KR100602857B1 - 감각 정보 전달과 관련된 ｇ-단백질 커플링된 수용체를암호화하는 핵산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감각 세포 특이적 G-단백질 커플링된 수용체의 분리된 핵산 및 아미노산 서열, 이 수용체에 대한 항체, 이러한 핵산 및 수용체를 검출하는 방법과 감각 세포 특이적 G-단백질 커플링된 수용체의 조절인자의 검색 방법을 제공한다.

Description

감각 정보 전달과 관련된 Ｇ-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 핵산{NUCLEIC ACIDS ENCODING A G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR INVOLVED IN SENSORY TRANSDUCTION}

관련 출원의 전후 참조

본 출원은 그 전문을 참고로 인용한 1998년 7월 28일에 출원된 USSN 60/094,465호에 대한 우선권을 주장한다.

연방 정부가 후원한 연구 및 개발에 관한 진술

본 발명은 국립 건강 협회가 인정하는 승인 번호 5R01 DC03160하에 정부의 지원으로 행하여졌다. 정부는 본 발명에 관한 일부 권리를 갖는다.

기술분야

본 발명은 감각 세포 특이적 G-단백질 커플링된 수용체의 분리된 핵산 및 아미노산 서열, 이 수용체에 대한 항체, 이러한 핵산 및 수용체를 검출하는 방법과, 감각 세포 특이적 G-단백질 커플링된 수용체의 조절인자에 대한 검색 방법을 제공한다.

미각 정보 전달(transduction)은 동물의 화학 정보 전달의 가장 복잡한 형태 중 하나이다[예컨대 Margolskee, BioEssays 15:645-650(1993); Avenet & Lindemann, J.Membrane Biol. 112:1-8(1989) 참조]. 미각의 시그널링은 단순 후생동물에서 가장 복합적인 척추 동물에 이르기까지 동물계 전반에서 발견된다. 미각 시그널링의 주요한 목적은 비휘발성 리간드에 대한 신뢰할 수 있는 시그널링 반응을 제공하는 것이다. 이들 각각의 양식은 수용체 또는 채널이 매개하는 독특한 시그널링 경로에 의해 매개되어, 수용체 세포 소극화, 수용체 또는 작용 전위 형성, 및 미각의 구심성 뉴론 시냅스에서의 신경전달자의 방출을 초래하는 것으로 생각된다[예컨대 Roper, Ann. Rev. Neurosci. 12:329-353(1989) 참조].

포유류는 5가지 기본 미각 양식, 즉 단맛, 쓴맛, 신맛, 짠맛 및 우나미맛(글루탐산1나트륨의 맛)을 갖는 것으로 보인다[예컨대, Kawamura & Kare, Introduction to Unami: A basic Taste(1987); Kinnamon & Cummings, Ann. Rev. Physiol. 54:715-731(1992); Lindemann, Physiol. Rev. 76:718-766(1996); Stewart 등., Am. J. Physiol. 272:1-26(1997) 참조]. 인간에 관한 광범위한 정신물리학적 연구로부터 혀의 상이한 영역은 다른 미각을 선호한다는 것이 보고되었다[예컨대, Hoffmann, Menchen, Arch. Path. Anat. Physiol. 62:516-530(1987); Bradley 등, Anatomical Record 212:246-249(1985); Miller & Reedy, Physiol. Behav. 47:1213-1219(1990) 참조]. 또한, 동물의 다양한 생리학적 연구 결과, 미각 수용체 세포는 상이한 미각촉진제에 선택적으로 반응할 수 있음이 확인되었다[예컨대 Akabas 등, Science 242:1047-1050(1988); Gilbertson 등, J. Gen. Physiol. 100:803-24(1992); Bernhardt 등, J.Physiol. 490:325-336(1996); Cummings 등, J. Neurophysiol. 75:1256-1263(1996) 참조].

포유류의 경우, 미각 수용체 세포는 혀의 상피세포에서 상이한 유두 내에 분포되어 있는 미뢰로 조합된다. 혀의 매우 뒷부분에서 발견되는 유곽 유두는 수백개(마우스) 내지 수천개(인간)의 미뢰를 포함하며, 쓴 물질에 특히 민감하다. 혀의 후방 측연부에 위치하는 엽상 유두는 수십 내지 수백개의 미뢰를 포함하고, 신 물질과 쓴 물질에 특히 민감하다. 하나 또는 수 개의 미뢰를 포함하는 용상 유두는 혀의 앞 부분에 있으며, 주로 단맛 종류를 매개하는 것으로 생각된다.

각각의 미뢰는, 그 종류에 따라서, 전구 세포, 지지 세포 및 미각 수용체 세포를 비롯하여 50∼150개의 세포를 포함한다[예컨대, Lindemann, Physiol. Rev.. 76:718-766(1996)]. 수용체 세포는 뇌 간세포 및 시상내에서 시냅스를 통해 대뇌 피질의 미각 센터로 정보를 전달하는 구심성 신경 말단에 의해 세포의 기부에서 신경 자극을 받는다. 미각 세포 시그널링 및 정보 처리의 메카니즘을 설명하는 것은 미각의 기능, 조절 및 "인지"를 이해하는데 중요하다.

미각 세포 기능의 정신물리학 및 생리학에 관해 많은 것이 알려져 있지만, 이들 감각 시그널링 반응을 매개하는 분자 및 경로에 관해서는 알려진 것이 거의 없다[Gilbertson, Current Opn. in Neurobiol. 3:532-539(1993)에 검토]. 전기생리학적 연구는 시거나 짠 미각 촉진제가 세포의 정상 표면에 분화된 막 채널을 통해 H⁺ 및 Na⁺ 이온을 직접 유입시켜 미각 세포 기능을 조절한다고 제안한다. 이들 신맛을 갖는 화합물의 경우, 미각 세포 소극화는 K⁺ 채널의 H⁺ 차단[예컨대, Kinnamon 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:7023-7027 (1988)] 또는 pH-민감성 채널의 활성화[예컨대 Gilbertson 등., J.Gen.Physiol. 100:803-24(1992) 참조]로부터 생기는 것이라는 가설이 있고; 염의 정보 전달은 아밀로라이드 민감성 Na⁺ 채널을 통한 Na⁺의 유입으로 부분적으로 매개될 수 있다[예컨대, Heck 등, Science 223:403-405(1984); Brand 등, Brain Res. 207-214(1985); Avenet 등, Nature 331:351-354(1988) 참조].

단맛, 쓴맛 및 우나미맛 정보 전달은 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR) 시그널링 경로가 매개하는 것으로 보인다[예컨대, Striem 등, Biochem. J. 260:121-126(1989); Chaudhari 등., J.Neuros. 16:3817-3826(1996); Wong 등, Nature 381:769-800 (1996) 참조]. 당황스럽게도, GPCR 다단계에 대한 작동기 효소(예, G 단백질 서브유닛, cGMP 포스포디에스테라제, 포스포리파제 C, 아데닐레이트 시클라제; 예를 들어 Kinnamon & Margolskee, Curr. Opin. Neurobiol. 6:506-513(1996) 참조)와 거의 비슷한 수의 단맛 및 쓴맛 정보 전달에 대한 시그널링 경로 모델이 있다. 그러나, 미각 정보 전달과 연루된 특정 막 수용체, 또는 개개의 미각 정보 전달 경로에 의해 활성화되는 여러개의 각 세포내 시그널링 분자에 관해 알려진 것은 거의 없다. 여러 약리학적 및 식품 산업 용도에서 제공되는 쓴맛의 길항물질, 단맛의 작용물질, 및 짠맛과 신맛의 조절인자에 대한 분자를 확인하는 것이 중요하다.

미각 수용체(미각 이온 채널을 비롯)와, 미각 시그널링 분자, 예컨대 시그널 정보 전달에 연루된 효소 및 G-단백질 서브유닛의 확인 및 분리로 미각 정보 전달 경로의 약리학적 및 유전자적 조절이 가능하다. 예를 들어, 수용체 및 채널 분자의 이용가능성으로 인해, 미각 세포 활성의 고친화도 작용물질, 길항물질, 역 작용물질 및 조절인자를 검색할 수 있다. 그 다음, 이러한 미각 조절 화합물을 약리학 및 식품 산업에 사용하여 맛을 주문 생산할 수 있다. 또한, 이러한 미각 세포 특이적 분자는 혀의 미각 세포와 뇌의 미각 센터로 유도하는 미각 감각 뉴론 사이의 관계를 설명하는 미각 해부학적 지도를 작성하는데 있어서 매우 귀중한 도구로서 작용할 수 있다.

발명의 개요

따라서, 본 발명은 무엇보다도 미각 세포 특이적 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 핵산을 제공한다. 이들 핵산과 이 핵산이 암호화하는 폴리펩티드는 G-단백질 커플링된 수용체("GPCR") B3"에 대해서 "GPCR-B3"로 언급한다. 이들 미각 세포 특이적 GPCR은 미각 정보 전달 경로의 성분이다.

제1 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 약 70% 이상의 아미노산 동일성이 있는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.

일양태에서, 핵산은 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 핵산은, 엄중 하이브리드화 조건하에서 IAWDWNGPKW(서열 번호 7) 및 LPENYNEAKC(서열 번호 8)로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 축퇴성 프라이머 세트와 동일한 서열에 선택적으로 하이 브리드화하는 프라이머로 증폭시킨다.

제2 측면에서, 본 발명은 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 분리된 핵산을 제공하는데, 여기서 핵산은 고도로 엄중한 조건하에서 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 서열을 보유한 핵산에 특이적으로 하이브리드화한다.

제3 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 서열을 보유한 폴리펩티드와 약 70% 이상의 아미노산 동일성이 있는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 분리된 핵산을 제공하는데, 여기서 핵산은 중간 엄중 하이브리드화 조건하에서 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 하이브리드화한다.

제4 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1의 세포외 도메인과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체의 세포외 도메인을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.

제5 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1의 경막 도메인과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체의 경막 도메인을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.

제6 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 분리된 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 제공한다.

일양태에서, 수용체는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3에 대해 형성된 폴리클론 항체에 특이적으로 결합한다. 또 다른 양태에서, 수용체는 G-단백질 커플링된 수용체 활성을 보유한다. 또 다른 양태에서, 수용체는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 보유한다. 또 다른 양태에서, 수용체는 인간, 래트 또는 마우스에서 유래한다.

제7 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1의 세포외 도메인과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

일양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 세포외 도메인을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 세포외 도메인은 이종 폴리펩티드에 공유적으로 결합되어, 키메라 폴리펩티드를 형성한다.

제8 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1의 경막 도메인과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체의 경막 도메인을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

일양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 경막 도메인을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 세포질 도메인과 약 70% 이상의 아미노산 동일성이 있는 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 세포질 도메인을 암호화한다. 또 다른 양태에서, 경막 도메인은 이종 폴리펩티드에 공유 결합하여, 키메라 폴리펩티드를 형성한다. 또 다른 양태에서, 키메라 폴리펩티드는 G-단백질 커플링된 수용체 활성을 보유한다.

제9 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아 미노산 서열과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 수용체에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다.

제10 측면에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

제11 측면에서, 본 발명은 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.

제12 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 세포외 도메인과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 화합물을 접촉시키는 단계; 및 (ii) 세포외 도메인에 대한 화합물의 기능적 효과를 측정하는 단계를 포함하여, 감각 세포에서 감각 시그널링을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

제13 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 경막 도메인과 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성이 있는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체의 경막 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 화합물을 접촉시키는 단계; 및 (ii) 경막 도메인에 대한 화합물의 기능적 효과를 측정하는 단계를 포함하여, 감각 세포에서 감각 시그널링을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

일양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3을 암호화하는 폴리펩티드와 약 70% 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체이다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드에 공유적으로 결합하여 키메라 폴리펩티드를 형성하는 세포외 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 G-단백질 커플링된 수용체 활성을 보유한다. 또 다른 양태에서, 세포외 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 고상에 결합한다. 또 다른 양태에서, 기능적 효과는 세포내 cAMP, IP3 또는 Ca²⁺에서의 변화를 측정하여 결정한다. 또 다른 양태에서, 기능적 효과는 화학적 효과이다. 또 다른 양태에서, 기능적 효과는 세포외 도메인에 대한 화합물의 결합을 측정하여 결정한다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 재조합체이다. 또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 세포 또는 세포막에서 발현된다. 또 다른 양태에서, 세포는 진핵 세포이다.

일양태에서, 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드에 공유적으로 결합하여, 키메라 폴리펩티드를 형성하는 경막 도메인을 포함한다.

제14 측면에서, 본 발명은 수용체의 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 서열을 보유한 폴리펩티드와 약 70% 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터로부터 수용체를 발현하는 단계를 포함하여, 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 제조하는 방법을 제공한다.

제15 측면에서, 본 발명은 수용체의 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 서열을 보유한 폴리펩티드와 약 70% 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 세포를 형질도입하는 단계를 포함하여, 감각 정보 전달 G-단 백질 커플링된 수용체를 포함하는 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

제16 측면에서, 본 발명은 수용체의 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 서열을 보유한 폴리펩티드와 약 70% 이상의 아미노산 동일성을 포함하는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 결찰시키는 단계를 포함하여, 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 마우스 GPCR-B3 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 대략 아미노산 580(잔기 1로서 정의된 ATG 개시 메티오닌이 있는 마우스 서열의 뉴클레오티드 잔기 1-1740에 해당)에 있는 거대한 세포외 도메인과 7개의 경막 도메인을 보유한, GPCR-B3(서열 번호 2)의 제안된 해부학적 지도(topology)를 제시한다. 거대한 세포외 도메인은 제1 경막 도메인으로 확장될 수 있다. 어둡게 표시한 잔기는 GPCR-B3 및 GPCR-B4 사이의 동일성을 표시한다[GPCR-B4의 설명에 대해서는, 1998년 7월 28일에 출원된 USSN 60/095,464호와, 1998년 12월 17일에 출원된 USSN 60/112,747호 참조; 또한, Hoon 등, Cell.96:541-551(1991) 참조].

도 2는 미뢰에서는 GPCR-B3 단백질을 발현하지만 미각 이외의 조직에서는 발현하지 않음을 보여주는 웨스턴 블롯이다. PCR 분석을 사용하여, GPCR-B3 발현에 대하여 혀 이외의 조직, 즉 뇌, 간, 후각 상피세포, VNO 및 심장 조직을 검색하였다. GPCR-B3은 미각 조직에서만 발현되었다(도시되지 않음).

도 3은 미뢰의 미각 수용체 세포에서는 GPCR-B3가 표지화되지만, 인접하는 비-미각 조직에서는 표지화되지 않음을 보여주는 혀 조직 절편의 동일계 하이브리드화를 도시한다.

도 4는 쥐 GPCR-B3에서 유래한 쥐 mGluR1 수용체의 전체 세포외 도메인과 7개의 경막 영역 및 해당 시토졸 루프를 포함하는 경막 도메인, 및 C 말단을 포함하는 키메라 수용체(서열 번호 2)를 도시한다.

도 5는 도 4에 도시된 키메라 글루타메이트/GPCR-B3 수용체로 형질감염된 HEK 세포를 도시한다. 도 5는 글루타메이트에 대한 칼슘 반응을 보여주는데, 이는 포스포리파제 C에 대한 키메라 수용체의 강한 커플링을 입증하는 것이다. 이들 결과는, 키메라 글루타메이트/GPCR-B3가 불규칙한(promiscuous) G 단백질 Gα15에 커플링되고, 지시제 푸라-2를 사용하여 검출할 수 있는 칼슘 반응을 촉발할 수 있음을 제시한다.

발명의 상세한 설명

I. 도입

본 발명은 먼저 미각 세포 특이적 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 핵산을 제공한다. 이들 핵산과 이들이 암호화하는 수용체는 G-단백질 커플링된 수용체의 경우 "GPCR"이라 부르고, GPCR-B3로 명명한다. 이들 미각 세포 특이적 GPCR은 미각 정보 전달 경로의 성분이다. 이들 핵산은 미각 세포에서 특이적으로 발현되기 때문에, 미각 세포 확인용 프로브로서 가치가 있다. 예를 들어, GPCR 폴리펩티드 및 단백질에 대한 프로브를 사용하여 엽상 세포 및 유곽 세포와 같은 미각 세포의 서브 세트, 또는 특정 미각(예, 단맛, 신맛, 짠맛, 쓴맛) 수용체 세포를 확인할 수 있다. 또한, 이들은 혀의 미각 세포와 뇌의 미각 센터로 유도하는 미각 감각 뉴런 사이의 관계를 설명하는 미각 해부학적 지도를 형성하는 도구로서 작용한다. 또한, 핵산 및 이들이 암호화하는 단백질은 미각 유도된 작용을 분석하는데 프로브로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 신규 미각 세포 GPCR의 조절인자, 예컨대 활성인자, 억제인자, 자극인자, 증진인자, 작동물질 및 길항물질을 검색하는 방법을 제공한다. 이러한 미각 정보 전달의 조절인자는 미각 시그널링 경로의 약리학적 및 유전자적 조절에 유용하다. 검색 방법을 사용하여 미각 세포 활성의 고 친화도 작용물질 및 길항물질을 확인할 수 있다. 그 다음 이들 조절 화합물을 식품 및 약리학 산업에 사용하여 맛을 주문 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 미각 조절용 분석법을 제공하는데, 여기서 GPCR-B3은 조절인자가 미각 정보 전달에 미치는 효과에 대해 직접적 또는 간접적 리포터 분자로서 작용한다. 이 분석법에 GPCR을 사용하여, 예컨대 이온 농도, 막 전위, 전류, 이온 플럭스, 전사, 시그널 정보 전달, 수용체-리간드 상호작용, 제2의 전달자 농도의 변화를 시험관내, 생체내, 생체외에서 측정할 수 있다. 일양태에서, GPCR-B3은 녹색 형광 단백질과 같이 제2 리포터 분자에 결합하여 간접적 수용체로서 사용할 수 있다[예컨대 Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15:961-964(1997)]. 또 다른 양태에서, GPCR-B3은 세포내에서 재조합으로 발현되고, GPCR 활성을 통한 미각 정보 전달의 조절은 Ca²⁺ 레벨의 변화를 측정하여 분석한다.

미각 정보 전달의 조절인자에 대한 분석 방법으로는, GPCR-B3, 이의 일부, 예컨대 세포외 도메인, 또는 GPCR-B3의 하나 이상의 도메인을 포함하는 키메라 단백질, 난모세포 GPCR-B3 발현을 이용한 시험관내 리간드 결합 분석; 조직 배양 세포 GPCR-B3 발현; GPCR-B3의 전사 활성화; GPCR의 인산화 및 탈인산화; GPCR에 대한 G-단백질 결합; 리간드 결합 분석; 전압, 막 전위 및 전도성 변화; 이온 플럭스 분석; cAMP 및 이노시톨 트리포스페이트와 같은 세포내 제2 전달자 변화; 세포내 칼슘 레벨의 변화; 및 신경전달물질 방출 등이 있다.

마지막으로, 본 발명은 GPCR-B3 핵산 및 단백질 발현을 검출하는 방법을 제공하여, 미각 정보 전달 조절을 연구하고 미각 수용체 세포를 구체적으로 확인할 수 있다. GPCR-B3은 기원 및 법정 연구에 대한 유용한 핵산 프로브를 제공한다. GPCR-B3은 엽상, 용상 및 유곽 미각 수용체 세포와 같은 미각 수용체 세포의 아군을 확인하는데 유용한 핵산 프로브이다. GPCR-B3 수용체를 사용하여 미각 수용체 세포를 확인하는데 유용한 모노클론 및 폴리클론 항체를 형성할 수도 있다. mRNA의 역전사 및 증폭, 총 RNA 또는 폴리 A⁺ RNA의 분리, 노던 블롯, 도트 블롯, 동일계 하이브리드화, RNase 보호, S1 분해, 탐침 DNA 마이크로칩 어레이, 웨스턴 블롯 등의 기법을 사용하여 미각 수용체 세포를 확인할 수 있다.

기능적으로, GPCR-B3은 미각 정보 전달과 관련된 7개의 경막 G-단백질 커플링된 수용체를 제공하는데, 이 수용체는 G-단백질과 상호작용하여 미각 시그널 정보 전달을 매개한다[예컨대 Fong, Cell Signal 8:217(1996); Baldwin, Curr. Opin. Cell Biol. 6:180(1994) 참조].

구조적으로, GPCR-B3의 뉴클레오티드 서열(예컨대, 각각 래트, 마우스 및 인간에서 분리된 서열 번호 4∼6 참조)은 추정 분자량이 대략 97 kDa이고 추정 범위가 92∼102 kDa인 대략 840개의 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다(예컨대, 서열 번호 1∼3 참조). 기타 종에서 유래한 관련된 GPCR-B3 유전자는 약 25개 이상의 아미노산 길이, 임의적으로 50∼100개 아미노산 길이의 아미노산 영역에 걸쳐 약 70% 이상의 아미노산 동일성을 공유한다. GPCR-B3은 엽상 세포 및 용상 세포에서 특이적으로 발현되며, 혀의 유곽 미각 수용체 세포에서는 발현량이 낮다. GPCR-B3은 올리고-dT 프라이밍된 유곽 cDNA 라이브러리에서 유래한 cDNA 중 대략 1/150,000의 cDNA에서 발견되는 중간 정도로 드문 서열이다(실시예 1 참조).

본 발명은 서열 번호 1에 도시된 GPCR-B3의 다형성 변형체를 제공하는데, 여기서 변형체 1은 아미노산 위치 33에서 류신 산 잔기 대신 이소류신 잔기로 치환한 것이고; 변형체 2는 아미노산 위치 84에서 글루탐산 잔기를 아스파르트산 잔기로 치환한 것이며; 변형체 3은 아미노산 위치 90에서 알라닌 잔기를 글리신 잔기로 치환한 것이다.

GPCR-B3 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 특정 영역을 사용하여 GPCR-B3의 다형성 변형체, 종간 상동체, 및 대립유전자를 확인할 수 있다. 이러한 확인은, 예컨대 엄중 하이브리드화 조건하에서 또는 PCR(서열 번호 7∼8을 암호화하는 프라이머 사용) 및 서열결정으로, 또는 기타 뉴클레오티드 서열과 비교하기 위한 컴퓨터 시스템에서의 서열 정보를 사용하여 시험관내에서 실시될 수 있다. 통상적으로, GPCR-B3의 다형성 변형체 및 대립유전자는 약 25개 이상의 아미노산, 예컨대 50∼100개 아미노산의 아미노산 서열을 비교하여 확인할 수 있다. 대략 약 70% 이상, 임의로 80% 이상, 경우에 따라서는 90∼95% 이상의 아미노산 동일성은 통상적으로 단백질이 GPCR-B3의 다형성 변형체, 종간 상동체 또는 대립유전자라는 것을 입증한다. 서열 비교는 하기에 설명한 임의의 서열 비교 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. GPCR-B3 또는 이의 보존 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 대립유전자, 종간 상동체 및 다형성 변형체를 확인할 수 있다.

GPCR-B3의 다형성 변형체, 종간 상동체 및 대립유전자는 추정 GPCR-B3 폴리펩티드의 미각 세포 특이적 발현을 검사하여 확인한다. 통상적으로, 추정 GPCR-B3 단백질과 비교하는데 있어서 양성 대조군으로서 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 보유하는 GPCR-B3을 사용하여 GPCR-B3의 다형성 변형체 또는 대립유전자의 존재를 입증한다. 다형성 변형체, 대립유전자 및 종간 상동체는 G-단백질 커플링된 수용체의 7개의 경막 구조를 보유하는 것으로 추정된다.

GPCR-B3 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 정보를 사용하여 컴퓨터 시스템에서 미각 세포 특이적 폴리펩티드의 모델을 작제할 수도 있다. 그 다음, 이들 모델을 사용하여 GPCR-B3를 활성화 또는 억제할 수 있는 화합물을 확인한다. GPCR-B3의 활성을 조절하는 화합물을 이용하여 미각 정보 전달에서 GPCR-B3의 역할을 연구할 수 있다.

무엇보다도 GPCR-B3의 분리는 G-단백질 커플링된 수용체 미각 정보 전달의 억제인자 및 활성인자에 대한 분석 수단을 제공한다. 생물학적으로 활성인 GPCR-B3은, 예컨대 GPCR-B3의 전사 활성화; 리간드 결합; 인산화 및 탈인산화; G-단백질에 대한 결합; G-단백질 활성화; 조절 분자 결합; 전압, 막 전위 및 전도성 변화; 이온 플럭스; cAMP 및 이노시톨 트리포스페이트와 같은 세포내 제2 전달자; 세포내 칼슘 레벨; 및 신경전달물질 방출을 측정하는 생체내 및 시험관내 발현을 이용하여 미각 정보 전달자로서 GPCR-B3의 억제인자 및 활성인자를 시험하는데 유용하다. GPCR-B3을 사용하여 확인되는 이러한 활성인자 및 억제인자를 사용하여 미각 정보 전달을 추가로 연구하고, 특정 미각 작용물질 및 길항물질을 확인할 수 있다. 이러한 활성인자 및 억제인자는 맛을 주문 생산하기 위한 약제 및 식품 제제로서 유용하다.

GPCR-B3 핵산 및 GPCR-B3의 발현을 검출하는 방법은 미각 세포를 확인하고, 뇌의 미각 감각 뉴론에 대한 혀의 미각 수용체 세포의 관계와 혀의 해부학적 지도를 형성하는데 유용하다. 인간 GPCR-B3을 암호화하는 유전자의 염색체 위치 측정을 이용하여 GPCR-B3가 유발하거나, 또는 GPCR-B3과 관련된 질병, 돌연변이 및 형질을 확인할 수 있다.

II. 정의

본원에서 사용된 바와 같이, 다음 용어는 기타의 언급이 없으면 다음과 같은 의미를 갖는다.

"미각 수용체 세포"는 여러 군으로 편성되어 혀의 미뢰, 예컨대 엽상, 용상 및 유곽 세포를 형성하는 신경 표피 세포이다[예컨대, Roper 등, Ann. Rev. Neurosci. 12:329-353(1989) 참조].

"TR1"이라고도 부르는 "GPCR-B3"는 엽상, 용상 및 유곽 세포와 같은 미각 수용체 세포에서 특이적으로 발현되는 G-단백질 커플링된 수용체를 의미한다[예컨대, 본원에서 그 전문을 참고로 인용한 Hoon 등의 문헌 Cell. 96:541-551(1999) 참조]. 미각 세포는 미각 세포 특이적 G-단백질인 거스트듀신(Gustducin)과 같은 특정 분자를 발현하기 때문에, 이러한 미각 세포를 확인할 수 있다[McLaughin 등, Nature 357:563-569(1992)]. 미각 수용체 세포는 형태를 기준으로 확인할 수 있다(예컨대, Roper의 상기 문헌 참조).

GPCR-B3은 "G-단백질 커플링된 수용체 활성"을 보유하는 7개의 경막 영역을 보유한 GPCR을 암호화한다. 예컨대 GPCR은 세포외 자극에 반응하여 G-단백질에 결합하고, 포스포리파제 C 및 아데닐화 사이클라제와 같은 효소의 자극을 통해 IP3, cAMP 및 Ca²⁺와 같은 제2 전달자의 생성을 촉진한다(GPCR의 구조 및 기능의 설명에 대해서는, 예컨대 Fong의 상기 문헌과 Baldwin의 상기 문헌 참조).

따라서, 용어 GPCR-B3은 (1) 약 25 아미노산, 경우에 따라서 50∼100 아미노산의 윈도우에 걸쳐 서열 번호 1∼3과 약 70%, 경우에 따라서는 약 75, 80, 85, 90 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 보유하고; (2) 서열 번호 1∼3과 이의 보존적으로 변형된 변형체로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 면역원에 대해 발생된 항체에 결합하며; (3) 엄중 하이브리드화 조건하에서 서열 번호 4∼6과 이의 보존적으로 변형된 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 특이적으로 하이브리드화하고(크기는 약 500 뉴클레오티드 이상, 경우에 따라서는 약 900 뉴클레오티드 이상); (4) 엄중 하이브리드화 조건하에서 서열 번호 7∼8을 암호화하는 축퇴성 프라이머 세트와 동일한 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프라이머로 증폭시킨 다형성 변형체, 대립유전자, 돌연변이 및 종간 상동체를 의미한다.

형태학적으로, 감각 GPCR은 N-말단 "세포외 도메인", 7개의 경막 영역과 해당하는 세포질 및 세포외 루프를 포함하는 "경막 도메인", 및 C-말단의 "세포질 도메인"을 보유한다[도 1 참조; 또한 Hoon 등, Cell 96:541-551(1999); Buck & Axel, Cell 65:175-187(1991) 참조]. 이들 도메인은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 소수성 및 친수성 도메인을 확인하는 서열 분석 프로그램을 사용하여 구조적으로 확인할 수 있다[예컨대, Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132(1982) 참조]. 이러한 도메인은 본 발명의 시험관내 분석 및 키메라 단백질 제조에 유용하다.

따라서, "세포외 도메인"은 세포막으로부터 돌출되어 있고 세포외 리간드에 결합하는 GPCR-B3의 도메인을 의미한다. 이 영역은 N-말단에서 개시하여, 아미노산 563 +/- 약 20 아미노산에서의 보존된 글루탐산에서 대략 종결된다. 서열 번호 1의 아미노산 1∼580에 해당하는 영역(뉴클레오티드 1∼1740, 뉴클레오티드 1은 ATG 개시 메티오닌 코돈에서 시작; 도 1 참조)은 경막 도메인내로 약간 연장되는 세포외 도메인의 일양태이다. 이 양태는 가용성 및 고상의 시험관내 리간드 결합 분석에 유용하다.

7개의 경막 영역과 해당 세포질 및 세포외 루프를 포함하는 "경막 도메인"은 대략적으로 아미노산 위치 563 +/- 대략 20 아미노산 위치의 보존된 글루탐산 잔기에서 개시하여, 대략적으로 위치 812 +/- 대략 10 아미노산 위치의 보존된 티로신 아미노산 잔기에서 종결되는 GPCR-B3의 도메인을 의미한다.

"세포질 도메인"은 위치 812 +/- 약 10 아미노산 위치의 보존된 티로신 아미노산 잔기에서 개시하여 폴리펩티드의 C 말단까지 계속되는 GPCR-B3의 도메인을 의 미한다.

본원에서 사용된 "생물학적 시료"는 GPCR-B3 단백질을 암호화하는 핵산 또는 GPCR-B3을 함유하는 생물학적 조직이나 유체의 시료이다. 이러한 시료의 비제한적인 예로는, 인간, 마우스 및 래트로부터, 특히 다량으로 분리한 조직이 있다. 생물학적 시료는 조직학적 목적으로 취한 냉동 절편과 같은 조직의 절편을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 통상적으로 진핵 유기체, 예컨대 곤충, 원생 동물, 조류, 어류, 파충류, 바람직하게는 포유류, 예컨대 래트, 마우스, 소, 개, 기니아 피크 또는 토끼, 가장 바람직하게는 침팬지 또는 인간과 같은 영장류로부터 얻는다. 조직은 혀 조직, 분리된 미뢰 및 고환 조직을 포함한다.

"GPCR 활성"은 시그널을 정보 전달하는 GPCR의 능력을 의미한다. 이러한 활성은, GPCR(또는 키메라 GPCR)을 Gα15와 같은 혼합형 G-단백질 또는 G-단백질과 효소(예, PLC)에 커플링시킨 다음, 세포내 칼슘 이용 증가를 측정함으로써 이종 세포에서 결정할 수 있다[예컨대, Offermans & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175-15180(1995)]. 수용체 활성은, 형광 Ca²⁺-지시제 염료와 형광계 화상 형성을 이용하여 [Ca²⁺]_i에서 리간드 유도된 변화를 기록함으로써 효과적으로 측정할 수 있다. 경우에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 감각 정보 전달, 임의로 미각 세포에서의 미각 정보 전달과 관련되어 있다.

GPCR-B3 매개된 미각 정보 전달을 조절하는 화합물을 시험하는 분석에 있어서 "기능적 효과"란 직접적으로 또는 간접적으로 수용체의 영향 하에 있는 임의의 매개 변수, 예컨대 기능적 효과, 물리적 효과 및 화학적 효과의 측정을 포함한다. 이는 시험관내, 생체내 및 생체외에서 리간드 결합, 이온 플럭스의 변화, 막 전위, 전류, 전사, G-단백질 결합, GPCR 인산화 또는 탈인산화, 신호 정보 전달, 수용체-리간드 상호작용, 제2 전달자 농도(예, cAMP, IP3 또는 세포내 Ca²⁺)를 포함하고, 신경전달물질 또는 호르몬 방출의 증가 또는 감소와 같은 다른 생리학적 효과를 포함한다.

"기능적 효과의 측정"이란 간접적으로 또는 직접적으로 GPCR-B3의 영향하에 있는 매개 변수, 예컨대 기능적, 물리적 및 화학적 효과를 증가 또는 감소시키는 화합물에 대한 분석을 의미한다. 이러한 기능적 효과는 당업자에게 공지된 임의의 수단, 예컨대 분광 특성(예, 형광, 흡광도, 굴절률), 수력학 특성(예, 형상), 크로마토그래피 특성 또는 용해도 특성에 있어서의 변화, 패치-클램핑, 전압 감수성 염료, 전체 세포 전류, 방사성 동위 원소 방출, 유도성 마커, 난모세포 GPCR-B3 발현; 조직 배양 세포 GPCR-B3 발현; GPCR-B3의 전사 활성화; 리간드 결합 분석; 전압, 막 전위 및 전도성 변화; 이온 플럭스 분석; cAMP 및 이노시톨 트리포스페이트(IP3)와 같은 세포내 제2 전달자의 변화; 세포내 칼슘 레벨의 변화; 신경전달물질 방출 등으로 측정할 수 있다.

GPCR-B3의 "억제인자", "활성인자" 및 "조절인자"는 미각 정보 전달에 대한 시험관내 및 생체내 분석을 사용하여 확인된 억제, 활성화 또는 조절 분자, 예컨대 리간드, 작용물질, 길항물질과 이의 유사체 및 모사체를 의미하는 것으로서 호환적으로 사용된다. 억제인자는, 예컨대 결합하여, 부분적 또는 전체적으로 자극을 차단하고, 활성화를 감소, 방지, 지연시키고, 미각 정보 전달을 불활성화, 탈감작화 또는 하향 조절하는 화합물, 예컨대 길항물질이다. 활성인자는, 결합하여, 자극하고, 활성화를 증가, 개방, 활성화, 촉진, 증가시키고, 미각 정보 전달을 감작화 또는 상향조절하는 화합물, 예컨대 작용물질이다. 조절인자는, 예컨대 활성인자 또는 억제인자(예, 에브너린 및 소수성 담체계의 기타 구성원)를 결합시키는 세포외 단백질; G-단백질; 키나아제(예, 수용체의 탈활성화 및 탈감작화와 관련된 베타 아드레날린 수용체 키나아제 및 로돕신 키나아제의 유사체); 및 수용체를 탈활성화 및 탈감작시키는 아레스틴 유사 단백질과 수용체의 상호작용을 변경시키는 화합물이다. 조절인자는, 예컨대 변경된 활성을 갖는 유전자적으로 변형된 GPCR-B3의 형태와, 자연 발생적 및 합성 리간드, 길항물질, 작용물질, 작은 화학 분자 등을 포함한다. 억제인자 및 활성인자에 대한 이러한 분석은, 전술한 바와 같이, 예컨대 세포 또는 세포막에서 GPCR-B3를 발현시키는 단계, 추정 조절인자 화합물을 적용하는 단계, 및 미각 정보 전달에 대한 기능적 효과를 측정하는 단계를 포함한다. 추정 활성인자, 억제인자 또는 조절인자로 처리한 GPCR-B3를 포함하는 시료 또는 분석을, 억제인자, 활성인자 또는 조절인자가 없는 대조 시료와 비교하여 억제 정도를 검사한다. 대조 시료(억제제로 미처리)의 상대적 GPCR-B3 활성치를 100%로 한다. 대조군에 대한 GPCR-B3 활성치가 약 80%, 경우에 따라서 50%, 25∼0%인 경우, GPCR-B3가 억제된다. 대조군에 대한 GPCR-B3 활성치가 110%, 경우에 따라서 150%, 200∼500%, 1000∼3000% 이상인 경우, GPCR-B3가 활성화된다.

"생물학적으로 활성인" GPCR-B3은 미각 수용체 세포에서 미각 정보 전달과 관련되어 있는, 전술한 GPCR 활성을 갖는 GPCR-B3을 의미한다.

"분리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"이란, 천연 상태에서 발견되는 바와 같이 통상적으로 그 물질이 수반하는 성분이 실질적으로 또는 거의 없는 물질을 의미한다. 순도 및 균질도는 통상적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기법을 사용하여 측정한다. 제제에 주요 종류로서 존재하는 단백질은 실질적으로 정제되어 있다. 특히, 분리된 GPCR-B3 핵산을 GPCR-B3 유전자와 인접하고 GPCR-B3 이외의 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리한다. "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 형성하는 것을 의미한다. 특히, 정제되었다는 것은 핵산 또는 단백질의 순도가 85% 이상, 경우에 따라서는 95% 이상, 임의로 99% 이상인 것을 의미한다.

"핵산"은 1본쇄 또는 2본쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 의미한다. 이 용어는 기존의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 주쇄 잔기 또는 연쇄를 포함하는 핵산을 포함하는데, 이 핵산은 합성, 자연 발생적 및 비자연 발생적이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성이 있고, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 비제한적인 예로는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA) 등이 있다.

기타의 언급이 없으면, 특정 핵산 서열은 이의 보존적으로 변형된 변형체(예, 축퇴성 코돈 치환체) 및 상보 서열과, 명시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합형 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 형성하여 축퇴성 코돈 치환체를 얻을 수 있다[Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka 등, J.Biol.Chem. 260:2605-2608(1985); Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)]. 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 호환적으로 사용된다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미하는 것으로 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 이 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적 아미노산의 인공 화학적 모사체인 아미노산 중합체와, 자연 발생적 아미노산 중합체 및 비자연 발생적 아미노산 중합체에 적용된다.

용어 "아미노산"은 자연 발생적 아미노산 및 합성 아미노산과, 자연 발생적 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 의미한다. 자연 발생적 아미노산은 유전자 코드가 암호화하는 것과, 후에 변형되는 아미노산, 예컨대 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린 등이 있다. 아미노산 유사체는 자연 발생적 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물이다. 즉, α탄소가 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합되어 있다, 예컨대 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄 등이 있다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 주쇄를 갖지만, 자연 발생적 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유한다. 아미노산 모사체는 아미노산의 일반적 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생적 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 의미한다.

본 명세서에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회가 추천하는 통상적으로 공지되어 있는 3문자 기호 또는 1문자 기호로 표시할 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드는 통상적으로 허용되는 1문자 코드로 언급할 수 있다.

"보존적으로 변형된 변형체"는 아미노산 및 핵산 서열에 모두 적용된다. 특정 아미노산 서열에 관하여, 보존적으로 변형된 변형체는 동일하거나 또는 거의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는 거의 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈으로 지정된 모든 지점에서, 암호화되는 폴리펩티드를 변경시키지 않고 코돈을 임의의 기재된 해당 코돈으로 변경할 수 있다. 이러한 핵산 변형은, 보존적으로 바뀐 변형의 한 종류로서, "침묵 변형"이라고 한다. 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 본 명세서에서 언급한 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변형을 포함한다. 당업자라면 핵산에 있어서의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG와, 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)을 변형시켜 기능적으로 동일한 분자를 산출할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변형은 각 개시된 서열내에 포함된다.

아미노산 서열에 대하여, 당업자는 암호화된 서열내 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 삽입 또는 결실은 "보존적으로 변형된 변형체"이며, 여기서 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 것을 말함을 알 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변형체는 그 외에도, 본 발명의 다형성 변형체, 종간 유사체 및 대립유전자를 배제하지 않는다.

다음과 같은 8군은 각각 서로 보존적 치환인 아미노산을 포함한다.

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M).

(예컨대, Creighton, Ptoteins(1984) 참조).

폴리펩티드 구조와 같은 거대분자 구조는 각종 레벨의 조직화의 측면에서 설명할 수 있다. 이러한 조직화에 관한 일반적인 설명에 관해서는, 예컨대 Alberts 등의 문헌[Molecular Biology of the Cell(3판, 1994)] 및 Cantor 및 Schimmel의 문헌[Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules(1980)] 참조. "1차 구조"는 특정 펩티드의 아미노산 서열을 의미한 다. "2차 구조"는 폴리펩티드내에 국소적으로 정렬된 3차원 구조를 의미한다. 이들 구조는 통상적으로 도메인으로서 알려져 있다. 도메인은 폴리펩티드의 치밀한 단위체를 형성하는 폴리펩티드의 일부로서, 통상적으로 50∼350 아미노산 길이다. 통상적인 도메인은 β-병풍구조 및 α-나선구조의 연신물과 같은 덜 조직화된 절편으로 구성된다. "3차 구조"는 폴리펩티드 단량체의 완전한 3차원 구조를 의미한다. "4차 구조"는 무관한 3차 유닛의 비공유 회합으로 형성된 3차원 구조를 의미한다. 이방성은 에너지와 관련된 것으로 알려져 있다.

"표지" 또는 "검출가능한 부분"은 분광, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학 수단으로 검출가능한 조성물이다. 예를 들어, 유용한 표지로는 ³²P, 형광 염료, 전자 조밀 시약, 효소(예컨대, ELISA에 사용되는 효소), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 예컨대 펩티드 내로 방사능 표지를 도입하여 안트(ant) 또는 7을 검출할 수 있고 펩티드와 특이적으로 반응성이 있는 항체를 검출하는데 사용되는 합텐과 단백질 등이 있다.

"표지된 핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오티드"는, 링커 또는 화학 결합을 통해 공유적으로, 또는 이온 결합, 반데르발스 결합, 정전기적 결합 또는 수소 결합을 통해 비공유적으로 표지에 결합하여 프로브에 결합된 표지의 존재를 검출함으로써 프로브의 존재를 검출할 수 있는 것이다.

본 명세서에서, "핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오티드"는 1종 이상의 화학적 결합, 일반적으로 상보적 염기 쌍 형성, 일반적으로 수소 결합 형성을 통해서 상보 서열의 표적 핵산에 결합할 수 있는 핵산으로서 정의된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 프로브는 천연(즉, A, G, C 또는 T), 또는 변형된 염기(7-데아자구아노신, 이노신 등)를 포함할 수 있다. 또한, 프로브에서 염기는, 하이브리드화를 방해하지 않는 한, 포스포디에스테르 결합 이외의 결합으로 연결될 수 있다. 따라서, 예컨대 프로브는 구성 염기가 포스포디에스테르 결합보다는 펩티드 결합으로 연결된 펩티드 핵산일 수 있다. 프로브는 하이브리드화 조건의 엄중도에 따라 프로브 서열과의 완전한 상보성이 결여된 표적 서열을 결합시킬 수 있음을 당업자라면 알 것이다. 프로브는, 경우에 따라 동위 원소, 크로모포어, 루미포어, 색원체 등으로 직접 표지하거나, 스트렙타비딘 복합체가 나중에 결합할 수 있는 비오틴 등으로 간접 표지한다. 프로브의 존재 또는 부재를 분석함으로써, 선택 서열 또는 부분서열의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.

예컨대 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용된 "재조합체"란, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산이나 단백질의 도입 또는 천연 핵산이나 단백질의 변경으로 변형되어 있거나, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유도되는 것을 말한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비재조합) 형태에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 상황하에서, 기타 비정상적으로 발현되는 천연 유전자를 발현한다.

핵산의 일부와 관련하여 사용되는 "이종"이란 핵산이 천연 상태에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 2 이상의 부분 서열을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 핵산은 통상적으로 재조합 방식으로 제조되어, 하나의 공급원에서 유래한 프로모터와 다른 공급원에서 유래한 암호 영역과 같이 새로운 기능적 핵산을 제조하도록 배열된 미관련 유전자로부터 유래한 2 이상의 서열을 보유하게 된다. 유사하게, 이종 단백질이란, 단백질이 천연 상태에서 서로에 대해 동일한 관계에서는 발견되지 않는 2 이상의 부분 서열을 포함하는 것을 의미한다(예, 융합 단백질).

"프로모터"는 핵산의 전사를 유도하는 핵산 제어 서열의 배열로서 정의된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 프로모터는 폴리머라제 II형 프로모터의 경우 TATA 성분과 같이 전사의 개시 부위 부근의 필수 핵산 서열을 포함한다. 또한, 프로모터는 경우에 따라서 말단 인헨서 또는 리프레서 성분을 포함하고, 전사의 개시 부위로부터 수 천개의 염기 쌍이 위치하고 있을 수 있다. "구조" 프로모터는 최적 환경 및 형성 조건하에서 활성인 프로모터이다. "유도" 프로모터는 환경 또는 형성 조절하에서 활성인 프로모터이다. "작동가능하게 결합된"은 핵산 발현 제어 서열(예, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이) 및 제2 핵산 서열 간의 기능적 결합을 의미하며, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 해당하는 핵산의 전사를 유도한다.

"발현 벡터"는 숙주 세포내에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 성분과 재조합적으로 또는 합성적으로 형성된 핵산 작제물이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 통상적으로 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 결합되어 있는 전사하고자 하는 핵산을 포함한다.

2종 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에서 "동일한" 또는 동일성(%)"이란 다음과 같은 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여, 또는 수동 정렬 및 육안 검사로 측정되는 지정 영역에서, 또는 비교창에서 최대 대응부에 대해 비교 및 정렬하는 경우 특정 비율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖거나(즉, 특정 영역에 걸쳐 70% 동일성, 경우에 따라서 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성), 또는 동일한 2종 이상의 서열 또는 부분 서열을 의미한다. 이러한 서열은 "실질적으로 동일"하다고 한다. 이 정의는 시험 서열의 상보성을 의미하는 것이다. 경우에 따라서, 동일성은 약 50 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역, 더욱 바람직하게는 75∼100 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐서 존재한다.

서열 비교를 위해서, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열을 비교할 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 부분 서열 좌표를 필요에 따라 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 디폴트 프로그램 매개 변수를 사용할 수 있으며, 또는 별도의 매개 변수를 지정할 수 있다. 그 다음 서열 비교 알고리즘을 이용하여 프로그램 매개변수를 기준으로 기준 서열에 대한 시험 서열의 동일성(%)을 계산한다.

본 명세서에서 사용된 "비교창(comparision window)"이란, 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에 서열을 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교하는 20∼600, 일반적으로 약 50∼약 200, 더욱 일반적으로는 약 100∼약 150으로 구성된 군에서 선택된 수의 인접 위치 중 어떤 하나의 분절에 대한 기준을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업자들에게 공지되어 있다. 서열 비교를 위한 최적의 정렬은 예를 들면, Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2:482(1981)), Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:443(1970)), Pearson 및 Lipman의 유사성 방법을 위한 조사(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)), 이들 알고리즘의 전산화 실행법(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 수동 정렬 및 육안 관찰(예컨대, Current Protocols in Molecurlar Biology(Ausubel 등, 편저, 1995년 증간))로 수행할 수 있다.

유용한 알고리즘의 일례는 PILEUP이다. PILEUP은 진행성의 쌍을 이루는 방식의 정렬을 이용하여 관련된 서열군으로부터 다중 서열 정렬을 형성하여 관계 및 서열 동일성(%)을 밝힌다. 정렬을 형성하는데 사용된 무리의 관계를 보여주는 수상도 또는 계통도를 플롯한다. PILEUP은 Fneg & Doolittle의 문헌[J. Mol. Evol. 35:351-360(1987)]의 진행성 정렬 방법을 간략화하여 사용한다. 사용된 방법은 Higgins & Sharp의 문헌[CABIOS 5:151-153(1989)]에 개시된 방법과 유사하다. 이 프로그램은 최대 300개의 서열을 정렬할 수 있고, 각각의 최대 길이는 5,000 뉴클레오티드 또는 아미노산이다. 다중 정렬 절차는 2개의 가장 유사한 서열이 쌍을 이루도록 정렬하여 개시되어, 2개의 정렬된 서열 무리를 형성한다. 이 무리를, 그 다음으로 가장 관련이 있는 서열 또는 정렬된 서열의 무리에 대해 정렬한다. 2개의 서열 무리는 2개의 개개 서열을 쌍 형성 방식으로 정렬하여 단순히 연장함으로써 정렬한다. 최종 정렬은 일련의 진행성, 쌍 형성 방식 정렬로 달성한다. 이 프로그램은 서열 비교 영역에 대한 특정 서열과 이의 아미노산 또는 핵산 좌표를 지정하고, 프로그램 매개 변수를 지정하여 진행한다. PILEUP을 사용하여, 기준 서열을 또 다른 시험 서열과 비교하여 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 서열 동일성(%) 관계를 측정한다: 디폴트 차이 가중치(3.00), 디폴트 차이 길이 가중치(0.10) 및 가중치의 말단 차이. PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예컨대 버젼 7.0으로부터 얻을 수 있다[Devereaux 등, Nuc. Acids Res. 12:387-395(1984)].

서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 결정하는데 적합한 알고리즘의 또 다른 한 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데, 이것은 Altschul 등의 문헌[Nuc. Acids Res. 25:3389-3402(1997)] 및 문헌[J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)]에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information) (http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공공연히 이용되고 있다. 이 알고리즘은 먼저 의문 서열에서 짧은 단어 길이 W를 확인함으로써 고득점 서열쌍(HSPs)을 확인하는 것을 포함하는데, 데이타베이스 서열에 있는 동일한 길이의 단어와 정렬시켰을 때 일부 양의 값의 한계값인 T와 일치하거나 이를 만족시킨다. T는 이웃하는 단어 점수 한계값으로 불리운다(상기 Altschul 등의 문헌 참조). 이러한 초기의 이웃 단어의 적중은 그들을 포함하는 더 긴 HSPs를 찾기 위한 초기 조사의 출발점으로 작용한다. 그런 다음 이 단어 적중은 누적된 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적된 점수는, 뉴클레오티드 서열의 경우 변수 M(한 쌍의 정합 잔기에 대한 보상점수; 항상 > 0) 및 N(부정합 잔기에 대한 벌칙점수; 항상 < 0)을 이용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 누적된 점수를 계산하기 위해 점수 행렬을 사용한다. 각 방향으로의 단어 적중 연장은, 누적 정렬 점수가 이것의 최대치로부터 X양 만큼 떨어진 경우; 하나 이상의 음의 점수 잔기 정렬의 축적 때문에 누적 점수가 0 이하가 되는 경우; 또는 서열의 한 말단에 도달한 경우에 정지된다. BLAST 알고리즘 변수인 W, T, 및 X는 정렬의 속도와 민감도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 단어길이(W) 11, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 디폴트값으로 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 단어길이(W) 3, 기대값(E) 10 및 BLOSUM62 점수 행렬(Henikoff & Henikoff(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 참조), 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 양 가닥 비교를 디폴트값으로 사용한다.

BLAST 알고리즘은 두 서열간의 유사성의 통계적 분석도 수행한다(예, Karlin & Altschul Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 최소 합 확률(P(N))인데, 이것은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 정합이 우연히 일어날 확률을 나타내는 것이다. 예를 들면, 시험 핵산을 기준 핵산과 비교했을 때, 최소 합 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 핵산과 유사한 것으로 간주한다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 표시는, 후술하는 바와 같이 제1 핵산이 암호화하는 폴리펩티드가 제2 핵산이 암호화하는 폴리펩티드에 대해 생긴 항체와 면역학적으로 교차반응한다는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 통상적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하며, 예컨대 2개의 펩티드는 보존적 치환에 의해서만 차이가 있다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는, 후술하는 바와 같이 2개의 분자 또는 그의 보체가 엄중 하이브리 드화 조건하에서 서로 하이브리드화하는 것이다. 2개의 핵산이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.

"선택적으로(또는 특이적으로) 하이브리드화하는" 이란 서열이 복합 혼합물(예, 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)에 존재하는 경우 엄중 하이브리드화 조건하에서 특정 뉴클레오티드 서열에만 결합, 두가닥 사슬 형성 또는 하이브리드화하는 것을 의미한다.

"엄중 하이브리드화 조건"이란, 프로브가 통상적으로 핵산의 복합 혼합물에서 표적 서열에는 하이브리드화하지만, 다른 서열에는 하이브리드화하지 않는 조건을 의미한다. 엄중 조건은 서열 의존성이며, 상이한 환경 하에서 다를 수 있다. 더 긴 서열은 더 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 지침은 Tijssen의 문헌[Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays"(1993)]서 찾아 볼 수 있다. 일반적으로 엄중 조건은 지정된 이온 강도와 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(T_m)보다 약 5∼10℃ 낮은 온도로 선택된다. T_m은 표적 서열에 상보성이 있는 프로브의 50%가 평형 상태(표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, T_m에서 50% 프로브로 평형 상태를 충족함)에서 표적 서열에 하이브리드화하는 (지정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서의) 온도이다. 엄중 조건은 염 농도가 pH 7.0∼8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상적으로 약 0.01∼1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 기타 염)이고, 온도는 짧은 프로브(예, 10∼50 뉴클레오티드)의 경우 약 30℃ 이상이고 긴 프로브(예, 50 뉴클레티드 이상)의 경우 약 60℃ 이상이다. 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 엄중 조건을 달성할 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화의 경우, 양성 시그널은 배경의 2배 이상, 경우에 따라서는 배경 하이브리드화의 10배 이상이다. 예시적인 엄중 하이브리드화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 항온 처리, 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서의 항온 처리, 0.2 ×SSC, 및 65℃ 1% SDS에서 세척.

엄중 조건하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은, 이들이 암호화하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면, 실질적으로 동일하다. 이는, 예컨대 유전자 코드가 허용하는 최대 코돈 축퇴성을 이용하여 핵산의 카피를 형성하는 경우 발생한다. 이러한 경우, 핵산은 통상적으로 중간 엄중 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화한다. 예시적인 "중간 엄중 하이브리드화 조건"은 37℃에서 40% 포름 아미드, 1 M NaCl, 1% SDS의 완충액 중에서 하이브리드화, 및 45℃에서 1 ×SSC로 세척하는 것을 포함한다. 양성 하이브리드화는 배경의 2배 이상이다. 당업자는 대안적인 하이브리드화 및 세척 조건을 이용하여 유사한 엄중도의 조건을 제공할 수 있음을 알 것이다.

"항체"는 항원을 특이적으로 결합시키고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 단편으로부터 유래한 구조 영역을 포함하는 폴리펩티드이다. 인식된 면역글로불린 유전자로는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변부 유전자와, 무수한 면역글로불린 가변부 유전자가 있다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로서 분류되며, 각각 면역글로불린 부류인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정해진다.

예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬의 쌍으로 구성되는데, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa)와 하나의 "중쇄"(약 50∼70 kDa)를 보유한다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변부를 한정한다. 가변 경쇄(V_L) 및 가변 중쇄(V_H)를 각각 경쇄 및 중쇄라고 부른다.

항체는, 예컨대 온전한 면역글로불린으로서 또는 각종 펩티다제로 분해하여 생성된 특성 규명이 잘 되어 있는 여러개의 단편으로서 존재한다. 따라서, 예를 들어 펩신은 힌지 영역에서 디설파이드 결합 아래의 항체를 분해하여, 그 자체가 디설파이드 결합에 의해 V_H-C_H1에 결합된 경쇄인 Fab의 이량체 F(ab)'₂를 생성한다. F(ab)'₂는 온화한 조건하에 환원되어 힌지 영역에서 디설파이드 결합이 깨지고, 따라서 F(ab)'₂ 이량체가 Fab' 단량체로 전환될 수 있다. Fab' 단량체는 힌지 영역의 일부를 보유한 실질적인 Fab이다[Fundamental Immunology(Paul 편저, 3판, 1993) 참조]. 각종 항체 단편을 온전한 항체의 분해라는 측면에서 정의하였지만, 당업자는 이러한 단편을 화학적으로 데노보 합성하거나, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 합성할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본원에서 사용한 바와 같이, 항체라는 용어는 전체 항체의 변형으로 생성되거나 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 데노보 합성된 항체 단편(예, 단일쇄 Fv), 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 확인된 항체 단편을 포함한다[예컨대, McCafferty 등, Nature 348:552-554(1990)].

모노클론 항체 또는 폴리클론 항체를 제조하기 위해서, 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용할 수 있다[예컨대 Kohler & Milstein, Nature 256:495-497(1975)]; Kozbor 등, Immunology Today 4:72(1983); Cole 등, p77-96, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)]. 단일쇄 항체를 제조하는 기법(미국 특허 제4,946,778호)은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하는데 적용할 수 있다. 또한, 트랜스게닉 마우스, 또는 포유류와 같은 기타 유기체를 사용하여 인간화된 항체를 발현할 수 있다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기법을 사용하여 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로량체 Fab 단편을 확인할 수 있다[예컨대, McCafferty 등, Nature 348:552-554(1990); Marks 등, Biotechnology 10:779-783(1992)].

"키메라 항체"는 (a) 불변부 또는 이의 일부가 변경, 치환 또는 교체되어 항원 결합 부위(가변부)가 상이하거나 변경된 부류, 작동인자 기능 및/또는 종의 불변부, 또는 키메라 항체에 신규 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예컨대 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 결합하거나; 또는 (b) 가변부, 또는 이의 일부가 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변부 영역으로 변경, 치환 또는 교체되는 항체 분자이다.

"항GPCR-B3" 항체는 GPCR-B3 유전자, cDNA 또는 이의 부분 서열이 암호화하는 폴리펩티드를 특이적으로 결합시키는 항체 또는 항체 단편이다.

"면역분석"은 항원을 특이적으로 결합시키는 항체를 이용한 분석이다. 면역 분석은 특정 항체의 특이적 결합 특성을 이용하여 항원을 분리, 표적화 및/또는 정량하여 특성 규명한다.

단백질 또는 펩티드와 관련하여 언급되는 경우, 항체에 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합하는" 또는 "특이적으로(또는 선택적으로) 면역반응성이 있는" 이라는 용어는 단백질 및 기타 생물제제의 이종성 군에서 단백질의 존재를 결정하는 요인이 되는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 면역분석 조건하에서, 특정 항체가 배경의 2배 이상으로 특정 단백질에 결합하지만, 시료내 존재하는 기타 단백질에는 유의적인 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에서 항체에 대한 특이적 결합에는 특정 단백질에 대한 특이성으로 선별한 항체가 필요하다. 예를 들어, 래트, 마우스 또는 인간과 같은 특정 종에서 유래한 GPCR-B3에 대해 생성된 폴리클론 항체는, GPCR-B3의 다형성 변형체 및 대립유전자를 제외하고, GPCR-B3와 특이적으로 면역반응성이 있고 다른 단백질과는 면역반응성이 없는 폴리클론 항체만을 얻도록 선택할 수 있다. 기타 종으로부터 GPCR-B3 분자와 교차 반응하는 항체를 제거함으로써 선별할 수 있다. 각종 면역분석 형식을 이용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성이 있는 항체를 선별할 수 있다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역분석을 일상적으로 사용하여 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선별한다[특이적 면역반응성을 측정하는데 사용할 수 있는 면역분석 형식 및 조건의 설명에 대해서, 예컨대 Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988) 참조]. 통상적으로, 특정 또는 선별 반응은 배경 시그널 또는 노이즈의 2배 이상, 더욱 통상적으로는 배경의 10∼100배 이상일 것이다.

"~와 선택적으로 회합하는"이란, 전술한 바와 같이 또 다른 핵산과 "선택적으로 하이브리드화하는" 핵산의 능력, 또는 전술한 바와 같이 단백질에 "선택적으로(또는 특이적으로) 결합하는" 항체의 능력을 의미한다.

"숙주 세포"는 발현 벡터를 포함하고, 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 이.콜리와 같은 원핵 세포, 또는 효모, 곤충, 양서류, 또는 포유류 세포, 예컨대 CHO, HeLa 등과 같은 진핵 세포, 예컨대 배양된 세포, 외식체 및 생체내 세포일 수 있다.

III. GPCR-B3을 암호화하는 핵산의 분리

A. 일반적인 재조합 DNA 방법

본 발명은 재조합 유전자학 분야의 일반적인 기법을 따른다. 본 발명에서 사용하는 일반적인 방법을 개시한 기본서로는 Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning, A Laboratroy Manual(1989년 2판)]; Kriegler의 문헌[Gene Trnasfer and Expression: A Laboratory Manual(1990년); 및 Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology(1994년)] 등이 있다.

핵산의 경우, 크기는 킬로염기(kb) 또는 염기쌍(bp)으로 제공된다. 이들은 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기 영동, 서열 결정된 핵산 또는 공개된 DNA 서열로부터 추정한다. 단백질의 경우, 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산 잔기의 수로 제공된다. 단백질 크기는 겔 전기 영동, 서열 결정된 단백질, 유도된 아미노산 서열 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.

시판되지 않는 올리고뉴클레오티드는, Van Devanter 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 12:6159-6168(1984)]에 개시된 바와 같이 자동화된 합성기를 사용하여 Beaucage & Caruthers의 문헌[Tetrahedron Letts. 22:1859-1862(1981)]에 개시된 고상 포스포르아미디트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 Pearson & Reanier의 문헌[J. Chrom. 255:137-149(1983)]에 개시된 바와 같이 음이온 교환 HPLC로, 또는 천연 아크릴아미드 겔 전기 영동으로 정제한다.

클로닝된 유전자 및 합성 올리고뉴클레오티드 서열은, 예컨대 Wallace 등의 문헌[Gene 16:21-26(1981)]의 2본쇄 주형을 서열 결정하는 사슬 종결법을 사용하여 클로닝 후에 확인할 수 있다.

B. GPCR-B3을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 분리에 대한 클로닝 방법

일반적으로 GPCR-B3를 암호화하는 핵산 서열 및 관련 핵산 서열 상동체는 프로브와의 하이브리드화로 cDNA 또는 게놈 DNA로부터 클로닝하거나, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 증폭 기법으로 분리한다. 예를 들어, GPCR-B3 서열은 통상적으로 서열 번호 4∼6으로부터 유도할 수 있는 서열인 핵산 프로브와 하이브리드화하여 포유류 핵산(게놈 또는 cDNA) 라이브러리로부터 분리한다. GPCR-B3 RNA 및 cDNA를 분리할 수 있는 적절한 조직은 혀 조직, 경우에 따라서는 미뢰 조직 또는 개개의 미각 세포이다.

프라이머를 사용한 증폭 기법은 DNA 또는 RNA로부터 GPCR-B3을 증폭 및 분리하는데 사용할 수도 있다. 서열 번호 7∼8의 아미노산 서열을 암호화하는 축퇴성 프라이머를 사용하여 GPCR-B3의 서열을 증폭할 수 있다[예컨대 Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratroy Manual(1995) 참조]. 이들 프라이머를 사용하여, 예컨대 전길이 서열 또는 수 백개의 뉴클레오티드 중 하나의 프로브를 증폭시킨 다음, 이를 사용하여 전길이 GPCR-B3에 대한 포유류 라이브러리를 검색할 수 있다.

GPCR-B3을 암호화하는 핵산은 프로브로서 항체를 사용하여 발현 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 서열 번호 1∼3의 서열을 사용하여 이러한 폴리클론 또는 모노클론 항체를 생성할 수 있다.

GPCR-B3와 실질적으로 동일한 GPCR-B3 다형성 변형체, 대립유전자 및 종간 상동체는, 라이브러리를 검색하여 엄중 하이브리드화 조건하에서 GPCR-B3 핵산 프로브, 및 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분리할 수 있다. 대안적으로, 발현 라이브러리는, GPCR-B3 유사체를 인식하여 선택적으로 결합하는 GPCR-B3에 대해 생긴 항혈청 또는 정제된 항체를 이용하여 면역학적으로 발현되는 상동체를 검출함으로써, GPCR-B3 및 GPCR-B3 다형성 변형체, 대립유전자 및 종간 상동체를 클로닝하는데 사용할 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제조하기 위해서, GPCR-B3 mRNA가 풍부한 공급원, 예컨대 혀 조직, 또는 분리된 미뢰를 선택해야 한다. 그 다음 역전사 효소를 사용하여 mRNA를 cDNA로 만들고, 재조합 벡터내로 결찰시키고, 증식, 검색 및 클로닝을 위해서 재조합 벡터내로 형질감염시킨다. cDNA 라이브러리를 제조 및 검색하는 방법이 공지되어 있다[예컨대, Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269(1983); Sambrook 등, 상기 문헌; Ausubel 등, 상기 문헌 참조].

게놈 라이브러리의 경우, DNA를 조직으로부터 추출하여, 기계적으로 전단을 가하거나 또는 효소적으로 분해하여 약 12∼20 kb의 단편을 산출한다. 그 다음 구배 원심분리로 이러한 단편을 목적하지 않은 크기를 갖는 단편으로부터 분리하고, 박테리오파지 람다 벡터내에서 작제한다. 이들 벡터 및 파지를 시험관내에서 패키징한다. 재조합 파지는 Benton & Davis의 문헌[Science 196:180-182(1977)]에 개시된 바와 같이 플라크 하이브리드화로 분석한다. 콜로니 하이브리드화는 일반적으로 Grunstein 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72:3961-3965(1975)]에 개시된 바와 같이 수행한다.

GPCR-B3 핵산과 그의 상동체를 분리하는 대안적인 방법은, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용 및 RNA 또는 DNA 주형의 증폭을 조합하는 것이다[예컨대, 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis 등, 편저, 1990)]. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 리가제 연쇄 반응(LCR)과 같은 방법을 사용하여 mRNA, cDNA, 게놈 라이브러리, 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접적으로 GPCR-B3의 핵산 서열을 증폭할 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에서 제공된 서열을 사용하여 GPCR-B3 상동체를 증폭하도록 고안할 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제 부위를 프라이머내로 도입할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 또는 기타 시험관내 증폭 방법은, 예컨대 발현하고자 하는 단백질을 암호하는 핵산 서열을 클로닝하는데, 생리학적 시료내 mRNA를 암호화하는 GPCR-B3의 존재를 검출하는 프로브로서 사용하기 위한 핵산을 제조하는데, 핵산 서열 결정 또는 기타 목적에 유용할 수 있다. PCR 반응으로 증폭된 유전자는 아가로스 겔로부터 정제하여 적절한 벡터내로 클로닝할 수 있다.

GPCR-B3의 유전자 발현은 당업계에 공지된 기법, 예컨대 mRNA의 역전사 및 증폭, 총 RNA 또는 폴리 A⁺ RNA의 분리, 노던 블롯, 도트 블롯팅, 동일계 하이브리드화, RNase 보호, 탐침 DNA 마이크로칩 어레이 등으로 분석할 수 있다. 일양태에서, 고밀도 올리고뉴클레오티드 분석 기법(예, GeneChip^TM)을 사용하여 본 발명의 GPCR의 상동체 및 다형성 변형체를 확인한다. 확인된 상동체가 기지의 질병과 연관된 경우, 생물학적 시료내에서 질병을 검출하는 진단 도구로서 GeneChip^TM과 함께 상동체를 사용할 수 있다. 예컨대, Gunthand 등, AIDS Res. Hum. Retroviruses 14:869-876(1998); Kozal 등, Nat. Med. 2:753-759(1996); Matson 등, Anal.Biochem. 224:110-106(1995); Lockhart 등, Nat. Biotechnol. 14:1675-1680(1996); Gingeras 등, Genome Res. 8:435-448(1998); Hacia 등, Nucleic Acids Res. 26:3865-3866(1998).

합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 프로브로서 사용하거나 또는 단백질의 발현을 위한 재조합 GPCR-B3 유전자를 작제할 수 있다. 이 방법은, 유전자의 센스 및 넌센스 가닥을 나타내는, 일반적으로 길이가 40∼120 bp인 일련의 중첩 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행한다. 이들 DNA 단편을 어닐링하고, 결찰시킨 다음 클로닝한다. 대안적으로, 정확한 프라이머와 함께 증폭 기법을 사용하여 GPCR-B3 핵산의 특정 부분 서열을 증폭시킬 수 있다. 그 다음 특정 부분 서열을 발현 벡터에 결찰시킨다.

GPCR-B3을 암호화하는 핵산은 복제 및/또는 발현을 위한 진핵 또는 원핵 세 포내로 형질전환하기 전에 중간 벡터내로 클로닝하는 것이 통상적이다. 이들 중간 벡터는 통상적으로 원핵 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 셔틀 벡터이다.

경우에 따라서, GPCR-B3 또는 이의 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산은 표준 기법에 따라서 만들 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합 도메인, 세포외 도메인, 경막 도메인(예, 7개의 경막 영역과 시토졸 루프를 포함함), 경막 도메인과 세포질 도메인, 활성 부위, 서브유닛 회합 영역 등과 같은 도메인을 이종 단백질에 공유적으로 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 세포외 도메인을 이종 GPCR 경막 도메인에 결합시키거나, 또는 이종 GPCR 세포외 도메인을 경막 도메인에 결합시킬 수 있다. 선택한 기타 이종 단백질로는, 예컨대 녹색 형광 단백질, β-gal, 글루타메이트 수용체 및 로돕신 전구서열(presequence) 등이 있다.

C. 원핵세포 및 진핵세포에서의 발현

GPCR-B3을 암호화하는 cDNA와 같은 클로닝된 유전자 또는 핵산의 고 발현량을 얻기 위해서, 통상적으로 전사, 전사/해독 종결인자 및 단백질을 암호화하는 핵산의 경우 전사 개시를 위한 리보좀 결합 부위를 유도하는 강한 프로모터를 포함하는 발현 벡터내로 GPCR-B3를 서브클로닝한다. 적절한 박테리아 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 Sambrook 등 및 Ausubel 등의 문헌에 개시되어 있다. GPCR-B3 단백질을 발현하는 박테리아 발현계는, 예컨대 이.콜리, 바실러스 종 및 살모넬라에서 이용가능하다[Palva 등, Gene 22:229-235(1983); Mosbach 등, Nature 302:543-545(1983)]. 이러한 발현계를 위한 키트는 시판된다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵 발현계가 당업계에 공지되어 있으며, 시판되고 있다. 일양태 에서, 진핵 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다.

이종 핵산의 발현을 유도하는데 사용된 프로모터는 특정 용도에 따라 좌우된다. 프로모터는, 경우에 따라 천연 세팅에서 전사 개시 부위로부터의 거리와 대략 동일한 거리로 이종 전사 개시 부위로부터 떨어진 거리에 위치한다. 그러나, 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리에서의 일부 변형체는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

프로모터 이외에, 발현 벡터는 통상적으로 숙주 세포내에서 핵산을 암호화하는 GPCR-B3의 발현에 대해 필요한 추가의 모든 성분을 함유하는 전사 유니트 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 통상적인 발현 카세트는 효과적인 전사체의 폴리아데닐화, 리보좀 결합 부위 및 전사 종결에 필요한 시그널 및 GPCR-B3을 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함한다. GPCR-B3을 암호화하는 핵산 서열은 통상적으로 절단가능한 시그널 펩티드 서열에 결합되어 있어 형질전환된 세포에 의한 암호화된 단백질의 분비를 촉진한다. 이러한 시그널 펩티드로는, 조직 플라스미노겐 활성화제에서 유래한 시그널 펩티드, 인슐린, 및 헬리오디스 비레센스(Heliothis virescens)의 유년기 호르몬 에스테라제 및 뉴론 성장 인자 등이 있다. 카세트의 추가의 성분은 인헨서와, 게놈 DNA가 구조 유전자로서 사용되는 경우에는 기능적 스플라이스 공여 부위와 수용 부위가 있는 인트론을 포함할 수 있다.

프로모터 서열 이외에, 발현 카세트는 효과적인 종결을 위해서 구조 유전자 의 하류에 있는 전사 종결 영역을 포함해야 한다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 얻거나, 또는 상이한 유전자로부터 얻을 수 있다.

유전자 정보를 세포내로 수송하는데 사용된 특정 발현 벡터는 특별히 중요하지는 않다. 진핵 세포 또는 원핵 세포내 발현을 위해서 사용된 임의의 통상적인 백터를 사용할 수 있다. 표준 박테리아 발현 벡터로는 pBR322계 플라스미드, pSKF, pET23D와 같은 플라스미드, GST 및 LacZ와 같은 융합 발현계 등이 있다. 에피토프 태그, 예컨대 c-myc를 재조합 단백질에 부가하여 편리한 분리 방법을 제공할 수 있다.

진핵 바이러스에서 유래한 조절 성분을 함유하는 발현 벡터는 진핵 발현 벡터, 예컨대 SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터 및 엡스타인 바르 바이러스에서 유도된 벡터내에서 통상적으로 사용된다. 기타 예시적인 진핵 벡터로는 pMSG, pAV009/A⁺, pMTO10/A⁺, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE와 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 포유류 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵 세포내에서 발현에 효과적인 것으로 밝혀진 기타 프로모터의 유도 하에 단백질을 발현시키는 기타 임의의 벡터 등이 있다.

일부 발현계는 티미딘 키나아제, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 및 디히드로폴레이트 리덕타제와 같은 유전자 증폭을 제공하는 마커를 보유한다. 대안적으로, 유전자 증폭을 포함하지 않는 고 수율 발현계는, 예컨대 곤충 세포내 바큘로바이러스 벡터를 사용하여, 폴리헤드린 프로모터 또는 기타 강력한 바큘로바이러스 프로모터의 유도하에 GPCR-B3을 암호화하는 서열에 적절하다.

통상적으로 발현 벡터내에 포함되는 성분은 이.콜리내에서 기능하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아를 선택하기 위한 항생제 내성을 암호화하는 유전자, 및 진핵 서열을 삽입시키는 플라스미드의 비필수 영역내 고유 제한 부위를 포함한다. 선택되는 특정 항생제 내성 유전자가 중요한 것은 아니며, 당업계에 공지된 임의의 여러 내성 유전자가 적절하다. 원핵 서열은, 필요에 따라 진핵 세포내 DNA의 복제를 저해하지 않도록 선택하는 것이 통상적이다.

표준 형질감염 기법을 사용하여 다량의 GPCR-B3 단백질을 발현하는 박테리아, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생산한 다음, 표준 기법으로 정제한다[예컨대, Colley 등, J.Biol.Chem. 264:17619-17622(1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182(Deutscher 편저, 1990) 참조]. 진핵 세포 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 기법에 따라 수행한다[예컨대, Morrison, J. Bact. 132:349-351(1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362(Wu 등, 1983) 참조].

외래 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포에 도입하는 임의의 공지된 절차를 사용할 수 있다. 이들 절차의 예로는 칼슘 포스페이트 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기사출법, 리포좀, 미세주입법, 플라스마 벡터, 바이러스 벡터와 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전자 물질을 숙주 세포내로 도입하는 임의의 기타 공지된 기법(예컨대 Sambrook 등의 상기 문헌 참조)이 있다. 사용된 특정 유전자 공학 절차는 하나 이상의 유전자를 GPCR-B3을 발현할 수 있는 숙주 세 포내로 성공적으로 도입할 수 있어야 한다.

발현 벡터를 세포내로 도입한 후에, GPCR-B3의 발현을 선호하는 조건하에서 형질감염된 세포를 배양하고, 전술한 표준 기법을 사용하여 배양물로부터 회수한다.

Ⅳ. GPCR-B3의 정제

기능적 분석법에 사용하기 위하여 천연의 또는 재조합 GPCR-B3을 정제할 수 있다. 임의적으로, 재조합 GPCR-B3가 정제된다. 천연 GPCR-B3은, 예를 들어 혀 조직과 같은 포유류의 조직 및 기타 GPCR-B3의 상동체 근원으로부터 정제된다. 재조합 GPCR-B3은 임의의 적당한 발현계, 예를 들어 박테리아 및 진핵 생물 발현계, 예컨대 CHO 세포 또는 곤충 세포로부터 정제된다.

GPCR-B3은, 황산 암모늄과 같은 물질을 이용한 선택적 침전법, 컬럼 크로마토그래피, 면역 정제법 및 기타 방법들을 포함하는 표준적인 기술에 의하여 실질적으로 순수한 상태로 정제될 수 있다[예를 들어, Scopes, Protein Purification:Principles and Practice(1982); 미국 특허 제4,673,641호; Ausubel 등의 상기 문헌 참조; Sambrook 등의 상기 문헌 참조].

재조합 GPCR-B3을 정제하는데에 다수의 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 명확한 분자 부착 특성을 보유하는 단백질은 GPCR-B3에 가역적으로 융합될 수 있다. 적당한 리간드를 이용하면, GPCR-B3은 정제 컬럼에 선택적으로 흡착될 수 있으며, 이후 비교적 순수한 형태로 컬럼으로부터 분리될 수 있다. 이후 융합된 단백질은 효소 활성에 의하여 제거된다. 최종적으로 GPCR-B3은 면역 친화성 컬럼을 사 용하여 정제될 수 있다.

A. 재조합 세포로부터 GPCR-B3의 정제

재조합 단백질은 통상적으로 프로모터를 유도한 후에, CHO 세포 또는 곤충 세포와 같은 형질전환 박테리아 세포 또는 진핵 세포에 의하여 다량 발현되지만, 상기 발현은 구성적일 수 있다. IPTG에 의한 프로모터 유도 현상은 유도적 프로모터 시스템의 일례이다. 세포들은 당 업계의 표준적인 방법에 따라서 성장한다. 신선한 세포 또는 냉동 세포들이 단백질 분리에 사용된다.

박테리아내 발현된 단백질들은 불용성 응집물("봉입체")을 형성할 수 있다. 몇몇 방법들이 GPCR-B3 봉입체 정제에 적당하다. 예를 들어, 봉입체 정제 방법은, 예컨대 50 mM TRIS/HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.1 mM ATP 및 1mM PMSF의 완충액에서 항온 처리함으로써 박테리아 세포들을 파괴하여 봉입체를 추출, 분리 및/또는 정제하는 과정들을 포함한다. 세포 현탁액은 프렌치 프레스기를 2∼3 회 통과시킴으로써 용균될 수 있으며, 폴리트론(Brinkman Instruments)으로 균질화하거나, 얼음상에서 초음파 처리할 수 있다. 박테리아를 용균시키는 다른 방법들은 당 업계의 숙련자들에게 명백하다[예를 들어, Sambrook 등의 상기 문헌 참조; Ausubel 등의 상기 문헌 참조].

필요한 경우, 상기 봉입체들은 용해되며, 이와 같이 용균된 세포 현탁액은 통상적으로 원심분리되어 원하지 않는 불용성 물질을 제거할 수 있다. 상기 봉입체를 형성하는 단백질들은 혼화 가능한 완충액으로 희석 또는 투석시켜 재변성될 수 있다. 적당한 용매로서는 우레아(약 4M∼약 8 M), 포름아미드(약 80% 이상, 부피/ 부피 기준) 및 구아니딘 히드로클로라이드(약 4M∼약 8 M)와 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 SDS(소듐 도데실 설페이트), 70% 포름산과 같은 응집체 형성 단백질을 용해시킬 수 있는 몇몇 용매들은 단백질들을 비가역적으로 변성시켜, 그 결과 면역 유발성 및/또는 활성을 상실시킬 가능성이 있기 때문에, 상기 방법에 사용하기에는 적당하지 않다. 구아니딘 히드로클로라이드 및 유사 제제는 변성제이지만, 상기 변성 과정은 가역적이므로, 면역학적으로 및/또는 생물학적으로 활성인 단백질을 재형성시킬 수 있는 변성제를 제거(예를 들어, 투석법으로) 또는 희석시킴으로써 재변성시킬 수 있다. 다른 적당한 완충제들이 당 업계에 공지되어 있다. GPCR-B3은, 예를 들어 Ni-NTA 아가로즈 수지를 사용하는 표준적인 분리 기술에 의하여 다른 박테리아 단백질로부터 분리된다.

이와는 달리, GPCR-B3을 박테리아의 주변 세포질로부터 정제할 수 있다. 상기 박테리아를 용균시킨 후, GPCR-B3을 박테리아의 주변 세포질로 배출시킬때, 상기 박테리아의 주변 세포질 분획은 당 업계에 공지된 다른 방법과 함께 저온 삼투압 충격법에 의하여 분리될 수 있다. 상기 주변 세포질로부터 재조합 단백질을 분리하기 위하여, 박테리아 세포들을 원심 분리시켜 펠렛을 생성시킨다. 이후 상기 펠렛을 20% 수크로즈를 함유하는 완충액에 재현탁시킨다. 상기 세포들을 용균시키기 위하여, 박테리아를 원심분리시키고 상기 펠렛을 얼음 냉각된 5 mM MgSO₄에 재현탁시킨 후 약 10 분 동안 얼름조에 방치시킨다. 이후 상기 세포 현탁액을 원심 분리시켜 상등액을 따라낸 후 이를 모아둔다. 상기 상등액에 존재하는 재조합 단백질을 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지된 표준적인 분리 기술을 사용하여 숙주 단백질로부터 분리할 수 있다.

B. GPCR-B3을 정제하는 표준 단백질 분리 기술

용해도 분류법

종종 처음 단계로서, 특히 단백질 혼합물이 복합체인 경우, 초기 염 분류법으로 목적 재조합 단백질로부터 다수의 의도로 하지 않은 숙주 세포 단백질(또는 세포 배양 배지로부터 얻은 단백질)을 분리할 수 있다. 이때 바람직한 염으로서는 황산암모늄이 있다. 황산암모늄은 단백질 혼합물내 물의 양을 효율적으로 감소시킴으로써 단백질을 침전시킨다. 이후 단백질들은 이들의 용해도에 따라서 침전한다. 단백질이 소수성일 수록, 더욱 낮은 농도의 황산암모늄에서 침전된다. 통상적인 방법은 포화 황산암모늄을 단백질 용액에 가하여 생성된 황산암모늄 농도를 20∼30%로 만드는 과정을 포함한다. 이 농도는 가장 소수성인 단백질을 침전시킨다. 이후 상기 침전물을 폐기하고(목적 단백질이 소수성이 아닌 경우), 목적 단백질을 침전시키는 것으로 공지된 농도로 황산암모늄을 상등액에 첨가한다. 이후 상기 침전물을 완충액내 용해시키고, 필요한 경우 투석법 또는 투과성 여과법으로 과량의 염을 제거한다. 저온 에탄올 침전법과 같은 단백질 용해도를 기초로 한 방법들은 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있으며, 또한 이로써 복합 단백질 혼합물을 분류할 수 있다.

크기 감별 여과법

상이한 기공 크기의 막을 통한 한외 여과법(예를 들어, Amicon 또는 Millipore 막)으로, GPCR-B3의 분자량을 기초로 하여 이보다 더욱 크고 작은 크기의 단백질들로부터 이를 분리해 낼 수 있다. 첫 번째 단계로서, 목적 단백질의 분자량보다 낮은 분자량 컷오프를 갖는 기공 크기를 보유하는 막을 통하여 단백질 혼합물을 한외 여과시킬 수 있다. 이후 상기 한외 여과 보유물은 목적 단백질의 분자량보다 큰 분자량 컷오프를 갖는 막을 통하여 한외 여과된다. 상기 재조합 단백질은 상기 막을 통하여 여과물내로 통과하게 될 것이다. 이후 상기 여과물은 이하에 기술된 바와 같이 크로마토그래피될 수 있다.

컬럼 크로마토그래피

GPCR-B3은 또한 이의 크기, 표면의 순전하, 소수성 및 리간드에 대한 친화도를 기초로 하여 다른 단백질로부터 분리될 수 있다. 뿐만 아니라, 단백질에 대해서 생성된 항체들은 컬럼 매트릭스와 면역 정제된 단백질에 접합될 수 있다. 상기 모든 방법들은 당 업계에 널리 공지된 것들이다. 크로마토그래피 기술은 임의의 규모로, 다수의 제조원(예를 들어 Pharmacia Biotech)으로부터 공급된 장치를 사용하여 수행될 수 있다는 사실을 숙련자들은 이해할 수 있을 것이다.

Ⅴ. GPCR-B3의 면역학적 검출 방법

GPCR-B3 유전자 검출법 및 핵산 하이브리드화 기술을 사용한 유전자 발현법 이외에, GPCR-B3을 검출하는 면역분석법, 예를 들어 미각 수용 세포 및 GPCR-B3의 변형체를 동정하는 면역분석법도 사용될 수 있다. 면역분석법은 GPCR-B3을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는데에 사용될 수 있다. 적용 가능한 기술의 총괄적인 설명은 Harlow & Lane, Antibodies:A Laboratory Manual (1998)에서 살펴볼 수 있다.

A. GPCR-B3에 대한 항체

GPCR-B3과 특이적으로 반응하는 폴리클론 및 모노클론 항체를 생성시키는 방법은 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다[예를 들어, Coligan, Current Protocols in Immnunology(1991) Harlow & Lane, 상기 문헌 참조; Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2nd ed. 1986); 및 Kohler & Milstein, Nature 256:495∼497(1975) 참조]. 이러한 기술들은 파아지 또는 유사한 벡터에서 재조합 항체 라이브러리로부터 항체를 선택함으로써 항체를 제조하는 방법과, 토끼 또는 마우스를 면역화시켜 폴리클론 및 모노클론 항체들을 제조하는 방법을 포함한다[예를 들어, Huse 등의 문헌, Science 246:1275∼1281(1989) ; Ward 등의 문헌, Nature 341:544∼546 (1989) 참조].

면역원을 포함하는 다수의 GPCR-B3은 GPCR-B3와 특이적으로 반응하는 항체를 생성하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 GPCR-B3 또는 이들의 항원성 단편은 본원에 기술된 방법과 같이 분리된다. 재조합 단백질은 전술한 바와 같이 진핵 세포 또는 원핵 세포내에서 발현될 수 있으며, 일반적으로 전술한 바와 같이 정제된다. 재조합 단백질은 모노클론 또는 폴리클론 항체 생성에 대한 바람직한 면역원이다. 이와는 달리, 본원에 개시된 서열들로부터 유래되어 담체 단백질에 접합된 합성 펩티드는 면역원으로서 사용될 수 있다. 천연 단백질은 또한 순수하거나 또는 불순한 형태로 사용될 수 있다. 이후 생성물은 항체를 생성할 수 있는 동물내에 주입한다. 상기 단백질을 측정하기 위한 면역분석법에 후속적으로 사용하기 위하여, 모노클론 또는 폴리클론 항체들을 생성할 수 있다.

폴리클론 항체들을 생성하는 방법들은 당 업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 마우스(예를 들어, BALB/C 마우스) 또는 토끼의 육종된 계통은, 예를 들어 프로인트 애쥬반트와 같은 표준적인 애쥬반트 및 표준적인 면역화 방법을 사용하여 면역화될 수 있다. 면역원 제제에 대한 동물의 면역 반응은 시험 혈액을 채취하고 GPCR-B3에 대한 반응성의 역가를 측정하여 모니터링할 수 있다. 상기 면역원에 대한 적절히 높은 역가의 항체가 얻어지면, 상기 동물로부터 채혈하고 항혈청을 제조한다. 필요에 따라, 추가로 항혈청을 분류하여 상기 단백질에 반응성인 항체를 증량시킬 수 있다[Harlow & Lane 저서의 상기 문헌 참조].

모노클론 항체는 당 업계의 숙련자들에게 익숙한 다수의 기술로써 얻을 수 있다. 간단히 말하면, 목적 항원으로 면역화된 동물로부터 얻은 비장 세포들을, 일반적으로 골수종 세포로 융합시켜 죽지 않게 한다[Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511∼519(1976) 참조]. 죽지 않게 하는 다른 방법으로는 엡스타인 바르 바이러스, 종양 유전자, 또는 레트로바이러스를 사용하여 형질전환시키는 방법, 또는 당 업계에 널리 공지된 기타 방법들을 포함한다. 단일의 불사 세포들로부터 생성된 콜로니들을, 목적 특이성과 항원에 대한 친화도를 보유하는 항체의 생성에 대해 검색할 수 있으며, 이러한 세포들에 의하여 생성된 모노클론 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복막강으로 주사하는 방법을 포함하는 다수의 기술로 증가시킬 수 있다. 이와는 달리, Huse 등의 문헌, Science 246:1275∼1281(1989)에 개괄적으로 설명된 일반적인 방법에 따라, 인간의 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 검색하여 모노클론 항체 또는 이의 결합 단편을 암호하는 DNA 서열을 분리할 수 있다.

모노클론 항체 및 폴리클론 혈청을 수집한 후, 예를 들어 고체 지지체상에 고정시킨 면역원을 사용하는 고체상 면역분석법과 같은 면역분석법에서 면역원 단백질에 대하여 적정한다. 통상적으로 역가가 10⁴ 이상인 폴리클론 항혈청을 선택한후, 경쟁적 결합 면역분석법을 이용하여, 비 GPCR-B3 단백질 또는 기타 유기체 유래의 관련 단백질에 대한 교차 반응성에 대해서 시험하였다. 특이적 폴리클론 항혈청 및 모노클론 항체들은 일반적으로 약 0.1 mM 이상, 더욱 일반적으로는 1 μM 이상의 K_d로 결합할 것이며, 임의적으로는 약 0.1 μM 이상, 0.01 μM 이상의 K_d로 결합할 것이다.

GPCR-B3 특이적 항체가 이용가능한 경우, GPCR-B3은 다수의 면역분석법으로 검출될 수 있다. 면역학적 방법 및 면역분석법에 관한 자세한 설명은, Basic and Clinical Immunology(Sites & Terr eds., 7th ed. 1991)을 참조하시오. 더욱이, 본 발명의 면역분석법은 Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980) 및 Harlow & Lane의 상기 문헌 참조)의 저서에 보다 상세히 설명되어 있는 몇몇 방법중 임의의 방법으로 수행될 수 있다.

B. 면역학적 결합 분석법

GPCR-B3은 널리 공지된 다수의 면역학적 결합 분석법 중 하나를 사용하여 검출 및/또는 정량할 수 있다[예를 들어, 미국 특허 제4,366,241호 ; 동 제4,376,110호; 동 제4,517,288호 ; 및 동 제4,837,168호 참조]. 일반적인 면역분석법에 대해서는 Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology, 제37권(Asai, ed. 1993) ; Basic and Clinical Immunology(Sites & Terr eds., 7th ed. 1991)을 참조하시오. 면역학적 결합 분석법(또는 면역분석법)은 일반적으로 선택된 단백질 또는 항원(본 경우에는 GPCR-B3 또는 이의 항원 부분서열)에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한다. 항체(예를 들어, 항 GPCR-B3)는 전술한 바와 같은 당 업계의 숙련자에게 널리 공지된 다수의 방법으로 제조될 수 있다.

면역분석법은 또한 종종 특이적으로 결합하여 항체 및 항원에 의하여 형성되는 복합체를 표지화하는 표지화제를 사용한다. 상기 표지화제는 그 자체가 상기 항체/항원 복합체를 포함하는 부분 중의 하나일 수 있다. 그러므로, 상기 표지화제는 표지된 GPCR-B3 폴리펩티드 또는 표지된 항 GPCR-B3 항체일 수 있다. 대안적으로, 상기 표지화제는 항체/GPCR-B3 복합체에 특이적으로 결합하는 2차 항체와 같은(2차 항체는 일반적으로 1차 항체가 유도되는 종의 항체에 특이적임) 제3의 부분일 수도 있다. 단백질 A 또는 단백질 G와 같이, 면역글로불린의 불변부에 특이적으로 결합할 수 있는 기타의 단백질을 표지화제로서 사용할 수도 있다. 상기 단백질들은 다양한 종으로부터 얻은 면역글로불린 불변부와 강한 비면역원성 반응성을 나타낸다[예를 들어, Kronval 등의 문헌, J. Immunol. 111:1401∼1406(1973) ; Akerstrom 등의 문헌, J. Immunol. 135:2589∼2542(1985) 참조]. 상기 표지화제는 스트렙타비딘과 같이, 다른 분자가 특이적으로 결합할 수 있는, 비오틴과 같은 검출 가능한 부분으로 변형될 수 있다. 다수의 검출 가능한 부분들이 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다.

상기 분석법의 실시 과정에서, 각각의 시약들을 조합하여 사용한 후에는 항온 처리 단계 및/또는 세척 단계가 필요할 수 있다. 항온 처리 단계는 약 5 초 내지 수 시간, 임의적으로는 약 5 분 내지 약 24 시간으로 매우 다양할 수 있다. 그러나, 항온 처리 시간은 분석 방식, 항원, 용액의 부피, 농도 등과 같은 것에 따라서 달라질 수 있다. 일반적으로 상기 분석법은 상온에서 수행하지만, 10∼40 ℃와 같은 온도 범위에 걸쳐서 수행할 수도 있다.

비경쟁적 분석법

시료내 GPCR-B3을 검출하는 면역분석법은 경쟁적이거나 또는 비경쟁적일 수 있다. 비경쟁적 면역분석법은 항원의 양이 직접적으로 측정되는 분석법이다. 예를 들어 하나의 바람직한 "샌드위치" 분석법에서, 항 GPCR-B3 항체는 이들이 고정되어 있는 고체 기질에 직접적으로 결합될 수 있다. 이와 같이 고정화된 항체들은 이후 시험 시료에 존재하는 GPCR-B3을 포획한다. 그러므로 GPCR-B3은 이후 2차 GPCR-B3 항체 보유 표지와 같은 표지화제에 의하여 결합된다. 대안적으로, 2차 항체에는 표지가 결여되어 있지만, 2차 항체가 얻어진 종의 항체에 특이적인 표지된 3차 항체에 의하여 결합될 수도 있다. 2차 또는 3차 항체는 일반적으로, 예컨대 스트렙타비딘과 같은 기타의 분자들과 특이적으로 결합하는 비오틴 등의 검출 가능한 부분으로 변형되어, 검출가능한 부분을 제공한다.

경쟁적 분석법

경쟁적 분석법에서, 시료에 존재하는 GPCR-B3의 양은 항 GPCR-B3 항체로부터 시료에 존재하는 미지의 GPCR-B3으로 치환된(경쟁에서 승리한), 공지의 첨가된(외인성) GPCR-B3의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정된다. 하나의 경쟁적 분석법에서는, 공지의 양의 GPCR-B3를 시료에 첨가한 후, 시료를 GPCR-B3에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시킨다. 상기 항체에 결합한 외인성 GPCR-B3의 양은 시료내에 존재하는 GPCR-B3의 농도에 반비례한다. 일 구체예에서, 상기 항체는 고체 기질상에 고정된다. 상기 항체에 결합된 GPCR-B3의 양은 GPCR-B3/항체 복합체에 존재하는 GPCR-B3의 양을 측정하거나 또는 잔류하는 비복합화된 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. GPCR-B3의 양은 표지된 GPCR-B3 분자를 제공함으로써 검출될 수 있다.

햅텐 억제 분석법은 또 다른 경쟁적 분석법이다. 상기 분석법에서 공지의 GPCR-B3은 고체 기질상에 고정화된다. 공지의 양의 항 GPCR-B3 항체를 상기 시료에 첨가한 후, 상기 시료를 고정화된 GPCR-B3과 접촉시킨다. 공지의 고정화된 GPCR-B3에 결합된 항 GPCR-B3의 양은 시료내에 존재하는 GPCR-B3의 양에 반비례한다. 다시 말하면, 면역화된 항체의 양은 고정화된 항체 분획물 또는 용액내에 잔존하는 항체 분확물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 검출법은 상기 항체를 표지화시켜 직접적으로 수행하거나 또는 전술한 바와 같이 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 부분을 후속 첨가하여 간접적으로 수행할 수 있다.

교차 반응성 측정법

경쟁적 결합 방식의 면역분석법은 또한 교차 반응성 측정법에 사용될 수도 있다. 예를 들어, 서열 번호 1 내지 3에 의하여 최소한 부분적으로나마 암호화된 단백질은 고체 지지체상에 고정화될 수 있다. 고정화된 항원에 대한 항혈청 결합에 대해 경쟁하는 분석법에 단백질(예를 들어 GPCR-B3 단백질 및 상동체)을 첨가한다. 고정화된 단백질에 대한 항혈청의 결합에 대하여 경쟁하는 첨가된 단백질의 능력을 그 자체와 경쟁하는 서열 번호 1 내지 3이 암호화하는 GPCR-B3의 능력과 비교한다. 상기 단백질의 교차 반응성(%)은 표준적인 계산 방법을 이용하여 계산한다. 상기 첨가된 각각의 단백질들과의 교차 반응성이 10% 미만인 항혈청들을 선택한 후 모은다. 교차 반응성 항체들은 임의적으로, 예를 들어 근연관계가 먼 상동체와 같은, 첨가된 추정 단백질로 면역 흡착시켜 상기 푸울링된 항혈청으로부터 분리할 수도 있다.

이후 면역 흡착되어 푸울링된 항혈청은 전술한 바와 같은 경쟁적 결합 면역분석법에서 사용되어, 면역원 단백질(즉, 서열 1 ∼3의 GPCR-B3)에 대하여, GPCR-B3의 다형성 변형체 또는 대립유전자일 것으로 추정되는, 2차 단백질과 비교한다. 이와 같이 비교하기 위해서, 2개의 단백질들 각각은 광범위한 농도 범위에서 분석되며, 항혈청과 고정화된 단백질의 결합을 50 % 억제하는데에 필요한 각각의 단백질의 양을 측정한다. 만일, 결합을 50% 억제하는데에 필요한 2차 단백질의 양이 결합을 50% 억제하는데에 필요한 서열 번호 1 내지 3에 의하여 암호화된 단백질의 양보다 10 배 미만이면, 2차 단백질은 GPCR-B3 면역원에 대해서 생성된 폴리클론 항체와 특이적으로 결합한다고 할 수 있다.

기타 분석 방법

시료내 GPCR-B3의 존재 여부를 검출 및 정량하기 위하여 웨스턴 블롯법(면역 블롯법)을 사용한다. 상기 기술은 일반적으로 분자량을 기초로 하는 겔 전기 영동법에 의해서 시료 단백질을 분리하는 단계, 분리된 단백질을 적당한 고체 지지체(예를 들어, 니트로셀룰로즈 필터, 나일론 필터 또는 유도형 나일론 필터)상에 이동시키는 단계 및 GPCR-B3과 특이적으로 결합하는 항체들을 상기 시료와 함께 항온 처리시키는 단계를 포함한다. 항 GPCR-B3 항체들은 상기 고체 지지체상의 GPCR-B3과 특이적으로 결합한다. 상기 항체들은 직접적으로 표지되거나 또는 항 GPCR-B3 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체(예를 들어, 표지된 양 항 마우스 항체)를 사용하여 후속 검출될 수 있다.

다른 분석 방법으로서는 특정 분자(예를 들어, 항체)와 결합하고 캡슐화된 시약 또는 마커를 방출하도록 디자인된 리포좀을 사용하는, 리포좀 면역분석 방법(LIA)을 포함한다. 상기 방출된 화학 물질들은 이후 표준적인 기술에 따라서 검출된다[Monroe 등의 문헌, Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34∼41(1986) 참조].

비특이적 결합의 감소

당 업계의 숙련자는 면역분석법에서 비특이적 결합을 최소화시키는 것이 종종 바람직하다는 사실을 이해할 것이다. 특히, 상기 분석법이 항원 또는 고체 지지체상에 고정된 항체를 포함하는 경우, 상기 기질에 비특이적으로 결합하는 양을 최소화시키는 것이 바람직하다. 이러한 비특이적 결합을 감소시키는 수단은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 통상적으로, 상기 기술은 기질을 단백질계 조성물로 피복시키는 단계를 포함한다. 구체적으로 단백질 조성물, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 탈지 분유 및 젤라틴이 널리 사용되고 있다.

표지

상기 분석법에 사용된 특정 표지 또는 검출 가능한 그룹은, 상기 분석법에 사용된 항체의 특이적 결합을 크게 방해하지 않는 한, 본 발명의 중요한 측면을 이루는 것은 아니다. 검출 가능한 그룹은 검출 가능한 물리적 또는 화학적 특성을 보유하는 임의의 물질일 수 있다. 이와 같이 검출 가능한 표지들은 면역분석법 분야에서 활발하게 개발되어 온 것들로서, 일반적으로 이러한 방법에 가장 유용한 임의의 표지가 본 발명에 사용될 수 있다. 그러므로, 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역 화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의하여 검출 가능한 임의의 조성물이다. 본 발명의 유용한 표지들로서는 자기 비드(예를 들어, DYNABEADS™), 형광 염료(예를 들어, 플루오세인 이소티오시아네이트, Texas 레드, 로다민등), 방사성 표지(예를 들어, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³²P), 효소(예를 들어, 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제 및 기타 ELISA 에서 통상적으로 사용되는 효소) 및 콜로이드성 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱 비드(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)와 같은 비색 정량 표지를 포함한다.

상기 표지는 당 업계에 널리 공지된 방법에 따른 분석법의 목적 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 상기에서 밝힌 바와 같이, 다수의 표지는 필요한 감수성, 화합물과의 접합 용이성, 안정성 조건, 유용한 기구 및 처분 양에 따라서 선택될 수 있다.

비방사성 표지들은 종종 간접적인 방법에 의하여 부착된다. 일반적으로 리간드 분자(예를 들어, 비오틴)는 상기 분자에 공유적으로 결합된다. 이후 상기 리간드는 다른 분자들(예를 들어, 스트렙타비딘 분자)에 결합하는데, 이는 본질적으로 검출 가능하거나 또는 검출 가능한 효소, 형광성 화합물 또는 화학 발광 화합물과 같은 신호 시스템에 공유적으로 결합되어 있다. 상기 리간드 및 이의 표적은 GPCR-B3을 인지하는 항체 또는 항 GPCR-B3을 인지하는 2차 항체와 함께 임의로 적당하게 조합되어 사용될 수 있다.

상기 분자들은 또한, 예컨대 효소 또는 형광단과 접합시켜, 신호 발생 화합물에 직접적으로 접합될 수도 있다. 표지로서의 목적 효소는 주로 가수 분해 효소, 특히 포스파타제, 에스테라아제 및 글리코시다아제 또는 옥시도타아제, 구체적으로 퍼옥시다아제일 것이다. 형광 화합물로서는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 댄실, 움벨리페론 등을 포함한다. 화학 발광 화합물로서는 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀을 포함한다. 사용될 수 있는 다수의 표지화 시스템 또는 신호 발생 시스템에 관한 상세한 설명은 미국 특허 제 4,391,904 호를 참조하시오.

표지를 검출하는 방법에 관해서는 당 업계의 숙련자에 널리 공지되어 있다. 그러므로, 예를 들어 상기 표지가 방사성 표지인 경우, 검출 수단으로서는 신틸레이션 계수기 또는 방사선 사진의 사진 필름을 포함한다. 상기 표지가 형광성 표지인 경우, 적당한 파장의 광선으로 형광 색소를 여기시켜 결과의 형광도를 검출함으로써 검출될 수 있다. 상기 형광도는 사진 필름으로, 전하 커플링 장치(CCD) 또는 광 전자 증배관 등과 같은 전자 검출기를 사용하여 시각적으로 검출될 수 있다. 이와 유사하게, 효소 표지는 효소에 대한 적당한 기질을 제공하여 결과의 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 최종적으로 단일 비색 정량 표지는 단순히 그 표지와 관련된 색을 관찰하여야 검출될 수 있다. 그러므로, 다수의 딥스틱 분석법(dipstick assay)에 있어서, 접합된 금은 종종 분홍색으로 나타나는 반면에, 기타 접합된 다수의 비드들은 비드의 색을 그대로 나타낸다.

몇몇 분석 방법들에서는 표지된 성분들을 사용할 필요가 없다. 예를 들어, 응집 분석법은 표적 항체의 존재를 검출하는데에 사용될 수 있다. 이러한 경우, 항원 피복된 입자들은 표적 항체들을 포함하는 시료에 의하여 응집된다. 이러한 방법에 있어서는, 어떠한 성분들도 표지될 필요가 없으며 표적 항체의 존재는 단순히 시각적으로 관찰하여 검출된다.

Ⅵ. GPCR-B3 조절인자에 대한 분석법

A. GPCR-B3 활성에 대한 분석법

GPCR-B3 및 이의 대립유전자들 및 다형성 변형체들은 미각 정보 전달 과정에 관여하는 G-단백질 커플링된 수용체들이다. 상기 GPCR-B3의 폴리펩티드의 활성은 기능적, 화학적 및 물리적 효과를 측정하는 다수의 시험관내 및 생체내 분석법, 예를 들어 리간드 결합 측정(예를 들어, 방사성 리간드 결합), 2차 전달자(예를 들어, cAMP, cGMP, IP₃, DAG 또는 Ca²⁺), 이온 플럭스, 인산화 수준, 전사 수준, 신경 전달자 수준 등의 측정과 같은 방법으로 측정될 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 분석법들은 GPCR-B3의 억제인자 및 활성인자를 시험하는데에 사용될 수 있다. 조절인자들은 또한 유전적으로 변경된 GPCR-B3 일 수도 있다. 이러한 미각 정보 전달 활성 조절인자들은 미각을 조정하는데에 유용하다.

상기 분석법의 GPCR-B3은 서열 번호 1 내지 3의 서열을 보유하는 폴리펩티드 또는 이들의 보존적으로 변형된 변형체로부터 선택될 것이다. 이와는 달리, 상기 분석법의 GPCR-B3은 진핵 생물로부터 얻어질 것이며 이는 서열 번호 1 내지 3과 아미노산 서열 동일성을 보유하는 아미노산 부분서열을 포함할 것이다. 일반적으로, 상기 아미노산 서열 동일성은 70% 이상, 경우에 따라서 85% 이상, 임의적으로는 90∼95% 이상일 것이다. 또는 상기 분석법의 폴리펩티드는 세포외 도메인, 경막 도메인, 세포질 도메인, 리간드 결합 도메인, 서브유닛 결합 도메인, 활성 부위 등과 같은 GPCR-B3 도메인을 포함한다. GPCR-B3 또는 이들의 도메인은 이종 단백질과 공유적으로 연결되어 본원에 기술된 분석법에 사용된 키메라 단백질을 만든다.

GPCR-B3 활성 조절인자는 전술한 바와 같이, 재조합 폴리펩티드 또는 천연 폴리펩티드와 같은, GPCR-B3 폴리펩티드를 이용하여 시험된다. 상기 재조합 또는 천연 단백질은 분리된후, 세포내에서 발현되며, 세포로부터 유래된 막에서 발현되고, 조직 또는 동물내에서 발현된다. 예를 들어, 혀의 검편, 혀로부터 분리해 낸 세포, 형질전환된 세포 또는 막이 사용될 수 있다. 조절 작용은 본원에 기술된 시험관내 또는 생체내 분석법중 어느 하나를 사용하여 시험된다. 미각 정보 전달 과정은 또한, 예를 들어 이종 신호 전달 도메인에 공유적으로 연결된 수용체의 세포외 도메인, 또는 수용체의 경막 및/또는 수용체의 세포질 도메인에 공유적으로 결합된 이종 세포외 도메인과 같은, 키메라 분자를 이용하여 시험관내에서 가용성 또는 고체상 반응으로 관찰될 수도 있다. 뿐만 아니라, 목적 단백질의 리간드 결합 도메인은 시험관내에서 리간드 결합 여부를 분석하기 위하여 가용성 또는 고체상 반응에 사용될 수 있다.

GPCR-B3, 도메인 또는 키메라 단백질에 결합하는 리간드는 용액내, 고체상에 부착되어 있는 이중층 막, 지질 단일층 또는 비히클내에서 시험될 수 있다. 조절인자의 결합은, 예를 들어 분광 특성(예를 들어, 형광성, 흡광성, 굴절률)의 변화, 유체 역학(예를 들어, 형태), 색층 분석 또는 용해도 특성을 이용하여 시험될 수 있다.

또한 수용체-G 단백질 상호 작용도 관찰될 수 있다. 예를 들어, 상기 수용체에 G 단백질이 결합하거나 또는 상기 수용체로부터 이것이 방출되는 것을 관찰할 수 있다. 예를 들어, GTP의 부재시, 활성인자는 상기 수용체와 G 단백질(모두 3개의 서브유닛)의 단단한 복합체를 형성시킨다. 상기 복합체는, 전술한 바와 같이, 다수의 방법으로 검출될 수 있다. 이러한 분석법은 억제인자를 탐색하기 위하여 변형될 수 있다. GTP 의 부재하에서 상기 수용체 및 G 단백질에 활성인자를 첨가하여, 단단한 복합체를 형성한후, 수용체-G 단백질 복합체의 해리를 관찰함으로써 억제제를 검색할 수 있다. GTP 의 존재하에서, G 단백질의 다른 2개의 서브유닛으로부터 G 단백질의 알파 서브유닛이 방출되는 지의 여부는 활성화 여부의 척도가 된다.

활성화된 또는 억제된 G 단백질은 이후 표적 효소, 채널 및 기타 효과기 단백질의 특성을 변경시킬 것이다. 고전적인 예로서는, 시각 시스템에서 트랜스듀신(transducin)에 의한 cGMP 포스포디에스테라아제의 활성화, 자극 G 단백질에 의한 아데닐레이트 사이클라아제의 활성화, Gq 및 기타 동족의 G 단백질(cognate G protein)에 의한 포스포리파아제의 활성화, 그리고 Gi 및 기타 G 단백질에 의한 다양한 채널 조절을 들 수 있다. 또한 포스포리파아제 C에 의한 디아실 글리세롤 및 IP3의 발생과 같은 다운스트림 영향력이 측정될 수 있으며, 또한 IP3에 의한 칼슘 이동에 대해서도 측정될 수 있다.

활성화된 GPCR 수용체는 수용체의 C 말단 부분( 및 기능하다면 다른 위치)을 인산화시키는 키나아제의 기질이 된다. 따라서, 활성인자는 감마 표지된 GTP로부터 수용체로의 ³²P의 전이(이는 신틸레이션 계수기로 분석될 수 있음)를 촉진시킬 것이다. C 말단 부분의 인산화는 어레스틴(arrestin) 유사 단백질의 결합을 촉진할 것이며 또한 G 단백질의 결합을 방해할 것이다. 상기 키나아제/어레스틴 경로는 다수의 GPCR 수용체의 탈감작화에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 미각 수용체가 활성화된 상태로 지속되어 있는 상태를 조절하는 화합물은 바람직한 미각을 오랫동안 유지시키거나 또는 불쾌한 미각을 차단시키는 수단으로서 유용할 것이다. GPCR 신호 정보 전달 및 신호 정보 전달 분석 방법에 관하여는 예를 들어, Methods in Enzymology, vol. 237 및 238(1994), 제 96 권(1993) ; Bourne 등의 문헌, Nature 10:349:117-27(1991) ; Bourne 등의 문헌, Nature 348:125-32(1990) ; Pitcher 등의 문헌, Annu. Rev. Biochem. 67:653-92(1998)를 참조하시오.

유효한 GPCR-B3 억제인자 또는 활성인자로 처리된 시료 또는 분석물을 시험 화합물로 처리하지 않은 대조군 시료와 비교하여 이들의 조절의 정도를 평가할 수 있다. 대조군 시료(활성인자 또는 억제인자로 처리하지 않은 시료)의 상대적인 GPCR-B3 활성값을 100으로 하였다. GPCR-B3 활성값이 대조군 시료와 비교하여 약 90%, 임의적으로는 50%, 경우에 따라서는 25∼0%일 경우 GPCR-B3가 억제된다. GPCR-B3 활성 값이 대조군 시료와 비교하여 110%, 임의적으로는 150%, 200∼500% 또는 1000∼2000%인 경우, GPCR-B3가 활성화된다.

이온 플럭스의 변화는 GPCR-B3을 발현하는 세포 또는 막의 극성(즉, 전기적 퍼텐셜)의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 세포 극성 변화를 측정하는 하나의 수단으로서는, 예를 들어 "세포 부착" 모드, "내부 및 외부" 모드, 및 "전체 세포" 모드와 같은, 전압 클램프 및 패치 클램프 기술에 의하여 전류의 변화를 측정(이로써 극성의 변화를 측정)하는 것이다[예를 들어, Ackerman 등의 문헌, New Engl. J.Med. 336:1575-1595(1997) 참조]. 전체 세포 전류는 통상적으로 표준적인 방법에 의하여 측정된다[예를 들어 Hamil 등의 문헌, PFlugers. Archiv. 391:85(1981) 참조]. 기타 공지의 분석법으로는 전압 감수성 염료를 이용한 방사능 표지된 이온 플럭스 분석법 및 형광 분석법을 포함한다[예를 들어, Vestergarrd-Bogind 등의 문헌, J. Membrane Biol. 88:67-75(1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol. 4:269-277(1997); Daniel 등, J. Pharmacol. Meth. 25:185-193(1991); Holevinsky 등, J. Membrane Biology 137:59-70(1994)]. 일반적으로, 시험될 화합물들은 1 pM∼100 mM 의 범위내에 존재한다.

폴리펩티드 기능에 대한 시험 화합물의 효과는 전술된 변수들중 임의의 것에 의하여 측정될 수 있다. GPCR 활성에 영향을 미치는 임의의 적당한 생리학적 변화는 본 발명의 폴리펩티드상의 시험 화합물의 영향력을 평가하는데에 사용될 수 있다. 기능적 영향력이 온전한 세포 또는 동물을 사용하여 측정될 때, 전달 물질 방출, 호르몬 방출, 공지의 유전적 마커 및 특성 규명이 되지 않은 유전적 마커에 대한 전사의 변화(예를 들어, 노던 블롯), 세포 성장 또는 pH 변화와 같은 세포 대사상의 변화, 및 Ca²⁺, IP3 또는 cAMP 와 같은 세포내 2차 전달자의 변화와 같은 다양한 효과를 측정할 수도 있다.

G-단백질 커플링된 수용체의 분석은 리포터 수용체 활성에 대한 이온 또는 전압 감수성 염료를 로딩한 세포를 포함한다. 이러한 수용체의 활성을 측정하기 위한 분석법은 또한 시험 화합물의 활성을 측정하는 음성 또는 양성 대조군으로서 기타 G 단백질과 커플링된 수용체에 대한 공지의 작용물질 및 길항물질을 사용할 수도 있다. 조절 화합물들(예를 들어, 작용물질, 길항물질)을 동정하기 위한 분석법에서, 세포질내 이온 수준 또는 막 전압의 변화는 각각 이온 감수성 또는 막 전압 형광 지표를 사용하여 모니터될 수 있다. 사용 가능한 이온 감수성 지표 및 전압 프로브들은 Molecular Probes 1997 Catalog 에 개시되어 있는 것들을 사용할 수 있다. G-단백질 커플링된 수용체의 경우, 선택된 분석법에서 Gα15 및 Gα16 과 같은 무차별적인 G 단백질이 사용될 수 있다[Wilkie 등의 문헌, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:10049-10053(1991)]. 이와 같은 무차별적 G 단백질은 광범위한 수용체와 커플링될 수 있다.

수용체 활성화는 통상적으로 후속 세포내 현상, 예를 들어 세포내 저장된 칼슘 이온을 방출시키는 IP3와 같은 2차 전달자의 증가와 같은 현상을 개시한다. 일부 G-단백질 커플링된 수용체가 활성화되면 포스파티딜이노시톨의 포스포리파아제 C 매개성 가수 분해 과정을 통하여 이노시톨 트리포스페이트(IP3)의 형성을 촉진시키게 된다[Berridge & Irvine, Nature 312:315-21(1984)]. IP3은 세포내 저장된 칼슘 이온을 방출시키는 과정을 자극한다. 그러므로, 세포질 칼슘 이온 수준의 변화 또는 IP3 와 같은 2차 전달자 수준의 변화는 G-단백질 커플링된 수용체 기능을 평가하는데에 사용될 수 있다. 이러한 G-단백질 커플링된 수용체 발현 세포들은 세포내 저장 및 이온 통로의 활성화에 따른 분포의 결과로서 세포질 칼슘 수준을 증가시킬 수 있으며, 이러한 경우, 내부 저장고로부터 칼슘이 방출되어 생기는 형광성 반응을 식별하기 위해서, 경우에 따라 EGTA와 같은 킬레이트제를 보충한 칼슘 부재 완충액에서 분석법을 수행할 필요는 없지만, 그렇게 하는 것이 바람직하다.

다른 분석법으로서는, 활성화되면 아데닐레이트 시클라제와 같은 효소를 활성화 또는 억제시켜, 예를 들어 cAMP 또는 cGMP 와 같은 세포내 고리형 뉴클레오티드의 수준을 변화시키는 수용체의 활성을 측정하는 과정을 포함할 수 있다. cAMP 또는 cGMP가 결합함에 따라서 활성화시 양이온이 투과되는, 예를 들어 막대형 광수용체 세포 통로 및 후각 뉴런 통로와 같은, 고리형 뉴클레오티드 게이트 이온 통로가 있다[예를 들어, Altenhofen 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:9868-9872(1991) 및 Dhallan 등의 문헌, Nature 347:184-187(1990)]. 수용체가 활성화되어, 고리형 뉴클레오티드 수준을 감소시키는 경우, 상기 분석법에서 세포에 수용체 활성화 조절 화합물을 첨가하기 이전에, 예를 들어 폴스콜린과 같은 세포내 고리형 뉴클레오티드 수준을 증가시키는 제제에 세포를 노출시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 유형의 분석법에 대한 세포는 숙주 세포를 고리형 뉴클레오티드 게이트 이온 통로, GPCR 포스파타아제 및 수용체를 암호화하는 DNA(예를 들어, 임의의 글루타메이트 수용체, 무스카린 아세틸콜린 수용체, 도파민 수용체, 세로토닌 수용체 등)로 공동 형질감염시켜 제조될 수 있으며, 이것이 활성화되면 세포질내 고리형 뉴클레오티드 수준을 변화시킨다.

하나의 구체예에서, GPCR-B3 활성은 포스포리파아제 C 신호 정보 전달 경로에 대한 수용체와 결합하는 무차별적 G 단백질을 포함하는 이종 세포에서 GPCR-B3을 발현시킴으로써 측정될 수 있다[Offermanns & Simon, J.Biol. Chem. 270:15175-15180(1995)]. 경우에 따라서 세포주는 HEK-293(천연적으로 GPCR-B3을 발현하지 않음)이고, 무차별한 G 단백질은 Gα15이다[Offermanns & Simon, 상기 문헌 참조]. 미각 정보 전달 과정의 조절은 세포내 Ca²⁺ 수준의 변화량을 측정함으로써 분석될 수 있으며, 상기 변화는 GPCR-B3과 관련된 분자를 투여함으로써 GPCR-B3 신호 정보 전달 경로의 조절에 따른 반응 변화이다. Ca²⁺ 수준의 변화량은 경우에 따라 형광 Ca²⁺ 지표 염료 및 형광계 화상화 방법을 통해 측정될 수도 있다.

하나의 구체예에서, 세포내 cAMP 또는 cGMP의 변화량은 면역분석법을 통하여 측정될 수 있다. Offermanns & Simon, J. Biol.Chem. 270:15175-15180(1995)에 기술된 방법은 cAMP의 수준을 측정하는데에 사용될 수 있다. 또한 Felley-Bosco 등의 문헌[Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. 11:159-164(1994)]에 기술된 방법은 cGMP의 수준을 측정하는데에 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, cAMP 및/또는 cGMP 측정용 분석 키트는 본원에 참고 문헌으로서 첨부되어 있는 미국 특허 제4,115,538호에 기술되어 있다.

다른 구체예에서, 포스파티딜 이노시톨(PI) 가수 분해는 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 미국 특허 제5,436,128호에 따라서 분석될 수 있다. 간단히 말해서, 상기 분석법은 세포들을 48 시간 또는 그 이상의 시간 동안 ³H-미오이노시톨로 표지화하는 과정을 포함한다. 표지된 세포들은 1 시간 동안 시험 화합물로 처리된다. 처리된 세포들은, 이노시톨 포스페이트를 이온 교환 크로마토그래피로 분리하고 신틸레이션 계수법으로 정량한 후, 클로로포름-메탄올-물내에서 용균 및 추출된다. 폴딩 자극은 작용물질 존재하에서의 cpm 대 완충 대조군의 존재하에서의 cpm 의 비율을 계산함으로써 측정된다. 이와 유사하게, 폴딩 억제는 길항물질의 존재하에서의 cpm 대 완충액 대조군(작용물질을 함유할 수 있거나 또는 함유할 수 없는)의 존재하에서의 cpm의 비율을 계산함으로써 측정된다.

다른 구체예에서, 전사 수준은 신호 전달에 시험 화합물이 미치는 효과를 평가하기 위해 측정될 수 있다. 목적 단백질을 함유하는 숙주 세포를 임의의 상호 작용을 수행하기에 충분한 시간 동안 시험 화합물과 접촉시킨 후, 유전자 발현 수준을 측정한다. 이러한 상호 작용을 수행하는 시간의 양은, 수행 시간 및 시간의 함수로서 전사 수준을 측정함으로써 실험적으로 결정될 수 있다. 전사의 양은 당 업계의 숙련자에게 적당한 것으로 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질의 mRNA 발현은 노던 블롯을 수행하여 검출될 수 있거나 또는 이들의 폴리펩티드 산물은 면역분석법을 사용하여 동정될 수 있다. 이와는 달리, 리포터 유전자를 사용하는 전사계 분석법은, 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 미국 특허 제5,436,128호에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 상기 리포터 유전자는, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 개똥 벌레의 루시퍼라아제, 박테리아 루시퍼라아제, β갈락토시다아제 및 알칼리성 포스파타아제일 수 있다. 뿐만 아니라, 목적 단백질은 녹색 형광성 단백질과 같은 2차 리포터에 부착됨으로써 간접 리포터로서 사용될 수 있다[예를 들어, Mistili & Spector, Nature Biotechnology 15:961-964(1997) 참조].

이후 전사량은 시험 화합물 부재하에서 동일한 세포내에서의 전사량과 비교될 수 있으며, 또는 목적 단백질이 존재하지 않는 실질적으로 동일한 세포내에서의 전사량과 비교될 수도 있다. 실질적으로 동일한 세포는 재조합 세포가 제조되지만 이종 DNA 를 도입하였어도 변형되지 않는, 동일 세포로부터 얻어질 수 있다. 전사량에 있어서의 임의의 차이는 시험 화합물이 목적 단백질의 활성을 임의의 방식으로 변형시킨다는 사실을 시사한다.

B. 조절인자

GPCR-B3의 조절인자로서 시험된 화합물들은 임의의 작은 화학적 화합물 또는, 예를 들어 단백질, 당, 핵산 또는 지질과 같은 생물학적 실재물일 수 있다. 이와는 달리, 조절인자는 유전학적으로 변형된 형태의 GPCR-B3일 수 있다. 통상적으로, 시험 화합물은 작은 화학 분자 및 펩티드이다. 본질적으로, 수성 또는 유기 용액내(특히 DMSO 계)에 용해될 수 있는 화합물이 빈번히 사용되지만, 임의의 화학적 화합물이 본 발명의 분석법에 있어서 유효한 조절인자 또는 리간드로서 사용될 수 있다. 상기 분석법은 분석 단계들을 자동화 시키고 분석이 용이한 임의의 편리한 근원으로부터 화합물을 제공함으로써 거대한 화학적 라이브러리를 검색하도록 디자인되는데, 이때 상기 단계들은 통상적으로는 동시에 수행[예를 들어, 자동 분석법에서 미세 적정 플레이트상에 미세 적정 방식으로]된다. 시그마(미국 미조리주 세이트루이스), 알드리치(미국 미조리주 세이트루이스), 시그마-알드리치(미국 미조리주 세이트루이스), 플루카 케미카-바이오케미카 어널러티카(스위스 부흐스)등과 같은 것들을 포함하는 다수의 화학적 화합물의 공급원이 존재한다는 사실을 이해할 것이다.

하나의 바람직한 구체예에서, 고처리량 검색 방법은 다수의 유효한 치료 화합물(유효 조절인자 또는 리간드 화합물)을 함유하는 조합성 화학 물질 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 이러한 "조합성 화학 라이브러리(combinatorial chemical libraries)" 또는 "리간드 라이브러리"는, 이후 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 분석법에서 검색되어, 목적 특성 활성을 나타내는 라이브러리 일원들(구체적으로 화학종 또는 하위 클래스)을 동정할 수 있다. 그러므로 동정된 화합물은 종래의 "선도 화합물(lead compound)"로서 사용될 수 있으며 또는 이들 자체가 유효한 또는 실질적인 치료제로서 사용될 수 있다.

조합성 화학 라이브러리는, 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의하여, 시약과 같은 다수의 화학적 "조립 블록(building block)" 을 조합함으로써 생성된 다양한 화학적 화합물의 모음이다. 예를 들어, 폴리펩티드 라이브러리와 같은 선형의 조합성 화학적 라이브러리는 주어진 화합물의 길이(즉, 폴리펩티드 화합물의 아미노산의 수)에 대해서 가능한 모든 방법으로 화학적 조립 블럭(아미노산)의 세트를 조합함으로써 형성된다. 화학적 조립 블럭의 이러한 조합성 혼합과정을 통하여 수백만 가지의 화학적 화합물이 합성될 수 있다.

조합성 화학 라이브러리의 제조 및 검색 방법은 당 업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 조합성 화학 라이브러리는 펩티드 라이브러리[예를 들어, 미국 특허 제5,010,175호, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493(1991) 및 Houghton 등의 문헌, Nature 354:84-88(1991)참조]를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 화학적으로 다양한 라이브러리를 생성하는 기타의 화학 물질도 사용될 수 있다. 이러한 화학 물질들로서는 펩토이드(예를 들어, PCT 공개 공보 WO 91/19735호), 암호화된 펩티드(예를 들어, PCT 공개 공보 WO 93/20242호), 랜덤한 생체 올리고머(예를 들어, PCT 공개 공보 WO 92/00091호), 벤조디아제핀(예를 들어, 미국 특허 제 5,288,514호), 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드와 같은 전환성 올리고머(diversomer)(Hobbs 등의 문헌, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913(1993)), 비닐성 폴리펩티드(vinylogous polypeptides)(Hagihara 등의 문헌, Amer. Chem. Soc. 114:6568(1992)), 글루코즈 골격의 비펩티드성 펩티드 유사체(nonpeptidal peptidomimetics)(Hirschmann 등의 문헌, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218(1992)), 작은 화합물 라이브러리의 유사성 유기 합성(Chen 등의 문헌, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661(1994)), 올리고카바메이트(Cho 등의 문헌, Science 261:1303(1993)) 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell 등의 문헌, J.Org. Chem. 59:658(1994), 핵산 라이브러리(Ausubel, Berger and Sambrook, 상기 문헌 참조), 펩티드 핵산 라이브러리(예를 들어, 미국 특허 제5,539,083호 참조), 항체 라이브러리(예를 들어, Vaughn 등의 문헌, Nature Biotechnology, 14(3):309-314(1996)) 및 PCT/US96/10287 참조), 탄수화물 라이브러리(예를 들어, Liang 등의 문헌, Science, 274:1520-1522(1996) 및 미국 특허 제5,593,853호), 작은 유기 분자 라이브러리(예를 들어, 벤조디아제핀, Baum C & EN, Jan. 18, p33(1993), 이소프레노이드(미국 특허 제5,569,588호), 티아졸리디논 및 메타티아자논(미국 특허 제5,549,974호), 피롤리딘(미국 특허 제5,525,735 호 및 제5,519,134 호), 모폴리노 화합물(미국 특허 제5,506,337호), 벤조디아제핀(미국 특허 제5,288,514호) 등)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

조합성 라이브러리의 제조 장치는 상업적으로 시판되고 있다[예를 들어, 357 MPS, 390 MPS, Advaced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA 참조]. 뿐만 아니라, 다수의 조합성 라이브러리 또한 이들 자체가 상업적으로 시판되고 있다[예를 들어, ComGenex, Princeton, N.J. Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, 등].

C. 고체상 및 가용성 고처리량 분석법

본 발명의 하나의 구체예에서는 리간드 결합 도메인, 세포외 도메인, 경막 도메인(예를 들어, 7개의 경막 영역 및 세포질 루프를 포함하는 도메인), 경막 도메인 및 세포질 도메인, 활성화 부위, 서브유닛 결합 영역 등과 같은 도메인 ; 키메라 분자를 제조하기 위하여 이종 단백질과 공유적으로 결합된 도메인 ; GPCR-B3 ; 천연 또는 재조합 형태의, GPCR-B3 발현 세포 또는 조직 등의 분자를 사용한 가용성 분석을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은, 도메인, 키메라 분자, GPCR-B3, 또는 GPCR-B3 발현 세포 또는 조직이 고체상 기질에 부착될 경우, 고처리량의 방식으로 고상계 시험관내 분석법을 제공한다.

본 발명의 고처리량 분석법에 있어서, 수 천개 이상의 상이한 조절인자 또는 리간드를 하루에 검색할 수 있다. 특히 미세 적정 플레이트의 각각의 웰은 선택된 유효 조절인자에 대해서 독립적인 분석법을 수행할 수 있으며, 또는 농도나 항온 처리 시간 효과가 관찰되면, 5∼10 개의 웰마다 단일의 조절인자를 시험할 수 있다. 그러므로, 단일 표준 미세 적정 플레이트는 약 100개(예를 들어 96개)의 조절인자를 분석할 수 있다. 만일 1536 개의 웰을 보유하는 플레이트를 사용할 경우, 단일 플레이트는 약 100∼약 1500개의 상이한 화합물을 용이하게 분석할 수 있다. 매일 몇몇 상이한 플레이트들을 분석할 수 있으며 ; 약 6000∼20,000 개 이상의 상이한 화합물을 검색하는 분석법은 본 발명의 통합 시스템을 사용하는 경우 수행 가능하다. 최근들어, 시약 조작에 대한 미소 유체 접근법이, 예를 들어 칼리퍼 테크놀러지(미국 캘리포니아주 팔로알토)에 의하여 개발된 바 있다.

목적 분자는 공유적 또는 비공유적 결합, 예를 들어 태그에 의하여, 직접적 또는 간접적으로, 고체상 성분과 결합할 수 있다. 상기 태그는 다수의 성분들중 임의의 것일 수 있다. 일반적으로 상기 태그와 결합하는 분자(태그 결합제)는 고체 지지체상에 고정되며, 태깅된 목적 분자(예를 들어, 목적 미각 정보 전달 분자)는 태그와 태그 결합제의 상호 작용에 의해서 상기 고체 지지체상에 부착된자.

문헌에 상세히 기술되어 있는 공지의 분자들의 상호 작용을 기초로 하여, 다수의 태그 및 태그 결합제들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 태그가 천연 결합제, 예를 들어 비오틴, 단백질 A, 또는 단백질 G인 경우, 적당한 태그 결합제들(아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 면역글로블린의 Fc 영역 등)과 함께 사용될 수 있다. 또한 비오틴과 같은 중성 결합제를 보유하는 분자에 대한 항체들과 적당한 태그 결합제들은 널리 이용 가능하다[SIGMA Immunochemicals 1998, catalogue SIGMA, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재].

이와 유사하게, 임의의 햅텐성 또는 항원성 화합물이 적당한 항체와 함께 사용되어 태그/태그 결합제 쌍을 형성할 수 있다. 수 천 가지의 특정 항체들이 상업적으로 시판중에 있으며 다수의 부가적 항체들에 관하여는 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 일반적인 형태에 있어서, 태그는 1차 항체이며 태그 결합제는 상기 제1 항체를 인지하는 2차 항체이다. 항체-항원 상호 작용에 더하여, 수용체-리간드 상호 작용은 또한 태그 및 태그 결합제 쌍으로서 적당하다. 예를 들어, 세포막 수용체의 작용물질 및 길항물질으로서는, 예를 들어, 트랜스페린, c-키트, 바이러스 수용체 리간드, 시토킨 수용체, 케모카인 수용체, 인터루킨 수용체, 면역글로블린 수용체 및 항체, 카데린군, 인테그린군, 셀렉틴군 등과 같은, 세포 수용체-리간드의 상호 작용 등이 있다[예를 들어 Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts BookI(1993)]. 이와 유사하게, 독소 및 독, 바이러스 에피토프, 호르몬(예를 들어, 아편, 스테로이드 등), 세포내 수용체(예를 들어, 스테로이드, 티로이드 호르몬, 레티노이드 및 비타민 D를 포함하는 다수의 작은 리간드; 펩티드의 효과를 매개하는 수용체), 약물, 레시틴, 당, 핵산(선형 및 고리형 중합체 형태), 올리고당류, 단백질, 포스포리피드 및 항체들은 모두 다수의 세포 수용체와 상호 작용할 수 있다.

폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레아, 폴리아미드, 폴리에틸렌이민, 폴리아릴렌 설파이드, 폴리실록산, 폴리이미드 및 폴리아세테이트와 같은 합성 중합체가 적당한 태그 또는 태그 결합제를 형성할 수 있다. 본원에 개시된 사항을 기초로 숙련자에게 명확할 수 있는 바와 같이, 다수의 다른 태그/태그 결합제 쌍들도 또한 본원에 기술된 분석 시스템에 유용할 수 있다.

펩티드, 폴리에테르 등과 같은 일반적인 링커들 또한 태그로서 사용될 수 있으며, 약 5∼200 아미노산의 길이인 폴리 Gly 서열과 같은 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이러한 유동성 링커들은 당 업계의 숙련자에게 공지된 것이다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커들은 쉬어워터 폴리머즈 인코포레이티드[미국 알라바마주 헌츠빌]로부터 시판되고 있다. 상기 링커들은 임의적으로는 아미드 결합, 설프히드릴 결합 또는 이종 기능성 결합을 보유할 수 있다.

태그 결합제들은 현재 사용되고 있는 다수의 방법들중 임의의 방법을 사용하여 고체 기질상에 고정된다. 고체 기질은 일반적으로 상기 기질의 전부 또는 일부를, 상기 태그 결합제의 일부와 반응성인 표면에 화학기를 고정시키는 화학 시약에 노출시켜 유도 또는 기능화된다. 예를 들어, 더욱 긴 사슬 부분에 부착시키기에 적당한 기들로서는 아민, 히드록실, 티올 및 카르복실기를 포함한다. 아미노알킬실란 및 히드록시알킬실란은 유리 표면과 같은 다수의 표면을 기능화시키는데에 사용될 수 있다. 이러한 고체상 생체 중합체 배열의 구성물에 관하여는 문헌에 상세히 기술되어 있다. 예를 들어, Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154(1963)(예를 들어 펩티드의 고체상 합성에 관하여 기술) ; Geysen 등의 문헌, J.Immun.Meth. 102:259-274(1987)(핀 상의 고체 상 성분의 합성에 관하여 기술) ; Frank & Doring, Tetrahedron 44:6031-6040(1988)(셀룰로즈 디스크상 다수의 펩티드 서열의 합성에 관하여 기술) ; Foder 등의 문헌, Science, 251:767-777(1991) ; Sheldon 등의 문헌, Clinical Chemistry 39(4):718-719(1993) ; 및 Kozal 등의 문헌, Nature Medicine 2(7):753-759(1996)(모두 고체상에 고정된 생체 중합체 배열에 관하여 기술). 태그 결합제를 기질에 고정화시키는 비화학적 접근 방법에는 열, UV 복사선등에 의한 교차 결합과 같은, 기타의 일반적인 방법들을 포함한다.

D. 컴퓨터를 기초로 한 분석법

GPCR-B3 활성을 조절하는 화합물을 분석하는 다른 분석법으로서는 컴퓨터 보조 약물 디자인을 포함하는데, 여기서 컴퓨터 시스템은 아미노산 서열에 의하여 암호화되는 구조 정보를 기초로 하여 GPCR-B3의 3 차원적 구조를 산출해 내는데에 사용된다. 입력 아미노산 서열은 컴퓨터 프로그램으로 이미 확립시켜 놓은 알고리즘과 직접적 및 능동적으로 상호작용하여 단백질의 2 차원, 3 차원 및 4 차원 구조 모델을 만들어 낸다. 이후 상기 단백질 구조의 모델은, 예를 들어 리간드와 결합하는 능력을 보유하는 구조의 영역을 동정하도록 평가된다. 이들 영역은 이후 상기 단백질에 결합하는 리간드를 동정하는데에 사용된다.

상기 단백질의 3 차원적 구조 모델은 10 개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 단백질 아미노산 서열 또는 GPCR-B3 폴리펩티드를 암호하는 해당 핵산 서열을 컴퓨터 시스템에 입력함으로써 도출될 수 있다. 상기 폴리펩티드 암호 핵산의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 3 또는 서열 번호 4 내지 6 그리고 이들의 보전적으로 변형된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 상기 아미노산 서열은 단백질의 1차 서열 또는 부분서열을 나타내는데, 이는 단백질의 구조 정보를 암호한다. 상기 아미노산 서열의 10 개 이상의 잔기들(또는 10 개의 아미노산을 암호하는 뉴클레오티드 서열)이 컴퓨터 키보드, 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스켓, 테이프, 카트리지 및 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM), 인터넷 사이트, 또는 RAM 에서 공급받은 정보를 포함하나, 이에 한정되지는 않는, 컴퓨터 판독성 기재로부터 컴퓨터 시스템에 입력된다. 이후 단백질의 3차원 구조 모델은, 당 업계의 숙련자에게 공지된 소프트웨어를 사용하여 아미노산 서열과 컴퓨터 시스템의 상호 작용에 의하여 작제된다.

아미노산 서열은 목적 단백질의 2 차, 3 차 및 4 차 구조를 형성하는데에 필요한 정보를 암호하는 1차 구조를 나타낸다. 소프트웨어는 구조적 모델을 작제하는데에 1 차 서열에 의하여 암호화되는 임의의 변수들을 고려하도록 되어 있다. 상기 변수를 "에너지 조건(energy terms)" 이라 하며, 주로 정전기적 퍼텐셜, 소수성 퍼텐셜. 용매 접촉 표면 및 수소 결합을 포함한다. 2 차 에너지 조건으로서는 반 데르 발스 퍼텐셜을 포함한다. 생물학적 분자는 누진적 방식으로 에너지 조건을 최소화시키는 구조들을 형성한다. 따라서 컴퓨터 프로그램은 1 차 구조 또는 아미노산 서열에 의하여 암호화되는 상기 조건들을 이용하여 2차 구조적 모델을 작제한다.

상기 2차 구조에 의하여 암호화되는 단백질의 3 차 구조는 이후 2차 구조의 에너지 조건을 기초로 하여 형성된다. 이 시점에서 사용자는 상기 단백질이 막 결합형인지 또는 가용성인지, 이의 신체내 위치, 그리고 이의 세포 위치, 예를 들어 세포질, 표면 또는 핵과 같은 부가적인 변수들을 입력시킬 수 있다. 2 차 구조의 에너지 조건과 함께 상기 변수들은 3 차 구조의 모델을 형성하는데에 사용된다. 3차 구조를 모델화시키는데에 있어서, 컴퓨터 프로그램은 2 차 구조의 소수성 표면과 변수들을 매치시키고, 2 차 구조의 친수성 표면과 변수들을 매치시키게 된다.

일단 상기 구조가 형성되면, 유효한 리간드 결합 부위는 상기 컴퓨터 시스템에 의하여 동정된다. 유효한 리간드에 대한 3 차원 구조는 전술한 바와 같이, 화합물의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 또는 화학식을 도입시킴으로써 작제된다. 이후 유효한 리간드의 3차원 구조는 GPCR-B3 단백질과 비교되어 GPCR-B3에 결합하는 리간드를 동정하게 된다. 상기 단백질과 리간드 사이의 결합 친화도는 어떠한 리간드가 단백질과 결합할 가능성이 증가되었는지 여부를 결정하는 에너지 조건들을 사용하여 결정된다.

컴퓨터 시스템은 또한 GPCR-B3 유전자의 돌연 변이, 다형성 변형체, 대립유전자 및 종간 상동체를 검색하는데에 사용된다. 이러한 돌연 변형체들은 질환 상태 또는 유전적 형질과 관련될 수 있다. 전술한 바와 같이, GeneChip™ 및 이와 관련된 기술은 또한 돌연 변이, 다형성 변형체 및 종간 상동체를 검색하는데에도 사용될 수 있다. 일단 상기 변형체가 동정되면, 진단 분석법을 사용하여 이러한 돌연 변이 유전자를 보유하고 있는 환자들을 확인할 수 있다. 돌연 변이 GPCR-B3 유전자의 확인은, 서열 번호 1 내지 3 또는 서열 번호 4 내지 6, 그리고 이들의 보존적으로 변형된 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 GPCR-B3을 암호하는 제1 핵산 또는 아미노산 서열의 입력을 수용하는 것을 포함한다. 상기 서열은 전술한 바와 같이 컴퓨터 시스템에 도입된다. 이후 제1 핵산 또는 아미노산 서열이 이들 제1 서열과 실질적으로 동일한 제2 핵산 또는 아미노산 서열과 비교된다. 상기 제2 서열은 전술한 바와 같은 방식으로 컴퓨터 시스템에 도입된다. 일단 상기 제1 서열 및 제2 서열이 비교되면, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열간 차이가 확인된다. 이러한 서열들은 GPCR-B3 유전자의 대립유전자간 차이점, 그리고 질환의 상태와 유전적 형질과 관련된 돌연 변이를 나타낼 수 있다.

Ⅷ. 키트

GPCR-B3 및 이의 상동체들은 미각 수용체 세포, 법의학적 및 부계 형질 결정, 그리고 미각 정보 전달 과정을 관찰하는 도구로서 유용하다. GPCR-B3 프로브 및 프라이머와 같은 GPCR-B3 핵산과 특이적으로 하이브리드화하는 GPCR-B3 특이적 시약과, 예를 들어 GPCR-B3 항체와 같은 GPCR-B3 단백질에 특이적으로 결합하는 GPCR-B3 특이적 시약은 미각 세포 발현 및 미각 정보 전달 과정 조절을 관찰하는데에 사용된다.

시료내 GPCR-B3 DNA 및 RNA의 존재에 대한 핵산 분석법은 당 업계의 숙련자들에게 공지되어 있는 여러 분석법을 포함하며, 예컨대 서던 분석법, 노던 분석법, 도트 블롯, RNase 보호법, S1 분석법, PCR 및 LCR 과 같은 증폭 기술과 동일계 하이브리드화법 등이 있다. 예를 들어 동일계 하이브리드화법에 있어서, 후속적인 해석법 및 분석법을 위하여 세포의 형태를 보존하면서 세포내에서의 하이브리드화 과정에 유용하도록, 표적 핵산은 이의 세포 환경으로부터 분리된다. 이하의 문헌들은 상기 동일계 하이브리드화 법에 대한 개괄적인 설명을 제공한다: Singer 등의 문헌, Biotechniques 4:230-250(1986) ; Hasse 등의 문헌, Methods in Virology, vol.Ⅶ pp189-226(1984) ; 및 Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach (Hames 등의 문헌, 1987년판). 뿐만 아니라, GPCR-B3 단백질은 전술한 바와 같은 다수의 면역분석법으로 검출될 수 있다. 이때 시험 시료는 통상적으로 양성 대조군(예를 들어, 재조합 GPCR-B3을 발현하는 시료) 및 음성 대조군 모두와 비교된다.

본 발명은 또한 GPCR-B3 조절인자를 검색하는 키트를 제공한다. 이러한 키트들은 용이하게 입수할 수 있는 재료들과 시약들로부터 제조될 수 있다. 예컨대, 이러한 키트는 GPCR-B3, 반응관 및 GPCR-B3 활성 시험에 관한 지침 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 임의적으로, 상기 키트는 생물학적으로 활성인 GPCR-B3을 함유한다. 각종 키트 및 구성 요소들은 키트의 사용자와 사용자의 특정 요구 사항에 따라서, 본 발명에 의하여 제조될 수 있다.

Ⅸ. 투여 방법 및 약학 조성물

미각 조절인자는 생체내에서 미각을 조절하기 위해서 포유 동물 개체에 직접적으로 투여될 수 있다. 투여 방법은 조절 화합물을 처리하고자 하는 조직, 예컨대 혀 또는 입과 궁극적으로 접촉하도록 도입시키는데에 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 의한다. 미각 조절인자는 임의의 적당한 방식으로, 경우에 따라서 약학적 허용 담체와 함께 투여된다. 이와 같은 조절인자를 투여하는 적당한 방법은 이용가능하고 당 업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있으며, 특정 조성물을 투여하는데에 1 이상의 경로가 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 다른 경로보다 더욱 신속하고 더욱 효과적인 반응을 제공한다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 부분적으로는 투여될 특정 조성물에 의하여, 그리고 상기 조성물을 투여하는데에 사용되는 특정 방법에 의하여 결정된다. 따라 서, 본 발명의 약학 조성물의 적당한 제형들이 존재한다[예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 제17판, 1985 참조].

미각 조절인자는, 단독으로 또는 기타 적당한 성분들과 조합하여, 흡입법에 의하여 투여될 수 있는 에어로졸 제제(즉, "분무화"될 수 있음)로 제조될 수 있다. 에어로졸 제제는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압될 수 있는 분사제에 첨가될 수 있다.

투여에 적당한 제제로서는 항산화제, 완충액, 박테리아 발육 저지제 및 상기 제제를 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 용액, 등장성 멸균 용액과, 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 본 발명을 수행함에 있어서, 조성물은, 예를 들어 경구적, 국소적, 정맥내, 복강내, 방광내 또는 초내로 투여될 수 있다. 임의적으로, 상기 조성물은 경구적 또는 비강내에 투여된다. 화합물의 제제들은 1회 투여 또는 수회 투여 방식의 밀봉된 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알과 같은 용기에 넣을 수 있다. 용액 및 현탁액은 전술한 바와 같은 멸균 분말, 과립 및 정제로 제조될 수 있다. 조절인자는 또한 제조되어 있는 식품 또는 약물의 일부로서 투여될 수도 있다.

본 발명의 명세서내에 기재되어 있는, 환자에게 투여되는 투여량은 개체가 시간이 경과함에 따라서 유익한 효과를 나타내기에 충분해야 한다. 상기 투여량은 사용된 특정 미각 조절인자의 효능과 검체의 증상 뿐 아니라 체중 또는 처리될 부위의 표면적에 의하여 결정될 것이다. 투여량은 또한 특정 개체에 특정 화합물 또는 벡터를 투여함에 따라 수반될 수 있는 임의의 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의하여 결정될 것이다.

투여하고자 하는 조절인자의 유효량을 결정하는데에 있어서 치료의사는 순환하고 있는 혈장에서의 조절인자의 수준 , 조절인자의 독성 및 항 조절인자 항체의 생산을 평가할 수 있다. 일반적으로, 조절인자의 투여량은 통상의 검체에 대하여 약 1 ng/㎏∼10 ㎎/㎏ 이다.

투여시, 본 발명의 미각 조절인자는 검체의 체중과 개체의 전반적인 건강 상태에 따라서 적용될 때, 조절인자의 LD-50 및 다양한 농도의 억제제에 의한 부작용으로 결정되는 비율로 투여될 수 있다. 투여 방법은 1회 투여 방식 또는 분할 투여 방식으로 수행될 수 있다.

각각의 공개 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 독립적으로 참고 문헌으로서 첨부되어 있는 것으로 표시되어 있는 바와 같이, 본 명세서중에 인용된 모든 공개 공보와 특허 출원들은 본원에 참고 문헌으로서 첨부되어 있다.

이해를 명확히 하기 위해서 전술한 발명은 예시 및 실시예에 의하여 더욱 상세히 기술되어 있으나, 본 발명의 교시에 비추어 당 업계의 통상의 숙련자는 이하 첨부된 청구 범위에 나타난 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않도록 임의로 변화 및 변형을 가할 수 있다는 사실을 용이하게 파악할 수 있을 것이다.

하기 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공된 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 당업자라면 거의 유사한 결과를 산출하도록 변화 또는 변형시킬 수 있는 중요하지 않은 각종 매개 변수를 알 것이다.

실시예 I: GPCR-B3의 클로닝 및 발현

미각 정보 전달은 혀 및 구개 상피 세포의 미뢰에서 발견되는 미각 수용체 세포에서 발생하기 때문에, 전길이 cDNA 라이브러리는 래트의 미각 유두로부터 형성하였다. 이 라이브러리는, 유도성 1ZAP 벡터(스트라타젠 인코포레이티드; Hoon & Ryba, J. Dent. Res. 76:831-838(1997))를 사용하여 수 백개의 래트 유곽 유두에서 분리된 폴리-A+ RNA의 올리고 dT 프라이밍 후, 표준 분자 생물학 절차에 따라 제조하였다[예컨대, Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology(1995) 참조]. 단일 세포 및 단일 미뢰 cDNA 라이브러리의 콜렉션은, Dulac & Axel의 문헌[Cell 83:195-206(1995)]의 방법에 따라 래트 및 마우스 유곽, 엽상 및 용상 유두에서 개별적으로 분리된 미각 수용체 세포 및 미뢰로부터 형성하였다. 미뢰 및 단일 미각 수용체 세포는 어른 래트 및 마우스로부터 혀 상피세포의 미세 절개 및 효소 분해로 분리하였다. 미뢰 제제에서 세포 용해 효율을 최대화하기 위해서, 세포용해 완충액 부피를 10배 증가시켰다(Dulac & Axel, 상기 문헌 참조).

GPCR-B3은, 먼저 미각 조직에서 발현되는 서열이 풍부한 감법 라이브러리를 형성하여 1ZAP 유곽 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 미각 수용체 세포가 제거된 cDNA 라이브러리의 작제 및 초기 분석은 Hoon & Ryba 등의 상기 문헌에 개시된 바와 같이 수행하였다. 미각 특이적 전사체의 추가의 농축은 비미각 cDNA 프로브를 사용하여 cDNA 클론을 도트-블롯 검색하여 달성하였다. 비미각 프로브는 미뢰가 없는 혀의 상피 세포 조직, 근육, 간 및 뇌 조직을 포함하였다. 개개의 하이브리드화 프로브는 제1 가닥의 cDNA를 제조한 다음, Ausubel 등의 상기 문헌에 개시된 무작위 프라이밍 방법을 사용하여 표지함으로써 제조하였다. 하이브리드화 조건 및 세척 조건은, 하이브리드화의 경우 65℃, 2 ×SSC이고, 세척 조건의 경우 65℃, 0.1 ×SSC였다.

미각 및 비미각 조직을 이용한 차등 검색에 있어서 미각 조직 농축을 나타내는 모든 cDNA를, 표준 디데옥시-종결 방법과 자동화된 ABI 서열 결정 기기를 사용한 DNA 서열 결정 분석을 위해 취하였다. 각종 상동성 및 구조 예측 프로그램(예컨대, blast의 경우에는, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Tempred의 경우에는, http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-search/struc-predict.html)을 사용하여 DNA 서열에 대해 데이타 분석을 수행하였다. 신규 서열, 공지된 시그널링 성분과 일부 유사성이 있는 서열, 다중 예측된 경막 도메인을 보유한 서열, 또는 SH2, SH3, PDZ 등과 같은 기존의 모티프를 보유한 서열(예컨대 pfam에 대해서는 http://pfam.wustl.edu/ 참조)을 암호화하는 개개의 cDNA 클론을 추가 분석에 대한 후보로서 선택하였다.

후보 cDNA는 래트의 혀 조직 절편에 대한 동일계 하이브리드화로 미각 세포 발현에 대해 분석하였다. 조직은 어른 래트로부터 얻었다. 새로 동결시킨 절편(14 mm)을 실란화시킨 슬라이드에 부착시키고, Ryba & Tirindelli의 문헌[Neuron 19:371-379(1997)]에 개시된 바와 같이 동일계 하이브리드화를 위해 제조하였다. 모든 동일계 하이브리드화는 고 엄중도(5 ×SSC, 50% 포름아미드, 72℃)에서 수행하였다. 단일 표지 검출의 경우, Ryba & Tirindelli의 상기 문헌에 개시된 바와 같이 디곡시게닌 및 표준 색원 기질(뵈링거 만하임)에 대한 알칼리-포스파타제 접합된 항체를 사용하여 시그널을 형성하였다. 부분적 DNA 서열 결정 반응은 ∼2000 감법 및 단일 세포 cDNA 클론에서 수행하고, 동일계 하이브리드화는 ∼400 상이한 후보 cDNA로 수행하였다. 이 검색으로 GPCR-B3의 3' 단편을 암호화하는 단일 클론을 비롯한 미각 수용체 세포에서 발현되는 다수의 유전자를 확인하였다.

전길이 래트 GPCR-B3은 표준 플라크 하이브리드화 프로토콜에 따라 1ZAP 래트 유곽 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다(Ausubel 등, 상기 문헌 참조). 대략 2.5×10⁶ 클론을 고밀도로 LB 평판(∼100,000 파지/평판)에서 평판배양하고, 복제 필터를 방사능표지된 GPCR-B3 프로브와 고엄중도(65℃, 2 ×SSC)에서 하이브리드화시켰다. 양성 클론을 취하고, 재시험하고, 정제한 다음 DNA 제한 지도 작성 및 서열 결정 분석으로 특성 규명하였다.

몇개의 전길이 GPCR-B3 클론을 분리하고 특성규명하였다(예컨대, 서열 번호 4∼6과 이들이 암호화하는 아미노산 서열인 서열 번호 1∼3). 래트 GPCR-B3의 마우스 종간 상동체는 저 및 중간 엄중도(48℃, 7×SSC 및 55℃, 5 ×SSC)에서 마우스 게놈 Bac 및 l 라이브러리(게놈 시스템)를 검색하여 분리하였다. 제한 지도작성 및 DNA 서열 결정으로 클론을 특성 규명하였다. 마우스 유곽 유두 및 엽상 유두에서 분리된 RNA로부터 제조한 제1 가닥 cDNA를 사용하여 RACE 반응(마라톤 키트, 클론테크)을 수행하여 마우스 cDNA를 분리하였다. GPCR-B3의 인간 상동체는 후각 및 시각 수용체와 같은 다른 감각 수용체가 고환에서 발현되는 것을 관찰한 후에 인간 고환 라이브러리(클론테크 인코포레이티드)로부터 분리하였다(Axel & Dulac, 상기 문헌 참조). 세포외 도메인, 7개의 경막 도메인, 세포내 또는 C-말단 도메인을 보여주는 GPCR-B3의 해부학적 지도에 대해서는 도 1 참조.

실시예 II: 웨스턴 블롯 및 동일계 분석

미각 세포에서 GPCR-B3 단백질의 특이적 발현을 입증하기 위해서, 짧은 펩티드 및 GPCR-B3 융합 단백질에 대한 항체를 형성하였다. 이 펩티드는 GPCR-B3 예측된 단백질의 N-말단 또는 C-말단 유래의 18개 아미노산 잔기로 구성되었다(예컨대, 서열 번호 1 및 2 참조). 융합 단백질은 전체 N-말단 도메인 또는 최종 3개의 예측된 경막 분절과 C-말단 영역을 포함하는 GST 융합 폴리펩티드로 구성되었다. 융합체는 표준 분자 기법을 사용하여 형성하였다(Harlow & Lane, Antibodies(1988)). 펩티드는 캐리어 단백질에 융합시키고, 토끼내로 면역화시킨 다음, Cassill 등의 문헌[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:11067-11070(1991)]에 개시된 바와 같이 혈청 친화도 정제 및 분석하였다.

유곽 유두 및 용상 유두로부터 얻은 단백질 균질물의 웨스턴 블롯 분석으로 항체의 특이성에 대해 시험하였다. 블롯은 음성 대조군으로서 간 및 뇌 단백질 추출물을 함유하였다. 면역조직화학을 위해서, 동결된 절펀을 Rybe & Tirindelli의 상기 문헌에 개시된 바와 같이 동일계 하이브리드화를 위해 제조하였으나, 단 차단 반응은 10% 당나귀 면역글로불린, 1% 소 혈청 알부민, 0.3% 트리톤 X-100을 사용하였다. 절편을 12∼18 시간 동안 항-TR1(1:100)의 적절한 희석액에서 항온배양하고, 플루오레세인-접합된 당나귀 항-토끼 2차 항체(잭슨 이뮤노래보러터리)를 사용하여 검출하였다. 미뢰는 F-액틴 마커 BODIPYRTR-X 팔라시딘(몰리큘라 프로브)으로 반대 염색하였다. 이들 연구의 대조군으로서, 항-NCAM 항체를 사용하였다. 아르곤-크립톤 레이저가 있는 레카 TSC 공초점 현미경을 사용하여 형광 영상을 얻었다. 펩티드 면역원으로 항체를 전처리하여 염색을 제거하였다. 웨스턴 블롯 및 동일계 분석에 대해서는 각각 도 2 및 도 3 참조.

SEQUENCE LISTING <110> Zuker, Charles S. Adler, Jon Elliot Lindemeier, Juergen Ryba, Nick Hoon, Mark The Regents of the University of California <120> Nucleic Acids Encoding a G-Protein Coupled Receptor Involved in Sensory Transduction <130> 02307E-088610PC <140> WO PCT/US99/17099 <141> 1999-07-27 <150> US 60/094,465 <151> 1998-07-28 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 840 <212> PRT <213> Rattus sp. <220> <223> rat G-protein coupled receptor B3 (GPCR-B3) <400> 1 Met Leu Phe Trp Ala Ala His Leu Leu Leu Ser Leu Gln Leu Val Tyr 1 5 10 15 Cys Trp Ala Phe Ser Cys Gln Arg Thr Glu Ser Ser Pro Gly Phe Ser 20 25 30 Leu Pro Gly Asp Phe Leu Leu Ala Gly Leu Phe Ser Leu His Gly Asp 35 40 45 Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Leu Val Thr Ser Cys Asp Arg Pro 50 55 60 Asp Ser Phe Asn Gly His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg Phe 65 70 75 80 Thr Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Ser Ala Leu Leu Pro Asn Ile Thr 85 90 95 Leu Gly Tyr Glu Leu Tyr Asp Val Cys Ser Glu Ser Ala Asn Val Tyr 100 105 110 Ala Thr Leu Arg Val Leu Ala Leu Gln Gly Pro Arg His Ile Glu Ile 115 120 125 Gln Lys Asp Leu Arg Asn His Ser Ser Lys Val Val Ala Phe Ile Gly 130 135 140 Pro Asp Asn Thr Asp His Ala Val Thr Thr Ala Ala Leu Leu Gly Pro 145 150 155 160 Phe Leu Met Pro Leu Val Ser Tyr Glu Ala Ser Ser Val Val Leu Ser 165 170 175 Ala Lys Arg Lys Phe Pro Ser Phe Leu Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg 180 185 190 His Gln Val Glu Val Met Val Gln Leu Leu Gln Ser Phe Gly Trp Val 195 200 205 Trp Ile Ser Leu Ile Gly Ser Tyr Gly Asp Tyr Gly Gln Leu Gly Val 210 215 220 Gln Ala Leu Glu Glu Leu Ala Val Pro Arg Gly Ile Cys Val Ala Phe 225 230 235 240 Lys Asp Ile Val Pro Phe Ser Ala Arg Val Gly Asp Pro Arg Met Gln 245 250 255 Ser Met Met Gln His Leu Ala Gln Ala Arg Thr Thr Val Val Val Val 260 265 270 Phe Ser Asn Arg His Leu Ala Arg Val Phe Phe Arg Ser Val Val Leu 275 280 285 Ala Asn Leu Thr Gly Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Asp Trp Ala Ile 290 295 300 Ser Thr Tyr Ile Thr Ser Val Thr Gly Ile Gln Gly Ile Gly Thr Val 305 310 315 320 Leu Gly Val Ala Val Gln Gln Arg Gln Val Pro Gly Leu Lys Glu Phe 325 330 335 Glu Glu Ser Tyr Val Arg Ala Val Thr Ala Ala Pro Ser Ala Cys Pro 340 345 350 Glu Gly Ser Trp Cys Ser Thr Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys His Thr 355 360 365 Phe Thr Thr Arg Asn Met Pro Thr Leu Gly Ala Phe Ser Met Ser Ala 370 375 380 Ala Tyr Arg Val Tyr Glu Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu His 385 390 395 400 Gln Leu Leu Gly Cys Thr Ser Glu Ile Cys Ser Arg Gly Pro Val Tyr 405 410 415 Pro Trp Gln Leu Leu Gln Gln Ile Tyr Lys Val Asn Phe Leu Leu His 420 425 430 Glu Asn Thr Val Ala Phe Asp Asp Asn Gly Asp Thr Leu Gly Tyr Tyr 435 440 445 Asp Ile Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Glu Trp Thr Phe Glu Ile 450 455 460 Ile Gly Ser Ala Ser Leu Ser Pro Val His Leu Asp Ile Asn Lys Thr 465 470 475 480 Lys Ile Gln Trp His Gly Lys Asn Asn Gln Val Pro Val Ser Val Cys 485 490 495 Thr Thr Asp Cys Leu Ala Gly His His Arg Val Val Val Gly Ser His 500 505 510 His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Glu Ala Gly Thr Phe Leu Asn 515 520 525 Met Ser Glu Leu His Ile Cys Gln Pro Cys Gly Thr Glu Glu Trp Ala 530 535 540 Pro Lys Glu Ser Thr Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Glu Phe Leu Ala 545 550 555 560 Trp His Glu Pro Ile Ser Leu Val Leu Ile Ala Ala Asn Thr Leu Leu 565 570 575 Leu Leu Leu Leu Val Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Phe His 580 585 590 Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met Leu 595 600 605 Gly Ser Leu Val Ala Gly Ser Cys Ser Phe Tyr Ser Phe Phe Gly Glu 610 615 620 Pro Thr Val Pro Ala Cys Leu Leu Arg Gln Pro Leu Phe Ser Leu Gly 625 630 635 640 Phe Ala Ile Phe Leu Ser Cys Leu Thr Ile Arg Ser Phe Gln Leu Val 645 650 655 Ile Ile Phe Lys Phe Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr Arg Thr Trp 660 665 670 Ala Gln Asn His Gly Ala Gly Leu Phe Val Ile Val Ser Ser Thr Val 675 680 685 His Leu Leu Ile Cys Leu Thr Trp Leu Val Met Trp Thr Pro Arg Pro 690 695 700 Thr Arg Glu Tyr Gln Arg Phe Pro His Leu Val Ile Leu Glu Cys Thr 705 710 715 720 Glu Val Asn Ser Val Gly Phe Leu Leu Ala Phe Thr His Asn Ile Leu 725 730 735 Leu Ser Ile Ser Thr Phe Val Cys Ser Tyr Leu Gly 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gccctgcaag 420 ggccccgcca catagagata cagaaagacc ttcgcaacca ctcctccaag gtggtggcct 480 tcatcgggcc tgacaacact gaccacgctg tcactaccgc tgccttgctg ggtcctttcc 540 tgatgcccct ggtcagctat gaggcaagca gcgtggtact cagtgccaag cgcaagttcc 600 cgtctttcct tcgtaccgtc cccagtgacc ggcaccaggt ggaggtcatg gtgcagctgc 660 tgcagagttt tgggtgggtg tggatctcgc tcattggcag ctacggtgat tacgggcagc 720 tgggtgtgca ggcgctggag gagctggccg tgccccgggg catctgcgtc gccttcaagg 780 acatcgtgcc tttctctgcc cgggtgggtg acccgaggat gcagagcatg atgcagcatc 840 tggctcaggc caggaccacc gtggttgtgg tcttctctaa ccggcacctg gctagagtgt 900 tcttcaggtc cgtggtgctg gccaacctga ctggcaaagt gtgggtcgcc tcagaagact 960 gggccatctc cacgtacatc accagcgtga ctgggatcca aggcattggg acggtgctcg 1020 gtgtggccgt ccagcagaga caagtccctg ggctgaagga gtttgaggag tcttatgtca 1080 gggctgtaac agctgctccc agcgcttgcc cggaggggtc ctggtgcagc actaaccagc 1140 tgtgccggga gtgccacacg ttcacgactc gtaacatgcc cacgcttgga gccttctcca 1200 tgagtgccgc ctacagagtg tatgaggctg tgtacgctgt ggcccacggc ctccaccagc 1260 tcctgggatg tacttctgag atctgttcca gaggcccagt ctacccctgg cagcttcttc 1320 agcagatcta caaggtgaat tttcttctac atgagaatac tgtggcattt gatgacaacg 1380 gggacactct aggttactac gacatcatcg cctgggactg gaatggacct gaatggacct 1440 ttgagatcat tggctctgcc tcactgtctc cagttcatct ggacataaat aagacaaaaa 1500 tccagtggca cgggaagaac aatcaggtgc ctgtgtcagt gtgtaccacg gactgtctgg 1560 cagggcacca cagggtggtt gtgggttccc accactgctg ctttgagtgt gtgccctgcg 1620 aagctgggac ctttctcaac atgagtgagc ttcacatctg ccagccttgt ggaacagaag 1680 aatgggcacc caaggagagc actacttgct tcccacgcac ggtggagttc ttggcttggc 1740 atgaacccat ctctttggtg ctaatagcag ctaacacgct attgctgctg ctgctggttg 1800 ggactgctgg cctgtttgcc tggcattttc acacacctgt agtgaggtca gctgggggta 1860 ggctgtgctt cctcatgctg ggttccctgg tggccggaag ttgcagcttc tatagcttct 1920 tcggggagcc cacggtgccc gcgtgcttgc tgcgtcagcc cctcttttct ctcgggtttg 1980 ccatcttcct ctcctgcctg acaatccgct ccttccaact ggtcatcatc ttcaagtttt 2040 ctaccaaggt gcccacattc taccgtacct gggcccaaaa ccatggtgca ggtctattcg 2100 tcattgtcag ctccacggtc catttgctca tctgtctcac atggcttgta atgtggaccc 2160 cacgacccac cagggaatac cagcgcttcc cccatctggt gattctcgag tgcacagagg 2220 tcaactctgt aggcttcctg ttggctttca cccacaacat tctcctctcc atcagtacct 2280 tcgtctgcag ctacctgggt aaggaactgc cagagaacta taatgaagcc aaatgtgtca 2340 ccttcagcct gctcctcaac ttcgtatcct ggatcgcctt cttcaccatg gccagcattt 2400 accagggcag ctacctgcct gcggtcaatg tgctggcagg gctgaccaca ctgagcggcg 2460 gcttcagcgg ttacttcctc cccaagtgct atgtgattct ctgccgtcca gaactcaaca 2520 atacagaaca ctttcaggcc tccatccagg actacacgag gcgctgcggc actacctgat 2580 ccactggaaa ggtgcagacg ggaaggaagc ctctcttctt gtgctgaagg tggcgggtcc 2640 agtggggccg agagcttgag gtgtctggga gagctccggc acagcttacg atgtataagc 2700 acgcggaaga atccagtgca ataaagacgg gaagtgtgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa a 2771 <210> 5 <211> 2579 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <223> mouse G-protein coupled receptor B3 (GPCR-B3) <400> 5 tttggccagc atgcttttct gggcagctca cctgctgctc agcctgcagc tggccgttgc 60 ttactgctgg gctttcagct 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cacgtacatc accaatgtgc ccgggatcca 960 gggcattggg acggtgctgg gggtggccat ccagcagaga caagtccctg gcctgaagga 1020 gtttgaagag tcctatgtcc aggcagtgat gggtgctccc agaacttgcc cagaggggtc 1080 ctggtgcggc actaaccagc tgtgcaggga gtgtcacgct ttcacgacat ggaacatgcc 1140 cgagcttgga gccttctcca tgagcgctgc ctacaatgtg tatgaggctg tgtatgctgt 1200 ggcccacggc ctccaccagc tcctgggatg tacctctggg acctgtgcca gaggcccagt 1260 ctacccctgg cagcttcttc agcagatcta caaggtgaat ttccttctac ataagaagac 1320 tgtagcattc gatgacaagg gggaccctct aggttattat gacatcatcg cctgggactg 1380 gaatggacct gaatggacct ttgaggtcat tggttctgcc tcactgtctc cagttcatct 1440 agacataaat aagacaaaaa tccagtggca cgggaagaac aatcaggtgc ctgtgtcagt 1500 gtgtaccagg gactgtctcg aagggcacca caggttggtc atgggttccc accactgctg 1560 cttcgagtgc atgccctgtg aagctgggac atttctcaac acgagtgagc ttcacacctg 1620 ccagccttgt ggaacagaag aatgggcccc tgaggggagc tcagcctgct tctcacgcac 1680 cgtggagttc ttggggtggc atgaacccat ctctttggtg ctattagcag ctaacacgct 1740 attgctgctg ctgctgattg ggactgctgg cctgtttgcc tggcgtcttc acacgcctgt 1800 tgtgaggtca gctgggggta ggctgtgctt cctcatgctg ggttccttgg tagctgggag 1860 ttgcagcctc tacagcttct tcgggaagcc cacggtgccc gcgtgcttgc tgcgtcagcc 1920 cctcttttct ctcgggtttg ccattttcct ctcctgtctg acaatccgct ccttccaact 1980 ggtcatcatc ttcaagtttt ctaccaaggt acccacattc taccacactt gggcccaaaa 2040 ccatggtgcc ggaatattcg tcattgtcag ctccacggtc catttgttcc tctgtctcac 2100 gtggcttgca atgtggaccc cacggcccac cagggagtac cagcgcttcc cccatctggt 2160 gattcttgag tgcacagagg tcaactctgt gggcttcctg gtggctttcg cacacaacat 2220 cctcctctcc atcagcacct ttgtctgcag ctacctgggt aaggaactgc cggagaacta 2280 taacgaagcc aaatgtgtca ccttcagcct gctcctccac ttcgtatcct ggatcgcttt 2340 cttcaccatg tccagcattt accagggcag ctacctaccc gcggtcaatg tgctggcagg 2400 gctggccact ctgagtggcg gcttcagcgg ctatttcctc cctaaatgct acgtgattct 2460 ctgccgtcca gaactcaaca acacagaaca ctttcaggcc tccatccagg actacacgag 2520 gcgctgcggc actacctgag gcgctgcggc actacctgag gcgctgcggc actacctga 2579 <210> 6 <211> 2333 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> human G-protein coupled receptor (GPCR-B3) <400> 6 aggtcttgta gcttcaatga gcatggctac cacctcttcc aggctatgcg gcttggggtt 60 gaggagataa acaactccac ggccctgctg cccaacatca ccctggggta ccagctgtat 120 gatgtgtgtt ctgactctgc caatgtgtat gccacgctga gagtgctctc cctgccaggg 180 caacaccaca tagagctcca aggagacctt ctccactatt cccctacggt gctggcagtg 240 attgggcctg acagcaccaa ccgtgctgcc accacagccg ccctgctgag ccctttcctg 300 gtgcatatta gctatgcggc cagcagcgag acgctcagcg tgaagcggca gtatccctct 360 ttcctgcgca ccatccccaa tgacaagtac caggtggaga ccatggtgct gctgctgcag 420 aagttcgggt ggacctggat ctctctggtt ggcagcagtg acgactatgg gcagctaggg 480 gtgcaggcac tggagaacca ggccctggtc aggggcatct gcattgcttt caaggacatc 540 atgcccttct ctgcccaggt gggcgatgag aggatgcagt gcctcatgcg ccacctggcc 600 caggccgggg ccaccgtcgt ggttgttttt tccagccggc agttggccag ggtgtttttc 660 gagtccgtgg tgctgaccaa cctgactggc aaggtgtggg tcgcctcaga agcctgggcc 720 ctctccaggc acatcactgg ggtgcccggg atccagcgca ttgggatggt gctgggcgtg 780 gccatccaga agagggctgt ccctggcctg aaggcgtttg aagaagccta tgcccgggca 840 gacaaggagg cccctaggcc ttgcacaagg gctcctggtg cagcagcaat cagctctgca 900 gagaatgcca agctttcatg gcacacacga tgcccaagct caaagccttc tccatgagtt 960 ctgcctacaa cgcataccgg gctgtgtatg cggtggccca tggcctccac cagctcctgg 1020 gctgtgcctc tgagctctgt tccaggggcc gagtctaccc ctggcagctt ttggagcaga 1080 tccacaaggt gcatttcctt ctacacaagg acactgtggc gtttaatgac aacagagatc 1140 ccctcagtag ctataacata attgcctggg actggaatgg acccaagtgg accttcacgg 1200 tcctcggttc ctccacatgg tctccagttc agctaaacat aaatgagacc aaaatccagt 1260 ggcacggaaa gaaccaccag gtgcctaagt ctgtgtgttc cagcgactgt cttgaagggc 1320 accagcgagt ggttacgggt ttccatcact gctgctttga gtgtgtgccc tgtggggctg 1380 ggaccttcct caacaagagc gagctctaca gatgccagcc ttgtggaaca gaagagtggg 1440 cacctgaggg aagccagacc tgcttcccgc gcactgtggt gtttttggct ttgcgtgagc 1500 acacctcttg ggtgctgctg gcagctaaca cgctgctgct gctgctgctg cttgggactg 1560 ctggcctgtt tgcctggcac ctagacaccc ctgtggtgag gtcagcaggg ggccgcctgt 1620 gctttcttat gctgggctcc ctggcagcag gtagtggcag cctctatggc ttctttgggg 1680 aacccacaag gcctgcgtgc ttgctacgcc aggccctctt tgcccttggt ttcaccatct 1740 tcctgtcctg cctgacagtt cgctcattcc aactaatcat catcttcaag ttttccacca 1800 aggtacctac attctaccac gcctgggtcc aaaaccacgg tgctggcctg tttgtgatga 1860 tcagctcagc ggcccagctg cttatctgtc taacttggct ggtggtgtgg accccactgc 1920 ctgctaggga ataccagcgc ttcccccatc tggtgatgct tgagtgcaca gagaccaact 1980 ccctgggctt catactggcc ttcctctaca atggcctcct ctccatcagt gcctttgcct 2040 gcagctacct gggtaaggac ttgccagaga actacaacga ggccaaatgt gtcaccttca 2100 gcctgctctt caacttcgtg tcctggatcg ccttcttcac cacggccagc gtctacgacg 2160 gcaagtacct gcctgcggcc aacatgatgg ctgggctgag cagcctgagc agcggcttcg 2220 gtgggtattt tctgcctaag tgctacgtga tcctctgccg cccagacctc aacagcacag 2280 agcacttcca ggcctccatt caggactaca cgaggcgctg cggctccacc tga 2333 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:amino acid sequence encoded by degenerate primer <400> 7 Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Lys Trp 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:amino acid sequence encoded by degenerate primer <400> 8 Leu Pro Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys 1 5 10

Claims (63)

1. 서열 번호 1과 약 70% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 암호화하는 분리된 핵산.
2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 1과 약 90% 이상의 동일성이 있는 것인 분리된 핵산.
3. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 1과 약 95% 이상의 동일성이 있는 것인 분리된 핵산.
4. 제1항에 있어서, 상기 아미노산이 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3인 것인 분리된 핵산.
5. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산.
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8. 제1항에 있어서, 상기 수용체가 약 92 kDa 내지 약 102 kDa의 분자량을 보유하는 것인 분리된 핵산.
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19. 서열 번호 1과 약 70% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체.
20. 제19항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 1과 약 90% 이상의 동일성이 있는 것인 분리된 수용체.
21. 제19항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 1과 약 95% 이상의 동일성이 있는 것인 분리된 수용체.
22. 제19항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3인 것인 분리된 수용체.
23. 제19항에 있어서, 상기 수용체는 약 92 kDa 내지 약 102 kDa의 분자량을 보유하는 것인 분리된 수용체.
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33. 제19항에 기재된 분리된 수용체에 선택적으로 결합하는 항체.
34. 제1항에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
35. 제34항에 기재된 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
36. (i) 제19항에 기재된 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 포함하는 폴리펩티드와 화합물을 접촉시키는 단계; 및

    (ii) 상기 수용체에 대한 화합물의 기능적 효과를 측정하는 단계

    를 포함하는, 감각 세포에서 감각 시그널링을 조절하는 화합물을 확인하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 수용체가 서열 번호 1과 약 70% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
38. 제36항에 있어서, 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드에 공유 결합된 세포외 도메인을 포함하여, 키메라 폴리펩티드를 형성하는 것인 방법.
39. 삭제
40. 제36항에 있어서, 상기 수용체가 고형 지지체에 결합되어 있는 것인 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 수용체가 고형 지지체에 공유 결합되어 있는 것인 방법.
42. 제36항에 있어서, 상기 기능적 효과가 세포내 cAMP, IP3 또는 Ca²⁺의 변화를 측정하여 결정되는 것인 방법.
43. 제36항에 있어서, 상기 기능적 효과가 화학적 효과인 것인 방법.
44. 제36항에 있어서, 상기 기능적 효과가 물리적 효과인 것인 방법.
45. 제36항에 있어서, 상기 기능적 효과가 상기 수용체에 대한 화합물의 결합을 측정하여 결정되는 것인 방법.
46. 삭제
47. 제36항에 있어서, 상기 수용체가 서열 번호 1과 약 95% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
48. 제36항에 있어서, 상기 수용체가 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3인 것인 방법.
49. 제36항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 세포 또는 세포막에서 발현되는 것인 방법.
50. 제49항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 것인 방법.
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61. 제34항에 기재된 발현 벡터로부터 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 발현시키는 단계를 포함하는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체의 제조 방법.
62. 제34항에 기재된 발현 벡터를 세포에 형질도입시키는 단계를 포함하는 감각 정보 전달 G-단백질 커플링된 수용체를 포함하는 재조합 세포의 제조 방법.
63. 제1항에 기재된 핵산을 발현 벡터에 결찰시키는 단계를 포함하는 상기 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터의 제조 방법.

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