个CDR。如本文所使用的，术语“CDR移植的抗体”意指其中“受体”抗体的至少一个CDR被来自具有期望抗原特异性的“供体”抗体的CDR“移植物”替代的抗体。
如本文所使用的，术语“嵌合抗体”意指其中来自一个物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如，小鼠Fc恒定区)使用重组DNA技术被来自另一个物种的抗体的Fc恒定区(例如，人Fc恒定区)替换的抗体。通常参见Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人美国专利第4,816,567号；Cabilly等人,欧洲专利申请0125,023；Better等人,《科学(Science)》240:1041-1043,1988；Liu等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》84:3439-3443,1987；Liu等人,《免疫学杂志》139:3521-3526,1987；Sun等人,《美国国家科学院院刊)》84:214-218,1987；Nishimura等人,《癌症研究》47:999-1005,1987；Wood等人,《自然》314:446-449,1885；以及Shaw等人,《美国国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)》80:1553-1559,1988。
如本文所使用的，“清除剂”是与受试者的血液室中存在的过量双特异性抗体结合以促进通过肾的快速清除的药剂。在半抗原施用(例如，DOTA)之前使用清除剂促进在预靶向放射免疫疗法(PRIT)系统中获得更好的肿瘤背景比。清除剂的实例包含500kD-葡聚糖-DOTA-Bn(Y)(Orcutt等人,《分子癌症疗法(Mol Cancer Ther.)》11(6):1365-1372(2012))、500kD氨基葡聚糖-DOTA缀合物、针对预靶向抗体的抗体等。
如本文所使用的，术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”通常是指在与表面抗原结合时触发经典补体通路，诱导膜攻击复合物的形成和靶细胞裂解的IgG和IgM抗体的效应子功能。本发明技术的抗体通过与GPA33结合诱导针对癌细胞的CDC。
如本文所使用的，术语“缀合”是指通过本领域技术人员已知的任何方法将两个分子缔合。合适的缔合类型包含化学键和物理键。化学键包含例如共价键和配位键。物理键包含例如氢键、偶极相互作用、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用以及芳香族堆积。
如本文所使用的，术语“共有FR”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区。抗体的FR区不接触抗原。
如本文所使用的，“对照”是出于比较目的在实验中使用的替代样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，当实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗功效的相关性时，通常采用阳性对照(表现出期望的治疗效果的已知化合物或组合物)和阴性对照(未接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所使用的，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括与同一条多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如以下中：例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人,《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993)。
如本文所使用的，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，使本文所描述的疾病或病状或与本文所述疾病或病状相关联的一种或多种体征或症状得到预防或减轻的量。在治疗或预防应用的上下文中，向受试者施用的组合物的量将根据组合物、疾病的程度、类型和严重性以及个体的特性，如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性而变化。熟练的技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。组合物还可以与一种或多种另外的治疗化合物组合施用。在本文所描述的方法中，可以向具有本文所描述的疾病或病状的一种或多种体征或症状的受试者施用治疗组合物。如本文所使用的，组合物的“治疗有效量”是指改善或消除疾病或病状的生理作用的组合物水平。可以通过一次或多次施用来给出治疗有效量。
如本文所使用的，术语“效应子细胞”意指涉及与免疫应答的认知和激活阶段相反的免疫应答的效应子阶段的免疫细胞。示例性免疫细胞包含骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞，包含溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。效应子细胞表达特定的Fc受体并且执行特定的免疫功能。效应子细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)例如，能够诱导ADCC的中性粒细胞。例如，表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞涉及特异性杀伤靶细胞并且将抗原呈递给免疫系统的其它组分或与呈递抗原的细胞结合。
如本文所使用的，术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特异性三维结构特性以及特异性电荷特性。构象表位与非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在的情况下，与前者而非后者的结合丧失。在一些实施例中，GPA33蛋白的“表位”是与本发明技术的抗GPA33抗体特异性结合的蛋白的区。在一些实施例中，所述表位是构象表位或非构象表位。为了筛选与表位结合的抗GPA33抗体，可以执行常规交叉阻断测定，如在《抗体：实验室手册》,冷泉港实验室,Ed Harlow和David Lane(1988)中所描述的。该测定可以用于确定抗GPA33抗体是否与本发明技术的抗GPA33抗体结合相同的位点或表位。可替代地或另外地，表位作图可以通过本领域已知的方法执行。例如，可以如通过丙氨酸扫描对抗体序列进行诱变，以鉴定接触残基。在不同的方法中，与GPA33蛋白的不同区相对应的肽可以用于与所述测试抗体或具有经表征或已知的表位的测试抗体和抗体的竞争测定中。
如本文所使用的，“表达”包含以下中的一者或多者：将基因转录成前体mRNA；对前体mRNA进行剪接和其它加工，以产生成熟的mRNA；mRNA稳定性；将成熟的mRNA翻译成蛋白质(包含密码子使用和tRNA可用性)；以及对翻译产物进行糖基化和/或其它修饰(如果正确表达和功能需要的话)。
如本文所使用的，术语“基因”意指含有关于RNA产物的调控的生物合成的所有信息的DNA区段，包含启动子、外显子、内含子以及控制表达的其它非翻译区。
如本文所使用的，术语“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较可以出于比较目的比对的每个序列中的位置来确定同源性。当比较序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，则分子在所述位置处是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配或同源位置的数量的函数。多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一个序列具有一定百分比(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着，当比对时，在两个序列的比较中，所述百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和百分比同源性或序列同一性。在一些实施例中，默认参数用于比对。一种比对程序是使用默认参数的BLAST。具体地，程序是使用以下默认参数的BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)找到。生物学等效的多核苷酸是那些具有指定百分比同源性并编码具有相同或类似生物活性的多肽的多核苷酸。如果两个序列彼此共享低于40％的同一性或低于25％的同一性，则所述两个序列被视为“不相关”或“非同源”。
如本文所使用的，非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中受体的高变区残基被来自如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等具有所期望的特异性、亲和力以及能力的非人物种(供体抗体)的高变区残基替代。在一些实施例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能，如结合亲和力。通常，人源化抗体将包括至少一个并且通常两个可变结构域(例如，Fab、Fab'、F(ab')2或Fv)中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有FR序列的那些区，尽管FR区可以包含一个或多个改善结合亲和力的氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。对于另外的细节，参见Jones等人,《自然》,321:522-525(1986)；Reichmann等人,《自然》,332:323-329(1988)；和Presta,《当代结构生物学评论(Curr.Op.Struct.Biol.)》2:593-596(1992)。参见例如Ahmed和Cheung,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》588(2):288-297(2014)。例如，针对给定抗原的鼠类抗体的人源化版本在其重链和轻链两者上具有：(1)人抗体的恒定区；(2)来自人抗体的可变结构域的框架区；以及(3)来自鼠类抗体的CDR。必要时，人框架区中的一个或多个残基可以被改变成鼠类抗体中的对应位置处的残基，以保持人源化抗体对抗原的结合亲和力。这种变化有时被称为“回复突变”。类似地，由于期望的原因，例如稳定性或对抗原的亲和力，可以使正向突变回复到鼠类序列。
如本文所使用的，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人,《免疫学关注的蛋白的序列》,第5版马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的公共卫生署(PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.)(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987))。
如本文所使用的，当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，术语“相同”或“同一性”百分比是指当在比较窗口或指定区之上针对最大对应性进行比较和比对时，如使用利用以下所描述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查(例如，NCBI网站)测量的，相同的或具有指定百分比的氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列或相同的核苷酸(即，在指定区(例如，编码本文所描述的抗体的核苷酸序列或本文所描述的抗体的氨基酸序列)之上的约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。此类序列然后被称为“基本上相同”。该术语还指或可以应用于测试序列的补体。所述术语还包含具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在一些实施例中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸或长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区内。
如本文所使用的，“免疫原”是指能够诱导体液和/或细胞介导的免疫应答而非免疫耐受性的任何抗原。
如本文所使用的，术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”意指具有通过二硫键互连的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体。每条重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的不同细胞(例如，效应子细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所使用的，术语“连接子”是指与两个或更多个多肽或核酸共价连接以使其相互连接的官能团(例如，化学物质或多肽)。如本文所使用的，“肽连接子”是指用于将两种蛋白质偶联在一起(例如，与VH和VL结构域偶联)的一个或多个氨基酸。在某些实施例中，连接子包括具有序列(GGGGS)n的氨基酸，其中n是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、12、14或15。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外。例如，单克隆抗体可以是源自单克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，并且不是产生抗体的方法。单克隆抗体组合物对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特性是从基本上同质的抗体群体中获得的，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的各种技术制备，包含例如但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如，根据本发明方法使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人,《自然》256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)制备。例如，单克隆抗体也可以使用在Clackson等人,《自然》352:624-628(1991)和Marks等人,《分子生物学杂志》222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离。
如本文所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”意指任何RNA或DNA，其可以是未经修饰或经修饰的RNA或DNA。多核苷酸包含但不限于单链和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链区和双链区的混合物的RNA、以及包括可以是单链或更典型地双链或单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子。另外，多核苷酸是指包括RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包含含有一个或多个经修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有为了稳定性或其它原因而修饰的主链的DNA或RNA。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”旨在包含与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物以及吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体和其调配物是本领域技术人员已知的并且在例如在以下文献中进行描述：《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(第20版,编辑：A.R.Gennaro,2000,宾夕法尼亚州费城利平科特威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.))。
如本文所使用的，术语“多克隆抗体”意指源自至少两(2)种不同产生抗体的细胞系的抗体的制备。该术语的使用包含至少两(2)种抗体的制备，所述抗体含有与抗原的不同表位或区特异性结合的抗体。
如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以便意指包括通过肽键或经修饰的肽键即肽等排体彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。多肽是指通常被称作肽、糖肽或寡聚物的短链和通常被称作蛋白质的较长链两者。多肽可以含有除20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。多肽包含通过如翻译后加工等天然过程或通过本领域中熟知的化学修饰技术进行修饰的氨基酸序列。此类修饰在基本文本和更详细的专著以及大量研究文献中都有详细描述。
如本文所使用的，“PRIT”或“预靶向放射免疫疗法”是指解决肿瘤靶向抗体的缓慢血液清除的多步骤过程，其导致对如骨髓等正常组织的不期望的毒性。在预靶向中，放射性核素或其它诊断或治疗剂与小半抗原连接。首先施用具有半抗原以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性抗体。然后允许未结合的抗体从循环中清除并且随后施用半抗原。
如本文所使用的，当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者细胞源自如此修饰的材料。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或表达以其它方式异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
如本文所使用的，术语“单独的”治疗使用是指通过不同途径同时施用或者基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所使用的，术语“顺序”治疗使用是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地，顺序使用是指在另一种或其它有效成分开始施用之前，完全施用一种活性成分。因此，在施用一种或多种其它活性成分前几分钟、几小时或几天，可以施用一种活性成分。在此情况下不存在同时治疗。
如本文所使用的，术语“同时”治疗使用是指以相同的途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所使用的，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可以包括具有许多单个分子的聚合物，例如，二聚体、三聚体或其它聚合物。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成连接子来连接，在所述单个蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988)《科学》242:423-426和Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊》85:5879-5883。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促或化学裂解来制备。
如本文所使用的，“特异性结合”是指识别另一分子(例如，抗原)并与其结合，但是基本上不识别其它分子并不与其结合的分子(例如，抗体或其抗原结合片段)。如本文所使用的，术语“特异性结合”特定分子(例如，多肽或多肽上的表位)、“与”特定分子“特异性结合”或“对”特定分子“具有特异性”可以例如通过这样的分子来表现，所述分子对与其结合的所述特定分子的KD为约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。术语“特异性结合”也可以指分子(例如，抗体或其抗原结合片段)与特定多肽(例如，GPA33多肽)或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的结合。
如本文所使用的，“序列倾向”是指核酸或氨基酸序列中可能影响本公开的免疫球蛋白相关组合物的异质性的任何特征。此类序列倾向包含但不限于易于脱酰胺、异构化、切割、氧化和糖基化的任何序列基序。
如本文所使用的，术语“受试者”、“患者”、或“个体”可以是单个生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施例中，受试者、患者或个体是人。
如本文所使用的，术语“治疗剂”旨在意指当以有效量存在时对有需要的受试者产生期望治疗效果的化合物。
如本文所使用的，“治疗(treating或treatment)”涵盖对如人等受试者的本文所描述的疾病或病症的治疗并且包含：(i)抑制疾病或病症，即，阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，导致病症消退；(iii)减缓病症的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。在一些实施例中，治疗意指与疾病相关的症状例如减轻、减少、治愈或处于缓解状态。
还应了解，本文所描述的各种治疗病症的模式旨在表示“基本的”，其包含完全的治疗但也包含次于其的治疗，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。治疗可以是对慢性疾病的连续长期治疗或用于治疗急性病状的单次或几次施用。
设想了本文所描述的抗GPA33抗体的氨基酸序列修饰。可以引入此类修饰以改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学性质，例如，使经编码的氨基酸去糖基化，或破坏抗体与C1q、Fc受体结合的能力或激活补体系统。抗GPA33抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸改变引入抗体核酸中，通过肽合成或通过化学修饰来制备。此类修饰包含例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。只要获得的抗体具有期望的性质，缺失、插入和取代的任何组合都可以获得所关注的抗体。修饰还包含蛋白质的糖基化模式的改变。用于取代诱变的最受关注的位点包含高变区，但是还设想了FR改变。
保守氨基酸取代是将给定氨基酸改变为具有类似生物化学性质(例如，电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸的氨基酸取代。“保守取代”在下表中示出。
一种类型的取代型变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。产生此类取代型变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。具体地，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在各位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示，作为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物。然后针对噬菌体展示的变体的生物活性(例如，结合亲和力)对所述变体进行筛选，如本文所公开的。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以执行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可替代地或另外地，可能有利的是分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与抗原之间的接触点。根据本文详述的技术，此类接触残基和相邻残基是供取代的候选者。一旦产生了此类变体，就如本文所描述的对所述组变体进行筛选，并且可以选择在一个或多个相关测定中具有类似或优越性质的抗体用于进一步开发。
CRC和GPA33
结直肠癌(CRC)构成美国癌症死亡的第3大原因(Siegel,R.L.等人,《CA临床医师癌症杂志(CACancer J Clin)》67(3):177-193(2017))并且占全世界男性所有癌症的10％和女性所有癌症的9.2％(Ferlay,J.等人,《国际癌症杂志(Int J Cancer)》136(5):E359-386(2015))。尽管从2004年至2013年发病率每年稳定下降3％，但预计2017年仅在美国就有135,000例新增病例。虽然局部和区域性疾病可以治愈，但转移性CRC(mCRC)的预后很差，5年存活率仅为14％(Siegel,R.L.等人,《CA临床医师癌症杂志》67(3):177-193(2017))。CRC是异质疾病并且基于基因表达分析可以细分为4种共有分子亚型(CMS)，即CMS1-4。MSI肿瘤主要属于CMS1(占所有CRC患者的14％)并且由于DNA修复通路的缺陷，其特征在于基因组超突变和微卫星不稳定性。据推测，超突变产生了过多的新抗原，所述新抗原出现在细胞表面上并吸引T细胞进入肿瘤中。事实上，CMS1具有免疫系统激活和逃避的强分子特征。ICI功能通过重新激活被抑制的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)来恢复杀肿瘤能力，并且因此MSI肿瘤是对ICI应答最敏感的CRC肿瘤。然而，MSI肿瘤占mCRC的<5％；对于大多数mCRC来说，ICI的功效至今令人失望。腹膜癌转移通常是不可治愈的CRC的晚期。与肝和肺转移不同，其通常不可切除，对化学疗法和放射无应答，导致显著的发病率。目前的治疗主要是姑息性的，包括细胞减灭术(CRS)和热疗化学疗法(HIPEC)，这仅在小体积疾病的一小部分患者中有效。
结肠癌的一个潜在有用的靶标是43kD跨膜糖蛋白A33(GPA33)。人糖蛋白A33(GPA33或A33)是属于免疫球蛋白家族中细胞粘附分子的CTX家族的单程I型膜蛋白。GPA33包括一个Ig样C2型结构域和一个Ig样V型结构域。预测的成熟蛋白包含单个跨膜结构域、细胞外区和细胞内尾部。GPA33在细胞内运输、细胞-细胞识别/信号传递和再循环到细胞表面中发挥作用。人GPA33的氨基酸序列提供如下：MVGKMWPVLWTLCAVRVTVDAISVETPQDVLRASQGKSVTLPCTYHTSTSSREGLIQWDKLLLTHTERVVIWPFSNKNYIHGELYKNRVSISNNAEQSDASITIDQLTMADNGTYECSVSLMSDLEGNTKSRVRLLVLVPPSKPECGIEGETIIGNNIQLTCQSKEGSPTPQYSWKRYNILNQEQPLAQPASGQPVSLKNISTDTSGYYICTSSNEEGTQFCNITVAVRSPSMNVALYVGIAVGVVAALIIIGIIIYCCCCRGKDDNTEDKEDARPNREAYEEPPEQLRELSREREEEDDYRQEEQRSTGRESPDHLDQ(SEQ ID NO:100)
GPA33的胞外结构域(Ile22-Val235)的氨基酸序列提供如下：
ISVETPQDVLRASQGKSVTLPCTYHTSTSSREGLIQWDKLLLTHTERVVIWPFSNKNYIHGELYKNRVSISNNAEQSDASITIDQLTMADNGTYECSVSLMSDLEGNTKSRVRLLVLVPPSKPECGIEGETIIGNNIQLTCQSKEGSPTPQYSWKRYNILNQEQPLAQPASGQPVSLKNISTDTSGYYICTSSNEEGTQFCNITVAVRSPSMNV(SEQ IDNO:101)。
GPA33在超过95％的结直肠癌(CRC)中大量表达，在正常组织(结肠和肠上皮)中表达水平较低。相对于肠，其在肿瘤中的细胞膜中表现出长期滞留(>100小时)，具有最小内化和最小血管脱落。如被CRC吸收的huA33等单克隆抗体可以持续至多6周，而肠道滞留的半衰期为32小时(Ackerman,M.E.等人,《癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother)》57(7):1017-1027(2008))。正常肠道细胞的自然脱落在功能上相当于清除。作为膜连接复合物组分，GPA33表现出可忽略不计的内化和比大多数膜组分慢得多的周转。
本发明技术的免疫球蛋白相关组合物
本发明技术描述了用于产生和使用抗GPA33免疫球蛋白相关组合物(例如，抗GPA33抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以用于GPA33相关癌症的诊断或治疗。本发明技术范围内的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物包含例如但不限于与靶多肽特异性结合的单克隆、嵌合、人源化、多特异性抗体和双抗体、其同源物、衍生物或片段。本公开还提供了本文所公开的任何抗GPA33抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。图14-32中描述了本发明技术的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物的代表性氨基酸序列。
一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中：(a)所述VH包括选自SEQ ID NO:1-3中的任一个的氨基酸序列；和/或(b)所述VL包括选自SEQ ID NO:4-10中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗体进一步包括任何同种型的Fc结构域，例如但不限于IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包含IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY。恒定区序列的非限制性实例包含：
人IgD恒定区，Uniprot：P01880(SEQ ID NO:81)
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
人IgG1恒定区，Uniprot：P01857(SEQ ID NO:82)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2恒定区，Uniprot：P01859(SEQ ID NO:83)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG3恒定区，Uniprot：P01860(SEQ ID NO:84)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人IgM恒定区，Uniprot：P01871(SEQ ID NO:85)
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
人IgG4恒定区，Uniprot：P01861(SEQ ID NO:86)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人IgA1恒定区，Uniprot：P01876(SEQ ID NO:87)
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人IgA2恒定区，Uniprot：P01877(SEQ ID NO:88)
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人Igκ恒定区，Uniprot：P01834(SEQ ID NO:89)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包括与SEQ ID NO:81-88至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的重链恒定区。另外地或可替代地，在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包括与SEQ ID NO:89至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的轻链恒定区。
在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物与GPA33多肽的胞外结构域结合。在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物与包括SEQ ID NO:101的至少五至八个连续氨基酸残基的GPA33多肽的表位结合。在一些实施例中，所述表位是构象表位或非构象表位。
另一方面，本公开提供了一种分离的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)，所述分离的免疫球蛋白相关组合物包括包含以下的重链(HC)氨基酸序列：SEQID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:79或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。另外地或可替代地，在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物包括轻链(LC)氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物分别包括选自由以下组成的组的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:21(BC015(G3AH1L4))；SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:25(BC016(G3A H3L3))；SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:59(BC369(G3A H1L4 huOKT3))；SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:61(BC373(G3A H1L4 huOT3 H2L2))；以及SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:63(BC377(G3A H1L4huOT3 H2L4))。
在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物分别包括选自由以下组成的组的第一HC氨基酸序列、第二HC氨基酸序列、第一LC氨基酸序列和第二LC氨基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66(HD152)；SEQ ID NO:71、SEQID NO:72、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70(HD156)；SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:73和SEQ ID NO:74(HD160)；以及SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:77和SEQ IDNO:78(HD164)。
在免疫球蛋白相关组合物的任何上述实施例中，所述HC免疫球蛋白可变结构域序列和所述LC免疫球蛋白可变结构域序列形成抗原结合位点，所述抗原结合位点与包括GPA33(SEQ ID NO:101)的胞外结构域的至少五至八个连续氨基酸残基的GPA33多肽的表位结合。在一些实施例中，所述表位是构象表位或非构象表位。
在一些实施例中，所述HC免疫球蛋白可变结构域序列和所述LC免疫球蛋白可变结构域序列是同一多肽链的组分。在其它实施例中，所述HC免疫球蛋白可变结构域序列和所述LC免疫球蛋白可变结构域序列是不同多肽链的组分。在某些实施例中，所述抗体是全长抗体。
在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物与至少一种GPA33多肽特异性结合。在一些实施例中，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物与至少一种GPA33多肽结合，其中解离常数(KD)为约10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10- 12M。在某些实施例中，所述免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施例中，所述抗体包括人抗体框架区。
在某些实施例中，所述免疫球蛋白相关组合物包含以下特性中的一个或多个：(a)所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9或10中的任一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或(b)与SEQ SEQ ID:1、2或3中的任一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。另一方面，本文所提供的免疫球蛋白相关组合物中的一个或多个氨基酸残基被另一种氨基酸取代。取代可以是如本文所定义的“保守取代”。
一方面，本公开提供了一种免疫球蛋白相关组合物，所述免疫球蛋白相关组合物包括与选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19或29-58的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，所述免疫球蛋白相关组合物包括选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19或29-58中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述免疫球蛋白相关组合物包括：(a)LC序列，所述LC序列与SEQID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQID NO:69、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:77中的任一个中存在的LC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同；和/或(b)HC序列，所述HC序列与SEQ ID NO:23、SEQID NO:27、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQID NO:75或SEQ ID NO:79中的任一个中存在的HC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。
一方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合片段，所述多特异性抗原结合片段包括第一多肽链，其中：所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的重链可变结构域；(ii)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(iii)所述第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；(iv)包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；(v)能够与第二表位特异性结合的第二免疫球蛋白的重链可变结构域；(vi)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(vii)所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域；(viii)包括氨基酸序列TPLGDTTHT的柔性肽连接子序列；以及(ix)自组装拆卸(SADA)多肽，其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
另一方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合片段，所述多特异性抗原结合片段包括第一多肽链，其中：所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；(ii)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(iii)所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域；(iv)包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；(v)能够与第二表位特异性结合的第二免疫球蛋白的重链可变结构域；(vi)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(vii)所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域；(viii)包括氨基酸序列TPLGDTTHT的柔性肽连接子序列；以及(ix)自组装拆卸(SADA)多肽，其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
一方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合片段，所述多特异性抗原结合片段包括第一多肽链，其中：所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的重链可变结构域；(ii)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(iii)所述第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；(iv)包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；(v)能够与第二表位特异性结合的第二免疫球蛋白的轻链可变结构域；(vi)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(vii)所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域；(viii)包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；(ix)能够与第三表位特异性结合的第三免疫球蛋白的重链可变结构域；(x)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(xi)所述第三免疫球蛋白的轻链可变结构域；(xii)包括氨基酸序列TPLGDTTHT的柔性肽连接子序列；以及(xiii)自组装拆卸(SADA)多肽，其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第三免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第三免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
另一方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合片段，所述多特异性抗原结合片段包括第一多肽链，其中：所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；(ii)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(iii)所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域；(iv)包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；(v)能够与第二表位特异性结合的第二免疫球蛋白的轻链可变结构域；(vi)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(vii)所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域；(viii)包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；(ix)能够与第三表位特异性结合的第三免疫球蛋白的重链可变结构域；(x)包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；(xi)所述第三免疫球蛋白的轻链可变结构域；(xii)包括氨基酸序列TPLGDTTHT的柔性肽连接子序列；以及(xiii)自组装拆卸(SADA)多肽，其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第三免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第三免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
在本文所公开的多特异性抗原结合片段的某些实施例中，所述SADA多肽包括四聚化、五聚化或六聚化结构域。在一些实施例中，所述SADA多肽包括p53、p63、p73、hnRNPC、SNA-23、Stefin B、KCNQ4和CBFA2T1中的任一个的四聚化结构域。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述多特异性抗原结合片段包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:11、13、15、17、19或29-58。
在本文所公开的任何含有多特异性抗体或抗原结合片段的SADA多肽中，当所述抗体或抗原结合片段静脉内或腹膜内施用于受试者时，所述抗体或抗原结合片段不会穿过肠上皮或肠腔。
一方面，本公开提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包括第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链彼此共价键合，所述第二多肽链和所述第三多肽链彼此共价键合，并且所述第三多肽链和所述第四多肽链彼此共价键合，并且其中：(a)所述第一多肽链和所述第四多肽链中的每一个在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；(ii)所述第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域；(iii)包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及(iv)与第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域连接的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域，或与第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域连接的所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域，其中所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域能够与第二表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；并且(b)所述第二多肽链和所述第三多肽链中的每一个在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与所述第一表位特异性结合的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域；以及(ii)所述第一免疫球蛋白的重链恒定结构域；并且其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
另一方面，本公开提供了一种异二聚体多特异性抗体，所述异二聚体多特异性抗体包括第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链彼此共价键合，所述第二多肽链和所述第三多肽链彼此共价键合，并且所述第三多肽链和所述第四多肽链，并且其中：(a)所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-1)；(ii)所述第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域(CL-1)；(iii)包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及(iv)与第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域(VH-2)连接的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-2)，或与第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域(VL-2)连接的所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-2)，其中VL-2和VH-2能够与第二表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；(b)第二多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与所述第一表位特异性结合的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-1)；(ii)所述第一免疫球蛋白的第一CH1结构域(CH1-1)；以及(iii)所述第一免疫球蛋白的第一异二聚化结构域，其中所述第一异二聚化结构域不能与另一个第一异二聚化结构域一起形成稳定的同二聚体；(c)第三多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与第三表位特异性结合的第三免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-3)；(ii)所述第三免疫球蛋白的第二CH1结构域(CH1-3)；以及(iii)所述第三免疫球蛋白的第二异二聚化结构域，其中所述第二异二聚化结构域包括不同于所述第一免疫球蛋白的所述第一异二聚化结构域的氨基酸序列或核酸序列，其中所述第二异二聚化结构域不能与另一个第二异二聚化结构域一起形成稳定的同二聚体，并且其中所述第三免疫球蛋白的所述第二异二聚化结构域被配置成与所述第一免疫球蛋白的所述第一异二聚化结构域一起形成异二聚体；(d)第四多肽在N末端至C末端方向上包括：(i)能够与所述第三表位特异性结合的所述第三免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-3)；(ii)所述第三免疫球蛋白的轻链恒定结构域(CL-3)；(iii)包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及(iv)与第四免疫球蛋白的互补重链可变结构域(VH-4)连接的所述第四免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-4)，或与第四免疫球蛋白的互补轻链可变结构域(VL-4)连接的所述第四免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-4)，其中VL-4和VH-4能够与第四表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；其中VL-1和/或VL-3包括选自SEQ IDNO:4-10中的任一个的VL氨基酸序列，并且其中VH-1和/或VH-3包括选自SEQ ID NO:1-3中的任一个的VH氨基酸序列。在一些实施例中，所述第二表位和所述第四表位是相同的或不同的。
在本文所公开的多特异性抗体的任何和所有实施例中，所述多特异性抗体与以下中的一个或多个结合：CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、CD32、CD64、TCRγ/δ、NKp46、KIR、PD-1、PD-L1、LAG3、CD28、B7H3、STEAP1、HER2、EGFR、CEA、CECAM5、转铁蛋白受体、FAP、NKG2D-配体、TRAIL、FasL、组织蛋白酶G、颗粒酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、DOTA(金属)络合物、苄基-DOTA(金属)络合物、变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、NOGADA-变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、星-DFO(金属)络合物、DFO(金属)络合物或小分子DOTA半抗原。在本文所描述的多特异性抗体或多特异性抗原结合片段的一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括催化抗体、免疫检查点抑制剂或免疫检查点激活剂。
在某些实施例中，所述免疫球蛋白相关组合物含有IgG1恒定区，所述IgG1恒定区包括一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：N297A、K322A、L234A和L235A。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述免疫球蛋白相关组合物含有IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包括S228P突变。
在一些方面，本文所描述的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物含有结构修饰以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，本发明技术的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体)可以含有CH2恒定重链区的缺失以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。
一方面，本发明技术提供了一种核酸序列，所述核酸序列编码本文所描述的免疫球蛋白相关组合物的重链或轻链。本文还公开了编码本文所描述的任何抗体的重组核酸序列。在一些实施例中，所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26和28。另一方面，本发明技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达编码本文所描述的免疫球蛋白相关组合物的重链或轻链的任何核酸序列。
另一方面，本发明技术提供了一种细胞(例如，免疫细胞，如T细胞)，所述细胞用本文所公开的多特异性抗体的任何和所有实施例涂覆。
本发明技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗GPA33抗体)可以是单特异性、双特异性、三特异性或更大的多特异性。多特异性抗体可以对一种或多种GPA33多肽的不同表位具有特异性，或者可以对GPA33多肽以及如异源多肽或固相载体材料等异源组合物两者具有特异性。参见例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,《免疫学杂志》147:60-69(1991)；美国专利第5,573,920号、第4,474,893号、第5,601,819号、第4,714,681号、第4,925,648号、第6,106,835号；Kostelny等人,《免疫学杂志》148:1547-1553(1992)。在一些实施例中，免疫球蛋白相关组合物是嵌合的。在某些实施例中，免疫球蛋白相关组合物是人源化的。
本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以进一步在N或C末端处与异源多肽重组融合或与多肽或其它组合物化学缀合(包含共价和非共价缀合)。例如，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可以与在检测测定中用作标记的分子和效应子分子如异源多肽、药物或毒素重组融合或缀合。参见例如WO 92/08495；WO 91/14438、WO 89/12624；美国专利第5,314,995号；以及EP 0 396 387。
在本发明技术的免疫球蛋白相关组合物的任何上述实施例中，所述抗体或抗原结合片段可以任选地与选自由以下组成的组的药剂缀合：同位素、染料、发色团、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。对于化学键或物理键，免疫球蛋白相关组合物上的官能团通常与药剂上的官能团缔合。可替代地，药剂上的官能团与免疫球蛋白相关组合物上的官能团缔合。
药剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以直接缔合。例如，药剂上的官能团(例如，巯基)可以与免疫球蛋白相关组合物上的官能团(例如，巯基)缔合以形成二硫化物。可替代地，官能团可以通过交联剂(即，连接子)缔合。下文描述了交联剂的一些实例。交联剂可以与药剂或免疫球蛋白相关组合物连接。缀合物中的药剂或免疫球蛋白相关组合物的数量也受到另一个缀合物上存在的官能团的数量的限制。例如，与缀合物缔合的试剂的最大数量取决于免疫球蛋白相关组合物上存在的官能团的数量。可替代地，与药剂缔合的免疫球蛋白相关组合物的最大数量取决于药剂上存在的官能团的数量。
在又另一个实施例中，缀合物包括与一种药剂缔合的一种免疫球蛋白相关组合物。在一个实施例中，缀合物包括与至少一种免疫球蛋白相关组合物化学键合(例如，缀合)的至少一种药剂。药剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法与免疫球蛋白相关组合物化学键合。例如，药剂上的官能团可以与免疫球蛋白相关组合物上的官能团直接连接。合适的官能团的一些实例包含例如氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯和羟基。
药剂也可以通过如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等交联剂与免疫球蛋白相关组合物化学键合。交联剂可以例如从伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,Ill)获得。皮尔斯生物技术公司网站可以提供帮助。包含铂交联剂的另外的交联剂在以下中描述：荷兰阿姆斯特丹的Kreatech生物技术公司(Kreatech Biotechnology,B.V.,Amsterdam,The Netherlands)的美国专利第5,580,990号；第5,985,566号；以及第6,133,038号。
可替代地，药剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以是相同的。同双官能交联剂通常用于交联相同的官能团。同双官能交联剂的实例包含EGS(即，乙二醇双[琥珀酸琥珀酰亚胺酯])、DSS(即，辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、DMA(即，二亚胺代己二酸二甲酯2HCl)、DTSSP(即，3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺丙酸酯])、DPDPB(即，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)和BMH(即，双马来酰亚胺己烷)。此类同双官能交联剂也可从皮尔斯生物技术公司获得。
在其它情况下，将药剂从免疫球蛋白相关组合物中切割下来可能是有益的。上文所描述的皮尔斯生物技术公司的网站也可以帮助本领域技术人员选择合适的交联剂，所述交联剂可以被例如细胞中的酶切割。因此，可以将药剂从免疫球蛋白相关组合物中分离出来。可裂解连接子的实例包含SMPT(即，4-琥珀酰亚胺氧羰基-甲基-a-[2-吡啶基二硫代]甲苯)、磺基-LC-SPDP(即，磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸酯)、LC-SPDP(即，琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰氨基)己酸酯)、磺基-LC-SPDP(即，磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、SPDP(即，N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基己酸酯)和AEDP(即，3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸HCl)。
在另一个实施例中，缀合物包括与至少一种免疫球蛋白相关组合物物理键合的至少一种药剂。可以采用本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理键合。例如，免疫球蛋白相关组合物和药剂可以通过本领域技术人员已知的任何方法混合在一起。混合的顺序并不重要。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理混合。例如，可以将免疫球蛋白相关的组合物和药剂置于容器中并通过例如摇动容器来搅拌，以混合免疫球蛋白相关组合物和药剂。
免疫球蛋白相关组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行修饰。例如，免疫球蛋白相关组合物可以通过交联剂或官能团进行修饰，如上文所描述的。
A.制备本发明技术的抗GPA33抗体的方法
概述。最初，选择本发明技术的抗体可以针对其产生的靶多肽。例如，可以针对全长GPA33蛋白，或针对GPA33蛋白的胞外结构域的一部分来产生抗体。用于产生涉及此类靶多肽的抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。此类技术的实例包含例如但不限于涉及展示文库、异种或人小鼠、杂交瘤等的技术。本发明技术的范围内的靶多肽包含源自GPA33蛋白的任何多肽，所述GPA33蛋白含有能够引发免疫应答的胞外结构域。在某些实施例中，所述胞外结构域包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
应当理解，针对GPA33蛋白及其片段的重组工程化抗体和抗体片段，例如抗体相关多肽适合根据本公开使用。
可以用于本文所述技术的抗GPA33抗体包含单克隆抗体和多克隆抗体，以及抗体片段，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、scFv、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或抗体片段。已经描述了可用于高产率产生含抗体Fv的多肽，例如Fab'和F(ab')2抗体片段的方法。参见美国专利第5,648,237号。
通常，抗体是从源物种获得的。更具体地，获得了对靶多肽抗原具有特异性的源物种抗体的轻链、重链或两者的可变部分的核酸或氨基酸序列。源物种是可用于产生本发明技术的抗体或抗体的文库的任何物种，例如大鼠、小鼠、兔、鸡、猴、人等。
噬菌体或噬菌粒展示技术是获得本发明技术的抗体的有用技术。用于产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。编码本发明技术的抗体的序列的表达可以在大肠杆菌中进行。
由于核酸编码序列的简并性，在本发明技术的实践中可以使用编码与天然存在的蛋白质的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的其它序列。这些包含但不限于包含编码上述多肽的全部或部分核酸序列的核酸序列，所述多肽通过取代编码序列内功能等同的氨基酸残基的不同密码子而改变，由此产生沉默变化。应当理解，根据本发明技术的免疫球蛋白的核苷酸序列容许通过标准方法计算的至多25％的序列同源性变化(“序列比较和分析中的当前方法(Current Methods in Sequence Comparison and Analysis)”,《大分子测序与合成所选方法与应用(Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methodsand Applications)》,第127-149页,1998,Alan R.Liss公司(Alan R.Liss,Inc.))，只要此类变体形成识别GPA33蛋白的有效抗体。例如，多肽序列内的一个或多个氨基酸残基可以被另一个具有类似极性的氨基酸取代，所述氨基酸作为功能等同物，导致沉默改变。序列内的氨基酸的取代物可以选自所述氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包含精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。在本发明技术的范围内还包含在翻译期间或之后被差异修饰的蛋白质或其片段或衍生物，例如通过糖基化、蛋白水解切割、与抗体分子或其它细胞配体的连接等。另外地，可以在体外或体内突变免疫球蛋白编码核酸序列，以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或在编码区产生变化和/或形成新的限制性内切酶位点或破坏已有的位点，以促进另外的体外修饰。可以使用本领域已知的任何诱变技术，包含但不限于体外定点诱变，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》253:6551，标签连接子的使用(法玛西亚公司(Pharmacia))等。
多克隆抗血清和免疫原的制备。产生本发明技术的抗体或抗体片段的方法通常包含用纯化的GPA33蛋白或其片段，或用表达GPA33蛋白或其片段的细胞免疫受试者(通常为非人受试者，如小鼠或兔)。适当的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的GPA33蛋白或化学合成的GPA33肽。GPA33蛋白的胞外结构域或其部分或片段可以用作免疫原，以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术产生与GPA33蛋白或其部分或片段结合的抗GPA33抗体。在某些实施例中，所述胞外结构域包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一些实施例中，抗原性GPA33肽包括至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸残基。取决于用途并根据本领域技术人员众所周知的方法，较长的抗原性肽有时比较短的抗原性肽更理想。给定表位的多聚体有时比单体更有效。
适当的免疫原性制剂可以含有例如包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重组表达的GPA33蛋白或化学合成的GPA33肽。GPA33蛋白的胞外结构域或其部分或片段可以用作免疫原，以产生与GPA33蛋白的胞外结构域结合的抗GPA33抗体。
如果需要，GPA33蛋白(或其片段)的免疫原性可以通过与如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)等载体蛋白融合或缀合来增加。许多此类载体蛋白在本领域中是已知的。可以将合成的树木计量学树添加到反应性氨基酸侧链，例如赖氨酸中，以增强GPA33蛋白的免疫原性质。此外，可以添加CPG-二核苷酸基序来增强GPA33蛋白的免疫原性质。还可以将GPA33蛋白与如弗氏完全或不完全佐剂等常规的佐剂组合，以增加受试者对多肽的免疫反应。用于增加免疫应答的各种佐剂包含但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)、表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基酚等)、如卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)等人佐剂或类似的免疫刺激性化合物。这些技术在本领域中是标准的。
可替代地，纳米颗粒，例如病毒样颗粒(VLP)可以用于向宿主动物呈递抗原，例如GPA33蛋白。病毒样颗粒是模拟没有传染性的真实天然病毒的组织和构象的多蛋白结构，因为其不携带任何病毒遗传物质(Urakami A等人,《临床与疫苗免疫学(Clin VaccineImmunol)》24:e00090-17(2017))。当引入宿主免疫系统中时，VLP可以引发有效的免疫应答，使其成为有吸引力的外源抗原载体。基于VLP的抗原呈递平台的重要优势是其可以以密集、重复的方式展示抗原。因此，携带抗原的VLP能够通过有效地使B细胞受体(BCR)交联而诱导强B细胞应答。可以对VLP进行基因操作以改善其性质，例如免疫原性。这些技术在本领域中是标准的。
分离足够纯化的蛋白或多肽以产生抗体可能是耗时的并且有时在技术上具有挑战性。与常规的基于蛋白的免疫相关的另外的挑战包含对蛋白抗原的安全性、稳定性、可扩展性和一致性的关注。基于核酸(DNA和RNA)的免疫已经成为有前景的替代方法。DNA疫苗通常基于编码候选抗原，例如GPA33的多肽序列的细菌质粒。一旦用质粒接种宿主，使用稳健的真核启动子，经编码的抗原可以被表达以产生足够水平的转基因表达(Galvin T.A.等人,《疫苗(Vaccine)》2000,18:2566-2583)。现代DNA疫苗产生依赖于DNA合成，可能是一步克隆到质粒载体中并且随后分离质粒，这显著减少了制备时间和成本。所得质粒DNA在室温下也是高度稳定的，避免了冷运输并显著延长了保质期。这些技术在本领域中是标准的。
可替代地，编码所关注抗原，例如GPA33的核酸序列可以被合成引入到mRNA分子中。然后将mRNA递送到宿主动物中，所述宿主动物的细胞将识别mRNA序列并将其翻译成候选抗原的多肽序列，例如GPA33，由此触发对外源抗原的免疫应答。mRNA抗原或mRNA疫苗的吸引人的特征是mRNA是非感染性、非整合性平台。没有与DNA疫苗相关的感染或插入诱变的潜在风险。另外，mRNA由正常细胞过程降解并且通过设计和递送方法的修饰具有可控的体内半衰期(Kariko,K.等人,《分子疗法(Mol Ther.)》16:1833-1840(2008)；Kauffman,K.J.等人,《控制释放杂志(J Control Release)》240,227-234(2016)；Guan,S.和Rosenecker,J.,《基因疗法(Gene Ther)》24,133-143(2017)；Thess,A.等人,《分子疗法》23,1456-1464(2015))。这些技术在本领域中是标准的。
在描述本发明技术时，免疫应答可以被描述为“初级”或“次级”免疫应答。也被描述为“保护性”免疫应答的初级免疫应答是指由于对特定抗原，例如GPA33蛋白的一些初始暴露(例如，初始“免疫”或“引发”)而在个体中产生的免疫应答。在一些实施例中，免疫可以作为用含有抗原的疫苗对个体进行接种的结果而发生。例如，疫苗可以是包括一种或多种GPA33蛋白源性抗原的GPA33疫苗。随着时间的推移，初级免疫应答可以变弱或减弱并且可以甚至消失或至少减弱到无法检测到。因此，本发明技术还涉及在本文中也被称为“记忆免疫应答”的“次级”免疫应答。术语次级免疫应答是指在已经产生初级免疫应答之后在个体中引发的免疫应答。
因此，可以引发次级免疫应答，例如，增强已变弱或减弱的现有免疫应答，或重建已消失或不再能检测到的先前免疫应答(例如，“加强”)。次级或记忆免疫应答可以是体液(抗体)应答或细胞应答。在抗原的第一呈递时产生的记忆B细胞受到刺激时，发生次级或记忆体液应答。迟发型超敏(DTH)反应是由CD4+T细胞介导的一种细胞次级或记忆免疫应答。对抗原的第一暴露引发了免疫系统并且另外的暴露导致了DTH。
在适当的免疫之后，可以从受试者的血清中制备抗GPA33抗体。如果需要，可以从哺乳动物中(例如，从血液中)分离针对GPA33蛋白的抗体分子，并且通过如多肽A色谱法等众所周知的技术对其进行进一步纯化以获得IgG级分。
单克隆抗体。在本发明技术的一个实施例中，所述抗体是抗GPA33单克隆抗体。例如，在一些实施例中，抗GPA33单克隆抗体可以是人或小鼠抗GPA33单克隆抗体。为了制备针对GPA33蛋白或其衍生物(例如，本发明技术的抗GPA33抗体)、片段、类似物或同源物的单克隆抗体，可以利用通过连续细胞系培养提供抗体分子生产的任何技术。此类技术包含但不限于杂交瘤技术(参见例如Kohler和Milstein,1975《自然》256:495-497)；三体瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor等人,1983《今日免疫学(Immunol.Today)》4:72)和EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见例如Cole等人,1985《单克隆抗体与癌症疗法(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY)》,Alan R.Liss公司,第77-96页)。人单克隆抗体可以用于本发明技术的实践中并且可通过使用人杂交瘤产生(参见例如Cote等人,1983《美国国家科学院院刊》80:2026-2030)或通过在体外用爱泼斯坦巴尔病毒转化人B细胞(参见例如Cole等人,1985《单克隆抗体与癌症疗法》,Alan R.Liss公司,第77-96页)。例如，可以分离编码抗体的区的核酸群体。利用源自编码抗体的保守区的序列的引物的PCR用于从群体中扩增编码抗体的部分的序列并且然后从扩增的序列中重构编码抗体或其片段如可变结构域的DNA。此类扩增的序列也可以与编码其它蛋白的DNA融合，-例如噬菌体外壳或细菌细胞表面蛋白-用于在噬菌体或细菌上表达和展示融合多肽。然后可以表达扩增的序列并且基于例如表达的抗体或其片段对GPA33蛋白上存在的抗原或表位的亲和力进一步选择或分离。可替代地，表达本发明技术的抗GPA33单克隆抗体的杂交瘤可以通过免疫受试者并且然后使用常规方法从受试者的脾中分离杂交瘤来制备。参见例如Milstein等人(Galfre和Milstein,《酶学方法》(1981)73:3-46)。使用标准方法筛选杂交瘤将产生不同特异性(即，针对不同表位)和亲和力的单克隆抗体。可以使用由杂交瘤表达的具有期望的性质，例如GPA33结合的选定单克隆抗体；其可以与如聚乙二醇(PEG)等分子结合以改变其性质，或者编码其的cDNA可以被分离、测序并以各种方式操作。其它操作包取代换或删除特定的氨基酰基残基，所述氨基酰基残基导致抗体在储存期间或对受试者进行施用之后的不稳定性，以及亲和力成熟技术以改善GPA33蛋白的抗体的亲和力。
杂交瘤技术。在一些实施例中，本发明技术的抗体是由杂交瘤产生的抗GPA33单克隆抗体，所述杂交瘤包含B细胞，所述B细胞从转基因非人动物例如转基因小鼠中获得，从而具有包括与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包含本领域已知的技术并在以下中教导：Harlow等人,《抗体：实验室手册》,纽约冷泉港的冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY),349(1988)；Hammerling等人,《单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas)》,563-681(1981)。用于产生杂交瘤和单克隆抗体的其它方法是本领域技术人员众所周知的。
噬菌体展示技术。如上所述，本发明技术的抗体可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来产生。例如，抗GPA33抗体可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法制备。在噬菌体展示方法中，将功能性抗体结构域展示在携带编码所述功能性抗体结构域的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。通过直接选择抗原，通常是与固体表面或珠粒结合或捕获到其的抗原，从全部或组合抗体文库(例如，人或鼠)中选择具有期望的结合性质的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包含fd和M13，具有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域。另外，方法可以适用于构建Fab表达文库(参见例如Huse等人,《科学》246:1275-1281,1989)以允许快速且有效地鉴定对GPA33多肽，例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物具有期望的特异性的单克隆Fab片段。可以用于制备本发明技术的抗体的噬菌体展示方法的其它实例包含在以下中公开的方法：Huston等人,《美国国家科学院院刊》,85:5879-5883,1988；Chaudhary等人,《美国国家科学院院刊》,87:1066-1070,1990；Brinkman等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》182:41-50,1995；Ames等人,《免疫学方法杂志》184:177-186,1995；Kettleborough等人,《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》24:952-958,1994；Persic等人,《基因(Gene)》187:9-18,1997；Burton等人,《免疫学进展(Advances in Immunology)》57:191-280,1994；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047(《医学研究(MedicalResearch)》Council等人)；WO 97/08320(莫弗西斯公司(Morphosys))；WO 92/01047(CAT/MRC)；WO 91/17271(安斐曼科斯公司(Affymax))；以及美国专利5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号和第5,733,743号。可用于通过二硫键连接多肽在噬菌体颗粒的表面展示多肽的方法已经由以下描述：Lohning,美国专利第6,753,136号。如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以分离出来自噬菌体的抗体编码区，并将所述抗体编码区用于生成完整抗体(包含人抗体或任何其它期望的抗原结合片段)，并在任何期望的宿主(包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达。例如，还可以采用使用本领域已知的方法重组产生如Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，如以下文献中所公开的方法：WO 92/22324；Mullinax等人,《生物技术(BioTechniques)》12:864-869,1992；以及Sawai等人,《美国生殖免疫学杂志(AJRI)》34:26-34,1995；以及Better等人,《科学》240:1041-1043,1988。
通常，克隆到展示载体中的杂交抗体或杂交抗体片段可以针对适当的抗原进行选择，以便鉴定维持良好结合活性的变体，因为抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒颗粒的表面上。参见例如Barbas III等人,《噬菌体展示，实验室手册(Phage Display,ALaboratory Manual)》(纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.),2001)。然而，其它载体形式也可以用于该过程，如将抗体片段文库克隆到裂解性噬菌体载体(经修饰的T7或λZap系统)中用于选择和/或筛选。
重组抗GPA33抗体的表达。如上所述，本发明技术的抗体可以通过应用重组DNA技术来产生。编码本发明技术的抗GPA33抗体的重组多核苷酸构建体通常包含与抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列，包含天然相关或异源启动子区。因此，本技术的另一方面包含含有编码本发明技术的抗GPA33抗体的一个或多个核酸序列的载体。为了重组表达本发明技术的多肽中的一种或多种，通过本领域众所周知的重组DNA技术，将含有编码本发明技术的抗GPA33抗体的全部或部分核苷酸序列的核酸插入到适当的克隆载体或表达载体(即，含有转录和翻译插入的多肽编码序列的必要元件的载体)中并且详述如下。用于产生不同载体群体的方法已经由以下描述：美国专利第6,291,160号和第6,680,192号。
通常，可用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒形式。在本公开中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明技术旨在包含提供同等功能的此类其它形式的在技术上不是质粒的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。此类病毒载体允许受试者感染并在该受试者体内表达构建体。在一些实施例中，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体被掺入到适当的宿主中，宿主就被维持在适于编码本发明技术的抗GPA33抗体的核苷酸序列的高水平表达以及收集和纯化本发明技术的抗GPA33抗体的条件下。通常参见U.S.2002/0199213。这些表达载体通常可以在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分复制。通常，表达载体含有选择标志物，例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性，以允许检测用期望的DNA序列转化的那些细胞。载体也可以编码可用于引导细胞外抗体片段的分泌信号肽，例如果胶酸裂解酶。参见美国专利第5,576,195号。
本发明技术的重组表达载体包括编码具有GPA33结合性质的蛋白的呈适合在宿主细胞中表达核酸的形式核酸，这意味着重组表达载体包含一个或多个调控序列，所述调控序列基于用于表达的宿主细胞而选择，其与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在意指所关注的核苷酸序列(例如，在体外转录/翻译系统中或在将载体引入宿主细胞时在宿主细胞中)以允许表达核苷酸序列的方式与调控序列连接。术语“调控序列”旨在包含启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调控序列在例如以下中进行了描述：Goeddel,《基因表达技术：酶学方法(GENEEXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press,San Diego,Calif.),(1990)。调控序列包含指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如组织特异性调控序列)。本领域技术人员应了解，表达载体的设计可以取决于如要转化的宿主细胞的选择、期望的多肽表达水平等因素。可用作重组多肽表达的启动子(例如，抗GPA33抗体)的典型调控序列包含但不限于3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶的启动子。诱导型酵母启动子包含来自乙醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。在一个实施例中，编码本发明技术的抗GPA33抗体的多核苷酸与ara B启动子可操作地连接并可在宿主细胞中表达。参见美国专利5,028,530。本发明技术的表达载体可以引入宿主细胞中，由此产生由如本文所描述的核酸编码的包含融合多肽的多肽或肽(例如，抗GPA33抗体等)。
本发明技术的另一方面涉及表达抗GPA33抗体的宿主细胞，所述宿主细胞含有编码一种或多种抗GPA33抗体的核酸。本发明技术的重组表达载体可以设计用于在原核或真核细胞中表达抗GPA33抗体。例如，抗GPA33抗体可以在细菌细胞，如大肠杆菌(Escherichiacoli)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞，例如酵母、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在以下中进行了进一步讨论：Goeddel,《基因表达技术：酶学方法》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社,(1990)。可替代地，重组表达载体可以在体外例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶来转录和翻译。先前已经描述了可用于通过表达随机产生的多核苷酸序列制备和筛选具有预定性质的多肽，例如抗GPA33抗体的方法。参见美国专利第5,763,192号；第5,723,323号；第5,814,476号；第5,817,483号；第5,824,514号；第5,976,862号；第6,492,107号；第6,569,641号。
多肽在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有引导融合或非融合多肽的表达的组成性或诱导型启动子的载体来进行。融合载体将许多氨基酸添加到其中所编码的多肽，通常添加到重组多肽的氨基末端。此类融合载体通常有三个目的：(i)增加重组多肽的表达；(ii)增加重组多肽的溶解度；以及(iii)通过在亲和纯化中作为配体来帮助纯化重组多肽。通常，在融合表达载体中，将蛋白水解切割位点引入到融合部分与重组多肽的接合处以使得能够在纯化融合多肽之后将重组多肽与融合部分分离。此类酶和其同源识别序列包含因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包含pGEX(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech Inc)；Smith和Johnson,1988.《基因》67:31-40)、pMAL(马萨诸塞州贝弗利的新英格兰实验室(New England Biolabs,Beverly,Mass.))以及pRIT5(新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚公司(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A与靶向重组多肽融合。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包含pTrc(Amrann等人,(1988)《基因》69:301-315)和pET 11d(Studier等人,《基因表达技术：酶学方法》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(1990)60-89)。用于通过多肽融合靶向装配不同活性肽或蛋白结构域以产生多功能多肽的方法已经由以下描述：Pack等人,美国专利第6,294,353号；第6,692,935号。在大肠杆菌中最大化重组多肽表达，例如抗GPA33抗体的一种策略是在蛋白水解切割重组多肽的能力受损的宿主细菌中表达多肽。参见例如Gottesman,《基因表达技术：酶学方法》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(1990)119-128。另一种策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的单独密码子是在表达宿主，例如大肠杆菌中使用的那些优选密码子(参见例如Wada等人,1992《核酸研究(Nucl Acids Res)》20:2111-2118)。本发明技术的核酸序列的此类改变可以通过标准DNA合成技术来进行。
在另一个实施例中，抗GPA33抗体表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体的实例包含pYepSec1(Baldari等人,1987《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,《细胞(Cell)》30:933-943,1982)；pJRY88(Schultz等人,《基因》54:113-123,1987)、pYES2(加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.))和picZ(加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司)。可替代地，抗GPA33抗体可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达多肽，例如抗GPA33抗体的杆状病毒载体包含pAc系列(Smith等人,《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》3:2156-2165,1983)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989.《病毒学(Virology)》170:31-39)。
在又另一个实施例中，编码本发明技术的抗GPA33抗体的核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包含例如但不限于pCDM8(Seed,《自然》329:840,1987)和pMT2PC(Kaufman等人,《欧洲分子生物学组织杂志》6:187-195,1987)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的对照功能经常由病毒调控元件来提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于可用于表达本发明技术的抗GPA33抗体的原核和真核细胞两者的其它合适表达系统，参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》第2版,冷泉港实验室,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社,1989的第16和17章。
在另一个实施例中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸在特定细胞类型中表达(例如，组织特异性调控元件)。组织特异性调控元件在本领域中是已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包含白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等人,《基因与发育(Genes Dev)》1:268-277,1987)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,《免疫学进展》43:235-275,1988)、T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore,《欧洲分子生物学组织杂志》8:729-733,1989)和免疫球蛋白(Banerji等人,1983.《细胞(Cell)》33:729-740；Queen和Baltimore,《细胞》33:741-748,1983)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle,《美国国家科学院院刊》86:5473-5477,1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985《科学》230:912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利第4,873,316号和欧洲申请公开第264,166号)。发育性调控启动子也涵盖其中，例如鼠类hox启动子(Kessel和Gruss,《科学》249:374-379,1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,《基因与发育》3:537-546,1989)。
本发明方法的另一方面涉及其中已引入本发明技术的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解此类术语不仅涉及具体受试者细胞，而且还涉及此类细胞的子代或潜在子代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，因此这种子代可能在事实上与亲本细胞不同，但是仍然包含在如本文所用的术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，抗GPA33抗体多肽可以在细菌细胞，如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。哺乳动物细胞是用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的合适宿主。参见Winnacker,《从基因到克隆(From GenesTo Clones)》(纽约的VCH出版社(VCH Publishers,NY),1987)。本领域已经开发了能够分泌完整异源蛋白的多个合适的宿主细胞系，并且包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。在一些实施例中，所述细胞是非人细胞。针对这些细胞的表达载体可以包含如复制起点、启动子和增强子等表达控制序列和如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷化位点和转录终止子序列等必需的处理信息位点。Queen等人,《免疫学综述(Immunol.Rev.)》89:49,1986。说明性的表达控制序列是源自内源性基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。Co等人,《免疫学杂志》148:1149,1992。其它合适的宿主细胞是本领域的技术人员已知的。
载体DNA可以通过常规转化或转染技术而引入到原核细胞或真核细胞中。如本文所使用的，术语“转化”和“转染”旨在指用于向宿主细胞中引入外源核酸(例如，DNA)的多种领域公认的技术，包含磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染法、脂质转染法、电穿孔、基因枪法或基于病毒的转染法。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包含使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见Sambrook等人,《分子克隆(Molecular Cloning)》)。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人(《分子克隆：实验室手册》第2版,冷泉港实验室,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社,1989)以及其它实验室手册。取决于细胞宿主的类型，含所关注的DNA区段的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中。
合适载体的非限制性实例包含那些设计用于增殖和扩增或用于表达或两者的载体。例如，克隆载体可以选自由以下组成的组：pUC系列、pBluescript系列(加利福尼亚州加州拉的Stratagene公司(Stratagene,LaJolla,Calif.))、pET系列(威斯康星州麦迪逊的诺瓦根公司(Novagen,Madison,Wis.))、pGEX系列(瑞典乌普萨拉的玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden))和pEX系列(加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆科技公司(Clontech,Palo Alto,Calif.))。也可以使用如λ-GT10、λ-GT11、λ-ZapII(Stratagene公司)、λ-EMBL4和λ-NM1149等噬菌体载体。植物表达载体的非限制性实例包含pBI110、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(克隆科技公司)。动物表达载体的非限制性实例包含pEUK-C1、pMAM和pMAMneo(克隆科技公司)。TOPO克隆系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Calsbad,CA,Carlsbad,CA))也可以根据制造商的建议使用。
在某些实施例中，所述载体是哺乳动物载体。在某些实施例中，哺乳动物载体含有介导mRNA转录的起始、抗体编码序列以及转录终止和转录物多聚腺苷酸化所需的信号的至少一个启动子元件。在某些实施例中，哺乳动物载体含有另外的元件，例如增强子、Kozak序列和侧接RNA剪接的供体和受体位点的间插序列。在某些实施例中，可以用例如来自SV40的早期和晚期启动子、来自逆转录病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的长末端重复序列(LTRS)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子实现高效转录。也可以使用细胞元素(例如，人肌动蛋白启动子)。哺乳动物表达载体的非限制性实例包含如pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或pLNCX(加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆科技实验室(Clonetech Labs,Palo Alto,Calif.))、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)、PSVL和PMSG(瑞典乌普萨拉的法玛西亚公司(Pharmacia,Uppsala,Sweden))、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)等载体。可以与此类哺乳动物载体组合使用的哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包含人Hela 293、HEK 293、H9和Jurkat细胞、小鼠3T3、NIH3T3和C127细胞、Cos 1、Cos 7和CV 1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在某些实施例中，载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体、基于细小病毒的载体，例如基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体和基于腺病毒的载体，以及慢病毒载体，如基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体。在某些实施例中，操作病毒载体以使病毒复制缺陷。在某些实施例中，操作病毒载体以消除对宿主的毒性。这些病毒载体可以使用在以下中描述的标准重组DNA技术来制备：例如Sambrook等人,《分子克隆：实验手册》,第2版,纽约冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(1989)；以及Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南》,纽约州纽约市的格林出版协会与约翰威立国际出版公司(Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,New York,N.Y.)(1994)。
在某些实施例中，本文所描述的载体或多核苷酸可通过常规技术转移至细胞(例如，离体细胞)并且所得细胞可以通过常规技术培养以产生本文所描述的抗GPA33抗体或抗原结合片段。因此，本文提供了包括编码抗GPA33抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞，所述多核苷酸与用于在宿主细胞中表达此类序列的调控表达元件(例如，启动子)可操作地连接。在某些实施例中，编码与启动子可操作地连接的重链的载体和编码与启动子可操作地连接的轻链的载体可以在细胞中共表达，以表达完整的抗GPA33抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，细胞包含载体，所述载体包括编码本文所描述的抗GPA33抗体或抗原结合片段的重链和轻链两者的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。在某些实施例中，细胞包括两种不同的载体：第一载体，所述第一载体包括编码与启动子可操作地连接的重链的多核苷酸；以及第二载体，所述第二载体包括编码与启动子可操作地连接的轻链的多核苷酸。在某些实施例中，第一细胞包括第一载体，所述第一载体包括编码本文所描述的抗GPA33抗体或抗原结合片段的重链的多核苷酸，并且第二细胞包括第二载体，所述第二载体包括编码本文所描述的抗GPA33抗体或抗原结合片段的轻链的多核苷酸。在某些实施例中，本文提供了包括所述第一细胞和所述第二细胞的细胞的混合物。细胞的实例包含但不限于人细胞、人细胞系、大肠杆菌(例如，大肠杆菌TB-1、TG-2、DH5a、XL-蓝MRF'(Stratagene公司)、SA2821和Y1090)、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、酿酒酵母、粗糙脉孢菌、昆虫细胞(例如,Sf9、Ea4)等。
为了稳定转染哺乳动物细胞，已知取决于所使用的表达载体和转染技术，只有小部分的细胞可以将外源DNA并入其基因组中。为了鉴定并且选择这些整合体，通常将编码可选择标志物(例如，抗生素抗性)的基因与所关注的基因一起引入宿主细胞中。各种可选择标志物包含那些赋予药物抗性的标志物，如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码可选择标志物的核酸可以在与编码抗GPA33抗体的载体相同的载体上引入宿主细胞中，或可以在单独的载体上引入。用所引入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如，掺入可选择标志物基因的细胞将存活，而其它细胞将死亡)。
包含本发明技术的抗GPA33抗体的宿主细胞，如培养物中的原核或真核宿主细胞，可以用于产生(即，表达)重组抗GPA33抗体。在一个实施例中，所述方法包括在合适的培养基中培养宿主细胞(其中已引入编码抗GPA33抗体的重组表达载体)，使得产生抗GPA33抗体。在另一个实施例中，所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离抗GPA33抗体的步骤。一旦表达，从培养基和宿主细胞中纯化抗GPA33抗体集合，例如抗GPA33抗体或抗GPA33抗体相关多肽。抗GPA33抗体可以根据本领域的标准程序纯化，包含HPLC纯化、柱色谱法、凝胶电泳等。在一个实施例中，抗GPA33抗体通过Boss等人,美国专利第4,816,397号的方法在宿主生物中产生。通常，抗GPA33抗体链用信号序列表达并且因此被释放到培养基中。然而，如果抗GPA33抗体链不是宿主细胞天然分泌的，则抗GPA33抗体链可以通过用温和洗涤剂处理来释放。重组多肽的纯化是本领域众所周知的并且包含硫酸铵沉淀、亲和色谱法纯化技术、柱色谱法、离子交换纯化技术、凝胶电泳等(通常参见Scopes,《蛋白纯化(ProteinPurification)》纽约的施普林格出版公司(Springer-Verlag,N.Y.),1982)。
编码抗GPA33抗体的多核苷酸，例如抗GPA33抗体编码序列可以被掺入转基因中，以引入到转基因动物的基因组中并且随后在转基因动物的乳汁中表达。参见例如美国专利第5,741,957号、第5,304,489号和第5,849,992号。合适的转基因包含与来自如酪蛋白或β-乳球蛋白等乳腺特异性基因的启动子和增强子可操作地连接的轻链和/或重链的编码序列。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精的卵母细胞中，或者可以将转基因掺入到胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的细胞核转移到去核的卵母细胞中。
单链抗体。在一个实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体是单链抗GPA33抗体。根据本发明技术，技术可以适用于产生对GPA33蛋白具有特异性的单链抗体(参见例如美国专利第4,946,778号)。可以用于产生本发明技术的单链Fv和抗体的技术实例包含在以下中描述的实例：美国专利第4,946,778号和第5,258,498号；Huston等人,《酶学方法》,203:46-88,1991；Shu,L.等人,《美国国家科学院院刊》,90:7995-7999,1993；以及Skerra等人,《科学》240:1038-1040,1988。
嵌合和人源化抗体。在一个实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体是嵌合抗GPA33抗体。在一个实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体是人源化抗GPA33抗体。在本发明技术的一个实施例中，供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体。例如，受体抗体是人抗体(以最小化其在人体内的抗原性)，在这种情况下，所得CDR移植的抗体被称为“人源化”抗体。
重组抗GPA33抗体，如包括人部分和非人部分两者的嵌合和人源化单克隆抗体，可以使用标准重组DNA技术制备，并且在本发明技术的范围内。对于一些用途，包含本发明技术的抗GPA33抗体在人体内的体内用途以及这些药剂在体外检测测定中的用途，有可能使用嵌合、人源化或双特异性抗体。此类嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。此类有用的方法包含例如但不限于描述于以下中的方法：国际申请第PCT/US86/02269号；美国专利第5,225,539号；欧洲专利第184187号；欧洲专利第171496号；欧洲专利第173494号；PCT国际申请第WO 86/01533号；美国专利第4,816,567号；第5,225,539号；欧洲专利第125023号；Better等人,1988《科学》240:1041-1043；Liu等人1987《美国国家科学院院刊》84:3439-3443；Liu等人1987《免疫学杂志》139:3521-3526；Sun等人,1987《美国国家科学院院刊》84:214-218；Nishimura等人,1987《癌症研究》47:999-1005；Wood等人,1985《自然》314:446-449；Shaw等人,1988《美国国立癌症研究所杂志》80:1553-1559；Morrison(1985)《科学》229:1202-1207；Oi等人(1986)《生物技术》4:214；Jones等人,1986《自然》321:552-525；Verhoeyan等人,1988《科学》239:1534；Morrison,《科学》229:1202,1985；Oi等人,《生物技术》4:214,1986；Gillies等人,《免疫学方法杂志》,125:191-202,1989；美国专利第5,807,715号；以及Beidler等人,1988《免疫学杂志》141:4053-4060。例如，可以使用多种技术将抗体人源化，所述多种技术包含CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,859,205号；第6,248,516号；EP460167)、镶面或表面重修(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.,《分子免疫学(Molecular immunology)》,28:489-498,1991；Studnicka等人,《蛋白质工程(ProteinEngineering)》7:805-814,1994；Roguska等人,《美国国家科学院院刊》91:969-973,1994)和链改组(美国专利第5,565,332号)。在一个实施例中，编码鼠类抗GPA33抗体的cDNA用特异性选择的限制性内切酶消化，以去除编码Fc恒定区的序列，并取代编码人Fc恒定区的cDNA的等同部分(参见Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人,美国专利第4,816,567号；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)《科学》240:1041-1043；Liu等人(1987)《美国国家科学院院刊》84:3439-3443；Liu等人(1987)《免疫学杂志》139:3521-3526；Sun等人(1987)《美国国家科学院院刊》84:214-218；Nishimura等人(1987)《癌症研究》47:999-1005；Wood等人(1985)《自然》314:446-449；以及Shaw等人(1988)《美国国立癌症研究所杂志》80:1553-1559；美国专利第6,180,370号；美国专利第6,300,064号；第6,696,248号；第6,706,484号；第6,828,422号。
在一个实施例中，本发明技术提供了人源化抗GPA33抗体的构建，其不太可能诱导人抗小鼠抗体(下文被称为“HAMA”)应答，同时仍具有有效的抗体效应子功能。如本文所使用的，与抗体相关的术语“人”和“人源化”涉及预期在人受试者体内引发治疗上可耐受的弱免疫原性应答的任何抗体。在一个实施例中，本发明技术提供了人源化抗GPA33抗体、重链免疫球蛋白和轻链免疫球蛋白。
CDR移植的抗体。在一些实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体是抗GPA33 CDR移植的抗体。通常，用于产生抗GPA33 CDR移植的抗体的供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体；受体抗体典型地是人抗体(以最小化其在人体内的抗原性)，在这种情况下，所得CDR移植的抗体被称为“人源化”抗体。移植物可以是受体抗体的单个VH或VL内的单个CDR(或甚至是单个CDR的一部分)或者可以是VH和VL中的一者或两者内的多个CDR(或其部分)。通常，受体抗体的所有可变结构域中的所有三个CDR将被对应的供体CDR替换，尽管只需要替换所需的数量，以允许所得CDR移植的抗体与GPA33蛋白充分结合。用于产生CDR移植的和人源化抗体的方法由以下教导：Queen等人美国专利第5,585,089号；美国专利第5,693,761号；美国专利第5,693,762号；以及Winter U.S.5,225,539；以及EP 0682040。可用于制备VH多肽和VL多肽的方法由以下教导：Winter等人,美国专利第4,816,397号；第6,291,158号；第6,291,159号；第6,291,161号；第6,545,142号；EP 0368684；EP0451216；以及EP0120694。
在从同一家族和/或同一家族成员中选择合适的框架区候选物之后，通过将来自源物种的CDR移植到杂交框架区中来产生重链可变区和轻链可变区中的一个或两个。使用本领域技术人员已知的常规方法，可以完成关于上述任一方面的具有杂交可变链区的杂交抗体或杂交抗体片段的组装。例如，可以通过寡核苷酸合成和/或PCR产生编码本文所描述的杂交可变结构域的DNA序列(即，基于靶物种和来自源物种的CDR的框架)。编码CDR区的核酸也可以使用合适的限制性内切酶从源物种抗体中分离出来并通过用合适的连接酶连接而与靶物种框架连接。可替代地，可以通过定点诱变改变源物种抗体的可变链的框架区。
由于杂交体是从与每个框架区相对应的多个候选物中选择构建的，因此存在许多序列组合，所述序列组合可以根据本文所描述的原理进行构建。因此，可以组装成员具有单个框架区的不同组合的杂交体的文库。此类文库可以是序列的电子数据库集合或杂交体的物理集合。
该过程通常不会改变侧接移植的CDR的受体抗体的FR。然而，本领域技术人员有时可以通过替换给定FR的某些残基以使FR更类似于供体抗体的对应FR来提高所得抗GPA33CDR移植的抗体的抗原结合亲和力。取代的合适位置包含邻近CDR的氨基酸残基，或者能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见例如US 5,585,089，尤其是第12-16栏)。或者本领域技术人员可以从供体FR开始并将其修饰为更类似于受体FR或人共有FR。用于进行这些修饰的技术是本领域已知的。特别是如果所得FR符合该位置的人共有FR，或与此类共有FR至少90％或更多相同，则与具有完全人FR的同一抗体相比，这样做不会显著增加所得经修饰的抗GPA33 CDR移植的抗体的抗原性。
多特异性融合蛋白。如双特异性抗体(BsAb)和双特异性抗体片段(BsFab)等多特异性融合蛋白具有与例如GPA33特异性结合的至少一条臂和与第二靶抗原特异性结合的至少一条其它臂。
双特异性抗体是可以同时与具有不同结构的两个靶标结合的抗体例如，两种不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位、或半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链来制备。在一些实施例中，通过分子功能，双特异性结合剂与其两个结合臂(一个VH/VL对)之一上的一个抗原(或表位)结合，并与其第二臂(不同的VH/VL对)上的不同抗原(或表位)结合。根据这个定义，双特异性结合剂具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列两者中)，并且对于与其结合的每个抗原是单价的。
本发明技术的双特异性抗体(BsAb)和双特异性抗体片段(BsFab)具有与例如GPA33特异性结合的至少一条臂和与第二靶抗原特异性结合的至少一条其它臂。在一些实施例中，第二靶抗原是B细胞、T细胞、髓系细胞、浆细胞或肥大细胞的抗原或表位。另外地或可替代地，在某些实施例中，所述第二靶抗原选自由以下组成的组：CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、CD32、CD64、TCRγ/δ、NKp46、KIR、PD-1、PD-L1、LAG3、CD28、B7H3、STEAP1、HER2、EGFR、CEA、CECAM5、转铁蛋白受体、FAP、NKG2D-配体、TRAIL、FasL、组织蛋白酶G、颗粒酶、羧肽酶和β-内酰胺酶。在某些实施例中，BsAb能够与在细胞表面上表达GPA33抗原的肿瘤细胞结合。在一些实施例中，BsAb已经被工程化成通过将细胞毒性T细胞引导(或募集)到肿瘤位点来促进肿瘤细胞的杀伤。其它示例性BsAb包含具有对GPA33具有特异性的第一抗原结合位点和对小分子半抗原具有特异性的第二抗原结合位点的BsAb(例如，DTP A、IMP288、DOTA、DOTA-Bn、DOTA去铁胺、DOTA(金属)络合物、苄基-DOTA(金属)络合物、变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、NOGADA-变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、星-DFO(金属)络合物、DFO(金属)络合物、本文所描述的其它DOTA螯合物、生物素、荧光素或Goodwin,D A.等人,1994,《癌症研究》54(22):5937-5946)中公开的BsAb。在一些实施例中，所述双特异性抗体或双特异性抗原结合片段包括催化抗体、免疫检查点抑制剂或免疫检查点激活剂。
使用分子工程化可以产生多种多特异性融合蛋白。例如，已经构建了利用全免疫球蛋白框架(例如，IgG)、单链可变片段(scFv)或其组合的BsAb。在一些实施例中，双特异性融合蛋白是二价的，包括例如对一种抗原具有单一结合位点的scFv和对第二抗原具有单一结合位点的Fab片段。在一些实施例中，双特异性融合蛋白是二价的，包括例如对一种抗原具有单一结合位点的scFv和对第二抗原具有单一结合位点的另一种scFv片段。在其它实施例中，双特异性融合蛋白是四价的，包括例如具有一种抗原的两个结合位点和第二抗原的两个相同scFv的免疫球蛋白(例如，IgG)。由两个scFv单元串联组成的BsAb已被证明是临床上成功的双特异性抗体形式。在一些实施例中，已经设计了包括串联的两个单链可变片段(scFv)的BsAb，使得与肿瘤抗原(例如，GPA33)结合的scFv与和T细胞结合的scFv连接(例如，通过结合CD3)。以这种方式，T细胞被募集到肿瘤位点，使得其可以介导肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。参见例如Dreier等人,《免疫学杂志》170:4397-4402(2003)；Bargou等人,《科学》321:974-977(2008)。在一些实施例中，已经设计了包括串联的两个单链可变片段(scFv)的BsAb，使得与肿瘤抗原(例如，GPA33)结合的scFv与和小分子DOTA半抗原结合的scFv连接。
用于产生多特异性融合蛋白的最近方法包含具有另外的半胱氨酸残基的经工程化的重组单克隆抗体，使得其比更常见的免疫球蛋白同种型交联更强。参见例如FitzGerald等人,《蛋白质工程》10(10):1221-1225(1997)。另一种方法是对重组融合蛋白进行工程化，所述重组融合蛋白将两种或更多种不同的单链抗体或抗体片段区段与所需的双重特异性连接起来。参见例如Coloma等人,《自然生物技术(Nature Biotech.)》15:159-163(1997)。使用分子工程化可以产生多种双特异性融合蛋白。
以类似的方式产生连接两种或更多种不同单链抗体或抗体片段的多特异性融合蛋白。重组方法可以用于产生多种融合蛋白。在一些某些实施例中，根据本发明技术的BsAb包括免疫球蛋白和scFv，所述免疫球蛋白包括重链和轻链。在一些某些实施例中，scFv与本文所公开的任何GPA33免疫球蛋白的重链的C末端(例如，IgG(H)-scFv)连接。在一些某些实施例中，scFv与本文所公开的任何GPA33免疫球蛋白的轻链的C末端(例如，IgG(L)-scFv)连接。在一些实施例中，与抗GPA33×CD3单体BITE、抗GPA33×CD3二聚体BITE、抗GPA33×CD3BITE-Fc、抗GPA33×CD3 IgG异二聚体或抗GPA33×CD3 IgG(H)-scFv相比，施用IgG(L)-scFv双特异性抗体在更大程度上抑制受试者的癌症进展和/或增殖。
在各种实施例中，scFv通过连接子序列与重链或轻链连接。通过PCR反应将重链Fd与scFv框内连接所必需的适当连接子序列引入到VL和Vκ结构域中。然后将编码scFv的DNA片段连接到含有编码CH1结构域的DNA序列的分级载体中。将所得scFv-CH1构建体切除并连接到含有编码GPA33抗体的VH区的DNA序列的载体中。所得载体可以用于转染适当的宿主细胞，如哺乳动物细胞，以表达多特异性融合蛋白。
在一些实施例中，连接子的长度是至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个氨基酸。在一些实施例中，连接子的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽(例如，第一和/或第二抗原结合位点)提供柔性。在一些实施例中，基于赋予多特异性融合蛋白的特定性质，例如稳定性的增加，在本文所描述的多特异性融合蛋白中采用连接子。在一些实施例中，本发明技术的多特异性融合蛋白包括G4S连接子。在一些某些实施例中，本发明技术的多特异性融合蛋白包括(G4S)n连接子，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大。
自组装拆卸(SADA)缀合物。在一些实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体包括一个或多个SADA结构域。可以设计和/或定制SADA结构域，以实现具有有益的动力学、热力学和/或药理学性质的环境依赖性多聚化。例如，应当认识到，SADA结构域可以是缀合物的一部分，所述缀合物允许将有效载荷有效递送至所关注的靶位点，同时最小化脱靶相互作用的风险。本发明技术的抗GPA33抗体可以包括与一个或多个结合结构域连接的SADA结构域。在一些实施例中，此类缀合物的特征在于其在相关条件下(例如，在溶液中，其中缀合物存在的浓度或pH高于阈值和/或当存在于以有效载荷的受体的相关水平或密度为特征的靶位点时)多聚化形成期望的大小的复合物，并且在其它条件下(例如，没有相关的环境多聚化触发)分解成更小的形式。
与不具有SADA结构域的缀合物相比，SADA缀合物可以具有改善的特性。在一些实施例中，多聚体缀合物的改善的特性包含：对靶标的亲合力/结合增加，对靶细胞或组织的特异性增加和/或初始血清半衰期延长。在一些实施例中，改善的特性包含通过解离成更小的状态(例如，二聚体或单体)，SADA缀合物表现出非特异性结合减少、毒性降低和/或肾清除率改善。在一些实施例中，SADA缀合物包括具有氨基酸序列的SADA多肽，所述氨基酸序列与人同多聚化多肽的氨基酸序列显示出至少75％同一性并且其特征在于一个或多个多聚化解离常数(KD)。
在一些实施例中，构建并排列SADA缀合物，使得其采用第一多聚化状态和一种或多种更高阶多聚化状态。在一些实施例中，第一多聚化状态的大小小于约70kDa。在一些实施例中，第一多聚化状态是非多聚化的状态(例如，单体或二聚体)。在一些实施例中，第一多聚化状态是单体。在一些实施例中，第一多聚化状态是二聚体。在一些实施例中，第一多聚化状态是多聚化的状态(例如，三聚体或四聚体)。在一些实施例中，更高阶多聚化状态是大小大于150kDa的同四聚体或更高阶同多聚体。在一些实施例中，当缀合物以高于SADA多肽KD的浓度存在时，更高阶同多聚化缀合物在水溶液中是稳定的。在一些实施例中，当缀合物的浓度低于SADA多肽KD时，SADA缀合物在生理条件下从更高阶多聚化状态转变为第一多聚化状态。
在一些实施例中，SADA多肽通过连接子与结合结构域共价连接。可以使用本领域已知的任何合适的连接子。在一些实施例中，SADA多肽通过多肽连接子与结合结构域连接。在一些实施例中，多肽连接子是Gly-Ser连接子。在一些实施例中，多肽连接子是或包括(GGGGS)n的序列，其中n表示重复GGGGS单元的数目并且是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多。在一些实施例中，结合结构域与SADA多肽直接融合。
在一些实施例中，SADA结构域是人多肽或其片段和/或衍生物。在一些实施例中，SADA结构域在人体中是基本上非免疫原性的。在一些实施例中，SADA多肽作为多聚体是稳定的。在一些实施例中，SADA多肽缺乏未配对的半胱氨酸残基。在一些实施例中，SADA多肽不具有大的暴露的疏水性表面。在一些实施例中，SADA结构域具有或被预测具有包括螺旋束的结构，所述螺旋束可以以平行或反平行取向缔合。在一些实施例中，SADA多肽能够进行可逆的多聚化。在一些实施例中，SADA结构域是四聚化结构域、七聚化结构域、六聚化结构域或八聚化结构域。在某些实施例中，SADA结构域是四聚化结构域。在一些实施例中，SADA结构域由多聚化结构域组成，每个多聚化结构域由以平行或反平行取向缔合的螺旋束组成。在一些实施例中，SADA结构域选自下列人蛋白之一的组：p53、p63、p73、异质核核糖核蛋白C(hnRNPC)、突触体相关蛋白23(SNAP-23)的N末端结构域、Stefin B(胱抑素B)、钾电压门控通道亚家族KQT成员4(KCNQ4)或细胞周期蛋白-D相关蛋白(CBFA2T1)的四聚化结构域。合适的SADA结构域的实例描述于PCT/US2018/031235中，所述文献特此通过引用整体并入。下文提供了示例性SADA结构域的多肽序列。
人p53四聚化结构域氨基酸序列(321-359)
KPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEP(SEQ ID NO:90)
人p63四聚化结构域氨基酸序列(396-450)
RSPDDELLYLPVRGRETYEMLLKIKESLELMQYLPQHTIETYRQQQQQQHQHLLQKQ(SEQ ID NO:91)
人p73四聚化结构域氨基酸序列(348-399)
RHGDEDTYYLQVRGRENFEILMKLKESLELMELVPQPLVDSYRQQQQLLQRP(SEQ ID NO:92)。
人HNRNPC四聚化结构域氨基酸序列(194-220)
QAIKKELTQIKQKVDSLLENLEKIEKE(SEQ ID NO:93)
人SNAP-23四聚化结构域氨基酸序列(23-76)
STRRILGLAIESQDAGIKTITMLDEQKEQLNRIEEGLDQINKDMRETEKTLTEL(SEQ ID NO:94)
人Stefin B四聚化结构域氨基酸序列(2-98)
MCGAPSATQPATAETQHIADQVRSQLEEKENKKFPVFKAVSFKSQVVAGTNYFIKVHVGDEDFVHLRVFQSLPHENKPLTLSNYQTNKAKHDELTYF(SEQ ID NO:95)
KCNQ4四聚化结构域氨基酸序列(611-640)
DEISMMGRVVKVEKQVQSIEHKLDLLLGFY(SEQ ID NO:96)
CBFA2T1四聚化结构域氨基酸序列(462-521)
TVAEAKRQAAEDALAVINQQEDSSESCWNCGRKASETCSGCNTARYCGSFCQHKDWEKHH(SEQ IDNO:97)
在一些实施例中，SADA多肽是或包括p53、p63、p73、异质核核糖核蛋白C(hnRNPC)、突触体相关蛋白23(SNAP-23)的N末端结构域、Stefin B(胱抑素B)、钾电压门控通道亚家族KQT成员4(KCNQ4)或细胞周期蛋白-D相关蛋白(CBFA2T1)的四聚化结构域。在一些实施例中，SADA多肽是或包括与如SEQ ID NO:90-97中的任一个所示的序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
Fc修饰。在一些实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体包括变体Fc区，其中所述变体Fc区包括相对于野生型Fc区(或亲本Fc区)的至少一个氨基酸修饰，使得所述分子对Fc受体(例如，FcγR)具有改变的亲和力，条件是基于Fc-Fc受体相互作用的晶体学和结构分析，如由Sondermann等人,《自然》,406:267-273(2000)公开的晶体学和结构分析，所述变体Fc区在与Fc受体直接接触的位置处不具有取代。与如FcγR等Fc受体直接接触的Fc区内的位置的实例包含氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C7E环)和氨基酸327-332(F/G)环。
在一些实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体对激活和/或抑制受体具有改变的亲和力，所述受体具有带有一个或多个氨基酸修饰的变体Fc区，其中所述一个或多个氨基酸修饰是用丙氨酸的N297取代，或用丙氨酸的K322取代。另外地或可替代地，在一些实施例中，本文所公开的GPA33抗体的Fc区包括两个氨基酸取代Leu234Ala和Leu235Ala(所谓的LALA突变)以消除FcγRIIa结合。LALA突变通常用于从T细胞减轻细胞因子诱导，由此降低抗体的毒性(Wines BD等人,《免疫学杂志》164:5313-5318(2000))。
糖基化修饰。在一些实施例中，与亲本Fc区相比，本发明技术的抗GPA33抗体具有带有变体糖基化的Fc区。在一些实施例中，变体糖基化包含缺乏岩藻糖；在一些实施例中，变体糖基化由GnT1缺陷型CHO细胞中的表达产生。
在一些实施例中，本发明技术的抗体相对于与所关注的抗原(例如，GPA33)结合的适当参考抗体可以具有经修饰的糖基化位点，而不改变抗体的功能性，例如，与抗原的结合活性。如本文所使用的，“糖基化位点”包含抗体中寡糖(即，含有两个或更多个连接在一起的单糖的碳水化合物)将特异性并共价连接的任何特定氨基酸序列。
寡糖侧链通常通过N或O键与抗体的主链连接。N连接的糖基化是指寡糖部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。O连接的糖基化是指寡糖部分与羟基氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸的连接。例如，缺乏包含岩藻糖和末端N-乙酰氨基葡萄糖的某些寡糖的Fc-糖型(hGPA33-IgGln)可以在特殊的CHO细胞中产生并表现出增强的ADCC效应子功能。
在一些实施例中，通过添加或删除糖基化位点来修饰本文所公开的免疫球蛋白相关组合物的碳水化合物含量。用于修饰抗体的碳水化合物含量的方法是本领域众所周知的并且包含在本发明技术中，参见例如美国专利第6,218,149号；EP 0359096B1；美国专利公开第US 2002/0028486号；国际专利申请公开WO 03/035835；美国专利公开第2003/0115614号；美国专利第6,218,149号；美国专利第6,472,511号；所有这些专利均通过引用整体并入本文。在一些实施例中，通过删除抗体的一个或多个内源性碳水化合物部分来修饰抗体(或其相关部分或组分)的碳水化合物含量。在一些某些实施例中，本发明技术包含通过将位置297从天冬酰胺修饰为丙氨酸来删除抗体的Fc区的糖基化位点。
经工程化的糖型可以用于多种目的，包含但不限于增强或降低效应子功能。经工程化的糖型可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如通过使用经工程化的或变体表达菌株，通过与一种或多种酶例如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII)共表达，通过在各种生物或来自各种生物的细胞系中表达包括Fc区的分子，或通过在包括Fc区的分子表达之后修饰碳水化合物。用于产生经工程化的糖型的方法是本领域已知的，并且包含但不限于以下中描述的方法：Umana等人,1999,《自然生物技术》17:176-180；Davies等人,2001,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》74:288-294；Shields等人,2002,《生物化学杂志》277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,《生物化学杂志》278:3466-3473；美国专利第6,602,684号；美国专利申请序列第10/277,370号；美国专利申请序列第10/113,929号；国际专利申请出版物WO 00/61739A1；WO 01/292246A1；WO 02/311140A1；WO 02/30954A1；POTILLEGENTTM技术(新泽西州普林斯顿的Biowa公司(Biowa,Inc.Princeton,N.J.))；GLYCOMABTM糖基化工程技术(瑞士苏黎世的GLYCART生物技术股份公司(GLYCARTbiotechnology AG,Zurich,Switzerland))；所述文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。参见例如国际专利申请公开WO 00/061739；美国专利申请公开第2003/0115614号；Okazaki等人,2004,《分子生物学杂志》,336:1239-49。
融合蛋白。在一个实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体是融合蛋白。当与第二蛋白融合时，本发明技术的抗GPA33抗体可以用作抗原标签。可以与多肽融合的结构域的实例不仅包含异源信号序列，还包含其它异源功能区。融合不必是直接的，但可以通过连接子序列发生。此外，本发明技术的融合蛋白也可以被工程化以改善抗GPA33抗体的特性。例如，可以将另外的氨基酸的区，特别是带电氨基酸添加到抗GPA33抗体的N末端，以改善从宿主细胞纯化或随后的处理和储存期间的稳定性和持久性。同样，可以将肽部分添加到抗GPA33抗体中以促进纯化。可以在最终制备抗GPA33抗体之前将此类区去除。添加肽部分以促进多肽的处理是本领域熟悉且常规的技术。本发明技术的抗GPA33抗体可以与标志物序列融合，如促进融合的多肽的纯化的肽。在选择实施例中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(加利福尼亚州查茨沃斯的QIAGEN公司(QIAGEN,Inc.,Chatsworth,Calif))中提供的标签，其中许多是可商购获得的。如Gentz等人,《美国国家科学院院刊》86:821-824,1989中所描述的，例如，六组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。可用于纯化的另一种肽标签“HA”标签与源自流感血凝素蛋白的表位相对应。Wilson等人,《细胞》37:767,1984。
因此，可以使用本发明技术的多核苷酸或多肽对任何这些上述融合蛋白进行工程化。此外，在一些实施例中，本文所描述的融合蛋白显示体内半衰期增加。
与单独的单体分泌蛋白或蛋白片段相比，具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白(由于IgG)在结合和中和其它分子方面更有效。Fountoulakis等人,《生物化学杂志》270:3958-3964,1995。
类似地，EP-A-O 464 533(加拿大对应物2045869)公开了包括免疫球蛋白分子的恒定区的不同部分以及另一种人蛋白或其片段的融合蛋白。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在疗法和诊断方面是有益的，并且因此可以使得例如药物代谢动力学性质改善。参见EP-A 0232 262。可替代地，可能需要在表达、检测和纯化融合蛋白之后删除或修饰Fc部分。例如，如果融合蛋白用作免疫的抗原，Fc部分可能会妨碍疗法和诊断。在药物发现中，例如人蛋白，如hIL-5，已经与Fc部分融合，用于高通量筛选测定的目的，以鉴定hIL-5的拮抗剂。Bennett等人,《分子识别杂志(J.Molecular Recognition)》8:52-58,1995；Johanson等人,《生物化学杂志》,270:9459-9471,1995。
标记的抗GPA33抗体。在一个实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体与标记部分，即可检测基团偶联。与抗GPA33抗体缀合的特定标记或可检测基团不是本技术的关键方面，只要其不显著干扰本发明技术的抗GPA33抗体与GPA33蛋白的特异性结合。可检测基团可以是具有可检测物理或化学性质的任何材料。此类可检测标记已经在免疫测定和成像领域得到良好发展。通常，在此类方法中有用的几乎任何标记可以应用于本发明技术。因此，标记可以是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。在本发明技术的实践中有用的标签包含磁珠粒(例如，DynabeadsTM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记物(例如，3H、14C、35S、125I、121I、131I、112In、99mTc)、其它成像剂如微气泡(用于超声成像)、18F、11C、15O、89Zr(用于正电子发射断层扫描)、99mTC、111In(用于单光子发射断层扫描)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)、以及比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠粒。描述此类标签的用途的专利包含美国专利第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；以及第4,366,241号；每个美国专利通过引用且出于所有目的整体并入本文。还参见《荧光探针和研究化学品手册(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)》(第6版,俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes,Inc.,Eugene OR.))。
根据本领域公知的方法，标记可以直接或间接地与测定的期望的组分偶联。如上文指出的，可以使用多种标记，其中标记的选择取决于多种因素，如期望的灵敏度、易于与化合物缀合、稳定性要求、可用的仪器和可支配的供应物。
非放射性标记通常通过间接手段连接。通常，配体分子(例如，生物素)与分子共价结合。然后配体与抗配体(例如，链霉亲和素)分子结合，所述抗配体分子可以是固有可检测的或与信号系统共价结合的，如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物。可以使用许多配体和抗配体。当配体具有天然抗配体时，例如生物素、甲状腺素和皮质醇，其可以与标记的天然存在的抗配体结合使用。可替代地，任何半抗原或抗原化合物可以与抗体，例如抗GPA33抗体组合使用。
分子还可以与产生信号的化合物直接缀合，例如通过与酶或荧光团结合。作为标记的所关注的酶将主要是水解酶，具体地是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶，具体地是过氧化物酶。用作标记部分的荧光化合物包括但不限于例如荧光素及其衍生物、罗丹明和其衍生物、丹磺酰、伞形酮等。可用作标记部分的化学发光化合物包含但不限于例如荧光素和2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见美国专利第4,391,904号。
检测标记的方法是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，当标记是放射性标记时，检测手段包含闪烁计数器或如放射自显影中的照相胶片。在标记是荧光标记的情况下，通过用适当的光波长激发荧光染料并检测所得荧光可以对其进行检测。荧光可以通过照相胶片、通过使用如电荷耦接装置(CCD)或光电倍增器等电子检测器进行视觉检测。类似地，酶标记可以通过提供酶的适当底物并检测所得反应产物来进行检测。最后，可以通过观察与标记相关联的颜色来对简单的比色标记进行简单地检测。因此，在各种试纸测定中，缀合的金通常呈现粉红色，而各种缀合的珠粒呈现珠粒的颜色。
一些测定形式不需要使用标记的组分。例如，凝集测定可以用于检测靶抗体，例如抗GPA33抗体的存在。在这种情况下，抗原涂覆的颗粒被包括靶抗体的样品凝集。在这种形式中，不需要标记任何组分并且通过简单的视觉检查检测靶抗体的存在。
B.鉴定和表征本发明技术的抗GPA33抗体
用于鉴定和/或筛选本发明技术的抗GPA33抗体的方法。可用于鉴定和筛选针对GPA33多肽的抗体以获得对GPA33蛋白具有期望的特异性的抗体(例如，与GPA33蛋白的胞外结构域(例如，包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列)结合的抗体)的方法包含本领域已知的任何免疫介导的技术。免疫应答的组分可以通过本领域普通技术人员众所周知的各种方法在体外检测。例如，(1)用于检测和测量抗体-抗原亲和力和动力学的表面等离子体共振(SPR)；(2)细胞毒性T淋巴细胞可以与放射性标记的靶细胞一起温育并且通过释放放射性检测这些靶细胞的裂解；(3)辅助性T淋巴细胞可以与抗原和抗原呈递细胞一起温育并且通过标准方法测量细胞因子的合成和分泌(Windhagen A等人,《免疫(Immunity)》,2:373-80,1995)；(4)抗原呈递细胞可以与全蛋白抗原一起温育并且该抗原在MHC上的呈递通过T淋巴细胞激活测定或生物物理方法检测(Harding等人,《美国国家科学院院刊》,86:4230-4,1989)；(5)肥大细胞可以与和其Fc-ε受体交联的试剂一起温育并且组胺释放通过酶免疫测定法测量(Siraganian等人,《植物科学趋势(TIPS)》,4:432-437,1983)；以及(6)酶联免疫吸附测定(ELISA)。
类似地，也可以通过本领域普通技术人员众所周知的各种方法检测模型生物(例如，小鼠)或人受试者体内的产物的免疫应答。例如，(1)通过目前在临床实验室中使用的标准方法，例如ELISA可以容易地检测对疫苗接种应答的抗体的产生；(2)免疫细胞向炎症位点的迁移可以通过抓挠皮肤表面并放置无菌容器以捕获抓挠位点上的迁移细胞来检测(Peters等人,《血液(Blood)》,72:1310-5,1988)；(3)外周血单核细胞(PBMC)对有丝分裂原或混合淋巴细胞应答的增殖可以用3H-胸苷测量；(4)PBMC中的粒细胞、巨噬细胞和其它吞噬细胞的吞噬能力可以通过将PBMC与标记的颗粒一起放置在孔中测量(Peters等人,《血液》,72:1310-5,1988)；以及(5)免疫系统细胞的分化可以通过用如CD4和CD8等CD分子的抗体标记PBMC并测量表达这些标志物的PBMC的分数来测量。
在一个实施例中，使用GPA33肽在可复制基因包的表面上的展示来选择本发明技术的抗GPA33抗体。参见例如美国专利第5,514,548号；第5,837,500号；第5,871,907号；第5,885,793号；第5,969,108号；第6,225,447号；第6,291,650号；第6,492,160号；EP 585287；EP 605522；EP 616640；EP 1024191；EP 589 877；EP 774 511；EP 844306。已经描述了用于产生/选择含有编码具有期望的特异性的结合分子的噬菌粒基因组的丝状噬菌体颗粒的方法。参见例如EP 774 511；US 5871907；US 5969108；US 6225447；US 6291650；US6492160。
在一些实施例中，使用GPA33肽在酵母宿主细胞的表面上的展示来选择本发明技术的抗GPA33抗体。可用于通过酵母表面展示分离scFv多肽的方法已经由以下描述：Kieke等人,《蛋白质工程》1997年11月；10(11):1303-10。
在一些实施例中，使用核糖体展示选择本发明技术的抗GPA33抗体。使用核糖体展示在肽文库中鉴定配体的有用方法已经由以下描述：Mattheakis等人,《美国国家科学院院刊》91:9022-26,1994；以及Hanes等人,《美国国家科学院院刊》94:4937-42,1997。
在某些实施例中，使用GPA33肽的tRNA展示选择本发明技术的抗GPA33抗体。使用tRNA展示体外选择配体的有用方法已经由以下描述：Merryman等人,《化学与生物学(Chem.Biol.)》9:741-46,2002。
在一个实施例中，使用RNA展示选择本发明技术的抗GPA33抗体。用于使用RNA展示文库选择肽和蛋白质的有用方法已经由以下描述：Roberts等人,《美国国家科学院院刊》,94:12297-302,1997；以及Nemoto等人,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)》,414:405-8,1997。用于使用非天然RNA展示文库选择肽和蛋白质的有用方法已经由以下描述：Frankel等人,《当代结构生物学评论》,13:506-12,2003。
在一些实施例中，本发明技术的抗GPA33抗体在革兰氏阴性菌的周质中表达并与标记的GPA33蛋白混合。参见WO 02/34886。在表达对GPA33蛋白具有亲和力的重组多肽的克隆中，与抗GPA33抗体结合的标记的GPA33蛋白的浓度增加并使得细胞与文库的其余部分分离，如在以下中所描述的：Harvey等人,《国家科学院院刊》22:9193-982004以及美国专利公开第2004/0058403号。
在选择期望的抗GPA33抗体之后，经考虑可以通过本领域技术人员已知的任何技术，例如原核或真核细胞表达等大量产生所述抗体。可以通过使用常规技术构建编码抗体重链的表达载体来产生抗GPA33抗体，例如但不限于抗GPA33杂交抗体或片段，其中CDR和可变区框架的最小部分(如果必要)保留原始物种抗体结合特异性所需的(如根据本文所描述的技术工程化的)源自源物种抗体并且抗体的其余部分源自可以如本文所描述的操作的靶物种免疫球蛋白，由此产生用于表达杂交抗体重链的载体。
GPA33结合的测量。在一些实施例中，GPA33结合测定是指测定形式，其中GPA33蛋白和抗GPA33抗体在适于GPA33蛋白与抗GPA33抗体之间结合的条件下混合并评估GPA33蛋白与抗GPA33抗体之间的结合的量。将结合的量与合适的对照进行比较，所述对照可以是GPA33蛋白不存在时的结合的量、非特异性免疫球蛋白组合物存在时的结合的量或两者。结合的量可以通过任何合适的方法进行评估。结合测定方法包含例如SPR、ELISA、放射免疫测定、闪烁邻近测定、荧光能量转移测定、液相色谱法、膜过滤测定等。用于直接测量GPA33蛋白与抗GPA33抗体结合的生物物理测定是例如核磁共振、荧光、荧光偏振、表面等离子共振(BIACORE芯片)等。特异性结合通过本领域已知的标准测定来确定，例如放射性配体结合测定、ELISA、FRET、免疫沉淀、SPR、NMR(2D-NMR)、质谱法等。如果候选抗GPA33抗体的特异性结合比不存在候选抗GPA33抗体时观察到的结合高至少1％，那么候选抗GPA33抗体可用作本发明技术的抗GPA33抗体。
本发明技术的抗GPA33抗体的用途
综述。本发明技术的抗GPA33抗体可用于本领域已知的与GPA33蛋白的定位和/或定量相关的方法中(例如，用于测量适当生理样品中GPA33蛋白的水平、用于诊断方法、用于多肽成像等)。本发明技术的抗体可用于通过如亲和色谱法或免疫沉淀等标准技术分离GPA33蛋白。本发明技术的抗GPA33抗体可以促进从生物样品，例如，哺乳动物血清或细胞中纯化天然免疫反应性GPA33蛋白，以及在宿主系统中表达的重组产生的免疫反应性GPA33蛋白。此外，本发明技术的抗GPA33抗体可以用于检测免疫反应性GPA33蛋白(例如，在血浆、细胞裂解物或细胞上清液中)，以评估免疫反应性多肽的丰度和表达模式。作为临床测试程序的一部分，本发明技术的抗GPA33抗体可以用于诊断性监测组织中的免疫反应性GPA33蛋白水平，以例如确定给定治疗方案的功效。如上所述，可以通过将本发明技术的抗GPA33抗体与可检测物质偶联(即，物理连接)来促进检测。
GPA33蛋白的检测。用于检测生物样品中是否存在免疫反应性GPA33蛋白的示例性方法涉及从测试受试者中获得生物样品并且使所述生物样品与能够检测免疫反应性GPA33蛋白的本发明技术的抗GPA33抗体接触，使得在生物样品中检测免疫反应性GPA33蛋白的存在。检测可以通过与抗体连接的可检测标记来完成。
关于抗GPA33抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质与抗体偶联(即，物理连接)来直接标记抗体，以及通过与另一种直接标记的化合物如次级抗体的反应性来间接标记抗体。间接标记的实例包含使用荧光标记的次级抗体检测初级抗体，以及用生物素对DNA探针进行末端标记，从而可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。
在一些实施例中，本文所公开的抗GPA33抗体与一种或多种可检测标记缀合。对于此类用途，抗GPA33抗体可以通过显色、酶促、放射性同位素、同位素、荧光、毒性、化学发光、核磁共振造影剂或其它标记的共价或非共价连接可检测地标记。合适的显色标记的实例包含二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧酸。合适的酶标记的实例包含苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸酯脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记的实例包含3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。111In是使用体内成像的示例性同位素，因为其避免了125I或131I标记的GPA33结合抗体被肝脱卤的问题。另外，该同位素具有对成像更有利的γ发射能量(Perkins等人,《欧洲核医学杂志(Eur.J.Nucl.Med.)》70:296-301(1985)；Carasquillo等人,《核医学杂志》25:281-287(1987))。例如，与具有1-(P-异硫氰基苄基)-DPTA的单克隆抗体偶联的111In在非肿瘤组织，特别是肝脏中几乎不被摄取，并且增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人,《核医学杂志》28:861-870(1987))。合适的非放射性同位素标记的实例包含157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记的实例包含152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。合适的毒素标记的实例包含白喉毒素、蓖麻毒素和霍乱毒素。
化学发光标记的实例包含鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖锭酯标记、咪唑标记、吖锭盐标记、草酸酯标记、荧光素标记、荧光素酶标记以及水母发光蛋白标记。核磁共振造影剂的实例包含重金属核，例如Gd、Mn和铁。
本发明技术的检测方法可以用于体外和体内检测生物样品中的免疫反应性GPA33蛋白。用于检测免疫反应性GPA33蛋白的体外技术包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光。此外，用于检测免疫反应性GPA33蛋白的体内技术包含将本发明技术的标记的抗GPA33抗体引入到受试者体内。例如，抗GPA33抗体可以用放射性标志物标记，所述放射性标志物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术来检测。在一个实施例中，生物样品含有来自测试受试者的GPA33蛋白分子。
免疫测定和成像。本发明技术的抗GPA33抗体可以用于使用基于抗体的技术测定生物样品(例如，人血浆)中的免疫反应性GPA33蛋白水平。例如，可以用经典的免疫组织学方法研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen,M.等人,《细胞生物学杂志(J Cell Biol)》101:976-985,1985；Jalkanen,M.等人,《细胞生物学杂志》105:3087-3096,1987。可用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包含免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，并且包含酶标记，如葡萄糖氧化酶和放射性同位素或其它放射性药剂，如碘(125I、121I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)，以及荧光标记物，如荧光素、罗丹明和绿色荧光蛋白(GFP)，以及生物素。
除了测定生物样品中的免疫反应性GPA33蛋白水平之外，本发明技术的抗GPA33抗体还可以用于GPA33的体内成像。可用于此方法的抗体包含那些可通过X射线照相术、NMR或ESR检测的抗体。对于X射线照相术，合适的标记包含放射性同位素，如钡或铯，所述放射性同位素发出可检测的辐射但是不会对受试者造成明显的伤害。NMR和ESR的合适标志物包含具有可检测特性自旋的标志物，如氘，所述标志物可以通过标记相关scFv克隆的营养物而掺入到抗GPA33抗体中。
已经用适当的可检测成像部分，如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc)、不透射线物质或可通过核磁共振检测的材料标记的本发明技术的抗GPA33抗体被引入(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)到受试者中。应在本领域中理解，受试者的大小和所使用的成像系统将决定需要产生诊断图像的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人受试者，注射的放射性的量通常在99mTc的约5毫居里至20毫居里的范围内。然后，标记的抗GPA33抗体将在含有特定靶多肽的细胞位置处累积。例如，本发明技术的标记的抗GPA33抗体将在受试者体内累积在GPA33蛋白所定位于的细胞和组织中。
因此，本发明技术提供了一种医学病状的诊断方法，所述诊断方法涉及：(a)通过测量本发明技术的抗GPA33抗体在个体的细胞或体液中的结合来测定免疫反应性GPA33蛋白的表达；(b)将样品中存在的免疫反应性GPA33蛋白的量与标准参考进行比较，其中与标准相比，免疫反应性GPA33蛋白水平的增加或减少指示医学病状。
亲和力纯化。本发明技术的抗GPA33抗体可以用于从样品中纯化免疫反应性GPA33蛋白。在一些实施例中，抗体被固定在固相载体上。此类固相载体的实例包含塑料如聚碳酸酯、复合碳水化合物如琼脂糖和琼脂糖凝胶、丙烯酸树脂以及如聚丙烯酰胺和乳胶珠粒。将抗体与此类固相载体偶联的技术是本领域中众所周知的(Weir等人,《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》第4版,英国牛津布莱克韦尔科学出版社(Blackwell Scientific Publications,Oxford,England),第10章(1986)；Jacoby等人,《酶学方法》34纽约学术出版社(Academic Press,N.Y.)(1974))。
将抗原与抗体-支撑物基质结合的最简单的方法是将珠粒收集在柱中，并且使抗原溶液沿柱向下流动。这种方法的效率取决于固定抗体与抗原之间的接触时间，所述接触时间可以通过使用低流动速率来延长。当抗原流过时，固定化抗体会捕获所述抗原。可替代地，可以通过将抗原溶液与支撑物(例如，珠粒)混合并旋转或摇动浆料，使抗原与固定抗体之间最大程度地接触，从而使抗原与抗体-支撑物基质接触。结合反应已经完成后，将浆料传送到收集珠粒的柱中。使用合适的洗涤缓冲液洗涤珠粒，并且然后洗脱纯的或基本上纯的抗原。
所关注的抗体或多肽可以与如珠粒等固相载体缀合。另外，如果需要的话，如珠粒等第一固相载体也可以通过任何合适的方式与第二固相载体缀合，所述第二固相载体可以是第二珠粒或其它支撑物，包含本文所公开的用于使多肽与支撑物缀合的那些。因此，本文所公开的关于多肽与固相载体缀合的任何缀合方法和方式也可以应用于第一支撑物与第二支撑物的缀合，其中第一固相载体和第二固相载体可以相同或不同。
用于使多肽与固相载体缀合的适当的连接子(其可以为交联剂)包含可以与存在于支撑物表面的官能团、或与多肽或与两者反应的多种药剂。可用作交联剂的试剂包含同双官能试剂，并且具体地异双官能试剂。有用的双官能交联剂包含但不限于N-SIAB、二马来酰亚胺、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMCC和6-HYNIC。可以选择交联剂以在多肽与固相载体之间提供可选择性裂解的键。例如，光不稳定交联剂，如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸可以用作从固相载体裂解多肽的方式。(Brown等人,《分子多样性(Mol.Divers)》,第4-12页(1995)；Rothschild等人,《核酸研究》,24:351-66(1996)；以及美国专利第5,643,722号)。其它交联剂在本领域是众所周知的。(参见例如Wong(1991),同上；以及Hermanson(1996),同上)。
抗体或多肽可以通过羧基官能化珠粒与多肽的氨基末端之间形成的共价酰胺键，或者相反地，通过氨基官能化珠粒与多肽的羧基末端之间形成的共价酰胺键固定在如珠粒等固相载体上。另外，双官能三苯甲基连接子可以通过树脂上的氨基或羧基经由氨基树脂连接到支撑物，例如连接到如Wang树脂等树脂上的4-硝基苯基活性酯。使用双官能三苯甲基方法，固相载体可能需要用如甲酸或三氟乙酸等挥发性酸处理，以确保多肽被裂解并且可以被去除。在此类情况下，多肽可以作为无珠粒膜片沉积在固相载体的孔底部或固相载体的平坦表面上。添加基质溶液之后，多肽可以被解吸到MS中。
疏水性三苯甲基连接子也可以通过使用挥发性酸或适当的基质溶液，例如，含有3-HPA的基质溶液，从多肽裂解氨基连接的三苯甲基而用作酸不稳定连接子。酸不稳定性也可以改变。例如，三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基可以被改变为多肽的合适的对取代的或更多酸不稳定的三苯甲基胺衍生物，即可以在多肽上形成三苯甲基醚和三苯甲基胺键。因此，可以例如通过在酸性条件下(如果需要的话，包含在典型的MS条件下，其中基质(如3-HPA)用作酸)破坏疏水性吸引力或通过裂解三苯甲基醚或三苯甲基胺键而从疏水连接子中去除多肽。
可正交裂解的连接子还可以用于将第一固相载体，例如，珠粒与第二固相载体结合，或者用于将所关注的多肽与固相载体结合。使用此类连接子，第一固相载体，例如珠粒可以从第二固相载体选择性地裂解，而不从支撑物裂解多肽；接着可以稍后从珠粒裂解多肽。例如，可以使用如DTT等还原剂裂解的二硫键连接子可以用于将珠粒与第二固相载体结合，并且酸可裂解的双官能三苯甲基可以用于将多肽固定到支撑物。根据需要，可以首先裂解多肽与固相载体的连接，而例如使第一支撑物与第二支撑物之间的连接保持完整。三苯甲基连接子可以提供共价或疏水缀合，并且无论缀合的性质如何，三苯甲基在酸性条件下都容易裂解。
例如，珠粒可以通过连接基团与第二支撑物结合，所述连接基团可以被选择为具有使得珠粒与固相载体的高密度结合，或多肽与珠粒的高密度结合得以促进的长度和化学性质。此类连接基团可以具有例如“树状”结构，从而在固相载体上的每个连接位点提供多个官能团。此类连接基团的实例包含聚赖氨酸、聚谷氨酸、季戊四醇和三-羟基-氨基甲烷。
非共价结合缔合。通过非共价相互作用，抗体或多肽可以与固相载体缀合，或者第一固相载体也可以与第二固相载体缀合。例如，由能够被磁化的铁磁材料制成的磁珠粒可以被吸引到磁性固相载体上，并且可以通过去除磁场而从支撑物上释放。可替代地，固相载体可以被提供有离子或疏水部分，所述固相载体可以允许离子或疏水部分分别与多肽，例如，含有连接的三苯甲基的多肽相互作用或与具有疏水特性的第二固相载体相互作用。
固相载体也可以被提供有特异性结合对的成员，并且因此可以与多肽或含有互补结合部分的第二固相载体缀合。例如，涂覆有亲和素或链霉亲和素的珠粒可以结合到其中掺入生物素部分的多肽，或结合到涂覆有生物素或生物素衍生物如亚氨基生物素的第二固相载体。
应认识到，本文所公开的或本领域另外已知的任何结合成员都可以逆转。因此，例如生物素可以掺入到多肽或固相载体中，并且相反，亲和素或其它生物素结合部分将分别掺入到支撑物或多肽中。设想用于本文的其它特异性结合对包含但不限于激素及其受体、酶及其底物、核苷酸序列及其互补序列、抗体及与其特异性相互作用的抗原，以及本领域技术人员已知的其它此类对。
A.本发明技术的抗GPA33抗体的诊断用途
综述。本发明技术的抗GPA33抗体可用于诊断方法。如此，本发明技术提供了在受试者体内使用抗体诊断GPA33活性的方法。可以选择本发明技术的抗GPA33抗体，使得其对GPA33蛋白具有任何水平的表位结合特异性和非常高的结合亲和力。通常，抗体的结合亲和力越高，可以在免疫测定中执行的用于去除非特异性结合物质而不去除靶多肽的洗涤条件就越严格。因此，可用于诊断测定的本发明技术的抗GPA33抗体通常对GPA33具有约108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1的结合亲和力。进一步地，期望用作诊断试剂的抗GPA33抗体具有足够的动力学缔合速率，以在标准条件下在至少12小时、至少五(5)小时或至少一(1)小时内达到平衡。
抗GPA33抗体可以用于以多种标准测定形式检测免疫反应性GPA33蛋白。此类形式包含免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定和免疫测定。参见Harlow和Lane,《抗体：实验室手册》(纽约冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publications,New York),1988)；美国专利第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,879,262号；第4,034,074号；第3,791,932号；第3,817,837号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；以及第4,098,876号。生物样品可以从受试者的任何组织或体液中获得。在某些实施例中，受试者处于癌症的早期阶段。在一个实施例中，癌症的早期阶段由从受试者中获得的样品中的GPA33蛋白的水平或表达模式确定。在某些实施例中，样品选自由以下组成的组：尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水、脑脊液(CSF)和活检的身体组织。
免疫测定或夹心测定是本发明技术的诊断方法的一种形式。参见美国专利第4,376,110号、第4,486,530号、第5,914,241号和第5,965,375号。此类测定使用一种抗体，例如抗GPA33抗体或抗GPA33抗体的群体，例如固定在固相上的本发明技术的抗GPA33抗体，以及溶液中的另一种抗GPA33抗体或抗GPA33抗体的群体。通常，溶液抗GPA33抗体或抗GPA33抗体的群体被标记。如果使用抗体群体，则所述群体可以含有与靶多肽内的不同表位特异性结合的抗体。因此，相同的群体可以用于固相和溶液抗体两者。如果使用抗GPA33单克隆抗体，则具有不同结合特异性的第一和第二GPA33单克隆抗体用于固相和液相。固相(也称为“捕获”)和溶液(也称为“检测”)抗体可以按任一顺序或同时与靶抗原接触。如果首先接触固相抗体，则所述测定被称为正向测定。相反地，如果首先接触溶液抗体，则所述测定被称为反向测定。如果靶标同时与两种抗体接触，则所述测定被称为同时测定。在将GPA33蛋白与抗GPA33抗体接触之后，将样品温育，持续通常约10分钟到约24小时，并且通常约1小时的时间段。然后执行洗涤步骤，以去除样品中不与抗GPA33抗体特异性地结合的用作诊断试剂的组分。当固相和溶液抗体在单独的步骤中结合时，可以在任一个或两个结合步骤之后执行洗涤。洗涤之后，通常通过检测借助于标记的溶液抗体的结合而与固相连接的标记来对结合进行定量。通常，对于给定的抗体对或抗体群体以及给定的反应条件，从含有已知浓度的靶抗原的样品中制备校准曲线。然后通过从校准曲线(即，标准曲线)中插值读取被测样品中的免疫反应性GPA33蛋白的浓度。可以通过平衡时结合的标记的溶液抗体的量或通过在达到平衡之前的一系列时间点对结合的标记溶液抗体的动力学测量来测量分析物。此类曲线的斜率是样品中的GPA33蛋白浓度的量度。
用于上述方法的合适支撑物包含例如硝化纤维素膜、尼龙膜和衍生化尼龙膜，以及颗粒，如琼脂糖、葡聚糖基凝胶、试纸、微粒、微球、磁性颗粒、试管、微量滴定孔、SEPHADEXTM(新泽西州皮斯卡塔韦安发玛西亚生物技术公司(Amersham PharmaciaBiotech,Piscataway N.J.))等。可以通过吸收或共价连接来进行固定。任选地，抗GPA33抗体可以与如生物素等连接子分子结合，以与如亲和素等表面结合的连接子连接。
在一些实施例中，本公开提供了与诊断剂缀合的本发明技术的抗GPA33抗体。诊断剂可以包括放射性或非放射性标记、造影剂(如用于磁共振成像、计算机断层扫描或超声)，并且放射性标记可以是γ-发射同位素、β-发射同位素、α-发射同位素、俄歇电子发射同位素、或正电子发射同位素。诊断剂是与抗体部分，即抗体或抗体片段或亚片段缀合施用的分子，并且通过定位含有抗原的细胞可用于诊断或检测疾病。
有用的诊断剂包含但不限于放射性同位素、染料(如具有生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如，顺磁性离子)。美国专利第6,331,175号描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，并且通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，诊断剂选自由以下组成的组：放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物。为了用放射性金属或顺磁性离子装载抗体组分，可能有必要使其与具有用于连接多个供结合离子的螯合基团的长尾的试剂反应。此类尾可以是聚合物，如聚赖氨酸、多糖，或具有可以与螯合基团的侧基团结合的其它衍生化或可衍生化链，所述螯合基团例如为乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚肟及已知可用于此目的的类似基团。螯合物可以使用标准化学方法与本发明技术的抗体偶联。螯合物通常通过基团与抗体连接，所述基团能够在免疫反应性损失最小并且聚集和/或内部交联最小的情况下与分子形成键。用于将螯合物与抗体缀合的其它方法和试剂公开于美国专利第4,824,659号中。特别有用的金属螯合物组合包含与诊断同位素一起用于放射性成像的2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。当与本发明技术的GPA33抗体一起使用时，相同的螯合物可在与如锰、铁和钆等非放射性金属复合的情况下用于MRI。
如NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-N,N',N"-三乙酸)、DOTA和TETA(对溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸)等大环螯合物可分别用于各种金属和放射性金属如镓、钇和铜的放射性核素。此类金属螯合物可以通过剪裁所关注的金属的环大小来稳定。其它DOTA螯合物的实例包含：(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2；(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2；(ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2；(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2；(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2；(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；以及(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xx)BnDOTA；(xxi)DOTA；(xxii)BnDOTA-生物素；以及(xxiii)DOTA-生物素。
也设想了对于稳定结合核素感兴趣的其它环型螯合物，如大环聚醚，如用于RAIT的223Ra。
B.本发明技术的抗GPA33抗体的治疗用途
一方面，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)可用于治疗GPA33相关病理，如结直肠癌、T细胞白血病、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌和胃癌。在一些实施例中，所述GPA33相关癌症是实体瘤。此类治疗可以用于被鉴定为具有病理性高水平GPA33的患者(例如，通过本文所描述的方法诊断的患者)或被诊断患有已知与此类病理水平相关的疾病的患者。
一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的GPA33相关病理学的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗体(或其抗原结合片段)。可以由本发明技术的抗体治疗的GPA33相关病理的实例包含但不限于：结直肠癌、T细胞白血病、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌和胃癌。所述GPA33相关癌症可以是具有MSI基因型或MSS基因型的结直肠癌。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述结直肠癌与KRAS G12D突变或p53突变相关。
本发明技术的组合物可以与可用于治疗GPA33相关癌症的其它治疗剂联合使用。例如，本发明技术的抗体或抗原结合片段可以与至少一种另外的治疗剂单独、依序或同时施用，所述至少一种另外的治疗剂选自由以下组成的组：烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、细胞抑制生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、双膦酸盐治疗剂和靶向的生物治疗剂(例如，在US 6306832、WO 2012007137、WO 2005000889、WO 2010096603等中描述的治疗肽)。在一些实施例中，所述至少一种另外的治疗剂是化学治疗剂。特定化学治疗剂包含但不限于环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达蝶呤(10-乙基-10-脱氧氨基蝶呤)、噻替帕(thiotepa)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、紫杉烷、紫杉醇、蛋白结合紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、长春瑞滨(vinorelbine)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、富韦司琼(fulvestrant)、吉西他滨(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)、异沙比隆(ixabepilone)、替莫唑胺(temozolmide)、拓扑替康(topotecan)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、艾瑞布林(eribulin)、突变霉素(mutamycin)、卡培他滨(capecitabine)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、布舍瑞林(buserlin)、戈舍瑞林(goserelin)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、利塞膦酸盐(risedronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、地诺单抗(denosumab)、唑来膦酸盐(zoledronate)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、泰立沙(tykerb)、蒽环类药物(例如，柔红霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin))、贝伐单抗(bevacizumab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、美法仑(melphalan)、依托泊苷(etoposide)、氮芥(mechlorethamine)、博来霉素(bleomycin)、微管毒物(microtubule poison)、番荔枝内酯(annonaceousacetogenin)或其组合。
另外地或可替代地，在一些实施例中，本发明技术的抗体或抗原结合片段可以与至少一种另外的免疫调节/刺激抗体单独、依序或同时施用，所述抗体包含但不限于抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗4-1BB抗体、抗CD73抗体、抗GITR抗体和抗LAG-3抗体。
本发明技术的组合物可以任选地作为单次团注施用于有需要的受试者。可替代地，给药方案可以包括在肿瘤出现之后的不同时间进行多次施用。
可以通过任何合适的途径进行施用，包含口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、颅内、肿瘤内、鞘内或局部施用。施用包含自我施用和由另一个人施用。还应了解，如所描述的各种治疗医学病状的模式旨在表示“基本的”，其包含完全的治疗但也包含次于其的治疗，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。
在一些实施例中，本发明技术的抗体包括可以以一个或多个剂量施用于有需要的受试者的药物调配物。可以调整剂量方案以提供期望的应答(例如，治疗应答)。
典型地，足以实现治疗效果的本发明技术的抗体组合物的有效量的范围为约0.000001mg/千克体重/天至约10,000mg/千克体重/天。典型地，剂量范围为约0.0001mg/千克体重/天至约100mg/千克体重/天。为了施用抗GPA33抗体，剂量的范围为受试者体重的约0.0001至100mg/kg，并且更通常为0.01至5mg/kg/周、两周或三周。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重/周、两周或三周或者处于1-10mg/kg/周、两周或三周的范围内。在一个实施例中，抗体的单次剂量范围为0.1-10,000微克/kg体重。在一个实施例中，抗体在载体中的浓度范围为0.2至2000微克/递送毫升。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。抗GPA33抗体可以在多种情况下施用。单一剂量之间的间隔可以是每小时、每天、每周、每月或每年。如通过测量受试者体内的抗体的血液水平所指示的，间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调整剂量以在受试者体内实现约75μg/mL至约125μg/mL、100μg/mL至约150μg/mL、约125μg/mL至约175μg/mL或约150μg/mL至约200μg/mL的血清抗体浓度。可替代地，抗GPA33抗体可以作为缓释调配物施用，在这种情况下要求较低频率地施用。剂量和频率根据抗体在受试者体内的半衰期而变化。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，相对较低剂量在长时间段内以相对不频繁的间隔施用。在治疗性应用中，有时要求相对短的间隔下相对高的剂量，直到疾病进展减少或终止或者直到受试者示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对患者施用预防方案。
另一方面，本公开提供了一种用于检测受试者体内癌症的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗体(或其抗原结合片段)，其中所述抗体被配置成定位于表达GPA33的癌细胞并且用放射性同位素标记；以及(b)通过检测由所述抗体发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者的肿瘤的存在。在一些实施例中，参考值表示为每克注射剂量(ID/g％)。参考值可以通过测量存在于非肿瘤(正常)组织中的放射性水平，并且计算存在于非肿瘤(正常)组织中的平均放射性水平±标准偏差来计算。在一些实施例中，肿瘤与正常组织之间的放射性水平比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
在一些实施例中，所述受试者被诊断患有或疑似患有癌症。由所述抗体发射的放射性水平可以使用正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描检测。
另外地或可替代地，在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包括与放射性核素缀合的本发明技术的抗体。在一些实施例中，所述放射性核素是α颗粒发射同位素、β颗粒发射同位素、俄歇发射器或其任何组合。β颗粒发射同位素的实例包含86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。α颗粒发射同位素的实例包含213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At和255Fm。俄歇发射器的实例包含111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl和203Pb。在所述方法的一些实施例中，正常组织中的非特异性FcR依赖性结合被消除或减少(例如，通过Fc区中的N297A突变，其导致糖基化)。此类免疫缀合物的治疗效果可以通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来确定。在一些实施例中，免疫缀合物的AUC肿瘤:AUC正常组织比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
PRIT。一方面，本公开提供了一种用于检测有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和与所述放射性标记的DOTA半抗原和GPA33抗原结合的本发明技术的多特异性抗体，其中所述复合物被配置成定位于表达由所述复合物的所述多特异性抗体识别的所述GPA33抗原的肿瘤；以及(b)通过检测由所述复合物发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者的实体瘤的存在。在一些实施例中，所述受试者是人。
另一方面，本公开提供了一种用于选择受试者用于预靶向放射免疫疗法的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和与所述放射性标记的DOTA半抗原和GPA33抗原结合的本发明技术的多特异性抗体，其中所述复合物被配置成定位于表达由所述复合物的所述多特异性抗体识别的所述GPA33抗原的肿瘤；(b)检测由所述复合物发射的放射性水平；以及(c)当由所述复合物发射的所述放射性水平高于参考值时，选择所述受试者用于预靶向放射免疫疗法。在一些实施例中，所述受试者是人。
DOTA半抗原的实例包含：(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2；(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2；(ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2；(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2；(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2；(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xx)BnDOTA；(xxi)DOTA；(xxii)BnDOTA-生物素；以及(xxiii)DOTA-生物素。所述放射性标记可以是α颗粒发射同位素、β颗粒发射同位素或俄歇发射器。放射性标记的实例包含213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu。
在本文所公开的方法的一些实施例中，由所述复合物发射的所述放射性水平是使用正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描检测的。另外地或可替代地，在本文所公开的方法的一些实施例中，所述受试者被诊断患有或疑似患有GPA33相关癌症，如结直肠癌、T细胞白血病、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌和胃癌。
另外地或可替代地，在本文所公开的方法的一些实施例中，所述复合物通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服、肿瘤内或鼻内施用。在某些实施例中，将所述复合物施用于所述受试者的脑脊髓液或血液中。
在本文所公开的方法的一些实施例中，在施用所述复合物后2至120小时之间检测由所述复合物发射的所述放射性水平。在本文所公开的方法的某些实施例中，由所述复合物发射的所述放射性水平表示为每克组织的注射剂量百分比(ID/g％)。参考值可以通过测量存在于非肿瘤(正常)组织中的放射性水平，并且计算存在于非肿瘤(正常)组织中的平均放射性水平±标准偏差来计算。在一些实施例中，参考值是标准摄取值(SUV)。参见ThieJA,《核医学杂志》45(9):1431-4(2004)。在一些实施例中，肿瘤与正常组织之间的放射性水平比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
另一方面，本公开提供了一种用于增加被诊断患有GPA33相关癌症的受试者的肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗DOTA多特异性抗体，其中所述抗DOTA多特异性抗体被配置成定位于表达GPA33抗原靶标的肿瘤；以及(b)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置成与所述抗DOTA多特异性抗体结合。在一些实施例中，所述受试者是人。
所述抗DOTA多特异性抗体在足以使肿瘤细胞饱和的条件下施用一段时间(例如，根据给药方案)。在一些实施例中，在施用所述抗DOTA多特异性抗体之后将未结合的抗DOTA多特异性抗体从血流中去除。在一些实施例中，在足以清除未结合的抗DOTA多特异性抗体的时间段之后施用所述放射性标记的DOTA半抗原。
所述放射性标记的DOTA半抗原可以在施用所述抗DOTA多特异性抗体之后1分钟至4天或更多天之间的任何时间施用。例如，在一些实施例中，所述放射性标记的DOTA半抗原在施用所述抗DOTA多特异性抗体之后施用1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时、96小时或其中的任何范围。可替代地，所述放射性标记的DOTA半抗原可以在施用所述抗DOTA多特异性抗体之后在4天或更多天之后的任何时间施用。
另外地或可替代地，在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用所述放射性标记的DOTA半抗原之前，向所述受试者施用有效量的清除剂。清除剂可以是可以与C825半抗原缀合的任何分子(葡聚糖或树枝状大分子或聚合物)。在一些实施例中，所述清除剂不超过2000kD、1500kD、1000kD、900kD、800kD、700kD、600kD、500kD、400kD、300kD、200kD、100kD、90kD、80kD、70kD、60kD、50kD、40kD、30kD、20kD、10kD或5kD。在一些实施例中，所述清除剂是500kD氨基葡聚糖-DOTA缀合物(例如，500kD葡聚糖-DOTA-Bn(Y)、500kD葡聚糖-DOTA-Bn(Lu)或500kD葡聚糖-DOTA-Bn(In)等)。
在一些实施例中，施用清除剂和放射性标记的DOTA半抗原，而不进一步施用本发明技术的抗DOTA多特异性抗体。例如，在一些实施例中，本发明技术的抗DOTA多特异性抗体根据包含以下中的至少一个循环的方案施用：(i)施用本发明技术的抗DOTA多特异性抗体(任选地使得相关肿瘤细胞饱和)；(ii)施用放射性标记的DOTA半抗原以及任选地清除剂；(iii)任选另外施用放射性标记的DOTA半抗原和/或清除剂，而不另外施用抗DOTA多特异性抗体。在一些实施例中，所述方法可以包括多个此类循环(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个循环)。
另外地或可替代地，在所述方法的一些实施例中，所述抗DOTA多特异性抗体和/或所述放射性标记的DOTA半抗原通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、肿瘤内、口服或鼻内施用。
一方面，本公开提供了一种用于增加被诊断患有GPA33相关癌症的受试者的肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和识别所述放射性标记的DOTA半抗原和GPA33抗原靶标并与其结合的本发明技术的多特异性抗体，其中所述复合物被配置成定位于表达由所述复合物的所述多特异性抗体识别的所述GPA33抗原靶标的肿瘤。所述复合物可以通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服、肿瘤内或鼻内施用。在一些实施例中，所述受试者是人。
另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者施用有效量的本发明技术的抗DOTA多特异性抗体，其中所述抗DOTA多特异性抗体被配置成定位于表达GPA33抗原靶标的肿瘤；以及(b)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置成与所述抗DOTA多特异性抗体结合。所述抗DOTA多特异性抗体在足以使肿瘤细胞饱和的条件下施用一段时间(例如，根据给药方案)。在一些实施例中，在施用所述抗DOTA多特异性抗体之后将未结合的抗DOTA多特异性抗体从血流中去除。在一些实施例中，在足以清除未结合的抗DOTA多特异性抗体的时间段之后施用所述放射性标记的DOTA半抗原。在一些实施例中，所述受试者是人。
因此，在一些实施例中，所述方法进一步包括在施用所述放射性标记的DOTA半抗原之前，向所述受试者施用有效量的清除剂。所述放射性标记的DOTA半抗原可以在施用所述抗DOTA多特异性抗体之后1分钟至4天或更多天之间的任何时间施用。例如，在一些实施例中，所述放射性标记的DOTA半抗原在施用所述抗DOTA多特异性抗体之后施用1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时、96小时或其中的任何范围。可替代地，所述放射性标记的DOTA半抗原可以在施用所述抗DOTA多特异性抗体之后在4天或更多天之后的任何时间施用。
所述清除剂可以是500kD氨基葡聚糖-DOTA缀合物(例如，500kD葡聚糖-DOTA-Bn(Y)、500kD葡聚糖-DOTA-Bn(Lu)或500kD葡聚糖-DOTA-Bn(In)等)。在一些实施例中，施用清除剂和放射性标记的DOTA半抗原，而不进一步施用抗DOTA多特异性抗体。例如，在一些实施例中，抗DOTA多特异性抗体根据包含以下中的至少一个循环的方案施用：(i)施用本发明技术的抗DOTA多特异性抗体(任选地使得相关肿瘤细胞饱和)；(ii)施用放射性标记的DOTA半抗原以及任选地清除剂；(iii)任选另外施用放射性标记的DOTA半抗原和/或清除剂，而不另外施用抗DOTA多特异性抗体。在一些实施例中，所述方法可以包括多个此类循环(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个循环)。
本文还提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和识别所述放射性标记的DOTA半抗原和GPA33抗原靶标并与其结合的本发明技术的多特异性抗体，其中所述复合物被配置成定位于表达由所述复合物的所述多特异性抗体识别的所述GPA33抗原靶标的肿瘤。此类复合物的治疗效果可以通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来确定。在一些实施例中，所述复合物的AUC肿瘤:AUC正常组织比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
离体武装T细胞。一方面，本公开提供了一种离体武装T细胞，所述离体武装T细胞用有效量的本发明技术的抗GPA33多特异性抗体涂覆或与其复合，其中所述抗GPA33多特异性抗体包含CD3结合结构域，其中所述抗GPA33多特异性抗体是包括两条重链和两条轻链的免疫球蛋白，其中所述轻链中的每条轻链与单链可变片段(scFv)融合。在一些实施例中，所述抗GPA33多特异性抗体的至少一个scFv包括所述CD3结合结构域。另外地或可替代地，在一些实施例中，所述抗GPA33多特异性抗体的至少一个scFv包括DOTA结合结构域。
本文还公开了一种用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的离体武装T细胞。
毒性。最佳地，有效量(例如，剂量)的本文所描述的抗GPA33抗体将提供治疗益处而不会对受试者造成实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验用动物中的标准药物程序来确定抗GPA33抗体的毒性，例如通过确定LD50(致死50％的群体的剂量)或LD100(致死100％的群体的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比率是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于制定对于在人类中使用无毒的剂量范围。本文所描述的抗GPA33抗体的剂量处于循环浓度的范围内，所述循环浓度包含低毒性或无毒性的有效剂量。根据所采用的剂型和所利用的施用通路，剂量可以在此范围内变化。精确的调配物、施用途径和剂量可以由个体医师根据受试者的病状来选择。参见例如，Fingl等人,《治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)》,第1章(1975)。
药物组合物的调配物。根据本发明技术的方法，可以将抗GPA33抗体掺入到适于施用的药物组合物中。药物组合物通常包括呈适于施用于受试者的形式的重组或基本上纯化的抗体和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体部分地由所施用的特定组合物以及通过用于施用组合物的特定方法来测定。因此，存在用于施用抗体组合物的药物组合物的多种合适的调配物(参见例如《雷明顿氏医药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA)第18版,1990)。所述药物组合物通常被调配为无菌、基本等渗并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。所述药物组合物可以进一步包括选自由以下组成的组的药剂：同位素、染料、发色团、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
指代组合物、载体、稀释剂和试剂的术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变化可互换使用，并且表示所述物质能够对受试者施用或在受试者上施用而不会产生不期望的生理作用，其程度会阻止所述组合物的施用。例如，“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备通常是安全的、无毒的且理想的药物组合物的赋形剂，并且包含对于兽医使用以及人类药用可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或在气溶胶组合物的情况下，可以是气体。“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并具有期望药理性质的盐和酯。此类盐包含在组合物中存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应的情况下可以形成的盐。合适的无机盐包含与碱金属，例如，钠和钾、镁、钙和铝一起形成的盐。合适的有机盐包含与有机碱，如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等一起形成的有机盐。此类盐还包含与无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃和芳烃磺酸，如甲磺酸和苯磺酸)一起形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包含由抗GPA33抗体中存在的羧基、磺酰氧基和膦氧基形成的酯，例如，C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸-单盐或酯或二盐或酯；并且类似地，当存在两个以上酸性基团时，这些基团中的一些或全部可以被盐化或酯化。本技术中命名的抗GPA33抗体可以以未盐化或未酯化的形式存在，或以盐化和/或酯化的形式存在，并且此类抗GPA33抗体的命名旨在包含原始的(未盐化和未酯化的)化合物及其药学上可接受的盐和酯两者。同样，在本发明技术的某些实施例可以以多于一种的立体异构体形式存在，并且此类抗GPA33抗体的命名旨在包含所有单一的立体异构体以及此类立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是其它形式的)。对于本发明技术的特定药物和组合物，本领域普通技术人员可以容易地确定适当的施用时间、顺序和剂量。
此类载体或稀释剂的实例包含但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性媒剂，如固定油。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除了任何常规介质或化合物与抗GPA33抗体不相容的情况之外，设想了所述介质或化合物在组合物中的使用。还可以将补充的活性化合物掺入到组合物中。
本发明技术的药物组合物被调配成与其预期施用途径相容。本发明技术的抗GPA33抗体组合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、经皮、直肠、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内或肌肉内途径或作为吸入剂施用。抗GPA33抗体可以任选地与在治疗各种GPA33相关癌症中至少部分有效的其它药剂联合施用。
用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制剂密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适用于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中可溶于水)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包含生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(新泽西州派西派尼市的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸酯缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是流体，以达到易于注射的程度。其必须在制备和储存的条件下稳定，并且必须保存以抵抗如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。恰当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散体的情况下通过维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持。预防微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌化合物(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，期望的是在组合物中包含等渗化合物，例如糖、多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的化合物，例如，单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的本发明技术的抗GPA33抗体根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起掺入适当溶剂中，随后过滤灭菌处理来制备。通常，通过将抗GPA33抗体掺入到含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些干燥产生活性成分加来自其先前经无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。本发明技术的抗体可以以贮库注射剂或植入制剂的形式施用，所述贮库注射剂或植入制剂可以以此类方式调配以允许活性成分的持久或脉动释放。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。所述口服组合物可以被包封在明胶胶囊中或被压制成片剂。出于口服治疗性施用的目的，可以将抗GPA33抗体与赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用适用作漱口水的流体载剂制备，其中流体载剂中的化合物口服施用并且漱口并吐掉或吞咽。可以包括药学上相容的结合化合物和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有以下成分中的任何成分或者具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解化合物，如海藻酸、羧甲基淀粉钠或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味化合物，如蔗糖或糖精；或调味化合物，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于通过吸入施用，将抗GPA33抗体以气溶胶喷雾的形式从含有合适的推进剂，例如，如二氧化碳等气体或喷雾器的加压容器或分配器中递送。
全身施用还可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在调配物中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的并且包含例如就经粘膜给予而言洗涤剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾或栓剂实现。如所属领域中通常已知，对于经皮施用来说，将抗GPA33抗体调配成软膏、油膏、凝胶或乳膏。
抗GPA33抗体也可以制备成呈栓剂形式的药物组合物(例如，用常规的栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。
在一个实施例中，抗GPA33抗体与保护抗GPA33抗体免于从体内快速消除的载剂一起制备，如控释调配物，包含植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类调配物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。所述材料还可以从Alza公司(Alza Corporation)和Nova制药公司(Nova Pharmaceuticals,Inc)商购获得。脂质体悬浮液(包含靶向感染的细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如在美国专利第4,522,811号中所描述的方法。
试剂盒
本发明技术提供了用于检测和/或治疗GPA33相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种本发明技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所描述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能变体(例如，取代型变体)。任选地，本发明技术的试剂盒的上文所描述的组分被包装在合适的容器中并贴上标记以用于GPA33相关癌症的诊断和/或治疗。上述组分可以以用于重构的水溶液，优选地无菌溶液或以冻干，优选地无菌调配物形式储存在单位或多剂量容器，例如密封安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管中。试剂盒可以进一步包括第二容器，所述第二容器容纳适用于将药物组合物稀释到更高体积的稀释剂。合适的稀释剂包含但不限于药物组合物的药学上可接受的赋形剂和盐水溶液。此外，试剂盒可以包括用于稀释药物组合物的说明书和/或用于施用药物组合物(无论稀释与否)的说明书。容器可以由各种材料形成，如玻璃或塑料，并且可以具有无菌接入端口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可以通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒可以进一步包括更多个容器，所述更多个容器包括药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。试剂盒可以进一步包括从商业和用户的观点来看合乎期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、用于合适的宿主中的一种或多种宿主的培养基。试剂盒可以任选地包含说明书，所述说明书通常包含在治疗或诊断产品的商业包装中，其含有关于例如关于此类治疗或诊断产品的使用的适应症、用法、剂量、制造、施用、禁忌症和/或警告的信息。
试剂盒可用于检测生物样品中的免疫反应性GPA33蛋白的存在，所述生物样品例如任何体液，包含但不限于例如血清、血浆、淋巴、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液，并且包含身体组织的活检样品。例如，试剂盒可以包括：能够与生物样品中的GPA33蛋白结合的本发明技术的一种或多种人源化、嵌合、双特异性或多特异性抗GPA33抗体(或其抗原结合片段)；用于确定样品中的GPA33蛋白的量的构件；以及用于将样品中的免疫反应性GPA33蛋白的量与标准进行比较的构件。可以标记抗GPA33抗体中的一种或多种。试剂盒组分(例如，试剂)可以包装在合适的容器中。试剂盒可以进一步包括用于使用试剂盒检测免疫反应性GPA33蛋白的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可以包括例如1)第一抗体，例如与固相载体连接的本发明技术的人源化、嵌合、双特异性或多特异性GPA33抗体(或其抗原结合片段)，所述第一抗体与GPA33蛋白结合；以及任选地；2)不同的第二抗体，其与GPA33蛋白或第一抗体结合，并且与可检测标记缀合。
试剂盒还可以包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒可以进一步包括用于检测可检测标记所需的组分，例如，酶或底物。试剂盒还可以含有可以进行测定并且与测试样品进行比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的每种组分可以封装在单独的容器内，并且所有各种容器可以连同用于解释使用所述试剂盒进行的测定的结果的说明书一起在单独的包装内。本发明技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或在其中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中含有的试剂，例如，用于体外或体内检测GPA33蛋白，或用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症。在某些实施例中，试剂的使用可以根据本发明技术的方法进行。
实例
通过以下实例进一步展示本发明技术，所述实例不应被解释为以任何方式进行限制。以下实例展示了本发明技术的说明性抗GPA33抗体的制备、表征和用途。
实例1：材料与方法
细胞系和人白细胞。细胞系LS174T、Colo205和SW122细胞购自ATCC或从路德维希研究所(Ludwig Institute)(SW1222)获得。所有细胞通过STR分型鉴定。细胞维持在补充有10％ FBS(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO))、0.03％L-谷氨酰胺(马里兰州盖瑟斯堡的吉博科实验室(Gibco Laboratories,Gaithersburg,MD))和Pen/Strep(马里兰州盖瑟斯堡的吉博科实验室)的RPMI培养基中。从纽约血液中心(New York BloodCenter)(纽约州纽约市)购买来自健康供体的血沉棕黄层并且通过血沉棕黄层的Ficoll梯度分离人PBMC。
SEC-HPLC分析。使用HPLC系统(马里兰州哥伦比亚的岛津科学仪器有限公司(Shimadzu Scientific Instruments Inc.,Columbia,MD))分析huA33-BsAb的大小和纯度。使用分子量标准(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的伯乐实验室公司(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA))鉴定单体物种并基于不同非缓冲峰的相对曲线下面积(AUC)计算单体百分比。
抗体和流式细胞术。山羊抗人IgG-PE购自南方生物技术公司(Southern Biotech)(阿拉巴马州伯明翰(Birmingham,AL))。生物素化-[Lu177]BnDOTA是在MSKCC通过有机合成核心合成的。链霉亲和素-PE购自百进生物公司(Biolegend)(加利福尼亚州圣地亚(SanDiego,CA))。所有FACS分析使用BD FACSCalibur、BD Fortessa(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,CA))或Attune NxT流式]细胞仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的英杰公司(Invitrogen,Waltham,MA))进行并使用FlowJo(FLOWJO，俄勒冈州的亚什兰公司(Ashland,OR))进行分析。
FACS细胞结合测定。将细胞与5μg/mL的初级抗GPA33抗体在PBS中在4℃下温育三十分钟，并且然后在洗去过量的初级抗体之后添加对人Fc具有特异性的次级藻红蛋白标记的抗体。在FACSCalibur细胞仪(美国新泽西州富兰克林湖的BD生物科学公司(BDbiosciences,Franklin Lakes,New Jersey,U.S.))上分析之前，用1％多聚甲醛(PFA)固定细胞。对照是仅具有次级抗体的平均荧光强度(MFI)设定为5的细胞。
鼠类A33的人源化。使用CDR移植，小鼠A33人源化为IgG1。将3个人源化VH序列(SEQID NO:1-3)和8个人源化VL序列(SEQ ID NO:4-10)组合产生24种不同的人源化A33抗体。A33的3个人源化VH和8个人源化VL变体的氨基酸序列分别如图12和图13所示。
使用表面等离子共振(SPR)分析将结合动力学与嵌合抗体chA33的结合动力学进行比较。嵌合抗体chA33的VH序列和VL序列提供如下：
chA33 VH(SEQ ID NO:106)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSTYDMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYLDSVKGRFTISRDSARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCAPTTVVPFAYWGQGTLVTVSA
chA33 VL(SEQ ID NO:107)
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRTVVAWYQQKPGQSPKTLIYLASNRH TGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWSYPLTFGSGTKLEVK
本发明技术的24个不同的人源化A33抗体的产率、稳定性和结合亲和力在图9-11中公开。如图10所示，可变轻链VK4(SEQ ID NO:7)和可变重链VH1(SEQ ID NO:1)的组合对GPA33表现出最高结合亲和力，KD为1.68×10-10M。因此，VK4和VH1被选择用于构建抗GPA33多特异性抗体。
SPR分析。人GPA33(新泽西州萨米特的近岸蛋白质科技有限公司(Novoprotein,Summit,NJ))被固定在CM5芯片上。使用BiacoreTM T100系统(伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗集团(GE Healthcare,Chicago,IL))使五种浓度的2倍连续稀释的huA33IgG1或huA33-BsAb(从20nM开始)流过芯片。在25℃下测量huA33的结合动力学并且在25℃和37℃两者下测量huA33-BsAb的结合动力学。传感器图与两种状态结合模型拟合，以得到动力学参数。
基于IgG-[L]-scFv平台的抗GPA33双特异性抗体的工程化。可变重链和轻链基因序列，即VH1和VK4，被密码子优化、合成并插入到具有人IgG1的恒定区基因(含有N297A和K322A突变)的哺乳动物表达质粒中。抗DOTA scFv或抗CD3 scFv与抗GPA33抗体的轻链的C末端连接。抗GPA33×DOTA双特异性抗体BC015和BC016的HC和LC氨基酸序列和核酸序列如图19-22所示。抗GPA33×CD3抗体的HC和LC氨基酸序列如图28所示。
基于IgG-[L]-scFv平台的异二聚体抗GPA33三特异性抗体的工程化。可变重链和轻链基因序列，即VH1和VK4，被密码子优化、合成并插入到具有人IgG1的恒定区基因(含有N297A和K322A突变)的哺乳动物表达质粒中。抗DOTA scFv或抗CD3 scFv与抗GPA33 VK4 LC的C末端连接。
类似地，抗HER2抗体的可变重链和轻链基因序列被密码子优化、合成并插入到具有人IgG1的恒定区基因(含有N297A和K322A突变)的哺乳动物表达质粒中。携带K409R突变的HER2-HC与携带F405L突变的抗GPA33 VH1 HC形成异二聚体。抗DOTA scFv或抗CD3 scFv与抗HER2 LC的C末端连接。抗GPA33×HER2×DOTA三特异性抗体和3种抗GPA33×HER2×CD3三特异性抗体的HC和LC氨基酸序列分别如图29和图30-32所示。
抗GPA33 SADA多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体的工程化。可变重链和轻链基因序列，即VH1和VK4，被密码子优化、合成并插入到哺乳动物表达质粒中以产生抗GPA33 scFv。人源化C825抗DOTA scFv、OKT3抗CD3 scFv或抗CD276 scFv和p53 SADA结构域中的一个或多个与抗GPA33 scFv的C末端连接。
抗GPA33×抗DOTA SADA多特异性抗体和抗GPA33×抗CD3 SADA多特异性抗体的示例性氨基酸序列如图14-18和23所示。抗GPA33×抗HER2×抗DOTA SADA多特异性抗体和抗GPA33×抗HER2×抗CD3 SADA多特异性抗体的示例性氨基酸序列分别如图24和25所示。抗GPA33×抗CD276×抗DOTA SADA多特异性抗体和抗GPA33×抗CD276×抗CD3 SADA多特异性抗体的示例性氨基酸序列分别如图26和27所示。
生物分布测定。雌性裸鼠在第0天在其右胁腹植入SW1222肿瘤。已建立的肿瘤在第12天用BsAb治疗并且在第14天用DOTA[177Lu](1.85至18.5MBq)治疗。在DOTA[177Lu]施用之后24小时，切除组织进行γ闪烁计数(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))。使用Expi293表达系统(英杰公司)表达含有人源化抗GPA33抗体和人源化抗DOTA抗体的序列的SADA蛋白并通过亲和色谱法(GE，Ni-NTA Gravitrap，目录号11003399)纯化，如Santich等人,用于治疗性2步预靶向的放射免疫疗法的自组装和拆卸(SADA)双特异性抗体(BsAb)平台,《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》(2020)中所描述的。通过尺寸排阻HPLC确认生物化学纯度>90％并通过Biacore和流式细胞术测定抗原结合。在200μL培养基中，用稳定的荧光素酶/GFP转染的SW1222的5×106个细胞腹膜内(i.p.)接种8周大的雌性无胸腺裸鼠。如果在第24天生物发光的所关注的腹膜腔区(ROI)的平均辐射度>1×105p/s/cm2/sr，则将小鼠包含在内。BsAb在第26或27天i.v.注射。符合纳入标准的小鼠静脉内(i.v.)注射GPA33 SADA或非特异性GD2 SADA，在48小时之后i.p.注射1mCi(37MBq)(200pmol)[177Lu]Lu-DOTA-Bn。为了进行比较，向另外的小鼠施用250μg(1.19nmol)GPA33-BsAb(n＝4)，在24小时之后i.v.注射20μg(2.21nmol)CCA16-DOTAY清除剂(CA)并且在另外的4小时之后，i.p.注射1mCi(37MBq)(200pmol)[177Lu]Lu-DOTA-Bn(3步PRIT)。还包含由i.p.注射1mCi(37MBq)(200pmol)[177Lu]Lu-DOTA-Bn组成的非靶向对照。在i.p.注射177Lu放射性半抗原之后24小时，对所有小鼠进行生物分布。在excel上用斯图登氏t检验(Student's t-test)进行统计分析。
与GPA33结合。将人GPA33蛋白溶解于1×PBS中以制备0.2mg/ml储备液并储存在-80℃下。使用胺偶联试剂盒将GPA33蛋白固定在CM5传感器芯片上。用10mM乙酸钠，pH 4.5将GPA33蛋白稀释至10μg/ml。使用Biacore T200控制软件中的固定Wizard将稀释的GPA33以500RU固定在活性表面上。参考表面是空白固定的。在分析之前，将抗体稀释于不同浓度(1.25-2.5-5-10-20nM)的HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中。在37℃下，以30微升/分钟的流速在1分钟内将样品(60μl)注射到传感器表面。在缔合阶段完成之后，在HBS-EP缓冲液中以相同的流速在37℃下监测解离15分钟。在每个循环结束时，使用20mM NaOH以50微升/分钟的流速在2×15秒内再生表面。
将样品注射到活性表面上之后获得的生物传感器曲线与动力学分析之前样品注射到参考表面上获得的对照曲线相减。使用Biacore T200评估软件，用1:1拟合模型拟合所有数据，KD＝kd/ka。
与生物素-175Lu-DOTABn结合。将生物素-175Lu-DOTABn溶解于DMSO中以制备10mg/ml储备液并储存在-80℃下。将生物素-175Lu-DOTABn直接固定在SA传感器芯片上。用HBS-P缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)将生物素-175Lu-DOTABn稀释至200ng/ml，并使用Biacore T200控制软件中的SA固定Wizard以300RU固定在活性表面上。参考表面是空白固定的。
在分析之前，将样品稀释于不同浓度(1.25-2.5-5-10-20nM)的HBS-EP缓冲液中。以30微升/分钟的流速在1分钟内将样品(30μl)注射到传感器表面。在缔合阶段完成之后，在HBS-EP缓冲液中以相同的流速监测解离15分钟。在每个循环结束时，使用6M盐酸胍，pH6.0以30微升/分钟的流速在2×30秒内再生表面。
将样品注射到活性表面之后获得的生物传感器曲线用于动力学分析。使用Biacore T200评估软件，用1:1拟合模型拟合所有数据，KD＝kd/ka。
实例2：GPA33 SADA和GPA33 IgG-[L]-scFv将放射性金属-Bn-DOTA半抗原靶向 GPA33+结肠癌细胞
图9描述了呈IgG形式的24个抗GPA33 LC和HC配对序列的生物化学性质。值得注意的是，新的人源化表达显著优于原始鼠类序列(G3A嵌合)，这表明这些新序列的稳定性得到改善。图10展示了这些序列使用SPR针对重组GPA33的结合动力学。图11展示了这些克隆针对两种GPA33+结肠癌细胞系的细胞结合活性。图1A-1B描述了针对肿瘤抗原GPA33和放射性金属-Bn-DOTA两者具有特异性的不同抗体设计。图1A描绘了针对对放射性金属-Bn-DOTA具有第二特异性的GPA33的自组装和拆卸(SADA)平台。图1B展示了靶向肿瘤抗原GPA33和放射性金属-Bn-DOTA的IgG-[L]-scFv平台。放射性金属-Bn-DOTA可以与放射性同位素螯合或者用作亲和手柄来递送其它有效载荷。
图2A-2D展示了可以在反复的自由和解冻循环以及在37℃或40℃下的延迟的温育之后表达并维持纯度>80％的GPA33×DOTA SADA(TC170、TC171、TC213)和GPA33×DOTAIgG-[L]-scFv(BC015、BC016)的稳定性。图37示出了这些新的GPA33序列如何比形成为SADA-BsAb的替代性GPA33序列(参见图35-36)基本上更稳定。
图3A-3B展示了GPA33×DOTA IgG-[L]-scFv BsAb(BC015、BC016、BC155、TC159、TC160、TC170和TC171)针对肿瘤抗原GPA33(SPR)的结合动力学，并且图38A-38B总结了这些新的IgG-L-scFv或SADA-BsAb形式的GPA33序列的结合动力学，与旧的GPA33克隆BC105、BC155、TC159和TC160(参见图33-36)相比，其显示了结合亲和力的显著提高。图4A-4C和图39总结了TC170、TC171、BC015和BC016的细胞结合活性(FACS)。
与Colo 205细胞系结合。TC170/171分别以0.74和1.04nM的IC50与Colo 205结合，而TC159/160分别以2.46和1.20nM的IC50与Colo 205结合。TC213/234/235以0.53至0.71nM的IC50与Colo 205结合(图4A-4B)。对于所有测试的SADA，通过gMFI测量的最大结合强度(最高SADA BsAb浓度，在该测定中使用的50nM)在100,000至138,000的范围内。尽管如TC170/171和TC159/160配对的IC50所暗示的，VH和VL抗GPA33 scFv取向最低程度地影响靶结合，但是与亲本TC170相比，3pI变体TC213/234/235表现出类似的IC50。
与LS174T细胞系结合。TC170/171分别以0.31和0.56nM的IC50与LS174T结合，而TC159/160分别以1.22和0.56nM的IC50与LS174T结合。TC213/234/235共享类似的IC50(0.22-0.23nM)(图4A-4B)。与Colo 205相比，LS174T表达较低量的表面人GPA33，具有最大结合强度的一半，所有测试的GPA33 SADA表现出类似的gMFI(SADA BsAb浓度，50nM)。尽管如TC170/171和TC159/160配对的IC50所暗示的，VH和VL抗GPA33 scFv取向最低程度地影响靶结合，但是与亲本TC170相比，3pI变体TC213/234/235再次表现出类似IC50。
与SW1222细胞系结合。TC170/171分别以1.65和1.78nM的IC50与SW 1222结合，而TC159/160分别以0.40和0.36nM的IC50与SW 1222结合。TC213/234/235共享类似的IC50(1.02-2.05nM)(图4A-4B)。对于所有测试的SADA，通过gMFI测量的最大结合强度(最高SADABsAb浓度，在该测定中使用的50nM)在17,000至22,000的范围内。尽管如TC170/171和TC159/160配对的IC50所暗示的，VH和VL抗GPA33 scfv取向最低程度地影响靶结合，但是与亲本TC170相比，3pI变体TC213/234/235再次表现出类似的IC50。
总的来说，所有测试的GPA33 SADA显示出与结直肠细胞系类似的IC50和结合强度。抗GPA33 scFv VH和VL取向不会显著修饰靶结合。重要的是，如SPR所示，改变等电点(PI)的TC170(TC213、TC234、TC235)突变不影响结合。另外地，与TC170相比，TC159和TC160显示出降低的结合活性。
GPA33 BsAb与GPA33抗原的结合动力学总结如下：
GPA33 BsAb与生物素-175Lu-DOTABn的结合动力学总结如下：
这些结果证明GPA33 SADA以比GPA33 BsAb-IgG更高的亲和力与GPA33抗原结合。GPA33 scFv的可变重链(VH)和轻链(VL)的取向不影响结合(TC170与TC171)。然而，源自另一克隆的GPA33 scFv似乎与优选的VH和VL取向结合(TC159的亲和力是TC160的亲和力的3倍)。GPA33 scFv内的单个至三个突变不会显著改变结合亲和力(TC170与TC213/234/235)。
类似地，GPA33 SADA与生物素-175Lu-DOTABn结合的亲和力显著高于与GPA33BsAb-IgG结合的亲和力。GPA33 scFv的可变重链(VH)和轻链(VL)的取向不影响(TC170与TC171和TC159与TC160)与生物素-175Lu-DOTABn的结合，因为两种SADA共享相同的C825 scFv序列。与亲本TC170相比，分别在GPA33 scFv中具有双重和三重突变的TC213和TC235与生物素-175Lu-DOTABn似乎具有更弱的结合。TC213和TC235中的C825序列与TC170相同。
图5A-5D示出了SADA和IgG-L-scFv设计两者的体内生物分布，展示了在肿瘤中类似的高摄取和在其它非靶向器官中的低摄取。当与N-乙酰半乳糖胺树突清除剂组合时(描述于Cheal,S.M.等人,《生物共轭化学》31:501-506(2019)中)，BC015(3步)显示出高的治疗指数，与该格式的先前版本一致[Cheal,S.M.等人,《核医学杂志》,201758(11):第1735-1742页，Cheal,S.M.等人,《欧洲核医学和分子成像杂志》,2016 43(5):第925-937页]。然而，TC170在不使用任何清除剂的情况下表现出类似或更好的治疗指数(2步)，简化了临床翻译。
图5D展示了使用TC170的2步方法也优于先前使用BC105的3步方法，这两种方法都靶向腹膜内疾病并减少血液暴露。肿瘤负荷(g)为0.369±0.239(平均±SD)克，通过生物分布获得并且发现其分布在整个腹膜腔，粘附在腹膜衬里和所有腹膜内器官表面。在注射之后24小时，在用SADA-GPA33处理的采集的腹膜内SW1222异种移植肿瘤中吸收的放射性量(4.92±1.59[平均±SD]每克注射剂量百分比[ID/g％])显著大于用传统的3步PRIT至GPA33(2.68±0.179ID/g％，p＝0.043)或用阴性对照SADA-GD2(0.513±0.293ID/g％，p<0.001)处理的采集的肿瘤中吸收的放射性量。在用SADA-GPA33处理的小鼠中，所有器官的肿瘤与器官放射性摄取的比率为19.6±5.08(平均传播误差)(p<0.001)、肾为4.12±0.734(p＝0.002)、肝为30.5±6.14(p<0.001)并且血液为122.8±22.6(p<0.001)。
图6示出了来自用BsAb和177Lu(SPECT)或86Y(PET)处理的小鼠(图6A和6B)或NHP(图6C)的成像数据。重要的是，在使用非人灵长类动物(NHP)的研究中，TC170的肠道摄取明显低于IgG-[L]-scFv形式的GPA33双特异性(BC155，图6C)，这示出了在GPA33天然表达的结肠中有大量摄取。由于该人源化序列与NHP GPA33交叉反应，这表明SADA形式可以显著减少与人体内的正常组织的不希望结合。这可能是由于更快的肾清除率和缺乏与FcRn的结合，通过有限的运输进入肠道的内腔实现的。这表明与常规方法相比，GPA33×DOTA SADA将在人患者体内表现出显著更高的治疗指数。最后，如图6D所示，TC170可以用于治疗腹膜内CRC的小鼠模型中的肿瘤，与使用IgG-L-scFv形式的BsAb的3步方法相比，存活率显著提高。
这些结果表明，本发明技术的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物在用于检测生物样品中的GPA33多肽和治疗有需要的受试者的GPA33(+)癌症的方法中是有用的。
实例3：T细胞参与GPA33 SADA和GPA33 IgG-[L]-scFv
图7A-7B示出了靶向肿瘤上的肿瘤抗原GPA33和T细胞上的CD3的SADA形式和IgG-[L]-scFv形式的双特异性抗体的设计。在这些设计中，T细胞可以被募集到GPA33+肿瘤位点并引发对肿瘤细胞的细胞毒性。另外，在IgG-[L]-scFv GPA33×CD3双特异性抗体中，重链恒定区的N297A和K322A突变通过减少非特异性FcR介导的摄取和限制细胞因子风暴(TC252-TC263(图23)，以及BC369、BC373、BC377(图28))使Fc功能最小化并改善体内生物分布。
使用51Cr释放测定评估细胞毒性。简而言之，将靶细胞与铬酸钠(100μCi/一百万个细胞)温育一小时并与人T细胞(10:1E:T)和连续滴定的BsAb混合，一式三份。在四小时之后，使用γ计数器(珀金埃尔默公司)测量释放的51Cr。使用公式[样品裂解-自发裂解]/[总裂解-自发裂解]计算细胞裂解，其中自发裂解测量来自没有抗体或T细胞的靶细胞的释放的51Cr，并且总裂解测量来自与10％ SDS混合的靶细胞的释放的51Cr。通过从计算的细胞裂解中减去不含BsAb(仅T细胞和靶细胞)的样品的测量释放量来计算特异性裂解。为了计算EC50，使用GraphPad Prism 8的四参数逻辑拟合来拟合曲线。
预期本发明技术的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物将对一种或多种GPA33相关癌症表现出有效的体外和/或体内细胞毒性活性。因此，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症。
实例4：靶向GPA33的多特异性抗体和具有225Ac-PrDOTA PRIT的放射性金属Bn-DOTA
雌性无胸腺裸鼠在第0天在其右胁腹植入SW1222肿瘤。PRIT研究开始于5百万细胞/小鼠接种后约1周。将动物分为以下处理小组：无处理(n＝10)；250μg TC170(n＝30)；250μg BC177(n＝15)；250μg BC105(n＝15)和仅225Ac-PrDOTA(n＝5)。所有动物接受225Ac-PrDOTA的2μCi(0.7nmol)至106kBq/nmol的单循环处理。相对于双特异性抗体BC177(又名BC015)，TC170 SADA构建体显示出对表达A33的SW1222肿瘤的出众体内靶向(图40A)。使用Ac-225变形杆菌属，用BC177、BC105或TC170处理的动物表现出强大的处理功效(图40B)。
构建体 0mm3 至多5mm3 5-10mm3 10-20mm3 >25mm3
TC170 1/25 9/25 7/25 4/25 4/25
BC105 3/10 6/10 1/10
BC177 2/10 2/10 3/10 2/10 1/10
此外，用BC177、BC105或TC170处理的动物均未表现出血液学参数的显著降低，如WBC、RBC、血小板(图40C-40E)等。
这些结果表明，本发明技术的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物表现出针对一种或多种GPA33相关癌症的有效体内细胞毒性活性。因此，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症。
实例5：靶向GPA33的多特异性抗体和具有177Lu-Bn-DOTA PRIT的放射性金属-Bn- DOTA
方法。雌性无胸腺裸鼠(品系：Hsd：无胸腺裸鼠-Foxnlnu，Envigo，6-8周龄，六周龄和八周龄动物的平均体重分别为18.6和21.0g)用于所有实验。在该研究中使用皮下SW1222肿瘤模型(通过卡尺测量约100-500mm3，假设用于计算肿瘤体积的椭球几何形状)。
在开始处理之前2周(第-14天)，向雌性无胸腺裸鼠皮下植入5×106百万个SW1222细胞。在第2天向第1组小鼠给予放射性半抗原177Lu-Bn-DOTA。在第0天向第2组小鼠给予抗体GPA33 BsAb-IgG(BC177)，随后在第2天施用放射性半抗原177Lu-Bn-DOTA之前4小时给予CA(葡聚糖-CA 62.5ug，0.125nmol葡聚糖)。在第0天向第3组和第4组小鼠给予抗体GPA33SADA(TC170)，随后在第2天给予放射半抗原177Lu-Bn-DOTA。
所有注射用试剂在250μL正常无菌等渗盐水溶液(NSS)中调配。对于所有的注射，将小鼠用加热灯温和地加热并放在约束器上。用酒精垫对小鼠的尾巴进行消毒并在侧尾静脉进行单次快速注射。
每周测量一次体重和肿瘤体积，并且每周至少评估三次小鼠的整体健康状况。一旦肿瘤体积达到1,500-2,000mm3，就处死小鼠。在10-14天内观察到已形成的肿瘤(50-500mm3)；肿瘤体积(TV)使用椭圆体积(V)的公式进行估计：V＝4/3π(长度/2×宽度/2×高度/2)，尺寸以毫米为单位。所有试剂通过尾侧静脉进行静脉内施用。
结果。使用GPA33 BsAb和放射性半抗原177Lu-Bn-DOTA，SW1222异种移植肿瘤在所有处理组中消退(图41A-41B)。用GPA33 SADA(TC170)处理的小鼠显示出比GPA33 IgG(BC177)组更快的肿瘤消退和更高的存活率。更重要的是，对于低(1mCi)和高(3mCi)剂量放射半抗原两者，在用TC170处理的小鼠中直到第184天没有肿瘤再生。肿瘤在来自BC177组的一只小鼠中再生并且由于肿瘤中的溃疡而进行安乐死(400mm3)。
这些结果表明，本发明技术的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物表现出针对一种或多种GPA33相关癌症的有效体内细胞毒性活性。因此，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症。
实例6：靶向GPA33的多特异性抗体和具有177Lu-ABD PRIT和225Ac-ABD PRIT的放射 性金属-Bn-DOTA的离体分布
方法。雌性无胸腺裸鼠(品系：Hsd：无胸腺裸鼠-Foxnlnu，Envigo，6-8周龄，六周龄和八周龄动物的平均体重分别为18.6和21.0g)用于所有实验。在该研究中使用皮下SW1222肿瘤模型(通过卡尺测量约100-500mm3，假设用于计算肿瘤体积的椭球几何形状)
分布研究1和2。在开始处理之前2周(第-14天)，向雌性无胸腺裸鼠皮下植入5×106百万个SW1222细胞。在第2天向第1组小鼠给予放射半抗原225Ac-4-氨基苄基-DOTA(ABD)或177Lu-ABD。在第0天向第2-4组小鼠给予抗体GPA33 SADA TC170，随后在第2天给予放射半抗原225Ac-ABD或177LU-ABD。在第1天分别向第5组和第6组小鼠给予抗体GPA33克隆BC177和GPA33克隆BC105 BsAb，随后在第2天施用放射半抗原225Ac-ABD或177LU-ABD之前4小时给予CA(葡聚糖-CA 62.5ug，0.125nmol葡聚糖)。所有注射用试剂在250μL正常无菌等渗盐水溶液(NSS)中调配。对于所有的注射，将小鼠用加热灯温和地加热并放在约束器上。用酒精垫对小鼠的尾巴进行消毒并在侧尾静脉进行单次快速注射。
分布研究3。雌性无胸腺裸鼠不植入任何异种移植物。这些无肿瘤小鼠在7-9周龄时使用。在第2天向第1组小鼠给予放射性半抗原177Lu-ABD。在第0天向第2组小鼠给予抗体GPA33 BsAb-IgG(BC177)，随后在第2天施用放射半抗原177Lu-ABD之前4小时给予CA(葡聚糖-CA 62.5ug，0.125nmol葡聚糖)。在第0天向第3至6组小鼠给予抗体GPA33 SADA(TC170、TC213、TC234和TC235)，随后在第2天给予放射半抗原177Lu-ABD。所有注射用试剂在250μL正常无菌等渗盐水溶液(NSS)中调配。对于所有的注射，将小鼠用加热灯温和地加热并放在约束器上。用酒精垫对小鼠的尾巴进行消毒并在侧尾静脉进行单次快速注射。
生物分布实验。对于放射性半抗原注射之后的生物分布测定，通过CO2(g)窒息对小鼠实施安乐死并且采集肿瘤和选定的器官，用PBS冲洗并风干，称重，并通过γ闪烁计数(珀金埃尔默公司Wallac Wizard 3”)进行放射性测定。对计数率进行背景和衰变校正，使用特定于同位素的系统校准因子将其转换为活性，根据施用的活性进行归一化，并表示为每克组织的注射活性百分比(IA/g％)。对于225Ac，使用150至600keV的能量窗口对每个样品计数至多10分钟(当达到长期平衡时收集之后24小时)。
结果。在分布研究1中，并排比较了使用SW 1222异种移植小鼠用GPA33 SADA(TC170)和GPA33 BsAb-IgG(BC105和BC177)处理的小鼠中的225Ac-ABD的生物分布(图42A-42B)。使用100μg、250μg和500μg的三种不同剂量的GPA33 SADA(TC170)来研究剂量和225Ac-ABD-组织摄取关系。在TC170处理的2步PRIT方案中，首先施用抗体，随后在48小时之后施用225Ac-ABD。在BC105和BC177处理的3步PRIT方案中，首先施用抗体，随后在24小时之后施用CA-葡聚糖，并且最后在CA-葡聚糖注射之后4小时施用225Ac-ABD。
与100μg和500μg组相比，250μg TC170处理的小鼠表现出最高的225Ac-ABD肿瘤摄取。100μg、250μg和500μg TC170组的血液活性分别为0.58、2.00和7.55ID/g％。100μg、250μg、500μg TC170组的肾中的225Ac-ABD分别为4.32、15.45和33.99。100μg TC170组虽然在血液和肾中具有最低的225Ac活性，但这些小鼠的肿瘤摄取是250μg组的一半。500μg TC170组虽然在血液和肾中具有最高的225Ac活性，但这些小鼠显示出与250μg组类似的肿瘤摄取(图42A)。
图42A示出了是3步GPA33 BsAb-IgG(BC105)PRIT的肿瘤摄取的6倍的2步TC170处理的小鼠中的225Ac。在2步TC170和3步BC177处理组中，225Ac-ABD的肿瘤摄取是相当的。然而，BC177处理的小鼠中的血液活性(4.51)是TC170组的血液活性(2.00)的2倍。相反，BC177处理的小鼠的225Ac-ABD的肾摄取(3.09)是TC170组的225Ac-ABD的肾摄取(15.45)的1/5。
在分布研究2中，使用相同的实验方案，用177LU-ABD作为放射性半抗原重复用225Ac-ABD处理的动物研究(图43A-43B)。与100μg(7.738)和250μg(15.94)组相比，500μgTC170组明显表现出最高177Lu-ABD的肿瘤摄取(28.8)(图43A)。所有3组的血液177Lu活性低于0.2。该观察结果与在500μg TC170组中发现的7.55的高血液225Ac活性形成对比。100μg(0.95)、250μg(1.07)和500μg(3.268)TC170组的177Lu-ABD的肾摄取表明250μg剂量比500μg剂量更耐受。100μg(8.15)、250μg(14.85)和500μg(8.82)TC170组的肿瘤与肾177Lu-ABD摄取比率表明最佳剂量为250μg。
图43A示出了不管方案(2步骤与3步骤)和克隆差异如何，177Lu-ABD的肿瘤摄取没有差异。所有3组的血液177Lu活性低于0.1。与3步250μg 3步BC105(肾，0.45和大肠，0.88)和BC177(肾，0.57和大肠，1.38)处理的小鼠相比，2步250μg TC170处理的小鼠表现出更高的177Lu-ABD的肾(1.07)和大肠(2.46)摄取。
在分布研究3中，在无肿瘤裸鼠中进行177Lu-ABD分布的离体监测(图44)。所有组的血液177Lu活性很低(<0.58)。177Lu-ABD的肝和脾摄取分别小于0.74和0.42。各组间177Lu-ABD的肾滞留量不同。在3步BC177(0.36)和2步TC170(0.58)处理的小鼠中，177Lu-ABD的肾摄取较低，其中均低于177Lu-ABD的1ID/g％的推荐阈值水平。与亲本TC170 pI为8.46相比，用pI估计为8.03的单一突变的TC234处理的小鼠显示在1时的177Lu-ABD的肾摄取显著增加。用pI分别估计为7.81和7.56的TC213和TC235处理的小鼠显示肾中的177Lu-ABD为1.94和5.12ID/g％。这些数据证实了抗体pI和肾中的生物分布之间的关系。
这些结果表明，本发明技术的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物表现出针对一种或多种GPA33相关癌症的有效体内细胞毒性活性。因此，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症
实例7：靶向GPA33、HER2和放射性金属-Bn-DOTA或T细胞的多特异性SADA抗体
图8A-8B展示了使用多特异性SADA形式(图8A)或异二聚体IgG-[L]-scFv(图8B)靶向GPA33和如HER2等另一种肿瘤抗原的多特异性抗体的设计。这些可以用于提高特异性，仅靶向共表达GPA33和如HER2或B7H3等第二肿瘤抗原的细胞，或者其可以提高对已经失去或下调GPA33表达但仍保留如HER2或B7H3等其它肿瘤标志物的异质性肿瘤的靶向。这两种设计可以与DOTA或CD3特异性组合，以靶向可以将辐射或T细胞递送到靶向的肿瘤位点(TC264-TC281(图24-27)、HD152、HD156、HD160和HD164(图29-32))的放射性金属Bn-DOTA。
雌性裸鼠在第0天在其右胁腹植入SW1222肿瘤。已建立的肿瘤在第12天用SADA抗体治疗并且在第14天用DOTA[177Lu](1.85至18.5MBq)治疗。在DOTA[177Lu]施用之后24小时，切除组织进行γ闪烁计数(珀金埃尔默公司)。
预期本发明技术的抗GPA33免疫球蛋白相关组合物将对一种或多种GPA33相关癌症表现出有效的体外和/或体内细胞毒性活性。因此，本发明技术的免疫球蛋白相关组合物可用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症。
等效物
本发明技术不限于本申请中所描述的特定实施例，这些特定实施例旨在作为本发明技术的单个方面的单独绘示。在不脱离本发明技术的精神和范围的情况下，可以对本发明的技术进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。根据以上描述，除了本文所列举的那些方法和装置之外，在本发明技术的范围内的在功能上等效的方法和装置对本领域技术人员而言将是显而易见的。此类修改和变化旨在落入本发明技术的范围内。应当理解，本发明技术不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然，所述特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。
另外，在按照马库什(Markush)组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也由此按照马库什组中的任何单独成员或成员子组进行描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文所公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为是充分地描述和使能被分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等的相同范围。作为非限制性实例，本文中所讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包含列出的数字并且是指随后可以被分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解，范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1个、2个或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞的组，等等。
在本文中提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物在其不与本说明书中的明确教导不一致的程度上以全文引用的方式并入本文中，包含所有附图和表格。

Claims (70)

1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中：(a)所述VH包括SEQ ID NO:1-3中的任一个的氨基酸序列；和/或(b)所述VL包括SEQ ID NO:4-10中的任一个的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包括选自由以下组成的组的同种型的Fc结构域：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE。
3.根据权利要求2所述的抗体，其包括IgG1恒定区，所述IgG1恒定区包括一个或多个选自由N297A和K322A组成的组的氨基酸取代。
4.根据权利要求2所述的抗体，其包括IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包括S228P突变。
5.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列的GPA33多肽结合。
7.根据权利要求1至4或6中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。
8.一种抗体，其包括：包含以下的重链(HC)氨基酸序列：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:79或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体；和/或包含以下的轻链(LC)氨基酸序列：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
9.根据权利要求8所述的抗体，其分别包括选自由以下组成的组的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:21(BC015(G3A H1L4))；SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:25(BC016(G3A H3L3))；SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:59(BC369(G3A H1L4 huOKT3))；SEQID NO:62和SEQ ID NO:61(BC373(G3A H1L4 huOT3H2L2))；以及SEQ ID NO:64和SEQ IDNO:63(BC377(G3A H1L4 huOT3 H2L4))。
10.一种抗体，其分别包括选自由以下组成的组的第一HC氨基酸序列、第二HC氨基酸序列、第一LC氨基酸序列和第二LC氨基酸序列：SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66(HD152)；SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70(HD156)；SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74(HD160)；以及SEQID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78(HD164)。
11.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:4-10中的任一个至少95％或至少99％相同的VL序列；和/或(b)与SEQ ID NO:1-3中的任一个至少95％或至少99％相同的VH序列。
12.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:77中存在的轻链序列至少95％或至少99％相同的轻链序列；和/或(b)与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:79中存在的重链序列至少95％或至少99％相同的重链序列。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的抗体，其中所述抗体与包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列的GPA33多肽结合。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括IgG1恒定区，所述IgG1恒定区包括一个或多个选自由N297A和K322A组成的组的氨基酸取代。
16.根据权利要求8至14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包括S228P突变。
17.一种多特异性抗体或抗原结合片段，其包括与选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19或29-58中的任一个的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19或29-58中的任一个的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至4或6至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
20.一种多特异性抗原结合片段，其包括第一多肽链，其中：
所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：
i.能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的重链可变结构域；
ii.包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；
iii.所述第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；
iv.包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；
v.能够与第二表位特异性结合的第二免疫球蛋白的重链可变结构域；
vi.包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；
vii.所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域；
viii.包括氨基酸序列TPLGDTTHT的柔性肽连接子序列；以及
ix.自组装拆卸(SADA)多肽；
其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
21.一种多特异性抗原结合片段，其包括第一多肽链，其中：
所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：
i.能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；
ii.包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；
iii.所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域；
iv.包括氨基酸序列(GGGGS)4的柔性肽连接子；
v.能够与第二表位特异性结合的第二免疫球蛋白的重链可变结构域；
vi.包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子；
vii.所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域；
viii.包括氨基酸序列TPLGDTTHT的柔性肽连接子序列；以及
ix.自组装拆卸(SADA)多肽；
其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自SEQ ID NO:1-3中的任一个，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域或所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自SEQ ID NO:4-10中的任一个。
22.根据权利要求20或21所述的多特异性抗原结合片段，其中所述SADA多肽包括四聚化、五聚化或六聚化结构域。
23.根据权利要求22所述的多特异性抗原结合片段，其中所述SADA多肽包括p53、p63、p73、hnRNPC、SNA-23、Stefin B、KCNQ4或CBFA2T1中的任一个的四聚化结构域。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的多特异性抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19或29-58的氨基酸序列。
25.一种多特异性抗体，其包括第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链彼此共价键合，所述第二多肽链和所述第三多肽链彼此共价键合，并且所述第三多肽链和所述第四多肽链彼此共价键合，并且其中：
a.所述第一多肽链和所述第四多肽链中的每一个在N末端至C末端方向上包括：
i.能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域；
ii.所述第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域；
iii.包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及
iv.与第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域连接的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域，或与第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域连接的所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域，其中所述第二免疫球蛋白的所述轻链可变结构域和所述重链可变结构域能够与第二表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；并且
b.所述第二多肽链和所述第三多肽链中的每一个在N末端至C末端方向上包括：
i.能够与所述第一表位特异性结合的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域；以及
ii.所述第一免疫球蛋白的重链恒定结构域；并且
其中所述第一免疫球蛋白的所述重链可变结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1-3，和/或所述第一免疫球蛋白的所述轻链可变结构域选自由以下组成的组：SEQID NO:4-10。
26.根据权利要求7、12、17、18或20至25中任一项所述的多特异性抗体或多特异性抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与以下结合：CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、CD32、CD64、TCRγ/δ、NKp46、KIR、PD-1、PD-L1、LAG3、CD28、B7H3、STEAP1、HER2、EGFR、CEA、CECAM5、转铁蛋白受体、FAP、NKG2D-配体、TRAIL、FasL、组织蛋白酶G、颗粒酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、DOTA(金属)络合物、苄基-DOTA(金属)络合物、变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、NOGADA-变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、星-DFO(金属)络合物、DFO(金属)络合物或小分子DOTA半抗原。
27.根据权利要求7、12、17、18或20至26中任一项所述的多特异性抗体或多特异性抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与T细胞、B细胞、髓系细胞、浆细胞或肥大细胞结合。
28.一种异二聚体多特异性抗体，其包括第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链彼此共价键合，所述第二多肽链和所述第三多肽链彼此共价键合，并且所述第三多肽链和所述第四多肽链，并且其中：
(a)所述第一多肽链在N末端至C末端方向上包括：
(i)能够与第一表位特异性结合的第一免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-1)；
(ii)所述第一免疫球蛋白的轻链恒定结构域(CL-1)；
(iii)包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及
(iv)与第二免疫球蛋白的互补重链可变结构域(VH-2)连接的所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-2)，或与第二免疫球蛋白的互补轻链可变结构域(VL-2)
连接的所述第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-2)，其中VL-2和VH-2能够与第二表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；
(b)第二多肽在N末端至C末端方向上包括：
(i)能够与所述第一表位特异性结合的所述第一免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-1)；
(ii)所述第一免疫球蛋白的第一CH1结构域(CH1-1)；以及
(iii)所述第一免疫球蛋白的第一异二聚化结构域，其中所述第一异二聚化结构域不能与另一个第一异二聚化结构域一起形成稳定的同二聚体；
(c)第三多肽在N末端至C末端方向上包括：
(i)能够与第三表位特异性结合的第三免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-3)；
(ii)所述第三免疫球蛋白的第二CH1结构域(CH1-3)；以及
(iii)所述第三免疫球蛋白的第二异二聚化结构域，其中所述第二异二聚化结构域包括不同于所述第一免疫球蛋白的所述第一异二聚化结构域的氨基酸序列或核酸序列，其中所述第二异二聚化结构域不能与另一个第二异二聚化结构域一起形成稳定的同二聚体，并且其中所述第三免疫球蛋白的所述第二异二聚化结构域被配置成与所述第一免疫球蛋白的所述第一异二聚化结构域一起形成异二聚体；
(d)第四多肽在N末端至C末端方向上包括：
(i)能够与所述第三表位特异性结合的所述第三免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-3)；
(ii)所述第三免疫球蛋白的轻链恒定结构域(CL-3)；
(iii)包括氨基酸序列(GGGGS)3的柔性肽连接子；以及
(iv)与第四免疫球蛋白的互补重链可变结构域(VH-4)连接的所述第四免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL-4)，或与第四免疫球蛋白的互补轻链可变结构域(VL-4)连接的所述第四免疫球蛋白的重链可变结构域(VH-4)，其中VL-4和VH-4能够与第四表位特异性结合，并且通过包括氨基酸序列(GGGGS)6的柔性肽连接子连接在一起以形成单链可变片段；
其中VL-1和/或VL-3包括选自SEQ ID NO:4-10中的任一个的VL氨基酸序列，并且其中VH-1和/或VH-3包括选自SEQ ID NO:1-3中的任一个的VH氨基酸序列。
29.根据权利要求28所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体与GPA33和以下中的至少一种结合：CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、CD32、CD64、TCRγ/δ、NKp46、KIR、PD-1、PD-L1、LAG3、CD28、B7H3、STEAP1、HER2、EGFR、CEA、CECAM5、转铁蛋白受体、FAP、NKG2D-配体、TRAIL、FasL、组织蛋白酶G、颗粒酶、羧肽酶、β-内酰胺酶、DOTA(金属)络合物、苄基-DOTA(金属)络合物、变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、NOGADA-变形杆菌属-DOTA(金属)络合物、星-DFO(金属)络合物、DFO(金属)络合物或小分子DOTA半抗原。
30.根据权利要求28或29所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体与T细胞、B细胞、髓系细胞、浆细胞或肥大细胞结合。
31.一种重组核酸序列，其编码根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
32.一种重组核酸序列，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26和28。
33.一种宿主细胞或载体，其包括根据权利要求31或权利要求32所述的重组核酸序列。
34.一种组合物，其包括根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段以及药学上可接受的载体，其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自由以下组成的组的药剂缀合：同位素、染料、发色团、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
35.一种用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述GPA33相关癌症是结直肠癌、T细胞白血病、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌或胃癌。
37.根据权利要求35至36中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段与另外的治疗剂单独、依序或同时施用于所述受试者。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述另外的治疗剂是以下中的一种或多种：烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、细胞抑制生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、双膦酸盐治疗剂、T细胞或免疫调节/刺激抗体。
39.一种用于在体内检测受试者的肿瘤的方法，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段被配置成定位于表达GPA33的肿瘤并且用放射性同位素标记；以及
(b)通过检测由所述抗体或抗原结合片段发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者的肿瘤的存在。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述受试者被诊断患有或疑似患有癌症。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中由所述抗体或抗原结合片段发射的所述放射性水平是使用正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描检测的。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包括与放射性核素缀合的根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述放射性核素是α颗粒发射同位素、β颗粒发射同位素、俄歇发射器(Auger-emitter)或其任何组合。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述β颗粒发射同位素选自由以下组成的组：86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。
45.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及使用说明书。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中所述抗体或抗原结合片段与至少一种选自由以下组成的组的可检测标记偶联：放射性标记、荧光标记和显色标记。
47.根据权利要求45或46所述的试剂盒，其进一步包括与根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或抗原特异性结合的次级抗体。
48.根据权利要求7、12、17、18或20至30中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述多特异性抗体至少与放射性标记的DOTA半抗原和GPA33抗原结合。
49.一种用于选择受试者用于预靶向放射免疫疗法的方法，所述方法包括：
(a)向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和根据权利要求48所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述复合物被配置成定位于表达GPA33的肿瘤；
(b)检测由所述复合物发射的放射性水平；以及
(c)当由所述复合物发射的所述放射性水平高于参考值时，选择所述受试者用于预靶向放射免疫疗法。
50.一种用于增加被诊断患有GPA33相关癌症的受试者的肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和根据权利要求48所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述复合物被配置成定位于表达GPA33的肿瘤。
51.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的复合物，所述复合物包括放射性标记的DOTA半抗原和根据权利要求48所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述复合物被配置成定位于表达GPA33的肿瘤。
52.一种用于增加被诊断患有GPA33相关癌症的受试者的肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括：
(a)施用有效量的根据权利要求48所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中
所述多特异性抗体或抗原结合片段被配置成定位于表达GPA33的肿瘤；以及
(b)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置成与所述多特异性抗体或抗原结合片段结合。
53.一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)施用有效量的根据权利要求48所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中
所述多特异性抗体或抗原结合片段被配置成定位于表达GPA33的肿瘤；以及
(b)向所述受试者施用有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置成与所述多特异性抗体或抗原结合片段结合。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其进一步包括在施用所述放射性标记的DOTA半抗原之前，向所述受试者施用有效量的清除剂。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
56.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述复合物通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服、肿瘤内或鼻内施用。
57.根据权利要求49至56中任一项所述的方法，其中所述放射性标记的DOTA半抗原包括α颗粒发射同位素、β颗粒发射同位素或俄歇发射器。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的方法，其中所述放射性标记的DOTA半抗原包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu。
59.根据权利要求7、12、17、18或20至30中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中所述多特异性抗体至少与CD3和GPA33抗原结合。
60.一种离体武装T细胞，其用有效量的根据权利要求59所述的多特异性抗体涂覆或与其复合，其中所述多特异性抗体包含CD3结合结构域。
61.根据权利要求60所述的离体武装T细胞，其中所述多特异性抗体是包括两条重链和两条轻链的免疫球蛋白，其中所述轻链中的每条轻链与单链可变片段(scFv)融合，并且其中所述多特异性抗体的至少一个scFv包括所述CD3结合结构域。
62.一种用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求60或61所述的离体武装T细胞。
63.根据权利要求7或12所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括两条相同的重链和两条相同的轻链，所述轻链是第一轻链和第二轻链，其中所述第一轻链通过肽连接子与第一单链可变片段(scFv)融合以产生第一轻链融合多肽，并且其中所述第二轻链通过肽连接子与第二scFv融合以产生第二轻链融合多肽，其中所述第一scFv与所述第一轻链的羧基端融合，并且其中所述第二scFv与所述第二轻链的羧基端融合。
64.根据权利要求63所述的双特异性抗体，其中所述第一scFv和所述第二scFv相同，并且其中所述第一轻链融合多肽和所述第二轻链融合多肽相同。
65.根据权利要求63或64所述的双特异性抗体，其中所述免疫球蛋白与GPA33结合，并且所述第一scFv和所述第二scFv与CD3结合。
66.一种用于治疗有需要的受试者的GPA33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求63至65中任一项所述的双特异性抗体。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述GPA33相关癌症是结直肠癌、T细胞白血病、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌或胃癌。
68.根据权利要求66至67中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体与另外的治疗剂单独、依序或同时施用于所述受试者。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述另外的治疗剂是以下中的一种或多种：烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香化酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、细胞抑制生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、双膦酸盐治疗剂、T细胞或免疫调节/刺激抗体。
70.根据权利要求17、18、20至24或26至27中任一项所述的多特异性抗体或抗原结合片段，其中当所述抗体或抗原结合片段静脉内或腹膜内施用于受试者时，所述抗体或抗原结合片段不会穿过肠上皮或肠腔。
CN202180090807.7A 2020-11-18 2021-11-17 抗gpa33多特异性抗体和其用途 Pending CN117794568A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063115326P 2020-11-18 2020-11-18
US63/115,326 2020-11-18
PCT/US2021/059634 WO2022108976A2 (en) 2020-11-18 2021-11-17 Anti-gpa33 multi-specific antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117794568A true CN117794568A (zh) 2024-03-29

Family

ID=81709651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180090807.7A Pending CN117794568A (zh) 2020-11-18 2021-11-17 抗gpa33多特异性抗体和其用途

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240026037A1 (zh)
EP (1) EP4247426A2 (zh)
CN (1) CN117794568A (zh)
AU (1) AU2021381768A1 (zh)
CA (1) CA3199320A1 (zh)
WO (1) WO2022108976A2 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3238399A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 Torben LUND-HANSEN Scfv and antibodies with reduced multimerisation
CN117384286A (zh) * 2022-03-03 2024-01-12 南京融捷康生物科技有限公司 针对gpa33的单域抗体及其衍生蛋白和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3049189A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 Yamaguchi University Anti-gpc3 antibody
WO2018204873A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Modular self assembly disassembly (sada) technologies
CN111372590A (zh) * 2017-09-23 2020-07-03 纪念斯隆-凯特林癌症中心 A33抗体组合物及在放射免疫疗法中使用其的方法
CA3121168A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Heterodimeric tetravalency and specificity antibody compositions and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20240026037A1 (en) 2024-01-25
CA3199320A1 (en) 2022-05-27
AU2021381768A1 (en) 2023-06-22
WO2022108976A3 (en) 2022-09-15
EP4247426A2 (en) 2023-09-27
WO2022108976A2 (en) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11555072B2 (en) A33 antibody compositions and methods of using the same in radioimmunotherapy
US20240002501A1 (en) Anti-l1-cam antibodies and uses thereof
US20230212289A1 (en) Anti-cd3 antibodies and uses thereof
US20220348686A1 (en) Anti-steap1 antibodies and uses thereof
CA3133074A1 (en) Cd22 antibodies and methods of using the same
CN114341176A (zh) Cd19抗体及其使用方法
CN114502584A (zh) Cd33抗体和使用所述抗体治疗癌症的方法
US20220251192A1 (en) Anti-cd33 antibodies for treating cancer
US20240026037A1 (en) Anti-gpa33 multi-specific antibodies and uses thereof
US20230279152A1 (en) Anti-claudin 18.2 multi-specific antibodies and uses thereof
CN112566642A (zh) 抗聚唾液酸抗体及其用途
US20220242967A1 (en) Anti-glypican-3 antibodies and uses thereof
CN116529264A (zh) 抗claudin 18.2多特异性抗体及其用途
US20230374150A1 (en) Anti-psma antibodies and uses thereof
CA3235788A1 (en) Anti-tshr multi-specific antibodies and uses thereof
WO2024031009A2 (en) Anti-cd24 antibodies and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination