HU204890B - Process for producing human interleukin-3 and its muteins - Google Patents

Description

A találmány általánosságban a hematopoetikus rendszerkialakulásában szerepet játszó proteinmediátorokra és az ezeket kódoló nukleinsavakra vonatkozik. Részletesebben, a találmány a humán interleukin-3 egy változatára, ennek muteinjeire és az ezeket kódoló nukleinsavakra vonatkozik.

A keringő vérsejíek folyamatosan helyettesítődnek újonnan keletkező sejtekkel. Az új sejtek a hematopoézisnek nevezett folyamatban képződnek, amely legalább nyolc érett vérsejt vonalproduktumait foglalja magában: vörösvérsejtek (eritrociták), makrofágok (monociták), eozinofíl granulociták, megakariociták (vérlemezkék), neutrofil granulociták, bazofil granulociták (hízósejtek), T limfociták és B limfociták [Burgess és Nicola: „Growth Factors and Stem Cells”, Academic Press, New York, (1983)]. A vérsejtek képződésének szabályozásában főként a kölcsönösen egymásra ható glükoproteinek egy csoportja játszikközvetítő szerepet, amelyeket telepsíimuláló faktoroknak (colony stűnulating factors=CSFs) nevezünk. Ezek a glükoproteinek a jelenlétük kimutatására szolgáló in vivő és in vitro kísérletekben kapták elnevezésüket. A klónozott hematopoetikus sejtek tenyésztési technikái szemiszolid táptalajban különösen fontosak az in vitro assay-k kifejlesztésében. Ilyen tenyészetekben az egyedi progenitorsejtek, (azaz azok a sejtek, amelyek fejlődésük folyamán el vannak kötelezve egy adott sejtvonalra, de még proliferáciőra képesek) proliferációra képesek és úgy tűnik, hogy oly módon képeznek telepet az érő utódokból, hogy ez a folyamat lényegében azonos az in vivő végbemenő hasonló folyamattal. Számos legújabban megjelent referátum tárgyalja a CSF-ek szerepét a hematopoézisben, mint például: Metcalf: „The Hemopoietic Colony Stimulating Factors” (Elsevier, New York, 1984); Metcalf, Science, I 229,16-22 (1985); Nicola és mtsai, Immunology Today, 5, 76-80 (1984); Whetton és'mtsai, TTBS, 11, 207-211 (1986).

Ezeknek a faktoroknak a kimutatása, izolálása és tisztítása rendkívüli módon nehéz, ugyanis azoknak a ² felülúszóknak a tulajdonságai, amelyek ezeket a faktorokat tartalmazzák, gyakran bonyolulttá teszik ezeket az eljárásokat. Például: az elegyekben lévő különböző komponensek aktivitásának eltérő és egymást keresztező volta, a faktorok tulajdonságainak meghatározására 4 használt vizsgálómődszerek érzékenysége (vagy ennek hiánya), a molekulatömeg-tartományok gyakori hasonlósága és hogy ezek a faktorok természetes környezetükben igen alacsony koncentrációban fordulnak elő.

Ahogyan mind több CSF vált hozzáférhetővé, első- 5 sorban a molekuláris klónozás révén, megnőtt az érdeklődés klinikai felhasználhatóságuk megállapítása iránt. Minthogy fiziológiai szempontból a hormonokhoz hasonlóan (szolubilis faktorok, növekdésre ható mediátorok, sejtreceptorok révén fejtik ki a hatásukat), 5a CSF-ek potenciális felhasználhatóságát a hormonok jelenlegi felhasználásának analógiájára képzelik el, lásd például: Dexter, Natúré, 321,198 (1986). Felhasználásukat számos olyan klinikai állapotnál javasolják, amelyben a vérsejtek képződésének a stimulálása lenne 6( kívánatos, például tumorok kemoterápiája vagy sugárkezelése utáni rehabilitációs gyógykezelésre, mieloid hipopláziák kezelésére, neutrofil hiány kezelésére, csontvelő-átültetést követően a hematopoetikus rege5 nerálódás fokozását célzó kezelésnél, fennálló fertőzéseknél a gazdaszervezet ellenálló képességének növelését célzó kezelésnél. Lásd Dexter (Natúré) és Metcalf (Science) fent idézett közleményeit.

Az elmúlt néhány év folyamán azonosítottak, tisztí0 tottak és klónoztak egy olyan egér CSF-aktivitású proteint, mely multi-CSF, vagy interleukin-3 (IL-3) elnevezést kapott. Lásd: Yokota és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 1070-1040 (1984); Fung és mtsai, Natúré, 307, 233-237 (1984); Hapel és mtsai, Blood, 129,

1453-1459 (1985); Ihle és mtsai, J. Immunoi, 129, 2431-2436 (1982); Ihle és mtsai, J. Immunoi, 131, 282-287 (1983); Iscove és mtsai: „Cellular and Molecular Biology of Lymphokines”, (Academic Press, New York, 1985,397-425. oldal). Az egér IL-3 széles spektrumú CSF-aktivitást fejt ki, minthogy minden ismert mieloid sejtvonal progenitorsejtjeinek proliferációjátés fejlődését képes stimulálni [Dexter, Natúré, 309, 746-747 (1984); Ihle és mtsai, Lymphokines, 9,153— 200 (1984)]. E faktor széles spektrumú stimuláló hatáj sa miatt nagyon megnőtt az érdeklődés az iránt, hogy más emlősnél, különösen embernél, azonos faktorokat izoláljanak.

Legutóbb az egér IL-3-mal homológ patkány, gibbon és humán molekulát ismertettek Cohen és mtsai ) [Nucleic Acids Research, 14, 3641-3658 (1986)] és Yangés mtsai [Cell, 47,3-10 (1986)]. Aközleményekben szereplő molekulák aminosav-szekveniájának viszonylag alacsony fokú a homológiája az egér Il-3-hoz viszonyítva: a patkány homológiája 54%-os, a gibboné i 29%-os és az emberé 29%-os. Ezenfelül még nem bizonyos, hogy vajon a humán homológ molekula ugyanolyan biológiai aktivitástartománnyal rendelkezik-e, mint egér megfelelője.

Az előzőekben említettekre tekintettel, ha az egér IL-3 humán megfelelőjének bizonyítottan biológiai aktivitású variánsai állnának rendelkezésre, ez nagy előrelépés lenne a klinikai felhasználás lehetősége szempontjából, főként olyan eseteknél, amikor a vérsejtképződés stimulálása kompenzálhatná a betegség okozta mieloid hipopláziát, akadályozná a rákterápiák káros mellékhatásait, fokozná az átültetett csontvelő hatásosságát és ehhez hasonlók.

A találmány tárgyát egy humán interleukin-3 (IL-3) és ennek géntechnológiával előállított muteinjei (mutáns protein) képezik. A találmány további tárgyát képezik azok a polipeptidek, amelyeknek az aminosavszekvenciáját az alábbi I képlettel meghatározott szekvenciacsoportból választjuk ki és amelyek standard módszerekkel meghatározott telepstimuláló faktor (CSF) hatást fejtenek ki. Vonatkozik még a találmány olyan nukleinsavakra is, amelyek az I képlettel meghatározott polipeptideket képesek kódolni, valamint ezen polipeptideknek a találmány szerinti nukleinsavak felhasználásával történő előállítására és olyan eljárásokra, amelyekben a találmány szerinti polipeptideket hasz2

HU 204 890 Β náljuk fel vagy egyedül, vagy más CSF-ekkel együttesen mieloid hipopláziával járó zavarok kezelésére vagy csontvelő-átültetés után, vagy bizonyos rákbetegségeknél alkalmazott gyógymódokat követően a hematopoetikus rendszer regenerálódásának a fokozására.

A találmány egy előnyös megvalósítása olyan glükozilált és nem glükozilált polipeptidek csoportjának előállítását jelenti, amely a

X(Pro) - X(Met) - X(Thr) - X(Gln) - XfThr) 10

W(Thr) - W(Pro) - W(Leu) - W(Lys) - X(Thr) X(Ser) - XfTrp) - X(Val) - X(Asn) - Cys 20

X(Ser) - W(Asn) - W(Met) - W(Ile) - W(Asp) W(Glu)- W(Ile) - W(Ile) - W(Thr) - W(His)30

W(Leu) - W(Lys) - W(Gln) - W(Pro) - W(Pro) X(Leu) - X(Pro) - X(Leu) - X(Leu) - X(Asp) 40

X(Phe) -X(Asn)- X(Asn) - W(Leu) - W(Asn)W(Gly) - W(GIu) - W(Asp) - W(Gln) - W(Asp) 50

W(Ile) - W(Leu) - W(Met) - W(Glu) - W(Asn) W(Asn) - W(Leu) - W(Arg) - W(Arg) - W(Pro) 60

W(Asn) - W(Leu) - W(Glu) - W(Ala) - W(Phe) W(Asn) - W(Arg) - W(Ala) - W(Val) - W(Lys) 70

W(Ser) - W(Leu) - W(Gln) - W(Asn) - W(Ala) W(Ser)-W(Ala)- W(Ile) - W(Glu) - W(Ser) 80

W(Ue) - W(Leu) - X(Lys) - X(Asn) - X(Leu) X(Leu) - X(Pro) - Cys - X(Leu) - X(Pro) 90

X(Leu)- X(Ala)- X(Thr)- X(Ala) - W(Ala)W(Pro) - W(Thr) - W(Arg) - W(His) - W(Pro) 100

W(Ile) - W(His)-W(Ile) - W(Lys) - W(Asp) W(Gly) - W(Asp) - W(Trp) - W(Asn) - W(Glu) 110

W(Phe) - W(Arg) - W(Arg) - W(Lys) - W(Leu) X(Thr) - X(Phe) - X(Tyr) - X(Leu) - X(Lys) 120

W(Thr) - W(Leu) - W(Glu) - W(Asn) - W(Ala) W(Gln) - W(Ala) - W(Gln) - W(Gln) - X(Thr) 130

X(Thr) - X(Leu) - X(Ser) - X(Leu) - X(Ala)X(Ile)-X(Phe)

I képlettel meghatározott szekvenciacsoportból kiválasztott egy aminosav-szekvenciát tartalmaz. A képletben a W(Xaa) jel és az X(Xaa) jel a protein egy hidrofil, illetve egy hidrofób szakaszában elhelyezkedő, az Xaa aminosavval szinonim aminosavak csoportját jelenti, a Hopp-Woods analízissel való meghatározás szerint. Az egy csoportba tartozó szinonim aminosavaknak eléggé hasonlóak a fizikokémiai tulajdonságai ahhoz, hogy ha a csoport tagjait egymással helyettesítjük, a molekula megőrzi biológiai funkcióját [Grantham, Science, 185, 862-864 (1974) és Dayhoff és mtsai, „A Model of Evolutionary Change in Proteins”, Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, 5. kötet, 89-99. oldal]. Természetesen a fent meghatározott szekvenciába beépíthetünk aminosavakat és törölhetünk belőle aminosavakat anélkül, hogy biológiai funkciója megváltozna, főként úgy, ha az inszerciók és deléciók csak néhány aminosavra terjednek ki - például tíznél kevesebbre - és nem távolítunk el vagy helyettesítünk olyan aminosavakat, amelyek a funkcionális szerkezet szempontjából lényegesek, például ilyenek a ciszteincsoportok [Anfinsen: „Principles that Govem the Folding of Protein Chains” Science, 181, 223-230 (1973)]. Az olyan proteinek és muteinek, amelyek az ilyen deléciók és/vagy inszerciók révén jönnek létre, szintén a találmány tárgyát képezik. Abban az esetben, ha az I képlet szerinti protein aminosavcsoportjait számmal jelöljük, a szám vagy a számok a protein N-terminálisára vonatkoznak.

Meg kell jegyezni, hogy a humán IL-3 polipeptid, amelyet az I képletben ténylegesen az Xaa aminosavak reprezentálnak (és amelyet a későbbiekben megadott II képlet mutat be), a hetes pozícióban egy nem konzervatív aminosav-szubtitúciót tartalmaz, szerin helyett prolint, a Yang és mtsai [Cell, 47, 3-10, (1986)] által előzőleg ismertetett humán IL-3 szekvenciával szemben.

Az előnyös szinonim aminosavcsoportokat az I. és H. táblázat mutatja be. A még előnyösebb szinonim aminosavakat az I. és Π. táblázat minden sorában a második ferde vonal előtt soroljuk fel és a legelőnyösebben szinonim aminosavakat az I. és Π. táblázat minden sorában az első ferde vonal előtt soroljuk fel [minden legelőnyösebb W(Xaa) csoport éppen magából az Xaa-ból áll]. (Lásd Grantham és Dayhoff előbb idézett közleményeit).

I. táblázat

Az X(Xaa) szinonim aminosavak előnyös, előnyösebb és legelőnyösebb csoportjai

Xaa	X(Xaa)
Ser	Ser, //Thr, Gly, Asn, Cys
Arg	Arg, /Lys, His, /Gin, Glu
Leu	Leu, Ile, Met, /Phe, / Val, Tyr
Pro	Pro, /Alá, /Gly, Thr
Thr	Thr, //Pro, Ser, Alá, Gly, His, Gin
Alá	Alá, /Pro, /Gly, Thr
Val	Val, /Met, Ile, /Leu, Tyr, Phe
Gly	Gly, //Alá, Thr, Pro, Ser
De	Ile, Met, Leu, /Phe, Val, /Tyr
Phe	Phe, /Met, Tyr, Ile, Leu, / Val, Trp
iyr	Tyr, /Phe, /Trp, Met, Ile, Val, Leu
His	His, /Gin, Arg, /Glu, Lys, Thr
Gin	Gin, /Glu, His, /Thr, Arg, Lys, Asn
Asn	Asn, /Asp, /Ser, Gin
Lys	Lys, /Arg, /Glu, Gin, His
Asp	Asp, /Asn, Glu

HU 204890 Β

Xaa	X(Xaa)
Glu	Glu, /Gin, /His, Arg, Asp, Lys, Asn
Met	Met, Πβ Leu, /Phe, Val/
Trp	Trp//
Cys	Cys//
	H. táblázat
A W(Xaa) szinonim aminosavak előnyös, előnyösebb és legelőnyösebb csoportjai
Xaa	W(Xaa)
Ser	Ser, //Cys
Arg	Arg, //His, Lys
Leu	Leu, /He, Met, /Phe
Pro	Pro,//Alá
Thr	Thr//
Alá	Alá, //Pro
Val	Val,//Met, He
Gly	Gly//
Ile	Πβ, /Met, Leu, /Phe, Val
Phe	Phe, //Met, Tyr, He, Leu
Tyr	Tyr, //Phe
His	His,//Gin, Arg
Gin	Gin,//GIu, His
Asn	Asn, l/Asp
Lys	Lys, f/Arg
Asp	Asp, ff Asn
Glu	GIu,//Gin
Met	Met, /He, Leu, /Phe, Val
Trp	Trp//
Cys	Cys//

A találmány azokat az I képleté polipeptideket is magában foglalja, amelyekben egy vagy több pozícióban aminosav-szubsztitúciők (a H képlettel - ez a feltételezett natív szekvencia - meghatározott egy arninosavnak egy szinonim aminosavval való szubsztitúciója) jönnek létre. Az „n-szer szubsztituált” kifejezést akkor használjuk, ha leírjuk az I képlettel meghatározott polipeptideknek olyan alcsoportjait, amelyekben szinonim aminosavakkal helyettesítettük a natív szekvencia 0-n aminosavait. Tehát például az I képlet 1szer szubsztituált polipeptidcsoportja a következőkből áll: 381 polipeptid a szinonim aminosavak előnyös csoportjai szerint, 245 polipeptid a szinonim aminosavak előnyösebb csoportjai szerint, és 38 polipeptid a szinonim aminosavak legelőnyösebb csoportjai szerint. Ezekhez a számokhoz úgy jutunk, hogy összeadunk két összeget: i) a natív szekvencia hidrofób szakaszában lévő mindenfajta aminosav száma, szorozva az ezen aminosavra vonatkozó szinonim aminosavcsoport (X csoport) nagyságával és ii) a natív szekvencia hidrofil szakaszában lévő mindenfajta aminosav száma szorozva az ezen aminosavhoz tartozó szinonim aminosavcsoport (W csoport) nagyságával.

Előnyösen a humán IL-3 polipeptidek csoportját az olyan 10-szer szubsztituált I képletű polipeptidek alkotják, amelyekben a 10-32, 47-60, 71-86 és 95-113 aminosavakból álló szakaszokban nincs háromnál 5 többszöri szubsztitúció. Ezekben a szakaszokban az aminosav-szekvenciák sokkal állandóbbak a molekula többi részéhez viszonyítva, ha összehasonlítjuk az egér, a patkány és a gibbon IL-3 szekvenciákkal.

A humán IL-3 polipeptidek előnyösebb csoportját az 10 olyan 5-ször szubsztituált I képleté polipeptidek alkotják, amelyekben a 10-32, 47-60, 71-86 és 95-113 aminosavcsoportból álló szakaszokban nincs egynél többszöri szubsztitúció. A humán IL-3 polipeptidek még előnyösebb csoportját az olyan 2-szer szubsztitu15 ált I képleté polipeptidek alkotják, amelyekben a 1032, 47-60, 71-86 és 95-113 aminosavcsoportból álló szakaszokban nem történt szubsztitúció. A legelőnyösebb találmány szerinti polipeptid a

Pro-Met—Thr-Gin—Thr-Thr-Pro-Leu10

Lys - Thr- Ser- Trp - Val - Asn - Cys - Ser 20

Asn - Met - Ile - Asp - Glu - Ile - Ile - Thr 25 30

His - Leu - Lys - Gin - Pro - Pro - Leu - Pro 40

Leu - Leu - Asp-Phe-Asn-Asn-Leu-Asn Gly-Glu-Asp-Gin-Asp- He - Leu-Met 30 50

Glu - Asn - Asn - Leu - Arg - Arg - Pro - Asn 60

Leu - Glu - Alá - Phe - Asn - Arg - Alá - Val 70

Lys - Ser - Leu - Gin - Asn - Alá - Ser - Alá 80

Ile - Glu - Ser - Ile - Leu - Lys - Asn - Leu Leu - Pro - Cys - Leu - Pro - Leu - Alá - Thr90

Alá - Alá - Pro - Thr - Arg - His - Pro - Ile 100

His - Ile - Lys - Asp-Gly-Asp-Trp-Asn 110

GIu - Phe - Arg - Arg - Lys - Leu - Thr - Phe120

Tyr - Leu - Lys - Thr - Leu - Glu - Asn - Alá Gin - Alá- Gin - Gin - Thr- Thr- Leu - Ser130

Leu- Alá-He-Phe

Π képleté natív szekvenciából áll.

Ehhez hasonlóan az I képleté polipeptidek vonatkozásában az „n-szer inszertált” kifejezést a polipeptidek egy olyan csoportjára használjuk, amikor 1-tól n-ig számú aminosavat építünk be az I képleté szekvenciába. Előnyös, ha a beépített aminosavakat az inszercióval szomszédos aminosavakkal szinonim aminosavak előnyös csoportjaiból választjuk ki; még előnyösebb, ha ezeket az inszertációval szomszédos aminosavakkal szinonim aminosavak előnyösebb csoportjából választ4

HU 204 890 Β juk ki és a legelőnyösebb, ha ezeket az inszertációval szomszédos aminosavak legelőnyösebb csoportjából választjuk ki (lásd az I. és H. táblázatot). Tehát például az egyszer inszertált peptidcsoport egy alcsoportja egy olyan aminosavat tartalmaz, amely az N-terminális X(Pro) és a szomszédos X(Met) közé van beépítve. Azokat az inszertumokat, amelyek meghatározzák ennek az alcsoportnak a tagjait, előnyösen a következő aminosavak közül választjuk ki: Pro, Alá, Gly, Thr, Met, Phe, Ile, Val és Leu; előnyösebben a következőkből választjuk ki: Alá, Pro, Met, Leu, Phe, He és Val; és a legelőnyösebben a következőkből választjuk ki: Pro, Met, Ile és Leu. Az I képlet szerinti bármely szomszédos aminosav között és az aminosav-szekvencia elejétől a végéig terjedően végezhetők a beépítések. Minthogy 133 lehetséges inszerciós hely létezik, s minthogy ugyanarra a helyre többszörösen végezhetünk beépítéseket, egy 2-szeresen inszertált I képletű peptid 17.689 peptidalcsoportot eredményez és mindegyik alcsoport nagysága az inszertációkat határoló aminosavakkal szinonim aminosavcsoportok nagyságától függ.

Az I képletű polipeptidekre vonatkoztatva az „nszer deletált” kifejezés a peptidek egy olyan csoportját jellemzi, ahol 1-től n-ig számú aminosavat törlünk ki az I képletű szekvenciából. Tehát az I képletű polipeptidek 1-szer deletált csoportja 132 polipeptidből álló alcsoportokat foglal magában, ahol mindegyik polipeptid 131 aminosavhosszú (131-merek). Ennek megfelelően mindegyik alcsoportban minden 131-mert az előnyös, előnyösebb és a legelőnyösebb szinonim aminosavcsoportok alkotják a szubsztitúciók számától függően.

Abban az esetben, ha egy polipeptidcsoportot mind a „deletált” - az I képletű szekvenciára vonatkoztatva mind az „inszertált” - az I képletű szekvenciára vonatkoztatva - megjelölés határoz meg, először az inszerciókkal jellemzett polipeptidcsoportot alkotjuk meg, és ezután ennek a csoportnak minden tagjához egy olyan polipeptidcsoportot képezünk, amelyet a deléciók jellemeznek. Ez utóbbi csoportok tagjainak a száma alkotja azt a polipeptidcsoportot, amelyet mind az inszerciók, mind a deléciók határoznak meg.

A találmány szerinti polipeptid része lehet egy olyan hosszabb polipeptidnek, amely egy, a találmány szerinti polipeptid N-terminálisához kapcsolt, kiegészítő peptidet tartalmaz. A kiegészítő peptid lehet egy olyan szignálszekvencia, amely a proteinnek a gazdaszervezetből való szekrécióját vezérli, ilyen például az élesztő MF-alfal szignálszekvencia [Kurjan és mtsai, Cell, 30, 933-943 (1982)]. Fel lehet használni a kiegészítő peptidet például a kívánt polipeptid tisztításának a megkönnyítésére (például: Sassenfeld és mtsai: „A Polypeptide Fusion Designed fór the Purification of Recombinant Proteins”, Biotechnology, 76-81. old. 1984. január). Ez utóbbi esetben a kiegészítő peptid szelektív hasítási helyet tartalmaz a kívánt polipeptid N-terminálisának a szomszédságában, hogy ez utóbbit lehasíthassuk a biológiai aktivitás szempontjából fölös számú aminosav-szekvenciáról, akár enzimatikus, akár kémiai módszerekkel.

A találmány fenti előnyös megvalósításához azok a nukleotidszekvenciák is hozzátartoznak, amelyek az előnyös, előnyösebb és legelőnyösebb szinonim aminosavcsoportokat tartalmazó I képletű polipeptideket kódolják. Részletesebben: a találmány olyan nukleinsavakra vonatkozik, amelyek a pcD-huIL3-22-l klón 2. ábrán bemutatott cDNS-inszertumának szekvenciáját tartalmazzák. A pcD-huIL3-22-l kiónt letétbe helyeztük az American Type Culture Collection intézményben (Rockville, Maryland, USA), 67 318 letéti szám alatt.

A leírásban standard rövidítéseket alkalmazunk az aminosavak, nukleotidok, restrikciós endonukleázok és hasonlók jelölésére. Például: Cohn: „Nomenclature and Symbolism of α-Amino Acids” Methods in Enzymology, 106,3-17 (1984); Wood és mtsai, Biochemistry, A Problems Approach, 2. kiadás, Benjámin, Menlo Park (1981); Roberts: „Directory ofRestrictionEndonucleases”. Methods in Enzymology, 68,27-40 (1979).

A találmány feladatát az olyan problémák megoldása képezik, amelyek az embergyógyászatban és/vagy állatgyógyászatban előforduló zavarok kezelésében az immunregulációra alkalmas szerek használatával kapcsolatosak. Részletesebben, a találmány olyan vegyületekre vonatkozik, amelyek a vérsejtek regenerálódását képesek stimulálni és amelyek hasznosak lehetnek a rák terápiájában, bizonyos vérrel kapcsolatos betegségek kezelésében és makacs fertőzések kezelésében.

A találmány jobb megértése érdekében a találmány előnyös kiviteli módozatának - valamint a csatolt ábráknak - a leírása következik.

Az 1. ábra a pcDVl plazmid restrikciós helyeit és több kódolószakaszát mutatja be. A plazmidot a pcD expressziós és klónozó vektor szerkesztéséhez használjuk.

A 2. ábra a pLl plazmid restrikciós helyeit és több kódolószakaszát mutatja be. A plazmidot a pcD expressziós és klónozó vektor szerkesztéséhez használjuk.

A 3. ábrán a találmány szerinti humán IL-3 cDNS nukleotidszekvenciája és előre látható aminosav-szekvenciája látható.

A 4. ábrán a pSP6 elnevezésű módosított pcD vektort látjuk, amelyet petesejtekbe oltunk, hogy mRNS képződjék.

A találmány tárgyát olyan glükozilált vagy nem glükozilált polipeptidek képezik, amelyek humán 11-3 aktivitást fejtenek ki, valamint olyan polipeptidek, amelyek a találmány szerinti IL-3 polipeptidekből származtathatók standard proteintechnológiai eljárások révén. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan nukleinsavak is, amelyeknek a szekvenciája a találmány szerinti polipeptideket képesek kódolni. Végül a találmány azokra az eljárásokra is vonatkozik, amelyek segítségével a találmány szerinti glükozilált és nem glükozilált polipeptideket előállíthatjuk, s amelyekben a találmány tárgyát képező nukleotidszekvenciákat használjuk fel. Vonatkozik a találmány szerinti polipeptidek felhasználásának módszereire is.

Az alábbiakban a találmány szerinti polipeptidek és nukleinsavak előállítására, felhasználására és meghatározására szolgáló eljárásokat általánosságban tárgyal5

HU 204890 Β juk, majd ezután számos speciális példát ismertetünk, amelyekben az általános eljárásokat speciális sejttípusok, vektorok, reagensek és hasonlók felhasználása mellett alkalmazzuk.

I. Humán IL-3 cDNS-ek előállítása természetes forrásokból

A találmány szerinti cDNS-eket úgy állíthatjuk elő, hogy a 2. ábra szerinti cDNS-szekvencia alapján cDNS-szondát szerkesztünk. A szondát ezután arra használjuk, hogy egy cDNS-gyűjíeményben komplementer cDNS-eket azonosítsunk. Előnyös, ha a cDNSgyűjteményt mitogénnel indukált T-sejt klónpopulációból vagy perifériás vérlimfocitákból (PBL=peripheral blood Iymphocyte) hozzuk létre. A cDNS-gyűjtemények előállítása - olyan sejtekből, amelyeket növekedésre és/vagy bizonyos sejttermékek szintetizálására késztetünk - jól ismert eljárás a molekuláris biológiában. A legújabb összefoglaló munkák például a következők: Doherty: „CIoning and Expression of cDNA”, a í Molecular Cell Genetics című kiadvány 10. fejezete (kiadó: John Wiley and Sons, New York, 1985, szerkesztő: Gottesman); Brandis és mtsai: „Preparáljon of cDNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequences” a Genetic Engineering c. kiadvány 8. feje- 2 zetében a 299-316. oldal (Plenum Press, New Yoric, 1986, szerkesztők: Seüow és mtsai).

Az össz-mRNS kivonását, kettős szálú DNS-sé való átalakítását, a cDNS klónozását és a megfelelő gazdasejtek transzformálását a PCT/US86/02 464 számú sza- 3 badalmi bejelentésben - nyilvánosságra hozva WO 87/02 990 szám alatt - a 30. oldalról a 31. oldalra átmenő bekezdésben foglaltak szerint végezzük.

A kívánt polipeptideket kódoló mRNS előnyös forrásául szolgálnak az olyan sejtek, amelyeknek a felűlúszói 3 a találmány szerinti polipeptidekkel kapcsolatos aktivitást tartalmaznak. Általában különböző forrásokból nyerhetünk megfelelőT-sejteket, ilyen a humán lép, a mandulák és a perifériás vér. T-sejt kiónokat- amelyeket a perifériás vér T-limfocitáibőI izolálhatunk - szintén használ- 4( hatunk (lásd: „Research Monographs in Immunology”, szerkesztők: H. von Doehmer és V. Haaf, D fejezet „Humán T-Cell CIones” 8. kötet, 243-333. oldal; kiadó: Elsevier Science Publishers, N. Y. 1985.).

A cDNS-gyűjíeményhez való szondákat standard 4£ technikákkal szerkesztjük meg, például a találmány szerinti teljes hosszúságú vagy közel teljes hosszúságú cDNS-klőnok nick-transzláciőjával vagy jelzett szintetikus oligonukleotidokkal. Maniatis és mtsai (idézve fentebb) részletesen leírják a níck-transzlációs technikát. 50 Egyébként bármilyen kívánt bázisszekvenciából álló jelzett szintetikus oligonukleotid készíthető a kereskedelemben kapható DNS-szintetízátorokkal, mint amilyen például az Applied Biosystems, Inc., (Fosíer City, CA, USA) 381Amodellje, vagy ehhez hasonlókkal. 55

A cDNS-gyűjteményt ezután a szondával szűrjük standard technikák használatával. [Például: Beltz és mtsai, „Isolation of Multigene Families and Determination of Homologies by Filter Hybridization Methods, Methods in Enzymology, 100, 266-285 (1983); Calla- 60 han és mtsai, „Detection and CIoning of Humán DNA

Seqences Related to the Mouse Mammary Tumor Vírus

Genome”, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 5503-5507 (1982); Grunstein és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 72, 5 3961-3965 (1975); Benton és mtsai, Science, 196,

180-183 (1977)].

II. Humán IL-3 muteinek előállítása proteintechnológiával

A DNS mutációjára és a muteinek előállítására szolgáló általános technikák a PCT/US86/02 464 számú bejelentésben (fent idézve) a 33. oldalon alulról a 4. sortól a 34. oldal II. soráig vannak leírva; ezeket a technikákat a találmányban is fel lehet használni.

A természetes polipeptid muteinjei kívánatosak lehetnek különböző körülmények miatt. Például: a nem kívánatos mellékreakciók bizonyos muteinekkel csökkenthetők, különösen ha a mellékreakciót kiváltó hatás a polipeptid egy más részéhez kapcsolódik és nem a 0 kívánt aktivitást hordozó részhez. Ezenkívül, bizonyos expressziós rendszerekben a natív polipeptid érzékeny lehet a proteázok által okozott lebomlással szemben, de a megválasztott aminosav-szubsztitúciók és/vagy deléciók, amelyek megváltoztatják az érzékeny szekvenci5 ákat, jelentősen fokozhatják a kitermelést Lásd például a 2173-804-A számú brit szabadalmi bejelentést, amelyben a szöveti plazminogén aktivátor 275. pozíciójában lévő Arg-ot Gly vagy Glu helyettesíti. A muteinek a tisztítási eljárások kitermelését is növelhetik és/vagy növelhetik a proteinek tárolási idejét azáltal, hogy kiiktatják az oxidációra, acilezésre, alkilezésre vagy más kémiai módosulásokra érzékeny aminosavakat. Például a metíonin könnyen oxidálódik és szulfoxid keletkezik belőle, amely számos proteinben a biológiai aktivitás veszteségét okozza. [Lásd például: Brot és Weissbach, Arch, Biochem, Biophys., 223, 271 (1983)]. A metioninek gyakran helyettesíthetők sokkal inertebb aminosavakkal, a biológiai aktivitás elvesztése nélkül, vagy ennek csak kis vesztesége mellett. Lásd az AU-A-52 451/86 számú ausztráliai szabadalmi bejelentést. Bakteriális expressziós rendszerekben a kitermelés néha úgy növelhető, ha töröljük vagy helyettesítjük a konformáció szempontjából lényegtelen ciszteincsoportokat (például: Mark és mtsai, 4 518 584 számú US szabadalmi leírás).

Az alábbi fejezetekben az Esteli és mtsai (idézve fentebb) által használt jelzéseket követjük és általánosítjuk a muteinek azonosításánál. Például: „humán IL-3 mutein Leu¹³” (vagy egyszerűen „Leu¹³”, ha a natív proteint a szövegből ismerjük), olyan polipeptidet jelent, amelynek az aminosav-szekvenciája azonos a natív proteinéval, kivéve az N-teiminálisnál lévő 13-as pozíciót Ebben a pozícióban Val helyébe Leu-t szubsztituálunk. Az egynél több szubsztitúció hasonlóan jelezhető; például azt a muteint, amelyben a 13. pozícióban Val helyett Leu-t szubsztituálunk és a 18. pozícióban Met helyébe Phe-t, úgy nevezzük, hogy humán IL-3 mutein (Leu¹³, Phe¹⁸). A deléciókat „Δ’’-val jelöljük. Például, ha egy muteinből a 4. pozícióban hiányzik a Gin, annak neve humán IL-3 mutein Δ⁴ lesz. Az

HU 204 890 Β inszerciót „IN(Xaa)”-val jelöljük. Például, ha a 4. pozícióban lévő Gin után beépítünk egy Leu-t, annak neve humán IL-3 mutein IN⁴(Leu) lesz. Tehát a humán IL-3 mutein (Ser¹⁰, Δ⁴, IN⁶(Gly) egy olyan natív IL-3 szekvenciát jelent, amelyet úgy módosítottunk, hogy a Thr-t Ser-rel helyettesítettük a 10. pozícióban, a 4. pozícióból töröltük a Gln-t és a 6. pozícióba, közvetlenül a Thr után, beépítettünk egy Gly-t. Az ugyanazon helyre való többszörös aminosav-inszerciót következőképpen jelöljük: IN‘(Xaai-Xaa₂-Xaa3-...), ahol XaaiXaa2-Xaa3~... jelenti az I pozíció után beépített szekvenciát. Az N-terminális addíciókat a „o” index jelzi, például IN°(Xaa); továbbá ha például a 6-10 aminosav-szekvencia törlődik, annak jele vagy Δ^{6 10} vagy (Δ⁶, Δ⁷, Δ⁸, Δ⁹, Δ¹⁰).

Humán IL-3 muteinek előállítására a legelőnyösebben a kazetta mutagenezist használhatjuk. Amint ezt az alábbiakban részletesebben leírjuk, egy szintetikus humán IL-3 gént szerkesztünk, amelynek a szekvenciája egyedi restrikciós helyeket tartalmaz, megközelítőleg egyenlő távolságban a gén hosszában. A restrikciós helyek egyediségét meg kell tartani abban az esetben is, amikor a gént egy megfelelő vektorba építjük be, s így a génszegmentumokat kényelmesen kihasíthatjuk, hogy ezeket olyan szintetikus oligonukleotidokkal (azaz „kazettákkal”) helyettesíthessük, amelyek a kívánt mutációkat kódolják.

A „kazetta” egy ismert természetes DNS-szekvencia által kódolt polipeptidet kódoló, de a természetessel nem pontosan azonos szintetikus DNS-szekvencia, amelyben a változtatások nem befolyásolják a polipeptid kifejezését, de olyan egyedi restrikciós helyeket biztosítanak, hogy egy plazmidba beépített ilyen „kazetta” két specifikus endonukleázzal kivágható, és azonos hasítási végekkel rendelkező más kívánt DNSszekvenciával kicserélhető.

Az egyedi restrikciós helyek számának és eloszlásának a meghatározása során számos faktort kell tekintetbe venni, s ezek a következők: 1) az expresszióhoz használt vektorban már előzőleg meglévő restrikciós helyek; 2) faj- vagy nemspecifikus kodonok használata kívánatos-e; 3) a különbözőhozzáférhető nem vektorhasító restrikciós endonukleázok száma (és ezek sokasága a szintetikius génen belül); és 4) az egyedi restrikciós helyek közti szegmentumok szintetizálásának és/vagy szekvenálásának egyszerű és megbízható volta.

Az I képlet általánosságban a polipeptidek egy olyan csoportját határozza meg, ahol a feltételezetten valódi humán IL-3 szekvenciához viszonyítva az aminosavszubsztitúciók, inszerciók és/vagy deléciók konzervatívok. Az itt használt „konzervatív” kifejezés azt jelenti, hogy i) a változtatások - amennyire lehetséges - közömbösek a konformáció szempontjából, azaz úgy vannak megtervezve, hogy a mutáns polipeptidek tercier szerkezetét illetően, összhasonlítva a natív humán IL-3-mal, csak minimális változásokkal járjanak és hogy ii) a változtatások a lehetőség szerint lényegtelenek legyenek az antigenitás szempontjából, azaz olyanok, hogy a mutáns polipeptidek antigéndeterminánsaiban, összehasonlítva a natív humán IL-3-mal, minimális változásokat okozzanak. A konformációt illető közömbösség a biológiai aktivitás megőrzése miatt kívánatos és az antigenitásra vonatkozó közömbösség azért kívánatos, hogy a találmány szerinti vegyülettel kezelt beteg emberekben vagy állatokban elkerüljük Immunogének által keltett válaszok megjelenését. Bár abszolút biztonsággal nehéz megválasztani azokat a változtatásokat, amelyek mind a konformáció, mind az antigenitás szempontjából közömbösek, vannak szabályok, amelyek az ezen szakterületen jártas kutatókat az olyan változtatások megtételében segítik, amelyek nagy valószínűséggel a konformáció és antigenitás szempontjából közömbösek [lásd: Anfinsen (fent idézve) és Berzofsky, Science, 229, 932-940 (1985)]. Néhány fontosabb szabály a következő:

1) kevéssé valószínű, hogy hidrofób csoportok szubsztitúciója az antigenitásban változásokat okoz, mivel ezek valószínűleg a protein belsejében helyezkednek el (például lásd Beizofsky fent idézett közleményét);

2) a fizikokémiailag hasonló, azaz szinonim csoportok szubsztitúciója kevéssé valószínű, hogy konformációs változásokat hoz létre, mivel a helyettesítő aminosav ugyanolyan szerepet játszik a szerkezet szempontjából, mint a helyettesített aminosav; és

3) az evolúció folyamán kialakult szekvenciák változtatása valószínűleg káros konformációs hatásokkal jár, mivel az evolúciós alak fenntartása olyan szekvenciákat feltételez, amelyek funkcionálisan fontosak lehetnek.

Ezeken az alapszabályokon kívül a muteinszekvenciák kiválasztásához rendelkezésre állnak olyan vizsgáló módszerek, amelyekkel a manipulált molekulák biológiai aktivitása és konformációja megállapítható. A találmány szerinti polipeptidek biológiai vizsgáló módszereit alább részletesen ismertetjük. A konformációs változásokat legalább két jól ismert módszerrel tesztelhetjük: mikrokomplement fíxációs módszerrel [például: Wassermanés mtsai, J. Immunot, 87,290-295 (1961), Levine és mtsai, Methods in Enzymology, 11, 928-936 (1967)], amely széles körben használatos a proteinek tercier szerkezete evolúciójának tanulmányozásában; és a konformációspecifikus monoklonális antitestekhez való affinitások vizsgálatával [például: Lewis és mtsai, Biochemistry, 22, 948-954(1983)].

III. CSF-aktivitás assay-k

A CSF-aktivitás meghatározása céljára hematopoetikus sejtekből, például csontvelősejtekből, vagy magzati köldökzsinór-vérsejtekből egysejtszuszpenziót készítünk. Az egyedi sejteket ezután „immobilizáljuk” olyan szemiszolid (agar) vagy viszkózus (metilcellulóz) közegben, mely tápanyagokat és rendszerint fetális borjúszérumot tartalmaz. Megfelelő stimulálófaktor jelenlétében az egyedi sejtek proliferálódnak és differenciálódnak. Minthogy a kezdő sejtek immobilizáltak, telepek keletkeznek, mihelyt e sejtek szaporodnak és érnek. Ezeket a telepeket 7-14 nap elteltével leszámolhatjuk. A CSF assay-k kiviteléhez részletes utasítások találhatók az alábbi közleményekben: A. Burgess:

HU 204890 Β „Growth Factors and Stem Cells”, Academic Press, New York (52-55. oldal, 1984), Metcalf: „The Hemopoietic Colony Stimulating Factors”, Elsevier, New York (103-125. oldal, 1984). Ha kívánt, az individuális telepeket kivonjuk, tárgylemezre visszük, fixáljuk és Wright/Giemsa szerint megfestjük [Todd-Sanford, Clinical Díagnosis by Laboratory Methods, 15. kiadás, szerkesztők: Davidson és Henry (1974)]. Ezután az egyes telepekben jelen lévő sejttípusokat morfológiai analízissel határozhatjuk meg.

Nem hematológiai betegségben szenvedő betegektől csontvelősejteket vesszük le és Ficoll-ra (type 400, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) rétegezzűk, majd Iecentrifugáljuk (600 g, 20 perc) és a határrétegből eltávolítjuk a sejteket Ezeket a sejteket kétszer mossuk az Iscove által módosított Dulbecco-féle tápoldattal, mely 10% fetális borjúszérumot (FCS=fetal calf serum) tartalmaz, majd ugyanezen közegben ieszuszpendáljuk. Az adherens sejteket műanyag Petri-csészékhez való adherenciával távolítjuk el [az adherens í sejtek gyakran GM-CSF-teimelő sejtek (Metcalf, fent idézve); GM-CSF=granuIocita-monocita-CSF]. A nem adherens sejteket -10* sejt/ml sűrűségben - olyan Iscove tápoldathoz adjuk, mely 20% FCS-t, 50 pmól 2-ME-t (2-merkapto-etanol) és 0,9% metilcellulőzt tar- 2 talmaz és ehhez különböző· koncentrációban olyan felülúszókat adunk, amelyek ismert mennyiségű telepstimuláló aktivitást tartalmaznak, vagy a vizsgálandó felülúszőkat Peíri-csészékre (35 mm) 1 ml alikvot mennyiségeket szélesztünk, s a csészéket 37 ’C-on 6% 3 CO₂-atmoszférában, telített nedvességtartalmú levegődben tenyésztjük. A tenyésztés megindítása után 3 nap múlva minden lemezhez 1 egység eritropoietint adunk.

A granulocita-makrofág telepeket és az eritroidsejtek robbanásszerű szaporodását a 10-14. napon számoljuk 3í meg inverz mikroszkóp használatával.

A heparinba levett köldökzsinór-vérsejíeket 600 g mellett 6 percig centrifugáljuk. A plazma és a vörösvérsejt közti határfelületen lévő fehérvérsejteket átvisszük egy csőbe, amely 0,17 n ammőnium-kloridot és 6% 4C FCS-t tartalmaz. A csövet 5 percig tartjuk jégen, majd a szuszpenzió alá 4 ml FCS-t rétegezőnk és 6 percig 600 g mellett centrifugáljuk. A sejtüledéket Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal mossuk, majd újra elvégezzük a FicoII-os és műanyag 45 adherencialépéseket, ahogyan ezt fent, a csontvelősejteknél leírtuk. A kis sűrűségű nem adherens sejteket összegyűjtjük és szemiszolid táptalajba visszük - mint fent leírtuk -10* sejt/ml arányban.

Az assay-k végén a sejtösszetételt úgy határozzuk 50 meg, hogy az egyedi telepeket üveg tárgylemezekre visszük és Wright/Giemsa szerint festjük meg. Az eozinofil sejteket Luxol és Fást Blue-val való festéssel határozzuk meg [G. Johnson és D. Metcalf, Exp. Hematol, 8,549-561 (1980)].

IV. Tisztítás és gyógyszerkészítmények

A találmány szerinti polipeptidek tisztítására szolgáló általános eljárásokat, laboratóriumi felhasználásukat vagy gyógyszerkészítményekben aktív ingrediensekként való használatukat a PCT/US86/02 464 számú szabadalmi bejelentés V. fejezete tartalmazza, azaz a

43. oldal 20. sorától a 44. oldal 15. soráig és a 44. oldal

27. sorától a 45. oldal 27. soráig terjedő részek. A találmány szerint az egyadagos kiszerelésben lévő aktív polipeptid mennyisége 1 pg-től 100 mg-ig terjedhet, hatékonyságától és alkalmazásától függően.

Ezenfelül egy egyén hematopoetikus sejtpopulációja ex vivő fenntartható és/vagy szaporítható vagy diffe10 renciálódásra késztethető, hogy ugyanannak vagy egy másik személynek beadhassuk a jótékony hatás elérése céljából. A készítmények szelektíven stimulálhatják az immunrendszer különböző komponenseit, akár egyedül, akár más olyan szerekkel együtt, amelyeket a 15 szakemberek jól ismernek. Részletesebben: a készítmények más immunreaktív anyagokat is tartalmazhatnak, mint például limfokineket (ilyenek például: IL-1, IL-2, IL-4, GM-CSF és hasonlók).

V. Expressziós rendszerek

Bármilyen megfelelő expressziós rendszert választhatunk, mivel ezek tulajdonságai nem lényegesek a találmány szempontjából, amennyiben megfelelőek. Az alkalmas expressziős rendszereket a PCT/US86/02 5 464 számú szabadalmi bejelentés VI. fejezete tárgyalja.

Az alábbi példák a találmány megvilágítását célozzák. A cDNS-gyűjtemények, vektorok és gazdasejtek megválasztása, valamint a reagensek koncentrációja, a hőmérséklet és a többi változó értéke a találmány al0 kalmazásához csak példaként szolgálnak, de nem tekinthetők a találmány oltalmi kőiét korlátozó tényezőknek.

I. példa

Humán IL-3 cDNS előállítása a pcD cDNS-gyűjteménynek szintetikus szondával való szűrése révén, továbbá kifejezése COS 7 majomsejtekben ésXenopus petesejtekben A pcD cDNS-gyűjteményt humán T-sejt kiónból

Ϊ (6D11) izolált mRNS-ből állítjuk elő. A kiónt kokanavalin A-val (ConA-val) kezeljük (2-10 pg/ml; 4-12 óra) mRNS-szintetizálás indukálása céljából. Az alkalmazott eljárásokat Okayama és Berg közleményei [Mól. Cell. Bioi., 2, 161-170 (1982) és 3, 280-289 ' (1983)] tartalmazzák. Más indukciós szerek, mint a fitohemagglutinin (PHA), a pokeweed mitogén (PWM), a kalcium ionofór (Calimycin), az anti-T3 antigén és hasonlók, hatásosabbak lehetnek bizonyos sejttípusoknál s bizonyos feltételek mellett ApcD prekurzor plazmidok, a pcDVl és a pLl, a Pharmacia Inc., cégtói (Piscataway, NJ, USA) megvásárolhatók.

Az Okayama- és Berg-féle pcD cDNS-gyűjtemény előállításának rövid leírását a PCT/US86/02 464 számú bejelentés tartalmazza, a 31-32. oldalon olvasható bekezdésben.

Mihelyt a cDNS-gyűjtemény az Okayama/Berg plazmid vektorokban - lásd az 1. ábrát - elkészül, a cDNS-klőnokat összegyűjtjük és random poolokat vizsgálunk a kívánt cDNS-ek jelenlétére standard módszerekkel, ilyenek például a hibrid szelekció, az anti8

HU 204 890 Β géndeterminánsok kimutatása a kifejezett terméken és/vagy a funkcionális vizsgálatok.

Aj A mRNS izolálása

A 6D11 sejtekből a teljes sejt RNS-t a Chirgwin és mtsai szerinti guanidin-izotiocianát-eljárással [Biochemistry, 18,5294-5299 (1979)] izoláljuk. Az eljárást Maniatis és mtsai (idézve fent) munkája is tartalmazza. A ConA-Val stimulált, mosott és ülepített 6D11 sejteket guanidin-izotiocianátos lizáló oldatban [50 g guanidiniumtiocianát 0,5 g nátrium-N-lauril-szarkozinnal (végkoncentráció 0,5%), 23 ml 1 mólos nátrium-citrát, pH=7,0 (25 mmól), 0,7 ml 2-ME (0,1 mól), 0,33 Sigma 305 Antifoam A (0,1%); ionmentes vízzel 100 ml-re feltöltve szobahőmérsékleten; a végső térfogatot szűrjük és pH=7-re állítjuk be 1 n NaOH-dal] szuszpendáljuk. A lizáló oldatból 20 ml-t használunk 1,5· 10⁸ sejthez.

A kapott üledéket ezután a PCT/US86/02 464 számú bejelentésben leírt eljárás szerint (B fejezet, 55. oldal 22 sorától az 56. oldal 24. soráig) dolgozzuk fel.

B) A pcD gyűjtemény előállítása

Az Okayama- és Berg-féle eljárást [Mól. Cell. Bioi., 2,161-170 (1982)] alkalmazzuk csekély módosításokkal. A pcDVl és pLl plazmidot Okayama és Berg [Mól. Cell. Bioi., 3, 380-389 (1983)] írta le, s ezek a Pharmacia cégtől (Piscataway, NJ, USA) megvásárolhatók. Tulajdonképpen módosított pcDVl plazmidot használunk, amely egy Nsil helyet tartalmaz a KpnI helyet megelőzően és egy módosított pLl-et, amelyben az Xhol helyre be van építve a HTLV(I) retrovírus hosszú ismétlődő végszakaszának (LTR-long terminál repeat) egy része. Úgy találták, hogy az LTR-szegmentum jelenléte emlős gazdasejtekben általában 20-50szeresre fokozza az expressziót. A módosított szerkezetek az 1. és 2. ábrán láthatók.

A retrovírus eredetű LTR-ek számos rendszerben fokozzák az expressziót· lásd például: Chen és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 7285-7288 (1985); Gorman és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 79,6777-6781 (1982); Temin, Cell, 27 1-3 (1981); Luciw és mtsai, Cell, 33,705716 (1983). Az a HTLV(I) LTR-darab, amely a pLl Xhol helyére van beépítve, egy 267 bázist tartalmazó szegmentumból áll, ez magában foglalja a teljes R szakaszt és az U5 szakasz egy részét (a 2. ábrában U5’-vel jelölve), amely az R/U5 határától az első downstream Taql helyig terjed (összesen 39 bzis). A HTLV(I) LTR-szekvenciáját Yoshida és mtsai írták le [Current Topics in Microbiology, 115,157-175 (1985)].

A HTLV(I) LTR-szegmentumot négy lépésben inszertáljuk a pLl-be, a H. példában leírt eljárások szerint. A pLl-et először BglI-gyel és Xhol-gyel emésztjük, majd a nagy fragmentumot izoláljuk. A nagy fragmentumot ezután standard ligáló elegyben a szintetikus 1A/B és 2A/B szekvenciával keverjük. A szintetikus 1A/B és 2A/B szekvencia együttesen a következő részekből áll 5’-től 3’-ig: a kis BglI/XhoI fragmentumból, az LTR R szakaszának 26 bázisból álló 5’ darabjából és egy polilinkerből, amelyben az adott sorrendben a Smal, SacI, Nael és Xhol hely található.

1A/B szintetikus szekvencia:

(BglI)

TCGGCCTCTGAGCTATTCCAGCGGAGCCGGAGACTCGATAAGGTCTTCATCACTCCTCCGAAAAAACCTGGCCTAGGCmT

CCGG

2A/B szintetikus szekvencia:

SV40 őri -»l R->

GCAAAAAGCTCGGCTCGATCCGAAAACGTTTTTCGAGCCGAGCSmal

R-»l SacI

CATCTCTCCTTCACGCGCCCGGGGAGGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCCCCTCNael Xhol

CTCGCCGGCC

GAGCGGCCGGAGCT

Ligálás után az 1. lépésben előállított plazmidot szaporítjuk, izoláljuk, ezután Smal-gyel és Sacl-gyel emésztjük, majd a nagy fragmentumot izoláljuk. A nagy fragmentumot ezután standard ligáló elegyben a 3A/B és 4A/B szintetikus szekvenciával keverjük.

3A/B szintetikus szekvencia:

GCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAGCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCT

GTGCGGCCAACTC

4A/B szintetikus szekvencia:

GCCGCCTCCCGCCTGAGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGACTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCACCACGGAGGACTTGACGCAGGCGSacI

CGTCTAGGTAAGTTTAGAGCT

GCAGATCCATTCAAATC

Ligálás után a 2. lépésben kapott plazmidot szaporítjuk, izoláljuk, ezután Sacl-gyel és Nael-gyel emésztjük, majd a nagy fragmentumot izoláljuk. A nagy fragmentumot ezután standard ligáló elegyben az 5A/B szintetikus szekvenciával keverjük.

5A/B szintetikus szekvencia:

CAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCGAGTCCAGCTCTGGCCCGGAAAC9

HU 204890 Β

TCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGGCCGCGAGGGAACCTCGGATGGANael

AGACTCAGCC 5

TCTGAGTCGG

Ligálás után a 3. lépésben kapott plazmidot szaporítjuk, izoláljuk, ezután Nael-gyel és Xhol-gyel emésztjük, majd a nagy fragmentumot izoláljuk A nagy frag- 10 mentumot ezután standard ligáló elegyben a 6A/B és 7A/B szintetikus szekvenciákkal keveijük, s így keletkezik a módosított pLl plazmid, melynek jele: pLl

6A/B szintetikus szekvencia: 15

Nael

GGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGTGCTTGCTCAACTCTACG 20

ACGAACGAG

ΊΑίδ szintetikus szekvencia:

TCTTTGTTTCGTTTTTTGAGATGCAGAAACAAAGCAAAA- 25

Xhol

CTGTTCTGCGCCGTTACAGATC

GACAAGACGCGGCAATGTCTAGAGCT

A pcDVl DNS-ből 80 pg-ot emésztünk 20 egység KpnI endonukleázzal 30 °C-on 450 pl reakcióelegyben, mely 6 mmól trisz-HCI-ot (pH-7,5), 6 mmól MgChot, 6 mmól NaCI-ot, 6 mmól 2-ME-t és 0,1 mg/ml bovinszéram-albumint (BSA) tartalmaz. Az emésztést 16 óra múlva 40 pl 0,25 mólos ED1A (pH-8,0) és 20 μΐ 10%-os nátrium-dodecil-szulfát (SDS) hozzáadásával állítjuk le; a DNS-t úgy kapjuk meg, hogy az elegyet vízzel telített 1:1 fenoI-Horofonn elegyével (a továbbiakban fenolCHCI3) extraháljuk és etanoUal kicsapjuk. Homopolimer farkakat - ezek végenként átlag 60, de 80-nál nem több dezoxitimidilát (dT) csoportból állnak - adunk az Nsil endonukleázzal kialakított terminálisokhoz boqutimuszteiminálistranszferáz segítségével a következőképpen: a reakcióelegy (38 μΐ) nátrium-kakodilát - 30 mmól trisz-HCI-puffert (pH=6,8), 1 mmól CoCk-ot, 0,1 mmól DTT-t, 0,25 mmól dTTP-t, Nsil endonukleázzal emésztett DNS-t és 68 egység terminális dezoxinukleotídiltranszferúzt (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI, USA) tartalmaz. A reakciót - 30 perc, 37 °C - 20 μΐ 0,25 mólos EDTA (pH-8,0) és 10 pl 10%-os SDS hozzáadásával állítjuk le. Ezután a DNS-t többszöri fenolCHClj-mal való extrahálással és etanolos kicsapással izoláljuk. A DNS-t ezután 15 egység EcoRI endonukleázzal emésztjük 50 μΐ 10 mmól trisz-HCl (pH-7,4), 10 mmól MgCb, 1 mmól DTT és 0,1 mg/ml BSA-tartalmú oldatban 5 órán át 37 'C-on. A nagy fragmentumot, amely az S V40 poüadenilációs helyét és a pBR322 replikáciős origóját és ampicillin-rezisztenciagénjét tartalmazza, agarőzgél (1%) elektroforézissel tisztítjuk, majd a gélből egy módosítottüveg- pormódszerrel [B. Vogelstein és D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 615-619 (1979)] nyerjük ki. A dT-farokkal ellátott DNS-t ezután oligo(dA)-cellulőzoszlopon való adszorpcióval és elúcióval tisztítjuk a következőképpen: a DNS-t 1 ml 10 mmólos trisz-HCl (pH=7,3) pufferben-mely 1 mmól EDTA-t és 1 mól NaCI-ot tartalmaz - oldjuk fel, 0 ‘C-ra lehűtjük, majd rávisszük egy ugyanezen puffénál 0 ’Con kiegyensúlyozott oligo(dA)-celluIózoszlopra (0,6*2,5 cm). A Ieoldás vízzel történik, szobahőmérsékleten. A leoldott DNS-t etanollal csapjuk ki és 1 mmól EDTA-íaríalmú 10 mmólos trisz-HCl-ban (pH=7,3) oldjuk fel. Az oligo(dG)-farkat viselő Iinker DNS-t úgy állítjuk elő, hogy a pLl’ DNS-ből 75 pg-ot emésztünk 20 egység PstI endonukleázzal 450 pl reakcióelegyben, mely mmól trisz-HCI-t (pH=7,4), 6 mmól MgCl₂-ot, 6 mmól

2-ME-t, 50 mmól NaCI-ot és 0,01 mg/ml BSA-t tartalmaz. A reakcióelegyet 30 ’C-on tartjuk 16 órán át, majd fenol-CHCh-mal extraháljuk és a DNS-t etanollal csapjuk ki. A10-15 dezoxiguanilát (dG) csoportból álló farkakat ezután 46 egység terminális dezoxinukleotidiítranszferáz segítségével kapcsoljuk a végekhez a fent leírt azonos reakcióelegyben (38 μΐ), kivéve, hogy a dTTP-t 0,1 mmól dGTP helyettesíti. Az elegyet 20 percig tartjuk 37 ’C-ön, majd fenol-CHCh-mal extraháljuk, a DNS-t etanoUal kicsapjuk, majd 35 egység Hindin endonukleázzal emésztjük 50 pl 20 mmól trisz-HCl (pH-7,4), mmól MgCh, 60 mmól NaCI és 0,1 mg/ml BSA-tartalmú oldatban 37 ’C-on 4 órán át. Akis oUgo(dG)-farkazott Iinker DNS-t agarőzgél (1,8%) elektroforézissel tisztítjuk és úgy izoláljuk, mint fent.

A gyűjtemény előáüítását a PCT/US86/02 464 számú szabadalmi bejelentés C2 fejezete - cDNA Library Preparation, 48. oldalon alulról a 9. sortól a 61. oldal

10. soráig - szerint végezzük. Ezután a tenyészet mintáit DMSO-ban lefagyasztva tároljuk. Emellett, a DMSO hozzáadása előtt húsz 15 cm-es lemezt oltunk le, egyenként körülbelül 3000 kiónnal.

Fenti telepek számára a radioaktív jelzett szondákat a kővetkezőképpen készítjük el: 1) a Yand és mtsai [Cell, 47, 3-10 (1986)] által közölt humán IL-3 szekvencia adatainak felhasználásával egy szemiszintetikus oligonukleotidot szintetizálunk, amely az ismertetett IL-3 szekvencia kódoló szálának első 55 nukleotidját tartalmazza (ATG-vel kezdődően); 2) ugyanezen szekvenciaadatok felhasználásával egy átfedő ellenkező szálú oligonukleotidot szintetizálunk, amely az ismertetett szekvencia 45-100 bázisát tartalmazza; 3) a két szintetikus szálat egymáshoz illesztjük és prímetekként használjuk a DNS-poIimeráz Klenow-fragmentjéhez ATP, GTP, ΊΤΡ, valamint radioaktív jelzett CTP jelenlétében; 4) végül a reakciót „hidegen futtatjuk” („cold chased”) jelzetlen prekurzorokkal, hogy biztosítsuk a szál maximáUs kiterjedését. (A „cold chased” kifejezés azt jelenti, hogy a radioaktív CTP prekurzort ennek nem radioaktív formájával helyettesítjük.)

A fent elkészített 20 lemez klónjáit a szintetikus szondák segítségéve], standard telephibridizációs technikával (Maniatis és mtsai, fent idézve), szűrjük. Két pozitív telepet észleltünk. Az egyiket, amelynek a pcD10

HU 204 890 Β huIL3-22-l elnevezést adtuk, leválasztottuk, szaporítottuk és beklónoztuk az Ml3 plazmádba szekvenálás céljából, amit a Sanger és mtsai [Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5363-5367 (1977)] féle didezoxi-láncterminációs módszerrel végeztünk el. A cDNS-szekvenciát a legnagyobb nyílt leolvasási keret előre feltételezett aminosav-szekvenciájával együtt a 3. ábrán mutatjuk be. Az N-terminális aminosavak analízise, amely a Perlman és mtsai [J. Mól. Bioi., 167, 391-409 (1983)] által közölt empirikus szabályok szerint történt, azt mutatta, hogy a nyűt leolvasási keret kezdetétől számított harmadik prolin legnagyobb valószínűséggel az érett protein Nterminálisa. Azonban ezeknek a szabályoknak az ellenére, valószínűleg a szomszédos Alá lehet a natív protein igazi N-terminálisa, annak felfedése alapján, hogy az egér IL-3 N-terminálisa Alá. Mindenesetre a szignálszekvencia nem kritikus része az aktív molekuláknak és a szekvenciák széles változatából állhat, amelyek nincsenek káros hatással a szekréciós aktivitásra [például: Kaiser és mtsai, Science, 235, 312-317 (1987)]. A 3. ábrán a potenciális N-glükozilációs helyek be vannak keretezve.

Meglepő módon az izolált humán IL-3 cDNS-ben egy jelentős aminosav-különbség fedeztünk fel a Yang és mtsai (fent idézve) által közölt szekvenciához képest: az izolált cDNS prolint kódol a 7. pozícióban (a H képlet Nterminálisához viszonyítva) a Yang és mtsai (fent idézve) szerinti szerin helyett. Egy ilyen változás a két polipeptidben jelentős konformációs különbségeket kell jelentsen, a prolin és szerin különbözősége miatt.

Párhuzamos kísérletben ugyanezt a kiónt külön szaporítjuk; a pcD klónozó vektort standard technikák használatával (lásd például Maniatis és mtsai fent idézett munkáját) izoláljuk és a cDNS-t két külön rendszerben, COS 7 majomsejtekben és Xenopus oocitákban, fejezzük ki. A pcD vektorokkal következőképpen transzformáljuk a COS 7 sejteket. A transzfekció előtt egy nappal körülbelül 10⁶ COS 7 majomsejtet oltunk le egy-egy 100 mm-es lemezre, Dulbecco által módosított Eagle tápoldatba (DME), mely 10% fetális borjúszérumot és 2 mmól glutamint tartalmaz. A transzfekció kiviteléhez az oldatot leszívjuk a lemezekről és 4 ml olyan DME-vei helyettesítjük, mely 50 mmól triszHCl-ot (pH=7,4), 400 pg/ml DEAE-dextránt tartalmaz, valamint a vizsgálandó plazmid DNS-ekből 50 pg-ot. A lemezeket 4 óra hosszat inkubáljuk 37 ’C-on, majd a DNS-tartalmú tápoldatot eltávolítjuk és a lemezeket kétszer mossuk 5 ml szérummentes DME- vei. Ezután 150 pmól klorokint tartalmazó DME-t adunk vissza a lemezekre, amelyeket ezután még 3 órán át inkubálunk 37 ’C-on. Ekkor a lemezeket egyszer mossuk DME-vel, majd hozzáadunk 4% fetális borjúszérumot, 2 mmól glutamint, penicillint és streptomicint tartalmazó DME-t. A sejteket most 37 ’C-on 72 órán át inkubáljuk. A tápoldatokat learatjuk és CSF-aktivitásra vizsgáljuk a fent leírt fetális köldökzsinórvér-assay-t használva. Különféle teleptípusokat figyeltünk meg,

ApcD-huIL3-22-l cDNS-inszertumról átírt RNS-sel oltott Xenopus oocita felülúszókat biológiai aktivitásukra vizsgáljuk. A követett eljárás lényegében azonos volt a Méltón és mtsai [Nucleic Acids Research, 12, 7035-7056 (1984)] és a Krieg és mtsai [Nucleic Acids Research 12,7057-7070 (1984)] által leírt módszerrel. A pcD-huIL3-22-1 cDNS-inszertumát először újra beklónozzuk a pSP6 módosított pcD vektorba. A pSP6-ot úgy szerkesztjük meg, hogy a pcD-ben lévő SV40 replikációs origót SP6 promotorral helyettesítjük, mint ahogyan ezt a 3. ábra mutatja. A módosított pcD vektor egy megbénított PstI helyet is tartalmaz az ampicillinrezisztenciagénen belül (a 3. ábrában Pstl-gyel jelöljük) és egy polilinker szakaszt a pcD poliA szakaszának Xhol helyére beépítve. A polilinker szakasz a következő helyeket tartalmazza: EcoRI, SacI, Smal BamHI, Xbal, Sáli, SstI és HindIH. A működésképtelen PstI hely lehetővé teszi, hogy az SV40 őri szakaszt HindlHmal és Pstl-gyel való emésztéssel kihasítsuk (mielőtt a polilinkert beépítjük). Az alkalmas SP6 promotor inszertumot (körülbelül 60 bázishosszú) standard technikák segítségével szintetizálhatjuk a Méltón és mtsai (fent idézve) által ismertetett szekvencia alapján. Az SP6 promotor beépítése után kapott plazmidot szaporítjuk, izoláljuk, majd Xhol-gyel emésztjük. A standard technikákkal szintetizált polilinkert az Xhol helyre építjük be. Ezenkívül kereskedelemben kapható SP6 promotort és polilinker szakaszokat tartalmazó plazmidokat is használhatunk, például a pSP62-PL a NEM Research Products cégtől (Boston, MA, USA) kapható, vagy a pSP18 vagy pSP19 a BR1 Life Technologies cégtől (Gaithersburg, MD, USA) szerezhető be.

A pcD-huIL3-22-l plazmidból Pstl-gyel és BamHIgyel való emésztéssel kihasítjuk a humán IL-3 cDNS-t, melyet izolálunk, majd a Psű/BamHI-gyel emésztett pSP6-tal ligálunk, miáltal létrehozzuk a pSP6-huIL3 plazmidot. A pSP6-huIL3 plazmidot E.coli MC1061 sejtekben elszaporítjuk, izoláljuk és Xbal-gyel linearizáljuk. A petesejtekbe való oltáshoz az RNS-t úgy készítjük, hogy a linearizált pSP6-huEL3-at SP6 RNS-polimeráz (kapható a BRL Life Technologies cégtől) használatával Krieg és mtsai (fent idézve), valamint Méltón és mtsai (fenti idézve) technológiája szerint átírjuk. Az SP6 RNSpolimerázt DNáz-zal (például: RNáz-os DNáz-ból 1 egység/pl, illetve RNáz-mentes DNáz-ból 20 pg/ml) kezeljük, majd Xenopus petesejtekbe injiciáljuk. A Xenopus tenyészetek felülúszóját CSF-aktivitásra vizsgáljuk. Különböző teleptípusokat figyeltünk meg.

II. példa

Szintetikus humán IL-3 gén szerkesztése kazetta mutagenezishez pcD-ben és expressziója COS 7 majomsejtekben

Az ebben a példában szereplő szintetikus gén szerkesztésére és kifejezésére szolgáló technikák a molekuláris biológiában alapvető eljárások. Lásd főként: Sproat és Gait, Nucleic Acids Research, 13,2959-2977 (1985); Feretti és mtsai, Proc. Natl. Acad. Scil, 83, 599-603 (1986); Mullenbach és mtsai, J. Bioi. Chem., 261, 719-722 (1986); Wells és mtsai, Gene, 34, 315323 (1985); Esteli és mtsai, Science, 233, 659-633 (1986). Röviden: A szintetikus IL-3 gént kémiailag szintetizált kettős szálú DNS-fragmentumok sokaságá11

HU 204890 Β ból szereljük össze. A szintetikus gén alapszekvenciáit úgy választjuk meg, hogy az összeszerelt szintetikus gén egy sor egyedi restrikciós helyet tartalmazzon, tekintetbe véve a gént hordozó vektort is.

Az egyedi restrikciós helyek egy sor olyan szegmentumot határoznak meg, amelyek könnyen kihasíthatok és más bázisszekvenciájú szegmentumokkal helyettesíthetők. A szintetikus fragmentumokat vagy közvetlenül vagy más fragmentumokkal való ligálás után építjük be egy megfelelő vektorba, mint amilyen a pcD plazmid. A fent említett szegmentumok a Wells és mtsai (fent idézve) szerinti ^kazettáknak” felelnek meg. A szintetikus fragmentumokat standard technikák használatával szintetizáljuk. Például: Gait „Olegonucleotid Synthesis: A Practical Approach” (IRL Press, Oxford, UK, 1984). Előnyös, ha automata szintetizátort használunk, például az Applied Biosystems, Inc., (Foster City, CA, USA) 380A modelljét. ApcD plazmid és más alkalmas vektorok beszerezhetők a kereskedelemből, például a Pharmacia cégtől. Ami a pcD-t illeti, klónozása megoldható E.coli MCI061 vagy HB101 sejtekben, a kifejezése pedig COS majomsejtekben vagy kínai hörcsög petefészeksejtekben.

Ebben példában egy szintetikus humán IL-3 gén szerkesztését írjuk le, a pcD plazmidba való beépítéshez. Röviden: a pcD vektort úgy szerkesztjük meg, hogy először négy fragmentumot kapcsolunk össze T4 DNS-Iigáz segítségévek a pBR322 ori-t és Amp^r-t tartalmazó pcDVl-ből származó nagy HindlIIZBamHI fragmentumot, az SV40 korai szakasz promotorát és a késői szakasz intronjait tartalmazó pLl HíndHEPstl fragmentumot, valamint az alant leírt szintetikus 11A/B és 12A/B szekvenciákat. Ezután három egymás után kővetkező lépésben - szaporítás, tisztítás és inszertálás - a többi - 13A/B - 18A/B - szintetikus I szekvenciát adjuk hozzá, amíg a teljes szintetikus IL-3 gén nem jelenik meg a pcD vektorban.

A restrikciós endonukleázzal való emésztéseket és a ligázreakciókat standard előírások (például: Maniatis és mtsai: „Molecular CIoning: A Laboratory Manual”, ^z Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) szerint végezzük.

Az alkalikus módszert (Maniatis és mtsai; fent idézve) plazmidok kis méretekben való előállítására használjuk.

A nagy méretekben való előállításhoz egy módosított al- 4 kalikus módszert használunk, amelyben azonos térfogatú izopropillal csapjuk ki a nukleinsavakat a derített h'zátumból. Az RNS eltávolítására hideg 25 mólos ammőnium-acetátos kicsapást használunk, ezután következik cézium-kloriddal az egyensúlyi súrúséggradiens- 5 centrifugálás, majd az etidium-bromiddal való kimutatás.

11A/B szintetikus szekvencia:

A klónozandó szintetikus DNS-ek komplementer szálait (egyenként körülbelül 400 ng-ot) elkeverjük és polínukleotid-kinázzal foszforiláljuk 50 pl reakciótérfogatban. Ezt a DNS-t 1 pg olyan vektor DNS-sel ligáljuk, amelyet a megfelelő restrikciós enzimekkel emésztettünk. A ligálást 50 pl reakciótérfogatban, szobahőmérsékleten végezzük 4-12 órán át. A foszforilálás, restrikciós enzimes emésztések, polimerázreakciók, ligálások és a baktérium-transzfekciók leírását Maniatis és mtsai fent idézett munkája tartalmazza.

Az első lépésben a pcDVl-et szaporítjuk, izoláljuk és Hindül-mal és BamHI-gyel emésztjük. A pBR322 őri és Amp^r régióit tartalmazó fragmentumot gélelektroforézissel, standard technikák segítségével (lásd i Maniatis és mtsai fent idézett munkáját) izoláljuk. A pLl-et szaporítjuk, izoláljuk és HindHI-mal és Pstlgyel emésztjük. Az SV40 korai szakasz promotorát tartalmazó fragmentumot gélelektroforézissel izoláljuk. A két izolált pcDVl és pLl fragmentumot gélei Iektroforézissel izoláljuk. A két izolált pcDVl és pLl fragmentumot ezután a 11A/B és 12A/B szintetikus szekvenciákkal (lásd alább) keverjük el standard T4 DNS-ligázoldatban. A 11A/B és 12A/B szintetikus szekvenciák egymáshoz illeszkednek és így az újonnan készített pcD vektorhoz inszertumot képeznek.

A vektort E.coliban szaporítjuk, majd izoláljuk.

A második lépésben az első lépésben izolált pcD vektort Spel-gyel és Saul-gyel emésztjük. A nagy fragmentumot elválasztjuk és a 13A/B és 14A/B szintetikus szekvenciákkal keverjük el standard T4 DNSIigáz oldatban, amikor is a második lépés szerinti pcD vektor képződik, s ezt E.coli MC1061 sejtekben szaporítjuk, majd izoláljuk.

A harmadik lépésben a második lépésben izolált pcD vektort Miül- gyei és Saul-gyel emésztjük. A nagy fragmentumot elválasztjuk és a 15A/B és 16A/B szintetikus szekvenciákkal keveqük el standard T4 DNS-ligáz oldatban, amikor is a harmadik lépés szerinti pcD vektor képződik, s ezt E.coli MCI061 sejtekben szaporítjuk, majd izoláljuk.

A negyedik lépésben a harmadik lépésben izolált pcD vektort EcoRI-gyel és Saul-gyel emésztjük. A nagy fragmentumot elválasztjuk és a 17/A és a 8A/B szintetikus szekvenciákkal keveq'űk el standard T4DNS-ligáz oldatban. így kapjuk meg a teljes szintetikus IL-3 gént a pcDben. A negyedik lépés szerinti pcD vektort E.coli MC1061 sejtekben elszaporítjuk, majd izoláljuk. A vektorral COS 7 sejteket transzfíciálunk az I. példában leírtak szerint. A tenyészetek felülúszóit learatjuk és a fent leírtak szerint CSF-aktivitásra vizsgáljuk.

AΙ1Α/Β - 18A/B szintetikus szekvenciákat az alábbiakban ismertetjük. Az egyedik restrikciós helyek elhelyezkedését és típusát a szekvenciák felett jelezzük.

' (PstI) Bell

GTGATCAATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCACGTCACTAGTTACTCGGCGGACGGGCAGGACGAGCTGCTCCAACTCCTGGTC

GACGAGGTT

HU 204 890 Β

12A/B szintetikus szekvencia:

NarI

CGCCCCGGACTCCAGGCGCCCATGACCGAGGACCAGGCGGGGCCTGAGGTCCGCGGGTACTGGSpel Saul (BamHI) CAGACAACGCCCTTGAAGACTAGTCCTTAGGG GTCTGTTGCGGGAACTTCTGATCAGGAATCCCCTAG

13A/B szintetikus szekvencia:

Spel

CTAGTTGGGTTAACTGCTCTAACATGATCGATCAAAACCCAATTGACGAGATTGTACTAGCTACTTXbal

AITATAACACACTTAAAGCAGCCACCTTTGCCTCTTTAATATTGTGTGAATITCGTCGGTGGAAACGGAGAACTAGACTTCAACAACCTCAAT

GATCTGAAGTTG

14A/B szintetikus szekvencia:

GGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAATTGGAGTTACCCCTTCTGGTTCTGTAAGACTACCTTXmalH

AATAACCTTCGACGGCCGAACCTGGAGGCATTCAACTTATTGGAAGCTGCCGGCTTGGACCTCCGTAAGTTGMlul (Saul)

AGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAACGCGTCC

TCCCGACAGTTCTCAAATGTCTTGCGCAGGAAT

15A/B szintetikus szekvencia:

Miül

CGCGTCAGCAATTGAGAGCATTCTTAAAAATCTCAGTCGTTAACTCTCGTAAGAATTTTTAGAGCTGCCATGTCTGCCC

GACGGT

16A/B szintetikus szekvencia:

SacII

CTGGCCACCGCGGCACCCACGCGACATACAGACGGGGACCGGTGGCGCCGTGGGTGCGCTGTACCAATCCATATCAAGGACGGTGACTGGATTGGTTAGGTATAGTTCCTGCCACTGACCTAAEcoRI (Saul)

GAATTCCC

CTTAAGGGAAT

17A/B szintetikus szekvencia:

EcoRI

TTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGAAGGCCTCCTTTGACTGCAAGATAGACAAAACCCTTGAGAAT

TTTTGG

HU 204 890 Β

18A/B szintetikus szekvencia:

GCGCAGGCTCAACAGACGACTGAACTCTTACGCGTCCGAGTTGTCTGCTGANhel (Saul)

TTGTCGCTAGCGATCTTTTAGCC AACAGCGATCGCTAGAAAATCGGATT

III. példa

Humán IL-3 műiéin Leié³¹ szerkesztése és kifejezése

A131. pozícióban 3évőHe-tLeu-ra változtatjuk, s így képezzük a humán IL-3 muteintLeu^UI-et. AH. példa szerinti, teljes humán IL-3 gént tartalmazó pcD plazmidot Saul-gyel és Nhel-gyel emésztjük. A nagy fragmentumot izoláljuk és a következő szintetikus szekvenciával kombináljuk standard T4 DNS-Iigáz oldatban:

CTAGCGCTCTTTAGCC

GCGAGAAATCGGATT

A kapott pcD vektort elszaporítjuk E.coli MC1061 sejtekben és izoláljuk. A vektorral COS 7 majomsejteket transzficiálunk a fent leírt eljárások szerint. A sejteket 3-4 napon keresztül inkubáljuk, majd a COS 7 tenyészetek felülúszőit learatjuk és CSF-aktivításra megvizsgáljuk.

IV. példa

Humán IL-3 mutein IIP- szerkesztése és kifejezése A 2. pozícióban lévő Met-et Ile-re cseréljük, s így képezzük a humán IL-3 mutein Ile²-t. A II. példa szerinti teljes humán IL-3 gént tartalmazó pcD plazmidot Narl-gyel és Spel-gyel emésztjük. A nagy fragmentumot izoláljuk és a következő szintetikus szekvenciával kombináljuk standard T4 DNS-ligáz oldatban:

CGCCCATAACCCAGACAACGCCCTTGAAGA

GGGTATTGGGTCTGTTGCGGGAACTTCTGATC

A kapott pcD vektort szaprítjuk E.coli MC1061 sejtekben és izoláljuk. A vektorral COS 7 majomsejteket transzficiálunk a fent elírt eljárások szerint. A sejteket 3-4 napon át inkubáljuk, majd a COS 7 tenyészetek felűlűszóit learatjuk és CSF-aktivitásra vizsgáljuk.

A találmány megvalósítási módozatainak fent leüt példái csak a találmány megvilágítását és szemléltetését szolgálják. Ezek nem részletesek és nem is korlátozzák a találmány oltalmi körét e példák pontos tartalmára.

A bejelentők letétbe helyezték a pcD-huIL3-22-l plazmidot az American Type Culture Collection intézményben (Rockville, MD, USA) ATCC 67318 letéti szám alatt.

Claims (12)

1. Eljárás telepstimuláló faktoraktivitást kifejtő protein előállítására, amely a

X(Pro) - X(Met) - X(Thr) - X(Gln) - X(Thr) 10

W(Thr) - W(Pro) - W(Leu) - W(Lys) - X(Thr) X(Ser) -X(Trp) - X(Val)- X(Asn)- Cys 20

X(Ser) - W(Asn) - W(Met) - W(Be) - W(Asp) W(GIu)-W(IIe) - W(üe) -W(Thr)_W(His)30

W(Leu) - W(Lys) - W(GIn) - W(Pro) - W(Pro) X(Leu)- X(Pro)- X(Leu)- X(Leu) - X(Asp)40

X(Phe) - X(Asn) - X(Asn) - W(Leu) - W(Asn) W(GIy) - W(Glu) - W(Asp) - W(Gln) - W(Asp) 50

W(Ile) - W(Leu)-W(Met)-W(Glu)-W(Asn)W(Asn) - W(Leu) - W(Arg) - W(Arg) - W(Pro) 60

W(Asn) - W(Leu) - W(GIu) - W(Ala) - W(Phe) W(Asn) - W(Arg) - W(Ala) - W(Val) - W(Lys) 30 70

W(Ser) - W(Leu) - W(GIn) - W(Asn) - W(Ala) W(Ser)-W(Ala)- W(Ile) - W(Glu)-W(Ser)80

W(He) -W(Leu)-X(Lys)-X(Asn)-X(Leu)35 X(Leu) - X(Pro) - Cys - X(Leu)-X(Pro)90

X(Leu)- X(Ala)- X(Thr)- X(Ala)-W(Ala)W(Pro) - W(Thr) - W(Arg) - W(His) - W(Pro) 100

40 W(Be) - W(His) - W(üe) - W(Lys) - W(Asp) W(Gly) - W(Asp) - W(Trp) - W(Asn) - W(Glu) 110

W(Phe) - W(Arg) - W(Arg) - W(Lys) - W(Leu) X(Thr)- X(Phe)- X(Tyr)- X(Leu)-X(Lys)45 120

W(Thr) - W(Leu) - W(Glu) - W(Asn) - W(Ala) W(GIn) - W(Ala) - W(Gln) - W(GIn) - X(Thr) 130

X(Thr) - X(Leu) -X(Ser) - X(Leu)-X(Ala)50 X(IIe)-X(Phe) képlettel - a képletben X(Ser): Ser;

55 X(Arg) jelentése Arg, His vagy Lys;

X(Leu) jelentése Leu, Ile, Phe vagy Met;

X(Pro) jelentése Pro vagy Alá;

X(Thr):Thr;

X(AIa) jelentése Alá vagy Pro;

X(Val) jelentése Val, Met vagy Be;

HU 204 890 Β

X(Gly): Gly;

X(Ile) jelentése De, Met, Phe, Val vagy Leu;

X(Phe) jelentése Phe, Met, iyr, He vagy Leu;

X(Tyr) jelentése Tyr vagy Phe;

X(His) jelentése His, Gin vagy Arg;

X(Gln) jelentése Gin, Glu vagy His;

X(Asn) jelentése Asn vagy Asp;

X(Lys) jelentése Lys vagy Arg;

X(Asp) jelentése Asp vagy Asn;

X(Glu) jelentése Glu vagy Gin;

X(Met) jelentése Met, Phe, He, Val vagy Leu;

X(Trp):Tip;

W(Ser): Ser;

W(Arg):Arg;

W(Leu) jelentése Leu, Ile vagy Met;

W(Pro): Pro;

W(Thr): Thr;

W(Ala):Ala;

W(Val): Val;

W(Gly): Gly;

W(Ile) jelentése Ile, Met vagy Leu;

W(Phe): Phe;

W(Tyr): Tyr;

W(His): His;

W(Gln): Gin;

W(Asn): Asn;

W(Lys): Lys;

W(Asp): Asp;

W(Glu): Glu;

W(Met) jelentése Met, He vagy Leu; és

W(Trp):Tipábrázolható glükozilált vagy glükozilálatlan polipeptid, melyben legfeljebb 5 inszerció, legfeljebb 5 deléció és legfeljebb 5 szubsztitúció fordul elő, azzal a megkötéssel, hogy az illető polipeptid 10-32, 47-60, 71-86 és 95-113 számú aminosavakkal meghatározott szakaszain belül összesen legfeljebb 3 szubsztitúció fordulhat elő és a teljes aminosav-szekvenciában az inszerciók, deléciók és szubsztitúciók összege legfeljebb 7 lehet, azzal jellemezve, hogy

i) egy gazdaszervezetben kifejeződésre képes, az illető polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk;

ii) a vektorral transzformáljuk a gazdasejtet;

iii) a gazdasejtet a nukleotidszekvenciának az illető polipeptiddé való kifejeződésére alkalmas körülmények között táptalajon tenyésztjük; és iv) a kifejeződött polipeptidet elválasztjuk a táptalajtól és a gazdasejtektől.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás 5 szubsztitúciót tartalmazó, de a 10-32, 47-60, 71-86 és 95-113 számú aminosavakkal meghatározott szakaszokon bejül összesen legfeljebb 1 szubsztitúciót tartalmazó polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás 2 szubsztitúciót tartalmazó, de a 10-32, 47-60, 71-86 és 95-113 számú aminosavakkal meghatározott szakaszokon belül szubsztitúciótól mentes polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás legfeljebb 2 inszerciót, legfeljebb 2 deléciót és legfeljebb 2 szubsztitúciót tartalmazó, de a 10-32,47-60, 71-86 és 95-113 számú aminosavakkal meghatározott szakaszokon belül szubsztitúciótól, deléciótól és inszerciótól mentes polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás 5 szubsztitúciót tartalmazó, de a 10-32, 47-60, 71-86 és 95-113 számú aminosavakkal meghatározott szakaszokon belül összesen legfeljebb 1 szubsztitúciót tartalmazó polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás 2 szubsztitúciót tartalmazó, de a 10-32, 47-60,71-86 és 95-113 számú aminosavakkal meghatározott szakaszokon belül szubsztitúciótól mentes polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk.

7. A 4. igénypont szerinti eljárás olyan polipeptid előállítására, amelynek képletében

X(Arg) jelentése Arg;

X(Leu) jelentése Leu, He vagy Met;

X(Pro) jelentése Pro;

X(Ala) jelentése Alá;

X(Val) jelentése Val;

X(Ile) jelentése Ile, Met vagy Leu;

X(Phe) jelentése Phe;

X(Tyr) jelentése iyr;

X(His) jelentése His;

X(Gln) jelentése Gin;

X(Asn) jelentése Asn;

X(Lys) jelentése Lys;

X(Asp) jelentése Asp;

X(Glu) jelentése Glu;

X(Met) jelentése Met, Ile vagy Leu;

W(Leu) jelentése Leu;

W(He) jelentése Ile;

W(Met) jelentése Met, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás a

Pro - Met - Thr - Gin - Thr - Thr - Pro - Leu 10

Lys - Thr ~ Ser - Trp-Val-Asn-Cys-Ser 20

Asn - Met - Ile - Asp - Glu - Ile - Ile - Thr 30

His - Leu - Lys - Gin - Pro - Pro - Leu - Pro 15

HU 204890 Β

Leu - Leu - Asp-Phe-Asn-Asn-Leu-Asn Gly-Glu-Asp-Gin-Asp- Ile -Leu-Met50

Glu - Asn - Asn-Leu-Arg-Arg-Pro-Asn 60

Leu - Glu - Alá - Phe - Asn - Arg - Alá - Val 70

Lys - Ser - Leu - Gin - Asn - Alá - Ser - Alá 80

He- Glu-Ser- Ile - Leu - Lys - Asn-LeuLeu - Pro - Cys - Leu - Pro - Leu - Alá - Thr 90

Alá- Ala-Pro - Thr-Arg- His-Pro -He100

His - Ile - Lys - Asp - Gly - Asp - Trp - Asn 110

Glu - Phe - Arg-Arg-Lys-Leu-Thr-Phe 120

Tyr - Leu - Lys - Thr - Leu - Glu - Asn - Alá Gin - Alá - Gin - Gin - Thr - Thr - Leu - Ser130

Leu - Alá - Ile - Phe képlettel ábrázolható glükozilált vagy glükozilálatlan polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk.

9, Az 1. igénypont szerinti eljárás a

Alá - Pro - Met-Thr-Gin-Thr-Thr-Pro 10

Leu - Lys - Thr - Ser - Trp - Val - Asn - Cys 20

Ser-Asn-Met-Ile-Asp-Glu- He - He30

Thr - His - Leu-Lys-Gin-Pro-Pro-Leu 40

Pro - Leu - Leu - Asp - Phe - Asn - Asn - Leu Asn-Gly-Glu-Asp-Gin-Asp- He -Leu50

Met - Glu - Asn - Asn - Leu - Arg - Arg- Pro 60

Asn - Leu - Glu - Alá - Phe - Asn - Arg - Ala5 70

Val - Lys - Ser - Leu - Gin - Asn - Alá - Ser 80

Alá- He-Glu-Ser- He - Leu-Lys-Asn Leu - Leu - Pro - Cys - Leu - Pro - Leu - Alá 10 90

Thr - Alá - Alá - Pro - Thr - Arg - His - Pro100

He -His- He - Lys-Asp-Gly-Asp-Tip110

15 Asn-Glu-Phe-Arg-Arg-Lys-Leu-Thr120

Phe - Tyr - Leu - Lys - Thr - Leu - Glu - Asn Alá - Gin - Alá - Gin - Gin - Thr - Thr - Leu130

20 Ser- Leu-Alá-He-Phe képlettel ábrázolható polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort

25 szerkesztünk.

10. Eljárás hatóanyagként az 1-10. igénypontok bármelyikének tárgyi körében meghatározott proteint tartalmazó gyógyszekészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított

30 hatóanyagot a gyógyszertechnolőgiában szokásos hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal keverünk össze, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás a vérsejtnövekedést és -fejlődést in vitro vagy in vivő stimuláló gyógy35 szeikészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a megadott hatású hatóanyagot alakítjuk gyógyszerkészítménnyé.

12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás40 sál előállított hatóanyagot használunk.