CN111372590A - A33抗体组合物及在放射免疫疗法中使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开文本总体上涉及可以与A33蛋白结合并中和其活性的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)。本技术的抗体可用于检测和治疗有需要的受试者中A33阳性癌症的方法。

Description

A33抗体组合物及在放射免疫疗法中使用其的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月23日提交的美国临时专利申请号62/562,373和2017年9月23日提交的美国临时专利申请号62/562,374的权益和优先权，将这些申请的内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本技术总体上涉及特异性地结合A33蛋白的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)的制备以及所述免疫球蛋白相关组合物的用途。具体地，本技术涉及A33中和抗体的制备以及所述抗体在检测和治疗A33相关癌症中的用途。
背景技术
下文提供对本技术背景的说明仅仅是为了帮助理解本技术，并且不承认所述说明描述或构成针对本技术的现有技术。
结肠直肠癌(CRC)是美国癌症死亡的第3大原因(Siegel RL,Miller KD,Jemal A,CA:A Cancer Journal for Clinicians 67:7-30(2017))，并且占全球男性所有癌症的10％以及女性所有癌症的9.2％(Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,等人,International Journal of Cancer 136:E359-E386(2015))。尽管从2004年到2013年，发病率每年稳步下降3％，但仅在美国，预期2017年就有135,000例新病例。虽然局部和区域性疾病是可以治愈的，但转移性CRC(mCRC)的预后很差，其5年生存率仅有14％(Siegel RL,Miller KD,Jemal A,CA:A Cancer Journal for Clinicians 67:7-30(2017))。
mCRC的标准治疗由化疗结合阻断肿瘤信号传导或血管生成的单克隆抗体组成。目前FDA已经批准四种单克隆抗体药物用于CRC治疗：贝伐单抗和雷莫芦单抗靶向VEGF-VEGFR血管生成途径，而西妥昔单抗和帕尼单抗靶向EGFR途径。然而，西妥昔单抗和帕尼单抗并不能为伴有RAS突变的mCRC提供临床益处(Van Cutsem E,Cervantes A,Adam R,等人,Annalsof Oncology 27:1386-1422(2016))，所述RAS突变发现于在所有mCRC的约40％中(Bencsikova B,Bortlicek Z,Halamkova J,等人,BMC Gastroenterology 15:37(2015))。此外，这些抗体对生存率的改善一般不大(Peeters M等人,Journal of ClinicalOncology 28:4706-4713(2010)；Cutsem EV等人,Journal of Clinical Oncology 29:2011-2019(2011)；Saltz LB等人,Journal of Clinical Oncology 26:2013-2019(2008))，并且可能与严重的副作用相关。免疫检查点抑制剂(ICI)的益处局限于具有微卫星不稳定性(MSI)的CRC患者的子集。然而，大多数患有mCRC的患者是微卫星稳定的(MSS)，并且因此预期他们不会从ICI单一疗法中获益。迄今为止，使用抗体将毒素靶向到肿瘤，例如使用直接缀合抗体的放射免疫疗法(RIT)，部分由于次最佳的肿瘤剂量和治疗指数(TI)，获得了有限的成功。此外，由于正常组织的旁观者毒性，剂量递增是不可行的，并且因此这种疗法导致有限的抗肿瘤效果。
发明内容
在一个方面，本公开文本提供了包含重链免疫球蛋白可变区(VH)和轻链免疫球蛋白可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中(a)VH包含FTFSTYDMS(SEQ ID NO:37)的VH-CDR1序列、TISSGGSYTYYLDSVKG(SEQ ID NO:38)的VH-CDR2序列和TTVVPFAY(SEQ ID NO:39)的VH-CDR3序列；和/或(b)VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：KASQNVRTVVA(SEQ ID NO:40)、LASNRHT(SEQ ID NO:41)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)；KASQNVRTVVA(SEQ ID NO:40)、LASDRHT(SEQ ID NO:43)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)；KASQNVRTLVA(SEQ ID NO:44)、LASNRHT(SEQ ID NO:41)和QHWSYPLT(SEQ ID NO:45)；以及KASQNVRTLVA(SEQ ID NO:44)、LASNRHT(SEQ ID NO:41)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)。
所述抗体可以进一步包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。在一些实施方案中，所述抗体包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体包含含有S228P突变的IgG4恒定区。在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与A33蛋白的表位结合，所述表位包含SEQID NO:57的至少五至八个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。
在另一个方面，本公开文本提供了抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62的重链(HC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体，和/或含有SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63的轻链(LC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。在某些实施方案中，所述抗体包含分别选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9(3A3-H1/L1)；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10(3A3-H1/L2)；SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9(3A3-H2/L1)；SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10(3A3-H2/L2)；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17(huA33-IgG1(H2L2))；SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21(huA33-BsAb)；SEQ ID NO:23和SEQID NO:24(克隆31)；SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(克隆32)；SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28(克隆48)；SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(克隆49)；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(克隆53)；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34(克隆56)；SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36(克隆57)；SEQID NO:58和SEQ ID NO:60(huA33-huC825)；和SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63(huA33-mC825)。
在一个方面，本公开文本提供了抗体，其包含(a)与SEQ ID NO:9、10、17、21、24、26、28、30、32、34、36、60或63中任何一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或(b)与SEQ ID NO:5、6、15、19、23、25、27、29、31、33、35、58或62中任何一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。
在另一个方面，本公开文本提供了抗体，其包含(a)与SEQ ID NO:9、10、17、21、24、26、28、30、32、34、36、60或63中任何一个中存在的LC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的LC序列；和/或(b)与SEQ ID NO:5、6、15、19、23、25、27、29、31、33、35、58或62中任何一个中存在的HC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的HC序列。
在上述实施方案中的任何一个中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。在某些实施方案中，本技术的抗体包含含有S228P突变的IgG4恒定区。在上述实施方案中的任何一个中，所述抗体与A33蛋白的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:57的至少五至八个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。另外地或可替代地，在一些实施方案中，本技术的抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
在一个方面，本公开文本提供了编码本文所述的任何抗体的重组核酸序列。在一些实施方案中，所述重组核酸序列选自：SEQ ID NO:7、8、11、12、16、18、20、22、59和61。
在另一个方面，本公开文本提供了包含本文公开的任何重组核酸序列的宿主细胞或载体。
在一个方面，本公开文本提供了组合物，所述组合物包含本技术的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体，其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原(chromagen)、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
在本技术的双特异性抗体的一些实施方案中，所述双特异性抗体与T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述双特异性抗体与CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR或小分子DOTA半抗原结合。所述小分子DOTA半抗原可以选自DOTA、DOTA-Bn、DOTA-去铁胺、DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2、Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2；DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2、Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2、Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2、Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2和Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
在另一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者中的A33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的本文公开的任何一种抗体。在某些实施方案中，所述抗体包含分别选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9(3A3-H1/L1)；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10(3A3-H1/L2)；SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9(3A3-H2/L1)；SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10(3A3-H2/L2)；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17(huA33-IgG1(H2L2))；SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21(huA33-BsAb)；SEQ ID NO:23和SEQID NO:24(克隆31)；SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(克隆32)；SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28(克隆48)；SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(克隆49)；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(克隆53)；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34(克隆56)；SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36(克隆57)；SEQID NO:58和SEQ ID NO:60(huA33-huC825)；以及SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63(huA33-mC825)，其中所述抗体与A33特异性地结合并中和A33活性。
在一些实施方案中，A33相关癌症是结肠直肠癌、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌或胃癌。A33相关癌症可以是具有MSI基因型或MSS基因型的结肠直肠癌。另外地或可替代地，在一些实施方案中，结肠直肠癌与KRAS G12D突变或p53突变相关。
另外地或可替代地，在所述方法的一些实施方案中，将所述抗体与另外的治疗剂分开地、顺序地或同时给予至所述受试者。另外的治疗剂的例子包括以下中的一种或多种：烷基化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、抑制细胞的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、二膦酸盐治疗剂。
在另一个方面，本公开文本提供了用于在体内检测受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的本技术的抗体，其中所述抗体被配置为定位于表达A33的肿瘤，并用放射性同位素标记；以及(b)通过检测由所述抗体发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中肿瘤的存在。在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有或怀疑患有癌症。可以使用正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机断层摄影术检测由所述抗体发射的放射性水平。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者给予有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与放射性核素缀合的本技术的抗体。在一些实施方案中，所述放射性核素是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇(Auger)发射体或其任何组合。发射β粒子的同位素的例子包括86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。在所述方法的一些实施方案中，正常组织中非特异性FcR依赖性结合被消除或减少(例如，经由Fc区中的N297A突变，其导致去糖基化)。
本文还公开了用于检测和/或治疗A33相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能性变体(例如，取代变体)以及使用说明书。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白相关组合物与一种或多种可检测标记偶联。在一个实施方案中，所述一种或多种可检测标记包括放射性标记、荧光标记或发色标记。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含与本文所述的抗A33免疫球蛋白相关组合物特异性地结合的二抗。在一些实施方案中，所述二抗与选自放射性标记、荧光标记或发色标记的至少一种可检测标记偶联。
在一个方面，本公开文本提供了用于检测有需要的受试者中的实体肿瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原以及与所述放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原结合的本技术的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达由所述复合物的双特异性抗体识别的A33抗原的实体肿瘤；和(b)通过检测由所述复合物发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中实体肿瘤的存在。
在另一个方面，本公开文本提供了用于选择受试者进行预靶向放射免疫疗法的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原以及与所述放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原结合的本技术的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达由所述复合物的双特异性抗体识别的A33抗原的实体肿瘤；(b)检测由所述复合物发射的放射性水平；和(c)当由所述复合物发射的放射性水平高于参考值时，选择所述受试者进行预靶向放射免疫疗法。
在一个方面，本公开文本提供了用于在被诊断为A33阳性癌症的受试者中增加肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原以及识别并结合所述放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原靶标的本技术的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达由所述复合物的双特异性抗体识别的A33抗原靶标的肿瘤。
在另一个方面，本公开文本提供了用于治疗有需要的受试者中癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原以及识别并结合所述放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原靶标的本技术的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达由所述复合物的双特异性抗体识别的A33抗原靶标的肿瘤。
在本文公开方法的上述实施方案中的任何一个中，所述复合物通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内给予。在本文公开方法的一些实施方案中，受试者是人。另外地或可替代地，在本文公开方法的上述实施方案中的任何一个中，所述放射性标记的DOTA半抗原包含213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu，并且任选地包含发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素或俄歇发射体。
在一个方面，本公开文本提供了用于在被诊断为A33阳性癌症的受试者中增加肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的本技术的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位于表达A33抗原靶标的肿瘤；和(b)向所述受试者给予有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置为结合所述抗DOTA双特异性抗体。在另一个方面，本公开文本提供了用于治疗有需要的受试者中癌症的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的本技术的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位于表达A33抗原靶标的肿瘤；和(b)向所述受试者给予有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置为结合所述抗DOTA双特异性抗体。在一些实施方案中，本技术的方法进一步包括在给予放射性标记的DOTA半抗原之前，向所述受试者给予有效量的清除剂。
另外地或可替代地，在本文公开方法的上述实施方案中的任何一个中，所述放射性标记的DOTA半抗原包含213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu，并且任选地包含发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素或俄歇发射体。在本文公开方法的上述实施方案中的任何一个中，受试者是人。
附图说明
图1(A)显示了人源化A33-双特异性抗体(huA33-BsAb)的设计和构建。图1(B)显示了纯化的huA33-BsAb在37℃下经过4周的加速稳定性测试。图1(C)显示了huA33-BsAb在25℃和37℃下的表面等离子体共振(SPR)分析。将数据拟合至1:1结合模型。图1(D)显示了不同肿瘤细胞系和激活的T细胞的FACS染色。平均荧光强度(MFI)值是几何平均值。
图2(A)显示了在与Colo205细胞和不同抗体孵育后24小时，T细胞中CD25和CD69标记的激活。图2(B)显示了在与Colo205细胞和不同抗体孵育后96小时，基于CFSE染料稀释对分裂细胞的量化。图2(C)显示了图2(B)的代表性图像。图2(D)显示了在独立的实验中，与Colo205细胞和huA33-BsAb孵育后96小时，CD45RO的染色。图2(E)显示了在体内huA33-BsAb对T细胞的激活和增殖。简而言之，将CFSE标记的外周血单核细胞(PBMC)与Colo205细胞混合，并将混合物皮下植入DKO小鼠上。第二天静脉内注射huA33-BsAb，并且在另外4天后分离肿瘤并通过FACS进行分析。
图3显示了在靶肿瘤的存在下，由huA33-BsAb激活的T细胞分泌的细胞因子和细胞毒性组分的分布。在4天期间确定在huA33-BsAb和靶细胞Colo205或阴性对照细胞SKMEL5的存在下，由T细胞产生细胞因子和细胞裂解分子的动力学。因为SKMEL5分泌大量的IL-6，在IL-6动力学实验中，将在没有抗体的情况下，来自与Colo205细胞孵育的T细胞的上清液用作阴性对照。
图4(A)显示了由huA33-BsAb引起的对不同靶肿瘤细胞系和对照细胞的细胞毒性。将激活的T细胞用作效应细胞，效应子与靶标的比率(E:T)为10:1。在获得读数之前，将细胞孵育16小时。图4(B)显示了由huA33-BsAb诱导的针对Colo205细胞的细胞毒性。将分选的新鲜T细胞子集用作效应细胞(E:T＝5:1)。在获得读数之前，将细胞孵育48小时。CD4记忆T细胞的EC50是25pM。
图5(A)显示了通过酵母筛选对huA33(H2L2)的亲和力成熟的总结。图5(B)显示了亲代和亲和力成熟的huA33-BsAb的KD的总结(上图)和源自SPR分析的不同huA33-BsAb的结合-解离速率图(下图)。图5(C)显示了亲代和亲和力成熟的huA33-BsAb的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的结果。
图6(A)显示了治疗组和对照组中s.c.LS174T肿瘤的生长。肿瘤大小通过体积进行评估(对于肿瘤+scPBMC与肿瘤+scPBMC+huA33-BsAb，p＝0.0133；对于仅肿瘤与肿瘤+scPBMC+huA33-BsAb，p＝0.006)。图6(B)显示了治疗组和对照组中的i.p.LS174T肿瘤生长(上图)(对于肿瘤+ATC与肿瘤+ATC+huA33-BsAb，p＝0.0125；对于仅肿瘤与肿瘤+ATC+huA33-BsAb，p＝0.0026)以及治疗组和对照组中的小鼠存活率(下图)。图6(C)显示了不同组中腹部LS174T肿瘤的发光图像。仅肿瘤组有一只小鼠(4号)在21天后没有取得肿瘤，并因此被排除在分析之外。
图7(A)显示了发光图像，所述发光图像显示了不同组中s.c.Colo205肿瘤的生长。图7(B)显示了来自图7(A)的信号的量化(上图)和来自图7(A)中不同组的小鼠的存活率(下图)。图7(C)显示了i.p.SW1222肿瘤的发光图像；来自仅肿瘤组的小鼠1号和来自肿瘤+ATC组的小鼠3号在21天后没有取得肿瘤，因此在随后的时间点被排除在成像之外，并且不包括在图7(D)的存活分析中。图7(D)显示了患有i.p.SW1222肿瘤的小鼠的存活率。
图8(A)显示了不同组中s.c.SNU16肿瘤的生长。图8(B)显示了来自图8(A)中小鼠血液的人细胞的移植。
图9显示了人源化A33的4种形式的SPR分析。所有抗体都包含IgG1恒定结构域。3A3-H1L1、3A3-H1L2、3A3-H2L1和3A3-H2L2是人源化3A3的4种形式。3A3-chA33是嵌合的3A3。
图10显示了用huA33-BsAb染色的各种细胞系的FACS分析结果。
图11(A)显示了在24小时(左)和96小时(右)后，在Colo205细胞的存在下，由huA33-BsAb激活的T细胞上的PD-1的上调。图11(B)显示了在96小时后，在huA33-BsAb的存在下，用SKMEL5孵育后，T细胞没有分裂。图11(C)显示了在LS174T细胞的存在下，huA33-BsAb对T细胞分裂的激活。图11(B)和图11(C)使用了相同的T细胞制剂。
图12(A)和图12(B)示出了在不同抗体的存在下，与Colo205细胞孵育后48小时，T细胞上CD45RO和CD25标记的染色。在将上清液用于LDH测量后，从TDCC测定获得细胞。图12(A)：CD4(+)T细胞上门控；图12(B)：CD8(+)T细胞上门控。
图13显示了将scFv快速重整为huA33-BsAb形式的策略。将表达载体(1)用HindIII/ApaI线性化。启动子片段(3)由含有SapI消化的启动子的载体制备。载体和启动子片段两者都可以大量制备，用于更高通量的克隆。VH(4)和VL(2)用两个5'引物从酵母直接扩增以添加前导序列，并用HindIII/SapI(VL)或ApaI/SapI(VH)消化。所述4个片段在一步反应中连接。
图14显示了鼠A33抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列以及它们对应的同源人序列(SEQ ID NO:1-4)。鼠A33抗体的VH和VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3区由带下划线的黑体字型指示。
图15显示了huA33-H1(3A3-H1)(SEQ ID NO:5)和huA33-H2(3A3-H2)(SEQ ID NO:6)的人源化重链的氨基酸序列。3A3-H1和3A3-H2的CDR1、CDR2和CDR3区由带下划线的黑体字型指示。
图16显示了huA33-H1(3A3-H1)(SEQ ID NO:7)和huA33-H2(3A3-H2)(SEQ ID NO:8)的人源化重链的cDNA序列。
图17显示了huA33-L1(3A3-L1)(SEQ ID NO:9)和huA33-L2(3A3-L2)(SEQ ID NO:10)的人源化轻链的氨基酸序列。3A3-L1和3A3-L2的CDR1、CDR2和CDR3区由带下划线的黑体字型指示。
图18显示了huA33-L1(3A3-L1)(SEQ ID NO:11)和huA33-L2(3A3-L2)(SEQ ID NO:12)的人源化轻链的cDNA序列。
图19显示了来自King等人(1995)同上的原始人源化序列hA33与新的重新人源化huA33(3A3)序列的比对。
图20显示了使用SPR(Biacore T100)在GPA33重组蛋白上测定的huA33的人源化IgG变体的结合动力学。所有四种形式都保留了嵌合A33(chA33)的高结合亲和力。
图21显示了使用SPR(Biacore T100)在GPA33重组蛋白上测定的原始人源化hA33(呈hA33-mC825双特异性形式，如Cheal等人,Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging,43:925-937(2016)所述)与huA33(3A3-H2L2)的结合动力学。与huA33相比，原始人源化hA33失去了相当大的亲和力。
图22显示了使用SPR(Biacore T100)在GPA33重组蛋白上测定的原始人源化hA33(呈hA33-mC825双特异性形式，如Cheal等人J.Nucl.Med.Mol.I maging,43:925-937(2016)所述)与huA33(3A3-H2L2)的结合动力学。与huA33相比，原始人源化hA33失去了相当大的亲和力。
图23显示了对huA33重链和轻链序列(3A3-H1、3A3-H2、3A3-L1、3A3-L2)和原始hA33序列的人性分析。由于重新人源化的所有四种形式都保留了原始chA33的高结合亲和力，因此基于H2L2形式的更高的人性T20得分选择H2L2形式用于进一步开发。
图24显示了嵌合chA33-IgG1的轻链和重链的氨基酸序列，它们分别对应于SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14。
图25显示了huA33-IgG1(H2L2)的重链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQID NO:15和SEQ ID NO:16。
图26显示了huA33-IgG1(H2L2)的轻链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQID NO:17和SEQ ID NO:18。
图27显示了T细胞接合的huA33-BsAb双特异性抗体的重链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
图28显示了T细胞接合的huA33-BsAb双特异性抗体的轻链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。带下划线序列对应于GS接头序列。
图29显示了对本文公开的T细胞接合的huA33-BsAb双特异性抗体的潜在修饰的总结。
图30显示了呈huA33-BsAb形式的亲和力成熟的克隆31的重链和轻链的氨基酸序列，分别对应于SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。带下划线序列对应于GS接头序列。
图31显示了呈huA33-BsAb形式的亲和力成熟的克隆32的重链和轻链的氨基酸序列，分别对应于SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。带下划线序列对应于GS接头序列。
图32显示了呈huA33-BsAb形式的亲和力成熟的克隆48的重链和轻链的氨基酸序列，分别对应于SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。带下划线序列对应于GS接头序列。
图33显示了呈huA33-BsAb形式的亲和力成熟的克隆49的重链和轻链的氨基酸序列，分别对应于SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。带下划线序列对应于GS接头序列。
图34显示了呈huA33-BsAb形式的亲和力成熟的克隆53的重链和轻链的氨基酸序列，分别对应于SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32。带下划线序列对应于GS接头序列。
图35显示了呈huA33-BsAb形式的亲和力成熟的克隆56的重链和轻链的氨基酸序列，分别对应于SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。带下划线序列对应于GS接头序列。
图36显示了呈huA33-BsAb形式的亲和力成熟的克隆57的重链和轻链的氨基酸序列，分别对应于SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。带下划线序列对应于GS接头序列。
图37显示了双特异性抗体huA33-huC825(H2L2)的重链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
图38显示了双特异性抗体huA33-huC825(H2L2)的轻链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61。带下划线序列对应于GS接头序列。
图39显示了双特异性抗体huA33-mC825(H2L2)的重链和轻链的氨基酸序列，它们分别对应于SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63。带下划线序列对应于GS接头序列。
图40显示了在携带皮下GPA33(+)SW1222人结肠直肠异种移植物的小鼠中，GPA33阳性(GPA33(+))人结肠直肠肿瘤异种移植物靶向的离体生物分布结果，所述皮下GPA33(+)SW1222人结肠直肠异种移植物用本文公开的重新人源化的huA33-DOTA双特异性抗体和示踪剂剂量的177Lu-DOTA-生物素处理。
具体实施方式
应当理解，下文以不同详细程度描述了本发明方法的某些方面、模式、实施方案、变化形式和特征，以提供对本技术的实质理解。
本公开文本总体上提供了免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)，所述免疫球蛋白相关组合物可与A33多肽特异性地结合并中和A33多肽的生物活性。本技术的免疫球蛋白相关组合物可用于检测或治疗有需要的受试者中A33相关癌症的方法。因此，本发明方法的各个方面涉及抗A33抗体的制备、表征和操纵。本技术的免疫球蛋白相关组合物可单独使用或与用于治疗癌症的另外的治疗剂组合使用。在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
在实践本发明方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见例如，Sambrook和Russell编辑(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版；丛书Ausubel等人编辑(2007)CurrentProtocols in Molecular Biology；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,纽约)；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press at OxfordUniversity Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,第5版；Gait编辑(1984)OligonucleotideSynthesis；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic AcidHybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,伦敦)；以及Herzenberg等人编辑(1996)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology。检测和测量多肽基因表达产物水平(即基因翻译水平)的方法是本领域中熟知的，并且包括使用多肽检测方法，如抗体检测和量化技术。(还参见，Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版.(John Wiley and Sons,Inc.,纽约州,1999))。
定义
除非另外限定，否则在此所使用的所有技术和科技术语一般均具有如本技术所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物，除非上下文另外明确说明。例如，提及“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。通常，本文所用的命名和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域中熟知的和常用的那些。
除非上下文另外说明或另外明显，否则如本文所用，关于数字的术语“约”通常视为包括落在所述数字任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字(这样的数字低于可能值的0％或超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所用，向受试者“给予”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。给予可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、肿瘤内或局部。给予包括自我给予和由另一个人给予。
“佐剂”是指引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在这种情况下，佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原或抗体的免疫应答。可以在疫苗的给予之前、与疫苗的给予组合或在疫苗的给予之后将佐剂给予至受试者。用作佐剂的化学化合物的例子包括铝化合物、油、嵌段聚合物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质(例如，维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、Quil A(皂苷)、细菌和真菌细胞壁组分(例如，脂多糖、脂蛋白和糖蛋白)、激素、细胞因子和共刺激因子。
如本文所用，术语“抗体”共同地指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合，以及在任何脊椎动物中例如在哺乳动物(如人、山羊、兔子和小鼠)以及非哺乳动物物种中在免疫应答过程中产生的类似分子，如鲨鱼免疫球蛋白。如本文所用，“抗体”(包括完整免疫球蛋白)和“抗原结合片段”与目的分子(或一组高度类似的目的分子)特异性地结合，而基本上排除与其他分子的结合(例如，对于目的分子的结合常数比对于生物样品中的其他分子的结合常数大至少103M-1、大至少104M-1或大至少105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括基因工程化形式如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,罗克福德，伊利诺伊州)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,纽约,1997。
更具体地，抗体是指特异性地识别并结合抗原表位的至少包含轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链构成，它们各自具有可变区，称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。通常，免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，即λ(lambda)和κ(kappa)。有五种主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，它们决定了抗体分子的功能活性。每条重链和轻链均含有恒定区和可变区(所述区域也称为“结构域”)。组合的重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)打断的“框架”区。已经定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，其通过引用特此并入)。Kabat数据库目前在线上维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区(即组成性轻链和重链的组合框架区)主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下所述环形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区起到形成支架的作用，所述支架通过链间非共价相互作用使CDR以正确取向定位。
CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次编号，并且通常还依据其中定位特定CDR的链来标识。因此，VH CDR3位于发现它所在的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现它所在的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合A33蛋白的抗体将具有特定的VH区和VL区序列，从而具有特定的CDR序列。具有不同特异性(即对于不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管不同的抗体之间CDR不同，但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。如本文所用，“免疫球蛋白相关组合物”是指抗体(包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段与抗原特异性地结合。
如本文所用，术语“抗体相关多肽”意指包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段，其可以包含一个或多个可变区，所述可变区是单独的或与以下多肽元件的全部或部分组合：抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。所述技术中还包括一个或多个可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。可用于本发明方法中的抗体相关分子是例如但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。例子包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“双特异性抗体”或“BsAb”是指可以同时与具有不同结构的两个靶标(例如，两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位、或者半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位)结合的抗体。多种不同的双特异性抗体结构是本领域已知的。在一些实施方案中，双特异性抗体中的每个抗原结合部分都包括VH和/或VL区；在一些此类实施方案中，VH和/或VL区是在特定单克隆抗体中发现的那些。在一些实施方案中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，每个抗原结合部分包括来自不同单克隆抗体的VH和/或VL区。在一些实施方案中，双特异性抗体含有两个抗原结合部分，其中两个抗原结合部分中的一个包括具有VH和/或VL区的免疫球蛋白分子，所述VH和/或VL区含有来自第一单克隆抗体的CDR；并且另一个抗原结合部分包括具有VH和/或VL区的抗体片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab')2、Fd、Fv、dAB、scFv等)，所述VH和/或VL区含有来自第二单克隆抗体的CDR。
如本文所用，“清除剂”是与存在于受试者血液隔室中的过量双特异性抗体结合以促进经由肾脏的快速清除的试剂。在半抗原给予(例如DOTA)之前使用清除剂有助于在预靶向放射免疫疗法(PRIT)系统中获得更好的肿瘤与背景比。清除剂的例子包括500kD-葡聚糖-DOTA-Bn(Y)(Orcutt等人,Mol Cancer Ther.11(6):1365–1372(2012))、500kD氨基葡聚糖-DOTA缀合物、针对预靶向抗体的抗体等。
如本文所用，术语“缀合的”是指通过本领域技术人员已知的任何方法使两个分子缔合。合适的缔合类型包括化学键和物理结合。化学键包括例如共价键和配位键。物理结合包括例如氢键、偶极相互作用、范德华力、静电相互作用、疏水性相互作用和芳环堆积。
如本文所用，术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如以下文献中：EP404,097；WO93/11161；和30Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可以包含具有多个单独分子的聚合物，例如二聚体、三聚体或其他聚合物。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成的接头进行连接，从而将它们制成单个蛋白质链，在所述单个蛋白质链中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988)Science 242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879-5883。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶切割或化学切割来制备。
任何上述抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性筛选所述片段。
如本文所用，“抗原”是指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原可以是多肽(例如，A33多肽)。也可以将抗原给予至动物以在动物中产生免疫应答。
术语“抗原结合片段”是指完整免疫球蛋白结构的片段，所述片段具有负责与抗原结合的多肽部分。可用于本技术中的抗原结合片段的例子包括scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'和F(ab')2，但不限于此。
“结合亲和力”意指分子(例如，抗体)的单个结合位点与分子的结合配偶体(例如，抗原或抗原肽)之间的总非共价相互作用的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的标准方法(包括本文所述的那些)测量。低亲和力复合物含有通常倾向于容易从抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于更长时间地保持与抗原结合的抗体。
如本文所用，术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料。生物样品可以包括从受试者分离的组织、细胞、细胞的蛋白质或膜提取物、和生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。本技术的生物样品包括但不限于取自以下的样品：乳腺组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头或颈、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑下垂体、肾脏组织、肌肉、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、毛发、颊、皮肤、血清、血浆、CSF、精子、前列腺液、精液、尿、粪便、汗液、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴和泪液。生物样品也可以从内脏的活检或从癌症获得。生物样品可以从受试者获得以进行诊断或研究；或者可以从未患病的个体获得，作为对照或用于基础研究。样品可以通过标准方法获得，所述标准方法包括例如静脉穿刺和手术活检。在某些实施方案中，生物样品是通过针吸活检获得的乳房、肺、结肠或前列腺组织样品。
如本文所用，术语“CDR移植抗体”意指这样的抗体，在所述抗体中“受体”抗体的至少一个CDR被来自“供体”抗体的具有所需抗原特异性的CDR“移植物”替代。
如本文所用，术语“嵌合抗体”意指这样的抗体，在所述抗体中使用重组DNA技术将来自一个物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如，小鼠Fc恒定区)用来自另一物种的抗体的Fc恒定区(例如，人Fc恒定区)替代。一般参见，Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人美国专利号4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请0125,023；Better等人,Science 240:1041-1043,1988；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443,1987；Liu等人,J.Immunol 139:3521-3526,1987；Sun等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218,1987；Nishimura等人,Cancer Res47:999-1005,1987；Wood等人,Nature 314:446-449,1885；以及Shaw等人,J.Natl.CancerInst.80:1553-1559,1988。
如本文所用，术语“共有FR”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区域。抗体的FR区不与抗原接触。
如本文所用，“对照”是实验中出于比较目的使用的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”的。例如，在实验目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗的功效的相关性的情况下，通常使用阳性对照(已知展现出所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(不接受治疗或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如导致预防或减少本文所述疾病或病症或者与本文所述疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量。在治疗或预防应用的情况下，给予至受试者的组合物的量将根据组合物、疾病的程度、类型和严重程度以及根据个体的特征(如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性)而变化。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。所述组合物也可以与一种或多种另外的治疗化合物组合给予。在本文所述的方法中，可以将治疗组合物给予至具有本文所述疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用，组合物的“治疗有效量”是指其中疾病或病症的生理影响得到改善或消除的组合物水平。治疗有效量可以在一次或多次给药中给予。
如本文所用，术语“效应细胞”意指参与免疫应答的效应阶段的免疫细胞，所述效应阶段与免疫应答的认知阶段和激活阶段相反。示例性的免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如，B细胞和T细胞，包括细胞裂解性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。效应细胞表达特定的Fc受体并执行特定的免疫功能。效应细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞参与靶细胞的特异性杀伤并向免疫系统的其他组分呈递抗原，或与呈递抗原的细胞结合。
如本文所用，术语“表位”意指能够与抗体特异性地结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，与构象表位而不是非构象表位的结合丧失。在一些实施方案中，A33蛋白的“表位”是所述蛋白质中与本技术的抗A33抗体特异性地结合的区域。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。为了筛选与表位结合的抗A33抗体，可以进行常规的交叉阻断测定，如描述于以下文献中的该测定：Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow和David Lane编辑(1988)。此测定可用于确定抗A33抗体是否与本技术的抗A33抗体结合相同的位点或表位。可替代地或另外地，可以通过本领域已知的方法进行表位作图。例如，抗体序列可以如通过丙氨酸扫描被诱变，以鉴定接触残基。在不同的方法中，对应于A33蛋白的不同区域的肽可以用于与多种测试抗体、或与一种测试抗体和具有经表征或已知表位的抗体的竞争测定中。
如本文所用，“表达”包括以下中的一项或多项：基因转录为前体mRNA；前体mRNA的剪接和其他加工以产生成熟mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译成蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性)；以及糖基化和/或翻译产物的其他修饰(如果适当的表达和功能需要)。
如本文所用，术语“基因”意指含有RNA产物的调节的生物合成的所有信息(包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其他非翻译区)的DNA区段。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列可以出于比较目的进行比对。当所比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度随所述序列共有的匹配或同源位置数而变。多核苷酸或多核苷酸区域(多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着，当比对时，在比较两个序列中，该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序确定此比对以及同源性或序列同一性百分比。在一些实施方案中，将默认参数用于比对。一种比对程序是BLAST，使用默认参数。具体而言，程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高得分(HIGH SCORE)；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)找到。生物学上等同的多核苷酸是具有指定同源性百分比并编码具有相同或相似生物活性的多肽的那些多核苷酸。如果两个序列彼此共有小于40％的同一性或小于25％的同一性，则将所述序列视为“无关的”或“非同源的”。
如本文所用，术语非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中受体的高变区残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物的具有所需的特异性、亲和力和能力的高变区残基替代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步完善抗体性能如结合亲和力。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域(例如，Fab、Fab'、F(ab')2或Fv)的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有FR序列的那些FR区，但所述FR区可以包括改善结合亲和力的一个或多个氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。所述人源化抗体任选地也可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。参见例如，Ahmed和Cheung,FEBS Letters 588(2):288-297(2014)。
如本文所用，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)前后，以及VH中的31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)前后(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州.(1991年))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
如本文所用，当在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下使用时，术语“相同”或“同一性”百分比是指相同的两个或更多个序列或子序列或者具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或特定区域中比较和比对以求最大对应时，在指定区域(例如，编码本文所述抗体或本文所述抗体的氨基酸序列的核苷酸序列)中，约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的两个或更多个序列或子序列，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法以下文所述的默认参数所测量，或通过手动比对和视觉检查(例如NCBI网站)所测量。则将此类序列称为“基本上相同”。此术语也指或可以适用于测试序列的互补体。所述术语还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。在一些实施方案中，在长度为至少约25个氨基酸或核苷酸或长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域中存在同一性。
如本文所用，术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”意指具有通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是单独生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，所述个体、患者或受试者是人。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能自然发生的突变之外，构成所述群体的单独抗体是相同的。例如，单克隆抗体可以是源自单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)而不是产生它的方法的抗体。单克隆抗体组合物对特定表位展示出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆的”指示抗体的特征为是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。可以使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体，所述多种技术包括例如但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如，待根据本发明方法使用的单克隆抗体可以通过最初由Kohler等人,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。例如，“单克隆抗体”也可以使用Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给予相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其配制品是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences(第20版，A.Gennaro编辑,2000,Lippincott，Williams&Wilkins,费城,宾夕法尼亚州)中。
如本文所用，术语“多克隆抗体”意指源自至少两(2)种不同的产抗体细胞系的抗体的制剂。此术语的使用包括至少两(2)种抗体的制剂，所述制剂含有与抗原的不同表位或区域特异性地结合的抗体。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”意指任何RNA或DNA，其可以是未修饰的或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链和双链区域的混合物的RNA以及包含DNA和RNA的杂交分子，所述DNA和RNA可以是单链的或更通常是双链的或者单链和双链区域的混合物。此外，多核苷酸是指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及出于稳定性或其他原因对骨架进行修饰的DNA或RNA。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，以意指包含两个或更多个氨基酸的聚合物，所述氨基酸通过肽键或经修饰的肽键(即，肽电子等排体)彼此连接。多肽既是指通常称为肽、糖肽或寡聚物的短链，也是指通常称为蛋白质的较长链。多肽可以含有除了20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰充分描述于基础教材和更详细的专题论文以及长篇研究文献中。
如本文所用，“PRIT”或“预靶向放射免疫疗法”是指解决肿瘤靶向抗体的缓慢血液清除的多步骤过程，所述缓慢血液清除导致对正常组织如骨髓的不希望的毒性。在预靶向中，放射性核素或其他诊断或治疗剂附接至小型半抗原。首先给予具有半抗原以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性抗体。然后允许未结合的抗体从循环中清除，并且随后给予半抗原。
如本文所用，当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”指示，所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或所述材料源自经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在所述细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因，或者表达原本异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。
如本文所用，术语“分开的”治疗使用是指通过不同途径同时或基本上同时给予至少两种活性成分。
如本文所用，术语“顺序的”治疗使用是指在不同时间给予至少两种活性成分，给予途径相同或不同。更具体地，顺序使用是指一种活性成分的整个给予在另外一种或多种活性成分的给予开始之前进行。因此，可以在给予另外一种或多种活性成分之前几分钟、几小时或几天内给予一种活性成分。在这种情况下，没有同时治疗。
如本文所用，“特异性地结合”是指识别并结合另一个分子(例如抗原)但基本上不识别并结合其他分子的分子(例如抗体或其抗原结合片段)。如本文所用，术语“特异性结合”特定分子(例如，多肽或多肽上的表位)、“特异性结合至”特定分子或“对特定分子具有特异性”可以展现为例如对其所结合的分子具有约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的KD的分子。术语“特异性结合”也可以指这样的结合，其中分子(例如，抗体或其抗原结合片段)与特定多肽(例如，A33多肽)或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。
如本文所用，术语“同时的”治疗使用是指通过相同的途径并且同时或基本上同时给予至少两种活性成分。
如本文所用，术语“治疗剂”旨在意指当以有效量存在时对有需要的受试者产生期望的治疗效果的化合物。
如本文所用，“治疗”(“treating”或“treatment”)涵盖治疗受试者如人中的本文所述疾病或障碍，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即引起障碍的消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指与疾病相关的症状例如得到减轻、降低、治愈或处于缓解状态。
还应理解，如本文所述的障碍的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗但也不到完全治疗，并且其中实现了一些生物学或医学有关的结果。治疗可以是针对慢性疾病的连续长期治疗，或者是治疗急性病症的单次或几次给予。
考虑了本文描述的抗A33抗体的一种或多种氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备抗A33抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。只要获得的抗体具有所需的特性，就可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得目的抗体。修饰还包括蛋白质糖基化模式的变化。进行取代诱变的最感兴趣的位点包括高变区，但是也考虑FR改变。“保守取代”显示在下表中。
Figure BDA0002502391540000251
Figure BDA0002502391540000261
一个类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。用于生成此类取代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。特别地，使数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。将如此产生的抗体变体从丝状噬菌体粒子以单价方式展示，为所述抗体变体作为与包装在每个粒子中的M13的基因III产物的融合物。然后针对其生物活性(例如，结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体，如本文所公开。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可替代地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。根据本文详述的技术，此类接触残基及邻近残基是取代的候选物。一旦产生了此类变体，就对这组变体进行如本文所述的筛选，并且可以在一种或多种相关测定中选择具有相似或更优特性的抗体进行进一步开发。
CRC和A33
CRC是一种异质性疾病，并且基于基因表达分析可以分为4种共有分子亚型(CMS)，即CMS1-4。MSI肿瘤主要属于CMS1(占所有CRC患者的14％)，并且其特征在于基因组高突变和微卫星不稳定性，这是由于DNA修复途径的缺陷。据推测，超突变产生过多新抗原，它们存在于细胞表面上并将T细胞吸引至肿瘤中。事实上，CMS1具有免疫系统激活和逃避的强分子特征。ICI通过使受抑制的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)恢复活力来恢复杀肿瘤能力，并且因此，MSI肿瘤是对ICI反应最强的CRC肿瘤。然而，MSI肿瘤占mCRC的<5％；对于大多数mCRC，ICI的功效到目前为止是令人失望的。腹膜癌扩散通常是终末期的不可治愈的CRC。与转移到肝和肺不同，它通常是不可切除的，对化疗和放疗无反应，从而导致显著的发病率。目前的治疗大多是姑息性的，包括减瘤手术(CRS)和热灌注化疗(HIPEC)，这两种治疗仅对患有小体积疾病的患者中的一小部分有效。
人糖蛋白A33(GPA33或A33)是一种单次穿膜I型膜蛋白，其属于免疫球蛋白家族内的细胞粘附分子的CTX家族。A33在95％的CRC组织中表达，在正常组织中的表达非常有限。A33包括一个Ig样C2型结构域和一个Ig样V型结构域。预测的成熟蛋白包括单个跨膜结构域、胞外区和胞内尾。A33在细胞内运输、细胞间识别/信号传导和再循环至细胞表面中发挥作用。A33的胞外结构域的氨基酸序列(Ile22-Val235)提供如下：
ISVETPQDVLRASQGKSVTLPCTYHTSTSSREGLIQWDKLLLTHTERVVIWPFSNKNYIHGELYKNRVSISNNAEQSDASITIDQLTMADNGTYECSVSLMSDLEGNTKSRVRLLVLVPPSKPECGIEGETIIGNNIQLTCQSKEGSPTPQYSWKRYNILNQEQPLAQPASGQPVSLKNISTDTSGYYICTSSNEEGTQFCNITVAVRSPSMNV(SEQ IDNO:57)。
本技术的免疫球蛋白相关组合物
已发现现有的人源化A33 IgG1抗体在结肠癌患者中具有免疫原性。参见Ritter G等人,Cancer Res 61:6851-9(2001)。本技术描述了用于产生和使用抗A33免疫球蛋白相关组合物(例如，抗A33抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本公开文本的抗A33免疫球蛋白相关组合物可用于诊断或治疗A33阳性癌症。在本技术范围内的抗A33免疫球蛋白相关组合物包括例如但不限于特异性地结合靶多肽、其同源物、衍生物或片段的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和双抗体。本公开文本还提供本文公开的任何抗A33抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab)'2、Fab'、scFv和Fv。
在一个方面，本技术提供了包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中(a)VH包含FTFSTYDMS(SEQ ID NO:37)的VH-CDR1序列、TISSGGSYTYYLDS VKG(SEQ ID NO:38)的VH-CDR2序列和TTVVPFAY(SEQ ID NO:39)的VH-CDR3序列；和/或(b)VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：KASQNVRTVVA(SEQ ID NO:40)、LASNRHT(SE Q ID NO:41)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)；KASQNVRTVVA(SE Q ID NO:40)、LASDRHT(SEQ ID NO:43)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)；KASQNVRTLVA(SEQ ID NO:44)、LASNRHT(SEQ ID NO:41)和QHWSYPLT(SEQ ID NO:45)；以及KASQNVRTLVA(SEQ ID NO:44)、LASNRHT(SEQ ID NO:41)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含任何同种型的Fc结构域，所述同种型例如但不限于IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和Ig A2)、IgD、IgE或IgM和IgY。恒定区序列的非限制性例子包括：
人IgD恒定区，Uniprot：P01880(SEQ ID NO:46)
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
人IgG1恒定区，Uniprot：P01857(SEQ ID NO:47)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2恒定区，Uniprot：P01859(SEQ ID NO:48)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG3恒定区，Uniprot：P01860(SEQ ID NO:49)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人IgM恒定区，Uniprot：P01871(SEQ ID NO:50)
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
人IgG4恒定区，Uniprot：P01861(SEQ ID NO:51)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人IgA1恒定区，Uniprot：P01876(SEQ ID NO:52)
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人IgA2恒定区，Uniprot：P01877(SEQ ID NO:53)
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人Igκ恒定区，Uniprot：P01834(SEQ ID NO:54)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:46-53至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的重链恒定区。另外地或可替代地，在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含与SEQ ID NO:54至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的轻链恒定区。在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物与A33多肽的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:57的至少五至八个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。
在另一方面，本公开文本提供了分离的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)，其包含含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQID NO:35、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62的重链(HC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含含有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:63的轻链(LC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物包含分别选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9(3A3-H1/L1)；SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:10(3A3-H1/L2)；SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9(3A3-H2/L1)；SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10(3A3-H2/L2)；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17(huA33-IgG1(H2L2))；SEQ ID NO:19和SEQID NO:21(huA33-BsAb)；SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24(克隆31)；SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26(克隆32)；SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28(克隆48)；SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(克隆49)；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(克隆53)；SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34(克隆56)；SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36(克隆57)，SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:60(huA33-huC825)；和SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63(huA33-mC825)。
在免疫球蛋白相关组合物的上述实施方案中的任何一个中，所述HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列形成与A33多肽的表位结合的抗原结合位点，所述表位包含A33的胞外结构域(SEQ ID NO:57)的至少五至八个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，所述表位是构象表位。
在一些实施方案中，HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是同一多肽链的组分。在其他实施方案中，HC和LC免疫球蛋白可变结构域序列是不同多肽链的组分。在某些实施方案中，所述抗体是全长抗体。
在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物与至少一种A33多肽特异性地结合。在一些实施方案中，本技术的免疫球蛋白相关组合物以约10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的解离常数(KD)结合至少一种A33多肽。在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含人抗体框架区。
在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包括一种或多种以下特征：(a)与SEQID NO:9、10、17、21、24、26、28、30、32、34、36、60或63中任何一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或(b)与SEQ ID NO:5、6、15、19、23、25、27、29、31、33、35、58或62中任何一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。在另一个方面，本文提供的免疫球蛋白相关组合物中的一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸取代。取代可以是如本文所定义的“保守取代”。
在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包含(a)与SEQ ID NO:9、10、17、21、24、26、28、30、32、34、36、60或63中任何一个中存在的LC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的LC序列；和/或(b)与SEQ ID NO:5、6、15、19、23、25、27、29、31、33、35、58或62中任何一个中存在的HC序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的HC序列。
在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。另外地或可替代地，在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物包含含有S228P突变的IgG4恒定区。
在一些方面，本文描述的抗A33免疫球蛋白相关组合物含有结构修饰以促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。在一些方面，本技术的抗A33免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体)可以在CH2恒定重链区中含有缺失，以促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段用于促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段用于促进快速结合和细胞吸收和/或缓慢释放。
在一个方面，本技术提供了编码本文所述的免疫球蛋白相关组合物的重链或轻链的核酸序列。本文还公开了编码本文所述任何抗体的重组核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列选自SEQ ID NO:7、8、11、12、16、18、20、22、59和61。在另一个方面，本技术提供了宿主细胞，其表达编码本文所述的免疫球蛋白相关组合物的重链或轻链的任何核酸序列。
本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗A33抗体)可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以对一种或多种A33多肽的不同表位具有特异性，或者可以对一种或多种A33多肽以及对异源组合物(如异源多肽或固体支持物材料)两者均具有特异性。参见例如，WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利号5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648；6,106,835；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。在一些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是嵌合的。在某些实施方案中，免疫球蛋白相关组合物是人源化的。
本技术的免疫球蛋白相关组合物可以进一步在N-末端或C-末端与异源多肽重组融合，或者与多肽或其他组合物化学缀合(包括共价和非共价缀合)。例如，本技术的免疫球蛋白相关组合物可以与可用作检测测定中的标记的分子和效应分子(如异源多肽、药物或毒素)重组融合或缀合。参见例如，WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；以及EP 0 396 387。
在本技术的免疫球蛋白相关组合物的任何上述实施方案中，抗体或抗原结合片段可以任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。对于化学键或物理结合，免疫球蛋白相关组合物上的官能团通常与药剂上的官能团缔合。可替代地，药剂上的官能团与免疫球蛋白相关组合物上的官能团缔合。
药剂上的官能团和免疫球蛋白相关组合物上的的官能团可以直接缔合。例如，药剂上的官能团(例如巯基)可以与免疫球蛋白相关组合物上的官能团(例如巯基)缔合以形成二硫键。可替代地，官能团可以通过交联剂(即，接头)缔合。交联剂的一些例子描述如下。交联剂可以附接至药剂或免疫球蛋白相关组合物。缀合物中的药剂或免疫球蛋白相关组合物的数量也受到对方上存在的官能团数量的限制。例如，与缀合物缔合的药剂的最大数量取决于免疫球蛋白相关组合物上存在的官能团的数量。可替代地，与药剂缔合的免疫球蛋白相关组合物的最大数量取决于药剂上存在的官能团的数量。
在又另一个实施方案中，缀合物包含与一种药剂缔合的一种免疫球蛋白相关组合物。在一个实施方案中，缀合物包含与至少一种免疫球蛋白相关组合物化学键合(例如缀合)的至少一种药剂。可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物化学键合。例如，药剂上的官能团可以直接附接至免疫球蛋白相关组合物上的官能团。合适的官能团的一些例子包括例如氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯和羟基。
也可以通过交联剂(如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等)将药剂与免疫球蛋白相关组合物化学键合。交联剂可以例如从伊利诺伊州罗克福德的Pierce Biotechnology,Inc.获得。Pierce Biotechnology,Inc.网站可以提供帮助。另外的交联剂包括以下文献中描述的铂交联剂：荷兰阿姆斯特丹的Kreatech Biotechnology,B.V.的美国专利号5,580,990；5,985,566；和6,133,038。
可替代地，药剂和免疫球蛋白相关组合物上的官能团可以是相同的。同双官能交联剂通常用于交联相同的官能团。同双官能交联剂的例子包括EGS(即乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯])、DSS(即二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、DMA(即己二亚胺酸二甲酯.2HCl)、DTSSP(即3,3'-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯])、DPDPB(即1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)和BMH(即双马来酰亚胺己烷)。此类同双官能交联剂也可从Pierce Biotechnology,Inc.获得。
在其他情况下，从免疫球蛋白相关组合物切割药剂可能是有益的。上述PierceBiotechnology,Inc.的网站还可以为本领域技术人员在选择合适的交联剂方面提供帮助，所述交联剂可以通过例如细胞中的酶切割。由此，可以将药剂与免疫球蛋白相关组合物分离。可切割的接头的例子包括SMPT(即4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-α-[2-吡啶基二硫代]甲苯)、磺基-LC-SPDP(即磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、LC-SPDP(即琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、磺基-LC-SPDP(例如磺基琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)、SPDP(即N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基己酸酯)和AEDP(即3-[(2-氨基乙基)二硫代]丙酸HCl)。
在另一个实施方案中，缀合物包含与至少一种与免疫球蛋白相关组合物物理结合的至少一种药剂。可以采用本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理结合。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将免疫球蛋白相关组合物和药剂混合。混合的顺序并不重要。例如，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将药剂与免疫球蛋白相关组合物物理混合。例如，可以将免疫球蛋白相关组合物和药剂放置在容器中，并通过例如摇动容器进行搅拌，以混合免疫球蛋白相关组合物和药剂。
免疫球蛋白相关组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行修饰。例如，如上所述，可以通过交联剂或官能团来修饰免疫球蛋白相关组合物。
A.制备本技术的抗A33抗体的方法
概述。首先，选择靶多肽，可以产生针对所述靶多肽产生本技术的抗体。例如，可以针对全长A33蛋白或A33蛋白的胞外结构域的一部分产生抗体。用于产生针对此类靶多肽的抗体的技术是本领域技术人员熟知的。此类技术的例子包括但不限于涉及展示文库、异种或人小鼠、杂交瘤等的技术。在本技术范围内的靶多肽包括能够引发免疫应答的源自含有胞外结构域的A33蛋白的任何多肽。实施例1、2、3和5中说明了对A33蛋白具有特异性的抗体的制备。
应当理解，针对A33蛋白及其片段的重组工程化抗体和抗体片段(例如抗体相关多肽)适合于根据本公开文本使用。
可以经受本文所述技术的抗A33抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及抗体片段，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、scFv、双抗体、抗体轻链、抗体重链和/或抗体片段。已经描述了可用于高产量产生含抗体Fv的多肽例如Fab'和F(ab')2抗体片段的方法。参见美国专利号5,648,237。
通常，抗体是从起源物种获得的。更具体地，获得对靶多肽抗原具有特异性的起源物种抗体的轻链、重链或两者的可变部分的核酸或氨基酸序列。起源物种是可用于产生本技术的抗体或抗体文库的任何物种，例如大鼠、小鼠、兔子、鸡、猴、人等。
噬菌体或噬菌粒展示技术是可用于衍生本技术抗体的技术。用于产生和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员熟知的。编码本技术的抗体的序列的表达可以在大肠杆菌中进行。
由于核酸编码序列的简并性，编码与天然存在的蛋白质的那些氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的其他序列可用于本技术的实践中。这些序列包括但不限于包括编码上述多肽的全部或部分核酸序列在内的核酸序列，所述核酸序列通过编码序列内功能等同氨基酸残基的不同密码子的取代而发生改变，从而产生沉默变化。应当理解，根据本技术的免疫球蛋白的核苷酸序列容忍如通过标准方法计算的高达25％的序列同源性变异(“CurrentMethods in Sequence Comparison and Analysis,”Macromolecule Sequencing andSynthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页,1998,Alan R.Liss,Inc.)，只要这种变体形成识别A33蛋白的有效抗体即可。例如，多肽序列内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似极性的另一个氨基酸取代，所述另一个氨基酸充当功能等同物，从而导致沉默改变。序列内氨基酸的取代基可以选自所述氨基酸所属的类别的其他成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在本技术范围内还包括蛋白质或其片段或衍生物，所述蛋白质或其片段或衍生物在翻译过程中或翻译后进行差异性修饰，例如通过糖基化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等来进行。另外，可以使编码免疫球蛋白的核酸序列在体外或体内突变，以产生和/或破坏序列的翻译、起始和/或终止，或者在编码区产生变异和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏先前存在的所述位点，以促进进一步的体外修饰。可以使用本领域中已知的任何诱变技术，包括但不限于体外定点诱变(J.Biol.Chem.253:6551)、使用Tab接头(Pharmacia)等。
多克隆抗血清和免疫原的制备。产生本技术的抗体或抗体片段的方法通常包括用纯化的A33蛋白或其片段或用表达A33蛋白或其片段的细胞对受试者(通常是非人受试者，如小鼠或兔子)进行免疫。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的A33蛋白或化学合成的A33肽。使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，可将A33蛋白的ECM或其部分或片段用作免疫原以产生与A33蛋白或其部分或片段结合的抗A33抗体。
全长A33蛋白或其片段可作为片段用作免疫原。在一些实施方案中，A33片段包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的至少五至八个连续氨基酸残基，并且涵盖A33蛋白的表位，使得针对所述肽产生的抗体与A33蛋白形成特异性免疫复合物。
在一些实施方案中，与A33胞外结构域(Ile22-Val235)重叠的抗原性A33肽包含至少5、8、10、15、20或30个氨基酸残基。取决于用途和根据本领域技术人员熟知的方法，有时需要较长的抗原肽而不是较短的抗原肽。给定表位的多聚体有时比单体更有效。
如果需要的话，可通过与半抗原(如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA))融合或缀合来提高A33蛋白(或其片段)的免疫原性。许多此类半抗原是本领域已知的。还可以将A33蛋白与常规佐剂(如弗氏完全或不完全佐剂)组合，以增强受试者对所述多肽的免疫反应。用于提高免疫应答的各种佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、表面活性物质(例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚等)、人用佐剂(如卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))或类似的免疫刺激化合物。这些技术在本领域中是标准的。
在描述本技术时，免疫应答可以被描述为“初级”或“次级”免疫应答。初级免疫应答，也称为“保护性”免疫应答，是指由于初始暴露(例如，初始“免疫”)于特定抗原(例如A33蛋白)而在个体中产生的免疫应答。在一些实施方案中，可以通过用含有抗原的疫苗对个体进行疫苗接种来进行免疫。例如，所述疫苗可以是包含一种或多种A33蛋白衍生抗原的A33疫苗。随着时间的推移，初级免疫应答可能会削弱或减弱，甚至可能消失或至少变得减弱到无法检测到。因此，本技术还涉及“次级”免疫应答，在此也称为“记忆免疫应答”。术语次级免疫应答是指在已经产生初级免疫应答之后在个体中引发的免疫应答。
因此，可以引发次级免疫应答，例如以增强已经削弱或减弱的现有免疫应答，或者重新产生已经消失或无法再被检测到的先前免疫应答。次级或记忆免疫应答可以是体液(抗体)应答或细胞应答。在刺激首次呈递抗原时产生的记忆B细胞后发生次级或记忆体液应答。迟发型超敏(DTH)反应是CD4+T细胞介导的细胞次级或记忆免疫应答的类型。首次暴露于抗原启动免疫系统，并且另外的一次或多次暴露导致DTH。
适当的免疫后，可以从受试者的血清制备抗A33抗体。如果需要，可以从哺乳动物(例如从血液)分离针对A33蛋白的抗体分子，并通过熟知的技术如多肽A色谱进一步纯化以获得IgG级分。
单克隆抗体。在本技术的一个实施方案中，抗体是抗A33单克隆抗体。例如，在一些实施方案中，抗A33单克隆抗体可以是人或小鼠抗A33单克隆抗体。为了制备针对A33蛋白或其衍生物、片段、类似物或同源物的单克隆抗体，可以使用通过连续细胞系培养产生抗体分子的任何技术。此类技术包括但不限于杂交瘤技术(参见例如，Kohler和Milstein,1975.Nature 256:495-497)；三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见例如，Kozbor等人,1983.Immunol.Today 4:72)和EBV杂交瘤技术来产生人单克隆抗体(参见例如，Cole等人,1985.In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER T HERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)。人单克隆抗体可以用于本技术的实践中，并可以通过使用人杂交瘤(参见例如，Cote等人,1983.Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 80:2026-2030)或通过在体外用埃伯斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒转化人B细胞(参见例如，Cole等人,1985.In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)来产生。例如，可以分离编码抗体区域的核酸群。将利用衍生自编码抗体保守区的序列的引物的PCR用于从所述群体扩增编码抗体部分的序列，然后从扩增的序列重建编码抗体或其片段(如可变结构域)的DNA。此类扩增的序列也可以与编码其他蛋白质-例如噬菌体外壳或细菌细胞表面蛋白的DNA融合，-以在噬菌体或细菌上表达和展示融合多肽。然后可以表达扩增的序列，并基于例如表达的抗体或其片段对存在于A33蛋白上的抗原或表位的亲和力来进行进一步选择或分离。可替代地，可以通过对受试者进行免疫并随后使用常规方法从受试者的脾脏分离杂交瘤来制备表达抗A33单克隆抗体的杂交瘤。参见例如，Milstein等人(Galfre和Milstein,Methods Enzymol(1981)73:3-46)。使用标准方法筛选杂交瘤将产生具有不同特异性(即针对不同表位)和亲和力的单克隆抗体。具有所需特性(例如，A33结合)的所选单克隆抗体可以如杂交瘤表达地使用，可以将其与分子(如聚乙二醇(PEG))结合以改变其特性，或者可将编码所述单克隆抗体的cDNA以各种方式进行分离、测序和操纵。可以将合成的树型体(dendromeric)树添加到反应性氨基酸侧链例如赖氨酸，以增强A33蛋白的免疫原性特性。另外，CPG-二核苷酸技术可用于增强A33蛋白的免疫原性特性。其他操纵包括使促进抗体在储存过程中或在给予至受试者后的不稳定性的特定氨基酰基残基取代或缺失，以及亲和力成熟技术以改善A33蛋白的抗体的亲和力。
杂交瘤技术。在一些实施方案中，本技术的抗体是由杂交瘤产生的抗A33单克隆抗体，所述杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞，所述转基因非人动物具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的并且在以下文献中传授的那些：Harlow等人,Antibodies:A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,纽约州,349(1988)；Hammerling等人,Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas,563-681(1981)。用于产生杂交瘤和单克隆抗体的其他方法是本领域技术人员熟知的。
噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来产生本技术的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备抗A33抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在噬菌体粒子的表面上，所述噬菌体粒子携带编码所述功能性抗体结构域的多核苷酸序列。通过直接用抗原(通常是结合或捕获到固体表面或珠粒上的抗原)选择，从库或组合抗体文库(例如人或鼠)选择具有所需结合特性的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包含具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的fd和M13，所述结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。此外，方法可以适用于Fab表达文库的构建(参见例如，Huse等人,.Science 246:1275-1281,1989)，以允许快速且有效地鉴定对A33多肽(例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物)具有所希望特异性的单克隆Fab片段。可以用于制造本技术的抗体的噬菌体展示方法的其他例子包括以下文献中所披露的那些：Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,85:5879-5883,1988；Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,87:1066-1070,1990；Brinkman等人,J.Immunol.Methods 182:41-50,1995；Ames等人,J.Immunol.Methods 184:177-186,1995；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.24:952-958,1994；Persic等人,Gene 187:9-18,1997；Burton等人,Advances in Immunology 57:191-280,1994；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047(医学研究委员会等人)；WO 97/08320(Morphosys)；WO92/01047(CAT/MRC)；WO 91/17271(Affymax)以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743。Lohning的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键附接多肽而在噬菌体粒子表面上展示多肽的方法。如上述参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并且将其用于产生完整抗体(包括人抗体)或任何其他所需的抗原结合片段，并在任何所需宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达。例如，重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术也可以使用本领域已知的方法来利用，所述方法如以下文献中披露的那些：WO 92/22324；Mullinax等人,BioTechniques 12:864-869,1992；和Sawai等人,AJRI 34:26-34,1995；以及Better等人,Science240:1041-1043,1988。
通常，可以针对适当抗原选择克隆到展示载体中的杂合抗体或杂合抗体片段，以鉴定保持良好结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒粒子的表面上。参见例如，Barbas III等人,Phage Display,A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,纽约,2001)。然而，其他载体形式可用于此过程，如将抗体片段文库克隆到裂解性噬菌体载体(经修饰的T7或Lambda Zap系统)中进行选择和/或筛选。
重组抗A33抗体的表达。如上所述，可以通过应用重组DNA技术来产生本技术的抗体。编码本技术的抗A33抗体的重组多核苷酸构建体通常包括与抗A33抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列，所述表达控制序列包括天然缔合的或异源的启动子区域。因此，本技术的另一方面包括含有编码本技术的抗A33抗体的一种或多种核酸序列的载体。对于一种或多种本技术的多肽的重组表达，通过本领域中熟知和如下详述的重组DNA技术将含有编码抗A33抗体的核苷酸序列的全部或一部分的核酸插入合适的克隆载体或表达载体(即含有用于插入的多肽编码序列的转录和翻译的必要元件的载体)中。Lerner等人的美国专利号6,291,160和6,680,192已经描述了用于产生多种载体群体的方法。
一般而言，可用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒形式。在本公开文本中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本技术旨在包括在技术上不是质粒的、发挥同等功能的此类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。此类病毒载体允许感染受试者并在该受试者中表达构建体。在一些实施方案中，表达控制序列是在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体掺入合适的宿主中，就将宿主维持在适合于高水平表达编码抗A33抗体的核苷酸序列以及收集和纯化抗A33抗体(例如交叉反应的抗A33抗体)的条件下。一般参见，U.S.2002/0199213。这些表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标记物，例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性，以允许检测那些用所需DNA序列转化的细胞。载体还可以编码可用于引导细胞外抗体片段的分泌的信号肽，例如果胶裂解酶。参见美国专利号5,576,195。
本技术的重组表达载体包含编码具有A33结合特性的蛋白质的核酸，所述重组表达载体呈适合于所述核酸在宿主细胞中表达的形式，这意味着所述重组表达载体包括根据用于表达的宿主细胞选择的一种或多种调节序列，所述一种或多种调节序列与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在意指，目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式与一个或多个调节序列连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如以下文献中：Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的那些(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如以下等因素：待转化的宿主细胞的选择、所需多肽的表达水平等。可用作重组多肽(例如抗A33抗体)表达的启动子的典型调节序列包括例如但不限于3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶的启动子。诱导型酵母启动子尤其包括来自以下的启动子：醇脱氢酶、异细胞色素C、以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在一个实施方案中，编码本技术的抗A33抗体的多核苷酸与ara B启动子可操作地连接并且在宿主细胞中是可表达的。参见美国专利5,028,530。可以将本技术的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由本文所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽(例如，抗A33抗体等)。
本技术的另一方面涉及表达抗A33抗体的宿主细胞，其含有编码一种或多种抗A33抗体的核酸。本技术的重组表达载体可以被设计用于在原核或真核细胞中表达抗A33抗体。例如，抗A33抗体可以在细菌细胞(如大肠杆菌(Escherichia coli))、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞(例如酵母、酵母细胞)或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞进一步论述于以下文献中：Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY 185,Academic Press,圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)。可替代地，可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译重组表达载体。先前已经描述了可用于经由表达随机产生的多核苷酸序列来制备并筛选具有预定特性的多肽(例如抗A33抗体)的方法。参见美国专利号5,763,192；5,723,323；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862；6,492,107；6,569,641。
多肽在原核生物中的表达最常在大肠杆菌中用含有引导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体进行。融合载体将许多氨基酸添加至其中编码的多肽，通常添加至重组多肽的氨基末端。此类融合载体通常具有三个目的：(i)增加重组多肽的表达；(ii)增加重组多肽的溶解度；以及(iii)通过充当亲和纯化中的配体来帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点，以使得在纯化融合多肽之后能够从融合部分分离重组多肽。此类酶及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson,1988.Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs，贝弗利，马萨诸塞州)和pRIT5(Pharmacia，皮斯卡塔韦，新泽西州)，它们分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A与靶重组多肽融合。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amrann等人,(1988)Gene 69:301-315)和pET 11d(Studier等人,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY 185,Academic Press,圣地亚哥,加利福尼亚州(1990)60-89)。Pack等人的美国专利号6,294,353；6,692,935已经描述了用于经由多肽融合来靶向组装不同活性肽或蛋白质结构域以产生多功能多肽的方法。一种最大化大肠杆菌中的重组多肽(例如抗A33抗体)表达的策略是在以蛋白水解方式切割重组多肽的能力受损的宿主细菌中表达所述多肽。参见例如，Gottesman,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,圣地亚哥,加利福尼亚州(1990)119-128。另一种策略是改变要插入表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的单独密码子是表达宿主(例如大肠杆菌)中优先使用的那些密码子(参见例如Wada等人,1992.Nucl.Acids Res.20:2111-2118)。本技术的核酸序列的这种改变可以通过标准的DNA合成技术来进行。
在另一个实施方案中，抗A33抗体表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari等人,1987.EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,Cell 30:933-943,1982)、pJRY88(Schultz等人,Gene 54:113-123,1987)、pYES2(Invitrogen Corporation,圣地亚哥,加利福尼亚州)和picZ(Invitrogen Corp,圣地亚哥,加利福尼亚州)。可替代地，可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达抗A33抗体。可用于在培养的昆虫细胞(例如SF9细胞)中表达多肽(例如抗A33抗体)的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,Mol.Cell.Biol.3:2156-2165,1983)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989.Virology 170:31-39)。
在又另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达编码本技术的抗A33抗体的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括例如但不限于pCDM8(Seed,Nature329:840,1987)和pMT2PC(Kaufman等人,EMB O J.6:187-195,1987)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。关于可用于表达本技术的抗A33抗体的原核和真核细胞两者的其他合适的表达系统，参见例如Sambrook等人,MOLECULAR CL ONING:A LABORATORYMANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laborato ry,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,纽约,1989的第16章和第17章。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸在特定细胞类型中的表达(例如组织特异性调节元件)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性例子包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等人,Genes Dev.1:268-277,1987)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,Adv.Immunol.43:235-275,1988)、T细胞受体(Winoto和Baltimore,EMBO J.8:729-733,1989)和免疫球蛋白(Banerji等人,1983.Cell 33:729-740；Queen和Baltimore,Cell 33:741-748,1983.)的启动子、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477,1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985.Science 230:912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如，牛奶乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss,Science 249:374-379,1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,Genes Dev.3:537-546,1989)。
本发明方法的另一个方面涉及宿主细胞，其中已经引入了本技术的重组表达载体。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。应当理解，此类术语不仅是指特定的受试者细胞，而且还指这种细胞的子代或潜在子代。因为在后代中由于突变或环境影响可能发生某些修饰，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的所述术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，抗A33抗体可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。哺乳动物细胞是适合于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的宿主。参见Winnacker,From Genes To Clones,(VCHPublishers,纽约州,1987)。在本领域中已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白的合适的宿主细胞系，并且所述合适的宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。在一些实施方案中，所述细胞是非人的。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点、启动子、增强子，以及必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。Queen等人,Immunol.Rev.89:49,1986。说明性表达控制序列是源自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。Co等人,J Immunol.148:1149,1992。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”旨在是指用于将外源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的各种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、基因枪或基于病毒的转染。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见Sambrook等人,Molecular Cloning)。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在以下文献中找到：Sambrook等人(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,纽约,1989)和其他实验室手册。取决于细胞宿主的类型，可以通过熟知的方法将含有目的DNA区段的载体转移到宿主细胞中。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所用的表达载体和转染技术，只有小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选择标记物(例如，对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。各种可选择标记物包括赋予对药物(如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)的抗性的那些可选择标记物。可以将编码可选择标记物的核酸在与编码抗A33抗体的载体相同的载体上引入宿主细胞中，或者可以在单独的载体上引入。可以通过药物选择来鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已掺入可选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
包括本技术的抗A33抗体的宿主细胞(如培养中的原核或真核宿主细胞)可以用于产生(即表达)重组抗A33抗体。在一个实施方案中，所述方法包括在合适的培养基中培养宿主细胞(已向其中引入了编码抗A33抗体的重组表达载体)，从而产生抗A33抗体。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离抗A33抗体的步骤。一旦表达，就从培养基和宿主细胞纯化抗A33抗体，例如抗A33抗体或抗A33抗体相关多肽的收集物。可以根据本领域的标准程序(包括HPLC纯化、柱色谱、凝胶电泳等)纯化抗A33抗体。在一个实施方案中，通过Boss等人,美国专利号4,816,397的方法在宿主生物体中产生抗A33抗体。通常，抗A33抗体链信号序列一起表达，并由此被释放到培养基中。然而，如果抗A33抗体链不是由宿主细胞自然分泌的，则可以通过用温和的洗涤剂处理来释放抗A33抗体链。重组多肽的纯化是本领域熟知的，并且包括硫酸铵沉淀、亲和色谱纯化技术、柱色谱、离子交换纯化技术、凝胶电泳等(一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,纽约,1982))。
可将编码抗A33抗体的多核苷酸例如抗A33抗体的编码序列掺入转基因中，以供引入转基因动物的基因组中并随后在转基因动物的乳汁中表达。参见例如，美国专利号5,741,957、5,304,489和5,849,992。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因(如酪蛋白或β-乳球蛋白)的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链的编码序列。对于转基因动物的产生，可以将转基因显微注射到受精的卵母细胞中，或者可以将转基因掺入胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的核转移到无核的卵母细胞中。
单链抗体。在一个实施方案中，本技术的抗A33抗体是单链抗A33抗体。根据本技术，技术可以适用于产生对A33蛋白具有特异性的单链抗体(参见例如，美国专利号4,946,778)。可以用于产生本技术的单链Fv和抗体的技术的例子包括描述于以下文献中的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人,Methods in Enzymology,203:46-88,1991；Shu,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999,1993；和Skerra等人,Science240:1038-1040,1988。
嵌合和人源化抗体。在一个实施方案中，本技术的抗A33抗体是嵌合抗A33抗体。在一个实施方案中，本技术的抗A33抗体是人源化抗A33抗体。在本技术的一个实施方案中，供体抗体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体。例如，受体抗体是人抗体(以使其在人中的抗原性最小化)，在这种情况下所得的CDR移植抗体称为“人源化”抗体。
包含人和非人部分的重组抗A33抗体(如嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体)可以使用标准重组DNA技术来制备，并且在本技术范围内。对于某些用途，包括本技术的抗A33抗体在人体中的体内用途以及这些药剂在体外检测测定中的用途，可以使用嵌合或人源化抗A33抗体。此类嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。此类有用的方法包括例如但不限于描述于以下文献中的方法：国际申请号PCT/US86/02269；美国专利号5,225,539；欧洲专利号184187；欧洲专利号171496；欧洲专利号173494；PCT国际公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；5,225,539；欧洲专利号125023；Better等人,1988.Science 240:1041-1043；Liu等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人,1987.J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人,1987.Cancer Res.47:999-1005；Wood等人,1985.Nature 314:446-449；Shaw等人,1988.J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4:214；Jones等人,1986.Nature 321:552-525；Verhoeyan等人,1988.Science 239:1534；Morrison,Science 229:1202,1985；Oi等人,BioTechniques 4:214,1986；Gillies等人,J.Immunol.Methods,125:191-202,1989；美国专利号5,807,715；和Beidler等人,1988.J.Immunol.141:4053-4060。例如，可以使用多种技术将抗体人源化，所述技术包括CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利号5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,248,516；EP460167)、镶面或表面重修(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.,Molecular Immunology,28:489-498,1991；Studnicka等人,Protein Engineering 7:805-814,1994；Roguska等人,PNAS 91:969-973,1994)和链改组(美国专利号5,565,332)。在一个实施方案中，用特异性选择的限制性内切酶消化编码鼠抗A33单克隆抗体的cDNA，以除去编码Fc恒定区的序列，并取代编码人Fc恒定区的cDNA的等效部分(参见Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人美国专利号4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)Science 240:1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人(1987)JImmunol 139:3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res 47:999-1005；Wood等人(1985)Nature 314:446-449；以及Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；美国专利号6,180,370；美国专利号6,300,064；6,696,248；6,706,484；6,828,422。
在一个实施方案中，本技术提供人源化抗A33抗体的构建，所述人源化抗A33抗体不太可能诱导人抗小鼠抗体(以下称为“HAMA”)应答，同时仍然具有有效的抗体效应子功能。如本文所用，关于抗体的术语“人”和“人源化”涉及预期在人受试者中引发治疗上可耐受的弱免疫原性应答的任何抗体。在一个实施方案中，本技术提供人源化抗A33抗体、重链和轻链免疫球蛋白。
CDR抗体。在一些实施方案中，本技术的抗A33抗体是抗A33 CDR抗体。通常，用于产生抗A33 CDR抗体的供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体；通常，受体抗体是人抗体(以使其在人中的抗原性最小化)，在这种情况下所得的CDR移植抗体称为“人源化”抗体。移植物可以具有受体抗体的单个VH或VL内的单个CDR(或甚至单个CDR的一部分)，或者可以具有VH和VL中的一个或两个内的多个CDR(或其部分)。通常，受体抗体的所有可变结构域中的所有三个CDR都将被相应的供体CDR替代，但只需要替代所需数量，以使所得的CDR移植抗体与A33蛋白充分结合。用于产生CDR移植和人源化抗体的方法在以下文献中传授：Queen等人的美国专利号5,585,089；美国专利号5,693,761；美国专利号5,693,762；和Winter的U.S.5,225,539；和EP 0682040。可用于制备VH和VL多肽的方法在以下文献中传授：Winter等人,美国专利号4,816,397；6,291,158；6,291,159；6,291,161；6,545,142；EP 0368684；EP0451216；和EP0120694。
选择来自相同家族和/或相同家族成员的合适的框架区候选物后，重链和轻链可变区中的一个或两个是通过将来自起源物种的CDR移植到杂合框架区中而产生的。可以使用本领域技术人员已知的常规方法来完成关于以上任一方面的具有杂合可变链区的杂合抗体或杂合抗体片段的组装。例如，可以通过寡核苷酸合成和/或PCR来产生编码本文所述的杂合可变结构域(即，基于靶物种的框架和来自起源物种的CDR)的DNA序列。也可以使用合适的限制酶从起源物种抗体分离编码CDR区的核酸，并通过用合适的连接酶连接而连接到靶物种框架中。可替代地，可以通过定点诱变来改变起源物种抗体的可变链的框架区。
由于杂合体是从对应于每个框架区的多个候选物之间的选择构建的，因此存在适合于根据本文所述原理构建的许多序列组合。因此，可以组装杂合体的文库，其成员具有单独框架区的不同组合。此类文库可以是序列的电子数据库集合或杂合体的物理集合。
此过程通常不会改变移植CDR侧翼的受体抗体的FR。然而，本领域技术人员有时可以通过替代给定FR的某些残基以使FR与供体抗体的相应FR更相似，来提高所得抗A33 CDR移植抗体的抗原结合亲和力。合适的取代位置包括与CDR相邻的氨基酸残基，或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见例如，US 5,585,089，尤其是第12-16栏)。或者本领域技术人员可以从供体FR开始并对其进行修饰以使其与受体FR或人共有FR更相似。用于进行这些修饰的技术是本领域已知的。特别是如果所得的FR符合该位置的人共有FR或者与这种共有FR至少90％或更多相同，则与具有完全人FR的相同抗体相比，这样做可能不会显著增加所得经修饰的抗A33 CDR移植抗体的抗原性。
双特异性抗体(BsAb)。双特异性抗体是可以同时与具有不同结构的两个靶标(例如，两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位或者半抗原和靶抗原或靶抗原上的表位)结合的抗体。BsAb可以例如通过组合识别相同或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链来制备。在一些实施方案中，通过分子功能，双特异性结合剂在其两个结合臂中的一个结合臂(一个VH/VL对)上结合一个抗原(或表位)，并在其第二个臂(不同的VH/VL对)上结合不同的抗原(或表位)。依据此定义，双特异性结合剂具有两个不同的抗原结合臂(特异性和CDR序列两者均不同)，并且对于其结合的每种抗原是单价的。
本技术的双特异性抗体(BsAb)和双特异性抗体片段(BsFab)具有与例如A33特异性结合的至少一个臂和与第二靶抗原特异性结合的至少一个其他臂。在一些实施方案中，第二靶抗原是B细胞、T细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞的抗原或表位。另外地或可替代地，在某些实施方案中，第二靶抗原选自CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46和KIR。在某些实施方案中，BsAb能够与在细胞表面上表达A33抗原的肿瘤细胞结合。在一些实施方案中，BsAb已经工程化以通过将细胞毒性T细胞引导(或募集)到肿瘤部位来促进杀伤肿瘤细胞。其他示例性BsAb包括具有对A33具有特异性的第一抗原结合位点和对于小分子半抗原(例如DTP A、IMP288、DOTA、DOTA-Bn、DOTA去铁胺、本文所述的其他DOTA螯合物、生物素、荧光素或Goodwin,D A.等人,1994,Cancer Res.54(22):5937-5946中披露的那些)具有特异性的第二抗原结合位点的那些。
使用分子工程化可以产生多种双特异性融合蛋白。例如，已经构建了利用完整的免疫球蛋白框架(例如IgG)、单链可变片段(scFv)或其组合的BsAb。在一些实施方案中，双特异性融合蛋白是二价的，其包含例如具有针对一种抗原的单一结合位点的scFv和具有针对第二抗原的单一结合位点的Fab片段。在其他实施方案中，双特异性融合蛋白是四价的，其包含例如具有针对一种抗原的两个结合位点的免疫球蛋白(例如IgG)和针对第二抗原的两个相同scFv。已经显示由两个串联的scFv单元构成的BsAb是临床上成功的双特异性抗体形式。在一些实施方案中，BsAb包含两个串联的单链可变片段(scFv)，其被设计成使得结合肿瘤抗原(例如，A33)的scFv连接至接合T细胞的scFv(例如，通过结合CD3)。以这种方式，T细胞被募集到肿瘤部位，使得它们可以介导肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。参见例如，Dreier等人,J.Immunol.170:4397-4402(2003)；Bargou等人,Science 321:974-977(2008)。
用于产生BsAb的最新方法包括工程化重组单克隆抗体，其具有另外的半胱氨酸残基，使得它们比更常见的免疫球蛋白同种型更牢固地交联。参见例如，FitzGerald等人,Protein Eng.10(10):1221-1225(1997)。另一种方法是工程化重组融合蛋白，其连接具有所需的双重特异性的两种或更多种不同的单链抗体或抗体片段区段。参见例如，Coloma等人,Nature Biotech.15:159-163(1997)。使用分子工程化可以产生多种双特异性融合蛋白。
连接两种或更多种不同单链抗体或抗体片段的双特异性融合蛋白以类似的方式产生。重组方法可以用于产生多种融合蛋白。在一些特定的实施方案中，根据本技术的BsAb包含含有重链和轻链的免疫球蛋白以及scFv。在一些特定的实施方案中，scFv与本文公开的任何A33免疫球蛋白的重链的C末端连接。在一些特定的实施方案中，scFv与本文公开的任何A33免疫球蛋白的轻链的C末端连接。在各个实施方案中，scFv经由接头序列与重链或轻链连接。通过PCR反应，将重链Fd与scFv进行框内连接所必需的适当接头序列引入VL和Vκ结构域中。然后将编码scFv的DNA片段连接至含有编码CH1结构域的DNA序列的分期(staging)载体中。切下所得的scFv-CH1构建体，并将其连接至含有编码A33抗体的VH区的DNA序列的载体中。所得载体可用于转染合适的宿主细胞，如哺乳动物细胞，以表达双特异性融合蛋白。
在一些实施方案中，接头长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽提供灵活性(例如，第一和/或第二抗原结合位点)。在一些实施方案中，基于赋予BsAb的特定的特性，例如稳定性增加，在本文所述的BsAb中采用接头。在一些实施方案中，本技术的BsAb包含G4S接头。在一些特定的实施方案中，本技术的BsAb包含(G4S)n接头，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多。
Fc修饰。在一些实施方案中，本技术的抗A33抗体包含变体Fc区，其中所述变体Fc区包含相对于野生型Fc区(或亲本Fc区)的至少一个氨基酸修饰，使得所述分子对Fc受体(例如FcγR)的亲和力发生了改变，条件是基于Fc-Fc受体相互作用的晶体学和结构分析(如Sondermann等人,Nature,406:267-273(2000)所披露的那些)，所述变体Fc区在与Fc受体直接接触的位置没有取代。Fc区内与Fc受体(如FcγR)直接接触的位置的例子包括氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C7E环)和氨基酸327-332(F/G)环。
在一些实施方案中，本技术的抗A33抗体对激活和/或抑制性受体具有改变的亲和力，其中变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，其中所述一个或多个氨基酸修饰是N297取代为丙氨酸或K322取代为丙氨酸。
糖基化修饰。在一些实施方案中，本技术的抗A33抗体具有Fc区，所述Fc区与亲本Fc区相比含有变体糖基化。在一些实施方案中，变体糖基化包括不存在岩藻糖；在一些实施方案中，在GnT1缺乏的CHO细胞中表达导致变体糖基化。
在一些实施方案中，相对于与目的抗原(例如A33)结合的适当参考抗体，本技术的抗体可以具有经修饰的糖基化位点，而不改变抗体的功能性，例如与抗原的结合活性。如本文所用，“糖基化位点”包括抗体中将与寡糖(即，含有连接在一起的两个或更多个单糖的碳水化合物)特异性和共价附接的任何特定氨基酸序列。
寡糖侧链通常经由N连接或O连接与抗体的骨架连接。N连接的糖基化指寡糖部分附接至天冬酰胺残基的侧链。O连接的糖基化指寡糖部分附接至羟基氨基酸，例如丝氨酸、苏氨酸。例如，缺乏某些寡糖(包括岩藻糖)和末端N-乙酰葡糖胺的Fc-糖型(huA33-IgGln)可以在特殊的CHO细胞中产生，并展现出增强的ADCC效应子功能。
在一些实施方案中，通过添加或缺失糖基化位点来修饰本文公开的免疫球蛋白相关组合物的碳水化合物含量。用于修饰抗体的碳水化合物含量的方法是本领域熟知的并且包括在本技术内，参见例如美国专利号6,218,149；EP 0359096B1；美国专利公开号US2002/0028486；国际专利申请公开WO 03/035835；美国专利公开号2003/0115614；美国专利号6,218,149；美国专利号6,472,511；所有这些参考文献均通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，通过缺失抗体的一个或多个内源性碳水化合物部分来修饰抗体(或其相关部分或组分)的碳水化合物含量。在一些特定的实施方案中，本技术包括通过将位置297的天冬酰胺修饰为丙氨酸来缺失抗体Fc区的糖基化位点。
工程化的糖型可用于多种目的，包括(但不限于)增强或减弱效应子功能。工程化糖型可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生，所述方法是例如通过使用工程化或变体表达菌株、通过与一种或多种酶(例如DI N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))共表达、通过在各种生物体或来自多种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子、或通过在已经表达包含Fc区的分子后修饰一种或多种碳水化合物。用于产生工程化糖型的方法是本领域已知的，并且包括但不限于描述于以下文献中的那些：Umana等人,1999,Nat.Biotechnol.17:176-180；Davies等人,2001,Biotechnol.Bioeng.74:288-294；Shields等人,2002,J.Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,J.Biol.Chem.278:3466-3473；美国专利号6,602,684；美国专利申请序列号10/277,370；美国专利申请序列号10/113,929；国际专利申请公开WO 00/61739A1；WO 01/292246A1；WO02/311140A1；WO 02/30954A1；POTILLEGENTTM技术(Biowa,Inc.，普林斯顿，新泽西州)；GLYCOMABTM糖基化工程技术(GLYCART biotechnology AG，苏黎士，瑞士)；这些文献各自通过引用以其整体并入本文。参见例如，国际专利申请公开WO 00/061739；美国专利申请公开号2003/0115614；Okazaki等人,2004,JMB,336:1239-49。
融合蛋白。在一个实施方案中，本技术的抗A33抗体是融合蛋白。当与第二蛋白质融合时，本技术的抗A33抗体可以用作抗原标签。可以与多肽融合的结构域的例子不仅包括异源信号序列，还包括其他异源功能区。融合不一定是直接的，而是可以通过接头序列进行。而且，本技术的融合蛋白也可以工程化以改善抗A33抗体的特征。例如，可以将另外的氨基酸(特别是带电氨基酸)的区域添加至抗A33抗体的N-末端以改善在从宿主细胞纯化或随后的处理和储存过程中的稳定性和持久性。另外，可以将肽部分添加到抗A33抗体以促进纯化。可以在最终制备抗A33抗体之前去除此类区域。添加肽部分以促进多肽的处理是本领域熟知的常规技术。可以将本技术的抗A33抗体与标记序列(如促进融合多肽的纯化的肽)融合。在选择的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，尤其如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，查茨沃斯(Chatsworth)，加利福尼亚州)中提供的标签，许多所述六组氨酸肽是可商购的。如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824,1989中所述，例如，六组氨酸使得可便利地纯化融合蛋白。另一个可用于纯化的肽标签即“HA”标签对应于源自流感血凝素蛋白的表位。Wilson等人,Cell 37:767,1984。
因此，任何这些上述融合蛋白可以使用本技术的多核苷酸或多肽进行工程化。另外，在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白显示增加的体内半衰期。
与单独的单体分泌的蛋白质或蛋白质片段相比，具有二硫键连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白可以更高效地结合和中和其他分子。Fountoulakis等人,J.Biochem.270:3958-3964,1995。
类似地，EP-A-O 464 533(加拿大对应案2045869)公开了融合蛋白，其包含免疫球蛋白分子恒定区的各个部分以及另一种人蛋白或其片段。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有益的，因此可以导致例如改善的药代动力学特性。参见EP-A 0232262。可替代地，可能需要在表达、检测和纯化融合蛋白后缺失或修饰Fc部分。例如，如果使用融合蛋白作为抗原用于免疫，则Fc部分可能妨碍治疗和诊断。在药物发现中，例如人蛋白(如hIL-5)已经与Fc部分融合，用于高通量筛选测定以鉴定hIL-5的拮抗剂的目的。Bennett等人,J.Molecular Recognition 8:52-58,1995；Johanson等人,J.Biol.Chem.,270:9459-9471,1995。
标记的抗A33抗体。在一个实施方案中，本技术的抗A33抗体与标记部分即可检测基团偶联。与抗A33抗体缀合的特定标记或可检测基团不是本技术的关键方面，只要它不显著干扰本技术的抗A33抗体与A33蛋白的特异性结合即可。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性的任何材料。此类可检测的标记在免疫测定和成像领域已经得到了很好的发展。一般而言，可用于此类方法中的几乎任何标记都可以应用于本技术。因此，标记是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。在本技术的实践中有用的标记包括磁珠(例如，DynabeadsTM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如，3H、14C、35S、125I、121I、131I、112In、99mTc)、其他成像剂如微泡(用于超声成像)、18F、11C、15O(用于正电子发射断层摄影术)、99mTC、111In(用于单光子发射断层摄影术)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)和量热标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠粒。描述此类标记的用途的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241，其每一个均通过引用以其整体并且出于所有目的并入本文。也参见Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第6版,MolecularProbes,Inc.,俄勒冈州尤金市)。
可以根据本领域熟知的方法将标记直接或间接地与测定的所需组分偶联。如上所述，可以使用多种标记，标记的选择取决于诸如以下的因素：所需的灵敏度、与化合物缀合的简便性、稳定性要求、可用的仪器以及处置规定。
非放射性标记通常通过间接方式附接。通常，配体分子(例如生物素)与分子共价结合。然后配体与抗配体(例如，链霉亲和素)分子结合，所述抗配体分子是固有地可检测的或者与信号系统共价结合，所述信号系统如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。可使用许多配体和抗配体。在配体(例如生物素、甲状腺素和皮质醇)具有天然抗配体的情况下，所述配体可与标记的天然存在的抗配体结合使用。可替代地，任何半抗原或抗原化合物可与抗体例如抗A33抗体组合使用。
分子还可以与产生信号的化合物直接缀合，例如通过与酶或荧光团缀合。作为标记的目的酶将主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或者是氧化还原酶，特别是过氧化物酶。可用作标记部分的荧光化合物包括但不限于例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰基、伞形酮等。可用作标记部分的化学发光化合物包括但不限于例如萤光素和2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。关于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见美国专利号4,391,904。
检测标记的手段是本领域技术人员熟知的。因此，例如，在标记是放射性标记的情况下，检测手段包括闪烁计数器或胶片，如在放射自显影中。在标记是荧光标记的情况下，它可以通过用适当波长的光激发荧光染料并检测产生的荧光来检测。荧光可以以目测形式、借助胶片、通过使用电子检测器如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等来检测。类似地，酶标记可以通过提供酶的适当底物并检测所得反应产物来检测。最后，简单的比色标记可以通过观察与标记相关的颜色简单地检测。因此，在各种油尺测定中，缀合金经常呈粉色，而各种缀合的珠粒呈现珠粒的颜色。
一些测定形式不需要使用标记的组分。例如，凝集测定可用于检测靶抗体例如抗A33抗体的存在。在这种情况下，通过包含靶抗体的样品将抗原包被的颗粒凝集。在这种形式中，不需要标记任何组分，并且通过简单的目测检查来检测靶抗体的存在。
B.鉴定并表征本技术的抗A33抗体
用于鉴定和/或筛选本技术的抗A33抗体的方法。用于在针对A33多肽的抗体中鉴定和筛选对A33蛋白具有所需特异性的抗体的方法包括本领域中已知的任何免疫介导的技术。可以通过本领域普通技术人员熟知的各种方法在体外检测免疫应答的组分。例如，(1)可以将细胞毒性T淋巴细胞与放射性标记的靶细胞一起孵育，并通过放射性的释放来检测这些靶细胞的裂解；(2)可以将辅助T淋巴细胞与抗原和抗原呈递细胞一起孵育，并通过标准方法测量细胞因子的合成和分泌(Windhagen A等人,Immunity,2:373-80,1995)；(3)可以将抗原呈递细胞与全蛋白抗原一起孵育，并通过T淋巴细胞激活测定或生物物理学方法检测该抗原在MHC上的呈递(Harding等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:4230-4,1989)；(4)可以将肥大细胞与交联其Fc-ε受体的试剂一起孵育，并通过酶免疫测定来测量组胺释放(Siraganian等人,TIPS,4:432-437,1983)；以及(5)酶联免疫吸附测定(ELISA)。
类似地，也可以通过本领域普通技术人员熟知的各种方法来检测模型生物体(例如小鼠)或人受试者中免疫应答的产物。例如，(1)可以通过目前用于临床实验室中的标准方法例如ELISA容易地检测响应于疫苗接种的抗体的产生；(2)可以通过刮伤皮肤表面并放置无菌容器以捕获刮痕部位上的迁移细胞来检测免疫细胞向炎症部位的迁移(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988)；(3)可以使用3H-胸苷测量外周血单核细胞(PBMC)响应于有丝分裂原或混合淋巴细胞反应的增殖；(4)可以通过将PBMC与标记的颗粒一起置于孔中来测量粒细胞、巨噬细胞和其他吞噬细胞在PBMC中的吞噬能力(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988)；和(5)可以通过用针对CD分子(如CD4和CD8)的抗体标记PBMC并测量表达这些标记物的PBMC的分数来测量免疫系统细胞的分化。
在一个实施方案中，利用A33肽在可复制的遗传包装的表面上的展示来选择本技术的抗A33抗体。参见例如，美国专利号5,514,548；5,837,500；5,871,907；5,885,793；5,969,108；6,225,447；6,291,650；6,492,160；EP 585 287；EP 605522；EP 616640；EP1024191；EP 589 877；EP 774 511；EP 844 306。已经描述了可用于产生/选择丝状噬菌体粒子的方法，所述丝状噬菌体粒子含有编码具有所需特异性的结合分子的噬菌粒基因组。参见例如，EP 774 511；US 5871907；US 5969108；US 6225447；US 6291650；US 6492160。
在一些实施方案中，利用A33肽在酵母宿主细胞的表面上的展示来选择本技术的抗A33抗体。可用于通过酵母表面展示分离scFv多肽的方法已经由Kieke等人,ProteinEng.1997年11月；10(11):1303-10描述。
在一些实施方案中，使用核糖体展示选择本技术的抗A33抗体。可用于使用核糖体展示来鉴定肽文库中配体的方法已经由Mattheakis等人,Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 91:9022-26,1994；和Hanes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937-42,1997描述。
在某些实施方案中，使用A33肽的tRNA展示来选择本技术的抗A33抗体。可用于使用tRNA展示进行配体的体外选择的方法已经由Merryman等人,Chem.Biol.,9:741-46,2002描述。
在一个实施方案中，使用RNA展示选择本技术的抗A33抗体。可用于使用RNA展示文库选择肽和蛋白质的方法已经由Roberts等人Proc.Natl.Acad.Sc i.USA,94:12297-302,1997；和Nemoto等人,FEBS Lett.,414:405-8,1997描述。可用于使用非天然RNA展示文库选择肽和蛋白质的方法已经由Franke l等人,Curr.Opin.Struct.Biol.,13:506-12,2003描述。
在一些实施方案中，将本技术的抗A33抗体在革兰氏阴性菌的周质中表达，并与标记的A33蛋白混合。参见WO 02/34886。在表达对A33蛋白具有亲和力的重组多肽的克隆中，与抗A33抗体结合的标记的A33蛋白的浓度增加，并且允许细胞与文库的其余部分分离，如在Harvey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.22:9193-98 2004和美国专利公开号2004/0058403中所述。
在选择所需的抗A33抗体之后，预期可以通过本领域技术人员已知的任何技术(例如原核或真核细胞表达等)大量生产所述抗体。抗A33抗体(它们是例如但不限于抗A33杂合抗体或片段)可以通过以下方式来产生：使用常规技术构建编码抗体重链的表达载体，在所述抗体重链中保留起源物种抗体结合特异性所需的CDR和(如果需要)可变区框架的最小部分(如根据本文所述的技术工程化)源自起源物种抗体，并且抗体的其余部分源自可以如本文所述操纵的靶物种免疫球蛋白，从而产生用于表达杂合抗体重链的载体。
A33结合的测量。在一些实施方案中，A33结合测定是指一种测定形式，其中将A33蛋白和抗A33抗体在适合于A33蛋白与抗A33抗体之间结合和评估A33蛋白与抗A33抗体之间的结合量的条件下混合。将结合量与合适的对照进行比较，所述对照可以是在不存在A33蛋白的情况下的结合量、在存在非特异性免疫球蛋白组合物的情况下的结合量或两者。结合量可以通过任何合适的方法来评估。结合测定法包括例如ELISA、放射免疫测定、临近闪烁测定、荧光能量转移测定、液相色谱、膜过滤测定等。用于直接测量与抗A33抗体结合的A33蛋白的生物物理学测定是例如核磁共振、荧光、荧光偏振、表面等离子体共振(BIACORE芯片)等。通过本领域已知的标准测定来确定特异性结合，所述标准测定是例如放射性配体结合测定、ELISA、FRET、免疫沉淀、SPR、NMR(2D-NMR)、质谱法等。如果候选抗A33抗体的特异性结合比在不存在候选抗A33抗体的情况下观察到的结合高至少1％，则所述候选抗A33抗体可用作抗本技术的抗A33抗体。
A33中和的测量。如本文所用，“A33中和”是指通过抗A33抗体的结合降低A33蛋白的活性和/或表达。可以使用本领域已知的方法在体外或体内评估本技术的抗A33抗体中和A33活性/表达的能力。
本技术的抗A33抗体的用途
概述。本技术的抗A33抗体可用于本领域已知与A33蛋白的定位和/或定量有关的方法中(例如，用于测量适当的生理样品中A33蛋白的水平、用于诊断方法、用于多肽成像等)的。本技术的抗体可用于通过标准技术如亲和色谱或免疫沉淀来分离A33蛋白。本技术的抗A33抗体可以促进从生物样品例如哺乳动物血清或细胞纯化天然免疫反应性A33蛋白，以及在宿主系统中表达的重组产生的免疫反应性A33蛋白的纯化。此外，抗A33抗体可用于检测免疫反应性A33蛋白(例如，在血浆、细胞裂解液或细胞上清液中)以评价免疫反应性多肽的表达丰度和模式。本技术的抗A33抗体可以用于诊断性地监测组织中的免疫反应性A33蛋白水平作为临床测试程序的一部分，例如以确定给定治疗方案的功效。如上所述，可以通过将本技术的抗A33抗体与可检测物质偶联(即物理连接)来促进检测。
A33蛋白的检测。用于检测生物样品中是否存在免疫反应性A33蛋白的示例性方法涉及从测试受试者获得生物样品，并使所述生物样品与本技术的能够检测免疫反应性A33蛋白的抗A33抗体接触，从而检测生物样品中免疫反应性A33蛋白的存在。可以通过附接于抗体的可检测标记来完成检测。
关于抗A33抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质与抗体偶联(即物理连接)来直接标记抗体，以及通过与直接标记的另一化合物(如二抗)的反应性来间接标记抗体。间接标记的例子包括使用荧光标记的二抗检测一抗以及用生物素对DNA探针进行末端标记，使得可以用荧光标记的链霉亲和素对其进行检测。
在一些实施方案中，将本文公开的抗A33抗体与一个或多个可检测标记缀合。对于此类用途，抗A33抗体可以通过发色剂、酶剂、放射性同位素剂、同位素剂、荧光剂、毒性剂、化学发光剂、核磁共振造影剂或其他标记的共价或非共价附接来可检测地标记。
合适的发色标记的例子包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-甲酸。合适的酶标记的例子包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记的例子包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。111In是使用体内成像的示例性同位素，因为它避免了肝脏对125I或131I标记的A33结合抗体脱卤的问题。此外，这种同位素具有对于成像更有利的伽马发射能量(Perkins等人,Eur.J.Nucl.Med.70:296-301(1985)；Carasquillo等人,J.Nucl.Med.25:281-287(1987))。例如，与具有1-(P-异硫氰基苄基)-DPTA的单克隆抗体偶联的111In在非肿瘤组织(特别是肝脏)中展现出很少的吸收，并增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人,J.Nucl.Med.28:861-870(1987))。合适的非放射性同位素标记的例子包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记的例子包括152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸盐标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。合适的毒素标记的例子包括白喉毒素、蓖麻毒素和霍乱毒素。
化学发光标记的例子包括鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯(acridiniumester)标记、咪唑标记、吖啶盐(acridinium salt)标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记和水母发光蛋白标记。核磁共振造影剂的例子包括重金属核，如Gd、Mn和铁。
本技术的检测方法可以用于在体外以及在体内检测生物样品中的免疫反应性A33蛋白。用于检测免疫反应性A33蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光。此外，用于检测免疫反应性A33蛋白的体内技术包括将标记的抗A33抗体引入受试者中。例如，可以用放射性标记物标记抗A33抗体，所述放射性标记物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术来检测。在一个实施方案中，生物样品含有来自测试受试者的A33蛋白分子。
免疫测定和成像。本技术的抗A33抗体可用于使用基于抗体的技术测定生物样品(例如人血浆)中的免疫反应性A33蛋白水平。例如，组织中的蛋白质表达可以用经典免疫组织学方法来研究。Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.101:976-985,1985；Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.105:3087-3096,1987。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，并且包括酶标记(如葡萄糖氧化酶)和放射性同位素或其他放射性剂(如碘(125I、121I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc))和荧光标记(如荧光素、罗丹明和绿色荧光蛋白(GFP))以及生物素。
除了测定生物样品中的免疫反应性A33蛋白水平外，本技术的抗A33抗体也可用于A33的体内成像。可用于此方法的抗体包括可通过X射线照相术、NMR或ESR检测的那些抗体。对于X射线照相术，合适的标记包括放射性同位素，如钡或铯，它们发射出可检测的辐射，但对受试者没有明显的伤害。适用于NMR和ESR的标记物包括具有可检测特征性自旋的那些标记，如氘，可以通过标记用于相关scFv克隆的营养素而将所述标记物掺入抗A33抗体中。
将已用适当的可检测成像部分(如放射性同位素(例如131I、112In、99mTc)、不透射线的物质或通过核磁共振可检测的材料)标记的抗A33抗体引入(例如肠胃外、皮下或腹膜内)受试者中。在本领域中将理解，受试者的大小和所使用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下，对于人受试者，所注射的放射性的量通常在约5至20毫居里99mTc的范围内。然后，标记的抗A33抗体将积聚在含有特定靶多肽的细胞位置。例如，本技术的经标记的抗A33抗体将积聚在受试者体内已定位有A33蛋白的细胞和组织中。
因此，本技术提供了医学病症的诊断方法，其涉及：(a)通过测量本技术的抗A33抗体在个体的细胞或体液中的结合来测定免疫反应性A33蛋白的表达；(b)将样品中存在的免疫反应性A33蛋白的量与标准参照物进行比较，其中与标准品相比免疫反应性A33蛋白水平的升高或降低指示医学病症。
亲和纯化。本技术的抗A33抗体可以用于从样品纯化免疫反应性A33蛋白。在一些实施方案中，将抗体固定在固体支持物上。此类固体支持物的例子包括塑料(如聚碳酸酯)、复合碳水化合物(如琼脂糖(agarose)和琼脂糖(sepharose))、丙烯酸树脂以及如聚丙烯酰胺和乳胶珠粒。使抗体与此类固体支持物偶联的技术是本领域熟知的(Weir等人,“Handbook of Experimental Immunology”第4版,Blackwell Scientific Publications,牛津,英国,第10章(1986)；Jacoby等人,Meth.Enzym.34Academic Press,纽约(1974))。
将抗原与抗体-支持基质结合的最简单方法是将珠粒收集在柱子中，并使抗原溶液向下通过柱子。此方法的效率取决于固定化抗体与抗原之间的接触时间，可以通过使用低流速来延长所述接触时间。固定化抗体在抗原流过时捕获所述抗原。可替代地，可以通过以下方式使抗原与抗体支持基质接触：将抗原溶液与支持物(例如，珠粒)混合并旋转或摇动浆料，从而使抗原与固定化抗体之间实现最大接触。结合反应完成后，将浆料通入柱子中以收集珠粒。使用合适的洗涤缓冲液洗涤珠粒，然后洗脱纯的或基本上纯的抗原。
可以将目的抗体或多肽与固体支持物(如珠粒)缀合。另外，如果需要的话，也可以通过任何合适的手段(包括本文公开的用于将多肽与支持物缀合的那些手段)将第一固体支持物如珠粒与第二固体支持物(其可以是第二珠粒或其他支持物)缀合。因此，本文公开的关于多肽与固体支持物的缀合的任何缀合方法和手段也可以用于将第一支持物与第二支持物缀合，其中第一和第二固体支持物可以相同或不同。
用于将多肽与固体支持物缀合的合适的接头(其可以是交联剂)包括可以与支持物表面上存在的官能团或与多肽或两者反应的多种药剂。可用作交联剂的试剂包括同双官能试剂以及特别地异双官能试剂。有用的双官能交联剂包括但不限于N-SIAB、二马来酰亚胺、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMC C和6-HYNIC。可以选择交联剂以提供多肽与固体支持物之间的可选择性切割的键。例如，可以使用光不稳定的交联剂如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸，作为从固体支持物切割多肽的手段。(Brown等人,Mol.Divers,第4-12页(1995)；Rothschild等人,Nucl.Acids Res.,24:351-66(1996)；以及美国专利号5,643,722)。其他交联试剂是本领域熟知的。(参见例如，Wong(1991)，同上；和Hermanson(1996)，同上)。
可以通过在羧基官能化的珠粒与多肽的氨基末端之间形成的共价酰胺键，或者相反地通过在氨基官能化的珠粒与多肽的羧基末端之间形成的共价酰胺键，将抗体或多肽固定在固体支持物(如珠粒)上。另外，双官能的三苯甲基接头可以经由氨基树脂通过树脂上的氨基或羧基附接于支持物，例如附接于树脂(如Wang树脂)上的4-硝基苯基活性酯。使用双官能三苯甲基方法时，固体支持物可能需要使用挥发酸(如甲酸或三氟乙酸)进行处理，以确保多肽被切割并能够被去除。在这种情况下，多肽可以作为无珠粒的斑块沉积在固体支持物的孔底部或沉积在固体支持物的平坦表面上。添加基质溶液后，可将多肽解吸到MS中。
通过使用挥发酸或适当的基质溶液(例如含有3-HPA的基质溶液)从多肽切割氨基连接的三苯甲基，疏水性三苯甲基接头也可以用作酸不稳定的接头。酸不稳定性也可以改变。例如，可以将三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基改为多肽的适当的对位取代的或更加呈酸不稳定的三苯甲胺衍生物，即可以形成与所述多肽的三苯甲基醚键和三苯甲基胺键。因此，可以例如通过在酸性条件下破坏疏水引力或通过切割三苯甲基醚键或三苯甲胺键从疏水性接头去除多肽，所述酸性条件包括(如果需要)在典型的MS条件下，其中基质如3-HPA用作酸。
正交可切割的接头也可用于将第一固体支持物(例如珠粒)与第二固体支持物结合，或可用于将目的多肽与固体支持物结合。使用此类接头，可以在不从支持物切割多肽的情况下从第二固体支持物选择性地切割第一固体支持物(例如珠粒)；然后可以在稍后时间从珠粒切割多肽。例如，可以使用还原剂如DTT切割的二硫化物接头可以用于将珠粒与第二固体支持物结合，并且可以使用酸可切割的双官能三苯甲基将多肽固定至支持物。根据需要，可以首先切割多肽与固体支持物的连接，例如，保持第一与第二支持物之间的连接完整。三苯甲基接头可以提供共价或疏水性缀合，并且无论缀合的性质如何，三苯甲基在酸性条件下均易于切割。
例如，可以通过连接基团将珠粒与第二支持物结合，可以选择所述连接基团以具有促进珠粒与固体支持物的高密度结合或多肽与珠粒的高密度结合的长度和化学性质。这种连接基团可以具有例如“树状”结构，从而为固体支持物上的每个附接位点提供多个官能团。这种连接基团的例子包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、五-赤藓糖醇(penta-erythrole)和三羟基氨基甲烷。
非共价结合缔合。通过非共价相互作用，抗体或多肽可以与固体支持物缀合，或第一固体支持物也可以与第二固体支持物缀合。例如，由能够被磁化的铁磁材料制成的磁性珠粒可以被吸引至磁性固体支持物，并且可以通过移除磁场而从支持物释放。可替代地，固体支持物可以具有离子或疏水性部分，这可以允许离子或疏水性部分分别与多肽(例如含有附接的三苯甲基的多肽)或与具有疏水性特征的第二固体支持物相互作用。
固体支持物也可以具有特异性结合对的成员，因此可以与含有互补结合部分的多肽或第二固体支持物缀合。例如，用抗生物素蛋白或用链霉亲和素包被的珠粒可以与其中掺入生物素部分的多肽结合，或者与用生物素或生物素衍生物(如亚氨基生物素)包被的第二固体支持物结合。
应当认识到，本文公开的或本领域另外已知的任何结合成员都可以逆转。因此，分别地例如可以将生物素掺入多肽或固体支持物中，并且相反地，可以将抗生物素蛋白或其他生物素结合部分掺入支持物或多肽中。所考虑用于本文的其他特异性结合对包括但不限于激素及其受体、酶及其底物、核苷酸序列及其互补序列、抗体及其特异性相互作用的抗原，以及本领域技术人员已知的其他此类对。
A.本技术的抗A33抗体的诊断用途
概述。本技术的抗A33抗体可用于诊断方法。因此，本技术提供了使用所述抗体诊断受试者中的A33活性的方法。可以对本技术的抗A33抗体进行选择，使得它们具有任何水平的表位结合特异性和对A33蛋白的非常高的结合亲和力。一般而言，抗体的结合亲和力越高，就可以在免疫测定中执行更严格的洗涤条件以去除非特异性结合的材料而不去除靶多肽。因此，用于诊断测定的本技术的抗A33抗体通常具有约108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1的结合亲和力。此外，期望用作诊断试剂的抗A33抗体具有足够的动力学缔合速率，以在标准条件下在至少12h、至少五(5)h或至少一(1)小时内达到平衡。
抗A33抗体可用于在多种标准测定形式中检测免疫反应性A33蛋白。此类形式包括免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定和免疫测量测定。参见Harlow和Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications,纽约,1988)；美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074；3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。生物样品可以从受试者的任何组织或体液获得。在某些实施方案中，受试者处于癌症的早期阶段。在一个实施方案中，癌症的早期阶段是通过从受试者获得的样品中A33蛋白的水平或表达模式来确定的。在某些实施方案中，样品选自尿、血液、血清、血浆、唾液、羊水、脑脊液(CSF)和活检身体组织。
免疫测量测定或夹心测定是本技术诊断方法的一种形式。参见美国专利号4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375。此类测定使用一种固定至固相的抗体(例如抗A33抗体或抗A33抗体群体)以及在溶液中的另一种抗A33抗体或抗A33抗体群体。通常，溶液抗A33抗体或抗A33抗体群体被标记。如果使用抗体群体，则所述群体可以含有针对靶多肽内不同表位特异性而结合的抗体。因此，相同的群体可以用于固相和溶液抗体两者。如果使用抗A33单克隆抗体，则具有不同结合特异性的第一和第二A33单克隆抗体用于固相和溶液相。可以使固相(也称为“捕获”)和溶液(也称为“检测”)抗体以任何顺序或同时与靶抗原接触。如果首先接触固相抗体，则所述测定称为正向测定。相反，如果首先接触溶液抗体，则所述测定称为反向测定。如果靶标同时与两种抗体接触，则所述测定称为同时测定。使A33蛋白与抗A33抗体接触后，将样品孵育一段时间，所述时间段通常从约10分钟到约24小时不等，并且通常为约1小时。然后执行洗涤步骤以去除样品中未与用作诊断试剂的抗A33抗体特异性结合的组分。当固相抗体和溶液抗体在单独的步骤中结合时，可以在任一个或两个结合步骤之后进行洗涤。洗涤后，对结合进行定量，通常是通过经由标记的溶液抗体的结合而检测与固相连接的标记。通常对于给定的抗体对或抗体群体和给定的反应条件，从含有已知浓度的靶抗原的样品制作校准曲线。然后通过从校准曲线(即标准曲线)内插来读取正在测试的样品中免疫反应性A33蛋白的浓度。可以从平衡时结合的标记溶液抗体的量或通过在达到平衡之前在一系列时间点对结合的标记溶液抗体的动力学测量来测量分析物。这种曲线的斜率是样品中A33蛋白浓度的量度。
用于上述方法的合适支持物包括例如硝酸纤维素膜、尼龙膜和衍生化尼龙膜，并且还包括颗粒，如琼脂糖、基于葡聚糖的凝胶、量油尺、微粒、微球、磁性颗粒、试管、微量滴定孔、SEPHADEXTM(Amersham Pharmacia Biotech,皮斯卡塔韦，新泽西州)等。固定化可以是通过吸收或通过共价附接来实现。任选地，抗A33抗体可以与接头分子(如生物素)连接，以附接于表面结合的接头(如抗生物素蛋白)。
在一些实施方案中，本公开文本提供了与诊断剂缀合的本技术的抗A33抗体。诊断剂可以包含放射性或非放射性标记、造影剂(如用于磁共振成像、计算机断层摄影术或超声)，并且放射性标记可以是γ、β、α、俄歇电子或正电子发射同位素。诊断剂是与抗体部分即抗体或抗体片段或亚片段缀合给予的分子，并且可用于通过定位含有抗原的细胞诊断或检测疾病。
有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(如采用生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁性离子)。美国专利号6,331,175描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，并且通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，诊断剂选自放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物。为了使抗体组分负载放射性金属或顺磁性离子，可能需要使其与具有长尾部的试剂发生反应，所述长尾部附接有多种用于结合离子的螯合基团。这种尾部可以是聚合物，如聚赖氨酸、多糖或其他衍生化或可衍生的链，所述聚合物具有可与螯合基团结合的侧基，所述螯合基团是例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的的类似基团。螯合物可以使用标准化学方法与本技术的抗体偶联。螯合物通常通过如下基团与抗体连接，所述基团能够在免疫反应性损失最小并且聚集和/或内部交联最小的情况下与分子形成键。用于将螯合物与抗体缀合的其他方法和试剂公开在美国专利号4,824,659中。特别有用的金属-螯合物组合包括与诊断性同位素一起用于放射成像的2-苄基-DTPA及其一甲基和环己基类似物。在与非放射性金属(如锰、铁和钆)复合时，在与本技术的A33抗体一起使用时，相同螯合物可用于MRI。
大环螯合物如NOTA(1,4,7-三氮杂-环壬烷-N,N',N"-三乙酸)、DOTA和TETA(对溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸)分别与多种金属和放射性金属(如镓、钇和铜的放射性核素)一起使用。可以通过使环的大小适合目的金属来稳定此类金属-螯合物复合物。其他DOTA螯合物的例子包括(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2；(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2；(ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2；(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2；(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2；(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；和(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2。
还考虑了对于稳定结合核素(如用于RAIT的223Ra)感兴趣的其他环型螯合物，如大环聚醚。
B.本技术的抗A33抗体的治疗用途
本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，抗体或其抗原结合片段)可用于治疗A33相关癌症。这种治疗可以用于被鉴定为具有病理上高水平的A33的患者(例如，通过本文所述的方法诊断的那些患者)或被诊断为已知与此类病理水平相关的疾病的患者。在一个方面，本公开文本提供了用于在有需要的受试者中治疗A33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的本技术的抗体(或其抗原结合片段)。可以用本技术的抗体治疗的癌症的例子包括但不限于：结肠直肠癌、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌和胃癌。A33相关癌症可以是具有MSI基因型或MSS基因型的结肠直肠癌。另外地或可替代地，在一些实施方案中，结肠直肠癌与KRAS G12D突变或p53突变相关。
本技术的组合物可以与可用于治疗A33相关癌症的其他治疗剂结合使用。例如，可以将本技术的抗体与选自以下的至少一种另外的治疗剂分开地、顺序地或同时给予：烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、抑制细胞的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、二膦酸盐治疗剂和靶向生物治疗剂(例如，US 6306832、WO 2012007137、WO2005000889、WO 2010096603等中描述的治疗肽)。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂是化学治疗剂。特定化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(10-乙基-10-脱氮-氨基喋呤)、塞替派、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、替莫唑胺、托泊替康、长春新碱、长春碱、艾日布林、突变霉素、卡培他滨、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、亮丙瑞林、阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、地诺单抗、唑来膦酸盐、曲妥珠单抗、拉帕替尼、蒽环霉素(例如柔红霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin))、贝伐单抗、奥沙利铂、美法仑、依托泊苷、氮芥、博来霉素、微管毒药、番荔枝内酯或其组合。
本技术的组合物可以任选地以单次推注的形式给予至有需要的受试者。可替代地，给药方案可以包括在肿瘤出现后的不同时间多次给予。
给予可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、颅内、鞘内或局部。给予包括自我给予和由另一个人给予。还应理解，如本文所述的医学病症的各种治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗但也不到完全治疗，并且其中实现了一些生物学或医学有关的结果。
在一些实施方案中，本技术的抗体包含药物配制品，可以将所述药物配制品以一个或多个剂量给予至有需要的受试者。可以调整剂量方案以提供所需反应(例如，治疗反应)。
通常，足以实现治疗效果的本技术的抗体组合物的有效量在每天每公斤体重约0.000001mg至每天每公斤体重约10,000mg的范围内。通常，剂量范围为每天每公斤体重约0.0001mg至每天每公斤体重约100mg。对于给予抗A33抗体，剂量范围为每周、每两周或每三周0.0001至100mg/kg受试者体重，并且更通常为0.01至5mg/kg受试者体重。例如，剂量可以是每周、每两周或每三周1mg/kg体重或10mg/kg体重，或者在每周、每两周或每三周1-10mg/kg的范围内。在一个实施方案中，抗体的单次剂量范围为每公斤体重0.1-10,000微克。在一个实施方案中，载体中的抗体浓度范围为每递送一毫升0.2至2000微克。示例性治疗方案使得需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次给予。可以在多个时机给予抗A33抗体。单个剂量之间的间隔可以是每小时、每日、每周、每月或每年。如通过测量受试者中抗体的血液水平所指示，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以在受试者中实现以下血清抗体浓度：约75μg/mL至约125μg/mL、100μg/mL至约150μg/mL、约125μg/mL至约175μg/mL或约150μg/mL至约200μg/mL。可替代地，抗A33抗体可以作为持续释放配制品给予，在这种情况下需要不太频繁的给予。剂量和频率根据抗体在受试者中的半衰期而变化。给予的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间段期间以相对不频繁的间隔给予相对低的剂量。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止为止，或直到受试者显示疾病症状的部分或完全改善为止。此后，可以向患者给予预防性方案。
在另一个方面，本公开文本提供了用于在体内检测受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的本技术的抗体(或其抗原结合片段)，其中所述抗体被配置为定位于表达A33的肿瘤，并用放射性同位素标记；和(b)通过检测由所述抗体发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中肿瘤的存在。在一些实施方案中，参考值表示为每克注射剂量(％ID/g)。参考值可通过如下方法来计算：测量存在于非肿瘤(正常)组织中的放射性水平，并计算存在于非肿瘤(正常)组织中的平均放射性水平标±准差。在一些实施方案中，肿瘤与正常组织之间的放射性水平的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
在一些实施方案中，所述受试者被诊断患有或怀疑患有癌症。可以使用正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机断层摄影术检测由所述抗体发射的放射性水平。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者给予有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与放射性核素缀合的本技术的抗体。在一些实施方案中，所述放射性核素是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇发射体或其任何组合。发射β粒子的同位素的例子包括86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。发射α粒子的同位素的例子包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At和255Fm。俄歇发射体的例子包括111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl和203Pb。在所述方法的一些实施方案中，正常组织中非特异性FcR依赖性结合被消除或减少(例如，经由Fc区中的N297A突变，其导致去糖基化)。可以通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来确定这种免疫缀合物的治疗有效性。在一些实施方案中，免疫缀合物的AUC肿瘤:AUC正常组织比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
PRIT。在一个方面，本公开文本提供了用于检测有需要的受试者中的实体肿瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原以及与所述放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原结合的本技术的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达由所述复合物的双特异性抗体识别的A33抗原的实体肿瘤；和(b)通过检测由所述复合物发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中实体肿瘤的存在。在一些实施方案中，受试者是人。
在另一个方面，本公开文本提供了用于选择受试者进行预靶向放射免疫疗法的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原以及与所述放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原结合的本技术的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达由所述复合物的双特异性抗体识别的A33抗原的实体肿瘤；(b)检测由所述复合物发射的放射性水平；和(c)当由所述复合物发射的放射性水平高于参考值时，选择所述受试者进行预靶向放射免疫疗法。在一些实施方案中，受试者是人。
DOTA半抗原的例子包括(i)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2；(ii)Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(iii)DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2；(iv)DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(v)DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vi)DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(vii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；(viii)Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2；(ix)Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(x)Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2；(xi)Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xii)DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xiii)(Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2；(xiv)Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xv)(Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2；(xvi)Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2；(xvii)Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2；(xviii)Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2；(xix)Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2和(xx)DOTA。所述放射性标记可以是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素或俄歇发射体。放射性标记的例子包括213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu。
在本文公开方法的一些实施方案中，使用正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机断层摄影术检测由所述复合物发射的放射性水平。另外地或可替代地，在本文公开方法的一些实施方案中，所述受试者被诊断患有或被怀疑患有A33阳性癌症，如结肠直肠癌、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌和胃癌。
另外地或可替代地，在本文公开方法的一些实施方案中，所述复合物通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内给予。在某些实施方案中，将所述复合物给予到受试者的脑脊液或血液中。
在本文公开方法的一些实施方案中，在给予所述复合物后2至120小时之间检测由所述复合物发射的放射性水平。在本文公开方法的某些实施方案中，由所述复合物发射的放射性水平表示为每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。参考值可通过如下方法来计算：测量存在于非肿瘤(正常)组织中的放射性水平，并计算存在于非肿瘤(正常)组织中的平均放射性水平±标准差。在一些实施方案中，参考值是标准摄取值(SUV)。参见Thie JA,JNucl Med.45(9):1431-4(2004)。在一些实施方案中，肿瘤与正常组织之间的放射性水平的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
在另一个方面，本公开文本提供了用于在被诊断为A33阳性癌症的受试者中增加肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的本技术的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位于表达A33抗原靶标的肿瘤；和(b)向所述受试者给予有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置为结合所述抗DOTA双特异性抗体。在一些实施方案中，受试者是人。
抗DOTA双特异性抗体在一定条件下给予并持续一段时间(例如，根据给药方案)，所述条件和时间段足以使其在肿瘤细胞中饱和。在一些实施方案中，在给予抗DOTA双特异性抗体后，从血流中去除未结合的抗DOTA双特异性抗体。在一些实施方案中，在足以允许清除未结合的抗DOTA双特异性抗体的时间段后给予放射性标记的DOTA半抗原。
放射性标记的DOTA半抗原可以在给予抗DOTA双特异性抗体后1分钟至4天或更多天数之间的任何时间给予。例如，在一些实施方案中，在给予抗DOTA双特异性抗体后1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时、96小时或其中的任何范围，给予放射性标记的DOTA半抗原。可替代地，放射性标记的DOTA半抗原可以在给予抗DOTA双特异性抗体后4天或更多天数之后的任何时间给予。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述方法进一步包括在给予放射性标记的DOTA半抗原之前，向所述受试者给予有效量的清除剂。清除剂可以是能够与C825半抗原缀合的任何分子(葡聚糖或树枝状聚合物或聚合物)。在一些实施方案中，清除剂不多于2000kD、1500kD、1000kD、900kD、800kD、700kD、600kD、500kD、400kD、300kD、200kD、100kD、90kD、80kD、70kD、60kD、50kD、40kD、30kD、20kD、10kD或5kD。在一些实施方案中，清除剂是500kD氨基葡聚糖-DOTA缀合物(例如，500kD葡聚糖-DOTA-Bn(Y)、500kD葡聚糖-DOTA-Bn(Lu)或500kD葡聚糖-DOTA-Bn(In)等)。
在一些实施方案中，在不进一步给予本技术的抗DOTA双特异性抗体的情况下，给予清除剂和放射性标记的DOTA半抗原。例如，在一些实施方案中，本技术的抗DOTA双特异性抗体根据包括至少一个以下循环的方案给予：(i)给予本技术的抗DOTA双特异性抗体(任选地，使得相关肿瘤细胞饱和)；(ii)给予放射性标记的DOTA半抗原和任选的清除剂；(iii)任选地另外给予放射性标记的DOTA半抗原和/或清除剂，而不另外给予抗DOTA双特异性抗体。在一些实施方案中，所述方法可以包括多个这样的循环(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个循环)。
另外地或可替代地，在所述方法的一些实施方案中，抗DOTA双特异性抗体和/或放射性标记的DOTA半抗原通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内给予。
在一个方面，本公开文本提供了用于在被诊断为A33阳性癌症的受试者中增加肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原以及识别并结合所述放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原靶标的本技术的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达由所述复合物的双特异性抗体识别的A33抗原靶标的肿瘤。所述复合物可以通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内给予。在一些实施方案中，受试者是人。
在另一个方面，本公开文本提供了用于治疗有需要的受试者中癌症的方法，所述方法包括(a)向所述受试者给予有效量的本技术的抗DOTA双特异性抗体，其中所述抗DOTA双特异性抗体被配置为定位于表达A33抗原靶标的肿瘤；和(b)向所述受试者给予有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置为结合所述抗DOTA双特异性抗体。抗DOTA双特异性抗体在一定条件下给予并持续一段时间(例如，根据给药方案)，所述条件和时间段足以使其在肿瘤细胞中饱和。在一些实施方案中，在给予抗DOTA双特异性抗体后，从血流中去除未结合的抗DOTA双特异性抗体。在一些实施方案中，在足以允许清除未结合的抗DOTA双特异性抗体的时间段后给予放射性标记的DOTA半抗原。在一些实施方案中，受试者是人。
因此，在一些实施方案中，所述方法进一步包括在给予放射性标记的DOTA半抗原之前，向所述受试者给予有效量的清除剂。放射性标记的DOTA半抗原可以在给予抗DOTA双特异性抗体后1分钟至4天或更多天数之间的任何时间给予。例如，在一些实施方案中，在给予抗DOTA双特异性抗体后1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、48小时、72小时、96小时或其中的任何范围，给予放射性标记的DOTA半抗原。可替代地，放射性标记的DOTA半抗原可以在给予抗DOTA双特异性抗体后4天或更多天数之后的任何时间给予。
所述清除剂可以是500kD氨基葡聚糖-DOTA缀合物(例如，500kD葡聚糖-DOTA-Bn(Y)、500kD葡聚糖-DOTA-Bn(Lu)或500kD葡聚糖-DOTA-Bn(In)等)。在一些实施方案中，在不进一步给予抗DOTA双特异性抗体的情况下，给予清除剂和放射性标记的DOTA半抗原。例如，在一些实施方案中，抗DOTA双特异性抗体根据包括至少一个以下循环的方案给予：(i)给予本技术的抗DOTA双特异性抗体(任选地，使得相关肿瘤细胞饱和)；(ii)给予放射性标记的DOTA半抗原和任选的清除剂；(iii)任选地另外给予放射性标记的DOTA半抗原和/或清除剂，而不另外给予抗DOTA双特异性抗体。在一些实施方案中，所述方法可以包括多个这样的循环(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个循环)。
本文还提供了用于治疗有需要的受试者中癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原以及识别并结合所述放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原靶标的本技术的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达由所述复合物的双特异性抗体识别的A33抗原靶标的肿瘤。可以通过计算曲线下面积(AUC)肿瘤:AUC正常组织比率来测定这种复合物的治疗有效性。在一些实施方案中，复合物的AUC肿瘤:AUC正常组织比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
毒性。最佳地，本文描述的抗A33抗体的有效量(例如剂量)将提供治疗益处，而不会引起对受试者的实质性毒性。本文所述的抗A33抗体的毒性可以在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序来确定，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)来确定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于制定对人无毒的剂量范围。本文所述的抗A33抗体的剂量在循环浓度的范围内，所述循环浓度包括具有很小或没有毒性的有效剂量。所述剂量可以根据所采用的剂型和所利用的给予途径在这个范围内变化。单独医师可以根据受试者的情况选择确切配方、给予途径和剂量。参见例如，Fingl等人,In:The Pharmacological Basisof Therapeutics,第1章(1975)。
药物组合物的配制品。根据本技术的方法，可以将抗A33抗体掺入适合于给予的药物组合物中。药物组合物通常包含重组或基本上纯化的抗体和药学上可接受的载体，呈适合于给予至受试者的形式。药学上可接受的载体部分取决于所给予的特定组合物，以及取决于用于给予所述组合物的特定方法。因此，存在用于给予抗体组合物的药物组合物的多种合适配制品(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.,伊斯顿,宾夕法尼亚州第18版,1990)。通常将药物组合物配制为无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。
术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法变体，当它们指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可以互换使用，并表示所述材料能够被给予至受试者或给予至受试者上而不产生会禁止组合物的给予的程度的不希望的生理影响。例如，“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备通常是安全、无毒并且期望的药物组合物的赋形剂，并且包括对于兽用以及人药物用途可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下是气体。“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并具有所需药理特性的盐和酯。此类盐包括可以在存在于组合物中的酸性质子能够与无机或有机碱反应的情况下形成的盐。合适的无机盐包括与碱金属例如钠和钾、镁、钙和铝形成的那些盐。合适的有机盐包括与有机碱形成的那些有机盐，所述有机碱如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。此类盐还包括与无机酸(例如盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃磺酸和芳烃磺酸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由抗A33抗体中存在的羧基、磺酰氧基和膦酸氧基形成的酯，例如C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或者二盐或酯；并且类似地，当存在多于两个酸性基团时，此类基团中的一些或全部可以被盐化或酯化。以此技术命名的抗A33抗体可以以未盐化或未酯化形式存在，或以盐化和/或酯化形式存在，并且这种抗A33抗体的命名旨在包括初始(未盐化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。另外，本技术的某些实施方案可以以多于一种立体异构体形式存在，并且这种抗A33抗体的命名旨在包括所有单一的立体异构体以及此类立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是其他形式)。本领域普通技术人员不难确定给予本技术的特定药物和组合物的适当时间安排、顺序和剂量。
此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发性油类。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或化合物与抗A33抗体不相容，否则考虑其在组合物中的使用。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
配制本技术的药物组合物以与其预期的给予途径相容。本技术的抗A33抗体组合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、真皮内、透皮、直肠、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内；或肌肉内途径，或者作为吸入剂给予。可以将抗A33抗体任选地与在治疗各种A33相关癌症方面至少部分有效的其他药剂组合给予。
用于肠胃外、真皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液(如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)，以及用于调节张力的化合物(如氯化钠或右旋糖)。可用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给予，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州派西派尼市(Parsippany，NJ))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。所述组合物在制造和储存条件下必须稳定，并且其保存必须可抵抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适宜混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，希望在组合物中包含等渗化合物，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的化合物例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将本技术的抗A33抗体以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，通过将所述抗A33抗体掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。本技术的抗体可以以积存注射剂或植入制剂的形式给予，可以将所述形式以允许活性成分的持续或脉冲释放的方式配制。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们封装于明胶胶囊中或压成片剂。出于口服治疗性给予的目的，可以将抗A33抗体与赋形剂一起掺入，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用用作漱口剂的流体载体来制备，其中流体载体中的化合物经口施用并被漱口(swish)和吐出或者被吞下。可以包括药学上相容的结合化合物和/或辅助材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解性化合物，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅胶体；甜味化合物，如蔗糖或糖精；或调味化合物，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
对于通过吸入给予，可以从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或者喷雾器以气溶胶喷雾剂形式递送抗A33抗体。
全身性给予也可以是通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮给予，在配制品中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括(例如对于经粘膜给予)洗涤剂、胆汁盐、以及梭链孢酸衍生物。经粘膜给予可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮给予，将抗A33抗体配制成如本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
也可以将抗A33抗体制备为呈栓剂(例如，与常规栓剂基质如可可脂和其他甘油酯一起)或保留灌肠剂的形式以供直肠递送的药物组合物。
在一个实施方案中，抗A33抗体是用防止抗A33抗体从身体迅速清除的载体制备的，如控释配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制品的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。所述材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如在美国专利号4,522,811中所述。
C.试剂盒
本技术提供用于检测和/或治疗A33相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本技术的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能性变体(例如，取代变体)。任选地，将本技术的试剂盒的上述组分包装在合适的容器中并进行标记以用于A33相关癌症的诊断和/或治疗。上述组分可以作为水溶液(优选无菌溶液)或作为用于重构的冻干(优选无菌)配制品的形式储存在单元容器或多剂量容器(例如密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管)中。试剂盒还可以包含第二容器，所述第二容器容纳有适合于将药物组合物稀释至更大体积的稀释剂。合适的稀释剂包括但不限于药物组合物的药学上可接受的赋形剂和盐水溶液。此外，试剂盒可以包含用于稀释药物组合物的说明书和/或用于给予稀释的或未稀释的药物组合物的说明书。容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)制成，并且可以具有无菌的进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或带有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒可以进一步包含更多容器，所述容器含有药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。试剂盒可以进一步包括从商业和用户的角度来看合意的其他材料，包括用于一种或多种合适宿主的其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、培养基。试剂盒可以任选地包括通常包含在治疗或诊断产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于例如关于使用此类治疗或诊断产品的适应症、用法、剂量、制造、给予、禁忌症和/或警告的信息。
试剂盒可用于检测生物样品中免疫反应性A33蛋白的存在，所述生物样品是例如任何体液，包括但不限于例如血清、血浆、淋巴液、囊液、尿、粪便、脑脊液、腹水或血液，并且包括体组织的活检样品。例如，试剂盒可以包含：能够结合生物样品中的A33蛋白的本技术的一种或多种人源化、嵌合或双特异性抗A33抗体(或其抗原结合片段)；用于确定样品中A33蛋白的量的器件；以及用于将样品中的免疫反应性A33蛋白的量与标准品进行比较的器件。一种或多种抗A33抗体可以经标记。试剂盒组分(例如试剂)可以被包装在合适的容器中。试剂盒可以进一步包含使用所述试剂盒检测免疫反应性A33蛋白的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可以包含，例如1)附接于固体支持物的第一抗体，例如本技术的人源化、嵌合或双特异性A33抗体(或其抗原结合片段)，所述第一抗体与A33蛋白结合；以及，任选地；2)第二种不同抗体，其与A33蛋白或所述第一抗体结合并与可检测标记缀合。
试剂盒也可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒可以进一步包含检测所述可检测标记所需的其他组分，例如酶或底物。试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照样品，可以对其进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器内，并且所有不同的容器可以与用于解释使用所述试剂盒进行测定的结果的说明书一起放在单个包装内。本技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或试剂盒容器中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中含有的试剂，例如用于在体外或体内检测A33蛋白，或用于在有需要的受试者中治疗A33相关癌症。在某些实施方案中，可以根据本技术的方法使用所述试剂。
实施例
通过以下实施例进一步说明本技术，不应将所述实施例视为以任何方式加以限制。以下实施例展示了本技术的说明性A33抗体的制备、表征和用途。以下实施例展示了本技术的嵌合、人源化和双特异性抗体的产生，以及对它们的结合特异性和体内生物活性的表征。
实施例1：用于产生和表征本技术的抗A33抗体的材料和方法
细胞系和人白细胞。细胞系LS174T、Colo205、SNU-16和293T细胞购自ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)；SW1222是ECACC(索尔兹伯里，英国)。所有细胞都通过STR分型验证。细胞保存在补充有10％FBS(Sigma，圣路易斯，密苏里州)、0.03％L-谷氨酰胺(GibcoLaboratories，盖瑟斯堡，马里兰州)和Pen/Strep(Gibco Laboratories，盖瑟斯堡，马里兰州)的RPMI培养基中。来自健康供体的血沉棕黄层从New York Blood Center(纽约市，纽约州)购买，并且人PBMC是通过血沉棕黄层的Ficoll梯度分离。
表达萤光素酶的细胞系的建立。首先根据制造商的说明书，使用PolyJet转染试剂(SignaGen，罗克维尔，马里兰州)，用含有萤光素酶和GFP基因的逆转录病毒构建体转染293T细胞。36小时后，收集含病毒的上清液，并用0.45μm过滤器过滤。将两毫升过滤的上清液等分至预先涂有Retronectin(Clontech Laboratories，山景城，加利福尼亚州)的12孔板的每个孔中。使所述板在4℃下以3500rpm旋转45min。将所述过程重复2至3次。在旋转后，将板用PBS洗涤一次，之后将0.2×106个肿瘤细胞铺板并在37℃下孵育。24小时后再一次重复旋转接种。然后将细胞进一步孵育至少48小时，之后针对表达GFP的细胞进行分选。对于细胞分选，将转导的细胞以1个细胞/孔的密度分选到至少4个板的96孔板中，并在集落挑选之前孵育2周。基于与亲代细胞系相比的萤光素酶、GFP和GPA33的表达来评估和选择所挑选的集落。
SEC-HPLC分析。使用HPLC系统(Shimadzu Scientific Instruments Inc.，哥伦比亚，马里兰州)分析huA33-BsAb的大小和纯度。使用分子量标准品(Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)鉴定单体种类，并基于不同非缓冲峰的相对曲线下面积(AUC)计算单体百分比。
鼠A33的人源化。使用CDR移植，将小鼠A33人源化为IgG1。将两种不同的VH和VL序列组合以产生4种不同的人源化A33抗体。使用表面等离子体共振(SPR)分析将结合动力学与嵌合抗体chA33的结合动力学进行比较。重链序列是SEQ ID NO:6(3A3-H2)，并且轻链序列是SEQ ID NO:10(3A3-L2)。
包括前导序列的重链序列是
MGWSCIILFLVATATGEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSTYDMSWVRQAPGKRLEWVATISSGGSYTYYLDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAPTTVVPFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:55)，并且包括前导序列的轻链序列是
MGWSCIILFLVATATGDIQMTQSQSSLSTSVGDRVTITCKASQNVRTVVAWYQQKPGKSPKTLIYLASNRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNVQPEDFADYFCLQHWSYPLTFGSGTKLEIKR(SEQ ID NO:56)。带下划线序列对应于前导序列。
SPR分析。将人GPA33(Novoprotein，萨米特，新泽西州)固定在CM5芯片上。使用BiacoreTM T100系统(GE Healthcare，芝加哥，伊利诺伊州)将五种浓度的2倍连续稀释的huA33 IgG1或huA33-BsAb(起始于20nM)流过芯片。在25℃下测量了huA33的结合动力学，并在25℃和37℃下测量了huA33-BsAb的结合动力学。将传感图用二者的1:1结合模型拟合，以得出动力学参数。
huA33-BsAb双特异性抗体的产生。通过将人源化OKT3 scFv经由(G4S)3接头融合到huA33抗体轻链的C末端上构建huA33-BsAb，如先前在以下文献中所述：Xu H等人,CancerImmunology Research 3:266-277(2015)和Lopez-Albaitero A等人,OncoImmunology 6:e1267891(2017)。在抗体的Fc区中引入N297A和K322A突变，以分别消除FcR和补体结合活性(Shields RL等人,Journal of Biological Chemistry 276:6591-6604(2001)；IdusogieEE等人,Journal of Immunology 164:4178-4184(2000))。然后将DNA构建体转染到CHO-S细胞中，并针对高抗体产生水平选择稳定的克隆。对于更大规模的抗体纯化，将选择的稳定克隆在摇瓶中扩增。使用一步式蛋白A亲和色谱从上清液纯化双特异性抗体。
T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定。使用51Cr释放测定和Pierce LDH释放测定(Thermo Fisher Scientific，坎布里奇，马萨诸塞州)两者进行细胞毒性测定。对于这两个测定，随后使用通过暴露于抗CD3/抗CD28 Dynaband14天激活的T细胞作为效应细胞，但对于来自PBMC的分选细胞除外，所述分选细胞用于在没有预先刺激的情况下进行TDCC测定。如先前在Cheng M等人,International Journal of Cancer 136:476-486(2015)中所述地进行51Cr测定。根据具有以下修改的制造商说明书进行LDH测定。简而言之，对于96孔圆底板的每个测定孔，根据预期的E:T比，将1.5×104个靶细胞与可变数量的效应细胞一起孵育。然后以不同的稀释度加入抗体，并将板在37℃下孵育16小时。每个条件以一式三份进行。然后将上清液转移到具有反应底物的平底板并孵育30min，之后以680nm作为参考波长，在490nm下读取。通过使用GraphPad Prism将曲线拟合到4参数非线性回归模型来计算EC50值。
细胞因子和细胞裂解分子释放测定。使用全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，坎布里奇，马萨诸塞州)从PBMC纯化T细胞。在24孔板中，将靶标和对照肿瘤细胞以5:1的效应子与靶标的比率与2×106个细胞/孔一式三份地孵育，其中每孔总体积为2ml。根据制造商的方案，在24小时、48小时、72小时和96小时收集培养物上清液，并使用LEGENDplexTM人CD8/NK面板(Biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚州)用流式细胞术测量细胞因子水平。
T细胞增殖测定。在室温下，用2.5nM CFSE(Life Technologies Corp.，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)标记来自健康供体的新鲜PBMC持续5min，随后使用含有5％FBS的PBS进行中和。然后将靶细胞与标记的PBMC在不同条件下在37℃下一起孵育，之后在24小时和96小时分析表面激活标记物的表达以及T细胞增殖。
体内肿瘤治疗。对于皮下(s.c.)肿瘤模型，将LS174T、Colo205或SNU16细胞与新鲜PBMC以1:1比率组合，与基质胶混合(细胞体积:凝胶体积＝1:2)，并在Balb/c Rag2-/-IL2Rγ-/-(DKO)小鼠(现在可从Taconic作为CIEA BRG小鼠购得)的侧腹处植入(100μl/小鼠)。在确认肿瘤存在后，用BIW时间表以100μg/小鼠开始治疗，并持续3-4周。通过每周使用卡尺或数字装置Peira TM900扫描仪(Peira Scientific Instruments，蒂伦豪特，比利时)测量肿瘤体积来监测肿瘤生长。
对于腹膜内(i.p.)肿瘤模型，将表达萤光素酶的LS174T-luc或SW1222-luc细胞重悬于RPMI培养基中，并腹膜内注射到DKO小鼠中。将人效应细胞作为激活的T细胞来供应并静脉内注射。用抗体-T细胞-抗体方案2-3个每周循环治疗小鼠，其中每个组分间隔3-4天。在注射3.3mg/小鼠的萤光素后，通过在IVIS光谱体内成像系统(PerkinElmer Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)上测量发光信号，每周跟踪肿瘤的生长。使用Living Image软件(PerkinElmer Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)分析和量化发光。
抗体和流式细胞术。抗体抗hCD25-PE、抗CD69-PE、抗hCD8-APC、抗hCD45-PECy7、抗hCD4-PE、抗hCD4-BV421、抗hCD62L-PercpCy5.5、抗hPD1-BV421、抗hCD45RO-PECy7均购自Biolegend(圣地亚哥，加利福尼亚州)。山羊抗人IgG-PE购自SouthernBiotech(伯明翰，亚拉巴马州)。链霉亲和素-PE、抗hCD4-APC和抗hCD25-APC购自BD Biosciences(圣何塞，加利福尼亚州)。所有FACS分析均使用FACSCalibur或LSRII系统(BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)进行，并使用FlowJo(FLOWJO，阿什兰，俄勒冈州)分析。
使用酵母展示进行亲和力成熟。用20个氨基酸(G4S)4接头将亲本huA33转化成scFv形式，并克隆到酵母展示载体中。使用GeneMorph II诱变试剂盒(AgilentTechnologies，圣克拉拉，加利福尼亚州)使huA33 scFv随机突变。将PCR产物与线性化载体一起电穿孔到酵母中，并使用生物素化的GPA33使文库经受4轮分选。对最后一轮的单独克隆进行PCR扩增并测序，以分析突变模式。将所选择的scFv克隆转化成huA33-BsAb形式是使用一步式4片段连接方法来进行，其中使用用50ng线性化载体并且其他3种组分的载体与插入物的摩尔比为1:3。在室温下用快速DNA连接试剂盒(Thermo Fisher Scientific，坎布里奇，马萨诸塞州)进行连接1小时。将II型限制性酶SapI(New England Biolabs，伊普斯威奇，马萨诸塞州)用于确保不同组分之间的无缝连接(图13)。根据制造商的说明书，使用Expi293表达系统(Thermo Fisher Scientific，坎布里奇，马萨诸塞州)瞬时表达所选择的克隆。在摇瓶中培养4-5天后，将来自Expi293细胞的上清液用于使用MabSelect SuRe(GEHealthcare，芝加哥，伊利诺伊州)纯化抗体，并在透析膜(Spectrum Laboratories,Inc.，兰乔多明格兹，加利福尼亚州)中针对pH 8.0柠檬酸盐缓冲液进行透析。
统计分析。使用Student's t-检验来测试显著性(p<0.05)。
实施例2：本技术的人源化抗A33抗体的结构和结合亲和力
图14显示了鼠A33抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列以及它们对应的同源人序列(SEQ ID NO:1-4)。本技术的3A3-H1/L1、3A3-H1/L2、3A3-H2/L1和3A3-H2/L2人源化A33抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列在图15和图17中示出。3A3-H1/L1、3A3-H1/L2、3A3-H2/L1和3A3-H2/L2人源化A33抗体的VH和VL结构域的cDNA序列在图16和图18中示出。图19显示了来自King等人(1995)同上的原始人源化氨基酸序列hA33与新近重新人源化的huA33(3A3)氨基酸序列的比对。
图24显示了嵌合chA33-IgG1的轻链和重链的氨基酸序列，它们分别对应于SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14。图25显示了huA33-IgG1(H2L2)的重链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。图26显示了huA33-IgG1(H2L2)的轻链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
当与嵌合A33相比时，在SPR分析中，在与固定化GPA33的结合中，所有四种新近人源化的A33抗体的k解离都略有改善(图9和图20)。基于KD、37℃下的稳定性和T20人性得分，选择H2L2 huA33克隆用于进一步开发。参见图23。图21和图22证明，与huA33-H2L2相比，Cheal等人(2016)同上中所述的原始人源化hA33(hA33-mC825 BsAb)表现出结合亲和力显著降低。
这些结果证明，本技术的抗体或其抗原结合片段以高结合亲和力与A33抗原特异性地结合。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于检测样品中的A33蛋白。
实施例3：本技术的T细胞接合的huA33-BsAb抗体的结构和结合亲和力
通过将人源化OKT3的scFv经由柔性GS接头融合到轻链的C末端，将huA33抗体重整成双特异性形式(图1(A))。将DNA构建体用于建立CHO-S稳定细胞系，并从上清液纯化huA33-BsAb。没有充分优化的情况下，使用蛋白A色谱的蛋白质产量是50mg/L至100mg/L。使用Expi293瞬时表达系统观察到类似的产量(数据未显示)。一步式蛋白A纯化常规产生纯度高于90％的蛋白质，如通过SEC-HPLC所测量。四次冻融循环并未引起SEC-HPLC谱的显著变化(数据未显示)。如图1(B)所示，在将分子在37℃下孵育4周后，单体的百分比仅略有下降。这些数据表明，huA33-BsAb具有良好的溶解性、纯度和热稳定性，所有这些都是进一步下游开发的关键特征。
图27显示了T细胞接合的huA33-BsAb双特异性抗体的重链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。图28显示了T细胞接合的huA33-BsAb双特异性抗体的轻链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。图29显示了对本文公开的T细胞接合的huA33-BsAb双特异性抗体的潜在修饰的总结。
在25℃和37℃下，使用GPA33固定化的CM5芯片测量了huA33-BsAb对GPA33的亲合力。如图1(C)所示，huA33-BsAb以约0.2nM的高表观亲和力结合GPA33，这略低于对于亲本huA33所观察到的0.13nM的值。对源自不同癌症的一组细胞系的FACS分析显示，huA33-BsAb对结肠癌细胞系和一个胃癌细胞系染色，但没有对GPA33(-)神经母细胞瘤细胞系IMR32、骨肉瘤细胞系TC32或黑素瘤细胞系SKMEL5染色(图1(D)和图10)，从而证明了huA33-BsAb在结合结肠癌细胞和胃癌细胞子集上的靶抗原时保留了亲本抗体A33的特异性。激活的T细胞的染色也显示出huA33-BsAb与T细胞表面上的CD3结合。参见图1(D)。
这些结果证明，本技术的抗体或其抗原结合片段以高结合亲和力与A33抗原特异性地结合。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于检测样品中的A33蛋白。
实施例4：本技术的T细胞接合的huA33-BsAb抗体的生物活性
huA33-BsAb激活并诱导新鲜T细胞进入细胞循环。为了测试huA33-BsAb激活未刺激的T细胞的能力，将CFSE标记的PBMC与Colo205细胞以等于5的E:T比率混合，并在huA33-BsAb(1μg/ml)的存在下培养。将携带无关scFv(Cheal SM等人,Eur J Nucl Med MolImaging 43:925-37(2016))而不是抗CD3 scFv的huA33-C825，以及通过FACS分析不与L1CAM(-)Colo205结合的针对抗原L1CAM(L1CAM x CD3)的无关T细胞接合的BsAb抗体L1CAM-BsAb用作阴性对照。
在24小时和96小时后，将细胞用不同的T细胞激活标记物染色，以评估T细胞激活状态和增殖。早在24小时，huA33-BsAb就引起CD4(+)和CD8(+)T细胞两者的激活，如通过细胞表面上CD25和CD69标记物的上调所示(图2(A))。相比之下，huA33-C825和L1CAM-BsAb仅引起CD25的最小上调。L1CAM-BsAb确实增加了CD69的表达，特别是在CD4(+)T细胞中，这可能是由于L1CAM在T细胞上的表达所致。类似地，24小时后观察到PD-1上调，并持续直到96小时(图11(A))。96小时后，在CD4(+)和CD8(+)T细胞两者中观察到细胞分裂，如通过CFSE染料稀释法所测量(图2(B))。CD8(+)T细胞显示出更高的细胞分裂周期，表明CD8(+)T细胞比CD4(+)T细胞更快地分裂(图2(C))。对照抗体huA33-C825在任何一个T细胞子集中都未刺激大量细胞分裂，这证实了T细胞分裂需要CD3激活。L1CAM-BsAb诱导了低水平的细胞分裂，这与上文观察到的低水平激活一致。当使用GPA33(-)SKMEL5靶细胞时，huA33-BsAb不激活T细胞(图11(B))。这些结果表明，huA33-BsAb对T细胞的激活依赖于肿瘤细胞上同源抗原的存在。我们还观察到，细胞分裂与CD45RO(+)效应细胞/记忆细胞的扩增相关(图2(D))，表明这一子集在介导T-BsAb活性中的重要性，这在下文中得到证实。使用不同的结肠癌细胞系LS174T重复这些测定，得出相似结论(图11(C))。
为了确定是否可以在体内激活T细胞，通过将CFSE标记的PBMC与Colo205细胞混合进行体内增殖测定，并将混合物皮下植入到DKO小鼠上。第二天静脉内注射huA33-BsAb，并且在另外4天后分离肿瘤并通过FACS进行分析。如图2(E)所示，约25％的CD4(+)和CD8(+)T细胞在经历细胞分裂时上调CD25表达(CFSE荧光逐渐减半)，这表明huA33-BsAb也能够在体内刺激T细胞激活和增殖。
huA33-BsAb诱导炎性细胞因子和细胞裂解分子的分泌。检查在靶肿瘤的存在下，huA33-BsAb激活的T细胞的分泌细胞因子谱。将总T细胞从PBMC纯化，并在Colo205肿瘤细胞的存在下以5:1的效应子与靶标的比率进行培养。为了估计非特异性激活，将SKMEL5细胞用作阴性对照。在4天内每天收集细胞培养物上清液，并使用基于流式细胞术的多重方法测量细胞因子和细胞毒性分子的水平。如图3所示，激活的T细胞分泌Th1细胞因子(IL-2、IFNγ、TNFα)和Th2细胞因子(IL-4、IL-10)两者，但是IL-4的分泌水平比其他细胞因子低得多。类似地，激活的T细胞分泌大量IL-6。Th17细胞因子IL-17α也以高水平分泌。细胞毒性组分sFasL、sFas、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素和颗粒溶素均在上清液中释放。
huA33-BsAb重定向T细胞以特异性地杀伤结肠癌和胃癌细胞。测试了huA33-BsAb重定向T细胞以杀伤癌细胞的能力。基于对多种人癌细胞系上的GPA33表达的调查(图10)，选择3种结肠癌细胞系(LS174T、SW1222和Colo205)和1种胃癌细胞系(SNU16)进行细胞毒性研究。将这些细胞系基于其微卫星不稳定性分布分类为MSI(LS174T)亚型或MSS(SW1222、Colo205、SNU16)亚型(Williams DS等人,PLOS ONE 5:e16012(2011)；Yoon K等人,GenomeResearch 23:1109-1117(2013)；Suter CM等人,Br J Cancer88:413-419(2003))。此外，LS174T细胞携带KRAS G12D突变，而其他细胞携带p53突变或缺失(Ahmed D等人,Oncogenesis 2:e71(2013)；Liu Y和Bodmer WF,Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 103:976-981(2006)；Ku J-L和Park J-G:Cancer Research and Treatment:Official Journal of Korean Cancer Association37:1-19(2005)；Ikediobi ON,Davies H,Bignell G等人,Molecular cancertherapeutics 5:2606-2612(2006))。
在10倍连续稀释的huA33-BsAb的存在下，将癌细胞与激活的T细胞以10:1的效应子与靶标的比率一起孵育。将GPA33(-)黑素瘤细胞系SKMEL5和骨肉瘤细胞系TC32用作阴性对照。如图4(A)所示，huA33-BsAb重定向了T细胞以特异性地杀伤所有表达GPA33的癌细胞，而不管其遗传背景如何，同时不杀伤SKMEL5和TC32，从而证实了huA33-BsAb介导的TDCC的抗原特异性。细胞毒性的最大水平似乎与FACS染色的水平相关(图1(D)和图4(A))。此外，由huA33-BsAb诱导的TDCC是有效的，其中EC50值在pM范围内。参见图4(A)。
为了确定哪些T细胞子集被huA33-BsAb动员，对来自CD4(+)和CD8(+)T细胞两者的CD45RA(+)CD62L(+)和CD45RA(-)CD45RO(+)CD62L(-)记忆子集进行分选。在Colo205肿瘤细胞的存在下，以5:1的E:T比率将分选的细胞培养48小时，然后使用LDH测定测量细胞毒性。如图4(B)所示，CD4(+)和CD8(+)记忆T细胞子集两者都能够诱导细胞毒性，其中CD8(+)记忆T细胞在较高浓度下介导更有效的杀伤。CD4(+)和CD8(+)两个群体(其中大多数为初试T细胞)的CD45RA(+)CD62L(+)子集在48小时后能够诱导细胞毒性，但是效力相比于记忆T细胞较低。
当将来自TDCC测定的T细胞用CD45RO和CD25染色时，发现在CD45RO+和CD45RO-两个级分中，CD25表达在huA33-BsAb的存在下上调(图12(A)和图12(B))，从而证实了初试和记忆T细胞两者均可以由huA33-BsAb激活。大多数CD45RA(+)CD62L(+)T细胞在孵育后仍保持CD45RO(-)状态，其中较小但显著的群体的CD45RO表达增加，尤其是在CD8(+)细胞中。参见图12(B)。然而，此群体可能源自初试T细胞的成熟或初始培养物中存在的稀有CD45RO+细胞的扩增。综上所述，这些数据表明，通过动员CD4和CD8 T细胞两者(尤其是记忆表型的那些)，huA33-BsAb可以以GPA33依赖性方式诱导针对结肠癌和胃癌细胞的有效细胞毒性。
这些结果证明，本技术的抗体或其抗原结合片段以高结合亲和力与A33抗原特异性地结合。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于检测样品中的A33蛋白。
实施例5：通过酵母展示进行huA33-BsAb的亲和力成熟
在进一步改善huA33-BsAb的效力的尝试中，使用酵母展示法使源自huA33的scFv亲和力成熟。由于scFv往往易于聚集，因此开发了一种将scFv快速重整为T细胞接合的huA33-BsAb(这是一种更相关的形式，并且可以容易地以高产量和高纯度生产)的方法(图13)。
所述方法基于一步式4片段连接方法，其利用II型酶SapI以允许不同片段的无缝连接，并且可以容易地适应于其他载体或扩大规模到高通量工作流程。多片段
Figure BDA0002502391540000861
克隆(Clontech Laboratories，山景城，加利福尼亚州)也进行了测试并获得了成功，但不太稳健(数据未显示)，可能是由于表达载体的特定序列所致。
从60个单克隆的序列分析中，选择了7个克隆(图5(A))用于通过SPR和TDCC测定进行的进一步表征。如与亲本抗体相比，所有7个克隆均显示出增加的结合亲和力，范围从4.3至51倍(图5(B))。七个亲和力成熟克隆的重链和轻链的氨基酸序列在图30-图36中示出。大部分改善归因于较慢的解离速率。在TDCC测定中，所有克隆的最大杀伤都略有改善(图5(C))。
这些结果证明，本技术的抗体或其抗原结合片段以高结合亲和力与A33抗原特异性地结合。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于检测样品中的A33蛋白。
实施例6：使用huA33-BsAb的体内治疗研究
使用两种不同的肿瘤模型，在人源化DKO小鼠中的以下异种移植模型中，在体内测试了huA33-BsAb的功效：(1)s.c.肿瘤加s.c.效应子和(2)i.p.肿瘤加i.v.效应子。
huA33-BsAb在s.c.异种移植模型中治愈了MSI肿瘤LS174T，并在i.p.模型中抑制了肿瘤生长。以1:1的比率将LS174T细胞与PBMC混合，并皮下植入DKO小鼠中。如图6(A)所示，在没有抗体治疗的情况下，仅肿瘤组和肿瘤+PBMC组两者表现出快速的肿瘤生长。来自肿瘤+PBMC组的小鼠出现肿瘤溃疡，并且必须实施安乐死。相比之下，在3周内6次剂量的huA33-BsAb有效地治愈了小鼠，所述小鼠保持无肿瘤至少120天。
为了模拟恶性腹水(结肠癌中的常见事件)，将表达萤光素酶的LS174T细胞腹膜内植入DKO小鼠体内。当通过发光证实肿瘤生长时，将小鼠随机分为不同的治疗组，用无抗体组(仅肿瘤)、仅肿瘤+T细胞组(肿瘤+ATC)或i.v.huA33-BsAb(3周内7次剂量)加上3周内每周注射T细胞治疗。在肿瘤植入后第5天开始治疗。所有的T细胞都是通过眼眶后途径注射的。
如图6(B)和图6(C)所示，所有对照组(无抗体组或仅肿瘤+T细胞组)均显示肿瘤在腹部指数增长。到第28天，无抗体组4只小鼠中的3只以及肿瘤+T细胞组5只小鼠中的3只分别死于肿瘤。相比之下，在经治疗小鼠的腹部区域中，huA33-BsAb显著抑制LS174T肿瘤的转移生长。在没有进一步治疗的情况下，所有的小鼠保持存活至少60天。这些结果表明，huA33-BsAb有效抵抗具有MSI基因型的CRC肿瘤。然而，如前所述，MSI肿瘤仅占CRC癌患者的一小部分。大多数CRC患者是MSS。因此，进一步使用MSS肿瘤来测试huA33-BsAb的功效。
huA33-BsAb在s.c.异种移植模型中治愈了MSS肿瘤COLO205，并抑制了转移MSS肿瘤SW1222的肿瘤生长。测试了两个MSS结肠癌细胞系Colo205和SW1222。对于Colo205细胞，将肿瘤皮下植入，其中PBMC作为效应细胞。在此模型中，4个剂量的huA33-BsAb足以完全根除Colo205肿瘤，并且在总共6个剂量的抗体治疗后，小鼠保持无肿瘤至少4个月(图7(A)和图7(B))。
对于SW1222细胞系，将肿瘤腹膜内种植并用3周内6个剂量的i.v.抗体和2周内每周的i.v.T细胞治疗。如图7(C)和图7(D)所示，两个对照组的肿瘤生长扩散到整个腹部区，而用huA33-BsAb治疗抑制了肿瘤生长并显著延长了小鼠的生存期(p＝0.0125)。这些结果表明，huA33-BsAb治疗MSS肿瘤的功效与治疗MSI肿瘤时所观察到的功效相当。预计另外的治疗周期将完全根除肿瘤的生长，如在皮下模型中。
huA33-BsAb在s.c.异种移植模型中抑制胃癌的生长。将GPA33在胃癌细胞子集中表达。FACS分析和体外TDCC测定表明，SNU16表达GPA33，并对huA33-BsAb重定向的T细胞杀伤敏感。在与人PBMC混合后，将SNU16细胞皮下异种移植。huA33-BsAb有效地治愈了具有s.c.肿瘤的小鼠(图8(A))并显著延长了生存期。与NSG小鼠不同，DKO小鼠对人PBMC移植的抗性更强。在s.c.SNU16模型中，在第58天(图8(B))，大多数小鼠显示低水平的具有较大变异的血液嵌合体。
如上所述，huA33-BsAb的功效与CRC肿瘤的遗传背景或突变状态无关，如果希望适用于大部分CRC，这是一个关键的生物学特性。与CAR修饰的T细胞不同，huA33-BsAb重定向的T细胞没有经历细胞衰竭，并且表现>3周的连续定量的肿瘤归巢特性。尽管存在PD1和PD-L1，肿瘤还是被治愈了，并且在亚治疗剂量的huA33-BsAb下添加检查点阻断进一步增强了这些抗肿瘤特性。本文公开的A33免疫球蛋白相关组合物为A33相关癌症的诊断和治疗提供了FcR依赖性和T细胞依赖性免疫治疗策略两者。
综上所述，这些结果证明，本技术的抗体或抗原结合片段可以检测肿瘤并抑制肿瘤生长和/或转移的进展。因此，本文公开的免疫球蛋白相关组合物可用于检测和治疗有需要的受试者中的A33阳性癌症。
实施例7：本技术的huA33-C825抗体在预靶向放射免疫疗法中的用途
开发用于预靶向放射免疫疗法(PRIT)的抗体试剂的主要缺点是正常组织中的辐射过度暴露、免疫原性、次最佳肿瘤剂量和低治疗指数。此实施例将证明，本技术的huA33-DOTA双特异性抗体可用于PRIT以治疗表达人A33抗原的癌症，如结肠直肠癌。
本技术的A33-DOTA双特异性抗体包含基于本文所述人源化A33抗体的第一抗原结合位点和结合小分子半抗原(例如，苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸[DOTA-Bn])的第二抗原结合位点。基于亲和力成熟的2D12.5抗体的抗DOTA-Bn单链Fv片段(ScFv)将连接到人源化A33轻链的羧基端。图37显示了双特异性抗体huA33-huC825(H2L2)的重链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。图38显示了双特异性抗体huA33-huC825(H2L2)的轻链的氨基酸和cDNA序列，它们分别对应于SEQ IDNO:60和SEQ ID NO:61。图39显示了双特异性抗体huA33-mC825(H2L2)的重链和轻链的氨基酸序列，它们分别对应于SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63。
肿瘤细胞系和细胞培养试剂。人结肠直肠癌细胞系SW1222将通过连续传代维持。在含有5％CO2的37℃环境中，在补充有10％热灭活胎牛血清、2.0mM谷氨酰胺、100个单位/mL青霉素和100个单位/mL链霉素的最小必需培养基中培养细胞。建立培养物并以小等份冷冻保存，以限制传代至少于三个月，并根据制造商的规范使用商业试剂盒(Lonza，朴茨茅斯，新罕布什尔州)定期地测试支原体。对于在细胞传代和收获期间进行胰蛋白酶消化，使用0.25％胰蛋白酶/0.53mM EDTA在不含钙和镁的汉克斯缓冲盐溶液中的溶液。huA33-huC825和huA33-mC825将在CHO细胞中在哺乳动物表达载体中产生，并通过蛋白A亲和色谱进行纯化。
表面等离子体共振研究。Biacore T100生物传感器、CM5传感器芯片和相关试剂购自GE Healthcare(芝加哥，伊利诺伊州)。重组人A33蛋白将购自Novoprotein Scientific,Inc.(萨米特，新泽西州)。BSA-(Y)-DOTA-Bn缀合物将如Cheal等人,Mol.Cancer Ther.13(7)(2014)中所述地制备。使用氨基偶联试剂盒(GE Healthcare，芝加哥，伊利诺伊州)固定A33和DOTA抗原。分析纯化的双特异性抗体和对照抗体，并将使用Biacore T100评价软件将数据拟合到二价分析物模型，如Cheal等人,(2014)所述。
PRIT试剂、方案和异种移植研究。所有的动物实验都将由Memorial SloanKettering Cancer Center的Institutional Animal Care and Use Committee批准，并且将遵循研究动物的正确和人道使用的机构指南。无胸腺nu/nu雌性小鼠(6-8周龄；HarlanSprague Dawley)被允许在动物饲养所适应至少一周。将各组动物在左侧腹用5×106个肿瘤细胞s.c.注射A33阳性SW1222，所述肿瘤细胞以1:1的比率用基质胶(BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)配制，并且使用椭圆体体积公式(V＝4/3π(长/2×宽/2×高/2)将在7-10天内观察到已建立的肿瘤(100-900mm2)。所有试剂都将经由侧尾静脉静脉内(i.v.)给予。PRIT方案包括注射以下物质：huA33-huC825或huA33-mC825[t＝-28h]，之后的清除剂(500KDa葡聚糖-(Y)-DOTA-Bn缀合物，根据Orcutt等人,Nucl.Med.Biol.38:223-233(2011)制备，并在24h后配制于注射用盐水中。每摩尔葡聚糖的(Y)-DOTA-Bn的摩尔取代比将是61(Y)-DOTA-Bn/葡聚糖)[t＝-4h]，以及4h后的177Lu-DOTA-Bn(如先前所述通过孵育来自Macrocyclics的氨基苄基-DOTA(p-NH2-Bn-DOTA)和177LuCl3(比活性-30Ci/mg；PerkinElmer)来制备，并且配制于注射用盐水中)[t＝0h]。此外，将huA33-C825用I131示踪放射性标记，以估计在PRIT期间的肿瘤摄取。
使用IODOGEN方法(Cheal,S.等人,Mol.Cancer Ther.13(7):1-10(2014))制备131I-huA33-mC825或131I-huA33-huC825(最终比活性为95.5MBq/mg，其中加入冷的huA33-huC825或huA33-mC825以实现所希望的mg剂量，使用尺寸排阻高压液相色谱法使放射化学纯度>98％)，并且将使用SW1222细胞评价体外细胞结合免疫反应性，基本上如Lindmo,T.等人,J.Immunol.Meth.126(2):183-189(1990)所述。对于使用非特异性IgG-C825的PRIT，使用同等mg剂量的GD2靶向双特异性抗体(hu3F8-C825)代替huA33-mC825或huA33-huC825。
对于离体生物分布分析，通过CO2(g)窒息对小鼠实施安乐死，并收获肿瘤和所选择的器官，用水冲洗，并允许风干，称重并且通过γ闪烁计数(Perkin Elmer WallacWizard 3"，PerkinElmer Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)进行放射测定。将对计数率进行背景和衰变校正，使用系统校准系数将其转换为活性，归一化为给予的活性，并表示为每克注射剂量百分比(％ID/g)。肿瘤和各种组织中177Lu-活性浓度的差异将在适当时通过Student's不成对t-检验进行分析。
吸收剂量的估计。给予携带A33阳性SW1222肿瘤的小鼠的组(n＝4-5)0.25mghuA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)、清除剂(62.5μg；25％(w/w))和1.85-2.0MBq(-10pmol)177Lu-DOTA-Bn，并在2、24和120h p.i时处死。对于每个组织，视情况使用Excel将非衰变-校正时间-活性浓度数据拟合至1-组分、2-组分或更复杂的指数函数，并将进行分析整合，以得出每单位给予活性的累积活性浓度(MBq-h/g/MBq)。非穿透辐射的177Lu平衡剂量常数(8.49g-cGy/MBq-h)将用于估算肿瘤间和选择器官间自我吸收剂量，假设仅177Luβ射线被完全局部吸收，并忽略γ射线和非自我剂量贡献。为了确定177Lu-DOTA-Bn剂量对肿瘤具有最高吸收剂量的选择组织(即血液、肝脏、脾脏和肾脏)中177Lu-DOTA-Bn的相对摄取的影响，将在t＝-28h向携带SW1222肿瘤的雌性无胸腺裸鼠的组(n＝5/组)给予0.25mg(1.19nmol)huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)，并且在t＝-4h给予62.5μg清除剂，随后给予11.1MBq(11.14-11.40MBq)、55.5MBq(54.61-55.06MBq)或111MBq(109.52-112.5MBq)。所有组在177Lu-DOTA-Bn的24h p.i.时(即最大肿瘤摄取时)处死，用于177Lu-活性的生物分布分析。
PRIT+86Y-DOTA-Bn的PET成像。向在肩部携带A33阳性SW1222肿瘤的小鼠的单个组(n＝5)给予0.25mg huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)、清除剂(62.5μ25％(w/w))和8.6-8.8MBq(-50pmol)的86Y-DOTA-Bn，并使用microPET Focus 120(CTI MolecularImaging,Inc.，诺克斯维尔，田纳西州)在大约2和20h p.i时进行非侵入式成像。将使用以下成像采集参数：350-750keV的能量窗口、6nsec的符合时间窗口和20min的采集时间。通过傅里叶重新分箱将所得的列表模式数据分选至2D直方图中，并且通过滤波反投影将断层图像重建成128×128×95矩阵(重建的空间分辨率是2.6mm半最大值全宽(FWHM))。针对扫描仪反应的不均匀性、空载时间计数损失、物理衰减(到注射时间)和86Y正电子分支比，对图像数据进行校正。将不应用衰减、散射或部分体积平均校正。将根据经验确定的小鼠系统校准系数(即μCi/mL/cps/体素)用于将体素计数率转换成活性浓度。然后将所得图像数据归一化为给予的活性，以通过感兴趣区域分析来确定针对到注射时间的放射性衰变校正的每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。使用AsiPRO VM 5.0软件(Concorde Microsystems，诺克斯维尔，田纳西州)执行成像和感兴趣区域(ROI)分析(作为ROI最大值，％ID/g)。在24hp.i.时处死动物，以进行离体生物分布分析。
放射自显影和免疫组织化学。使用低温恒温器(Avantik，斯普林菲尔德，新泽西州)，将来自给予huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)PRIT和随后的11.1(11.14-11.40MBq)、55.5(54.61-55.06MBq)或111MBq(109.52-112.5MBq)的177Lu-DOTA-Bn的选择小鼠(处死时间：p.i.24小时)的冷冻和OCT包埋的肿瘤和肾脏切成10μm切片，并且立即暴露于成像板(Fuji Photo Film，神奈川，日本)72h，并且随后使用Typhoon FLA 7000扫描仪(GE，匹兹堡，宾夕法尼亚州)进行扫描。将使相同的切片经受苏木精和曙红染色，并将在配备有受控移动台的Olympus BX60显微镜(Olympus，Central Valley，宾夕法尼亚州)下进行扫描。放射自显影和显微镜图像两者都是使用ImageJ(NIH,贝塞斯达,马里兰州)处理和分析的。
治疗和闪烁扫描法研究。对携带已建立的s.c.A33阳性SW1222异种移植物的小鼠的组注射huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)或非特异性(n.s.)IgG-C825 PRIT(即单周期治疗，在肿瘤接种后第7天注射177Lu-DOTA-Bn)或两个周期的PRIT(即双周期治疗研究，在肿瘤接种后第10天和第17天给予177Lu-DOTA-Bn注射)。对于双周期治疗研究，描述了肿瘤接种后第10天的肿瘤体积(TV 10)(即，第一次177Lu-DOTA-Bn注射当天)，并在适当时表示为平均值±SD。将以下定义用于描述治疗反应：完全反应(CR)定义为肿瘤缩小至<100mm3。持久反应(DR)定义为在治疗后140天存活。过度的肿瘤负荷定义为>2000mm3。对于闪烁扫描法研究，将经受治疗的携带A33阳性SW1222肿瘤的小鼠的所选择组置于通过气体吸入进行的麻醉下，然后使用低能量高分辨率准直器和设定在208keV的窗口在p.i.20小时在nanoSPECT(Bioscan，华盛顿)中扫描30分钟(每幅图像约105个计数)。使用BioscanHiSPECT软件将图像重建为256×256矩阵，并上传到ASIPro VM进行分析。
结果。基于使用0.1-0.6mg的huA33-C825(0.48-2.86nmol)以及固定比率的清除剂和177Lu-DOTA-Bn(5.6MBq)，在177Lu-DOTA-Bn的24h p.i.在携带SW1222肿瘤小鼠中的先导生物分布研究，选择huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)的剂量。接下来，进行另外的生物分布实验，以优化PRIT期间的清除剂剂量。对携带肿瘤的小鼠的组(n＝3至4/组)注射huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)，随后在24h后注射以下任一种：生理盐水(即媒介物)、2.4％(w/w，相对于预先选择的huA33-C825剂量)、5％(w/w)、10％(w/w)或25％(w/w)清除剂剂量(0-62.5μg/小鼠)。在另外4h后，对小鼠注射5.6MBq 177Lu-DOTA-Bn，并在24h后处死以用于生物分布分析。预期所述清除剂剂量将对循环(即血液)177Lu-活性具有显著影响，并可能降低肿瘤处随后摄取177Lu-DOTA-Bn的能力。
接下来，使用huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)和清除剂的优化PRIT剂量进行177Lu-DOTA-Bn剂量滴定研究。对于Lu-DOTA-Bn剂量滴定研究，将肿瘤和关键选择组织(血液、肝脏、脾脏和肾脏)的177Lu-活性生物分布数据以％ID/g和绝对摄取量(kBq/g)二者计在177Lu-DOTA-Bn剂量组之间进行比较。最后，在携带SW1222肿瘤的小鼠中在131I示踪标记的huA33-C825(0.39-0.40MBq，将冷的huA33-C825添加到1.19nmol)的24h p.i.进行单时间点生物分布实验，以估计在PRIT期间huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)在肿瘤中的绝对抗体摄取(以pmol/g计)。
确定了在植入SW1222肿瘤细胞的小鼠中放射性标记的DOTA-Bn的生物分布和吸收剂量的估计。在携带A33阳性SW1222肿瘤的小鼠的组中用huA33-C825和清除剂的最佳剂量和随后的2.0MBq(-10pmol)177Lu-DOTA-Bn进行PRIT，并在177Lu-DOTA-Bn的2-120h p.i.进行生物分布研究，以确定肿瘤和各种正常组织中的177Lu-活性停留时间。简而言之，在用最佳的A33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)和葡聚糖清除剂剂量以及2.0MBq(-10pmol)177Lu-DOTA-Bn进行PRIT之后，使用生物分布测定来确定肿瘤和各种正常组织中的177Lu-活性。向携带SW1222肿瘤的小鼠的组(n＝4-5)给予huA33-C825，随后在24h后给予葡聚糖清除剂，并且在另外4h后给予2.0MBq(-10pmol)的177Lu-DOTA-Bn。在177Lu-DOTA-Bn的2、24和120hp.i.处死单一组动物以进行生物分布分析。这些数据将如本文所述用于估算使用177Lu-DOTA-Bn的放射免疫疗法的吸收剂量。预计177Lu的肿瘤摄取将在给予后非常快速地发生，并将在接下来的96h内在120h p.i下降。对于每个目标区域，将吸收剂量计算为非穿透辐射(即β射线)的177Lu平衡剂量常数与目标区域177Lu累积活性的乘积，假设完全局部吸收177Luβ射线，并忽略γ射线和非自我剂量贡献。预计将在单周期治疗期间观察到高的肿瘤-血液治疗指数，并且将在表现出持久反应的受试者中在延长时间段期间观察到很少或没有毒性。当使用PET成像评估时，预期PRIT后肿瘤摄取有相似结果。
此实施例证明了使用本技术的A33-DOTA双特异性抗体的PRIT对A33阳性肿瘤的功效。预计随着剂量的增加，将观察到治疗指数的逐渐增加和绝对肿瘤摄取的减少。因此，本技术的huA33-DOTA双特异性抗体可用于治疗表达人A33抗原的癌症，如结肠直肠癌。
实施例8：本技术的huA33-C825抗体的体内治疗效果
此实施例说明了在携带A33阳性癌细胞的小鼠中，PRIT中huA33-C825双特异性抗体介导肿瘤负荷减少的体内功效。具体地，此实施例描述了单周期和双周期疗法对携带SW1222肿瘤的小鼠中肿瘤负荷的作用。
在单周期疗法研究中，将5组携带肿瘤的小鼠(n＝6至8/组)用以下任一种治疗：媒介物(即未治疗，n＝8，TV7：76±15mm3)、仅33.3MBq 177Lu-DOTA-Bn(在双特异性抗体和清除剂注射期间给予的媒介物，n＝6，TV 7：116±23mm3)、单周期IgG-C825 PRIT+33.3MBq 177Lu-DOTA-Bn(给予n.s.IgG-C825代替huA33-C825，n＝8，TV7：100±10mm3)，或单周期huA33-C825(huA33-huC825或huA33-mC825)PRIT+11.1MBq或33.3MBq177Lu-DOTA-Bn(都是n＝8，分别地，TV7：103±17mm3和TV7：93±15mm3)。预期在治疗过程中，相对肿瘤摄取将随着177Lu-DOTA-Bn剂量增加而减少。预计接受无治疗、由仅33.3MBq 177Lu-DOTA-Bn或单周期IgG-C825 PRIT+33.3MBq 177Lu-DOTA-Bn组成的治疗的携带肿瘤的小鼠的组将显示无肿瘤反应。预期给予177Lu-DOTA-Bn的后两个组的闪烁扫描法将在肿瘤区域中显示最小的活性。相比之下，预期用单周期huA33-C825 PRIT(huA33-huC825或huA33-mC825)+11.1MBq或33.3MBq 177Lu-DOTA-Bn治疗的组在治疗后显示肿瘤生长延迟。
在第二疗法研究中，研究了双周期huA33-C825 PRI(huA33-huC825或huA33-mC825)治疗。当向小鼠给予无治疗时(n＝5/TV10：314±77mm3)，所有小鼠将因肿瘤负荷过大而在30天内被处死。预计用两个周期的PRIT+11.1MBq 177Lu-DOTA-Bn(177Lu-DOTA-Bn总剂量22.2MBq)治疗(n＝5/TV10：462±179mm3)将在经治疗受试者中导致完全肿瘤反应和/或肿瘤生长延迟。
毒性研究。简而言之，在治疗后最多9周，提交用两个周期的PRIT+11.1MBq 177Lu-DOTA-Bn(n＝3)或两个周期的PRIT+1.5mCi 177Lu-DOTA-Bn(n＝3)治疗的总共6只小鼠进行肾脏、骨髓、肝脏和脾脏的解剖病理学评估。预计在经治疗的动物中，肾脏、骨髓、肝脏和脾脏将是正常的，并且PRIT治疗将与辐射诱导的毒性无关。
治愈性治疗诊断PRIT。携带已建立的SW1222 s.c.异种移植物的裸鼠(n＝20；肿瘤体积＝102±40mm3；平均值±标准差(SD))将经历采用以下任一种的治疗(n＝5-10/组)：无治疗(n＝5)、仅177Lu-DOTA-Bn(n＝5)，或三个周期的由huA33-C825 PRIT(huA33-huC825或huA33-mC825)+55MBq177Lu-DOTA-Bn组成的PRIT方案(n＝10；总计：165MBq)。在注射177Lu-DOTA-Bn的第一个周期后最多160小时，对五只随机选择的经历DPRIT的小鼠进行系列nanoSPECT/CT成像，以用于剂量测定计算。预计DPRIT将在所有经治疗的动物中诱导完全肿瘤反应，并且在肾脏、肝脏、脾脏和骨骼/骨髓中没有明显的毒性。预期三周期PRIT方案治疗的动物的镥-177nanoSPECT/CT成像将显示与肿瘤的可见摄取和最小组织背景的高度对比。这些结果表明，本技术的huA33-DOTA双特异性抗体可用于减少体内肿瘤负荷，并且基于PRIT的治疗诊断可以具有治愈作用和/或可用于检测受试者的肿瘤。
治疗诊断“实时”同时治疗和图像引导的剂量测定。将NanoSPECT/CT用于经历177Lu-DPRIT治疗的小鼠的高分辨率定量成像，以用于“实时”剂量测定。将携带SW1222肿瘤的裸鼠(体积：根据游标卡尺测量为100mm3)用单个周期的huA33-C825 PRIT(huA33-huC825或huA33-mC825)+55MBq177Lu-DOTA-Bn治疗，并在注射177Lu-DOTA-Bn后的以下三个时间通过nanoSPECT/CT成像：注射后1、24和160小时。将图像按照注射时间进行衰减校正，并使用已知的活性标准进行校准。使用校准图像的感兴趣区域分析来确定肿瘤中的活性浓度。
因此，本技术的huA33-DOTA双特异性抗体可用于治疗A33阳性癌症，并且可用于检测受试者的肿瘤。
实施例9：用本技术的huA33-DOTA双特异性抗体进行的离体生物分布研究
GPA33(+)人结肠直肠癌细胞系SW1222是从Ludwig Institute for CancerImmunotherapy(纽约，纽约州)获得的。在补充有10％热灭活胎牛血清、2.0mM谷氨酰胺、100个单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的最小必需培养基中培养SW1222细胞。将所有细胞都保持在含有5％CO2(g)的37℃环境中。在收到细胞系后，建立培养物并以小等份冷冻保存，以限制传代少于三个月，并使用商业试剂盒(Lonza，巴塞尔，瑞士)定期地测试支原体阴性。在细胞传代和收获过程中，将0.25％胰蛋白酶/0.53mM EDTA在不含钙和镁的汉克斯缓冲盐溶液中的溶液用于进行胰蛋白酶消化。对于SW1222肿瘤的建立，经由皮下(s.c.)注射在下侧腹上用培养基与重构的基膜(BD Matrigel，Collaborative Biomedical ProductsInc.，贝德福德，马萨诸塞州)的1:1混合物的200μL细胞悬浮液中的5.0x106个细胞对多组小鼠进行接种，并在7-10天内观察到建立的肿瘤(100-300mm3)。
对于所有静脉内注射，将小鼠用加热灯温和地加热，并放在约束器上。将小鼠尾巴用酒精垫消毒，并将注射液放入侧尾静脉中。
对于放射性示踪剂给予后的生物分布分析，通过CO2(g)窒息对小鼠实施安乐死，并收获肿瘤和选择的器官，用水冲洗，并允许风干，称重并且通过γ闪烁计数(WallacWizard 3”，Perkin Elmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)进行放射测定。除非另有说明，否则将计数率根据背景和衰变进行校正，使用同位素专用的系统校准系数转化为活性，归一化为给予的活性，并表示为平均值+SD％ID/g。
为了确定huA33-DOTA BsAb的生物分布，经由侧尾静脉对携带SW1222肿瘤的小鼠(组大小：对于给予清除剂(CA)步骤的那些，n＝2，并且对于盐水媒介物对照，n＝1；在生物分布时，离体肿瘤质量的范围为225-571mg)静脉内给予以下三种单独的试剂：在t＝-28小时给予0.25mg(1.19nmol)的huA33-C825(BC155-3克隆2G7)，随后在t＝-4小时给予500kD葡聚糖-DOTA(Y)清除剂，以及在t＝0小时给予[177Lu]Lu-DOTA-生物素(50μCi)。生物分布研究是在注射[177Lu]Lu-DOTA-生物素示踪剂后24小时时进行的。500kD葡聚糖-DOTA(Y)清除剂和[177Lu]Lu-DOTA-生物素是使用Orcutt,K.D.等人,Mol Cancer Ther 11:1365-1372(2012)中所述的方法制备的；将对于[177Lu]Lu-DOTA-苯所述的相同放射化学方案用于[177Lu]Lu-DOTA-生物素。％ID/gm＝每克组织的注射剂量百分比。
如图40所示，经历使用本技术的huA33-DOTA双特异性抗体的PRIT的动物在进行或没有进行清除剂给予步骤的情况下表现出高度的肿瘤穿透(大约20％-25％ID/g定位于GPA33(+)肿瘤)，因此证明了huA33-DOTA双特异性抗体可以有效地靶向体内肿瘤。
因此，本技术的huA33-DOTA双特异性抗体可用于治疗A33阳性癌症，并且可用于检测受试者的肿瘤。
等效物
本技术并非受限于本申请中描述的具体实施方案，所述实施方案旨在仅作为本技术的单独方面的说明。对于本领域技术人员清楚的是，可以在不背离本技术的精神和范围的情况下，对本技术进行多种修改和改变。本领域技术人员根据前述描述将清楚，除了本文列举的方法和装置外，在本技术范围内的功能上等效的方法和装置。此类修改和改变旨在落于本技术的范围内。应当理解，本技术不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然它们可以改变。还应理解本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意图具有限制性。
另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员应认识到，本公开文本由此也是按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
本领域技术人员应理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围都可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样本领域技术人员应理解，如“高达(upto)”、“至少(at least)”、“大于(greater than)”、“小于(less than)”等所有言辞都包括所述数字并且涉及随后可以分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组等等。
本文提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用以其整体并入，包括所有图形和表格，并入程度使其与本说明书的明确教示一致。

Claims (52)

1.一种包含重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)的抗体或其抗原结合片段，其中：
(a)所述VH包含FTFSTYDMS(SEQ ID NO:37)的VH-CDR1序列、TISSGGSYTYYLDSVKG(SEQ IDNO:38)的VH-CDR2序列和TTVVPFAY(SEQ ID NO:39)的VH-CDR3序列；和/或
(b)所述VL包含选自以下的VL-CDR1序列、VL-CDR2序列和VL-CDR3序列：
KASQNVRTVVA(SEQ ID NO:40)、LASNRHT(SEQ ID NO:41)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)；
KASQNVRTVVA(SEQ ID NO:40)、LASDRHT(SEQ ID NO:43)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)；
KASQNVRTLVA(SEQ ID NO:44)、LASNRHT(SEQ ID NO:41)和QHWSYPLT(SEQ ID NO:45)；以及
KASQNVRTLVA(SEQ ID NO:44)、LASNRHT(SEQ ID NO:41)和QYWSYPLT(SEQ ID NO:42)。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其进一步包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE的同种型的Fc结构域。
3.根据权利要求2所述的抗体，其包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。
4.根据权利要求2所述的抗体，其包含含有S228P突变的IgG4恒定区。
5.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与A33蛋白的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:57的至少五至八个连续氨基酸残基。
7.根据权利要求1-4或6中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
8.一种抗体，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62的重链(HC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体，和/或包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63的轻链(LC)氨基酸序列或其具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
9.根据权利要求8所述的抗体，其包含分别选自以下的HC氨基酸序列和LC氨基酸序列：
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9(3A3-H1/L1)；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10(3A3-H1/L2)；
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9(3A3-H2/L1)；
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10(3A3-H2/L2)；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17(huA33-IgG1(H2L2))；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21(huA33-BsAb)；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24(克隆31)；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(克隆32)；
SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28(克隆48)；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(克隆49)；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(克隆53)；
SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34(克隆56)；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36(克隆57)；
SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:60(huA33-huC825)；和
SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63(huA33-mC825)。
10.一种抗体，所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:9、10、17、21、24、26、28、30、32、34、36、60或63中任何一个中存在的轻链免疫球蛋白可变结构域序列至少95％相同的轻链免疫球蛋白可变结构域序列；和/或
(b)与SEQ ID NO:5、6、15、19、23、25、27、29、31、33、35、58或62中任何一个中存在的重链免疫球蛋白可变结构域序列至少95％相同的重链免疫球蛋白可变结构域序列。
11.一种抗体，所述抗体包含(a)与SEQ ID NO:910、17、21、24、26、28、30、32、34、36、60或63中任何一个中存在的LC序列至少95％相同的LC序列；和/或
(b)与SEQ ID NO:5、6、15、19、23、25、27、29、31、33、35、58或62中的任何一个中存在的HC序列至少95％相同的HC序列。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的抗体，其中所述抗体与A33蛋白的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:57的至少五至八个连续氨基酸残基。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有选自N297A和K322A的一个或多个氨基酸取代的IgG1恒定区。
15.根据权利要求8-13中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含含有S228P突变的IgG4恒定区。
16.一种编码根据权利要求8-15中任一项所述的抗体的重组核酸序列。
17.一种选自以下的重组核酸序列：SEQ ID NO:7、8、11、12、16、18、20、22、59和61。
18.一种包含根据权利要求16或权利要求17所述的重组核酸序列的宿主细胞或载体。
19.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体，其中所述抗体或抗原结合片段任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
20.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求8-15中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体，其中所述抗体任选地与选自以下的药剂缀合：同位素、染料、色原、造影剂、药物、毒素、细胞因子、酶、酶抑制剂、激素、激素拮抗剂、生长因子、放射性核素、金属、脂质体、纳米颗粒、RNA、DNA或其任何组合。
21.根据权利要求1-4、6或7中任一项所述的抗体，其中所述抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
22.根据权利要求8-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体缺乏α-1,6-岩藻糖修饰。
23.根据权利要求7或12所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与T细胞、B细胞、骨髓细胞、浆细胞或肥大细胞结合。
24.根据权利要求7或12所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与CD3、CD4、CD8、CD20、CD19、CD21、CD23、CD46、CD80、HLA-DR、CD74、CD22、CD14、CD15、CD16、CD123、TCRγ/δ、NKp46、KIR或小分子DOTA半抗原结合。
25.一种治疗有需要的受试者中A33相关癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的抗体，所述抗体包含HC氨基酸序列和LC氨基酸序列，所述HC氨基酸序列和LC氨基酸序列各自包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9(3A3-H1/L1)；
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10(3A3-H1/L2)；
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9(3A3-H2/L1)；
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10(3A3-H2/L2)；
SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17(huA33-IgG1(H2L2))；
SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21(huA33-BsAb)；
SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24(克隆31)；
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(克隆32)；
SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28(克隆48)；
SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(克隆49)；
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(克隆53)；
SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34(克隆56)；
SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36(克隆57)；
SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:60(huA33-huC825)；和
SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63(huA33-mC825)，
其中所述抗体与A33特异性地结合并中和A33活性。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述A33相关癌症是结肠直肠癌、腹膜假粘液瘤、阑尾癌、胰腺癌或胃癌。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中将所述抗体与另外的治疗剂分开地、顺序地或同时给予至所述受试者。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述另外的治疗剂是以下中的一种或多种：烷基化剂、铂剂、紫杉烷、长春花剂、抗雌激素药物、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、抑制细胞的生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、二膦酸盐治疗剂。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述A33相关癌症是具有MSI基因型的结肠直肠癌。
30.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述A33相关癌症是具有MSS基因型的结肠直肠癌。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述结肠直肠癌与KRASG12D突变或p53突变相关。
32.一种用于在体内检测受试者中肿瘤的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者给予有效量的根据权利要求8-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体被配置为定位于表达A33的肿瘤，并用放射性同位素标记；以及
(b)通过检测由所述抗体发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中肿瘤的存在。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者被诊断患有或怀疑患有癌症。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中使用正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机断层摄影术检测由所述抗体发射的放射性水平。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者给予有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与放射性核素缀合的根据权利要求8-15中任一项所述的抗体。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述放射性核素是发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素、俄歇发射体或其任何组合。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述发射β粒子的同位素选自86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu和67Cu。
38.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-15中任一项所述的抗体和使用说明书。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中根据权利要求1-15中任一项所述的抗体与选自放射性标记、荧光标记和发色标记的至少一种可检测标记偶联。
40.根据权利要求38或39所述的试剂盒，其还包含与根据权利要求1-15中任一项所述的抗体特异性结合的二抗。
41.根据权利要求7或12所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与放射性标记的DOTA半抗原和A33抗原结合。
42.一种用于检测有需要的受试者中的实体肿瘤的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原和根据权利要求41所述的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达A33的实体肿瘤；以及
(b)通过检测由所述复合物发射的高于参考值的放射性水平来检测所述受试者中实体肿瘤的存在。
43.一种用于选择受试者进行预靶向放射免疫疗法的方法，所述方法包括
(a)向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原和根据权利要求41所述的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达A33的实体肿瘤；
(b)检测由所述复合物发射的放射性水平；以及
(c)当由所述复合物发射的放射性水平高于参考值时，选择所述受试者进行预靶向放射免疫疗法。
44.一种用于在被诊断为A33阳性癌症的受试者中增加肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原和根据权利要求41所述的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达A33的肿瘤。
45.一种用于治疗有需要的受试者中癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的复合物，所述复合物包含放射性标记的DOTA半抗原和根据权利要求41所述的双特异性抗体，其中所述复合物被配置为定位于表达A33的肿瘤。
46.一种用于在被诊断为A33阳性癌症的受试者中增加肿瘤对放射疗法的敏感性的方法，所述方法包括
(a)给予有效量的根据权利要求41所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体被配置为定位于表达A33的肿瘤；以及
(b)向所述受试者给予有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置为结合所述双特异性抗体。
47.一种用于治疗有需要的受试者中癌症的方法，所述方法包括
(a)给予有效量的根据权利要求41所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体被配置为定位于表达A33的肿瘤；以及
(b)向所述受试者给予有效量的放射性标记的DOTA半抗原，其中所述放射性标记的DOTA半抗原被配置为结合所述双特异性抗体。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其进一步包括在给予所述放射性标记的DOTA半抗原之前，向所述受试者给予有效量的清除剂。
49.根据权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
50.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述复合物通过静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、脑室内、口服或鼻内给予。
51.根据权利要求42-50中任一项所述的方法，其中所述放射性标记的DOTA半抗原包含发射α粒子的同位素、发射β粒子的同位素或俄歇发射体。
52.根据权利要求42-51中任一项所述的方法，其中所述放射性标记的DOTA半抗原包含213Bi、211At、225Ac、152Dy、212Bi、223Ra、219Rn、215Po、211Bi、221Fr、217At、255Fm、86Y、90Y、89Sr、165Dy、186Re、188Re、177Lu、67Cu、111In、67Ga、51Cr、58Co、99mTc、103mRh、195mPt、119Sb、161Ho、189mOs、192Ir、201Tl、203Pb、68Ga、227Th或64Cu。
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