CN88100685A - 人的白细胞间素-3及其突变蛋白质 - Google Patents
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Abstract
提供了新的人白细胞间素-3蛋白质,与以前报道的人IL-3顺序相比较,它含有非保守氨基酸的取代(7位的Ser Pro)。还提供了合成构象及抗原中性的突变蛋白的方法。所公开的人IL-3蛋白可促进多种造血谱系的生长发育,因此可用于涉及血细胞再生和/或血细胞群体受抑制的病症,例如骨髓发育不全、慢性感染和利用移植骨髓的治疗。
Description
一般地说,本发明涉及造血系统发育中的蛋白质介体及其核酸编码顺序。更具体地说,本发明涉及人白细胞间素-3的一种变异体,其突变蛋白及其核酸编码顺序。
循环的血细胞不断被新生成的细胞所更新。取代的血细胞是在称为造血的过程中形成的,此过程涉及至少八种成熟血细胞谱系的生成:红血球(红细胞)、巨噬细胞(单核细胞)、嗜酸性粒细胞、巨核细胞(血小板)、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞(肥大细胞)、T淋巴细胞和B淋巴细胞(Burgess and Nicola,Growth Factors and Stem Cells(Academic Press,New York,1983))。血细胞形成的调控大多是由一组称为集落促进因子(CSF)的相互作用的糖蛋白介导的。这样命名这些糖蛋白是基于用来检测其存在的体内试验和体外试验。对于发展体外检测法来说,在半固体培养基中对造血细胞进行克隆培养的技术一直是非常重要的。在这种培养中,单个的母细胞(即那些将定型发育成特定谱系的细胞,但它们仍然能够增殖)能够通过增殖而以某种方式形成成熟的子代集落,并且认为,此过程与相应的体内过程基本一致。最近有许多综述讨论了CSF在造血过程中的作用(例如Metcalf,The Hemopoietic Colony Stimulating Factors(Elsevier,New York,1984);Metcalf,Science,Vol.229,pgs.16-22(1985);Nicola et al.,Immunology Today,Vol.5,pgs.76-80(1984);Whetton et al.,TIBS,Vol.11,pgs.207-211(1986))。
检测,分离和纯化这些因子是极为困难的,因为下述因素经常使这些过程变得非常复杂:例如含有这些因子的典型上清液的特性、混合物中各组分活性的差异及交叉、用于确定这些因子特性的检测方法的灵敏度(或灵敏度的缺乏)、这些因子的分子量范围和其他性质经常很相似、这些因子在其天然环境中的浓度很低等。
随着能够得到更多的CSF(主要通过分子克隆),人们的兴趣开始集中于寻找这些因子的临床应用途径。由于CSF与激素在生理上具有相似之处(如都是可溶性因子和生长介体、都通过细胞受体作用等),因此一直推测它们的潜在应用类似于目前对激素的应用(如Dexter,Nature,321∶198,1986)。已有过建议将它们用于几种需要促进血细胞生成的临床状况中,例如用于对肿瘤进行化疗和放疗后的恢复治疗、治疗骨髓发育不全、治疗嗜中性白细胞缺乏症、在骨髓移植后提高造血机能的再生能力、增强受体对已有感染的抗性等(例如Dexter,出处同上;Metcalf,Science,出处同上)。
在过去几年中,已经鉴别、纯化并克隆了称为多-CSF或白细胞间素-3(IL-3)的鼠CSF活性;参见Yokota et al;Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.81,pgs.1070-1074(1984);Fung et al.,Nature,Vol.307,pgs.233-237(1984);Hapel et al.,Blood,Vol.65,pgs.1453-1459(1985);Ihle et al.,J.Immunol.,Vol.129,pgs.2431-2436(1982);Ihle et al.,J.Immunol.,Vol.131,pgs.282-287(1983);and Iscove et al.,pgs.397-425 in Cellular and Molecular Biology of Lymphokines(Academic Press,New York,1985)。鼠IL-3表现出广谱的CSF活性,能够促进所有已知的骨髓谱系母细胞的增殖和发育(参见Dexter,Nature,309:746-747,1984;Ihle et al.,Lymphokines 9:153-200,1984)。由于此因子具有广泛的刺激效应,对于从其他哺乳动物(尤其是人)中分离出类似因子一直存在极大的兴趣。
最近报道了大鼠、长臂猿和人的小鼠IL-3的同源物(Cohen et al.,Nucleic Acids Research 14:3641-3658,1986;Yang et al.,Cell 47:3-10,1986)。所报道分子的氨基酸顺序与小鼠IL-3的同源程度较低:大鼠为54%,长臂猿为29%,人为29%。而且,尚未确定人的同源物是否象小鼠IL-3一样具有相同范围的生物活性。
综上所述,得到具有确定生物活性的小鼠IL-3的人类同源物的变异体,对于可能的临床应用来说将是极为有利的,尤其是在促进血细胞生成以补偿疾病诱导的骨髓发育不全、逆转癌症治疗中的有害副作用、提高骨髓移植效能等情况下。
本发明涉及人的白细胞间素-3(IL-3)及其通过基因工程构建的变异蛋白。它包括具有由下述式Ⅰ定义的顺序中选择出来的氨基酸顺序的多肽,并具有由标准检测法所定义的集落促进因子(CSF)活性。本发明还包括能够编码式Ⅰ所定义的多肽的核酸;利用本发明核酸制备这种多肽的方法;以及单独使用或与其他CSF一起使用本发明多肽的方法,以治疗与骨髓发育不全有关的机能紊乱,或在骨髓移植或某些肿瘤治疗后增强造血系统的机能再生。
本发明一个较好的具体方案是一组糖基化或非糖基化的多肽,它包括选自由下式定义的一组顺序的氨基酸顺序:
X(Pro)-X(Met)-X(Thr)-X(Gln)-X(Thr)-W(Thr)-
10
W(Pro)-W(Leu)-W(Lys)-X(Thr)-X(Ser)-X(Trp)-
X(Val)-X(Asn)-Cys-X(Ser)-W(Asn)-W(Met)-
20
W(Ile)-W(Asp)-W(Glu)-W(Ile)-W(Ile)-W(Thr)-
30
W(His)-W(Leu)-W(Lys)-W(Gln)-W(Pro)-W(Pro)-
X(Leu)-X(Pro)-X(Leu)-X(Leu)-X(Asp)-X(Phe)-
40
X(Asn)-X(Asn)-W(Leu)-W(Asn)-W(Gly)-W(Glu)-
W(Asp)-W(Gln)-W(Asp)-W(Ile)-W(Leu)-W(Met)-
50
W(Glu)-W(Asn)-W(Asn)-W(Leu)-W(Arg)-W(Arg)-
60
W(Pro)-W(Asn)-W(Leu)-W(Glu)-W(Ala)-W(Phe)-
W(Asn)-W(Arg)-W(Ala)-W(Val)-W(Lys)-W(Ser)-
70
W(Leu)-W(Gln)-W(Asn)-W(Ala)-W(Ser)-W(Ala)-
W(Ile)-W(Glu)-W(Ser)-W(Ile)-W(Leu)-X(Lys)-
80
X(Asn)-X(Leu)-X(Leu)-X(Pro)-Cys-X(Leu)-
90
X(Pro)-X(Leu)-X(Ala)-X(Thr)-X(Ala)-W(Ala)-
W(Pro)-W(Thr)-W(Arg)-W(His)-W(Pro)-W(Ile)-
100
W(His)-W(Ile)-W(Lys)-W(Asp)-W(Gly)-W(Asp)-
W(Trp)-W(Asn)-W(Glu)-W(Phe)-W(Arg)-W(Arg)-
110
W(Lys)-W(Leu)-X(Thr)-X(Phe)-X(Tyr)-X(Leu)-
120
X(Lys)-W(Thr)-W(Leu)-W(Glu)-W(Asn)-W(Ala)-
W(Gln)-W(Ala)-W(Gln)-W(Gln)-X(Thr)-X(Thr)-
130
X(Leu)-X(Ser)-X(Leu)-X(Ala)-X(Ile)-X(Phe)
式Ⅰ
其中,符号W(Xaa)和X(Xaa)分别代表与位于蛋白亲水区或疏水区氨基酸Xaa同义的氨基酸组,正如Hopp-Woods分析所测定的那样。一组中的同义氨基酸具有足够相似的物化性质,能在同组成员间进行取代而保留分子的生物功能(Grantham,Science 185:862-864,1974;Dayhoff et al.,“A Model of Evolutionary Change in Proteins”,Atlas of Protein Sequence and Structure 1972,5:89-99)。显然,在上面定义的顺序中,在不改变生物功能的条件下,还可以进行氨基酸的插入和缺失,尤其是在插入或缺失仅仅涉及几个氨基酸(例如小于10个),并且不去掉或置换对于功能构象至关重要的氨基酸(例如半胱氨酸残基)时(Anfinsen,“Principles That Govern the Folding of Protein Chains”,Science 181:223-230,1973)。由这种缺失和/或插入产生的蛋白和突变蛋白落入本发明的权限范围内。在本文中,无论何时提及式Ⅰ蛋白中的氨基酸残基号码,这种记数都是参照蛋白的N末端。
应当注意到,由式Ⅰ(以及后面给出的式Ⅱ)中的实际氨基酸Xaa代表的人IL-3多肽,与以前报道的人IL-3顺序(Yang et al.,Cell 47:3-10,1986)相比较,7位的非保守氨基酸丝氨酸由脯氨酸所取代。
同义氨基酸组优选表Ⅰ和表Ⅱ中所定义的氨基酸。更好的是,同义氨基酸组是表Ⅰ和表Ⅱ每一行中第二斜线之前所列的氨基酸,最好的是,同义氨基酸组是表Ⅰ和表Ⅱ每一行中第一斜线之前所列的氨基酸(每一个最好的W(Xaa)组由Xaa本身组成)。
表Ⅰ.较好的、更好的和最好的同义氨基酸组X(Xaa)
Xaa X(Xaa)
Ser Ser,//Thr,Gly,Asn,Cys
Arg Arg,/Lys,His,/Gln,Glu
Leu Leu,Ile,Met,/Phe/Val,Tyr
Pro Pro,/Ala,/Gly,Thr
Thr Thr,//Pro,Ser,Ala,Gly,His,Gln
Ala Ala,/Pro,/Gly,Thr
Val Val,/Met,Ile,/Leu,Tyr,Phe
Gly Gly,//Ala,Thr,Pro,Ser
Ile Ile,Met,Leu,/Phe,Val,/Tyr
Phe Phe,/Met,Tyr,Ile,Leu,/Val,Trp
Tyr Tyr,/Phe,/Trp,Met,Ile,Val,Leu
His His,/Gln,Arg,/Glu,Lys,Thr
Gln Gln,/Glu,His,/Thr,Arg,Lys,Asn
Asn Asn,/Asp,/Ser,Gln
Lys Lys,/Arg,/Glu,Gln,His
Asp Asp,/Asn,/Glu
Glu Glu,/Gln,/His,Arg,Asp,Lys,Asn
Met Met,Ile,Leu,/Phe,Val/
Trp Trp//
Cys Cys//
表Ⅱ.较好的、更好的和最好的同义氨基酸组W(Xaa)
Xaa W(Xaa)
Ser Ser,//Cys
Arg Arg,//His,Lys
Leu Leu,/Ile,Met,/Phe
Pro Pro,//Ala
Thr Thr//
Ala Ala,//Pro
Val Val,//Met,Ile
Gly Gly//
Ile Ile,/Met,Leu,/Phe,Val
Phe Phe,//Met,Tyr,Ile,Leu
Tyr Tyr,//Phe
His His,//Gln,Arg
Gln Gln,//Glu,His
Asn Asn,//Asp
Lys Lys,//Arg
Asp Asp,//Asn
Glu Glu,//Gln
Met Met,/Ile,Leu,/Phe,Val
Trp Trp//
Cys Cys//
本发明包括在式Ⅰ的一个或多个位置具有氨基酸取代(在式Ⅱ所定义多肽的氨基酸(公认的天然顺序)和同义氨基酸之间取代)的多肽。术语“N重取代”用来描述式Ⅰ定义的多肽亚组,其中,O-N个天然顺序的氨基酸被同义氨基酸所取代。以式Ⅰ的1重取代的多肽组为例,对于较好的同义氨基酸组来说,由381种多肽组成,对于更好的同义氨基酸组来说为245,对于最好的同义氨基酸组来说为38。这些数目是由两个数相加得到的:(1)天然顺序疏水区中的每种氨基酸的数目乘以该氨基酸的同义氨基酸组(X组)数目的积;(2)天然顺序亲水区中每种氨基酸的数目乘以该氨基酸的同义氨基酸组(W组)的数目的积。
人IL-3多肽组较好地是由式Ⅰ中10重取代的多肽组成,其中,由残基10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的区域中的氨基酸不超过3-重取代。与小鼠、大鼠和长臂猿IL-3顺序相比较,此分子的这些区域的氨基酸顺序比其他区域具有相对更高的保守性。
更好的是,人IL-3多肽组由式Ⅰ中5重取代的多肽组成,其中,由残基10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的区域中的氨基酸不超过1重取代。进一步更好的是,人IL-3多肽组由式Ⅰ中2重取代的多肽组成,其中,由残基10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的区域中的氨基酸不发生取代。最好的是,本发明的多肽包括由下式限定的天然氨基酸顺序:
Pro-Met-Thr-Gln-Thr-Thr-Pro-Leu-
10
Lys-Thr-Ser-Trp-Val-Asn-Cys-Ser-
20
Asn-Met-Ile-Asp-Glu-Ile-Ile-Thr-
30
His-Leu-Lys-Gln-Pro-Pro-Leu-Pro-
40
Leu-Leu-Asp-Phe-Asn-Asn-Leu-Asn-
Gly-Glu-Asp-Gln-Asp-Ile-Leu-Met-
50
Glu-Asn-Asn-Leu-Arg-Arg-Pro-Asn-
60
Leu-Glu-Ala-Phe-Asn-Arg-Ala-Val-
70
Lys-Ser-Leu-Gln-Asn-Ala-Ser-Ala-
80
Ile-Glu-Ser-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu-
Leu-Pro-Cys-Leu-Pro-Leu-Ala-Thr-
90
Ala-Ala-Pro-Thr-Arg-His-Pro-Ile-
100
His-Ile-Lys-Asp-Gly-Asp-Trp-Asn-
110
Glu-Phe-Arg-Arg-Lys-Leu-Thr-Phe-
120
Tyr-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Asn-Ala-
Gln-Ala-Gln-Gln-Thr-Thr-Leu-Ser-
130
Leu-Ala-Ile-Phe
式Ⅱ
与此相似,在提及式Ⅰ的多肽时使用术语“N-重插入”是描述这样一组多肽,其中有1-N个氨基酸插入式Ⅰ所限定的顺序中。较好的是,插入氨基酸由邻接插点的氨基酸的较好的同义氨基酸组中选出;更好的是,它们是由邻接插点的氨基酸的更好的同义氨基酸组中选出;最好是从邻接插点的氨基酸的最好的同义氨基酸组中选出(见表Ⅰ和表Ⅱ)。例如,1重插入肽组的一个亚组在N末端X(Pro)和邻接的X(Met)之间含有一个插入氨基酸。限定此亚组各成员的插入氨基酸较好地是选自Pro、Ala、Gly、Thr、Met、Phe、Ile、Val和Leu;更好是选自Ala、Pro、Met、Leu、Phe、Ile和Val;最好是选自Pro、Met、Ile、和Leu。插入可在式Ⅰ的任何邻接氨基酸之间进行,也可以插在氨基酸顺序的起始和终点处。由于有133个可能的插入位点,并由于在同一位点可进行多重插入,所以式Ⅰ的一个2重插入肽亚组共由17,689种肽组成,每个亚组的大小取决于邻接插点的氨基酸的同义氨基酸组的大小。
提及式Ⅰ的多肽时使用术语“N重缺失”是描述这样一组肽,它们在式Ⅰ所限定的顺序中缺失了1-N个氨基酸。因此,式Ⅰ的1重缺失多肽组由132个多肽亚组组成,其中每个多肽长度为131个氨基酸(131聚体)。每个亚组又由所有由较好的、更好的和最好的同义氨基酸组所限定的131聚体组成,其数量取决于取代的多重性。
不论何时用式Ⅰ顺序的缺失和插入共同限定多肽组,首先形成由插入限定的多肽组,然后对于该组的每一成员形成由缺失限定的多肽组。后面所有组的成员之和则形成由插入和缺失共同限定的多肽组。
本发明的多肽可以是更长多肽的一部分,该更长的多肽在本发明多肽的N末端连接有一个额外的肽段。外加肽段可以是引导蛋白从宿主生物中分泌的信号顺序,例如酵母的MFα信号顺序(Kurjan et al.,Cell 30:933-943,1982)。或者,外加肽段可以用来促进所需蛋白的纯化(如Sassenfeld et al.,“A Polypeptide Fusion Designed for the Purification of Recombinant Proteins”,
Biotechnology1984年1月:76-81)。在后一情况中,外加肽段含有一个邻接于所需多肽N末端的选择性切割位点,以用于以后通过酶解或化学法切掉多余的(对于生物活性来说)的氨基酸顺序。
本发明的上述较好的具体方案进一步包括某些核苷酸顺序,这些顺序能够编码式Ⅰ中较好的、更好的和最好的同义氨基酸组的多肽。尤其是,本发明包括具有图2给出的pcD-huIL3-22-1克隆中cDNA插段顺序的核酸。pcD-huIL3-22-1已寄存于ATCC(Rockville,Maryland),寄存号为67318。
本文自始至终使用标准缩写表示氨基酸、核苷酸、限制性核酸内切酶等等(Cohn,“Nomenclature and Symbolism of α-Amino Acids,"Methods in Enzymology,Vol.106,pgs.3-17(1984);Wood et al.Biochemistry:A Problems Approach,2nd ed.(Benjamin,Menlo Park,1981);and Roberts,"Directory of Restriction Endonucleases",Methods in Enzymology,Vol.68,pgs.27-40(1979))。
本文要解决的问题是,应用免疫调控剂治疗医学和/或兽医学上的机能紊乱。具体地说,本发明提供了能够促进血细胞再生的化合物,它可用于治疗癌症,治疗某些血液疾病和治疗持续性感染。
为了更好地理解本发明,现在结合附图描述较好的实例,在这些附图中:
图1表明在构建pcD表达和克隆载体中所用的质粒pcDV1的限制性位点和主要编码区;
图2表明在构建pcD表达和克隆载体中所用的质粒pL1的限制性位点和主要编码区;
图3表明本发明的人IL-3 cDNA的核苷酸顺序和推测的氨基酸顺序;
图4表明用于产生mRNA以注射入卵毋细胞中的修饰的pcD载体pSP6。
本发明包括具有人IL-3活性的糖基化或非糖基化的多肽,它可利用标准的蛋白质工程技术从本文公开的IL-3多肽中衍生出来。本发明还包括具有能够编码本发明多肽的顺序的核酸。最后,本发明包括利用本文公开的核苷酸顺序制备本发明的糖基化或非糖基化的多肽的方法,以及使用本发明多肽的方法。
下面,以一般方式讨论本发明多肽和核酸的制备、使用和鉴定技术。然后提供若干个具体实例,其中,使用具体的细胞型、载体、试剂等实施一般技术。
Ⅰ.由天然来源制备人IL-3 cDNA
本发明的cDNA可通过从图2公开的cDNA顺序构建cDNA探针而得到。然后使用探针鉴别cDNA文库中的互补cDNA克隆。cDNA文库最好是由分裂素诱导的T细胞克隆或外周血液淋巴细胞(PBL)群体构建。从通过诱导而生长的和/或合成某些细胞产物的细胞中构建cDNA文库,是分子生物学中的公知技术(参见Doherty最近的综述"Cloning and Expression of cDNA",Chapter 10 in Gottesman,Ed.Molecular Cell Genetics(John Wiley & Sons,New York,1985);and Brandis et al.,"Preparation of cDNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequences",in Setlow et al.,Eds.Genetic Engineering,Vol.8,pgs.299-316(Plenum Press,New York,1986)。
总mRNA的提取、mRNA至双链cDNA的转化、cDNA的克隆和合适宿主的转化根据WO87/02990(PCT申请/US 86/02464)30页最后一段(延至31页)所述方法进行。
编码所需多肽的mRNA的较好来源是这样的细胞,它的上清液中含有与本发明多肽有关的活性。一般来说,合适的T细胞可从多种来源得到,例如人的脾脏、扁桃体和外周血液等。也可以使用例如从外周血液T淋巴细胞中分离的T细胞克隆
(见Research Monographs in Immunology,eds.von Doehmer,H.and Haaf,V.;Section D:"Human T-Cell Clones",vol.8,pgs.243-333;Elsevier Science Publishers,N.Y.[1985]).)。
利用标准技术构建cDNA文库的探针,例如对本发明完整长度或几乎完整长度的cDNA克隆进行缺口翻译,或者标记合成的寡核苷酸。Maniatis等人(出处同上)详细描述了缺口翻译技术,而使用市售DNA合成仪(如Applied Biosystems,Inc.,(Foster City,CA)381A型或其类似仪器)可构建具有任何所需碱基顺序的标记的合成寡核苷酸。
然后利用标准技术用探针筛选cDNA文库
(如Beltz et al.,"Isolation of Multigene Families and Determination of Homologies by Filter Hybridization Methods,"Methods in Enzymology,Vol.100,pgs.266-285(1983);Callahan et al.,"Detection and Cloning of Human DNA Sequences Related to the Mouse Mammary Tumor Virus Genome,"Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.79,pgs.5503-5507(1982),Grunstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.72,pgs.3961-3965(1975);or Benton et al.,Science,Vol.196,pgs.180-183(1977))。
Ⅱ.通过蛋白质工程制备人IL-3的突变蛋白
在PCT/US86/02464(见上述)申请的第33页倒数第4行至第3页第11行中,描述了使DNA突变并产生突变蛋白的一般技术,这些技术也可用于本发明中。
在许多情况下都可能需要天然多肽的突变蛋白。例如,通过某些突变蛋白可减少不利的副作用,如果此副作用活性是由多肽中不同于所需活性的部分所决定,则尤其是这样。而且,在某些表达系统中,天然多肽可能对蛋白酶降解敏感;因此,选择能改变敏感顺序的氨基酸取代和/或缺失将显著地提高产率。例如英国专利申请2173-804-A,其中,人的组织血纤维蛋白溶酶原活化因子中275位的Arg由Gly或Glu所置换。通过去掉对氧化、酰化、烷基化或其他化学修饰敏感的氨基酸,还可提高突变蛋白纯化过程的产率和/或提高蛋白质的保存寿命。例如,蛋氨酸很容易氧化形成亚砜,这使许多蛋白质丧失其生物活性(Brot and Weissbach,Arch.Biochem.Biophys.223:271,1983)。蛋氨酸常常可由惰性较强的氨基酸置换,而很少或不丧失生物活性(例如澳大利亚专利申请AU-A-52451/86)。在细菌表达系统中,有时可通过去掉或置换在构象上起关键作用的半胱氨酸残基而提高产率(例如Mark等人,美国专利4,518,584)。
下面按照Estell等人(出处同上)所用的记号区别突变蛋白,并给予一般的说明。例如,“人IL-3突变蛋白Leu13”(或如果能从上下文理解天然蛋白,则简化为“Leu13”)表明这样一个多肽,其氨基酸顺序除了以N末端起13位以外,与天然蛋白一致。该位置的Val已由Leu所取代。可用类似方法表示一个以上的置换;例如,在13位由Leu取代Val并且18位由Phe取代Met的突变蛋白,记为人IL-3突变蛋白(Leu13,Phe13)。用“△”表示缺失。例如,在4位缺乏Gln的突变蛋白称为人IL-3突变蛋白△4。用“IN(Xaa)”表示插入。例如,在4位的Gln之后插入Leu的突变蛋白称为人IL-3突变蛋白IN4(Leu)。因此,人IL-3突变蛋白(Ser10,△4,IN6(Gly))代表经过如下修饰的人IL-3的天然顺序:在10位由Ser置换Thr,4位缺失了Gln,紧跟在6位Thr之后插入了Gly。在同一位点插入多个氨基酸用INi(Xaa1-Xaa2-Xaa3-…)表示,其中Xaa1-Xaa2-Xaa3…是在i位之后插入的顺序。N末端加入用上标“O”表示,例如IN0(Xaa);而氨基酸6-10的缺失顺序则用△6-10或(△6,△7,△8,△9,△10)表示。
最好是利用盒式诱变法(Cassette mutagenesis)产生人IL-3突变蛋白。正如下面将进一步描述的,用具有沿着基因大致均一隔开的单一限制性核酸内切酶位点的顺序构建合成的人IL-3基因。当基因插入合适的载体中时,应保持限制性位点的单一性,以便能够方便地切下基因片段,并用合成的编码所需突变的寡核苷酸(即“核苷酸盒”)来置换。
确定单一限制性位点的数目和分布时要考虑如下若干因素:(1)在将用于表达的载体中现存的限制性位点;(2)是否需要使用具有种或属专一性的密码子;(3)能够得到的不同的非载体切割的限制性核酸内切酶数目(及其在合成基因中的多重性);(4)单一限制性位点之间的片段的合成和/或顺序测定的方便程度和可靠性。
一般说来,相对于公认的天然人IL-3的顺序来说,式Ⅰ限定了具有保守氨基酸取代插入和/或缺失的多肽组。此处所用的“保守”是指:(ⅰ)这些改变尽可能是构象中性的,即与天然的人IL-3比较,所设计的改变使突变多肽的三级结构产生最小的变化;(ⅱ)这些改变尽可能是抗原中性的,即,与天然的人IL-3比较,所设计的改变使突变多肽的抗原决定簇产生最小的变化。构象中性是保存生物活性所需要的,抗原中性则是在用本发明化合物治疗的病人或动物中避免引发免疫原应答所需要的。虽然很难有绝对把握选择构象和抗原中性的方案,但对于本领域的普通专业人员来说,仍然有进行改变的指导原则,这些改变有很大的机率是构象和抗原中性的(例如Anfisen,出处同上;以及Berzofsky,Science 229:932-940,1985)。一些比较重要的原则是:(1)疏水残基的取代产生的抗原性变化可能较小,因为它们可能位于蛋白质内部(例如Berzofsky,出处同上);(2)物化性质相似的即同义残基的取代产生的构象变化可能较小,因为置换氨基酸能够起与被取代氨基酸相同的结构作用;(3)进化上保守顺序的改变可能产生不利的构象效应,因为进化的保守性说明这些顺序可能在功能上是重要的。
除了选择突变蛋白的这些基本原则外,可以用检测方法确证所构建分子的生物活性和构象。下面进一步描述本发明多肽的生物检测法。构象变化的检测至少可用两种熟知的方法:广泛用于蛋白质三级结构进行研究的微补体固定法(如Wasserman et al.,J.Immunol.,87:290-295,1961;Levine et al.,Methods in Enzymology,11:928-936,1967);使用构象专一性的单克隆抗体组的亲和法(如Lewis et al.,Biochemistry,22:948-954,1983)。
Ⅲ.CSF活性检测
为了测定CSF活性,将造血细胞(例如骨髓细胞或胎儿带状组织血细胞)制成单细胞悬浮液。然后将单个细胞“固定”在含有养分(通常是胎牛血清)的半固体(琼脂)或粘性(甲基纤维素)基质中。在合适的促进因子存在下,单个细胞将增殖和分化。由于最初的细胞被固定,所以随着细胞增殖和成熟出现集落。可在7-14天后计数这些集落。进行CSF检测的详细说明参见文献(Burgess,A.,Growth Factors and Stem Cells,52-55页,Academic Press,New York 1984;Metcalf,The Hemopoietic Colony Stimulating Factors,130-125页,Elsevier,New York,1984)。如果需要,可以提取单个集落,置于显微镜载玻片上,用Wright/Geimsa固定并染色(Todd-Sanford,Clinical Diagnosis by Laboratory Methods,15th Edition,Eds.Davidson and Henry,1974)。然后可对每一单独集落中存在的细胞类型进行形态分析。
将从患有非血液疾病的病人中收集的骨髓细胞铺在Ficoll上(400型,Sigma Chemicals Co.,St.Louis,MO)离心(600×g,200分钟),取出界面的细胞。这些细胞用含有10%胎牛血清(FCS)的Iscove修饰的Dulbecco培养基洗涤两次,再悬浮在同样的培养基中,用塑料培养皿进行粘附,取出粘附的细胞(粘附细胞通常是产生GM-CSF的细胞,参见Metcalf,出处同上)。将非粘附细胞以105细胞/ml加至含有20%FCS、50μm2-巯基乙醇、0.9%甲基纤维素的Iscove培养基中,其中还含有不同浓度的已知含有集落促进活性的上清液或测试上清液。将1ml等分试样涂布于35mm培养皿中,于37℃在含有6%CO2的完全湿润的空气中培养。在开始培养3天以后,每个培养皿中加入1单位促红细胞生成素。在10-14天时用倒置显微镜对粒细胞-巨噬细胞集落和红细胞生长进行计数。
将收集于肝素中的带状组织血细胞以600×g离心6分钟。将血浆和红细胞峰之间界面上的白细胞转移至含有0.17N氯化铵和6%FCS的管中。在冰上放置5分钟后,将悬浮液下面铺4ml FCS,以600×g离心6分钟。将细胞沉淀用Dulbecco磷酸缓冲液洗涤,并进行上述对骨髓细胞操作时的Ficoll和塑料吸附步骤。收集低密度非粘附细胞,如上述以105细胞/份置于半固体培养基中。
在检测结束时,将单个集落置于载玻片上用Wright-Geimsa染色,然后测定细胞组分,嗜酸性细胞通过用Luxol Fast Blue染色进行测定(Johnson,G.and Metcalf,D.,Exp.Hematol.,8:549-561,1980)。
Ⅳ.纯化及药物配方
在PCT/US 86/02464申请的第Ⅴ部分中,尤其是从43页20行至44页15行、44页27行至45页27行,公开了纯化本发明多肽、在实验室使用或作为活性组分用于药物配方中的一般方法。在根据本发明的一个单位剂量中,活性多肽的量根据其效力和用途可以是1μg至100mg。
进一步,可以维持和/或增大一个人的造血细胞群落,或使之体外分化,便于最后为产生有利效应而再导入同一人或另一人中。该配方能够选择性地促进免疫系统中的各种成分,单独使用或与本领域专业人员熟知的其他药剂一起使用都可以。尤其是,该配方可包括其他的免疫活性剂,例如淋巴因子(如IL-1、IL-2、IL-4、GM-CSF等等)。
Ⅴ.表达系统
可以选择任何合适的表达系统;其特性对本发明并不重要,只要适用就行。PCT/US 86/02464申请的第Ⅵ部分(“表达系统”,45-50页)讨论了合适的表达系统。
实例
下述实例用于说明本发明。cDNA文库、载体和宿主的选择,以及试剂浓度、温度和其他变量的数值的选择仅用来举例说明本发明的应用,而不应当认为是对本发明的限制。
实例Ⅰ.通过用合成探针筛选pcD cDNA文库制备人IL-3 cDNA及在COS7猴细胞和爪蟾卵母细胞中的表达
利用Okayama和Berg所公开的技术(Mol.Cell.Biol.,2:161-170,1982和3:280-289,1983),将人的T细胞克隆(6D11)与伴刀豆球蛋白A(conA)接触(2-10μg/ml,4-12小时)而诱导mRNA的合成,然后从中分离mRNA以构建pcD cDNA文库。其他诱导化合物,例如植物凝集素(pHA)、商陆分裂素、钙离子载体、抗T3抗原等,可能对某些细胞类型在某些条件下更为有效。pcD前体质粒(即pcDV1和pL1)可通过商业途径从Pharmacia,Inc.(Piscataway,NJ)得到。
在PCT/US 86/02464申请31页最后一段(延至32页),简要描述了Okayama和Berg pcD cDNA文库的构建方法。
在Okayama/Berg质粒载体中的cDNA文库(如图1的图示)一旦建成后,即收集cDNA克隆,通过标准方法对所需cDNA的存在进行随机取样检查,这些方法有例如杂交选择、检测表达产物的抗原决定簇和/或功能测定等。
A.mRNA的分离
利用Chirgwin等人的异硫氰酸胍法(Biochemistry,18:5294-5299,1979),从6D11细胞中分离细胞的总RNA。Maniatis等人也公开过该方法(出处同上)。洗涤并沉淀经conA刺激的6D11细胞,然后悬浮于异硫氰酸胍溶解液中,该溶液含有50g硫氰酸胍和0.5gN-月桂酰肌氨酸钠(终浓度0.5%)、2.5ml 1M柠檬酸钠pH7.0(25mM)、0.7ml 2-巯基乙醇(0.1M)、0.33ml Sigma 305 Antifoam A(0.1%);加入去离子水直至室温下的体积等于100ml,使最终溶液过滤并用1N NaOH将pH调至7.1 5×108个细胞需用20ml溶解液。
然后,根据PCT/US 86/02464申请B部分55页22行至56页24行的方法,对产生的沉淀进行处理。
B.pcD文库的构建
使用稍加修改的Okayama和Berg的方法(Mol.& Cell.Biol.2:161-170,1982)。Okayama和Berg描述了pcDV1和pL1质粒(Mol.& Cell.Biol.3:380-389,1983),这些质粒可从Pharmacia公司(Piscataway,N.J.)得到。具体地说,使用一种修饰的pcDV1质粒,它在原来的KpnI位点处含有一个NSiI位点;使用一种修饰的pL1,它在XhoI位点处含有一个由HTLV(I)还原病毒长末端重复(LTR)部分组成的插段。发现LTR片段的存在一般能20-50倍地提高在哺乳动物细胞宿主中的表达。图1和图2给出了修饰的构建体。
已经表明,还原病毒的LTR在许多系统中都促进表达(参见例如Chen et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.82,pgs.7285-7288(1985);Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.79,pgs.6777-6781(1982);Temin,Cell,Vol.27,pgs.1-3(1981);and Luciw et al.,Cell,Vol.33,pgs.705-716(1983).
插入pL1中XhoI位点的HTLV(I)LTR部分,由267碱基的片段组成,其中包括完整的R区和部分U5区(图2中标为U5′),它从R/U5边界延伸至下游的第一个TaqI位点(总共39碱基)。Yoshida等人公开了HTLV(I)的LTR顺序(Current Topics in Microbiology and Immunology,115:157-175,1985)。
利用实例Ⅱ公开的方法,通过四个步骤将HTLV(I)的LTR片段插入pL1中。首先,用BglI和XhoI消化pL1并分离大片段。然后在标准的连接混合物中,使大片段与合成片段1A/B和2A/B(定义如下)混合。合成片段1A/B和2A/B由(以5′→3′的顺序)BglI/XhoI的小片段顺序、LTR的R区5′端的26碱基及由SmaI、SacI、NaeI和XhoI位点以所述顺序组成的多连接子共同组成。
(BglI)
TCGGCCTCTGAGCTATTCCAG-
CGGAGCCGGAGACTCGATAAGGTC-
AAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGA-
TTCATCACTCCTCCGAAAAAACCT-
GGCCTAGGCTTTT
CCGG
合成片段 1A/B
SV40起点->|R->
GCAAAAAGCTCGGCTCG-
ATCCGAAAACGTTTTTCGAGCCGAGC-
SmaI
R->|SacI
CATCTCTCCTTCACGCGCCCGGGGAG-
GTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCCCCTC-
NaeI XhoI
CTCGCCGGCC
GAGCGGCCGGAGCT
合成片段2A/B
连接后,使步骤1得到的质粒扩增、分离、用SmaI和SacI消化并分离大片段。然后使大片段在标准连接混合物中与合成片段3A/B和4A/B(定义如下)混合。
GCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATC-
CGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAG-
CACGCCGGTTGAGTCGCGTTCT
GTGCGGCCAACTC
合成片段3A/B
GCCGCCTCCCGCCTG-
AGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGAC-
TGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGC-
ACCACGGAGGACTTGACGCAGGCG-
SacI
CGTCTAGGTAAGTTTAGAGCT
GCAGATCCATTCAAATC
合成片段4A/B
连接后,使步骤2得到的质粒扩增、分离、用SacI和NaeI消化并分离大片段。然后使大片段在标准连接混合物中与合成片段5A/B(定义如下)混合。
CAGGTCGAGACCGGGCCTTTG-
TCGAGTCCAGCTCTGGCCCGGAAAC-
TCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCT-
AGGCCGCGAGGGAACCTCGGATGGA-
NaeI
AGACTCAGCC
TCTGAGTCGG
合成片段5A/B
连接后,使步骤3得到的质粒扩增、分离、用NaeI和XhoI消化并分离大片段。然后使大片段在标准连接混合物中与合成片段6A/B和7A/B(定义如下)混合,形成修饰的pL1质粒,定名为pL1′。
NaeI
GGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCC-
CCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGG-
TGCTTGCTCAACTCTACG
ACGAACGAG
合成片段6A/B
TCTTTGTTTCGTTTT-
TTGAGATGCAGAAACAAAGCAAAA-
XhoI
CTGTTCTGCGCCGTTACAGATC
GACAAGACGCGGCAATGTCTAGAGCT
合成片段7A/B
将80μg pcDV1 DNA样品于30℃下用20单位KpnI核酸内切酶消化,反应在450μl反应混合物中进行,其中含有6mM Tris-HCl(pH7.5)、6mM MgCl2、6mM NaCl、6mM 2-ME和0.1mg/ml牛血清清蛋白(BSA)。16小时后,用40μl0.25M EDTA(pH8.0)和20μl 10%十二烷基硫酸钠(SDS)终止消化;用水饱和的1∶1苯酚-CHCl3(以后称为苯酚-CHCl3)萃取后用乙醇沉淀回收DNA。利用小牛胸腺末端转移酶,在NsiI核酸内切酶产生的每个末端加上一般为60(但不超过80)个脱氧胸苷酸(dT)残基共聚物尾巴,如下述:反应混合物(38μl)含有二甲胂酸钠-30mM Tris-HCl pH6.8作为缓冲液,以及1mM CoCl2、0.1mM二硫苏糖醇、0.25mM dTTP、经NsiI核酸内切酶消化的DNA、68单位末端脱氧核苷转移酶(P-L Biochemicals,Inc.,Milwaukee,WI)。于37℃下反应30分钟后,用20μl0.25M EDTA(pH8.0)和10μl 10%SDS停止反应,用苯酚-CHCl3提取几次,然后通过乙醇沉淀回收DNA。然后用15单位EcoRI核酸内切酶消化DNA,反应于50μl含有10mM Tris-HCl pH7.4、10mM MgCl2,1mM二硫苏糖醇、0.1mg/ml BSA的反应液中于37℃下进行5小时。大片段含有SV 40多聚腺苷酸位点、pBR322的复制起点及氨苄青霉素抗性基因,通过1%琼脂糖凝胶电泳纯化大片段,并通过修饰的玻璃粉法(Vogelstein,B.&Gillespie,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:615-619,1979)从凝胶中回收。加dT尾的DNA如下述通过在寡聚(dA)-纤维素柱上吸附和洗脱而进一步纯化:将DNA溶于1ml含有1mM EDTA和1mM NaCl的10mM Tris-HCl pH7.3缓冲液中,冷却至0℃,加到用同样缓冲液于0℃下平衡的寡聚(dA)-纤维素柱上(0.6×2.5Cm),在室温下用水洗脱。用乙醇沉淀洗脱出的DNA,并溶于含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl,pH7.3中。
接寡聚(dG)尾的DNA如下制备:用20单位PstI核酸内切酶消化75μg pL1′DNA,反应在450μl含有6mM Tris-HCl pH7.4、6mM MgCl2、6mM 2-ME、50mM NaCl、0.01mg/ml BSA的反应液中进行。于30℃下反应16小时后,用苯酚-CHCl3萃取反应混合物,用乙醇沉淀DNA。然后,用46单位末端脱氧核苷转移酶在每个末端加上10-15个脱氧鸟苷(dG)残基的尾巴,反应混合物(38μl)同上,只是用0.1mM dGTP代替dTTP。于37℃下20分钟后,用苯酚-CHCl3萃取混合物,用乙醇沉淀DNA,然后用35单位HindⅢ核酸内切酶在50μl含有20mM Tris-HCl pH7.4、7mM MgCl2、60mM NaCl、0.1mg BSA的反应液中于37℃下消化4小时。利用1.8%琼脂糖凝胶电泳纯化小的加寡聚(dG)尾的连接子DNA,然后如上述回收。
文库构建:文库构建根据PCT/US 86/02464申请48页倒数第9行至61页10行,即C2部分“cDNA文库的制备”中所述进行。然后,培养物样品冷冻在DMSO中保存。在加入DMSO之前,20个15cm的培养皿每个分别用大约3000个克隆接种。
如下述构建上述集落的放射标记探针:(1)利用Yang等人公开的人IL-3顺序数据(Cell 47:3-10,1986)合成一个合成寡核苷酸,它包括所报道的人IL-3顺序编码链的前面55个核苷酸(始于ATG);(2)利用同样的顺序数据合成一个重叠的反义链寡核苷酸,它包括所报道顺序的碱基45-100;(3)使两个合成链退火,在ATP、GTP、TTP和放射标记的CTP存在下用作DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段的引物;(4)最后,用未标记的前体对反应进行“冷追踪”以确保最大的链延伸(“冷追踪”是指放射性前体CTP被它的非放射性形式所取代)。
根据标准的集落杂交技术(Maniatis等人,出处同上),用合成探针在上述制备的20个培养皿中筛选克隆。检测到两个阳性集落。选择其中的一个克隆(称为pcD-huIL3-22-1)进行扩增,并再克隆到质粒M13中,以通过双脱氧链终止法测定顺序(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.74:5363-5367,1977)。图3表明cDNA顺序及最大的开放读码的预测氨基酸顺序。根据Perlman等人公布的经验原则(J.Mol.Biol.167:391-409,1983)分析N末端氨基酸,结果表明,来自开放读码起始点的第三个脯氨酸最可能是成熟蛋白的N末端。尽管有这些原则,但考虑到发现小鼠IL-3的N末端是Ala,因此邻近的Ala也可能是天然蛋白的真正N末端。在任何情况下,信号顺序不是活性分子中的重要部分,并且,它可能包括种类很多的对分泌过程或活性没有不利作用的顺序(参见Kaiser et al.,Science,235:312-317,1987)。潜在的N-糖基化位点包括在图3的方框中。
令人惊异的是,发现所分离的人IL-3 cDNA顺序中,有一个氨基酸与Yang等人的报道(出处同上)显著不同:分离的cDNA在7位(从式Ⅱ的N末端起)编码脯氨酸,而不是Yang等人所报道的(出处同上)丝氨酸。由于脯氨酸和丝氨酸很不相同,所以这种变化应当使两种多肽具有很大的构象差异。
同时,分别扩增同一克隆;利用标准技术(如Maniatis等人,出处同上)分离pcD克隆载体,并在两个系统中分别表达cDNA∶COS7猴细胞和爪蟾卵母细胞。用pcD载体如下述转染COS7细胞。在转染前一天,将大约106个COS7猴细胞接种在单个的100mm培养皿中,其中装有Dulbecco修饰的Eagle培养基(DME),并含有10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺。为了进行转染,从每个培养皿中吸出培养基,用4ml含有50mM Tris-HCl pH7.4、400μg/ml DEAE-葡聚糖和50μg待测的质粒DNA的DME取代。培养皿于37℃下保温4小时,然后移走含有DNA的培养基,用5ml无血清DME将培养皿洗涤2次。将含有150μm氯奎的DME加回至培养皿中,然后使之于37℃下再保温3小时。培养皿用DME洗涤一次,然后加入含有4%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素的DME。然后将细胞于37℃下保温72小时。收集生长培养基,并用上述的胎儿带状组织血液检测法测定CSF活性。观察到了多种类型的集落。
用由pcD-huIL3-22-1的cDNA插段转录的RNA注射爪蟾卵母细胞,然后检测其上清液的生物活性。所用方法与文献中公开的基本一致(Melton
et al.,Nucleic Acids Research,Vol.12,pgs.7035-7056(1984),and Krieg et al.,Nucleic Acids Research,Vol.12,pgs.7057-7070(1984))。首先,将pcD-huIL3-22-1的cDNA插段再克隆到修饰的pcD载体pSP6中。pSP6的构建如图3所示,即用SP6启动子取代SV40的复制起点。修饰的pcD载体在氨苄青霉素抗性基因中还含有一个失去功能的PstI位点(图3中用△PstI标出),以及一个插入pcD多聚A区域XhoI位点中的多连接子区。多连接子区含有EcoRI、SacI、SmaI、BamHI、XbaI、SalI、SstI和HindⅢ位点。PstI位点失去功能则使得能够用HindⅢ和PstⅠ进行消化(在插入多连接子之前),而将SV40起点区切下。合适的SP6启动子插段(长度约为60碱基)可根据Melton等人公开的顺序(出处同上)用标准技术合成。插入SP6启动子后,使得到的质粒扩增、分离并用XhoI消化。将用标准技术合成的多连接子插入XhoI位点。另外,也可以使用含有SP6启动子和多连接子区的市售质粒,例如得自NEN Research Products(Boston,MA)的pSP62-PL,或得自BRL Life Technologies(Gaithersburg,MD)的pSP18或pSP19。
通过用PstⅠ和BamHI消化从pcD-huIL3-22-1中切下人IL-3cDNA,分离后与用PstI/BamHI消化的psP6连接形成pSP6-huIL3。使pSP6-huIL3在大肠杆菌MC1061中扩增,分离后用XbaI使之成为直链。根据Krieg等人(出处同上)和Melton等人(出处同上)的方法,用SP6 RNA聚合酶(得自BRL Life Technologies)转录直链pSP6-huIL3,从而制备用于注射卵母细胞的RNA。SP6 RNA聚合酶用DNA酶处理(例如用分别为1单位/μl和20μg/ml的RNA sin和无RNA酶的DNA酶),并注射到爪蟾卵母细胞的细胞质中,检测爪蟾培养物上清液中的CSF活性。观察到了多种类型的集落。
实例Ⅱ.用于在pcD中进行盒式诱变和在COS7猴细胞中进行表达的人IL-3合成基因的构建
本实例合成基因的构建和表达技术是分子生物学领域的标准技术(尤其可参见Sproat and Gait,Nucleic Acids Research,13:2959-2977,1985;Ferrett et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.83:599-603,1986;Mullenbach et al.,J.Biol.Chem.261:719-722,1986;Wells et al.,Gene 34:315-323,1985;Estell et al.,Science 233:659-663,1986)。简言之,人IL-3的合成基因是由许多化学合成的双链DNA片段装配而成的。选择合成基因的碱基顺序的原则是,要使装配的合成基因含有一系列相对于携带此基因的载体是独特的限制性位点。
独特限制性位点的系列限定了一系列片段,它们能很容易地切下并由碱基顺序不同的片段取代。合成片段直接或与其他片段连接后插入合适的载体中,例如pcD质粒等。上述片段对应于Wells等人的“核苷酸盒”(出处同上)。合成片段利用标准技术来合成(Gait,Oligonucleotide Systhesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford,UK,1984)。最好是使用自动化合成仪,例如Applied Biosystems,Inc.(Foster City,CA)的380A型合成仪。pcD质粒和其他合适载体是市售可得的(例如购自Pharmacia公司)。对于pcD,可在大肠杆菌MC1061或HB101中进行克隆,可在COS猴细胞或中国仓鼠卵巢细胞中进行表达。
在本实例中,构建了一个用于插入pcD质粒的人IL-3合成基因。简言之,pcD载体的构建首先是用T4DNA连接酶将下述4种片段连在一起:来自pcDV1的含有pBR322起点和Ampr的HindⅢ/BamHI大片段;来自pL1的含有SV40早期区域启动子和晚期区域内含子的HindⅢ/PstⅠ片段;以及下述的合成片段11A/B和12A/B。然后,在连续的三个另外的步骤(即扩增、纯化和插入)中,加入其余的合成片段13A/B至18A/B,直至pcD载体中产生完整的IL-3合成基因时为止。
用标准方法(Maniatis et al.,Molecular Cloning∶A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1982)进行限制性核酸内切酶消化和连接酶反应。
用碱法(Maniatis等人,出处同上)制备小规模的质粒。对于大规模制备则使用修饰的碱法,即同等体积的异丙醇从澄清的溶解液中沉淀核酸。用2.5M冷的乙酸铵进行沉淀以除去RNA,然后进行氯化铯平衡密度离心并用溴化乙锭检测。
使待克隆的合成DNA的互补链(每种约400ng)混合,在50μl反应体积中用多核苷酸激酶使之磷酸化,使此DNA与1μg用合适的限制酶消化的载体DNA连接,在50μl体积中于室温下放置4-12小时进行连接反应。磷酸化、限制酶消化、聚合酶反应、连接反应和细菌转染的条件已有过描述(Maniatis等人,出处同上)。
在第1步中,使pcDV1扩增、分离并用HindⅢ和BamHI消化。利用标准技术通过凝胶电泳分离含有pBR322起点和Ampr区的片段(Maniatis等人,出处同上)。使pL1扩增、分离并用HindⅢ和PstⅠ消化。通过凝胶电泳分离含有SV40早期区域启动子的片段。然后使两种分离的pcDV1和pL1片段在标准的T4 DNA连接酶溶液中与合成片段11A/B和12A/B(图示如下)混合。合成片段11A/B和12A/B退火形成新建成的pcD载体的插段,使其在大肠杆菌中扩增后分离。
在第2步中,用SpeI和SauI消化第1步分离的pcD载体。分离大片段,并在标准的T4DNA连接酶溶液中与合成片段13A/B和14A/B混合,形成第2步的pcD载体,使之在大肠杆菌MC 1061中扩增并分离。
第3步中,用MluI和SauI消化第2步所分离的pcD载体。分离大片段,并在标准的T4DNA连接酶溶液中与合成片段15A/B和16A/B混合,形成第3步的pcD载体,使之在大肠杆菌MC1061中扩增并分离。
在第4步中,用EcoRI和SauI消化第3步所分离的pcD载体。分离大片段,并在标准的T4DNA连接酶溶液中与合成片段17A/B和18A/B混合,形成完整的pcD中的IL-3合成基因。第4步的pcD载体在大肠杆菌MC 1061中扩增、分离并转染至实例Ⅰ所述的COS7细胞中。收集培养物上清液并如上述检测CSF活性。
下面列出了合成片段11A/B至18A/B的顺序。顺序上方标明了独特限制性位点的位置和类型。
(PstI)BclI
GTGATCAATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTC-
ACGTCACTAGTTACTCGGCGGACGGGCAGGACGAG-
CTGCTCCAACTCCTGGTC
GACGAGGTT
合成片段11A/B
NarI
CGCCCCGGACTCCAGGCGCCCATGACC-
GAGGACCAGGCGGGGCCTGAGGTCCGCGGGTACTGG-
SpeI SauI (BamHI)
CAGACAACGCCCTTGAAGACTAGTCCTTAGGG
GTCTGTTGCGGGAACTTCTGATCAGGAATCCCCTAG
合成片段12A/B
SpeI
CTAGTTGGGTTAACTGCTCTAACATGATCGATCAA-
AACCCAATTGACGAGATTGTACTAGCTACTT-
XbaI
ATTATAACACACTTAAAGCAGCCACCTTTGCCTCTT-
TAATATTGTGTGAATTTCGTCGGTGGAAACGGAGAA-
CTAGACTTCAACAACCTCAAT
GATCTGAAGTTG
合成片段13A/B
GGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAA-
TTGGAGTTACCCCTTCTGGTTCTGTAAGACTACCTT-
XmaIII
AATAACCTTCGACGGCCGAACCTGGAGGCATTCAAC-
TTATTGGAAGCTGCCGGCTTGGACCTCCGTAAGTTG-
MluI(SauI)
AGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAACGCGTCC
TCCCGACAGTTCTCAAATGTCTTGCGCAGGAAT
合成片段14A/B
MluI
CGCGTCAGCAATTGAGAGCATTCTTAAAAATCTC-
AGTCGTTAACTCTCGTAAGAATTTTTAGAG-
CTGCCATGTCTGCCC
GACGGT
合成片段15A/B
SacII
CTGGCCACCGCGGCACCCACGCGACAT-
ACAGACGGGGACCGGTGGCGCCGTGGGTGCGCTGTA-
CCAATCCATATCAAGGACGGTGACTGGATT-
GGTTAGGTATAGTTCCTGCCACTGACCTAA-
EcoRI(SauI)
GAATTCCC
CTTAAGGGAAT
合成片段16A/B
EcoRI
TTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTG-
AAGGCCTCCTTTGACTGCAAGATAGAC-
AAAACCCTTGAGAAT
TTTTGG
合成片段17A/B
GCGCAGGCTCAACAGACGACT-
GAACTCTTACGCGTCCGAGTTGTCTGCTGA-
NheI (SauI)
TTGTCGCTAGCGATCTTTTAGCC
AACAGCGATCGCTAGAAAATCGGATT
合成片段 18A/B
实例Ⅲ 人IL-3突变蛋白Leu131的构建和表达
将131位的Ile变成Leu,形成人IL-3突变蛋白Leu131。用SauI和NheI消化实例Ⅱ中含有人IL-3完整基因的pcD质粒。分离大片段,使之在标准的T4DNA连接酶溶液中与下述合成片段结合:
CTAGCGCTCTTTAGCC
GCGAGAAATCGGATT
得到的pcD载体在大肠杆菌MC1061株中扩增、分离,并根据前述方法转染至COS7猴细胞中。保温3-4天后,收集COS7培养物上清液并检测CSF活性。
实例Ⅳ 人IL-3突变蛋白Ile2的构建和表达
将2位的Met变成Ile,形成人IL-3突变蛋白Ile2。用NarI和SpeI消化实例Ⅱ中含有人IL-3完整基因的pcD质粒。分离大片段,使之在标准的T4 DNA连接酶溶液中与下述合成片段结合:
CGCCCATAACCCAGACAACGCCC-
GGGTATTGGGTCTGTTGCGGG-
TTGAAGA
AACTTCTGATC
得到的pcD载体在大肠杆菌MC1061中扩增、分离后根据前述方法转染至COS7猴细胞中。保温3-4天后,收集COS7培养物上清液并检测CSF活性。
本发明前面所述的具体方案是仅为说明和描述的目的而给出的。它们并不是包括一切的完全描述,因此并不将本发明严格限制在所公开的形式中。
申请人已将pcD-huIL-3-22-1寄存于ATCC(Rockville,MD,USA),寄存号为67318。
Claims (20)
1、一种具有集落促进因子活性的蛋白质,包括由下式限定的糖基化或非糖基化的10重取代的多肽:
X(Pro) -X(Met) -X(Thr) -X(Gln) -X(Thr) -W(Thr)-
10
W(Pro) -W(Leu) -W(Lys) -X(Thr) -X(Ser) -X(Trp)-
X(Val) -X(Asn) -Cys -X(Ser) -W(Asn) -W(Met)-
20
W(Ile) -W(Asp) -W(Glu) -W(Ile) -W(Ile) -W(Thr)-
30
W(His) -W(Leu) -W(Lys) -W(Gln) -W(Pro) -W(Pro)-
(Leu) -X(Pro) -X(Leu) -X(Leu) -X(Asp) -X(Phe)-
40
X(Asn) -X(Asn) -W(Leu) -W(Asn) -W(Gly) -W(Glu)-
W(Asp) -W(Gln) -W(Asp) -W(Ile) -W(Leu) -W(Met)-
50
W(Glu) -W(Asn) -W(Asn) -W(Leu) -W(Arg) -W(Arg)-
60
W(Pro) -W(Asn) -W(Leu) -W(Glu) -W(Ala) -W(Phe)-
W(Asn) -W(Arg) -W(Ala) -W(Val) -W(Lys) -W(Ser)-
70
W(Leu) -W(Gln) -W(Asn) -W(Ala) -W(Ser) -W(Ala)-
W(Ile) -W(Glu) -W(Ser) -W(Ile) -W(Leu) -X(Lys)-
80
X(Asn) -X(Leu) -X(Leu) -X(Pro) -Cys -X(Leu)-
90
X(Pro) -X(Leu) -X(Ala) -X(Thr) -X(Ala) -W(Ala)-
W(Pro) -W(Thr) -W(Arg) -W(His) -W(Pro) -W(Ile)-
100
W(His) -W(Ile) -W(Lys) -W(Asp) -W(Gly) -W(Asp)-
W(Trp) -W(Asn) -W(Glu) -W(Phe) -W(Arg) -W(Arg)-
110
W(Lys) -W(Leu) -X(Thr) -X(Phe) -X(Thr) -X(Leu)-
120
X(Lys) -W(Thr) -W(Leu) -W(Glu) -W(Asn) -W(Ala)-
W(Gln) -W(Ala) -W(Gln) -W(Gln) -X(Thr) -X(Thr)-
130
X(Leu) -X(Ser) -X(Leu) -X(Ala) -X(Ile) -X(Phe)
其中:
X(Ser) 代表 Ser,Cys,Thr,Gly,或Asn;
X(Arg) 代表 Arg,His,Gln,Lys,或Glu;
X(Leu) 代表 Leu,Ile,Phe,Tyr,Mer,或Val;
X(Pro) 代表 Pro或Ala;
X(Thr) 代表 Thr,Pro,Ser,Ala,Gly,His,或Gln;
X(Ala) 代表 Ala,Gly,Thr,或Pro;
X(Val) 代表 Val,Met,Tyr,Phe,Ile,或Leu;
X(Gly) 代表 Gly,Ala,Thr,Pro,或Ser;
X(Ile) 代表 Ile,Met,Tyr,Phe,Val,或Leu;
X(Phe) 代表 Phe,Trp,Met,Tyr,Ile,Val,或Leu;
X(Tyr) 代表 Tyr,Trp,Met,Phe,Ile,Val,或Leu;
X(His) 代表 His,Glu,Lys,Gln,Thr,或Arg;
X(Gln) 代表 Gln,Glu,Lys,Asn,His,Thr,或Arg;
X(Asn) 代表 Asn,Glu,Asp,Gln,或Ser;
X(Lys) 代表 Lys,Glu,Gln,His,或Arg;
X(Asp) 代表 Asp,Glu,或Asn;
X(Glu) 代表 Glu,Asp,Lys,Asn,Gln,His,或Arg;
X(Met) 代表 Met,Phe,Ile,Val,Leu,或Tyr;
X(Trp) 是 Trp;
W(Ser) 是 Ser;
W(Arg) 代表 Arg,His,或Lys;
W(Leu) 代表 Leu,Ile,Phe,或Met;
W(Pro) 代表 Pro或Ala;
W(Thr) 是 Thr;
W(Ala) 代表 Ala或Pro;
W(Val) 代表 Val,Met,或Ile;
W(Gly) 是 Gly;
W(Ile) 代表 Ile,Met,Phe,Val,或Leu;
W(Phe) 代表 Phe,Met,Tyr,Ile,或Leu;
W(Tyr) 代表 Tyr或Phe;
W(His) 代表 His,Gln,或Arg;
W(Gln) 代表 Gln,Glu,或His;
W(Asn) 代表 Asn或Asp;
W(Lys) 代表 Lys或Arg;
W(Asp) 代表 Asp或Asn;
W(Glu) 代表 Glu或Gln;
W(Met) 代表 Met,Phe,Ile,Val,或Leu;
W(Trp) 是 Trp;
并且,在所述多肽的由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的区域中,总共不超过3重取代。
2、权利要求1的蛋白质,其中所述多肽是5重取代的,而且在由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的所述区域中总共不超过1重取代。
3、权利要求2的蛋白质,其中所述多肽是2重取代的,而且在由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的所述区域中没有取代。
4、权利要求1的蛋白质,其中:
X(Ser)是Ser;
X(Arg)代表 Arg,His,或Lys;
X(Leu)代表 Leu,Ile,Phe,或Met;
X(Pro)代表 Pro或Ala;
X(Thr)是Thr;
X(Ala)代表 Ala或Pro;
X(Val)代表 Val,Met,或Ile;
X(Gly)是Gly;
X(Ile)代表 Ile,Met,Phe,Val,或Leu;
X(Phe)代表 Phe,Met,Tyr,Ile,或Leu;
X(Tyr)代表 Tyr或Phe;
X(His)代表 His,Gln,或Arg;
X(Gln)代表 Gln,Glu,或His;
X(Asn)代表 Asn或Asp;
X(Lys)代表 Lys或Arg;
X(Asp)代表 Asp或Asn;
X(Glu)代表 Glu或Gln;
X(Met)代表 Met,Phe,Ile,Val,或Leu;
W(Arg)是Arg;
W(Leu)代表 Leu,Ile,或Met;
W(Pro)是Pro;
W(Ala)是Ala;
W(Val)是Val;
W(Ile)代表 Ile,Met,或Leu;
W(Phe)是Phe;
W(Tyr)是Tyr;
W(His)是His;
W(Gln)是Gln;
W(Asn)是Asn;
W(Lys)是Lys;
W(Asp)是Asp;
W(Glu)是Glu;
W(Met)代表 Met,Ile,或Leu。
5、权利要求4的蛋白质,其中所述多肽是5重取代的,而且,在由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的所述区域中总共不超过1重取代。
6、权利要求5的蛋白质,其中所述多肽是2重取代的,而且,在由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的所述区域中没有取代。
7、权利要求4的蛋白质,其中:
X(Arg)是Arg;
X(Leu)代表 Leu,Ile,或Met;
X(Pro)是Pro;
X(Ala)是Ala;
X(Val)是Val;
X(Ile)代表 Ile,Met,或Leu;
X(Phe)是Phe;
X(Tyr)是Tyr;
X(His)是His;
X(Gln)是Gln;
X(Asn)是Asn;
X(Lys)是Lys;
X(Asp)是Asp;
X(Glu)是Glu;
X(Met)代表 Met,Ile,或Leu;
W(Leu)是Leu;
W(Ile)是Ile;
W(Met)是Met.
8、权利要求7的蛋白质,其中所述的多肽是5重取代的,而且,由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的所述区域中总共不超过1重取代。
9、权利要求8的蛋白质,其中所述的糖基化或非糖基化多肽是2重取代的,而且,由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的所述区域中没有取代。
10、权利要求9的蛋白质,其中所述的糖基化或非糖基化多肽包括由下式限定的氨基酸顺序:
Pro-Met-Thr-Gln-Thr-Thr-Pro-Leu-
10
Lys-Thr-Ser-Trp-Val-Asn-Cys-Ser-
20
Asn-Met-Ile-Asp-Glu-Ile-Ile-Thr-
30
His-Leu-Lys-Gln-Pro-Pro-Leu-Pro-
40
Leu-Leu-Asp-Phe-Asn-Asn-Leu-Asn-
Gly-Glu-Asp-Gln-Asp-Ile-Leu-Met-
50
Glu-Asn-Asn-Leu-Arg-Arg-Pro-Asn-
60
Leu-Glu-Ala-Phe-Asn-Arg-Ala-Val-
70
Lys-Ser-Leu-Gln-Asn-Ala-Ser-Ala-
80
Ile-Glu-Ser-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu-
Leu-Pro-Cys-Leu-Pro-Leu-Ala-Thr-
90
Ala-Ala-Pro-Thr-Arg-His-Pro-Ile-
100
His-Ile-Lys-Asp-Gly-Asp-Trp-Asn-
110
Glu-Phe-Arg-Arg-Lys-Leu-Thr-Phe-
120
Tyr-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Asn-Ala-
Gln-Ala-Gln-Gln-Thr-Thr-Leu-Ser-
130
Leu-Ala-Ile-Phe.
11、一种具有集落促进因子活性的蛋白质,包括具有权利要求1的式子所限定氨基酸顺序的、糖基化或非糖基化的5重插入、5重缺失和5重取代的多肽;并且,在所述多肽的由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的区域中总共不超过3重取代。
12、权利要求11的蛋白质,其中所述的多肽是2重插入、2重缺失和2重取代的,而且由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的所述区域中没有取代、没有缺失、没有插入。
13、权利要求12的蛋白质,其中所述多肽由下式限定:
Ala-Pro-Met-Thr-Gln-Thr-Thr-Pro-
10
Leu-Lys-Thr-Ser-Trp-Val-Asn-Cys-
Ser-Asn-Met-Ile-Asp-Glu-Ile-Ile-
30
Thr-His-Leu-Lys-Gln-Pro-Pro-Leu-
40
Pro-Leu-Leu-Asp-Phe-Asn-Asn-Leu-
Asn-Gly-Glu-Asp-Gln-Asp-Ile-Leu-
50
Met-Glu-Asn-Asn-Leu-Arg-Arg-Pro-
60
Asn-Leu-Glu-Ala-Phe-Asn-Arg-Ala-
70
Val-Lys-Ser-Leu-Gln-Asn-Ala-Ser-
80
Ala-Ile-Glu-Ser-Ile-Leu-Lys-Asn-
Leu-Leu-Pro-Cys-Leu-Pro-Leu-Ala-
90
Thr-Ala-Ala-Pro-Thr-Arg-His-Pro-
100
Ile-His-Ile-Lys-Asp-Gly-Asp-Trp-
110
Asn-Glu-Phe-Arg-Arg-Lys-Leu-Thr-
120
Phe-Tyr-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Asn-
Ala-Gln-Ala-Gln-Gln-Thr-Thr-Leu-
130
Ser-Leu-Ala-Ile-Phe.
14、一种核酸,包括一种选自能编码由权利要求1所给式子限定的10重取代多肽的核苷酸顺序的核苷酸顺序;并且,在所述多肽由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的区域中总共不超过3重取代。
15、权利要求14的核酸,其中所述核苷酸顺序选自能够编码由权利要求10所给式子限定的多肽的核苷酸顺序。
16、一种生产具有集落促进因子活性的多肽的方法,该方法包括下述步骤:
(a)构建一个包括编码所述多肽的核苷酸顺序的载体,其中的核苷酸顺序能够在含有此载体的宿主中表达,并且,此核苷酸顺序选自能够编码由权利要求1所给式子限定的10重取代多肽的核苷酸顺序;而且,在所述多肽由氨基酸10-32(包括两头)、47-60(包括两头)、71-86(包括两头)和95-113(包括两头)所限定的区域中总共不超过3重取代;
(b)将此载体导入宿主;
(c)将培养基中的宿主置于适合核苷酸顺序表达为所述多肽的条件下。
17、权利要求16的方法,其中所述核苷酸顺序选自能够编码由权利要求10所给式子限定的多肽的核苷酸顺序。
18、权利要求17的方法,进一步包括从所述培养基和所述宿主中分离所述多肽的步骤。
19、一种在体外或体内促进血细胞生长发育的药物配方,包括一种医药上相容的载体和有效量的权利要求1的蛋白质。
20、权利要求19的药物配方,其中所述蛋白质包括一种由权利要求10所给式子或所述式子之前加上Ala所限定的氨基酸顺序。
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