CN1094446A - Eck受体配体 - Google Patents

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Abstract

公开了与eck受体结合的配体。尤其是公开了 与eck受体特异性结合的多肽(eck受体结合蛋白或 EBPｓ)和编码所述多肽的DNA序列。公开了使用 eck受体配体和可溶性eck受体的治疗方法，及含它 们的药物组合物，提供了一种检测粗样品中受体结合 活性的快速灵敏的方法。

Description

本发明主要涉及ECK受体的配体，特别是涉及称为eck受体结合蛋白（EBPs）的多肽配体。本发明也包括使用eck受体配体和可溶性eck受体的治疗方法，以及含上述组分的药物组合物。同时也描述了用于检测粗样品中受体结合活性的一种快速灵敏的方法。
肽生长和分化因子通过与细胞表面的受体特异性地相互作用在靶细胞中引起反应。生长因子受体一般是随细胞外区，跨膜区和细胞内区而不同的膜糖蛋白。所述区域的结构分异与功能相符（ullrich等人，Cell  61，203（1990））;细胞外区似乎引起配体结合以及配体-介导的受体二聚作用（Cunningham等人，Science  254，821（1991）;Lev等人，J.Biol.Chem.276  10866（1992）），而受体的细胞内区或附属成分的细胞内区（Takeshita等人，Science  257，379（1992））引起信号转导。生长因子活性的大部分特异性由与源受体细胞外检的结合位点的相互作用支配。嵌合受体，（用遗传工程方法加工的含一种受体的细胞外区和第二种受体的细胞内区）保留了细胞外成分的配体特异性（Lehvaslaiho等人，EMBO  J.8，159（1989））。由所述嵌合受体激活的下游信号途径与由细胞内成分激活的那些一致。在受体的许多可溶形式（仅由细胞外区组成的）中，保留了配体结合活性（Lev等人.ibid;Duan等人，J.Biol  Chem  266，413（1991））。已经鉴定了在血清（Fernandez-Botran  FASEB  J.5，2567（1991）），细胞培养上清液（Zabrecky等人，J.Biol.Chem.266，1716（1991））中的平截受体，并已用重组技术进行了生产（Lev等人，ibid，Duan等人，ibid）。
在核酸定序和扩增技术方面的最新进展使得数量不断增加的编码了以前未鉴定的生长因子的受体的基因能够得以鉴别（Wilks  Proc.Natl  Acad.Sci  USA  36，1603（1989）;Lai等人，Neuron  6.691（1991））。结果，要求研究能确定孤儿受体（orphan  receptors）生物学作用的方法，包括能鉴定这些受体配体的技术（McConnell等人，Science  257，1906（1992））。受体亲和技术是解决该问题的一种方法。这种技术可以扩充分离生长因子的现有方法，因为若反应微妙或不确定时，可以检测配体。
最新的报道表明可用受体的细胞外区作为生长因子-特异性的亲和剂。Bailon等人（Biotechnology  5，1195（1987））已表明可将IL-2受体α亚单位的细胞外区固定在层析介质上并用于纯化重组IL-2。该盒（kit）的细胞外区与碱性磷酸酶碎片的遗传融合使得与该受体配体有关的细胞可被鉴定（Flanagan等人，Cell  63，185（1990））。Lupu等人（Proc.Natl.Acad  Sei，USA  89，2287（1992））已报道了与固定的erbB-2基因产物的细胞外区结合的亲和纯化活性。
最初通过人上皮细胞文库的CDNA克隆鉴定的eck基因编码一种130KDa受体类似蛋白质酪氨酸激酶（p130eck）（Lindbreg等人，Mol Cell.Biol.10，6316（1990））。组织及细胞系的免疫组织化学和mRNA筛选说明eck表达在上皮细胞中最高。从编码其它受体类似蛋白质酪氨酸激酶的基因类推，eck可能是一种原癌基因并因此在癌的形成中起作用。eck的这种潜在作用似乎使得在人癌中，上皮细胞的出现频繁。受体蛋白激酶一般通过与一种或多种配体的相互作用来激活。但是，能激活p130eck的配体还未有报道。上述配体鉴定对于确定p130eck激活在某些人癌症的产生方面的作用可能是重要的。
因此，本发明的目的之一是鉴定一种或多种p130eck配体。p130eck在上皮细胞转化成癌状态方面的可能作用，说明鉴定引起受体激活的配体对于某些上皮细胞衍生的恶性肿瘤可能有治疗学意义。
本发明主要涉及eck受体配体。尤其是描述了与eck受体特异性结合的多肽（本文称之为eck受体结合蛋白（EBPs）。通过使用固定细胞外eck受体的亲和层析鉴定并分离了EBPs。本发明的EBPs通过结合也可以诱导受体的磷酸化，从而引起靶细胞生理学方面，如细胞生长和/或分化的改变。EBP有基本上如SEQ.ID.NO.1中所示的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，EBP具有如SEQ  ID.NO.1中所示的氨基酸序列的一部分。例如，EBP具有终止于150位的氨基的序列。
特异性结合eck受体的多肽（其中所述多肽具有与SEQ ID NO.1所示基本相同的氨基酸序列并在-1位有甲硫氨酸残基）也包括在内。作为实例，多肽是[Met-1]EBP1-150或[Met-1EBP1-159。也提供编码所述多肽的DNA序列。EBPs也可以是具有在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列部分的类似物。上述类似物的实例是终止于167，171或180位的EBPs。
本发明也提供作为外源DNA序列原核或真核表达产物的EBP，即由重组DNA方法得到的eck受体结合蛋白。
本发明也包括通过检验与受体固定配体结合区的结合，从而检测粗样品中受体结合活性的方法。
同时描述含有治疗有效量eck受体配体的药物组合物。也包括eck受体配体在治疗特定类型癌症，特别是以上皮细胞增殖为特征的癌症中的用途。也可将eck受体配体用于治疗创伤以促进愈合，增加血细胞生成，及刺激肝细胞和结肠隐窝细胞的增殖。
本发明也包括治疗有效量配体顽抗剂或可溶性eck受体用于调节eck受体配体生物学效应的用途。上述治疗在癌症治疗以及控制炎症方面是有用的。
图1A，固定的eck-x亲和层析的SDS-PAGE分析。将来自HCT-8细胞的限制性培养浓缩、透滤，并载了1ml的固定eck-x柱上（每ml凝胶1mg  eck-x）。若需要，在存在0.02%SDS的情况下浓缩样品;圆括号中表示等量原体积。道1，栓载（20ml）。道2，未结合部分（20ml）。道3，PBS洗涤（50ml）。道4，PH4.0洗脱，部分1（200ml）。道5，PH4.0洗脱，部分2（200ml）。道6，PH4.0洗脱，部分3（200ml）。
图1B。固定的eck-x亲和层析的SDS-PAGE分析。将用EBP基因转染的CHO细胞的细胞上清液按对图1A说明中的描述进行处理和分析。
图2.来自HCT-8细胞系的纯化EBP的凝胶过滤分析。将EBP（经固定的eck-x受体亲和层析纯化的）用50μg/mlBSA修正并将其注射到Superdex75柱上。用BIAcore检测各组分的eck-x结合活性。
图3.用EBP  CDNA转染的CHO细胞EBP的Q-Sepharose层析。用SDS-PAGE分析样品并用抗-EBP抗体探查。
图4.用磷脂酶C处理分析从CHO细胞表面释放的膜-结合的EBP。-表示在没有膦脂酶C的情况下温育;+表示在存在磷脂酶C的情况下温育。温育时间是0，5和10分钟。
图5.125I-rEBP与表达eck的CHO19.32细胞的化学交联。按实例5中所述处理细胞。道1，125I-rEBP+CHO 19.32。道2，125I-rEBP+CHOd-（未转染的）.道3，125I-rEBP+CHO19.32，未加交联剂。道4，125I-rEBP+CHO19.32+50x未标记的rEBP。
图6.在用纯化的/rEBP处理的LIM  2405细胞中，eck受体酪氨酸激酶的激活。用增加深度的纯化rEBP（CHOd-/EBP）在37℃将血清-饥饿的LIM2405细胞处理10-15分钟。将处理的细胞溶解，然后用抗-eck  C-末端抗体免疫沉淀。将免疫沉淀物分成两等份，同时溶解于7.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶中。将凝胶印到膜上，然后，用单克隆抗-磷酸酪氨酸抗体（上行）或抗-eckc-末端（下行）检测。用箭头指示eck多肽的迁移。
图7.用BIAcore检测CHO-产生的EBP在各种洗涤剂配方中与固定的eck受体的结合。存在在或不存在洗涤剂的情况下，用PBS将纯化的EBP稀释到100μg/ml并于3℃温育2小时，将蛋白质样品稀释到图中标明的浓度，并检测eck受体结合。
图8.单独存在EBP及其与IL-3，促红细胞生成素或GM-CSF相结合的情况下，骨髓培养物中CFU-C和CFU-MK的组成。
图9.存在EBP，酸性FGF或KGF的情况下，3H-胸首在肝细胞培养物中的掺入。
本发明涉及eck受体（一种由Lindberg等人（见上文）鉴定的130KDa蛋白质酪氨酸激酶）结合的配体。eck受体配体通过诱导蛋白质-酪氨酸激酶催化区的自身磷酸化而激活受体。蛋白质-酪氨酸激酶是调节细胞增殖和分化的信号转导途径的一部分。因此，能激活eck受体蛋白质-酪氨酸激酶活性的配体，在调节表达该受体的细胞生长和分化中可能是重要的。eck受体配体可能是一种多肽，肽，或与eck受体结合和/或激活eck受体的非蛋白质分子。
本发明提供与eck受体特异性结合的新多肽。这些多肽被称之为eck结合蛋白，或EBPs。通过使用eck受体细胞外区（eck-x）作为亲和试验剂的受体亲和层析，已经从SK-BR-3和HCT-8细胞系的限制性培养中分离出了EBPs。在实施例1中描述了eck-x基因的构建和eck-x的表达及纯化。在实施例3A中描述了eck结合蛋白在固定eck-x上的纯化。
按由SDS-PAGE揭示的（图1A），从HCT-8细胞系中得到的EBP存在21-27KDa范围的几种不同分子量形式。21-27KDa范围内的EBPs的N-末端定序揭示出一种单一序列（实施例3B）。酶除去碳水化合物链后，观察到范围在17-19KDa的混合物。说明不同形式可能起因于该蛋白不同的转译后加工。
SK-BR-3产生的EBP的N-末端序列与从861基因（Holzman等人Mol  Cell.Biol.10，5830（1990）;PCT申请No.Wo92/07094）表达预测的N-末端氨基酸序列相同。最初，经差示杂交B61基因被鉴定为一种即早期反应基因，通过用肿瘤坏死，α因子处理，可在培养的人血管内皮细胞中诱导其表达。以EBP基因序列为基础，预测编码蛋白质的成熟形式有187个氨基酸。以前还末报告过EBP-编码的蛋白质的分离及特征描述。认为EBP蛋白质作为细胞激活素诱导的炎症的标记而起作用，因此，可将其用作为检测即将发生的炎症反应的诊断试剂（PCT申请No，Wo92/07094）。
克隆并定序了编码EBP（具有实施例3B中确定的N-末端序列的）的CDNA，并正如所预料的，发现其与B61基因（Holzman等人，同上文）相同。在SEQ ID NO.11中列出了由Holzman等人报告的B61 DNA序列。按实施例4中的描述，在CHO细胞和大肠杆菌中表达了EBP（或EBP基因）。在CHO细胞中，由EBP基因表达了至少两种有不同分子量的多肽。CHO细胞EBP的C末端定序表明它仅代表一种150个氨基酸残基多肽的序列-Lys-Leu-ala-ala-COOH。将该多肽称为EBP1-150。相当于预测EBP蛋白质187个氨基酸残基的多肽，如果存在的话，代表很小量的CHO细胞表达产物。EBP基因（缺乏前导序列）在大肠杆菌中的表达产生一种在SDS-PAGE上具有对全长蛋白质所预测的C-末端序列的产物。在氨基末端有一个甲硫氨酸残基的这种多肽被称为[Met]EBP1-187，并且除N-末端met外，在氨基酸序列方面与预测的EBP蛋白质相同。
通过下列实验（参见实施例5）已表明CHO细胞产生的rEBP与eck受体的相互作用：1）CHOrEBP与天然表达eck受体的结肠癌细胞或用eck基因转染的CHO细胞交联;2）CHOrEBP与eck受体在结肠癌细胞上的平衡结合研究;和3）eck受体磷酸化对结肠癌细胞的刺激作用。由CHO   rEBP诱导受体磷的化说明在呈现eck受体的细胞中，配体能够影响生物学反应（如生长或分化）。
显然，可以以许多不同的分子量形式表达EBP，其中不只一种可以有生物学活性。通过人细胞系和EBP基因-转染的宿主细胞天然产生如图1A和1B中所示的各种形式的EBP。如图3所示，将来自转染的CHO细胞的EBP被分离为22KDa（大部分）和24KDa（少量的）两种不同分子量的形式。这些不同形式的特征描述表明是150和165个氨基酸的两种不同EBPs，称为EBP1-159和EBP1-165磷酸肌醇-磷脂酶C处理的EBP-转染的CHO细胞系释放可溶性EBP，有力地说明了一种EBP的糖脂形式。分离的EBP的27KDa形式对用磷脂酶D消化敏感，从而进一步说明这些形式是糖磷酸脂-固定的EBP的可溶形式。
本发明提供具有与eck受体特异性结合活性并有与SEQ  ID  NO.1所示氨基酸序列基本相同的EBP。本文所用的术语“基本相同的氨基酸序列”指SEQ  ID  NO.1中的氨基酸的缺失或取代，以致所得的多肽仍与eck受体特异性结合。如上所述，EBP也诱导eck受体的磷酸化。然而本发明包括结合eck受体并可以或不可诱导受体磷酸化的多肽。在优选的实验方案中，EBP具有如SEQ  ID  NO.1所示的部分氨基酸序列。例如，EBP具有终止于150位的如SEQ  ID  NO.1所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO.1所示基本相同的氨基酸序列。优选的，EBP是EBP1-150，即，如SEQ ID NO.1所示的+1位到150位的氨基酸序列。
具有与SEQ ID NO.1所示基本相同的氨基酸序列并在-1位有一个甲硫氨酸残基的EBP也包括在内。[Met-1]EBP1-150和[Met-1]EBP1-150是实例。也提供了为基编码的DNA序列。构建了编码如SEQ ID NO.1中所示+1到150氨基酸残基的平截DNA序列，并在大肠杆菌中表达。所得的蛋白质，[Met-1]EBP1-150与eck受体结合并诱导受体磷酸化（实施例6）。
本发明也包括有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段和类似物，其中所述片段和类似物与eck受体结合，以及编码所述片段和类似物的DNA序列。所包括片段具有SEQ ID NO.1所示多肽的N-末端或C-末端的缺失和内区的缺失。EBP片段的实例包括在实施例5中描述的EBP1-167，EBP1-171和EBP1-180。类似物包括在多肽中一个或多个位点的氨基酸取代物。用本领域专业人员熟知的重组DNA技术，可以很容易地构建本发明的片段和类似物。通过与细胞表面上的eck可溶性受体或eck受体结合及通过eck受体的诱导磷酸化，很容易检测所得片段和类似物的生物学活性。
本发明也包括其特征在于是外源DNA序列的原核或真核表达产物的EBP，即EBP是重组EBP。外源DNA序列可以是CDNA，基因组或合成的DNA序列。可以在培养中，于细胞，酵母，植物，昆虫哺乳动物细胞中或转基因动物中表达EBP。适于在各种宿主细胞中表达EBP的DNA载体是本领域专业人员的熟知的。上述载体的实例是用于在CHO  D-细胞中表达EBP基因的pDSRα2和用于在大肠杆菌中表达EBP基因的pCFM1156。
EBP在大肠杆菌中表达导致不溶性包含体的形成。生物学活性EBP的恢复需要溶解EBP聚集体，接着重折叠被溶解的蛋白质。实施例4C描述了重折叠从大肠杆菌产生的EBP的方法，从而得到有eck-x结合和eck磷酸化活性的EBP。可以改进EBP重折叠的方法以提高复性蛋白质的活性并增加活性EBP的产率。上述改进包括改变用于溶解包含体的变性剂（如，用氯化胍对脲），氧化剂（可包括氧化还原配对如氧化的和还原的谷胱甘肽），或根据变性剂的稀释方法（如将EBP以不同的蛋白质浓度稀释到含（改变的PH的）缓冲液的洗涤剂中）。
本发明也提供检测粗样品（如限制性培养基）中存在的能结合受体的配体的方法。该方法包括步骤：
a）.固定受体的纯化配位结合区;
b）.将固定的受体与含配体的限制性培养基接触的;和
c）.通过表面胞质团共振检测系统监控配体与固定受体的结合。
如实施例2中所述，该方法提供了一种快速灵敏地筛选细胞上清液中eck受体结合活性的方法。该筛选方法的结果列于表1。虽然该方法是用于检测eck结合活性，但通常也可将其用于任何的受体-配体相互作用。可以固定在任何受体的配体结合区以分离受体结合蛋白。在优选的实施方案中，配体结合区是能够结合的细胞外区或其片段或类似物。除筛选细胞上清液外，也可用该方法筛选用于受体结合的随机序列肽的混合物。
由本发明第一次提供了一种调节eck受体外源酶活性的方法。所述的方法包括给哺乳动物施用对eck受体有效量的配体以调整所述受体的酶活性。eck受体酶活性调节包括分化，增殖及代谢在内的细胞功能。在优选的实施方案中，EBP，或其片段或类似物是配体。然而，也可以用其它配体调整eck受体活性，例如多肽（不限于EBP），或肽及非蛋白质有机分子。
本发明也包括鉴别可调节eck受体活性的化合物的方法。所述方法包括步骤：
a）.将呈现受体的细胞暴露于已知配体一段足够的时间以形成受体-配体复合物并诱导信号转导;
b）.检测细胞内活性的范围;和
c）.将检测的活性与未暴露于配体的细胞中的活性进行比较。可通过靶细胞增殖，分化或代谢方面的改变来检测eck受体活性。有关eck受体活性对造血祖代细胞，结肠隐窝细胞和肝细胞调节的方法描述见实施例9。
本发明也包括由eck受体与配体（如EBP）的相互作用而产生的一种分离的eck受体-配体复合物。这种相互作用可导致激活受体和信号转导，所述信号可调节携带受体的细胞的生理学状态。优选的是，配体作为一种生长因子刺激靶细胞的增殖，另外，配体的结合也可能不激活受体。在这种情形下，配体可能作为可激活受体并诱导信号转导的其它分子的颉抗剂。
最初是在含显著量上皮细胞的组织（如肺和肠）及由上皮细胞得到的细胞系（Lindberg等人，同上文）中表达eck受体。eck受体的配体可以刺激表达这种受体的细胞的生长或分化。可将诱导携带eck受体的细胞分化的配体用于治疗特定类型的癌症，尤其是起因于上皮细胞增殖的那些癌症。可单独或与标准化疗或放疗结合起来，将eck受体配体用于癌症治疗。
EBP与eck受体的相互作用可能通过刺激细胞生长而与癌症状态的发展有关，或者可能通过刺激细胞迁移及粘附而促进新陈代谢。可以用几种方法调节EBP的生物学效应。可结合但又不激活eck受体的EBP片段类似物可用作EBP颉抗剂。施用具有eck受体亲和性的EBP颉抗剂将会释放EBP而阻断受体的结合和激活。也可以施用可溶性eck受体来抵消EBP的生物学作用。可溶性eck受体将会与细胞表面受体进行结合EBP的竞争，并由此降低EBP引起的eck受体激活的程度。适用于治疗用途的可溶性eck受体包括实施例1中描述的受体蛋白质及其可结合EBP的片段和类似物。另外，抗EBP或eck受体的单克隆抗体也可以用来阻断  细胞表面EBP与eck受体的相互作用。
已表明EBP基因在内皮细胞中的表达是由TNF-α和IL-1β（两种前炎症细胞激活素，它的在内皮细胞中可激活作为炎症反应部分的各种功能）刺激的（Holzman等人，同上文）。治疗包括施用可溶性eck受体降低在炎症反应期间升高的EBP水平，该治疗在控制炎症的过程中可能是有用的。
提供一种治疗哺乳动物创伤的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。如实施例9A中所示，在大鼠创伤室检测中，EBP促进组织净重中，总蛋白质、总DNA和总葡糖胺聚糖的增加。由于EBP在炎症反应早期表达，所以在损伤位点上皮细胞的恢复中，它可能起作用。
还提供了一种增加哺乳动物中血细胞生成的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。如实施例9B中所示，EBP与白介素-3（IL-3）结合可显著增加小鼠骨髓培养物中的CFU-C3。为发生骨髓抑制（由于疾病或暴露于骨髓抑制剂，如化疗药物或试剂后的结果）时，可以用EBP恢复血细胞生成。在优选的实施例方案中，将治疗有效量的EBP与治疗有效量的IL-3结合起来使用以增加血细胞生成。
也包括刺激哺乳动物中结肠细胞增殖的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。如实施例9C中所示，EBP刺激结肠隐窝检测中的细胞增殖。在缓解化疗后肠毒性方面，eck受体配体（如EBP）是有用的。
提供了一种刺激肝细胞增殖的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。实施例9D说明用EBP刺激肝细胞。这种刺激与使用酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）（一种已知的肝细胞生长因子）的相同检测中见到的是可比的。对于修复由疾病或损伤引起的肝损坏，用eck受体配体治疗是有用的。
本发明提供了含有治疗有效量eck受体配体和药物学可接受稀释剂、载体、防腐剂、乳化剂和/或增溶剂的药物组合物。本文所用的“治疗有效量”指对给定的病体和给药方式可提供治疗效果的量。认为本领域专业人员能够确定eck受体配体对于任何所需治疗疾病的治疗有效量。
药物组合物包括各种缓冲液（如Tris，乙酸磷酸）的稀释剂，增溶剂（如Tween，Polysorbate），载体（如人血清白蛋白），防腐剂（thimensol苄醇）和抗氧化剂（如抗坏血酸）。如实施例7中所示，若在存在稳定剂的情况下配制EBP，则可延长纯化稀释的EBP与可溶性eck受体结合的能力。稳定剂可以是一种洗涤剂，如tween-20，tween-80，NP-40，或TritonX-100。也可以将EBP掺入到聚合化合物的颗粒制剂中，以便在一段延长的时期内有控制地释放给患者。有关药物组合物中组分的广泛性综述参见Remington′s  Pharmaceutical  Sciences（第18版，A.R.Gennaro，编.Mack，Easton，PA（1990））。
可以通过注射（皮下，静脉内，或肌肉内），或口服或鼻给药来施用EBP。给药途径取决于所需治疗的特定疾病。
提供下列实施例以便更全面地说明本发明，但不对其范围构成限制。
实施例1
生产eck受体细胞外区
A.构建eck-x表达质粒
从pGEM3Z-eck（一种eck  cDNA的3.4Kb  EcoRⅠ-Kpn  Ⅰ亚克隆）开始，在几个步骤中得到用于哺乳动物表达eck细胞外区的质粒（Lindberg等人，同上文）。将寡核苷酸317-11（5′-AGCTTAGATCTCC-3′;SEQ  ID  NO.7）和317-12（5′-AATTGGAGATCTA-3′;SEQ  ID  NO.8）用激酶处理并与已用HindⅢ和EcoRⅠ消化的pGEM  32-eck和pGEM  42的1.7Kb  EcoRⅠ片段相连。选出仅将寡核苷酸加到eck5′末端的克隆。该克隆的特征包括Hind  Ⅲ和Bgl  Ⅱ位点的加入以及与eck序列相邻的5′EcoRⅠ位点的缺失。用Hind  Ⅲ和EcoRⅠ消化后，分离该克隆的插入片段并连接到寡核苷酸：
317-9  5′-AATTCCAGACGCTGTCCCCGGAGGGATCCGGCAACTGAG-3′
（SEQ.ID.NO.9）和
317-10  5′-TCGACTCAGTTGCCGGATCCCTCCGGGGACAGCGTCTGG-3′
（SEQ.ID.NO.10）
和用Hind Ⅲ及Sal Ⅰ消化的pGEM 42上。这样在Asn534和Sal Ⅰ限制酶位点后，加入了一个BamHl位点，一个TGA终止密码子。然后将含有eck外区编码序列的Hind Ⅲ-Sal Ⅰ片段转移到pDSRαZ（deCalerk等人，J.Biol.Chem.266，3893（1991））。
B.eck  x的哺乳动物细胞表达
通过钙介导的转染（Wigler等人，Cell  11，233（1977）），将表达质粒pDSRα-eck-x导入CHO细胞。以质粒中二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的表达为基础筛选单个菌落，并选出一个克隆（命名为21.021）进行扩增。通过RNA杂交检测eck基因的表达（Hunt等人，Erp.Hematol.19，779（1991））。
在10nM氨甲喋呤中完成eck表达的扩增。扩充细胞系21.02用以生产eck-x。在用非必需氨基酸，10nM氨甲喋呤和5%EBS补充的200ml DMEM：Ham′s F12（1∶1）中，以2×107细胞种于Roller瓶。3天后，细胞达到会合，此时，加入不含5%EBS的新鲜培养基。收集限制性培养基，7天后重复，14天后，第二次收集。
C.纯化eck-x
将21.02细胞的限制性培养基浓缩并用10，000MWCO螺旋缠绕滤器（S/Y10，Amicon，Danvers，MA）对10nMTrio-HCl.PH7.4透滤。将50ml浓缩物载到阴离子交换柱（Hema-Q，颗粒大小10μm，1.6x12cm，Separon，Sunnyvale，CA）上，并用0-0.5M  NaCl线性梯度的10nM  Tris-HCl，PH  7.4洗脱。用SDS-PAGE和使用抗合成eck-x  N-末端肽产生的兔抗血清进行Western印迹从而分析各部分。收集含eck-x的部分，并对10nM  Tris-HCl，PH  7.4作渗析。然后再放到Hema-Q粒上，并象前面那样洗脱并分析。将得到的收集物浓缩到3ml（centriprep-10，Amicon，Davers，MA）并用于用PBS平衡的Superdex  200（Pharmacia，Piscataway，NJ）凝胶滤柱（2.2×90cm，流速1.0ml/分钟）。得到含纯化eck-x的收集物并将其作为进一步实验的基础。
实施例2
筛选结合eck细胞外区的限制性培养基
在表面胞质基因共振检测系统（BIAcore，Pharmacia  Biosensor，Piscataway，NJ）按制造商说明的方法检测eck-x的相互作用。以5μl/分钟的流速，注射35μl  0.2M  1-2乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺-HCl，0.05M  N-羟基琥珀酰亚胺从而激活传感器芯片的葡聚糖表面。通过以5μl/分钟，两次连续的50μl注射而固定纯化的eck-x（0.2mg/ml，在10nM醋酸钠中，PH4）。通过注射1M乙醇胺，PH8.5来阻断未反应的结合位点。用电泳缓冲液（HBS，10mM  Hepes，150mM  NaCl，3.4mM  EDTA，0.005%  Tween  20，PH  7.4）洗涤表面过夜，直到达到稳定的基值。典型的固定会导致建立高于原始值的基值6000-8000个反应单位。将50μl各种限制性培养基样品在无血清条件下培养并浓缩到5至40倍（centricon-10，Amicon，Danvers，MA），然后，以10μl/分钟的流速注射。在相当于每次注射结束后20秒的Sensorgran上，于报告点检测样品反应。通过注射50μl  25mM  3-（环己基氨基）1-1丙烷磺酸，PH10.4，在样品间再生固定的eck-x表面。
用固定在BIAcore传感器芯片上的纯化eck-x筛选具受体结合活性的浓缩限制性培养基。在几种限制性培养基（包括HCT-8，SK-BR-3，和HT-29细胞系的）中观察到结合活性（见表1）。
表1.用BIAcore和抗-EBP  Western印迹检测细胞培养物上清液
eck-x  结合活性  抗-EBP
细胞系  浓度  (BIAcore 反应单位  Western
A704  40X  49  -
TE671  40X  115  -
CCD18CO  40X  25  -
CCFSTTG1  40X  35  -
HCT-8  40X  180  ++
GMO-0948  40X  10  -
SK-BR-3  40X  270  ++
HT-29  40X  310  ++
MDA-MB-453  30X  80  ++
FF-1  30X  55  -
WS-1  25X  55  -
BRL-3A  25X  125  -
GMO1391  25X  20  -
HT-1080  20X  230  +
AG-2804  20X  170  +
BUD-8  20X  -10  -
AG-3022  20X  175  +
HFL-1  20X  15  -
LIM-1863  20X  75  -
PAEC  20X  -10  -
HOs  10X  95  -
33CO  10X  -10  -
按实施例2中所述，用BIAcore检测样品（50μl注射液）与固定的eck-x的结合。用兔抗-EBP（大肠肝菌）抗血清追溯分析相同样品的等份（10μl）。
实施例3
纯化并特征描述来自限制性培养基的eck受体结合蛋白（EBP）
A.固定的eck-x受体亲和层析
用0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，PH8.3渗析纯化的eck-x，并得到2mg/ml的终深度。以每ml凝胶1mgeck-x的配体密度将蛋白质固定在CNBr-激活的Sepharose 4B（Pharmacia，Piscataway，NJ）上（Kenny等人，inNew Protein Techniques，J.M Walker，编The Humana Perss，Clifton，NJ（1988））。
将来自SK-BK-3或HCT-8细胞系的限制性培养基浓缩20培，并做PBS透滤（SIY  10.螺旋筒，Amiccom）。使浓缩物以0.1ml/分钟流速直接装在固定eck-x的柱（1×1cm，每ml树脂1mg  eck-x）上。用10ML  PBS洗涤该柱，接着用0.05M醋酸钠，0.5M  NaCl，PH4.0洗脱。将洗脱物倒入0.01%SDS中，浓缩，并在centricon-10超滤装置（Amicon）上用10mM  Tris-HCl，PH8.0作缓冲液交换。将样品与SDS-PAGE样品缓冲混合由centricon-10收集，并直接装到聚丙烯酰胺凝胶上。将凝胶用银染色（Merrill  Meth.Enzymol.182，477（1991））或印到PVDF膜上（Problot，Applied  Biosystems，Foster  CA）进行N-末端序列分析（Faussset等人，Electrophoresis12，22（1991））。
图1中表示出典型电泳后的SDS-PAGE分析。柱的PH4.0洗脱液（道5所示）表现出明显富集了近似分子量为21-27KDa的几种蛋白质。当以相似体积的非限制性培养基通过同样的柱时未发现这样的蛋白质，这表明该21-27KDa蛋白质是由该细胞产生的，相比之下，在该非限制性培养基中也观察到了HCT-8或SKBR-3的PH4.0洗提组份中存在较高分子量蛋白质。这些蛋白质代表了与柱的非特异性反应和来源于细胞培养所用的血清。
B.EBP的N-末端序列分析
在液体-脉冲自动测序仪（477型，Applied  Biosystems，Foster  City  CA）上完成N-末端序列分析。用Brownlee  C-18反相柱（0.21×25cm）通过联机的微孔高效液体层析（Model  123，Applied  Biosystems）分析所得的乙内酰苯硫脲基（Phenylthiohydantoinyl）氨基酸。PVDF印迹的定序循环和序列分析的最佳条件是以Applied  Biosystems提供的说明为基础的。
在凝胶21-27KDa区中电印迹蛋白质的N-末端序列分析揭示出一种单一序列（SEQ.ID.NO.13）：
NHz-Asp-Arg-His-Thr-Val-Phe-Trp-[Asn]-Ser-Ser-Asn-Pro-Lys-Phe-Arg-Asn-Glu-Asp-Tyr-Thr-Ile-His-Val-Gln
以NBRF蛋白质数据库的同源检索为基础的计算机（Devereu等人，Nucleic  Acid  Res.12，387（1984））明确地测定该序列属于EBP（Holzman等人，同上文）。
C.EBP的结构特征描述
由于N-末端测序检测出单一序列，所以用SDS-PAGE观察到的EBP的多种形式可能是由该分子其它区的转泽后修饰引起的。循环8（N）的定序率被大大地降低，说明该位点有效的糖基化。然而，这种蛋白质的明显不均质性不可能完全归因于糖基作作用的不同，因为用N-聚糖酶，神经氨糖酸酶，和0-聚糖酶结合起来消化rEBP，当用SDS-PAGE分析时得到Mr17-19KDa（前用SDS-PAGE分析）形式的混合物。由于EBP基因编码22KDa的蛋白质（Holzman等人，ibid），这种结果说明EBP可能要经蛋白水解加工。
D.EBP与可溶性eck受体的相互作用
PH4.0洗脱收集物的凝胶过滤分析说明全部的eck-结合活性（由BIAcore反应测量的）可能归因于近似分子量为22KDa（图2）的洗脱物质。从该柱的说明组份的SDS-PAGE分析确证，EBP是与受体结合活性一起被共洗脱的。在其它实验中，纯化EBP不能与用该药盒受体细胞外区激活的BIAcore表面结合，尽管这些表面能结合rSCF（该药盒配体）。
E.筛选其它细胞系的eck结合蛋白质
分离并鉴定EBP后，制备该蛋白的抗血清，完成原筛选的追溯分析（表1）。Western印迹分析确认EBP以高水平存在于三种筛选中标为阳性的限制性培养基（SK-BR-3，HCT-8，HT-29）中。几种其它的细胞系（AG-3022，AG-2804，和HT-1080）标记为阳性，但通过Western分析只能检测到痕量的加工过的EBP。这些细胞系不生产可由抗-EBP抗血清检测的29KDa蛋白质。
实施例4
EBP的克隆、表达及特征描述
用来自人脐形静脉内皮细胞（HUVEC）文库（Clontech  Laboratories，Palo  Alto，CA）的热破裂的噬菌体作为模板，通过聚合酶链反应（PCR）（Saiki等人，Science  230，1350（1985）;Mullis等人，Cold  Spring  Harbor  Symp.Quant.Biol.51;263）扩增人EBP基因。以公知的EBP核酸序列（Holzman等人，ibid）为基础设计引物以产生能插入大肠杆菌或CHO细胞表达载体的PCR片段。
A.克隆用于大肠杆菌表达的EBP
用下列所示的寡核苷酸引物386-4和386-5
386-4）  5′AAG  CAT  ATG  GAT  CGC  CAC  ACC  GTC  TTC  TGG  3′
（SEQ.ID.NO.2）
386-5）  5′GAA  GGA  TCC  TTA  TCA  CGG  GGT  TTG  CAG  CAG  CAG  AA  3′（SEQ.ID.NO.3）
通过PCK得到用于大肠杆菌表达的EBP全长形式的基因。该形式没有信号肽并包括起始密码子甲硫氨酸以及对于克隆到表达质粒pCFM  1156（Fox等人，J.Biol.Chem.263，18452（1988））中所必需的限制位点。将入gtll/HUVEC文库（Clontech）的10μl样品在70℃加热至5分钟，然后快速在湿冰上冷却。将破碎的噬菌体用作100μl体积中含386-4和386-5引物各300皮摩尔，1  X  Tag  Ⅰ聚合酶缓冲液（Promega，Madison，WI），dNTP各0.77mM和2.5单位TagⅠ聚合酶（Promega）和PCR反应的模板。将该反应产物用酚/氯仿提取，乙醇沉淀，再悬浮于20μl蒸馏水中，然后用限制内切酶NdeⅠ和BamHⅠ（Boehringer  Mannheim，Indianapolis，IN）消化。将该片段连接到已用相同两种酶消化的质粒载体pCFM1156中并转化到大肠杆菌宿主菌株FM5（ATCCNO.53911）中。当将转化细胞从30℃移到42℃时，EBP以高水平表达。
按有关全长基因的描述，除在PCR中用寡核苷酸469-11取代38-5外，构建经设计在大肠杆菌中表达EBP的150个氨基酸形式的基因。寡核苷酸469-11有序列：
5′GAAGGATCCCTATTATGCTGCAAGTCTCTTCTCCTG  3′
（SEQ.ID.NO.4）
B.克隆用于CHO细胞表达的EBP
从细胞系SK-BR-3中分离总RNA，并用于制备CDNA。将3μg总RNA与3μg随机引物（Gibco BRL，Gaithersburg，MD）混合，在65℃温育5分钟，然后在冰上简短地冷却。然后将RNA-引物混合物用于在由50mM Tris-HCl（PH8.3），75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，每dNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）各125μm，200单位反转录酶（Superscript，BRL）组成的CDNA反应物（终体积20μl）中。将反应物在37℃温育1小时。
合成两种寡核苷酸并与SK-BR-3  CDNA一起通过PCR扩增EBP编码区。
386-2）5′GAA  TTC  AAG  CTT  CAG  GCC  CCG  CGC  TAT  GGA  G  3′
（SEQ.ID.NO.5）
386-3）5′GAA  TTC  TCT  AGA  TCA  TCA  CGG  GGT  TTG  CAG  CAG  CA  3′（SEQ.ID.NO.6）
PCR含1μl  CDNA反应物的上述两种寡核苷酸各500ng，10mM  Tris-HCl（PH8.3），50mM  KCl  dNTP各200μm和1.25单位Tag聚合酶（Perkin  Elmer  Cetus，CA）。将DNA扩增35个循环（94℃30秒，50℃1分钟，72℃1分钟），用酚提取1次，用酚-氯仿提取1次，沉淀，经微离心形成沉淀，并用限制酶Hind  Ⅲ和XbaⅠ（Boerhinger  Mannheim）消化。将DNA用凝胶纯化（Geneclean  Ⅱ，Biolol.La  Jolla，CA），并与已预先用相同限制酶消化的质粒pDSRα2（deClerck等人，ibid）相连。将连接的DNA转染到感受态HB101细菌（BRL）中，并分离质粒DNA（Qiagen，Chatsworth，CA）。通过使用合成引物在双链质粒DNA上的双脱氧链终止反应（Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463（1977））法确定该DNA序列，该序列相当于EBP  DNA序列。
用在BIAcore上表现eck-x结合活性的EBP基因转染CHO细胞培养上清液，并且可通过固定eck-x受体亲和层析从上清液中回收EBP。未转染的CHO细胞，或用含有内缺失的EBP基因转染的CHO细胞不表现受体结合活性。
C.从大肠杆菌和CHO细胞中纯化重组EBP
按实施例3A中所述，通过固定的eck-x受体亲和层析，从CHO细胞培养上清液中纯化重组EBP。用5mM  CHAPS（用于结构分析和交联研究）或Q5mg/mlBSA（用于磷酸化研究）将纯化EBP作PBS渗析。用受体亲和层析纯化的CHO细胞产生的EBP含两个主要的带，次一些几个次要的带（图B）。
用常规层析也可纯化从CHO细胞得到的重组EBP。将CHO细胞培养上清液浓缩并对10mM  Tris，PH8.5透滤，并将其用于阴离子交换柱（Q-Serharose，Pharmacia-LKB）。用在10mM  Tris-HCl，PH8.5中的NaCl线性梯度洗脱该柱。通过Western印迹分析各部分表明已将两个主要的EBP带与另一个分开。用含主要EBP带的各部分制成分离收集物，将收集物通过凝胶过滤层析（Superdex-75，Pharmaia-LKB）作进一步纯化。
用下列方法纯化大肠杆菌重组EBP。将表达EBP1-150或EBP1-187基因的细胞悬浮于10mM Tris-HCl，PH7.4并用French压力器溶解。用J6-B（JS-4.2旋转器）于4000rpm将溶解物离心30分钟。将不可溶的沉淀（含未折叠的EBP1-150或EBP1-187）保留作进一步加工。将沉淀在2%脱氧胆酸钠，5mMEDTA，10mM Tris-HCl，PH8.5中，于4℃悬浮30分钟。如所述离心悬浮液并除去上清液。将不可溶的沉淀悬浮于10mM Tris-HCl PH7.4中，混合，并如上述离心。将不可溶沉淀溶解于2%月桂基肌氨酸钠，10mM CAPS，PH10，以溶解EBP1-150或EBP1-187。加入CuSO4直到50μm的终浓度。并于4℃将混合物搅拌过夜，然后用Dowex 1×4树脂处理以除去洗涤剂。
SDS-PACE分析表明大部分EBP1-150或EBP1-187已被氧化并且是单体。然而，EBP1-187的凝胶过滤分析表明该蛋白质表现为高分子量非共价聚集体。相反，凝过滤分析表明重折叠的EBP1-150相当于单体或二聚物。
按实施例2中所述，用BIAcore检测大肠杆菌中生产的EBP1-180和EBP1-150与固定ekc-x的结合。EPC1-187聚集体与eck-x表面结合很弱（如果算的说）。重折叠的EBP1-150对BIAcore上的eck-x表面表现出高亲和性。
另外，可以用下列方法重折叠在肠杆菌中表达的EBP1-150。将细胞糊悬浮于9体（v/w）的冷Super-Q水中。用Gaulin匀浆器以9，000Psi的压力溶解悬浮的细胞糊。将溶胞物立即在4℃以3，500XG离心30分钟。除去上清液并保留含EBP包含体的沉淀。将沉淀悬浮于10体积（v/w）8M脲，0.1M Tris PH8.5中，并搅拌1小时。进行离心以除去不可溶的部分。由于可溶解性包含体的两步稀释，影响重折叠。首先，将包含体稀释到10体积（v/w）的3M脲，0.1M Tris，PH8.5（含0.0005%CuSO4作为氧化剂）中。于4℃搅拌过夜。将该物质用3体积（v/v）20mM Tris，PH9.2稀释，并缓慢搅拌温育24小时。在40℃以15，000×G离心30分钟以除去沉淀。
然后将上清液加到Q-Sepharose  Fast  Flow柱中，并用5倍柱体积的20mM  Tris，PH9.2洗涤。用在20mM  Tris，PH9.2中的0-0.5M的NaCl线性梯度洗脱柱。收集含EBP的部分，并浓缩，经Superdex-75层析。用1×PBS洗脱EBP。
通过其在BIAcore检测中与固定eck-x结合能力所测量的，所得的纯化EBP具有的特异性活性是纯化CHO-产生的EBP的30-40%。通过该方法重折叠并纯化的大肠杆菌产生的EBP可诱导位于细胞表面的eck的磷酸化。
D.特征描述来自大肠杆菌和CHO细胞表达的重组EBP
将经CHO细胞培养上清液的受体层析，或大肠杆菌的RP-HPLC而纯化的重组EBP用胰蛋白酶消化并用RP-HPLC分析。虽然C-末端肽（氨基酸155-187）可以从大肠杆菌中表达的EBP1-187基因中回收，但在哺乳动物产生的重组蛋白质中不能对其进行检测。纯化CHO EBP的羧肽酶消化说明，可检测的C-末端序列仅仅是-lys-arg-Lue-ala-COOH（SEQ ID NO.12），说明是在氨基酸150的末端。
E.EBP的其它形式
按实施例3中所述从SK-BR-3细胞系分离的EBP在SDS-PAGE上迁移的范围是21-27KDa（见图1A）。CHO细胞上清液中的重组EBP在eck-x层析后，以两个主要种类和一些次要的形式存在（实施例4和图1B）。着手进行进一步的CHO-产生的EBP的不同分子量形式特征描述纯化CHO细胞上清液的重组EBP，表现出22KDa和24KDa两个带及第3个27KDa次要的带（见图3）。用糖苷酶处理纯化的EBP并未改变这些带的相对迁移，这说明它们并不是通过改变N-或O-连接的碳水化合物而简单产生的。以前的C-末端定序说明22KDa带是一种150个氨基酸的多肽，称为EBP1-150。通过C-末端定序发现24KDa带是159个氨基酸长。该形式叫做EBP1-150。
研究表达EBP的CHO细胞是否存在EBP的膜结合形式。通过用质粒pDSRα-EBP转染CHOd-细胞建立重组CHO细胞系36.44。细胞生长在用1X非必需氨基酸和1X青霉素，链霉素，谷氨酰胺和10%热炎活的渗析胎牛血清补充的EMEM∶F12悬浮培养基中生长。用在1ml磷酸缓冲盐中的4μg/ml磷脂酶C（Calbiochem，La Jolla，CA），将106细胞等份于37℃处理不同的时间。将细胞在14.000RPM沉淀1分钟。取出上清液进行分析。将细胞沉淀溶解于RIPA缓冲液（150mMNaCl;1%NP-40∶0.5%脱氧胆酸盐：50mM Tris-HCl PH8.0;0.1%SDS;1.74μg/ml PMSF的抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂，亮抑蛋白酶肽各1ng/ml;18.4μg/ml原钡酸盐）。将样品放到14% Tris-Glycine凝胶上，印到PVDF膜上，并用兔抗EBP-多克隆抗体检测。图4说明存在磷脂酶C的情况下，将EBP释放到上清液中。这些实验说明EBP的27KDa形式有糖磷脂固定端。
实施例5
EBP类似物
除由全长EBP基因产生的不同形式重组EBP外，构建具有不同多肽长度的EBP类似物。尤其是，按如下构建有167，171和180个氨基酸的EBP。合成寡核苷酸421-12，421-13和421-14用以作为PCR引物分别导入氨基酸180，171和167后的终止密码子。分别用各种引物和pDSRα-EBP质粒及寡核苷酸386-2;按实施例4B所述完成PCR反应
421-12  5′-GAATTCTCTAGATTATCATGGAAGGAGCAGCACAGTCCAG-3′
（SEQ.ID.NO.14）
421-13  5′-GAATTCTCTAGATTATCATGGGAAGAGGCGTGGGGCAGC-3′
（SEQ.ID.NO.15）
421-14  5′-GAATTCTCTAGATTATCATGGGGCAGCACTGTGACCGATGC-3′
（SEQ.ID.NO.16）
使用描述过的用于表达EBP的方法，在用改变的DNA序列转染CHO细胞中表达所得的类似物。在存在血清的情况下使细胞生长至会合，随后将培养基换成无血清的并使其积累。48小时时，收集限制性培养基并溶融粘附的细胞。将限制性培养基和溶解物等份经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并经Western印迹。EBP1-187和EBP1-180表现出与溶胞物和上清液中抗体反应的相似蛋白质特性。表达EBP1-171和EBP1-167的细胞在上清液中有EBP积累，但在溶胞产物中没有。按实施例2中所述用BIAcore分析EBP类似物与eck-x的结合，按实施例6中所述分析EBP类似物的eck受体磷酸化活性。
实施例6
重组EBP与eck受体的相互作用
A.交联研究
按下文所述用125I放射性标记CHO-细胞产生的EBP以用于交联和结合研究。将5或10μg的EBP的0.1M磷酸钠（Na3PO4，PH8.0）溶液加到5mCi干125I-Bolton-Hunter试剂（NEN，Boston，MA）中，使终体积为50μl或100μl并将试管在4℃温育1小时。通过加入0.3ml 0.2M甘氨酸的0.1M Na3PO4终止反应，接着在4℃温于5分钟。在10ml含（用0.1M Na3PO4-0.25%明胶平衡的）Sephadex G-25M（Pharmacia）的PD10柱上，经凝胶过滤层析从未掺入的试剂中分离标记的蛋白质。125I-EBP的特异性活性范围为4-19cpm/pg。
按下文完成EBP与LIM 2405（天然表达eck受体的细胞系）或CHO19.32（用全长eck受体克隆转染的中国仓鼠卵巢细胞）的交联。使细胞在悬浮液中生长达到培养基中约5×105细胞/ml的密度。使LIM2405细胞在含5%FCS，1μg/ml胰岛素，1μg/ml氢化可的松，10μm硫甘油和2nML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中生长到在T-175烧瓶达到约90%融合，弄碎取出用于交联研究。将细胞离心出并再悬浮于PBS以得到单一细胞悬浮液。对于每个交联反应，将2×106细胞与约20ng的125I-EBP在1ml总体积中混合。将该混合物在4℃温育1小时以便在加入20μl10nM二琥珀酸酰亚胺/底物（DSS）作为交联剂前，使EBP与细胞表面受体结合。然后用结合缓冲液将细胞洗涤3次，离心收集，计算掺入细胞沉淀中的放射性量以评估交联程度。然后，通过用100μlPBS，1m MEDCA，0.5%WP-40，1mM苯基甲基磺酰基氟化物（PMSF，Sigma，St.Louis，Mo）在4℃处理10分钟来溶解细胞。通过离心除不可溶的物质，并收集含受体/配体复合物的可溶部分。这些样品或者直接上SDS-PAGE柱或者先用抗eck受体C末端部分的抗体（Lindberg等人，同上文）免疫沉淀。通过在加到细胞中之前，将竞争剂与标记的EBP混合完成与未标记EBP或不相关蛋白质（FGF）的竞争。
如图5中所示，可以将125I-EBP与CHO19.32细胞（道1）交联，而不与未转染的细胞（道2）交联。交联产生145KDa蛋白质的检测，以及可代表受体二聚物或更高级复合物的高分子量形成。超过50倍摩尔的未标记rEBP能够就结合和交联（道3）进行竞争。在其它实验中，浓度为1μg/mL的重组成纤母细胞生长因子对rEBP交联没有影响。对于LIM2405细胞系，得到了相似的交联结果。
B结合研究
为了测量相关的动力学数据，将CHO19.32细胞（2×106细胞/ml）与3.8nM125I-EBP和PBS-BSA（1mg/ml）一起在0℃温育。取出齐等份，通过蔗糖梯度离心确定细胞结合的125I-EBP。从含380nM未标记EBP的平行反应中，测量到非特异性结合。
通过将CHO19.32或LIM2405细胞（0.5×106细胞/ml）与不同量的125I-EBP在0℃一起温育1小时，确定平衡结分常数，并按上述确定结合的EBP，用Scatehard的方法（Annal.N.y.Acad.Sci.51，660（1949））分析数据。从含超过50倍的未标记EBP的相同反应中确定非特异性结合。
125-rEBP与LLM2405细胞稳定状态结合的Scatehard分析说明，在细胞表面上，有近似单一类型的kd为2.8×10-8M±0.3×10-8的受体。平均说LIM2405细胞在细胞表面含1.3×106EBP受体。EBP与固定eck-X表面的BIAcore分析得出估计的kd为2.4×10-8M±0.4×10-8。
C.p130eck自身磷酸化研究
将LIM2405结肠直肠癌细胞系（Whitehead等人，Lmmunol，and Cell Biol.70，227（1992））保持于含5%EBS1μg/ml胰岛素，10μg/ml氢化可的松和（Oμ Mα-硫甘油的RPMl1640中，并通过胰蛋白酶化次传代，然后稀释（1∶5）到新鲜培养基中。检测前，将2.5×LIM2405细胞种到6孔盘（Falcon ＃ 3046），并于37℃湿育24小时。除去培养基，并用含0.03%BSA，1μg/ml胰岛素，10μg/ml氢化可的松和10μMα-硫甘油的无血清培养基代替，然后温育12-18小时。在一些实验中，处理前，在无磷酸RPMI1640（Flow）中用32P-在磷酸盐2mCi/ml）标记细胞培养物。以不同的浓度将生长因子贮备溶液预稀释到2.0ml无血清培养基中，然后加热到37℃。从培养箱中取出细胞培养物，并除去上清液培养基。迅速处理并在37℃将细胞培养物温育10-15分钟。然后从培养箱中取出培养物，放在冰上，并抽吸细胞上清液。
将处理过的细胞培养物冷却到0℃，然后用冰冷的PBS（GIBCO）洗涤一次。抽吸残余的PBS，加入1.0ml冰冷的RIPA缓冲液（10mM磷酸钠，PH7.4，150mM氯化钠，0.1%+二烷基硫酸钠，1%NP-40，1%脱氧胆酸盐，1%Trasylol，2m  MEDTA，50mM氟化钠和100mM原钒酸钠）来溶解细胞。温育10分钟后，将溶解物移到1.5ml试管并以10，000xg离心30分钟澄清的。将澄清的溶解物上清液转移到新试管中，并用1.0μg/ml的亲和纯化的兔抗-Eck  C未端区抗体在0℃免疫沉淀2小时。将免疫复合物于4℃经30分钟吸附到Protein-G  Sepharose珠（Pharmacia）上，用含0.5M  Licl的冰-冷的RIPA缓冲液洗涤两次，用0.1M  Tris-HCl，PH8.0（含0.5M  Licl）洗涤1次，用RIPA洗涤1次。用SDS-PAGE样品缓冲液溶解所得的免疫沉淀并贮存用于进一步分析。
如前所述（Boyle等人，Meth′Enzymol.201，110（1991））将处理得到的抗-eck免疫沉物和未处理的LIM2405细胞溶解物放在7.5%聚丙烯酰胺凝胶上分析。电泳后，将凝胶电印迹（Kamps  Meth.Erzyrnol  201  110（1991））到Immobilon  P（Millipore）上，然后在含0.1%Tween-20（TBST）和5%BSA的Tris-缓冲盐中将印迹湿温育1小时以阻断膜上的非特异性结合位点。在含3%BSA，1%卵白蛋白的TBST中，将一级抗体，或者抗磷酸酪氨酸抗体（4G10，UBI，Lake  Plaid，NY），或抗-eck  C末端稀释到1.0μg/ml，并与印迹在温育1小时。此后，用TBSI润湿印迹，然各用TBST，洗涤一次10-15分钟，然后再洗涤2次，各5分钟。然后将印迹同与辣根过氧化物酶（Amers-ham，Arlingten  Heights，IL）结合的二级抗体的1∶5000稀释液一起单独的TBST中湿育20-30分钟，然后按前述用TBST洗涤。通过化学发光物质（ECL，Amorsham）于室温暴露于Kodak·X-OMAT  X射线胶片0.5-5分钟，来检测免疫复合物。
用SDS-PAGE分析来自32P-标记的LIM2405细胞的eck受体免疫沉淀物，不用固定直接干燥凝胶。暴露于X-射线胶片后，分离标记的eck受体，按描述（Boyle等人，MethEnzymol，201，110（1991））确定磷酸氨基酸含量。
CHO细胞-产生的rEBP以剂量依赖方式最佳浓度在100ng/ml和1mg/ml之间刺激完整LIM2405细胞中的eck受体磷酸化（图6，上行），在总细胞eck蛋白质水平中，似乎是适度的剂量-依赖型降低（图6，下行），说明暴露于可溶性EBP后，受体的下降调节。用EBP处理LIM2405细胞不会导致EGF受体的虚假磷酸化，EGF处理也不会诱导eck磷酸化。此外，分析用rEBP处理的LIM2405细胞的总细胞蛋白质，仅仅诱导的磷酸蛋白质是Mr130  kd的多肽，相当于成熟的eck受体。
在完成用于CHO-细胞产生的rEBP分析后，接着检测大肠杆菌rEBP1-150有关LIM2405细胞上eck受体的自身磷酸化。根所据用相同量的CHO-产生的rEBP和大杆菌产生的EBP1-150处理细胞，观察到两种重组EBP形式在诱导磷酸化方面均有活性。
实施例7
重组EBP的制剂
用BIAcore测量EBP与固定的可溶性eck细胞外区的结合，发现，纯化EBP的稀释溶液迅速失去与eck受体的结合能力，除非将它与保护试剂如洗涤剂配制在一起。
在PBS中稀释到100μg/ml并于3℃温育2小时的重组EBP会丧失约50%的其eck结合活性。通过在洗涤剂如1mM  CHAPS，0.1%NP-40，0.1%  Tween  20，0.1%  triton-x100，或0.1%  tween  80中配制EBP，可以避免这种活性丢失。（见图7）通过将该蛋白质与其它蛋白质载体如胎牛血清一起温育也可以避免稀释EBP  eck结合活性的丢失。
以2-5mg/ml保持在洗涤剂溶液中的EBP的eck结合活性于3℃至少稳定一星期，10-500μg/ml的蛋白质溶液，若于-20℃贮存，或使其经多次冷冻融解循环，则失去活性。
实施例8
在组织和细胞系中表达EBP和eck受体
用Lindberg等人（同上文）描述的方法，已在大鼠的各种组织器官中，在mRNA水平研究了EBP的表达。在肺，肠，肝，卵巢和肾中，EBP的表达最高。在肌肉，胃和脑中也检测到低水平的表达。
在细胞系中，有关EBP和eck受体的表达研究都已做过。在Western分析中，用亲和纯化的抗-人EBP单克隆抗体免疫印迹细胞上清液，从而检测EBP表达。如表2所示，在许多癌细胞中发现了EBP。可用几种方法（包括全细胞溶胞物的免疫印迹和用来自溶胞物的抗-eck抗体免疫沉淀）检测eck表达。（Lindberg等人，同上文）。表2中的结果说明在许多上皮细胞系中都表达过eck，此外，在成纤维细胞和黑瘤细胞系中也发现eck。
表2
表达EBP的细胞系
细胞系  细胞类型
CaCO2结肠腺癌
FADU  鳞状细胞癌
T47D  乳癌
MDAMD361  乳腺癌
THP-1  单核细胞性白摁病
SKBR3  乳腺癌
CaOV4  腺癌
MDAMB453  乳腺癌
Caki1  肾癌
HBL100  乳房
HT29  结肠腺癌
JEGI  绒膜癌
293  胚胎肾
A704  肾腺癌
Caki2  肾腺癌
CaOV3  卵巢腺癌
SKOV3  卵巢腺癌
A172  成胶质细胞癌
A431  表皮癌
BSCI  肾
BT20  乳癌
PC3  前列腺腺癌
JAR  绒膜癌
A498  肾癌
LNCaP  前列腺腺癌
BT474  乳癌
SW480  结肠腺癌
SW620  结肠腺癌
MCF7  乳腺癌
T24  膀胱癌
5637  膀胱癌
Du145  前列腺癌
SKNSA  成神经细胞癌
L929  结缔组织
G401  肾肿瘤
THP-1  单核细胞性白血病
CCDIILu  肺
HT29  结肠腺癌
SKOV3  卵巢腺癌
A172  成交质细胞瘤
A431  表皮癌
JAR  绒膜癌
GM4312A  成纤维细胞
Wi38  肺
UT7  前巨核细胞(premegakaryocyte)
CHOK1  卵巢
HS249T  黑瘤
M14  黑瘤
N1H3T3  成纤维细胞
实施例9
EBP的生物学活性
A.在大鼠创伤腔检测中的EBP活性
研究在大鼠皮下植入的创伤腔中，重组CHO-产生的和大肠杆菌产生的EBP对肉芽组织形成的影响。
将雄性无Sprague-Dawley特异性病原体大鼠（300-350g;Charles River Breeding Laboratories，Inc.）用于该研究。通过膜腔内注射用戊巴比妥钠（50mg/Kg体重）麻醉大鼠。用无菌手术技术，在大鼠的背部表面切一个3cm中线切口。通过在该动物一侧钝切，于膜肌下形成一个袋。然后皮下插入一个3cm长×1cm直径的无菌不锈钢丝网柱。所用的创伤腔与Schilling等人（Surgery 46，702-710（1959））描述的并由Hunt等人（Am.J.Surg H4，302-307（1967））用作创伤愈合模式的那些相似，用创伤钳合上该切口。大鼠术后存活很好，没有术后不适的迹象。创伤腔植入后的起初3天。将大鼠随机分成5个组。此时开始每天注射1）10μgCHO-产生的EBP，2）1μgCHO-产生的EBP，3）8μg大肠杆菌产生的EBP，4）5μg重组血小板产生的生长因子（PDGE），或5）0.1ml无菌PBS和1mMCHAPS，并共持续9天。通过室外边缘的硅酮间隔，直接注射到创伤腔中，腔植入12天后，用CO2窒息处死这些大鼠。处死后，立即手术取出腔并小心打开。然后将其中的肉芽组织称重，并贮存于-70℃以作进一步加工。
将肉芽组织样品融溶并用Polytron匀浆器在2ml冰冷的蒸馏水中匀浆约1分钟。接着，将2ml冰冷的10%三氯乙酸加到匀浆物中并于4℃温育1小时。将TCA-沉淀的样品于4℃离心（500g，10分钟）用2ml冰-冷的5%TCA洗涤一次，最后用含50mM乙酸钠的2ml冰-冷95%乙醇洗涤。将样品用2ml乙醇∶乙醚（3∶1v/v）在20℃脱脂两次。每次脱脂后，离心样品（500×g，10分钟）并除去上清液。然后将沉淀溶解于1N氧化钠中，并将体积加到10ml。
取一份溶解的肉芽组织并按Bradford的方法（Anal  Biochem.72，248-25（1976））检测，从而确定总蛋白质。用牛血清白蛋白（Sigma  Chemical  Co.，St.Louis，MO）及为蛋白质标准曲线。
用Burton的比色法（Biochem.J.62，315（1956））按脱氧核糖确定总DNA含量。总之，加入0.5mlZNHCl中和1ml溶解的样品（在N  NaOH中）。用10%高氯酸在90℃提取1ml中和溶液15分钟。将1ml的最后提取物加到2ml激活的二苯胺（Sigma  Chemical.St.Louis，MO）试剂中，并在室温温育过夜后测定600nm的吸收值。用水解的小牛胸腺DNA（Sigma）制作标准曲线。该DNA含量是创伤腔中细胞数的近似指数，同时认为细胞类型和细胞循环也影响DNA含量。
用硫酸软骨素作为标准，测定总葡糖氨聚糖（GAGs）。利用染料1，9-二甲基亚甲基蓝（Farndale等人，Conn，Tiss.Res  9.247-248（1982））吸收光谱的改变完成GAGs的分光光度检测。
用6N  HCl将溶解的肉芽组织在110℃水解24小时后，将总胶原蛋白含量确定为羟基脯氨酸量（胶原蛋白含量的指数）。干燥200μl样品水解物的各等份，在200μl缓冲液中重新制成，并用Beekman  6300氨基酸分析仪通过氨基酸分析来分析羟基-L-脯氨酸。用外标准的羟基-L-脯氨酸（Sigma）完成定量分析。
通过变量的单向分析来分析数据。然后用双尾未配对的Student′s  t试验对比各组的平均值来分析显著性差异。将统计学显著性确定为P＜0.05。将所有值均表达成平均值±SEM。
与溶剂-处理（PBS和1mMCHAPS）的对照大鼠相比，CHO-产生的rEBP以每室每天10μg的剂量连续9天和rPDGF以每天5μg的剂量（×9天）均显著提高创伤腔肉芽组织的净重，总蛋白，总DNA和总GAG含量（见表3）。植入后12天，收集全部的创伤腔。该时间点是肉芽组织形成的高峰和胶原蛋白形成的早期。与溶剂处理的对照大鼠室相比，CHO-产生的rEBP（以每室每天1μg的剂量）在肉芽组织净重和GAG含量方面有显著的增加。然而，对于1μg  rEBP剂量，在总蛋白，DNA和羟基脯氨酸方面与对照没有显著区别。
胶原蛋白的积累可以是影响创伤强度的唯一最重要的因素。PDGF处理的腔与对照腔相比在羟基脯氨酸含量方面有82%的增加（并因此得出胶原蛋白的合成）。CHO、-产生的rEBP以1μg/室/天在羟基脯氨酸方面有21%的增加，以10μg/室/天则在羟基脯氨酸方面有35%的增加，尽管这些增加并没有统计学的显著的。
Figure 931213215_IMG1
B.鼠血细胞生成中的EBP活性
将来自BDF小鼠的未分离骨髓悬浮液铺在0.3%琼脂糖中的无血清培养基（Iscove′s改性的Dulbecco′s培养基）中，并在96孔平板中以1×105/ml细胞浓度于37℃，5%CO2温育10天。每孔总体积是50μl。以标明的数量加入EBP和其它生长因子，并在温育的第10天将菌落划线。结果列于表8。
与单独用IL-3相比，EBP（以1μg/ml的剂量）可促进IL-3依赖性鼠CFU-C的形成约2倍。CFU-C代表CFU-G，CFU-GM和CFU-M。单独的EBP对CFU-M或EFU-E/CFU-E未表现刺激作用。
C.结肠隐窝检测（Colon  Crypt  Assay）牛的EBP活性
取出5只（BDF）小鼠的结肠，并用非酶（EDTA）提取法分离隐窝（Crypts）简而言之，洗涤结肠并在含0.04%次氯酸钠的PBs溶液中放20分钟。通过在含3mM  EDTA和0.5mMDTT的PBs溶液中于37℃温育该组织1小时使隐窝分离。将隐窝在37℃经胰酶消化（在PBS中0.2%）90分钟以得到单细胞悬浮液。用PBS洗涤细胞，计数，用台盼蓝排除法确定成活力（该实验是85%）。然后将细胞铺在上层是0.37%Sigma低融点琼脂，底层是0.5%琼脂的顶层。在琼脂中所用的RPMI培养基有1×ITS（胰岛素，转铁蛋白，硒，Gibco）存在。在存在1%胎牛血清（FCS）和下列浓度标明的生长因子的情况下进行培养：TGFα，500ng/ml;bFGF，60ng/ml;EBP，500ng/ml。对照培养不含生长因子和/或FCS。各种培养条件的每一个均完成一式三份，并每过几天划线。
隐窝细胞与1%FCS和EBP或1%FCS和bFGF一起培养后，得到阳性结果。在两种条件下，细胞群很大且群内的单个细胞看起来健康。在一些情况下，细胞群象隐窝形。若将EBP和bFGF与FCS一起加入，很少且很小的细胞群与存在1%FCS时单独加入该两种生长因子之一的情况相象。开始，EBP与hFGF结合似乎诱导细胞生长，但生长方面的刺激作用是短暂的。在单独用EBP的平板中（没有血清），偶尔有大细胞群，但它们很稀疏，细胞很大，而约一半的细胞在群内不能存活。
这些结果说明，EBP涉及结肠隐窝细胞的增殖，分化或再生。
D.EBP对细胞一级培养物的活性
通过Segien描述的原位两步胶原酶预融合技术（Methods in Toxicol.，Vol.lA，231-243（1993））分离肝细胞。简而言之，将预融合的肝分散于冰冷Hank′s缓冲液中，通过尼龙网过滤，以50xg重复离心从非实质细胞中分离肝细胞。通过台盼蓝排除法确定肝细胞有远大于85%的可存活。在用大鼠尾胶原蛋白包被的平板上培养肝细胞并铺在含5%FCS，10-7M胰岛素，10-8M地塞米松，谷氨酰胺，青霉素和链霉素的Williams E中。
使细胞在含培养基的血清中粘附3-4小时，然后转移到无血清培养基中。加入适当浓度的EBP或其它生长因子，并在3H-胸苷存在的情况下将细胞温育24到48小时。温育后，确定3H-胸苷掺入到细胞中的程度。被检测的生长因子是10ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF），20ng/ml的酸FGF（aFGF），和20ng/ml的EBP。结果列于图9。EBP刺激的3H-胸苷掺入量与由aFGF诱导有大约相同。KGF和EBP的结合对肝细胞生长的刺激不超过单独用KGF观察到的水平。在这项特别的实验中，无血清值通常不高的（约3倍）。
以优选实施方案的方式，已描述了本发明，本领域专业人员会理解发生的变化和改变。因此，所附的权利要求将覆盖在本发明要求范围内的全部上述等同变化。
序列目录
（1）一般资料;
（Ⅰ）申请人;Bartley，Timothy  Dudley
Fox，Gqry  Michael
Boyle，William  Tames
Weleher，Andrew  Avery
Parker，Vann  Phillips
（Ⅱ）发明题目;eck受体配体
（Ⅲ）序列数：16
（Ⅳ）有关地址;
（A）收信人：Amgen  Ine
（B）街道;Amgen  Center
1840  Dehavilland  Drive
（C）城市;Thausand  Oaks
（D）州;California
（E）国家;USA
（F）邮编;91320-1789
（Ⅴ）计算机可读形式;
（A）介质类型;Diskette，3.5  in.，DS，2.0Mb
（B）计算机;Apple  Macintosh
（C）操作系统;Macintosh  OS  7.0
（D）软件;Microsoft  Word  Uersion  5.1a
（Ⅵ）目前的申请资料;
（A）申请号;
（B）申请日;
（C）分类号;
（2）SEQ  ID  NO：1的资料
（1）序列特征;
（A）长度;205个氨基酸
（B）类型;氨基酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;未知的.
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：1
Met Glu Phe Leu Trp Ala Pro Leu Leu Gly Leu Cys Cys Ser
            -15                 -10                 -5
Leu Ala Ala Ala Asp Arg His Thr Val Phe Trp Asn Ser Ser
                 1               5                   10
Asn Pro Lys Phe Arg Asn Glu Asp Tyr Thr Ile His Val Gin
                15                   20
Leu Asn Asp Tyr Val Asp Ile Ile Cys Pro His Tyr Glu Asp
25                  30                  35
His Ser Val Ala Asp Ala Ala Met Glu Gln Tyr Ile Leu Tyr
    40                  45                  50
Leu Val Glu His Glu Glu Tyr Gln Leu Cys Gln Pro Gln Ser
         55                 60                  65
Lys Asp Gln Val Arg Trp Gln Cys Asn Arg Pro Ser Ala Lys
            70                  75                   80
His Gly Pro Glu Lys Leu Ser Glu Lys Phe Gln Arg Phe Thr
                85                  90
Pro Phe Thr Leu Gly Lys Glu Phe Lys Glu Gly His Ser Tyr
95                  100                 105
Tyr Tyr Ile Ser Lys Pro Ile His Gln His Glu Asp Arg Cys
    110                 115                 120
Leu Arg Leu Lys Val Thr Val Ser Gly Lys Ile Thr His Ser
        125                 130                 135
Pro Gln Ala His Val Asn Pro Gln Glu Lys Arg Leu Ala Ala
            140                 145                 150
Asp Asp Pro Glu Val Arg Val Leu His Ser Ile Gly His Ser
                155                 160
Ala Ala Pro Arg Leu Phe Pro Leu Ala Trp Thr Val Leu Leu
165                 170                 175
Leu Pro Leu Leu Leu Leu Gln Thr Pro
    180                 185
（2）SEQ  ID  NO：2的资料
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;30个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：2
AAGCATATGG  ATCGCCACAC  CGTCTTCTGG
（2）SEQ  ID  NO：3的资料
（ⅰ）序列特征
（A）长度;35个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：3：
GAAGGATCCT  TATCACGGGG  TTTGCAGCAG  CAGAA
（2）SEG  ID  NO：4  的资料
（ⅰ）序列特征
（A）长度;36个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序述描述;SEQ  ID  NO：4
GAAGGATCCC  TATTATGCTG  CAAGTCTCTT  CTCCTG
（2）SEQ  ID  NO：5的资料
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;31个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓朴结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：5：
GAATTCAAGC  TTCAGGCCCC  GCGCTATGGA  G
（2）SEQ  ID  NO：6的资料;
（ⅰ）序列特征
（A）长度;35个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：6
GAATTCTCTA  GATCATCACG  GGGTTTGCAG  CAGCA
（2）SEQ  ID  NO：7的资料
（ⅹ）序列特征;
（A）长度;13个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓朴结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：7
AGCTTAGATC  TCC
（2）SEQ  ID  NO：8的资料;
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;13个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：8
AATTGGAGAT  CTA
（2）SEQ  ID  NO：9的资料;
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;39个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（C）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：9
AATTCCAGAC  GCTGTCCCCG  GAGGGATCCG  GCAACTGAG
（2）SEQ  ID  NO：10的资料;
（ⅹ）序列特征;
（A）长度;39个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：10
TCGACTCAGT  TGCCGGATCC  CTCCGGGGAC  AGCGTCTGG
（2）SEQ  ID  NO：11的资料
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;1480个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;双链
（D）拓扑结构：线性
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  NO：11：
Figure 931213215_IMG3
（2）SEQ  ID  NO：12  的资料;
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;5个氨基酸
（B）类型;氨基酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;未知
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：12：
Lys  Arg  Leu  Ala  Ala
（2）SEQ  ID  NO：13的资料;
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;23个氨基酸
（B）类型;氨基酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;未知
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ  ID  No：13：
Asp Arg His Thr Val Phe Asp Asn Ser Ser Asn Pro Lys Phe
1               5                   10
Arg Asn Glu Asp Tyr Ile His Val Gln
15                  20
（2）SEQ  ID  NO：14  的资料;
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;40个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：14
GAATTCTCTA  GATTTCATGG  AAGGAGCAGC  ACAGTCCAG
（2）SEQ  ID  NO：15  的资料;
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;39个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：15
GAATTCTCTA  GATTATCATG  GGAAGAGGCG  TGGGGCAGC
（2）SEQ  ID  NO：16  的资料;
（ⅰ）序列特征;
（A）长度;41个核苷酸
（B）类型;核酸
（C）链型;单链
（D）拓扑结构;线性
（ⅹⅰ）序列描述;SEQ  ID  NO：16：
GAATTCTCTA  GATTATCATG  GGGCAGCACT  GTGACCGATG  C

Claims (43)

1、一种特异性结合eck受体并具有与SEQ  ID  NO：1所示基本相同的氨基酸序列的纯化及分离的多肽。
2、诱导eck受体磷酸化的权利要求1的多肽。
3、具有SEQ  ID  NO：1所示的终止于150位的氨基酸序列或具有与终止于150位SEQ  ID  NO∶1所示基本相同的氨基酸序列的权利要求1的多肽。
4、其中氨基酸的序列是SEQ  ID  NO∶1中所示的+1位到150位的权利要求3的多肽。
5、在-1位有一个甲硫氨酸残基的如权利要求的多肽。
6、选自[Met-1]EBP1-150和[Met-1]EBP1-159的如权利要求5的多肽。
7、选自EBP1-167EBP1-171和EBP1-180的如权利要求1的多肽。
8、权利要求1的多肽，其特征在于它是外源DNA列的原核或真核表达产物。
9、权利要求8的多肽它是CHO细胞表达的产物。
10、权利要求8的多肽，其中外源序列是cDNA序列。
11、权利要求8的多肽，其中外源序列是基因组DNA序列。
12、权利要求8的多肽，其中外源序列是合成的DNA序列。
13、权利要求8的多肽，其中外源DNA序列由自我复制的DNA质粒或病毒载体携带。
14、权利要求8的多肽，它是大肠杆菌表达的产物。
15、有一个N-末端甲硫氨酸残基的权利要求8的多肽。
16、编码特异性结合eck受体的多肽的DNA序列，其中所述多肽在一1位有一个甲硫氨酸残基并且具有与SEQ  ID  NO∶1所示基本相同的氨基酸序列。
17、根据权利要求16的DNA序列编码[Met-1]EBP1-150和[Me-1]EBP1-159。
18、编码EBP1-167，EPB1-171和EBP1-180的DNA序列。
19、一种分离的eck受体-配体复合物。
20、根据权利要求19的受体-配体复合物，其中配体是权利要求1的多肽。
21、检测粗样品中能结合受体的配体的方法，包括步骤;
a）固定受体的纯化配体结合区;
b）将固定的受体与含配体的限制性培养基接触;和
c）用表面胞质基因共振检测系统检测配体与固定受体的结合。
22、权利要求21的方法，其中受体是eck受体。
23、调节哺乳动物中eck受体外源活性的方法，包括给所述哺乳动物施用有效量的eck受体配体以调节所述受体有活性。
24、根据权利要求23的方法，其中所述配体是权利要求1的多肽。
25、根据权利要求23的方法，其中所述eck受体活性的调节作用调节包括分化，增殖以及代谢内的新陈代谢。
26、一种用于鉴别可调节eck受体活性的化合物的方法，包括步骤;
a）将呈现受体的细胞暴露于已知配体中一段足够的时间以使受体-配体复合形成并诱导信号转导;
b）确定细胞内活性的程度;和
c）将测得的活性与未暴露可配体细胞中的活性进行比较。
27、一种治疗患者中癌症的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。
28、一种治疗患者中癌症的方法，包括施用治疗有效量的权利要求和27的配体，所述配体与eck受体结合，但不使其磷酸化。
29、一种治疗患者中癌症的方法，包括施用治疗有效量的eck可溶性受体。
30、权利要求27，28或29的任一种方法，还包括治疗有效量的化疗或放射治疗。
31、一种治疗患者中炎症的方法，包括施用治疗有效量的eck可溶性受体。
32、一种治疗患者中炎症的方法，包括施用治疗有效量的eck受体，其中所述配体与eck受体结合，但不使其磷酸化。
33、一种治疗哺乳动物创伤的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。
34、一种治疗哺乳动物中增加血细胞生成的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。
35、根据权利要求34的方法，其中配体是权利要求1的多肽。
36、一种刺激结肠细胞增殖的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。
37、根据权利要求36的方法，与癌症疗法结合起来使用。
38、根据权利要求36的方法，其中配体是权利要求1的多肽。
39、一种刺激肝细胞增殖的方法，包括施用治疗有效量的eck受体配体。
40、根据权利要求39的方法，其中配体是权利要求1的多肽。
41、一种药物学组合物，含有治疗有效量的eck受体配体和药物学可接受的稀释剂，辅剂或载体。
42、一种药物学组合物，含有治疗有效量的eck可溶性受体和药物学可接受的稀释剂辅剂或载体。
43、一种组合物含有权利要求1的多肽和一种洗涤剂。
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