JP2568394B2 - 哺乳動物インターロイキン−４活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸 - Google Patents

哺乳動物インターロイキン−４活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は哺乳動物の免疫系の
タンパク質因子および突然変異タンパク質(ムテイン,mu
tein)因子をコードする核酸に関する。より詳細には、
本発明はＴ細胞増殖因子活性およびＢ細胞増殖因子活性
の両方を示すタンパク質因子および突然変異タンパク質
因子をコードする核酸に関する。また、本明細書中に
は、それらのタンパク質因子についても記載する。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術は一般に供給源からの
遺伝情報をベクター内に組み込み、その後宿主への導入
のようなプロセッシングを行って、新しい環境のもとで
その転移遺伝情報を複製および／または発現させる技術
に関する。通常、遺伝情報は目的のタンパク質産物をコ
ードするメッセンジャーＲＮＡ(mＲＮＡ)から誘導され
る相補ＤＮＡ(cＤＮＡ)の形で存在する。キャリアは往
々にしてプラスミドであり、プラスミドは宿主内での複
製のためにcＤＮＡを組み込れる能力を有し、いくつか
の場合には実際にcＤＮＡの発現を制御し、それにより
宿主内でのコード化産物の合成を導く能力をもってい
る。
【０００３】しばらくの間、哺乳動物の免疫応答は“免
疫ネットワーク"と呼ばれる一連の複雑な細胞相互作用
に基づくことが知られていた。最近の研究は、このネッ
トワークの内部機構への新たな洞察を与えた。多くの免
疫応答が実際にリンパ球、マクロファージ、顆粒球およ
び他の細胞のネットワーク様相互作用を中心に動いてい
ることは確かであるが、今や免疫学者達は一般にこれら
の細胞の相互作用を制御する上で可溶性タンパク質(例
えば、いわゆる“リンフォカイン”や“モノカイン”)
が重要な役割を演じていると考えている。従って、細胞
調節因子の単離、同定および作用機構には多大の関心が
寄せられ、これらの理解は数多くの病気の診断および治
療に画期的な躍進をもたらすであろう。
【０００４】リンフォカインは明らかにいろいろなやり
方で細胞の活動を仲介する。それらは多分化能性造血幹
細胞の増殖、成長および分化を促進して、免疫応答に関
与する種々の細胞系統を構成する膨大な数の前駆細胞へ
と分化させることが知られている。これらの細胞系統
は、リンフォカインを他の作用物質と共に使用する場
合、しばしば異なる方法で応答する。
【０００５】免疫応答にとって特に重要な細胞系統は２
種類のリンパ球:すなわちＢ細胞とＴ細胞であり、Ｂ細
胞は免疫グロブリン(異物を認識し、それと結合してそ
れを除去する能力をもつタンパク質)を生産・分泌する
ことができ、一方種々のサブセットのＴ細胞はリンフォ
カインを分泌し、Ｂ細胞と免疫ネットワークを構成する
他の細胞(他のＴ細胞を含む)を誘発または抑制すること
ができる。
【０００６】その他の重要な細胞系統は肥満細胞(すべ
ての哺乳動物種においてポジティブに同定されたわけで
はない)・・・・体中の毛細管に接近して、特に肺、皮
膚、胃腸管および泌尿生殖器官に高濃度で存在する顆粒
含有結合組織細胞である。肥満細胞はアレルギー関連疾
患(特にアナフィラキシー)において中心的な役割を演
じ、すなわち所定の抗原が肥満細胞表面上の受容体に結
合したあるクラスの免疫グロブリンと交差結合すると
き、肥満細胞は顆粒を放出してアレルギー反応(例えば
アナフィラキシー)を引き起こす媒介物質(例えばヒスタ
ミン、セロトニン、ヘパリン、プロスタグランジンな
ど)を放出する。
【０００７】種々の免疫疾患をより一層理解するための
研究(これは免疫疾患を治療することにつながる)は、一
般に免疫系の細胞をin vitroで維持することが困難で
あるために妨げられている。免疫学者達は、これらの細
胞の培養が種々の増殖因子(例えばリンフォカイン類)を
含むＴ細胞および他の細胞の上清を使用することにより
達成できることを見出した。
【０００８】リンフォカインや免疫反応の他の可溶性媒
介物質のような因子の検出、単離および精製は非常に困
難であり、そしてしばしばそれらを含む上清の性質その
もの、混合物中の諸成分の活性の分散および乗り換え(c
ross−over)、因子の性質を調べるために利用するアッ
セイの感度(またはその欠如)、因子の分子量範囲および
他の特性における類似性、ならびにそれらの自然環境に
おける因子濃度の低さにより複雑になっている。
【０００９】リンフォカインが主に分子クローニングに
よって次第に利用可能になるにつれて、それらの臨床上
の用途を見出すことに関心が高まった。ホルモンとの生
理学的類似性(例えば可溶性因子、増殖媒介物、細胞受
容体を介しての作用)のために、リンフォカインの使用
可能性はホルモンの最近の用途に類推して論じられた:
例えばデクスター(Ｄexter),Ｎature,Ｖol．３２１,p.
１９８(１９８６)を参照されたい。１つの期待は、患者
におけるリンフォカイン レベルが有益な免疫応答(例
えば炎症、アレルギーまたは組織拒絶反応の抑制、ある
いは感染症または悪性増殖に対する刺激もしくは増強)
を引き起こすために直接的または間接的に操作し得ると
いうことである。リンフォカインの他の臨床上の用途に
は、あるヒトのある種の免疫系細胞を有益な作用のため
に同じヒトまたは別のヒトへ終局的に再導入すべく、こ
れらの細胞のin vitro集団を維持・増殖させることが
含まれる。例えば、患者のリンフォカイン活性化キラー
Ｔ細胞の集団を患者の体外で増殖させて、その後高めら
れた抗腫瘍応答を引き起こすために再注入し得るかどう
かを調べる研究が現在進行中である。リンフォカイン、
特に顆粒球−マクロファジコロニー刺激因子(ＧＭ−Ｃ
ＳＦ)のようなコロニー刺激因子およびそれらの活性を
高める因子、の他の臨床上の用途は、例えば腫瘍に対す
る化学療法または放射線療法の前後に、骨髄形成不全の
治療のために、あるいは好中球欠損症候群の治療のため
に、血液細胞の発生を刺激することである:デクスター
(Ｄexter),Ｎature,Ｖol.３２１,p.１９８(１９８６)を
参照されたい。この種の因子はまた、再生不良性貧血や
ある種の白血病の治療に次第に使用されつつある骨髄移
植療法において有用であるだろう。
【００１０】このような臨床用途にとって重要なリンフ
ォカインの２つの性質がある:すなわち個々のリンフォ
カインはしばしば多面作用性(pleiotropic)であり;また
１つのリンフォカインの生物学的作用は一般に少なくと
も１つの他のリンフォカインによって調節(抑制または
増強)しうる。例えば、γ−インターフェロンと相乗的
な腫瘍壊死因子はインターロイキン−１(ＩＬ−１)の生
産を刺激し、且つ好中球の食作用を活性化することがで
きる。活性化マクロファージによって生産されるタンパ
ク質ＩＬ−１は、インターロイキン−２(ＩＬ−２)放出
の誘導による胸腺細胞増殖の刺激、Ｂリンパ球の成熟お
よび増殖の刺激、線維芽細胞増殖因子活性、および肝細
胞による急性期タンパク質(acutephase protein)合成
の誘導を含めた広範囲の生物学的作用を仲介する。ま
た、ＩＬ−１は滑液からのプロスタグランジンおよびコ
ラゲナーゼ放出を刺激し、且つ内因性発熱因子に一致す
ることが報告された:クランプシュミット(Ｋrampschmid
t),Ｊ.Ｌeuk．Ｂiol．,Ｖol．３６,p.３４１〜３５５
(１９８４)を参照されたい。
【００１１】インターロイキン−２(以前はＴ細胞増殖
因子と呼ばれていた)はレクチン活性化または抗原活性
化Ｔ細胞によって生産されるリンフォカインである。Ｉ
Ｌ−２の報告された生物学的活性には、活性化Ｔ細胞ク
ローンの長期in vitro増殖、胸腺細胞の有糸分裂増
強、およびヌードマウス脾細胞培養物における細胞障害
性Ｔ細胞の反応性およびプラーク形成細胞の応答の誘導
が含まれる。さらに、インターフェロン(ＩＦＮ)と同様
に、ＩＬ−２はナチュラルキラー細胞の活性を増大させ
ることが分かり、新生物疾患の治療への使用可能性が示
唆された:ヘネイ(Ｈenney)ら,Ｎature,Ｖol．２９１,p.
３３５〜３３８(１９８１)を参照されたい。このような
治療法においていくつかの成功が報告された:例えばロ
ッゼ(Ｌotze)およびローゼンバーグ(Ｒosenberg),“精
製ヒトインターロイキン−２による腫瘍患者の治療”,
ソーグ(Ｓorg)ら編集,Ｃel lular and Ｍo lecular Ｂ
iologyof Ｌympho kines(アカデミックプレス社,ニュー
ヨーク,１９８５);およびローゼンバーグおよびロッゼ,
“インターロイキン−２およびインターロイキン−２活
性化リンパ球を使用する癌の免疫療法”,Ａnn．Ｒev．
Ｉmmunol．,Ｖol．４,p.６８１〜７０９(１９８６)を参
照されたい。しかしながら、ＩＬ−２の毒性はこれらの
性質を利用するために癌患者に投与しうるＩＬ−２の投
与量を制限した:ソーグら編集の上記文献中のロッゼお
よびローゼンバーグ,p.７１１〜７１９;およびウェルテ
(Ｗelte)ら,p.７５５〜７５９を参照されたい。
【００１２】メットカーフ(Ｍetcalf,Ｄ．),Ｔh e Ｈem
atopoietic Ｃolony Ｓtimulating Ｆactors (エル
セビアー,アムステルダム,１９８４)は哺乳類の免疫応
答に関与するリンフォカインおよび種々の増殖因子に関
する研究の概要を開示している。ヤング(Ｙung,Ｙ．
Ｐ．)ら、Ｊ.Ｉmmunol．Ｖol．１２７,p.７９４(１９８
１)は肥満細胞増殖因子(ＭＣＧＦ)活性を示す約３５kd
のタンパク質の部分精製およびＴ細胞増殖因子(ＴＣＧ
Ｆ)とも呼ばれるインターロイキン−２(ＩＬ−２)から
のその分離を開示している。ナベル(Ｎabel,Ｇ．)ら,Ｎ
ature,Ｖol．２９１,p.３３２(１９８１)は約４５kdの
分子量および約６.５のpＩをもつＭＣＧＦを報告してい
る。クラークルイス(Ｃlark−Ｌewis,Ｉ)およびシュレ
ーダー(Ｓchrader),Ｊ.Ｉmmunol．,Ｖol．１２７,p.１
９４１(１９８１)はリン酸緩衝溶液中で約２９kdおよび
６Ｍグアニジン塩酸塩中で約２３kdの分子量、ならびに
約４〜８のpＩ(ノイラミニダーゼ処理後には約６〜８の
pＩ)をもつ肥満細胞様増殖因子活性を示すタンパク質を
開示している。ネズミＩＬ−２およびインターロイキン
−３(ＩＬ−３)はそれぞれギリス(Ｇillis,Ｓ．)ら,Ｊ.
Ｉmmunol．,Ｖol．１２４,p.１９５４〜１９６２(１９
８０)およびイーレ(Ｉhle,Ｊ.)ら、Ｊ.Ｉmmunol．,Ｖo
l．１２９,p.２４３１〜２４３６(１９８２)によって生
化学的に部分同定され、ＩＬ−２は約３０〜３５kdの見
かけ分子量(恐らくは二量体として)をもち、そしてＩＬ
−３は約２８kdの分子量をもつことが報告された。ヒト
ＩＬ−２は明らかに約１５kdの分子量をもち、ギリス
ら,Ｉmmu．Ｒev．,Ｖol．６３,p.１６７〜２０９(１９
８２)に記載されている。ＩＬ−３とＴ細胞上清のＭＣ
ＧＦ活性との比較はヤング(Ｙung,Ｙ．)およびムーア
(Ｍoore,Ｍ．),Ｃontemp．Ｔop．Ｍol．Ｉ mmunol．,Ｖo
l．１０,p.１４７〜１７９(１９８５)およびレニック
(Ｒennick,Ｄ．)ら,Ｊ.Ｉmmunol．,Ｖol．１３４,p.９
１０〜９１９(１９８５)に報告された。
【００１３】可溶性因子によるＢ細胞の増殖および分化
の調節に関して多数の文献が存在する:例えばハワード
(Ｈoward)およびポール(Ｐaul),Ａnn.Ｒev．Ｉmmuno
l．,Ｖol．１,p.３０７〜３３３(１９８３);ハワード
ら,Ｉmmunol．Ｒev．,１９８４,Ｎo.７８,p.１８５〜２
１０;キシモト(Ｋishimoto)ら、Ｉmmu nol．,Ｒev．,１
９８４,Ｎo.７８,p.９７〜１１８;およびキシモト,Ａn
n．Ｒev．Ｉmmunol．,Ｖol．３,p.１３３〜１５７(１９
８５)を参照されたい。種々の因子を分類するために用
いた命名法には、供給源物質の相違、精製の困難性、お
よびそれらの生物学的活性を定めるのに使用したアッセ
イの相違のために幾分かの混乱が生じた。命名法に関す
るコンセンサスは明らかにいくつかの場合に達成され
た:ポール(Ｐaul),Ｉmmunology Ｔoday,Ｖol．４,p.３
２２(１９８３);およびポール(Ｐaul),Ｍolecular Ｉm
munol．,Ｖol．２１,p.３４３(１９８４)を参照された
い。Ｂ細胞増殖因子(ＢＣＧＦ)活性は、抗ＩgＭまたは
類似の抗原にさらすことにより刺激したＢ細胞において
ＤＮＡ合成を引き起こす能力により特徴づけられる。イ
ンターロイキン−１(ＩＬ−１)もまた、少なくともアッ
セイを低密度のＢ細胞の存在下で行う場合には、ＢＣＧ
Ｆ活性を証明するために必要であると考えられる。ヒト
ＢＣＧＦについての別のアッセイは例えばメイゼル(Ｍa
izel)ら、Ｐroc．Ｎatl． Ａcad．Ｓci．,Ｖol．８０,p.
５０４７〜５０５１(１９８３)(培養下でのヒトＢ細胞
の長期増殖の維持)に記載されている。前者のアッセイ
に関連した活性はまた、類似のおよび／または関連した
活性からそれを区別するために、Ｂ細胞刺激因子−１
(ＢＳＦ−１)活性およびＢＣＧＦ Ｉとして分類され
た。特にＢＣＧＦ ＩＩと呼ばれる活性が明示された。
これはマイトジエン刺激Ｂ細胞または形質転換Ｂ細胞株
においてＤＮＡ合成を誘発する能力によって特徴づけら
れる。ＢＣＧＦ ＩＩと関係したマイトジエンにはデキ
ストラン硫酸、リポ多糖およびスタフィロコッカス・ア
ウレウス(Ｓtaphylococcus)抽出物が含まれる。ＢＣＧ
Ｆ Ｉはこれらのアッセイにおいて何の応答も示さな
い。ヒトの場合に、ＢＣＧＦ ＩＩは約５０キロダルト
ン(ＫＤ)の分子量をもつ分子であり、それは免疫応答に
おいてＢ細胞増殖を促進する際にＢＣＧＦ Ｉ(すなわち
ＢＳＦ−１)と相乗的に作用すると考えられる:ヨシザカ
(Ｙoshizaka)ら,Ｊ.Ｉ mmunol．,Ｖol．１３０,p.１２４
１〜１２４６(１９８３)を参照されたい。ハワードら,
Ｊ. Ｅxp．Ｍed．,Ｖol．１５５,p.９１４〜９２３(１９
８２)は初めてインターロイキン−２と異なるネズミＢ
ＣＧＦ(のちにＢＣＧＦ−１,ＢＳＦ−１,またはＩgＧ1
誘導因子といろいろな名称で呼ばれた)の存在を明らか
にした。同じような観察がヨシザキら,Ｊ.Ｉmmunol．,
Ｖol．１２８,p.１２９６〜１３０１(１９８２)により
ほとんど同時にヒトの系について報告され、その後オカ
ダ(Ｏkada)ら,Ｊ.Ｅxp．Ｍed．,Ｖol．１５７,p.５８３
〜５９０によっても報告された。
【００１４】ＢＣＧＦまたはＢＳＦ−１活性を示す分子
の生化学的および生物学的性状決定はこれらの初期発見
以来たゆまず進行している。メイゼル(Ｍaizel)ら,Ｐro
c．Ｎatl．Ａ cad．Ｓci．,Ｖol．７９,p.５９９８〜６
００２(１９８２)は１２〜１３ＫＤの分子量および約
６.３〜６.６の等電点(pＩ)をもつトリプシン感受性ヒ
トＢＣＧＦを報告した。ファーラー(Ｆarrar)ら,Ｊ.Ｉm
munol．,Ｖol．１３１,p.１８３８〜１８４２(１９８
３)はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１１ＫＤと１５ＫＤの分
子量および６.４〜８.７のpＩをもつ不均一のネズミＢ
ＣＧＦの部分精製を報告した。オハラ(Ｏhara)およびポ
ール(Ｐaul),Ｎature,Ｖol．３１５,p.３３３〜３３６
(１９８５)はネズミＢＳＦ−１に特異的なモノクローナ
ル抗体を開示し、そして１４ＫＤおよび１９〜２０ＫＤ
の分子量および６.７のpＩをもつＢＳＦ−１を示した。
バトラー(Ｂutler)ら,Ｊ.Ｉmmunol．,Ｖol．１３３,p.
２５１〜２５５(１９８４)は１８〜２０ＫＤの分子量お
よび６.７〜６.６のpＩをもつヒト−ＢＣＧＦを報告し
ている。ルビン(Ｒubin)ら,Ｐroc．Ｎatl．Ａca d．Ｓc
i．,Ｖol．８２,p.２９３５〜２９３９(１９８５)は抗
ＩgＭ抗体にさらす前に休止Ｂ細胞とＢＳＦ−１とをプ
レインキュベーションすると細胞容量が増大し、その後
抗ＩgＭ抗体にさらした際にＳ期へ入るのが早まること
を報告している。ビテッタ(Ｖitetta)ら,Ｊ.Ｅxp．Ｍe
d．,Ｖol．１６２,p.１７２６〜１７３１(１９８５)は
ＥＬ−４細胞の血清不含上清の逆相ＨＰＬＣによるネズ
ミＢＳＦ−１の部分精製を開示している。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥは約２０〜２２ＫＤのタンパク質を示した。オハラ
(Ｏhara)ら、Ｊ.Ｉmmunol．,Ｖol．１３５,p.２５１８
〜２５２３(１９８５)はまた類似の方法によるネズミＢ
ＳＦ−１の部分精製を報告し、その因子が約１８〜２
１.７ＫＤのタンパク質であることを示した。サイダー
ス(Ｓideras)ら、Ｅu r．Ｊ.Ｉmmunol．,Ｖol．１５,p.
５８６〜５９３および５９３〜５９８(１９８５)はネズ
ミＩgＧ1誘導因子(すなわちＢＳＦ−１)の部分精製を報
告し、その因子が７.２〜７.４および６.２〜６.４のp
Ｉをもつ約２０ＫＤのタンパク質であることを示した。
スミス(Ｓmith)およびレニック(Ｒennick),Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．,Ｖol．８３,p.１８５７〜１８６１
(１９８６)はＩＬ−２およびＩＬ−３からのＴ細胞増殖
因子活性および肥満細胞増殖因子活性を示す因子の分離
を報告している。その後、ノマ(Ｎoma)ら,Ｎature,Ｖo
l．３１９,p.６４０〜６４６(１９８６)はサイダースら
の因子をコードする核酸をクローニングして、その塩基
配列を決定し、またリー(Ｌee)ら、Ｐroc．Ｎ atl．Ａca
d．Ｓci．,Ｖol．８３,p.２０６１〜２０６５(１９８
６)はスミスとレニックの因子をコードする核酸をクロ
ーニングしてその塩基配列を決定した。比較的最近にな
って、グラブスタイン(Ｇrabstein)ら,Ｊ.Ｅxp．Ｍe
d．,Ｖol．１６３,p.１４０５〜１４１４(１９８６)は
ネズミＢＳＦ−１の精製およびアミノ酸配列決定を報告
している。
【００１５】ミネラス(Ｍilanese)ら、Ｓcience,Ｖol．
２３１,p.１１１８〜１１２２(１９８６)は彼らが暫定
的にＩＬ−４Ａと命名したＢＳＦ−１とは無関係のリン
フォカインを報告した。彼らのＩＬ−４ＡはＴ３−Ｔi
受容体の交差結合後にヘルパーＴ細胞から分離された１
０〜１２ＫＤのタンパク質である。それはＴ１１受容体
との相互作用およびインターロイキン−２(ＩＬ−２)受
容体はその後の誘導により休止リンパ球を刺激する。
【００１６】サンダーソン(Ｓanderson)ら、Ｐroc．Ｎa
tl．Ａcad． Ｓci．,Ｖol．８３,p.４３７〜４４０(１９
８６)は好酸球分化因子がＢ細胞増殖因子ＩＩと明らか
に同じであるという証拠に基づいて、そのＢ細胞分化因
子にインターロイキン−４という名称を与えることを提
案した。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】前述のことから、新し
いフォカインの発見および開発が、免疫系および／また
は造血細胞と直接的または間接的に関係する広い範囲の
変性症状の治療法の開発に寄与することは明らかであ
る。特に、既知のリンフォカインの有効性を増強するリ
ンフォカインの発見および開発は非常に有利であるだろ
う。例えば、腫瘍治療におけるＩＬ−２の用量制限毒性
は相乗作用をもつリンフォカインまたはコファクターの
利用によって減少し、また骨髄移植物の効力はコロニー
刺激因子の活性を増強する因子の使用により増加するで
あろう。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は哺乳動物のイン
ターロイキン−４(ＩＬ−４)に関する。それはＩＬ−４
活性を示すポリペプチドをコードする核酸、およびポリ
ペプチド自体、ならびにそれらの生産方法を包含する。
本発明の核酸は(１)本明細書に記載のクローン化相補Ｄ
ＮＡ(cＤＮＡ)配列に対するそれらの相同性、および
(２)その核酸によってコードされるポリペプチドに適用
されるＩＬ−４活性の機能検定により規定される。本明
細書において使用する場合、タンパク質またはポリペプ
チドに関する“ＩＬ−４活性”なる用語は、そのタンパ
ク質またはポリペプチドがＢ細胞増殖因子(ＢＣＧＦ)活
性およびＴ細胞増殖因子(ＴＣＧＦ)活性の両方を示すこ
とを意味する。所定の哺乳類の場合、ＩＬ−４活性は種
特異的ＴＣＧＦおよびＢＣＧＦ検定により測定される。
以下でより詳細に説明するように、ＩＬ−４の特定態様
は別のアッセイによってさらに同定される。例えば、い
くつかの形のネズミＩＬ−４は肥満細胞増殖因子(ＭＣ
ＧＦ)活性を示し;いくつかの形のヒトおよびネズミＩＬ
−４はともにＩＬ−２のＴＣＧＦ活性を増強し;いくつ
かの形のネズミおよびヒトＩＬ−４はあるタイプの細胞
におけるＧＭ−ＣＳＦ刺激増殖を増強し;いくつかの形
ヒトおよびネズミＩＬ−４はＢ細胞上のＦc−イプシロ
ン受容体発現を誘導することができ;そしていくつかの
形のヒトおよびネズミＩＬ−４はＢ細胞上の主要組織適
合遺伝子複合体(ＭＨＣ)抗原:すなわちヒトＢ細胞上の
クラスＩＩＤＲ抗原およびマウスＢ細胞上のＩa抗原、
の発現を誘導することができる。
【００１９】本発明はその一面がＩＬ−４活性をもつタ
ンパク質を発現し得るcＤＮＡの発見およびクローニン
グに基づいている。本発明のcＤＮＡクローンにはプラ
スミドベクター“クローン４６”(またここではpcＤ−
２Ｆ１−１３やpcＤ−４６と呼ばれる)および“クロー
ン１２５”(またここではpcＤ−１２５と呼ばれる)のヒ
トcＤＮＡ挿入物、ならびにプラスミドベクターpcＤ−
２Ａ−Ｅ３のマウスcＤＮＡ挿入物が含まれる。３種の
ベクターはメリーランド州ロックビルのアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)に受託番号
５３３３７,６７０２９および５３３３０としてそれぞ
れ寄託された。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明は、本発明のcＤＮＡクロ
ーンに事実上相同であり且つＩＬ−４活性を示すヌクレ
オチド配列をもつ核酸を含む。本発明の核酸およびタン
パク質は、核酸配列の標準突然変異誘発技術により上記
cＤＮＡから誘導される。それらはＩＬ−４をコードす
るメッセンジャーＲＮＡ(mＲＮＡ)配列を含むか又はそ
れを含むように誘導し得る免疫系誘導細胞株(例えばＴ
細胞ハイブリドーマ)から新たに作ることができ、それ
らは本発明のcＤＮＡクローンから誘導されるプローブ
を用いてＤＮＡまたはＲＮＡの抽出物もしくはライブラ
リーを検索することにより得られる。
【００２１】本明細書で用いる“事実上相同”なる用語
は、ヌクレオチド配列が本発明のcＤＮＡクローンから
誘導されるハイブリダイゼーションプローブによって検
出され得ることを意味する。ＩＬ−４活性をコードする
核酸を検出するために必要な相同性の正確な数値測定は
(１)標的核酸に関連した非ＩＬ−４コード配列に対する
プローブの相同性、(２)ハイブリダイゼーション条件の
緊縮性、(３)１本鎖プローブを使用するか又は２本鎖プ
ローブを使用するか、(４)ＲＮＡプローブを使用するか
又はＤＮＡプローブを使用するか、(５)その測定がプロ
ーブの非特異的結合を減らすように行われるか、(６)プ
ローブを検出するために用いる標識の性質、(７)プロー
ブ中のグアニンおよびシトシン塩基の割合、(８)プロー
ブと標的との誤対合の分布、(９)プローブの大きさなど
を含めたいくつかの要因により左右される。
【００２２】好ましくは、本発明のcＤＮＡから誘導さ
れる事実上相同なプローブは単離すべき配列と少なくと
も５０％相同である。より好ましくは、事実上相同なプ
ローブは単離すべき配列と少なくとも７５〜８０％相同
である。最も好ましくは、事実上相同なプローブは単離
すべき配列と少なくとも９０％相同である。本明細書で
用いる“相同”なる用語は２つのヌクレオチド(または
アミノ酸)配列間の類似性の尺度である。相同は２つの
配列(恐らく等しくない長さのもの)を整列させた後の対
合塩基(またはアミノ酸)の割合すなわち百分率として表
される。“整列”なる用語はＴime Ｗarps,Ｓtring
Ｅdits,and Ｍacromolecules:Ｔhe Ｔheory and Ｐ
ractice of Ｓequence Ｃompari son(アジソン−ウェ
スレー,リーディング,ＭＡ,１９８３)の第１章にサンコ
フ(Ｓankoff)およびクラスカル(Ｋruskal)によって定義
された意味で使用される。概略的に述べると、２つの配
列は最大オーバーラップをもたらすようにいずれかの配
列に最小限の“ブランク(blank)”または“ナル(nul
l)”塩基を挿入することにより、２つの配列間の対合塩
基(またはアミノ酸)の数を最大にすべく整列される。２
つの配列が与えられると、それらの相同をコンピュータ
で算定するためにアルゴリズムが利用可能である:例え
ばニードルハム(Ｎeedleham)およびヴァンシュ(Ｗunsc
h),Ｊ.Ｍol．Ｂiol．,Ｖol．４８,p.４４３〜４５３(１
９７０)、およびサンコフおよびクラスカルの上記文献
p.２３〜２９を参照されたい。また、このような比較を
行うための商業サービス、例えばインテリジェネティク
ス社(パロアルト,ＣＡ)を利用をすることもできる。
【００２３】本発明はまた免疫応答に必要不可欠な種々
の細胞に対して広範囲の活性スペクトルを示す天然哺乳
類増殖因子(ポリペプチド)に関する。この種の因子の生
産方法および哺乳類のin vitro治療におけるそれらの使
用が提供される。このようなポリペプチドにはＢ細胞、
Ｔ細胞および肥満細胞刺激活性を示すことができる実質
的に純粋な哺乳動物因子が含まれる。
【００２４】最初に種々のＴ細胞の上清から単離された
これらの因子には非還元条件で約２０kdまたは１５kdの
分子量を示す天然ポリペプチド、またはこのようなポリ
ペプチドの活性断片が含まれる。これらの因子は様々な
診断および治療目的(特定抗体の生産を含む)のために単
独でまたは他の化合物と共に使用される。本発明の好適
な態様は下記の式Ｉで表されるグルコシル化または非グ
ルコシル化ヒトＩＬ−４タンパク質および突然変異タン
パク質である:
【００２５】式 Ｉ X(His)−X(Lys)−X(Cys)−X(Asp)−X(Ile)−X(Thr)− X(Leu)−X(Gln)−X(Glu)−X(Ile)−X(Ile)−X(Lys)− X(Thr)−X(Leu)−X(Asn)−X(Ser)−X(Leu)−X(Thr)− X(Glu)−X(Gln)−X(Lys)−X(Thr)−X(Leu)−X(Cys)− X(Thr)−X(Glu)−X(Leu)−X(Thr)−X(Val)−X(Thr)− X(Asp)−X(Ile)−X(Phe)−X(Ala)−X(Ala)−X(Ser)− X(Lys)−X(Asn)−X(Thr)−X(Thr)−X(Glu)−X(Lys)− X(Glu)−X(Thr)−X(Phe)−X(Cys)−X(Arg)−X(Ala)− X(Ala)−X(Thr)−X(Val)−X(Leu)−X(Arg)−X(Gln)− X(Phe)−X(Tyr)−X(Ser)−X(His)−X(His)−X(Glu)− X(Lys)−X(Asp)−X(Thr)−X(Arg)−X(Cys)−X(Leu)− X(Gly)−X(Ala)−X(Thr)−X(Ala)−X(Gln)−X(Gln)− X(Phe)−X(His)−X(Arg)−X(His)−X(Lys)−X(Gln)− X(Leu)−X(Ile)−X(Arg)−X(Phe)−X(Leu)−X(Lys)− X(Arg)−X(Leu)−X(Asp)−X(Arg)−X(Asn)−X(Leu)− X(Trp)−X(Gly)−X(Leu)−X(Ala)−X(Gly)−X(Leu)− X(Asn)−X(Ser)−X(Cys)−X(Pro)−X(Val)−X(Lys)− X(Glu)−X(Ala)−X(Asn)−X(Gln)−X(Ser)−X(Thr)− X(Leu)−X(Glu)−X(Asn)−X(Phe)−X(Leu)−X(Glu)− X(Arg)−X(Leu)−X(Lys)−X(Thr)−X(Ile)−X(Met)− X(Arg)−X(Glu)−X(Lys)−X(Tyr)−X(Ser)−X(Lys)− X(Cys)−X(Ser)−Ｘ（Ｓｅｒ）
【００２６】式中、Ｘ（Ｘaa)はアミノ酸Ｘaaと同義の
アミノ酸群を表す。１つの群に含まれる同義アミノ酸
は、その群のアミノ酸同士を置換してもその分子の生物
学的機能を保存するのに十分なほど類似した物理化学的
性質を持っている:グランサム(Ｇrantham),Ｓcience,Ｖ
ol．１８５,p.８６２〜８６４(１９７４)を参照された
い。また、アミノ酸の挿入および欠失が生物学的機能を
変えることなく上記配列においてなし得ることは明らか
であり、特に挿入または欠失が数個のアミノ酸(例えば
１０個以下)を巻き込むにすぎず、しかも機能的なコン
ホメーションに重要なアミノ酸(例えばシスティン残基)
を除去または置換しない場合に、アミノ酸の挿入および
欠失が可能である:アンフィンセン(Ａnfinsen),“タン
パク質鎖の折りたたみを支配する原理”,Ｓcince,Ｖo
l．１８１,p.２２３〜２３０(１９７３)を参照された
い。このような欠失および／または挿入によって生じる
タンパク質および突然変異タンパク質は本発明の範囲に
含まれる。式Ｉのタンパク質のアミノ酸残基が数字で表
される場合、その数字はいつでもタンパク質のＮ末端か
らのものである。
【００２７】好ましくは、同義アミノ酸群は表１で定義
されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は
表１のそれぞれの列の第２斜線の前に表示されるもので
あり、最も好ましくは同義アミノ酸群は表２のそれぞれ
の列の第１斜線の前に表示されるものである。
【００２８】
【表１】 好適な同義アミノ 酸群 アミノ酸 同義アミノ酸群 Ｓer Ｓer,／Ｔhr,Ｇly,Ａsn Ａrg Ａrg,／Ｈis,Ｌys,／Ｇlu,Ｇln Ｌeu Ｌeu,Ｉle,Ｍet,／Ｐhe,／Ｖal,Ｔyr Ｐro Ｐro,／Ａla,／Ｔhr,Ｇly Ｔhr Ｔhr,／Ｐro,Ｓer,Ａla,Ｇly,Ｈis,Ｇln Ａla Ａla,／Ｐro,／Ｇly,Ｔhr Ｖal Ｖal,／Ｍet,Ｉle,／Ｔhe,Ｐhe,Ｌeu,Ｖal Ｇly Ｇly,／Ａla,Ｔhr,Ｐro,Ｓer Ｉle Ｉle,Ｍet,Ｌeu,／Ｐhe,Ｖal,／Ｉle,Ｔyr Ｐhe Ｐhe,／Ｍet,Ｔyr,Ｉle,Ｌeu,／Ｔrp,Ｖal Ｔyr Ｔyr,／Ｐhe,／Ｔrp,Ｍet,Ｉle,Ｖal,Ｌeu, Ｃys Ｃys,Ｓer,／Ｔhr Ｈis Ｈis,／Ｇln,Ａrg,／Ｌys,Ｇlu,Ｔhr Ｇln Ｇln,／Ｇlu,Ｈis,／Ｌys,Ａsn,Ｔhr,Ａrg Ａsn Ａsn,／Ａsp,／Ｓer,Ｇln Ｌys Ｌys,／Ａrg,／Ｇlu,Ｇln,Ｈis Ａsp Ａsp,／Ａsn,／Ｇlu Ｇlu Ｇlu,／Ｇln,Ａsp,Ｌys,Ａsn,Ｈis,Ａrg Ｍet Ｍet,Ｉle,Ｌeu,／Ｐhe,Ｖal／
【００２９】本発明は１個所または複数の個所にアミノ
酸置換(天然ヒトＩＬ−４のアミノ酸と同義アミノ酸と
の置換)をもつ式Ｉのポリペプチドを包含する。“Ｎ重
置換”なる用語は、天然アミノ酸が少なくともＮ個所で
同義アミノ酸によって置換された式Ｉのポリペプチドの
サブセットを説明するために用いられる。従って、例え
ば式Ｉの１重置換ポリペプチド群は同義アミノ酸の好適
な群の場合に５５９種のポリペプチドから成り、同義ア
ミノ酸のより好適な群の場合に１８９種のポリペプチド
から成り、そして同義アミノ酸の最適な群の場合に５６
種ポリペプチドから成る。これらの数字は天然鎖中のそ
れぞれの種類のアミノ酸の数にそのアミノ酸の同義アミ
ノ酸群の数を掛けたものを合計することによって得られ
た。好ましくは、ヒトＩＬ−４ポリペプチドの群は式Ｉ
の１０重置換ポリペプチドから成り、より好ましくは式
Ｉの３重置換ポリペプチドから成り、そして最も好まし
くは式Ｉの１重置換ポリペプチドから成り、とりわけ図
３に示す配列（配列番号３）をもつ天然ヒトＩＬ−４ポ
リペプチドが含まれる。
【００３０】同様に、式Ｉのペプチドに関する“Ｎ重挿
入”なる用語は、１〜Ｎ個のアミノ酸が式Ｉの配列中に
挿入されたポリペプチドを表すために用いられる。好ま
しくは、挿入アミノ酸は挿入の両側に位置するアミノ酸
の好適な同義アミノ酸群(表１)から選ばれ、より好まし
くはそれらは挿入の両側に位置するアミノ酸のより好適
な同義アミノ酸群(表２)から選ばれ、そして最も好まし
くはそれらは挿入の両側に位置するアミノ酸の最適な同
義アミノ酸群(表３)から選ばれる。従って、例えば１重
挿入ペプチド群の１つのサブグループはＮ末端Ｘ(Ｈis)
と隣接Ｘ(Ｇly)との間に挿入された。１個のアミノ酸を
含む。このサブグループのアミノ酸を規定する挿入は好
ましくはＰro,Ａla,Ｇly,Ｔhr,Ｓer,Ｇln,Ｇlu,Ａrg,Ｈ
isおよびＬysよりなる群から選ばれ、より好ましくはそ
れらはＧly,Ｈis,ＧlnおよびＡrgよりなる群から選ば
れ、そして最も好ましくはそれらＨisおよびＧlyよりな
る群から選ばれる。挿入は式Ｉのどの隣接アミノ酸の間
でも行うことができる。可能な挿入個所は１２８存在
し、しかも同一位置での多重挿入が可能であるので、式
Ｉの２重挿入ペプチドは１６３８４サブグループのペプ
チドをもたらし、それぞれのサブグループの大きさは挿
入の両側に位置するアミノ酸の同義アミノ酸群の大きさ
に関係している。
【００３１】式Ｉのポリペプチドに関する“Ｎ重欠失”
なる用語は、１〜Ｎ個のアミノ酸が式Ｉの配列から欠失
されたペプチド群を表すために用いられる。従って、式
Ｉの１重欠失ポリペプチド群は１２９サブグループのポ
リペプチドから成り、それぞれのポリペプチドは１２８
個のアミノ酸から成る鎖長(１２８−mer)を有する。そ
れぞれのサブグループは好適な、より好適な、および最
適な同義アミノ酸群によって定められるすべての１２８
−merを包含する。かくして、本明細書、特に特許請求
の範囲で用いる“ポリペプチドのアミノ酸配列において
１ないし１０個のアミノ酸が挿入、欠失または置換され
たアミノ酸配列を有し、かつ当該ヒトインターロイキン
−４活性を有するポリペプチド”なる用語は、式Ｉで表
されるアミノ酸配列の基本配列である第１Ｃ図で示され
るアミノ酸配列と比較して、１ないし１０個のアミノ酸
が付加、失欠または置換されたアミノ酸配列を有し、か
つ基本となるポリペプチドの性質や機能を実質的に保持
しているポリペプチドを指称する。これらのポリペプチ
ドは、核酸突然変異誘発法、部位特異的変異誘発法のよ
うな自体常套の手段で調製することが可能なものであ
る。例えば、後に述べるごとく、サイエンス．２２９
巻，１１９３−１２０１頁（１９８５）に概説される核
酸突然変異誘発法を用いることができる。また、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー，１００巻、４６８−５０
０頁（１９８３）、米国特許第４,５１８,５８４号明細
書、ジーン，３４巻，３１５−３２３頁（１９８５）等
に記載の方法に準じて特定の部位の塩基配列を変換した
ＤＮＡを得、これを使用して所望のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを生産することが可能である。
【００３２】本発明の好適な態様はさらに好適な、より
好適な、および最適な同義アミノ酸群のための式Ｉのポ
リペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列
または事実上相同なヌクレオチド配列を含む。より好ま
しくは、上記ヌクレオチド配列は好適な、より好適な、
および最適な同義アミノ酸群のための式Ｉポリペプチド
をコードすることができる。
【００３３】特に、本発明は天然ヒトＩＬ−４(そのア
ミノ酸配列は図３（配列番号３）に示す)、およびそれ
をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。
【００３４】本明細書の全体を通して、アミノ酸、ヌク
レオチド、制限エンドヌクレアーゼなどを示すために標
準的な略号が用いられる:例えばコーン(Ｃohn),“α−
アミノ酸の命名法および略号”, Ｍethods in Ｅnzym
ology,Ｖol．１０６,p.３〜１７(１９８４);ウッド(Ｗo
od)ら, Ｂioche mistry:Ａ Ｐroblems Ａpproach,第２
版,(ベンジャミン,メンロパーク,(１９８１);およびロ
バーツ(Ｒoberts),“制限エンドヌクレアーゼ一覧集”,
Ｍethods in Ｅnzymology,Ｖol．６８,p.２７〜４０
(１９７９)を参照されたい。
【００３５】本発明は医学および／または獣医学疾患を
治療するための免疫調節剤の応用に関連した諸問題に向
けられる。とりわけ、本発明は単独で使用するとき有益
な効力をもつ化合物、または他のリンフォカインおよび
免疫系媒介物と協力して有益な効力を生ずることができ
る化合物を提供する。
【００３６】本発明の好適な態様は今や添付の図面(図
１〜４０)を参照することにより説明されるであろう。
【００３７】図１はネズミＩＬ−４を発現するベクター
pcＤ−２Ａ−Ｅ３の挿入物のヌクレオチド配列および推
定上のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【００３８】図２はヒトＩＬ−４を発現するベクターpc
Ｄ−１２５の挿入物のヌクレオチド配列および推定上の
アミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【００３９】図３はpcＤ−１２５でトランスフェクショ
ンされたＣＯＳ７サル細胞により発現・分泌された精製
天然ヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を示す（配列番号
３）。
【００４０】図４はベクターpcＤ−２Ａ−Ｅ３の地図で
あり、その挿入物はネズミＩＬ−４をコードする。
【００４１】図５はベクターpcＤ−２Ａ−Ｅ３の挿入物
の制限エンドヌクレアーゼ切断地図である。
【００４２】図６はベクターpcＤ−４６の地図であり、
その挿入物はヒトＩＬ−４をコードする。
【００４３】図７はベクターpcＤ−４６の挿入物の制限
エンドヌクレアーゼ切断地図である。
【００４４】図８はpcＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェク
ションされたＣＯＳ７細胞からの１つの(曲線１)を含む
種々の培養上清の(希釈範囲にわたる)相対的なＴＣＧＦ
活性を示す。
【００４５】図９はpcＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェク
ションされたＣＯＳ７細胞からの１つの(曲線１)を含む
種々の培養上清の(希釈範囲にわたる)相対的なＭＣＧＦ
活性を示す。
【００４６】図１０はpcＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェ
クションされたＣＯＳ７細胞(曲線１)、Ｃ１．Ｌy１+ 2
-／９細胞(曲線２)、および疑似トランスフェクション
されたＣＯＳ７細胞(曲線３)からの表示量の上清によっ
て生じたＩa誘導の相対度を示す。
【００４７】図１１はpcＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェ
クションされたＣＯＳ７細胞およびＴ細胞を除いたマウ
ス脾細胞の種々の対照からの上清によるＩgＥおよびＩg
Ｇ1誘導の度合を示す。
【００４８】図１２は因子依存性ヒトヘルパーＴ細胞株
ＪＬ−ＥＢＶに対する比色定量増殖検定により測定され
た。数種のpcＤ−１２５トランスフェクション上清およ
び対照のＴＣＧＦ活性を示す。
【００４９】図１３はＰＨＡ刺激末梢血リンパ球に対す
る比色定量増殖検定により測定された、pcＤ−１２５ト
ランスフェクション上清および対照のＴＣＧＦ活性を示
す。
【００５０】図１４はＰＨＡ刺激末梢血リンパ球による
トリチウム化チミジン取り込みにより測定されたpcＤ−
１２５トランスフェクション上清および対照のＴＣＧＦ
活性を示す。
【００５１】図１５はＦc−イプシロン受容体を蛍光標
識した刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞の対照集団についての細胞
相対数対蛍光強度のヒストグラムである。
【００５２】図１６はpcＤ−１２５でトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ７細胞からの０.１％上清より成る培
地にさらした刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団(そのＦc−イプ
シロン受容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対
数対蛍光強度のヒストグラムである。
【００５３】図１７はpcＤ−１２５でトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ７細胞からの１％上清より成る培地に
さらした刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団(そのＦc−イプシロ
ン受容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対数対
蛍光強度のヒストグラムである。
【００５４】図１８はpcＤ−１２５でトランスフェクシ
ョンされたＣＯＳ７細胞からの１０％上清より成る培地
にさらした刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団(そのＦc−イプシ
ロン受容体を蛍光標識したもの)についての細胞相対数
対蛍光強度のヒストグラムである。
【００５５】図１９は天然または突然変異ＩＬ−４を大
腸菌内で発現させるのに有用な合成ヒトＩＬ−４遺伝子
のヌクレオチド配列を示す（配列番号４）。
【００５６】図２０はプラスミドpＵＣ１８に挿入され
た合成ヒトＩＬ−４遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切
断地図を示す。
【００５７】図２１−２６はそれぞれ合成ヒトＩＬ−４
遺伝子を構築するために使用される２本鎖ＤＮＡフラグ
メント１Ａ／Ｂ〜６Ａ／Ｂを示す（配列番号５〜１
６）。
【００５８】図２７は大腸菌発現ベクターＴＡＣ−ＲＢ
Ｓ中のイニシエーターＡＴＧコドンに隣接するヌクレオ
チド配列を示す。その配列はＥcoＲＩ制限部位から始ま
り、ＨindＩＩＩ部位で終わる。１６ＳリボソームＲＮ
Ａの３'末端に相補性を示すリボソーム結合配列(ＲＢ
Ｓ)およびＡＴＧイニシエーターコドンには下線が施さ
れている。
【００５９】図２８は裸リンパ球症候群の患者から誘導
される細胞集団についての細胞相対数対蛍光強度のヒス
トグラムである。これらの細胞は蛍光標識抗ＤＲモノク
ローナル抗体で染色した。
【００６０】図２９はＣ−４カラムでの逆相ＨＰＬＣに
よるヒトＩＬ−４の最終精製工程における２１５nm吸収
プロフィールである。
【００６１】図３０はヒトＩＬ−４cＤＮＡを含むプラ
スミドpＥＢＶ−１７８の作製地図である。
【００６２】図３１はプラスミドＴＲＰＣ１１の作製地
図である。
【００６３】図３２はプラスミドpＭＦ−アルファ８の
作製地図である。
【００６４】図３３は天然ヒトＩＬ−４および種々のそ
の突然変異タンパク質を発現する酵母培養物からの数種
のトランスフェクション上清のＴＣＧＦ活性を示す。
【００６５】図３４は因子依存性細胞株:ＭＣ／９肥満
細胞(１Ａ)、ＤＸ−２肥満細胞(１Ｂ)、ＮＦＳ−６０細
胞(１Ｃ)およびＨＴ２ Ｔ細胞(１Ｄ)の増殖曲線を示
す。５×１０3個の細胞をいろいろな濃度のＣ１.１上清
(中実の円)ＩＬ−２R (中実の正方形)、ＩＬ−３R (中
空の円)、ＧＭ−ＣＳＦR (中空の三角形)、ＩＦＮ−γR
(中実の三角形)、またはＰ３８８Ｄ１上清(中空のひし
形)の存在下に培養した。ＭＣ／９細胞(１Ａ)はまたい
ろいろな濃度の精製ＩＬ−３(中実の円)、または２００
単位のＩＬ−２R (中実の正方形)、ＧＭ−ＣＳＦR (中
空の三角形)、ＩＦＮ−γR (中実の三角形)またはＰ３
８８Ｄ１上清(中空のひし形)と混合したＩＬ−３R の存
在下で培養した。増殖因子活性は比色定量検定により２
４時間後に測定した。５７０nm(基準６３０nm)での吸光
度はダイナテク・マイクロ・エリサ・リーダーを使って
測定した。
【００６６】図３５はＣ１.１上清のＦＰＬＣカチオン
交換クロマトグラフィーを示す。濃縮上清７ml(タンパ
ク質３５mg)は５０nＭリン酸Ｎa、１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ
７.０中で透析し(７.８mＳ／cm)、同じ緩衝液(緩衝液
Ａ)で平衡化したファーマシア・モノＳカラム(０.５×
５cm)に加えた。緩衝液Ｂ＝Ａ＋１Ｍ ＮaＣl。溶出条
件:流速０.５ml／分;０.５ml／分画;４０分で０〜４０
％Ｂ,１０分で４０〜１００％Ｂ。各分画のアリコート
はＮＦＳ−６０(ＩＬ−３,中実の円)、ＨＴ２(ＴＣＧ
Ｆ,中空の円)およびＭＣ／９(ＭＣＧＦ)細胞に対する増
殖活性について検定した。ＭＣ／９応答は示されていな
い;矢印はＭＣ／９増殖レベルがＣ１.１上清のそれらに
到達した位置を示す。
【００６７】図３６はＩＬ−３を除去したＣ１.１上清
の逆相Ｃ８クロマトグラフィーを示す。モノＳカラムに
３回通過させた０.１％ＴＦＡ中の上清(分画５９〜６
１,図３５)１００μlはファーマシアＣ８逆相カラム
(０.５×２cm)に装填した。緩衝液Ａ＝Ｈ2Ｏ中の０.１
％ＴＦＡ;緩衝液Ｂ＝アセトニトリル中の０.１％ＴＦ
Ａ。溶出条件＝０.５ml／分;０.５ml／分画;４０分で０
〜２５％Ｂ,５０分で２５〜６０％Ｂ,４分で６０〜１０
０％Ｂ。各分画のアリコートはＮＦＳ−６０(ＩＬ−３,
中実の円)、ＨＴ２(ＴＣＧＦ,中空の円)およびＭＣ／９
細胞(ＭＣＧＦ,中実の三角形)に対する増殖活性につい
て検定した。矢印は各分画に飽和レベルのＩＬ−３R を
添加後にＣ１.１上清と類似のＭＣ／９増殖レベルを生
じた、ピークＴＣＧＦ活性を含む分画を示す。
【００６８】図３７はＧＫ１５−１ネズミＴ細胞上清の
逆相Ｃ８クロマトグラフィーを示す。０.１％ＴＦＡ中
の濃縮ＧＫ１５−１上清２mg(０.５ml)はファーマシア
Ｃ８逆相カラムに加え、上記のように溶出した。各分画
のアリコートはＨＴ２細胞(中空の円)に対するＴＣＧＦ
活性について検定した。矢印はネズミＩＬ−２R 同一条
件で溶出した位置を示す。挿入:同一プレートで直接比
較されたＣ１.１(中実の円)およびＩＬ−２R (中実の正
方形)およびＧＫ１５−１上清(中空の円)のＴＣＧＦ活
性の滴定。
【００６９】図３８は逆相カラムからの部分精製因子
(ＲＰ因子)のＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性を示す。増殖
は２４時間の培養期間の経過後の[3Ｈ]−チミジン取り
込みにより測定した。ＭＣ／９肥満細胞およびＨＴ２
Ｔ細胞はいろいろな濃度のＣ１.１上清(中実の円)、Ｉ
Ｌ−３R (中空の円)、ＩＬ−２R (中空の三角形)、ＲＰ
因子(中空の正方形)および２００単位のＩＬ−３R の存
在下でのＲＰ因子の希釈物(中実の正方形)または飽和レ
ベルのＲＰ因子の存在下でのＩＬ−２の希釈物(中実の
三角形)と共に培養した。
【００７０】図３９はＣ１.１上清のクロマトフォーカ
シングを示す。２５nＭビス−トリス、pＨ７.１中の上
清１.５ml(３５mg)はファーマシア・モノＰカラム(０.
５×２０cm)に加え、ポリバッファー７４(１:１０)pＨ
４.０を用いて流速０.５ml／分、１ml／分画で溶出し
た。各分画のアリコートはＮＦＳ−６０(ＩＬ−３,中空
の円)、ＨＴ２(ＴＣＧＦ,中実の円)およびＭＣ／９(Ｍ
ＣＧＦ,図示せず,但しピークＭＣＧＦ活性は矢印で示
す)に対する増殖活性について検定した。ＴＣＧＦピー
ク(分画１２,pＩ＝６.２)は最小ＩＬ−３活性と一致
し、ＭＣＧＦ増殖レベルは矢印で示したところで最も高
い。
【００７１】図４０はＣ１.１上清および分精製ＭＣＧ
Ｆ／ＴＣＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 Ａ) 非分画化上清の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。５０mＭ
ＤＴＴでの先行還元(６０℃で５分間)はＴＣＧＦピー
クをわずかに高分子量(２１kdおよび１６kd)へ移し、こ
れは活性の急激な消失を伴う。 Ｂ) カチオン交換クロマトグラフィーからのピークＭ
ＣＧＦ／ＴＣＧＦ分画(分画５９〜６１,図３６)の非還
元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。５０mＭ ＤＴＴでの先行還元(６
０℃で５分間)はＭＣＧＦおよびＴＣＧＦピークをわず
かに高分子量(２１kdおよび１６kd)へ移し、これは活性
の急激な消失を伴う。矢印は飽和量のＩＬ−３の添加に
よりＭＣＧＦ活性が上清レベルにまで高まる分画のみを
示す:ＩＬ−３(中空の円)、ＴＣＧＦ(中実の円)、ＭＣ
ＧＦ(中空の三角形)。
【００７２】本発明はＩＬ−４活性を示し且つ標準的な
タンパク質工学技術を用いてここに記載のＩＬ−４ポリ
ペプチドから誘導し得るグリコシル化または非グリコシ
ル化哺乳動物ポリペプチドを包含する。本発明はまた本
発明ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、その核
酸配列は本発明のcＤＮＡクローンと事実上相同であ
る。最後に、本発明はここに記載のヌクレオチド配列を
使用する本発明のグリコシル化または非グリコシル化ポ
リペプチドの製法、ならびに本発明のポリペプチドの使
用方法を包含する。
【００７３】本発明のポリペプチドおよび核酸を製造、
使用および同定する技術は以下で一般的に説明される。
その後、一般技術を特定の細胞型、ベクター、試薬など
と共に使用するいくつかの特定実施例が提供される。ま
ず初めに、天然源からのそれらの単離を簡潔に説明する
であろう。
【００７４】これらのポリペプチドは容易に入手しうる
細胞源の上清から見かけ上均一になるまで精製すること
ができ、こうして種々の治療用途または他の用途を可能
にすべく純粋な形で経済的に製造することができる。
【００７５】これらのポリペプチドはＢ細胞−、Ｔ細胞
−および肥満細胞−刺激活性を示すポリペプチドを含む
ことにより特徴づけられる。ある種の天然型ポリペプチ
ドは非還元条件下で約２０kdおよび１５kd、そして還元
条件で約２１kdおよび１６kdのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での
分子量を示す。実質的に純粋な形の本発明のポリペプチ
ドを含む組成物はクロマトフォーカシングで約６.２の
等電点(pＩ)を示す。この増殖因子は極めて低濃度(例え
ば１ng／ml以下)で顕著な活性を示し、非常に効力のあ
る物質である。このポリペプチドはカチオン交換クロマ
トグラフィーまたは逆相カラムからの特定溶出条件を使
用することにより、自然界でＴ細胞によって生産される
タンパク質(例えばＩＬ−２,ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦお
よびＩＦＮ−γ)およびホルモン類から区別することが
できる。
【００７６】ネズミの場合では本発明のいくつかのポリ
ペプチドはＩＬ−３依存性肥満細胞株のようなある種の
細胞を低レベルで増殖させるにすぎないが、第２因子
(例えばＩＬ−３)の存在下ではこの種の細胞(例えば肥
満細胞)の増殖を相乗的に高める。このポリペプチドは
数種のＴ細胞株の増殖を刺激するが、一般に精製ＩＬ−
２よりは増殖の度合が劣る。またこの種のポリペプチド
は休止Ｂ細胞上でのＩa発現を誘導し、またＢＳＦ−１
と同様にＢ細胞によるＩgＧおよびＩgＥ発現を高めるこ
とができる。これらの活性は多数の性化学的分画化にも
かかわらず分画不能である。しかしながら大部分の活性
は還元後、例えばＳＤＳの存在下で破壊される。
【００７７】これらの因子はいろいろな方法で多数の天
然源から得られる１つの適当な源はこのようなポリペプ
チドを生産する多数のＴ細胞株のうちのいずれかであ
る。１つのこのようなＴ細胞株はＣ５７ＧＬ６マウス
[ネーブル(Ｎable)ら、 Ｐroc．Ｎatl．Ａ cad．Ｓci．
ＵＳＡ,７８:１１５７〜１１６１(１９８１)を参照]か
ら誘導され、この細胞株は修飾補充ＤＭＥ[ネーブル
ら、 Ｃell,２３:１９〜２８(１９８２)を参照]中に維
持される。初めにＣ１.Ｌy１+２-／９と呼ばれたこの細
胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に受託番号ＣＲＬ８１７９として寄託された。これらの
ポリペプチドの他の適当な細胞源には、ヒト抹消血リン
パ球およびよく知られたＴ細胞源(例えば扁桃腺、脾臓
など)のいずれかのような、そのポリペプチドに対する
種々の抗体を分泌するほとんど全ての細胞が含まれる。
【００７８】このような細胞源からの上清または、いく
つかの場合には破壊細胞からの液体は、本発明タンパク
質を分離するために多種多様の公知精製法に付される。
好ましくは、精製法は高い純度を確保するために組合せ
て使用される。一般的に、精製はゲル濾過クロマトグラ
フィー、ＳＰカチオン交換クロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィー、官能基特異的クロマトグラフィー
(例えばヘパリンセファロースによるクロマトグラフィ
ー)、または有効なタンパク質の分画化をもたらす他の
慣用分離法を使用するだろう。高圧液体クロマトグラフ
ィー(ＨＰＬＣ)、等電点フォーカシングおよびＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動も使用することができ
る。
【００７９】例えば、適当な細胞株からの上清は初めに
強カチオン交換クロマトグラフィーにより分画化され
る。一般に、本発明のポリペプチドはカラムに結合され
たままであり、一方負荷タンパク質の約９８％は通り抜
ける。残存する結合タンパク質は塩勾配を用いて溶離し
うる。本発明の１つの態様では、塩化ナトリウム勾配が
約０.１９Ｍで本発明ポリペプチドを遊離させた。この
分画化を２回以上(主に残留ＩＬ−３を除くために)繰り
返すと、約９５％以上の純度が得られた。その後、この
物質は順次ヘパリンセファロースおよび逆相(Ｃ４また
はＣ８)クロマトグラフィーで分画化される。後者の場
合に、これらのポリペプチドは４２％アセトニトリルで
溶離した。プールしたこれらの分画は本発明ポリペプチ
ドを極めて高純度で、本質的に均一(銀染色ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上で約２０kdの単一バンド)に含有する。この精
製物質はそれが天然形で存在するときよりも少なくとも
６５０００倍純粋である。
【００８０】これらのポリペプチドは抗体生産用の抗原
として使用され、続いてその抗体は抗イディオタイプ抗
体生産用の抗原として使用される。ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体が慣用方法に従って作られ
る。これらのポリペプチドまたはその断片(一般に断片
は少なくとも約１５個のアミノ酸をもつ)は単独で使用
しうるが、好ましくは免疫系を活性化するアジュバンド
または抗原に結合もしくは架橋される。血清アルブミ
ン、キーホール・リンペット(Ｋeyhole Ｌimpet)、ヘ
モシアニン、グロブリンなどの種々の抗原が使用され
る。アジュバンドをポリペプチドに架橋させるために
は、グルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ
安息香酸のような種々の技法が利用される。アジュバン
ドにはフロインドアジュバンド、水酸化アルミニウムな
どが含まれる。通常の量の抗原は適当な宿主に注射さ
れ、その後１回またはそれ以上の２次免疫注射が２〜４
週間おきに行われる。モノクローナル抗体を使用する場
合、一般にマウスに１次および２次免疫注射を行い、脾
臓を摘出し、その後その脾細胞を慣用技法に従って適当
な融合パートナーと融合させる。例えばガルフレ(Ｇalf
re)ら,Ｎature,２６６:５５０(１９７７);ケネット(Ｋe
nnett)ら、Ｃurrent Ｔopics in Ｍicrobiolog y an
dＩmmunology,８１:７７(１９７８);および米国特許第
４３８１２９２号、同第４３６３７９９号を参照された
い。しかしながら、特殊な目的のために他の哺乳類(例
えば霊長目動物)も使用され、例えばヒトＦc鎖を持つ抗
体を生産するためにヒトが使用される。
【００８１】ポリペプチドはそのポリペプチドの診断に
おいて単独で、または抗体と組合せて使用される。診断
アッセイで使用するために、いずれか一方または両方が
標識されるか、あるいは標識されない。これらのポリペ
プチドまたは抗体を直接または間接に種々の標識(例え
ば酵素、放射性核種、蛍光体、基質、補酵素、磁性粒子
のような粒子など)に結合させることを含めた多くの診
断アッセイが文献中に記載されている。これらのアッセ
イの例として、例えば、米国特許第３８１７８３７号、
同第３８５０７５２号、同第４１７４３８４号、同第４
１７７４３７号および同第４３７４９２５号を参照され
たい。
【００８２】種々のアッセイは任意に均質イムノアッセ
イと不均質イムノアッセイに分けられ、その区分はポリ
ペプチドとその抗体との複合体を特異的結合対の非結合
員子から分離しなければならないかどうかに基づいてい
る。種々のアッセイはＥＩ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、均質
ＥＩＡ、ドット−ブロット、ウエスターンなどと呼ばれ
ている。
【００８３】これらのポリペプチドに対する抗体は、こ
れらのポリペプチドのエピトープ部位と競合するエピト
ープ部位をもつ競合的抗原として役立ちうる抗イディオ
タイプを作るために、抗原として単独で使用される。従
って、これらの抗イディオタイプは腫瘍抑制剤として、
本発明ポリペプチドの代替物として、または本発明ポリ
ペプチドの拮抗物質として使用することができる。
【００８４】これらのポリペプチドは天然源から誘導さ
れる自然界に存在するポリペプチド、ならびに結合特異
性およびＢ細胞または肥満細胞刺激活性のような生理学
的特性を共有する自然界に存在しないポリペプチドの一
群を形成する。種または源の間の小さな差異は、当分野
で習熟した者には明らかなように、精製プロトコルにお
いて何らかの変更を必要とするかもしれない。またこれ
らのポリペプチドはそのアミノ酸配列を決定し、その後
公知技術に従ってポリペプチド断片を合成することがで
きる。例えば、バラニー(Ｂarany)およびメリーフィー
ルド(Ｍerrifield)Ｓolid−Ｐhase Ｐeptide Ｓynthe
sis,“ペプチド、分析・合成・生物学”,特別なヘプチ
ド合成法、パートＡ,Ｖol．２,グロス(Ｇross)およびメ
ーレンホッファー(Ｍerenhofer)編集、アカデミックプ
レス,ニューヨーク,１９８０,p.１〜２８４を参照され
たい。
【００８５】本発明ポリペプチドはいろいろな方法で有
用性を見出せるであろう。例えば、これらのポリペプチ
ドは培養下で又はin vivoでＴ細胞および肥満細胞の増
殖を誘発することができる。先に述べたように、肥満細
胞はヘパリン、ヒスタミン、プロスタグランジンおよび
他の生理学的に重要な物質の大切な供給源である。同様
に、この増殖因子はＢ細胞およびＴ細胞、特に免疫系に
おいて有用なタンパク質(例えばリンフォカインおよび
免疫グロブリン)を分泌することが知られているもの、
を刺激するために使用される。一般に、この増殖因子は
細胞培養物に添加される培地中に混入されるであろう。
その因子の適当な濃度は細胞株の型により変化しうる
が、一般に約０.１μg／ml〜約１mg／ml、より好ましく
は約１μg／ml〜約１０μg／mlで培地中に存在するであ
ろう。本発明増殖因子の使用は、所望の細胞株を維持す
るための支持細胞(feeder cell)の必要性を排除するこ
とができ、その結果その細胞株からの生産物の純度を実
質的に高めることができる。
【００８６】また、本発明のポリペプチドは各種の免疫
不全症を治療するために、あるいは自然の免疫応答を増
強させるために、in vivoでの用途を見出せるであろ
う。例えば、この種のポリペプチドはＢ細胞、Ｔ細胞お
よび肥満細胞の成熟および／または増殖を刺激し、それ
により感染症に対する動物の感受性を低下させることに
より、感染症の治療または防御に役立つであろう。
【００８７】Ｉ．ＩＬ−４ cＤＮＡの de novo調製 cＤＮＡのde novo調製およびクローニング、ならびにc
ＤＮＡライブラリーの構築のために現在では種々の方法
がある。たとえば、最近の総説が下記に示されている。
ドハーティ、“cＤＮＡのクローニングおよび発現”,ゴ
ッテスマン編,分子細胞遺伝学,１０章(ジョン・ワイリ
イ・アンド・サンズ・ニョーヨーク,１９８５);および
ブランディスら,“cＤＮＡライブラリーの調製および特
異的遺伝子配列の検出”,セトロウら編、遺伝子工学,８
巻,２９９−３１６頁(プレナム・プレス,ニョーヨーク,
１９８６)。
【００８８】たとえば、目的活性を示すポリペプチドを
産生する細胞(たとえば形質転換されていないヒトＴ細
胞源)から総mＲＮＡを抽出する(たとえばエス・バーガ
ーら,バイオケミストリー１８:５１４３−５１４９[１
９７９])。二重鎖ＤＮＡはこの総mＲＮＡから、プライ
マー開始により逆転写して(アイ・ベルメ・ビオヘミ・
ビオフィジ・アクタ(Ｂiochem．Ｂiophys．Ａ cta),４７
３巻,１−３８頁[１９７７])、まず各mＲＮＡ配列の相
補体を作成し、次いで第２鎖合成を開始することにより
(エッチ・ランドら,ヌクレイック・アシッヅ・リサ
(Ｎucl eic ＡcidsＲes．),９:２２５１−２２６６[１
９８１])構築される。次いでcＤＮＡを適切なプラスミ
ドまたはバクテリオファージベクターに(エフ・ルージ
ョンら,ヌクレイック・アシッヅ・リサ (Ｎucleic Ａ
cids Ｒes．),２,２３６５−２３７８[１９７５]また
はジー・シエラーら,ディベ・バイオロ(Ｄev．Ｂiol．)
８６,４３８−４４７[１９８１])、相補的ホモポリマー
テイルを介して(エー・エフストラチアジスら,セル,１
０,５７１−５８５[１９７７])または適宜な制限部位を
含むリンカーセグメントにより作られた粘着末端を介し
て(マニアチスら,モレ キュラー・クローニング:実験室
の手引,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー,ニョーヨーク,１９８２)結合させ、次いで適切な宿
主を形質転換することによってクローニングしうる。
(一般的にはエー・エフストラチアジスおよびエル・ビ
ラーコルマロフ,“二重鎖cＤＮＡのクローニング”,ジ
ェイ・セトロウおよびエー・ホレンダー(編者),遺伝子
工学,１巻,プレナム・パブリッシング社,ニョーヨーク,
米国[１９８２]を参照されたい。)
【００８９】目的とするポリペプチドをコードする好ま
しいmＲＮＡ源はそれらの上層液がＢ細胞、Ｔ細胞およ
び／またはマスト細胞に対する刺激活性、あるいは本発
明のポリペプチドに付随する他の活性を含む細胞であ
る。このような系列の１つはマウスＴ細胞系列Ｃ１.Ｌy
１+２-／９(Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ．受理番号ＣＲＬ８１７９)で
ある(ジー・ナーベルら,ネイチャー２９１:３３２−３
３４(１９８１)。一般に、適切なＴ細胞を各種の供給
源、たとえば哺乳動物(たとえばヒト)、脾臓、扁桃腺お
よび末梢血から得ることができる。Ｔ細胞クローン、た
とえば末梢血Ｔリンパ球から単離されたものも使用でき
る(免疫学における研究論文,編者,エッチ・フォン・デ
ーマーおよびブイ・ハーフ;Ｄ章:“ヒトＴ細胞クロー
ン”,８巻,２４３−３３３;エルスフィール・サイエン
ス・パブリッシャーズ,ニョーヨーク,[１９８５])。
【００９０】これらの細胞によりＩＬ−４をコードしう
るmＲＮＡが産生されることは、抽出されたmＲＮＡをゼ
ノプス・レビス(Ｘenopus laevis)の卵母細胞にマイク
ロインジェクションすることにより確認できる。このマ
イクロインジェクション法はのちにより詳細に記述さ
れ、一般的には下記に示されている。コールマンら、
“ゼノプス・レビスの卵母細胞からの蛋白質の排出”セ
ル,１７巻,５１７−５２６頁(１９７９);およびマニア
チスら、分子クローニ ング:実験室の手引き,３５０−３
５２頁(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー,ニューヨーク,１９８２)。
【００９１】目的とするＩＬ−４をコードするmＲＮＡ
が総mＲＮＡのうちのきわめて小さな画分をなす場合
は、目的とするcＤＮＡクローンを検出するためのスク
リーニング法を実質的なものにするために画分濃度を高
める工程が必要になるであろう。この種の方法は当技術
分野で標準的であり、後記の具体的ならびに幾つかの報
文および参考文献に示されている。たとえばマニアチス
ら、２２５〜２２８頁,前掲;サグズら,プロシ・ナショ
ナル・アカデ・サイ (Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．),
７８巻,６６１３−６６１７頁(１９８１);パーネスら、
プロシ・ナショナル・アカデ・サイ (Ｐroc ．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．),７８巻,２２５３−２２５７頁(１９８
１);デイビスら,プロシ・ナショナル・アカデ・サイ
(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．),８１巻,２１９４−２
１９８頁(１９８４)。
【００９２】ＩＬ−４ cＤＮＡをde novo製造するため
の好ましい方法はオカヤマおよびバーグ(モレ・セル・
バイオロ(Ｍol．Ｃell．Ｂiol．),２巻,１６１−１７０
頁(１９８２);および３巻,２８０−２８９頁(１９８３)
により開発された、pcＤ発現系におけるcＤＮＡの機能
的発現に依存し、これはファルマシア(ニュージャージ
ー州,ビスカタウェイ)から入手できる。pcＤ発現ベクタ
ーはＳＶ４０初期プロモーター、後期スプライシングジ
ャンクション、および複製起点を含む。このベクターは
pcＤプラスミドの複製に関するＴ抗原を提供するＣＯＳ
７サル細胞においてcＤＮＡ挿入物の発現を可能にす
る。cＤＮＡライブラリーのスクリーニングにはプラス
ミドＤＮＡのプールをＤＥＡＥ−デキストランの使用に
よりＣＯＳ７細胞へトランスフェクションすることが含
まれる。リンフォカイン(特にＩＬ−４s)は分泌蛋白質
であるので、トランスフェクションした細胞から得た上
層液を数日間インキュベートしたのち生物活性につきア
ッセイすることができる。陽性のプールをさらに分割し
て、トランスフェクション後に生物活性を与える単一c
ＤＮＡクローンを固定する。
【００９３】要約するとオカヤマおよびバーグの発現ベ
クターは下記の構成をもつ。ＳＶ４０初期プロモーター
領域を含むＫpnＬ Ｉ消化pＢＲ３２２プラスミドの突出
鎖に結合したポリデオキシチミジル酸(オリゴdＴ)テイ
ルにポリアデニル化mＲＮＡがアニールしている。すな
わちベクター全体がcＤＮＡ合成のプライマーとして作
用する。cＤＮＡ合成後に３'−ポリデオキシシチジレー
ト(オリゴdＣ)テイルを結合させ、次いでＨindＩＩＩ消
化し、これによりオリゴdＣテイルのうち１個が結合し
たＳＶ４０ ＤＮＡの断片が切り取られる(唯一のでＨin
dＩＩＩ部位において)。ＳＶ４０初期プロモーターは無
傷のまま残り、挿入物の偶発性でＨindＩＩＩ部位が受
ける影響は最小である(ハイブリッドcＤＮＡ／ＲＮＡは
ＨindＩＩＩ消化に対して抵抗性であるため)。別個に構
成された、３'−ポリグアニジル化(オリゴdＧ)テイルを
もつＨindＩＩＩ断片を、ＨindＩＩＩ消化により残され
た粘着末端にアニールする。このベクターを環化し、大
腸菌ＲＮアーゼＨ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡ
リガーゼで処理し、ＲＮＡ鎖をＤＮＡで置換する。これ
らのベクターを大腸菌にクローニングして、cＤＮＡラ
イブラリーを形成する。ＳＶ４０由来の要素はベクター
を真核細胞においても原核細胞、特に哺乳動物細胞、た
とえばＣＯＳ７サル細胞またはチャイニーズ・ハムスタ
ー卵巣(ＣＨＯ)細胞においても発現可能にする。
【００９４】オカヤマ／バーグプラスミドベクターにお
けるcＤＮＡライブラリーが完成すると、cＤＮＡクロー
ンを採取し、ランダムプールを目的のcＤＮＡの存在に
ついて、標準的方法、たとえばハイブリッド選択、発現
生成物における抗原決定因子の検出、および／または機
能アッセイにより調べる。次いで陽性のプールを、誘導
されたＴ細胞系列から得たcＤＮＡでプローブ検出す
る。次いで陽性のプローブ検出プールを個々のクローン
に分け、さらに適切な宿主(たとえば哺乳動物培養細胞)
へトランスフェクションし、宿主上層液を活性につきア
ッセイすることにより試験する。
【００９５】ＩＩ．本発明cＤＮＡから誘導されたハイ
ブリダイゼーションプローブによるＩＬ−４ cＤＮＡ
の調製 ここに開示されたcＤＮＡをプローブとして使用し、Ｉ
Ｌ−４コード化ヌクレオチドの新たな単離およびクロー
ニングの代わりとして異なる細胞型における相同配列を
同定することができる。標準法が用いられる。たとえば
ベルツら,“フィルターハイブリダイゼーション法によ
るマルチジーン ファミリーの単離および相同体の決
定”,メソッズ・イン・エンザイモロジー,１００巻,２
６６−２８５頁(１９８３);およびカラハンら,“マウス
乳腺腫瘍ウイルスゲノムに関連するヒトＤＮＡ配列の検
出およびクローニング”プロシ・ナショナル・アカデ・
サイ．,(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．),７９巻,５５０
３−５５０７頁(１９８２)。基本的には本発明のcＤＮ
Ａを用いて、ＩＬ−４産生が推定される細胞型のゲノム
またはcＤＮＡライブラリー(同様に標準法により構成)
を低いハイブリダイゼーションストリンジェンシーにお
いてスクリーニングするためのプローブを構築する(標
準法による;たとえばマニアチスら,前掲文献を参照され
たい)。標準スクリーニング法を用いる。たとえばグリ
ュンシュタインら,プロシ・ナショナル・アカデ・サ
イ．,(Ｐroc． Ｎatl．Ａcad．Ｓci．),７２巻,３９６１
−３９６５頁(１９７５);またはベントンら,サイエン
ス,１９６巻,１８０−１８３頁(１９７７)。
【００９６】後により詳細に記述するように、ヒトＩＬ
−４をネズミＩＬ−４プローブにより単離した。後述の
分析によりヒトcＤＮＡマウスcＤＮＡの選ばれた領域間
に約７０％の相同性が示された。マウスとヒトの進化の
差を仮定すると、大部分(すべてではなくても)哺乳動物
ＩＬ−４遺伝子を本発明のcＤＮＡ一種または２種以上
から構成されたプローブにより検出しうると考えられ
る。ウイルソンら,“生化学的進化”,アナ・レビ・バイ
オケミ(Ａnn．Ｒev．Ｂiochem．),４６巻,５７３−６３
９頁(１９７７);キムラ,“分子進化の中性理論”,１１
章,ナイおよびケーン編 遺伝子および蛋白質の進化(サ
イナウエル・アソシエーツ,マサチュセッツ州,サンダー
ランド,１９８３)。
【００９７】ＩＩＩ．蛋白質工学による突然 変異体ＩＬ
−４s の調製 天然蛋白質について核酸配列および／またはアミノ酸配
列が求められると、天然配列において実質上いかなる突
然変異をも得るために各種方法を用いることができる。
ショートルはサイエンス,２２９巻,１１９３−１２０１
頁(１９８５)に、本発明に適用できる核酸突然変異誘発
法につき概説している。好ましくは天然ＩＬ−４s の突
然変異体、すなわちＩＬ−４ムテイン(mutein)が部位特
異性オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、たとえば
ゾラーおよびスミス,メソッズ・イン・エンザイモ ロジ
ー,１００巻４６８−５００頁(１９８３);マークら,米
国特許第４,５１８,５８４号明細書,“ヒト組換インタ
ーロイキン−２ムテイン”により,あるいはいわゆる
“カセット”突然変異誘発、ウェルズら,ジーン,３４
巻,３１５−３２３頁(１９８５);およびエステルら,サ
イエンス,２３３巻,６５９−６６３頁(１９８６)により
得られる。以下の節ではエステルら(上記)ガムテインの
識別に用いた表記法に従い、一般化する。たとえば“ヒ
トＩＬ−４ムテインＬeu82”(または天然蛋白質が状況
から理解される場合は簡単に“Ｌeu82”)はそのアミノ
酸配列がＮ末端に関して８２の位置以外は天然蛋白質の
ものと等しいポリペプチドを示す。この位置において、
ＰheがＬeuにより置換されている。２以上の置換も同様
に指示できる。たとえば位置８２のＰheがＬeuにより、
位置１１１のＡsnがＡspにより置換されているムテイン
はヒトＩＬ−４ムテイン(Ｌeu82,Ａsp111)と呼ばれる。
欠失は“△'s”により示される。たとえば位置７１のＧ
lnを欠如するムテインはヒトＩＬ−４ムテイン△71と呼
ばれる。挿入は“ＩＳ(Ｘaa)"により示される。たとえ
ば位置７１のＧlnの後ろにＬeuが挿入されたムテインは
ヒトＩＬ−４ムテインＩＳ71(Ｌeu)と呼ばれる。従って
ヒトＩＬ−４ムテイン(Ｓer13,△71,ＩＳ94(Ｇly))は位
置１３のＴhrをＳerによって交換し、位置７１のＧlnを
欠失させ、かつ位置９４のＡlaの直後にＧlyを挿入する
ことにより修飾された天然ヒトＩＬ−４配列を表す。多
数のアミノ酸を同一部位に挿入したものはＩＳi(Ｘaa1
−Ｘaa2−Ｘaa3−・・・)により示され、ここでＸaa1−
Ｘaa2−Ｘaa3−・・・は位置iの後ろに挿入された配列
である。Ｎ末端追加は上部添字“０”によって示され
(たとえばＩＳ0(Ｘaa))、たとえばアミノ酸６−１０の
欠失は△6-10としてまたは(△6,△7,△8,△9,△10)とし
て示される。
【００９８】きわめて好ましくは、ヒトＩＬ−４ムテイ
ンを与えるカセット突然変異が採用される。後により詳
細に記述するように、遺伝子に沿ってほぼ均一な間隔を
置いた唯一の制限部位の配列を含む合成ヒトＩＬ−４遺
伝子が構築された。制限部位の唯一性は遺伝子が適宜な
ベクターに挿入された際に保持されなければならず、こ
れにより遺伝子の各部分を適宜切除して、目的とするム
テインをコードする合成オリゴヌクレオチド(すなわち
“カセット”)と置換することができる。唯一の制限部
位の数および分布を決定するためには、(１)発現ベクタ
ー中の既存の制限部位、(２)種特異性コドンまたは属特
異性コドンのいずれを使用したいか、ならびに(３)唯一
の制限部位間の各部分の合成および／または配列決定の
簡便さおよび信頼性を含む幾つかの因子を考慮する必要
がある。
【００９９】ＩＶ．ＩＬ−４活性についての生物学的特
性およびアッセイ 本発明のヒトＩＬ−４を生物活性および／または示され
た具体例との相同性に関して定める。本発明のヒトＩＬ
−４s は示された天然ポリペプチドと相同であり、かつ
ＢＣＧＦ活性およびＴＣＧＦ活性の双方を示す蛋白質お
よびムテイン(示された天然ポリペプチドの)を含む。あ
るいは本発明の哺乳動物ＩＬ−４s はそれらの生物活性
(のちにより詳細に定める)によっても定められ、これに
はＢＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性(ここではＩＬ−４活性
と呼ぶ)のほか、ＭＨＣ抗原誘導活性、Ｆcイプシロンレ
セプター誘導活性、ＧＭ−ＣＳＦ刺激顆粒白血球コロニ
ー増殖増強活性、インターロイキン−２ＴＣＧＦ増強活
性、ならびにＩgＧ1−およびＩgＥ−誘導活性よりなる
群から選ばれる少なくとも１種またはそれ以上が含まれ
る。
【０１００】ＩＬ−４s の活性は種特異性であると考え
られる。すなわち、たとえばヒトＩＬ−４はヒトＴ細胞
系列によりアッセイしてＴＣＧＦ活性を示すが、ネズミ
Ｔ細胞系列によりアッセイして活性は示さない。逆にネ
ズミＩＬ−４はネズミＴ細胞系列によりアッセイしてＴ
ＣＧＦ活性を示すが、ヒトＴ細胞系列によりアッセイし
て活性は示さない。
【０１０１】Ａ．ＴＣＧＦ活性 ＴＣＧＦ活性については幾つかの標準アッセイ法が報告
されている。たとえばデボスら,ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ、１１巻,４３０７−４３２３頁(１９８
３);サーマンら,ジェイ・バイオロ・レスポンス・モデ
ィファイヤーズ(Ｊ.Ｂiol．Ｒesponse Ｍodifiers),５
巻,８５−１０７頁(１９８６);およびロバート−グロフ
ら,グロフ編,増殖および成熟因子,９章(ジョン・ワイリ
イ・ニューヨーク,１９８４)。一般にＴＣＧＦ活性はあ
る因子が末梢Ｔリンパ球またはＩＬ−２依存性Ｔ細胞系
列の増殖を促進する効力に基づく。たとえばギリスら,
ジェイ・イムノロ(Ｊ.Ｉmmunol．),１２０巻,２０２７
頁(１９７８)増殖は標準法、たとえばトリチル化チミジ
ンの取込みにより、または比色法により測定できる。モ
スマン,ジェイ・イムノロジ・メソ(Ｊ. Ｉmmunol．Ｍet
h ．),６５巻,５５−６３頁(１９６８)。
【０１０２】たとえばヒトＴＣＧＦ活性は下記の各工程
によりアッセイすることができる。 (１)あらかじめフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)で７日間
刺激したのちＩＬ−２と共に７日間培養され、洗浄され
たヒト末梢血リンパ球(５０μl中に約２×１０5個)をマ
イクロタイターウェルに添加し;(２)ＴＣＧＦ含有材料
の希釈液(５０μl)を各ウェルに添加し;(３)リンパ球を
３７℃で７２時間インキュベートし;(４)トリチル化チ
ミジン(約２０μl,２０μＣi)を各ウェルに添加し;そし
て(５)細胞を濾紙片上に採取し、洗浄し、シンチレーシ
ョンカウンターで計数する。
【０１０３】具体例中により詳細に記述するように、あ
る種のＩＬ−４はＩＬ−２のＴＣＧＦ活性を増強しう
る。ここでこの種の活性に関連して用いられる“増強(p
otentiation)”は、ＩＬ−２により生じる、ＴＣＧＦア
ッセイ系における最高水準の増殖がＩＬ−４の添加によ
って高められることを意味する。
【０１０４】Ｂ．ＢＣＧＦ活性 ＢＣＧＦ活性はハワードら、ジェイ・エクス・メ ディ
(Ｊ.Ｅxp．Ｍe d．),１５５巻,９１４−９２３頁(１９８
２)に示されたアッセイ法により定められる。ＢＣＧＦ
アッセイ法はハワードおよびポール,アナ・レビ・イム
ノロ(Ａn n．Ｒev．Ｉmmuno l．),１巻,３０７−３３３頁
(１９８３)に一般的に概説されている。要約するとＢＣ
ＧＦ活性は精製された休止Ｂ細胞が分裂促進濃度以下の
抗ＩgＭなどの抗原の存在下で増殖を刺激する程度によ
って測定される。たとえばヒトＢＣＧＦ活性のアッセイ
は下記の各工程により行うことができる。
【０１０５】末梢血、脾臓、扁桃腺その他の標準的供給
源から、フィコール／ハイパーク(Ｆicoll／Ｈypaque)
密度勾配遠心分離法(たとえばファルマシア)、および２
−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド処理ヒツジ
赤血球を用いてＴ細胞を除去するロゼット形成サイクル
２回によって、濃縮Ｂ細胞集団を得る。これらのＢ細胞
は表面Ｉg+ 細胞９５％以上を含有し、抗ヒトＢ細胞特
異性モノクローナル抗体Ｂ１(コールターより入手、フ
ロリダ州、ハイアリース)により測定して９５％以上の
細胞がヒトＢ細胞特異性抗原に対し陽性でなければなら
ない。Ｔ細胞の混入は、抗Ｌeu−１モノクローナル抗体
(ベクトン−ディッキンソン、カリフォルニア州、マウ
ンテン・ビュー)またはＯＫＴ １１抗体(オルト・ディ
アグノスティックス、マサチュウセッツ州、ウエストウ
ッド)を用いる染色法により測定して１％以下でなけれ
ばならない。このＢリンパ球の培養物３ml(約５×１０5
個／ml・イッセル培地,イッセルら,ジェイ・イムノロ・
メソ(Ｊ. Ｉmmunol．Ｍeth ．),６５巻,５５−６３頁(１
９８４))をスタフィロコッカス・アウレウス・コーワン
Ｉ(Ｓtaphyl ococcus aureus Ｃowan Ｉ)菌株(ＳＡＣ)
(たとえばＳＡＣの０.０１％溶液,パンソルビン(Ｐanso
rbin)の商品名でカルビオヘミから得られる;またはファ
ルコフ,ジェイ・イムノロ(Ｊ.Ｉmmunol.),１２９, 巻,
９７−１０２頁(１９８２)の記載に従って調製できる)
またはビーズに結合させた抗ＩgＭ抗体(たとえばＢＲ
Ｌ、ガイタースバーズ、ＭＤ)、たとえばバイオーラド
(リッチモンド、ＣＡ)から入手できる５μg／mlのイム
ノビーズ(Ｉmmunobead)によって活性化する。Ｂ細胞を
２４時間(ＳＡＣの場合)または７２時間(抗ＩgＭビーズ
の場合)培養し、次いでフィコール／ハイパーク密度勾
配遠心法により再精製してＳＡＣ粒子、ビーズ、生存し
ていない細胞を除去する。培地５０μl中約５×１０4個
のＢリンパ球を０.２mlの平底マイクロタイターウェル
中で平板培養することによりＢ細胞の増殖を測定する。
ＢＣＧＦ活性をもつと推定される材料の各種希釈液を添
加して最終容積５０μlとなす。４８時間後(抗ＩgＭ培
養)または７２時間後(ＳＡＣ培養)にトリチル化チミジ
ンの取込みを測定する。同様なアッセイ法がムラグチ
ら,ジェイ・イムノロ(Ｊ.Ｉmmunol．),１２９巻,１１０
４−１１０８頁(１９８２);およびヨシザキら,ジェイ・
イムノロ(Ｊ.Ｉmmunol.),１２８巻,１２９６−１３０１
頁(１９８１)にも示されている。
【０１０６】Ｃ．ＭＨＣ抗原誘導 ＩＬ−４が種々の免疫系の細胞、特にＢ細胞においてＭ
ＨＣ抗原(たとえばマウスにおけるＩa)の発現を誘導し
うることが証明されている。レームら,(ジェイ・エクス
・メディ・(Ｊ.Ｅxp．Ｍe d．),１６０巻,６７９−６９
４頁)はＢＣＧＦ活性を示す因子が正常な休止Ｂ細胞に
おいてＭＨＣ抗原の発現をも誘導しうることを証明し
た。ＭＨＣ抗原誘導に関するアッセイ法は、この文献に
示されたネズミＢ細胞についてのアッセイ法を一般化し
たものである。要約すると、免疫系細胞をＩＬ−４に暴
露し、次いで細胞表面における特定のＭＨＣ抗原の発現
を、この抗原に特異的な標識付き抗体によって測定す
る。誘導の程度は、誘導された細胞を対照と比較するこ
とによって判定される。いずれの特定の種についても数
種の抗体を用いることができる。モノクローナル抗ＭＨ
Ｃ抗原抗体を産生するハイブリドーマ数種がＡＴＣＣか
ら入手され、数種が市販されている(たとえばＡＴＣＣ
受託番号ＨＢ１０３,ＨＢ１０９,ＨＢ１１０,またはＨ
Ｂ１５１のハイブリドーマにより産生される抗ＨＬＡ−
ＤＲ;ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ３５のハイブリドーマによ
り産生される抗Ｉ−Ａ b'd;ベクトン・ディッキンソン
(カリフォルニア州、マウンテン・ビュー)から入手され
る抗ＨＬＡ−ＤＲ Ｌ２４３など)。このアッセイ法を
個々の種に適応させるためには、また最も感度の高いＭ
ＨＣ抗原水準の読みを得るのに最適な条件にするために
は、若干のルーテイン実験が必要であろう。ヒトＭＨＣ
抗原誘導アッセイのためには、精製Ｂ細胞を上記によ
り、または同様な方法により調製することができる。あ
るいは脾臓細胞の精製調製物につきＭＨＣ誘導をアッセ
イすることができる。抗体標識付き細胞は好ましくはフ
ローサイトメトリーにより、たとえばベクトン・ディッ
キンソンＦＡＣＳ型機器などにより検出される。
【０１０７】Ｄ．ＭＣＧＦ活性 ＩＬ−４sは一般にＭＣＧＦ活性を示すと考えられてい
る。しかし適切なアッセイ法がないため、ＭＣＧＦ活性
はけっ歯類ＩＬ−４について証明されていたにすぎな
い。ネズミＩＬ−４ ＭＣＧＦアッセイ法は因子依存性
ネズミ肥満細胞または好塩基細胞系列の増殖に基づく。
特にＭＣＧＦ活性はネズミ肥満細胞系列ＭＣ／９を用い
てアッセイすることができる。この細胞系はＡＴＣＣに
受託番号ＣＲＬ ８３０６で寄託され、米国特許第４,
５５９,３１０号明細書、およびナーベルら、セル、２
３巻、１９頁(１９８１)に記載されている。ネズミＭＣ
ＧＦアッセイ法はイーレら、ジ ェイ・イムノロ(Ｊ．Ｉm
munol．)、１２７巻、７９４(１９８１)によっても報告
されている。
【０１０８】好ましくはＭＣＧＦ活性はＭＣ／９細胞を
用いてモスマン(前掲)の比色アッセイ法によって測定さ
れる。要約すると、ＭＣ／９細胞を平底ファルコンマイ
クロタイタートレー(細胞１０4／ウェル)内で、４％ウ
シ胎仔血清、５０μＭ・２−メルカプトエタノール、２
mＭＩグルタミン、非必須アミノ酸、必須ビタミン、お
よび種々の濃度の被験上層液を補充したダルベッコの改
良培地(最終容量０．１ml)中において培養する。リン酸
塩緩衝化食塩液１０μl中５０μgの３−(４,５−ジメチ
ルチアゾール−２−イル)−２,５−ジフェニルテトラゾ
リウムブロミド(シグマ)を、２０時間のインキュベーシ
ョン後に各細胞培養物に添加する。４時間後にイソプロ
パノール中の０.０４Ｍ・ＨＣlを０.１ml添加して、有
色のホルマゲン系反応生成物を可溶化する。５７０nm
(参考６３０nm)における吸光をダイナテック・マイクロ
エリザ・オートリーダー(ＭＲ５８０)またはこれに類す
る機器により測定する。
【０１０９】Ｅ．Ｆc−イプシロンレセ プター誘導 ＩＬ−４がＢ細胞およびＴ細胞、特に抗ＩgＭ抗体また
は同様に抗原により刺激されたヒトＢ細胞においてＦc
−イプシロンの発現を誘導することが見出された。また
ガンマインターフェロンがＢ細胞におけるＩＬ−４誘導
Ｆc−イプシロンの発現を特異的に抑制することも見出
された。
【０１１０】好ましくはＦc−イプシロンレセプター誘
導のアッセイ法は最初はＢＣＧＦアッセイの場合と同様
に行われる。すなわち精製Ｂ細胞を得て、これを次いで
抗ＩgＭ抗体(または同様に抗原)で刺激し、ＩＬ−４に
暴露する。最後にこれらの細胞をＦc−イプシロンレセ
プターにつきアッセイする。
【０１１１】細胞表面のＦc−イプシロンレセプターの
定量については数種のアッセイ法がある。たとえばヨド
イおよびイシザカ、ジェイ・イムノロ(Ｊ．Ｉmmuno
l．)、１２２巻、２５７７−２５８３頁(１９７９); ハ
ダックら、ジェイ・イムノロ・メソ(Ｊ．Ｉmmunol．Ｍe
th．)、８４巻、１１−２４頁(１９８５); およびボン
ネフォイら、ジェイ・イムノロ・メソ(Ｊ．Ｉmmunol．
Ｍeth．)、８８巻、２５−３２頁(１９８６)。特にＦc
−イプシロンレセプターはそのレセプターに特異的な標
識付きモノクローナル抗体を用いたベクトン・ディッキ
ソンＦＡＣＳ−ＩＶなどの機器によるフローサイトメト
リーにより測定することができる。Ｆc−イプシロンレ
セプター特異性モノクローナル抗体は常法により構成す
ることができる。
【０１１２】Ｆ．ＩgＧ 1 −およびＩgＥ誘導 ＩＬ−４はリポ多糖類(ＬＰＳ)活性化したＢ細胞におい
てＩgＥおよびＩgＧ1同基準標本の分泌を誘導する。た
とえばコフマンら、ジェイ・イムノロ(Ｊ．Ｉmm uno
l．)、１３６巻、４５８３−４５４１頁(１９８６); サ
イデラスら、ユーロ・ジェイ・イムノロ(Ｅur．Ｊ．Ｉm
munol．)、１５巻、５８６−５９３頁(１９８５)。これ
らの活性は抗体同基準標本の標準イムノアッセイ法、た
とえばコフマンら、ジェイ・イムノロ(Ｊ．Ｉmmuno
l．)、１３６１巻、９４９−９５４頁(１９８６)に記載
された方法により測定することができる。要約すると、
Ｂ細胞をたとえばサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓal
mo nella typhimurium）ＬＰＳ(シグマより入手)約４μg
／mlまたは大腸菌０５５から抽出したＬＰＳ(サイデラ
スらが報告した方法による、前掲)と共に培養すること
によりＬＰＳ活性化する。４〜８日間培養したのち、上
層液をアッセイ用に採取する。標準的な同基準標本特異
性ＥＬＩＳＡ型アッセイ法を用いて各種同基準標本濃度
を測定することができる。アッセイ用の抗−同基準標本
抗体が市販されており、あるいはＡＴＣＣから入手でき
る。
【０１１３】Ｇ．コロニー刺激因子(Ｃ ＳＦ)活性 ＣＳＦ活性を測定するために造血細胞、たとえば骨髄細
胞または臍帯(fetal cord)血球を単一細胞懸濁液状にし
た。次いで栄養素および通常はウシ胎仔血清を含有する
半固体状の(寒天)または粘稠な(メチルセルロース)培地
中で個々の細胞を“固定化する”。適宜な刺激因子の存
在下で個々の細胞が増殖し、分化するであろう。最初の
細胞は固定化されているので、細胞が増殖し、成熟する
のに伴ってコロニーが発達する。これらのコロニーを７
〜１４日後に採点することができる。エー・バーゲス、
成長因子および幹細胞、５２−５５頁、アカデミック・
プレス ニューヨーク、[１９８４]。(顆粒球およびマ
クロファージの増殖への特異的適用については、ティー
・ブラッドリーおよびディー・メトカーフ、オースト・
ジェイ・エクスペ・バイオロ・メディ・サイ(Ａust．
Ｊ．Ｅxp．Ｂiol．Ｍed．Ｓci．)、４４巻、２８７−３
００頁[１９６６]を、また一般的にはディー・メトカー
フ、造血コロニー、シュプリンゲル・フェアラーク、フ
ェルラーク、ベルリン[１９７７]を参照されたい。)所
望により個々のコロニーを抽出し、顕微鏡用スライドに
乗せ、固定し、ライト／ギームザにより染色することが
できる。(トッド−スタンフォード、実験室的方法によ
る臨床診断、第１５版、編者、デイビッドソンおよびヘ
ンリー[１９７４])。単一コロニーにつき存在する細胞
型の形態学的分析を次いで行うことができる。
【０１１４】非血液学的疾患を伴う患者から採取した骨
髄細胞をフィコール(４００型、シグマ・ケミカル社、
セントルイス、ＭＯ)上に広げ、遠心分離し(２,０００r
pm、２０分)、界面の細胞を取出す。ウシ胎仔血清(ＦＣ
Ｓ)１０％を含有するイスコブ(Ｉscove)の改良ダルベッ
コ培地中でこれらの細胞を２回洗浄し、同培地に再懸濁
し、プラスチック製シャーレに付着させることにより付
着性細胞を除去する。２０％ ＦＣＳ、５０μＭ・２−
メルカプトエタノール、０．９％メチルセルロース、お
よびコロニー刺激活性を含むことが知られている上層液
または被験上層液(種々の濃度)を含有するイスコブの培
地に、非付着性細胞を１０5個／mlにおいて添加する１m
lのアリコートを３５mmのシャーレに広げ、３７℃で空
気中６％ＣＯ2の飽和湿度雰囲気内において培養する。
培養開始の３日後にエリスロポエチン１単位を各プレー
トに添加する。顆粒球−マクロファージコロニーおよび
赤血球バーストを１０〜１４日目に倒立顕微鏡により計
数する。
【０１１５】ヘパリン中に採取した臍帯(coyd)血細胞を
２,０００rpmで６分間遠心分離する。血漿と赤血球のピ
ーク間の界面にある白血球を０.１７Ｍ塩化アンモニウ
ムおよび６％ＦＣＳを含有する試験管に移す。氷上で５
分間保持したのち、懸濁液の下部にＦＣＳ ４mlを積層
し、２,０００rpmで６分間遠心分離する。細胞ペレット
をダンベッコのリン酸塩緩衝化食塩液で洗浄し、先に骨
髄細胞に関して記載したフィコールおよびプラスチック
付着工程を行う。低密度の非付着性細胞を採取し、前記
の半固体培地に１０5個／培地において広げる。
【０１１６】アッセイの終了時に個々のコロニーをガラ
ススライドに施しライト／ギムザで染色したのち細胞組
成を調べる。好酸球はルキソール・ファースト・ブルー
(Ｌuxol Ｆast Ｂlue)で染色することにより測定され
る(ジー・ジョンソンおよびディー・メトカーフ、エク
スペ・ヘマ トロ(Ｅxp．Ｈematol)Ｖol．８、５４９−５
６１頁[１９８０]。
【０１１７】ＧＭ−ＣＳＦ刺激顆粒球の増殖に関してこ
こで用いられる“増強(potentiation)”は上記アッセイ
法において顆粒球コロニーがコロニーの増殖を刺激する
ためにＧＭ−ＣＳＦをＩＬ−４と共に用いた場合の法が
ＧＭ−ＣＳＦを単独で用いた場合よりも大きいことを意
味する。
【０１１８】Ｖ．精製および薬剤組成物 大腸菌、酵母その他の細胞中で発現された本発明のポリ
ペプチドは当技術分野における標準法に従って精製され
る。これには硫酸アンモニウム沈澱法、分画カラムクロ
マトグラフィー(たとえばイオン交換、ゲル濾過、電気
泳動、アフィニティクロマトグラフィーなど)および最
終的な結晶化(一般的に“酵素の精製および関連法”、
メソッズ・イン・エンザイモロジー２２; ２３３−５７
７[１９７７]およびアール・スコープス、蛋白質の精
製: 原理と実際、シュプリンゲル・フェアラーク、ニュ
ーヨーク[１９８２]を参照されたい)が含まれる。精製
されると(部分的に、または均質に)、本発明のポリペプ
チドを研究の目的で、たとえば細胞増殖用培地への補充
として(たとえば最小必須培地 イーグル・イスコブの
改良ダルベッコ培地、またはＲＰＭＩ １６４０; シグ
マ・ケミカル社(ミズーリ州、セントルイス)およびジコ
ブ・ディビジョン(チャグリン・オハイオ州、フォール
ズ)から入手される)、またイムノアッセイ、免疫蛍光染
色などに有用な特異的免疫グロブリンを誘導するための
抗原物質として使用できる(一般的に免疫学的方法、Ｉ
およびＩＩ巻、編者: アイ・レフコビッツおよびビー・
ペルニス、アカデミック・プレス、ニューヨーク州、ニ
ューヨーク、１９７９、１９８１];および実験的免疫学
ハンドブック、編者: ディー・ワイル、ブラックウェル
・サイエンティフィック・パブリケーションズ、ミズー
リ州、セントルイス[１９７９]を参照されたい)。
【０１１９】本発明のポリペプチドは薬剤組成物中に
も、たとえば各種感染に対する天然の防御を強化するた
めに使用できる。たとえば慢性関節リウマチを伴う患
者、移植を要する患者、または癌の化学療法、高齢化、
免疫抑制剤などにより起こる免疫欠損を伴う患者をこれ
らのポリペプチドで処置することができる。これらの組
成物は単独で、または当業者に周知の他の薬剤と組み合
わせて、免疫系の種々の部分を選択的に刺激することが
できる。特にこれらの組成物は本発明のポリペプチドが
もつ増強活性の点からみて他の免疫反応性薬剤、たとえ
ばリンフォカイン(たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２など)、
コロニー刺激因子、免疫グロブリンなどを含有すること
ができる。これらのポリペプチドは細胞増殖または免疫
グロブリン産生の強化を目的とする際の刺激(インビボ
またはインビトロ)にも使用される。
【０１２０】本発明の薬剤組成物はこれらのポリペプチ
ドを好ましくは不活性の、薬剤学的に受容できる担体と
混合することにより調製できる。適切な担体およびそれ
らの調製法は当技術分野で周知である(たとえばレミン
トンの製 剤化学および米国薬局方: 米国処方集、マック
・パブリッシング・カンパニー、ペンシルバニア州、イ
ーストン[１９８４]を参照されたい)。好ましい投与経
路は非経口であり、機械的デリバリーシステムの使用も
含まれる。
【０１２１】好ましくは薬剤組成物は単位用量剤形であ
り、各単位は適宜な量の有効成分を含有する。単位用量
製剤中の有効化合物の量は、個々の用途および有効成分
の効力に応じて１μgから１００mgまで変化または調製
することができる。所望により組成物は他の治療薬を含
有してもよい。
【０１２２】用量は患者の要求条件、処置すべき状態の
程度、および用いられる個々の化合物に基づいて変える
ことができる。ここで用いる“有効量”という語は、用
量を考慮する際にこれらの因子を計算に入れることを意
味する。個々の状況に適した用量を決定することは当業
者が容易になしうる範囲のものである。一般に処置はそ
の化合物の最適用量よりも少ない小用量から開始する。
その後、用量を少量ずつ増し、その状況下で最適な効果
を達成する。便宜的に総一日量を分割して、その日に少
量ずつ投与することもできる。
【０１２３】ＶＩ．発現系 本発明の蛋白質およびムテインを産生させるために広範
な発現系(すなわち宿主−ベクターの組み合わせ)を用い
ることができる。可能な種類の宿主細胞には細菌、酵
母、昆虫、哺乳動物などからの細胞が含まれるが、これ
らに限定されない。特定の蛋白質またはムテインの発現
を最適なものにするのは多くの因子に依存し、これには
以下のものが含まれる。(１)発現すべき蛋白質またはム
テインの性質、たとえば発現産物がある種の宿主系にと
って有毒であるかも知れない、(２)翻訳後修飾が望まし
いか否か、またいかなる型の修飾が望ましいか、たとえ
ば希望するグリコシル化の程度および種類が宿主の選択
に影響を与える可能性がある、(３)目的とする蛋白質ま
たはムテインのコード部位をフランキングする５'およ
び３'領域の性質、たとえば翻訳の制御に関与するプロ
モーターおよび／または配列の選択が効果的発現にとっ
て重要である、(４)一過性の発現または持続的な発現の
いずれかを求めるか、(５)発現産物を宿主細胞および／
または培地の蛋白質および他の物質から分離する際の難
易、(６)一過性に目的の蛋白質またはムテインを発現す
る宿主のトランスフェクションの難易および効率、(７)
目的とする蛋白質またはムテインを発現するために用い
られる細胞培養の規模、(８)目的とする蛋白質またはム
テインが宿主にとって内生の蛋白質断片に融合した形で
発現されるか否か。
【０１２４】一般に本発明のＤＮＡ配列のクローニング
には原核生物が好ましい。原核生物発現系を提供するた
めの一般的ガイドはマニアチスらの分子クローニング:
実験室の手引き(コールド・スブリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、ニューヨーク、１９８２); パーバル、分
子クローニングの実用ガイド(ジョン・ワイリー・アン
ド・サンズ、ニューヨーク、１９８４); クローバー、
ＤＮＡク ローニング: 実際の研究法、ＩおよびＩＩ巻
(ＩＲＬプレス、オクスフオード、１９８５); ならびに
デ・ベールら、“大腸菌における最適な外来遺伝子発現
のための方法”、遺伝子: 構造と発現、クルーン編(ジ
ョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９
８３)により得られる。たとえば大菌Ｋ１２ 株２９４
(ＡＴＣＣ Ｎo．３１４４６)が特に有用である。使用
できる他の微生物株には大腸菌の菌株、たとえば大腸菌
Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ Ｎo．３１５３
７)が含まれる。これらの例はもちろん例示のためのも
のであって限定ではない。
【０１２５】原核生物は発現のためにも使用できる。上
記の菌株のほか、大腸菌Ｗ３１１０(Ｆs-、λ-、原栄養
体、ＡＴＣＣ Ｎo．２７３２５)、杆菌、たとえば枯草
菌(Ｂacillu s subtilis)、および他の腸内細菌、たとえ
ばネズミチフス菌もしくは霊菌(Ｓerratia marcesan
s)、および種々のシュードモナス属菌種も使用できる。
【０１２６】一般に、宿主細胞と適合性の種に由来する
レプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが
これらの宿主の組み合わせて用いられる。ベクターは通
常は複製部位、および形質転換細胞において表現型を選
定しうるマーキング配列を保有する。たとえば大腸菌は
しばしばpＢＲ３２２、すなわち大腸菌の一菌種に由来
するプラスミドを用いて形質転換される(ボリバーラ、
ジーン、２巻、９５頁(１９７７))。pＢＲ３２２はアン
ピシリンおよびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を
含むので、形質転換細胞を識別するための容易な手段を
提供する。pＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プ
ラスミドは微生物が自身の蛋白質の発現のために利用し
うるプロモーターをも含むか、またはこれを含むべく修
飾されなければならない。組換えＤＮＡの構築に最も一
般的に用いられるプロモーターにはβ−ラクタマーゼ
(ペニシリナーゼ)およびラクトーズプロモーター系(チ
ャンら、ネイチャー、２７５巻、６１５頁(１９７８);
イタクラら、サイエンス、１９８巻、１０５６頁(１９
７７); ゲッテルら、ネ イチャー、２８１巻、５４４頁
(１９７９))、およびトリプトファン(trp)プロモーター
系(ゲッテルら、ヌクレイック・アシッズ・リサ(Ｎucle
ic Ａcids Ｒes．)、８巻、４０５７頁(１９８０);
欧州特許出願公開第００３６７７６号明細書)が含まれ
る。これらが最も一般的に用いられるが、他の微生物の
プロモーターも見出されて利用されており、それらがヌ
クレオチド配列に関する詳細は公表され、当業者はこれ
らをプラスミドベクターと機能的にリゲートさせること
ができる(シーベンリストら、セル、２０巻、２６９頁
(１９８０))。
【０１２７】原核微生物、真核微生物のほかに酵母培養
物も使用できる。ビール酵母(Ｓaccharomyces serevis
iae)、または一般のパン酵母が真核微生物のうちでは最
も慣用されるものである。サッカロミセス属において発
現させるために慣用されるプラスミドはＹＲp７である
(スティナヒコームら、ネイチャー、２８２巻、３９頁
(１９７９); キングスマンら、ジーン、７巻、１４１頁
(１９７９); チェンパーら、ジーン、１０巻、１５７頁
(１９８０))。このプラスミドは、トリプトファン中で
増殖する能力を欠如した酵母の突然変異株(たとえばＡ
ＴＣＣ Ｎo．４４０７６のたはＰＥＰ４−１)に対する
選択マーカーを備えたtrp１遺伝子をすでに含んでいる
(ジョーンズら、ジェネティックス、８５巻、１２頁(１
９７７))。そこで、酵母細胞ゲノムの特色としてtrp１
傷害(lesion)が存在することは、トリプトファンの不存
下での増殖により形質転換を検出するために有効な状況
を与える。
【０１２８】酵母ベクターにおける適切なプロモーター
配列には３−ホスホグリセレートキナーゼ(ヒッツェマ
ンら、ジェイ・バイオロ・ケミ(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)、
２５５巻、２０７３頁(１９８０))、あるいは他の解糖
酵母(ヘスら、ジェイ・アドバ・ エンザイム・レギ(Ｊ．
Ａdv．Ｅnzyme Ｒeg．)、７巻、１４９頁(１９６８);
ホランドら、バイ オケミストリー、１７巻、４９００頁
(１９７８))、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸 デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、
ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホ
グリセリン酸ムダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオー
スリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ
およびグルコキナーゼが含まれる。適切な発現プラスミ
ドを構築する際には、これらの遺伝子に付随する終止配
列も、発現ベクターの発現すべき配列の３'位にリゲー
トさせ、mＲＮＡのポリアデニル化および終止を行わせ
る。増殖条件によって転写が制御されるという付加的な
利点をもつ他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、
窒素の代謝に付随する変性酵素、前記のグリセリルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルト
ースおよびガラクトースの利用に関与する酵素に関する
プロモーター領域である(ホランド、前掲)。酵母適合性
プロモーター、複製起点、および終止配列を含むプラス
ミドベクターはいずれも適している。
【０１２９】微生物のほかに、多細胞生物に由来する細
胞培養物も宿主として利用できる。原則として、この種
の細胞培養物は脊椎動物または無脊椎動物のいずれであ
っても有効である。しかし脊椎動物細胞における関心が
きわめて大きく、培養における脊椎動物の増殖(組織培
養)が近年ルーティンな方法となっている[組織培養、ア
カデミック・プレス、クルーズおよびパターソン編者４
(１９７３)]。この種の有用な宿主細胞系の例はＶＥＲ
ＯおよびＨeＬa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(Ｃ
ＨＯ)細胞系、ならびにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ７、
マウス骨髄腫(ＡＴＣＣ Ｎo．ＴＩＢ１９またはＴＩＢ
２０)およびＭＤＣＫ細胞系列である。この種の細胞に
対する発現ベクターには通常は(必要ならば)、発現すべ
き遺伝子の前方に位置する複製起点およびプロモーター
が、必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング
部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター
配列と共に含まれる。
【０１３０】哺乳動物細胞に用いるために、発現ベクタ
ーに対する制御機能がしばしばウイルス材料によって供
給される。たとえば慣用されるプロモーターはポリオー
マ、アデノウイルス２、きわめて頻繁にシミアンウイル
ス４０(ＳＶ４０)に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期
および後期プロモーターは特に有用である。両者とも、
ＳＶ４０ウイルス由来の複製起点をも含む断片としてウ
イルスから容易に得られるからである(フィールズら、
ネイチャー、２７３巻、１１３頁(１９７８)。これより
も小さいかまたは大きいＳＶ４０断片も、ＨindＩＩＩ
部位からウイルス由来の複製起点に位置するＢglＩ部位
へ向かって伸びる約２５０bpの配列を含む限り使用でき
る。さらに、普通は目的とする遺伝子配列に付随するプ
ロモーターまたは制御配列を用いることも、これらの制
御配列が宿主細胞系に適合しうる限り可能であり、しば
しば望ましい。
【０１３１】複製起点は外来起点によってベクターに
(たとえばＳＶ４０または他のウイルス(たとえばポリオ
ーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど)源に由来するもの)
与えられるか、あるいは内的に宿主細胞染色体複製機構
によって与えることができる。ベクターを宿主細胞染色
体に挿入することでしばしば十分である。
【０１３２】t−ＰＡおよびＤＨＦＲ蛋白質双方をコー
ドするＤＮＡ配列を含む本発明のベクターによるトラン
スフェクションのために好ましい宿主細胞を選ぶ際に
は、用いるＤＨＦＲタンパク質の型に従って宿主を選ぶ
ことが適切である。野性型ＤＨＦＲタンパク質を用いる
場合は、ＤＨＦＲを欠如する宿主細胞を選ぶことが好ま
しい。これによりヒポキサンチン、グリシンおよびチミ
ジンを欠如する選択培地においてトランスフェクション
成立のマーカーとしてＤＨＦＲコード配列を使用するこ
とができる。このような適切な宿主細胞はＤＨＦＲ活性
を欠如するチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系
列であり、これはウルラウプおよびチェイシン、プロシ
・ナショナル・アカデ・サイ．、(ユーエスエー)(Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．)(ＵＳＡ)７７巻、４２１６頁
(１９８０)に記載された方法に従って調製され、増殖す
る。
【０１３３】他方、ＭＴＸに対し低い結合親和性をもつ
ＤＨＦＲタンパク質を制御配列として用いる場合、ＤＨ
ＦＲ耐性細胞を用いる必要はない。突然変異ＤＨＦＲは
メトトレキセート耐性であるので、宿主細胞自体がメト
トレキセート感受性である限り、ＭＴＸ含有培地を選択
の手段として用いることができる。ＭＴＸを吸収するこ
とができる。真核細胞は大部分がメトトレキセート感受
性であると思われる。これらの有用な細胞系列の１つ
は、ＣＨＯ系列、ＣＨＯ−Ｋ１ ＡＴＣＣ Ｎo．ＣＣ
Ｌ６１である。
【０１３４】無脊椎動物の発現系にはバキュロウイルス
(baculovirus)ベクター、ＢmＮＰＶを感染させたカイコ
(Ｂomby x mori)の幼虫が含まれる。これについてはマ
エダら、ネイチャー、３１５巻、８９２〜８９４頁(１
９８５)、および細胞工学、４巻、７６７−７７９頁(１
９８５)に記載されている。
【０１３５】
【実施例】以下の実施例は本発明を説明するためのもの
である。ベクターおよび宿主、ならびに試薬濃度、温度
および他の変数の値は本発明の応用を例示するためのも
のにすぎず、本発明の限定と考えるべきではない。材料および方法 細胞系列Ｃl．Ｌyl+２-／９(Ｃl．１と呼ぶ)(ジー・ナ
ーベル、ジェイ・エス・グリーンバーガー、エム・サカ
キーニー、およびエッチ・カント(１９８１)プロシ・ナ
ショナル・アカデ・サイ．、ユーエ スエー(Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)、７８、１１５７−１１６１
頁)、およびＧＫ１５−１(エム・ギードリン提供、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー社 ＤＮＡ
Ｘ研究所; ＤＮＡＸ)を、ＲＰＭＩ １６４０、５０μm
２ＭＥ、１％ ＦＣＳおよび２μg／ml ＣonＡ中に
細胞５×１０5個／mlで２４時間再懸濁した。上層液を
採取し−７０℃に保存した。
【０１３６】クローン化マスト細胞系列、ＭＣ／９(ジ
ー・ナーベル、エス・ジェイ・ガリ、エッチ・エフ・ド
ボラックおよびエッチ・カントー(１９８１)、ネイチャ
ー２９１、３３２−３３４はジー・ナーベル(ダナ・フ
ァルベル癌研究所; ＤＦＣＩ)から得られた。マスト細
胞系列ＭＭ３(アール・コフマンにより提供、ＤＮＡＸ)
およびＤx−２(ディー・レニックにより誘導、ＤＮＡ
Ｘ)は骨髄単球付随マーカーの不在によって、またＩgＥ
レセプターおよび２５０ng／１０6細胞以上の水準のヒ
スタミンの存在によって明らかにされた。骨髄姓ＮＦＳ
−６０細胞はジェイ・レイ(フレデリック癌研究施設;
ＦＣＲＦ)により提供された。ＮＦＳ−６０細胞系列を
サブクローニングしてＩＬ−３依存性クローンを得た。
Ｔ細胞系列ＨＴ２はエス・ストロバー(スタンフォード
大学、カリフォルニア州、パロ・アルト、から得られ;
ＣＴＬＬ−２はダブリュー・ファラル(ＦＣＲＦ)により
供給され; Ｌy２３／４はジー・ナーベル(ＤＦＣＩ)に
より供給された。マスト細胞およびＴ細胞系列は組換え
ＩＬ−３またはＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ１６４０、
１０％ ＦＣＳ、５０μＭ ２ＭＥ中で増殖させた。
【０１３７】数種のＩＬ−３依存性細胞系列のヒスタミ
ン水準をピー・エー・ショア、エー・バークハルターお
よびブイ・エッチ・コン(１９５９)、ジェイ・ファルマ
・エクスペ・テラ(Ｊ．Ｐharm．Ｅ xp．Ｔher．) １２
７、１８２−１８６の方法によりアッセイした。Ｔ細胞
およびマスト細胞発育因子の活性は[3Ｈ]−チミジンの
取り込みにより、または比色アッセイ法により測定され
た(ティー・モスマン、ジェイ・イムノロ ・メソズ(Ｊ．
Ｉmmunol．Ｍethods)、６５: ５５−６３(１９８３)に
記載)。
【０１３８】ＷＥＨＩ３上層液より精製したＩＬ−３は
ジェイ・イーレ(ＦＣＲＦ)から与えられた。組換えＩＬ
−２、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＮＦ−γは、対
応するcＤＮＡクローンをトランスフェクションさせた
ＣＯＳ−７サル腎細胞からの上層液の形で用いられた。
ＩＬ−２、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦの１単位は、因
子依存性細胞系列の最大[3Ｈ]−チミジン取り込みを５
０％刺激した量の因子と定義された(ディー・レニック
ら(１９８５)ジェイ・ イムノロ(Ｊ．Ｉmmunol．）１３
４:９１０−９１９)。１単位のＩＦＮ−γプロモーター
は５０％のマウスＬ細胞を水疱性口内炎ウイルスの細胞
変性作用から保護する。(アール・シュライバーら、(１
９８２)ジェイ・エクスペ・メディ(Ｊ．Ｅxp ．Ｍed．)
１５６: ６７７−６８９)。
【０１３９】Ｂ細胞はマウス脾臓細胞の単一細胞懸濁液
から、Ｔ細胞およびマクロファージを標準法により除去
することによって調製された(エム・ハワードら、ジェ
イ・エクスペ・メディ(Ｊ．Ｅxp．Ｍed．)１５５: ９１
４(１９８２))。ここに記載された精製因子はそれがＢ
細胞におけるＩaの発現を誘発する効力についてサイト
フルオロメトリー分析により、またＢ細胞増殖を刺激す
る効力について抗Ｉg同時刺激(co−stimulation)アッセ
イ法により評価した(エヌ・レームら、ジェイ・エクス
ペ・メディ(Ｊ．Ｅxp ．Ｍed．)１６０: ６７９に記
載)。
【０１４０】タンパク質測定はＵＶ吸収(２８０nmまた
は２２０nm)に基づくか、あるいは色素結合アッセイ法
により作成された標準曲線に基づいてなされた(エム・
ブラッドフォード、(１９７６)アナリ・バイオケミ(Ａn
nal．Ｂiochem．)７２: ２４８−２５４)。上層液をま
ずペリコ・カセットユニット(ミリポア、マサチュセッ
ツ州、ベッドフォード)によって、あるいは(逆相クロマ
トグラフィーの後)スピードバク(セイバント、ニューヨ
ーク州、ファーミングデール)中での溶剤蒸発によって
２０倍に濃縮した。ＳＤＳ ＰＡＧＥはレムリのシステ
ム(ユー・レムリ、(１９７０)ネイチャー２２７: ６８
０−６８５)により１２％分離用を用いて行なわれた。
マーカータンパク質はファルマシア低分子量標品(ファ
ルマシア、スウェーデン、ウプサラ)であった。ゲルは
シー・メリルら(１９８１)サイエンス２１１:１４３７
−１４３８の記載に従って銀染色された。ＭＣＧＦおよ
びＴＣＧＦ活性を分子量の関数として直接に評価するた
めに、５０mＭ、ＤＴＴであらかじめ還元したまたは還
元しない試料を電気泳動し、ゲルを１mmの切片にスライ
スし、破砕し、卵アルブミン(シグマ、ミズーリ州、セ
ントルイス)５mg／mlを補充したアッセイ培地０．５ml
中へ４℃で一夜、タンパク質を溶離させた。
【０１４１】クロマトグラフィーは１８℃で、クラスト
・スペクトロフロー７７３ＵＶ検出器(クラトス、ニュ
ージャージー州、ラムゼー)を備えたファルマシアＦＰ
ＬＣシステムにより行われた。陽イオン交換クロマトグ
ラフィーには５０mＭリン酸ナトリウム、１mＭ、ＥＤＴ
Ａ(pＨ７.０)で平衡化したファルマシア・モノＳカラム
(０.５×５cm)を用いた。同緩衝液中の上層液をこのカ
ラムに施し、ＮaＣl濃度勾酸(１Ｍまで)で溶離した。逆
相クロマトグラフィーにはファルマシアＣ８カラム
(０．５×２cm)を用いた。０.１％ＴＦＡ(pＨ２)で希釈
した試料をカラムに乗せ、０.１％ＴＦＡを含有するア
セトニトリル濃度勾配により溶離した。
【０１４２】ＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性体の等電点は
ファルマシア・モノＰカラム(０.５×２０cm)上でクロ
マトフォーカシング(chromatofocussing)により推定さ
れた。０.０２５Ｍビストリス(pＨ７.１)中の試料を同
緩衝液で平衡化した“モノＰ”カラムに装填した。濃度
勾配溶離はファルマシア・ポリバッファー７４(pＨ４.
０)(１:１０希釈、０.２Ｍアミノジ酢酸でpＨ調整)を用
いて行われた。溶出液のpＨはファルマシアpＨモニター
により連続的に測定された。注入前に試料はすべてミレ
ックスＧＶ０.２μユニット(ミリポア)により濾過され
た。
【０１４３】ＳＤＳ ＰＡＧＥまたはクロマトグラフィ
ー実験で得た画分はそれらが３種類の細胞系列ＮＦＳ−
６０(ＩＬ−３)、ＭＣ／９(ＭＣＧＦ)、およびＨＴ２
(ＴＣＧＦ)の増殖を支持する効力についてアッセイされ
た。
【０１４４】この因子を精製均質化するために、Ｃon−
Ａ活性化したＣl.１上層液８lで２０mＭヘペス緩衝液(p
Ｈ７.０)中へ透析し、次いで緩衝液で平衡化したファル
マシア・モノＳ１０／１０陽イオン交換カラムに導通し
た。ピーク活性は直線的塩濃度勾配により０.２Ｍ・Ｎa
Ｃlにおいて溶出した。この材料をプールし、濃縮し、
２０mＭヘペス緩衝液(pＨ７.０)中へ再透析し、同緩衝
液で平衡化したヘパリン−セファロースカラム上へ装填
した。ピーク活性は２Ｍ・ＮaＣlまでの直線濃度勾配に
より０.４５Ｍ・ＮaＣlで溶出した。この材料をプール
し、０.１０／ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ(pＨ２)で１０倍希釈し、
バイダック逆相カラム(c４)で分画した。アセトニトリ
ルの直線濃度勾配(０.１％、ＴＦＡ)を施すことにより
活性が４２％アセトニトリルにおいて放出された。
【０１４５】実施例Ｉ．Ｃl．Ｌy１ + ２ - ／９細胞からの
ネズミＩＬ−４cＤＮＡのde novo調製およびＣＯＳ７サ
ル細胞における一時的発現 ＩＬ−４をコードするcＤＮＡクローンをネズミヘルパ
ーＴ細胞系列Ｃl．Ｌy１+２-／９から単離した。この細
胞系列はＡＴＣＣに受託番号ＣＲＬ８１７９で寄託さ
れ、ナーベルらによりセル、２３巻、１９−２８頁(１
９８１)、およびプロシ・ナショナル ・アカデ・サ
イ．、(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．)７８巻、１１５
７−１１６０頁(１９８１)に記載されている。ＢＣＧＦ
活性を生じることが知られている他のマウス細胞にはＥ
Ｌ−４系列が含まれ、これはＡＴＣＣから受託番号ＴＩ
Ｂ３９で入手できる。この例に用いた方法はリーら、プ
ロシ・ナショナル ・アカデ・サイ (Ｐroc．Ｎatl．Ａc
ad． Ｓci．)８３巻、２０６１−２０６５頁(１９８６)
に示されている。要約すると、コンカナバリンＡ(Ｃon
Ａ)誘発Ｃl．Ｌy１+２-／９細胞からオカヤマおよびバ
ーグ(前掲)の方法により、pcＤcＤＮＡライブラリーを
構成した。ランダムに選ばれたクローンの大型サブライ
ブラリーから32Ｐ標識cＤＮＡプローブとのハイブリダ
イゼーションによりＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦを除去
した。このサブライブラリーの残りからなるプールおよ
び／または各クローンを、ＣＯＳ７サル細胞の感染およ
びＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性についての培養物上層液
の試験によって、ＩＬ−４につきスクリーニングした。
【０１４６】Ａ．ＩＬ−４産生の誘導 Ｃl．Ｌy１+２-／９細胞を下記に従ってＣonＡにより誘
導し、ＩＬ−４mＲＮＡを産生させた。細胞を５×１０5
／mlにおいて、４％熱不活性化ウシ胎仔血清、５×１０
-5Ｍ・２−メルカプトエタノール(２−ＭＥ)、２mＭ、
グルタミン、非必須アミノ酸、必須ビタミン、およびＣ
onＡ ２μg／mlを含むダルベッコの改良イーグル培地
(ＤＭＥ)中で培養した。３７℃で１０％ＣＯ2中におい
て１２〜１４時間インキュベートした後、細胞懸濁液を
１５００rpmで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを
採取し、直ちに−７０℃で凍結した。
【０１４７】Ｂ．mＲＮＡの単離 ジェイ・チルグウィンら(バイオケミストリー、１８:
５２９４−５２９９[１９７９])のグアニジンイソチオ
シアヌレート法により細胞から総細胞ＤＮＡを分離し
た。ＣonＡ誘導Ｃl．Ｌy１+２-／９細胞からの凍結細胞
ペレット(刺激の１２時間後)をグアニジンイソシアヌレ
ート細胞溶解用溶液に懸濁した。細胞溶解用溶液２０ml
を１.５×１０8個の細胞につき用いた。ペレットをピペ
ッティングにより再懸濁し、次いで１６ゲージの針を用
いて注射器に４回導通することによりＤＮＡを剪断し、
細胞溶解物を４０ml容ポリアロマー(polyallomer)遠心
管中で２０mlの５.７Ｍ・ＣsＣl、１０mＭ・ＥＤＴＡの
上部に積層した。この溶液を２５,０００rpmでベックマ
ンＳＷ２８ローター(ベックマン・インスツルメンツ
社、カリフォルニア州、パロ・アルト)中において１５
℃で４０時間遠心分離した。ＤＮＡを含有するグアニジ
ンイソシアヌレート相をピペットで上から下方の界面に
まで下降させた。管壁および界面をグアニジンイソシア
ヌレート細胞溶解用溶液２〜３mlで洗浄した。試験管を
界面の下方ではさみにより切断し、ＣsＣl溶液をデカン
トした。ＲＮＡペレットを冷７０％エタノールで２回洗
浄した。次いでペレットを１０mＭトリス・ＨＣl(pＨ
７.４)、１mＭ・ＥＤＴＡ、０.０５％ＳＤＳ ５００μ
lに再懸濁した。３Ｍ酢酸ナトリウム５０μlを添加し、
ＲＮＡをエタノール１mlで沈澱させた。総ＲＮＡ約０.
３mgを遠心分離により採取し、ペレットを冷エタノール
で１回洗浄した。
【０１４８】洗浄および乾燥した総ＲＮＡペレットをオ
リゴ(dＴ)溶離緩衝液(１０mＭトリス・ＨＣl(pＨ７.
４)、１mＭ・ＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳ)９００mlに懸濁
した。ＲＮＡを６８℃で３分間加熱し、次いで氷上で冷
却した。１００lの５Ｍ・ＮaＣlを添加した。ＲＮＡ試
料を結合緩衝液(１０mＭトリス・ＨＣl(pＨ７.４)、１m
Ｍ・ＥＤＴＡ、０.５Ｍ・ＮaＣl、０.５％ＳＤＳ)で平
衡化した１.０mlのオリゴ(dＴ)セルロースカラム(タイ
プ３、コラボラティブ・リサーチ、マサチュセッツ州、
ウォルサム)に装填した。カラムからの流出液をさらに
２回カラムに導通した。次いでカラムを結合緩衝液２０
mlで洗浄した。溶離緩衝液で洗浄することによりポリＡ
+mＲＮＡを採取した。ＲＮＡは通常、最初の２mlの溶離
緩衝液中に溶出した。ＲＮＡを０.１容量の３Ｍ酢酸ナ
トリウム(pＨ６)および２倍容量のエタノールで沈澱さ
せた。ＲＮＡペレットを遠心分離によって採取し、冷エ
タノールで２回洗浄し、乾燥させた。次いでペレットを
水に再懸濁した。アリコートを希釈し、２６０nmにおけ
る吸光度を測定した。
【０１４９】Ｃ．pcＤ cＤＮＡライブラリーの構築 １) ベクタープライマーおよびオリゴ(dＧ)テイル付き
リンカーＤＮＡの調製 オカヤマおよびバーグ(モレ・アンド・セル ・バイオロ
(Ｍol＆Ｃell．Ｂiol．)、２巻、１６１−１７０頁[１
９８２])の方法をわずかに変更して用いた。pcＤＶ１お
よびpＬ１プラスミドはオカヤマおよびバーグ(モレ・ア
ンド・セル・バイオロ(Ｍo l＆Ｃell．Ｂiol．)３: ３８
０−３８９[１９８３])により記載されており、ファル
マシア(ニュージャージー州、ピスカタウェイ)から入手
できる。詳細には、先のＫpnＩ部位の位置にＮsiＩ部位
を含む修飾されたpcＤＶ１プラスミドを用いた。
【０１５０】pcＤＶ１ ＤＮＡの試料８０μgを３０℃
で２０ＵのＫpnＩエンドヌクレアーゼにより、６mＭト
リス・ＨＣl(pＨ７.５)、６mＭ・ＭgＣl2、６mＭ・Ｎa
Ｃl、６mＭ・２−ＭＥ、および０.１mg／mlウシ血清ア
ルブミン(ＢＳＡ)を含有する４５０μlの反応混合物中
で消化した。１６時間後に０.２５Ｍ・ＥＤＴＡ(pＨ８.
０)４０μlおよび１０％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤ
Ｓ)２０μlで消化を停止し、水−飽和１:１フェノール
−ＣＨＣl3(以下フェノール−ＣＨＣl3と呼ぶ)で抽出し
た後エタノールで沈澱させることによりＤＮＡを採取し
た。平均６０(ただし８０を越えない)のデオキシチミジ
レート(dＴ)残基(末端当たり)のホモポリマーテイルを
下記によりウシ胸線ターミナルトランスフェラーゼによ
り、ＮsiＩエンドヌクレアーゼ産生末端に付加した。反
応混合物(３８μl)はカコジル酸ナトリウム−３０mＭト
リス・ＨＣl(pＨ６.８)(緩衝液として)、ならびに１mＭ
・ＣＯＣl2、０.１mＭジチオスレイトール、０.２５mＭ
・dＴＴＰ、ＮsiＩエンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡ、お
よび６８Ｕのターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ(p−Ｌバイオケミカルズ社、ワイオミング
州、ミルウォーキー)を含有していた。３７℃で３０分
後に０.２５Ｍ・ＥＤＴＡ(pＨ８.０)２０μlおよび１０
％ＳＤＳ １０μlにより反応を停止し、フェノール−
ＣＨＣl3で数回抽出したのちエタノール沈澱によりＤＮ
Ａを採取した。次いでＤＮＡを１５ＵのＥcoＲＩエンド
ヌクレアーゼにより、１０mＭトリス・ＨＣl(pＨ７.
４)、１０mＭ・ＭgＣl2、１mＭジチオスレイトール、お
よび０.１mg／mlのＢＳＡを含有する５０μl中で３７℃
において５時間消化した。ＳＶ４０ポリアデニル化部位
およびpＢＲ３２２複製起点およびアンピシリン耐性遺
伝子を含む大型断片を、アガロース(１％)ゲル電気泳動
により精製し、ガラス粉末法に変法によりゲルから採取
した(ビー・フォーゲルシュタインおよびディー・ジレ
スピー、プロシ ・ナショナル・アカデ・サイ． (Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．)７６: ６１５−６１９[１９
７９])。dＴ−テイル付きＤＮＡをさらに下記に従って
オリゴ(dＡ)−セルロースカラムの吸収および溶離によ
って精製した。１mＭ・ＥＤＴＡおよび１Ｍ・ＮaＣlを
含有する１０mＭトリス・ＨＣl(pＨ７.３)緩衝液１mlに
ＤＮＡを溶解し、０℃に冷却し、同緩衝液で平衡化した
オリゴ(dＡ)−セルロースカラム(０.６×２.５cm)に施
し、水により室温で溶離した。溶離したＤＮＡをエタノ
ールで沈澱させ、１mＭ・ＥＤＴＡを含む１０mＭトリス
・ＨＣl(pＨ７.３)に溶解した。
【０１５１】オリゴ(dＧ)テイル付きリンカーＤＮＡは
下記により製造された。７５μgのpＬ１・ＤＮＡを２０
ＵのＰstＩエンドヌクレアーゼにより、６mＭ・トリス
・ＨＣl(pＨ７.４)、６mＭ・ＭgＣl2、６mＭ・２−Ｍ
Ｅ、５０mＭ・ＮaＣl、および０.０１mg／mlのＢＳＡを
含有する４５０μl中で消化した。３０℃で１６時間後
に反応混合物をフェノール−ＣＨＣl3により抽出し、Ｄ
ＮＡをアルコールで沈澱させた。次いで１０〜１５デオ
キシグアヌレート(dＧ)残基のテイルを各末端に、前記
と同じ反応混合物(３８μl)(ただし、dＴＴＰの変わり
に０.１mＭ・dＧＴＰを含む)中で４６Ｕのターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより付加し
た。３７℃で２０分後に混合物をフェノール−ＣＨＣl3
で抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させたのち、これ
を３０ＵのＨindＩＩＩエンドヌクレアーゼにより、２
０mＭ、トリス・ＨＣl(pＨ７.４)、７mＭ・ＭgＣl2、６
０mＭ・ＮaＣlおよび０.１mgのＢＳＡを含有する５０μ
l中で３７℃において４時間消化した。少量のオリゴ(d
Ｇ)テイル付きリンカーＤＮＡをアガロースゲル(１．８
％)電気泳動により精製し、上記に従って採取した。
【０１５２】２) cＤＮＡライブラリーの調製: 工程１: cＤＮＡ合成。反応混合物は５０mＭトリス・Ｈ
Ｃl(pＨ８.３)、８mＭ・ＭgＣl2、３０mＭ・ＫＣl、０.
３mＭジチオスレイトール、各２mＭのdＡＴＰ、dＴＴ
Ｐ、dＧＴＰ、およびdＣＴＰ、２０μＣi 32Ｐ−dＣＴ
Ｐ(３０００Ｃi／ミリモル)、３μgのＣoＡ誘導Ｔ細胞
由来ポリＡ+・ＲＮＡ、６０単位のＲＮアシン(ＲＮasi
n、リボヌクレアーゼ阻害剤の商品名、プロメガバイオ
テック社より、ワイオミング州、マジソン)および２μg
のベクター−プライマーＤＮＡ(プライマー末端１５ピ
コモル)、および４５Ｕのリバーストランスクタプター
ゼを含有していた。反応物を４２℃で６０分間インキュ
ベートし、次いで、０.２５Ｍ・ＥＤＴＡ(pＨ８.０)１
μlおよび１０％ＳＤＳ ０.５μlの添加により停止し;
フェノール−ＣＨＣl3 ４０μlを添加し、溶液をボル
テックスミキサー中で激しくブレンドした後遠心分離し
た。４Ｍ酢酸アンモニウム４０μlおよびエタノール１
６０μlを水相に添加し、溶液をドライアイスで１５分
間冷却し、緩和に振とうしながら室温にまで加温して、
冷却に際して沈澱していた未反応のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸を溶解し、エッペンドルフ微量遠心機で１０
分間遠心分離した。ペレットを１０μlの１０mＭトリス
・ＨＣl(pＨ７.３)および１mＭ・ＥＤＴＡに溶解し、４
Ｍ酢酸アンモニウム１０μlと混合し、エタノール４０
μlで再沈澱させた。この処理により９９％以上の未反
応デオキシヌクレオシド三リン酸が除去された。ペレッ
トをエタノールで濯いだ。
【０１５３】工程: ２ オリゴデオキシシチジレート
[オリゴ(dＣ)]の付加。プラスミド−cＤＮＡ: mＲＮＡ
を含有するペレットを１mＭ・ＣＯＣl2、０.１mＭジチ
オスレイトール、０.２μgのポリ(Ａ)、７０μＭ・dＣ
ＴＰ、５μＣi 32Ｐ−dＣＴＰ(３０００Ｃi／ミリモ
ル)、および６０Ｕのターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを含有する１４０mＭカコジル酸
ナトリウム−３０mＭトリス・ＨＣl(pＨ６.８)緩衝液２
０μlに溶解した。反応を３７℃で５分間行い、各末端
に１０〜１５残基のdＣＭＰを付加させ、０.２５Ｍ・Ｅ
ＤＴＡ(pＨ８.０)２μlおよび１０％ＳＤＳ １μlで終
結させた。フェノール−ＣＨＣl3 ２０μlで抽出したの
ち水相を４Ｍ酢酸アンモニウム２０μlと混合し、ＤＮ
Ａを沈澱させ、エタノール８０μlで再沈澱させ、最終
ペレットをエタノールで濯いだ。
【０１５４】工程３: エンドヌクレアーゼ消化。２０m
Ｍトリス・ＨＣl(pＨ７.４)、７mＭ・ＭgＣl2、６０mＭ
・ＮaＣl、および０.１mg／mlのＢＳＡを含有する緩衝
液３０μlにペレットを溶解し、１０ＵのＨindＩＩＩエ
ンドヌクレアーゼにより３７℃で２時間消化した。反応
を０.２５Ｍ・ＥＤＴＡ(pＨ８.０)３μlおよび１０％Ｓ
ＤＳ １.５μlで終結させ、フェノール−ＣＨＣl3で抽
出した後４Ｍ酢酸アンモニウム３０μlを添加し、エタ
ノール１２０μlによりＤＮＡを沈澱させた。ペレット
をエタノールで濯ぎ、次いで１０μlの１０mＭトリス・
ＨＣl(pＨ７.３)および１mＭ・ＥＤＴＡに溶解し、エタ
ノール３μlを添加して−２０℃での貯蔵に際して凍結
するのを防止した。
【０１５５】工程４: オリゴ(dＣ)テイル付きリンカー
ＤＮＡにより媒介された環化。ＨindＩＩＩエンドヌク
レアーゼ消化したオリゴ(dＣ)テイル付きcＤＮＡ:mＲＮ
Ａプラスミド(試料の約９０％)の試料９μlを、１０mＭ
トリス・ＨＣl(pＨ７.５)、１mＭ・ＥＤＴＡ、０.１Ｍ
・ＮaＣl、および１．８ピコモルのオリゴ(dＣ)テイル
付きリンカーＤＮＡを含有する混合物(９０μl)の中で
６５℃において５分間インキュベートし、４２℃に移行
させ(６０分間)、次いで０℃に冷却した。混合物(９０
μl)を９００μlの容量に調製した。２０mＭ・トリス・
ＨＣl(pＨ７.５)、４mＭ・ＭgＣl2、１０mＭ・(ＮＨ4)2
ＳＯ4、０.１Ｍ・ＫＣl ＢＳＡ ５０μg／mlおよび
０.１mＭ・β−ＮＡＤを含有していた。大腸菌ＤＮＡリ
ガーゼ６μgを添加し、次いで溶液を１２℃で一夜イン
キュベートした。
【０１５６】工程５: ＤＮＡによるＲＮＡ鎖の置換。挿
入物のＲＮＡ鎖を置換するために、リゲーション混合物
を、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸各４０μＭ、
０．１５mＭ・β−ＮＡＤ、追加の大腸菌ＤＮＡリガー
ゼ４μg、１６Ｕの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ(Ｐol
Ｉ)および９Ｕの大腸菌ＲＮアーゼＨを含有すべく調製
した。この混合物(９６０μl)を順次、１２℃および室
温で各１時間インキュベートして、ＰolＩによる修復合
成およびニックトランスレーションを促進した。
【０１５７】工程６: 大腸菌の形質転換。形質転換はコ
ーエンら(プロシ・ナショナル・アカデ・サ イ， ユー
エスエー(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)、６９:
２１１０−２１１４[１９７２])の方法をわずかに変更
したものにより行われた。大腸菌Ｋ−１２株ＭＣ１０６
１(エム・カサダバンおよびエス・コーエン、ジェイ・
モレ・バイオロ(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)、１３８: １７９
−２０７[１９８０］）を３７℃でＬ−ブロス３００ｍ
ｌ中において、６００nmで０.５吸光単位になるまで増
殖させた。細胞を遠心分離により採取し、３０mlの１０
mＭパイパス(pＨ７)６０mＭ・ＣaＣl2、１５％グリセリ
ンに懸濁し、０℃で５分間遠心分離した。細胞を上記緩
衝液２４mlに再懸濁し、再び０℃で５分間インキュベー
トした。次いでアリコートの細胞懸濁液をＤＮＡ溶液
(工程５)０.１mlと混合し、０℃で２０分間インキュベ
ートした。次いで細胞を４２℃に２分間保持した後室温
に１０分間保持した。次いでＬ−ブロス１リットルを添
加し培養物を３７℃で６０分間インキュベートした。ア
ンピシリンを５０μg／mlの濃度にまで添加した。培養
物を３７℃でさらに１０時間振とうした。この培養物の
希釈液を、アンピシリン５０μg／mlを含有するＬ−ブ
ロス寒天上に広げた。３７℃で１２〜２４時間インキュ
ベートした後各コロニーを無菌のつまようじで採取し
た。全体として約１×１０5の独立したcＤＮＡクローン
が得られた。
【０１５８】Ｄ．pcＤライブラリーのスクリーニング。 Ｔ細胞cＤＮＡライブラリーから１０4の単一クローンを
ランダムに採取し、アンピシリン５０μg／mlおよびジ
メチルスルホキシド７％を含むＬ−ブロス２００μlを
入れたマイクロタイターディッシュのウェル中で別個に
増殖させた。新規なＭＣＧＦ活性のみに注目するため
に、５３個のＩＬ−３cＤＮＡクローンおよび１個のＧ
Ｍ−ＣＳＦ cＤＮＡクローンを、リーら、プロシ・ ナシ
ョナル・アカデ・サイ．(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．)、８２巻、４３６０−４３６４頁(１９８５)および
ヨコタら、プロシ・ナ ショナル・アカデ・サイ (Ｐro
c．Ｎatl．Ａc ad．Ｓci．)、８１巻、１０７０−１０７
４頁(１９８４)により示されたクローンから構成された
適宜な32Ｐ標識cＤＮＡプローブとのハイブリダイゼー
ションにより同定し、除いた。この処理は下記に従って
行われた。培養物９６種の各プレートのレプリカをニト
ロセルロースフィルター上に作成し、ハイブリダイゼー
ションスクリーニングに用いた。ハイブリダイゼーショ
ンは６ＸＳＳＰＥ(１ＸＳＳＰＥ＝１８０mＭ・ＮaＣl;
１０mＭリン酸ナトリウム(pＨ７.４); １mＭ・ＥＤＴ
Ａ)０．１％ＳＤＳ、１００μg／ml大腸菌tＲＮＡ、５
０％ホルムアミド中で４２℃において１６時間行われ
た。ハイブリダイズするクローンは洗浄フィルターのオ
ートラジオグラフィーにより同定された。これらのクロ
ーンを含むミクロタイターウェルをクローンプールの調
製前にエタノールで滅菌することにより、これらのクロ
ーンを除いた。４８個までのcＤＮＡクローンを含むプ
ールをミクロタイター培養物から調製した。この種のプ
ール２００個を、アンピシリン１００μg／mlを含有す
るＬ−ブロスの培養物１リットル中で増殖させた。プラ
スミドＤＮＡを各培養物から単離し、２回のＣsＣl濃度
勾配により精製した。各プールを表すＤＮＡを下記によ
りＣＯＳ７サル細胞にトランスフェクションした(ＣＯ
Ｓ７細胞についてはグルツマンによりセル２３巻、１７
５−１８０頁(１９８１)に記載されており、ＡＴＣＣか
ら受託番号ＣＲＬ１６５１で入手できる。)
【０１５９】トランスフェクションの１日前に、１０％
ウシ胎仔血清および２mＭグルタミンを含有するＤＭＥ
に、１００mmのプレート上において、約１０6個のＣＯ
Ｓ７サル細胞を接種した。トランスフェクションを行う
ために、培地を各プレートから吸引除去し、５０mＭト
リス・ＨＣl(pＨ７.４)、４００μg／ml・ＤＥＡＥ−デ
キストランおよび被験プラスミドＤＮＡ５０μgを含有
するＤＭＥ４mlで置換した。プレートを３７℃で４時間
インキュベートし、次いでＤＮＡ含有培地を除去し、各
プレートを血清不含のＤＭＥ５mlで２回洗浄した。クロ
ロキン１５０μＭを含有するＤＭＥをプレートに添加
し、次いで３７℃でさらに３時間インキュベートした。
プレートをＤＭＥで１回洗浄し、次いで４％ウシ胎仔血
清、２mＭグルタミン、ペニシリンおよびストレプトマ
イシンを添加した。次いで細胞を３７℃で７２時間イン
キュベートした。増殖培地を採取し、種々のバイオアッ
セイ法において評価した。
【０１６０】最初の１組のプラスミドプールを主として
増殖アッセイ法により、ＴＣＧＦ活性およびＭＣＧＦ活
性についてそれぞれＨＴ−２細胞系列(下記に、より詳
細に記述する)およびＭＣ／９細胞配列を用いてスクリ
ーニングした。これら２細胞系列についてアッセイした
最初の１１０プールのうち８プールはＨＴ−２ＴＣＧＦ
アッセイにおいて有意の活性を生じた。これらのプール
のうち数種は弱いが有意のＭＣＧＦ活性を示したけれど
も、ＭＣＧＦ活性は一般により弱くかつより変動性であ
ったため、本発明者らは陽性プールの同定のためこのア
ッセイ法を信頼しなかった。
【０１６１】ランダムプールトランスフェクションによ
るＣＯＳ７上層液の約半数はマウスＢ細胞に対するＩa
誘導活性についてもアッセイされた。被験プールのうち
ＴＣＧＦ活性については有効であることが示された各プ
ールはＩa誘導活性も備えていることが認められた。従
って、ＴＣＧＦ活性とＩa誘導活性の間には完全な相関
関係があった。
【０１６２】すべてのアッセイにおいて再現性をもって
最も有効であった１プール(２Ａ)を、より小さな４８の
サブプールに小分割した。これらのサブプールはＭＣＧ
ＦおよびＴＣＧＦ活性の双方について陽性であった。両
サブプールに共通の単一クローン、(２Ａ−Ｅ３)を次い
で別個に増殖させ、そのプラスミドＤＮＡを前記のＣＯ
Ｓ７細胞にトランスフェクションした。次いで生じたＣ
ＯＳ上層液を各種活性の存在についてアッセイした。こ
れにｆＭＣＧＦ、ＴＣＧＦ、Ｉa誘導、ならびにＩgＥお
よびＩgＧ増強活性が含まれていた。
【０１６３】クローン２Ａ−Ｅ３から単離し、32Ｐで標
識した３６６塩基対の長さをもつＰstＩ断片(図１)をプ
ローブとして用いて、生物活性について陽性であったプ
ールおよび他の未試験プールをスクリーニングした。ス
クリーニングは前記のようにマイクロタイター培養物の
レプリカを作成したフィルターへのハイブリダイゼーシ
ョンによって行われた。ハイブリダイズした９クローン
を単離し、それらのＤＮＡを制限マッピングにより分析
した。生物活性を示したプールはすべて、クローン２Ａ
−Ｅ３と共通の制限開裂地図を共有する少なくとも１種
のハイブリダイズクローンを含んでいた。採取したクロ
ーン１０4のうちハイブリダイズクローンは、総ライブ
ラリー中約０.２％の頻度を示す。被験ハイブリダイズ
クローンのうち約９０％が機能性タンパク質を発現し
た。
【０１６４】Ｅ．pcＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ７サル細胞の培養上層液の生物活性 pcＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクションしたＣＯＳ７
細胞からの上層液を、ネズミヘルパーＴ細胞系列ＨＴ−
２においてＴＣＧＦ活性につき試験した(ワトソン、ジ
ェイ・エクスペ・メディ(Ｊ．Ｅxp．Ｍed．)、１５０
巻、１５１０頁(１９７９)に記載)。モスマン(前掲)の
比色アッセイ法により測定したＨＴ−２細胞の増殖をＴ
ＣＧＦ活性の尺度として用いた(増殖の程度は５７０〜
６３０nmの光学濃度(ＯＤ)と相関関係にあった)。図８
は種々の希釈度における(i)pcＤ−２Ａ−Ｅ３でトラン
スフェクションしたＣＯＳ７細胞から得た上層液(曲線
１)、(ii)Ｃl．Ｌyl+２-／９培養物から得た上層液(曲
線２)、(iii)ＩＬ−２ cＤＮＡを保有するpcＤプラス
ミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞から得た
上層液(曲線３)および(iv)cＤＮＡ挿入物を含まないpc
ＤプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞
(すなわち“モック(mock)”トランスフェクション)から
得た上層液(曲線４)の相対的ＴＣＧＦ活性を示す。
【０１６５】同様に、pcＤ−２Ａ−Ｅ３トランスフェク
ションしたＣＯＳ７細胞から得た上層液をＭＣ／９細胞
におけるＭＣＧＦ活性について試験した。この場合もモ
スマンの比色アッセイ法を採用してＭＣ／９増殖を測定
した。図９は(i)pcＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ７細胞から得た上層液(曲線１)、(ii)Ｉ
Ｌ−３ cＤＮＡを保有するpcＤプラスミドでトランスフ
ェクションしたＣＯＳ７細胞から得た上層液(曲線２)、
(iii)Ｃl．Ｌyl+２-／９細胞から得た上層液(曲線３)、
および(iv)モックトランスフェクションしたＣＯＳ７細
胞から得た上層液(曲線４)の相対的ＭＣＧＦ活性を示
す。
【０１６６】図１０は(i)pcＤ−２Ａ−Ｅ３でトランス
フェクションしたＣＯＳ７細胞の上層液(曲線１)、(ii)
Ｃl．Ｌyl+２-／９細胞の上層液(曲線２)、および(iii)
モックトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の上層液
(曲線３)について行ったＩa誘導アッセイの結果を示
す。Ｉa誘導アッセイはレームら(前掲)により記載され
た方法に従って行われた。数匹のＤＢＡ／２マウス(２
〜３カ月令)を屠殺し、脾臓を外科処置により採取し
た。０.８７％塩化アンモニウムを用いる低張ショック
により赤血球を細胞溶解した。次いで、Ｔ細胞特異性表
面マーカー(Ｔhy−１、Ｌyt−１およびＬyt−２)指向性
の細胞毒性モノクローナル抗体を用いてＴ細胞を溶解
し、次いで家兎補体中でインキュベートした。次いで、
フィコール−ハイパーク密度勾配により死細胞を除去し
た。付着性細胞は３７℃プラスチック製シャーレに付着
させることによりあらかじめ除去されていた。この時点
で細胞を洗浄し、計数し、生存率につき採点した。１０
％のウシ胎仔血清、２−メルカプトエタノールおよび各
種抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲ
ンタマイシン)を補充した組織培養用培地(ＲＰＭＩ１６
４０、または最小必須培地−ＭＥＭ／アーレの塩(ジブ
コ)０.５ml中で約１００万個の細胞をインキュベートし
た。陽性の対照がＴ細胞有糸分裂誘発因子コンカナバリ
ンＡで誘発したＴ細胞からの上層液よりなる実験におい
ては、１０mg／ml(最終濃度)のα−メチルマンノシドを
添加して、有糸分裂誘発因子を中和した。２４時間のイ
ンキュベーションの後、細胞を採取し、抗−Ｉ−Ａdま
たは抗−Ｉ−Ａbdモノクロナール抗体による染色のため
に調製した。これらの抗体をハプテンＮ.Ｉ.Ｐまたはビ
オチンのいずれかに結合した第１段階抗体として用い
た。次いで細胞を蛍光処理した第２段階試薬(抗−ＮＩ
Ｐ抗体またはアビシン)と共にインキュベートすること
により、染色を完了した。次いで蛍光活性化細胞ソータ
ー(ベクトン−ディッキンソン、カリフォルニア州、マ
ウンテンビュー)またはサイトフルオログラフ(オルト・
ダイアグノスティックス、マサチュセッツ州、ケンブリ
ッジ)を用いて蛍光染色の強度を測定した。図１０の蛍
光単位は、各試料中の陽性細胞の％に蛍光染色の強度を
掛けることにより算出された。
【０１６７】図１１はＩgＥおよびＩgＧ1の産生がＴ細
胞枯渇したマウス脾臓細胞において(i)ＣＯＳ７培地の
み(棒１)、(ii)モックトランスフェクションしたＣＯＳ
７細胞からの上層液２０％(棒２)、８(iii)Ｃl．Ｌyl+
２-／９からの上層液１０％プラスモックトランスフェ
クションしたＣＯＳ７細胞からの上層液２０％(棒３)、
および(iv)pcＤ−２Ａ−Ｅ３トランスフェクションした
ＣＯＳ７細胞からの上層液２０％(棒４)により誘発され
る程度をグラフで示す。ＩgＥおよびＩgＧ1の水準は前
記の同基準標本特異性ＥＬＩＳＡにより測定された。
【０１６８】ネズミＩＬ−４はＭＣ／９細胞においてＩ
Ｌ−３のＭＣＧＦ活性を高めることが認められた(スミ
スおよびレニック、プロシ・ナショナル・アカデ・サイ
(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．)、８３巻、１８５７
−１８６１頁(１９８６)、ネズミＩＬ−４はＩＬ−３依
存性細胞系列のＧＭ−ＣＳＦ刺激による増殖を高めるこ
とも認められた(ホームズら、プロシ・ナショナル・ア
カデ・サイ (Ｐ roc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．)、８２
巻、６６８７−６６９１頁(１９８５)に記載)。挿入物
はマキサマおよびギルバー法(メソッズ・イン・エンザ
イモロジー、６５巻、４９９−５６０頁(１９８０))、
ならびにサンガー法(プロシ・ナショナル・アカデ ・サ
イ (Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．)、７４巻、５４６
３−５４６７頁(１９７７))の双方により配列決定され
た。図１にその配列を、第１ＡＴＧ開始コドンと同相の
最長オープンリーディングフレームについての推定アミ
ノ酸配列と共に示す（配列番号１）。マウス２Ａ−Ｅ３
cＤＮＡクローンにおける単一長鎖オープンリーディン
グフレームは１４０アミノ酸残基からなる。このリンフ
ォカインは分泌タンパク質であるので、疏水性リーダー
配列が分泌形の成熟タンパク質に関する配列に先行する
と予想される。ポリペプチドの疏水性を分析し、先行す
るシグナルペプチドに関して提示されたコンセンサス配
列(パールマンら、ジェイ・モレ・バイオロ(Ｊ．Ｍol．
Ｂiol．)、１６７巻、３９１−４０９頁(１９８３))と
比較することにより、前駆ポリペプチドの開裂は図１の
アミノ酸位置２０におけるセリン残基に続いて起こるこ
とが示唆される。グラブシュタインら(ジェイ・エクス
ペ・メディ、(Ｊ．Ｅxp．Ｍed．)、１６３巻、１４０５
−１４１４頁(１９８６))は分泌されたネズミＩＬ−４
のＮ−末端配列が図１の位置２１Ｈisにおいて開始する
ことを確認した。
【０１６９】実施例ＩＩ．ヒトヘルパーＴ細胞cＤＮＡ
に対するネズミcＤＮＡプローブによるヒトＩＬ−４の
産生ならびにＣＯＳ７ サル細胞およびマウスＬ細胞にお
ける一過性発現 誘導ヒトヘルパーＴ細胞、２Ｆ１、および誘導ヒト末梢
血リンパ球(ＰＢＬ)から構成されたcＤＮＡライブラリ
ーより、ネズミcＤＮＡプローブによってＩＬ−４をコ
ードするcＤＮＡクローンを単離した。ＢＣＧＦ活性を
生じることが知られている他のヒト細胞系列にはＣＥＭ
系列の変種が含まれ、ＡＴＣＣから受託番号ＣＣＬ１１
９、ＣＲＬ８４３６、およびＴＩＢ１９５で入手でき、
フォーレーら、キャンサー、１８巻、５２２−５２９頁
(１９６５)、およびクグラー、リンフォカイン・リサー
チ、３巻、１８３−１９１頁(１９８４)に記載されてい
る。
【０１７０】ヒトヘルパーＴ細胞クローン、２Ｆ１、お
よびヒトＰＢＬを、ウシ胎仔血清３％を補充したイスコ
ブの培地で増殖させた。２Ｆ１細胞をＣonＡ(１０μg／
ml)で活性化し、ＰＢＬをＰＮＡ １μg／mlで１２時間
刺激した後５μg／mlのＣonＡを添加した。ＣonＡ添加
の４時間後(２Ｆ１)または１０時間後(ＰＢＬ)に細胞を
採取した。
【０１７１】mＲＮＡの抽出およびcＤＮＡライブラリー
の構成は実施例１の記載に従って行われた。ＰstＩ断片
をマウスpcＤ−２Ａ−Ｅ３ cＤＮＡクローンから単離
し、ニックトランスレーションにより標識し、(１×１
０8cpm／μg)、１０個のプール(それぞれ約１×１０3ク
ローンの２Ｆ１ cＤＮＡライブラリーを表す)からのプ
ラスミドＤＮＡ調製物を含むニトロセルロースフィルタ
ーのプローブ検出に用いた。低ストリンジェンシーハイ
ブリダイゼーション条件(４２℃で一夜)を採用した。６
xＳＳＰＥ(１xＳＳＰＥ＝１８０mＭ・ＮaＣl／１０mＭ
リン酸ナトリウム(pＨ７.４)／１mＭ・ＥＤＴＡ)(ティ
ー・マニアチスら、分 子クローニング: 実験室の手引
(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニ
ューヨーク、(１９８２))、２０％(v／v)ホルムアルデ
ヒド、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム、酵母キャリヤ
ーtＲＮＡ １００μl。フィルターを２×ＳＳＰＥ、０.
１％ドデシル硫酸ナトリウムで３７℃において洗浄し
た。
【０１７２】単一クローン(pcＤ−４６)が１０中１個の
プールにおいて同定された。他のクローンが、pcＤ−４
６のＮheＩ−ＥcoＲＩ断片(図７の制限地図に示す)から
構成されたプローブを用いてＰＢＬ cＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングすることにより得られた。制限酵素
による分析からこれらのＰＢＬクローンの構造はpcＤ−
４６と等しいことが示された。
【０１７３】pcＤ−４６のコード部位挿入物から５'(す
なわち上流)方向のグアニジンに富む領域がＩＬ−４ポ
リペプチドの発現を抑制することが見出された。従って
pcＤ−４６の挿入物を再クローニングしてグアニジンに
富む領域を除去した。得られたクローンはpcＤ−１２５
と表示される。マウスＬ細胞をpcＤ−４６でトランスフ
ェクションすることによっても発現が改良されることが
見出された。ベクターpcＤ−１２５は下記により形成さ
れた。pcＤ−４６をＳau３Ａで開裂して、cＤＮＡ挿入
物の５'側１６２ヌクレオチドを含む断片(ＧＣセグメン
トを除く)を単離し、次いでこの断片をp１０１のＢglＩ
Ｉ部位に挿入した。プラスミドp１０１はpcＤマウスＩ
Ｌ−３(ヨココタら、[１９８４]前掲文献参照]から誘導
され、cＤＮＡの５'末端のＰstＩ部位からマウスＩＬ−
３ cＤＮＡ内のＢglＩＩ部位までの配列を欠失してい
た。ＢglＩＩ部位は欠失配列のジャンクションに含まれ
る。Ｓau３Ａ断片をpcＤ−４６断片の場合と同様にＳＶ
４０プロモーターに融合させた(ＧＣセグメントを除
く)。次いでcＤＮＡの３'末端、ＳＶ４０ポリＡ部位、
およびpcＤ−４６のすべてのpＢＲ３２２配列を保有す
るpcＤ−４６からのＨindＩＩＩ／ＮheＩ断片を用いて
ヒトcＤＮＡの残部を再構成した。
【０１７４】pcＤ−４６およびpcＤ−１２５−トランス
フェクションされたＣＯＳ７およびＬ細胞の上層液をＢ
ＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性についてアッセイした。ＴＣ
ＧＦはエプスタイン−バルウイルスで形質転換されたヒ
トヘルパーＴ細胞系列ＪＬ−ＥＢＶ、およびフィトヘマ
グルチニン刺激されたヒト末梢血リンパ球を用いてアッ
セイされた。
【０１７５】ヒトヘルパーＴ細胞クローンＪＬ−ＥＢＶ
を、ヒトＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系列の照射(４５００Ｒ)
細胞で刺激したのち、１０％ヒトＡＢ血清、５０μＭ−
２−メルカプトエタノール(２ＭＥ)および組換えヒトＩ
Ｌ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。
ヒトＰＢＬをＰＨＡ(２０μg／ml)で刺激し、１０％ウ
シ胎仔血清、５０μＭ・２ＭＥおよび組換えヒトＩＬ−
２を含有するＲＰＭＩ１６４０中に維持した。刺激の５
〜１０日後にＪＬ−ＥＢＶ細胞またはＰＨＡブラスト(b
last)をモスマンの比色法(前記)による２日間のＴＣＧ
Ｆアッセイ法または[3Ｈ]−チミジン取込みによる３日
間のＴＣＧＦアッセイ法においてターゲットとして用い
た。
【０１７６】図１２は、ＪＬ−ＥＢＶ細胞により測定し
た(比色アッセイ法) (i)ヒトＩＬ−２を発現するpcＤプラスミドでトランス
フェクションしたＣＯＳ７細胞からの上層液(曲線Ａ);
(ii)pcＤ−１２５でトランスフェクションしたＬ細胞か
らの上層液(曲線Ｂ); (iii)pcＤ−１２５でトランスフ
ェクションしたＣＯＳ７細胞からの上層液(曲線Ｃ); (i
v)pcＤ−４６でトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞
からの上層液(曲線Ｄ); および(v)モックトランスフェ
クションしたＣＯＳ７細胞からの上層液(曲線Ｅ)のＴＣ
ＧＦ活性を示す。図１３はＰＨＡ刺激したＰＢＬにより
測定した(比色アッセイ法)(i)ヒトＩＬ−２を発現するp
cＤプラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ７細
胞からの上層液(曲線Ａ)、(ii)pcＤ−１２５でトランス
フェクションしたＣＯＳ７細胞からの上層液(曲線Ｂ)、
および(iii)モックトランスフェクションしたＣＯＳ７
細胞からの上層液(曲線Ｃ)のＴＣＧＦ活性を示す。図１
４はＰＨＡ刺激されたＰＢＬにより測定された(トリチ
ル化チミジン取込みアッセイ法)(i)pcＤ−１２５でトラ
ンスフェクションしたＣＯＳ７細胞からの上層液(曲線
Ａ)、(ii)ヒトＩＬ−２を発現するpcＤプラスミドでト
ランスフェクションしたＣＯＳ７細胞からの上層液(曲
線Ｂ)、および(iii)モックトランスフェクションしたＣ
ＯＳ７細胞からの上層液(曲線Ｃ)のＴＣＧＦ活性を示
す。
【０１７７】pcＤ−１２５トランスフェクション上層液
の各種希釈液のＢＣＧＦ活性を、マイゼルら、(プロシ
・ナショナル・アカデ・サイ (Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．
Ｓ ci．)、７９巻、５９９８−６００２頁(１９８２))に
より報告されたＢＣＧＦ(“市販ＢＣＧＦ”)(サイトカ
イン・テクノロジー・インターナショナル(ニューヨー
ク州、バッファロー)から市販されている)の活性と比較
した。表２は抗ＩgＭ抗体により予備活性化したＢ細胞
に対するＣＯＳ７トランスフェクション上層液の各種希
釈液のＢＣＧＦ活性を示す。Ｂ細胞は前記アッセイの章
の記載に従って調製された。
【０１７８】
【表２】
【０１７９】表３はＳＡＣ予備活性化されたＢ細胞(前
記により調製)における、ＣＯＳ７トランスフェクショ
ン上層液の各種希釈液のＢＣＧＦ活性を示す。
【０１８０】
【表３】
【０１８１】本発明のヒトＩＬ−４および市販のＢＣＧ
Ｆは共にＢＣＧＦ活性を示すが、メータら(ジェイ・イ
ムノロ(Ｊ．Ｉmmunol．)、１３５巻、３２９８−３３０
２頁(１９８５)は市販のＢＣＧＦのＢＣＧＦ活性から生
化学的にＴＣＧＦ活性を分離できることを証明した。こ
れはその活性が別個の分子によって生じていることを示
している。従ってヒトＩＬ−４と市販のＢＣＧＦは異な
る分子である。ヒトＩＬ−４の場合、ＴＣＧＦ活性を標
準的な生化学的分画技術によってＢＣＧＦ活性から分離
することはできないからである。
【０１８２】ヒトＩＬ−４cＤＮＡを保有するプラスミ
ドでトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞からの上
層液は正常なヒトＴ細胞およびヒトＴ細胞クローンＪＬ
−ＥＢＶの増殖、ならびにマウスＩＬ−４に類似の活性
を誘発する。しかしヒトＩＬ−４に応答して誘発された
ヒトＴ細胞の最大増殖度はヒトＩＬ−２により誘発され
たものの約半分である。ＩＬ−４の増殖誘発活性は試験
に際しＩＬ−２に対する、またはＩＬ−２レセプターに
対するモノクローナル抗体により阻害されなかった。こ
れらの結果は、ＩＬ−４はＴ細胞に直接に作用し、ＩＬ
−２の誘導によるものではないこと、またその活性はＩ
Ｌ−２レセプターにより媒介されないことを示唆する。
ＣＯＳヒトＩＬ−４上層液はビーズに結合した最適濃度
の抗ＩgＭ抗体で予備活性化されたヒトＢ細胞の増殖も
刺激し、ＢＣＧＦアッセイの飽和水準において市販のＢ
ＣＧＦに付加的な増殖容量をもつ。これは、ヒトＩＬ−
４と市販のＢＣＧＦが異なる経路で、たとえば恐らく異
なる組のレセプターによりＢ細胞に作用することを示唆
する。各上層液はＳＡＣで予備活性化されたＢ細胞の増
殖を有意に誘発しなかったが、ＰＨＡで刺激されたＰＢ
Ｌ培養物の上層液から精製した市販のＢＣＧＦはＳＡＣ
予備活性化されたヒトＢ細胞の増殖を著しく誘発した。
これらの結果はさらに、ヒトＩＬ−４cＤＮＡが市販の
ＢＣＧＦに存在するものと異なるＢＣＧＦ活性をコード
することを示す。
【０１８３】pcＤ−１２５トランスフェクションしたＣ
Ｏ７細胞の上層液を、それが扁桃腺Ｂ細胞のＦc−イプ
シロンレセプターを誘発する効力についても試験した。
ヒト扁桃腺細胞を標準法により分散させ、単一細胞懸濁
液となした。前記のプロトコールによりＢ細胞集団を濃
縮し、濃縮された細胞を３７℃の培地中で２４時間、抗
ＩgＭ抗体により刺激した。Ｆc−イプシロンレセプター
保有細胞をベクトン・ディッキンソンＦＡＣＳ ＩＶ細
胞ソーターにより、該レセプターに特異的な蛍光標識モ
ノクローナル抗体を用いてボンネフォイら、(ジェイ・
イムノロ・メソ(Ｊ．Ｉmmunol．Ｍeth．)、８８巻、２
５−３２頁(１９８６)により示された方法によりアッセ
イした。図１５−１８は細胞頻度(縦軸)対蛍光強度(横
軸)を示すヒストグラムである。蛍光強度は細胞上に存
在するＦc−イプシロンレセプターの数に比例する。す
べての図において細胞は抗ＩgＭで刺激された。図１５
−１８はpcＤ−１２５トランスフェクションしたＣＯＳ
７細胞からの０％、０.１％、１％および１０％上層液
からなる培地への暴露に相当する。
【０１８４】クローンＮo．４６のcＤＮＡ挿入物のＤＮ
Ａ配列を決定し、図２に示す（配列番号２）。cＤＮＡ
挿入物は６１５bpの長さである(ポリ(Ａ)テイルを除
く)。単一オープンリーディングフレームがあり、最初
のＡＴＧコドンは５'末端から６４ヌクレオチドの位置
にあり、これに１５３コドンが続き、ヌクレオチド位置
５２３〜５２５の終止コドンＴＡＧで終わる。予言され
たポリペプチドのＮ末端セグメントは分泌タンパク質に
ついて予期されたように疏水性である。
【０１８５】本発明のヒトおよびマウスcＤＮＡのコー
ド部位間の比較によって、アミノ酸位置１−９０および
１２９−１４９に包含される、pcＤ−４６のヒトcＤＮ
Ａコード配列の各領域は、対応するマウスcＤＮＡ(２Ａ
−Ｅ３)コード配列領域とほぼ５０％相同域を共有する
ことが明らかになった。これらの領域、ならびに５'お
よび３'非翻訳領域はこれら異種からの２種のcＤＮＡ配
列間でほぼ７０％の相同域を共有するが、ヒトタンパク
質のアミノ酸９１−１２８により包含される領域はマウ
スの対応する領域と共有する相同域がごく限られてい
る。全体的にヒトタンパク質における７個のシステイン
残基のうち６個は関連するマウスタンパク質において保
守されている。天然の形の本発明のヒトポリペプチドを
マウスＩＬ−３のものとの間には若干のアミノ酸配列相
同性がある。アミノ酸残基７−１６および１２０−１２
７は、それぞれマウスＩＬ−３前駆ポリペプチドの残基
１６−２７および４１−４９に５０％および５５％相同
である(ヨコタら、プロシ・ナショナ ル・アカデ・サ
イ．,ユーエスエー(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci． Ｕ．
Ｓ．Ａ．)８１:１０７０−１０７４[１９８４])．
【０１８６】後に、より詳細に記述するように、pcＤ−
１２５トランスフェクションしたＣＯＳ７上層液から精
製したヒトＩＬ−４は図３に示した配列をもつ１２９ア
ミノ酸ポリペプチドであることが見出された（配列番号
３）。
【０１８７】実施例ＩＩＩ．ＲＳＶ−ＬＴＲプロ モータ
ーを含むエプシュタインバルウィルス(ＥＢＶ)由来のベ
クターの使用によるＣＯＳ７サル細胞におけるヒト ＩＬ
−４の発現の増強 ラウス肉腫ウイルス長鎖末端反復(ＲＳＶ−ＬＴＲ)プロ
モーターを含むＥＢＶ由来のベクターへpcＤ−１２５の
Ｘho Ｉ断片を再クローニングすることにより、ヒトＩ
Ｌ−４発現が１０〜２０倍増強された。ＥＢＶ由来のベ
クターおよびＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターはゴルマン
ら,プロシ・ナ ショナル・アカデ・サイ(Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．)７９巻,６７７７−６７８１頁(１９８
２):およびエイテスら,ネイチャー,３１３巻,８１２−
８１５頁(１９８５)に記載されている。
【０１８８】ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターを含むＨind
ＩＩＩ／Ｘho Ｉ断片を、ゴルマンら(前掲)により記載
されたＡccＣＩ／ＨindＩＩＩ断片を含むＲＳＶ−ＬＴ
Ｒおよび市販のpcＤベクター(たとえばファルマシア)よ
りあらかじめ構成されたpcＤプラスミドから単離した。
ＳＶ４０複製起点(ori)を含むpＬ１プラスミド(ファル
マシア)から得た上記のＨin dＩＩＩ／ＸhoＩ断片および
ＨindＩＩＩ／ＸhoＩ断片をプラスミドＰＣＤＶ１(ファ
ルマシアから入手できる)へ挿入した。ＳＶ４０ori領域
の向きは決定的ではない。得られるpcＤベクターはＡat
ＩＩ部位とＮdeＩ部位の間に順次(ＡatＩＩ部位から)Ｓ
Ｖ４０ori領域、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、および
ＳＶ４０ポリＡ領域を含む。pcＤ−１２５のＸhoＩ断片
を単離し、新たに構成されたpcＤベクターに挿入した
後、ベクター上の唯一のＡatＩＩおよびＮdeＩ部位を標
準法によりＳalＩ部位に変える。要約すると、pcＤベク
ターをＡatＩＩおよびＮdeＩで消化し、ＩＬ−４を含む
断片を単離し、単離された断片を適宜な濃度のヌクレオ
シド三リン酸の存在下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの
５'→３'ＤＮＡポリメラーゼ活性が制限切断部の５'突
出末端をフィルインし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの
３'→５'エキソヌクレアーゼ活性が制限切断部の３'突
出末端を消化して平滑末端断片を残し、これにキナーゼ
処理Ｓal Ｉリンカー(ニュー・イングランド・バイオ
ラボズ）をＴ４ ＤＮＡリガーゼによりリゲートする。
【０１８９】上記Ｓal Ｉ断片(図３０に示す)をエイテ
スら(前掲)により記載されたＥＢＶ由来のベクターp２
０１の唯一のＣ la Ｉ部位の位置(標準法によりＳal
Ｉ部位に変えられている)に挿入する。要約すると、p２
０１(図３０に示す)をＣla Ｉで消化し、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ(クレノー断片)および適宜な濃度のヌクレオシ
ド三リン酸類で処理する。この方法により、Ｃla Ｉ切
断部の突出末端がフィルインされ、平滑末端断片が残さ
れる。次いで平滑末端をキナーゼ処理Ｓal Ｉリンカー
にリゲートする。得られたＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター
およびＩＬ−４cＤＮＡ挿入因子を含むＥＢＶ由来のプ
ロモーターをここではpＥＢＶ−１７８と呼ぶ。
【０１９０】pＥＢＶ−１７８を標準法によりＣＯＳ７
細胞中にトランスフェクションし、培養上層液をＩＬ−
４発現の尺度としてのＴＣＧＦ活性についてアッセイし
た。
【０１９１】実施例ＩＶ．大腸菌における天然のヒトＩ
Ｌ −４およびムテインＩＳ 0 (Ａla−Ｇlu−Ｐhe)の発現 ヒトＩＬ−４cＤＮＡ挿入物を含む２種のベクターを大
腸菌におけるヒトＩＬ−４の発現用として構築した。す
なわちompＡタンパク質のシグナルペプチド配列を含むp
ＩＮ−ＩＩＩ分泌ベクター(“pＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ
２”),ならびにtrp Ｐプロモーターおよび隣接するリ
ボソーム結合部位(ＲＢＳ)隣接を含むpＵＣ１２プラス
ミド(“ＴＲＰＣ１１”)である。
【０１９２】Ａ．pＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ２ pＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ２プラスミド(グラエブ(Ｇhraye
b)ら,ＥＭＢＯジャーナル,３巻,２４３７−２４４２頁
(１９８４),およびマツイら,バイオテクノロジー,２巻,
８１−８５頁(１９８４)に記載)を用いて２種のベクタ
ーを構築した。
【０１９３】pＩＮ−ＩＩＩompＡ２(１)と表示される第
１ベクターは順次ＥcoＲＩ／ＢamＨＩ−消化pＩＮ−Ｉ
ＩＩ−ompＡ２プラスミド、合成リンカー、およびpcＤ
−１２５のＢamＨＩ／ＥcoＲＶ断片をリゲートすること
により構築された。この構築に用いた合成リンカーは３
個の追加Ｎ末端アミノ酸Ａla−Ｇlu−Ｐhe−をもつ生物
活性ＩＬ−４ポリペプチドを分泌した。すなわちムテイ
ンＩＬ0(Ａia−Ｇlu−Ｐhe)が分泌された。合成リンカ
ーは下記のヌクレオチド配列からなっていた（配列番号
１７および１８）。 ＡＡ ＴＴＣ ＣＡＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＧＡＴ Ｇ ＧＴＧ ＴＴＣ ＡＣＧ ＣＴＡ
【０１９４】ＥcoＲＩ／ＢamＨＩ−消化pＩＮ−ＩＩＩ
−ompＡ２およびpcＤ−１２５のＢamＨＩ／ＥcoＲＶ断
片を、０.１μＭ合成リンカーを含有する標準リゲーシ
ョン溶液(たとえばマニアチスら、前掲)中で混合した。
大腸菌株Ａb１８９９をpＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ２(１)プ
ラスミドで感染し、形質転換体を32Ｐ−標識付きＩＬ−
４cＤＮＡプローブによるコロニーハイブリダイゼーシ
ョンにより選択した。アッセイ用のヒトＩＬ−４抽出物
は下記により得られた。音波処理後に細菌培養物を遠心
分離し、上層液をペレットから除去した。ペレットを１
％ＳＤＳ、２mＭジチオスレイトール、および６Ｍグア
ニジンで処理した。材料を再遠心分離し、上層液を廃棄
し、ペレットを４５℃で３％ＳＤＳおよび２mＭジチオ
スレイトールで処理した。材料を再び遠心分離し、上層
液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイした。
【０１９５】pＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ(２)は天然ヒトＩＬ
−４を発現すべく構築された。pＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ
(１)構築における３種のアミノ酸付加物をpＩＮ−ＩＩ
Ｉ−ompＡ２のompＡシグナルペプチド配列の部位特異性
突然変異により除去した。部位特異性突然変異はゾラー
およびスミス(前掲)の記事に従って行われた。要約する
と、ompＡシグナルペプチドをコードする配列を含むpＩ
Ｎ−ＩＩＩ−ompＡ２のＸbaＩ／ＢamＨＩ断片(グラエブ
らの第１図を参照されたい、前掲)を精製し、精製され
たＸbaＩ／ＢamＨＩ消化した複製形(ＲＦ)のＭ１３mp１
９と混合し、リゲートし、大腸菌Ｋ−１２ ＪＭ１０１
にトランスフェクションし、平板培養した。ＩＰＩＧお
よびＸ−galの存在下で透明なプラークを選択し、増殖
させ、たとえばメッシング,メソッズ・イン・エンザイ
モロジー,１０１巻(アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、１９８３)に示された方法により一重鎖ＤＮＡを調
製した。別個に、指示された塩基置換体(四角で囲んだ
もの)を含む下記のオリゴヌクレオチドプライマー(２３
−mer)を合成し、リン酸化した。
【０１９６】
【化１】
【０１９７】この配列（配列番号１９）は突然変異pＩ
Ｎ−ＩＩＩ−ompＡ２のシグナルペプチドコード部位に
第２のＨindＩＩＩ部位を導入する。pＩＮ−ＩＩＩ−om
pＡ２のＸbaＩ／ＢamＨＩ断片を含むＭ１３mp１９ Ｒ
Ｆにこのオリゴヌクレオチドプライマーをアニールし、
適宜な濃度のヌクレオシド三リン酸類の存在下にＤＮＡ
ポリメラーゼで処理した。得られたＲＦを用いてＪＭ１
０１大腸菌をトランスフェクションし、突然変異を含む
プラークを標識付きオリゴヌクレオチドプローブにより
スクリーニングした。選ばれたＲＦの配列はユニバーサ
ルＭ１３プライマーを用いるジデオキシ配列決定法によ
り確認された。選ばれたＲＦを増殖させ、単離し、Ｘba
ＩおよびＢamＨＩで消化し、精製ＸbaＩ／ＢamＨＩ断片
をＸbaＩ／ＢamＨＩ消化したpＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ２に
挿入した。pＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ２(２)を形成するため
に、pＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ２を増殖させ、精製し、Ｈin
dＩＩＩおよびＢamＨＩで消化し、pcＤ−１２５のＢam
ＨＩ／ＥcoＲＶ断片と、０.１μＭの下記合成リンカー
（配列番号２０および２１）を含有する標準リゲーショ
ン溶液中で混合した。
【０１９８】 Ａ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＴＴＣ ＡＣＧ ＣＴＡ
【０１９９】大腸菌株Ａb１８９９にpＩＮ−ＩＩＩ−om
pＡ２(２)プラスミドを感染させ、形質転換体を32Ｐ−
標準ＩＬ−４cＤＮＡプローブによるコロニーハイブリ
ダイゼーションにより選択した。前記により調製された
ＩＬ−４抽出物はpcＤ−１２５ ＣＯＳ７細胞上層液に
匹敵するＴＣＧＦ活性を示した。
【０２００】Ｂ．ＴＲＰＣ１１ ＴＲＰＣ１１ベクターは合成コンセンサスＲＢＳ断片を
Ｃla Ｉリンカー(ＡＴＧＣＡＴ)にリゲートし、得られ
た断片をＣla Ｉ制限pＭＴ１１hc(あらかじめＣla Ｉ
部位を含むべく修飾されている)へクローニングするこ
とにより構築された。pＭＴ１１hcはπＶＸプラスミド
(マニアチスらにより記載、前掲)のＥcoＲＩ／ＨindＩ
ＩＩポリリンカー領域を保有するpＢＲ３２２の小型
(２.３Ｋb)高コピーＡＭＰR,ＴＥＴS誘導体である。こ
れはpＭＴ１１hcをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで制限し、
得られた粘着末端をフィルーインし、Ｃla Ｉリンカー
(ＣＡＴＣＧＡＴＧ)とリゲートさせ、これによりＥcoＲ
ＩおよびＢamＨＩ部位を再形成し、ＳmａＩ部位をＣla
Ｉ部位で置換することによって、Ｃla Ｉ部位を含有
すべく修飾された。
【０２０１】ＴＲＰＣ１１構成からの一形質転換はＣla
Ｉ部位によりフランクされた縦列ＲＢＳ配列を含んで
いた。Ｃla Ｉ部位の１つおよびＲＢＳ配列の第２コピ
ーの一部は、このプラスミドを、Ｐst Ｉで消化し、Ｂ
a１３１ヌクレアーゼで処理し、Ｅco ＲＩで制限し、４
種すべてのデオキシヌクレオシド三リン酸類の存在でＴ
４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより除去され
た。得られた３０−４０bp断片をＰＡＧＥにより採取
し、Ｓma Ｉ制限pＵＣ１２へクローニングした。次い
で、pＫＣ１０１(ニコルズらによりメソッズ・ イン・エ
ンザイモロジー,１０１巻,１５５頁(アカデミック・プ
レス・ニューヨーク、１９８３)に記載)から誘導された
２４８８bp 大腸菌trp Ｐ保有ＥcoＲＶ断片をＥcoＲ
Ｉ部位にクローニングし、ＴＲＰＣ１１の構築を完了し
た。これを図３１に示す。
【０２０２】ＴＲＰＣ１１をまずＣla ＩおよびＢamＨ
Ｉで消化し、これを精製し、次いで０.１μＭの下記合
成リンカー（配列番号２２および２３）を含有する標準
リゲーション溶液中でpcＤ−１２５のＥ coＲＶ／ＢamＨ
Ｉ断片と混合することによって、ＴＲＰＣ１１をヒトＩ
Ｌ−４cＤＮＡに関するベクターとして用いた。
【０２０３】 ＴＣＧ ＡＴＧ ＣＡＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＧＡＴ ＡＣ ＧＴＧ ＴＴＣ ＡＣＧ ＣＴＡ
【０２０４】挿入物を含むベクターを前記に従って選択
し、大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１中で増殖させた。ＩＬ
−４は下記により抽出された。ＪＭ１０１細胞をそれら
の培地中で音波処理し、遠心分離した。ペレットを４Ｍ
グアニジンおよび２mＭジチオスレイトールに再懸濁
し、再び遠心分離した。上層液を生物活性につき試験
し、pcＤ−１２５トランスフェクションしたＣＯＳ７細
胞の上層液のものに匹敵するＴＣＧＦ活性を示すことが
認められた。
【０２０５】実施例Ｖ．ウシヘルパーＴ細胞cＤＮＡラ
イブラリーに対するマウスおよびヒトＩＬ−４cＤＮＡ
プローブによるウシＩＬ−４の調製およびＣＯＳ７サル
細胞における一過性発現 マウスおよびヒトcＤＮＡプローブの組合わせにより誘
発されたウシ末梢血リンパ球(ＰＢＬ)から構築されたc
ＤＮＡライブラリーより、ＩＬ−４をコードするcＤＮ
Ａクローンを単離する。ウシcＤＮＡの代替供給源には
ＡＴＣＣのＮＢＬ動物系列コレクションに維持される数
種のウシ細胞系列が含まれる。処理法は実施例２に記載
されたものと実質的に等しい。ＣonＡによる誘発の約１
０時間後に細胞を採取する。mＲＮＡの抽出の場合と同
様に行われる。
【０２０６】マウスおよびヒトcＤＮＡプローブを共に
混合物として、または順次用いて、ウシＩＬ−４cＤＮ
Ａを検出する。実施例ＩＩの場合と同様に、Ｐst Ｉ断
片をマウスpcＤ−２Ａ−Ｅ３ cＤＮＡクローンから単
離する。同様にＰst Ｉ断片をヒトpcＤ−１２５ cＤ
ＮＡクローンから単離する。他の数種の断片もこれから
プローブを構成するために用いることができる。単離さ
れたＰst Ｉ断片を一緒に、または別個にニックトラン
スレーションにより標識し(約１×１０8cpm／μg)、こ
れを用いて１０プールからのプラスミドＤＮＡ調製物を
含むニトロセルロースフィルターをプローブ検出する。
各プローブは約１０００クローンの誘導ＰＢＬ cＤＮ
Ａライブラリーを示す。フィルターハイブリダイゼーシ
ョンは実施例ＩＩの場合と同様に行われた。陽性に採点
されるクローンを同定し、増殖させた。
【０２０７】実施例ＶＩ．ビール酵母菌における天然ヒ
トＩＬ−４およびムテインΔ 1-4 およびＩＳ 0 (Ｇly−Ａs
n−Ｐhe−Ｖal−Ｈis− Ｇly)の発現 天然ヒトＩＬ−４cＤＮＡおよびそれらの２種の突然変
異体をプラスミドpＭＦ−２８にクローニングし、ビー
ル酵母菌において発現させた。pＭＦ−２８の構成およ
び非酵母タンパク質発現への利用についてはミヤジマ
ら,ジーン,３７巻,１５５−１６１頁(１９８５):ミヤジ
マら,ＥＭＢＯ ジャーナル,５巻,１１９３−１１９７頁
(１９８６)に詳細に記載されている。pＭＦ−２８はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(マリー
ランド州,ロックビル)に受託番号４０１４０で寄託され
ており、プラスミドの地図は図３２に示されている(図
中の表示はミヤジマら,ジーン、(前掲)に詳細に定義さ
れている)。
【０２０８】Ａ．ヒトＩＬ−４ムテインΔ1-4 プラスミドpcＤ−１２５を単離し、ＥcoＲＶおよびＢ am
ＨＩで消化した。ヒトＩＬ−４cＤＮＡを含むＥc oＲＶ
／ＢamＨＩを単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩ(クレノー
断片)で処理してＢamＨＩ切断部をフィルーインし、キ
ナーゼ処理した(すなわちリン酸化)。pＭＦ−２８をＳt
u Ｉで消化し、pcＤ−１２５のキナーゼ処理ＥcoＲＶ
／ＢamＨＩ断片と標準リゲーション溶液中で混和し、プ
ラスミドphＩＬ−４−２を形成した。phＩＬ−４−２を
用いてビール酵母菌２０Ｂ−１２(ＭＴＡアルファtrp
１−２８９ pep４−３)(酵母遺伝子保存センター、カ
リフォルニア大学、バークレーから入手した)を形質転
換した。アミノ酸不含のイースト・ナイトロジェン・ベ
ース０.６７％、グルコース２％およびカザミノ酸(ディ
フコ)０.５％を含有する合成培地で酵母を増殖させた。
酵母細胞を上記プラスミドでイトーら、(ジェイ・バク
テリオロ・(Ｊ．Ｂacteriol．),１５３巻,１６３−１６
８頁(１９８３))の酢酸リチウム法により形質転換し、
形質転換体をトリプトファン欠如合成培地において選択
した。形質転換体培養物上層液をＴＣＧＦ活性について
試験した。図３２(曲線Ｄ)はphＩＬ−４−２形質転換し
た酵母細胞から得た上層液の希釈液数種のＴＣＧＦ活性
を他の因子と比較して示す(曲線Ａ………ヒトＩＬ−２;
曲線Ｂ………pcＤ−１２５トランスフェクションしたＣ
ＯＳ７細胞からの上層液;および曲線Ｃ………phＩＬ−
４−２形質転換した酵母細胞からの上層液)。曲線Ｅは
ＩＬ−４cＤＮＡ挿入物を欠如したpＭＦ−２８で形質転
換した酵母(すなわち“モック(mock)”形質転換体から
の上層液のＴＣＧＦ活性を示す。
【０２０９】Ｂ．ヒトＩＬ−４ムテインＩＳ0(Ｇly−Ａ
sn−Ｐhe−Ｖal−Ｈis−Ｇly) ムテインＩＳ0(Ｇly−Ａsn−Ｐhe−Ｖal−Ｈis−Ｇly)
の発現のためのpＭＦ−２８挿入物をムテインΔ1-4の場
合と同様に調製した。ただしpcＤ−１２５由来のＮaeＩ
／ＢamＨＩ断片を用いた。得られたプラスミドをphＩＬ
−４−１と表示した。phＩＬ−４−１形質転換した酵母
細胞から得た上層液の希釈液数種類をＴＣＧＦ活性につ
き試験した。結果は図３３の曲線Ｃによって示される。
上層液を抗ＩgＭおよびＳＡＣ活性化Ｂリンパ球の双方
においてＢＣＧＦ活性についても試験した。これらのア
ッセイは前記に従って行われ、結果は表４に示される。
【０２１０】
【表４】
【０２１１】Ｃ．酵母における天然ヒトＩＬ−４の発現 まずＮ末端Ｈisコドンの上流に塩基を挿入することによ
りＫpn Ｉ制限部位を形成することによって、ヒト天然
ＩＬ−４をコードするcＤＮＡをpＭＦ−α８にクローニ
ングした。Ｋpn Ｉで開裂し、ＤＮＡポメリラーゼＩで
処理した後、平滑末端ＩＬ−４cＤＮＡをpＭＦ−α８の
Ｓtu Ｉ部位に挿入した。Ｋpn Ｉ部位は標準的な部位
特異性突然変異誘発を採用して形成された。要約する
と、pcＤ−１２５をＢamＨＩで消化し、ヒトＩＬ−４c
ＤＮＡ全体を含む断片を単離し、Ｍ１３mp８のＢamＨＩ
部位へ挿入した。この挿入物を含む一重鎖Ｍ１３mp８を
単離し、プライマーとして作用する下記の合成オリゴヌ
クレオチド（配列番号２４）にハイブリダイゼーション
した。
【０２１２】
【化２】
【０２１３】挿入されたヌクレオチドを四角で囲んだ。
突然変異ＩＬ−４cＤＮＡを含むプラスミドをオリゴヌ
クレオチドプローブにより同定し、増殖させ、単離し、
ＫpnＩおよびＢamＨＩで処理した。Ｋpn Ｉ／ＢamＨＩ
断片を単離し、ＤＮＡポメリラーゼＩ(クレノー断片)で
処理して平滑末端となし、キナーゼ処理し、ＳtuＩ消化
pＭＦ−α８とリゲートさせた。得られたpＭＦ−α８プ
ラスミド(phＩＬ−４−３と表示)により前記に従って酵
母を形質転換し、上層液をＴＣＧＦ活性について試験し
た。上層液はphＩＬ−４−１形質転換した酵母について
観察されたものに匹敵するＴＣＧＦ活性を示した。
【０２１４】実施例ＶＩＩ．大腸菌における合成 ヒトＩ
Ｌ−４遺伝子の構成および発現 実質的に菌の好ましいコドンからなり、一連の唯一の制
限エンドヌクレアーゼ部位(ここでは“唯一の制限部
位”と呼ぶ)を含み各種のヒトＩＬ−４ムテインを速や
かにかつ簡便に発現させることができる合成ヒトＩＬ−
４遺伝子を構築する。この合成遺伝子のヌクレオチド配
列を図１９に示す（配列番号４）。この例の合成遺伝子
を構築および発現するための方法は分子生物学の分野で
標準的である。たとえば特にスプロートおよびゲイト、
ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ,１３巻,２９５９−
２９７７頁(１９８５);およびフェレッティら,プロシ・
ナシ ョナル・アカデ・サイ (Ｐroc．Ｎatl．Ａca d．Ｓ
ci．),８３巻,５９９−６０３頁(１９８６):が参照され
るが、ムインバッハら,ジェイ・ バイオロ・ケミ (Ｊ．
Ｂi ol．Ｃhem．),２６１巻、７１９−７２２頁(１９８
６);ウェルズら,ジーン,３４巻,３１５−３２３頁(１９
８５);およびエステルら,サイエンス,２３３巻,６５９
−６６３頁(１９８６)も参照される。すなわち合成ヒト
ＩＬ−４遺伝子は化学的に合成された複数の二重鎖ＤＮ
Ａ断片から組立てられる。組立てられた合成遺伝子が一
連の唯一の制限部位を含むように合成遺伝子の塩基配列
が選ばれる。
【０２１５】この一連の唯一の制限部位が、容易に切除
されかつ異なる塩基配列をもつセグメントと置換されう
る一連のセグメントを規定する。かく合成断片は直接
に、または他の断片とのリゲーションに、適切なベクタ
ー、たとえばpＵＣプラスミドなどに挿入される。上記
各セグメントはウェルズら(前掲)の“カセット”にほぼ
対応する。合成断片は標準法により合成さる。たとえば
ゲイト,オリゴヌクレオチド合成:実用的な方 法(ＩＲＬ
プレス、英国オックスフォード,１９８４)。好ましくは
自動合成装置、たとえばアプライド・バイオシステムズ
社(カリフォルニア州、フォスター・シティー)モデル３
８１Ａが用いられる。pＵＣプラスミドなどのベクター
は市販されている(たとえばファルマシア−ＰＬ、また
はベーリンガー−マンハイム)。クローニングおよび発
現は標準的な細胞系、たとえば大腸菌Ｋ−１２株、ＪＭ
１０１,ＪＭ１０３などにおいて行うことができる。(ピ
エラおよびメッシング,ジーン,１９巻,２５９−２６８
頁(１９８２)に記載)。
【０２１６】制限エンドヌクレアーゼ消化およびリガー
ゼ反応は標準法により行われる。たとえばマニアチス
ら,分子クローニング:実験室の手引(コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリーズ、ニューヨーク、１９
８２)。
【０２１７】小規模プラスミド調製にはアルカリ法(マ
ニアチスら,前掲)が採用される。大規模調製にはアルカ
リ法の変法が採用され、この場合は等容量のイソプロパ
ノールを用いて、透明化された細胞溶解液から核酸を沈
澱させる。２.５Ｍ酢酸アンモニウムを用いる沈澱法に
よりＲＮＡ除去した後、塩化セシウム平衡密度勾配遠心
分離、および臭化エチジウムによる検出を行う。
【０２１８】ハイブリダイゼーション後の濾過のために
はワットマン５４０フィルターサークルを用いてコロニ
ーを取り上げ、ついでこれを０.５Ｍ・ＮaＯＨ、１.５
Ｍ・ＮaＣl;１ＭトリスＨＣl(pＨ８.０),１.５Ｍ・Ｎa
Ｃl(各２分);および８０℃における加熱(３０分)によ
り、順次処理することによって細胞溶解し、固定する。
ハイブリダイゼーションは６ＸＳＳＰＥ、２０％ホルム
アミド、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、１
００μg／ml大腸菌tＲＮＡ、１００μg／mlクーマシー
・プリリアント・ブルーＧ２５０(バイオラド)中で４２
℃において６時間、32Ｐ標識(キナーゼ処理)合成ＤＮＡ
を用いて行われる。(２０×ＳＳＰＥはＮaＣl １７４
g,ＮaＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ２ ７.６g、およびＥＤＴＡ７.
４gをＨ2Ｏ８００mlに溶解し、ＮaＯＨによりpＨを７.
４に調整し、容量を１lに調整し、オートクレーブ処理
により滅菌することによって調製される)。
【０２１９】フィルターを１xＳＳＰＥ０.１％ＳＤＳで
２回(室温で１５分間)洗浄する。オートラジオグラフィ
ー(フジＲＸフィルム)後に、再増殖したコロニーをフィ
ルター上の青色に着色したコロニーに整列させることに
より陽性コロニーの位置を決定する。
【０２２０】ＤＮＡ配列はマキサムおよびギルバート
(メソッズ・イン・エンザイモロジー,６５巻,４９９頁
(１９８０)の化学的分解法、またはサンガーら(プロシ
・ナショナル・アカデ・サイ),(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．
Ｓci．)．,７４巻,５４６３頁(１９７７)のジデオキシ
法により決定される。ジデオキシ反応の鋳型はＭ１３mp
ベクターに再クローニングされた関連領域の一重鎖ＤＮ
Ａ(たとえばメッシングら,ヌクレイック・アシッヅ・リ
サ,(Ｎucleic Ａcids Ｒes．),９巻,３０９頁(１９８
１)、またはミニアルカリ法により調製され、０.２Ｍ．
ＮaＯＨで変性され(５分、室温)、０.２Ｍ．ＮaＯＨ、
１.４３Ｍの酢酸アンモニウムから２容量のエタノール
の添加により沈澱した二重鎖ＤＮＡである。ジデオキシ
反応は４２℃で行われる。
【０２２１】ＤＮＡはアプライド・バイオシステムズ３
８０Ａ合成装置を用いてホスファーアミダイト化学によ
り合成される。合成、脱保護基、開裂および精製(７Ｍ
尿素ＰＡＧＥ、溶離、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラ
フィ)は３８０Ａ合成装置取扱い説明書の記載に従って
行われる。クローニングすべき相補的な合成ＤＮＡ鎖
(各４００ng)を混合し、５０μlの反応容積でポリヌク
レオチドキナーゼによってリン酸化する。このＤＮＡを
適宜な制限酵素で消化したベクターＤＮＡ１μgとリゲ
ートし、リゲーションする。リゲーションは５０μlの
容量で室温において行われる。リン酸化、制限酵素によ
る消化、ポリメラーゼ反応、およびリゲーションの条件
は文献に記載されている(マニアチスら、前掲)。アンピ
シリン、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシ
ド(ＩＰＩＧ)(０.４mＭ)および５−ブロム−４−クロル
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド(x−ga
l)(４０μg／ml)を補充したＬ寒天上で平板培養するこ
とにより、コロニーをlacＺ+について採点する(所望に
より)。
【０２２２】ＴＡＣ−ＲＢＳベクターは、tacＰ−保有
プラスミドpＤＲ５４０(ファルマシア)の単一ＢamＨＩ
部位をＤＮＡポメリラーゼによりフィルーインすること
に始まる一連の工程により構築される。次いで生成物を
非リン酸化合成オリゴヌクレオチドにリゲートさせると
コンセンサスリボソーム結合部位(ＲＢＳ、ＧＴＡＡＧ
ＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣ)をコードする二重鎖断片が形成
される。リゲーション後に混合物をリン酸化し、Ｓst
ＩリンカーＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴ と再リゲートさせ
る。得られた複合体を次いでＳst ＩおよびＥcoＲＩで
開裂し、１７３bpの断片をポリアクリルアミドゲル電気
泳動(ＰＡＧＥ)により単離し、Ｅco ＲＩ／Ｓst Ｉ制限
pＵＣ１８(ファルマシア)にクローニングする(後述)。
最終構築物(ＴＡＣ−ＲＢＳと呼ぶ)のＲＢＳ−ＡＴＧポ
リリンカー領域の配列を図２８に示す。
【０２２３】合成ヒトＩＬ−４遺伝子は６工程でpＵＣ
１８プラスミド中へ組込まれる。各工程１で挿入された
ＡＴＧ開始コドンと共にフレーム内に維持することによ
り、欠失を含まない挿入物および／または挿入物を検出
することができる。欠失および／または挿入変化を含む
クローンはx−galおよびＩＰＩＧを含有するＬ−アンピ
シリン平板上で青色のコロニーを計数することによって
排除することができる。あるいは各工程で、小規模プラ
スミドＤＮＡ調製物についての万能配列決定プライマ
ー、たとえば(ベーリンガー・マンハイムから得られる
もの)を用いて挿入物の配列を容易に確認することがで
きる。
【０２２４】工程１ではＴＡＣ−ＲＢＳベクターをＳst
Ｉで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポメリラーゼ(その３'エキ
ソヌクレアーゼ活性がＳst Ｉ切断部の３'突出鎖を消
化して、平滑末端断片を形成する)で処理し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡポメリラーゼを不活化した後ＥcoＲＩで処理する
と、ＴＡＣ−ＲＢＳ領域を含み、ＡＴＧ開始コドン部に
平滑末端をもち、その反対側にＥcoＲＩ末端をもつ１７
３塩基体(bp)の断片が形成される。最後に１７３bpのＴ
ＡＣ−ＲＢＳ断片を単離する。
【０２２５】工程２では、工程１の単離されたＴＡＣ−
ＲＢＳ断片をＥcoＲＩ／ＳstＩ消化プラスミドpＵＣ１
８および合成断片１Ａ／Ｂと混合する。後者は図２１に
示すようにその上流末端に平滑末端をもち、その下流末
端にはＳst Ｉに対応する粘着末端をもつ。この断片を
リゲートして工程２のpＵＣ１８を形成する。
【０２２６】工程３では、合成断片２Ａ／Ｂ(図２２お
よび図２３に示す)を工程２のＳstＩ／ＢamＨＩ消化pＵ
Ｃ１８(増幅および精製の後)と混合し、リゲートして、
工程３のpＵＣ１８を形成する。断片２Ａ／Ｂの下流末
端が付加的な塩基を含み、これがＢamＨＩ粘着末端を形
成する点を留意されたい。これらの付加的塩基は工程４
で開裂する。同様に２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂは相補的な
９残基一重鎖末端を備えており、これらが混和された際
にアニールし、２Ａ／Ｂの上流Ｓst Ｉ切断部および３
Ａ／Ｂの下流ＢamＨＩ切断部を残し、pＵＣ１８にリゲ
ートする。
【０２２７】工程４では、工程３のＭlu Ｉ／ＸbaＩ消
化pＵＣ１８(増幅および精製の後)を再精製し、合成断
片４Ａ／Ｂ８(図２４）と混合し、リゲートして、工程
４のpＵＣ１８を形成する。
【０２２８】工程５では、工程４のＸbaＩ／ＳalＩ消化
pＵＣ１８(増幅および精製の後)を５Ａ／Ｂの合成断片
(図２５)と混合し、リゲートして、工程５のpＵＣ１８
を形成する。
【０２２９】工程６では、工程５のＳalＩ／ＨindＩＩ
Ｉ消化pＵＣ１８(増幅および精製の後)を合成断片６Ａ
／Ｂ(図２６)と混合し、リゲートして、最終構成を形成
する。
【０２３０】図２０は上記のpＵＣ１８構成に存在する
唯一の制限部位の開裂マップである。開示された合成ヒ
トＩＬ−４遺伝子をpＵＣ１８の挿入物として用いた場
合、唯一の制限部位各対は、容易に切除され、他の合成
断片と置換しうるセグメントを規定する。この唯一の制
限部位の組にはＥcoＲＩ,ＨpaＩ,ＳacＩ,(ＳstＩ),Ｅco
ＲＶ,ＰstＩ,ＭluＩ,ＢclＩ,ＸbaＩ,ＮaeＩ,ＳalＩ,Ｘh
oＩ,およびＨindＩＩＩが含まれる。
【０２３１】合成ＩＬ−４遺伝子を含むpＵＣ１８を大
腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１に挿入する。培養後にＪＭ１
０１から蛋白質を抽出し、抽出後の希釈液を生物活性に
つき試験する。
【０２３２】実施例ＶＩＩＩ．大腸菌におけるヒトＩＬ
−４ムテインＩle 5 2 の構成および発現 位置５２(天然ヒトＩＬ−４のＮ末端に対し)のＬeuをＩ
leに変えて、ヒトＩＬ−４ムテインＩle52を形成する。
図１９の合成ヒトＩＬ−４遺伝子を含む実施例ＶＩＩの
pＵＣ１８プラスミドをＰstＩおよびＭluＩで消化し、
精製する。この精製プラスミドを下記の合成二重鎖断片
（配列番号２５および２６）と混合し、リゲートさせ
る。変化させた部分の塩基配列を四角で囲む。得られた
pＵＣ１８を大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１などにトラン
スフェクションし、発現させる。
【０２３３】
【化３】
【０２３４】ヒトＩＬ−４ムテインＩle 52 を得るための
ＰstＩ／ＭluＩ置換用断片 培養後に標準法によりタンパク質をＪＭ１０１細胞から
抽出し、抽出液の希釈液を生物活性につき試験する。
【０２３５】実施例ＩＸ．ヒトＩＬ−４ムテイン(Ｉle
52 ,Ａsp 111 )の構築および発現 実施例ＶＩＩＩの修飾されたpＵＣ１８プラスミド(Ｉle
52コード配列を含む)をＳalＩおよびＸhoＩで消化し、
大型断片を単離する。単離された断片を標準リゲーショ
ン溶液中で下記の合成二重鎖断片（配列番号２７および
２８）と混合する。セグメントの変化させた部分を四角
で囲む。得られたプラスミドを大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１
０１などにトランスフェクションし、発現させる。
【０２３６】
【化４】
【０２３７】ＳalＩ／ＸhoＩ置 換用断片 培養後に標準法によりタンパク質をＪＭ１０１から抽出
し抽出液の希釈液を生物活性につき試験する。
【０２３８】実施例Ｘ．トランスフェクションした上清
から精製したヒトＩ Ｌ−４の配列 ヒトＩＬ−４ cＤＮＡを含むベクターで一過性トラン
スフェクションした細胞の培養上清からヒトＩＬ−４を
精製した。精製した物質を用いて分泌された天然型ヒト
ＩＬ−４の配列を決定した。
【０２３９】Ａ．精製のための生物学的アッセイ 分離工程を通じてヒトＩＬ−４をアッセイするためにＴ
ＣＧＦ活性を用いた。このアッセイは実施例ＩＩで記載
した方法と実質的に同じである。簡単に述べると、健康
な給与者(ドナー)から得た血液をヘパリン化チューブに
入れて、フィコール−ヒパーク(Ｆicoll−Ｈypaque)の
上に層とした;例えば１５mlの遠沈管中でフィコール−
ヒパーク３mlあたり血液５mlとする。３０００xgで２０
分間遠心分離した後、表面の細胞を吸引し、１０％ウシ
胎児血清、２−メルカプトエタノール５０μlフィトヘ
マグルチニン(ＰＨＡ)２０μg／mlおよび組換えヒトＩ
Ｌ−２を含むＲＰＭＩ１６４０からなる成長培地中に希
釈した。３７℃で５〜１０日間インキュベーションした
後、ＰＨＡ−刺激末梢リンパ球(ＰＢＬ)を洗浄し、モス
マン(Ｍossmann),Ｊ．Ｉmmonol．Ｍethods,６,５５〜６
３(１９８３)に記載の２日間の比色分析アッセイに用い
た。ＩＬ−４標準品(pcＤ−１２５)またはpＥＢＴ−１
７８でトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞からの
上清)の連続２倍希釈物または試験すべき分画を９６ウ
ェルのトレー上に上記した成長培地を用いて調製し、最
終容量を５０μl／ウェルとした。各ウェルに約４〜８
×１０6細胞／mlのＰＨＡ−刺激ＰＢＬ５０μlを加え、
トレーを３７℃で２日間インキュベートした。次いでモ
スマン(同上)の方法によって細胞成長を刺激した。
【０２４０】ヒトＩＬ−４ＴＣＧＦ活性の単位はpcＤ−
１２５でトランスフェクションした ＣＯＳ７細胞(実施例ＩＩ)またはpＥＢＶ−１７８でト
ランスフェクションした ＣＯＳ７細胞(実施例ＩＩＩ)のいずれかに関して定めら
れる。
【０２４１】精製のためには、以下のようにして産生さ
れるpcＤ−１２５でトランスフェクションした上清の活
性に基づいて単位を定める。約１×１０6個のＣＯＳ７
細胞をダルベッコの改変イーグル培地(ＤＭＥ),１０％
ウシ胎児血清および４mＭ Ｌ−グルタミンを含有する
１００mmの組織培養プレート上に播種した。播種２４時
間後に培地をプレートから吸引し、そして細胞を血清不
含緩衝化(５０mＭトリス)ＤＭＥで２回洗浄した。各プ
レートに血清不含緩衝化ＤＭＥ４ml(４mＭＬ−グルタミ
ンを含む),ＤＥＡＥ−デキストラン８０μlおよびpcＤ
−１２５ＤＮＡ５μgを加えた。この混合物中で細胞を
３０℃にて４時間インキュベーションし、その後混合物
を吸引除去し、そして細胞を血清不含緩衝化ＤＭＥで１
回洗浄した。洗浄後、４mＭ Ｌ−グルタミンを含むＤ
ＭＥ５ml,１００μＭクロロキンおよび２％ウシ胎児血
清を各プレートに加え、細胞を３時間インキュベーショ
ンし、その後血清不含緩衝化ＤＭＥで２回洗浄した。次
いで、４mＭ Ｌ−グルタミンおよび４％ウシ胎児血清
を含むＤＭＥ５mlを加えて細胞を３７℃にて２４時間イ
ンキュベーションした。細胞をＤＭＥまたはＰＢＳで１
〜３回洗浄した後、血清不含ＤＭＥ５ml(４mＭ Ｌ−グ
ルタミン含有)を加え、そして細胞を３７℃で培養し、
５日後に培養上清を回収した。
【０２４２】本明細書中で使用する１単位とは、２×１
０4個のＰＨＡ−刺激ＰＢＬの５０％最大増殖を刺激す
る１ウェル(０.１ml)あたりの因子量である。
【０２４３】Ｂ．精製 精製は陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過およ
び逆相高速液体クロマトグラフィーを順次用いて行っ
た。全ての操作を４℃で実施した。
【０２４４】遠心分離によってＣＯＳ７細胞を除去した
後、上清を限外濾過によって約１０倍に濃縮し、そして
次の工程に用いるまで−８０℃で保存した。ＩＬ−４の
力価は上記の標準的アッセイ法を用いることによってフ
ィトヘマグルチニン−誘導ヒト末梢血リンパ球の増殖を
刺激するタンパク質の活性、即ちＴＣＧＦ活性をアッセ
イすることによって決定した。
【０２４５】約１０4〜１０6単位／mlのＴＣＧＦ活性と
約１５〜２０mg／mlのタンパク質含量を有する濃縮ＣＯ
Ｓ７の上清を５０mＭ ＨＥＰＥＳナトリウム,pＨ７.０
を２回取りかえて２４時間透析する(１回の外液量は濃
縮分物の約１０〜１５倍容量である)。透析液をあらか
じめ５０mＭ ＨＥＰＥＳナトリウム,pＨ７.０で平衡化
しておいたＳ−セファロースのカラム(１×２.５cm,流
速:０.２ml／分)にかけた。カラムをカラムの１５倍容
量の平衡緩衝液で洗浄し、次いでカラムの２０倍容量の
直線的塩化ナトリウムグラジエント(５０mＭ ＨＥＰＥ
Ｓナトリウム,pＨ７.０中の０〜０.５Ｍ塩化ナトリウ
ム)を用いて溶出した。５倍容量の固定濃度液(５０mＭ
ＨＥＰＥＳナトリウム,０.５Ｍ ＮaＣl pＨ７.０)で
溶出することによってグランジエントを終了させた。夫
々のバッチから１.５mlおよび１.８mlの分画を回収し
た。３００mＭから５００mＭ塩化ナトリウムで溶出した
両方のクロマトグラフィーにＩＬ−４力価が見い出され
た。
【０２４６】ＩＬ−４力価を含む各Ｓ−セファロースカ
ラムからの６つの分画を全容量が９.０および１０.８ml
となるように別途合せた。両方の容量をアミコンＹＭ５
膜(分子量カットオフ:５,０００)を用いる限外濾過によ
って１.９mlに濃縮した。この工程からのタンパク質の
回収率は約８０％であった。濃縮したＩＬ−４溶液をあ
らかじめ５０mＭ ＨＥＰＥＳ,０.４Ｍ ＮaＣl,pＨ７.
０で平衡化しておいたセファデックスＧ−１００カラム
(１.１×５８cm)に装填し、カラムを同じ緩衝液で０.１
５ml／分の速度で溶出した。全部で５０分画(１.０ml／
分画)を回収し、そのＩＬ−４力価を分析した。生物活
性のピークはみかけ分子量２２,０００ダルトンのあた
りに認められた。ウシ血清アルブミン(６５,０００ダル
トン),炭酸脱水酵素(３０,０００ダルトン)およびチト
クロームＣ(１１,７００ダルトン)を用いてセファデッ
クスＧ−１００カラムの見掛け分子量の決定を行った。
【０２４７】ＩＬ−４活性を有するセファデックスＧ−
１００カラムからの分画を真空下に３〜４倍に濃縮し、
これをバイダックＣ−４ガードカラム(４.６×２０mm)
に注入した。０.１％(v／v)トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)
中の０〜７２％(v／v)アセトニトリルの直線的グランジ
エントで１５分かけてカラム温度３５℃,流速１.０ml／
分にて溶出した。２１４nmで検出したところ、保持時間
７,８.２および８.７分に３つのピーク(それぞれ図２９
のピーク１、２および３)が観察された。ピーク２(溶出
時間８.２分)の４０μlアリコートを凍結乾燥し、そし
て１０％ウシ胎児血清を含む最小必須培地中に再溶解し
た。この溶液は陽性のＴＣＧＦ反応を示した。ピーク２
の３００μlを蒸発乾固して０.１％(w／v)ドデシル硫酸
ナトリウム(ＳＤＳ)２００μl中に再溶解した。その２
μlを１％(v／v)ＴＦＡ２００μl中に希釈して再クロマ
トグラフに付した。この試料のＨＰＬＣは２１５nmに単
一ピークを示した。ピーク２の物質は約７×１０8単位
／mgの活性を有することを示した。
【０２４８】Ｃ．アミノ酸配列分析 アミノ酸配列の決定はアプライド・バイオシステムズ社
の微量配列分析機を用いて自動ガス相エドマン分解法
[Ｒ．Ｍ．ヘウイック(Ｈewick),Ｍ．Ｗ．フンカピラー
(Ｈunkapillar),Ｌ．Ｅ．フッド(Ｈood)およびＷ．Ｊ．
ドレイヤー(Ｄryer),Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２５６ ７９
９０(１９８１)参照]によって実施した。ピーク２のＨ
ＰＬＣ分画９０μlを上記のように０.１％ＳＤＳに溶解
して、ポリブレン(Ｐolybrene)の存在下にグラスファイ
バーフィルターカートリッジに装填した。３５番目の残
基までのアミノ酸配列の情報が得られた。Ｎ−末端の配
列は以下の通りである。
【０２４９】 Ｈis - Ｌys - Ａsd - Ｉle - Ｔhr - Ｌeu - Ｇln - Ｇlu - Ｉle - Ｉle - Ｌys - Ｔhr - Ｌeu - Ａsn - Ｓer - Ｌeu - Ｔhr - Ｇlu - Ｇln - Ｌys - Ｔhr - Ｌeu - - Ｔhr - Ｇlu - Ｌeu - - Ｖal - Ｔhr - Ａsp - Ｉle - Ｐhe - Ａla - Ａla (式中、空欄は同定しうるアミノ酸が欠如していること
を示す。)
【０２５０】アミノ末端における第３位および２３位の
空欄はこの決定では検出されないシステインの存在と一
致した。cＤＮＡの予測配列ではトレオニンに対応する
第２８位の空欄はフェニルチオヒダントイン・トレオニ
ン検出の代わり易さによるものか或いはＯ−結合グリコ
シル化またはエステル化の存在によるものであるかも知
れない。
【０２５１】アミノ末端配列に用いたＨＰＬＣ分画１０
０μlを蒸発乾燥して７０％ギ酸に再溶解した。５０倍
モル過剰の臭化シアンを加えてこの溶液を室温に２.５
時間おいた。開裂したタンパク質を上記のようにアプラ
イド・バイオシステム社のガス相配列決定機にかけて配
列の決定を行った。以下の２つの配列が同定された。
【０２５２】 (１) Ａrg - Ｇlu - Ｌys - Ｔyr - Ｓer - Ｌys (２) Ｈis - Ｌys - - Ａsp - Ｉle - Ｔhr
【０２５３】配列(１)は、第１２０位のメチオニン残基
を臭化シアン分解することにより得られたcＤＮＡの予
測配列と同じである。Ｃ末端の最後の２残が存在してい
たかも知れないが、試料が不十分であったために検出さ
れなかったのかも知れない。配列(２)は上記したよう
に、天然型ＩＬ−４タンパク質として得られたアミノ末
端配列と同じである。得られたアミノ末端およびカルボ
キシル末端のフェニルチオヒダントイン−アミノ酸の相
対的量は試料中に両配列が等モル量存在することを示唆
した。この結果は、配列決定に用いたタンパク質試料が
ヒトＩＬ−４のcＤＮＡ配列から予測されたアミノ末端
およびカルボキシル末端を有する単一のポリペプチド鎖
を主して含んでいたという結論を支持する。
【０２５４】実施例ＸＩ．ヒトＩＬ−４突然変異タンパ
ク質(Ｉle52,Δ71,ＩＳ94(Ａla))の創製および発現 実施例ＶＩＩＩの修飾プラスミドpＵＣ１８(Ｉle52をコ
ードする配列を含む)をＭluＩおよびＢclＩで切断し、
大きいフラグメントを単離した。単離したフラグメント
を標準連結用溶液中で以下に記載の合成二本鎖フラグメ
ント（配列番号２９および３０）と混合した。得られた
プラスミドを大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１株等にトラン
スフェクションして増殖した。
【０２５５】
【化５】
【０２５６】ＭluＩ／ＢclＩ置 換フラグメント 修飾プラスミドを単離してＸbaＩおよびＮaeＩで切断
し、大きいフラグメントを単離した。単離したフラグメ
ントを標準連結溶液中で以下に記載の合成二本鎖フラグ
メント（配列番号３１および３２）と混合した。追加し
たコドンを箱で囲んだ。得られたプラスミドを大腸菌Ｋ
−１２ＪＭ１０１株等にトランスフェクションして発現
させた。
【０２５７】
【化６】
【０２５８】ＸbaＩ／ＮaeＩ置 換フラグメント 培養後、タンパク質を標準手法によってＪＭ１０１細胞
から抽出し、抽出物の希釈物の生物活性をアッセイし
た。
【０２５９】実施例ＸＩＩ．裸リンパ球症候群(bare l
ymphocyte syndrome) 患者からの細胞上にあるＤＮ 抗原
の誘導 裸リンパ球症候群は細胞表面のＨＬＡ抗原クラスＩおよ
び／またはクラスＩＩの発現を欠くことを特徴とし、ま
たしばしば重篤な免疫不全を伴う[例えばツーレイン(Ｔ
ouraine),Ｌancet,３１９〜３２１(１９８１．２．７);
ツーレインおよびベテル(Ｂethel),Ｈuman Ｉmmunol og
y,２,１４７〜１５３(１９８１);およびサリバン(Ｓull
ivanら,Ｊ．Ｃlin． Ｉnvest．,７６,７５〜７９(１９８
５)を参照のこと]。ヒトＩＬ−４は裸リンパ球症候群患
者に由来する細胞表面上のクラスＩＩＤＲ抗原の発現を
誘導しうることが見い出された。
【０２６０】ＨＬＡクラスＩＩ抗原の非発現に悩む患者
から末梢リンパ球(ＰＢＬ)を採取した。このＰＢＬから
上記の方法でＢ細胞を精製,そしてエプソン−バールウ
イルス(ＥＢＶ)を用いて形質転換することによってＢ細
胞系(ＵＤ３１と命名)を樹立した。ＥＢＶで形質転換さ
れた細胞は、２ウシ胎児血清および５％(v／v)濃度のpc
Ｄ−１２５でトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞を
含むイッセル培地(上述)中で４８時間培養した。細胞を
収穫し、固定し、蛍光標識した抗−ＤＲモノクローナル
抗体(例えばベクトン・ディッキンソン社のＬ２４３)で
染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。図２
８はＩＬ−４処理前に収穫したＥＢＶ−形質転換細胞の
対照数(曲線Ａ)およびＩＬ−４処理後のＥＢＶ−形質転
換細胞数(曲線Ｂ)の各蛍光強度に対する細胞頻度のヒス
トグラムを表す。
【０２６１】実施例ＸＩＩＩ．Ｃ１．Ｌy１ + ２ - ／９(Ｃ
１．１) 上清のＭＣＧＦ活性 精製ＩＬ−３およびＩＬ−３ cＤＮＡクローンでトラ
ンスフェクトしたＣＯＳ７細胞からの上清(組換えＩＬ
−３;ＩＬ−３R)は肥満細胞系ＭＣ／９の増殖を同程度
に刺激した(図３４Ａ)。しかしながら、このレベルはＣ
１．１Ｔ細胞上清によって誘導されたレベルの１／３〜
１／２であった。Ｔ細胞上清中のＣonＡの存在(２μg／
ml)はそのＭＣＧＦ活性に有意に寄与しない。上記効果
の説明として、Ｃ１．１細胞によって産生されるＭＣＧ
Ｆ活性の全てがＩＬ−３によるものではないということ
が考えられる。あるいは、アッセイに使用した肥満細胞
系が細胞の第２の要因に依存する集団で汚染されていた
ということも(理論的には)考えられる。しかしながら、
後の説は排除される。何故なら、ＭＣ／９細胞の再クロ
ーン化はサブクローンを生産し、各サブクローンはＩＬ
−３および元のＭＣ／９クローンと同様の細胞上清に対
応するからである。
【０２６２】Ｃ１．１の上清はＩＬ−３以外のリンホカ
インも含んでいるのでこれらのもののＭＣ／９細胞の生
育増強能を試験した。しかしながら、ＭＣ／９細胞は各
種濃度の組換えＩＬ−２,ＩＦＮ ＪおよびＧＭ−ＣＳ
Ｆに対して反応を示さず、またＩＬ−１を上清(Ｐ３８
８Ｄ１細胞)に対しても反対を示さなかった(図３４
Ａ)。更に、各種濃度の組換えＩＬ−３とＩＬ−２,ＧＭ
−ＣＳＦ,ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１を含む培養物を補
充してもＩＬ−３単独で得られるレベル以上にＭＣ／９
細胞の増殖を刺激しなかった。このことは、Ｔ細胞上清
のＭＣＧＦ活性の増加は、これらの既知の因子を含有す
ることによるものではないことを示唆している。
【０２６３】他の因子に依存する細胞系との比較研究 他の２種の肥満細胞であるＤＸ−２およびＭＭ３もまた
ＩＬ−３よりもＣ１．１上清を用いた方より高い増殖反
応を示した(ＤＸ−２についての代表的なデータを図３
４Ｂに示す)。これらの細胞は、ＩＬ−２,ＩＦＮ−γ,
ＧＭ−ＣＳＦまたはＰ３８８Ｄ−１細胞に対して反応し
なかった。従って、Ｔ細胞上清に対するＭＣ／９細胞の
増殖増強反応は肥満細胞一般にいえることなのかも知れ
ない。これとは対照的に、顆粒球性細胞(ＮＦＳ−６０)
はＩＬ−３およびＣ１．１上清によってほぼ同等に刺激
された(図３４Ｃ)。ＮＦＳ−６０細胞はＩＬ−２,ＩＦ
Ｎ−γおよびＰ３８８Ｄ−１上清に対して反応しなかっ
たが、ＧＭ−ＣＳＦによって少しではあるが再現性のあ
る刺激を示した。ＩＬ−３およびＴ細胞上清が同程度の
レベルの増殖を誘導するという事実は、ＮＦＳ−６０細
胞系がＴ細胞上清中に存在する付加的な因子に対して比
較的非感受性であるかも知れないということを示唆す
る。従って、ＮＦＳ−６０細胞を、タンパク質分画によ
ってＩＬ−３をその他のＭＣＧＦ活性体から分離する試
みにおいてＩＬ−３のアッセイに用いた。
【０２６４】Ｃ１．１上清のＴＣＧＦ活性をＩＬ−２依
存性Ｔ細胞系ＨＴ２を用いて評価した。Ｃ１．１上清の
飽和濃度は、組換えＩＬ−２で達成される最高レベルよ
りも十分低いレベルでの3Ｈ−チミジンの取り込みを一
定に刺激した(図３４Ｄ)。同様の結果が他の２つの細胞
系でも得られた。上記上清をＩＬ−２を含有するＨＴ２
培養物に添加しても3Ｈ−チミジンの取り込みを全く減
少させなかったので該上清は阻害物質を含んでいない
(図３４Ｄ)。これらの結果はＣ１．１上清がＩＬ−２と
は異なるＴＣＧＦ活性を含んでいることを示している。
この結論を支持する性化学的根拠を以下に示す。
【０２６５】Ｃ１．１上清の予備的クロマトグラフィー
分画 ＩＬ−３を他のＭＣＧＦ活性体から分離するという目的
のために各種のクロマトグラフィー法を用いてＣ１．１
上清を分画した。ＭＣ／９増殖によって明らかにされた
全ＭＣＧＦ活性のバックグラウンドに対するＩＬ−３を
特異的に追跡するためにＮＦＳ−６０細胞の増殖を用い
た。ＴＣＧＦ活性はＨＴ２細胞増殖によってアッセイし
た。
【０２６６】Ｃ１．１上清を中性pＨにおいて陽イオン
交換クロマトグラフィーで分画したところ、充填したタ
ンパク質の約９８％,ＩＬ−３単位の９７％(ＮＦＳ−６
０増殖によるアッセイにおいて)およびＴＣＧＦ単位の
１％がフロースルー中に出現した(図３５)。結合したタ
ンパク質を塩化ナトリウムのグラジエントで溶出したと
ころ、０.１９Ｍ ＮaＣl(フラクション６０)でＴＣＧ
Ｆ活性が放出された。小さいながらも再現可能なＴＣＧ
Ｆ活性のピークも１Ｍ ＮaＣlでみられた。これ以上の
高いＮaＣl濃度(３Ｍまで)にしても更に有意なＴＣＧＦ
活性は溶出しなかった。ＴＣＧＦのピークとほぼ同じ領
域に少量のＩＬ−３にも溶出した(ＮＦＳ−６０応答に
て検出可能)。ＴＣＧＦ活性のピークに対応する分画(フ
ラクション５９〜６１)およびフロースルー(フラクショ
ン１〜２０)のみが分画上清に比較して高レベルのＭＣ
／９増殖を刺激した(図３５,矢印)。滴定曲線はフラク
ション５９〜６１の方がフロースルーよりも高レベルの
ＭＣＧＦ活性を含んでいることを示唆したので、ＴＣＧ
Ｆピークと同時溶出するＩＬ−３活性を更に減らして再
度ＭＣ／９増殖レベルを評価する試みを行った。そこで
フラクション５９〜６１を同じ条件で更に２回再クロマ
トグラフィーに付した。
【０２６７】３回カラムを通した後は、９５％以上のＴ
ＣＧＦ活性が終止一貫して０.１９Ｍ ＮaＣlで溶出し
た。フロースルー中、あるいはどのカラムフラクション
も測定しうるＩＬ−３(ＮＦＳ−６０応答)は見られなか
った。しかしながら、ＴＣＧＦピークとなおかつ同時溶
出するものは、Ｃ１．１上清またはＩＬ−３で得られた
よりも有意に低いプラトーレベルのＭＣ／９増殖を刺激
した(以下参照)。これらフラクションは測定しうるＩＬ
−３活性を欠いていた(ＮＦＳ−６０応答の欠如)ので、
新たなＭＣＧＦ自体は粗Ｔ細胞上清と同程度にＭＣ／９
細胞を刺激することができなかった。
【０２６８】ＴＣＧＦからＭＣＧＦを更に分離するため
に、上記３回分画したもの(フラクション５９〜６１)を
水中の０.１％ＴＦＡで１０倍に希釈してpＨ２とし、こ
れを直接Ｃ８逆相カラムに装填した。図３６は結合した
タンパク質を０.１％ＴＦＡ中のアセトニトリルのグラ
ジエントで溶出した溶出パターンを示す図である。フロ
ースルー中にはＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性は何ら見ら
れなかった。これらの活性はいずれも３７％アセトニト
リル(フラクション２６〜２９)で同時溶出した。しかし
ながら、飽和ＭＣＧＦ応答は今や、ＩＬ−３で得られた
約半分しかなかった(図３８)。全フラクションを飽和レ
ベルのＩＬ−３存在下で再アッセイしたところ、フラク
ション２６〜２９のみが過剰のＩＬ−３単独中でＭＣ／
９増殖応答を示した(図３６矢印)。事実、その応答強度
は未分画の上清自体の応答強度と似ていた(図３８Ａ)。
更に、未分画の上清と同等な増強レベルはＩＬ−３含有
フロースルーまたはＷＥＨＩ３から精製したＩＬ−３の
存在下でアッセイしたフラクション２６〜２９に観察さ
れた。従ってＩＬ−３とユニークなＭＣＧＦ／ＴＣＧＦ
との組合わせがもとのＴ細胞上清に特徴的なＭＣ／９増
強レベルを刺激する。
【０２６９】逆相クロマトグラフィーによってはＭＣＧ
ＦをＴＣＧＦから分離することができなかったけれど
も,ＴＣＧＦは２つの基準によってＩＬ−２とは異なる
ものであることが示された。第１に、ＣＯＳ７細胞上清
中の組換えＩＬ−２(ＩＬ−２R)およびＩＬ−２産生性
(ＣonＡ刺激)ネズミＴ細胞系(ＧＦ１５−１)からの上清
をいずれも同じ条件で同じカラムにかけてクロマトグラ
フィーに付したところ、ＴＣＧＦ活性は４５％アセトニ
トリルでシャープなピークで溶出するが、このピークは
Ｃ１．１ ＴＣＧＦを示す３７％アセトニトリルの位置
とオーバーラップしない(図３７)。第２に、ＩＬ−２R
に対するＨＴ２細胞の飽和応答はＣ１．１上清の特徴と
は全く異なっている(図３７,挿入図)。更に、部分精製
したＴＣＧＦとＩＬ−２との間に明らかな相乗効果は何
ら見られなかった(図３８)。
【０２７０】Ｃ１．１上清のクロマトグラフォーカシン
グを図３９に示す。ＩＬ−３活性(ＮＦＳ−６０応答性)
は７.１よりも大きい等電点を有する活性を含む非常に
不均質のものであることを示したが、ＴＣＧＦ活性の方
は主要ＴＣＧＦ(フラクション１２)が等電点約６.２を
有するより均質なものであることを示した。このことは
飽和レベルのＩＬ−３を添加後にＭＣＧＦ活性(ＭＣ／
９応答)が最大となったことと一致する。
【０２７１】Ｃ１．１上清および部分精製因子のＳＡＣ
ＰＡＧＥ 図４０は未分画Ｃ１．１上清(図４０Ａ)の電気泳動パタ
ーンを陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた物質で
あるフラクション５９〜６１の電気泳動パターン(図４
０Ｂ)とを比較したものである。ゲル切断物からタンパ
ク質を直接溶出し、増殖法により活性を測定した。陽イ
オン交換フラクションとＣ１．１上清はいずれもＴＣＧ
Ｆピーク(非還元条件下では２９Ｋdおよび１５Ｋdに、
そして還元条件下では２１Ｋdおよび１６Ｋd)を示す。
陽イオン交換した物質はＩＬ−３を減じているため、ご
く低レベルのＭＣ／９増殖のみが誘導され、このＭＣＧ
Ｆ活性はなおＴＣＧＦピークと一致していた。全フラク
ションに飽和量のＩＬ−３Ｒを加えたところ、ＭＣＧＦ
／ＴＣＧＦフラクションピークにおいてのみＣ１．１上
清レベルに対するＭＣ／９増殖応答が上昇した（図４０
Ｂ,矢印)。該上清のＩＬ−３活性は２４Ｋdの位置で最
大であったが、約２０Ｋdの領域にも幅広いのピークが
見られた。ＩＬ−３よりも十分大きなＭＣ／９増殖レベ
ルは電気泳動した上清の１０Ｋdの位置に見られること
は重要である(図４０Ａ,矢印)。最も高度に精製したＭ
ＣＧＦ／ＴＣＧＦ物質(逆相カラムのフラクション２８)
の銀染色ＳＤＳゲルも２０Ｋdおよび１５Ｋdに顕著なタ
ンパク質のバンドを示した。
【０２７２】上記因子の２０Ｋdの物質μg量を活性化Ｃ
１．１Ｔ細胞からのＣonＡ上清を上述した連続的分画: (１) 陽イオン交換クロマトグラフィー (２) ヘパリン・セファロース・クロマトグラフィー,
および (３) Ｃ４逆相クロマトグラフィー を行うことによって均質に精製した。最終精製物質は銀
染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２０Ｋdに単一バンドの
みを示し、これはＣ４逆相カラムの溶出物の単一のＵＶ
吸収と対応する。この精製因子の生物学的性質は低いレ
ベルのＴ細胞および肥満細胞増殖刺激能ならびにＩＬ−
３依存性肥満細胞増殖増強能であることが確かめられ
た。
【０２７３】表５に示すように、この因子はＢＳＦ−１
について報告されている数種のＢ細胞刺激活性[Ｎ．
Ｗ．ローム(Ｒoehm)ら,Ｊ．Ｅ xp．Ｍed１６９,６７９〜
６９４(１９８４);Ｍ．ハワード(Ｈoward)ら,Ｐroc．Ｎ
atl．Ａcad．Ｓci．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８,５７８８(１９８
１);Ｎ．Ｗ．ロームら,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc i．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８１,６１４９〜６１５３(１９８４)]を有
している。第１に該因子は対照群に比較して休止Ｂ細胞
上におけるＩaの発現増加を誘導する(表５)。第２にこ
の因子は抗−Ｉg抗体と結合して有意[3Ｈ]−チミジンの
取り込みを誘導するが,このことは該因子がＢ細胞増殖
の刺激において補助的な因子として機能することを示し
ている。
【０２７４】
【表５】
【０２７５】これらのポリペプチドは機能および影響を
及ぼす細胞の型の双方において異なる数種の生物学的活
性を示すことができる。上述したように、これらの活性
はＢ細胞および肥満細胞系の増殖誘導、休止Ｂ細胞の初
期活性化、Ｔ細胞の増殖刺激およびマイトジェン−活性
化Ｂ細胞におけるＩgＧ1およびＩgＥ産生増強における
相乗作用を含んでいる。
【０２７６】以上詳しく説明したように、本発明の精製
タンパク質が当業者に新規な治療の可能性を提供するこ
とが理解されよう。これらの因子を有意な量産生するこ
とができたことは、選択された哺乳動物細胞系のin vi
tro培養における改良および哺乳動物免疫応答の全体的
な理解の向上に寄与することであろう。
【０２７７】cＤＮＡクローンpcＤ−２Ａ−Ｅ３、pcＤ
−４６(pcＤ−２Ｆ１−１３)、pcＤ−１２５および酵母
ベクターpＭＦ−アルファ８はアメリカンタイプカルチ
ャーコレクション(米国メリーランド州,ロックビル)(Ａ
ＴＣＣ)にそれぞれ受託番号５３３３０、５３３３７、
６７０２９および４０１４０として寄託されている。こ
れらの寄託は特許手続上の微生物の寄託に関する国際的
承認に基づくブダペスト条約(１９７７)上の寄託であ
る。
【０２７８】
【発明の効果】本発明により、有用なインターロイキン
−４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からな
る核酸、かかる核酸を含むベクター、かかるベクターで
形質転換した細胞が提供される。
【０２７９】
【配列表】
【０２８０】配列番号：１ 配列の長さ：５８５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTAGCATCTC TTGATAAACT TAATTGTCTC TCGTCACTGA CGCACAGAGC TATTG ATG 58 MET 1 GGT CTC AAC CCC CAG CTA GTT GTC ATC CTG CTC TTC TTT CTC GAA TGT 106 Gly Leu Asn Pro Gln Leu Val Val Ile Leu Leu Phe Phe Leu Glu Cys 5 10 15 ACC AGG AGC CAT ATC CAC GGA TGC GAC AAA AAT CAC TTG AGA GAG ATC 154 Thr Arg Ser His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile 20 25 30 ATC GGC ATT TTG AAC GAG GTC ACA GGA GAA GGG ACG CCA TGC ACG GAG 202 Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu 35 40 45 ATG GAT GTG CCA AAC GTC CTC ACA GCA ACG AAG AAC ACC ACA GAG AGT 250 MET Asp Val Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser 50 55 60 65 GAG CTC GTC TGT AGG GCT TCC AAG GTG CTT CGT ATA TTT TAT TTA AAA 298 Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys 65 70 75 CAT GGG AAA ACT CCA TGC TTG AAG AAG AAC TCT AGT GTT CTC ATG GAG 346 His Gly Lys Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu MET Glu 80 85 90 CTG CAG AGA CTC TTT CGG GCT TTT CGA TGC CTG GAT TCA TCG ATA AGC 394 Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser 95 100 105 TGC ACC ATG AAT GAG TCC AAG TCC ACA TCA CTG AAA GAC TTC CTG GAA 442 Cys Thr MET Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu 110 115 120 AGC CTA AAG AGC ATC ATG CAA ATG GAT TAC TCG TAG TACTGAGCCA 488 Ser Leu Lys Ser Ile MET Gln MET Asp Tyr Ser 125 130 135 CCATGCTTTA ACTTATGAAT TTTTAATGGT TTTATTTTTA ATATTTATAT ATTTATAATT 548 CATAAAATAA AATATTTGTA TAATGTAACA GAAAAAA 585
【０２８１】配列番号：２ 配列の長さ：６１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GATCGTTAGC TTCTCCTGAT AAACTAATTG CCTCACATTG TCACTGCAAA TCGACACCTA 60 TTA ATG GGT CTC ACC TCC CAA CTG CTT CCC CCT CTG TTC TTC CTG CTA 108 MET Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 GCA TGT GCC GGC AAC TTT GTC CAC GGA CAC AAG TGC GAT ATC ACC TTA 156 Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu 20 25 30 CAG GAG ATC ATC AAA ACT TTG AAC AGC CTC ACA GAG CAG AAG ACT CTG 204 Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu 35 40 45 TGC ACC GAG TTG ACC GTA ACA GAC ATC TTT GCT GCC TCC AAG AAC ACA 252 Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr 50 55 60 ACT GAG AAG GAA ACC TTC TGC AGG GCT GCG ACT GTG CTC CGG CAG TTC 300 Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe 65 70 75 TAC AGC CAC CAT GAG AAG GAC ACT CGC TGC CTG GGT GCG ACT GCA CAG 348 Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln 80 85 90 95 CAG TTC CAC AGG CAC AAG CAG CTG ATC CGA TTC CTG AAA CGG CTC GAC 396 Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp 100 105 110 AGG AAC CTC TGG GGC CTG GCG GGC TTG AAT TCC TGT CCT GTG AAG GAA 444 Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu 115 120 125 GCC AAC CAG AGT ACG TTG GAA AAC TTC TTG GAA AGG CTA AAG ACG ATC 492 Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile 130 135 140 ATG AGA GAG AAA TAT TCA AAG TGT TCG AGC TGA ATATTTTAAT 535 MET Arg Glu Lys Thr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 TTATGAGTTT TTGATAGCTT TATTTTTTAA GTATTTATAT ATTTATAACT CATCATAAAA 595 TAAAGTATAT ATAGAATCTA AAA 618
【０２８２】配列番号：３ 配列の長さ：１２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【０２８３】配列番号：４ 配列の長さ：３８７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CAC AAA TGT GAC ATC ACT CTG CAA GAA ATC ATC AAA ACT CTG AAC 45 TCG TTA ACC GAA CAG AAA ACC CTG TGC ACC GAG CTC ACT GTT ACT 90 GAT ATC TTC GCT GCT TCC AAA AAC ACT ACT GAA AAA GAA ACT TTC 135 TGC AGA GCT GCT ACC GTT CTG CGT CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA 180 AAA GAC ACG CGT TGT CTC GGC GCC ACT GCG CAG CAG TTC CAC CGT 225 CAC AAA CAG CTG ATC AGA TTC CTG AAA CGT CTA GAC CGT AAC CTG 270 TGG GGC CTG GCC GGC CTG AAC TCT TGT CCG GTT AAA GAA GCT AAC 315 CAG TCG ACT CTG GAA AAC TTC CTC GAG CGT CTG AAA ACC ATC ATG 360 CGT GAA AAG TAC TCT AAA TGC TCT TCT 387
【０２８４】配列番号：５ 配列の長さ：８０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CAC AAA TGT GAC ATC ACT CTG CAA GAA ATC ATC AAA ACT CTG AAC TCG 48 TTA ACC GAA CAG AAA ACC CTG TGC ACC GAG CT 80
【０２８５】配列番号：６ 配列の長さ：７６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： C GGT GCA CAG GGT TTT CTG TTC GGT TAA CGA GTT CAG AGT TTT GAT GAT 49 TTC TTG CAG AGT GAT GTC ACA TTT GTG 76
【０２８６】配列番号：７ 配列の長さ：５５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： C ACT GTT ACT GAT ATC TTC GCT GCT TCC AAA AAC ACT ACT GAA AAA GAA 49 ACT TTC 55
【０２８７】配列番号：８ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TTT TTC AGT AGT GTT TTT GGA AGC AGC GAA GAT ATC AGT AAC AGT GAG CT 50
【０２８８】配列番号：９ 配列の長さ：５８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TGC AGA GCT GCT ACC GTT CTG CGT CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA AAA 48 GAC ACG CGT G 58
【０２８９】配列番号：１０ 配列の長さ：７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GGA TCC ACG CGT GTC TTT TTC GTG GTG AGA GTA GAA CTG ACG CAG AAC 48 GGT AGC AGC TCT GCA GAA AGT TTC 72
【０２９０】配列番号：１１ 配列の長さ：６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CG CGT TCT CTC GCC GCC ACT GCG CAG CAG TTC CAC CGT CAC AAA CAG 47 CTG ATC AGA TTC CTG AAA CGT 68
【０２９１】配列番号：１２ 配列の長さ：６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： C TAG ACG TTT CAG GAA TCT GAT CAC CTG TTT GTG ACG GTG GAA CTG 46 CTG CGC AGT GGC GCC GAG ACA A 68
【０２９２】配列番号：１３ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GGC CTG AAC TCT TGT CCG GTT 48 AAA GAA GCT AAC CAG 63
【０２９３】配列番号：１４ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： T CGA CTG GTT AGC TTC TTT AAC CGG ACA AGA GTT CAG GCC GGC CAG 46 GCC CCA CAG GTT ACG GT 63
【０２９４】配列番号：１５ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TCG ACT CTG GAA AAC TTC CTC GAG CGT CTG AAA ACC ATC ATG CGT GAA 48 AAG TAC TCT AAA TGC TCT TCT TAA A 73
【０２９５】配列番号：１６ 配列の長さ：７４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： AAG CTT TTA AGA AGA GCA TTT AGA GTA CTT TTC ACG CAT GAT GGT TTT 48 CAG ACG CTC GAG GAA GTT TTC CAG AG 74
【０２９６】配列番号：１７ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： AA TTC CAC AAG TGC GAT 17
【０２９７】配列番号：１８ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ATC GCA CTT GTG G 13
【０２９８】配列番号：１９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GGAATTCAGAAGCTTGCGGCTAC 23
【０２９９】配列番号：２０配列の長さ：１６配列の
型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状 配列： A GCT CAC AAG TGC GAT 16
【０３００】配列番号：２１配列の長さ：１２配列の
型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状 配列： ATC GCA CTT GTG 12
【０３０１】配列番号：２２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TCG ATG CAC AAG TGC GAT 18
【０３０２】配列番号：２３ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ATC GCA CTT GTG CA 14
【０３０３】配列番号：２４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TCCACGGAGGTACCACAAGTG 21
【０３０４】配列番号：２５ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GA GCT GCT ACC GTT ATC CGT CAG TTC TAC TCT CAC CAC GAA AAA GAC A 48
【０３０５】配列番号：２６ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CG CGT GTC TTT TTC GTG GTG AGA GTA GAA CTG ACG GAT AAC GGT AGC AGC 50 TCT GCA 56
【０３０６】配列番号：２７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TCG ACT CTG GAA GAC TTC C 19
【０３０７】配列番号：２８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： TC GAG GAA GTC TTC CAG AG 19
【０３０８】配列番号：２９ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CG CGT TGT CTC GGC GCC ACT GCG CAG TTC CAC CGT CAC AAA GAG CT 46
【０３０９】配列番号：３０ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GAT CAG CTG TTT GTG ACG GTG GAA CTG CGC AGT GGC GCC GAG ACA A 46
【０３１０】配列番号：３１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CTA GAC CGT AAC CTG TGG GGC CTG GCC GCC 30
【０３１１】配列番号：３２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GC GGC CAG GCC CCA CAG GTT ACG GT 25
【図面の簡単な説明】
【図１】 ネズミＩＬ−４を発現するベクターｐｃＤ−
２Ａ−Ｅ３の挿入物のヌクレオチド配列および推定上の
アミノ酸配列を示す配列図である。
【図２】 ヒトＩＬ−４を発現するベクターｐｃＤ−１
２５の挿入物のヌクレオチド配列および推定上のアミノ
酸配列を示す配列図である。
【図３】 ｐｃＤ−１２５でトランスフェクションされ
たＣＯＳ７サル細胞により発現・分泌された精製天然ヒ
トＩＬ−４のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図４】 その挿入物がネズミＩＬ−４をコードする、
ベクターｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３の地図である。
【図５】 ベクターｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３の挿入物の制限
エンドヌクレアーゼ切断地図である。
【図６】 その挿入物がヒトＩＬ−４をコードする、ベ
クターｐｃＤ−４６の地図である。
【図７】 ベクターｐｃＤ−４６の挿入物の制限エンド
ヌクレアーゼ切断地図である。
【図８】 ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクション
されたＣＯＳ７細胞からの１つの（曲線１）を含む種々
の培養上清の（希釈範囲にわたる）相対的なＭＣＧＦ活
性を示すグラフである。
【図９】 ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクション
されたＣＯＳ７細胞からの１つの（曲線１）を含む種々
の培養上清の（希釈範囲にわたる）相対的なＭＣＧＦ活
性を示すグラフである。
【図１０】 ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクショ
ンされたＣＯＳ７細胞（曲線１）、Ｃ１.Ｌｙ１+２-／
９細胞（曲線２）、および疑似トランスフェクションさ
れたＣＯＳ７細胞（曲線３）からの表示量の上清によっ
て生じたＩａ誘導の相対度を示すグラフである。
【図１１】 ｐｃＤ−２Ａ−Ｅ３でトランスフェクショ
ンされたＣＯＳ７細胞およびＴ細胞を除いたマウス脾細
胞の種々の対照からの上清によりＩｇＥおよびＩｇＧ1
誘導の度合を示すグラフである。
【図１２】 因子依存性ヒトヘルパーＴ細胞株ＪＬ−Ｅ
ＢＶに対する比色定量増殖検定により測定された、種々
のｐｃＤ−１２５トランスフェクション上清および対照
のＴＣＧＦ活性を示すグラフである。
【図１３】 ＰＨＡ刺激末梢血リンパ球に対する比色定
量増殖検定により測定された、ｐｃＤ−１２５トランス
フェクション上清および対照のＴＣＧＦ活性を示すグラ
フである。
【図１４】 ＰＨＡ刺激末梢血リンパ球によるトリチウ
ム化チミジン取り込みにより測定されたｐｃＤ−１２５
トランスフェクション上清および対照のＴＣＧＦ活性を
示すグラフである。
【図１５】 Ｆｃ−イプシロン受容体を蛍光標識した刺
激ヒト扁桃腺Ｂ細胞の対照集団についての細胞相対数対
蛍光強度のヒストグラム図である。
【図１６】 ｐｃＤ−１２５でトランスフェクションさ
れたＣＯＳ７細胞からの０.１％上清よりなる培地に暴
露した刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団（そのＦｃ−イプシロ
ン受容体を蛍光標識したもの）についての細胞相対数対
蛍光強度のヒストグラム図である。
【図１７】 ｐｃＤ−１２５でトランスフェクションさ
れたＣＯＳ７細胞からの１％上清よりなる培地に暴露し
た刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団（そのＦｃ−イプシロン受
容体を蛍光標識したもの）についての細胞相対数対蛍光
強度のヒストグラム図である。
【図１８】 ｐｃＤ−１２５でトランスフェクションさ
れたＣＯＳ７細胞からの１０％上清よりなる培地に暴露
した刺激ヒト扁桃腺Ｂ細胞集団（そのＦｃ−イプシロン
受容体を蛍光標識したもの）についての細胞相対数対蛍
光強度のヒストグラム図である。
【図１９】 天然または突然変異ＩＬ−４を大腸菌内で
発現させるのに有用な合成ヒトＩＬ−４遺伝子のヌクレ
オチド配列図である。
【図２０】 プラスミドｐＵＣ１８に挿入された合成ヒ
トＩＬ−４遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断地図で
ある。
【図２１】 合成ヒトＩＬ−４遺伝子を構築するために
使用される２本鎖ＤＮＡフラグメント１Ａ／Ｂの配列図
である。
【図２２】 合成ヒトＩＬ−４遺伝子を構築するために
使用される２本鎖ＤＮＡフラグメント２Ａ／Ｂの配列図
である。
【図２３】 合成ヒトＩＬ−４遺伝子を構築するために
使用される２本鎖ＤＮＡフラグメント３Ａ／Ｂの配列図
である。
【図２４】 合成ヒトＩＬ−４遺伝子を構築するために
使用される２本鎖ＤＮＡフラグメント４Ａ／Ｂの配列図
である。
【図２５】 合成ヒトＩＬ−４遺伝子を構築するために
使用される２本鎖ＤＮＡフラグメント５Ａ／Ｂの配列図
である。
【図２６】 合成ヒトＩＬ−４遺伝子を構築するために
使用される２本鎖ＤＮＡフラグメント６Ａ／Ｂの配列図
である。
【図２７】 大腸菌発現ベクターＴＡＣ−ＲＢＳ中のイ
ニシエーターＡＴＧコドンに隣接するヌクレオチド配列
図である。
【図２８】 裸リンパ球症候群の患者から誘導される細
胞集団についての細胞相対数対蛍光強度のヒストグラム
図である。
【図２９】 Ｃ−４カラムでの逆相ＨＰＬＣによるヒト
ＩＬ−４の最終精製工程における２１５ｎｍ吸収プロフ
ィールを示すグラフである。
【図３０】 ヒトＩＬ−４ｃＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＥＢＶ−１７８の作製地図である。
【図３１】 プラスミドＴＲＰＣ１１の作製地図であ
る。
【図３２】 プラスミドｐＭＦ−アルファ８の作製地図
である。
【図３３】 天然ヒトＩＬ−４および種々のその突然変
異タンパク質を発現する酵母培養物からの数種のトラン
スフェクション上清のＴＣＧＦ活性を示すグラフであ
る。
【図３４】 因子依存性細胞株の増殖曲線を示すグラフ
であり、図３４（Ａ）はＭＣ／９肥満細胞（１Ａ）の場
合、図３４（Ｂ）はＤＸ−２肥満細胞（１Ｂ）、図３４
（Ｃ）はＮＦＳ−６０細胞（１Ｃ）の場合、および図３
４（Ｄ）はＨＴ２ Ｔ細胞（１Ｄ）である場合を示す。
【図３５】 Ｃ１.１上清のＦＰＬＣカチオン交換クロ
マトグラフィーにおけるクロマトグラムを示すグラフで
ある。
【図３６】 ＩＬ−３を除去したＣ１.１上清の逆相Ｃ
８クロマトグラフィーにおけるクロマトグラムを示すグ
ラフである。
【図３７】 ＧＫ１５−１ネズミＴ細胞上清の逆相Ｃ８
クロマトグラフィーにおけるクロマトグラムを示すグラ
フである。
【図３８】 逆相カラムからの部分精製因子（ＲＰ因
子）のＭＣＧＦおよびＴＣＧＦ活性を示すグラフであ
り、図３８（Ａ）はＭＣ／９肥満細胞の場合、図３８
（Ｂ）はＨＴ２ Ｔ細胞の場合を示す。
【図３９】 Ｃ１.１上清のクロマトフォーカシングに
おけるクロマトグラムを示すグラフである。
【図４０】 Ｃ１.１上清および分精製ＭＣＧＦ／ＴＣ
ＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるクロマトグラムを示す
グラフであり、図４０（Ａ）は非分画化上清の非還元Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥの場合、図４０（Ｂ）はカチオン交換ク
ロマトグラフィーからのピークＭＣＧＦ／ＴＣＧＦ分画
の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ９０８２１５ (32)優先日 1986年９月17日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ５３３３７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７０２９ (72)発明者 タカシ・ヨコタ アメリカ合衆国カリフォルニア州94303, パロ・アルト，コロラド・アベニュー 890 (72)発明者 ケンイチ・アライ アメリカ合衆国カリフォルニア州94306, パロ・アルト，ジョージア・アベニュー 648 (72)発明者 ティモシー・モスマン アメリカ合衆国カリフォルニア州94025, アサートン，エルロイデン・ドライブ69 (72)発明者 ドナ・レニック アメリカ合衆国カリフォルニア州94022, ロス・アルトス，アーモンド・アベニュ ー601 (72)発明者 クレイグ・スミス アメリカ合衆国カリフォルニア州94041, マウンテン・ビュー，フランクリン・ス トリート350 (56)参考文献 ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．319（1986. ２）Ｐ．640−646

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト細胞に対するＢ−細胞成長因子活性
    およびヒト細胞に対するＴ−細胞成長因子活性を有し；
    かつ式： His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile- Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln- Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr- Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-Thr- Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-Thr- Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-Glu- Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala- Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile- Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu- Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro- Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu- Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met- Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser で示されるアミノ酸配列を有する実質的に純粋な形態の
    ヒトインターロイキン−４ポリペプチド、または該ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列において１ないし１０個のアミ
    ノ酸が挿入、欠失または置換されたアミノ酸配列を有
    し、かつ当該ヒトインターロイキン−４活性を有するポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核
    酸。
  2. 【請求項２】 前記ヌクレオチド配列が、pcＤ−４６お
    よびpcＤ−１２５からなる群から選択されるベクターの
    cＤＮＡ挿入物中のＤＮＡ配列に対して事実上相同であ
    る請求項１記載の核酸。
  3. 【請求項３】 前記ヌクレオチド配列が、前記のＤＮＡ
    配列に対して少なくとも５０％相同である請求項２記載
    の核酸。
  4. 【請求項４】 前記ヌクレオチド配列が、前記ＤＮＡ配
    列に対して少なくとも７５％相同である請求項３記載の
    核酸。
  5. 【請求項５】 該ポリペプチドが、 （ｉ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅを有する
    ヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｕ−Ｐｈｅ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （iii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｌａ−Ｇｌ
    ｕ−Ｐｈｅを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ
    酸配列； （iv）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1のアミノ
    酸配列； （v）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-2のアミノ
    酸配列； （vi）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-3のアミ
    ノ酸配列； （vii）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-4のアミ
    ノ酸配列； （viii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙを有す
    るヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ix）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＨｉｓ−Ｇｌｙ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｘ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＶａｌ−Ｈｉｓ
    −Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸
    配列； （xi）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅ−Ｖａｌ
    −Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドの
    アミノ酸配列； （xii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｓｎ−Ｐｈ
    ｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列； （xiii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙ−Ａｓ
    ｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ
    −４ポリペプチドのアミノ酸配列； （xiv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであるヒトＩＬ−４
    のアミノ酸配列； （xv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであって１１１位のア
    ミノ酸がＡｓｐであるヒトＩＬ−４のアミノ酸配列；お
    よび （xvi）ヒトＩＬ−４ムテインＩｌｅ52，Δ71，ＩＳ94
    （Ａｌａ）のアミノ酸配列； よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項
    １記載の核酸。
  6. 【請求項６】 ヒト細胞に対するＢ−細胞成長因子活性
    およびヒト細胞に対するＴ−細胞成長因子活性を有し；
    かつ式： His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile- Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln- Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr- Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-Thr- Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-Thr- Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-Glu- Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala- Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile- Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu- Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro- Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu- Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met- Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser で示されるアミノ酸配列を有する実質的に純粋な形態の
    ヒトインターロイキン−４ポリペプチド、または該ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列において１ないし１０個個のア
    ミノ酸が挿入、欠失または置換されたアミノ酸配列を有
    し、かつ当該ヒトインターロイキン−４活性を有するポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクタ
    ーで形質転換または一過性トランスフェクションするこ
    とによって得られうる細胞。
  7. 【請求項７】 該ポリペプチドが、 （ｉ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅを有する
    ヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｕ−Ｐｈｅ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （iii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｌａ−Ｇｌ
    ｕ−Ｐｈｅを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ
    酸配列； （iv）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1のアミノ
    酸配列； （v）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-2のアミノ
    酸配列； （vi）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-3のアミ
    ノ酸配列； （vii）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-4のアミ
    ノ酸配列； （viii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙを有す
    るヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ix）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＨｉｓ−Ｇｌｙ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｘ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＶａｌ−Ｈｉｓ
    −Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸
    配列； （xi）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅ−Ｖａｌ
    −Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドの
    アミノ酸配列； （xii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｓｎ−Ｐｈ
    ｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列； （xiii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙ−Ａｓ
    ｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ
    −４ポリペプチドのアミノ酸配列； （xiv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであるヒトＩＬ−４
    のアミノ酸配列； （xv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであって１１１位のア
    ミノ酸がＡｓｐであるヒトＩＬ−４のアミノ酸配列；お
    よび （xvi）ヒトＩＬ−４ムテインＩｌｅ52，Δ71，ＩＳ94
    （Ａｌａ）のアミノ酸配列； よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項
    ７記載の細胞。
  8. 【請求項８】 酵母細胞、細菌細胞、および哺乳動物細
    胞からなる群から選択される請求項７記載の細胞。
  9. 【請求項９】 エシェリキア・コリ(Ｅscherichia col
    i)細胞、サッカロミセス・セレビシェ(Ｓaccharomyces
    cerevisiae)細胞、ＣＯＳ７サル細胞、チャイニーズハ
    ムスター卵巣細胞、マウスＬ細胞、およびマウスミエロ
    ーマ細胞からなる群から選択される請求項８記載の細
    胞。
  10. 【請求項１０】 ヒト細胞に対するＢ−細胞成長因子活
    性およびヒト細胞に対するＴ−細胞成長因子活性を有
    し；かつ式： His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile- Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln- Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr- Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-Thr- Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-Thr- Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-Glu- Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala- Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile- Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu- Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro- Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu- Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met- Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser で示されるアミノ酸配列を有する実質的に純粋な形態の
    ヒトインターロイキン−４ポリペプチド、または該ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列において１ないし１０個のアミ
    ノ酸が挿入、欠失または置換されたアミノ酸配列を有
    し、かつ当該ヒトインターロイキン−４活性を有するポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクタ
    ーであって、細菌宿主細胞を形質転換することのできる
    ベクター。
  11. 【請求項１１】 該ポリペプチドが、 （ｉ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅを有する
    ヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｕ−Ｐｈｅ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （iii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｌａ−Ｇｌ
    ｕ−Ｐｈｅを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ
    酸配列； （iv）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1のアミノ
    酸配列； （v）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-2のアミノ
    酸配列； （vi）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-3のアミ
    ノ酸配列； （vii）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-4のアミ
    ノ酸配列； （viii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙを有す
    るヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ix）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＨｉｓ−Ｇｌｙ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｘ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＶａｌ−Ｈｉｓ
    −Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸
    配列； （xi）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅ−Ｖａｌ
    −Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドの
    アミノ酸配列； （xii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｓｎ−Ｐｈ
    ｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列； （xiii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙ−Ａｓ
    ｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ
    −４ポリペプチドのアミノ酸配列； （xiv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであるヒトＩＬ−４
    のアミノ酸配列； （xv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであって１１１位のア
    ミノ酸がＡｓｐであるヒトＩＬ−４のアミノ酸配列；お
    よび （xvi）ヒトＩＬ−４ムテインＩｌｅ52，Δ71，ＩＳ94
    （Ａｌａ）のアミノ酸配列； よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項
    １０記載のベクター。
  12. 【請求項１２】 pＩＮ−ＩＩＩ−ompＡ２、ＴＲＰＣ１
    １、およびＴＡＣ−ＲＢＳからなる群から選択される請
    求項１１記載のベクター。
  13. 【請求項１３】 ヒト細胞に対するＢ−細胞成長因子活
    性およびヒト細胞に対するＴ−細胞成長因子活性を有
    し；かつ式： His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile- Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln- Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr- Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-Thr- Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-Thr- Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-Glu- Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala- Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile- Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu- Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro- Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu- Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met- Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser で示されるアミノ酸配列を有する実質的に純粋な形態の
    ヒトインターロイキン−４ポリペプチド、または該ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列において１ないし１０個のアミ
    ノ酸が挿入、欠失または置換されたアミノ酸配列を有
    し、かつ当該ヒトインターロイキン−４活性を有するポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクタ
    ーであって、酵母宿主細胞を形質転換することのできる
    ベクター。
  14. 【請求項１４】 該ポリペプチドが、 （ｉ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅを有する
    ヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｕ−Ｐｈｅ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （iii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｌａ−Ｇｌ
    ｕ−Ｐｈｅを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ
    酸配列； （iv）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1のアミノ
    酸配列； （v）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-2のアミノ
    酸配列； （vi）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-3のアミ
    ノ酸配列； （vii）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-4のアミ
    ノ酸配列； （viii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙを有す
    るヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ix）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＨｉｓ−Ｇｌｙ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｘ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＶａｌ−Ｈｉｓ
    −Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸
    配列； （xi）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅ−Ｖａｌ
    −Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドの
    アミノ酸配列； （xii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｓｎ−Ｐｈ
    ｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列； （xiii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙ−Ａｓ
    ｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ
    −４ポリペプチドのアミノ酸配列； （xiv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであるヒトＩＬ−４
    のアミノ酸配列； （xv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであって１１１位のア
    ミノ酸がＡｓｐであるヒトＩＬ−４のアミノ酸配列；お
    よび （xvi）ヒトＩＬ−４ムテインＩｌｅ52，Δ71，ＩＳ94
    （Ａｌａ）のアミノ酸配列； よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項
    １３記載のベクター。
  15. 【請求項１５】 ベクターpＭＦ−アルファ８である請
    求項１４記載のベクター。
  16. 【請求項１６】 ヒト細胞に対するＢ−細胞成長因子活
    性およびヒト細胞に対するＴ−細胞成長因子活性を有
    し；かつ式： His-Lys-Cys-Asp-Ile-Thr-Leu-Gln-Glu-Ile- Ile-Lys-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Thr-Glu-Gln- Lys-Thr-Leu-Cys-Thr-Glu-Leu-Thr-Val-Thr- Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Lys-Asn-Thr-Thr- Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg-Ala-Ala-Thr- Val-Leu-Arg-Gln-Phe-Tyr-Ser-His-His-Glu- Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala- Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile- Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu- Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro- Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu- Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met- Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser で示されるアミノ酸配列を有する実質的に純粋な形態の
    ヒトインターロイキン−４ポリペプチド、または該ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列において１ないし１０個のアミ
    ノ酸が挿入、欠失または置換されたアミノ酸配列を有
    し、かつ当該ヒトインターロイキン−４活性を有するポ
    リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクタ
    ーであって、哺乳動物宿主細胞を形質転換することので
    きるベクター。
  17. 【請求項１７】 該ポリペプチドが、 （ｉ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅを有する
    ヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｕ−Ｐｈｅ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （iii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｌａ−Ｇｌ
    ｕ−Ｐｈｅを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ
    酸配列； （iv）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1のアミノ
    酸配列； （v）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-2のアミノ
    酸配列； （vi）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-3のアミ
    ノ酸配列； （vii）ヒトインターロイキン−４ムテインΔ1-4のアミ
    ノ酸配列； （viii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙを有す
    るヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ix）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＨｉｓ−Ｇｌｙ
    を有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｘ）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＶａｌ−Ｈｉｓ
    −Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸
    配列； （xi）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＰｈｅ−Ｖａｌ
    −Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリペプチドの
    アミノ酸配列； （xii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＡｓｎ−Ｐｈ
    ｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ−４ポリ
    ペプチドのアミノ酸配列； （xiii）ポリペプチドのＮ−末端にさらにＧｌｙ−Ａｓ
    ｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙを有するヒトＩＬ
    −４ポリペプチドのアミノ酸配列； （xiv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであるヒトＩＬ−４
    のアミノ酸配列； （xv）５２位のアミノ酸がＩｌｅであって１１１位のア
    ミノ酸がＡｓｐであるヒトＩＬ−４のアミノ酸配列；お
    よび （xvi）ヒトＩＬ−４ムテインＩｌｅ52，Δ71，ＩＳ94
    （Ａｌａ）のアミノ酸配列； よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項
    １６記載のベクター。
  18. 【請求項１８】 pcＤプラスミドからなる請求項１７記
    載のベクター。
  19. 【請求項１９】 前記プラスミドがpcＤ−４６およびpc
    Ｄ−１２５からなる群から選択される請求項１８記載の
    ベクター。
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