CN1198836C - 编码与感觉转导有关的g－蛋白偶联受体的核酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供了感觉细胞特异性G-蛋白偶联受体的分离的核酸和氨基酸序列，这些受体的抗体，检测这些核酸和受体的方法，和筛选感觉细胞特异性G-蛋白偶联受体的调节剂的方法。

Description

编码与感觉转导有关的G-蛋白偶联受体的核酸

                       相关申请的交叉引用

本申请要求1998年7月28日提交的USSN 60/095,465的优先权，在此引入本文供参考。

                 关于联邦政府资助的研究和开发的声明

本发明得到政府资助进行，基金号5R01DC03160，由国立卫生研究院授予。故政府对本发明有一定权利。

                                发明领域

本发明提供了感觉细胞特异性G-蛋白偶联受体的分离的核酸和氨基酸序列，这些受体的抗体，检测这些核酸和受体的方法，和筛选感觉细胞特异性G-蛋白偶联受体的调节剂的方法。

                                 发明背景

味觉转导是动物化学转导的最复杂形式之一(见例如，Margolskee，生物学论文15：645-650(1993)；Avenet&Lindemann，膜生物学杂志112：1-8(1989))。整个动物界，从简单的多细胞动物到最复杂的脊椎动物都发现了味觉信号传递；其主要目的是提供对不挥发配体的可靠信号传递反应。认为这些感觉的每一种是由受体或通道介导的独特信号传导途径所介导的，导致受体细胞去极化，产生受体或作用潜能，并在味觉传入神经元突触处释放神经递质(见例如，Roper，神经科学年鉴12：329-353(1989))。

据信哺乳动物具有5种基本的味觉：甜、苦、酸、咸和鲜(谷氨酸钠的味道)(见例如，Kawamura&Kare，鲜味的介绍：一种基本味觉(1987)；Kinnamon&Cummings，生理学年鉴54：715-731(1992)；Lindermann，生理学综述76：718-766(1996)；Steward等，美国生理学杂志272：1-26(1997))。对人的广泛精神物理研究已报道，舌头的不同区域显示不同的味偏好(见例如，Hoffmann，Menchen.Arch.Path.Anat.Physiol.62：516-530(1875)；Bradley等，Anatomical Record212：246-249(1985)；Miley&Reedy，生理行为47：1213-1219(1990))。对动物的许多生理学研究也已显示了味觉受体细胞可选择性的对不同的味道作出反应(见例如Akabas等，科学242：1047-1050(1988)；Gilbertson等，普通生理学杂志100：803-24(1992)；Bernhardt等，生理学杂志490：325-336(1996)；Cummings等，神经生理学杂志75：1256-1263(1996))。

在哺乳动物中，味觉受体细胞集中于分布在舌上皮不同乳头中的味蕾中。舌最后部发现的周缘乳头含有成百(小鼠)上千(人)个味蕾，而且对苦味物质特别敏感。叶状乳头(位于舌后侧两边缘)含有几十到几百个味蕾，对酸和苦味物质特别敏感。含有一个或几个味蕾的蕈状乳头位于舌前部，据认为介导大部分甜味感觉。

每个味蕾视物种的不同，含有50-150个细胞，包括前体细胞、支持细胞和味觉受体细胞(见例如Lindermann生理学综述76：718-766(1996))。受体细胞受其基底处传入神经末梢支配，这些神经末梢通过脑干和丘脑的突触将信息传递给大脑皮质的味觉中枢。阐明味觉细胞信号传导和信息处理的机制，对于理解味觉功能、调节和“感觉”是关键的。

虽然对于味觉细胞功能的精神物理学和生理学已有了不少了解，但对于介导这些感觉信号传递反应的分子和途径所知很少(Gilbertson综述，神经生物学当前观点3：532-539(1993))。电生理学研究提出，酸味和咸味由H⁺和Na⁺离子通过细胞尖端表面的特殊膜通道直接进入细胞来调节味觉细胞功能。就酸性化合物而言，假定H⁺封闭了K⁺通道(见例如，Kinnamon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：7023-7027(1988))或pH敏感性通道的活化(见例如，Gilbertson等，遗传生理学杂志100：803-24(1992))导致味觉细胞去极化；盐转导可能是由Na⁺通过阿米洛利敏感性Na⁺通道进入而部分介导的(见例如Heck等，科学，223：403-405(1984)；Brand等，大脑研究207-214(1985)；Avenet等，自然331：351-354(1988))。

据信甜、苦和鲜味觉转导是由G-蛋白偶联受体(GPCR)信号传递途径介导的(见例如，Striem等，生物化学杂志260：121-126(1989)；Chaudhari等，神经学杂志16：3817-3826(1996)；Wong等，自然381：796-800(1996))。令人不解的是，甜味觉和苦味觉转导的信号传递途径模型和GPCR级连反应的效应物酶(如G蛋白亚基、cGMP磷酸二酯酶、磷脂酶C、腺苷酸环化酶；见例如，Kinnamon&Margolskee，神经生物学当前观点6：506-513(1996))几乎一样多。然而，对于参与味觉传导的特异性膜受体，或许多受单种味觉转导途径活化的单种胞内信号传递分子知之甚少。鉴定这些分子对苦味拮抗剂、甜味促效剂和咸与酸味调节剂在许多制药工业和食品工业中的应用是重要的。

味觉受体(包括味觉离子通道)和味觉信号传递分子，如与信号传递有关的G-蛋白亚基和酶的鉴定和分离，将使人们能够对味觉转导途径作药物学和遗传学调节。例如，受体和通道分子的获得将允许我们筛选高亲和力的促效剂、拮抗剂、反向促效剂和味觉细胞活性的调节剂。然后可将这些味觉调节化合物用于制药工业和食品工业，来按需要改变味道。另外，这些味觉细胞特异性分子在产生味觉局部解剖图上起着无价工具的作用，以阐明舌的味觉细胞和连接大脑味觉中枢的味觉神经元之间的关系。

                                发明简述

因此，本发明首次提供了编码味觉细胞特异性G-蛋白偶联受体的核酸。这些核酸及其编码的多肽称为“GPCR-B3”，代表G-蛋白偶联受体(“GPCR”)B3。这些味觉细胞特异性GPCR是味觉转导途径的成分。

一方面，本发明提供了一种编码感觉转导G-蛋白偶联受体的分离核酸，该受体含有与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3氨基酸序列约70％以上相同的氨基酸。

在一实施例中，该核酸包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6的核苷酸。在另一个实施例中，用能在严格杂交条件下与编码选自IAWDWNGPKW(SEQ ID NO：7)和LPENYNEAKC(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列的简并引物组相同的序列选择性杂交的引物，扩增该核酸。

另一方面，本发明提供了一种编码感觉转导G-蛋白偶联受体的分离核酸，其中该核酸在高度严格条件下与具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的序列的核酸特异性杂交。

另一方面，本发明提供了一种编码感觉转导G-蛋白偶联受体的分离核酸，该受体含有与具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列的多肽约70％以上的氨基酸相同，其中该核酸在中度严格条件下与SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列特异性杂交。

另一方面，本发明提供了一种分离核酸，它编码感觉转导G-蛋白偶联受体的胞外功能域，该胞外功能域具有与SEQ ID NO：1胞外功能域约70％以上相同的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种分离核酸，它编码感觉转导G-蛋白偶联受体的跨膜功能域，该跨膜功能域具有与SEQ ID NO：1跨膜功能域约70％以上相同的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种分离的感觉转导G-蛋白偶联受体，该受体含有与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列约70％以上相同的氨基酸序列。

在一个实施例中，该受体与针对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3产生的多克隆抗体特异性结合。在另一个实施例中，该受体具有G蛋白交联受体的活性。在另一个实施例中，该受体具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的氨基酸序列。在另一个实施例中，该受体来自人、大鼠或小鼠。

一方面，本发明提供了一种分离的多肽，它包含感觉转导G-蛋白偶联受体的一个胞外功能域，该胞外功能域包含与SEQ ID NO：1的胞外功能域约70％以上相同的氨基酸序列。

在一个实施例中，该多肽编码SEQ ID NO：1的胞外功能域。在另一个实施例中，该胞外功能域与一异源多肽共价连接，形成嵌合多肽。

一方面，本发明提供了一种分离的多肽，它包含感觉转导G-蛋白偶联受体的一个跨膜功能域，该跨膜功能域包含与SEQ ID NO：1的跨膜功能域约70％以上相同的氨基酸序列。

在一个实施例中，该多肽编码SEQ ID NO：1的跨膜功能域。在另一个实施例中，该多肽还包含胞质功能域，它包含与SEQ ID NO：1的胞质功能域约70％以上相同的氨基酸序列。在另一个实施例中，该多肽编码SEQ ID NO：1的胞质功能域。在另一个实施例中，该跨膜功能域与一异源多肽共价连接，形成嵌合多肽。在另一个实施例中，该嵌合多肽具有G-蛋白偶联受体活性。

一方面，本发明提供了一种抗体，其与受体选择性结合，该受体包含与SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列约70％以上相同的氨基酸序列。

另一个方面，本发明提供了一种表达载体，它包含一种核酸，该核酸编码包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列约70％以上氨基酸序列相同的多肽。

另一个方面，本发明提供了一种转染了该表达载体的宿主细胞。

另一个方面，本发明提供了一种鉴定调节感觉细胞中感觉信号传递的化合物的方法，该方法包括步骤如下：(i)使该化合物和包含感觉转导G-蛋白偶联受体的胞外功能域的多肽接触，该胞外功能域包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3胞外功能域约70％以上相同氨基酸序列；和(ii)确定该化合物对胞外功能域的功能作用。

另一个方面，本发明提供了一种鉴定调节感觉细胞中感觉信号传递的化合物的方法，该方法包括步骤如下：(i)使该化合物和包含感觉转导G-蛋白偶联受体的胞外功能域的多肽接触，该跨膜功能域包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3胞外功能域约70％以上相同的氨基酸序列；和(ii)确定该化合物对跨膜功能域的功能作用。

在一个实施例中，该多肽是感觉转导G-蛋白偶联受体，该受体包含与SEQ IDNO：1、SEQID NO：2或SEQID NO：3的肽约70％以上相同的氨基酸序列。在另一个实施例中，多肽包含一个与异源多肽共价连接的胞外功能域，形成嵌合多肽。在另一个实施例中，该多肽具有G-蛋白偶联受体活性。在另一个实施例中，该胞外功能域与固相共价或非共价连接。在另一个实施例中，通过测量胞内cAMP、IP3或Ca²⁺的变化确定功能作用。在另一个实施例中，该功能作用是化学作用。在另一个实施例中，通过测量该化合物与胞外功能域的结合确定作用。在另一个实施例中，该多肽是重组的。在另一个实施例中，该多肽在细胞内或细胞膜中表达。在另一个实施例中，细胞是真核细胞。

在一个实施例中，该多肽包含与异源多肽共价连接的跨膜功能域，形成嵌合多肽。

一方面，本发明提供了一种制备感觉转导G-蛋白偶联受体的方法，该方法包含步骤如下：从含有编码该受体的核酸的重组表达载体中表达该受体，其中该受体的氨基酸序列包含与具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列的多肽有约70％以上相同的氨基酸。

一方面，本发明提供制备一种重组细胞的方法，该重组细胞包含感觉转导G蛋白偶联受体，该方法包括用含编码该受体的核酸的表达载体转导细胞的步骤，其中该受体的氨基酸序列含有与具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列的多肽70％以上相同的氨基酸。

一方面，本发明提供了一种制备重组表达载体的方法，该载体包含编码感觉转导G-蛋白偶联受体的核酸，该方法包含步骤如下：将编码该受体的核酸连接于一表达载体，其中该受体的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列的多肽有约70％以上相同的氨基酸。

                                附图简述

图1显示了GPCR-B3的预测形态，具有从大鼠GPCR-B3的氨基酸序列的氨基酸1延伸到氨基酸580(对应大鼠序列的核苷酸残基1-1740，将ATG起始密码子甲硫氨酸定为残基1)的大胞外功能域，和7个跨膜功能域。大胞外功能域可能延伸入第一跨膜功能域。黑色残基表明GPCR-B3和GPCR-B4之间的相同性(对于GPCR-B4的描述，见例如USSN 60/095,464，1998年6月28日提交，和USSN60/112,747，1998年12月17日提交；也见Hoon等，细胞96：541-551(1990))。

图2是蛋白质印迹，显示GPCR-B3在味蕾而不在非味组织中表达。使用PCR实验，检测了下列非舌组织的GPCR-B3表达--脑、肝、嗅上皮、CNO和心脏。GPCR-B3仅在舌组织中表达(数据未显示)。

图3显示了舌组织切片的原位杂交，显示味蕾味受体细胞中的GPCR-B3标记，但不在邻近的非味组织中。

图4显示了含有小鼠mGluR1受体的整个胞外功能域：小鼠GPCR-B3的7个跨膜区及其相应的胞质环、和小鼠GPCR-B3的C-末端构成的嵌合受体。

图5显示了用图4描述的嵌合谷氨酸/GPCR-B3受体转染的HEK细胞。图5显示了对谷氨酸的钙反应，证明嵌合受体与磷脂酶C紧密结合。这些结果表明嵌合谷氨酸/GPCR-B3可与混杂G蛋白Gα15偶联，并引发用指示剂Fura-2可检测的钙反应。

                                发明详述

1.介绍

本发明首次提供了编码味觉细胞特异性G-蛋白偶联受体的核酸。这些核酸及其编码的受体称为“GPCR”，代表G-蛋白偶联受体，并被命名为GPCR-B3。这些味觉细胞特异性GPCR是味觉转导途径的成分。这些核酸提供了用于鉴定味觉细胞的有价值探针，因为这些核酸在味觉细胞中特异性表达。例如，可用GPCR多肽和蛋白质的探针鉴定味觉细胞各亚组，如叶状细胞和周缘细胞，或特异性味觉受体细胞，如甜、酸、咸和苦。它们也可作为工具，产生味觉局部解剖图，阐明舌头的味觉细胞和与大脑味觉中枢连接的味觉神经元之间的关系。另外，可用这些核酸及其编码的蛋白作为探针来研究味觉诱导行为。

本发明还提供了筛选这些新颖味觉细胞GPCR的调节剂，如活化剂、抑制剂、刺激剂、增强剂、促效剂和拮抗剂的方法。这些味觉转导调节剂可用于味觉信号传递途径的药物学和遗传学调节。可用这些筛选方法鉴定味觉细胞活性的高亲和力促效剂和拮抗剂。然后可将这些调节性化合物用于食品和制药工业，来按要求改变味道。因此，本发明提供了味觉调节的试验方法，其中GPCR-B3作为调节剂对味觉转导作用的直接或间接报告分子。可在一些实验，如测量离子浓度、膜电势、电流、离子流、转录、信号转导、受体配体相互反应、体外、体内和活体外的第二信使浓度测定中使用GPCR。在一个实施例中，可用GPCR-B3作为间接报道物，通过其与第二报道分子，如绿色荧光蛋白结合(见例如，Mistili&Spector，自然生物技术15：961-964(1997))。在另一个实施例中，在细胞中重组表达GPCR-B3，并测量Ca²⁺水平的变化检测通过GPCR作用的味觉转导的调节(见实施例II)。

检测味觉转导的调节剂的方法包括用GPCR-B3，其部分如胞外功能域、或含有GPCR-B3的一个或多个功能域的嵌合蛋白的体外配体结合试验，卵母细胞GPCR-B3表达；组织培养细胞GPCR-B3表达；GPCR-B3的转录活化；GPCR的磷酸化和去磷酸化；G-蛋白和GPCR的结合；配体结合试验；电压、膜电势和电导变化；离子流试验；胞内第二信使如cAMP和三磷酸肌醇的变化；胞内钙水平的变化；和神经递质释放的体外配体结合试验。

最后，本发明提供了检测GPCR-B3核酸和蛋白质表达的方法，可实现对味觉转导调控的研究和对味觉受体细胞的特异性鉴定。GPCR-B3还提供了可用于亲子鉴定和法医调查的核酸探针。GPCR-B3作为核酸探针，可鉴定味觉受体细胞，如叶状、蕈状和周缘味觉受体细胞亚群。还可用GPCR-B3受体产生单克隆和多克隆抗体，用于鉴定味觉受体细胞。可用反转录和mRNA扩增，分离总RNA或聚腺苷酸RNA，RNA印迹、斑点印迹、原位杂交、RNase保护、S1消化、探测DNA微芯片阵列、蛋白质印迹等技术鉴定味觉受体细胞。

功能上，GPCR-B3代表与味觉转导有关的一种7次跨膜G-蛋白偶联载体，其与G-蛋白相互反应，介导味觉信号转导(见例如，Fong，细胞信号8：217(1996)；Baldwin，细胞生物学当前观点6：180(1994))。

结构上，GPCR-B3的核苷酸序列(见例如SEQ ID NO：4-6，分别分离自大鼠、小鼠和人)编码一个约840个氨基酸的多肽，具有约97kDa的预测分子量，和92-102kDa的预测范围(见例如SEQ ID NO：1-3)。其它动物的相关GPCR-B3基因在长度至少约25个氨基酸，可任选在长度为50-100个氨基酸的区域中具有至少约70％相同的氨基酸。GPCR-B3细胞在叶状和蕈状细胞中特异性表达，在舌周缘味觉受体细胞中表达较低。GPCR-B3是较稀有的序列，在oligo-dT引导的周缘cDNA文库的150,000个cDNA中发现1个(见实施例I)。

本发明还提供了SEQ ID NO：1中描述的GPCR-B3多态变体：变体#1，其中氨基酸位置33的亮氨酸残基被异亮氨酸残基取代；变体#2，其中氨基酸位置84的谷氨酸残基被天门冬氨酸残基取代；和变体#3，其中氨基酸位置90的丙氨酸残基被甘氨酸残基取代。

可用GPCR-B3核苷酸和氨基酸序列的特定区域来鉴定GPCR-B3的多态变体、种间同系物、和等位基因。可在体外，如严格杂交条件下或PCR(用编码SEQ ID NO：7-8的引物)和测序，或使用计算机系统中的序列信息与其它核苷酸序列比较，进行该鉴定。通常，通过比较约25个氨基酸或更多，如50-100个氨基酸的氨基酸序列来进行对GPCR-B3的多态变体和等位基因的鉴定。约至少70％或以上，可任选80％或90-95％或以上相同的氨基酸通常证明一个蛋白质是GPCR-B3的多态变体、种间同系物、或等位基因。可用任何一种下文讨论的序列比较算法进行序列比较。还可用特异性结合GPCR-B3或其保守区域的抗体鉴定等位基因、种间同系物和多态变体。

通过检测味觉细胞特异性表达的推定GPCR-B3多肽证实了GPCR-B3的多态变体、种间同系物和等位基因。通常，用具有SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列的GPCR-B3作为与推定GPCR-B3蛋白比较的阳性对照，来证明GPCR-B3多态变体或等位基因的身份。希望多态变体、等位基因和种间同系物保留G-蛋白偶联受体的7次跨膜结构。

还可用GPCR-B3核苷酸和氨基酸序列信息在计算机系统中构建味觉细胞特异性多肽的模型。然后用这些模型来鉴定能活化或抑制GPCR-B3的化合物。可用这些调节GPCR-B3活性的化合物研究GPCR-B3在味觉转导中的作用。

GPCR-B3的分离首次提供了检验G-蛋白偶联受体味觉转导的抑制剂和激活物的方法。生物学活性的GPCR-B3用于测试作为味觉转导物的GPCR-B3的抑制剂和激活物，使用体内和体外表达，测量如：GPCR-B3的转录活化；配体结合；磷酸化和去磷酸化；与G-蛋白的结合；G-蛋白活化；调控分子结合；电压、膜电势和电导改变；离子流；胞内第二信使，如cAMP和三磷酸肌醇；胞内钙水平；和神经递质释放。用GPCR-B3鉴定的这些激活剂和抑制剂可用于进一步研究味觉转导和鉴定特异性味觉促效剂和拮抗剂。这些激活剂和抑制剂可用于药物和食品制剂来按要求改变味觉。

检测GPCR B3核酸和表达GPCR-B3的方法也可用来鉴定味觉细胞，并建立舌的局部解剖图和舌味觉受体细胞和大脑中味觉神经元之间的关系。可用编码人GPCR-B3基因的染色体定位，来鉴定由GPCR-B3导致或相关的疾病、突变和性状。

II.定义

如本文所用，下列术语除非另外指定，具有赋予它们的意义。

“味觉受体细胞”是神经上皮细胞，其组成若干组，形成舌头的味蕾，如叶状、蕈状和周缘细胞(见例如，Roper等，神经科学年鉴12：329-353(1989))。

“GPCR-B3”，也称为“TR1”，指G-蛋白偶联受体，在味觉受体细胞，如叶状、蕈状和周缘细胞中特异性表达(见例如Hoon等，细胞96：541-551(1999)，在此完全引入以供参考)。可鉴定这些味觉细胞，因为其表达特异性分子，如Gustducin味转导素，一种味觉细胞特异性G蛋白(McLaughin等，自然357：553-569(1992))。还可根据形态学鉴定味觉受体细胞(见例如Roper，见上)。

GPCR-B3编码具有7个跨膜区的，具有“G-蛋白偶联受体活性”的GPCR，例如，它们在对胞外刺激的反应中，与G-蛋白结合，并通过磷脂酶C和腺苷酸环化酶等酶的刺激促使产生第二信使，如IP3、cAMP和Ca²⁺(对于GPCR的结构和功能的描述，见例如Fong，见上，和Baldwin，见上)。

因此，术语GPCR-B3指多态变体、等位基因、突变物和种间同系物，它们：(1)在一个约25个氨基酸，可任选50-100个氨基酸的窗口上具有和SEQ ID NO：1-3约70％相同的氨基酸序列，可任选的约75、80、85、90或95％相同的氨基酸序列；(2)能与针对含有选自SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列及其保守修饰变化的免疫原的抗体结合；(3)在严格杂交条件下，与选自SEQ ID NO：4-6及其保守修饰变化的序列特异性杂交(大小至少约500，可任选至少约900个核苷酸)；或(4)可被在严格杂交条件下能与编码SEQ ID NO：7-8的简并引物组相同的序列特异性杂交的引物扩增。

拓扑形态上，感觉GPCR具有N-末端的“胞外功能域”，含有7个跨膜区和对应胞质和胞外环的“跨膜功能域”，和C-末端“胞质功能域”(见例如Hoon等，细胞96：541-551(1999)；Buck&Axel，细胞65：175-187(1991))。可用本领域技术人员已知的方法从结构上鉴定这些功能域，如鉴定疏水和亲水功能域的序列分析程序(见例如Kyte&Doolittle，分子生物学杂志157：105-132(1982))。这些功能域对于制备本发明的嵌合蛋白和体外试验是有用的。

因此，“胞外功能域”指GPCR-B3的突出于细胞膜，并与胞外配体结合的功能域。该功能域从N-末端开始，大约终止于氨基酸位置563加减约20个氨基酸的保守谷氨酸位置。对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-580(核苷酸1-1740，核苷酸1始于ATG起始甲硫氨酸密码子，也见图1)的该区域是略延伸入跨膜功能域的胞外功能域的一个例子。该例子用于液相和固相的体外配体结合试验。

“跨膜功能域”包含7个跨膜区域，加上对应的胞质和胞外环，指GPCR-B3的大约始于氨基酸位置563的保守谷氨酸加减约20个氨基酸的保守谷氨酸位置，并大约终止于氨基酸位置812的保守酪氨酸加减约20个氨基酸的保守酪氨酸位置的功能域。

“胞质功能域”指GPCR-B3的始于约氨基酸位置812加减约20个氨基酸的保守酪氨酸位置，持续到多肽C-末端的功能域。

本文所用的“生物学样品”是含有GPCR-B3或编码GPCR-B3蛋白质的核酸的生物组织或液体样品。这些样品包括但不限于：分离自人、小鼠和大鼠，具体是舌组织。生物学样品还包括供组织学研究目的的组织切片，如冰冻切片。通常生物学样品获自真核生物，如昆虫、原生动物、鸟类、鱼类、爬行类和优选哺乳动物，如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠、或家兔，和最优选的是灵长类，如黑猩猩或人。组织包括舌组织、分离的味蕾和睾丸组织。

“GPCR活性”指GPCR转导信号的活性。可在异源细胞中，通过将GPCR(或嵌合性GPCR)与G-蛋白或混杂G-蛋白(如Gα15)和PLC等酶偶联，并用(Offermans&Simon生物化学杂志270：15175-15180(1995))测量胞内钙的升高，来测量这种活性。可用荧光Ca²⁺-指示物染料和荧光显像记录配体诱导的[C9²⁺]_i变化，有效测量受体活性。可任选的，本发明的多肽与感觉转导，可任选的，味觉细胞中的味觉转导有关。

在测试调节GPCR-B3介导的味觉转导的化合物试验中，词组“功能作用”包括测定任何在该受体直接或间接影响下的参数，如功能、物理和化学作用。它包括配体结合、离子流变化、膜电势、电流、转录、G-蛋白结合、GPCR磷酸化和去磷酸化，信号转导、受体-配体相互作用，第二信使浓度(如cAMP、IP3、或胞内Ca²⁺)体外、体内、和活体外的变化，还包括增加或降低神经递质或激素释放等其它生理学作用。

通过“测定功能作用”指测试能提高或降低间接或直接受GPCR-B3影响的，如功能性、物理和化学作用的参数的化合物。这些功能性作用可通过本领域技术人员已知的任一方法测量，如光谱特征(如荧光、吸光度、折射指标)、流体动力学(如形状)、色谱分析、或可溶性能的变化，膜片钳、电压敏感性染料、全细胞电流、放射性同位素射流、可诱导标记、卵母细胞GPCR-B3表达；配体结合试验；电压、膜电势和电导的变化；离子流试验；胞内第二信使，如cAMP和三磷酸肌醇(IP3)的变化；胞内钙水平的变化；神经递质释放等。

可互换的使用GPCR-B3的“抑制剂”、“激活物”和“调节剂”，指抑制、活化或调节味觉转导用体外和体内试验鉴定的分子，如配体、促效剂、拮抗剂及其同类物和模仿物。抑制剂是能与刺激物结合，而部分或完全封闭刺激，降低，防止，延缓活化，灭活，脱敏，或下调味觉转导的化合物，如拮抗剂。激活物是例如：结合、刺激、提高、打开、活化、促进、增强活化、致敏或上调味觉转导的化合物，如促效剂。调节剂包括例如：改变受体与胞外蛋白质(其与激活物或抑制剂结合)(如舌腺蛋白和其它疏水载体家族的成员)相互反应；G-蛋白；激酶(如视紫红质激酶和β-肾上腺素受体激酶，其与受体灭活和脱敏有关)；和视紫红质样抑制蛋白(它也灭活和脱敏受体)的相互作用。调节剂包括GPCR-B3的遗传修饰形式，如改变的活性，以及天然存在和合成的配体，拮抗剂，促效剂，小化学分子等。抑制剂和激活剂的这些试验包括例如：在细胞或细胞膜中表达GPCR-B3，应用推定的调节剂化合物，然后如上所述测定对味觉转导的功能性作用。将包含用可能的激活剂、抑制剂或调节剂处理的GPCR-B3的试验样品，与不含抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品比较，来检测抑制程度。将对照样品(未用抑制剂处理)指定为相对GPCR-B3活性值100％。当相对对照的GPCR-B3活性值是大约80％时，可任选50％或25-0％，即实现了GPCR-B3的抑制。当相对于对照的GPCR-B3活性值是约110％，可任选150％或200-500％，或1000-3000％以上时，即实现了GPCR-B3的活化。

“生物学活性”GPCR-B3，指具有如上所述GPCR活性的GPCR-B3，与味觉受体细胞的味觉转导有关。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指某物质基本或根本没有其天然状态下通常伴随它的成分。通常用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析测定纯度或均一性。在制备物中是主要物质的某蛋白质是基本纯化的。具体说，分离的GPCR-B3核酸是与GPCR-B3基因旁侧编码GPCR-B3以外的蛋白质的开放阅读框相分开。术语“纯化的”指核酸或蛋白在电泳凝胶上基本只产生一条条带。特别是，它指核酸或蛋白质是至少85％纯的，可任选至少95％纯的，和可任选至少99％纯的。

“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷及其单链或双链形式的聚合物。术语包括含有已知核苷酸同类物或修饰的骨架残基或连接键，或合成的、天然存在的、和非天然存在的核酸，它们具有参比核酸相似的结合性能。它们以参比核苷酸相似的方式代谢。这些同类物的例子包括但不限于：硫代磷酸酯、磷酰胺、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

除非另有注明，特定核酸序列还包含其保守性修饰的变体(如简并密码子取代物)和互补序列，以及明确标出的序列。特别是，可通过产生在一个或多个选择的(或全部)密码子的第三个位置以混合的碱基和/或脱氧次黄嘌呤残基取代的序列，而实现简并密码子取代(Batzer等，核酸研究19：5081(1991)；Ohtsuka等，生物化学杂志260：2605-2608(1995)；Rossolini等，分子细胞探针8：91-98(1994))。术语核酸与基因，cDNA，mRNA，寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。

本文可互换使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”，指氨基酸残基的聚合物。该术语用于以下氨基酸聚合物，即其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸同类物和氨基酸模拟物，它们的功能在某方面和天然存在的氨基酸相似。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的，以及后来被修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羰基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸。氨基酸同类物指和天然存在的氨基酸具有相同基础化学结构的化合物，即，一个与氢结合的α碳，一个羧基、一个氨基和一个R基团，例如同丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些同类物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留天然存在的氨基酸的相同基础化学结构。氨基酸模拟物指具有和氨基酸的一般化学结构不同的结构，但功能与天然存在的氨基酸相似的化合物。

本文的氨基酸可用它们的公知三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号相称。同样，核苷酸可用它们普遍接受的单字母密码相称。

“保守性修饰变体”同时用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守性修饰变体指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或其中核酸不编码基本相同序列的一个氨基酸序列。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码了一给定的蛋白质。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸密码子的每一个位置，可将该密码子变成上述相应密码子的任何一个而不改变编码的多肽。这种核酸变化是“沉默变化”，它是一种保守性修饰变化。对本文编码多肽的每一核酸序列还描述了该核酸的每个可能的沉默变体。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码予，和TGG，它是色氨酸的唯一密码子)可被修饰，得到功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸中的每个沉默变体隐含在各所述序列中。

对于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加(在编码的序列中改变、添加或除去一个氨基酸或一小百分比的氨基酸)是“保守性修饰变体”，其中改变的结果是用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。这类保守性修饰变化是补充，而不排除本发明的多态变体、种间同系物、和等位基因。

下列8组各含有彼此可保守性取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天门冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天门冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(P)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)

(见例如，Creighton，蛋白质(1984))。

多肽结构等大分子结构可用多种结构水平的术语描述。关于结构的一般描述，见例如，Alberts等，细胞分子生物学(第3版，1994)和Cantor和Schimmel，生物物理化学第I部分：生物大分子的构象(1980)。“一级结构”指某特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指某肽中局部排序的三维结构。这些结构一般称为功能域。功能域是多肽的部分，形成该多肽的紧密单元，通常长50-350个氨基酸。典型的功能域是由较短的结构，如β-折叠和α-螺旋伸展片段构成。“三级结构”指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”指独立的三级单元非共价结合形成的三维结构。各向异性的术语也被称为能量术语。

“标记”或“可检测分子”指可被分光光度、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的组合物、例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(如ELISA中常用的)、生物素、异羟基洋地黄甙元、或半抗原，而且可通过在该肽中掺入放射性标记，并检测和该肽特异性反应的抗体，来检测蛋白质。

“标记的核酸探针或寡核苷酸”是共价通过接头或化学键、或非共价通过离子，范德华力、静电或氢键与标记结合的核酸探针或寡核苷酸，从而可通过检测与探针结合的标记的存在，来检测该探针的存在。

本文所用的“核酸探针或寡核苷酸”指能与互补序列的靶核酸通过一种或多种化学键，通常通过互补碱基形成氢键配对而结合的核酸。本文所用的探针可包括天然(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷等)。另外，探针内的碱基可通过除磷酸二酯键外的键连接，只要其不受杂交干扰。因此，例如探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键连接，而不是通过磷酸二酯键连接。本领域技术人员可理解，取决于杂交条件的严格度，探针可结合与序列不完全互补的靶序列。探针可任选的直接用放射性同位素、发色团、发光团、色原标记，或间接用生物素标记，然后与链霉亲和素复合物结合。通过检验探针的存在与否，可检测所选择序列或亚序列的存在与否。

当对细胞或核酸、蛋白或载体使用术语“重组”时，指该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白，或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此例如，重组细胞表达了在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或异常表达、表达低下或根本不表达天然基因。

术语“异源”和核酸部分相关使用时，指该核酸含有的两个或多个亚序列，发现它们在自然情况下相互之间无相同关系。例如，通常重组产生的核酸具有两个或多个来自无关基因的序列，排列形成新的功能性核酸，如来自一种来源的启动子和来自另一种来源的编码区。类似的，异源蛋白质表明蛋白质含有两种或多种在天然情况下彼此无相同关系的亚序列(如融合蛋白)。

“启动子”定义为核酸控制序列的阵列，它直接转录一种核酸。本文所用的启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，如就聚合酶II型启动子而言，是一TATA元件。启动子还可任选的包括远端增强子或抑制子元件，它们可位于距离转录起始位点多达几千个碱基对。“组成型”启动子是一种在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“可诱导”启动子是在环境或发育调控下活性的启动子。术语“可操纵连接”指核酸表达控制序列(如启动子，或转录因子结合位点的阵列)和第二核酸序列之间的功能性键连接，其中表达控制序列指导了对应于第二序列的核酸的转录。

“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒、或核酸片段的一部分。通常，表达载体包含与启动子可操纵性连接的待转录的核酸。

关于两种或多种核酸或多肽序列，术语“相同”或百分数“相同性”指两条或多条序列或亚序列，当在比较窗口或指定区域上如用下列序列比较算法之一或手工排列和目测，比较并排列对比寻找最大对应性时它们是相同的，或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即在一特定区域内有70％相同性，可任选75％、80％、85％、90％或95％相同性)。这样的序列称为“基本相同”。该定义还指对测试序列评价、可任选的，相同性存在于至少长度为50个氨基酸和核苷酸的区域中，或更优选的存在于长度为75-100个氨基酸和核苷酸的区域中。

对于序列比较，通常将一条序列作为参照序列，与测试序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机，如需要，指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或指定另外的参数。然后序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参照序列的序列相同性百分数。

本文所用的“比较窗”包括参比选自包含20-600、一般约50-200，更一般约100-150个毗邻位置数之一的片段，其中在将两条序列最佳排列后，可将一条序列和毗邻位置数相同的参比序列作比较。排列序列作比较的方法是本领域熟知的。可通过例如，Simth&Waterman，高级应用数学，2：482(1981)的局部同源性算法，Needleman&Wunsch，分子生物学，48：443(1970)的同源排列算法，Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的类似方法，这些算法的计算机化操作(Wisconsin Genetics Software Package的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或手工排列和目测(见例如分子生物学现有方案(Ausubel等，编1995增订))来进行序列的最佳排列，作比较。

一种有用算法的例子是PILEUP。PILEUP创立了一组相关序列的多条序列排列，使用推进的、成对排列对比来显示相互关系和序列相同性百分数。它还绘出了树状图或枝状图来显示用于建立排列对比的分类归并关系。PILEUP使用Feng&Doolittle，分子进化杂志35：351-360(1987)的推进排列方法的简化形式。使用的方法和Higgins&Sharp，CABIOS 5：151-153(1989)描述的方法相似。该程序可排列多达300条序列，各自最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。该多重排列程序始于两条最相似序列的成对排列对比，产生一个两条排列序列的组。然后将该组和下一条最相关的序列或排列序列的组排列对比。通过简单延伸两条独立序列的配对排列，对两组序列进行排列对比。通过一系列推进的成对排列来实现最终的排列对比。通过指定特定序列及其与序列比较区域同等的氨基酸或核苷酸，并指定程序参数来运行该程序。使用PILEUP，将参照序列和其它测试序列作比较，用下列参数测定序列相同性百分数：默认缺口加权值(3.00)、默认缺口长度加权值(0.10)、和加权的末端缺口。PILEUP可从GCG序列分析软件包，如7.0版(Devereaux等，核酸研究12：387-395(1984))获得。

另一个适用于测定序列相同性百分数和序列相似性的算法例子是BLAST和BLAST2.0算法，Altschul等，核酸研究25：3389-3402(1977)和Altschul等，分子生物学杂志215：403-410(1990)分别描述了它们。通过生物技术信息国家中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公众可获得进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的字，以鉴定高评分的配对(HSP)，当与数据库序列中同样长度的字排列对比时，匹配或满足某个正值的阈评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，见上)。找到这些起始的相邻字作为引发寻找含有它们的更长HSP的搜索的出发点。将找到的字沿着各序列双向延伸，直到能增加累计的排列对比评分。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的加分；总是＞0)和N(错配残基的减分，总是＜0)计算累计评分。对于氨基酸序列，用评分矩阵来计算累计评分。当：累计的排列对比评分从其最大达到值处下落数量X；由于一个或多个负评分残基排列对比的累计，该累计评分达到0或以下；或达到两序列之一的末端时，找到的字延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X确定了排列对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)用作默认值的句长(W)为11，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4，比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序用作默认值的句长为3，预期值(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))排列(B)为50，预期值(E)为10，M＝5，N＝-4，并比较双链。

BLAST算法还进行两条序列间相似性的统计学分析(见例如Karlin&Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量方法是最小可能性之和(P(N))，其提供了可能性的指示，通过它可碰巧发生两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配。例如，如果在测试核酸的和参考核酸的比较中，最小可能性之和小于约0.2，更优选小于约0.01，和最优选小于约0.001，将核酸视为和参照序列相似。

两条核酸序列或多肽基本相同的指示是，第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫性交叉反应(如下所述)。因此，如果两条肽仅在保守取代上有不同，该多肽通常与第二条多肽基本相同。另一个两条核酸序列基本相同的指示是两个分子或其互补分子在严格条件下相互杂交(如下所述)。而另一个两条核酸序列基本相同的指示是可用同样的引物扩增该序列。

词组“与…选择性(或特异性)杂交”指当某序列存在于复杂混合物中(如总细胞或文库DNA或RNA)时，该分子仅和特定的核苷酸序列在严格条件下结合、形成双体或杂交。

词组“严格杂交条件”指在该条件下，通常在核酸的复杂混合物中，一种探针将与其靶亚序列杂交，但不和其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，而且视不同环境而不同。越长的序列在越高的温度下特异性杂交。在Tijssen，生物化学和分子生物学技术与核酸探针杂交，“杂交原理纵览和核酸试验策略”(1993)中可找到核酸杂交的一般指南。一般，所选的严格条件比在限定离子强度的pH下，特定序列的热解链温度(T_m)低约5-10℃。T_m是在平衡时，有50％与靶互补的探针与靶序列杂交的(特定离子浓度、pH和核酸的浓度下)温度(当靶序列过量，在T_m下平衡时50％探针被使用)。严格条件将是盐浓度小于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH7.0-8.3，对于短探针(如10-50个核苷酸)温度至少约30℃，和对于长探针(如50个核苷酸以上)至少约60℃的条件。可加入去稳定剂，如甲酰胺来达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是至少两倍于背景，可任选10倍于背景杂交。示范性严格条件可如下：50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS，42℃培育，或5xSSC，1％SDS，65℃培育，用0.2xSSC和0.1％SDS65℃洗涤。

如果核酸编码的肽基本相同，在严格条件下不互相杂交的核酸仍是基本相同的。例如这发生在当用基因密码允许的最大密码子简并性建立核酸拷贝时。就此而言，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示范性“中等严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中37℃杂交，并以1XSSC 45℃洗涤。阳性杂交是至少背景的两倍。本领域普通技术人员将轻易认识到，可用其它杂交和洗涤条件来提供严格性相似的条件。

“抗体”指含有免疫球蛋白基因编码的框架区的多肽或其片段，其能特异性结合并识别一种抗原。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其进而分别定义为免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类。

典型的免疫球蛋白(抗体)的结构单元是四聚体。各四聚体由相同的两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N-末端定义为约100-110或以上的氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体可以完整的免疫球蛋白或各种肽酶消化产生的，特性明确的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在铰链区二硫键下方消化抗体，产生F(ab)’₂，一种Fab的二聚物，它自身是一条通过二硫键与V_H-C_H1结合的轻链。F(ab)’₂可在温和条件下还原而打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’₂二聚物转化成Fab’单体。Fab’单体本质上是带有部分铰链区的Fab(见基础免疫学(Paul编，第三版，1993))。虽然各种抗体片段被定义为完整抗体的消化物，本领域技术人员将理解，这些片段可用化学方法或用重组DNA方法合成。因此，本文使用的术语抗体还包括，修饰完整抗体产生的，或用重组DNA方法(如单链Fv)从头合成的，或用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(见例如，McCafferty等自然348：552-554(1990))。

为了制备单克隆或多克隆抗体，可使用任何本领域已知的技术(见例如，Kohler&Milstein，自然256：495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫学4：72(1983)；Cole等，单克隆抗体和癌症治疗77-96页(1985))。可使用产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)，来产生抗本发明多肽的抗体。还可用转基因小鼠，或其它生物体，如其它哺乳动物来表达人源化抗体。另外，可用噬菌体展示技术来鉴定能与所选抗原特异性结合的抗体和异聚Fab片段(见例如McCafferty等，自然348：552-554(1990)；Marks等，生物技术10：779-783(1992))。

“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、置换或交换，使抗原结合位点(可变区)与不同的或另一类抗体的有效应器功能的和/或动物的恒定区连接，或与赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子，如酶、毒素、激素、生长因子、药物等连接；或(b)用具有不同的或抗原特异性改变的可变区来改变、置换或交换其可变区或其部分。

“抗-GPCR-B3”抗体是能与GPCR-B3基因、cDNA、或其亚序列编码的多肽特异性结合的抗体或抗体片段。

术语“免疫试验”是用抗体与抗原特异性结合的试验。免疫试验的特征是用特定抗体的特异性结合性能来分离、靶向、和/或定量测定抗原。

当指蛋白质或肽时，词组“特异性(或选择性)结合”于抗体或“与抗体起特异性(或选择性)免疫反应”指一种结合反应，其对于蛋白质或其它生物制剂的异质性群体中该蛋白质的存在有确定作用。因此，在指定的免疫试验条件下，特定抗体与一特定蛋白质的结合至少是背景的两倍，而且和样品中存在的其它蛋白质基本上不以显著量结合。在这种条件下与抗体特异性结合需要选出一种抗体，其对与具体蛋白质有特异性。例如，可选用特殊动物，如大鼠、小鼠或人产生的抗GPCR-B3多克隆抗体，来获得只与GPCR-B3起特异性免疫反应，但不和其它蛋白质(除了GPCR-B3的多态性变体和等位基因外)起反应的多克隆抗体。可通过除去与其它动物的GPCR-B3分子起交叉反应的抗体，来实现该选择。可用各种形式免疫试验选择能与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫试验选择能与蛋白质起特异性免疫反应的抗体(见例如，Harlow&Lane，抗体，实验手册(1988)，对用于测定特异免疫反应性的免疫试验形式和条件的描述)。通常特异性或选择性反应将至少是背景信号或噪声的两倍，更通常是背景的10-100倍。

词组“与…选择性联系”指一核酸与以上定义的另一核酸“选择性杂交”的能力，或一抗体与以上定义的一种蛋白质“选择性(或特异性)结合”的能力。

“宿主细胞”意味觉着含有一表达载体并支持该表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是大肠杆菌等原核细胞，或酵母、昆虫、两栖类或CHO、HeLa等哺乳动物细胞等真核细胞，如培养的细胞、外植体和体内细胞。

III.编码GPCR-B3的核酸的分离

A.一般重组DNA方法

本发明依据重组遗传学领域中的常规技术。公开本发明所用一般方法的基础文章包括Sambrook等，分子克隆，实验手册(第二版，1989)；Kriegler，基因转移和表达：实验手册(1990)；和分子生物学现有方案(Ausubel等编，1994)。

对于核酸，以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出了大小。这些是从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳，从测序的核酸，或从出版的DNA序列得到的估计。对于蛋白质，以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出了大小。可从凝胶电泳，从测序的蛋白质，从衍生的氨基酸序列，或从出版的蛋白质序列估计蛋白质大小。

不能商品购得的寡核苷酸可根据eaucage&Caruthers，四面体通信22：1859-1862(1981)首选描述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用自动合成仪，如VanDevanter等，核酸研究，12：6159-6168(1984)所述来化学合成。寡核苷酸的纯化可采用天然丙烯酰胺凝胶电泳或Pearson&Reanier，J.Chrom 255：137-149(1983)所述的阴离子交换HPLC。

克隆后，可用例如Wallace等，基因16：21-26(1981)的用于测序双链模板的链终止方法验证克隆的基因和合成的寡核苷酸序列。

B.分离编码GPCR-B3的核苷酸序列的克隆方法。

一般从cDNA和基因组DNA文库，通过和探针杂交来克隆，或用寡核苷酸探针通过扩增技术来分离编码GPCR-B3的核酸序列和相关核酸序列同系物。例如，通常从哺乳动物核酸(基因组或cDNA)文库，和核酸探针(其序列可衍生自SEQ IDNO：4-6)杂交，来分离GPCR-B3序列。可分离得到GPCR-B3 RNA和cDNA的合适组织是舌组织，可任选味蕾组织或单个味觉细胞。

还可用使用引物的扩增技术，从DNA或RNA扩增并分离GPCR-B3。还可用编码下列氨基酸序列的简并引物扩增GPCR-B3的序列：SEQ ID NO：7-8(见例如，Dieffenfach&Dveksler，PCR引物：实验手册(1995))。可用这些引物来扩增全长序列或一到数百个核苷酸的探针，然后可用其筛选哺乳动物文库中的全长GPCR-B3。

还可用抗体作为探针从表达文库中分离编码GPCR-B3的核酸。可用SEQ IDNO：1-3的序列来产生这类多克隆和单克隆抗体。

可用GPCR-B3核酸探针和寡核苷酸在严格条件下，通过筛选文库来分离与GPCR-B3基本相同的GPCR-B3多态变体、等位基因和种间同系物。另外，可用表达文库通过检测表达的同系物(其能和针对GPCR-B3制备的抗血清或纯化的抗体(它们也识别并与GPCR-B3同系物选择性结合)起免疫反应)，来克隆GPCR-B3和GPCR-B3多态变体、等位基因和种间同系物。

为了制备cDNA文库，应选择富含GPCR-B3 mRNA的来源，如舌组织或分离的味蕾。然后用反转录酶将mRNA变成cDNA，连接入重组载体，转染入重组宿主来增殖、筛选并克隆。制备和筛选cDNA的方法是熟知的(见例如，Gubler&Hoffmann，基因25：263-269(1983)；Sambrook等，见上；Ausubel等，见上)。

对于基因组文库，从组织中抽提DNA，机械剪切或用酶消化，得到约12-20kb的片段。然后用梯度离心将该片段与不需要的片段分开，构建入λ噬菌体载体。体外包装这些载体和噬菌体。用Benton&Davis，科学196：180-182(1977)所述的噬斑杂交分析重组噬菌体。如Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72：3961-3965(1975)中所述进行集落杂交。

另一种分离GPCR-B3核酸及其同系物的方法，联合使用合成的寡核苷酸引物和RNA或DNA模板扩增(见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR方法：方法和应用指南(Innis等编，1990))。可用聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)直接从mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库扩增GPCR-B3的核酸序列。可设计简并寡核苷酸用本文提供的序列扩增GPCR-B3的同系物。可将限制性内切酶位点掺入引物，聚合酶链式反应或其它体外扩增的方法也可用来，例如，克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，来制备核酸，用作检测生理学样品中编码GPCR-B3的mRNA的存在与否，用于核酸测序或其它目的。可从琼脂糖凝胶中纯化PCR反应扩增的基因，并克隆入合适的载体。

还可用本领域已知的技术，如反转录和mRNA扩增，总RNA或poly A⁺RNA分离，RNA印迹法、斑点印迹法、原位杂交、RNase保护、探测DNA微芯片阵列等，来分析GPCR-B3基因的表达。在一个实施例中，用高密度寡核苷酸分析技术(如GeneChip^TM)来鉴定本发明GPCR的同系物和多态变体。就被鉴定的同系物与已知疾病的联系而言，可用它们和GeneChip^TM作为诊断工具，来检测生物学样品中的疾病，见例如，Gunthand等，AIDS研究，人逆转录病毒14：869-876(1998)；Kozal等，天然药物2：753-759(1996)；Matson等，生物化学年鉴224：110-106(1995)；Lockhart等，天然生物技术14：1675-1680(1996)；Gingeras等，基因组研究8：435-448(1998)；Hacia等，核酸研究26：3865-3866(1988)。

可用合成的寡核苷酸构建重组GPCR-B3基因，用作探针或表达蛋白质。用一系列重叠寡核苷酸，一般长40-120bp，代表基因的有义和反义链来进行该方法。然后将这些DNA片段退火、连接并克隆。另外，可用扩增技术和精密引物来扩增GPCR-B3核酸的特定亚序列。然后将该特异性亚序列连接入表达载体。

通常在转化入原核或真核细胞中，用于复制和/或表达前，将编码GPCR-B3的核酸克隆入中间载体。这些中间载体通常是原核载体，如质粒或穿梭载体。

可任选的，根据标准技术制备编码含有GPCR-B3或其功能域的嵌合蛋白质的核酸。例如，可将配体结合域等功能域、胞外功能域、跨膜功能域(如含有7个跨膜区域和对应的胞外和胞质环)、跨膜功能域和细胞质功能域、活性位点、亚基结合区域等与异源蛋白质共价连接。例如，可将胞外功能域与异源GPCR跨膜功能域连接，或异源GPCR胞外功能域可与跨膜功能域连接。其它所选异源蛋白质包括例如，绿色荧光蛋白质，β-半乳糖苷酶、谷氨酸受体和视紫红质前序列。

C.原核细胞和真核细胞中的表达

为了获得一克隆的基因或核苷酸，如编码GPCR-B3的cDNA的高水平表达，通常将GPCR-B3亚克隆入含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子，和(如果核酸编码蛋白)引发翻译的核糖体结合位点的表达载体。合适的细菌启动子是本领域熟知的，而且在Sambrook等和Ausubel等中有所描述。表达GPCR-B3蛋白质的细菌表达系统是在如大肠杆菌，芽胞杆菌亚种和沙门氏菌中可得到的(Palva等，基因22：229-235(1983)；Mosbach等，自然302：543-545(1983))。这些表达系统的试剂盒是可商业购得的。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域熟知的，而且也可商业购得。在一个实施例中，真核表达载体是腺病毒载体，一种腺伴随病毒载体或反转录病毒载体。

用来指导异源核酸表达的启动子由特定用途决定。可将启动子置于距离异源转录起始位点与离其天然位置中转录起始位点相同部位。然而如本领域已知，该距离可容纳一些变化，而启动子功能不丧失。

除了启动子，通常表达载体还含有一种转录单元或表达盒，其含有编码GPCR-B3的核酸在宿主细胞中表达所需的所有其它元件。因此，典型的表达盒含有与编码GPCR-B3的核酸序列可操纵性连接的启动子，和转录物有效聚腺苷酸化，核糖体结合位点，和翻译终止所需的信号。编码GPCR-B3的核酸序列通常与可切割信号肽序列连接，以促进转化细胞分泌编码蛋白质。这些信号肽将包括：组织纤维蛋白溶酶原激活物、胰岛素和神经生长因子、和烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)的保幼激素酯酶的信号肽。其它盒元件可包括增强子，和(如果用基因组DNA作为结构基因)，带有功能性剪接供体和受体位点的内含子。

除了启动子序列，表达盒还应含有在结构基因下游的转录终止区，以提供有效终止。可从启动子序列的相同基因或从不同基因获得该终止区。

用来将遗传信息转运入细胞的特定表达载体不是特别关键的。可用任何用于在真核或原核细胞中表达的常规载体。标准的细菌表达载体包括质粒，如pBR322为基础的质粒、pSKF、pET23D和融合表达系统，如GST和LacZ。还可将表位标记加到重组蛋白质中，以提供便利的分离方法，如c-myc。

通常在真核表达载体，如SV40载体、乳头瘤病毒载体，和衍生自Epstein-Barr病毒的载体中使用真核病毒的，含有调控元件的表达载体。其它示范性真核载体包括：pMSG、pAV009/A⁺、pMTO10/A⁺、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、和其它使蛋白质在SV40早启动子、SV40晚启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体启动子或其它在真核细胞中显示表达效果的启动子的指导下，使蛋白表达的载体。

某些表达系统含有提供基因扩增的标记，如胸腺嘧啶激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。另外，与基因扩增无关的高产量表达系统也是适合的，如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，和在多角体启动子或其它强杆状病毒启动子指导下的编码GPCR-B3的序列。

通常包含于表达载体中的元件还包括在大肠杆菌中起作用的复制子、能选择含有重组质粒的细菌的编码抗生素抗性的基因、和质粒非必需区中能插入真核序列的独特限制性位点。所选的特定抗生素抗性基因不是关键的，许多本领域已知的抗性基因中的任一种都是适合的。可选择原核序列，如需要，使它们不干涉DNA在真核细胞中的复制。

用标准转染方法来产生表达大量GPCR-B3蛋白质(其然后可用标准技术纯化)的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系(见例如，Colley等，生物化学杂志，264：17619-17622(1989)；酶学方法中的蛋白质纯化指南，182卷(Deutscher编，1990))。根据标准技术进行真核和原核细胞的转化(见例如，Morrison，细菌杂志132：349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，酶学方法101：347-362(Wu等编，1983))。

可使用任何将外源核苷酸引入宿主细胞的熟知程序。这些包括使用磷酸钙转染、Polybrene，原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和其它用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传材料引入宿主细胞的熟知方法(见例如，Sambrook等，见上)。只是需要所用的特定基因工程程序能将至少一个基因成功引入能表达GPCR-B3的宿主细胞。

表达载体被引入细胞后，在适合表达GPCR-B3的条件下培养转染细胞，用下文所述的标准技术从培养物中回收GPCR-B3。

IV.GPCR-B3的纯化

可纯化天然存在或重组的GPCR-B3，用于功能性试验。可任选的，纯化重组GPCR-B3。从哺乳动物组织，如舌组织，或其它GPCR-B3同系物来源中纯化天然存在的GPCR-B3。从任何合适细菌或真核表达系统，如CHO细胞或昆虫细胞中纯化重组GPCR-B3。

可将GPCR-B3用标准技术，包括用硫酸铵等物质选择性沉淀；柱层析；免疫纯化方法等纯化至基本纯(见例如，Scopes，蛋白质纯化：原理和实践(1982)；美国专利号4,673,641；Ausubel等，见上；和Sambrook，见上)。

当纯化重组GPCR-B3时，可使用许多程序。例如，可将具有分子粘合性能的蛋白质与GPCR-B3可逆融合。用合适配体，可将GPCR-B3选择性吸附于纯化柱，然后以相对纯的形式从柱上脱离。然后可用酶作用除去融合的蛋白质。最后可用免疫亲和柱纯化GPCR-B3。

A.从重组细胞中纯化GPCR-B3

通常在启动子诱导后，用转化的细菌或真核细胞，如CHO细胞或昆虫细胞大量表达重组蛋白质；但表达可以是组成性的。用IPTG启动子诱导是可诱导启动子系统的一个例子。按本领域标准程序培养细胞。用新鲜或冻结的细胞分离蛋白质。

在细菌中表达的蛋白可能形成可溶性积聚物(“包含体”)。几种方案适用于纯化GPCR-B3包含体。例如，包含体的纯化包括破坏细菌细胞，如通过在50mMTRIS/HCl pH 7.5，50mM NaCl，5mM MgCl₂，1mM DTT，0.1 mM ATP，和1mM PMSF的缓冲液中培育，抽提、分离和/或纯化包含体。可通过弗氏压碎器2-3次，裂解细胞悬液，用Polyton(Brinkman Instruments)或冰上超声进行匀浆。其它裂解细菌的方法本领域技术人员是清楚的(见例如，Sambrook等，见上；Ausubel等，见上)。

如需要，溶解包含体，通常离心裂解的细胞悬液，来除去不需要的不溶物。形成包含体的蛋白质可用兼容缓冲液稀释或透析复性。合适的溶剂包括但不限于：尿素(约4M-8M)、甲酰胺(至少约80％体积/体积成分)和胍基盐酸(约4M-8M)。能溶解形成的积聚蛋白质的某些溶剂，如SDS(十二烷基磺酸钠)，70％甲酸在该程序中由于可能使蛋白质不可逆变性而伴有免疫原性和/或活性的缺乏，所以是不适合用于该程序的。虽然盐酸胍和相似的试剂是变性剂，但该变性不是不可逆的，而且可在除去(例如通过透析)或稀释变性剂后复性，重新形成免疫原性和/或生物学活性的蛋白质。其它合适的缓冲液是本领域技术人员已知的。可从其它细菌蛋白质中，通过标准分离技术，如Ni-NTA琼脂糖树脂分离GPCR-B3。

另外，可从细菌周质中纯化GPCR-B3。细菌裂解后，当GPCR-B3被输入到细菌周质中时，可通过冷低渗休克和其它本领域已知的技术来分离细菌的周质组分。为了从周质中分离重组蛋白质，离心细菌细胞，形成沉淀。将沉淀重新悬浮在含有20％蔗糖的缓冲液中。为了裂解细胞，离心细菌，将沉淀重新悬浮在冰冷的5mM MgSO₄中，保存在冰浴中约10分钟。离心细胞悬液，倒出上清液并保存。可从宿主蛋白质中通过本领域技术人员熟知的标准分离技术分离出上清液中的重组蛋白质。

B.纯化GPCR-B3的标准蛋白质分离技术

溶解度分级

通常作为起始步骤，尤其如果蛋白质混合物是复杂的，初步盐分级可从感兴趣的重组蛋白中分离除去许多不需要的宿主细胞蛋白质(或衍生自细胞培养液的蛋白质)。在一个实施例中，该盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效减少蛋白质混合物中的水量来沉淀蛋白质。然后依据其溶解度沉淀蛋白质。蛋白质的疏水性越强，它就更可能在较低的硫酸盐浓度下沉淀出来。典型的方案包括在蛋白质溶液中加入饱和硫酸铵，从而使得到的硫酸铵浓度在20-30％之间。该浓度将沉淀最疏水的蛋白质。然后丢弃沉淀物(除非感兴趣的蛋白质是疏水的)，在上清液中加入硫酸铵，至能沉淀感兴趣的蛋白质的浓度。然后将沉淀溶于缓冲液，如需要，通过透析或渗滤除去过量的盐。其它依靠蛋白质溶解度的方法，如冷乙醇沉淀，是本领域技术人员已知的，可用于级分复杂的蛋白质混合物。

大小差异性过滤

可利用GPCR-B3的分子量从更大或更小尺寸的蛋白质中，通过不同孔径的膜(例如Amicon或Millipore膜)超过滤分离该蛋白质。作为第一步，通过孔径能截断比感兴趣的蛋白质分子量小的膜超滤该蛋白质混合物。然后通过孔径能截断比感兴趣的蛋白质分子量大的膜超滤上次超滤的保留物。重组蛋白质将穿过膜进入滤液。然后可如下层析滤液。

柱层析

可从其它蛋白质中，依据其大小、净表面电荷、疏水性、和对配体的亲和性分离GPCR-B3。另外，可将针对蛋白质产生的抗体与柱基质偶联，免疫纯化该蛋白质。所有这些方法都是本领域熟知的。技术人员清楚的是，可以任何规模，使用许多不同厂商(如Pharmacia Biotech)的器具进行层析技术。

V.GPCR-B3的免疫学检测

除了用核酸杂交技术检测GPCR-B3基因和基因表达，还可用免疫试验法来检测GPCR-B3，如鉴定味觉受体细胞和GPCR-B3变体。可用免疫试验来定性或定量分析GPCR-B3。可使用的技术的综述可见Harlow&Lane，抗体：实验手册(1988)。

A.GPCR-B3的抗体

产生与GPCR-B3特异性反应的多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的(见例如，Coligan，免疫学现有方法(1991)；Harlow&Lane，见上；和Kohler&Milstein，自然256：495-497(1975))。这些技术包括从噬菌体或类似载体中的重组抗体文库选择抗体，以及免疫家兔或小鼠制备多克隆和单克隆抗体，来制备抗体(见例如Huse等，科学246：1275-1281(1989)；Ward等，自然341：544-546(1989))。

可用许多含有GPCR-B3的免疫原来产生与GPCR-B3特异性反应的抗体。例如，如本文所述分离了重组GPCR-B3或其抗原性片段。可如上所述在真核细胞或原核细胞中表达重组蛋白质，并如上所述纯化。重组蛋白质是用于产生单克隆和多克隆抗体的免疫原的例子。另外，衍生自本文公开的序列，并与载体蛋白质偶联的合成肽可用作免疫原。还可使用天然存在的蛋白质，无论纯或不纯的形式。然后将产物注射入能产生抗体的动物。可产生单克隆或多克隆的抗体，随后用于免疫试验，以测定该蛋白质。

产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。用蛋白质和一种标准佐剂，如Freund’s佐剂，和标准免疫方案免疫近交系小鼠(如BALB/C小鼠)或家兔。抽取测试血样，并测定对GPCR-B3的反应性滴度，监测动物对免疫原制备物的免疫应答。当获得对免疫原的合适的抗体高滴度时，从动物收集血液，并制备抗血清。如需要，可进一步级分该抗血清，来浓缩与该蛋白质起反应的抗体(见Harlow&Lane，见上)。

可通过各种与本领域技术人员相似的技术获得单克隆抗体。简单说，无限增殖用所需抗原免疫的动物脾细胞(常通过与骨髓瘤细胞融合)(见Kohler&Milstein，欧洲免疫学杂志6：511-519(1976))。其它无限增殖的方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因或反转录病毒转化或其它本领域熟知的方法。筛选从单个无限增殖细胞产生的集落，以产生对抗原具有所需特异性和亲和性的抗体，而且这些细胞产生的单克隆抗体产量可用各种技术增强，包括注射入脊椎动物宿主的腹腔。另外，可根据Huse等，科学246：1275-1281(1989)描述的通用方法，从人B细胞中筛选DNA文库，分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。

在免疫试验法，例如免疫原固定在固相载体上的固相免疫试验法中收集单克隆抗体体和多克隆血清，滴定其对免疫原蛋白质的滴度。通常，选择滴度为10⁴或更大的多克隆抗血清，并使用竞争性结合免疫试验测试其对非GPCR-B3蛋白质或其它生物的其它相关蛋白质的交叉反应性。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体结合的K_d值一般至少约0.1mM，更常至少约1μM，可任选至少约0.1μM或更大，或可任选0.01μM或更大。

一旦得到GPCR-B3特异性抗体，可通过各种免疫试验方法检测GPCR-B3。对于免疫学和免疫试验程序的综述，见基础和临床免疫学(Stites&Terr编，第7版，1991)。另外，可用数种配置中的任一种进行本发明的免疫试验，在“酶免疫试验”一节中广泛描述(Maggio编，1980)；和Harlow&Lane，见上。

B.免疫结合试验

可用许多熟知的免疫学结合试验来检测和定量测定GPCR-B3(见例如，美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。对于一般免疫试验的综述，也见“细胞生物学方法：细胞生物学中的抗体”，37卷(Asai编，1993)；“基础和临床免疫学”(Stitier&Terr编，第7版，1991)。免疫学结合试验(或免疫试验)通常使用与所选蛋白质或抗原特异性结合的抗体(就GPCR-B3或其抗原性亚序列而言)。可通过许多本领域技术人员熟知的，或如上所述的方法产生该抗体(如抗GPCR-B3)。

免疫试验也常用标记试剂，来特异性结合或标记抗体和抗原形成的复合物。标记试剂自身可以是含有抗体/抗原复合物的分子之一。因此，标记试剂可以是标记的GPCR-B3多肽，或标记的抗GPCR-B3抗体。另外，标记试剂可以是第三种分子，例如第二抗体，其与抗体/GPCR-B3复合物特异性结合(第二抗体通常对产生第一抗体的动物的抗体是特异性的)。其它能与免疫球蛋白恒定区结合的蛋白质，如蛋白质A或蛋白质G也可用作标记试剂。这些蛋白质显示对不同动物的免疫球蛋白恒定区的非免疫性强反应性(见例如Kronval等，免疫学杂志111：1401-1406(1973)；Akerstrom等，免疫学杂志135：2589-2542(1985))。可用可检测分子，如生物素(可与另一种分子特异性结合，如链霉亲和素)修饰标记试剂。各种可检测分子是本领域技术人员熟知的。

在试验中，在各试剂结合后可能需要培育和/或洗涤步骤。培育步骤可从5秒到数小时而不同，可任选从约5分钟到约24小时。然而，培育时间将由试验方案、抗原、溶液体积、浓度等决定。通常，试验将在环境温度下进行，虽然可在一定温度范围内进行，如10℃到40℃。

非竞争性试验

检测样品中GPCR-B3的免疫试验可以是竞争性的或非竞争性的。非竞争性免疫试验是直接测量抗原量的试验。在一优选的“夹心”试验中，例如抗GPCR-B3抗体可与固相基质直接结合，固定在其上。然后这些固定化抗体可捕获存在于测试样品中的GPCR-B3。因此固定的GPCR-B3被标记剂，如带有标记的第二GPCR-B3抗体结合。另外，第二抗体可缺少标记，但它可以被标记的第三抗体结合，该第三抗体对产生第二抗体的动物的抗体是特异性的。第二或第三抗体通常被可检测分子，如生物素(另一种分子与其特异性结合，如链霉亲和素)修饰，来提供可检测分子。

竞争性试验

在竞争性试验中，测量已知加入的(外源)GPCR-B3被样品中存在的未知GPCR-B3从抗GPCR-B3抗体上取代(竞争)的量，来间接测量样品中存在的GPCR-B3量。在一竞争性试验中，在一样品中加入已知量的GPCR-B3，然后使该样品与特异性结合GPCR-B3的抗体接触。与抗体结合的外源GPCR-B3量和样品中存在的GPCR-B3浓度成反比。在一实施例中，抗体被固定在固相基质上。与抗体结合的GPCR-B3量可通过测量在GPCR-B3/抗体复合物中存在的GPCR-B3量，或通过测量剩余未复合的蛋白质量来确定。可提供标记的GPCR-B3分子来检测GPCR-B3量。

半抗原抑制试验是另一种竞争性试验。在该试验中，将已知的GPCR-B3固定在固相基质上。在样品中加入已知量的抗GPCR-B3抗体，然后使该样品与固定化的GPCR-B3接触。与已知固定化GPCR-B3结合的抗GPCR-B3抗体量，与样品中存在的GPCR-B3量成反比。另外，可通过检测抗体的固定化组分或剩余在溶液中的抗体组分来检测固定化抗体的量。抗体被标记时，检测可以是直接的，或随后加入与上述抗体特异性结合的分子间接检测。

交叉反应性决定簇

还可将竞争性结合形式中的免疫试验用于交叉反应性决定簇。例如，可将至少部分由SEQ ID NO：1-3编码的蛋白质固定在固相载体上。在试验中加入与固定化抗原竞争结合抗血清的蛋白质(如GPCR-B3蛋白质和同源物)。比较加入的蛋白质与固定的蛋白质竞争结合抗血清的能力与SEQ ID NO：1-3编码的GPCR-B3与其自身竞争的能力。使用标准算法计算上述蛋白质的交叉反应性百分数。选择并合并与各种上述加入的蛋白质具有小于10％的交叉反应性的抗血清。可任选的通过加入所考虑的蛋白质(如远亲同系物)，来免疫吸附，以除去合并抗血清中的交叉反应抗体。

然后将免疫吸附的合并抗血清用于上述竞争性结合免疫试验，来比较第二蛋白质(考虑其可能是GPCR-B3的等位或多态变体)和免疫原蛋白质(即SEQ IDNO：1-3的GPCR-B3)。为了进行该比较，以广泛浓度各检测了两种蛋白质，并确定抑制50％抗血清与固定化蛋白质结合所需的各蛋白质量。如果抑制50％结合所需的第二种蛋白质的量比SEQ ID NO：1-3编码的蛋白质抑制50％结合所需的量少10倍，则说第二种蛋白质能与针对GPCR-B3免疫原产生的多克隆抗体特异性结合。

其它试验

用蛋白质印迹(免疫印迹)分析检测并定量样品中GPCR-B3的存在。该技术一般包括用凝胶电泳根据分子量分离样品蛋白质，将分离的蛋白质转移到合适固相载体(如硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜、或衍生的尼龙滤膜)上，并培育样品和与GPCR-B3特异性结合的抗体。抗GPCR-B3抗体与固相载体上的GPCR-B3特异性结合。这些抗体可直接标记或随后用标记抗体(如标记的绵羊抗小鼠抗体，其与抗GPCR-B3抗体特异性结合)检测。

其它试验包括脂质体免疫试验(LIA)，它用设计的脂质体结合特异性分子(如抗体)，并释放包裹的试剂或标记物。然后根据标准技术检测释放的化学物质(见Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.5：34-41(1986))。

非特异性结合的还原

本领域技术人员将理解，常需要使免疫试验中非特异性结合最小化。特别是，当试验涉及固定在固相基质上的抗原或抗体时，需要使与基质的非特异性结合量最小化是理想的。减少这些非特异性结合的方法是本领域技术人员熟知的。通常该技术涉及用蛋白质组合物包被基质。具体说，广泛使用牛血清清蛋白(BSA)、脱脂粉末状牛奶和明胶等蛋白质组合物，而粉末状牛奶是最优选的。

标记

在试验中使用的特定标记或可检测基团不是本发明的关键部分，只要它不显著影响试验中使用的抗体的特异性结合。可检测基团可以是任何具有可检测的物理或化学性能的材料。这些可检测标记已在免疫试验领域中良好开发，而且，一般这些方法中的大部分标记都可用于本发明。因此，标记是分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、电子学、光学或化学方法可检测的任何组合物。本发明中可用的标记包括磁珠(如DYNABEAD^TM)、荧光染料(如异硫氰酸荧光素、Texas red、罗丹明等)、放射性标记(如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)、酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它ELISA中常用的酶)、和显色标记，如胶体金或着色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。

根据本领域熟知的方法，可直接或间接将标记与所需试验成分偶联。如上所示，可使用各种各样的标记，选择标记由所需灵敏度、和化合物偶联的容易度、稳定性要求、可得仪器和处理准备而定。

常用间接方法来结合非放射性标记。通常配体分子(如生物素)与该分子共价结合。然后该配体与另一种分子(如链霉亲和素)结合，另一种分子本身可被检测或可与一种信号系统，如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物共价结合。可将配体及其靶与识别GPCR-B3的抗体，或识别抗GPCR-B3的第二抗体适当联合使用。

可直接将分子与产生信号的化合物偶联，如与酶或荧光蛋白偶联。作为标记的感兴趣的酶主要是水解酶，特别是磷酸酯酶，酯酶和糖苷酶，氧化物酶(oxidotase)，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光黄及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹(磺)酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮，如鲁米诺。关于可使用的各种标记或信号产生系统的综述，见美国专利号4,391,904。

检测标记的方法是本领域技术人员熟知的。因此例如，当标记是放射性标记时，检测仪器包括闪烁计数器或放射性自显影中的照相胶片。当标记是荧光标记时，可用合适波长的光激发荧光色素，并检测产生的荧光来检测。荧光可以目测，通过感光胶片，用电子探测器如电荷偶联装置(CCD)或光电倍增管等。类似的，可提供合适的酶底物并检测产生的反应产物，来检测酶标记。最后，可观察与标记相关的颜色，来简单检测显色标记。因此，在各种测量尺试验中，偶联的金常呈粉红色，而各种偶联的珠呈珠的颜色。

一些试验不需要使用标记的组分。例如，可用凝集试验检测靶抗体的存在。就此而言，抗原包裹的颗粒被含有靶抗体的样品凝集。在该试验中，没有任何成分需要标记，可简单目测靶抗体的存在。

VI.GPCR-B3调节剂的试验

A.GPCR-B3活性试验

GPCR-B3及其等位和多态变体是参与味觉转导的G-蛋白质偶联受体。可用不同的体外和体内试验评估GPCR-B3多肽的活性，来测定功能、化学和物理作用，如测量配体结合(如放射性配体结合)、第二信使(如cAMP、cGMP、IP₃、DAG、或Ca²⁺)、离子流、磷酸化水平、转录水平、神经递质水平等。另外，可用这些试验检测GPCR-B3的抑制物和激活物。调节剂还可以是GPCR-B3的遗传改变版本。这些味觉转导活性的调节剂可用来按要求改变味觉。

从具有SEQ ID NO：1-3的序列的多肽，或其保守性修饰的变体中选出试验用的GPCR-B3。另外，试验用的GPCR-B3可衍生自真核生物，并包括具有氨基酸序列相同性的SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列。一般氨基酸序列相同性是至少70％，可任选至少85％，最优选至少90-95％。可任选的，试验用的多肽可含有GPCR-B3的一个功能域，如胞外功能域、跨膜功能域、细胞质功能域、配体结合功能域、亚基结合功能域、活化位点等。GPCR-B3或其功能域可与异源蛋白共价连接，产生用于本文所述试验的嵌合蛋白质。

可用上述GPCR-B3多肽，不论是重组的或天然的，测试GPCR-B3的调节剂。重组或天然存在的蛋白质可以分离，在细胞中表达，在衍生自细胞的膜中表达，在组织或动物中表达。例如，可使用舌切片、从舌上脱下的细胞，转化的细胞或膜……。用本文所述的体外或体内试验之一检测调节。可在体外用可溶性或固态反应，用嵌合分子，如与异源信号转导功能域共价连接的受体的胞外功能域，或与受体的跨膜和/或胞质功能域共价连接的异源胞外功能域来检测味觉转导。另外，可在体外可溶性或固态反应中使用感兴趣蛋白质的配体结合功能域来测定配体结合。

可在溶液中、与固相结合的双层膜中，脂单层中，或在囊泡中测试与GPCR-B3、功能域或嵌合蛋白质结合的配体。可用例如，分光光度特性的变化(荧光、吸光度、折射指数)水动力学(如形状)、色谱或溶解特性的变化测试调节剂的结合。

还可检测受体-G-蛋白相互反应。例如，可检测G蛋白与受体的结合或其从受体上的释放。例如，不存在GTP的情况下，活化剂将导致G蛋白(所有三个亚基)与受体形成紧密的复合物。可用上述不同方法检测该复合物。可修改这些试验，来搜索抑制剂。在GTP不存在时在受体和G蛋白中加入激活剂，形成紧密复合物，然后通过观察受体-G蛋白复合物的解离来筛选抑制剂。GTP存在下，G蛋白α亚基从其它两个G蛋白亚基上释放可作为活化的指标。

活化的或抑制的G蛋白将进而改变靶酶、通道和其它效应蛋白的性能。经典的例子是在视觉系统中转导素活化cGMP磷酸二酯酶。刺激性G蛋白活化腺嘌呤核苷酸环化酶，Gq和其它同源G蛋白对磷脂酶的活化，和Gi与其它G蛋白对多种通道的调节。也可检测下游共有序列，如磷脂酶C产生二酰甘油和IP3，和进而IP3使钙迁移。

活化的GPCR受体成为激酶的底物，激酶磷酸化受体的C-端尾(以及其它可能的位点)。因此，激活剂将启动³²P从γ-标记的GTP向受体转移，这可用闪烁计数器测定。C-末端尾的磷酸化将启动视紫红质抑制蛋白样蛋白的结合，并将干扰G-蛋白的结合。该激酶/视紫红质抑制蛋白通路在许多GPCR受体的脱敏中起了关键作用。例如，调节味觉受体保持活化持续时间的化合物，可被用作延长所需味道或切断不好味道的工具。关于GPCR信号转导和检验信号转导的方法的综述，见例如，“酶学方法”，237卷和238卷(1994)和96卷(1983)；Bourne等，自然10：349：117-27(1991)；Bourne等，自然348：125-32(1990)；Pitcher等，生物化学年鉴67：653-92(1998)。

将用潜在的GPCR-B3抑制剂或激活剂处理的样品或试验，与不含测试化合物的对照样品比较，来检测调节的程度。对照样品(未用激活剂或抑制剂)被指定相对GPCR-B3活性值为100。当与对照比较，GPCR-B3活性值是约90％，可任选50％，可任选25-0％时，实现对GPCR-B3的抑制。当GPCR-B3活性值相对于对照是110％，可任选150％，200-500％，或1000-2000％时，实现了对GPCR-B3的活化。

通过测定表达GPCR-B3的细胞或膜的极化(即电势)的变化，来评估离子流的变化。一种测定细胞极化中的变化的方法是用电压钳和膜片钳技术，如“细胞结合”模式，“外翻”模式，和“全细胞”模式测量电流的变化(从而测量极化的变化)(见例如，Ackerman等，新英格兰医学杂志336：1575-1595(1997))。用标准方法可方便的测定全细胞电流(见例如，Hamil等，PFlugers.Archiv.391：85(1981))。其它已知试验包括：放射性标记离子流试验和使用电压-敏感性染料的荧光试验(见例如Vestergarrd-Bogind等，膜生物学杂志88：67-75(1988)；Gonzales&Tsien，化学生物学4：269-277(1997)；Daniel等，药物学方法杂志25：185-193(1991)；Holevinsky等，膜生物学杂志137：59-70(1994))。一般要测试的化合物存在范围是1pM到100mM。

可检测上述任一参数来测量测试化合物对该多肽功能的作用。可用任何合适的影响GPCR活性的生理学变化来评估测试化合物对本发明多肽的影响。当用完整细胞或动物测定功能性结果时，还可测量不同作用，如递质释放、激素释放、已知的和未确定特征的基因标记物(如RNA印迹)的转录变化，细胞代谢的变化，如细胞生长或pH的变化，和胞内第二信使，如Ca²⁺、IP3和cAMP的变化。

G蛋白偶联受体的试验包括负载有离子或电压敏感性染料，能报告受体活性的细胞。测定这些受体活性的试验还可使用已知的作为阴性或阳性对照的G-蛋白偶联受体的刺激剂和拮抗剂，来评估测试化合物的活性。在鉴定调节性化合物(如刺激剂、拮抗剂)的试验中，细胞质离子水平或膜电压的变化将分别用离子敏感性指示剂或膜电压荧光指示剂监测。在可使用的离子敏感性指示剂和电压探针中，可使用“分子探针1997”目录中公开的那些。对于G-蛋白偶联受体，可在所选试验中使用混合G-蛋白如Gα15和Gα16(Wilkie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10049-10053(1991))。这些混合G-蛋白能偶联大量受体。

受体活化通常引发随后的胞内活动，如第二信使，如IP3的增加，其释放胞内钙离子的储藏。某些G-蛋白偶联受体的活化通过磷脂酶C-介导的磷脂酰肌醇的水解，刺激肌醇三磷酸(IP3)的形成(Berridge&Irvine，自然312：315-21(1984))。IP3进而刺激胞内钙离子储藏的释放。因此，细胞质中钙离子水平的变化，或第二信使水平，如IP3的变化，可用来评估G-蛋白偶联受体的功能。表达这些G-蛋白偶联受体的细胞可能是显示提高的细胞质钙水平，是胞内钙储藏和离子通道活化产生的结果，此时虽然不一定要在无钙缓冲液中进行这种试验，但理想的是可在任选补充了EGTA等螯合剂的缓冲液中进行这些试验，来甄别从内部储藏释放的钙产生的荧光反应。

其它试验可能涉及测定受体活性，其当被活化时，通过活化或抑制腺苷酸环化酶等酶，导致胞内环化核苷酸，如cAMP或cGMP水平的变化。存在环化核苷酸阀门离子通道，如视杆光受体细胞通道和嗅神经元通道，它们在与cAMP或cGMP结合活化后，对阳离子是可通透的(见例如，Altenhofen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9868-9872(1991)和Dhallan等，自然347：184-187(1990))。就受体的活化导致环化核苷酸水平降低的情况而言，优选使细胞暴露于能提高胞内环化核苷酸水平的试剂，如毛喉素，然后在试验的细胞中加入受体激活化合物。可用编码环化核苷酸阀门离子通道、GPCR磷酸酶的DNA和编码(如某些谷氨酸受体、毒蝇碱性乙酰胆碱受体、多巴胺受体、血清紧张素受体等)受体(当被活化时，导致胞质环化核苷酸水平的变化)的DNA共转染宿主细胞，来制备用于该类试验的细胞。

在一个实施例中，在具有将受体与磷脂酶C信号转导途径连接的混杂G-蛋白的异源细胞中，表达GPCR-B3，测量了GPCR-B3活性(见Offermanns&Simon，生物化学杂志270：15175-15180(1995))。可任选的细胞系是HEK-293(它不天然表达GPCR-B3)而混杂G-蛋白是Gα15(Offermanns&Simon，见上)。测量胞内Ca²⁺水平的变化(该变化是对给予与GPCR-B3结合的分子，调节了GPCR-B3信号转导途径的反应)，以检测味觉转导的调节。用荧光Ca²⁺指示染料和荧光显影任选的测量了Ca²⁺水平的变化。

在一实施例中，可用免疫试验测量胞内cAMP或cGMP的变化。Offermann&Simon，生物化学杂志270：15175-15180(1995)描述的方法可用来测定cAMP的水平。另外，可用Felley-Bosco等，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.11：159-164(1994)描述的方法测定cGMP的水平。另外，美国专利4,115,538中描述了一种用于测量cAMP和/或cGMP的试剂盒，在此引入以供参考。

在另一个实施例中，可根据美国专利5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)的水解，在此引入以供参考。简单说，试验涉及用³H-肌醇标记细胞48小时或以上。用测试化合物处理细胞1小时。溶解处理的细胞，用氯仿-甲醇-水抽提，然后用离子交换层析分离肌醇磷酸酯，并用闪烁计数定量。计算促效剂存在时的cpm与缓冲对照cpm的比值，确定刺激倍数。同样，计算拮抗剂存在时的cpm与缓冲液对照(可含可不含促效剂)cpm的比值，确定抑制倍数。

在另一个实施例中，可测量转录水平，来评估测试化合物对信号转导的作用。使测试化合物与含有感兴趣蛋白质的宿主细胞接触足够时间，来影响任何相互反应，然后测量基因表达的水平。可凭经验确定影响这种相互反应的时间量，如通过运行一段时间并测量作为时间的转录水平。可用任何本领域技术人员已知的合适方法测量转录量。例如，可用RNA印迹检测感兴趣的蛋白质的mRNA表达，或用免疫试验鉴定其多肽产物。另外，可如美国专利5,436,128描述的那样，用报道基因进行基于转录的试验。报道基因可以是，如氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。另外，可将感兴趣的蛋白质通过与第二报道子，如绿色荧光蛋白结合，用作间接报道子(见例如，Mistili&Spector，自然生物技术15：961-964(1997))。

然后将转录量与不存在测试化合物的相同细胞中的转录量作比较，或与缺乏感兴趣的蛋白质的基本相同的细胞中的转录量作比较。基本相同的细胞可衍生自这样的相同细胞，即从它制备了重组细胞但未因引入异源DNA而改变。任何转录量的差异表明测试化合物以某种方式改变了固相蛋白质的活性。

B.调节剂

测试的作为GPCR-B3调节剂的化合物可以是任何小化合物或生物分子，如蛋白质、糖、核酸或脂类。另外，调节剂可以是GPCR-B3的遗传学改变形式。通常测试化合物将是小化学分子和肽。实质上任何化合物可被用作本发明试验潜在的调节剂或配体，虽然大多数化合物可溶于水或有机(尤其是基于DMSO的)溶液。设计一种试验，其可通过自动化检验步骤，并为试验提供来源方便的化合物(通常平行进行，如在机器人试验中的微量滴定板上的微量滴定试验)，来筛选庞大的化学药品文库。可理解，有许多化学药品供应商，包括Sigma(St.Louis，MO)、Aldrich(St.Louis，MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs Switzerland)等。

在一实施例中，高通量筛选方法涉及提供一种含有许多潜在治疗化合物(可能的调节剂或配体化合物)的组合性化学药品或肽文库。然后在一个或多个本文所述的试验中筛选这些“组合性化学药品文库”或“配体文库”，来鉴定那些显示理想特征活性的文库成员(具体化学药品种类或亚类)。如此鉴定的化合物可作为常规“前导化合物”或本身能作为潜在的或实际的治疗剂。

组合性化学药品文库是由化学合成或生物学合成，通过组合许多化学“建筑构件”如试剂，产生的多样化合物的集合。例如，线性组合性化学药品文库，如多肽文库是通过以各种可能方式针对给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数)组合一组化学建筑构件(氨基酸)形成的。可通过这种化学建筑构件的组合性混合合成数以百万计的化合物。

制备和筛选组合性化学药品文库是本领域技术人员熟知的。这些组合性化学药品文库包括但不限于：肽文库(见例如，美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，自然354：84-88(1991))。也可采用其它产生化学多样性文库的化学。这些化学包括但不限于：肽(如PCT出版号WO91/19735)、编码的肽(如PCT出版号WO 93/20242)、随机生物寡聚物(如PCT出版号WO 92/00091)、苯并二吖庚因(如美国专利号5,288,514)、多样体(diversome)如乙内酰脲、苯并二吖庚因和二肽(Hobbs等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))、乙烯基类多肽(Hagihara等，美国化学协会杂志114：6568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽肽模拟物(Hirschmann等，美国化学协会杂志114：9217-9218(1992))、小化合物文库的类似有机合成(Chan等，美国化学协会杂志116：2661(1994))、寡氨基甲酸盐(Cho等，科学261：1303(1993))，和/或肽基磷酸酯(Campbell等，有机化学杂志59：658(1994))、核酸文库(见Ausubel Berger和Sambrook，同上)、肽核酸文库(见专利5,539,083)、抗体文库(见例如Vaughn等，自然生物技术，14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)、糖类文库(见例如Liang等，科学274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)、小有机分子文库(见例如苯并二吖庚因，Baum C&EN，an18，33页(1993)；异戊二烯化合物，美国专利5,569,588；噻唑啉酮和间噻唑酮，美国专利5,549,974；吡咯啉酮，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二吖庚因，5,288,514等)。

制备组合文库的装置是可商业购得的(见例如，357MPS，390MPS，AdvancedChem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A AppliedBiosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。另外，许多组合文库自身是可商业购得的(见例如，ComGenex，Princeton，N.J.Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等)。

C.固态和可溶性高通量试验

在一个优选例中本发明提供了的可溶性试验采用分子，如功能域，配体结合功能域、胞外功能域、跨膜功能域(如含有含有7个跨膜区和胞质环)，跨膜功能域和胞质功能域、活化位点、亚基结合区等；与异源蛋白质共价连接，形成嵌合分子的功能域；GPCR-B3；表达天然存在或重组GPCR-B3的细胞或组织。在另一个实施例中，本发明提供了基于体外试验的高通量形式的固相，其中功能域、嵌合分子、GPCR-B3或表达GPCR-B3的细胞或组织与固相底物结合。

在本发明的高通量试验中，可能在一天中筛选上千种不同的调节剂或配体。具体说，可用微量滴定板的各孔进行针对所选潜在调节剂的独立试验，或如果要观察浓度或培育时间的作用，每5-10个孔可测试一个调节剂。因此，一个标准微量滴定板可检验约100(如96)种调节剂。如果使用1536孔板，则一块板可容易的检验从约100-1500种不同化合物。每天检验几块不同的板是可能的；用本发明的整合系统试验筛选约6000-20,000种不同化合物是可能的。最近，已由例如Caliper Technologies(Palo alto，CA)开发了试剂操纵的微流体方法。

可将感兴趣的分子与固态组分直接或间接通过共价或非共价键，如通过标记结合。标记可以是不同组分的任一种。一般与标记结合(标记粘合剂)的分子固定于固相载体，而感兴趣的加标记的分子(如感兴趣的味觉转导分子)通过标记和标记粘合剂的相互作用结合于固相载体。

可采用许多标记和标记粘合剂，可根据文献中详述的已知分子的相互作用。例如，当标记是天然粘合剂，如生物素、蛋白A、蛋白G时，可与合适的标记粘合剂联用(亲和素、链霉亲和素、中性亲和素(neotravidin)、免疫球蛋白的Fc区等)。具有天然粘合剂如生物素的分子的抗体也是广泛可得的；合适的标记粘合剂，见SIGMA immunochemicals 1998 catagolue SIGMA，St.Louis MO)。

类似的，可联合合适的抗体使用任何半抗原或抗原化合物形成标记/标记粘合剂对。数以千计的特异性抗体是商品可购得的，而且许多其它抗体在文献中有所描述。例如，在一种常用配置中，标记是第一抗体，而标记结合剂是第二抗体，它识别第一抗体。除了抗体-抗原相互作用外，受体-配体相互作用也适合作为标记和标记-结合剂配对。例如，细胞膜受体促效剂和拮抗剂(如细胞受体-配体相互作用，如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整合素家族、选择素家族等；见如Pigott&Power，结合分子调查书I(1993))。类似的，毒素和毒物、病毒表位、激素(如鸦片制剂、类固醇等)、胞内受体(如介导各种小配体，包括：类固醇、甲状腺激素、类视色素和维生素D；肽的作用)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环化聚合物构象的)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体都可与不同细胞受体相互作用。

合成聚合物，如聚氨基甲酸乙酯、聚酯、聚羧酸、聚脲、聚酰胺、聚乙亚胺、聚硫化丙烯、聚硅氧烷、聚亚酰胺和聚乙酸酯也可形成合适的标记或标记结合剂。许多其它标记/标记结合剂配对在本文描述的试验系统中也是有用的，而且对于技术人员参考本公开后将是清楚的。

常用接头如肽、聚酯等也可作为标记，并包括多肽序列，如约5-200个氨基酸之间的聚甘氨酸序列。这些柔性接头对于本领域技术人员来说是已知的。例如，聚(乙二醇)接头可得自Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama。这些接头可任选具有酰胺键、巯基键、或杂官能键。

使用任何现有的不同方法将标记结合剂固定在固相基质上。通过将全部或部分基质与一化学试剂(该试剂能将与标记结合剂的部分反应的化学基团固定到表面上)接触，衍生或官能化固相基质。例如，适合与较长链部分结合的基团包括胺、羟基、巯基和羧基。可用氨烷基硅烷和羟烷基硅烷官能化各种表面，如玻璃表面。这些固相生物聚合物阵列的构建在文献中被详细描述。见例如，Merrifield，美国化学协会杂志85：2149-2154(1963)(描述了肽的固相合成)；Geysen等，免疫学方法杂志102：259-274(1987)(描述了固相组分在针上的合成)；Frank&Doring，四面体44：60316040(1988)(描述了不同肽序列在纤维素盘上的合成)；Fodor等，科学，251：767-777(1991)；Sheldon等，临床化学39(4)：718-719(1993)；和Kozal等，天然医药2(7)：753759(1996)(全都描述了固定在固相基质上的生物聚合物阵列)。用于将标记结合剂固定在基质上的非化学方法包括其它常用方法，如加热、UV辐照交联等。

D.基于计算机的试验

还有另一种研究调节GPCR-B3活性的化合物的试验涉及计算机辅助药物设计，其中使用计算机系统来产生GPCR-B3的三维结构，根据其氨基酸序列编码的结构信息。输入的氨基酸序列直接和活跃的与计算机程序中预先设定的算法相互作用，得到蛋白质的二级、三级和四级结构模型。然后检测蛋白质结构模型，来鉴定具有结合例如配体的能力的结构区域。然后用这些区域鉴定与该蛋白质结合的配体。

将至少10个氨基酸残基的序列或编码GPCR-B3多肽的相应核酸序列输入计算机系统，产生了该蛋白质的三维结构模型。从含有SEQ ID NO：1-3，或SEQ IDNO：4-6，及其保守修饰形式选出编码多肽的核酸或多肽的氨基酸序列。氨基酸序列代表该蛋白质的初级序列或亚序列，其编码该蛋白质的结构信息。用计算机键盘将该氨基酸序列(或编码10个氨基酸的核苷酸序列)的至少10个残基输入计算机系统，计算机可读底物包括但不限于：电子储存媒体(如磁盘、磁带、盒式磁盘和芯片)，光学媒介(如CD ROM)，因特网站点散布的信息，和RAM。然后使用本领域技术人员已知的软件从氨基酸序列和计算机系统的相互作用产生该蛋白质的三维结构模型。

氨基酸序列代表编码形成感兴趣的蛋白质的二级、三级和四级结构所需的信息的初级结构。软件观察某些一级结构编码的参数来产生结构模型。这些参数被称为“能量条款”，主要包括静电电势、疏水性能、溶剂可接近表面和氢键、二级能量条款包括范德华力。生物分子形成以累计形式使能量条款最小化的结构。因此，计算机程序用这些一级结构或氨基酸序列编码的条件建立二级结构模型。

然后根据二级结构的能量条款，形成二级结构编码的蛋白质的三级结构。在此时用户可输入其它变量，如是否蛋白质是膜结合的或可溶的，它在体内的位置，及其细胞位置，如细胞质、表面或核。用这些变量和二级结构的能量条款形成三级结构的模型。在三级结构建模中，计算机程序使二级结构的疏水表面和类似的匹配，使二级结构的亲水表面和类似的匹配。

一旦结构已产生，用计算机系统鉴定可能的配体结合区域。如上所述输入氨基酸或核苷酸序列，或化合物的化学式，产生可能的配体的三维结构。然后将该可能的配体的三维结构与GPCR-B3蛋白的结构比较，来鉴定与GPCR-B3结合的配体。用能量条款确定蛋白质和配体之间的结合亲和力，来确定哪些配体具有增强的结合该蛋白质的可能性。

还可用计算机系统筛选GPCR-B3基因的突变、多态变体、等位基因和种间同系物。可将这些突变与疾病情况或基因性状相联系。如上所述，可用GeneChip^TM和相关技术筛选突变、多态变体、等位基因和种间同系物。一旦鉴定到了变体，可用诊断试验来鉴定具有这些突变基因的病人。突变的GPCR-B3基因的鉴定涉及接受输入编码GPCR-B3的第一核酸或氨基酸序列(选自SEQ ID NO：1-3，或SEQ IDNO：4-6及其保守修饰形式)。如上所述将该序列输入计算机系统。然后将第一核酸或氨基酸序列与第二核酸或氨基酸序列(与第一序列基本相同)比较。将第二序列以上述方式输入计算机系统。一旦比较第一和第二序列，鉴定了序列之间的核苷酸或氨基酸差异。这些序列可代表GPCR-B3基因中的等位基因差异，和与疾病状态和基因性状有关的突变。

VIII.试剂盒

GPCR-B3及其同系物是鉴定味觉受体细胞，法医学和亲子鉴定，和测定味觉转导的有用工具。用与GPCR-B3核酸特异性杂交的GPCR-B3特异性试剂，如GPCR-B3探针和引物，和与GPCR-B3蛋白质特异性结合GPCR-B3抗体等GPCR-B3特异性试剂，检测味觉细胞表达和味觉转导调控。

检测样品中GPCR-B3 DNA和RNA的存在的核酸试验包括许多本领域技术人员已知的技术，如DNA分析、RNA分析、斑点印迹、RNase保护、S1分析、扩增技术，如PCR和LCR，和原位杂交。例如在原位杂交中，靶核酸是从其细胞周质中释放出来的，从而能在细胞内杂交，而同时保存细胞形态，利于随后翻译和分析。下列文章提供了对原位杂交技术的纵览：Singer等，生物技术4：230-250(1986)；Haase等，病毒学方法，VII卷，189-226(1984)；和核酸杂交：实践方法(Hames等编，1987)。另外，可用上述各种免疫试验技术检测GPCR-B3蛋白质。通常将测试样品同时与阳性对照(如表达重组GPCR-B3的样品)和阴性对照比较。

本发明还提供了试剂盒，来筛选GPCR-B3调节剂。可从易得的材料和试剂制备这些试剂盒。例如，这些试剂盒可包含下列任一或多种材料：GPCR-B3、反应试管和测试GPCR-B3活性的说明书。可任选的，该试剂盒含有生物学活性GPCR-B3。可根据本发明，根据需要试剂盒的用户和用户的具体需求，来制备各式各样的试剂盒和组分。

IX.施药和药物组合物

可直接将味觉调节剂施给哺乳动物，在体内调节味道。施药可通过通常用于将调节剂化合物引入，待治疗的组织与其最终接触的任何途径，如舌或口接触途径施药。以任何合适方式，可任选的与药物学上可接受的载体一起施用味觉调节剂。合适的施用这些调节剂的方法是现成的，而且是本领域技术人员熟知的，并且，虽然可使用一种以上途径施用一种具体组合物，但一条特定途径常比其它途径提供更迅速和更有效的反应。

药物学上可接受的载体部分由待施用的具体组合物，以及施用该组合物使用的特定方法所确定。因此，有各式各样本发明药物组合物的合适制剂(见例如，Remington’s药物科学，17版，1985)。

味觉调节剂，单独或联合其它合适成分，可制成气雾制剂(即它们可以是“喷雾状”)，以通过吸入施用。可将气雾制剂置于压缩的可接受喷雾剂中，如二氯甲烷、丙烷、氮气等。

适合施用的制剂包括水或非水溶剂、等渗无菌溶液，它们可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂等渗的溶剂，和水和非水无菌悬液，它可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实施中，可口腔、外用、静脉内、腹膜内、膀胱内或鞘内施用该组合物。可任选的，口腔或鼻内施用该组合物。化合物制剂可置于单剂或多剂密封容器，如安瓿和试管中。可从上述的无菌粉末、颗粒和片剂制备溶剂和悬液。还可作为制备食品或药物的一部分施用调节剂。

本发明产品施给病人的剂量应足够能在一段时间内在病人体内产生有益反应。该剂量将由所用的具体味觉调节剂和病人的情况，以及体重或待治疗区域的表面积决定。剂量大小还将由具体病人施用具体化合物或载体后伴随发生的不良副作用、其性质和程度决定。

在确定要施用的调节剂的有效量时，医师可评估调节剂的循环血浆水平，调节剂的毒性，以及抗-调节剂抗体的产生。一般，相当于调节剂的剂量对于一般个体是约1ng/kg-10mg/kg。

为了施用，本发明的味觉调节剂可以根据该调节剂的LD-50，和抑制剂在不同浓度的副作用(如对病人的质量和总体健康)来确定施药速度。可通过单剂或分剂量完成施药。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请在此引入以供参考，如同各单独出版物或专利申请具体和单独指明引入以供参考的那样。

虽然前面的发明已用一些说明性的细节和便于理解的例子进行了描述，本领域普通技术人员将根据本发明的精神容易的懂得，可对本发明作某些改变和修饰，而不违背权利要求的精神和范围。

实施例

提供下列实施例仅供说明，而不是为了限制。本领域技术人员将轻易理解，可改变或修改各种非关键性参数，而得到实质上相似的结果。

实施例I：GPCR-B3的克隆和表达

由于味觉转导存在于舌的味蕾和上颚表皮中发现的味觉受体细胞中，从大鼠味觉乳头了全长的cDNA文库。用oligo-dT引导从几百个大鼠周缘乳头中分离polyA+RNA，并用定向IZAP载体(Stratagene Inc；Hoon&Ryba，J.Dent.Res.76：831-838(1997))根据标准分子生物学程序(见例如，Ausubel等，分子生物学现有方案(1995))制备了该文库。还从大鼠和小鼠周缘、叶状和蕈状乳头的单个分离的味觉受体细胞和味蕾，根据Dulac&Axel，细胞83：195-206(1995)制备了单细胞和单味蕾cDNA文库集合。用酶消化和显微切片来自成年大鼠和小鼠的舌上皮。为了使味蕾制备物中的裂解效率最大，将裂解液体积增加了10倍(Dulac&Axel，见上)。

从IZAP周缘cDNA文库中，首先产生富含味觉组织中表达的序列的差减文库，分离GPCR-B3。味觉受体细胞差减cDNA文库的构建和起始分析如Hoon&Ryba所述，见上。用非味觉cDNA探针斑点印迹法筛选cDNA克隆，实现了味觉特异性转录物的进一步富集。制备第一链cDNA并用如Ausubel等(见上所述)的随机探测方法标记产生独立的杂交探针。杂交条件和洗液是杂交65℃，2X SSC，洗涤65℃，0.1X SSC。

挑选所有在用味觉和非味觉组织差异筛选中显示味觉组织富集的cDNA进行标准双脱氧末端法，和自动ABI测序仪进行的DNA测序。用不同同源和结构预测程序(如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/的blast和http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/seq-search/struc-predict.html的Tmpred)对DNA进行数据分析。选出编码新序列，与已知信号传递成分具有某些相似性的序列，具有多个预测的跨膜功能域的序列，或具有已知构型，如SH2、SH3、PDZ等(见http：//pfam.wustl.edu/的pfam)的序列的独立cDNA，作为进一步分析的候选DNA。

通过与大鼠舌组织切片的原位杂交检测候选DNA的味觉细胞表达。从成年大鼠获得组织。将新鲜冰冻的切片(14毫米)与硅烷化玻片结合，如Ryba&Tirindelli，神经元19：371-379(1997)所述制备用于原位杂交。在高严格度(5xSSC，50％甲酰胺，72℃)下进行所有原位杂交。对于单标记检测，用碱性磷酸酶偶联的异羟基洋地黄毒甙元抗体和标准显色底物(Boehringer Mannheim)显示信号，如Ryba&Tirindelli，见上所述。在～2000酶解和单细胞cDNA克隆上进行部分DNA测序反应，和用～400不同候选cDNA进行原位杂交。该筛选鉴定了许多在味觉受体细胞中表达的基因，包括一个编码GPCR-B3的3’片段的克隆。

从1ZAP大鼠周缘cDNA文库中，根据标准噬斑杂交方案(Ausubel等，见上)，分离了全长大鼠GPCR-B3。将约2.5×10⁶个克隆以高密度置于LB平板上(约100，000噬斑/板)，用放射性标记的GPCR-B3探针在高严格度(65℃，2xSSC)下影印杂交。收集阳性克隆，重新测试，纯化并用DNA限制性作图和测序分析确定特征。分离了数个全长GPCR-B3克隆，并确定特征(见SEQ ID NO：4-6及其编码的氨基酸序列，SEQ ID NO：1-3)。

在低和中等严格度下(48℃，7xSSC和55℃，5xSSC)，筛选小鼠基因组Bac和1文库(Genome Systems)，分离小鼠的大鼠GPCR-B3种间同系物。通过限制性作图和DNA测序确定了克隆特征。进行RACE反应(Marathon Kit，Clonetech)，用从小鼠周缘和叶状乳头分离的RNA制备的第一链cDNA分离了小鼠cDNA。从人睾丸文库(Clonetech Inc.)分离了人GPCR-B3的同系物，并观察到其它感觉受体，如嗅觉和视觉受体在睾丸中表达(Axel&Dulac，见上)。见图1的GPCR-B3拓扑图，显示胞外功能域，7个跨膜功能域和一个胞内或C-末端功能域。

实施例II：蛋白质印迹和原位分析

为了证明GPCR-B3蛋白质在味觉细胞中的特异性表达，针对短肽和GPCR-B3融合蛋白质产生了抗体。该肽由从GPCR-B3推测蛋白质(见例如SEQ ID NO：1和2)的N-或C-末端的18个氨基酸残基构成。融合蛋白由包含全部N-末端功能域或最后3个预测跨膜区段加上C-末端区的GST-融合多肽构成。用标准分子技术(Harlow&Lane，抗体(1988))产生了融合物。将肽与载体蛋白质融合，接种入家兔，然后纯化血清并如Cassill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：11067-11070(1991)所述试验。

通过蛋白质印迹分析来自周缘或蕈状乳头的蛋白匀浆测试了抗体特异性。该印迹还含有肝和脑蛋白抽提物作为阴性对照。对于免疫组织化学，如Ryba&tirindelli，见上所述制备了冰冻切片，用于原位杂交，除了封闭反应使用10％驴免疫球蛋白、1％牛血清清蛋白、0.3％Triton X-100。在合适稀释度的抗-TR1(1∶100)中培育切片12-18小时，用荧光蛋白偶联的驴抗-兔第二抗体(Jackson Immunolaboratory)检测。用F-肌动素标记BODIPYRTR-X类鬼笔环肽(Molecular Probes)对染味蕾。作为这些研究的对照，还使用了抗-NCAM抗体。用带有氩-氪激光的Leica TSC共焦显微镜获得荧光显影。用肽免疫原预处理抗体终止了染色。对于蛋白质印迹和原位分析，分别见图2和3。

                             序列表

大鼠GPCR-B3氨基酸序列--SEQ ID NO：1

MLFWAAHLLLSLQLVYCWAFSCQRTESSPGFSLPGDFLLAGLFSLHGDCLQVRHRPLVTS

CDRPDSFNGHGYHLFQAMRFTVEEINNSSALLPNITLGYELYDVCSESANVYATLRVLAL

QGPRHIEIQKDLRNHSSKVVAFIGPDNTDHAVTTAALLGPFLMPLVSYEASSVVLSAKRK

FPSFLRTVPSDRHQVEVMVQLLQSFGWVWISLIGSYGDYGQLGVQALEELAVPRGICVAF

KDIVPFSARVGDPRMQSMMQHLAQARTTVVVVFSNRHLARVFFRSVVLANLTGKVWVASE

DWAISTYITSVTGIQGIGTVLGVAVQQRQVPGLKEFEESYVRAVTAAPSACPEGSWCSTN

QLCRECHTFTTRNMPTLGAFSMSAAYRVYEAVYAVAHGLHQLLGCTSEICSRGPVYPWQL

LQQIYKVNFLLHENTVAFDDNGDTLGYYDIIAWDWNGPEWTFEIIGSASLSPVHLDINKT

KIQWHGKNNQVPVSVCTTDCLAGHHRVVVGSHHCCFECVPCEAGTFLNMSELHICQPCGT

EEWAPKESTTCFPRTVEFLAWHEPISLVLIAANTLLLLLLVGTAGLFAWHFHTPVVRSAG

GRLCFLMLGSLVAGSCSFYSFFGEPTVPACLLRQPLFSLGFAIFLSCLTIRSFQLVIIFK

FSTKVPTFYRTWAQNHGAGLFVIVSSTVHLLICLTWLVMWTPRPTREYQRFPHLVILECT

EVNSVGFLLAFTHNILLSISTFVCSYLGKELPENYNEAKCVTFSLLLNFVSWIAFFTMAS

IYQGSYLPAVNVLAGLTTLSGGFSGYFLPKCYVILCRPELNNTEHFQASIQDYTRRCGTT

小鼠GPCR-B3氨基酸序列--SEQ ID NO：2

MLFWAAHLLLSLQLAVAYCWAFSCQRTESSPGFSLPGDFLIAGLFSLHADCLQVRHRPLV

TSCDRSDSFNGHGYHLFQAMRFTVEEINNSTALLPNITLGYELYDVCSESSNVYATLRVP

AQQGTGHLEMQRDLRNHSSKVVALIGPDNTDHAVTTAALLSPFLMPLVSYEASSVILSGK

RKFPSFLRTIPSDKYQVEVIVRLLQSFGWVWISLVGSYGDYGQLGVQALEELATPRGICV

AFKDVVPLSAQAGDPRMQRMMLRLARARTTVVVVFSNRHLAGVFFRSVVLANLTGKVWIA

SEDWAISTYITNVPGIQGIGTVLGVAIQQRQVPGLKEFEESYVQAVMGAPRTCPEGSWCG

TNQLCRECHAFTTWNMPELGAFSMSAAYNVYEAVYAVAHGLHQLLGCTSGTCARGPVYPW

QLLQQIYKVNFLLHKKTVAFDDKGDPLGYYDIIAWDWNGPEWTFEVIGSASLSPVHLDIN

KTKIQWHGKNNQVPVSVCTRDCLEGHHRLVMGSHHCCFECMPCEAGTFLNTSELHTCQPC

GTEEWAPEGSSACFSRTVEFLGWHEPISLVLLAANTLLLLLLIGTAGLFAWRLHTPVVRS

AGGRLCFLMLGSLVAGSCSLYSFFGKPTVPACLLRQPLFSLGFAIFLSCLTIRSFQLVII

FKFSTKVPTFYHTWAQNHGAGIFVIVSSTVHLFLCLTWLAMWTPRPTREYQRFPHLVILE

CTEVNSVGFLVAFAHNILLSISTFVCSYLGKELPENYNEAKCVTFSLLLHFVSWIAFFTM

SSIYQGSYLPAVNVLAGLATLSGGFSGYFLPKCYVILCRPELNNTEHFQASIQDYTRRCG

TT

人GPCR-B3氨基酸序列--SEQ ID NO：3

RSCSFNEHGYHLFQAMRLGVEEINNSTALLPNITLGYQLYDVCSDSANVYATLRVLSLPG

QHHIELQGDLLHYSPTVLAVIGPDSTNRAATTAALLSPFLVHISYAASSETLSVKRQYPS

FLRTIPNDKYQVETMVLLLQKFGWTWISLVGSSDDYGQLGVQALENQALVRGICIAFKDI

MPFSAQVGDERMQCLMRHLAQAGATVVVVFSSRQLARVFFESVVLTNLTGKVWVASEAWA

LSRHITGVPGIQRIGMVLGVAIQKRAVPGLKAFEEAYARADKEAPRPCHKGSWCSSNQLC

RECQAFMAHTMPKLKAFSMSSAYNAYRAVYAVAHGLHQLLGCASELCSRGRVYPWQLLEQ

IHKVHFLLHKDTVAFNDNRDPLSSYNIIAWDWNGPKWTFTVLGSSTWSPVQLNINETKIQ

WHGKNHQVPKSVCSSDCLEGHQRVVTGFHHCCFECVPCGAGTFLNKSELYRCQPCGTEEW

APEGSQTCFPRTVVFLALREHTSWVLLAANTLLLLLLLGTAGLFAWHLDTPVVRSAGGRL

CFLMLGSLAAGSGSLYGFFGEPTRPACLLRQALFALGFTIFLSCLTVRSFQLIIIFKFST

KVPTFYHAWVQNHGAGLFVMISSAAQLLICLTWLVVWTPLPAREYQRFPHLVMLECTETN

SLGFILAFLYNGLLSISAFACSYLGKDLPENTNEAKCVTFSLLFNFVSWIAFFTTASVYD

GKYLPAANMMAGLSSLSSGFGGYFLPKCYVILCRPDLNSTEHFQASIQDYTRRCGST

大鼠GPCR-B3核苷酶序列--SEQ ID NO：4

ATTCACATCAGAGCTGTGCTCAGCCATGCTGGGCAGAGGGACGACGGCTGGCCAGCATGC

TCTTCTGGGCTGCTCACCTGCTGCTCAGCCTGCAGTTGGTCTACTGCTGGGCTTTCAGCT

GCCAAAGGACAGAGTCCTCTCCAGGCTTCAGCCTTCCTGGGGACTTCCTCCTTGCAGGTC

TGTTCTCCCTCCATGGTGACTGTCTGCAGGTGAGACACAGACCTCTGGTGACAAGTTGTG

ACAGGCCCGACAGCTTCAACGGCCATGGCTACCACCTCTTCCAAGCCATGCGGTTCACTG

TTGAGGAGATAAACAACTCCTCGGCCCTGCTTCCCAACATCACCCTGGGGTATGAGCTGT

ACGACGTGTGCTCAGAATCTGCCAATGTGTATGCCACCCTGAGGGTGCTTGCCCTGCAAG

GGCCCCGCCACATAGAGATACAGAAAGACCTTCGCAACCACTCCTCCAAGGTGGTGGCCT

TCATCGGGCCTGACAACACTGACCACGCTGTCACTACCGCTGCCTTGCTGGGTCCTTTCC

TGATGCCCCTGGTCAGCTATGAGGCAAGCAGCGTGGTACTCAGTGCCAAGCGCAAGTTCC

CGTCTTTCCTTCGTACCGTCCCCAGTGACCGGCACCAGGTGGAGGTCATGGTGCAGCTGC

TGCAGAGTTTTGGGTGGGTGTGGATCTCGCTCATTGGCAGCTACGGTGATTACGGGCAGC

TGGGTGTGCAGGCGCTGGAGGAGCTGGCCGTGCCCCGGGGCATCTGCGTCGCCTTCAAGG

ACATCGTGCCTTTCTCTGCCCGGGTGGGTGACCCGAGGATGCAGAGCATGATGCAGCATC

TGGCTCAGGCCAGGACCACCGTGGTTGTGGTCTTCTCTAACCGGCACCTGGCTAGAGTGT

TCTTCAGGTCCGTGGTGCTGGCCAACCTGACTGGCAAAGTGTGGGTCGCCTCAGAAGACT

GGGCCATCTCCACGTACATCACCAGCGTGACTGGGATCCAAGGCATTGGGACGGTGCTCG

GTGTGGCCGTCCAGCAGAGACAAGTCCCTGGGCTGAAGGAGTTTGAGGAGTCTTATGTCA

GGGCTGTAACAGCTGCTCCCAGCGCTTGCCCGGAGGGGTCCTGGTGCAGCACTAACCAGC

TGTGCCGGGAGTGCCACACGTTCACGACTCGTAACATGCCCACGCTTGGAGCCTTCTCCA

TGAGTGCCGCCTACAGAGTGTATGAGGCTGTGTACGCTGTGGCCCACGGCCTCCACCAGC

TCCTGGGATGTACTTCTGAGATCTGTTCCAGAGGCCCAGTCTACCCCTGGCAGCTTCTTC

AGCAGATCTACAAGGTGAATTTTCTTCTACATGAGAATACTGTGGCATTTGATGACAACG

GGGACACTCTAGGTTACTACGACATCATCGCCTGGGACTGGAATGGACCTGAATGGACCT

TTGAGATCATTGGCTCTGCCTCACTGTCTCCAGTTCATCTGGACATAAATAAGACAAAAA

TCCAGTGGCACGGGAAGAACAATCAGGTGCCTGTGTCAGTGTGTACCACGGACTGTCTGG

CAGGGCACCACAGGGTGGTTGTGGGTTCCCACCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGCG

AAGCTGGGACCTTTCTCAACATGAGTGAGCTTCACATCTGCCAGCCTTGTGGAACAGAAG

AATGGGCACCCAAGGAGAGCACTACTTGCTTCCCACGCACGGTGGAGTTCTTGGCTTGGC

ATGAACCCATCTCTTTGGTGCTAATAGCAGCTAACACGCTATTGCTGCTGCTGCTGGTTG

GGACTGCTGGCCTGTTTGCCTGGCATTTTCACACACCTGTAGTGAGGTCAGCTGGGGGTA

GGCTGTGCTTCCTCATGCTGGGTTCCCTGGTGGCCGGAAGTTGCAGCTTCTATAGCTTCT

TCGGGGAGCCCACGGTGCCCGCGTGCTTGCTGCGTCAGCCCCTCTTTTCTCTCGGGTTTG

CCATCTTCCTCTCCTGCCTGACAATCCGCTCCTTCCAACTGGTCATCATCTTCAAGTTTT

CTACCAAGGTGCCCACATTCTACCGTACCTGGGCCCAAAACCATGGTGCAGGTCTATTCG

TCATTGTCAGCTCCACGGTCCATTTGCTCATCTGTCTCACATGGCTTGTAATGTGGACCC

CACGACCCACCAGGGAATACCAGCGCTTCCCCCATCTGGTGATTCTCGAGTGCACAGAGG

TCAACTCTGTAGGCTTCCTGTTGGCTTTCACCCACAACATTCTCCTCTCCATCAGTACCT

TCGTCTGCAGCTACCTGGGTAAGGAACTGCCAGAGAACTATAATGAAGCCAAATGTGTCA

CCTTCAGCCTGCTCCTCAACTTCGTATCCTGGATCGCCTTCTTCACCATGGCCAGCATTT

ACCAGGGCAGCTACCTGCCTGCGGTCAATGTGCTGGCAGGGCTGACCACACTGAGCGGCG

GCTTCAGCGGTTACTTCCTCCCCAAGTGCTATGTGATTCTCTGCCGTCCAGAACTCAACA

ATACAGAACACTTTCAGGCCTCCATCCAGGACTACACGAGGCGCTGCGGCACTACCTGAT

CCACTGGAAAGGTGCAGACGGGAAGGAAGCCTCTCTTCTTGTGCTGAAGGTGGCGGGTCC

AGTGGGGCCGAGAGCTTGAGGTGTCTGGGAGAGCTCCGGCACAGCTTACGATGTATAAGC

ACGCGGAAGAATCCAGTGCAATAAAGACGGGAAGTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAA

小鼠GPCR-B3核苷酸序列--SEQ ID NO：5

TTTGGCCAGCATGCTTTTCTGGGCAGCTCACCTGCTGCTCAGCCTGCAGCTGGCCGTTGC

TTACTGCTGGGCTTTCAGCTGCCAAAGGACAGAATCCTCTCCAGGTTTCAGCCTCCCTGG

GGACTTCCTCCTGGCAGGCCTGTTCTCCCTCCATGCTGACTGTCTGCAGGTGAGACACAG

ACCTCTGGTGACAAGTTGTGACAGGTCTGACAGCTTCAACGGCCATGGCTATCACCTCTT

CCAAGCCATGCGGTTCACCGTTGAGGAGATAAACAACTCCACAGCTCTGCTTCCCAACAT

CACCCTGGGGTATGAACTGTATGACGTGTGCTCAGAGTCTTCCAATGTCTATGCCACCCT

GAGGGTGCCCGCCCAGCAAGGGACAGGCCACCTAGAGATGCAGAGAGATCTTCGCAACCA

CTCCTCCAAGGTGGTGGCACTCATTGGGCCTGATAACACTGACCACGCTGTCACCACTGC

TGCCCTGCTGAGCCCTTTTCTGATGCCCCTGGTCAGCTATGAGGCGAGCAGCGTGATCCT

CAGTGGGAAGCGCAAGTTCCCGTCCTTCTTGCGCACCATCCCCAGCGATAAGTACCAGGT

GGAAGTCATAGTGCGGCTGCTGCAGAGCTTCGGCTGGGTCTGGATCTCGCTCGTTGGCAG

CTATGGTGACTACGGGCAGCTGGGCGTACAGGCGCTGGAGGAGCTGGCCACTCCACGGGG

CATCTGCGTCGCCTTCAAGGACGTGGTGCCTCTCTCCGCCCAGGCGGGTGACCCAAGGAT

GCAGCGCATGATGCTGCGTCTGGCTCGAGCCAGGACCACCGTGGTCGTGGTCTTCTCTAA

CCGGCACCTGGCTGGAGTGTTCTTCAGGTCTGTGGTGCTGGCCAACCTGACTGGCAAAGT

GTGGATCGCCTCCGAAGACTGGGCCATCTCCACGTACATCACCAATGTGCCCGGGATCCA

GGGCATTGGGACGGTGCTGGGGGTGGCCATCCAGCAGAGACAAGTCCCTGGCCTGAAGGA

GTTTGAAGAGTCCTATGTCCAGGCAGTGATGGGTGCTCCCAGAACTTGCCCAGAGGGGTC

CTGGTGCGGCACTAACCAGCTGTGCAGGGAGTGTCACGCTTTCACGACATGGAACATGCC

CGAGCTTGGAGCCTTCTCCATGAGCGCTGCCTACAATGTGTATGAGGCTGTGTATGCTGT

GGCCCACGGCCTCCACCAGCTCCTGGGATGTACCTCTGGGACCTGTGCCAGAGGCCCAGT

CTACCCCTGGCAGCTTCTTCAGCAGATCTACAAGGTGAATTTCCTTCTACATAAGAAGAC

TGTAGCATTCGATGACAAGGGGGACCCTCTAGGTTATTATGACATCATCGCCTGGGACTG

GAATGGACCTGAATGGACCTTTGAGGTCATTGGTTCTGCCTCACTGTCTCCAGTTCATCT

AGACATAAATAAGACAAAAATCCAGTGGCACGGGAAGAACAATCAGGTGCCTGTGTCAGT

GTGTACCAGGGACTGTCTCGAAGGGCACCACAGGTTGGTCATGGGTTCCCACCACTGCTG

CTTCGAGTGCATGCCCTGTGAAGCTGGGACATTTCTCAACACGAGTGAGCTTCACACCTG

CCAGCCTTGTGGAACAGAAGAATGGGCCCCTGAGGGGAGCTCAGCCTGCTTCTCACGCAC

CGTGGAGTTCTTGGGGTGGCATGAACCCATCTCTTTGGTGCTATTAGCAGCTAACACGCT

ATTGCTGCTGCTGCTGATTGGGACTGCTGGCCTGTTTGCCTGGCGTCTTCACACGCCTGT

TGTGAGGTCAGCTGGGGGTAGGCTGTGCTTCCTCATGCTGGGTTCCTTGGTAGCTGGGAG

TTGCAGCCTCTACAGCTTCTTCGGGAAGCCCACGGTGCCCGCGTGCTTGCTGCGTCAGCC

CCTCTTTTCTCTCGGGTTTGCCATTTTCCTCTCCTGTCTGACAATCCGCTCCTTCCAACT

GGTCATCATCTTCAAGTTTTCTACCAAGGTACCCACATTCTACCACACTTGGGCCCAAAA

CCATGGTGCCGGAATATTCGTCATTGTCAGCTCCACGGTCCATTTGTTCCTCTGTCTCAC

GTGGCTTGCAATGTGGACCCCACGGCCCACCAGGGAGTACCAGCGCTTCCCCCATCTGGT

GATTCTTGAGTGCACAGAGGTCAACTCTGTGGGCTTCCTGGTGGCTTTCGCACACAACAT

CCTCCTCTCCATCAGCACCTTTGTCTGCAGCTACCTGGGTAAGGAACTGCCGGAGAACTA

TAACGAAGCCAAATGTGTCACCTTCAGCCTGCTCCTCCACTTCGTATCCTGGATCGCTTT

CTTCACCATGTCCAGCATTTACCAGGGCAGCTACCTACCCGCGGTCAATGTGCTGGCAGG

GCTGGCCACTCTGAGTGGCGGCTTCAGCGGCTATTTCCTCCCTAAATGCTACGTGATTCT

CTGCCGTCCAGAACTCAACAACACAGAACACTTTCAGGCCTCCATCCAGGACTACACGAG

GCGCTGCGGCACTACCTGAGGCGCTGCGGCACTACCTGAGGCGCTGCGGCACTACCTGA

人GPCR-B3核苷酸序列--SEQ ID NO：6

AGGTCTTGTAGCTTCAATGAGCATGGCTACCACCTCTTCCAGGCTATGCGGCTTGGGGTT

GAGGAGATAAACAACTCCACGGCCCTGCTGCCCAACATCACCCTGGGGTACCAGCTGTAT

GATGTGTGTTCTGACTCTGCCAATGTGTATGCCACGCTGAGAGTGCTCTCCCTGCCAGGG

CAACACCACATAGAGCTCCAAGGAGACCTTCTCCACTATTCCCCTACGGTGCTGGCAGTG

ATTGGGCCTGACAGCACCAACCGTGCTGCCACCACAGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTCCTG

GTGCATATTAGCTATGCGGCCAGCAGCGAGACGCTCAGCGTGAAGCGGCAGTATCCCTCT

TTCCTGCGCACCATCCCCAATGACAAGTACCAGGTGGAGACCATGGTGCTGCTGCTGCAG

AAGTTCGGGTGGACCTGGATCTCTCTGGTTGGCAGCAGTGACGACTATGGGCAGCTAGGG

GTGCAGGCACTGGAGAACCAGGCCCTGGTCAGGGGCATCTGCATTGCTTTCAAGGACATC

ATGCCCTTCTCTGCCCAGGTGGGCGATGAGAGGATGCAGTGCCTCATGCGCCACCTGGCC

CAGGCCGGGGCCACCGTCGTGGTTGTTTTTTCCAGCCGGCAGTTGGCCAGGGTGTTTTTC

GAGTCCGTGGTGCTGACCAACCTGACTGGCAAGGTGTGGGTCGCCTCAGAAGCCTGGGCC

CTCTCCAGGCACATCACTGGGGTGCCCGGGATCCAGCGCATTGGGATGGTGCTGGGCGTG

GCCATCCAGAAGAGGGCTGTCCCTGGCCTGAAGGCGTTTGAAGAAGCCTATGCCCGGGCA

GACAAGGAGGCCCCTAGGCCTTGCACAAGGGCTCCTGGTGCAGCAGCAATCAGCTCTGCA

GAGAATGCCAAGCTTTCATGGCACACACGATGCCCAAGCTCAAAGCCTTCTCCATGAGTT

CTGCCTACAACGCATACCGGGCTGTGTATGCGGTGGCCCATGGCCTCCACCAGCTCCTGG

GCTGTGCCTCTGAGCTCTGTTCCAGGGGCCGAGTCTACCCCTGGCAGCTTTTGGAGCAGA

TCCACAAGGTGCATTTCCTTCTACACAAGGACACTGTGGCGTTTAATGACAACAGAGATC

CCCTCAGTAGCTATAACATAATTGCCTGGGACTGGAATGGACCCAAGTGGACCTTCACGG

TCCTCGGTTCCTCCACATGGTCTCCAGTTCAGCTAAACATAAATGAGACCAAAATCCAGT

GGCACGGAAAGAACCACCAGGTGCCTAAGTCTGTGTGTTCCAGCGACTGTCTTGAAGGGC

ACCAGCGAGTGGTTACGGGTTTCCATCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGTGGGGCTG

GGACCTTCCTCAACAAGAGCGAGCTCTACAGATGCCAGCCTTGTGGAACAGAAGAGTGGG

CACCTGAGGGAAGCCAGACCTGCTTCCCGCGCACTGTGGTGTTTTTGGCTTTGCGTGAGC

ACACCTCTTGGGTGCTGCTGGCAGCTAACACGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGGGACTG

CTGGCCTGTTTGCCTGGCACCTAGACACCCCTGTGGTGAGGTCAGCAGGGGGCCGCCTGT

GCTTTCTTATGCTGGGCTCCCTGGCAGCAGGTAGTGGCAGCCTCTATGGCTTCTTTGGGG

AACCCACAAGGCCTGCGTGCTTGCTACGCCAGGCCCTCTTTGCCCTTGGTTTCACCATCT

TCCTGTCCTGCCTGACAGTTCGCTCATTCCAACTAATCATCATCTTCAAGTTTTCCACCA

AGGTACCTACATTCTACCACGCCTGGGTCCAAAACCACGGTGCTGGCCTGTTTGTGATGA

TCAGCTCAGCGGCCCAGCTGCTTATCTGTCTAACTTGGCTGGTGGTGTGGACCCCACTGC

CTGCTAGGGAATACCAGCGCTTCCCCCATCTGGTGATGCTTGAGTGCACAGAGACCAACT

CCCTGGGCTTCATACTGGCCTTCCTCTACAATGGCCTCCTCTCCATCAGTGCCTTTGCCT

GCAGCTACCTGGGTAAGGACTTGCCAGAGAACTACAACGAGGCCAAATGTGTCACCTTCA

GCCTGCTCTTCAACTTCGTGTCCTGGATCGCCTTCTTCACCACGGCCAGCGTCTACGACG

GCAAGTACCTGCCTGCGGCCAACATGATGGCTGGGCTGAGCAGCCTGAGCAGCGGCTTCG

GTGGGTATTTTCTGCCTAAGTGCTACGTGATCCTCTGCCGCCCAGACCTCAACAGCACAG

AGCACTTCCAGGCCTCCATTCAGGACTACACGAGGCGCTGCGGCTCCACCTGA

Claims (31)

1.一种编码感觉转导G-蛋白偶联受体的分离的核酸，其特征在于，所述核酸在高度严格条件下能与具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6的序列的核酸特异性杂交，其中杂交反应是在50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS的溶液中42℃培育，然后在含有0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中65℃洗涤。

2.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码一种受体，所述受体含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸含有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸是来自人、小鼠或大鼠。

5.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码具有约92kDa-102kDa之间分子量的受体。

6.一种表达载体，其特征在于该表达载体含有权利要求1所述的核酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞被权利要求6所述载体转染。

8.一种制备感觉转导G-蛋白偶联受体的方法，其特征在于，该方法包括步骤：用含有编码该受体的核酸的重组表达载体表达该受体，所述核酸在高度严格条件下能与具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6的序列的核酸特异性杂交，其中杂交反应是在50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS的溶液中42℃培育，然后在含有0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中65℃洗涤。

9.一种制备含有感觉转导G-蛋白偶联受体的重组细胞的方法，其特征在于，该方法包括步骤：用含有编码该受体的核酸的重组表达载体转导细胞，所述核酸在高度严格条件下能与具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6的序列的核酸特异性杂交，其中杂交反应是在50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS的溶液中42℃培育，然后在含有0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中65℃洗涤。

10.一种制备含有编码感觉转导G-蛋白偶联受体的核酸的重组表达载体的方法，其特征在于，该方法包含步骤：将编码所述受体的核酸与一表达载体连接，所述核酸在高度严格条件下能与具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6的序列的核酸特异性杂交，其中杂交反应是在50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS的溶液中42℃培育，然后在含有0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中65℃洗涤。

11.一种分离的核酸，其特征在于，该核酸编码一种感觉转导G-蛋白偶联受体，该受体含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

12.一种分离的核酸，其特征在于，该核酸编码一种感觉转导G-蛋白偶联受体，所述核酸含有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

13.一种分离的感觉转导G-蛋白偶联受体，其特征在于，该受体是由一种核酸编码的，所述核酸在高度严格条件下能与具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQID NO：6的序列的核酸特异性杂交，其中杂交反应是在50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS的溶液中42℃培育，然后在含有0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中65℃洗涤。

14.如权利要求13所述的受体，其特征在于，该受体含有SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

15.如权利要求13所述的受体，其特征在于，所述核酸含有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

16.如权利要求13所述的受体，其特征在于，所述核酸是来自人、小鼠或大鼠。

17.如权利要求13所述的受体，其特征在于，所述受体具有92kDa-102kDa的分子量。

18.一种抗体，其特征在于，该抗体与权利要求13所述受体选择性结合。

19.一种鉴定调节感觉细胞中的感觉信号传递的化合物的方法，其特征在于，该方法包括步骤如下：

(i)使所述化合物与感觉转导G-蛋白偶联受体接触，该受体是由一种核酸编码的，所述核酸在高度严格条件下能与具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQID NO：6的序列的核酸特异性杂交，其中杂交反应是在50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS的溶液中42℃培育，然后在含有0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中65℃洗涤；和

(ii)确定所述化合物对所述受体的功能性作用。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述受体含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述受体是由具有SEQ ID NO：ID NO：4、SEQ ID NO：ID NO：5或SEQ ID NO：ID NO：6的核苷酸序列的核酸编码的。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述多肽来自大鼠、小鼠或人。

23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述受体具有92kDa-102kDa的分子量。

24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是化学作用。

25.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是物理作用。

26.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是通过测定化合物与受体的结合确定的。

27.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述功能性作用是通过测量胞内cAMP、IP3、或Ca²⁺的变化确定的。

28.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽是重组的。

29.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽来自大鼠、小鼠或人。

30.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多肽在细胞内或细胞膜中表达。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述细胞是真核细胞。

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