NO301234B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet, nukleinsyre og vektor - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet, nukleinsyre og vektor Download PDFInfo
- Publication number
- NO301234B1 NO301234B1 NO872988A NO872988A NO301234B1 NO 301234 B1 NO301234 B1 NO 301234B1 NO 872988 A NO872988 A NO 872988A NO 872988 A NO872988 A NO 872988A NO 301234 B1 NO301234 B1 NO 301234B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cells
- activity
- group
- sequence
- cell
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 199
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 73
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 65
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 title claims description 61
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 title claims description 60
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 20
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims abstract description 97
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 101
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 84
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 64
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 10
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N Ala-Glu-Phe Chemical group [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O FBHOPGDGELNWRH-DRZSPHRISA-N 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical group [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 2
- 241000024188 Andala Species 0.000 claims description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 277
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 151
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 142
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 142
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 121
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 121
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 112
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 97
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 80
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 69
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 66
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 64
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 61
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 58
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 57
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 32
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 30
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 30
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 29
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 25
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 23
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 23
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 20
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 20
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 20
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 19
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 18
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 18
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 18
- 201000005484 prostate carcinoma in situ Diseases 0.000 description 18
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 17
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 16
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 16
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 16
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 13
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 12
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 12
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 10
- 101100232919 Homo sapiens IL4 gene Proteins 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 10
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 9
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 9
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 9
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 9
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 9
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 9
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 7
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 7
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 7
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 7
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 6
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 6
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 6
- -1 below 10 Chemical class 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 4
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 4
- 101001033276 Mus musculus Interleukin-3 Proteins 0.000 description 4
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- RDZTWEVXRGYCFV-UHFFFAOYSA-M sodium 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].OCCN1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 RDZTWEVXRGYCFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 3
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 3
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 101001002717 Bos taurus Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 101000932768 Conus catus Alpha-conotoxin CIC Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 108040006849 interleukin-2 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 101150037435 tnaB gene Proteins 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150008346 trpP gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-BBGACYKPSA-N (2s,5r,6r)-6-[[(2s)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound C1([C@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-BBGACYKPSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- AENZGWONVTXLRC-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O AENZGWONVTXLRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQPDPIPLWCUACY-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethylthiourea;hydrobromide Chemical compound [Br-].NCC[NH+]=C(N)S OQPDPIPLWCUACY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPBWLZAKZOHLOP-UHFFFAOYSA-N 5-(1-hydroxyethyl)-3-phenyl-2-sulfanylideneimidazolidin-4-one Chemical compound O=C1C(C(O)C)NC(=S)N1C1=CC=CC=C1 ZPBWLZAKZOHLOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFCDHQNPTNBIGC-UHFFFAOYSA-N 6-diazocyclohexa-2,4-diene-1-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1C=CC=CC1=[N+]=[N-] MFCDHQNPTNBIGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000011765 DBA/2 mouse Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010089133 GGTACC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100020941 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- LUWJPTVQOMUZLW-UHFFFAOYSA-N Luxol fast blue MBS Chemical compound [Cu++].Cc1ccccc1N\C(N)=N\c1ccccc1C.Cc1ccccc1N\C(N)=N\c1ccccc1C.OS(=O)(=O)c1cccc2c3nc(nc4nc([n-]c5[n-]c(nc6nc(n3)c3ccccc63)c3c(cccc53)S(O)(=O)=O)c3ccccc43)c12 LUWJPTVQOMUZLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000013967 Monokines Human genes 0.000 description 1
- 108010050619 Monokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 108700005084 Multigene Family Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100438957 Mus musculus Cd8a gene Proteins 0.000 description 1
- 101001002703 Mus musculus Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000934342 Mus musculus T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000003532 endogenous pyrogen Substances 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004524 haematopoietic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 108040006856 interleukin-3 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002093 isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108010052620 leukocyte endogenous mediator Proteins 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000015929 positive regulation of B cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009712 regulation of translation Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 244000195895 saibo Species 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 101150108727 trpl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003245 working effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
- C07K16/247—IL-4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
- C12N2710/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Auxiliary Devices For Music (AREA)
- Fertilizers (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for
fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet. Videre vedrører oppfinnelsen nucleinsyrer som koder for et polypeptid som oppviser pattedyr-interleukin-4-aktivitet og minst én ytterligere aktivitet, samt to vektorer.
Rekombinant DNA-teknologi refererer generelt til teknikken for integrering av genetisk informasjon fra en donorkilde i vektorer for senere bearbeiding slik som gjennom innføring i en vert, hvorved den overførte genetiske informasjon kopieres og/eller uttrykkes i det nye miljø. Vanligvis foreligger den genetiske informasjon i form av komplementær DNA (cDNA) avledet fra budbærer-RNA (mRNA) som koder for et ønsket proteinprodukt. Bæreren er ofte et plasmid med evne til å inkorporere cDNA for senere replikasjon i en vert, og, i noen tilfeller, faktisk å regulere ekspresjon av cDNA og derved styre syntese av det kodede produkt i verten.
Det har en tid vært kjent at immunresponsen til pattedyr er basert på en serie komplekse cellulære reaksjoner kalt "immunnettverk". Nyere forskning har gitt ny innsikt i den indre virkemåte i dette nettverk. Mens det forblir klart at mye av responsen faktisk gjentas periodisk rundt i de nettverklignende reaksjoner til lymfocytter, makrofager, granulocytter og andre celler, er immunologer nå generelt av den oppfatning at oppløselige proteiner (f.eks. de såkalte "lymfokiner" eller "monokiner") spiller en avgjørende rolle når det gjelder å regulere disse cellulære reaksjoner. Det foreligger følgelig en betydelig interesse for isolering og karakterisering av, og virk-ningsmekanismene til, cellemodulerende faktorer, hvor en forståelse burde gi betydelige gjennombrudd i diagnostisering og terapi av et stort antall sykdomstilstander.
Lymfokiner formidler åpenbart cellulære aktiviteter på forskjellige måter. De er blitt påvist å understøtte celledeling, vekst og differensiering av de flerpotensielle hematopoietiske stamceller til det store antall forløper-celler som danner de forskjellige cellulære av avstamninger som er ansvarlige for immunresponsen. Disse avstamningene gir ofte respons på en forskjellig måte når lymfokiner brukes sammen med andre midler.
Celleavstamninger som er spesielt viktige for immunresponsen, omfatter to klasser lymfocytter: B-celler som kan danne og utskille immunglobuliner (proteiner med evne til å gjenkjenne og binde seg til fremmed stoff for å bevirke fjerning av dette), og T-celler av forskjellige undertyper som utskiller lymfokiner og induserer eller hemmer B-cellene og noen av de øvrige cellene (inkludert andre T-celler) som utgjør immunnettverket.
En annen viktig celleavstamning er mastcellen (som ikke er blitt positivt identifisert i alle pattedyrarter) - en granulholdig sammenbindende vevcelle som befinner seg proksimalt til kapillarårer gjennom hele kroppen, med særlig høye konsentrasjoner i lungene, huden og i mage- og tarmkanalen og kjønns- og urinveiene. Mastceller spiller en sentral rolle i allergirelaterte sykdommer, særlig anafylakse, på følgende måte: når utvalgte antigener kryssbinder en klasse immunglobuliner bundet til reseptorer på mastcelle-overflaten, degranuleres mastcellen og frigjør mediatorene
(f.eks. histamin, serotonin, heparin, prostaglandiner, etc.)
som forårsaker allergiske reaksjoner, f.eks. anafylakse.
Forskning for bedre å forstå (og derved eventuelt behandle terapeutisk) forskjellige immunsykdommer har vært vanskeliggjort av den generelle manglende evne til å opprettholde celler fra immunsystemet in vitro. Immunologer har oppdaget at dyrking av disse cellene kan utføres gjennom bruken av T-celle- og andre cellesupernatanter som inneholder forskjellige vekstfaktorer, slik som noen av lymfo-kinene.
Påvisningen, isoleringen og rensingen av slike faktorer som lymfokiner og andre oppløselige mediatorer for immunreaksjoner er svært vanskelig og kompliseres ofte av egenskapene til supernatantene som de vanligvis befinner seg i, forskjeller i og overkrysninger av aktiviteter hos de forskjellige bestanddelene i blandingene, sensitiviteten (eller mangel på sensitivitet i de prøvene som brukes til å fastlegge faktorenes egenskaper, den hyppige likhet i mole-kylvektområdet og andre karakteristika for faktorene, samt den svært lave konsentrasjon av faktorene i deres naturlige miljø.
Etter hvert som flere lymfokiner ble tilgjengelige, hovedsakelig gjennom molekylær kloning, har interessen for å finne kliniske anvendelser for dem tatt seg opp. På grunn av fysiologiske likheter med hormoner (f.eks. oppløselige faktorer, vekstmediatorer, virkning via cellereseptorer),
har det vært trukket analogier mellom mulige anvendelser av lymfokiner og de nåværende anvendelser av hormoner, f.eks. Dexter, Nature, vol. 321, s. 198 (1986). Ett håp er at nivåene av lymfokiner hos en pasient kan manipuleres direkte eller indirekte for å frembringe en gunstig immunrespons, f.eks. demping av betennelse, allergi, eller vevavvisning, eller stimulering eller styrking mot infeksjon eller malign vekst. Andre potensielle kliniske anvendelser for lymfokiner omfatter opprettholdelse og formering av in vitro populasjoner av visse immunsystemceller fra en person for eventuell innføring på nytt i den samme eller en annen person for å oppnå en gunstig virkning. F.eks. er det for tiden under-veis undersøkelser for å bestemme hvorvidt populasjoner av lymfokinaktiverte dreper-T-celler fra en pasient kan formeres utenfor hans eller hennes kropp og deretter på nytt injiseres for å tilveiebringe en forøkt antitumorrespons. En annen mulig klinisk anvendelse for lymfokiner, særlig kolonistimulerende faktorer, slik som granulocytt/makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), og faktorer som øker aktiviteten til disse, er stimulering av blodcelledannelse, f.eks. ved pre- eller post-kjemoterapi eller bestrålings-terapi mot tumorer, ved behandling av myeolid hypoplasi, eller ved behandling av neutrofile mangelsyndromer: Dexter, Nature, vol. 321, s. 198 (1986). Slike faktorer vil også være anvendelige ved terapi med benmargtransplantat som brukes i økende grad til å behandle aplastisk anemi og visse
leukemier.
Det er to egenskaper hos lymfokiner som har viktige følger for slik klinisk anvendelse: enkelte lymfokiner er ofte pleiotrope; og de biologiske virkninger av ett lymfokin kan vanligvis moduleres ved minst ett annet lymfokin, enten ved inhibering eller ved forsterkning. F.eks. stimulerer tumor-nekrosefaktor, som virker synergistisk sammen med gamma-interferon, dannelse av interleukin-1 (IL-1) og kan aktivere den fagocyttiske aktivitet til neutrofiler. IL-1, et protein dannet av aktiverte makrofager, formidler en lang rekke biologiske virkninger, deriblant stimulering av thymocytt-celledeling via induksjon av frigjørelse av interleukin-2 (IL-2), stimulering av B-lymfocyttmodning og celledeling, fibroblast-vekstfaktoraktivitet og induksjon av akuttfase-proteinsyntese av hepatocytter. IL-1 er også blitt rapportert å stimulere prostaglandin- og collagenase-frigjørelse fra synovialceller, og å være identisk med endogent pyrogen: Krampschmidt, J. Leuk. Biol., vol. 36,
s. 341-355 (1984).
Interleukin-2, tidligere referert til som T-celle-vekstfaktor, er et lymfokin som dannes av lectin- eller antigen-aktiverte T-celler. De biologiske virkninger av IL-2 som er rapportert, omfatter stimulering av den lang-varige in vitro vekst av aktiverte T-celle-kloner, forøkning av thymocytt-mitogenese, og induksjon av cytotoksisk T-celle-reaktivitet og plakk-dannende celleresponser i kulturer av miltceller fra nakne mus. På samme måte som inter-feroner (IFN-er) er dertil IL-2 blitt påvist å øke naturlig drepercelleaktivitet, hvilket antyder en mulig anvendelse ved behandlingen av neoplastiske sykdommer: Henney et al., Nature, vol. 291, s. 335-338 (1981). Det er blitt rapportert en viss suksess ved slik terapi, f.eks. Lotze og Rosenberg, "Treatment of Tumor Patients with Purified Human Interleukin-2", s. 711-719, i Sorg et al., red., Cellular and Molecular Biology of Lymphokines (Academic Press, Inc.,
New York, 19 85); og Rosenberg og Lotze, "Cancer Immuno-therapy Using Interleukin-2 and Interleukin-2-Activated
Lymphocytes", Ann. Rev. Immunol., vol. 4, s. 681-709 (1986). IL-2-toksisitet har imidlertid begrenset dosene som kan gis til kreftpasienter for å dra fordel av disse egenskapene: Lotze og Rosenberg, s. 711-719; og Welte et al., s. 755-759, i Sorg et al., red. (se ovenfor).
Metcalf, D., The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, (Elsevier, Amsterdam, 1984), gir en oversikt over forskning vedrørende lymfokiner og forskjellige vekstfaktorer involvert i immunresponsen hos pattedyr. Yung, Y.-P., et al., J. Immunol., vol. 127, s. 794 (1981), beskriver delvis rensing av proteinet med omtrent 35 kd som oppviser mast-celle-vekstfaktor-aktivitet (MCGF) og dets separasjon fra interleukin-2 (IL-2), også kjent som T-celle-vekstfaktor (TCGF). Nabel, G., et al., Nature, vol. 291, s. 332 (1981), rapporterer en MCGF med en molekylvekt på ca. 45 kd og en pl på ca. 6,0. Clark-Lewis, I. og Schrader, J., J. Immunol., vol. 127, s. 1941 (1981), beskriver et protein med mastcelle-lignende vekstfaktoraktivitet som har en molekylvekt på ca.
29 kd i fosfatbufret saltoppløsning, og ca. 23 kd i 6M guanidin-hydroklorid, med en pl på ca. 4,8, men med ca. 6-8 etter neuramidinasebehandling. Murin IL-2 og interleukin-3 (IL-3) er blitt delvis karakterisert biokjemisk av hhv. Gillis, S., et al., J. Immunol., vol. 124, s. 1954-1962
(1980) og Ihle, J., et al., J. Immunol., vol. 129, s. 2431-2436 (1982), idet IL-2 har en tilsynelatende molekylvekt (sannsynlighet som en dimer) på ca. 30-35 kd og IL-3 har en molekylvekt på ca. 28 kd. Human IL-2 har tilsynelatende en molekylvekt på ca. 15 kd og er beskrevet av Gillis, S.,
et al., Immu. Rev., vol. 63, s. 167-209 (1982). Sammenligning mellom virkningene av IL-3 og MCGF i T-cellesupernatanter er blitt rapportert av Yung Y. og Moore, M., Contemp. Top. Mol. Immunol., vol. 10, s. 147-179 (1985) og Rennick, D., et al., J. Immunol., vol. 134, s. 910-919
(1985).
Det foreligger en omfattende litteratur vedrørende reguleringen av B-celle-vekst og -differensiering ved hjelp av oppløselige faktorer: for oversikter vises det til f.eks. Howard og Paul, Ann. Rev. Immunol., vol. 1, s. 307-333
(1983); Howard et al., Immunol. Rev., 1984, nr. 78,
s. 97-118; og Kishimoto, Ann. Rev. Immunol., vol. 3,
s. 133-157 (1985) . Det har vært en viss forvirring vedrør-ende nomenklaturen som har vært brukt for å merke de forskjellige faktorer, på grunn av forskjeller i kildemateri-aler, vanskeligheter ved rensing og forskjeller ved de analysene som har vært brukt for å bestemme de biologiske virkninger. Det er tilsynelatende nådd frem til enighet vedrørende nomenklatur i noen tilfeller: Paul, Immunology Today, vol. 4, s. 322 (1983); og Paul, Molecular Immunol., vol. 21, s. 343 (1984). Aktiviteten til B-celle-vekstfaktor (BCGF) er kjennetegnet ved en evne til å forårsake DNA-syntese i B-celler som samtidig stimuleres ved eksponering mot anti-IgM, eller lignende antigener. Det antas at interleukin-1 (IL-1) også er påkrevet for at BCGF-aktivitet skal manifestere seg, i det minste når analysen utføres med lave tettheter av B-celler. Alternative analyser for human BCGF er blitt beskrevet: f.eks. Maizel et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 80, s. 5047-5051 (1983) (understøttelse av langvarig vekst av humane B-celler i kultur). Den aktivitet som er forbundet med den tidligere analyse, er også blitt merket B-celle-stimulerende faktor-l-aktivitet (BSF-1) og BCGF I for å skille den fra lignende og/eller beslektede aktiviteter. Særlig er en aktivitet betegnet BCGF II, blitt beskrevet. Den er kjennetegnet ved evne til å forårsake DNA-syntese i mitogen-stimulerte B-celler eller i transformerte B-celle-linjer. Mitogener forbundet med BCGF II-aktivitet omfatter dextransulfat, lipopolysaccharid og Staphylococcus-ekstrakter. BCGF I registrerer ingen respons i disse analysene. Hos mennesker antas det at BCGF II er et molekyl med en molekylvekt på ca. 50 kilodalton (kd), og at det virker synergistisk med BCGF I (dvs. BSF-1) når det gjelder å fremme B-celle-deling i en immunrespons: Yoshizaka et al., J. Immunol., vol. 130, s. 1241-1246 (1983). Howard et al., J. Exp. Med., vol. 155, s. 914-923 (1982), var først til å påvise eksistensen av en murin BCGF (som senere
varierende ble kalt BCGF I, BSF-1 eller IgG-^-induksjons-faktor) som er forskjellig fra interleukin-2. Lignende observasjoner ble rapportert nesten samtidig for et humant system av Yoshizaki et al., J. Immunol., vol. 128,
s. 1296-1301 (1982), og senere av Okada et al., J. Exp. Med., vol. 157, s. 583-590 (1983).
Biokjemisk og biologisk karakterisering av molekyler med BCGF- eller BSF-l-aktivitet har utviklet seg jevnt siden disse første oppdagelser. Maizel et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 79, s. 5998-6002 (1982), har rapportert en trypsin-sensitiv human BCGF med en molekylvekt på 12-13 kd og et isoelektrisk punkt (pl) på ca. 6,3-6,6. Farrar et al., J. Immunol., vol. 131, s. 1838-1842 (1983), rapporterte delvis rensing av en heterogen murin BCGF med molekylvekter på 11 og 15 kd ved SDS-PAGE og pl-verdier på 6,4-8,7. Ohara og Paul, i Nature, vol. 315, s. 333-336 (1985), beskriver et monoklonalt antistoff som er spesifikt for murin BSF-1, og gir molekylvekter for BSF-1 på 14 kd og 19-20 kd med pl på 6,7. Butler et al., J. Immunol., vol. 133, s. 251-255
(1984) , rapporterer en human BCGF med en molekylvekt på 18-20 kd og en pl på 6,3-6,6. Rubin et al., Proe. Nati. Sei., vol. 82, s. 2935-2939 (1985), rapporterer at for-inkubasjon av hvilende B-celler med BSF-1 før eksponering mot anti-IgM-antistoffer øker cellevolum, og senere setter fart på overgang til S-fase etter eksponering mot anti-IgM-antistoffer. Vitetta et al., J. Exp. Med., vol. 162,
s. 1726-1731 (1985) , beskriver delvis rensing av murin BSF-1 ved hjelp av revers-fase-HPLC av serumfrie supernatanter fra EL-4-celler. SDS-PAGE indikerte et protein på ca.
20-22 kd. Ohara et al., J. Immunol., vol. 135, s. 2518-2523
(1985) , rapporterer også delvis rensing av murin BSF-1 ved en lignende fremgangsmåte, og rapporterer at faktoren er et protein med ca. 18-21,7 kd. Sideras et al., i Eur. J. Immunol., vol. 15, s. 586-593, og 593-598 (1985), rapporterer delvis rensing av en murin IgG^-induserende faktor som er en BSF-1, og rapporterer at faktoren er et protein på ca. 20 kd med pl-verdier på 7,2-7,4 og 6,2-6,4, og Smith og Rennick, i Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 1857-1861 (1986), rapporterer separasjon av en faktor fra IL-2 og IL-3 som oppviser T-celle-vekstfaktoraktivitet og mastcelle-vekstfaktoraktivitet. Senere klonet og sekvensbestemte Norna et al., Nature, vol. 319, s. 640-646 (1986), en nucleinsyre som koder for faktoren til Sideras et al., og Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 2061-2065 (1986), klonet og sekvensbestemte en nucleinsyre som koder for faktoren til Smith og Rennick. Nylig rapporterte Grabstein et al., J. Exp. Med., vol. 163, s. 1405-1414 (1986), rensing og sekvensbestemmelse av murin BSF-1.
Milanese et al., i Science, vol. 231, s. 1118-1122
(1986), rapporterer et lymfokin som ikke er beslektet med
BSF-1, og som de foreløpig betegner IL-4A. Deres IL-4A er et 10-12 kd protein utskilt fra hjelper-T-celler etter kryssbinding av T3-Ti-reseptorer. Det stimulerer hvilende lymfocytter via reaksjon med Tll-reseptorer og etterfølgende induksjon av interleukin-2-reseptorer (IL-2).
Sanderson et al., i Proe. Nati. Acad. Sei.,
vol. 83, s. 437-440 (1986), foreslo at navnet interleukin-4 skulle gis til eosinofil differensieringsfaktor på grunnlag av bevis for at den er tilsynelatende den samme som B-celle-vekstfaktor II.
Av det ovenstående er det åpenbart at oppdagelsen og utviklingen av nye lymfokiner vil kunne bidra til utvik-ling av terapier for en lang rekke degenerative tilstander som direkte eller indirekte involverer immunsystemet og/eller hematopoietiske celler. Særlig ville oppdagelsen og utviklingen av lymfokiner som øker eller forsterker de gunstige virkninger av kjente lymfokiner, være svært for-delaktig. F.eks. ville den dosebegrensende toksisitet av IL-2 i tumorterapi kunne reduseres gjennom tilgjengeligheten av et lymfokin eller en cofaktor med forsterkende virkninger; eller virkningsfullheten av benmargtransplantater ville kunne bli økt gjennom tilgjengeligheten av faktorer som forsterker virkningene av de kolonistimulerende faktorer.
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremgangsmåte for fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet,og som har en sekvens av aminosyrer definert ved den følgende formel, som kan være enten 1 gang substituert eller 1 gang delert eller 1 gang innskutt:
hvor R er Ala-Glu-Phe eller Glu-Asn-Phe-Val-His, eller er fra-værende , og
hvor hvert av uttrykkene av typen X("Xaa") representerer aminosyren "Xaa", bortsett fra at den innskutte eller substituerte aminosyre X("Xaa") i de 1 gang substituerte eller 1 gang innskutte polypeptider i de stillinger hvor de er innskutt eller substituert, er definert på følgende måte:
X(Ser) er Ser,
X(Arg) er gruppen bestående av Arg, His og Lys, X(Leu) er gruppen bestående av Leu, Ile, Phe og Met, X(Pro) er gruppen bestående av Pro og Ala,
X(Thr) er Thr,
X(Ala) er gruppen bestående av Ala og Pro,
X(Val) er gruppen bestående av Val, Met og Ile, X(Gly) er Gly,
X(Ile) er gruppen bestående av Ile, Met og Leu,
X(Phe) er gruppen bestående av Phe, Met, Tyr, Ile og Leu,
X(Tyr) er gruppen bestående av Tyr og Phe,
X(His) er gruppen bestående av His, Gin og Arg, X(Gln) er gruppen bestående av Gin, Glu og His, X(Asn) er gruppen bestående av Asn og Asp,
X(Lys) er gruppen bestående av Lys og Arg,
X(Asp) er gruppen bestående av Asp og Asn,
X(Glu) er gruppen bestående av Glu og Gin,
X(Met) er gruppen bestående av Met, Ile og Leu, X(Trp) er Trp og
X(Cys) er Cys,
fortrinnsvis hvor:
X(Arg) er Arg,
X(Leu) er gruppen som består av Leu, Ile og Met, X(Pro) er Pro,
X(Ala) er Ala,
X(Val) er Val,
X(Ile) er gruppen bestående av Ile, Met og Leu, X(Phe) er Phe,
X(Tyr) er Tyr,
X(His) er His,
X(Gin) er Gin,
X(Asn) er Asn,
X(Lys) er Lys,
X(Asp) er Asp,
X(Glu) er Glu og
X(Met) er gruppen bestående av Met, Ile og Leu,
og uttrykket "1 gang substituert" angir en delmengde av polypeptider hvor de naturlig forekommende aminosyrer er blitt byttet ut med synonyme aminosyrer i 1 stilling, uttrykket "1 gang delert" angir en delmengde av polypeptider hvor de naturlig forekommende aminosyrer er blitt delert i 1 stilling, og uttrykket "1 gang innskutt" angir en delmengde av polypeptider hvor synonyme aminosyrer er blitt innskutt ved siden av de naturlig forekommende aminosyrer i 1 stilling. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: a) konstruksjon av en vektor som omfatter en nucleotidsekvens som koder for angitte polypeptid, i kombinasjon med
transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, slik at nucleotidsekvensen er i stand til å bli uttrykt av en vert som inneholder vektoren, hvor nucleotidsekvensen er minst 75 % homolog med en cDNA-sekvens i innskuddet i vektoren pcD-125 [ATCC 67029],
b) inkorporering av vektoren i verten, og
c) dyrking av den vektorholdige vert under betingelser
som er egnet for ekspresjon av nucleotidsekvensen til polypeptidet, hvoretter
d) det uttrykte protein isoleres.
Nucleinsyrene ifølge oppfinnelsen er definert (1) ved sin homologi med klonede komplementær-DNA-sekvenser (cDNA) som her er beskrevet, og (2) ved funksjonsanalyser av IL-4-aktivitet brukt på polypeptidene som kodes for av nucleinsyrene. Slik det her er brukt, betyr uttrykket "IL-4-aktivitet" ved henvisning til et protein eller et polypeptid at proteinet eller polypeptidet oppviser både B-celle-vekstfaktor-aktivitet (BCGF) og T-celle-vekstfaktoraktivitet (TCGF). For et bestemt pattedyr bestemmes IL-4-aktivitet ved artsspesifikke TCGF- og BCGF-analyser. Som forklart mer fullstendig nedenunder, kan bestemte utførelsesformer av IL-4 karakteriseres ytterligere ved tilleggsanalyser. F.eks. kan visse former av murin IL-4 oppvise mast-celle-vekstfaktor-aktivitet (MCGF), visse former av både human og murin IL-4 forsterker TCGF-aktiviteten til IL-2, visse former av både murin og human IL-4 forsterker GM-CSF-stimulert celledeling hos visse celletyper, visse former av både human og murin IL-4 induserer Fc-epsilon-reseptorekspresjon på B-celler, og visse former
av både human og murin IL-4 kan indusere ekspresjon av de viktigste vevforenlighetskompleksantigener (MHC) på B-celler: klasse II DR-antigenet på humane B-celler og Ia-antigenet på mus-B-celler.
Oppfinnelsen omfatter således nucleinsyrer som er kjennetegnet ved at de omfatter en sekvens av nucleotidbaser som er i stand til å kode for et polypeptid som utviser pattedyr-interleukin-4-aktivitet og minst én ytterligere aktivitet valgt fra gruppen bestående av MHC-antigen-induksjonsaktivitet, Fc-epsilon-reseptor-induksjonsaktivitet, GM-CSF-stimulert granulocyttkolonivekstforsterkende aktivitet, interleukin-2-TCGF-forsterkende aktivitet og IgG^ og IgE-induksjonsaktivitet, som fremstilt ifølge krav 1 og som har en sekvens av nucleotidbaser som er minst 75 % homolog med en sekvens av DNA i cDNA-innskuddet i en vektor valgt fra gruppen bestående av pcD-46 og pcD-125.
Oppfinnelsen er delvis basert på oppdagelsen og kloningen av cDNA-er som er i stand til å uttrykke proteiner med IL-4-aktivitet. cDNA-kloner omfatter humane cDNA-innskudd i plasmidvektorene "klon 46" (her også referert til som pcD-2F1-13 eller pcD-125). Oppfinnelsen omfatter således også vektorer som er kjennetegnet ved at de er pcD-46 eller pcD-125 som deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, under ATCC deponeringsnummer 53337 og 67029.
Nucleinsyrer ifølge oppfinnelsen kan avledes fra de ovenfor nevnte cDNA-er ved hjelp av standardteknikker for mutering av nucleinsyresekvenser. De kan fremstilles de novo fra immunsystem-avledede cellelinjer, slik som T-celle-hybridomer, som inneholder eller kan induseres til å inneholde sekvenser av budbærer-RNA (mRNA) som koder for IL-4; og de kan erholdes ved å søke i DNA- eller RNA-ekstrakter eller -samlinger med søkere avledet fra cDNA-klonene ifølge oppfinnelsen.
Uttrykket "effektivt homolog" betyr slik det her er brukt, at nucleotidsekvensen er i stand til å bli påvist ved hjelp av en hybridiseringssøker avledet fra en cDNA-
klon ifølge oppfinnelsen. Det nøyaktige tallmessige mål
for homologi som er nødvendig for å påvise nucleinsyrer som koder for IL-4-aktivitet, avhenger av flere faktorer, deriblant (1) homologi mellom søkeren og ikke-IL-4-kodende sekvenser forbundet med mål-nucleinsyrene, (2) hybridiser-ingsbetingelsenes strenghet, (3) hvorvidt det anvendes én-eller dobbeltkjedede søkere, (4) hvorvidt det anvendes RNA-eller DNA-søkere, (5) de tiltak som iverksettes for å redusere ikke-spesifikk binding av søkeren, (6) egenskapene til markøren som brukes for å påvise søkeren, (7) andelen av guanidin- og cytosinbaser i søkeren, (8) fordelingen av ulikheter mellom søker og mål, (9) størrelsen til søkeren,
og lignende.
Fortrinnsvis er en effektivt homolog søker avledet fra cDNA ifølge oppfinnelsen, minst femti prosent (50%) homolog med sekvensen som skal isoleres. Mer foretrukket
er den effektivt homologe søker minst syttifem til åtti prosent (75-80%) homolog med sekvensen som skal isoleres.
Mest foretrukket er den effektivt homologe søker minst
nitti prosent (90%) homolog med sekvensen som skal isoleres.
Slik uttrykket her er brukt, er homologi et mål for likhet mellom to nucleotidsekvenser (eller aminosyre-sekvenser). Homologi uttrykkes som andelen eller den prosentvise andel av sammenfallende baser (eller aminosyrer) etter at to sekvenser (eventuelt med ulik lengde) er blitt stilt opp mot hverandre. Uttrykket oppstilling brukes i den betydning som er definert av Sankoff og Kruskal i kapitel 1 av Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison (Addison-Wesley, Reading, MA, 1983). I grove trekk stilles to sekvenser opp mot hverandre ved å maksimere antallet sammenfallende baser (eller aminosyrer) mellom de to sekvensene ved innføring av et minimalt antall "blanke" eller "null"-baser i enten den ene eller den andre sekvens for å tilveiebringe maksimal overlapping. Når man har to sekvenser, er algoritmer tilgjengelige for å beregne homologien: f.eks. Needleham og Wunsch, J. Mol. Biol., vol. 48, s. 443-453
(1970); og Sankoff og Kruskal (henvist til ovenfor), s. 23-29. Kommersielle tjenester er også tilgjengelige for å utføre slike sammenligninger, f.eks. Intelligenetics, Inc. (Palo Alto, CA).
Synonyme aminosyrer innenfor en
gruppe har tilstrekkelig like fysikalsk-kjemiske egenskaper til å kunne byttes ut med medlemmer av gruppen og bevare molekylets biologiske funksjon: Grantham, Science, vol. 185, s. 862-864 (1974). Det er klart at innføyninger og fjerninger av aminosyrer også kan gjøres i den ovenfor definerte sekvens uten å endre biologisk funksjon, særlig dersom inn-føyningene og fjerningene bare omfatter noen få aminosyrer, f.eks. under 10, og ikke fjerner eller erstatter aminosyrer som er kritiske for en funksjonell konformasjon, f.eks. cysteinrester, Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, vol. 181, s. 223-230 (1973).
Fremstilling av proteiner og muteiner ved hjelp av slike dele-sjoner og/eller innskudd, faller innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Bestandig når det henvises til aminosyrerester fra proteinet med formel I ved tall, refererer tallet eller tallene seg til N-enden i proteinet.
Det er her brukt standardforkortelser for å betegne aminosyrer, nucleotider, restriksjonsendonucleaser og lignende: f.eks. Cohn, "Nornenelature and Symbolism of cx-Amino Acids" Methods in Enzymology, vol. 106, s. 3-17 (1984);
Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, 2. utg.
(Benjamin, Menlo Park, 1981), og Roberts, "Directory of Restriction Endonucleases", Methods in Enzymology, vol. 68,
s. 27-40 (1979).
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av forbindelser for anvendelse som immunregulerende midler for å behandle medisinske og/eller veterinærmedisinske sykdommer. Den tilveiebringer særlig forbindelser som har gunstige virkninger når de brukes alene, eller som kan virke sammen med andre lymfokiner og immunsystem-mediatorer for å gi gunstige virkninger.
Foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet, delvis sammen med tegningene (figurene 1 - 19). Figur IA viser nucleotidsekvensen og utledet aminosyresekvens av innføyningen av vektor pcD-2A-E3, som uttrykker murin IL-4. Figur IB viser nucleotidsekvensen og utledet aminosyresekvens av innføyningen av vektor pcD-125, som uttrykker human IL-4. Figur 1C viser aminosyresekvensen i renset, naturlig forekommende human IL-4 uttrykt og utskilt ved hjelp av COS 7 apeceller transfisert med pcD-125. Figur 2A er et kart over vektor pcD-2A-E3, hvis inn-føyning koder for murin IL-4. Figur 2B er et restriksjonsendonuclease-spaltingskart over innføyningen av vektor pcD-2A-E3. Figur 2C er et kart over vektor pcD-46, hvis inn-føyning koder for human IL-4. Figur 2D er et restriksjonsendonuclease-spaltingskart over innføyningen av vektor pcD-4 6. Figur 3A viser relative TCGF-aktiviteter (over et fortynningsområde) for forskjellige kultursupernatanter, deriblant en (kurve 1) fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler. Figur 3B viser relative MCGF-aktiviteter (over et fortynningsområde) for forskjellige kultursupernatanter, deriblant en (kurve 1) fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler. Figur 3C viser de relative grader av Ia-induksjon som fås ved hjelp av de angitte mengder supernatant fra pcD-
2A-E3-transfiserte COS 7 celler (kurve 1), Cl.Lyl<+>2~/9-celler (kurve 2), og "mock"-transfiserte COS 7 celler (kurve 3) . Figur 3D viser grafisk størrelsen avIgE- og IgG1~ induksjon ved supernatanter fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler og forskjellige kontroller i T-celle-tømte miltceller fra mus. Figur 4A viser TCGF-aktivitetene av flere pcD-125-transfeksjonssupernatanter og kontroller målt ved hjelp av en kolorimetrisk celledelingsanalyse på den faktor-avhengige humane hjelper-T-cellelinje, JL-EBV. Figur 4B viser TCGF-aktivitetene til en pcD-125-transfeksjonssupernatant og kontroller målt ved hjelp av en kolorimetrisk celledelingsanalyse på PHA-stimulerte lymfocytter fra perifert blod. Figur 4C viser TCGF-aktivitetene til en pcD-125-transfeksjonssupernatant og kontroller målt ved hjelp av inkorporering av tritiert thymidin ved hjelp av PHA-stimulerte lymfocytter fra perifert blod. Figur 5A er et histogram over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for en kontrollpopulasjon av stimulerte, humane mandel-B-celler hvis Fc-epsilon-reseptorer er blitt fluorescensmerket. Figur 5B er et histogram over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for en populasjon av stimulerte, humane mandel-B-celler som var blitt eksponert mot medium bestående av 0,1% supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler og hvis Fc-epsilon-reseptorer er blitt fluorescensmerket. Figur 5C er et histogram over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for en populasjon av stimulerte, humane mandel-B-celler som var blitt eksponert mot medium bestående av 1% supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler og hvis Fc-epsilon-reseptorer er blitt fluorescensmerket. Figur 5D er et histogram over cellefrekvens i forhold til fluorescensstyrke for en populasjon av stimulerte, humane mandel-B-celler som var blitt eksponert mot medium bestående av 10% supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler og hvis Fc-epsilon—reseptorer er blitt fluorescensmerket. Figur 6A viser nucleotidsekvensen til et syntetisk, humant IL-4-gen som er effektivt når det gjelder å uttrykke naturlig forekommende eller mutante IL-4-er i E. coli. Figur 6B er et restriksjonsendonuclease-spaltingskart over et syntetisk, humant IL-4-gen innføyd i plasmid pUC18.
Figurene 7A-7F viser hhv. de dobbeltkjedede DNA-fragmentene IA/B til 6A/B anvendt til å konstruere et syntetisk, humant IL-4-gen. Figur 8 viser nucleotidsekvenser i nabostilling til initiator-ATG-kodonet i E. coli ekspresjonsvektoren TAC-RBS. Sekvensene starter ved et EcoRI-restriksjonssete og slutter ved et Hindlll-sete. Den ribosombindende sekvens (RBS) som er komplementær til 3<1->enden i 16S ribosom-RNA, er understreket, og ATG-initiatorkodonet er understreket. Figur 9 viser histogrammer over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for populasjoner av celler avledet fra en pasient med lymfocyttmangelsyndrom. Cellene ble farget med fluorescensmerkede anti-DR monoklonale antistoffer. Figur 10 viser absorpsjonsprofilen ved 215 nm i det endelige rensingstrinn for human IL-4, som besto av revers-fase-HPLC på en C-4-kolonne. Figur 11 er et konstruksjonskart over plasmid pEBV-178 som inneholder human IL-4-cDNA. Figur 12 er et konstruksjonskart over plasmid TRPC11. Figur 13A er et konstruksjonskart over plasmid pMF-alfa8. Figur 13B viser TCGF-aktivitetene til flere transfeksjonssupernatanter fra gjærkulturer som uttrykker naturlig forekommende human IL-4 og forskjellige muteiner derav. Figur 14 viser vekstkurver for faktoravhengige celle-linjer; MC/9-mastceller (IA), DX-2-mastceller (IB), NFS-60-celler (1C) og HT2-T-celler (ID). 5 x IO<3> celler ble dyrket med varierende konsentrasjoner av Cl.1-supernatant (lukkede sirkler), IL-2R (lukkede kvadrater), IL-3R (åpne sirkler), GM-CSFR (åpne triangler), IFN-?R (lukkede triangler) eller P388Dl-supernatant (åpne romber). MC/9-celler (IA) ble også dyrket med varierende konsentrasjoner av renset IL-3 (lukkede sirkler) eller IL-3 blandet med 200 enheter av IL-2R (lukkede kvadrater), GM-CSF<R> (åpne triangler), IFN-7 TJ (lukkede triangler) eller P388Dl-supernatant (åpne romber). Vekstfaktoraktivitet ble målt etter 24 timer ved kolorimetrisk analyse. Absorbansen ved 570 nm (referanse 630 nm) ble målt på et avlesningsapparat av type Dynatek "Micro Elisa". Figur 15 viser FPLC kationbytterkromatografi av Cl.1-supernatant. 7 ml (35 mg protein) av konsentrert supernatant ble dialysert over i 50 nM Na-fosfat, 1 mm EDTA, pH 7,0 (7,8 mS/cm) og tilført Pharmacia Mono S-kolonne (0,5 x 5 cm) ekvilibrert med den samme buffer (buffer A). Buffer B = A + IM NaCl. Elueringsbetingelser: 0,5 ml/min. strømningshastighet; 0,5 ml/fraksjon; 0-40% B i løpet av 40 minutter, 40-100% B i løpet av 10 minutter. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på celledelingsaktivitet på NFS-60- (IL-3, lukkede sirkler), HT2- (TCGF, åpne sirkler) og MC/9- (MCGF) celler. MC/9-responsen er ikke vist; piler viser stillingene hvor MC/9-celledelingsnivåer nådde opp til nivåene for Cl.1-supernatant. Figur 16A viser reversfase — C8-kromatografi av IL-3-redusert Cl.1-supernatant. 100 ul 3X mono-S-passert supernatant (fraksjonene 59-61, figur 15) i 0,1% TFA ble fylt på Pharmacia C8 reversfase-kolonne (0,5 x 2 cm). Buffer A = 0,1% TFA i H20, buffer B = 0,1% TFA i acetonitril. Elueringsbetingelser: 0,5 ml/min., 0,5 ml/fraksjon, 0-25% B i løpet av 4 minutter, 25-60% B i løpet av 50 minutter, 60-100% B i løpet av 4 minutter. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på celledelingsaktivitet på NFS-60-(IL-3, lukkede sirkler), HT2- (TCGF, åpne sirkler) og MC/9-celler (MCGF, lukkede triangler). Pil viser fraksjon som inneholder topp-TCGF-aktivitet, og som ga MC/9-celledelingsnivåer svarende til nivåene til Cl.1-supernatant etter tilsetning av mettende IL-3 jj_-nivåer til hver fraksjon. Figur 16B viser reversfase-C8-kromatografi av GK15-1 murin T-celle-supernatant. 2 mg (0,5 ml) konsentrert GK15-1-supernatant i 0,1% TFA ble tilført en Pharmacia C8-revers-fase-kolonne og eluert som ovenfor. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på TCGF-aktivitet på HT2-celler (åpne sirkler). Pil markerer stillingen hvor murin IL-2 eluerte under identiske betingelser. Innføyelse: titreringer av Cl.l (lukkede sirkler) og IL-2 TJ (lukkede kvadrater) og GK15-l-supernatant (åpne sirkler) TCGF-aktiviteter direkte sammenlignet på den samme plate. Figur 17 viser MCGF- og TCGF-aktivitet av delvis renset faktor fra reversfase-kolonne (RP-faktor). Celle-deling ble målt ved hjelp av [ 3H]-thymidin-innlemmelse etter en 24-timers dyrkningsperiode. MC/9-mastceller og HT2-T-celler ble dyrket med varierende konsentrasjon av
jj_
Cl.1-supernatant (lukkede sirkler), IL-3 (åpne sirkler), IL-2 jj (åpne triangler), RP-faktor (åpne kvadrater) og fortynninger av RP-faktor i nærvær av 200 enheter IL-3jj_
(lukkede kvadrater) eller fortynninger av IL-2 i nærvær av mettende nivåer av RP-faktor (lukkede triangler).
Figur 18 viser kromatofokusering av Cl.1-supernatant. 1,5 ml (3,5 mg) supernatant i 25 nM bis-tris, pH 7,1, ble fylt på en Pharmacia "Mono P"-kolonne (0,5 x 20 cm) og eluert med polybuffer 74 (1:10), pH 4,0, strømningshastighet 0,5 ml/min., 1 ml/fraksjon. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på celledeling på NFS-60 (IL-3, åpne sirkler), HT2 (TCGF, lukkede sirkler) og MC/9 (MCGF, ikke vist, bortsett fra at topp-MCGF-aktivitet er angitt med pil). TCGF-toppen (fraksjon 12, pl=6,2) sammenfaller med en minimal IL-3-aktivitet; MCGF-celledelingsnivåer er høyest ved pilangivelsen. Figur 19 viser en SDS-PAGE av Cl.1-supernatant og delvis renset MCGF/TCGF. A) Ikke-reduserende SDS-PAGE av ikke-fraksjonert supernatant. Før reduksjon med 50 niM DTT (60°C x 5 minutter) skifter TCGF-topper til svakt høyere molekylvekter (21 kd og 16 kd), og ledsages av et drastisk aktivitetstap.
B) Ikke-reduserende SDS-PAGE av topp-MCGF/TCGF-fraksjoner fra kationbytterkromatografi (fraksjonene 59-61, figur 15). Før reduksjon med 50 mM DTT (ved 60°C
i 5 minutter) skifter MCGF- og TCGF-topper til svakt høyere molekylvekter (21 kd og 16 kd), og ledsages av et drastisk aktivitetstap. Piler markerer de eneste fraksjoner hvor tilsetning av mettende mengder av IL-3
øker MCGF-aktivitet til supernatantnivåer: IL-3 (åpne sirkler), TCGF (lukkede sirkler), MCGF (åpne triangler).
Foreliggende oppfinnelse omfatter således fremstilling av glycosylerte eller ikke-glycosylerte polypeptider som oppviser human-IL-4-aktivitet, og som lar seg avlede fra IL-4-polypeptidene som er beskrevet, ved å bruke standard protein-fremstillingsteknikker. Oppfinnelsen omfatter også nucleinsyrer med sekvenser som er i stand til å kode for polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen, og nucleinsyrer med sekvenser som er effektivt homologe med cDNA-klonene i en vektor ifølge oppfinnelsen.
Teknikker for fremstilling, anvendelse og identifisering av polypeptidene og nucleinsyrene
. er omtalt nedenunder i generelle vendinger. Senere
gis det flere spesifikke eksempler hvor de generelle tek-nikkene anvendes ved å bruke bestemte celletyper, vektorer, reagenser og lignende. Isoleringen fra naturlige kilder vil først bli beskrevet i korte trekk.
Disse polypeptidene kan renses til tilsynelatende homogenitet fra supernatanter av lett tilgjengelige celle-kilder, og kan således fremstilles økonomisk i ren form,
noe som muliggjør forskjellige terapeutiske og andre anvendelser.
Disse polypeptidene er karakterisert ved å omfatte et polypeptid som oppviser B-celle-, T-celle- og mastcelle-stimulerende aktivitet. I naturlig form i en art oppviser polypeptidene en molekylvekt på SDS-PAGE på ca. 20 kd og 15 kd under ikke-reduserende betingelser, og 21 kd og 16 kd under reduserende betingelser. Et preparat som inneholder de foreliggende polypeptider i hovedsakelig ren form, oppviser et isoelektrisk punkt (pl) på ca. 6,2 ved kromatofokusering. Vekstfaktorene er svært sterke midler, idet de oppviser betydelig aktivitet ved ekstremt lave konsentrasjoner (f.eks. mindre enn 1 nanogram pr. ml). Polypeptidene kan skjelnes fra hormoner og andre proteiner som fremstilles naturlig av T-celler (f.eks. IL-2, IL-3, GM-CSF og IFN-?) gjennom kationbytterkromatografi eller unike elueringsbetingelser fra reversfase-kolonner.
I murine arter gir noen polypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen bare lave nivåer av celledeling av visse celler, slik som IL-3-avhengige mastcellelinjer, men øker synergistisk veksten av slike celler (f.eks. mastceller) i nærvær av en andre faktor (f.eks. IL-3). Polypeptidene kan stimulere celledelingen av flere T-cellelinjer, men generelt i en mindre utstrekning enn renset IL-2. Dessuten kan slike polypeptider indusere Ia-ekspresjon på hvilende B-celler og øke IgG-^- og IgE-sekresjon fra B-celler, på samme måte som BSF-1. Disse aktivitetene lar seg ikke skille ut til tross for flere biokjemiske fraksjoneringer. De fleste aktivitetene ødelegges imidlertid etter reduksjon, f.eks. i nærvær av
SDS.
Disse faktorene kan oppnås fra en rekke naturlige kilder på flere forskjellige måter. En egnet kilde er en hvilken som helst av et antall T-cellelinjer som produserer angjeldende polypeptider. En slik T-cellelinje ble avledet fra C57GL6-mus (Nabel, G. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 7J3: 1157-1161 (1981)), en cellelinje som kan oppbevares i modifisert, supplert DME (Nabel, G. et al., Cell, 23: 19-28 (1982). Denne cellelinje, opprinnelig betegnet Cl.Lyl<+>2~/9, ble deponert ved American Type Culture Collection og tildelt deponeringsnummer CRL 8179. Andre egnede celle-kilder for disse polypeptidene omfatter nesten hvilke som helst celler som utskiller de forskjellige antistoffene som henfører seg til polypeptidene, slik som humane lymfocytter fra perifert blod, samt hvilke som helst av de velkjente T-celle-kilder, slik som mandler, milter, etc.
Supernatanten fra slike cellulære kilder eller, i noen tilfeller, væske fra de knuste celler, kan utsettes for en rekke forskjellige velkjente rensefremgangsmåter for å
fraskille proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Rense-teknikkene brukes fortrinnsvis i kombinasjon for å sikre høye renhetsnivåer. Vanligvis vil rensingene utnytte gel-filtreringskromatografi, SP-kationbytterkromatografi, reversfase-kromatografi, gruppespesifikk kromatografi (f.eks. på Heparin-Sepharose<®>) eller andre vanlige separasjons-metoder som gir effektiv proteinfraksjonering. Væske-kromatografi under høyt trykk (HPLC), isoelektrisk fokusering og SDS-polyacrylamidgelelektroforese kan også benyttes.
F.eks. kan en supernatant fra en passende cellelinje først fraksjoneres ved kromatografering på en sterk kation^-bytter. Vanligvis forblir polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen bundet til kolonnen, mens ca. 98% av det påsatte protein passerer igjennom. Det gjenværende, bundne protein kan elueres med en saltgradient. Ved en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse frigjorde en natriumkloridgradient vedkommende polypeptid ved ca. 0,19 M. Denne fraksjonering ble gjentatt to ytterligere ganger (primært for å fjerne rest-IL-3), noe som ga mer enn ca. 95% renhet. Deretter ble materialet suksessivt fraksjonert ved hjelp av Heparin-Sepharose<®> og reversfase-kromatografi (c4 eller cl8). I det sistnevnte tilfelle eluerte disse polypeptidene ved 42% acetonitril. Disse sammenslåtte fraksjoner inneholder angjeldende polypeptid i ekstremt høy renhet, i det vesentlige i homogen tilstand (et enkelt bånd ved ca. 20 kd på sølv-farget SDS-PAGE). Dette rensede materiale er minst 65.000 ganger mer rent enn materialet slik det foreligger i naturlig form.
Disse polypeptidene kan brukes som antigener for fremstilling av antistoffer som igjen kan brukes som antigener for fremstillingen av anti-idiotype antistoffer.
Det kan enten fremstilles polyklonale eller monoklonale antistoffer på konvensjonelle måter. Disse polypeptidene eller fragmenter derav, vanligvis fragmenter med minst ca. 15 aminosyrer, kan i seg selv brukes, men bindes eller knyttes fortrinnsvis til et hjelpestoff eller et antigen som akti-verer immunsystemet. Forskjellige antigener kan brukes, slik som serumalbuminer, "keyhole limpef-hemocyanin, globu-liner eller lignende. En lang rekke forskjellige teknikker er tilgjengelige for å knytte hjelpestoffer til polypeptider, slik som glutaraldehyd, maleimidobenzosyre, diazobenzosyre eller lignende. Hjelpestoffer omfatter Freunds hjelpestoffer, aluminiumhydroxyd eller lignende. Antigenet injiseres i en passende vert på konvensjonelle måter, og en eller flere forsterkningsinjeksjoner kan gjøres med inter-valler på 2 til 4 uker. Når det anvendes monoklonale antistoffer, injiseres vanligvis en mus med den opprinnelige og forsterkningsinjeksjonene, og milten isoleres, og deretter fusjoneres splenocytter med en passende fusjonspartner i henhold til konvensjonelle teknikker. Se f.eks. Galfre et al., Nature (1977), 266:550; Kennett et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:77; og U.S. patentskrift nr. 4 381 292 og 4 363 799. For spesielle formål kan imidlertid andre pattedyr anvendes, slik som primater,
f.eks. mennesker, for fremstilling av antistoffer med humane Fc-kjeder.
Polypeptidene kan brukes i seg selv eller i kombinasjon med antistoffene ved diagnostisering av polypeptidene. Enten den ene eller begge kan være merket eller umerket
for bruk i diagnoseprøver. Et stort antall diagnoseprøver er beskrevet i litteraturen og omfatter binding, enten direkte eller indirekte, av disse polypeptidene eller antistoffene til forskjellige markører, slik som enzymer, radio-nuclider, fluorescensmidler, substrater, coenzymer, partikler, f.eks. magnetiske partikler, eller lignende. Som
illustrasjoner på disse prøvene, se f.eks. U.S. patent-skrifter nr. 3 817 837, 3 850 752, 4 174 384, 4 177 437 og 4 374 925.
Forskjellige prøvemetoder oppdeles skjønnsmessig i homogene og heterogene immunprøver hvor adskillelsen er basert på hvorvidt komplekset mellom polypeptidet og dets antistoff må separeres fra de ikke-kompleksdannede medlemmer av det bestemte bindingpar. Forskjellige prøver er henvist til som EI, ELISA, RIA, homogen EIA, "dot-blot", Westerns eller lignende.
Antistoffer mot disse polypeptidene kan selv brukes som antigener til å fremstille anti-idiotyper som kan tjene som konkurrerende antigener, og som har epitope seter som konkurrerer med epitope seter i polypeptidene. Disse anti-idiotypene kan derfor tjene som tumorinhibitorer, som erstatninger for de angjeldende polypeptider eller som anta-gonister for de angjeldende polypeptider.
Disse polypeptidene danner en familie av naturlig forekommende polypeptider som kan avledes fra naturlige kilder, samt ikke-naturlig forekommende polypeptider som har fysiologiske egenskaper, slik som bindingsspesifisitet og B-celle- eller mastcelle-stimulerende aktivitet, til felles. Mindre forskjeller mellom arter eller opprinnelse kan kreve modifikasjon av rensefremgangsmåtene, noe som er kjent for fagfolk innen teknikken. Alternativt kan disse polypeptidene sekvensbestemmes, og deretter kan fragmenter syntetiseres i overensstemmelse med velkjente teknikker.
Se f.eks. Barany og Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, "The Peptides, Analysis Synthesis Biology",
Special Methods in Peptide Synthesis, del A, vol. 2, Gross og Merenhofer, red., Academic Press, N.Y. 1980, s. 1-284.
Polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse vil finne anvendelse på en rekke forskjellige måter. F.eks. kan disse polypeptidene indusere veksten av T-celler og mastceller, enten i kultur eller in vivo. Mastceller er som tidligere angitt, viktige kilder for heparin, histaminer, prostaglandiner og andre fysiologisk viktige stoffer. Likeledes kan vekstfaktorene anvendes til å stimulere B- og T-celler, særlig de som er kjent for å utskille proteiner (f.eks. lymfokiner og immunglobuliner) som virker i immunsystemet. Typisk vil faktorene bli inkorporert i kultur-medium tilsatt cellekulturer. En egnet konsentrasjon av faktorene vil variere avhengig av cellelinjetypen, men vil generelt være til stede i ca. 0,1 ug/ml til ca. 1 mg/ml, helst ca. 1 ug/ml til ca. 10 ug/ml, i kulturer. Bruken av vekstfaktorene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan eliminere behovet for å benytte mateceller for å opprettholde de ønskede cellelinjer, noe som resulterer i vesentlige økninger i renheten til produktene fra cellelinjen.
Polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse vil også finne anvendelse in vivo ved behandlingen av forskjellige immunmangler, eller for å øke den naturlige immunrespons. F.eks. kan slike polypeptidpreparater hjelpe til i behandlingen eller forhindringen av infeksjon ved å stimulere modningen og/eller veksten av B-celler, T-celler og mastceller, og derved redusere dyrets mottakelighet for infeksjon.
I. De novo fremstilling av IL- 4- cDNA
Flere fremgangsmåter er nå tilgjengelige for de novo fremstilling og kloning av cDNA-er, og for konstruksjon av cDNA-biblioteker: f.eks. er nyere oversikter gitt av Doherty, "Cloning and Expression of cDNA", kapittel 10 i Gottesman, red., Molecular Cell Genetics (John Wiley & Sons, New York, 1985) og Brandis et al., "Preparation of cDNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequences", i Setlow et al., redv Genetic Engineering, vol. 8, s. 299-316 (Plenum Press, New York, 1986).
Som et eksempel ekstraheres total mRNA (f.eks. som rapportert av Berger, S. et al., Biochemistry _18: 5143-5149
(1979)) fra celler (f.eks. en ikke-transformert human T-celle-kilde) som danner polypeptider som utviser den ønskede aktivitet. De dobbeltkjedede cDNA-er fra denne total-mRNA kan konstrueres ved å bruker primer-initiert revers-trans-
kripsjon (Verme, I., Biochem. Biophys. Acta, vol. 473,
s. 1-38 (1977)) for først å lage komplementet til hver mRNA-sekvens, og deretter ved å starte opp syntese av den andre kjede (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 2251-2266
(1981)). Deretter kan cDNA-er klones ved å binde dem til egnede plasmid- eller bakteriofagvektorer (Rougeon, F. et al., Nucleic Acids Res., 2, 2365-2378 (1975)) eller Scherer, G. et al., Dev. Biol. 8_6, 438-447 (1981)) gjennom komplementære homopolymere haler (Efstratiadis, A. et al., Cell, 10, 571-585 (1977)) eller sammenhengende ender dannet med koblersegmenter som inneholder passende restriksjonsseter (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1982), og deretter transformere en egnet vert. (Se generelt Efstratiadis, A., og Villa-Kormaroff, L., "Cloning of double stranded cDNA"
i Setlow, J. og Hollaender, A. (red.), Genetic Engineering, vol. 1, Plenum Publishing Corp., N.Y., U.S.A. (1982)).
En foretrukket mRNA-kilde som koder for de ønskede polypeptider, er celler med supernatanter som inneholder de stimulerende aktiviteter for B-cellen, T-cellen og/eller mastcellene, eller andre aktiviteter forbundet med polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen. En slik linje er mus-T-cellelinje Cl.Lyl"'"2~/9 (A.T.C.C. deponeringsnummer CRL8179) (Nabel, G. et al., Nature, 291: 332-334 (1981)). Generelt kan egnede T-celler fås fra en rekke forskjellige kilder, slik som pattefMEm*itt (f .eks. human) , mandler og perifert blod. T-celle-kloner, slik som de som isoleres fra T-lymfocytter fra perifert blod, kan også brukes (se Research Monographs in Immunology, red. von Doehmer, H. og Haaf, V.; Section D: "Human T-Cell Clones", vol. 8, ;s. 243-333; Elsevier Science Publishers, N.Y. (1985)). ;Fremstilling av mRNA-er som er i stand til å kode for IL-4 ved hjelp av slike celler, kan bekreftes ved mikro-injeksjon av den ekstraherte mRNA i oocytter fra Xenopus laevis. Denne mikroinjeksjonsteknikk er beskrevet mer fullstendig nedenunder og er generelt beskrevet i Colman et al., "Export of Proteins from Oocytes of Xenopus Laevis", Cell, vol. 17, s. 517-526 (1979) og Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, s. 350-352 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). ;Dersom mRNA-ene som koder for en ønsket IL-4 utgjør en svært liten del av den totale mRNA, kan det være nødvendig med trinn for å anrike fraksjonskonsentrasjonen for å gjøre screeningfremgangsmåten praktisk for påvisning av cDNA-kloner av interesse. Slike fremgangsmåter er standard innen teknikken og er beskrevet i eksemplene nedenunder og i flere papirer og litteraturhenvisninger, slik som Maniatis et al., s. 225-228, sitert ovenfor; Suggs et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 78, s. 6613-6617 (1981); Parnes et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 78, s. 2253-2257 (1981) og Davis et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 81, s. 2194-2198 (1984). ;En foretrukket fremgangsmåte for de novo fremstilling av IL-4-cDNA-er beror på funksjonell ekspresjon av cDNA-ene i pcD-ekspresjonssystem utviklet av Okayama og Berg, beskrevet i Mol. Cell. Biol., vol. 2, s. 161-170 (1982) og vol. 3, s. 280-289 (1983), og tilgjengelig fra Pharmacia (Piscataway, N.J.). pcD-ekspresjonsvektoren inneholder den første SV40-promoter, det siste sammenknytningspunktet og opprinnelsesstedet for replikasjon. Denne vektoren til-later ekspresjon av cDNA-innskudd i COS 7 apeceller som gir T-antigen for replikasjon av pcD-plasmidet. Screening av cDNA-biblioteker omfatter transfeksjon av blandinger av plasmid-DNA til COS 7 celler ved å bruke DEAE-dextran. Ettersom lymfokiner, og særlig IL-4, er utskilte proteiner, kan supernatantene fra de transfiserte celler analyseres med hensyn på biologisk aktivitet etter inkubasjon i flere dager. Positive blandinger oppdeles videre for å identifisere enkeltstående cDNA-kloner som gir biologisk aktivitet etter transfeksjon. ;I korte trekk konstrueres ekspresjonsvektoren til Okayama og Berg på følgende måte. Polyadenylert mRNA bindes til en polydeoxythymidylsyre-hale (oligo dT) festet til den fremstikkende kjede i et Kpnl-oppløst pBR322-plasmid som inneholder det første SV40-promoterområde. Dvs. at hele vektoren tjener som en primer for cDNA-syntese. Etter cDNA-syntese festes 3<1->polydeoxycytidylat-haler (oligo dC) , etterfulgt av Hindlll-oppløsning som skjærer av (i et unikt Hindlll-sete) et fragment av SV40-DNA som en av oligo dC-halene festes til. Den første SV40-promoter forblir intakt, og tilfeldig opptredende Hindlll-seter i innskuddet påvirkes minimalt ettersom den hybride cDNA/RNA er resistent mot Hindlll-oppløsning. Et separat konstruert HindIII-fragment med en 3'-polyguanidylert (oligo dG) hale bindes til den klebrige ende etter Hindlll-oppløsningen. Vektoren gjøres ringformet og behandles med E. coli RNase H, DNA-polymerase I og DNA-ligase for å erstatte RNA-kjeden med DNA. Vektorene klones i E. coli slik at det dannes et cDNA-bibliotek. SV40-elementene gjør det mulig for vektorene å bli uttrykt i eucaryote celler likeså vel som i procaryote celler, og særlig i pattedyrceller, slik som COS 7 apeceller eller eggstokkceller fra kinesisk hamster (CHO). ;Så snart cDNA-biblioteket i Okayama/Berg-plasmid-vektoren er blitt fullført, samles cDNA-klonene, og tilfeldige blandinger kontrolleres med hensyn på tilstedeværelsen av de ønskede cDNA-er ved hjelp av standardfremgangsmåter, f.eks. hybridseleksjon, påvisning av antigendetermin-anter på uttrykte produkter og/eller funksjonsanalyser. Positive blandinger kan deretter gjennomsøkes med en cDNA fra en indusert T-cellelinje. Deretter deles de positive, gjennomsøkte blandinger opp i individuelle kloner som testes ytterligere ved hjelp av transfeksjon i en egnet vert (slik som en pattedyrcellekultur), og vertsupernatanten analyseres med hensyn på aktivitet. II. Fremstilling av IL- 4- cDNA- er via hybridiserings-søkere avledet fra cDNA- er som her er beskrevet cDNA-ene som her er beskrevet, kan brukes som søkere for å identifisere homologe sekvenser i forskjellige celletyper, som et alternativ til de novo isolering og kloning av de IL-4-kodende nucleotider. Standardteknikker anvendes, ;f.eks. Beltz et al., "Isolation of Multigene Families and ;Détermination of Homologies by Filter Hybridization Methods", ;Methods in Enzymology, vol. 100, s. 266-285 (1983) og Callahan et al., "Detection and Cloning of Human DNA ;Sequences Related to the Mouse Mammary Tumor Virus Genome", Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 79, s. 5503-5507 (1982). I hovedtrekk brukes cDNA-ene til å konstruere søkere (ved å bruke standardteknikker, se f.eks. Maniatis et al. ovenfor) for screening ved lave hybridiser-ingsstrengheter, av genom- eller cDNA-biblioteker (igjen konstruert ved hjelp av standardteknikker) av en celletype som mistenkes for å danne IL-4. Det anvendes standard screeningsfremgangsmåter, f.eks. Grunstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 72, s. 3961-3965 (1975) eller Benton et al., Science, vol. 196, s. 180-183 (1977). ;Som beskrevet mer fullstendig nedenunder, ble human IL-4 isolert ved hjelp av en murin IL-4-søker. Etterfølgende analyse indikerte ca. 70% homologi mellom utvalgte områder av de humane og mus-cDNA-ene. På bakgrunn av den evolusjons-messige avstand mellom mus og mennesker antas det at de fleste, om ikke alle, pattedyr-IL-4-gener lar seg påvise ved hjelp av søkere konstruert fra én eller flere cDNA-er ifølge oppfinnelsen: Wilson et al., "Biochemical Evolution", Ann. Rev. Biochem., vol. 46, s. 573-639 (1977); Kimura, "The Neutral Theory of Molecular Evolution", kapittel 11 i Nei og Koehn, red., Evolution of Genes and Proteins (Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1983). ;III. Fremstilling av mutante IL- 4- er ved protein-oppbyqqing ;Når først informasjon om nucleinsyresekvens og/eller aminosyresekvens er tilgjengelig for et naturlig forekommende protein, blir en rekke teknikker tilgjengelige for å fremstille praktisk talt hvilken som helst mutasjon i den naturlig forekommende sekvens. Shortle, i Science, vol. 229, s. 1193-1201 (1985), gir en oversikt over teknikker for mutering av nucleinsyrer som er anvendbare for foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis fremstilles mutanter av de naturlig forekommende IL-4-er, dvs. IL-4-muteiner, ved hjelp av stedspesifikk oligonucleotid-rettet mutagenese, se f.eks. Zoller og Smith, Methods in Enzymology, vol. 100, ;s. 468-500 (1983); Mark et al., U.S. patentskrift nr. ;4 518 584 med tittel "Human Recombinant Interleukin-2 Muteins"; eller ved såkalt "kassett" mutagenese beskrevet av Wells et al., i Gene, vol. 34, s. 315-323 (1985) og Estell et al., Science, vol. 233, s. 659-663 (1986). I avsnittene nedenunder er tegnsystemet brukt av Estell et al. (referert til ovenfor) for å identifisere muteiner fulgt og general-isert. F.eks. angir "human IL-4 mutein Leu^" (eller 8 2 ;ganske enkelt "Leu " dersom det naturlig forekommende protein forstås ut fra sammenhengen) et polypeptid med aminosyresekvens som er identisk med sekvensen til det naturlig forekommende protein bortsett fra stilling 82 i forhold til N-enden. I den stillingen er Phe blitt erstattet med Leu. Mer enn én substitusjon kan angis på samme måte, f.eks. henvises et mutein hvor Phe er byttet ut med Leu i stilling 8 2 og Asn er byttet ut med Asp i stilling 111, til som human IL-4 mutein (Leu 82 , Asp 111). Fjerninger angis ved hjelp av "A-er". F.eks. refereres et mutein som mangler Gin i still-71 ;ing 71, til som human IL-4 mutein A.. Et innskudd angis ved hjelp av "IS(Xaa)". F.eks. refereres et mutein med en Leu innskutt eller Gin i stilling 71 til som human IL-4 mutein IS 71 (Leu). Således utgjør human IL-4 mutein (Ser 13, ;71 94 ;A. / IS (Gly)) den naturlig forekommende humane IL-4-sekvens som er blitt modifisert ved å bytte ut Thr med Ser i stilling 13, fjerne Gin i stilling 71 og innskyte Gly umiddelbart etter Ala i stilling 94. Innskudd av flere aminosyrer på det samme sted angis ved IS<1>(Xaa^-Xaa2~Xaag-...), hvor Xaa^-Xaa2~Xaa2••• er sekvensen innskutt etter stilling i. N-terminal-addisjoner angis ved hjelp av indeks "0", f.eks. IS°(Xaa), og en sekvens av fjerninger, f.eks. av aminosyrene r ir, w o. x. A6-10 , , (£ J A8 A9 10. 6-10, betegnes enten som A eller som IA r A , A , A , A )• ;Helst anvendes kassett-mutagenese til å frembringe humane IL-4-muteiner. Som mer fullstendig beskrevet nedenunder, er et syntetisk, humant IL-4-gen blitt konstruert med en sekvens av entydige restriksjonsendonucleaseseter omtrent jevnt fordelt langs genet. Entydigheten til restriksjons-setene bør beholdes når genet innføres i en passende vektor slik at segmenter av genet på høvelig måte kan fjernes og erstattes med syntetiske oligonucleotider (dvs. "kassetter") som koder for ønskede muteiner. ;Bestemmelse av antallet og fordelingen av entydige restriksjonsseter medfører bedømmelse av flere faktorer, deriblant (1) restriksjonsseter som foreligger på forhånd i ekspresjonsvektoren, (2) hvorvidt bruk av artsspesifikk eller slektsspesifikk kodon er ønsket, og (3) fordelen og påliteligheten ved å syntetisere og/eller sekvensere seg-mentene mellom de entydige restriksjonsseter. IV. Biologiske egenskaper og analyse med hensyn på IL- 4-aktivitet ;Pattedyr-IL-4 defineres ved hjelp av biologiske virkninger og/eller homologi med de beskrevne utførelsesformer. Pattedyr-IL-4 ;omfatter proteiner og muteiner (av de beskrevne naturlig forekommende polypeptider) som er homologe med de beskrevne naturlig forekommende polypeptider, og som utviser både BCGF-aktivitet og TCGF-aktivitet. Pattedyr-IL-4 ;defineres alternativt ved sine biologiske virkninger (definert mer fullstendig nedenunder) som omfatter BCGF-aktivitet og TCGF-aktivitet (som her er henvist til som IL-4-aktivitet), samt minst én eller flere aktiviteter valgt fra gruppen av aktiviteter bestående av MHC-antigen-induksjonaktivitet, Fc-epsilon-reseptor-induksjonsaktivitet, GM-CSF-stimulert granulocyttkolonivekstpotensierende aktivitet, interleukin-2-TCGF-potensierende aktivitet og IgG^-og IgE-induksjonsaktivitet. ;Det antas at IL-4 er artsspesifikke med hensyn til sine virkninger. Dvs. f.eks. at human IL-4 utviser TCGF-aktivitet slik den analyseres ved hjelp av humane T-celle-linjer, men ikke slik den analyseres ved hjelp av murine T-cellelinjer. Og omvendt utviser murin IL-4 TCGF-aktivitet slik den analyseres ved hjelp av murine T-cellelinjer, men ikke slik den analyseres ved hjelp av humane T-cellelinjer. ;A. TCGF-aktivitet ;Flere standardanalyser er blitt beskrevet for TCGF-aktivitet, f.eks. Devos et al., Nucleic Acids Research, ;vol. 11, s. 4307-4323 (1983); Thurman et al., J. Biol. Response Modifiers, vol. 5, s. 85-107 (1986) og Robert-Guroff et al., kapittel 9 i Guroff, red., Growth and Maturation Factors (John Wiley, New York, 1984). Generelt er TCGF-analyser basert på en faktors evne til å fremme celledelingen av perifere T-lymfocytter eller IL-2-avhengige T-cellelinjer, f.eks. Gillis et al., J. Immunol., vol. 120, s. 2027 (1978). Celledelingen kan bestemmes ved hjelp av standardteknikker, f.eks. inkorporering av tritiert thymidin, eller ved hjelp av kolorimetriske metoder, Mosmann, ;J. Immunol. Meth., vol. 65, s. 55-63 (1983). ;Som et eksempel kan human TCGF-aktivitet analyseres ved hjelp av følgende trinn: (1) vaskede, humane lymfocytter fra perifert blod (ca. 2 x IO<5> i 50 mikroliter) som på forhånd er stimulert med fytohemagglutinin (PHA) i 7 dager og deretter dyrket i 7 dager med IL-2, tilsettes til en mikro-titerbrønn; (2) fortynninger (50 mikroliter) av det TCGF-holdige materiale tilsettes til hver brønn; (3) lymfocyttene inkuberes i 72 timer ved 37°C; (4) tritiert thymidin ;(ca. 20 mikroliter, 20 mikrocurie/ml) tilsettes til hver brønn; og (5) celler innhøstes på filtrerpapirstrimler, vaskes og telles i en scintillasjonsteller. ;Som beskrevet mer fullstendig i eksemplene, har visse former av IL-4 evne til å potensiere TCGF-aktivitet til IL-2. "Potensiering" slik det her er brukt ved henvisning til slik aktivitet, betyr at det maksimale celledelings-nivå i et TCGF-analysesystem forårsaket av IL-2, økes ved tilsetning av IL-4. ;B. BCGF-aktivitet ;BCGF-aktivitet bestemmes ved hjelp av en analyse be- ;skrevet av Howard et al., J. Exp. Med., vol. 155, ;s. 914-923 (1982). En generell oversikt over analyser med hensyn på BCGF er gitt av Howard og Paul, i Ann. Rev. Immunol., vol. 1, s. 307-333 (1983). I korte trekk måles BCGF-aktivitet ved hjelp av den grad hvorved rensede, hvilende B-celler stimuleres til å dele seg i nærvær av en submitogen konsentrasjon av anti-IgM eller lignende antigen. Som et eksempel kan analyse av human BCGF-aktivitet utføres ved hjelp av følgende trinn: Anrikede B-cellepopulasjoner erholdes fra perifert blod, milt, mandler eller andre standardkilder ved hjelp av "Ficoll7Hypaque<®>densitetsgradientsentrifugering (f.eks. Pharmacia) og to omganger med rosettdannelse med 2-amino-ethylisothiouroniumbromid-behandlede erythrocytter fra sau for å eliminere T-celler. Slike B-cellepreparater bør inneholde mer enn 95% overflate-Ig<+->celler og mer enn 95% celler som er positive for human B-cellespesifikt antigen, slik det bestemmes ved hjelp av det anti-humane B-celle-spesifikke monoklonale antistoff Bl som er tilgjengelig fra Coulter (Hialeah, FL). T-celle-forurensning bør være mindre enn 1% bestemt ved farging med anti-Leu-1 monoklonale antistoffer (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) eller OKT 11 antistoffer (Ortho Diagnostics, Westwood, MA). 3 milliliter ;5 ;kulturer av slike B-lymfocytter (ca. 5 x 10 pr. ml i Yssels medium, Yssel et al., J. Immunol. Meth., vol. 65, ;s. 55-63 (1984)), aktiveres enten med Staphylococcus aureus stamme Cowan I (SAC) (f.eks. 0,01% oppløsning av SAC, som er tilgjengelig fra Calbiochem under varemerket Pansorbin®, eller som kan fremstilles som beskrevet av Falkoff et al., J. Immunol., vol. 129, s. 97-102 (1982)) eller med anti-IgM-antistoffer (f.eks. BRL, Gaithersburg, MD) koplet til kuler, f.eks. 5 mikrogram/ml "Immunobeads" som er tilgjengelig fra Bio-Rad (Richmond, CA). B-cellene dyrkes enten i 24 timer (i tilfellet med SAC) eller 72 timer (for anti-IgM-kuler) og renses deretter på nytt ved hjelp av "FicoliyHypaque-densitetsentrifugering for å fjerne SAC-partikler, kuler, ikke-levedyktige celler og lignende. B-celledelingen måles ved å plate ut ca. 5 x 10 4 B-lymfocytter ;i 50 mikroliter medium i 0,2 ml flatbunnede mikrotiter-brønner. Forskjellige fortynninger av materialene som mistenkes for å ha BCGF-aktivitet, tilsettes i et sluttvolum på 50 mikroliter. Inkorporering av tritiert thymidin bestemmes etter 48 timer (anti-IgM-kulturer) eller 72 timer (SAC-kulturer). Lignende analyser er også beskrevet av Muraguchi et al., J. Immunol., vol. 129, s. 1104-1108 (1982) og Yoshizaki et al., J. Immunol., vol. 128, s. 1296-1301 ;(1981). ;C. MHC-antigeninduksjon ;Det er blitt påvist at IL-4 kan indusere ekspresjon av MHC-antigener (f.eks. Ia i mus) i forskjellige celletyper i immunsystemet, særlig B-celler. Roehm et al., i J. Exp. Med., vol. 160, s. 679-694, fremla bevis for at en faktor som utviser BCGF-aktivitet, også var i stand til å indusere ekspresjon av MHC-antigener hos normale, hvilende B-celler. Analyser med hensyn på MHC-antigeninduksjon er generaliser-inger av analysene med hensyn på murine B-celler som frem-lagt i den litteraturhenvisningen. I korte trekk eksponeres immunsystemceller mot IL-4, og ekspresjon av partikkel-formede MHC-antigener på cellenes overflater bestemmes så ved hjelp av merkede antistoffer som er spesifikke for antigenet. Induksjonsgraden bestemmes ved sammenligning av de induserte celler med kontroller. Flere forskjellige antistoffer kan anvendes for hvilken som helst bestemt art. Fra ATCC er det tilgjengelig flere hybridomer som produserer monoklonale anti-MHC-antigen-antistoffer, og flere er tilgjengelige kommersielt (f.eks. anti-HLA-DR produsert av hybridomer under ATCC deponeringsnummere HB103, HB109, ;b cl ;HB110 eller HB151; anti-I-A ' produsert av hybridom under ATCC deponeringsnummer HB35; anti-HLA-DR L243 tilgjengelig fra Becton Dickinson (Mountain View, CA), eller lignende). Det kan være påkrevet med visse rutineforsøk for å tilpasse analysen til en bestemt art, og for å optimalisere betingelser for å gi de mest følsomme utlesninger av MHC-antigen-nivåer. For den humane MHC-antigen-induksjonsanalyse kan rensede B-celler fremstilles som beskrevet ovenfor, eller ved hjelp av lignende teknikker. Alternativt kan MHC-induksjon analyseres på urensede preparater av miltceller. Antistoffmerkede celler påvises fortrinnsvis ved hjelp av strømningscytometri, f.eks. på et instrument av type Becton Dickinson FACS eller lignende. ;D. MCGF-aktivitet ;Det antas at IL-4 generelt utviser MCGF-aktivitet. På grunn av mangel på passende analyseteknikker er imidlertid MCGF-aktivitet bare blitt påvist for IL-4 fra gnagere. Murine IL-4 MCGF-analyser er basert på celledelingen av faktoravhengige, murine mast- eller basofilcellelinjer. Særlig kan MCGF-aktivitet analyseres med den murine mastcellelinje MC/9 som er deponert ved ATCC under deponeringsnummer CRL 8306 og er beskrevet i US patentskrift nr. ;4 559 310 og i Nabel et al., Cell, vol. 23, s. 19 (1981). Murine MCGF-analyser er også beskrevet av Ihle et al., i ;J. Immunol., vol. 127, s. 794 (1981). ;MCGF-aktivitet bestemmes fortrinnsvis ved hjelp av den kolorimetriske analyse til Mosmann (henvist til ovenfor) ved bruk av MC/9-celler. I korte trekk dyrkes MC/9-celler i flatbunnede Falcon mikrotiterbrett (10 4 celler/brønn) i Dulbeccos modifiserte medium supplert med 4% kalvefosterserum, 50 uM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamin, ikke-essensielle aminosyrer, essensielle vitaminer og varierende konsentrasjoner av testsupernatanter i et sluttvolum på ;0,1 ml. 50 mikrogram 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (Sigma) i 10 ul fosfatbufret salt-oppløsning ble tilsatt til hver cellekultur etter 20 timer med inkubasjon. 4 timer senere ble 0,1 ml 0,04 M HC1 i isopropanol tilsatt for å oppløseliggjøre det fargede forma-zan-reaksjonsprodukt. Absorbansen ved 570 nm (referanse 630 nm) måles på en Dynatek Microelisa Autoreader (MR580) eller lignende instrument. ;E. Fc-epsilon-reseptorinduksjon. ;Det er oppdaget at IL-4 induserer Fc-epsiloneks-presjon på B-celler og på T-celler, men særlig på humane B-celler stimulert med anti-IgM-antistoffer, eller lignende antigen. Det er også blitt oppdaget at gamma-interferon spesifikt inhiberer IL-4-indusert Fc-epsilon-ekspresjon på B-celler. ;Analysen med hensyn på Fc-epsilon-reseptorinduksjon skjer til å begynne med fortrinnsvis på samme måte som ved BCGF-analysen. Dvs. at det erholdes rensede B-celler som deretter stimuleres med anti-IgM-antistoff (eller lignende antigen) og eksponeres mot IL-4. Til slutt analyseres cellene med hensyn på Fc-epsilon-reseptorer. ;Flere analyser er tilgjengelige for å kvantifisere Fc-epsilon-reseptorer på celleoverflater, f.eks. Yodoi og Ishizaka, J. Immunol., vol. 122, s. 2577-2583 (1979); ;Hudak et al., J. Immunol. Meth., vol. 84, s. 11-24 (1985) og Bonnefoy et al., J. Immunol. Meth., vol. 88, s. 25-32 (1986). Fc-epsilon-reseptorer kan særlig måles ved hjelp av strøm-ningscytometri med merkede monoklonale antistoffer som er spesifikke for reseptorene, f.eks. ved å bruke et Becton Dickinson FACS-IV eller lignende instrument. Fc-epsilon-reseptorspesifikke, monoklonale antistoffer kan konstrueres ved å bruke konvensjonelle teknikker. ;F. IgG^- og IgE-induksjon. ;IL-4 induserer utskillelsen av IgE- og IgG-^-isotyper i lipopolysaccharid-aktiverte (LPS) B-celler, se f.eks. Coffman et al., J. Immunol., vol. 136, s. 4538-4541 (1986) og Sideras et al., Eur. J. Immunol., vol. 15, s. 586-593 ;(1985) . Disse aktivitetene kan måles ved hjelp av standard immunologiske analyser for antistoffisotype, slik'som beskrevet av Coffman et al., J. Immunol., vol. 136, s. 949-954 ;(1986) . I korte trekk LPS-aktiveres B-celler ved å dyrke dem sammen med f.eks. ca. 4 mikrogram/ml av Salmonella typhimurium LPS (tilgjengelig fra Sigma) eller ca. 50 mikrogram/ml LPS ekstrahert fra E. coli 055 (som beskrevet av Sideras et al., se ovenfor). Etter 4-8 dagers dyrking innhøstes supernatanter for analysering. Standard isotype-spesifikke analyser av ELISA-type kan brukes til å måle de forskjellige isotypekonsentrasjoner. Anti-isotype-antistoffer for analysen er tilgjengelige kommersielt eller kan fås fra ATCC. ;G. Aktivitet av kolonistimulerende faktor (CSF). ;For å bestemme CSF-aktivitet opparbeides hemopoiet-iske celler, f.eks. benmargceller eller blodceller fra navlestreng, i en enkel cellesuspensjon. De enkelte celler "immobiliseres" så i et halvfast (agar) eller viskøst (methylcellulose) medium som inneholder næringsstoffer og vanligvis kalvefosterserum. I nærvær av en passende stimul-eringsfaktor vil enkelte celler dele seg og differensiere. Ettersom de første cellene er immobiliserte, utvikles kolonier etter hvert som cellene deler seg og modnes. Disse koloniene kan måles etter 7-14 dager, Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, s. 52-55, Academic Press, New York ;(1984). (For spesifikk anvendelse på veksten av granulocytter og makrofager, se Bradely, T. og Metcalf, D., Aust. ;J. Exp. Biol. Med. Sei., vol. 44, s. 287-300 (1966), og se generelt Metcalf, D., Hemopoietic Colonies, Springer-Verlag, Berlin (1977)). Om ønsket, kan individuelle kolonier ekstraheres, plasseres på mikroskopobjektglass, fikseres og farges med Wright/Geimsa (Todd-Sanford, Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, 15. utgave, red. Davidson og Henry (1974)). Deretter kan morfologisk analyse av celletyper som er til stede i hver enkelt koloni, utføres. ;Benmargceller samlet inn fra pasienter med ikke-hematologisk sykdom, legges over "Ficoll" (type 400, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), sentrifugeres (2.000 opm, ;20 min.), og cellene i grenseflaten fjernes. Disse cellene vaskes to ganger i Iscove's Modified Dulbecco's Medium inneholdende 10% kalvefosterserum (FCS), resuspenderes i det samme medium, og de vedhengende celler fjernes ved festing til petriskåler av plast. De ikke-vedhengende celler til-føres ved 10^ celler/ml til Iscoves medium som inneholder 20% FCS, 50 uM 2-mercaptoethanol, 0,9% methylcellulose og varierende konsentrasjoner av enten supernatanter som er kjent for å inneholde kolonistimulerende aktivitet, eller testsupernatanter. l ml aliquoter plates ut i 35 mm petriskåler og dyrkes ved 3 7°C i en fuktighetsmettet atmosfære med 6% C02 i luft. Tre dager etter oppstarting av dyrkingen tilsettes 1 enhet erythropoietin til hver plate. Granulo-cytt-makrofag-kolonier og erythroid-utbrudd måles etter 10-14 dager ved å bruke et invertert mikroskop. ;Blodceller fra navlestreng samlet opp i heparin, sentrifugeres ved 2.000 opm i 6 minutter. De hvite blod-cellene i grenseflaten mellom plasmaet og toppen av røde blodceller overføres til et rør som inneholder 0,17 N ammonium-klorid og 6% FCS. Etter 5 minutter på is underlegges sus-pensjonen med 4 ml FCS og sentrifugeres i 6 minutter ved 2.000 opm. Cellepelleten vaskes med Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning og sendes gjennom Ficoll-trinnet og trinnet med festing til plast slik som beskrevet ovenfor for benmargceller. De ikke-vedhengende celler med lav densitet samles opp og plasseres ved 10 celler/kultur i det halvfaste dyrk-ningsmedium som beskrevet ovenfor. ;Ved slutten av analysene bestemmes den cellulære sammensetning etter påføring av de enkelte kolonier på objektglass og farging med Wright-Giemsa. Eosinofiler bestemmes ved å farge med Luxol Fast Blue (Johnson, G. og Metcalf, D. , Exp. Hema to 1. , vol. 8, s. 549-561 (1980)}. ;"Potensiering", slik det her er brukt ved henvisning til GM-CSF-stimulert granulocyttvekst, betyr at granulocytt-koloniene i analysene beskrevet ovenfor, er større .. når GM-CSF brukes sammen med IL-4, enn når GM-CSF brukes alene for å stimulere kolonivekst. ;V. Rensing og farmasøytiske preparater ;Polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen ;uttrykt i E. coli, i gjær eller i andre celler, kan renses i henhold til standardfremgangsmåter innen teknikken, deri- ;blant ammoniumsulfatutfelling, fraksjonert kolonnekromato-grafi, (f.eks. ionebytting, gelfiltrering, elektroforese, affinitetskromatografi, etc.) og til sist krystallisering (se generelt "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 2_2:233-577 (1977), og Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)). Når de først er renset, delvis eller til ensartethet, kan polypeptidene ;brukes til forskningsformål, f.eks. som et supplement til cellevekstmedier (f.eks. minimum essensielt medium Eagle, "Iscove's modified Dulbecco Medium" eller RPMI 1640; tilgjengelig fra Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) og GIBCO Division (Chagrin Falls, OH)) og som et antigent stoff for frembringelse av spesifikke immunglobuliner som kan brukes i immunologiske analyser, immunologiske fluores-censfarginger, etc. (Se generelt Immunological Methods, ;vol. I & II, red. Lefkovits, I. og Pernis, B., Academic Press, New York, N.Y. (1979 & 1981); og Handbook of Experimental Immunology, red. Weir, D., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO (1978)). ;Polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan ;også brukes i farmasøytiske preparater, f.eks. for å øke naturlig forsvar mot forskjellige infeksjoner. Således kan pasienter med reumatoid arthritis og med behov for et trans-plantat, eller med immunsvikt forårsaket av kreft-kjemoterapi, fremskreden alder, immunundertrykkende midler, etc, behandles med slike polypeptider. Preparatene kan selektivt stimulere forskjellige bestanddeler i immunsystemet, enten alene eller sammen med andre midler som er velkjente for fagfolk innen teknikken. Særlig kan preparatene omfatte andre immun-reaktive mdiler, slik som lymfokiner (f.eks. IL-1, IL-2, etc), hvilke som helst av de kolonistimulerende faktorer, immunglobuliner, etc, med henblikk på de forsterkende virkninger av polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Polypeptidene vil også finne anvendelse i situasjoner (in vivo eller in vitro) hvor det er ønsket forøkt celledeling eller immunglobulinproduksjon. ;Farmasøytiske preparater kan fremstilles ved å blande disse polypeptidene med fortrinnsvis inerte, farmasøytisk akseptable bærere. Egnede bærere og fremgangsmåter for fremstilling av disse, er velkjente innen teknikken (se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)). Den foretrukne administrasjons-vei er parenteral og kan omfatte bruk av mekaniske avlever-ingssystemer. ;Det farmasøytiske preparat foreligger fortrinnsvis i enhetsdoseform, idet hver enhet inneholder en passende mengde av den aktive bestanddel. Mengden av aktiv forbindelse i en enhetsdose av preparatet kan variere eller justeres fra 1 ug til 100 mg, alt etter den bestemte anvendelse og styrken til den aktive bestanddel. Preparatet kan, om ønsket, også inneholde andre terapeutiske midler. ;Dosene kan varieres avhengig av pasientens behov, alvorligheten av tilstanden som behandles og den bestemte forbindelse som anvendes. Uttrykket "effektiv mengde" er, slik det her er brukt, ment å ta i betraktning disse faktorer når doser vurderes. Bestemmelse av den korrekte dose for en bestemt situasjon ligger innenfor ferdighetene innen teknikken. Generelt startes behandling opp med mindre doser som er mindre enn den optimale dose av forbindelsen. Deretter økes dosen med små mengder inntil den optimale virkning under de rådende omstendigheter nås. Av bekvemme-lighetshensyn kan den samlede daglige dose deles opp og administreres i porsjoner i løpet av dagen. ;VI. Ekspresjonssystemer ;En lang rekke ekspresjonssystemer (dvs. vert-vektor-kombinasjoner) kan brukes for å fremstille polypeptidene ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Mulige typer vertceller omfatter, men er ikke begrenset til, celler fra bakterier, gjær, insekter, pattedyr og lignende. Optimaliser-ing av ekspresjonen av et bestemt protein eller mutein avhenger av mange faktorer, deriblant (1) egenskapene til proteinet eller muteinet som skal uttrykkes, f.eks. kan det uttrykte produkt være giftig for noen vertsystemer, (2) hvorvidt, og hvilken type av, post-tranlasjonelle modifikasjoner er ønsket, f.eks. kan utstrekningen og typen av glycosylering påvirke valget av vert, (3) egenskapene til de 5<*-> og 3<1->områder som flankerer det kodende område for proteinet eller muteinet av interesse, f.eks. er utvelgelse av promoterer og/eller sekvenser som er involvert i reguleringen av translasjon, av avgjørende betydning for effektiv ekspresjon, (4) hvorvidt det søkes forbigående eller stabil ekspresjon, (5) lettheten hvorved det uttrykte produkt kan skilles fra proteinene og andre materialer i vertcellene og/eller dyrkningsmediet, (6) lettheten og effektiviteten av transfeksjon av verter som forbigående uttrykker det aktuelle protein eller mutein, (7) størrelsen på cellekultur som anvendes for å uttrykke det aktuelle protein eller mutein, (8) hvorvidt det aktuelle protein eller mutein uttrykkes fusjonert til et fragment av protein som er endogent for verten, og lignende faktorer.
Generelt er prokaryoter foretrukket for kloning av DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen. Generelle retningslinjer for realisering av prokaryote ekspresjonssystemer er gitt av Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982); Perbal,
A Practical Guide to Molecular Cloning (John Wiley & Sons, N.Y., 1984); Glover, DNA Cloning: A Practical Approach,
vol. I og II (IRL Press, Oxford, 1985) og de Boer et al., "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", i Genes: Structure and Expression, Kroon, red. (John Wiley & Sons, N.Y., 1983). F.eks. er E. coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) særlig brukbar. Andre mikrobe-stammer som kan brukes, omfatter E. coli-stammer, slik som E. coli B og E. coli X1776 (ATCC nr. 31537). Disse eksemplene er selvfølgelig ment å være illustrerende og ikke begrensende.
Prokaryoter kan også brukes for ekspresjon. De tidligere nevnte stammer samt E. coli W3110 (Fs , ^ , prototrof, ATCC nr. 27325) , bacillus-arter, slik som Bacillus sub-tilis, og andre enterobacteriaceae slik som Salmonella typhimurium eller Serratia marcesans, og forskjellige pseudomonas-arter, kan brukes.
Vanligvis brukes plasmidvektorer som inneholder replikon- og kontrollsekvenser som er avledet fra arter som er forenlige med vertcellen, i tilknytning til disse vertene. Vektoren har vanligvis et replikasjonssete samt markørsek-venser som er i stand til å gi fenotypeseleksjon i transformerte celler. F.eks. transformeres E. coli ofte ved å bruke pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene, vol. 2, s. 95 (1977)). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyclinresistens og gir således lettvinte midler for å identifisere transformerte celler. pBR322-plasmidet eller annet mikrobeplasmid må også inneholde, eller modifiseres til å inneholde, promoterer som kan brukes av mikrobeorganismen for ekspresjon av dens egne proteiner.
De promoterer som er vanligst brukt i rekombinant DNA-konstruksjon, omfatter (3-lactamase- (penicillinase) og lactose-promotersystemer (Chang et al, Nature, vol. 275, s. 615
(1978); Itakura et al., Science, vol. 198, s. 1056 (1977); Goeddel et al., Nature, vol. 281, s. 544 (1979)) og et tryptofan(trp)promotersystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., vol. 8, s. 4057 (1980); EPO-søknad med publikasjonsnr. 0036776). Selv om disse er de mest vanlig brukte, er det oppdaget og brukt andre mikrobielle promoterer, og detaljer vedrørende deres nucleotidsekvenser er blitt publisert, noe som gjør det mulig for en erfaren forsker å ligere dem funksjonelt med plasmidvektorer (Siebenlist et al., Cell, vol. 20, s. 269 (1980)).
I tillegg til prokaryoter kan også eukaryote mikrober, slik som gjærkulturer, brukes. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er den mest vanlig brukte blant eukaryote mikroorganismer. For ekspresjon i Saccharomyces er et vanlig brukt plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, vol. 282, s. 39 (1979); Kingsman et al., Gene, vol. 7,
s. 141 (1979); Tschemper et al., Gene, vol. 10, s. 157
(1980)). Dette plasmid inneholder allerede trpl-genet som
gir en seleksjonsmarkør for en mutantstamme av gjær som mangler evne til vekst i tryptofan, f.eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, vol. 85, s. 12 (1977)). Tilstedeværelsen av trpl-skaden som et kjennetegn for gjær-vertcellegenomet gir så et effektivt miljø for påvisning av transformasjon ved dyrking i fravær av tryptofan.
Egnede promotersekvenser i gjærvektorer omfatter promoterene for 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al.,
J. Biol. Chem., vol. 255, s. 2073 (1980)) eller andre glyco-lyttiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., vol. 7, s. 149 (1968); Holland et al., Biochemistry, voi. 17,
s. 4900 (1978)), slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, fosfofructo-kinase, glucose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglucoseisomerase og glucokinase. Ved konstruksjon av egnede ekspresjons-plasmider ligeres også termineringssekvensene som er forbundet med disse genene, i ekspresjonsvektoren i en stilling 3' i sekvensen som skal uttrykkes, hvorved man får poly-adenylering av mRNA og terminering. Andre promoterer som har den ytterligere fordel ved transkripsjon kontrollert av dyrkningsbetingelser, er promoterområdene for alkohol-dehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, nedbrytnings-1 enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme, den tidligere nevnte glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, og enzymer som er ansvarlige for maltose- og galactoseutnyttelse (Holland, ibid.). Enhver plasmidvektor som inneholder en gjærforenlig promoter, et opprinnelsessted for replikasjon og termineringssekvenser, er egnet.
I tillegg til mikroorganismer kan også kulturer av celler avledet fra flercellede organismer, brukes som verter. Prinsipielt er enhver slik cellekultur brukbar, uansett om den skriver seg fra et hvirveldyr eller ikke. Interessen for hvirveldyrceller har imidlertid vært størst, og deling av hvirveldyrceller i kultur (vevskultur) er blitt en rutinefremgangsmåte i de senere år (Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, red. (1973)). Eksempler på slike anvendbare vertcellelinjer er VERO-og HeLa-celler, eggstokkcellelinjer fra kinesisk hamster (CHO) og W138-, BHK-, C0S7-, musmyelom- (ATCC nr. TIB 19 eller TIB 20) og MDCK-cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler omfatter vanligvis (om nødvendig) et opprinnelsessted for replikasjon og en promoter som befinner seg foran genet som skal uttrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindende seter, RNA-sammenknytningsseter, polyadenylerings-sete og transkripsjonsterminatorsekvenser.
For bruk i pattedyrceller tilveiebringes kontroll-funksjonene på ekspresjonsvektorene ofte ved hjelp av virus-materiale. F.eks. avledes vanlig brukte promoterer fra polyoma, Adenovirus 2, og oftest fra apevirus 40 (SV40).
Den første og siste promoter i SV40-virus er særlig anvend-bar fordi begge fås lett fra viruset som et fragment som også inneholder SV40-virusopprinnelsesstedet for replikasjon (Fiers et al., Nature, vol. 273, s. 113 (1978)). Det kan også brukes mindre eller større SV40-fragmenter forutsatt at den omtrent 250 bp store sekvensen som strekker seg fra Hindlll-setet mot Bgll-setet som befinner seg i virusopp-rinnelsesstedet for replikasjon, er inkludert. Videre er det også mulig, og ofte ønskelig, å benytte promoter- eller kontrollsekvenser som vanligvis er forbundet med den ønskede gensekvens, forutsatt at slike kontrollsekvenser er forenlige med vertcellesystemene.
Et opprinnelsessted for replikasjon kan tilveiebringes enten ved hjelp av et exogent opprinnelsessted på vektoren, f.eks. på en avledet fra SV40- eller annen virus-kilde (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV, etc), eller endogent ved hjelp av vertcellens kromosomale replikasjonsmekanisme. Det er ofte tilstrekkelig å integrere vektoren i celle-kromosomet.
Ved utvelgelse av en foretrukken vertcelle for transfeksjon ved hjelp av vektorene ifølge oppfinnelsen, som omfatter DNA-sekvenser som koder for både tPA og DHFR-protein, er det passende å velge verten etter den type av DHFR-protein som anvendes. Dersom villtype DHFR-protein anvendes, er det foretrukket å velge en vertcelle som mangler DHFR, og derved muliggjøre bruken av den DHFR-kodende sekvens som en markør for vellykket transfeksjon i selektivt medium som mangler hypoxanthin, glycin og thymidin. En slik passende vertcelle er ovariecellelinje fra kinesisk hamster (CHO) som mangler DHFR-aktivitet, fremstilt og formert som beskrevet av Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), vol. 77,
s. 4216 (1980).
På den annen side er det, dersom DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for MTX brukes som kontrollsekvens, ikke nødvendig å bruke DHFR-resistente celler. Ettersom den mutante DHFR er resistent overfor methotrexat, kan MTX-holdige medier brukes som et middel for seleksjon forutsatt at vertcellene i seg selv er methotrexat-følsomme. De fleste eukaryote celler som er i stand til å absorbere MTX, synes å være methotrexat-følsomme. En slik brukbar cellelinje er en CHO-cellelinje, CH0-K1 ATCC nr. CCL 61.
Ekspresjonssystemer fra hvirvelløse dyr omfatter larve av silkeorm, Bombyx mori, infisert med en baculovirus-vektor, BmNPV, beskrevet av Maeda et al. i Nature, vol. 315, s. 892-894 (1985) og i Saibo Koguku, vol. 4, s. 767-779
(1985) .
Eksempler
De følgende eksempler tjener til å illustrere foreliggende oppfinnelse.
Materialer og metoder
T-cellelinjene Cl.Lyl<+>2~/9 (referert til som Cl.l), Nabel, Gv Greenberger, J.S. Sakakeeny, M.A. og Cantor, H.
(1981), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 18, 1157-1161, og GK15-1 (levert av M. Giedlin, DNAX Research Institute of Molecular and Cellular Biology, Inc.; DNAX) ble resuspendert ved 5 x IO<5> celler/ml i RPMI 1640, 50 um 2ME, 1% FCS og 2 um/ml Con A i 24 timer. Supernatantene ble samlet sammen og
lagret ved -70°C.
En klonet mastcellelinje, MC/9 (Nabel, G., Galli, S.J., Dvorak, H.F.og Cantor, H. (1981), Nature 291, 332-334), ble erholdt fra G. Nabel (Dana Farber Cancer Institute; DFCI). Mastcellelinjene MM3 (levert av R. Coffman, DNAX) og Dx-2 (avledet av D. Rennick, DNAX) var karakterisert ved fravær av myelomonocytt-assosierte markører og ved tilstedeværelse av IgE-reseptorer og histaminnivåer som var større enn 250 ng/10 celler. Den myeloide NFS-60-cellelinje ble levert av J. Ihle (Frederick Cancer Research Facility; FCRF). NFS-60-cellelinjen ble subklonet, hvorved man fikk en IL-3-avhengig klon. T-cellelinjen HT2 ble erholdt fra S. Strober (Stan-ford University, Palo Alto, CA); CTLL-2 ble levert av W. Farrar (FCRF); og Ly 23/4 ble levert av G. Nabel (DFCI). Mastcellen og T-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640, 10%
FCS, 50 uM 2ME levert med rekombinant IL-3 eller IL-2.
Histaminnivåer hos flere IL-3-avhengige cellelinjer ble analysert ved å bruke fremgangsmåten til Shore, P.A., Burkhalter, A., og Conn., V.H. (1959), J. Pharm. Exp. Ther. 127, 182-186. T-celle- og mastcelle-vekstfaktoraktiviteter ble bestemt ved inkorporering av [ 3H]-thymidin eller ved hjelp av en kolorimetrisk analyse som beskrevet av Mosmann, T., i J. Immunol. Methods, 65: 55-63 (1983).
IL-3 renset fra WEHI 3 supernatant, var en gave fra J. Ihle (FCRF). Rekombinant IL-2, IL-3, GM-CSF og INF-7
ble benyttet i form av supernatant fra COS 7 apenyreceller transfisert med de tilsvarende cDNA-kloner. En enhet av IL-2, IL-3 eller GM-CSF ble definert som den mengde faktor som stimulerte 50% av maksimal inkorporering av [ 3H]-thymidin i faktoravhengige cellelinjer (Rennick, D. et al. (1985),
J. Immunol. 134: 910-919). En enhet av IFN-t beskytter 50% av murine L-celler fra den cytopatiske virkning av vesikulært stomatitisvirus (Schreiber, R. et al. (1982), J. Exp. Med. 156: 677-689) .
B-celler ble fremstilt fra en enkel cellesuspensjon av musmiltceller ved fjerning av T-celler og makrofager i henhold til standardfremgangsmåter (Howard, M. et al.,
J. Exp. Med. 155: 914 (1982)). Den rensede faktor som her er beskrevet, ble vurdert med hensyn på sin evne til å indusere Ia-ekspresjon på B-celler under anvendelse av cyto-fluorometrisk analyse, og til å stimulere B-celledeling ved å bruke en anti-Ig-co-stimuleringsanalyse som beskrevet av Roehm, N. et al., J. Exp. Med. 160: 679.
Proteinbestemmelser var basert enten på UV-absorpsjon (280 nm eller 220 nm) eller på standardkurver konstruert ved å bruke en fargestoffbindende analyse (Bradford, M. (1976), Annal. Biochem. _72: 248-254) . Supernatanter ble først konsentrert 20 ganger med en Pellicon kassett-enhet (Millipore, Bedford, MA), eller (etter reversfase-kromatografi) ved opp-løsningsmiddelinndamping i en"Speedvac"(Savant, Farmingdale, NY). SDS-PAGE ble utført ved å bruke Laemmli-systemet (Laemmli, U. (1970) Nature, 227: 680-685) med en 12% separa-sjonsgel. Markørproteiner var Pharmacia-standarder for lav molekylvekt (Pharmacia, Uppsala, Sverige). Geler ble sølv-farget som beskrevet av Merril, C. et al. (1981), Science, 211: 1437-1438. For å bestemme MCGF- og TCGF-aktivitet direkte som en funksjon av molekylvekt, ble prøver med eller uten forutgående reduksjon med 50 mM DTT elektroforesebehandlet, gelene ble skåret opp i 1 mm snitt og knust, og protein ble eluert over natten ved 4°C til 0,5 ml analyse-mediet supplert med 5 mg/ml ovalbumin (Sigma, St. Louis,
MO) .
Kromatografi ble utført ved 18°C på et Pharmacia FPLC-system utstyrt med en Kratos Spectroflow 7 73 UV-detektor (Kratos, Ramsey, NJ). Ved kationbytterkromatografi ble det anvendt en Pharmacia "Mono S"-kolonne (0,5 x 5 cm) ekvilibrert med 50 mM natriumfosfat, 1 mM EDTA, pH 7,0. Supernatanter i den samme buffer ble tilført kolonnen og eluert med en NaCl-gradient til IM. For reversfase-kromatografi ble det brukt en Pharmacia C8-kolonne (0,5 x 2 cm). Prøven fortynnet med 0,1% TFA til pH 2, ble fylt på kolonnen og eluert med acetonitrilgradienter som inneholdt 0,1% TFA.
Isoelektriske punkter for MCGF- og TCGF-aktivitetene ble beregnet ved kromatofokusering på en Pharmacia "Mono P"-kolonne (0,5 x 20 cm). Prøven i 0,025 M bis-tris, pH 7,1, ble fylt på "Mono P"-kolonnen ekvilibrert med den samme buffer. Gradienteluering ble utført med Pharmacia Polybuffer 74, pH 4,0 (1:10 fortynning, pH regulert med 0,2 M aminodieddiksyre). pH i avløpet ble kontinuerlig bestemt med en Pharmacia pH-monitor. Før injeksjoner ble alle prøver filtrert gjennom en "Millex" GV 0,2 u enhet (Millipore).
Fraksjoner fra SDS-PAGE eller kromatograferinger ble analysert med hensyn på sin evne til å understøtte celle-deling hos tre cellelinjer, NFS-60 (IL-3), MC/9 (MCGF) og
HT2 (TCGF).
For rensing av denne faktor til ensartethet ble
8 liter Con-A-aktivert Cl.1-supernatant dialysert i 20 mM Hepes-buffer, pH 7,0, og deretter sendt over en Pharmacia "Mono S" 10/10 kationbytterkolonne ekvilibrert med den samme buffer. Toppaktivitet eluerte med en lineær saltgradient ved 0,2 M NaCl. Dette materiale ble slått sammen, oppkonsentrert, re-dialysert i 20 mM Hepes-buffer, pH 7,0, og fylt på en Heparin-Sepharose<®->kolonne ekvilibrert med den samme buffer. Toppaktivitet eluerte ved 0,45 M NaCl med en lineær gradient til 2 M NaCl. Dette materiale ble slått sammen, fortynnet 10 x med 0,10/TFA/H20, pH 2, og fraksjonert på en "Vydac" reversfasekolonne (c4). Anvendelse av en linær gradient med acetonitril, 0,1% TFA, utløste aktiviteten ved 42% acetonitril.
Eksempel 1. de novo fremstilling av murine IL- 4- cDNA- er fra Cl. Ly1— 2 / 9- celler og forbigående ekspresjon i COS 7 apeceller
cDNA-kloner som koder for IL-4, ble isolert fra den murine hjelper-T-cellelinje Cl.Lyl<+>2~/9 som er deponert ved ATCC under deponeringsnummer CRL 8179 og er beskrevet av Nabel et al., i Cell, vol. 23, s. 19-28 (1981), og i Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 78, s. 1157-1161 (1981). Andre murine celler som er kjent for å danne BCGF-aktivitet, omfatter
EL-4-linjen, tilgjengelig fra ATCC under deponeringsnummer TIB 39. De fremgangsmåter som er brukt i dette eksempel,
er blitt beskrevet i Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 2061-2065 (1986). I korte trekk ble et pcD-cDNA-bibliotek konstruert med budbærer-RNA (mRNA) fra concanavalin A (ConA)-induserte Cl.Lyl<+>2~/9-celler ved å følge fremgangsmåten til Okayama og Berg beskrevet ovenfor. IL-3-og GM-CSF-kloner ble fjernet fra et stort underbibliotek av
32 tilfeldig utvalgte kloner ved hybridisering med p-merkede cDNA-søkere. Blandinger og/eller enkeltstående kloner fra det gjenværende av underbiblioteket ble undersøkt med hensyn på IL-4-cDNA ved å transfisere COS 7 apeceller og teste kultursupernatanter med hensyn på MCGF- og TCGF-aktivitet.
A. Induksjon av IL-4-dannelse.
Cl.Lyl<+>2 /9-celler ble indusert til å danne IL-4-mRNA ved hjelp av ConA på følgende måte. Cellene ble dyrket ved 5 x 10<5>/ml i "Dulbecco's Modified Éagle's medium" (DME)
-5
med 4% varme-maktivert kalvefosterserum, 5 x 10 M 2-mercaptoethanol (2-ME), 2 mM glutamin, ikke-essensielle aminosyrer, essensielle vitaminer og 2 ug/ml ConA. Etter 12-14 timers inkubasjon ved 37°C i 10% C02, ble cellesuspen-sjonen sentrifugert ved 1500 opm i 10 minutter. Cellepelleten ble samlet opp pg øyeblikkelig frosset ved -70°C.
B. Isolering av mRNA
Total cellulær DNA ble isolert fra celler ved å bruke guanidinisothiocyanat-fremgangsmåten til Chirgwin, J. et al., (Biochemistry, 18: 5294-5299 (1979)). Frosne cellepellets fra ConA-indusert Cl.Lyl 2~/9-celler (12 timer etter stimulering) ble oppslemmet i guanidinisothiocyanatlyse-oppløs-ning. 20 ml lyseoppløsning ble brukt til 1,5 x 10 g celler. Pellets ble på nytt oppslemmet ved pipettering, og deretter ble DNA fordelt ved 4 passeringer gjennom en sprøyte ved å bruke en nål med kaliber 16. Lysatet ble lagt på toppen av 20 ml 5,7 M CsCl, 10 mM EDTA i 40 ml polyallomer-sentrifuge-rør. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 25.000 opm i en
Beckman SW28-sentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) i 40 timer ved 15°C. Guanidinisothiocyanat-
fasen som inneholdt DNA, ble pipettert bort fra toppen, ned til grenseflaten. Veggene i røret og grenseflaten ble vasket med 2-3 ml guanidinisothiocyanatlyse-oppløsning.
Røret ble kuttet under grenseflaten med saks, og CsCl-oppløs-ningen ble fradekantert. RNA-pellets ble vasket to ganger med kald 70% ethanol. Pellets ble deretter resuspendert i 500 ul 10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% SDS. 50 yl 3 M natriumacetat ble tilsatt, og RNA ble utfelt med 1 ml ethanol. Ca. 0,3 mg total RNA ble samlet opp ved sentrifugering og pelleten vasket en gang med kald ethanol.
Vasket og tørket total RNA-pellet ble resuspendert
i 900 yl oligo (dT)-elueringsbuffer (10 mM Tris.HCl, pH 7,4,
1 mM EDTA, 0,5% SDS). RNA ble varmet opp i 3 minutter ved 68°C og deretter avkjølt på is. 100 ul 5 M NaCl ble tilsatt. RNA-prøven ble fylt på en 1,0 ml oligo (dT)-cellulose-kolonne (Type 3, Collaborative Research, Waltham, MA) ekvilibrert med bindingsbuffer (10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,5% SDS). Det som strømmet gjennom kolonnen, ble sendt over kolonnen ytterligere to ganger. Kolonnen ble så vasket med 20 ml bindingsbuffer. PolyA<+>
mRNA ble samlet opp ved å vaske med elueringsbuffer. RNA eluerte vanligvis i de to første ml av elueringsbufferen.
RNA ble utfelt med 0,1 volumdel 3 M natriumacetat (pH 6) og to volumdeler ethanol. RNA-pelleten ble samlet opp ved sentrifugering, vasket to ganger med kald ethanol og tørket. Pelleten ble så resuspendert i vann. Aliquoter ble fortynnet, og absorbans ved 260 nm ble bestemt.
C. Konstruksjon av pcD-cDNA-bibliotek
1) Fremstilling av vektorprimer og oligo(dG)-forlengede kobler-DNA-er
Fremgangsmåten til Okayama & Berg (Mol. & Cell. Biol., vol. 2, s. 161-170 (1982)) ble brukt med bare mindre modifikasjoner. pcDVl- og pLl-plasmidene er beskrevet av Okayama & Berg (Mol. & Cell. Biol., 3_: 380-389 (1983)) og er tilgjengelige fra Pharmacia (Piscataway, N.J.). Nærmere bestemt ble det brukt et modifisert pcDVl-plasmid som inneholdt et Nsil-sete i den tidligere beliggenheten til Kpnl-setet.
En 80 ug prøve av pcDVl-DNA ble oppløst ved 30°C med 20 enheter Kpnl-endonuclease i en reaksjonsblanding av 450 ul som inneholdt 6 mM Tris.HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 6 mM 2-ME og 0,1 mg bovint serumalbumin (BSA) pr. ml. Etter 16 timer ble oppløsningen avsluttet med 40 pl 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 20 ul 10% natriumdodecylsulfat (SDS); DNA-en ble utvunnet etter ekstraksjon med vannmettet 1:1 fenol/CHCl-j (heretter henvist til som fenol/CHCl^) og deretter ved utfelling med ethanol. Homopolymerhaler med gjennomsnittlig 60, men ikke mer enn 80, deoxythymidylat (dT)-rester pr. ende ble tilsatt til de Nsil-endonuclease-genererte ender med terminaltransferase fra kalvethymus på følgende måte: Reaksjonsblandingen (38 yl) inneholdt natriumcacodylat, 30 mM Tris.HCl pH 6,8 som buffer, sammen med 1 mM CoCl2, 0,1 mM dithiothreitol, 0,25 mM dTTP, den Nsil-endonucleaseoppløste DNA og 68 enheter av den terminale deoxynucleotidyltransferase (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI). Etter 30 minutter ved 3 7°C ble reaksjonen stanset med 20 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 10 ul 10% SDS, og DNA-en ble utvunnet etter flere ekstraksjoner med fenol/CHCl^ ved ethanolutfelling. DNA-en ble så oppløst med 15 enheter EcoRI-endonuclease i 50 ul som inneholdt 10 mM Tris.HCl
pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol og 0,1 mg BSA pr. ml i 5 timer ved 37°C. Det største fragment som inneholdt SV40-polyadenyleringssetet og pBR322-opprinnelsesstedet for replikasjon og ampicillin-resistensgenet, ble renset ved hjelp av gelelektroforese på agarose (1%) og utvunnet fra gelen ved en modifikasjon av glasspulvermetoden (Vogelstein, B. & Gillespie, D., Proe. Nati. Acad. Sei., 7_6_: 615-619
(1979)). Den dT-forlengede DNA ble ytterligere renset ved absorpsjon og eluering fra en oligo (dA)-cellulosekolonne på følgende måte: DNA-en ble oppløst i 1 ml 10 mM Tris.HCl pH 7,3 buffer som inneholdt 1 mM EDTA og 1 M NaCl, avkjølt til 0°C og tilført en oligo (dA)-cellulosekolonne (0,6 ved 2,5 cm) ekvilibrert med den samme buffer ved 0°C og eluert med vann ved værelsetemperatur. Den eluerte DNA ble utfelt med ethanol og oppløst i 10 mM Tris.HCl pH 7,3 med 1 mM
EDTA.
Den oligo (dG)-forlengede, koblede DNA ble fremstilt ved oppløsning av 75 ug pLl-DNA med 20 enheter Pstl-ende-nuclease i 450 ul som inneholdt 6 mM Tris.HCl pH 7,4, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-ME, 50 mM NaCl og 0,01 mg BSA pr. ml. Etter 16 timer ved 30°C ble reaksjonsblandingen ekstrahert med fenol/CHCl^, og DNA-en ble utfelt med alkohol. Haler med 10-15 deoxyguanylat (dG)-rester ble deretter tilsatt pr.
ende med 46 enheter terminal deoxynucleotidyltransferase i den samme reaksjonsblanding (38 ul) som beskrevet ovenfor, bortsett fra at 0,1 mM dGTP erstattet dTTP. Etter 20 minutter ved 37°C ble blandingen ekstrahert med fenol/CHCl^,
og etter at DNA-en var utfelt med ethanol, ble den oppløst med 35 enheter Hindlll-endonuclease i 50 ul som inneholdt 20 mM Tris.HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 60 mM NaCl og 0,1 mg BSA ved 37°C i 4 timer. Den lille oligo (dG)-forlengede kobler-DNA ble renset ved elektroforese på agarosegel (1,8%) og utvunnet som beskrevet ovenfor.
2) cDNA-bibliotekfremstilling:
Trinn 1: cDNA-syntese. Reaksjonsblandingen (10 yl) som inneholdt 50 mM Tris.HCl pH 8,3, 8 mM MgCl2, 30 mM KC1, 0,3 mM dithiothreitol, 2 mM hver av dATP, dTTP, dGTP og dCTP, 20 uCi <32>P-dCTP (3000 Ci/mmol), 3 ug polyA<+> RNA fra Con-A induserte T-celler, 60 enheter "RNasi<n>"(et varemerke for ribonucleaseinhibitor fra Promega Biotec, Inc., Madison, WI), og 2 ug av vektor-primer-DNA (15 pmol primer-ende),
og 45 enheter reverse trankriptase. Reaksjonen ble inkubert i 60 minutter ved 42°C og deretter stanset ved tilsetning av 1 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 0,5 ul 10% SDS; 40 yl fenol/CHCl3 ble tilsatt, og oppløsningen ble blandet kraftig i en Vortex-blander og deretter sentrifugert. 40 yl 4 M ammoniumacetat og 160 yl ethanol ble tilsatt til vannfasen, og oppløsningen ble avkjølt med tørris i 15 minutter, varmet
opp til værelsetemperatur med forsiktig rysting for å opp-løse ikke-omsatte deoxynucleosidtrifosfater som var utfelt under avkjølingen, og sentrifugert i 10 minutter i en Eppendorf mikrosentrifuge. Pelleten ble oppløst i 10 ul 10 mM Tris.HCl pH 7,3 og 1 mM EDTA, blandet med 10 pl 4 M ammoniumacetat og på nytt utfelt med 40 ul ethanol, en fremgangsmåte som fjerner mer enn 99% av ikke-omsatt deoxy-nucleotidtrifosfater. Pelleten ble skylt med ethanol. Trinn 2: Oligodeoxycytidylat [oligo (dC)]-tilsetning. Pelleten som inneholdt plasmid-cDNArmRNA, ble oppløst i 20 ul 140 mM natriumcacodylat, 30 mM Tris.HCL pH 6,8 buffer som inneholdt 1 mM CoC^, 0,1 mM dithiothreitol, 0,2 ug poly (A), 70 uM dCTP, 5 yCi <32>P-dCTP, 3000 Ci/mmol og 60 enheter terminal deoxynucleotidyltransferase. Reaksjonen ble utført ved 37°C i 5 minutter for å muliggjøre tilsetningen av 10-15 rester dCMP pr. ende og deretter avsluttet ved 2 yl 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 1 yl 10% SDS. Etter ekstraksjon med 20 yl fenol-CHCl^ ble vannfasen blandet med 20 yl 4 M ammoniumacetat, DNA-en ble utfelt og på nytt utfelt med
80 yl ethanol, og sluttpelleten ble skylt med ethanol.
Trinn 3: Hindlll-endonucleaseopplØsning. Pelleten ble oppløst i 30 yl buffer som inneholdt 20 mM Tris.HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 60 mM NaCl og 0,1 mg BSA pr. ml og deretter oppløst med 10 enheter Hindlll-endonuclease i 2 timer ved 37°C. Reaksjonen ble avsluttet med 3 yl 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 1,5 yl 10% SDS, og, etter ekstraksjon med fenol/CHCl-j etterfulgt av tilsetning av 30 yl 4 M ammoniumacetat, ble DNA-en utfelt med 120 yl ethanol. Pelleten ble skylt med ethanol og deretter oppløst i 10 yl 10 mM
Tris.HCl (pH 7,3) og 1 mM EDTA, og 3 yl ethanol ble tilsatt for å forhindre frysing under lagring ved -20°C.
Trinn 4: Ringslutning formidlet ved hjelp av den olido (dG)-forlengede kobler-DNA. En 9 yl prøve av det Hindlll-endonuclease-oppløste oligo (dC)-forlengede cDNA: mRNA - plasmid (ca. 90% av prøven) ble inkubert i en blanding
(90 yl) som inneholdt 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA,
0,1 M NaCl og 1,8 pmol av den oligo (dG)-forlengede kobler-DNA ved 65°C i 5 minutter, endret til 42°C i 60 minutter
og deretter avkjølt til 0°C. Blandingen (90 yl) ble regulert til et volum på 900 ul som inneholdt 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 4 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KC1, 50 ug BSA pr. ml og 0,1 mM (3-NAD; 6 ug E. coli DNA-ligase ble tilsatt, og oppløsningen ble deretter inkubert over natten ved 12°C.
Trinn 5: Erstatning av RNA-kjede med DNA. For å erstatte RNA-kjeden i innskuddet ble ligeringsblandingen regulert slik at den inneholdt 40 uM av hver av de fire deoxynucleosidtrifosfåtene, 0,15 mM p-NAD, 4 ug ytterligere E. coli DNA-ligase, 16 enheter E. coli DNA-polymerase I (Poll) og 9 enheter E. coli RNase H. Denne blanding (960 ul) ble inkubert i rekkefølge ved 12°C og ved værelsetemperatur, 1 time hver gang, for å fremme optimal repara-sjonssyntese og "nick"-translasjon ved Poll.
Trinn 6: Transformasjon av E. coli.
Transformasjon ble utført ved å bruke mindre modifikasjoner av fremgangsmåten beskrevet av Cohen et al. (Proe. Nat.
Acad. Sei. U.S.A., 69: 2110-2114 (1972)). E. coli K-12 stamme MC1061 (Casadaban, M. og Cohen, S., J. Mol. Biol.
138: 179-207 (1980)) ble dyrket til 0,5 absorbansenhet ved 600 nm ved 37°C i 300 ml L-næringsvæske. Cellene ble samlet opp ved sentrifugé^fing og oppslemmet i 30 ml 10 mM Pipes (pH 7), 60 mM CaCl2, 15% glycerol og sentrifugert ved 0°C i 5 minutter. Cellene ble på nytt oppslemmet i 24 ml av den ovenfor nevnte buffer og inkubert på nytt ved 0°C i 5 minutter; deretter ble 1,0 ml aliquoter av cellesuspen-sjonene blandet med 0,1 ml av DNA-oppløsningen (trinn 5) og inkubert ved 0°C i 20 minutter. Deretter ble cellene holdt ved 42°C i 2 minutter og så ved væreIsetemperatur i 10 minutter; deretter ble 1 liter L-næringsvæske tilsatt, og kulturen ble inkubert ved 37°C i 60 minutter. Ampicillin ble tilsatt inntil en konsentrasjon på 50 ug/ml. Kulturen ble rystet i ytterligere 10 timer ved 3 7°C. Fortynninger av denne kultur ble spredt ut på L-næringsagar som inneholdt 50 ug/ml ampicillin. Etter inkubasjon ved 37°C i 12-24 timer ble individuelle kolonier plukket opp med sterile tann-stikkere. Totalt ble omtrent 1 x 10 5uavhengige cDNA-kloner generert.
D. Screening av pcD-biblioteket.
10 4 enkeltkloner ble tilfeldig utplukket fra T-celle-cDNA-biblioteket og formert hver for seg i brønner i mikro-titerplater som inneholdt 200 ul L-næringsvæske med 50 ug/ml ampicillin og 7% dimethylsulfoxyd. For å fokusere bare på den nye MCGF-aktivitet, ble 53 IL-3-cDNA-kloner og 1 GM-CSF-cDNA-klon identifisert ved hybridisering med de 32
passende P-merkede cDNA-søkere konstruert fra klonene beskrevet av Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 82, s. 4360-4364 (1985) og av Yokota et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 81, s. 1070-1074 (1984), og ble fjernet. Denne fremgangsmåte ble utført på følgende måte: Hver plate med 96 kulturer ble replikert over på nitrocellulosefiltre for hybridiseringsscreening. Hybridiseringer ble utført i 6XSSPE (1XSSPE = 180 mM NaCl; 10 mM natriumfosfat, pH 7,4; 1 mm EDTA), 0,1% SDS, 100 ug/ml E. coli tRNA, 50% formamid, i 16 timer ved 42°C. Hybridiseringskloner ble identifisert ved autoradiografi av det vaskede filter. Disse klonene ble fjernet ved sterilisering av mikrotiterbrønnene som inneholdt disse klonene, med ethanol før fremstilling av klonblandinger. Blandinger som inneholdt opptil 48 cDNA-kloner, ble fremstilt fra mikrotiterkulturene. 200 slike blandinger ble dyrket opp i 1 liter kulturer av L-næringsvæske inneholdende 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA ble isolert fra hver kultur og renset ved sammenslutning to ganger gjennom CsCl-gradienter. Den DNA som representerte hver blanding, ble transfisert inn i COS 7 apeceller på følgende måte. (COS 7 celler er beskrevet av Gluzman i Cell, vol. 23, s. 175-180 (1981), og er tilgjengelige fra ATCC under deponeringsnummer CRL 1651).
En dag før transfeksjon ble omtrent 10 COS 7 apeceller spredt ut på individuelle 100 mm plater i DME som inneholdt 10% kalvefosterserum og 2 mM glutamin. For å ut-føre transfeksjonen ble mediet sugd opp fra hver plate og erstattet med 4 ml DME som inneholdt 50 mM Tris.HCl pH 7,4, 400 ug/ml DEAE-dextran og 50 ug av plasmid-DNA-ene som skulle testes. Platene ble inkubert i 4 timer ved 37°C, deretter ble det DNA-holdige medium fjernet, og platene ble vasket to ganger med 5 ml serumfri DME. DME som inneholder 150 uM klorkin, ble tilsatt platene som så ble inkubert i ytterligere 3 timer ved 37°C. Platene ble vasket en gang med DME, og deretter ble DME inneholdende 4% kalvefosterserum, 2 mM glutamin, penicillin og streptomycin, tilsatt. Cellene ble så inkubert i 72 timer ved 37°C. Dyrkningsmediet ble samlet opp og bedømt i forskjellige biologiske analyser.
Et første sett med plasmidblandinger ble gjennomsøkt først ved å bruke celledelingsanalyser for TCGF- og MCGF-aktiviteter med hhv. HT-2-cellelinjen (beskrevet mere fullstendig nedenunder) og MC/9-cellelinjen. Blant de første 110 blandinger analysert på disse to cellelinjene, ga 8 signifikant aktivitet i HT-2-TCGF-analysen. Flere av disse blandingene hadde svak, men signifikant MCGF-aktivitet, men fordi MCGF-aktivitetene generelt var svakere og mer variable, stolte vi ikke på denne analysen for identifisering av positive blandinger.
Omtrent halvparten av COS-supernatantene fra den tilfeldige blanding av transfeksjoner ble også analysert med hensyn på Ia-induserende aktivitet på mus-B-celler. Blant blandingene som ble testet, ble hver blanding påvist å være aktiv for TCGF-aktivitet, også funnet å ha Ia-induserende aktivitet. Således var det et nøyaktig samsvar mellom TCGF-aktiviteten og den Ia-induserende aktivitet.
En blanding, 2A, som reproduserbart var den mest aktive i alle analyser, ble delt opp i 48 mindre underblandinger. To underblandinger var positive både med hensyn på MCGF- og TCGF-aktivitet. Den ene klon, 2A-E3, som var felles for begge underblandingene, ble så dyrket individuelt, og dens plasmid-DNA ble transfisert inn i COS 7 celler som beskrevet ovenfor. Den resulterende COS-supernatant ble så analysert med hensyn på tilstedeværelse av forskjellige aktiviteter, deriblant MCGF-, TCGF-, Ia-induserende og IgE-og IgG-økende aktivitet.
Et 366 basepar langt Pstl-fragment isolert fra
32
klon 2A-E3 (figur IA) og merket med P, ble brukt som en
søker for å undersøke blandinger som var blitt positive med hensyn på biologisk aktivitet, samt andre utestede blandinger. Screeningen ble utført ved hybridisering til filtere replikert med mikrortiterkulturene som beskrevet ovenfor. 9 hybridiserende kloner ble isolert og deres DNA analysert ved hjelp av restriksjonskartlegging. Alle blandinger som oppviste biologisk aktivitet, inneholdt minst én hybridiserende klon som delte et felles restriksjonsspaltingskart med klon 2A-E3. Hyppigheten av hybridiserende kloner blant de 10^ som var plukket ut, antyder en hyppighet på omtrent 0,2% i hele biblioteket. Blant de hybridiserende kloner som ble testet, uttrykte omtrent 90% et funksjonelt protein.
E. Biologiske aktiviteter i kultursupernatanter fra COS
7 apeceller transfisert med pcD-2A-E3.
Supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-2A-E3, ble testet med hensyn på TCGF-aktivitet på den murine hjelper-T-cellelinje HT-2, beskrevet av Watson i J. Exp. Med., vol. 150, s. 1510 (1979). Deling av HT-2-cellene,
som bestemt ved den kolorimetriske analyse ifølge Mosmann (henvist til ovenfor), ble brukt som et mål for TCGF-aktivitet (grad av celledeling korrelert til optisk densitet (OD) fra 570 til 630 nm). Figur 3A illustrerer de relative TCGF-aktiviteter ved forskjellige fortynninger av (i) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-2A-E3 (kurve 1), (ii) supernatant fra Cl.Lyl<+>2~/9-kulturer (kurve 2),
(iii) supernatant fra COS 7 celler transfisert med et pcD-plasmid som bærer IL-2-cDNA (kurve 3) og (iv) supernatant fra COS 7 celler transfisert med et pcD-plasmid som ikke inneholder noe cDNA-innskudd (dvs. en "falsk" transfeksjon)
(kurve 4) .
Likeledes ble supernatanter fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler testet med hensyn på MCGF-aktivitet på MC/9-celler, igjen ved å bruke den kolorimetriske analyse
til Mosmann for å måle MC/9-celledeling. Figur 3B viser relativ MCGF-aktivitet i (i) supernatent fra COS 7 celler transfisert med pcD-2A-E3 (kurve 1), (ii) supernatant fra
COS 7 celler transfisert med et pcD-plasmid som bærer IL-3-cDNA (kurve 2), (iii) supernatant fra Cl.Lyl<+>2 /9-celler (kurve 3) og (iv) supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve 4).
Figur 3C viser resultatene av en Ia-induksjonsanalyse utført på (i) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-2-E3 (kurve 1), (ii) supernatanter fra Cl.Lyl+2~/9-celler (kurve 2) og (iii) supernatanter fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve 3). Ia-induksjonsanalysen ble utført som beskrevet av Roehm et al. (se ovenfor). Flere DBA/2-mus (2-3 måneder gamle) ble ofret og miltene erholdt ved kirurgisk inngrep. Erythrocyttene ble lyst ved hjelp av hypotonisk sjokk under anvendelse av 0,87% ammonium-klorid. Deretter ble T-cellene lyst ved å bruke cyto-toksiske monoklonale antistoffer rettet mot T-celle-spesifikke overflatemarkører (Thy-1, Lyt-1 og Lyt-2) etterfulgt av inkubasjon i kaninkomplement. De døde cellene ble så fjernet ved å bruke "Ficoll"/Hypaqué®-densitetsgradienter. Vedhengende celler er blitt fjernet tidligere ved festing til plast petriskåler ved 37°C. På dette tidspunkt ble cellene vasket, tellet og bedømt med hensyn på levedyktighet. Omtrent 1 million celler ble inkubert i 0,5 ml vevkultur-medium (RPMI 1640 eller minimalt essensielt medium-MEM/ Earles salter) (Gibco) supplert med 10% kalvefosterserum, 2-mercaptoethanol og forskjellige antibiotika (penicillin, streptomycin og gentamicin). I forsøk hvor den positive kontroll besto av supernatanter fra T-celler indusert med T-celle-mitogenet Concanavalin A, ble 10 mg/ml (sluttkonsentra-sjon) av alfa-methyl-mannosid tilsatt for å nøytralisere mitogenet. Etter 24 timers inkubasjon ble cellene innhøstet
d. bel
og klargjort for farging med anti-I-A eller anti-I-A monoklonale antistoffer. Disse antistoffene ble brukt som førstetrinns antistoffer konjugert enten til haptenet N.I.P. eller biotin. Fargingen ble så fullført ved å inkubere cellene med fluoresceinerte andretrinns reagenser (enten anti-NIP-antistoffer eller avidin). Styrken på fluorescensfargingen ble så bestemt ved å bruke enten en fluorescens-
aktivert cellesorterer (Becton-Dickinson, Mountain View,
CA) eller en Cytofluorgraf (Ortho Diagnostics, Cambridge, MA). Fluorescensenheter i figur 3C er beregnet ved å multiplisere prosentandelen av positive celler i hver prøve med styrken på fluorescensfargingen.
Figur 3D viser grafisk gradene som IgE- og IgG^-dannelse induseres ved i T-celle-fjernede musmiltceller ved (i) COS 7 medium alene (søyle 1), (ii) 20% supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (søyle 2), (iii) 10% supernatant fra Cl.Lyl<+>2~/9-celler pluss 20% supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (søyle 3) og (iv) 20% supernatant fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler (søyle 4). Nivåer av IgE og IgG^ ble bestemt ved hjelp av den iso-typespesifikke ELISA beskrevet ovenfor.
Murin IL-4 ble funnet å øke MCGF-aktiviteten til IL-3 i MC/9-celler: Smith og Rennick, Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 1857-1861 (1986). Murin IL-4 ble også funnet å øke GM-CSF-stimulert celledeling av den IL-3-avhengige cellelinje, NFS-60, beskrevet av Holmes et al., i Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 82, s. 6687-6691 (1985).
F. Strukturen til pcD-2A-E3 og nucleotidsekvens i dens cDNA-innskudd.
Strukturen til pcD-2A-E3 er illustrert i diagramform i figur 2A, og et forstørret restriksjonskart over dens innskudd er vist i figur 2B. Innskuddet ble sekvensbestemt ved å bruke både fremgangsmåten til Maxan og Gilbert (Methods in Enzymology, vol. 65, s. 499-560 (1980)) og fremgangsmåten til Sanger (Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 74,
s. 5463-5467 (1977)). Sekvensen er vist i figur IA sammen med den utledede aminosyresekvens for den lengste åpne avlesningsramme i fase med det første ATG-startkodon. Den enkle, lange, åpne avlesningsramme i mus-2A-E3-cDNA-klon består av 140 aminosyrerester. Ettersom dette lymfokin er et utskilt protein, ville en hydrofob ledersekvens forventes å komme foran sekvensen for den ferdigutviklede, utskilte form av proteinet. Analyse av hydrofobisiteten til poly-
peptidet og sammenligning med en foreslått konsensus-
sekvens for fremstillingen av signalpeptider (Perlman et al., J. Mol. Biol., vol. 167, s. 391-409 (1983)) antyder at spalting av forløper-polypeptidet ville oppstå etter serin-resten i aminosyrestilling 20 i figur IA. Grabstein et al.,
J. Exp. Med., vol. 163, s. 1405-1414 (1986), har bekreftet
at den N-terminale sekvens i utskilt murin IL-4 begynner ved stilling 21 His i figur IA.
Eksempel II. Fremstilling av human IL- 4 via en murin cDNA- søker til et humant hjelper- T- celle-cDNA- bibliotek og forbigående ekspresjon i COS 7 apeceller og mus- L- celler.
cDNA-kloner som koder for IL-4, ble isolert fra cDNA-biblioteker konstruert fra en indusert human hjelper-T-celle, 2F1, og induserte humane, perifere blodlymfocytter (PBL-er) ved hjelp av en murin cDNA-søker. Andre humane cellelinjer kjent for å danne BCGF-aktivitet, omfatter vari-anter av CEM-cellelinjen som er tilgjengelig fra ATCC under deponeringsnumrene CC1 119, CRL 8436 og TIB 195, og er beskrevet av Foley et al., i Cancer, vol. 18, s. 522-529
(19 65) og av Ligler, i Lymphokine Research, vol. 3, s. 183-191 (1984).
En human hjelper-T-celleklon, 2F1, og humane PBL-er ble dyrket i Iscoves medium supplert med 3% kalvefosterserum. 2Fl-cellene ble aktivert med ConA (10 ug/ml), og PBL-er ble stimulert med 1 ug/ml PNA i 12 timer, hvoretter ConA ble tilsatt med 5 ug/ml. Cellene ble innhøstet 4 timer (2F1) eller 10 timer (PBL-er) etter tilsetning av ConA.
mRNA-ekstraksjon og konstruksjon av cDNA-bibliotek
ble utført som beskrevet i eksempel I. Et Pstl-fragment ble isolert fra mus-pCD-2A-E3-cDNA-klonen, merket ved "nick"-translasjon (1 x 10 cpm/ug) og brukt til å søke på nitro-cellulosefiltere som inneholder plasmid-DNA-preparater fra 10 blandinger som hver utgjør omtrent 1 x 10 3 kloner fra 2Fl-cDNA-bibliotek. Det ble brukt milde hybridiserings-be tinge Iser (over natten ved 4 2°C) : 6xSSPE (lxSSPE=180 mM NaCl/LOmM natriumfosfat, pH 7,4/1 mM EDTA) (Maniatis, T. et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982)), 20% (vol/vol) formamid, 0,1% natriumdodecylsulfat, gjærbærer-tRNA ved 100 ul. Filtrene ble vasket med 2 x SSPE, 0,1% natriumdodecylsulfat ved 37°C.
En enkel klon (pcD-46) ble identifisert i en av de ti blandingene. Ytterligere kloner ble erholdt ved screening av PBL-cDNA-bibliotekene med en søker konstruert fra Nhel-EcoRI-fragmentet av pcD-46 (illustrert i restriksjons-kartet i figur 2D). Analyse ved hjelp av restriksjonsenzymer indikerte at PBL-klonene var identiske i struktur med pcD-46.
Det ble oppdaget at et gunidin-rikt område i 5' - retningen, eller oppstrøms, fra det innskutte, kodende område i pcD-46 inhiberte ekspresjon av IL-4-polypeptidet. Følgelig ble innskuddet i pcD-46 reklonet for å fjerne det guanidin-rike område. Den resulterende klon betegnes pcD-125. Det ble også oppdaget at ekspresjon ble forbedret ved transfeksjon av mus-L-celler med pcD-46.
Vektor-pcD-125 ble dannet på følgende måte:
pcD-46 ble spaltet med Sau3A for å isolere et fragment som inneholder de 5' 16 2 nucleotider fra cDNA-innskuddet (som eliminerer GC-segmentet), og deretter ble fragmentet innføyd i Bglll-setet i plOl. Plasmidet plOl ble avledet fra pcD-mus-IL-3 (se Yokota, T. et al., (1984) ovenfor) og fikk fjernet sekvensen fra Pstl-setet i 5<1->enden av cDNA-en til et Bglll-sete innenfor mus-IL-3-cDNA-en. Et Bglll-sete innlemmes i tilknytningspunktet til den fjernede sekvens. Sau3A-fragmentet ble fusjonert til SV40-promoteren som i pcD-46, bortsett fra GC-segmentet. Det gjenværende av den humane cDNA ble så rekonstruert med et HindIII/NheI-fragment fra pcD-46 som bærer 3'-enden av cDNA-en, SV40-poly-A-setet og alle pBR322-sekvensene i pcD-46.
Supernatanter fra de pcD-46- og pcD-125-transfiserte COS 7- og L-celler ble analysert med hensyn på BCGF- og TCGF-aktivitet. TCGF ble analysert med en human hjelper-T-cellelinje, JL-EBV, transformert med Epstein-Barr-virus og fytohemagglutinin-stimulerte, humane, perifere blodlymfocytter.
Den humane hjelper-T-celleklon JL-EBV ble stimulert med bestrålte (4500R) celler fra en human EBV-transformert B-cellelinje og deretter oppbevart i RPMI 1640-medium inneholdende 10% humant AB-serum, 50 mikromolar 2-mercaptoethanol (2ME) og rekombinant human IL-2. Humane PBL-er ble stimulert med PHA (20 mikrogram/ml) og oppbevart i RPMI 1640 inneholdende 10% kalvefosterserum, 50 mikromolar 2ME og rekombinant human IL-2. 5 til 10 dager etter stimulering ble JL-EBV-celler eller PHA-blastceller brukt som mål i en to-dagers TCGF-analyse under anvendelse av den kolorimetriske metode til Mosmann (beskrevet ovenfor), eller i en tre-dagers TCGF-analyse under anvendelse av [ 3H]-thymidin-inkorporering.
Figur 4A viser TCGF-aktivitetene målt ved hjelp av JL-EBV-celler (kolorimetrisk analyse) til (i) supernatant
fra COS 7 celler transfisert med pcD-plasmider som uttrykker human IL-2 (kurve A) ; (ii) supernatant fra L-celler transfisert med pcD-125 (kurve B); (iii) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-125 (kurve C), (iv) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-46 (kurve D) og (v) supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve E). Figur 4B viser TCGF-aktivitetene målt ved hjelp av PHA-stimulerte PBL-er (kolorimetrisk analyse) i (i) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-plasmider som uttrykker human IL-2 (kurve A), (ii) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-125 (kurve B) og (iii) supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve C).
Figur 4C viser TCGF-aktivitetene målt ved hjelp av PHA-stimulerte PBL-er (analyse med inkorporering av tritiert thymidin) i (i) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-125 (kurve A), (ii) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-plasmider som uttrykker human IL-2 (kurve B) og (iii) supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve C) .
BCGF-aktivitet i forskjellige fortynninger av pcD-125-transfeksjonssupernatanter ble sammenlignet med BCGF-aktiviteten i en BCGF ("kommersiell BCGF") beskrevet av Maizel et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 79, s. 5998-6002
(1982) og kommersielt tilgjengelig fra Cytokine Technology
International (Buffalo, NY). Tabell II viser BCGF-aktivitetene i forskjellige fortynninger av COS 7 transfeksjonssupernatanter på anti-IgM-antistoff-foraktiverte B-celler. B-celler ble fremstilt som beskrevet i analyseavsnittet ovenfor .
Tabell III viser BCGF-aktivitetene i forskjellige fortynninger av COS 7 transfeksjonssupernatanter på SAC-foraktiverte B-celler (fremstilt som beskrevet ovenfor).
Selv om den fremstilte humane IL-4 og kommersiell
BCGF begge utviser BCGF-aktivitet, påviste Mehta et al., i
J. Immunol., vol. 135, s. 3298-3302 (1985), at TCGF-aktivitet kan adskilles biokjemisk fra BCGF-aktiviteten i kommersiell BCGF, noe som indikerer at aktivitetene forårsakes av forskjellige molekyler. Human IL-4 og kommersiell BCGF er således forskjellige molekyler ettersom TCGF-aktivitet ikke lar seg adskille fra BCGF-aktivitet i human IL-4 under anvendelse av standard biokjemiske fraksjoneringsteknikker.
Supernatanter fra COS 7 celler transfisert med plasmider som bærer den humane IL-4-cDNA, induserer celledelingen av normale, humane T-celler og den humane T-celleklon, JL-EBV, og aktivitet som er lik med mus-IL-4. Den maksimale utstrekning av celledeling av humane T-celler indusert som respons på human IL-4, er imidlertid ca. halvparten av den som induseres av human IL-2. Den celledelings-induserende aktivitet til IL-4 kunne ikke inhiberes ved hjelp av monoklonale antistoffer mot IL-2 eller mot IL-2-reseptoren når den ble testet. Disse resultatene antyder at IL-4 virker direkte på T-celler og ikke gjennom induksjon av IL-2, og at dens aktivitet ikke formidles ved hjelp av IL-2-reseptoren. De COS-humane IL-4-supernatanter stimulerer også celledelingen av humane B-celler som er foraktivert med optimale konsentrasjoner av anti-IgM-antistoffer koblet til kuler, og som har ytterligere celledelende kapasitet
med kommersiell BCGF ved metningsnivåene i BCGF-analysen. Dette antyder at human IL-4 og kommersiell BCGF virker på B-celler via forskjellige veier, f.eks. muligens ved hjelp av forskjellige reseptorsett. Supernatantene induserte ikke deling av B-celler som var foraktivert med SAC i noen betydelig grad, mens kommersiell BCGF renset fra supernatanter i PBL-kulturer stimulert med PHA, sterkt induserte delingen av SAC-foraktiverte humane B-celler. Disse resultatene indikerer videre at den humane IL-4-cDNA koder for en BCGF-aktivitet som er forskjellig fra den som er til stede i den kommersielle BCGF.
Supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler ble også testet med hensyn på dens evne til å indusere Fc-epsilon-reseptorer på mandel-B-celler. Humane mandelceller ble dispergert i en enkel cellesuspensjon ved å bruke standardteknikker. B-cellepopulasjonen ble anriket ved å bruke fremgangsmåten beskrevet ovenfor, og de anrikede celler ble stimulert med anti-IgM-antistoff i 24 timer i kultur-medium ved 37°C. Fc-epsilon-reseptorbærende celler ble analysert ved hjelp av en Becton Dickinson FACS IV cellesorterer under anvendelse av et fluorescensmerket, monoklonalt antistoff som er spesifikt for reseptoren, ved hjelp av teknikken beskrevet av Bonnefoy et al., i J. Immunol. Meth., vol. 88, s. 25-32 (1986). Figurene 5A-5D er histogrammer som viser cellehyppighet (ordinat) versus fluoresens-styrke (abscisse). Fluorescensstyrke er proporsjonal med antallet Fc-epsilon-reseptorer som er til stede på en celle. I alle figurene er cellene blitt stimulert med anti-IgM.
Figurene 5A - 5D tilsvarer eksponeringer mot medier som består av 0, 0,1, 1 og 10% supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler.
DNA-sekvensen til cDNA-innskuddet i klon nr. 46 ble bestemt og er vist i figur IB. cDNA-innskuddet er 615 bp langt når man ser bort fra poly(A)-enden. Det er en enkel, åpen avlesningsramme med det første ATG-kodon beliggende 64 nucleotider fra 5<1->enden etterfulgt av 153 kodoner som ender med termineringskodonet TAG i nucleotidstillingene 523-525. Det N-terminale segment i det utledede polypeptid er hydrofobt, noe som ville være å forvente av et utskilt protein.
En sammenligning mellom de kodende områder i en human og en mus-cDNA ifølge avslørte at områdene i den kodende sekvens i human cDNA i pdD-46 dekket ved aminosyrestillingene 1-90 og 129-149, er omtrent 50% homologe med de tilsvarende områder i den kodende sekvens i mus-cDNA (2A-E3). Disse områdene, og 5'- og 3'-ikke-translaterte områder, utgjør ca. 70% homologi mellom de to cDNA-sekvensene fra de forskjellige artene, mens området dekket av aminosyrene 91-128 i humanproteinet, er svært lite homologt med det tilsvarende musområde. Totalt er 6 av de 7 cysteinrestene i humanproteinet bevart i det beslektede musprotein. Det foreligger en viss aminosyresekvens-homologi mellom en naturlig forekommende form av et humant polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse og mus-IL-3. Aminosyrerestene 7-16 og 120-127 er hhv. 50% og 55% homologe med restene 16-27 og 41-49 i mus-IL-3-forløperpolypeptidet (Yokota, T. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81: 1070-1074 (1984)).
Som beskrevet mer fullstendig nedenunder, ble human IL-4 renset fra pcD-125-transfiserte COS 7 supernatanter, funnet å være polypeptidet med 129 aminosyrerester som har sekvensen som er vist i figur 1C.
Eksempel III. Forøkt ekspresjon av human IL- 4 i COS 7
apeceller ved bruk av en Epstein- Barr virus ( EBV)- avledet vektor som inneholder en RSV- LTR- promoter
En 10-20 ganger økning av human IL-4-ekspresjon ble oppnådd ved rekloning av Xhol-fragmentet i pcD-125 inn i en EBV-avledet vektor som inneholder en Rous sarcoma-virus "long-terminal repeat" (RSV-LTR)-promoter. Den EBV-avledede vektor og RSV-LTR-promoteren er beskrevet av Gorman et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 79, s. 6777-6781 (1982) og Yates et al., Nature, vol. 313, s. 812-815 (1985).
Et Hindlll/XhoI-fragment som inneholder RSV-LTR-promoteren, ble isolert fra et pcD-plasmid som tidligere var konstruert fra det RSV-LTR-inneholdende Accl/Hindlll-fragment beskrevet av Gorman et al. (se ovenfor) og en kommersielt tilgjengelig pcD-vektor (f.eks. Pharmacia). Det ovenfor nevnte HindIII/XhoI-fragment og et Hindlll/Xhol-fragment fra et pLl-plasmid (Pharmacia) som inneholder et SV40 opprinnelsessted for replikasjon (ori), føyes inn i plasmid pcDVl (tilgjengelig fra Pharmacia), idet orienter-ingen til SV40 ori-området ikke er av avgjørende betydning. Mellom et Aatll-sete og et Ndel-sete inneholder den resulterende pcD-vektor i rekkefølge (fra Aatll-setet) et SV40 ori-område, en RSV-LTR-promoter og SV40 poly A-området.
Etter at Xhol-fragmentet i pcD-125 er isolert og innføyd
i Xhol-setet i den nykonstruerte pcD-vektor, omdannes de unike Aatll- og Ndel-setene på vektoren til Sall-seter ved å bruke standardteknikker. I korte trekk oppløses pcD-vektoren med Aatll og Ndel, det IL-4-holdige fragment isoleres, og det isolerte fragment behandles med T4 DNA-polymerase i nærvær av passende konsentrasjoner av nucleosid-trifosfåtene. 5' — > 3' DNA-polymerase-aktiviteten til T4 DNA-polymerase fyller igjen de 5<1->fremstikkende ender i restriksjonskuttene, og 3'—» 5' exonuclease-aktiviteten til T4 DNA-polymerase løser opp de 3'-fremstikkende ender i restriksjonskuttene, hvorved man får et fragment med butt ende hvortil kinasebehandlede Sall-koblere (New England Biolabs) ligeres ved å bruke T4 DNA-ligase.
Det ovenfor nevnte Sall-fragment (illustrert i
figur 11) innføyes i den EBV-avledede vektor p201 beskrevet av Yates et al. (se ovenfor) i posisjonen til et unikt Clal-sete som var blitt omdannet til et Sall-sete ved å bruke standardteknikker. I korte trekk oppløses p201 (illustrert i figur 11) med Clal og behandles med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og passende konsentrasjoner av nucleosidtrifosfater. Denne fremgangsmåte fyller igjen de fremstikkende ender av Clal-kuttet og etterlater et fragment med butt ende. Deretter ligeres de butte endene til en kinasebehandlet Sall-kobler. Den resulterende EBV-avledede vektor som inneholder RSV-LTR-promoteren og human IL-4-cDNA-innskudd, henvises her til som pEBV-178.
pEBV-178 ble transfisert inn i COS 7 celler ved å bruke standardteknikker, og kultursupernatantene ble analysert med hensyn på TCGF-aktivitet som et mål på IL-4-ekspresjon.
Eksempel IV. Ekspresjon av naturlig forekommende human IL- 4 og mutein- IS0 ( Ala- Glu- Phe) i E. coli To vektorer som inneholdt human IL-4-cDNA-innskudd, ble konstruert for ekspresjon av human IL-4 i E. coli: en pIN-III-sekresjonsvektor som inneholder signalpeptidsekvensen for ompA-proteinet ("pIN-III-ompA2"), og et pUC12-plasmid som inneholder en trpP-promoter og et tilgrensende område med ribosombindende sete (RBS) ("TRPC11").
A. pIN-III-ompA2
To vektorer ble konstruert ved å bruke pIN-III-ompA2-plasmidet som er beskrevet av Ghrayeb et al., i EMBO Journal, vol. 3, s. 2437-2442 (1984) og Masui et al., i Biotechnology, vol. 2, s. 81-85 (1984).
Den første vektor betegnet pIN-III-ompA2(1), ble konstruert ved å ligere i rekkefølge, det EcoRI/BamHI-oppløste pIN-III-ompA2-plasmid, en syntetisk kobler og BamHI/EcoRV-fragmentet fra pcD-125. Den syntetiske kobler som ble brukt ved denne konstruksjonen, resulterte i ut-skillelse av et biologisk aktivt IL-4-polypeptid med de tre ekstra N-terminale aminosyrene Ala-Glu-Phe-; dvs. mutein IL<0>(Ala-Glu-Phe) ble utskilt. Den syntetiske kobler besto av følgende sekvenser med nucleotider:
EcoRI/BamHI-oppløst pIN-III-ompA2 og BamHI/EcoRV-fragmentet i pcD-125 ble blandet i en standard ligeringsopp-løsning (f.eks. Maniatis et al., se ovenfor) som inneholdt 0,1 mikromolar av den syntetiske kobler. E. coli stamme Abl899 ble infisert med pIN-III-ompA2(1)-plasmidet, og transformanter ble utvalgt ved kolonihybridisering under anvendelse av en 3 2P-merket IL-4-cDNA-søker. Humane IL-4-ekstrakter for analyse ble erholdt på følgende måte: Etter lyd-bølgebehandling ble bakteriekulturene sentrifugert og supernatanten fjernet fra pelleten. Pelleten ble behandlet med 1% SDS, 2 mM dithiothreitol og 6M guanidin. Materialet ble resentrifugert, supernatanten kastet og pelleten behandlet ved 45°C med 3% SDS og 2 mM dithiothreitol. Materialet ble på nytt sentrifugert og supernatanten analysert ved hjelp av SDS-PAGE.
pIN-III-ompA(2) ble konstruert slik at det naturlig forekommende IL-4 ville bli uttrykt. De tre aminosyre-addisjonene i pIN-III-ompA(1)-konstruksjonen ble fjernet ved stedspesifikk mutagenese av ompA-signalpeptidsekvensen i pIN-III-ompA2. Den stedspesifikke mutagenese ble utført som beskrevet av Zoller og Smith (se ovenfor). I korte trekk ble Xbal/BamHI-fragmentet i pIN-III-ompA2 som inneholdt den kodende sekvens for ompA-signalpeptidet (se fig. 1 i Ghrayeb et al., ovenfor) renset, blandet med renset Xbal/BamHI-oppløst replikasjonsform (RF) av M13mpl9, ligert, transfisert inn i E. coli K-12 JM101 og utplatet. En klar plakk i nærvær av IPTG og X-gal ble utvalgt og formert, og enkelkjedede DNA-er ble fremstilt, f.eks. i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Messing i Methods in Enzymology, vol. 101 (Academic Press, New York, 1983). Separat ble følgende oligonucleotidprimer (23-mer) som inneholdt de angitte basesubstitusjoner (innrammet), syntetisert og fosforylert:
Denne sekvens innfører et annet Hindlll-sete i det signal-peptidkodende område i det muterte pIN-III-ompA2. Oligo-nucleotidprimeren ble bundet til Ml3mpl9-RF som inneholdt Xbal/BamHI-fragmentet fra pIN-III-ompA2, og det ble behandlet med DNA-polymerase i nærvær av passende konsentrasjoner av nucleosidtrifosfater. De resulterende RF-er ble brukt til å transfisere JM101 E. coli, og mutantholdige plakker ble undersøkt ved hjelp av en merket oligonucleotidsøker. Sekvensen til den utvalgte RF ble bekreftet ved dideoxy-sekvensering under anvendelse av en universell Ml3-primer. Den utvalgte RF ble formert, isolert og oppløst med Xbal og BamHI, og det rensede Xbal/BamHI-fragment ble innføyd i en Xbal/BamHI-oppløst pIN-III-ompA2. For å danne pIN-III-ompA2(2), ble den mutante pIN-III-ompA2 formert, renset, oppløst med Hindlll og BamHI og blandet med BamHI/EcoRV-fragmentet fra pcD-125 i en standard ligeringsoppløsning som inneholdt 0,1 mikromolar av følgende syntetiske kobler:
E. coli stamme Abl899 ble infisert med pIN-III-ompA2(2)-plasmidet, og transformanter ble utvalgt ved kolonihybridis-32 ering under anvendelse av en P-merket IL-4-cDNA-søker. IL-4-ekstrakter fremstilt som beskrevet ovenfor, utviste TCGF-aktivitet som var sammenlignbar med supernatanter fra pcD-125 COS 7 celler.
B. TRPC11
TRPCll-vektoren ble konstruert ved å ligere et syntetisk konsensus-RBS-fragment til Clal-koblere (ATGCAT) og ved kloning av de resulterende fragmenter inn i Clal-restriksjonsenzymbehandlet pMTllhc (som var blitt modifisert på forhånd slik at det inneholdt Clal-setet). pMTllhc er et lite (2,3 kilobaser) i høyt kopiantall, AMR<R>, TET<S->derivat av pBR322 som bærer EcoRI-Hindlll-polykoblerområdet fra TrVX-plasmidet (beskrevet av Maniatis et al., ovenfor). Det ble modifisert slik at det inneholdt Clal-setet ved restriksjonsbehandling av pMTllhc med EcoRI og BamHI, gjen-fylling av de resulterende, klebrige ender og ligering med Clal-kobler (CATCGATG), for derved å gjenopprette EcoRI-
og BamHI-setene og erstatte Smal-setet med et Clal-sete.
En transformant fra TRPCll-konstruksjonen hadde en RBS-sekvens med repeterende enheter flankert av Clal-seter. Ett av Clal-setene og en del av den andre kopien av RBS-sekvensen ble fjernet ved oppløsning av plasmidet med Pstl, behandling med Bal31-nuclease, restriksjonsbehandling med EcoRI og behandling méd T4 DNA-polymerase i nærvær av alle fire deoxynucleotidtrifosfåtene. De resulterende 30-40 bp fragmenter ble utvunnet via PAGE og klonet inn i Smal-restriksjonsbehandlet pUC12. Et 248 bp E. coli trpP-bærende EcoRI-fragment avledet fra pKClOl (beskrevet av Nichols et al., i Methods in Enzymology, vol. 101, s. 155 (Academic
Press, N.Y., 1983)) ble deretter klonet inn i EcoRI-setet
for å fullføre TRPCll-konstruksjonen som er illustrert i figur 12.
TRPC11 ble anvendt som en vektor for human IL-4-
cDNA ved først å oppløse den med Clal og BamHI, rense den og deretter blande den med EcoRV/BamHI-fragmentet av pcD-
125 i en standard ligeringsoppløsning som inneholdt 0,1 mikromolar av følgende syntetiske kobler:
Vektoren som inneholdt innskuddet, ble utvalgt som beskrevet ovenfor og formert i E. coli K-12 stamme JM101. IL-4 ble ekstrahert på følgende måte. JMlOl-celler ble lydbølge-behandlet i kulturmediet sitt og sentrifugert. Pelleten ble resuspendert i 4 M guanidin og 2 mM dithiothreitol og sentrifugert på nytt. Supernatanten ble testet med hensyn på biologisk aktivitet og funnet å utvise TCGF-aktivitet som var sammenlignbar med aktiviteten til supernatanter fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler.
Eksempel V. Fremstilling av bovine IL- 4- cDNA- er via mus-oq human IL- 4- cDNA- søkere til et bovint hjelper- T- celle- cDNA- bibliotek og forbigående ekspresjon i COS 7 apeceller
cDNA-kloner som koder for IL-4, ble isolert fra cDNA-biblioteker konstruert fra induserte lymfocytter fra bovint, perifert blod (PBL-er) ved hjelp av kombinerte mus-og humane cDNA-søkere. Alternative kilder for bovine cDNA-er omfatter flere bovine cellelinjer som oppbevares i ATCCs NBL dyrecellelinjesamling. Fremgangsmåtene er i det vesentlige identiske med de som er beskrevet i eksempel II.
Celler ble innhøstet ca. 10 timer etter induksjon med
ConA. mRNA-ekstraksjon og cDNA-bibliotekoppbygning ble ut-ført som i eksempel II.
Mus- og humane cDNA-søkere kan brukes sammen som en blanding eller i rekkefølge for å påvise bovine IL-4-cDNA-er. Som i eksempel II, isoleres Pstl-fragmentet fra mus-pcD-2A-E3-cDNA-klon. Likeledes isoleres Pstl-fragmentet fra den humane pcD-125-cDNA-klon. Det er også tilgjengelig flere andre fragmenter som det kan konstrueres søkere ut fra. Enten sammen med eller hver for seg merkes de isolerte Pstl-fragmenter ved "nick"-translasjon (ca. 1 x 10 p cpm/mikrogram) og brukes til å undersøke nitrocellulosefiltre som inneholder plasmid-DNA-preparater fra 10 blandinger som hver utgjør ca. 1000 kloner fra det induserte PBL-cDNA-bibliotek. Filterhybridisering utføres som i eksempel II. Kloner som gir positivt resultat, identifiseres og formeres.
Eksempel VI. Ekspresjon. av naturlig forekommende human IL- 4 og muteiner A <1-4> og IS 0 ( Gly- Asn- Phe-Val- His- Gly) i Saccharomyces cerevisiae Naturlig forekommende human IL-4-cDNA og to mutanter derav ble klonet inn i plasmidet pMF-alfa8 og uttrykt i gjæren Saccharomyces cerevisiae. Konstruksjonen og anvend-elsen av pMF-alfa8 for uttrykking av ikke-gjær-proteiner er beskrevet fullstendig i Miyajima et al., Gene, vol. 37,
s. 155-161 (1985) og Miyajima et al., EMBO Journal, vol. 5,
s. 1193-1197 (1986). pMF-alfa8 er deponert ved American Type Culture Collection (Rockville, MD) under deponeringsnummer 40140, og et kart over plasmidet er gjengitt i figur 13A (betegnelsene i figuren er definert fullstendig i Miyajima et al., Gene, se ovenfor).
1-4
Human IL-4-mutein A
Plasmid pcD-125 ble isolert og oppløst med EcoRV og BamHI. EcoRV/BamHI-fragmentet som inneholder den humane IL-4-cDNA, ble isolert, behandlet med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) for å fylle igjen BamHI-kuttet, og kinasebehandlet (dvs. fosforylert). pMF-alfa8 ble oppløst med Stul og blandet med det kinasebehandlede EcoRV/BamHI-fragment fra pcD-125 i en standard ligeringsoppløsning, hvorved plasmid phIL-4-2 dannes. phIL-4-2 ble brukt til å transformere S. cerevisiae 20B-12 (MATalfa-trpl-289-pep4-3), som ble erholdt fra Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkely. Gjærcellene ble dyrket i syntetisk medium som inneholdt 0,67% "Yeast Nitrogen Base" uten aminosyrer, 2% glucose og 0,5% Casaminosyrer (Difco). Gjærcellene ble transformert med plasmidene ved hjelp av lithium-acetatmetoden til Ito et al., J. Bacteriol., vol. 153,
s. 163-168 (1983), og transformantene ble valgt ut i syntetisk medium som manglet tryptofan. Supernatant fra en transformantkultur ble testet med hensyn på TCGF-aktivitet.
Figur 13B (kurve D) illustrerer TCGF-aktiviteten til flere fortynninger av supernatanten fra phIL-4-2-transformerte gjærceller i sammenligning med andre faktorer (kurve A: human IL-2; kurve B: supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler; og kurve C: supernatanter fra phIL-4-l-transformerte gjærceller). Kurve E illustrerer TCGF-aktiviteten til supernatant fra gjær som var blitt transformert med pMF-alfa8 som mangler IL-4-cDNA-innskuddet, dvs. den "falske" transformant.
B. Human IL-4-mutein IS<0> (Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly).
pMF-alfa8-innskuddet for ekspresjon av mutein lg 0(Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly) ble fremstilt nøyaktig som for mutein A"<1>"<->^, bortsett fra at Nael/BamHI-fragmentet fra pcD-125 ble brukt. Det resulterende plasmid ble betegnet phIL-4-1. Flere fortynninger av supernatant fra phIL-4-1-transformerte gjærceller ble testet med hensyn på TCGF-aktivitet. Resultatene er vist ved hjelp av kurve C i figur 13B. Supernatantene ble også testet med hensyn på BCGF-aktivitet både på anti-IgM- og SAC-aktiverte B-lymfocytter. Analysene ble utført som beskrevet ovenfor, og resultatene er gjengitt i tabell IV.
C. Ekspresjon av naturlig forekommende human IL-4 i gjær.
cDNA som koder for naturlig forekommende human IL-4, ble klonet inn i pMF-alfa8 ved først å innføye baser opp-strøms fra det N-terminale His-kodon, hvorved et Kpnl-restriksjonssete dannes. Etter spalting med Kpnl og behandling med DNA-polymerase I ble den butt-endede IL-4-cDNA innføyd i Stul-setet i pMF-alfa8. Kpnl-setet ble dannet ved bruk av standard sete-spesifikk mutagenese. I korte trekk ble pcD-125 oppløst med BamHI, og fragmentet som inneholdt hele den humane IL-4-cDNA, ble isolert og innføyd i BamHI-setet i Ml3mp8. En-kjedet Ml3mp8 som inneholdt innskuddet, ble isolert og hybridisert til følgende syntetiske oligonucleotid som tjente som en primer:
De innføyde nucleotider er innrammet. Plasmidet som inneholdt den muterte IL-4-cDNA, ble indentifisert ved hjelp av en oligonucleotidsøker, formert, isolert og behandlet med Kpnl og BamHI. Kpnl/BamHI-fragmentet ble isolert, behandlet med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) for å frembringe butte ender, kinasebehandlet og ligert med Stul-oppløst pMF-alfa8. Gjær ble transformert ved hjelp av de resulterende pMF-alfa8-plasmider, betegnet phIL-4-3, slik som beskrevet ovenfor, og supernatanter ble testet med hensyn på TCGF-aktivitet. Supernatantene utviste TCGF-aktivitet som var sammenlignbar med den som iakttas hos supernatanter fra phIL-4-l-transformert gjær.
Eksempel VII. Konstruksjon og ekspresjon av et syntetisk,
humant IL- 4- gen i E. coli
Det ble konstruert et syntetisk, humant IL-4-gen som hovedsakelig omfatter bakterieforetrukne kodoner, deriblant en serie av unike restriksjonsendonucleaseseter (her referert til som "unike restriksjonsseter") og muliggjør hurtig og bekvem ekspresjon av en lang rekke humane IL-4-muteiner. Nucleotidsekvensen til det syntetiske gen er vist i figur 6A. Teknikker for konstruksjon og ekspresjon av det syntetiske gen ifølge dette eksempel er standard innen molekylær-biologien, se spesielt Sproat og Gait, Nucleic Acids Research, vol. 13, s. 2959-2977 (1985) og Ferretti et al., Proe. Nati, Acad. Sei., vol. 83, s. 599-603 (1986); men også Mullenbach et al., J. Biol. Chem., vol. 261, s. 719-722 (1986);
Wells et al., Gene, vol. 34, s. 315-323 (1985) og Estell et al., Science, vol. 233, s. 659-663 (1986). I korte trekk settes det syntetiske, humane IL-4-gen sammen av en rekke kjemisk syntetiserte, dobbeltkjedede DNA-fragmenter. Basesekvenser i det syntetiske gen velges slik at det sammensatte, syntetiske gen inneholder en serie av unike restriksjonsseter .
Serien av unike restriksjonsseter definerer en serie segmenter som lett kan skjæres ut og erstattes med segmenter med endrede basesekvenser. De syntetiske fragmentene inn-føyes enten direkte eller etter ligering med andre fragmenter i en egnet vektor, slik som et pUC-plasmid eller lignende.
De ovenfor nevnte segmenter tilsvarer i grove trekk "kassettene" til Wells et al. (se ovenfor). De syntetiske fragmentene syntetiseres ved å bruke standardteknikker, f.eks. Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984). Fortrinnsvis anvendes det
et automatisert synteseapparat, slik som en modell 380A fra Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA). pUC-plasmider og lignende vektorer er kommersielt tilgjengelige, f.eks. Pharmacia-PL, eller Boehringer-Mannheim. Kloning og ekspresjon kan utføres i standard bakteriesystemer, f.eks.
E. coli K-12 stamme JM101, JM103 eller lignende, beskrevet av Viera og Messing, i Gene, vol. 19, s. 259-268 (1982).
Restriksjonsendonucleaseoppløsninger og ligase-reaksjoner utføres ved å bruke standardfremgangsmåter, se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).
Den alkaliske metode (Maniatis et al., se ovenfor) brukes til plasmidfremstillinger i liten skala. For fremstilling i stor skala brukes en modifikasjon av den alkaliske metode hvor et like stort volum isopropanol brukes til å utfelle nucleinsyrer fra det klargjorte lysat. Utfelling med kald 2,5 M ammoniumacetat brukes for å fjerne RNA før cesiumklorid-likevektsdensitetsentrifugering og påvisning med ethidiumbromid.
For filterhybridiseringer brukes Whatman 540 filter-sirkler til å løfte kolonier som deretter lyses og fikseres ved hjelp av suksessive behandlinger med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl; 1 M Tris.HCl pH 8,0, 1,5 M NaCl (2 min. hver) og oppvarming ved 80°C (30 minutter). Hybridiseringer skjer i 6xSSPE, 20% formamid, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS),
100 ug/ ml E. coli tRNA, 100 ug/ml "Coomassie Brilliant Blue G-250" (Biorad) ved 42°C i 6 timer under anvendelse av 3 2P-merkede (kinasebehandlede), syntetiske DNA-er. (20xSSPE fremstilles ved å oppløse 174 g NaCl, 27,6 g NaH2P04.H20
og 7,4 g EDTA i 800 ml H20, regulere pH til 7,4 med NaOH, regulere volumet til 1 liter og sterilisere ved hjelp av autoklavering).
Filtere vaskes to ganger (15 minutter ved værelsetemperatur) med lxSSPE, 0,1% SDS• Etter autoradiografi (Fuji RX-film) lokaliseres positive kolonier ved å stille opp mot hverandre de redyrkede kolonier og de blåfargede kolonier på filtrene.
DNA sekvensbestemmes enten ved hjelp av den kjemiske nedbrytningsmetode til Maxam og Gilbert, Methods in Enzymology, vol. 65, s. 499 (1980), eller ved dideoxymetoden til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 74, s. 5463
(1977). Templater for dideoxyreaksjonene er enten énkjedede DNA-er fra relevante områder reklonet inn i M13mp vektorer, f.eks. Messing et al., Nucleic Acids Res., vol. 9, s. 309
(1981), eller dobbeltkjedet DNA fremstilt ved hjelp av den minialkaliske metode og denaturert med 0,2 M NaOH (5 minutter ved værelsetemperatur) og utfelt fra 0,2 M NaOH,
1,43 M ammoniumacetat ved tilsetning av 2 volumdeler ethanol. Dideoxyreaksjonene utføres ved 42°C.
DNA syntetiseres ved hjelp av fosforamidit-kjemi under anvendelse av Applied Biosystems 380A synteseapparater. Syntese, avbeskyttelse, spalting og rensing (7 M urea-PAGE, eluering, DEAE-cellulosekromatografi) utføres som beskrevet i syntesehåndboken for 380A. Komplementære kjeder av syntetiske DNA-er som skal klones (400 ng hver), blandes og fosforyleres med polynucleotidkinase i et reaksjonsvolum på 50 ul. Denne DNA ligeres med 1 ug vektor-DNA oppløst med passende restriksjonsenzymer, og ligeringer utføres i et volum på 50 ul ved værelsetemperatur i 4 til 12 timer. Betingelser for fosforylering, restriksjonsenzymoppløsninger, polymerasereaksjoner og ligering er blitt beskrevet (Maniatis et al., se ovenfor). Kolonier registreres med hensyn til lacZ<+> (om ønsket) ved utplating på L-agar supplert med ampicillin, isopropyl-l-thio-beta-D-galactosid (IPTG)
(0,4 mM) og 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (x-gal) (40 ug/ml).
TAC-RBS-vektoren ble konstruert ved hjelp av en trinnrekkefølge hvor man startet med igjenfylling med DNA-polymerase av det ene BamHI-sete i det tacP-bærende plasmid pDR540 (Pharmacia). Produktet ble så ligert til ufosforyl-erte, syntetiske oligonucleotider (Pharmacia) som danner et dobbeltkjedet fragment som koder for et konsensus-ribosombindende sete (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). Etter ligering ble blandingen fosforylert og religert med Sstl-kobleren ATGAGCTCAT. Det resulterende kompleks ble så spaltet med Sstl og EcoRI og 173 bp fragmentet isolert via polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og klonet inn i EcoRI/Sstl-restriksjonsbehandlet pUC18 (Pharmacia) (som beskrevet nedenunder). Sekvensen til RBS-ATG-polykoblerområdene i sluttkonsentrasjonen (kalt TAC-RBS) er vist i figur 8.
Det syntetiske, humane IL-4-gen settes sammen i et pUC18-plasmid i seks trinn. I hvert trinn kan innskudd fri for fjernelser og/eller innskudd påvises etter kloning ved å beholde lacZ(a)-genet fra pUC18 i ramme med ATG-startkodonet innføyd i trinn 1. Kloner som inneholder endringer ved fjerning og/eller innføyelse, kan filtreres fra ved å bedømme med hensyn på blå kolonier på L-ampicillinplater som inneholder x-gal og IPTG. Alternativt kan i hvert trinn innskuddssekvenser lett bekreftes ved å bruke en universell sekvenseringsprimer på plasmid-DNA-preparatet i liten skala, f.eks. tilgjengelig fra Boehringer-Mannheim.
I trinn 1 oppløses TAC-RBS-vektoren med Sstl, behandles med T4 DNA-polymerase (hvis 3'-exonucleaseaktivitet oppløser de 3'-fremstikkende kjeder i Sstl-kuttene, hvorved det dannes butt-endede fragmenter), og etter deaktivering med T4 DNA-polymerase, behandles med EcoRI, hvorved det dannes et fragment med 173 basepar (bp) som inneholder TAC-RBS-området og har en butt ende i ATG-startkodonet og EcoRI-kuttet i den motsatte ende. Til slutt isoleres TAC-RBS-fragmentet med 173 bp.
I trinn 2 blandes det isolerte TAC-RBS-fragment i trinn 1 med EcoRI/Sstl-oppløst plasmid pUC18, og syntetisk fragment IA/B som er vist i figur 7A, har en butt ende i sin oppstrømsende og en forskjøvet (klebrig) ende som svarer til et Sstl-kutt i sin nedstrømsende. Fragmentene ligeres, hvorved pUC18 dannes i trinn 2.
I trinn 3 blandes de syntetiske fragmenter 2A/B og 3A/B (vist i figur 7B og 7C) med Sstl/BamHI-oppløst pUC18
fra trinn 2 (etter økning av kopiantall og rensing) og ligeres, hvorved pUC18 dannes i trinn 3. Legg merke til at nedstrømsenden i fragment 2A/B inneholder ekstra baser som danner den BamHI-forskjøvede ende. Disse ekstra baser spaltes i trinn 4. Også fragmentene 2A/B og 3A/B har komplementære 9-rest-énkjedede ender som bindes etter blanding og etterlater det oppstrøms Sstl-kutt fra 2A/B og det ned-strøms BamHI-kutt fra 3A/B slik at de ligeres til pUC18.
I trinn 4 renses på nytt MluI/Xbal-oppløst pUCl8 fra trinn 3 (etter økning av kopiantall og rensing), blandes med syntetisk fragment 4A/B (figur 7D) og ligeres, hvorved pUC18 i trinn 4 dannes.
I trinn 5 blandes Xbal/Sall-oppløst pUC18 fra
trinn 4 (etter økning av kopiantall og rensing) med syntetisk fragment fra 5A/B (figur 7E) og ligeres, hvorved pUC18 i trinn 5 dannes.
I trinn 6 blandes Sall/Hindlll-oppløst pUC18 fra trinn 5 (etter økning av kopiantall og rensing) med syntetisk fragment 6A/B (figur 7F) og ligeres, hvorved sluttkonstruk-s j onen danne s.
Figur 6B er et spaltingskart over de unike restriksjonsseter som er til stede i pUC18-konstruksjonen som nettopp er beskrevet. Når det beskrevne, syntetiske, humane IL-4-gen brukes som et innskudd i pUC18, definerer hvert par av unike restriksjonsseter et segment som lett kan skjæres ut og erstattes med endrede, syntetiske segmenter. Settet av unike restriksjonsseter omfatter EcoRI, Hpal, SacI (Sstl), EcoRV, Pstl, Mlul, Bell, Xbal, Nael, Sali, Xhol og Hindlll.
pUC18 som inneholder det syntetiske IL-4-gen, inn-føyes i E. coli K-12 stamme JM101. Etter oppdyrking ekstraheres protein fra JMlOl-celler, og fortynninger av ekstraktene testes med hensyn på biologisk aktivitet.
Eksempel VIII. Konstruksjon og ekspresjon av human IL- 4-52
mutein - Ile i E. coli.
Leu i stilling 52 (i forhold til N-enden i det naturlig forekommende humane IL-4) endres til Ile for å danne human IL-4-mutein-Ile 52. pUC18-plasmidet ifølge eksempel VII som inneholder det syntetiske, humane IL-4-gen ifølge figur 6A, oppløses med Pstl og Mlul og renses. Det ovenfor rensede pUC18 blandes med det syntetiske, dobbeltkjedede fragment som er illustrert nedenunder, og ligeres. Den endrede del av grunnsekvensen er innrammet. Det resulterende pUCl8 transfiseres inn i E. coli K-12 stamme JM101 og lignende og uttrykkes.
Pstl/ Mlul- erstatningsfragment for
52 frembringelse av human IL- 4- mutein- Ile
Etter oppdyrking ekstraheres protein fra JM101-cellene ved å bruke standardteknikker, og. fortynninger av ekstraktene testes med hensyn på biologisk aktivitet.
Eksempel IX. Konstruksjon og ekspresjon av human IL- 4-mutein ( Ile52, Asp111).
Det modifiserte pUC18-plasmid ifølge eksempel VIII (som inneholder den Ile 52-kodende sekvens) oppløses med Sali og Xhol, og det største fragmentet isoleres. Det isolerte fragment blandes med det syntetiske, dobbeltkjedede fragment som er vist nedenunder, i en standard ligeringsopp-løsning. Den endrede del av sekvensen er innrammet. Det resulterende plasmid transfiseres inn i E. coli K-12 stamme JM101 eller lignende, og uttrykkes.
Sali/ Xhol- erstatningsfragment
Etter oppdyrking ekstraheres protein fra JM101-cellene ved å bruke standardteknikker, og fortynninger av ekstraktene testes med hensyn på biologisk aktivitet.
Eksempel X. Sekvens av human IL- 4 renset fra transfeksjonssupernatanter
Human IL-4 ble renset fra kultursupernatanter av celler som var forbigående transfisert med vektorer som inneholder human IL-4-cDNA. Sekvensen til det utskilte, naturlig forekommende, humane IL-4 ble bestemt fra det rensede materiale.
A. Biologisk analyse av rensningsgrad.
TCGF-aktivitet ble brukt til å analysere human IL-4 under separasjonsfremgangsmåtene. Analysen var i det vesentlige den samme som den som er beskrevet i eksempel II. I korte trekk ble det tatt blodprøve fra en frisk donor og plassert i et heparinisert rør og lagt oppå 'Ficolln-HypaquéV f. eks. 5 ml blod pr. 3 ml "Ficoll-Hypaqué® i et 15 ml sentri-fugerør. Etter sentrifugering ved 3000 x g i 20 minutter ble cellene i grenseflaten sugd opp og fortynnet i et dyrk-ningsmedium bestående av RPMI 1640 inneholdende 10% kalvefosterserum, 50 mikromolar 2-mercaptoethanol, 20 mikrogram/ml fytohemagglutinin (PHA) og rekombinant human IL-2. Etter 5-10 dager med inkubasjon ved 37°C ble de PHA-stimulerte lymfocytter fra perifert blod (PBL-er) vasket og brukt i 2-dagers kolorimetriske analyser: Mosmann, J. Immunol. Methods, vol. 65, s. 55-63 (1983). To gangers seriefortynn-inger av IL-4-standarden (supernatanter enten fra pcD-125-eller pEBT-178-transfiserte COS 7 celler) eller fraksjonen som skulle testes, ble utført i 96-brønners brett under anvendelse av dyrkningsmediet beskrevet ovenfor, hvorved man fikk et sluttvolum på 50 mikroliter/brønn. 50 mikroliter av de PHA-stimulerte PBL-er ved ca. 4-8 x 10 celler/ml ble tilsatt til hver brønn, og brettene ble inkubert ved 37°C i 2 dager. Cellevekst ble så målt i henhold til Mosmann (se ovenfor).
Enheter av human IL-4-TCGF-aktivitet er definert når det gjelder supernatanter enten av pcD-125-transfiserte COS 7 celler (eksempel II) eller pEBV-178-transfiserte
COS 7 celler (eksempel III).
For rensing er enheter basert på aktiviteten av pcD-125-transfeksjonssupernatanter som fremstilles på følgende måte. Ca. 1 x 10 COS 7 celler spres ut på 100 mm vev-kulturplater som inneholder Dulbecco's Modified Eagle's medium (DME), 10% kalvefosterserum og 4 mM L-glutamin. Ca.
24 timer etter utspredning suges mediet opp fra platene, og cellene vaskes to ganger med serumfri, bufret (50 mM Tris) DME. Til hver plate tilsettes 4 ml serumfri, bufret DME (med 4 mM L-glutamin), 80 mikroliter DEAE-dextran og 5 mikrogram pcD-125-DNA. Cellene inkuberes i denne blanding 1 4 timer ved 30°C, hvoretter blandingen suges bort, og cellene vaskes en gang med serumfritt, bufret DME. Etter vasking tilsettes 5 ml DME med 4 mM L-glutamin, 100 mikromolar klorkin og 2% kalvefosterserum til hver plate, og cellene inkuberes i 3 timer og vaskes deretter to ganger med serumfritt, bufret DME. Deretter tilsettes 5 ml DME med 4 mM L-glutamin og 4% kalvefosterserum, og cellene inkuberes ved 37°C i 24 timer. Deretter vaskes cellene 1-3 ganger med DME eller PBS, 5 ml serumfritt DME (med 4 mM L-glutamin) tilsettes, og cellene inkuberes ved 37°C inntil kultursupernatantene innhøstes 5 dager senere.
En enhet slik den her er brukt, er den mengde faktor som i én brønn (0,1 ml) stimulerer 50% maksimal formering av 2 x 10 4 PHA-stimulerte PBL-er over en 48-timers periode.
B. Rensing
Rensing ble utført ved hjelp av en sekvensvis anvendelse av kationbytterkromatografi, gelfiltrering og revers-fase-høytrykksvæskekromatografi. Alle operasjoner ble utført ved 4°C.
Etter fjerning av COS 7 cellene ved sentrifugering ble supernatanten oppkonsentrert ca. 10 ganger ved ultrafiltrering og lagret ved -80°C inntil den ble ytterligere bearbeidet. IL-4-titere ble bestemt ved å analysere med hensyn på proteinets evne til å stimulere formering av fytohemagglutinin-induserte lymfocytter fra humant, perifert blod, dvs. ved TCGF-aktivitet under anvendelse av standard-analysen beskrevet ovenfor.
Konsentrert COS 7 supernatant med TCGF-aktivitet på ca. 104-106 enheter/ml og et proteininnhold på ca. 15-20 mg/ml ble dialysert mot 2 endringer i 50 mM natrium-HEPES, pH 7,0
i løpet av et tidsrom på 24 timer (hver endring var omtrent 10-15 ganger volumet av et konsentrat). Dialysatet ble påført en kolonne (1 x 2,5 cm) med S-Sepharose<®> (strømnings-hastighet: 0,2 ml/min) forekvilibrert med 50 mM natrium-HEPES, pH 7,0. Kolonnen ble vasket med 15 kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer etterfulgt av eluering med 20 kolonnevolumer av en lineær natriumkloridgradient som strakk seg fra 0 til 0,5 M natriumklorid i 50 mM natrium-HEPES, pH 7,0. Gradienten ble avsluttet ved eluering med 5 kolonnevolumer med enhetlig konsentrasjon: 50 mM natrium-HEPES, 0,5 M NaCl, pH 7,0. 1,5 ml og 1,8 ml fraksjoner ble samlet opp fra de respektive satser. IL-4-titere ble funnet å eluere for begge kromatografiene mellom 300 mM og 500 mM natriumklorid.
Seks fraksjoner fra hver S-Sepharose<®->kolonne som inneholdt IL-4-titere, ble hver for seg slått sammen til totale volumer på 9,0 og 10,8 ml. Begge volumene ble oppkonsentrert til 1,9 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av en "Amicon" YM5-membran (molekylvekt-"cut-off": 5000). Utvinningen av protein fra dette trinnet var ca. 80%. Den konsentrerte IL-4-oppløsning ble tilført en Sephadex<®> G-
100-kolonne (1,1 x 58 cm) forekvilibrert i 50 mM HEPES,
0,4 M NaCl, pH 7,0, og kolonnen ble eluert med den samme buffer ved 0,15 ml/min. I alt 50 fraksjoner (1,0 ml/fraksjon) ble samlet opp og analysert med hensyn på IL-4-titere. En biologisk aktivitetstopp ble iakttatt ved en tilsynelatende molekylvekt på 22.000 dalton. Sephadex<®> G-100 ble kalibrert for bestemmelse av tilsynelatende molekylvekt med bovint serumalbumin (65.000 dalton), carbonsyreanhydrase (30.000 dalton) og cytokrom C (11.700 dalton).
En fraksjon fra Sephadex<®> G-100-kolonnen som inneholdt IL-4-aktivitet, ble oppkonsentrert 3-4 ganger under vakuum og ble injisert i en "Vydac" C-4 "guard"-kolonne (4,6 x 20 mm). En lineær gradient med 0-72% (volum/volum) acetonitril i 0,1% (volum/volum) trifluoreddiksyre (TFA) ble fremstilt 1 løpet av 15 minutter ved en kolonnetemperatur på 35°C
og en strømningshastighet på 1,0 ml/min. Man fikk tre topper som ble påvist ved 214 nm med retensjonstider på 7, 8,2 og 8,7 minutter (hhv. topp 1, 2 og 3 i figur 10). En 40 mikroliter aliquot av topp 2 (8,2 min. elueringstid)
ble lyofilisert og på nytt oppløst i minimalt essensielt medium som inneholdt 10% kalvefosterserum. Denne oppløsning utviste en positiv TCGF-respons. En 300 mikroliter aliquot av topp 2 ble inndampet til tørrhet og på nytt oppløst i 200 ul 0,1% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat (SDS). En 2 ul aliquot ble fortynnet i 200 ul med 1% (volum/volum)
TFA og på nytt kromatografert. HPLC for denne prøve påviste en enkel topp ved 215 nm. Materialet fra topp 2 indikerte
Q
en aktivitet på ca. 7 x 10 enheter/mg.
C. Aminosyresekvensanalyse
Aminosyresekvensbestemmelse ble utført ved hjelp av automatisert gassfase Edman-nedbrytning (Hewick, R.M., Hunkapillar, M.W., Hood, L.E. og Dryer, W.J. (1981), J. Biol. Chem., 256: 7990) under anvendelse av en Applied Biosystems "microsequenator". En 90 mikroliter aliquot av HPLC-fraksjonen fra topp 2 oppløst i 0,1% SDS som beskrevet ovenfor, ble tilført glassfiberfilterpatronen i nærvær av "Polybrene". Aminosyresekvensinformasjon ble oppnådd opp til 35. rest. Den N-terminale sekvens ble bestemt på følgende måte:
hvor de åpne mellomrommene angir mangel på en identifiserbar aminosyre.
De åpne mellomrommene i aminoenden i stillingene 3 og 23 var i overensstemmelse med tilstedeværelsen av cystein som ikke kan påvises i dette systemet. Det åpne mellomrom i stilling 28 som svarer til et threonin i den cDNA-forut-sagte sekvens, kan skyldes enten variabiliteten i fenylthio-hydantoin-threonin-påvisningen eller tilstedeværelsen av 0-bundet glycosylering eller forestring.
En 100 mikroliter aliquot av HPLC-fraksjonen hvor aminoendesekvensen opptrådte, ble inndampet til tørrhet og på nytt oppløst i 70% maursyre. Et 50-gangers molart over-skudd av cyanbromid ble tilsatt, og oppløsningen ble hensatt ved værelsetemperatur i 2,5 timer. Det spaltede protein ble sekvensbestemt på gassfase-sekvensapparatet fra Applied Biosystems som beskrevet ovenfor. To sekvenser var identi-fiserbare:
Sekvens (1) er identisk med sekvensen som ble forutsagt fra cDNA-en å være blitt frigjort etter cyanbromidspalting av methioninresten i stilling 120. De to siste restene i C-enden kan ha vært til stede, men behøver ikke å ha vært påvis-bare på grunn av utilstrekkelig prøve. Sekvens (2) er identisk med aminoendesekvensen erholdt fra det naturlig forekommende IL-4-protein som beskrevet ovenfor. De relative mengder aminoende- og carboxylende-fenylthiohydantoin-aminosyrer frigjort, antydet ekvimolare mengder av begge sekvensene i prøven. Dette resultatet understøtter den konklusjon at den proteinprøven som ble sekvensbestemt, inneholdt hovedsakelig en enkel polypeptidkjede med amino- og carboxylender forutsagt ut fra cDNA-sekvensen til human IL-4.
Eksempel XI. Konstruksjon og ekspresjon av human IL- 4-mutein ( Ile52, A<?1>, IS94( Ala))
Det modifiserte pUC18-plasmid ifølge eksempel VIII
52
(som inneholder den Ile -kodende sekvens) oppløses med
Mlul og Bell, og det største fragmentet isoleres. Det isolerte fragment blandes med det syntetiske, dobbeltkjedede fragment illustrert nedenunder i en standard ligeringsoppløs-ning. Det resulterende plasmid transfiseres inn i E. coli K-12 JM101 eller lignende, og formeres.
Mlul/ Bcll- erstatningsfragment
Det modifiserte plasmid isoleres og oppløses med Xbal og Nael, og det største fragmentet isoleres. Det isolerte fragment blandes med det syntetiske, dobbeltkjedede fragment illustrert nedenunder i en standard ligeringsopp-løsning. Det adderte kodon er innrammet. Det resulterende plasmid transfiseres inn i E. coli K-12 stamme JM101 eller lignende, og uttrykkes.
Xbal/ Nael- erstatningsfragment
Etter dyrking ekstraheres protein fra JMlOl-cellene under anvendelse av standardteknikker, og fortynninger av ekstraktene testes med hensyn på biologisk aktivitet.
Eksempel XII. Induksjon av DR- antigener på celler fra
en pasient som lider av lymfocyttmangelsyndrom
Lymfocyttmangelsyndrom er kjennetegnet ved mangel
på ekspresjon av klasse I og/eller klasse II HLA-antigener på celleoverflater og er ofte forbundet med alvorlig immunsvikt, se f.eks. Touraine, Lancet, s. 319-321 (7. februar 1981); Touraine og Bethel, Human Immunology, vol. 2,
s. 147-153 (1981) og Sullivan et al., J. Clin. Invest.,
vol. 76, s. 75-79 (1985). Det ble oppdaget at human IL-4
var i stand til å indusere ekspresjon av klasse II DR-antigen på overflatene av celler avledet fra en pasient som led at lymfocyttmangelsyndrom.
Lymfocytter fra perifert blod (PBL-er) ble erholdt fra en pasient som led av ikke-ekspresjon av HLA klasse II-antigener. B-celler ble renset fra PBL-er i det vesentlige som beskrevet ovenfor, og en B-cellelinje (betegnet UD31)
ble etablert ved transformasjon med Epstein-Barr-virus (EBV). De EBV-transformerte celler ble dyrket i 48 timer i Yssels definerte medium (beskrevet ovenfor) med 2% kalvefosterserum og en 5% (volum/volum) konsentrasjon av supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler. Cellene ble innhøstet, fiksert, farget med fluorescensmerket anti-DR monoklonalt antistoff (f.eks. Becton Dickinson, L243) og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Figur 9 viser histogrammer over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for en
kontrollpopulasjon av de EBV-transformerte celler innhøstet før IL-4-behandling (kurve A), og for populasjonen av. BSV-transformerte celler etter IL-4-behandling (kurve B).
Eksempel XIII. MCGF- aktivitet av Cl. Lyl+ 2~/ 9 ( Cl. l)-supernatanter
Renset IL-3 og supernatant fra COS 7 celler transfisert med en IL-3-cDNA-klon (rekombinant IL-3; IL-3 ) stimulerte formering av mastcellelinjen MC/9 i den samme grad (figur 14A). Dette nivået var imidlertid en tredjedel til en halvpart av det som ble indusert av Cl.l T-celle-supernatant. Nærværet av ConA i T-cellesupernatanten (2 yg/ml) bidrar ikke signifikant til dens MCGC-aktivitet. En forklaring på virkningen angitt ovenfor, er at IL-3 ikke bidrar med all MCGF-aktivitet frembrakt av Cl.l-celler. Alternativt kunne mastcellelinjen som ble brukt til analysene, (teoretisk) være forurenset med en annen faktor-avhengig populasjon av celler. Denne sistnevnte mulighet utelukkes imidlertid ettersom re-kloning av MC/9-cellelinjen ga subkloner som hver gir respons på IL-3 og cellesupernatanten på samme måte som den opprinnelige MC/9-klon.
Ettersom Cl.1-supernatant også inneholder andre lymfokiner enn IL-3, ble disse testet med hensyn på evne til å fremme veksten av MC/9-celler. MC/9-cellene ga imidlertid ikke respons på forskjellige konsentrasjoner av rekombinant IL-2, IFN og GM-CSF, samt på supernatant som inneholdt IL-1 (P388D-l-celler) (figur 14A). Dessuten stimulerte ikke supplering av kulturer som inneholdt varierende konsentrasjoner av rekombinant IL-3, med IL-2, GM-CSF, IFN-7 eller IL-1 formering av MC/9-celler over det nivå som ble erholdt med IL-3 alene. Dette angir at den økte MCGF-aktivitet av T-cellesupernatanten ikke skyldes dens innhold av disse andre kjente faktorer.
Komparative undersøkelser med andre faktor- avhengige celle-linjer.
To andre mastcellelinjer, DX-2 og MM3, ga også sterkere proliferative responser med Cl.1-supernatant enn med IL-3 (representative data for DX-2 vist i figur 14B). Disse cellene ga heller ikke respons på IL-2, IFN-Tf, GM-CSF eller supernatant fra P388D-l-celler. Således kan den for-økte formeringsrespons for MC/9-celler på T-cellesupernatant være typisk for mastceller generelt. Derimot ble granulo-cytt-typeceller (NFS-60) stimulert nesten like mye av IL-3-. og Cl.1-supernatant (fig. 14C). Selv om NFS-60-celler ikke ga respons på IL-2-, I FN-Tf- og P388D-l-supernatant, var det en liten, men reproduserbar stimulering med GM-CSF.
Det faktum at IL-3- og T-cellesupernatanten induserer sammen-lignbare nivåer av formering, antyder at NFS-60-cellelinjen kan være forholdsvis ufølsom for ytterligere faktorer som er til stede i T-cellesupernatanten. NFS-60-cellene ble således brukt til å analysere IL-3 under forsøk på å separere IL-3 fra andre MCGF-aktiviteter ved proteinfraksjonering.
TCGF-aktiviteten av Cl.1-supernatant ble fastslått ved å bruke den IL-2-avhengige T-cellelinje, HT2. Mettende konsentrasjoner av Cl.1-supernatant stimulerte konstant H-thymidin-inkorporering godt under det maksimale nivå som ble oppnådd med rekombinant IL-2 (figur 14D). Lignende resultater ble oppnådd med to andre cellelinjer. Supernatanten inneholder ikke et inhibitorstoff ettersom dens tilsetning til HT2-kulturer som inneholder IL-2, ikke ga noen reduksjon i <3>H-thymidin-inkorporering (figur 14D). Disse resultatene antyder at Cl.1-supernatant inneholder en TCGF-aktivitet som er forskjellig fra IL-2. Biokjemisk bevis som understøtter denne konklusjon, er gjengitt nedenunder.
Preliminær kromatografisk fraksjonering av Cl. 1- supernatant.
Cl.1-supernatant ble fraksjonert ved hjelp av forskjellige kromatografiske metoder med det øyeblikkelige mål å separere IL-3 fra andre MCGF-aktiviteter. Formering av NFS-60-celler ble brukt til å etterspore IL-3 spesifikt mot bakgrunnen av total MCGF-aktivitet avslørt ved hjelp av MC/9-formering. TCGF-aktivitet ble fastslått ved hjelp av HT2-celleformering.
Når Cl.1-supernatant ble fraksjonert ved hjelp av kationbytterkromatografi ved nøytral pH, kom omtrent 98% av det påsatte protein, 97% av IL-3-enhetene (fastslått ved hjelp av NFS-60-formering) og 1% av TCGF-enhetene til syne i gjennomstrømningen (figur 15). Eluering av. bundet protein med en gradient av natriumklorid frigjorde TCGF-aktivitet ved 0,19M NaCl (fraksjon 60). En liten, men reproduserbar topp av TCGF-aktivitet kom også til syne ved IM NaCl. Ingen ytterligere signifikant TCGF-aktivitet kunne elueres ved høyere NaCl-konsentrasjoner (opptil 3M). En liten mengde IL-3 eluerte også i omtrent det samme område som TCGF-toppen (påvisbar NFS-60-respons). Bare fraksjoner som svarte til topp-TCGF-aktivitet (fraksjonene 59-61) og det gjennom-strømmende (fraksjonene 1-20), stimulerte høye nivåer av MC/9-formering, noe som var sammenlignbart med den ufraksjonerte supernatant (piler, figur 15). Ettersom titrer-ingskurver antydet at fraksjonene 59-61 inneholdt mer av høynivå-MCGF-aktiviteten enn gjennomstrømningen gjorde, ble det gjort forsøk på å tappe ut ytterligere av IL-3-aktiviteten som eluerte sammen med TCGF-toppen, og igjen fastslå MC/9-formeringsnivåer. Fraksjonene 59-61 ble derfor på nytt kromatografert to ytterligere ganger under identiske betingelser.
Etter den tredje kolonnepassering eluerte mer enn 95% av TCGF-aktiviteten homogent ved .0,19 M NaCl. Det var ingen målbar IL-3-respons (NFS-60) i gjennomstrømningen eller i noen av kolonnefraksjonene. En MCGF-aktivitet som nå stimulerte et platånivå av MC/9-formering som var signifikant lavere enn det som ble oppnådd med Cl.1-supernatant eller IL-3 (se nedenunder), eluerte imidlertid fortsatt sammen med TCGF-toppen. Ettersom disse fraksjonene manglet målbar IL-3-aktivitet (fravær av NFS-60-respons), var tilsynelatende den nye MCGF i seg selv ute av stand til å stimulere MC/9-celler i den samme grad som den urensede T-celle-supernatant.
For ytterligere å forsøke på separasjon av MCGF fra TCGF, ble det 3X-fraksjonerte materiale (fraksjonene 59-61) fortynnet med 10X med 0,1% TFA i H20 til pH 2 og fylt direkte på en C8 reversfase-kolonne. Figur 16A viser eluerings-profilen for bundet protein frigjort med en gradient av acetonitril, 0,1% i TFA. Ingen MCGF- eller TCGF-aktivitet fremkom i gjennomstrømningen; begge aktivitetene eluerte sammen ved 37% acetonitril (fraksjonene 26-29). Den mettende MCGF-respons var imidlertid nå bare ca. halvparten av den som man fikk med IL-3 alene (figur 17A). Når alle fraksjonene på nytt var analysert i nærvær av mettende nivåer av IL-3, oppviste bare fraksjonene 26-29 en MC/9-formeringsrespons som var høyere enn for IL-3 alene (pil, figur 16A). Størrelsen på responsen var faktisk den samme som for selve den ufraksjonerte supernatant (figur 17A). Videre ble det iakttatt formeringsnivåer som var ekvivalente med nivåene for ufraksjonert supernatant, med fraksjonene 26-29 når de ble analysert i nærvær av IL-3-holdig gjennomstrømning eller IL-3-renset form av WEHI 3. Således stimulerer kom-binasjonen av IL-3 og den unike MCGF/TCGF nivåer av MC/9-formering som er karakteristisk for den opprinnelige T-celle-supernatant.
Selv om reversfase-kromatografering ikke oppløser MCGF fra TCGF, ble TCGF påvist å være forskjellig fra IL-2 ved hjelp av to kriterier. For det første, når rekombinant IL-2 i COS 7 cellesupernatanter (IL-2 ) og supernatant fra en IL-2-produserende (ConA-stimulert) murin T-cellelinje (GF15-1) begge kromatograferes på den samme kolonne under identiske betingelser, eluerer TCGF-aktiviteten ved 45% acetonitril i en skarp topp som ikke overlapper med 37% acetonitrilstillingen som markerer Cl.l-TCGF (figur 16B). For det andre er den mettende respons av HT2-celler på IL-2 svært forskjellig fra den som karakteriserer Cl.l-supernatanten (figur 16B, innskudd). Videre ble det ikke påvist noen opplagt synergi mellom den delvis rensede TCGF og IL-2 (figur 17B).
Det kromatofokuserte mønster for Cl.1-supernatant
er vist i figur 18. IL-3-aktiviteten (NFS-60-respons) ga en svært heterogen profil, deriblant aktivitet med pl-verdier som var høyere enn 7,1, men TCGF-aktiviteten syntes å være
mer homogen, idet hoved-TCGF-artene (fraksjon 12) ga en omtrentlig pl på 6,2. Dette stemmer overens med den maksimale MCGF-aktivitet (MC/9-respons) etter tilsetning av mettende nivåer av IL-3.
SDS- PAGE av Cl. 1- supernatant og delvis renset faktor
Figur 19 sammenlignet de elektroforetiske profiler av ufraksjonert Cl.1-supernatant (figur 19A) og profilene til kationbyttermaterialet, fraksjoner 59-61 (figur 19B). Protein ble eluert direkte fra gelstykker, og aktiviteter ble bestemt ved formering. Både kationbytterfraksjonen og Cl.l-supernatanten ga TCGF-topper: ved 20 kd og 15 kd under ikke-reduserende betingelser, og ved 21 kd og 16 kd under reduserende betingelser. Ettersom kationbyttermaterialet var tømt for IL-3, ble bare lave nivåer av MC/9-formering indusert, og denne MCGF-aktivitet var fortsatt i overensstemmelse med TCGF-topper. Tilsetning av mettende mengder av IL-3 til alle fraksjoner økte MC/9-formeringsresponsen til Cl.1-supernatantnivåer bare i topp-MCGF/TCGF-fraksjonene (piler, figur 19B). IL-3-aktivitet av supernatanten var størst i 24 kd-posisjonen, men fremkom også i brede topper rundt 20 kd-området. Likeledes oppstår MC/9-formeringsnivåer godt over nivået til IL-3 ved 20 kd-posisjonen til elektroforesebehandlet supernatant (pil, figur 19A). En sølvfarget SDS-gel med det mest høyrensede MCGF/TCGF-materiale (fraksjon 28 i reversfase-kolonnen) utviste også fremtred-ende proteinbånd ved 20 kd og 15 kd.
Mikrogrammengder av 20 kd-formen av faktoren er blitt renset til homogenitet ved sukesssiv fraksjonering av ConA-supernatanter fra aktiverte Cl.1-T-celler ved
(1) kationbytterkromatografi, (2) Heparin-Sepharose<®->kromatografi, og (3) c4 reversfase-kromatografi som tidligere beskrevet. Sluttmaterialet utviser bare et enkelt bånd ved 20 kd ved hjelp av sølvfarget SDS-PAGE, noe som tilsvarer en enkel UV-absorberende topp på c4-elueringsprofilen. Biologisk karakterisering av den rensede faktor bekreftet dens evne til å stimulere lave nivåer av T-celle- og mastcelleformering og å øke IL-3-avhengig mastcelleformering.
Som vist i tabell V, innehar faktoren flere B-celle-stimulerende aktiviteter som tilskrives BSFl (Roehm, N.W.
et al., J. Exp. Med., 169; 679-694 (1984); Howard, M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 7_8_: 5788 (1981); Roehm, N.W. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 81: 6149-6153 (1984). For det første induserer den økt ekspresjon av Ia på hvilende B-celler sammenlignet med kontrollpopulasjonen (tabell V). For det andre induserer faktoren sammen med anti-Ig-antistoffer signifikant [ H]-thymidin-inkorporering, noe som indikerer at den virker som en ekstrafaktor ved stimuleringen av B-celleformering.
Disse polypeptidene kan utvise flere biologiske aktiviteter som adskiller seg både med hensyn til den tilsynelatende funksjon som formidles, og celletypen som påvirkes. Som beskrevet ovenfor, omfatter disse aktivitetene synergi ved induksjonen av formering av B-celler og mastcellelinjer, tidlig aktivering av hvilende B-celler, stimulering av formeringen av T-celler og selektiv forøkning av IgG^- og IgE-produksjon av mitogenaktiverte B-celler. Rensing av polypeptidene til ensartethet har klargjort omfanget av disse aktivitetene.
Av det ovenfor nevnte vil det forstås at de rensede <p>olypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen gir fagfolk nye terapeutiske muligheter. Muligheten for å produsere betydelige mengder av disse faktorene vil gi forbedret in vitro dyrking av utvalgte pattedyrcellelinjer, samt en samlet forbedret forståelse av pattedyrimmunrespons.
cDNA-klonene pcD-2A-E3, pcD-46 (pcD-2Fl-13),
pcD-125 og gjærvektoren pMF-alfa8 er blitt deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), under deponeringsnumrene 53330, 53337, 67029 og 40140. Disse deponeringene er gjort under Budapest-konvensjonen
(1977) vedrørende internasjonal anerkjennelse av deponeringen av mikroorganismer for patentformål.
Claims (8)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet, og som har en sekvens av aminosyrer definert ved den følgende formel, som kan være enten 1 gang substituert eller 1 gang delert eller 1 gang innskutt:
hvor R er Ala-Glu-Phe eller Glu-Asn-Phe-Val-His, eller er fra-værende , og
hvor hvert av uttrykkene av typen X("Xaa") representerer aminosyren "Xaa", bortsett fra at den innskutte eller substituerte aminosyre X("Xaa") i de 1 gang substituerte eller 1 gang innskutte polypeptider i de stillinger hvor de er innskutt eller substituert, er definert på følgende måte: X(Ser) er Ser, X(Arg) er gruppen bestående av Arg, His og Lys, X(Leu) er gruppen bestående av Leu, Ile, Phe og Met, X(Pro) er gruppen bestående av Pro og Ala, X(Thr) er Thr, X(Ala) er gruppen bestående av Ala og Pro, X(Val) er gruppen bestående av Val, Met og Ile, X(Gly) er Gly, X(Ile) er gruppen bestående av Ile, Met og Leu, X(Phe) er gruppen bestående av Phe, Met, Tyr, Ile og Leu, X(Tyr) er gruppen bestående av Tyr og Phe, X(His) er gruppen bestående av His, Gin og Arg, X(Gin) er gruppen bestående av Gin, Glu og His, X(Asn) er gruppen bestående av Asn og Asp, X(Lys) er gruppen bestående av Lys og Arg, X(Asp) er gruppen bestående av Asp og Asn, X(Glu) er gruppen bestående av Glu og Gin, X(Met) er gruppen bestående av Met, Ile og Leu, X(Trp) er Trp og X(Cys) er Cys,
fortrinnsvis hvor: X(Arg) er Arg, X(Leu) er gruppen som består av Leu, Ile og Met, X(Pro) er Pro, X(Ala) er Ala, X(Val) er Val, X(Ile) er gruppen bestående av Ile, Met og Leu, X(Phe) er Phe, X(Tyr) er Tyr, X(His) er His, X(Gln) er Gin, X(Asn) er Asn, X(Lys) er Lys, X(Asp) er Asp, X(Glu) er Glu og X(Met) er gruppen bestående av Met, Ile og Leu,
og uttrykket "1 gang substituert" angir en delmengde av polypeptider hvor de naturlig forekommende aminosyrer er blitt byttet ut med synonyme aminosyrer i 1 stilling, uttrykket "1 gang delert" angir en delmengde av polypeptider hvor de naturlig forekommende aminosyrer er blitt delert i 1 stilling, og uttrykket "1 gang innskutt" angir en delmengde av polypeptider hvor synonyme aminosyrer er blitt innskutt ved siden av de naturlig forekommende aminosyrer i 1 stilling, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter følgende trinn: a) konstruksjon av en vektor som omfatter en nucleotidsekvens som koder for angitte polypeptid, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, slik at nucleotidsekvensen er i stand til å bli uttrykt av en vert som inneholder vektoren, hvor nucleotidsekvensen er minst 75 % homolog med en cDNA-sekvens i innskuddet i vektoren pcD-125 [ATCC 67029], b) inkorporering av vektoren i verten, og c) dyrking av den vektorholdige vert under betingelser som er egnet for ekspresjon av nucleotidsekvensen til polypeptidet, hvoretter d) det uttrykte protein isoleres.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at det anvendes en nucleotidsekvens som koder for et polypeptid som er definert ved formelen:
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en nucleotidsekvens som koder for det humane interleukin-4 human-interleukin-4-mutein-IS°( Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly), human-interleukin-4-mutein-IS°(Ala-Glu-Phe) eller human-interleukin-4-mutein-A1"4.
4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at det anvendes en nucleotidsekvens som omfatter en sekvens av kodoner definert ved en sekvens av baser som koder for polypeptidet:
og hvor verten er en pattedyrcelle.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes en sekvens av kodoner definert ved en sekvens av baser som koder for det følgende polypeptid som er det som er definert i krav 4 sammen med en ledersekvens:
6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at det anvendes en sekvens av kodoner definert ved den følgende formel:
7. Nucleinsyre,
karakterisert ved at den omfatter en sekvens av nucleotidbaser som er i stand til å kode for et polypeptid som utviser pattedyr-interleukin-4-aktivitet og minst én ytterligere aktivitet valgt fra gruppen bestående av MHC-antigen-induksjonsaktivitet, Fc-epsilon-reseptor-induksjonsaktivitet, GM-CSF-stimulert granulocyttkolonivekstforsterkende aktivitet, interleukin-2-TCGF-forsterkende aktivitet og IgG^ og IgE-induksjonsaktivitet, som fremstilt ifølge krav 1 og som har en sekvens av nucleotidbaser som er minst 75 % homolog med en sekvens av DNA i cDNA-innskuddet i en vektor valgt fra gruppen bestående av pcD-46 og pcD-125.
8. Vektor,
karakterisert ved at den er pcD-46 eller pcD-125 som er deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, under henholdsvis nr. 53337 og 67029.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US79966985A | 1985-11-19 | 1985-11-19 | |
US79966885A | 1985-11-19 | 1985-11-19 | |
US06/843,958 US5552304A (en) | 1985-11-19 | 1986-03-25 | CDNA Clones coding for human protein exhibiting a broad cellular activity spectrum (human interleukin-4) |
US88155386A | 1986-07-03 | 1986-07-03 | |
US06/908,215 US5017691A (en) | 1986-07-03 | 1986-09-17 | Mammalian interleukin-4 |
PCT/US1986/002464 WO1987002990A1 (en) | 1985-11-19 | 1986-11-19 | Mammalian interleukin-4 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO872988D0 NO872988D0 (no) | 1987-07-17 |
NO872988L NO872988L (no) | 1987-09-18 |
NO301234B1 true NO301234B1 (no) | 1997-09-29 |
Family
ID=27542219
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO872988A NO301234B1 (no) | 1985-11-19 | 1987-07-17 | Fremgangsmåte for fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet, nukleinsyre og vektor |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP0230107A1 (no) |
JP (2) | JP2557361B2 (no) |
KR (1) | KR940007773B1 (no) |
CN (1) | CN1020472C (no) |
AT (2) | ATE140009T1 (no) |
AU (1) | AU610057B2 (no) |
CZ (1) | CZ414191A3 (no) |
DE (2) | DE3650538T2 (no) |
DK (1) | DK371087A (no) |
ES (2) | ES2153444T3 (no) |
FI (1) | FI102075B1 (no) |
GR (1) | GR3021198T3 (no) |
HK (2) | HK1005594A1 (no) |
HU (1) | HU208710B (no) |
IE (1) | IE80828B1 (no) |
IL (1) | IL80678A (no) |
MY (1) | MY101972A (no) |
NO (1) | NO301234B1 (no) |
NZ (1) | NZ218332A (no) |
OA (1) | OA08947A (no) |
PT (1) | PT83761B (no) |
SK (1) | SK414191A3 (no) |
WO (1) | WO1987002990A1 (no) |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0740943B2 (ja) * | 1985-09-30 | 1995-05-10 | 佑 本庶 | 新規なポリペプチドをコードするdna及びその製造方法 |
US5912136A (en) * | 1985-11-19 | 1999-06-15 | Schering Corporation | Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same |
US5700915A (en) * | 1985-11-19 | 1997-12-23 | Schering Corporations | Human interleukin immunopurification processes |
US5041381A (en) * | 1986-07-03 | 1991-08-20 | Schering Corporation | Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same |
US5082927A (en) * | 1986-09-24 | 1992-01-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Selectively cytotoxic IL-4-PE40 fusion protein |
AU620537B2 (en) * | 1986-12-19 | 1992-02-20 | Immunex Corporation | Human interleukin-4 muteins |
SE8701004D0 (sv) * | 1987-03-11 | 1987-03-11 | Astra Ab | Method for therapy of leukemias and certain other malignancies |
WO1989001046A1 (en) * | 1987-07-29 | 1989-02-09 | Schering Biotech Corporation | Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli |
JPH02485A (ja) * | 1987-08-03 | 1990-01-05 | Yuu Honshiyo | 新規なヒトインターロイキン4、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体 |
DE3882611T2 (de) * | 1987-08-03 | 1993-12-23 | Tasuku Honjo | Menschliches Interleukin-4, Expressionsvektoren dafür und diese enthaltende Transformanten. |
ES2058490T3 (es) * | 1988-02-02 | 1994-11-01 | Schering Biotech Corp | Metodo de reducir respuestas de inmunoglobulina e. |
GB8808015D0 (en) | 1988-04-06 | 1988-05-05 | Ritter M A | Chemical compounds |
GB2218420B (en) * | 1988-04-12 | 1992-07-15 | British Bio Technology | Synthetic gene encoding interleukin 4 |
WO1989010939A1 (en) * | 1988-05-13 | 1989-11-16 | University Patents, Inc. | Immunogens and biologically active peptides derived from shared sequences from antigens and anti-idiotypic antibodies or antibodies specific for cellular receptors of the antigens |
US4958007A (en) * | 1988-05-17 | 1990-09-18 | Schering-Plough Corp. | Extraction of human interleukin-4- from bacteria |
AU643427B2 (en) * | 1988-10-31 | 1993-11-18 | Immunex Corporation | Interleukin-4 receptors |
WO1990006765A1 (en) * | 1988-12-21 | 1990-06-28 | Schering Corporation | Use of interleukin-4 for lowering blood glucose levels and/or effecting weight reduction |
WO1990007932A1 (en) * | 1989-01-20 | 1990-07-26 | The University Of Melbourne | Fibrinolysis |
US5077388A (en) * | 1990-05-31 | 1991-12-31 | Schering Corporation | Purification of human interleukin-4 from a secreted escherichia coli mutant |
WO1991007186A1 (en) * | 1989-11-21 | 1991-05-30 | The University Of Melbourne | Anti-inflammatory compositions and methods |
SE465039B (sv) * | 1989-11-23 | 1991-07-15 | Chemrec Ab | Saett att framstaella koklutar med hoeg sulfiditet foer sulfatmassakokning |
US5188827A (en) * | 1989-12-18 | 1993-02-23 | Schering Corporation | Use of interleukin-4- for lowering blood-cholesterol levels |
IL96714A0 (en) | 1989-12-20 | 1991-09-16 | Schering Corp | Antibody antagonists of human interleukin-4 |
CA2078676A1 (en) * | 1990-03-21 | 1991-09-22 | Jerome Schwartz | Use of il-4 to enhance immune response to infectious antigenic challenges |
EP0563254B1 (en) * | 1990-12-19 | 1995-11-08 | Schering Corporation | Use of il-4 to enhance immune response to immunogens in vaccines |
ATE135233T1 (de) * | 1991-01-10 | 1996-03-15 | Schering Corp | Verwendung von il-4 zur verstärkung von wundheilung und besserung und zur heilung von infizierten wunden und wunden bei diabetischen säugetieren |
US5494662A (en) * | 1992-04-27 | 1996-02-27 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Stimulator for bone formation |
US5716612A (en) * | 1994-09-07 | 1998-02-10 | Schering Corporation | Use of IL-4 for potentiation of chemotherapeutic agents |
AUPN481295A0 (en) * | 1995-08-16 | 1995-09-07 | Medvet Science Pty. Ltd. | Agonists of haemopoietic growth factors |
US6335426B1 (en) | 1996-06-14 | 2002-01-01 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
US5986059A (en) * | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
US6028176A (en) | 1996-07-19 | 2000-02-22 | Bayer Corporation | High-affinity interleukin-4 muteins |
CA2331726C (en) * | 1998-05-12 | 2010-03-09 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of molecular interaction sites on rna and other biomolecules |
AUPQ005399A0 (en) * | 1999-04-29 | 1999-05-27 | Medvet Science Pty. Ltd. | Agonists or antagonists for haemopoietic growth factors |
LT2665486T (lt) | 2011-01-18 | 2020-04-10 | Bioniz, Llc | Kompozicijos, skirtos gama-c-citokino aktyvumui moduliuoti |
WO2015089217A2 (en) | 2013-12-10 | 2015-06-18 | Bionz, Llc | Methods of developing selective peptide antagonists |
CN102212888A (zh) * | 2011-03-17 | 2011-10-12 | 靳海峰 | 一种基于高通量测序的免疫组库构建方法 |
US11400134B2 (en) | 2015-10-09 | 2022-08-02 | Bioniz, Llc | Modulating gamma-c-cytokine activity |
WO2020227019A1 (en) | 2019-05-03 | 2020-11-12 | Bioniz, Llc | Modulating the effects of gamma-c-cytokine signaling for the treatment of alopecia and alopecia associated disorders |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US799668A (en) * | 1905-05-29 | 1905-09-19 | Albert R Pritchard | Dough kneader and mixer. |
US799669A (en) * | 1905-07-27 | 1905-09-19 | Eugene S Regnier | Combined cutting and raking implement. |
US843958A (en) * | 1905-11-20 | 1907-02-12 | Whitehead & Hoag Co | Key-ring tag. |
US4613459A (en) * | 1982-10-20 | 1986-09-23 | Dana-Farber Cancer Institute | Lymphocyte growth factor |
US4695542A (en) * | 1983-10-04 | 1987-09-22 | Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. | cDNA clones coding for polypeptides exhibiting multi-lineage cellular growth factor activity |
WO1987004723A1 (en) * | 1986-02-11 | 1987-08-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant human b-cell growth factor |
ZA872781B (en) * | 1986-05-19 | 1987-10-05 | Immunology Ventures | B-cell stimulating factor |
AU620537B2 (en) * | 1986-12-19 | 1992-02-20 | Immunex Corporation | Human interleukin-4 muteins |
-
1986
- 1986-11-18 PT PT83761A patent/PT83761B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-11-18 IL IL8067886A patent/IL80678A/en active IP Right Grant
- 1986-11-19 CN CN86108579A patent/CN1020472C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-19 NZ NZ218332A patent/NZ218332A/xx unknown
- 1986-11-19 AT AT86907184T patent/ATE140009T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-19 EP EP86309041A patent/EP0230107A1/en active Pending
- 1986-11-19 AU AU67334/87A patent/AU610057B2/en not_active Ceased
- 1986-11-19 ES ES95108150T patent/ES2153444T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-19 IE IE304286A patent/IE80828B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-19 ES ES86907184T patent/ES2088858T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-19 DE DE3650538T patent/DE3650538T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-19 JP JP61506135A patent/JP2557361B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-19 AT AT95108150T patent/ATE198754T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-19 HU HU865547A patent/HU208710B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-11-19 EP EP95108150A patent/EP0675136B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-19 EP EP86907184A patent/EP0249613B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-19 DE DE3650751T patent/DE3650751T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-19 WO PCT/US1986/002464 patent/WO1987002990A1/en active IP Right Grant
-
1987
- 1987-07-16 DK DK371087A patent/DK371087A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-07-16 FI FI873141A patent/FI102075B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-07-17 NO NO872988A patent/NO301234B1/no not_active IP Right Cessation
- 1987-07-17 OA OA59167A patent/OA08947A/xx unknown
- 1987-08-10 MY MYPI87001250A patent/MY101972A/en unknown
-
1991
- 1991-12-30 SK SK4141-91A patent/SK414191A3/sk unknown
- 1991-12-30 CZ CS914141A patent/CZ414191A3/cs unknown
-
1993
- 1993-01-21 KR KR1019930000857A patent/KR940007773B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-08-25 JP JP7217072A patent/JP2568394B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-30 GR GR960402553T patent/GR3021198T3/el unknown
-
1998
- 1998-06-02 HK HK98104741A patent/HK1005594A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-29 HK HK98109519A patent/HK1008823A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0675136B1 (en) | Antibodies to mammalian interleukin-4 and peptides useful as antigens in their production | |
US5017691A (en) | Mammalian interleukin-4 | |
Yokota et al. | Isolation and characterization of lymphokine cDNA clones encoding mouse and human IgA-enhancing factor and eosinophil colony-stimulating factor activities: relationship to interleukin 5. | |
EP0282185A1 (en) | Human interleukin-3 and muteins thereof | |
JP4230659B2 (ja) | ケモカインアンタゴニストとしてのアミノ末端切除型mcp−2 | |
KR19990063653A (ko) | 케모킨 억제제 | |
CA1335717C (en) | Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor and muteins thereof | |
US5955315A (en) | Nucleic acids encoding human interleukin-4 | |
US5730970A (en) | Pharmaceutical compositions comprising human interleukin-4 (IL-4) | |
CA1341299C (en) | Mammalian interleukin-4 | |
KR930009084B1 (ko) | 포유동물의 인터로이킨-4, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법 | |
US5807996A (en) | Fused polypeptides comprising interleukin-4 polypeptide fragments | |
EP0267779A2 (en) | Human pleiotropic immune factor and muteins thereof | |
AU2131688A (en) | Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor and muteins thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN MAY 2003 |