NO301234B1

NO301234B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet, nukleinsyre og vektor

Info

Publication number: NO301234B1
Application number: NO872988A
Authority: NO
Inventors: Frank Lee; Takashi Yokota; Ken-Ichi Arai; Timothy Mosmann; Donna Rennick; Craig A Smith
Original assignee: Schering Biotech Corp
Priority date: 1985-11-19
Filing date: 1987-07-17
Publication date: 1997-09-29
Also published as: DE3650751D1; CZ414191A3; ES2153444T3; IE80828B1; FI873141A0; CN86108579A; EP0230107A1; DE3650751T2; EP0675136B1; EP0249613A1; SK414191A3; ATE140009T1; WO1987002990A1; OA08947A; HK1008823A1; JP2557361B2; KR940007773B1; CN1020472C; JPH0884591A; NZ218332A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for

fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet. Videre vedrører oppfinnelsen nucleinsyrer som koder for et polypeptid som oppviser pattedyr-interleukin-4-aktivitet og minst én ytterligere aktivitet, samt to vektorer.

Rekombinant DNA-teknologi refererer generelt til teknikken for integrering av genetisk informasjon fra en donorkilde i vektorer for senere bearbeiding slik som gjennom innføring i en vert, hvorved den overførte genetiske informasjon kopieres og/eller uttrykkes i det nye miljø. Vanligvis foreligger den genetiske informasjon i form av komplementær DNA (cDNA) avledet fra budbærer-RNA (mRNA) som koder for et ønsket proteinprodukt. Bæreren er ofte et plasmid med evne til å inkorporere cDNA for senere replikasjon i en vert, og, i noen tilfeller, faktisk å regulere ekspresjon av cDNA og derved styre syntese av det kodede produkt i verten.

Det har en tid vært kjent at immunresponsen til pattedyr er basert på en serie komplekse cellulære reaksjoner kalt "immunnettverk". Nyere forskning har gitt ny innsikt i den indre virkemåte i dette nettverk. Mens det forblir klart at mye av responsen faktisk gjentas periodisk rundt i de nettverklignende reaksjoner til lymfocytter, makrofager, granulocytter og andre celler, er immunologer nå generelt av den oppfatning at oppløselige proteiner (f.eks. de såkalte "lymfokiner" eller "monokiner") spiller en avgjørende rolle når det gjelder å regulere disse cellulære reaksjoner. Det foreligger følgelig en betydelig interesse for isolering og karakterisering av, og virk-ningsmekanismene til, cellemodulerende faktorer, hvor en forståelse burde gi betydelige gjennombrudd i diagnostisering og terapi av et stort antall sykdomstilstander.

Lymfokiner formidler åpenbart cellulære aktiviteter på forskjellige måter. De er blitt påvist å understøtte celledeling, vekst og differensiering av de flerpotensielle hematopoietiske stamceller til det store antall forløper-celler som danner de forskjellige cellulære av avstamninger som er ansvarlige for immunresponsen. Disse avstamningene gir ofte respons på en forskjellig måte når lymfokiner brukes sammen med andre midler.

Celleavstamninger som er spesielt viktige for immunresponsen, omfatter to klasser lymfocytter: B-celler som kan danne og utskille immunglobuliner (proteiner med evne til å gjenkjenne og binde seg til fremmed stoff for å bevirke fjerning av dette), og T-celler av forskjellige undertyper som utskiller lymfokiner og induserer eller hemmer B-cellene og noen av de øvrige cellene (inkludert andre T-celler) som utgjør immunnettverket.

En annen viktig celleavstamning er mastcellen (som ikke er blitt positivt identifisert i alle pattedyrarter) - en granulholdig sammenbindende vevcelle som befinner seg proksimalt til kapillarårer gjennom hele kroppen, med særlig høye konsentrasjoner i lungene, huden og i mage- og tarmkanalen og kjønns- og urinveiene. Mastceller spiller en sentral rolle i allergirelaterte sykdommer, særlig anafylakse, på følgende måte: når utvalgte antigener kryssbinder en klasse immunglobuliner bundet til reseptorer på mastcelle-overflaten, degranuleres mastcellen og frigjør mediatorene

(f.eks. histamin, serotonin, heparin, prostaglandiner, etc.)

som forårsaker allergiske reaksjoner, f.eks. anafylakse.

Forskning for bedre å forstå (og derved eventuelt behandle terapeutisk) forskjellige immunsykdommer har vært vanskeliggjort av den generelle manglende evne til å opprettholde celler fra immunsystemet in vitro. Immunologer har oppdaget at dyrking av disse cellene kan utføres gjennom bruken av T-celle- og andre cellesupernatanter som inneholder forskjellige vekstfaktorer, slik som noen av lymfo-kinene.

Påvisningen, isoleringen og rensingen av slike faktorer som lymfokiner og andre oppløselige mediatorer for immunreaksjoner er svært vanskelig og kompliseres ofte av egenskapene til supernatantene som de vanligvis befinner seg i, forskjeller i og overkrysninger av aktiviteter hos de forskjellige bestanddelene i blandingene, sensitiviteten (eller mangel på sensitivitet i de prøvene som brukes til å fastlegge faktorenes egenskaper, den hyppige likhet i mole-kylvektområdet og andre karakteristika for faktorene, samt den svært lave konsentrasjon av faktorene i deres naturlige miljø.

Etter hvert som flere lymfokiner ble tilgjengelige, hovedsakelig gjennom molekylær kloning, har interessen for å finne kliniske anvendelser for dem tatt seg opp. På grunn av fysiologiske likheter med hormoner (f.eks. oppløselige faktorer, vekstmediatorer, virkning via cellereseptorer),

har det vært trukket analogier mellom mulige anvendelser av lymfokiner og de nåværende anvendelser av hormoner, f.eks. Dexter, Nature, vol. 321, s. 198 (1986). Ett håp er at nivåene av lymfokiner hos en pasient kan manipuleres direkte eller indirekte for å frembringe en gunstig immunrespons, f.eks. demping av betennelse, allergi, eller vevavvisning, eller stimulering eller styrking mot infeksjon eller malign vekst. Andre potensielle kliniske anvendelser for lymfokiner omfatter opprettholdelse og formering av in vitro populasjoner av visse immunsystemceller fra en person for eventuell innføring på nytt i den samme eller en annen person for å oppnå en gunstig virkning. F.eks. er det for tiden under-veis undersøkelser for å bestemme hvorvidt populasjoner av lymfokinaktiverte dreper-T-celler fra en pasient kan formeres utenfor hans eller hennes kropp og deretter på nytt injiseres for å tilveiebringe en forøkt antitumorrespons. En annen mulig klinisk anvendelse for lymfokiner, særlig kolonistimulerende faktorer, slik som granulocytt/makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), og faktorer som øker aktiviteten til disse, er stimulering av blodcelledannelse, f.eks. ved pre- eller post-kjemoterapi eller bestrålings-terapi mot tumorer, ved behandling av myeolid hypoplasi, eller ved behandling av neutrofile mangelsyndromer: Dexter, Nature, vol. 321, s. 198 (1986). Slike faktorer vil også være anvendelige ved terapi med benmargtransplantat som brukes i økende grad til å behandle aplastisk anemi og visse

leukemier.

Det er to egenskaper hos lymfokiner som har viktige følger for slik klinisk anvendelse: enkelte lymfokiner er ofte pleiotrope; og de biologiske virkninger av ett lymfokin kan vanligvis moduleres ved minst ett annet lymfokin, enten ved inhibering eller ved forsterkning. F.eks. stimulerer tumor-nekrosefaktor, som virker synergistisk sammen med gamma-interferon, dannelse av interleukin-1 (IL-1) og kan aktivere den fagocyttiske aktivitet til neutrofiler. IL-1, et protein dannet av aktiverte makrofager, formidler en lang rekke biologiske virkninger, deriblant stimulering av thymocytt-celledeling via induksjon av frigjørelse av interleukin-2 (IL-2), stimulering av B-lymfocyttmodning og celledeling, fibroblast-vekstfaktoraktivitet og induksjon av akuttfase-proteinsyntese av hepatocytter. IL-1 er også blitt rapportert å stimulere prostaglandin- og collagenase-frigjørelse fra synovialceller, og å være identisk med endogent pyrogen: Krampschmidt, J. Leuk. Biol., vol. 36,

s. 341-355 (1984).

Interleukin-2, tidligere referert til som T-celle-vekstfaktor, er et lymfokin som dannes av lectin- eller antigen-aktiverte T-celler. De biologiske virkninger av IL-2 som er rapportert, omfatter stimulering av den lang-varige in vitro vekst av aktiverte T-celle-kloner, forøkning av thymocytt-mitogenese, og induksjon av cytotoksisk T-celle-reaktivitet og plakk-dannende celleresponser i kulturer av miltceller fra nakne mus. På samme måte som inter-feroner (IFN-er) er dertil IL-2 blitt påvist å øke naturlig drepercelleaktivitet, hvilket antyder en mulig anvendelse ved behandlingen av neoplastiske sykdommer: Henney et al., Nature, vol. 291, s. 335-338 (1981). Det er blitt rapportert en viss suksess ved slik terapi, f.eks. Lotze og Rosenberg, "Treatment of Tumor Patients with Purified Human Interleukin-2", s. 711-719, i Sorg et al., red., Cellular and Molecular Biology of Lymphokines (Academic Press, Inc.,

New York, 19 85); og Rosenberg og Lotze, "Cancer Immuno-therapy Using Interleukin-2 and Interleukin-2-Activated

Lymphocytes", Ann. Rev. Immunol., vol. 4, s. 681-709 (1986). IL-2-toksisitet har imidlertid begrenset dosene som kan gis til kreftpasienter for å dra fordel av disse egenskapene: Lotze og Rosenberg, s. 711-719; og Welte et al., s. 755-759, i Sorg et al., red. (se ovenfor).

Metcalf, D., The Hematopoietic Colony Stimulating Factors, (Elsevier, Amsterdam, 1984), gir en oversikt over forskning vedrørende lymfokiner og forskjellige vekstfaktorer involvert i immunresponsen hos pattedyr. Yung, Y.-P., et al., J. Immunol., vol. 127, s. 794 (1981), beskriver delvis rensing av proteinet med omtrent 35 kd som oppviser mast-celle-vekstfaktor-aktivitet (MCGF) og dets separasjon fra interleukin-2 (IL-2), også kjent som T-celle-vekstfaktor (TCGF). Nabel, G., et al., Nature, vol. 291, s. 332 (1981), rapporterer en MCGF med en molekylvekt på ca. 45 kd og en pl på ca. 6,0. Clark-Lewis, I. og Schrader, J., J. Immunol., vol. 127, s. 1941 (1981), beskriver et protein med mastcelle-lignende vekstfaktoraktivitet som har en molekylvekt på ca.

29 kd i fosfatbufret saltoppløsning, og ca. 23 kd i 6M guanidin-hydroklorid, med en pl på ca. 4,8, men med ca. 6-8 etter neuramidinasebehandling. Murin IL-2 og interleukin-3 (IL-3) er blitt delvis karakterisert biokjemisk av hhv. Gillis, S., et al., J. Immunol., vol. 124, s. 1954-1962

(1980) og Ihle, J., et al., J. Immunol., vol. 129, s. 2431-2436 (1982), idet IL-2 har en tilsynelatende molekylvekt (sannsynlighet som en dimer) på ca. 30-35 kd og IL-3 har en molekylvekt på ca. 28 kd. Human IL-2 har tilsynelatende en molekylvekt på ca. 15 kd og er beskrevet av Gillis, S., et al., Immu. Rev., vol. 63, s. 167-209 (1982). Sammenligning mellom virkningene av IL-3 og MCGF i T-cellesupernatanter er blitt rapportert av Yung Y. og Moore, M., Contemp. Top. Mol. Immunol., vol. 10, s. 147-179 (1985) og Rennick, D., et al., J. Immunol., vol. 134, s. 910-919

(1985).

Det foreligger en omfattende litteratur vedrørende reguleringen av B-celle-vekst og -differensiering ved hjelp av oppløselige faktorer: for oversikter vises det til f.eks. Howard og Paul, Ann. Rev. Immunol., vol. 1, s. 307-333

(1983); Howard et al., Immunol. Rev., 1984, nr. 78,

s. 97-118; og Kishimoto, Ann. Rev. Immunol., vol. 3,

s. 133-157 (1985) . Det har vært en viss forvirring vedrør-ende nomenklaturen som har vært brukt for å merke de forskjellige faktorer, på grunn av forskjeller i kildemateri-aler, vanskeligheter ved rensing og forskjeller ved de analysene som har vært brukt for å bestemme de biologiske virkninger. Det er tilsynelatende nådd frem til enighet vedrørende nomenklatur i noen tilfeller: Paul, Immunology Today, vol. 4, s. 322 (1983); og Paul, Molecular Immunol., vol. 21, s. 343 (1984). Aktiviteten til B-celle-vekstfaktor (BCGF) er kjennetegnet ved en evne til å forårsake DNA-syntese i B-celler som samtidig stimuleres ved eksponering mot anti-IgM, eller lignende antigener. Det antas at interleukin-1 (IL-1) også er påkrevet for at BCGF-aktivitet skal manifestere seg, i det minste når analysen utføres med lave tettheter av B-celler. Alternative analyser for human BCGF er blitt beskrevet: f.eks. Maizel et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 80, s. 5047-5051 (1983) (understøttelse av langvarig vekst av humane B-celler i kultur). Den aktivitet som er forbundet med den tidligere analyse, er også blitt merket B-celle-stimulerende faktor-l-aktivitet (BSF-1) og BCGF I for å skille den fra lignende og/eller beslektede aktiviteter. Særlig er en aktivitet betegnet BCGF II, blitt beskrevet. Den er kjennetegnet ved evne til å forårsake DNA-syntese i mitogen-stimulerte B-celler eller i transformerte B-celle-linjer. Mitogener forbundet med BCGF II-aktivitet omfatter dextransulfat, lipopolysaccharid og Staphylococcus-ekstrakter. BCGF I registrerer ingen respons i disse analysene. Hos mennesker antas det at BCGF II er et molekyl med en molekylvekt på ca. 50 kilodalton (kd), og at det virker synergistisk med BCGF I (dvs. BSF-1) når det gjelder å fremme B-celle-deling i en immunrespons: Yoshizaka et al., J. Immunol., vol. 130, s. 1241-1246 (1983). Howard et al., J. Exp. Med., vol. 155, s. 914-923 (1982), var først til å påvise eksistensen av en murin BCGF (som senere

varierende ble kalt BCGF I, BSF-1 eller IgG-^-induksjons-faktor) som er forskjellig fra interleukin-2. Lignende observasjoner ble rapportert nesten samtidig for et humant system av Yoshizaki et al., J. Immunol., vol. 128,

s. 1296-1301 (1982), og senere av Okada et al., J. Exp. Med., vol. 157, s. 583-590 (1983).

Biokjemisk og biologisk karakterisering av molekyler med BCGF- eller BSF-l-aktivitet har utviklet seg jevnt siden disse første oppdagelser. Maizel et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 79, s. 5998-6002 (1982), har rapportert en trypsin-sensitiv human BCGF med en molekylvekt på 12-13 kd og et isoelektrisk punkt (pl) på ca. 6,3-6,6. Farrar et al., J. Immunol., vol. 131, s. 1838-1842 (1983), rapporterte delvis rensing av en heterogen murin BCGF med molekylvekter på 11 og 15 kd ved SDS-PAGE og pl-verdier på 6,4-8,7. Ohara og Paul, i Nature, vol. 315, s. 333-336 (1985), beskriver et monoklonalt antistoff som er spesifikt for murin BSF-1, og gir molekylvekter for BSF-1 på 14 kd og 19-20 kd med pl på 6,7. Butler et al., J. Immunol., vol. 133, s. 251-255

(1984) , rapporterer en human BCGF med en molekylvekt på 18-20 kd og en pl på 6,3-6,6. Rubin et al., Proe. Nati. Sei., vol. 82, s. 2935-2939 (1985), rapporterer at for-inkubasjon av hvilende B-celler med BSF-1 før eksponering mot anti-IgM-antistoffer øker cellevolum, og senere setter fart på overgang til S-fase etter eksponering mot anti-IgM-antistoffer. Vitetta et al., J. Exp. Med., vol. 162, s. 1726-1731 (1985) , beskriver delvis rensing av murin BSF-1 ved hjelp av revers-fase-HPLC av serumfrie supernatanter fra EL-4-celler. SDS-PAGE indikerte et protein på ca.

20-22 kd. Ohara et al., J. Immunol., vol. 135, s. 2518-2523

(1985) , rapporterer også delvis rensing av murin BSF-1 ved en lignende fremgangsmåte, og rapporterer at faktoren er et protein med ca. 18-21,7 kd. Sideras et al., i Eur. J. Immunol., vol. 15, s. 586-593, og 593-598 (1985), rapporterer delvis rensing av en murin IgG^-induserende faktor som er en BSF-1, og rapporterer at faktoren er et protein på ca. 20 kd med pl-verdier på 7,2-7,4 og 6,2-6,4, og Smith og Rennick, i Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 1857-1861 (1986), rapporterer separasjon av en faktor fra IL-2 og IL-3 som oppviser T-celle-vekstfaktoraktivitet og mastcelle-vekstfaktoraktivitet. Senere klonet og sekvensbestemte Norna et al., Nature, vol. 319, s. 640-646 (1986), en nucleinsyre som koder for faktoren til Sideras et al., og Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 2061-2065 (1986), klonet og sekvensbestemte en nucleinsyre som koder for faktoren til Smith og Rennick. Nylig rapporterte Grabstein et al., J. Exp. Med., vol. 163, s. 1405-1414 (1986), rensing og sekvensbestemmelse av murin BSF-1.

Milanese et al., i Science, vol. 231, s. 1118-1122

(1986), rapporterer et lymfokin som ikke er beslektet med

BSF-1, og som de foreløpig betegner IL-4A. Deres IL-4A er et 10-12 kd protein utskilt fra hjelper-T-celler etter kryssbinding av T3-Ti-reseptorer. Det stimulerer hvilende lymfocytter via reaksjon med Tll-reseptorer og etterfølgende induksjon av interleukin-2-reseptorer (IL-2).

Sanderson et al., i Proe. Nati. Acad. Sei.,

vol. 83, s. 437-440 (1986), foreslo at navnet interleukin-4 skulle gis til eosinofil differensieringsfaktor på grunnlag av bevis for at den er tilsynelatende den samme som B-celle-vekstfaktor II.

Av det ovenstående er det åpenbart at oppdagelsen og utviklingen av nye lymfokiner vil kunne bidra til utvik-ling av terapier for en lang rekke degenerative tilstander som direkte eller indirekte involverer immunsystemet og/eller hematopoietiske celler. Særlig ville oppdagelsen og utviklingen av lymfokiner som øker eller forsterker de gunstige virkninger av kjente lymfokiner, være svært for-delaktig. F.eks. ville den dosebegrensende toksisitet av IL-2 i tumorterapi kunne reduseres gjennom tilgjengeligheten av et lymfokin eller en cofaktor med forsterkende virkninger; eller virkningsfullheten av benmargtransplantater ville kunne bli økt gjennom tilgjengeligheten av faktorer som forsterker virkningene av de kolonistimulerende faktorer.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremgangsmåte for fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet,og som har en sekvens av aminosyrer definert ved den følgende formel, som kan være enten 1 gang substituert eller 1 gang delert eller 1 gang innskutt:

hvor R er Ala-Glu-Phe eller Glu-Asn-Phe-Val-His, eller er fra-værende , og

hvor hvert av uttrykkene av typen X("Xaa") representerer aminosyren "Xaa", bortsett fra at den innskutte eller substituerte aminosyre X("Xaa") i de 1 gang substituerte eller 1 gang innskutte polypeptider i de stillinger hvor de er innskutt eller substituert, er definert på følgende måte:

X(Ser) er Ser,

X(Arg) er gruppen bestående av Arg, His og Lys, X(Leu) er gruppen bestående av Leu, Ile, Phe og Met, X(Pro) er gruppen bestående av Pro og Ala,

X(Thr) er Thr,

X(Ala) er gruppen bestående av Ala og Pro,

X(Val) er gruppen bestående av Val, Met og Ile, X(Gly) er Gly,

X(Ile) er gruppen bestående av Ile, Met og Leu,

X(Phe) er gruppen bestående av Phe, Met, Tyr, Ile og Leu,

X(Tyr) er gruppen bestående av Tyr og Phe,

X(His) er gruppen bestående av His, Gin og Arg, X(Gln) er gruppen bestående av Gin, Glu og His, X(Asn) er gruppen bestående av Asn og Asp,

X(Lys) er gruppen bestående av Lys og Arg,

X(Asp) er gruppen bestående av Asp og Asn,

X(Glu) er gruppen bestående av Glu og Gin,

X(Met) er gruppen bestående av Met, Ile og Leu, X(Trp) er Trp og

X(Cys) er Cys,

fortrinnsvis hvor:

X(Arg) er Arg,

X(Leu) er gruppen som består av Leu, Ile og Met, X(Pro) er Pro,

X(Ala) er Ala,

X(Val) er Val,

X(Ile) er gruppen bestående av Ile, Met og Leu, X(Phe) er Phe,

X(Tyr) er Tyr,

X(His) er His,

X(Gin) er Gin,

X(Asn) er Asn,

X(Lys) er Lys,

X(Asp) er Asp,

X(Glu) er Glu og

X(Met) er gruppen bestående av Met, Ile og Leu,

og uttrykket "1 gang substituert" angir en delmengde av polypeptider hvor de naturlig forekommende aminosyrer er blitt byttet ut med synonyme aminosyrer i 1 stilling, uttrykket "1 gang delert" angir en delmengde av polypeptider hvor de naturlig forekommende aminosyrer er blitt delert i 1 stilling, og uttrykket "1 gang innskutt" angir en delmengde av polypeptider hvor synonyme aminosyrer er blitt innskutt ved siden av de naturlig forekommende aminosyrer i 1 stilling. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: a) konstruksjon av en vektor som omfatter en nucleotidsekvens som koder for angitte polypeptid, i kombinasjon med

transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, slik at nucleotidsekvensen er i stand til å bli uttrykt av en vert som inneholder vektoren, hvor nucleotidsekvensen er minst 75 % homolog med en cDNA-sekvens i innskuddet i vektoren pcD-125 [ATCC 67029],

b) inkorporering av vektoren i verten, og

c) dyrking av den vektorholdige vert under betingelser

som er egnet for ekspresjon av nucleotidsekvensen til polypeptidet, hvoretter

d) det uttrykte protein isoleres.

Nucleinsyrene ifølge oppfinnelsen er definert (1) ved sin homologi med klonede komplementær-DNA-sekvenser (cDNA) som her er beskrevet, og (2) ved funksjonsanalyser av IL-4-aktivitet brukt på polypeptidene som kodes for av nucleinsyrene. Slik det her er brukt, betyr uttrykket "IL-4-aktivitet" ved henvisning til et protein eller et polypeptid at proteinet eller polypeptidet oppviser både B-celle-vekstfaktor-aktivitet (BCGF) og T-celle-vekstfaktoraktivitet (TCGF). For et bestemt pattedyr bestemmes IL-4-aktivitet ved artsspesifikke TCGF- og BCGF-analyser. Som forklart mer fullstendig nedenunder, kan bestemte utførelsesformer av IL-4 karakteriseres ytterligere ved tilleggsanalyser. F.eks. kan visse former av murin IL-4 oppvise mast-celle-vekstfaktor-aktivitet (MCGF), visse former av både human og murin IL-4 forsterker TCGF-aktiviteten til IL-2, visse former av både murin og human IL-4 forsterker GM-CSF-stimulert celledeling hos visse celletyper, visse former av både human og murin IL-4 induserer Fc-epsilon-reseptorekspresjon på B-celler, og visse former

av både human og murin IL-4 kan indusere ekspresjon av de viktigste vevforenlighetskompleksantigener (MHC) på B-celler: klasse II DR-antigenet på humane B-celler og Ia-antigenet på mus-B-celler.

Oppfinnelsen omfatter således nucleinsyrer som er kjennetegnet ved at de omfatter en sekvens av nucleotidbaser som er i stand til å kode for et polypeptid som utviser pattedyr-interleukin-4-aktivitet og minst én ytterligere aktivitet valgt fra gruppen bestående av MHC-antigen-induksjonsaktivitet, Fc-epsilon-reseptor-induksjonsaktivitet, GM-CSF-stimulert granulocyttkolonivekstforsterkende aktivitet, interleukin-2-TCGF-forsterkende aktivitet og IgG^ og IgE-induksjonsaktivitet, som fremstilt ifølge krav 1 og som har en sekvens av nucleotidbaser som er minst 75 % homolog med en sekvens av DNA i cDNA-innskuddet i en vektor valgt fra gruppen bestående av pcD-46 og pcD-125.

Oppfinnelsen er delvis basert på oppdagelsen og kloningen av cDNA-er som er i stand til å uttrykke proteiner med IL-4-aktivitet. cDNA-kloner omfatter humane cDNA-innskudd i plasmidvektorene "klon 46" (her også referert til som pcD-2F1-13 eller pcD-125). Oppfinnelsen omfatter således også vektorer som er kjennetegnet ved at de er pcD-46 eller pcD-125 som deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, under ATCC deponeringsnummer 53337 og 67029.

Nucleinsyrer ifølge oppfinnelsen kan avledes fra de ovenfor nevnte cDNA-er ved hjelp av standardteknikker for mutering av nucleinsyresekvenser. De kan fremstilles de novo fra immunsystem-avledede cellelinjer, slik som T-celle-hybridomer, som inneholder eller kan induseres til å inneholde sekvenser av budbærer-RNA (mRNA) som koder for IL-4; og de kan erholdes ved å søke i DNA- eller RNA-ekstrakter eller -samlinger med søkere avledet fra cDNA-klonene ifølge oppfinnelsen.

Uttrykket "effektivt homolog" betyr slik det her er brukt, at nucleotidsekvensen er i stand til å bli påvist ved hjelp av en hybridiseringssøker avledet fra en cDNA-

klon ifølge oppfinnelsen. Det nøyaktige tallmessige mål

for homologi som er nødvendig for å påvise nucleinsyrer som koder for IL-4-aktivitet, avhenger av flere faktorer, deriblant (1) homologi mellom søkeren og ikke-IL-4-kodende sekvenser forbundet med mål-nucleinsyrene, (2) hybridiser-ingsbetingelsenes strenghet, (3) hvorvidt det anvendes én-eller dobbeltkjedede søkere, (4) hvorvidt det anvendes RNA-eller DNA-søkere, (5) de tiltak som iverksettes for å redusere ikke-spesifikk binding av søkeren, (6) egenskapene til markøren som brukes for å påvise søkeren, (7) andelen av guanidin- og cytosinbaser i søkeren, (8) fordelingen av ulikheter mellom søker og mål, (9) størrelsen til søkeren,

og lignende.

Fortrinnsvis er en effektivt homolog søker avledet fra cDNA ifølge oppfinnelsen, minst femti prosent (50%) homolog med sekvensen som skal isoleres. Mer foretrukket

er den effektivt homologe søker minst syttifem til åtti prosent (75-80%) homolog med sekvensen som skal isoleres.

Mest foretrukket er den effektivt homologe søker minst

nitti prosent (90%) homolog med sekvensen som skal isoleres.

Slik uttrykket her er brukt, er homologi et mål for likhet mellom to nucleotidsekvenser (eller aminosyre-sekvenser). Homologi uttrykkes som andelen eller den prosentvise andel av sammenfallende baser (eller aminosyrer) etter at to sekvenser (eventuelt med ulik lengde) er blitt stilt opp mot hverandre. Uttrykket oppstilling brukes i den betydning som er definert av Sankoff og Kruskal i kapitel 1 av Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison (Addison-Wesley, Reading, MA, 1983). I grove trekk stilles to sekvenser opp mot hverandre ved å maksimere antallet sammenfallende baser (eller aminosyrer) mellom de to sekvensene ved innføring av et minimalt antall "blanke" eller "null"-baser i enten den ene eller den andre sekvens for å tilveiebringe maksimal overlapping. Når man har to sekvenser, er algoritmer tilgjengelige for å beregne homologien: f.eks. Needleham og Wunsch, J. Mol. Biol., vol. 48, s. 443-453

(1970); og Sankoff og Kruskal (henvist til ovenfor), s. 23-29. Kommersielle tjenester er også tilgjengelige for å utføre slike sammenligninger, f.eks. Intelligenetics, Inc. (Palo Alto, CA).

Synonyme aminosyrer innenfor en

gruppe har tilstrekkelig like fysikalsk-kjemiske egenskaper til å kunne byttes ut med medlemmer av gruppen og bevare molekylets biologiske funksjon: Grantham, Science, vol. 185, s. 862-864 (1974). Det er klart at innføyninger og fjerninger av aminosyrer også kan gjøres i den ovenfor definerte sekvens uten å endre biologisk funksjon, særlig dersom inn-føyningene og fjerningene bare omfatter noen få aminosyrer, f.eks. under 10, og ikke fjerner eller erstatter aminosyrer som er kritiske for en funksjonell konformasjon, f.eks. cysteinrester, Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, vol. 181, s. 223-230 (1973).

Fremstilling av proteiner og muteiner ved hjelp av slike dele-sjoner og/eller innskudd, faller innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Bestandig når det henvises til aminosyrerester fra proteinet med formel I ved tall, refererer tallet eller tallene seg til N-enden i proteinet.

Det er her brukt standardforkortelser for å betegne aminosyrer, nucleotider, restriksjonsendonucleaser og lignende: f.eks. Cohn, "Nornenelature and Symbolism of cx-Amino Acids" Methods in Enzymology, vol. 106, s. 3-17 (1984);

Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, 2. utg.

(Benjamin, Menlo Park, 1981), og Roberts, "Directory of Restriction Endonucleases", Methods in Enzymology, vol. 68,

s. 27-40 (1979).

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av forbindelser for anvendelse som immunregulerende midler for å behandle medisinske og/eller veterinærmedisinske sykdommer. Den tilveiebringer særlig forbindelser som har gunstige virkninger når de brukes alene, eller som kan virke sammen med andre lymfokiner og immunsystem-mediatorer for å gi gunstige virkninger.

Foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet, delvis sammen med tegningene (figurene 1 - 19). Figur IA viser nucleotidsekvensen og utledet aminosyresekvens av innføyningen av vektor pcD-2A-E3, som uttrykker murin IL-4. Figur IB viser nucleotidsekvensen og utledet aminosyresekvens av innføyningen av vektor pcD-125, som uttrykker human IL-4. Figur 1C viser aminosyresekvensen i renset, naturlig forekommende human IL-4 uttrykt og utskilt ved hjelp av COS 7 apeceller transfisert med pcD-125. Figur 2A er et kart over vektor pcD-2A-E3, hvis inn-føyning koder for murin IL-4. Figur 2B er et restriksjonsendonuclease-spaltingskart over innføyningen av vektor pcD-2A-E3. Figur 2C er et kart over vektor pcD-46, hvis inn-føyning koder for human IL-4. Figur 2D er et restriksjonsendonuclease-spaltingskart over innføyningen av vektor pcD-4 6. Figur 3A viser relative TCGF-aktiviteter (over et fortynningsområde) for forskjellige kultursupernatanter, deriblant en (kurve 1) fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler. Figur 3B viser relative MCGF-aktiviteter (over et fortynningsområde) for forskjellige kultursupernatanter, deriblant en (kurve 1) fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler. Figur 3C viser de relative grader av Ia-induksjon som fås ved hjelp av de angitte mengder supernatant fra pcD- 2A-E3-transfiserte COS 7 celler (kurve 1), Cl.Lyl<+>2~/9-celler (kurve 2), og "mock"-transfiserte COS 7 celler (kurve 3) . Figur 3D viser grafisk størrelsen avIgE- og IgG1~ induksjon ved supernatanter fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler og forskjellige kontroller i T-celle-tømte miltceller fra mus. Figur 4A viser TCGF-aktivitetene av flere pcD-125-transfeksjonssupernatanter og kontroller målt ved hjelp av en kolorimetrisk celledelingsanalyse på den faktor-avhengige humane hjelper-T-cellelinje, JL-EBV. Figur 4B viser TCGF-aktivitetene til en pcD-125-transfeksjonssupernatant og kontroller målt ved hjelp av en kolorimetrisk celledelingsanalyse på PHA-stimulerte lymfocytter fra perifert blod. Figur 4C viser TCGF-aktivitetene til en pcD-125-transfeksjonssupernatant og kontroller målt ved hjelp av inkorporering av tritiert thymidin ved hjelp av PHA-stimulerte lymfocytter fra perifert blod. Figur 5A er et histogram over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for en kontrollpopulasjon av stimulerte, humane mandel-B-celler hvis Fc-epsilon-reseptorer er blitt fluorescensmerket. Figur 5B er et histogram over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for en populasjon av stimulerte, humane mandel-B-celler som var blitt eksponert mot medium bestående av 0,1% supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler og hvis Fc-epsilon-reseptorer er blitt fluorescensmerket. Figur 5C er et histogram over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for en populasjon av stimulerte, humane mandel-B-celler som var blitt eksponert mot medium bestående av 1% supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler og hvis Fc-epsilon-reseptorer er blitt fluorescensmerket. Figur 5D er et histogram over cellefrekvens i forhold til fluorescensstyrke for en populasjon av stimulerte, humane mandel-B-celler som var blitt eksponert mot medium bestående av 10% supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler og hvis Fc-epsilon—reseptorer er blitt fluorescensmerket. Figur 6A viser nucleotidsekvensen til et syntetisk, humant IL-4-gen som er effektivt når det gjelder å uttrykke naturlig forekommende eller mutante IL-4-er i E. coli. Figur 6B er et restriksjonsendonuclease-spaltingskart over et syntetisk, humant IL-4-gen innføyd i plasmid pUC18. Figurene 7A-7F viser hhv. de dobbeltkjedede DNA-fragmentene IA/B til 6A/B anvendt til å konstruere et syntetisk, humant IL-4-gen. Figur 8 viser nucleotidsekvenser i nabostilling til initiator-ATG-kodonet i E. coli ekspresjonsvektoren TAC-RBS. Sekvensene starter ved et EcoRI-restriksjonssete og slutter ved et Hindlll-sete. Den ribosombindende sekvens (RBS) som er komplementær til 3<1->enden i 16S ribosom-RNA, er understreket, og ATG-initiatorkodonet er understreket. Figur 9 viser histogrammer over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for populasjoner av celler avledet fra en pasient med lymfocyttmangelsyndrom. Cellene ble farget med fluorescensmerkede anti-DR monoklonale antistoffer. Figur 10 viser absorpsjonsprofilen ved 215 nm i det endelige rensingstrinn for human IL-4, som besto av revers-fase-HPLC på en C-4-kolonne. Figur 11 er et konstruksjonskart over plasmid pEBV-178 som inneholder human IL-4-cDNA. Figur 12 er et konstruksjonskart over plasmid TRPC11. Figur 13A er et konstruksjonskart over plasmid pMF-alfa8. Figur 13B viser TCGF-aktivitetene til flere transfeksjonssupernatanter fra gjærkulturer som uttrykker naturlig forekommende human IL-4 og forskjellige muteiner derav. Figur 14 viser vekstkurver for faktoravhengige celle-linjer; MC/9-mastceller (IA), DX-2-mastceller (IB), NFS-60-celler (1C) og HT2-T-celler (ID). 5 x IO<3> celler ble dyrket med varierende konsentrasjoner av Cl.1-supernatant (lukkede sirkler), IL-2R (lukkede kvadrater), IL-3R (åpne sirkler), GM-CSFR (åpne triangler), IFN-?R (lukkede triangler) eller P388Dl-supernatant (åpne romber). MC/9-celler (IA) ble også dyrket med varierende konsentrasjoner av renset IL-3 (lukkede sirkler) eller IL-3 blandet med 200 enheter av IL-2R (lukkede kvadrater), GM-CSF<R> (åpne triangler), IFN-7 TJ (lukkede triangler) eller P388Dl-supernatant (åpne romber). Vekstfaktoraktivitet ble målt etter 24 timer ved kolorimetrisk analyse. Absorbansen ved 570 nm (referanse 630 nm) ble målt på et avlesningsapparat av type Dynatek "Micro Elisa". Figur 15 viser FPLC kationbytterkromatografi av Cl.1-supernatant. 7 ml (35 mg protein) av konsentrert supernatant ble dialysert over i 50 nM Na-fosfat, 1 mm EDTA, pH 7,0 (7,8 mS/cm) og tilført Pharmacia Mono S-kolonne (0,5 x 5 cm) ekvilibrert med den samme buffer (buffer A). Buffer B = A + IM NaCl. Elueringsbetingelser: 0,5 ml/min. strømningshastighet; 0,5 ml/fraksjon; 0-40% B i løpet av 40 minutter, 40-100% B i løpet av 10 minutter. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på celledelingsaktivitet på NFS-60- (IL-3, lukkede sirkler), HT2- (TCGF, åpne sirkler) og MC/9- (MCGF) celler. MC/9-responsen er ikke vist; piler viser stillingene hvor MC/9-celledelingsnivåer nådde opp til nivåene for Cl.1-supernatant. Figur 16A viser reversfase — C8-kromatografi av IL-3-redusert Cl.1-supernatant. 100 ul 3X mono-S-passert supernatant (fraksjonene 59-61, figur 15) i 0,1% TFA ble fylt på Pharmacia C8 reversfase-kolonne (0,5 x 2 cm). Buffer A = 0,1% TFA i H20, buffer B = 0,1% TFA i acetonitril. Elueringsbetingelser: 0,5 ml/min., 0,5 ml/fraksjon, 0-25% B i løpet av 4 minutter, 25-60% B i løpet av 50 minutter, 60-100% B i løpet av 4 minutter. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på celledelingsaktivitet på NFS-60-(IL-3, lukkede sirkler), HT2- (TCGF, åpne sirkler) og MC/9-celler (MCGF, lukkede triangler). Pil viser fraksjon som inneholder topp-TCGF-aktivitet, og som ga MC/9-celledelingsnivåer svarende til nivåene til Cl.1-supernatant etter tilsetning av mettende IL-3 jj_-nivåer til hver fraksjon. Figur 16B viser reversfase-C8-kromatografi av GK15-1 murin T-celle-supernatant. 2 mg (0,5 ml) konsentrert GK15-1-supernatant i 0,1% TFA ble tilført en Pharmacia C8-revers-fase-kolonne og eluert som ovenfor. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på TCGF-aktivitet på HT2-celler (åpne sirkler). Pil markerer stillingen hvor murin IL-2 eluerte under identiske betingelser. Innføyelse: titreringer av Cl.l (lukkede sirkler) og IL-2 TJ (lukkede kvadrater) og GK15-l-supernatant (åpne sirkler) TCGF-aktiviteter direkte sammenlignet på den samme plate. Figur 17 viser MCGF- og TCGF-aktivitet av delvis renset faktor fra reversfase-kolonne (RP-faktor). Celle-deling ble målt ved hjelp av [ 3H]-thymidin-innlemmelse etter en 24-timers dyrkningsperiode. MC/9-mastceller og HT2-T-celler ble dyrket med varierende konsentrasjon av

jj_

Cl.1-supernatant (lukkede sirkler), IL-3 (åpne sirkler), IL-2 jj (åpne triangler), RP-faktor (åpne kvadrater) og fortynninger av RP-faktor i nærvær av 200 enheter IL-3jj_

(lukkede kvadrater) eller fortynninger av IL-2 i nærvær av mettende nivåer av RP-faktor (lukkede triangler).

Figur 18 viser kromatofokusering av Cl.1-supernatant. 1,5 ml (3,5 mg) supernatant i 25 nM bis-tris, pH 7,1, ble fylt på en Pharmacia "Mono P"-kolonne (0,5 x 20 cm) og eluert med polybuffer 74 (1:10), pH 4,0, strømningshastighet 0,5 ml/min., 1 ml/fraksjon. Aliquoter av hver fraksjon ble analysert med hensyn på celledeling på NFS-60 (IL-3, åpne sirkler), HT2 (TCGF, lukkede sirkler) og MC/9 (MCGF, ikke vist, bortsett fra at topp-MCGF-aktivitet er angitt med pil). TCGF-toppen (fraksjon 12, pl=6,2) sammenfaller med en minimal IL-3-aktivitet; MCGF-celledelingsnivåer er høyest ved pilangivelsen. Figur 19 viser en SDS-PAGE av Cl.1-supernatant og delvis renset MCGF/TCGF. A) Ikke-reduserende SDS-PAGE av ikke-fraksjonert supernatant. Før reduksjon med 50 niM DTT (60°C x 5 minutter) skifter TCGF-topper til svakt høyere molekylvekter (21 kd og 16 kd), og ledsages av et drastisk aktivitetstap.

B) Ikke-reduserende SDS-PAGE av topp-MCGF/TCGF-fraksjoner fra kationbytterkromatografi (fraksjonene 59-61, figur 15). Før reduksjon med 50 mM DTT (ved 60°C

i 5 minutter) skifter MCGF- og TCGF-topper til svakt høyere molekylvekter (21 kd og 16 kd), og ledsages av et drastisk aktivitetstap. Piler markerer de eneste fraksjoner hvor tilsetning av mettende mengder av IL-3

øker MCGF-aktivitet til supernatantnivåer: IL-3 (åpne sirkler), TCGF (lukkede sirkler), MCGF (åpne triangler).

Foreliggende oppfinnelse omfatter således fremstilling av glycosylerte eller ikke-glycosylerte polypeptider som oppviser human-IL-4-aktivitet, og som lar seg avlede fra IL-4-polypeptidene som er beskrevet, ved å bruke standard protein-fremstillingsteknikker. Oppfinnelsen omfatter også nucleinsyrer med sekvenser som er i stand til å kode for polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen, og nucleinsyrer med sekvenser som er effektivt homologe med cDNA-klonene i en vektor ifølge oppfinnelsen.

Teknikker for fremstilling, anvendelse og identifisering av polypeptidene og nucleinsyrene

. er omtalt nedenunder i generelle vendinger. Senere

gis det flere spesifikke eksempler hvor de generelle tek-nikkene anvendes ved å bruke bestemte celletyper, vektorer, reagenser og lignende. Isoleringen fra naturlige kilder vil først bli beskrevet i korte trekk.

Disse polypeptidene kan renses til tilsynelatende homogenitet fra supernatanter av lett tilgjengelige celle-kilder, og kan således fremstilles økonomisk i ren form,

noe som muliggjør forskjellige terapeutiske og andre anvendelser.

Disse polypeptidene er karakterisert ved å omfatte et polypeptid som oppviser B-celle-, T-celle- og mastcelle-stimulerende aktivitet. I naturlig form i en art oppviser polypeptidene en molekylvekt på SDS-PAGE på ca. 20 kd og 15 kd under ikke-reduserende betingelser, og 21 kd og 16 kd under reduserende betingelser. Et preparat som inneholder de foreliggende polypeptider i hovedsakelig ren form, oppviser et isoelektrisk punkt (pl) på ca. 6,2 ved kromatofokusering. Vekstfaktorene er svært sterke midler, idet de oppviser betydelig aktivitet ved ekstremt lave konsentrasjoner (f.eks. mindre enn 1 nanogram pr. ml). Polypeptidene kan skjelnes fra hormoner og andre proteiner som fremstilles naturlig av T-celler (f.eks. IL-2, IL-3, GM-CSF og IFN-?) gjennom kationbytterkromatografi eller unike elueringsbetingelser fra reversfase-kolonner.

I murine arter gir noen polypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen bare lave nivåer av celledeling av visse celler, slik som IL-3-avhengige mastcellelinjer, men øker synergistisk veksten av slike celler (f.eks. mastceller) i nærvær av en andre faktor (f.eks. IL-3). Polypeptidene kan stimulere celledelingen av flere T-cellelinjer, men generelt i en mindre utstrekning enn renset IL-2. Dessuten kan slike polypeptider indusere Ia-ekspresjon på hvilende B-celler og øke IgG-^- og IgE-sekresjon fra B-celler, på samme måte som BSF-1. Disse aktivitetene lar seg ikke skille ut til tross for flere biokjemiske fraksjoneringer. De fleste aktivitetene ødelegges imidlertid etter reduksjon, f.eks. i nærvær av

SDS.

Disse faktorene kan oppnås fra en rekke naturlige kilder på flere forskjellige måter. En egnet kilde er en hvilken som helst av et antall T-cellelinjer som produserer angjeldende polypeptider. En slik T-cellelinje ble avledet fra C57GL6-mus (Nabel, G. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 7J3: 1157-1161 (1981)), en cellelinje som kan oppbevares i modifisert, supplert DME (Nabel, G. et al., Cell, 23: 19-28 (1982). Denne cellelinje, opprinnelig betegnet Cl.Lyl<+>2~/9, ble deponert ved American Type Culture Collection og tildelt deponeringsnummer CRL 8179. Andre egnede celle-kilder for disse polypeptidene omfatter nesten hvilke som helst celler som utskiller de forskjellige antistoffene som henfører seg til polypeptidene, slik som humane lymfocytter fra perifert blod, samt hvilke som helst av de velkjente T-celle-kilder, slik som mandler, milter, etc.

Supernatanten fra slike cellulære kilder eller, i noen tilfeller, væske fra de knuste celler, kan utsettes for en rekke forskjellige velkjente rensefremgangsmåter for å

fraskille proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Rense-teknikkene brukes fortrinnsvis i kombinasjon for å sikre høye renhetsnivåer. Vanligvis vil rensingene utnytte gel-filtreringskromatografi, SP-kationbytterkromatografi, reversfase-kromatografi, gruppespesifikk kromatografi (f.eks. på Heparin-Sepharose<®>) eller andre vanlige separasjons-metoder som gir effektiv proteinfraksjonering. Væske-kromatografi under høyt trykk (HPLC), isoelektrisk fokusering og SDS-polyacrylamidgelelektroforese kan også benyttes.

F.eks. kan en supernatant fra en passende cellelinje først fraksjoneres ved kromatografering på en sterk kation^-bytter. Vanligvis forblir polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen bundet til kolonnen, mens ca. 98% av det påsatte protein passerer igjennom. Det gjenværende, bundne protein kan elueres med en saltgradient. Ved en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse frigjorde en natriumkloridgradient vedkommende polypeptid ved ca. 0,19 M. Denne fraksjonering ble gjentatt to ytterligere ganger (primært for å fjerne rest-IL-3), noe som ga mer enn ca. 95% renhet. Deretter ble materialet suksessivt fraksjonert ved hjelp av Heparin-Sepharose<®> og reversfase-kromatografi (c4 eller cl8). I det sistnevnte tilfelle eluerte disse polypeptidene ved 42% acetonitril. Disse sammenslåtte fraksjoner inneholder angjeldende polypeptid i ekstremt høy renhet, i det vesentlige i homogen tilstand (et enkelt bånd ved ca. 20 kd på sølv-farget SDS-PAGE). Dette rensede materiale er minst 65.000 ganger mer rent enn materialet slik det foreligger i naturlig form.

Disse polypeptidene kan brukes som antigener for fremstilling av antistoffer som igjen kan brukes som antigener for fremstillingen av anti-idiotype antistoffer.

Det kan enten fremstilles polyklonale eller monoklonale antistoffer på konvensjonelle måter. Disse polypeptidene eller fragmenter derav, vanligvis fragmenter med minst ca. 15 aminosyrer, kan i seg selv brukes, men bindes eller knyttes fortrinnsvis til et hjelpestoff eller et antigen som akti-verer immunsystemet. Forskjellige antigener kan brukes, slik som serumalbuminer, "keyhole limpef-hemocyanin, globu-liner eller lignende. En lang rekke forskjellige teknikker er tilgjengelige for å knytte hjelpestoffer til polypeptider, slik som glutaraldehyd, maleimidobenzosyre, diazobenzosyre eller lignende. Hjelpestoffer omfatter Freunds hjelpestoffer, aluminiumhydroxyd eller lignende. Antigenet injiseres i en passende vert på konvensjonelle måter, og en eller flere forsterkningsinjeksjoner kan gjøres med inter-valler på 2 til 4 uker. Når det anvendes monoklonale antistoffer, injiseres vanligvis en mus med den opprinnelige og forsterkningsinjeksjonene, og milten isoleres, og deretter fusjoneres splenocytter med en passende fusjonspartner i henhold til konvensjonelle teknikker. Se f.eks. Galfre et al., Nature (1977), 266:550; Kennett et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:77; og U.S. patentskrift nr. 4 381 292 og 4 363 799. For spesielle formål kan imidlertid andre pattedyr anvendes, slik som primater,

f.eks. mennesker, for fremstilling av antistoffer med humane Fc-kjeder.

Polypeptidene kan brukes i seg selv eller i kombinasjon med antistoffene ved diagnostisering av polypeptidene. Enten den ene eller begge kan være merket eller umerket

for bruk i diagnoseprøver. Et stort antall diagnoseprøver er beskrevet i litteraturen og omfatter binding, enten direkte eller indirekte, av disse polypeptidene eller antistoffene til forskjellige markører, slik som enzymer, radio-nuclider, fluorescensmidler, substrater, coenzymer, partikler, f.eks. magnetiske partikler, eller lignende. Som

illustrasjoner på disse prøvene, se f.eks. U.S. patent-skrifter nr. 3 817 837, 3 850 752, 4 174 384, 4 177 437 og 4 374 925.

Forskjellige prøvemetoder oppdeles skjønnsmessig i homogene og heterogene immunprøver hvor adskillelsen er basert på hvorvidt komplekset mellom polypeptidet og dets antistoff må separeres fra de ikke-kompleksdannede medlemmer av det bestemte bindingpar. Forskjellige prøver er henvist til som EI, ELISA, RIA, homogen EIA, "dot-blot", Westerns eller lignende.

Antistoffer mot disse polypeptidene kan selv brukes som antigener til å fremstille anti-idiotyper som kan tjene som konkurrerende antigener, og som har epitope seter som konkurrerer med epitope seter i polypeptidene. Disse anti-idiotypene kan derfor tjene som tumorinhibitorer, som erstatninger for de angjeldende polypeptider eller som anta-gonister for de angjeldende polypeptider.

Disse polypeptidene danner en familie av naturlig forekommende polypeptider som kan avledes fra naturlige kilder, samt ikke-naturlig forekommende polypeptider som har fysiologiske egenskaper, slik som bindingsspesifisitet og B-celle- eller mastcelle-stimulerende aktivitet, til felles. Mindre forskjeller mellom arter eller opprinnelse kan kreve modifikasjon av rensefremgangsmåtene, noe som er kjent for fagfolk innen teknikken. Alternativt kan disse polypeptidene sekvensbestemmes, og deretter kan fragmenter syntetiseres i overensstemmelse med velkjente teknikker.

Se f.eks. Barany og Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, "The Peptides, Analysis Synthesis Biology",

Special Methods in Peptide Synthesis, del A, vol. 2, Gross og Merenhofer, red., Academic Press, N.Y. 1980, s. 1-284.

Polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse vil finne anvendelse på en rekke forskjellige måter. F.eks. kan disse polypeptidene indusere veksten av T-celler og mastceller, enten i kultur eller in vivo. Mastceller er som tidligere angitt, viktige kilder for heparin, histaminer, prostaglandiner og andre fysiologisk viktige stoffer. Likeledes kan vekstfaktorene anvendes til å stimulere B- og T-celler, særlig de som er kjent for å utskille proteiner (f.eks. lymfokiner og immunglobuliner) som virker i immunsystemet. Typisk vil faktorene bli inkorporert i kultur-medium tilsatt cellekulturer. En egnet konsentrasjon av faktorene vil variere avhengig av cellelinjetypen, men vil generelt være til stede i ca. 0,1 ug/ml til ca. 1 mg/ml, helst ca. 1 ug/ml til ca. 10 ug/ml, i kulturer. Bruken av vekstfaktorene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan eliminere behovet for å benytte mateceller for å opprettholde de ønskede cellelinjer, noe som resulterer i vesentlige økninger i renheten til produktene fra cellelinjen.

Polypeptidene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse vil også finne anvendelse in vivo ved behandlingen av forskjellige immunmangler, eller for å øke den naturlige immunrespons. F.eks. kan slike polypeptidpreparater hjelpe til i behandlingen eller forhindringen av infeksjon ved å stimulere modningen og/eller veksten av B-celler, T-celler og mastceller, og derved redusere dyrets mottakelighet for infeksjon.

I. De novo fremstilling av IL- 4- cDNA

Flere fremgangsmåter er nå tilgjengelige for de novo fremstilling og kloning av cDNA-er, og for konstruksjon av cDNA-biblioteker: f.eks. er nyere oversikter gitt av Doherty, "Cloning and Expression of cDNA", kapittel 10 i Gottesman, red., Molecular Cell Genetics (John Wiley & Sons, New York, 1985) og Brandis et al., "Preparation of cDNA Libraries and the Detection of Specific Gene Sequences", i Setlow et al., redv Genetic Engineering, vol. 8, s. 299-316 (Plenum Press, New York, 1986).

Som et eksempel ekstraheres total mRNA (f.eks. som rapportert av Berger, S. et al., Biochemistry _18: 5143-5149

(1979)) fra celler (f.eks. en ikke-transformert human T-celle-kilde) som danner polypeptider som utviser den ønskede aktivitet. De dobbeltkjedede cDNA-er fra denne total-mRNA kan konstrueres ved å bruker primer-initiert revers-trans-

kripsjon (Verme, I., Biochem. Biophys. Acta, vol. 473,

s. 1-38 (1977)) for først å lage komplementet til hver mRNA-sekvens, og deretter ved å starte opp syntese av den andre kjede (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 2251-2266

(1981)). Deretter kan cDNA-er klones ved å binde dem til egnede plasmid- eller bakteriofagvektorer (Rougeon, F. et al., Nucleic Acids Res., 2, 2365-2378 (1975)) eller Scherer, G. et al., Dev. Biol. 8_6, 438-447 (1981)) gjennom komplementære homopolymere haler (Efstratiadis, A. et al., Cell, 10, 571-585 (1977)) eller sammenhengende ender dannet med koblersegmenter som inneholder passende restriksjonsseter (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1982), og deretter transformere en egnet vert. (Se generelt Efstratiadis, A., og Villa-Kormaroff, L., "Cloning of double stranded cDNA" i Setlow, J. og Hollaender, A. (red.), Genetic Engineering, vol. 1, Plenum Publishing Corp., N.Y., U.S.A. (1982)).

En foretrukket mRNA-kilde som koder for de ønskede polypeptider, er celler med supernatanter som inneholder de stimulerende aktiviteter for B-cellen, T-cellen og/eller mastcellene, eller andre aktiviteter forbundet med polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen. En slik linje er mus-T-cellelinje Cl.Lyl"'"2~/9 (A.T.C.C. deponeringsnummer CRL8179) (Nabel, G. et al., Nature, 291: 332-334 (1981)). Generelt kan egnede T-celler fås fra en rekke forskjellige kilder, slik som pattefMEm*itt (f .eks. human) , mandler og perifert blod. T-celle-kloner, slik som de som isoleres fra T-lymfocytter fra perifert blod, kan også brukes (se Research Monographs in Immunology, red. von Doehmer, H. og Haaf, V.; Section D: "Human T-Cell Clones", vol. 8, ;s. 243-333; Elsevier Science Publishers, N.Y. (1985)). ;Fremstilling av mRNA-er som er i stand til å kode for IL-4 ved hjelp av slike celler, kan bekreftes ved mikro-injeksjon av den ekstraherte mRNA i oocytter fra Xenopus laevis. Denne mikroinjeksjonsteknikk er beskrevet mer fullstendig nedenunder og er generelt beskrevet i Colman et al., "Export of Proteins from Oocytes of Xenopus Laevis", Cell, vol. 17, s. 517-526 (1979) og Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, s. 350-352 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). ;Dersom mRNA-ene som koder for en ønsket IL-4 utgjør en svært liten del av den totale mRNA, kan det være nødvendig med trinn for å anrike fraksjonskonsentrasjonen for å gjøre screeningfremgangsmåten praktisk for påvisning av cDNA-kloner av interesse. Slike fremgangsmåter er standard innen teknikken og er beskrevet i eksemplene nedenunder og i flere papirer og litteraturhenvisninger, slik som Maniatis et al., s. 225-228, sitert ovenfor; Suggs et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 78, s. 6613-6617 (1981); Parnes et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 78, s. 2253-2257 (1981) og Davis et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 81, s. 2194-2198 (1984). ;En foretrukket fremgangsmåte for de novo fremstilling av IL-4-cDNA-er beror på funksjonell ekspresjon av cDNA-ene i pcD-ekspresjonssystem utviklet av Okayama og Berg, beskrevet i Mol. Cell. Biol., vol. 2, s. 161-170 (1982) og vol. 3, s. 280-289 (1983), og tilgjengelig fra Pharmacia (Piscataway, N.J.). pcD-ekspresjonsvektoren inneholder den første SV40-promoter, det siste sammenknytningspunktet og opprinnelsesstedet for replikasjon. Denne vektoren til-later ekspresjon av cDNA-innskudd i COS 7 apeceller som gir T-antigen for replikasjon av pcD-plasmidet. Screening av cDNA-biblioteker omfatter transfeksjon av blandinger av plasmid-DNA til COS 7 celler ved å bruke DEAE-dextran. Ettersom lymfokiner, og særlig IL-4, er utskilte proteiner, kan supernatantene fra de transfiserte celler analyseres med hensyn på biologisk aktivitet etter inkubasjon i flere dager. Positive blandinger oppdeles videre for å identifisere enkeltstående cDNA-kloner som gir biologisk aktivitet etter transfeksjon. ;I korte trekk konstrueres ekspresjonsvektoren til Okayama og Berg på følgende måte. Polyadenylert mRNA bindes til en polydeoxythymidylsyre-hale (oligo dT) festet til den fremstikkende kjede i et Kpnl-oppløst pBR322-plasmid som inneholder det første SV40-promoterområde. Dvs. at hele vektoren tjener som en primer for cDNA-syntese. Etter cDNA-syntese festes 3<1->polydeoxycytidylat-haler (oligo dC) , etterfulgt av Hindlll-oppløsning som skjærer av (i et unikt Hindlll-sete) et fragment av SV40-DNA som en av oligo dC-halene festes til. Den første SV40-promoter forblir intakt, og tilfeldig opptredende Hindlll-seter i innskuddet påvirkes minimalt ettersom den hybride cDNA/RNA er resistent mot Hindlll-oppløsning. Et separat konstruert HindIII-fragment med en 3'-polyguanidylert (oligo dG) hale bindes til den klebrige ende etter Hindlll-oppløsningen. Vektoren gjøres ringformet og behandles med E. coli RNase H, DNA-polymerase I og DNA-ligase for å erstatte RNA-kjeden med DNA. Vektorene klones i E. coli slik at det dannes et cDNA-bibliotek. SV40-elementene gjør det mulig for vektorene å bli uttrykt i eucaryote celler likeså vel som i procaryote celler, og særlig i pattedyrceller, slik som COS 7 apeceller eller eggstokkceller fra kinesisk hamster (CHO). ;Så snart cDNA-biblioteket i Okayama/Berg-plasmid-vektoren er blitt fullført, samles cDNA-klonene, og tilfeldige blandinger kontrolleres med hensyn på tilstedeværelsen av de ønskede cDNA-er ved hjelp av standardfremgangsmåter, f.eks. hybridseleksjon, påvisning av antigendetermin-anter på uttrykte produkter og/eller funksjonsanalyser. Positive blandinger kan deretter gjennomsøkes med en cDNA fra en indusert T-cellelinje. Deretter deles de positive, gjennomsøkte blandinger opp i individuelle kloner som testes ytterligere ved hjelp av transfeksjon i en egnet vert (slik som en pattedyrcellekultur), og vertsupernatanten analyseres med hensyn på aktivitet. II. Fremstilling av IL- 4- cDNA- er via hybridiserings-søkere avledet fra cDNA- er som her er beskrevet cDNA-ene som her er beskrevet, kan brukes som søkere for å identifisere homologe sekvenser i forskjellige celletyper, som et alternativ til de novo isolering og kloning av de IL-4-kodende nucleotider. Standardteknikker anvendes, ;f.eks. Beltz et al., "Isolation of Multigene Families and ;Détermination of Homologies by Filter Hybridization Methods", ;Methods in Enzymology, vol. 100, s. 266-285 (1983) og Callahan et al., "Detection and Cloning of Human DNA ;Sequences Related to the Mouse Mammary Tumor Virus Genome", Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 79, s. 5503-5507 (1982). I hovedtrekk brukes cDNA-ene til å konstruere søkere (ved å bruke standardteknikker, se f.eks. Maniatis et al. ovenfor) for screening ved lave hybridiser-ingsstrengheter, av genom- eller cDNA-biblioteker (igjen konstruert ved hjelp av standardteknikker) av en celletype som mistenkes for å danne IL-4. Det anvendes standard screeningsfremgangsmåter, f.eks. Grunstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 72, s. 3961-3965 (1975) eller Benton et al., Science, vol. 196, s. 180-183 (1977). ;Som beskrevet mer fullstendig nedenunder, ble human IL-4 isolert ved hjelp av en murin IL-4-søker. Etterfølgende analyse indikerte ca. 70% homologi mellom utvalgte områder av de humane og mus-cDNA-ene. På bakgrunn av den evolusjons-messige avstand mellom mus og mennesker antas det at de fleste, om ikke alle, pattedyr-IL-4-gener lar seg påvise ved hjelp av søkere konstruert fra én eller flere cDNA-er ifølge oppfinnelsen: Wilson et al., "Biochemical Evolution", Ann. Rev. Biochem., vol. 46, s. 573-639 (1977); Kimura, "The Neutral Theory of Molecular Evolution", kapittel 11 i Nei og Koehn, red., Evolution of Genes and Proteins (Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1983). ;III. Fremstilling av mutante IL- 4- er ved protein-oppbyqqing ;Når først informasjon om nucleinsyresekvens og/eller aminosyresekvens er tilgjengelig for et naturlig forekommende protein, blir en rekke teknikker tilgjengelige for å fremstille praktisk talt hvilken som helst mutasjon i den naturlig forekommende sekvens. Shortle, i Science, vol. 229, s. 1193-1201 (1985), gir en oversikt over teknikker for mutering av nucleinsyrer som er anvendbare for foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis fremstilles mutanter av de naturlig forekommende IL-4-er, dvs. IL-4-muteiner, ved hjelp av stedspesifikk oligonucleotid-rettet mutagenese, se f.eks. Zoller og Smith, Methods in Enzymology, vol. 100, ;s. 468-500 (1983); Mark et al., U.S. patentskrift nr. ;4 518 584 med tittel "Human Recombinant Interleukin-2 Muteins"; eller ved såkalt "kassett" mutagenese beskrevet av Wells et al., i Gene, vol. 34, s. 315-323 (1985) og Estell et al., Science, vol. 233, s. 659-663 (1986). I avsnittene nedenunder er tegnsystemet brukt av Estell et al. (referert til ovenfor) for å identifisere muteiner fulgt og general-isert. F.eks. angir "human IL-4 mutein Leu^" (eller 8 2 ;ganske enkelt "Leu " dersom det naturlig forekommende protein forstås ut fra sammenhengen) et polypeptid med aminosyresekvens som er identisk med sekvensen til det naturlig forekommende protein bortsett fra stilling 82 i forhold til N-enden. I den stillingen er Phe blitt erstattet med Leu. Mer enn én substitusjon kan angis på samme måte, f.eks. henvises et mutein hvor Phe er byttet ut med Leu i stilling 8 2 og Asn er byttet ut med Asp i stilling 111, til som human IL-4 mutein (Leu 82 , Asp 111). Fjerninger angis ved hjelp av "A-er". F.eks. refereres et mutein som mangler Gin i still-71 ;ing 71, til som human IL-4 mutein A.. Et innskudd angis ved hjelp av "IS(Xaa)". F.eks. refereres et mutein med en Leu innskutt eller Gin i stilling 71 til som human IL-4 mutein IS 71 (Leu). Således utgjør human IL-4 mutein (Ser 13, ;71 94 ;A. / IS (Gly)) den naturlig forekommende humane IL-4-sekvens som er blitt modifisert ved å bytte ut Thr med Ser i stilling 13, fjerne Gin i stilling 71 og innskyte Gly umiddelbart etter Ala i stilling 94. Innskudd av flere aminosyrer på det samme sted angis ved IS<1>(Xaa^-Xaa2~Xaag-...), hvor Xaa^-Xaa2~Xaa2••• er sekvensen innskutt etter stilling i. N-terminal-addisjoner angis ved hjelp av indeks "0", f.eks. IS°(Xaa), og en sekvens av fjerninger, f.eks. av aminosyrene r ir, w o. x. A6-10 , , (£ J A8 A9 10. 6-10, betegnes enten som A eller som IA r A , A , A , A )• ;Helst anvendes kassett-mutagenese til å frembringe humane IL-4-muteiner. Som mer fullstendig beskrevet nedenunder, er et syntetisk, humant IL-4-gen blitt konstruert med en sekvens av entydige restriksjonsendonucleaseseter omtrent jevnt fordelt langs genet. Entydigheten til restriksjons-setene bør beholdes når genet innføres i en passende vektor slik at segmenter av genet på høvelig måte kan fjernes og erstattes med syntetiske oligonucleotider (dvs. "kassetter") som koder for ønskede muteiner. ;Bestemmelse av antallet og fordelingen av entydige restriksjonsseter medfører bedømmelse av flere faktorer, deriblant (1) restriksjonsseter som foreligger på forhånd i ekspresjonsvektoren, (2) hvorvidt bruk av artsspesifikk eller slektsspesifikk kodon er ønsket, og (3) fordelen og påliteligheten ved å syntetisere og/eller sekvensere seg-mentene mellom de entydige restriksjonsseter. IV. Biologiske egenskaper og analyse med hensyn på IL- 4-aktivitet ;Pattedyr-IL-4 defineres ved hjelp av biologiske virkninger og/eller homologi med de beskrevne utførelsesformer. Pattedyr-IL-4 ;omfatter proteiner og muteiner (av de beskrevne naturlig forekommende polypeptider) som er homologe med de beskrevne naturlig forekommende polypeptider, og som utviser både BCGF-aktivitet og TCGF-aktivitet. Pattedyr-IL-4 ;defineres alternativt ved sine biologiske virkninger (definert mer fullstendig nedenunder) som omfatter BCGF-aktivitet og TCGF-aktivitet (som her er henvist til som IL-4-aktivitet), samt minst én eller flere aktiviteter valgt fra gruppen av aktiviteter bestående av MHC-antigen-induksjonaktivitet, Fc-epsilon-reseptor-induksjonsaktivitet, GM-CSF-stimulert granulocyttkolonivekstpotensierende aktivitet, interleukin-2-TCGF-potensierende aktivitet og IgG^-og IgE-induksjonsaktivitet. ;Det antas at IL-4 er artsspesifikke med hensyn til sine virkninger. Dvs. f.eks. at human IL-4 utviser TCGF-aktivitet slik den analyseres ved hjelp av humane T-celle-linjer, men ikke slik den analyseres ved hjelp av murine T-cellelinjer. Og omvendt utviser murin IL-4 TCGF-aktivitet slik den analyseres ved hjelp av murine T-cellelinjer, men ikke slik den analyseres ved hjelp av humane T-cellelinjer. ;A. TCGF-aktivitet ;Flere standardanalyser er blitt beskrevet for TCGF-aktivitet, f.eks. Devos et al., Nucleic Acids Research, ;vol. 11, s. 4307-4323 (1983); Thurman et al., J. Biol. Response Modifiers, vol. 5, s. 85-107 (1986) og Robert-Guroff et al., kapittel 9 i Guroff, red., Growth and Maturation Factors (John Wiley, New York, 1984). Generelt er TCGF-analyser basert på en faktors evne til å fremme celledelingen av perifere T-lymfocytter eller IL-2-avhengige T-cellelinjer, f.eks. Gillis et al., J. Immunol., vol. 120, s. 2027 (1978). Celledelingen kan bestemmes ved hjelp av standardteknikker, f.eks. inkorporering av tritiert thymidin, eller ved hjelp av kolorimetriske metoder, Mosmann, ;J. Immunol. Meth., vol. 65, s. 55-63 (1983). ;Som et eksempel kan human TCGF-aktivitet analyseres ved hjelp av følgende trinn: (1) vaskede, humane lymfocytter fra perifert blod (ca. 2 x IO<5> i 50 mikroliter) som på forhånd er stimulert med fytohemagglutinin (PHA) i 7 dager og deretter dyrket i 7 dager med IL-2, tilsettes til en mikro-titerbrønn; (2) fortynninger (50 mikroliter) av det TCGF-holdige materiale tilsettes til hver brønn; (3) lymfocyttene inkuberes i 72 timer ved 37°C; (4) tritiert thymidin ;(ca. 20 mikroliter, 20 mikrocurie/ml) tilsettes til hver brønn; og (5) celler innhøstes på filtrerpapirstrimler, vaskes og telles i en scintillasjonsteller. ;Som beskrevet mer fullstendig i eksemplene, har visse former av IL-4 evne til å potensiere TCGF-aktivitet til IL-2. "Potensiering" slik det her er brukt ved henvisning til slik aktivitet, betyr at det maksimale celledelings-nivå i et TCGF-analysesystem forårsaket av IL-2, økes ved tilsetning av IL-4. ;B. BCGF-aktivitet ;BCGF-aktivitet bestemmes ved hjelp av en analyse be- ;skrevet av Howard et al., J. Exp. Med., vol. 155, ;s. 914-923 (1982). En generell oversikt over analyser med hensyn på BCGF er gitt av Howard og Paul, i Ann. Rev. Immunol., vol. 1, s. 307-333 (1983). I korte trekk måles BCGF-aktivitet ved hjelp av den grad hvorved rensede, hvilende B-celler stimuleres til å dele seg i nærvær av en submitogen konsentrasjon av anti-IgM eller lignende antigen. Som et eksempel kan analyse av human BCGF-aktivitet utføres ved hjelp av følgende trinn: Anrikede B-cellepopulasjoner erholdes fra perifert blod, milt, mandler eller andre standardkilder ved hjelp av "Ficoll7Hypaque<®>densitetsgradientsentrifugering (f.eks. Pharmacia) og to omganger med rosettdannelse med 2-amino-ethylisothiouroniumbromid-behandlede erythrocytter fra sau for å eliminere T-celler. Slike B-cellepreparater bør inneholde mer enn 95% overflate-Ig<+->celler og mer enn 95% celler som er positive for human B-cellespesifikt antigen, slik det bestemmes ved hjelp av det anti-humane B-celle-spesifikke monoklonale antistoff Bl som er tilgjengelig fra Coulter (Hialeah, FL). T-celle-forurensning bør være mindre enn 1% bestemt ved farging med anti-Leu-1 monoklonale antistoffer (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) eller OKT 11 antistoffer (Ortho Diagnostics, Westwood, MA). 3 milliliter ;5 ;kulturer av slike B-lymfocytter (ca. 5 x 10 pr. ml i Yssels medium, Yssel et al., J. Immunol. Meth., vol. 65, ;s. 55-63 (1984)), aktiveres enten med Staphylococcus aureus stamme Cowan I (SAC) (f.eks. 0,01% oppløsning av SAC, som er tilgjengelig fra Calbiochem under varemerket Pansorbin®, eller som kan fremstilles som beskrevet av Falkoff et al., J. Immunol., vol. 129, s. 97-102 (1982)) eller med anti-IgM-antistoffer (f.eks. BRL, Gaithersburg, MD) koplet til kuler, f.eks. 5 mikrogram/ml "Immunobeads" som er tilgjengelig fra Bio-Rad (Richmond, CA). B-cellene dyrkes enten i 24 timer (i tilfellet med SAC) eller 72 timer (for anti-IgM-kuler) og renses deretter på nytt ved hjelp av "FicoliyHypaque-densitetsentrifugering for å fjerne SAC-partikler, kuler, ikke-levedyktige celler og lignende. B-celledelingen måles ved å plate ut ca. 5 x 10 4 B-lymfocytter ;i 50 mikroliter medium i 0,2 ml flatbunnede mikrotiter-brønner. Forskjellige fortynninger av materialene som mistenkes for å ha BCGF-aktivitet, tilsettes i et sluttvolum på 50 mikroliter. Inkorporering av tritiert thymidin bestemmes etter 48 timer (anti-IgM-kulturer) eller 72 timer (SAC-kulturer). Lignende analyser er også beskrevet av Muraguchi et al., J. Immunol., vol. 129, s. 1104-1108 (1982) og Yoshizaki et al., J. Immunol., vol. 128, s. 1296-1301 ;(1981). ;C. MHC-antigeninduksjon ;Det er blitt påvist at IL-4 kan indusere ekspresjon av MHC-antigener (f.eks. Ia i mus) i forskjellige celletyper i immunsystemet, særlig B-celler. Roehm et al., i J. Exp. Med., vol. 160, s. 679-694, fremla bevis for at en faktor som utviser BCGF-aktivitet, også var i stand til å indusere ekspresjon av MHC-antigener hos normale, hvilende B-celler. Analyser med hensyn på MHC-antigeninduksjon er generaliser-inger av analysene med hensyn på murine B-celler som frem-lagt i den litteraturhenvisningen. I korte trekk eksponeres immunsystemceller mot IL-4, og ekspresjon av partikkel-formede MHC-antigener på cellenes overflater bestemmes så ved hjelp av merkede antistoffer som er spesifikke for antigenet. Induksjonsgraden bestemmes ved sammenligning av de induserte celler med kontroller. Flere forskjellige antistoffer kan anvendes for hvilken som helst bestemt art. Fra ATCC er det tilgjengelig flere hybridomer som produserer monoklonale anti-MHC-antigen-antistoffer, og flere er tilgjengelige kommersielt (f.eks. anti-HLA-DR produsert av hybridomer under ATCC deponeringsnummere HB103, HB109, ;b cl ;HB110 eller HB151; anti-I-A ' produsert av hybridom under ATCC deponeringsnummer HB35; anti-HLA-DR L243 tilgjengelig fra Becton Dickinson (Mountain View, CA), eller lignende). Det kan være påkrevet med visse rutineforsøk for å tilpasse analysen til en bestemt art, og for å optimalisere betingelser for å gi de mest følsomme utlesninger av MHC-antigen-nivåer. For den humane MHC-antigen-induksjonsanalyse kan rensede B-celler fremstilles som beskrevet ovenfor, eller ved hjelp av lignende teknikker. Alternativt kan MHC-induksjon analyseres på urensede preparater av miltceller. Antistoffmerkede celler påvises fortrinnsvis ved hjelp av strømningscytometri, f.eks. på et instrument av type Becton Dickinson FACS eller lignende. ;D. MCGF-aktivitet ;Det antas at IL-4 generelt utviser MCGF-aktivitet. På grunn av mangel på passende analyseteknikker er imidlertid MCGF-aktivitet bare blitt påvist for IL-4 fra gnagere. Murine IL-4 MCGF-analyser er basert på celledelingen av faktoravhengige, murine mast- eller basofilcellelinjer. Særlig kan MCGF-aktivitet analyseres med den murine mastcellelinje MC/9 som er deponert ved ATCC under deponeringsnummer CRL 8306 og er beskrevet i US patentskrift nr. ;4 559 310 og i Nabel et al., Cell, vol. 23, s. 19 (1981). Murine MCGF-analyser er også beskrevet av Ihle et al., i ;J. Immunol., vol. 127, s. 794 (1981). ;MCGF-aktivitet bestemmes fortrinnsvis ved hjelp av den kolorimetriske analyse til Mosmann (henvist til ovenfor) ved bruk av MC/9-celler. I korte trekk dyrkes MC/9-celler i flatbunnede Falcon mikrotiterbrett (10 4 celler/brønn) i Dulbeccos modifiserte medium supplert med 4% kalvefosterserum, 50 uM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamin, ikke-essensielle aminosyrer, essensielle vitaminer og varierende konsentrasjoner av testsupernatanter i et sluttvolum på ;0,1 ml. 50 mikrogram 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (Sigma) i 10 ul fosfatbufret salt-oppløsning ble tilsatt til hver cellekultur etter 20 timer med inkubasjon. 4 timer senere ble 0,1 ml 0,04 M HC1 i isopropanol tilsatt for å oppløseliggjøre det fargede forma-zan-reaksjonsprodukt. Absorbansen ved 570 nm (referanse 630 nm) måles på en Dynatek Microelisa Autoreader (MR580) eller lignende instrument. ;E. Fc-epsilon-reseptorinduksjon. ;Det er oppdaget at IL-4 induserer Fc-epsiloneks-presjon på B-celler og på T-celler, men særlig på humane B-celler stimulert med anti-IgM-antistoffer, eller lignende antigen. Det er også blitt oppdaget at gamma-interferon spesifikt inhiberer IL-4-indusert Fc-epsilon-ekspresjon på B-celler. ;Analysen med hensyn på Fc-epsilon-reseptorinduksjon skjer til å begynne med fortrinnsvis på samme måte som ved BCGF-analysen. Dvs. at det erholdes rensede B-celler som deretter stimuleres med anti-IgM-antistoff (eller lignende antigen) og eksponeres mot IL-4. Til slutt analyseres cellene med hensyn på Fc-epsilon-reseptorer. ;Flere analyser er tilgjengelige for å kvantifisere Fc-epsilon-reseptorer på celleoverflater, f.eks. Yodoi og Ishizaka, J. Immunol., vol. 122, s. 2577-2583 (1979); ;Hudak et al., J. Immunol. Meth., vol. 84, s. 11-24 (1985) og Bonnefoy et al., J. Immunol. Meth., vol. 88, s. 25-32 (1986). Fc-epsilon-reseptorer kan særlig måles ved hjelp av strøm-ningscytometri med merkede monoklonale antistoffer som er spesifikke for reseptorene, f.eks. ved å bruke et Becton Dickinson FACS-IV eller lignende instrument. Fc-epsilon-reseptorspesifikke, monoklonale antistoffer kan konstrueres ved å bruke konvensjonelle teknikker. ;F. IgG^- og IgE-induksjon. ;IL-4 induserer utskillelsen av IgE- og IgG-^-isotyper i lipopolysaccharid-aktiverte (LPS) B-celler, se f.eks. Coffman et al., J. Immunol., vol. 136, s. 4538-4541 (1986) og Sideras et al., Eur. J. Immunol., vol. 15, s. 586-593 ;(1985) . Disse aktivitetene kan måles ved hjelp av standard immunologiske analyser for antistoffisotype, slik'som beskrevet av Coffman et al., J. Immunol., vol. 136, s. 949-954 ;(1986) . I korte trekk LPS-aktiveres B-celler ved å dyrke dem sammen med f.eks. ca. 4 mikrogram/ml av Salmonella typhimurium LPS (tilgjengelig fra Sigma) eller ca. 50 mikrogram/ml LPS ekstrahert fra E. coli 055 (som beskrevet av Sideras et al., se ovenfor). Etter 4-8 dagers dyrking innhøstes supernatanter for analysering. Standard isotype-spesifikke analyser av ELISA-type kan brukes til å måle de forskjellige isotypekonsentrasjoner. Anti-isotype-antistoffer for analysen er tilgjengelige kommersielt eller kan fås fra ATCC. ;G. Aktivitet av kolonistimulerende faktor (CSF). ;For å bestemme CSF-aktivitet opparbeides hemopoiet-iske celler, f.eks. benmargceller eller blodceller fra navlestreng, i en enkel cellesuspensjon. De enkelte celler "immobiliseres" så i et halvfast (agar) eller viskøst (methylcellulose) medium som inneholder næringsstoffer og vanligvis kalvefosterserum. I nærvær av en passende stimul-eringsfaktor vil enkelte celler dele seg og differensiere. Ettersom de første cellene er immobiliserte, utvikles kolonier etter hvert som cellene deler seg og modnes. Disse koloniene kan måles etter 7-14 dager, Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, s. 52-55, Academic Press, New York ;(1984). (For spesifikk anvendelse på veksten av granulocytter og makrofager, se Bradely, T. og Metcalf, D., Aust. ;J. Exp. Biol. Med. Sei., vol. 44, s. 287-300 (1966), og se generelt Metcalf, D., Hemopoietic Colonies, Springer-Verlag, Berlin (1977)). Om ønsket, kan individuelle kolonier ekstraheres, plasseres på mikroskopobjektglass, fikseres og farges med Wright/Geimsa (Todd-Sanford, Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, 15. utgave, red. Davidson og Henry (1974)). Deretter kan morfologisk analyse av celletyper som er til stede i hver enkelt koloni, utføres. ;Benmargceller samlet inn fra pasienter med ikke-hematologisk sykdom, legges over "Ficoll" (type 400, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), sentrifugeres (2.000 opm, ;20 min.), og cellene i grenseflaten fjernes. Disse cellene vaskes to ganger i Iscove's Modified Dulbecco's Medium inneholdende 10% kalvefosterserum (FCS), resuspenderes i det samme medium, og de vedhengende celler fjernes ved festing til petriskåler av plast. De ikke-vedhengende celler til-føres ved 10^ celler/ml til Iscoves medium som inneholder 20% FCS, 50 uM 2-mercaptoethanol, 0,9% methylcellulose og varierende konsentrasjoner av enten supernatanter som er kjent for å inneholde kolonistimulerende aktivitet, eller testsupernatanter. l ml aliquoter plates ut i 35 mm petriskåler og dyrkes ved 3 7°C i en fuktighetsmettet atmosfære med 6% C02 i luft. Tre dager etter oppstarting av dyrkingen tilsettes 1 enhet erythropoietin til hver plate. Granulo-cytt-makrofag-kolonier og erythroid-utbrudd måles etter 10-14 dager ved å bruke et invertert mikroskop. ;Blodceller fra navlestreng samlet opp i heparin, sentrifugeres ved 2.000 opm i 6 minutter. De hvite blod-cellene i grenseflaten mellom plasmaet og toppen av røde blodceller overføres til et rør som inneholder 0,17 N ammonium-klorid og 6% FCS. Etter 5 minutter på is underlegges sus-pensjonen med 4 ml FCS og sentrifugeres i 6 minutter ved 2.000 opm. Cellepelleten vaskes med Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning og sendes gjennom Ficoll-trinnet og trinnet med festing til plast slik som beskrevet ovenfor for benmargceller. De ikke-vedhengende celler med lav densitet samles opp og plasseres ved 10 celler/kultur i det halvfaste dyrk-ningsmedium som beskrevet ovenfor. ;Ved slutten av analysene bestemmes den cellulære sammensetning etter påføring av de enkelte kolonier på objektglass og farging med Wright-Giemsa. Eosinofiler bestemmes ved å farge med Luxol Fast Blue (Johnson, G. og Metcalf, D. , Exp. Hema to 1. , vol. 8, s. 549-561 (1980)}. ;"Potensiering", slik det her er brukt ved henvisning til GM-CSF-stimulert granulocyttvekst, betyr at granulocytt-koloniene i analysene beskrevet ovenfor, er større .. når GM-CSF brukes sammen med IL-4, enn når GM-CSF brukes alene for å stimulere kolonivekst. ;V. Rensing og farmasøytiske preparater ;Polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen ;uttrykt i E. coli, i gjær eller i andre celler, kan renses i henhold til standardfremgangsmåter innen teknikken, deri- ;blant ammoniumsulfatutfelling, fraksjonert kolonnekromato-grafi, (f.eks. ionebytting, gelfiltrering, elektroforese, affinitetskromatografi, etc.) og til sist krystallisering (se generelt "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 2_2:233-577 (1977), og Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)). Når de først er renset, delvis eller til ensartethet, kan polypeptidene ;brukes til forskningsformål, f.eks. som et supplement til cellevekstmedier (f.eks. minimum essensielt medium Eagle, "Iscove's modified Dulbecco Medium" eller RPMI 1640; tilgjengelig fra Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) og GIBCO Division (Chagrin Falls, OH)) og som et antigent stoff for frembringelse av spesifikke immunglobuliner som kan brukes i immunologiske analyser, immunologiske fluores-censfarginger, etc. (Se generelt Immunological Methods, ;vol. I & II, red. Lefkovits, I. og Pernis, B., Academic Press, New York, N.Y. (1979 & 1981); og Handbook of Experimental Immunology, red. Weir, D., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO (1978)). ;Polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan ;også brukes i farmasøytiske preparater, f.eks. for å øke naturlig forsvar mot forskjellige infeksjoner. Således kan pasienter med reumatoid arthritis og med behov for et trans-plantat, eller med immunsvikt forårsaket av kreft-kjemoterapi, fremskreden alder, immunundertrykkende midler, etc, behandles med slike polypeptider. Preparatene kan selektivt stimulere forskjellige bestanddeler i immunsystemet, enten alene eller sammen med andre midler som er velkjente for fagfolk innen teknikken. Særlig kan preparatene omfatte andre immun-reaktive mdiler, slik som lymfokiner (f.eks. IL-1, IL-2, etc), hvilke som helst av de kolonistimulerende faktorer, immunglobuliner, etc, med henblikk på de forsterkende virkninger av polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Polypeptidene vil også finne anvendelse i situasjoner (in vivo eller in vitro) hvor det er ønsket forøkt celledeling eller immunglobulinproduksjon. ;Farmasøytiske preparater kan fremstilles ved å blande disse polypeptidene med fortrinnsvis inerte, farmasøytisk akseptable bærere. Egnede bærere og fremgangsmåter for fremstilling av disse, er velkjente innen teknikken (se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)). Den foretrukne administrasjons-vei er parenteral og kan omfatte bruk av mekaniske avlever-ingssystemer. ;Det farmasøytiske preparat foreligger fortrinnsvis i enhetsdoseform, idet hver enhet inneholder en passende mengde av den aktive bestanddel. Mengden av aktiv forbindelse i en enhetsdose av preparatet kan variere eller justeres fra 1 ug til 100 mg, alt etter den bestemte anvendelse og styrken til den aktive bestanddel. Preparatet kan, om ønsket, også inneholde andre terapeutiske midler. ;Dosene kan varieres avhengig av pasientens behov, alvorligheten av tilstanden som behandles og den bestemte forbindelse som anvendes. Uttrykket "effektiv mengde" er, slik det her er brukt, ment å ta i betraktning disse faktorer når doser vurderes. Bestemmelse av den korrekte dose for en bestemt situasjon ligger innenfor ferdighetene innen teknikken. Generelt startes behandling opp med mindre doser som er mindre enn den optimale dose av forbindelsen. Deretter økes dosen med små mengder inntil den optimale virkning under de rådende omstendigheter nås. Av bekvemme-lighetshensyn kan den samlede daglige dose deles opp og administreres i porsjoner i løpet av dagen. ;VI. Ekspresjonssystemer ;En lang rekke ekspresjonssystemer (dvs. vert-vektor-kombinasjoner) kan brukes for å fremstille polypeptidene ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Mulige typer vertceller omfatter, men er ikke begrenset til, celler fra bakterier, gjær, insekter, pattedyr og lignende. Optimaliser-ing av ekspresjonen av et bestemt protein eller mutein avhenger av mange faktorer, deriblant (1) egenskapene til proteinet eller muteinet som skal uttrykkes, f.eks. kan det uttrykte produkt være giftig for noen vertsystemer, (2) hvorvidt, og hvilken type av, post-tranlasjonelle modifikasjoner er ønsket, f.eks. kan utstrekningen og typen av glycosylering påvirke valget av vert, (3) egenskapene til de 5<*-> og 3<1->områder som flankerer det kodende område for proteinet eller muteinet av interesse, f.eks. er utvelgelse av promoterer og/eller sekvenser som er involvert i reguleringen av translasjon, av avgjørende betydning for effektiv ekspresjon, (4) hvorvidt det søkes forbigående eller stabil ekspresjon, (5) lettheten hvorved det uttrykte produkt kan skilles fra proteinene og andre materialer i vertcellene og/eller dyrkningsmediet, (6) lettheten og effektiviteten av transfeksjon av verter som forbigående uttrykker det aktuelle protein eller mutein, (7) størrelsen på cellekultur som anvendes for å uttrykke det aktuelle protein eller mutein, (8) hvorvidt det aktuelle protein eller mutein uttrykkes fusjonert til et fragment av protein som er endogent for verten, og lignende faktorer.

Generelt er prokaryoter foretrukket for kloning av DNA-sekvensene ifølge oppfinnelsen. Generelle retningslinjer for realisering av prokaryote ekspresjonssystemer er gitt av Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982); Perbal,

A Practical Guide to Molecular Cloning (John Wiley & Sons, N.Y., 1984); Glover, DNA Cloning: A Practical Approach,

vol. I og II (IRL Press, Oxford, 1985) og de Boer et al., "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", i Genes: Structure and Expression, Kroon, red. (John Wiley & Sons, N.Y., 1983). F.eks. er E. coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) særlig brukbar. Andre mikrobe-stammer som kan brukes, omfatter E. coli-stammer, slik som E. coli B og E. coli X1776 (ATCC nr. 31537). Disse eksemplene er selvfølgelig ment å være illustrerende og ikke begrensende.

Prokaryoter kan også brukes for ekspresjon. De tidligere nevnte stammer samt E. coli W3110 (Fs , ^ , prototrof, ATCC nr. 27325) , bacillus-arter, slik som Bacillus sub-tilis, og andre enterobacteriaceae slik som Salmonella typhimurium eller Serratia marcesans, og forskjellige pseudomonas-arter, kan brukes.

Vanligvis brukes plasmidvektorer som inneholder replikon- og kontrollsekvenser som er avledet fra arter som er forenlige med vertcellen, i tilknytning til disse vertene. Vektoren har vanligvis et replikasjonssete samt markørsek-venser som er i stand til å gi fenotypeseleksjon i transformerte celler. F.eks. transformeres E. coli ofte ved å bruke pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene, vol. 2, s. 95 (1977)). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyclinresistens og gir således lettvinte midler for å identifisere transformerte celler. pBR322-plasmidet eller annet mikrobeplasmid må også inneholde, eller modifiseres til å inneholde, promoterer som kan brukes av mikrobeorganismen for ekspresjon av dens egne proteiner.

De promoterer som er vanligst brukt i rekombinant DNA-konstruksjon, omfatter (3-lactamase- (penicillinase) og lactose-promotersystemer (Chang et al, Nature, vol. 275, s. 615

(1978); Itakura et al., Science, vol. 198, s. 1056 (1977); Goeddel et al., Nature, vol. 281, s. 544 (1979)) og et tryptofan(trp)promotersystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., vol. 8, s. 4057 (1980); EPO-søknad med publikasjonsnr. 0036776). Selv om disse er de mest vanlig brukte, er det oppdaget og brukt andre mikrobielle promoterer, og detaljer vedrørende deres nucleotidsekvenser er blitt publisert, noe som gjør det mulig for en erfaren forsker å ligere dem funksjonelt med plasmidvektorer (Siebenlist et al., Cell, vol. 20, s. 269 (1980)).

I tillegg til prokaryoter kan også eukaryote mikrober, slik som gjærkulturer, brukes. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er den mest vanlig brukte blant eukaryote mikroorganismer. For ekspresjon i Saccharomyces er et vanlig brukt plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, vol. 282, s. 39 (1979); Kingsman et al., Gene, vol. 7,

s. 141 (1979); Tschemper et al., Gene, vol. 10, s. 157

(1980)). Dette plasmid inneholder allerede trpl-genet som

gir en seleksjonsmarkør for en mutantstamme av gjær som mangler evne til vekst i tryptofan, f.eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, vol. 85, s. 12 (1977)). Tilstedeværelsen av trpl-skaden som et kjennetegn for gjær-vertcellegenomet gir så et effektivt miljø for påvisning av transformasjon ved dyrking i fravær av tryptofan.

Egnede promotersekvenser i gjærvektorer omfatter promoterene for 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al.,

J. Biol. Chem., vol. 255, s. 2073 (1980)) eller andre glyco-lyttiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., vol. 7, s. 149 (1968); Holland et al., Biochemistry, voi. 17,

s. 4900 (1978)), slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, fosfofructo-kinase, glucose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglucoseisomerase og glucokinase. Ved konstruksjon av egnede ekspresjons-plasmider ligeres også termineringssekvensene som er forbundet med disse genene, i ekspresjonsvektoren i en stilling 3' i sekvensen som skal uttrykkes, hvorved man får poly-adenylering av mRNA og terminering. Andre promoterer som har den ytterligere fordel ved transkripsjon kontrollert av dyrkningsbetingelser, er promoterområdene for alkohol-dehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, nedbrytnings-1 enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme, den tidligere nevnte glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, og enzymer som er ansvarlige for maltose- og galactoseutnyttelse (Holland, ibid.). Enhver plasmidvektor som inneholder en gjærforenlig promoter, et opprinnelsessted for replikasjon og termineringssekvenser, er egnet.

I tillegg til mikroorganismer kan også kulturer av celler avledet fra flercellede organismer, brukes som verter. Prinsipielt er enhver slik cellekultur brukbar, uansett om den skriver seg fra et hvirveldyr eller ikke. Interessen for hvirveldyrceller har imidlertid vært størst, og deling av hvirveldyrceller i kultur (vevskultur) er blitt en rutinefremgangsmåte i de senere år (Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, red. (1973)). Eksempler på slike anvendbare vertcellelinjer er VERO-og HeLa-celler, eggstokkcellelinjer fra kinesisk hamster (CHO) og W138-, BHK-, C0S7-, musmyelom- (ATCC nr. TIB 19 eller TIB 20) og MDCK-cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler omfatter vanligvis (om nødvendig) et opprinnelsessted for replikasjon og en promoter som befinner seg foran genet som skal uttrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindende seter, RNA-sammenknytningsseter, polyadenylerings-sete og transkripsjonsterminatorsekvenser.

For bruk i pattedyrceller tilveiebringes kontroll-funksjonene på ekspresjonsvektorene ofte ved hjelp av virus-materiale. F.eks. avledes vanlig brukte promoterer fra polyoma, Adenovirus 2, og oftest fra apevirus 40 (SV40).

Den første og siste promoter i SV40-virus er særlig anvend-bar fordi begge fås lett fra viruset som et fragment som også inneholder SV40-virusopprinnelsesstedet for replikasjon (Fiers et al., Nature, vol. 273, s. 113 (1978)). Det kan også brukes mindre eller større SV40-fragmenter forutsatt at den omtrent 250 bp store sekvensen som strekker seg fra Hindlll-setet mot Bgll-setet som befinner seg i virusopp-rinnelsesstedet for replikasjon, er inkludert. Videre er det også mulig, og ofte ønskelig, å benytte promoter- eller kontrollsekvenser som vanligvis er forbundet med den ønskede gensekvens, forutsatt at slike kontrollsekvenser er forenlige med vertcellesystemene.

Et opprinnelsessted for replikasjon kan tilveiebringes enten ved hjelp av et exogent opprinnelsessted på vektoren, f.eks. på en avledet fra SV40- eller annen virus-kilde (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV, etc), eller endogent ved hjelp av vertcellens kromosomale replikasjonsmekanisme. Det er ofte tilstrekkelig å integrere vektoren i celle-kromosomet.

Ved utvelgelse av en foretrukken vertcelle for transfeksjon ved hjelp av vektorene ifølge oppfinnelsen, som omfatter DNA-sekvenser som koder for både tPA og DHFR-protein, er det passende å velge verten etter den type av DHFR-protein som anvendes. Dersom villtype DHFR-protein anvendes, er det foretrukket å velge en vertcelle som mangler DHFR, og derved muliggjøre bruken av den DHFR-kodende sekvens som en markør for vellykket transfeksjon i selektivt medium som mangler hypoxanthin, glycin og thymidin. En slik passende vertcelle er ovariecellelinje fra kinesisk hamster (CHO) som mangler DHFR-aktivitet, fremstilt og formert som beskrevet av Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), vol. 77,

s. 4216 (1980).

På den annen side er det, dersom DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for MTX brukes som kontrollsekvens, ikke nødvendig å bruke DHFR-resistente celler. Ettersom den mutante DHFR er resistent overfor methotrexat, kan MTX-holdige medier brukes som et middel for seleksjon forutsatt at vertcellene i seg selv er methotrexat-følsomme. De fleste eukaryote celler som er i stand til å absorbere MTX, synes å være methotrexat-følsomme. En slik brukbar cellelinje er en CHO-cellelinje, CH0-K1 ATCC nr. CCL 61.

Ekspresjonssystemer fra hvirvelløse dyr omfatter larve av silkeorm, Bombyx mori, infisert med en baculovirus-vektor, BmNPV, beskrevet av Maeda et al. i Nature, vol. 315, s. 892-894 (1985) og i Saibo Koguku, vol. 4, s. 767-779

(1985) .

Eksempler

De følgende eksempler tjener til å illustrere foreliggende oppfinnelse.

Materialer og metoder

T-cellelinjene Cl.Lyl<+>2~/9 (referert til som Cl.l), Nabel, Gv Greenberger, J.S. Sakakeeny, M.A. og Cantor, H.

(1981), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 18, 1157-1161, og GK15-1 (levert av M. Giedlin, DNAX Research Institute of Molecular and Cellular Biology, Inc.; DNAX) ble resuspendert ved 5 x IO<5> celler/ml i RPMI 1640, 50 um 2ME, 1% FCS og 2 um/ml Con A i 24 timer. Supernatantene ble samlet sammen og

lagret ved -70°C.

En klonet mastcellelinje, MC/9 (Nabel, G., Galli, S.J., Dvorak, H.F.og Cantor, H. (1981), Nature 291, 332-334), ble erholdt fra G. Nabel (Dana Farber Cancer Institute; DFCI). Mastcellelinjene MM3 (levert av R. Coffman, DNAX) og Dx-2 (avledet av D. Rennick, DNAX) var karakterisert ved fravær av myelomonocytt-assosierte markører og ved tilstedeværelse av IgE-reseptorer og histaminnivåer som var større enn 250 ng/10 celler. Den myeloide NFS-60-cellelinje ble levert av J. Ihle (Frederick Cancer Research Facility; FCRF). NFS-60-cellelinjen ble subklonet, hvorved man fikk en IL-3-avhengig klon. T-cellelinjen HT2 ble erholdt fra S. Strober (Stan-ford University, Palo Alto, CA); CTLL-2 ble levert av W. Farrar (FCRF); og Ly 23/4 ble levert av G. Nabel (DFCI). Mastcellen og T-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640, 10%

FCS, 50 uM 2ME levert med rekombinant IL-3 eller IL-2.

Histaminnivåer hos flere IL-3-avhengige cellelinjer ble analysert ved å bruke fremgangsmåten til Shore, P.A., Burkhalter, A., og Conn., V.H. (1959), J. Pharm. Exp. Ther. 127, 182-186. T-celle- og mastcelle-vekstfaktoraktiviteter ble bestemt ved inkorporering av [ 3H]-thymidin eller ved hjelp av en kolorimetrisk analyse som beskrevet av Mosmann, T., i J. Immunol. Methods, 65: 55-63 (1983).

IL-3 renset fra WEHI 3 supernatant, var en gave fra J. Ihle (FCRF). Rekombinant IL-2, IL-3, GM-CSF og INF-7

ble benyttet i form av supernatant fra COS 7 apenyreceller transfisert med de tilsvarende cDNA-kloner. En enhet av IL-2, IL-3 eller GM-CSF ble definert som den mengde faktor som stimulerte 50% av maksimal inkorporering av [ 3H]-thymidin i faktoravhengige cellelinjer (Rennick, D. et al. (1985),

J. Immunol. 134: 910-919). En enhet av IFN-t beskytter 50% av murine L-celler fra den cytopatiske virkning av vesikulært stomatitisvirus (Schreiber, R. et al. (1982), J. Exp. Med. 156: 677-689) .

B-celler ble fremstilt fra en enkel cellesuspensjon av musmiltceller ved fjerning av T-celler og makrofager i henhold til standardfremgangsmåter (Howard, M. et al.,

J. Exp. Med. 155: 914 (1982)). Den rensede faktor som her er beskrevet, ble vurdert med hensyn på sin evne til å indusere Ia-ekspresjon på B-celler under anvendelse av cyto-fluorometrisk analyse, og til å stimulere B-celledeling ved å bruke en anti-Ig-co-stimuleringsanalyse som beskrevet av Roehm, N. et al., J. Exp. Med. 160: 679.

Proteinbestemmelser var basert enten på UV-absorpsjon (280 nm eller 220 nm) eller på standardkurver konstruert ved å bruke en fargestoffbindende analyse (Bradford, M. (1976), Annal. Biochem. _72: 248-254) . Supernatanter ble først konsentrert 20 ganger med en Pellicon kassett-enhet (Millipore, Bedford, MA), eller (etter reversfase-kromatografi) ved opp-løsningsmiddelinndamping i en"Speedvac"(Savant, Farmingdale, NY). SDS-PAGE ble utført ved å bruke Laemmli-systemet (Laemmli, U. (1970) Nature, 227: 680-685) med en 12% separa-sjonsgel. Markørproteiner var Pharmacia-standarder for lav molekylvekt (Pharmacia, Uppsala, Sverige). Geler ble sølv-farget som beskrevet av Merril, C. et al. (1981), Science, 211: 1437-1438. For å bestemme MCGF- og TCGF-aktivitet direkte som en funksjon av molekylvekt, ble prøver med eller uten forutgående reduksjon med 50 mM DTT elektroforesebehandlet, gelene ble skåret opp i 1 mm snitt og knust, og protein ble eluert over natten ved 4°C til 0,5 ml analyse-mediet supplert med 5 mg/ml ovalbumin (Sigma, St. Louis,

MO) .

Kromatografi ble utført ved 18°C på et Pharmacia FPLC-system utstyrt med en Kratos Spectroflow 7 73 UV-detektor (Kratos, Ramsey, NJ). Ved kationbytterkromatografi ble det anvendt en Pharmacia "Mono S"-kolonne (0,5 x 5 cm) ekvilibrert med 50 mM natriumfosfat, 1 mM EDTA, pH 7,0. Supernatanter i den samme buffer ble tilført kolonnen og eluert med en NaCl-gradient til IM. For reversfase-kromatografi ble det brukt en Pharmacia C8-kolonne (0,5 x 2 cm). Prøven fortynnet med 0,1% TFA til pH 2, ble fylt på kolonnen og eluert med acetonitrilgradienter som inneholdt 0,1% TFA.

Isoelektriske punkter for MCGF- og TCGF-aktivitetene ble beregnet ved kromatofokusering på en Pharmacia "Mono P"-kolonne (0,5 x 20 cm). Prøven i 0,025 M bis-tris, pH 7,1, ble fylt på "Mono P"-kolonnen ekvilibrert med den samme buffer. Gradienteluering ble utført med Pharmacia Polybuffer 74, pH 4,0 (1:10 fortynning, pH regulert med 0,2 M aminodieddiksyre). pH i avløpet ble kontinuerlig bestemt med en Pharmacia pH-monitor. Før injeksjoner ble alle prøver filtrert gjennom en "Millex" GV 0,2 u enhet (Millipore).

Fraksjoner fra SDS-PAGE eller kromatograferinger ble analysert med hensyn på sin evne til å understøtte celle-deling hos tre cellelinjer, NFS-60 (IL-3), MC/9 (MCGF) og

HT2 (TCGF).

For rensing av denne faktor til ensartethet ble

8 liter Con-A-aktivert Cl.1-supernatant dialysert i 20 mM Hepes-buffer, pH 7,0, og deretter sendt over en Pharmacia "Mono S" 10/10 kationbytterkolonne ekvilibrert med den samme buffer. Toppaktivitet eluerte med en lineær saltgradient ved 0,2 M NaCl. Dette materiale ble slått sammen, oppkonsentrert, re-dialysert i 20 mM Hepes-buffer, pH 7,0, og fylt på en Heparin-Sepharose<®->kolonne ekvilibrert med den samme buffer. Toppaktivitet eluerte ved 0,45 M NaCl med en lineær gradient til 2 M NaCl. Dette materiale ble slått sammen, fortynnet 10 x med 0,10/TFA/H20, pH 2, og fraksjonert på en "Vydac" reversfasekolonne (c4). Anvendelse av en linær gradient med acetonitril, 0,1% TFA, utløste aktiviteten ved 42% acetonitril.

Eksempel 1. de novo fremstilling av murine IL- 4- cDNA- er fra Cl. Ly1— 2 / 9- celler og forbigående ekspresjon i COS 7 apeceller

cDNA-kloner som koder for IL-4, ble isolert fra den murine hjelper-T-cellelinje Cl.Lyl<+>2~/9 som er deponert ved ATCC under deponeringsnummer CRL 8179 og er beskrevet av Nabel et al., i Cell, vol. 23, s. 19-28 (1981), og i Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 78, s. 1157-1161 (1981). Andre murine celler som er kjent for å danne BCGF-aktivitet, omfatter

EL-4-linjen, tilgjengelig fra ATCC under deponeringsnummer TIB 39. De fremgangsmåter som er brukt i dette eksempel,

er blitt beskrevet i Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 2061-2065 (1986). I korte trekk ble et pcD-cDNA-bibliotek konstruert med budbærer-RNA (mRNA) fra concanavalin A (ConA)-induserte Cl.Lyl<+>2~/9-celler ved å følge fremgangsmåten til Okayama og Berg beskrevet ovenfor. IL-3-og GM-CSF-kloner ble fjernet fra et stort underbibliotek av

32 tilfeldig utvalgte kloner ved hybridisering med p-merkede cDNA-søkere. Blandinger og/eller enkeltstående kloner fra det gjenværende av underbiblioteket ble undersøkt med hensyn på IL-4-cDNA ved å transfisere COS 7 apeceller og teste kultursupernatanter med hensyn på MCGF- og TCGF-aktivitet.

A. Induksjon av IL-4-dannelse.

Cl.Lyl<+>2 /9-celler ble indusert til å danne IL-4-mRNA ved hjelp av ConA på følgende måte. Cellene ble dyrket ved 5 x 10<5>/ml i "Dulbecco's Modified Éagle's medium" (DME)

-5

med 4% varme-maktivert kalvefosterserum, 5 x 10 M 2-mercaptoethanol (2-ME), 2 mM glutamin, ikke-essensielle aminosyrer, essensielle vitaminer og 2 ug/ml ConA. Etter 12-14 timers inkubasjon ved 37°C i 10% C02, ble cellesuspen-sjonen sentrifugert ved 1500 opm i 10 minutter. Cellepelleten ble samlet opp pg øyeblikkelig frosset ved -70°C.

B. Isolering av mRNA

Total cellulær DNA ble isolert fra celler ved å bruke guanidinisothiocyanat-fremgangsmåten til Chirgwin, J. et al., (Biochemistry, 18: 5294-5299 (1979)). Frosne cellepellets fra ConA-indusert Cl.Lyl 2~/9-celler (12 timer etter stimulering) ble oppslemmet i guanidinisothiocyanatlyse-oppløs-ning. 20 ml lyseoppløsning ble brukt til 1,5 x 10 g celler. Pellets ble på nytt oppslemmet ved pipettering, og deretter ble DNA fordelt ved 4 passeringer gjennom en sprøyte ved å bruke en nål med kaliber 16. Lysatet ble lagt på toppen av 20 ml 5,7 M CsCl, 10 mM EDTA i 40 ml polyallomer-sentrifuge-rør. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 25.000 opm i en

Beckman SW28-sentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) i 40 timer ved 15°C. Guanidinisothiocyanat-

fasen som inneholdt DNA, ble pipettert bort fra toppen, ned til grenseflaten. Veggene i røret og grenseflaten ble vasket med 2-3 ml guanidinisothiocyanatlyse-oppløsning.

Røret ble kuttet under grenseflaten med saks, og CsCl-oppløs-ningen ble fradekantert. RNA-pellets ble vasket to ganger med kald 70% ethanol. Pellets ble deretter resuspendert i 500 ul 10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% SDS. 50 yl 3 M natriumacetat ble tilsatt, og RNA ble utfelt med 1 ml ethanol. Ca. 0,3 mg total RNA ble samlet opp ved sentrifugering og pelleten vasket en gang med kald ethanol.

Vasket og tørket total RNA-pellet ble resuspendert

i 900 yl oligo (dT)-elueringsbuffer (10 mM Tris.HCl, pH 7,4,

1 mM EDTA, 0,5% SDS). RNA ble varmet opp i 3 minutter ved 68°C og deretter avkjølt på is. 100 ul 5 M NaCl ble tilsatt. RNA-prøven ble fylt på en 1,0 ml oligo (dT)-cellulose-kolonne (Type 3, Collaborative Research, Waltham, MA) ekvilibrert med bindingsbuffer (10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,5% SDS). Det som strømmet gjennom kolonnen, ble sendt over kolonnen ytterligere to ganger. Kolonnen ble så vasket med 20 ml bindingsbuffer. PolyA<+>

mRNA ble samlet opp ved å vaske med elueringsbuffer. RNA eluerte vanligvis i de to første ml av elueringsbufferen.

RNA ble utfelt med 0,1 volumdel 3 M natriumacetat (pH 6) og to volumdeler ethanol. RNA-pelleten ble samlet opp ved sentrifugering, vasket to ganger med kald ethanol og tørket. Pelleten ble så resuspendert i vann. Aliquoter ble fortynnet, og absorbans ved 260 nm ble bestemt.

C. Konstruksjon av pcD-cDNA-bibliotek

1) Fremstilling av vektorprimer og oligo(dG)-forlengede kobler-DNA-er

Fremgangsmåten til Okayama & Berg (Mol. & Cell. Biol., vol. 2, s. 161-170 (1982)) ble brukt med bare mindre modifikasjoner. pcDVl- og pLl-plasmidene er beskrevet av Okayama & Berg (Mol. & Cell. Biol., 3_: 380-389 (1983)) og er tilgjengelige fra Pharmacia (Piscataway, N.J.). Nærmere bestemt ble det brukt et modifisert pcDVl-plasmid som inneholdt et Nsil-sete i den tidligere beliggenheten til Kpnl-setet.

En 80 ug prøve av pcDVl-DNA ble oppløst ved 30°C med 20 enheter Kpnl-endonuclease i en reaksjonsblanding av 450 ul som inneholdt 6 mM Tris.HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 6 mM 2-ME og 0,1 mg bovint serumalbumin (BSA) pr. ml. Etter 16 timer ble oppløsningen avsluttet med 40 pl 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 20 ul 10% natriumdodecylsulfat (SDS); DNA-en ble utvunnet etter ekstraksjon med vannmettet 1:1 fenol/CHCl-j (heretter henvist til som fenol/CHCl^) og deretter ved utfelling med ethanol. Homopolymerhaler med gjennomsnittlig 60, men ikke mer enn 80, deoxythymidylat (dT)-rester pr. ende ble tilsatt til de Nsil-endonuclease-genererte ender med terminaltransferase fra kalvethymus på følgende måte: Reaksjonsblandingen (38 yl) inneholdt natriumcacodylat, 30 mM Tris.HCl pH 6,8 som buffer, sammen med 1 mM CoCl2, 0,1 mM dithiothreitol, 0,25 mM dTTP, den Nsil-endonucleaseoppløste DNA og 68 enheter av den terminale deoxynucleotidyltransferase (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI). Etter 30 minutter ved 3 7°C ble reaksjonen stanset med 20 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 10 ul 10% SDS, og DNA-en ble utvunnet etter flere ekstraksjoner med fenol/CHCl^ ved ethanolutfelling. DNA-en ble så oppløst med 15 enheter EcoRI-endonuclease i 50 ul som inneholdt 10 mM Tris.HCl

pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol og 0,1 mg BSA pr. ml i 5 timer ved 37°C. Det største fragment som inneholdt SV40-polyadenyleringssetet og pBR322-opprinnelsesstedet for replikasjon og ampicillin-resistensgenet, ble renset ved hjelp av gelelektroforese på agarose (1%) og utvunnet fra gelen ved en modifikasjon av glasspulvermetoden (Vogelstein, B. & Gillespie, D., Proe. Nati. Acad. Sei., 7_6_: 615-619

(1979)). Den dT-forlengede DNA ble ytterligere renset ved absorpsjon og eluering fra en oligo (dA)-cellulosekolonne på følgende måte: DNA-en ble oppløst i 1 ml 10 mM Tris.HCl pH 7,3 buffer som inneholdt 1 mM EDTA og 1 M NaCl, avkjølt til 0°C og tilført en oligo (dA)-cellulosekolonne (0,6 ved 2,5 cm) ekvilibrert med den samme buffer ved 0°C og eluert med vann ved værelsetemperatur. Den eluerte DNA ble utfelt med ethanol og oppløst i 10 mM Tris.HCl pH 7,3 med 1 mM

EDTA.

Den oligo (dG)-forlengede, koblede DNA ble fremstilt ved oppløsning av 75 ug pLl-DNA med 20 enheter Pstl-ende-nuclease i 450 ul som inneholdt 6 mM Tris.HCl pH 7,4, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-ME, 50 mM NaCl og 0,01 mg BSA pr. ml. Etter 16 timer ved 30°C ble reaksjonsblandingen ekstrahert med fenol/CHCl^, og DNA-en ble utfelt med alkohol. Haler med 10-15 deoxyguanylat (dG)-rester ble deretter tilsatt pr.

ende med 46 enheter terminal deoxynucleotidyltransferase i den samme reaksjonsblanding (38 ul) som beskrevet ovenfor, bortsett fra at 0,1 mM dGTP erstattet dTTP. Etter 20 minutter ved 37°C ble blandingen ekstrahert med fenol/CHCl^,

og etter at DNA-en var utfelt med ethanol, ble den oppløst med 35 enheter Hindlll-endonuclease i 50 ul som inneholdt 20 mM Tris.HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 60 mM NaCl og 0,1 mg BSA ved 37°C i 4 timer. Den lille oligo (dG)-forlengede kobler-DNA ble renset ved elektroforese på agarosegel (1,8%) og utvunnet som beskrevet ovenfor.

2) cDNA-bibliotekfremstilling:

Trinn 1: cDNA-syntese. Reaksjonsblandingen (10 yl) som inneholdt 50 mM Tris.HCl pH 8,3, 8 mM MgCl2, 30 mM KC1, 0,3 mM dithiothreitol, 2 mM hver av dATP, dTTP, dGTP og dCTP, 20 uCi <32>P-dCTP (3000 Ci/mmol), 3 ug polyA<+> RNA fra Con-A induserte T-celler, 60 enheter "RNasi<n>"(et varemerke for ribonucleaseinhibitor fra Promega Biotec, Inc., Madison, WI), og 2 ug av vektor-primer-DNA (15 pmol primer-ende), og 45 enheter reverse trankriptase. Reaksjonen ble inkubert i 60 minutter ved 42°C og deretter stanset ved tilsetning av 1 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 0,5 ul 10% SDS; 40 yl fenol/CHCl3 ble tilsatt, og oppløsningen ble blandet kraftig i en Vortex-blander og deretter sentrifugert. 40 yl 4 M ammoniumacetat og 160 yl ethanol ble tilsatt til vannfasen, og oppløsningen ble avkjølt med tørris i 15 minutter, varmet opp til værelsetemperatur med forsiktig rysting for å opp-løse ikke-omsatte deoxynucleosidtrifosfater som var utfelt under avkjølingen, og sentrifugert i 10 minutter i en Eppendorf mikrosentrifuge. Pelleten ble oppløst i 10 ul 10 mM Tris.HCl pH 7,3 og 1 mM EDTA, blandet med 10 pl 4 M ammoniumacetat og på nytt utfelt med 40 ul ethanol, en fremgangsmåte som fjerner mer enn 99% av ikke-omsatt deoxy-nucleotidtrifosfater. Pelleten ble skylt med ethanol. Trinn 2: Oligodeoxycytidylat [oligo (dC)]-tilsetning. Pelleten som inneholdt plasmid-cDNArmRNA, ble oppløst i 20 ul 140 mM natriumcacodylat, 30 mM Tris.HCL pH 6,8 buffer som inneholdt 1 mM CoC^, 0,1 mM dithiothreitol, 0,2 ug poly (A), 70 uM dCTP, 5 yCi <32>P-dCTP, 3000 Ci/mmol og 60 enheter terminal deoxynucleotidyltransferase. Reaksjonen ble utført ved 37°C i 5 minutter for å muliggjøre tilsetningen av 10-15 rester dCMP pr. ende og deretter avsluttet ved 2 yl 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 1 yl 10% SDS. Etter ekstraksjon med 20 yl fenol-CHCl^ ble vannfasen blandet med 20 yl 4 M ammoniumacetat, DNA-en ble utfelt og på nytt utfelt med

80 yl ethanol, og sluttpelleten ble skylt med ethanol.

Trinn 3: Hindlll-endonucleaseopplØsning. Pelleten ble oppløst i 30 yl buffer som inneholdt 20 mM Tris.HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 60 mM NaCl og 0,1 mg BSA pr. ml og deretter oppløst med 10 enheter Hindlll-endonuclease i 2 timer ved 37°C. Reaksjonen ble avsluttet med 3 yl 0,25 M EDTA (pH 8,0) og 1,5 yl 10% SDS, og, etter ekstraksjon med fenol/CHCl-j etterfulgt av tilsetning av 30 yl 4 M ammoniumacetat, ble DNA-en utfelt med 120 yl ethanol. Pelleten ble skylt med ethanol og deretter oppløst i 10 yl 10 mM

Tris.HCl (pH 7,3) og 1 mM EDTA, og 3 yl ethanol ble tilsatt for å forhindre frysing under lagring ved -20°C.

Trinn 4: Ringslutning formidlet ved hjelp av den olido (dG)-forlengede kobler-DNA. En 9 yl prøve av det Hindlll-endonuclease-oppløste oligo (dC)-forlengede cDNA: mRNA - plasmid (ca. 90% av prøven) ble inkubert i en blanding

(90 yl) som inneholdt 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA,

0,1 M NaCl og 1,8 pmol av den oligo (dG)-forlengede kobler-DNA ved 65°C i 5 minutter, endret til 42°C i 60 minutter

og deretter avkjølt til 0°C. Blandingen (90 yl) ble regulert til et volum på 900 ul som inneholdt 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 4 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 0,1 M KC1, 50 ug BSA pr. ml og 0,1 mM (3-NAD; 6 ug E. coli DNA-ligase ble tilsatt, og oppløsningen ble deretter inkubert over natten ved 12°C.

Trinn 5: Erstatning av RNA-kjede med DNA. For å erstatte RNA-kjeden i innskuddet ble ligeringsblandingen regulert slik at den inneholdt 40 uM av hver av de fire deoxynucleosidtrifosfåtene, 0,15 mM p-NAD, 4 ug ytterligere E. coli DNA-ligase, 16 enheter E. coli DNA-polymerase I (Poll) og 9 enheter E. coli RNase H. Denne blanding (960 ul) ble inkubert i rekkefølge ved 12°C og ved værelsetemperatur, 1 time hver gang, for å fremme optimal repara-sjonssyntese og "nick"-translasjon ved Poll.

Trinn 6: Transformasjon av E. coli.

Transformasjon ble utført ved å bruke mindre modifikasjoner av fremgangsmåten beskrevet av Cohen et al. (Proe. Nat.

Acad. Sei. U.S.A., 69: 2110-2114 (1972)). E. coli K-12 stamme MC1061 (Casadaban, M. og Cohen, S., J. Mol. Biol.

138: 179-207 (1980)) ble dyrket til 0,5 absorbansenhet ved 600 nm ved 37°C i 300 ml L-næringsvæske. Cellene ble samlet opp ved sentrifugé^fing og oppslemmet i 30 ml 10 mM Pipes (pH 7), 60 mM CaCl2, 15% glycerol og sentrifugert ved 0°C i 5 minutter. Cellene ble på nytt oppslemmet i 24 ml av den ovenfor nevnte buffer og inkubert på nytt ved 0°C i 5 minutter; deretter ble 1,0 ml aliquoter av cellesuspen-sjonene blandet med 0,1 ml av DNA-oppløsningen (trinn 5) og inkubert ved 0°C i 20 minutter. Deretter ble cellene holdt ved 42°C i 2 minutter og så ved væreIsetemperatur i 10 minutter; deretter ble 1 liter L-næringsvæske tilsatt, og kulturen ble inkubert ved 37°C i 60 minutter. Ampicillin ble tilsatt inntil en konsentrasjon på 50 ug/ml. Kulturen ble rystet i ytterligere 10 timer ved 3 7°C. Fortynninger av denne kultur ble spredt ut på L-næringsagar som inneholdt 50 ug/ml ampicillin. Etter inkubasjon ved 37°C i 12-24 timer ble individuelle kolonier plukket opp med sterile tann-stikkere. Totalt ble omtrent 1 x 10 5uavhengige cDNA-kloner generert.

D. Screening av pcD-biblioteket.

10 4 enkeltkloner ble tilfeldig utplukket fra T-celle-cDNA-biblioteket og formert hver for seg i brønner i mikro-titerplater som inneholdt 200 ul L-næringsvæske med 50 ug/ml ampicillin og 7% dimethylsulfoxyd. For å fokusere bare på den nye MCGF-aktivitet, ble 53 IL-3-cDNA-kloner og 1 GM-CSF-cDNA-klon identifisert ved hybridisering med de 32 passende P-merkede cDNA-søkere konstruert fra klonene beskrevet av Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 82, s. 4360-4364 (1985) og av Yokota et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 81, s. 1070-1074 (1984), og ble fjernet. Denne fremgangsmåte ble utført på følgende måte: Hver plate med 96 kulturer ble replikert over på nitrocellulosefiltre for hybridiseringsscreening. Hybridiseringer ble utført i 6XSSPE (1XSSPE = 180 mM NaCl; 10 mM natriumfosfat, pH 7,4; 1 mm EDTA), 0,1% SDS, 100 ug/ml E. coli tRNA, 50% formamid, i 16 timer ved 42°C. Hybridiseringskloner ble identifisert ved autoradiografi av det vaskede filter. Disse klonene ble fjernet ved sterilisering av mikrotiterbrønnene som inneholdt disse klonene, med ethanol før fremstilling av klonblandinger. Blandinger som inneholdt opptil 48 cDNA-kloner, ble fremstilt fra mikrotiterkulturene. 200 slike blandinger ble dyrket opp i 1 liter kulturer av L-næringsvæske inneholdende 100 ug/ml ampicillin. Plasmid-DNA ble isolert fra hver kultur og renset ved sammenslutning to ganger gjennom CsCl-gradienter. Den DNA som representerte hver blanding, ble transfisert inn i COS 7 apeceller på følgende måte. (COS 7 celler er beskrevet av Gluzman i Cell, vol. 23, s. 175-180 (1981), og er tilgjengelige fra ATCC under deponeringsnummer CRL 1651).

En dag før transfeksjon ble omtrent 10 COS 7 apeceller spredt ut på individuelle 100 mm plater i DME som inneholdt 10% kalvefosterserum og 2 mM glutamin. For å ut-føre transfeksjonen ble mediet sugd opp fra hver plate og erstattet med 4 ml DME som inneholdt 50 mM Tris.HCl pH 7,4, 400 ug/ml DEAE-dextran og 50 ug av plasmid-DNA-ene som skulle testes. Platene ble inkubert i 4 timer ved 37°C, deretter ble det DNA-holdige medium fjernet, og platene ble vasket to ganger med 5 ml serumfri DME. DME som inneholder 150 uM klorkin, ble tilsatt platene som så ble inkubert i ytterligere 3 timer ved 37°C. Platene ble vasket en gang med DME, og deretter ble DME inneholdende 4% kalvefosterserum, 2 mM glutamin, penicillin og streptomycin, tilsatt. Cellene ble så inkubert i 72 timer ved 37°C. Dyrkningsmediet ble samlet opp og bedømt i forskjellige biologiske analyser.

Et første sett med plasmidblandinger ble gjennomsøkt først ved å bruke celledelingsanalyser for TCGF- og MCGF-aktiviteter med hhv. HT-2-cellelinjen (beskrevet mere fullstendig nedenunder) og MC/9-cellelinjen. Blant de første 110 blandinger analysert på disse to cellelinjene, ga 8 signifikant aktivitet i HT-2-TCGF-analysen. Flere av disse blandingene hadde svak, men signifikant MCGF-aktivitet, men fordi MCGF-aktivitetene generelt var svakere og mer variable, stolte vi ikke på denne analysen for identifisering av positive blandinger.

Omtrent halvparten av COS-supernatantene fra den tilfeldige blanding av transfeksjoner ble også analysert med hensyn på Ia-induserende aktivitet på mus-B-celler. Blant blandingene som ble testet, ble hver blanding påvist å være aktiv for TCGF-aktivitet, også funnet å ha Ia-induserende aktivitet. Således var det et nøyaktig samsvar mellom TCGF-aktiviteten og den Ia-induserende aktivitet.

En blanding, 2A, som reproduserbart var den mest aktive i alle analyser, ble delt opp i 48 mindre underblandinger. To underblandinger var positive både med hensyn på MCGF- og TCGF-aktivitet. Den ene klon, 2A-E3, som var felles for begge underblandingene, ble så dyrket individuelt, og dens plasmid-DNA ble transfisert inn i COS 7 celler som beskrevet ovenfor. Den resulterende COS-supernatant ble så analysert med hensyn på tilstedeværelse av forskjellige aktiviteter, deriblant MCGF-, TCGF-, Ia-induserende og IgE-og IgG-økende aktivitet.

Et 366 basepar langt Pstl-fragment isolert fra

32

klon 2A-E3 (figur IA) og merket med P, ble brukt som en

søker for å undersøke blandinger som var blitt positive med hensyn på biologisk aktivitet, samt andre utestede blandinger. Screeningen ble utført ved hybridisering til filtere replikert med mikrortiterkulturene som beskrevet ovenfor. 9 hybridiserende kloner ble isolert og deres DNA analysert ved hjelp av restriksjonskartlegging. Alle blandinger som oppviste biologisk aktivitet, inneholdt minst én hybridiserende klon som delte et felles restriksjonsspaltingskart med klon 2A-E3. Hyppigheten av hybridiserende kloner blant de 10^ som var plukket ut, antyder en hyppighet på omtrent 0,2% i hele biblioteket. Blant de hybridiserende kloner som ble testet, uttrykte omtrent 90% et funksjonelt protein.

E. Biologiske aktiviteter i kultursupernatanter fra COS

7 apeceller transfisert med pcD-2A-E3.

Supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-2A-E3, ble testet med hensyn på TCGF-aktivitet på den murine hjelper-T-cellelinje HT-2, beskrevet av Watson i J. Exp. Med., vol. 150, s. 1510 (1979). Deling av HT-2-cellene,

som bestemt ved den kolorimetriske analyse ifølge Mosmann (henvist til ovenfor), ble brukt som et mål for TCGF-aktivitet (grad av celledeling korrelert til optisk densitet (OD) fra 570 til 630 nm). Figur 3A illustrerer de relative TCGF-aktiviteter ved forskjellige fortynninger av (i) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-2A-E3 (kurve 1), (ii) supernatant fra Cl.Lyl<+>2~/9-kulturer (kurve 2),

(iii) supernatant fra COS 7 celler transfisert med et pcD-plasmid som bærer IL-2-cDNA (kurve 3) og (iv) supernatant fra COS 7 celler transfisert med et pcD-plasmid som ikke inneholder noe cDNA-innskudd (dvs. en "falsk" transfeksjon)

(kurve 4) .

Likeledes ble supernatanter fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler testet med hensyn på MCGF-aktivitet på MC/9-celler, igjen ved å bruke den kolorimetriske analyse

til Mosmann for å måle MC/9-celledeling. Figur 3B viser relativ MCGF-aktivitet i (i) supernatent fra COS 7 celler transfisert med pcD-2A-E3 (kurve 1), (ii) supernatant fra

COS 7 celler transfisert med et pcD-plasmid som bærer IL-3-cDNA (kurve 2), (iii) supernatant fra Cl.Lyl<+>2 /9-celler (kurve 3) og (iv) supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve 4).

Figur 3C viser resultatene av en Ia-induksjonsanalyse utført på (i) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-2-E3 (kurve 1), (ii) supernatanter fra Cl.Lyl+2~/9-celler (kurve 2) og (iii) supernatanter fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve 3). Ia-induksjonsanalysen ble utført som beskrevet av Roehm et al. (se ovenfor). Flere DBA/2-mus (2-3 måneder gamle) ble ofret og miltene erholdt ved kirurgisk inngrep. Erythrocyttene ble lyst ved hjelp av hypotonisk sjokk under anvendelse av 0,87% ammonium-klorid. Deretter ble T-cellene lyst ved å bruke cyto-toksiske monoklonale antistoffer rettet mot T-celle-spesifikke overflatemarkører (Thy-1, Lyt-1 og Lyt-2) etterfulgt av inkubasjon i kaninkomplement. De døde cellene ble så fjernet ved å bruke "Ficoll"/Hypaqué®-densitetsgradienter. Vedhengende celler er blitt fjernet tidligere ved festing til plast petriskåler ved 37°C. På dette tidspunkt ble cellene vasket, tellet og bedømt med hensyn på levedyktighet. Omtrent 1 million celler ble inkubert i 0,5 ml vevkultur-medium (RPMI 1640 eller minimalt essensielt medium-MEM/ Earles salter) (Gibco) supplert med 10% kalvefosterserum, 2-mercaptoethanol og forskjellige antibiotika (penicillin, streptomycin og gentamicin). I forsøk hvor den positive kontroll besto av supernatanter fra T-celler indusert med T-celle-mitogenet Concanavalin A, ble 10 mg/ml (sluttkonsentra-sjon) av alfa-methyl-mannosid tilsatt for å nøytralisere mitogenet. Etter 24 timers inkubasjon ble cellene innhøstet

d. bel

og klargjort for farging med anti-I-A eller anti-I-A monoklonale antistoffer. Disse antistoffene ble brukt som førstetrinns antistoffer konjugert enten til haptenet N.I.P. eller biotin. Fargingen ble så fullført ved å inkubere cellene med fluoresceinerte andretrinns reagenser (enten anti-NIP-antistoffer eller avidin). Styrken på fluorescensfargingen ble så bestemt ved å bruke enten en fluorescens-

aktivert cellesorterer (Becton-Dickinson, Mountain View,

CA) eller en Cytofluorgraf (Ortho Diagnostics, Cambridge, MA). Fluorescensenheter i figur 3C er beregnet ved å multiplisere prosentandelen av positive celler i hver prøve med styrken på fluorescensfargingen.

Figur 3D viser grafisk gradene som IgE- og IgG^-dannelse induseres ved i T-celle-fjernede musmiltceller ved (i) COS 7 medium alene (søyle 1), (ii) 20% supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (søyle 2), (iii) 10% supernatant fra Cl.Lyl<+>2~/9-celler pluss 20% supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (søyle 3) og (iv) 20% supernatant fra pcD-2A-E3-transfiserte COS 7 celler (søyle 4). Nivåer av IgE og IgG^ ble bestemt ved hjelp av den iso-typespesifikke ELISA beskrevet ovenfor.

Murin IL-4 ble funnet å øke MCGF-aktiviteten til IL-3 i MC/9-celler: Smith og Rennick, Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 1857-1861 (1986). Murin IL-4 ble også funnet å øke GM-CSF-stimulert celledeling av den IL-3-avhengige cellelinje, NFS-60, beskrevet av Holmes et al., i Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 82, s. 6687-6691 (1985).

F. Strukturen til pcD-2A-E3 og nucleotidsekvens i dens cDNA-innskudd.

Strukturen til pcD-2A-E3 er illustrert i diagramform i figur 2A, og et forstørret restriksjonskart over dens innskudd er vist i figur 2B. Innskuddet ble sekvensbestemt ved å bruke både fremgangsmåten til Maxan og Gilbert (Methods in Enzymology, vol. 65, s. 499-560 (1980)) og fremgangsmåten til Sanger (Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 74,

s. 5463-5467 (1977)). Sekvensen er vist i figur IA sammen med den utledede aminosyresekvens for den lengste åpne avlesningsramme i fase med det første ATG-startkodon. Den enkle, lange, åpne avlesningsramme i mus-2A-E3-cDNA-klon består av 140 aminosyrerester. Ettersom dette lymfokin er et utskilt protein, ville en hydrofob ledersekvens forventes å komme foran sekvensen for den ferdigutviklede, utskilte form av proteinet. Analyse av hydrofobisiteten til poly-

peptidet og sammenligning med en foreslått konsensus-

sekvens for fremstillingen av signalpeptider (Perlman et al., J. Mol. Biol., vol. 167, s. 391-409 (1983)) antyder at spalting av forløper-polypeptidet ville oppstå etter serin-resten i aminosyrestilling 20 i figur IA. Grabstein et al.,

J. Exp. Med., vol. 163, s. 1405-1414 (1986), har bekreftet

at den N-terminale sekvens i utskilt murin IL-4 begynner ved stilling 21 His i figur IA.

Eksempel II. Fremstilling av human IL- 4 via en murin cDNA- søker til et humant hjelper- T- celle-cDNA- bibliotek og forbigående ekspresjon i COS 7 apeceller og mus- L- celler.

cDNA-kloner som koder for IL-4, ble isolert fra cDNA-biblioteker konstruert fra en indusert human hjelper-T-celle, 2F1, og induserte humane, perifere blodlymfocytter (PBL-er) ved hjelp av en murin cDNA-søker. Andre humane cellelinjer kjent for å danne BCGF-aktivitet, omfatter vari-anter av CEM-cellelinjen som er tilgjengelig fra ATCC under deponeringsnumrene CC1 119, CRL 8436 og TIB 195, og er beskrevet av Foley et al., i Cancer, vol. 18, s. 522-529

(19 65) og av Ligler, i Lymphokine Research, vol. 3, s. 183-191 (1984).

En human hjelper-T-celleklon, 2F1, og humane PBL-er ble dyrket i Iscoves medium supplert med 3% kalvefosterserum. 2Fl-cellene ble aktivert med ConA (10 ug/ml), og PBL-er ble stimulert med 1 ug/ml PNA i 12 timer, hvoretter ConA ble tilsatt med 5 ug/ml. Cellene ble innhøstet 4 timer (2F1) eller 10 timer (PBL-er) etter tilsetning av ConA.

mRNA-ekstraksjon og konstruksjon av cDNA-bibliotek

ble utført som beskrevet i eksempel I. Et Pstl-fragment ble isolert fra mus-pCD-2A-E3-cDNA-klonen, merket ved "nick"-translasjon (1 x 10 cpm/ug) og brukt til å søke på nitro-cellulosefiltere som inneholder plasmid-DNA-preparater fra 10 blandinger som hver utgjør omtrent 1 x 10 3 kloner fra 2Fl-cDNA-bibliotek. Det ble brukt milde hybridiserings-be tinge Iser (over natten ved 4 2°C) : 6xSSPE (lxSSPE=180 mM NaCl/LOmM natriumfosfat, pH 7,4/1 mM EDTA) (Maniatis, T. et al.,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982)), 20% (vol/vol) formamid, 0,1% natriumdodecylsulfat, gjærbærer-tRNA ved 100 ul. Filtrene ble vasket med 2 x SSPE, 0,1% natriumdodecylsulfat ved 37°C.

En enkel klon (pcD-46) ble identifisert i en av de ti blandingene. Ytterligere kloner ble erholdt ved screening av PBL-cDNA-bibliotekene med en søker konstruert fra Nhel-EcoRI-fragmentet av pcD-46 (illustrert i restriksjons-kartet i figur 2D). Analyse ved hjelp av restriksjonsenzymer indikerte at PBL-klonene var identiske i struktur med pcD-46.

Det ble oppdaget at et gunidin-rikt område i 5' - retningen, eller oppstrøms, fra det innskutte, kodende område i pcD-46 inhiberte ekspresjon av IL-4-polypeptidet. Følgelig ble innskuddet i pcD-46 reklonet for å fjerne det guanidin-rike område. Den resulterende klon betegnes pcD-125. Det ble også oppdaget at ekspresjon ble forbedret ved transfeksjon av mus-L-celler med pcD-46.

Vektor-pcD-125 ble dannet på følgende måte:

pcD-46 ble spaltet med Sau3A for å isolere et fragment som inneholder de 5' 16 2 nucleotider fra cDNA-innskuddet (som eliminerer GC-segmentet), og deretter ble fragmentet innføyd i Bglll-setet i plOl. Plasmidet plOl ble avledet fra pcD-mus-IL-3 (se Yokota, T. et al., (1984) ovenfor) og fikk fjernet sekvensen fra Pstl-setet i 5<1->enden av cDNA-en til et Bglll-sete innenfor mus-IL-3-cDNA-en. Et Bglll-sete innlemmes i tilknytningspunktet til den fjernede sekvens. Sau3A-fragmentet ble fusjonert til SV40-promoteren som i pcD-46, bortsett fra GC-segmentet. Det gjenværende av den humane cDNA ble så rekonstruert med et HindIII/NheI-fragment fra pcD-46 som bærer 3'-enden av cDNA-en, SV40-poly-A-setet og alle pBR322-sekvensene i pcD-46.

Supernatanter fra de pcD-46- og pcD-125-transfiserte COS 7- og L-celler ble analysert med hensyn på BCGF- og TCGF-aktivitet. TCGF ble analysert med en human hjelper-T-cellelinje, JL-EBV, transformert med Epstein-Barr-virus og fytohemagglutinin-stimulerte, humane, perifere blodlymfocytter.

Den humane hjelper-T-celleklon JL-EBV ble stimulert med bestrålte (4500R) celler fra en human EBV-transformert B-cellelinje og deretter oppbevart i RPMI 1640-medium inneholdende 10% humant AB-serum, 50 mikromolar 2-mercaptoethanol (2ME) og rekombinant human IL-2. Humane PBL-er ble stimulert med PHA (20 mikrogram/ml) og oppbevart i RPMI 1640 inneholdende 10% kalvefosterserum, 50 mikromolar 2ME og rekombinant human IL-2. 5 til 10 dager etter stimulering ble JL-EBV-celler eller PHA-blastceller brukt som mål i en to-dagers TCGF-analyse under anvendelse av den kolorimetriske metode til Mosmann (beskrevet ovenfor), eller i en tre-dagers TCGF-analyse under anvendelse av [ 3H]-thymidin-inkorporering.

Figur 4A viser TCGF-aktivitetene målt ved hjelp av JL-EBV-celler (kolorimetrisk analyse) til (i) supernatant

fra COS 7 celler transfisert med pcD-plasmider som uttrykker human IL-2 (kurve A) ; (ii) supernatant fra L-celler transfisert med pcD-125 (kurve B); (iii) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-125 (kurve C), (iv) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-46 (kurve D) og (v) supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve E). Figur 4B viser TCGF-aktivitetene målt ved hjelp av PHA-stimulerte PBL-er (kolorimetrisk analyse) i (i) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-plasmider som uttrykker human IL-2 (kurve A), (ii) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-125 (kurve B) og (iii) supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve C).

Figur 4C viser TCGF-aktivitetene målt ved hjelp av PHA-stimulerte PBL-er (analyse med inkorporering av tritiert thymidin) i (i) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-125 (kurve A), (ii) supernatant fra COS 7 celler transfisert med pcD-plasmider som uttrykker human IL-2 (kurve B) og (iii) supernatant fra falskt transfiserte COS 7 celler (kurve C) .

BCGF-aktivitet i forskjellige fortynninger av pcD-125-transfeksjonssupernatanter ble sammenlignet med BCGF-aktiviteten i en BCGF ("kommersiell BCGF") beskrevet av Maizel et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 79, s. 5998-6002

(1982) og kommersielt tilgjengelig fra Cytokine Technology

International (Buffalo, NY). Tabell II viser BCGF-aktivitetene i forskjellige fortynninger av COS 7 transfeksjonssupernatanter på anti-IgM-antistoff-foraktiverte B-celler. B-celler ble fremstilt som beskrevet i analyseavsnittet ovenfor .

Tabell III viser BCGF-aktivitetene i forskjellige fortynninger av COS 7 transfeksjonssupernatanter på SAC-foraktiverte B-celler (fremstilt som beskrevet ovenfor).

Selv om den fremstilte humane IL-4 og kommersiell

BCGF begge utviser BCGF-aktivitet, påviste Mehta et al., i

J. Immunol., vol. 135, s. 3298-3302 (1985), at TCGF-aktivitet kan adskilles biokjemisk fra BCGF-aktiviteten i kommersiell BCGF, noe som indikerer at aktivitetene forårsakes av forskjellige molekyler. Human IL-4 og kommersiell BCGF er således forskjellige molekyler ettersom TCGF-aktivitet ikke lar seg adskille fra BCGF-aktivitet i human IL-4 under anvendelse av standard biokjemiske fraksjoneringsteknikker.

Supernatanter fra COS 7 celler transfisert med plasmider som bærer den humane IL-4-cDNA, induserer celledelingen av normale, humane T-celler og den humane T-celleklon, JL-EBV, og aktivitet som er lik med mus-IL-4. Den maksimale utstrekning av celledeling av humane T-celler indusert som respons på human IL-4, er imidlertid ca. halvparten av den som induseres av human IL-2. Den celledelings-induserende aktivitet til IL-4 kunne ikke inhiberes ved hjelp av monoklonale antistoffer mot IL-2 eller mot IL-2-reseptoren når den ble testet. Disse resultatene antyder at IL-4 virker direkte på T-celler og ikke gjennom induksjon av IL-2, og at dens aktivitet ikke formidles ved hjelp av IL-2-reseptoren. De COS-humane IL-4-supernatanter stimulerer også celledelingen av humane B-celler som er foraktivert med optimale konsentrasjoner av anti-IgM-antistoffer koblet til kuler, og som har ytterligere celledelende kapasitet

med kommersiell BCGF ved metningsnivåene i BCGF-analysen. Dette antyder at human IL-4 og kommersiell BCGF virker på B-celler via forskjellige veier, f.eks. muligens ved hjelp av forskjellige reseptorsett. Supernatantene induserte ikke deling av B-celler som var foraktivert med SAC i noen betydelig grad, mens kommersiell BCGF renset fra supernatanter i PBL-kulturer stimulert med PHA, sterkt induserte delingen av SAC-foraktiverte humane B-celler. Disse resultatene indikerer videre at den humane IL-4-cDNA koder for en BCGF-aktivitet som er forskjellig fra den som er til stede i den kommersielle BCGF.

Supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler ble også testet med hensyn på dens evne til å indusere Fc-epsilon-reseptorer på mandel-B-celler. Humane mandelceller ble dispergert i en enkel cellesuspensjon ved å bruke standardteknikker. B-cellepopulasjonen ble anriket ved å bruke fremgangsmåten beskrevet ovenfor, og de anrikede celler ble stimulert med anti-IgM-antistoff i 24 timer i kultur-medium ved 37°C. Fc-epsilon-reseptorbærende celler ble analysert ved hjelp av en Becton Dickinson FACS IV cellesorterer under anvendelse av et fluorescensmerket, monoklonalt antistoff som er spesifikt for reseptoren, ved hjelp av teknikken beskrevet av Bonnefoy et al., i J. Immunol. Meth., vol. 88, s. 25-32 (1986). Figurene 5A-5D er histogrammer som viser cellehyppighet (ordinat) versus fluoresens-styrke (abscisse). Fluorescensstyrke er proporsjonal med antallet Fc-epsilon-reseptorer som er til stede på en celle. I alle figurene er cellene blitt stimulert med anti-IgM.

Figurene 5A - 5D tilsvarer eksponeringer mot medier som består av 0, 0,1, 1 og 10% supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler.

DNA-sekvensen til cDNA-innskuddet i klon nr. 46 ble bestemt og er vist i figur IB. cDNA-innskuddet er 615 bp langt når man ser bort fra poly(A)-enden. Det er en enkel, åpen avlesningsramme med det første ATG-kodon beliggende 64 nucleotider fra 5<1->enden etterfulgt av 153 kodoner som ender med termineringskodonet TAG i nucleotidstillingene 523-525. Det N-terminale segment i det utledede polypeptid er hydrofobt, noe som ville være å forvente av et utskilt protein.

En sammenligning mellom de kodende områder i en human og en mus-cDNA ifølge avslørte at områdene i den kodende sekvens i human cDNA i pdD-46 dekket ved aminosyrestillingene 1-90 og 129-149, er omtrent 50% homologe med de tilsvarende områder i den kodende sekvens i mus-cDNA (2A-E3). Disse områdene, og 5'- og 3'-ikke-translaterte områder, utgjør ca. 70% homologi mellom de to cDNA-sekvensene fra de forskjellige artene, mens området dekket av aminosyrene 91-128 i humanproteinet, er svært lite homologt med det tilsvarende musområde. Totalt er 6 av de 7 cysteinrestene i humanproteinet bevart i det beslektede musprotein. Det foreligger en viss aminosyresekvens-homologi mellom en naturlig forekommende form av et humant polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse og mus-IL-3. Aminosyrerestene 7-16 og 120-127 er hhv. 50% og 55% homologe med restene 16-27 og 41-49 i mus-IL-3-forløperpolypeptidet (Yokota, T. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81: 1070-1074 (1984)).

Som beskrevet mer fullstendig nedenunder, ble human IL-4 renset fra pcD-125-transfiserte COS 7 supernatanter, funnet å være polypeptidet med 129 aminosyrerester som har sekvensen som er vist i figur 1C.

Eksempel III. Forøkt ekspresjon av human IL- 4 i COS 7

apeceller ved bruk av en Epstein- Barr virus ( EBV)- avledet vektor som inneholder en RSV- LTR- promoter

En 10-20 ganger økning av human IL-4-ekspresjon ble oppnådd ved rekloning av Xhol-fragmentet i pcD-125 inn i en EBV-avledet vektor som inneholder en Rous sarcoma-virus "long-terminal repeat" (RSV-LTR)-promoter. Den EBV-avledede vektor og RSV-LTR-promoteren er beskrevet av Gorman et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 79, s. 6777-6781 (1982) og Yates et al., Nature, vol. 313, s. 812-815 (1985).

Et Hindlll/XhoI-fragment som inneholder RSV-LTR-promoteren, ble isolert fra et pcD-plasmid som tidligere var konstruert fra det RSV-LTR-inneholdende Accl/Hindlll-fragment beskrevet av Gorman et al. (se ovenfor) og en kommersielt tilgjengelig pcD-vektor (f.eks. Pharmacia). Det ovenfor nevnte HindIII/XhoI-fragment og et Hindlll/Xhol-fragment fra et pLl-plasmid (Pharmacia) som inneholder et SV40 opprinnelsessted for replikasjon (ori), føyes inn i plasmid pcDVl (tilgjengelig fra Pharmacia), idet orienter-ingen til SV40 ori-området ikke er av avgjørende betydning. Mellom et Aatll-sete og et Ndel-sete inneholder den resulterende pcD-vektor i rekkefølge (fra Aatll-setet) et SV40 ori-område, en RSV-LTR-promoter og SV40 poly A-området.

Etter at Xhol-fragmentet i pcD-125 er isolert og innføyd

i Xhol-setet i den nykonstruerte pcD-vektor, omdannes de unike Aatll- og Ndel-setene på vektoren til Sall-seter ved å bruke standardteknikker. I korte trekk oppløses pcD-vektoren med Aatll og Ndel, det IL-4-holdige fragment isoleres, og det isolerte fragment behandles med T4 DNA-polymerase i nærvær av passende konsentrasjoner av nucleosid-trifosfåtene. 5' — > 3' DNA-polymerase-aktiviteten til T4 DNA-polymerase fyller igjen de 5<1->fremstikkende ender i restriksjonskuttene, og 3'—» 5' exonuclease-aktiviteten til T4 DNA-polymerase løser opp de 3'-fremstikkende ender i restriksjonskuttene, hvorved man får et fragment med butt ende hvortil kinasebehandlede Sall-koblere (New England Biolabs) ligeres ved å bruke T4 DNA-ligase.

Det ovenfor nevnte Sall-fragment (illustrert i

figur 11) innføyes i den EBV-avledede vektor p201 beskrevet av Yates et al. (se ovenfor) i posisjonen til et unikt Clal-sete som var blitt omdannet til et Sall-sete ved å bruke standardteknikker. I korte trekk oppløses p201 (illustrert i figur 11) med Clal og behandles med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og passende konsentrasjoner av nucleosidtrifosfater. Denne fremgangsmåte fyller igjen de fremstikkende ender av Clal-kuttet og etterlater et fragment med butt ende. Deretter ligeres de butte endene til en kinasebehandlet Sall-kobler. Den resulterende EBV-avledede vektor som inneholder RSV-LTR-promoteren og human IL-4-cDNA-innskudd, henvises her til som pEBV-178.

pEBV-178 ble transfisert inn i COS 7 celler ved å bruke standardteknikker, og kultursupernatantene ble analysert med hensyn på TCGF-aktivitet som et mål på IL-4-ekspresjon.

Eksempel IV. Ekspresjon av naturlig forekommende human IL- 4 og mutein- IS0 ( Ala- Glu- Phe) i E. coli To vektorer som inneholdt human IL-4-cDNA-innskudd, ble konstruert for ekspresjon av human IL-4 i E. coli: en pIN-III-sekresjonsvektor som inneholder signalpeptidsekvensen for ompA-proteinet ("pIN-III-ompA2"), og et pUC12-plasmid som inneholder en trpP-promoter og et tilgrensende område med ribosombindende sete (RBS) ("TRPC11").

A. pIN-III-ompA2

To vektorer ble konstruert ved å bruke pIN-III-ompA2-plasmidet som er beskrevet av Ghrayeb et al., i EMBO Journal, vol. 3, s. 2437-2442 (1984) og Masui et al., i Biotechnology, vol. 2, s. 81-85 (1984).

Den første vektor betegnet pIN-III-ompA2(1), ble konstruert ved å ligere i rekkefølge, det EcoRI/BamHI-oppløste pIN-III-ompA2-plasmid, en syntetisk kobler og BamHI/EcoRV-fragmentet fra pcD-125. Den syntetiske kobler som ble brukt ved denne konstruksjonen, resulterte i ut-skillelse av et biologisk aktivt IL-4-polypeptid med de tre ekstra N-terminale aminosyrene Ala-Glu-Phe-; dvs. mutein IL<0>(Ala-Glu-Phe) ble utskilt. Den syntetiske kobler besto av følgende sekvenser med nucleotider:

EcoRI/BamHI-oppløst pIN-III-ompA2 og BamHI/EcoRV-fragmentet i pcD-125 ble blandet i en standard ligeringsopp-løsning (f.eks. Maniatis et al., se ovenfor) som inneholdt 0,1 mikromolar av den syntetiske kobler. E. coli stamme Abl899 ble infisert med pIN-III-ompA2(1)-plasmidet, og transformanter ble utvalgt ved kolonihybridisering under anvendelse av en 3 2P-merket IL-4-cDNA-søker. Humane IL-4-ekstrakter for analyse ble erholdt på følgende måte: Etter lyd-bølgebehandling ble bakteriekulturene sentrifugert og supernatanten fjernet fra pelleten. Pelleten ble behandlet med 1% SDS, 2 mM dithiothreitol og 6M guanidin. Materialet ble resentrifugert, supernatanten kastet og pelleten behandlet ved 45°C med 3% SDS og 2 mM dithiothreitol. Materialet ble på nytt sentrifugert og supernatanten analysert ved hjelp av SDS-PAGE.

pIN-III-ompA(2) ble konstruert slik at det naturlig forekommende IL-4 ville bli uttrykt. De tre aminosyre-addisjonene i pIN-III-ompA(1)-konstruksjonen ble fjernet ved stedspesifikk mutagenese av ompA-signalpeptidsekvensen i pIN-III-ompA2. Den stedspesifikke mutagenese ble utført som beskrevet av Zoller og Smith (se ovenfor). I korte trekk ble Xbal/BamHI-fragmentet i pIN-III-ompA2 som inneholdt den kodende sekvens for ompA-signalpeptidet (se fig. 1 i Ghrayeb et al., ovenfor) renset, blandet med renset Xbal/BamHI-oppløst replikasjonsform (RF) av M13mpl9, ligert, transfisert inn i E. coli K-12 JM101 og utplatet. En klar plakk i nærvær av IPTG og X-gal ble utvalgt og formert, og enkelkjedede DNA-er ble fremstilt, f.eks. i henhold til fremgangsmåtene beskrevet av Messing i Methods in Enzymology, vol. 101 (Academic Press, New York, 1983). Separat ble følgende oligonucleotidprimer (23-mer) som inneholdt de angitte basesubstitusjoner (innrammet), syntetisert og fosforylert:

Denne sekvens innfører et annet Hindlll-sete i det signal-peptidkodende område i det muterte pIN-III-ompA2. Oligo-nucleotidprimeren ble bundet til Ml3mpl9-RF som inneholdt Xbal/BamHI-fragmentet fra pIN-III-ompA2, og det ble behandlet med DNA-polymerase i nærvær av passende konsentrasjoner av nucleosidtrifosfater. De resulterende RF-er ble brukt til å transfisere JM101 E. coli, og mutantholdige plakker ble undersøkt ved hjelp av en merket oligonucleotidsøker. Sekvensen til den utvalgte RF ble bekreftet ved dideoxy-sekvensering under anvendelse av en universell Ml3-primer. Den utvalgte RF ble formert, isolert og oppløst med Xbal og BamHI, og det rensede Xbal/BamHI-fragment ble innføyd i en Xbal/BamHI-oppløst pIN-III-ompA2. For å danne pIN-III-ompA2(2), ble den mutante pIN-III-ompA2 formert, renset, oppløst med Hindlll og BamHI og blandet med BamHI/EcoRV-fragmentet fra pcD-125 i en standard ligeringsoppløsning som inneholdt 0,1 mikromolar av følgende syntetiske kobler:

E. coli stamme Abl899 ble infisert med pIN-III-ompA2(2)-plasmidet, og transformanter ble utvalgt ved kolonihybridis-32 ering under anvendelse av en P-merket IL-4-cDNA-søker. IL-4-ekstrakter fremstilt som beskrevet ovenfor, utviste TCGF-aktivitet som var sammenlignbar med supernatanter fra pcD-125 COS 7 celler.

B. TRPC11

TRPCll-vektoren ble konstruert ved å ligere et syntetisk konsensus-RBS-fragment til Clal-koblere (ATGCAT) og ved kloning av de resulterende fragmenter inn i Clal-restriksjonsenzymbehandlet pMTllhc (som var blitt modifisert på forhånd slik at det inneholdt Clal-setet). pMTllhc er et lite (2,3 kilobaser) i høyt kopiantall, AMR<R>, TET<S->derivat av pBR322 som bærer EcoRI-Hindlll-polykoblerområdet fra TrVX-plasmidet (beskrevet av Maniatis et al., ovenfor). Det ble modifisert slik at det inneholdt Clal-setet ved restriksjonsbehandling av pMTllhc med EcoRI og BamHI, gjen-fylling av de resulterende, klebrige ender og ligering med Clal-kobler (CATCGATG), for derved å gjenopprette EcoRI-

og BamHI-setene og erstatte Smal-setet med et Clal-sete.

En transformant fra TRPCll-konstruksjonen hadde en RBS-sekvens med repeterende enheter flankert av Clal-seter. Ett av Clal-setene og en del av den andre kopien av RBS-sekvensen ble fjernet ved oppløsning av plasmidet med Pstl, behandling med Bal31-nuclease, restriksjonsbehandling med EcoRI og behandling méd T4 DNA-polymerase i nærvær av alle fire deoxynucleotidtrifosfåtene. De resulterende 30-40 bp fragmenter ble utvunnet via PAGE og klonet inn i Smal-restriksjonsbehandlet pUC12. Et 248 bp E. coli trpP-bærende EcoRI-fragment avledet fra pKClOl (beskrevet av Nichols et al., i Methods in Enzymology, vol. 101, s. 155 (Academic

Press, N.Y., 1983)) ble deretter klonet inn i EcoRI-setet

for å fullføre TRPCll-konstruksjonen som er illustrert i figur 12.

TRPC11 ble anvendt som en vektor for human IL-4-

cDNA ved først å oppløse den med Clal og BamHI, rense den og deretter blande den med EcoRV/BamHI-fragmentet av pcD-

125 i en standard ligeringsoppløsning som inneholdt 0,1 mikromolar av følgende syntetiske kobler:

Vektoren som inneholdt innskuddet, ble utvalgt som beskrevet ovenfor og formert i E. coli K-12 stamme JM101. IL-4 ble ekstrahert på følgende måte. JMlOl-celler ble lydbølge-behandlet i kulturmediet sitt og sentrifugert. Pelleten ble resuspendert i 4 M guanidin og 2 mM dithiothreitol og sentrifugert på nytt. Supernatanten ble testet med hensyn på biologisk aktivitet og funnet å utvise TCGF-aktivitet som var sammenlignbar med aktiviteten til supernatanter fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler.

Eksempel V. Fremstilling av bovine IL- 4- cDNA- er via mus-oq human IL- 4- cDNA- søkere til et bovint hjelper- T- celle- cDNA- bibliotek og forbigående ekspresjon i COS 7 apeceller

cDNA-kloner som koder for IL-4, ble isolert fra cDNA-biblioteker konstruert fra induserte lymfocytter fra bovint, perifert blod (PBL-er) ved hjelp av kombinerte mus-og humane cDNA-søkere. Alternative kilder for bovine cDNA-er omfatter flere bovine cellelinjer som oppbevares i ATCCs NBL dyrecellelinjesamling. Fremgangsmåtene er i det vesentlige identiske med de som er beskrevet i eksempel II.

Celler ble innhøstet ca. 10 timer etter induksjon med

ConA. mRNA-ekstraksjon og cDNA-bibliotekoppbygning ble ut-ført som i eksempel II.

Mus- og humane cDNA-søkere kan brukes sammen som en blanding eller i rekkefølge for å påvise bovine IL-4-cDNA-er. Som i eksempel II, isoleres Pstl-fragmentet fra mus-pcD-2A-E3-cDNA-klon. Likeledes isoleres Pstl-fragmentet fra den humane pcD-125-cDNA-klon. Det er også tilgjengelig flere andre fragmenter som det kan konstrueres søkere ut fra. Enten sammen med eller hver for seg merkes de isolerte Pstl-fragmenter ved "nick"-translasjon (ca. 1 x 10 p cpm/mikrogram) og brukes til å undersøke nitrocellulosefiltre som inneholder plasmid-DNA-preparater fra 10 blandinger som hver utgjør ca. 1000 kloner fra det induserte PBL-cDNA-bibliotek. Filterhybridisering utføres som i eksempel II. Kloner som gir positivt resultat, identifiseres og formeres.

Eksempel VI. Ekspresjon. av naturlig forekommende human IL- 4 og muteiner A <1-4> og IS 0 ( Gly- Asn- Phe-Val- His- Gly) i Saccharomyces cerevisiae Naturlig forekommende human IL-4-cDNA og to mutanter derav ble klonet inn i plasmidet pMF-alfa8 og uttrykt i gjæren Saccharomyces cerevisiae. Konstruksjonen og anvend-elsen av pMF-alfa8 for uttrykking av ikke-gjær-proteiner er beskrevet fullstendig i Miyajima et al., Gene, vol. 37,

s. 155-161 (1985) og Miyajima et al., EMBO Journal, vol. 5,

s. 1193-1197 (1986). pMF-alfa8 er deponert ved American Type Culture Collection (Rockville, MD) under deponeringsnummer 40140, og et kart over plasmidet er gjengitt i figur 13A (betegnelsene i figuren er definert fullstendig i Miyajima et al., Gene, se ovenfor).

1-4

Human IL-4-mutein A

Plasmid pcD-125 ble isolert og oppløst med EcoRV og BamHI. EcoRV/BamHI-fragmentet som inneholder den humane IL-4-cDNA, ble isolert, behandlet med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) for å fylle igjen BamHI-kuttet, og kinasebehandlet (dvs. fosforylert). pMF-alfa8 ble oppløst med Stul og blandet med det kinasebehandlede EcoRV/BamHI-fragment fra pcD-125 i en standard ligeringsoppløsning, hvorved plasmid phIL-4-2 dannes. phIL-4-2 ble brukt til å transformere S. cerevisiae 20B-12 (MATalfa-trpl-289-pep4-3), som ble erholdt fra Yeast Genetic Stock Center, University of California, Berkely. Gjærcellene ble dyrket i syntetisk medium som inneholdt 0,67% "Yeast Nitrogen Base" uten aminosyrer, 2% glucose og 0,5% Casaminosyrer (Difco). Gjærcellene ble transformert med plasmidene ved hjelp av lithium-acetatmetoden til Ito et al., J. Bacteriol., vol. 153,

s. 163-168 (1983), og transformantene ble valgt ut i syntetisk medium som manglet tryptofan. Supernatant fra en transformantkultur ble testet med hensyn på TCGF-aktivitet.

Figur 13B (kurve D) illustrerer TCGF-aktiviteten til flere fortynninger av supernatanten fra phIL-4-2-transformerte gjærceller i sammenligning med andre faktorer (kurve A: human IL-2; kurve B: supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler; og kurve C: supernatanter fra phIL-4-l-transformerte gjærceller). Kurve E illustrerer TCGF-aktiviteten til supernatant fra gjær som var blitt transformert med pMF-alfa8 som mangler IL-4-cDNA-innskuddet, dvs. den "falske" transformant.

B. Human IL-4-mutein IS<0> (Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly).

pMF-alfa8-innskuddet for ekspresjon av mutein lg 0(Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly) ble fremstilt nøyaktig som for mutein A"<1>"<->^, bortsett fra at Nael/BamHI-fragmentet fra pcD-125 ble brukt. Det resulterende plasmid ble betegnet phIL-4-1. Flere fortynninger av supernatant fra phIL-4-1-transformerte gjærceller ble testet med hensyn på TCGF-aktivitet. Resultatene er vist ved hjelp av kurve C i figur 13B. Supernatantene ble også testet med hensyn på BCGF-aktivitet både på anti-IgM- og SAC-aktiverte B-lymfocytter. Analysene ble utført som beskrevet ovenfor, og resultatene er gjengitt i tabell IV.

C. Ekspresjon av naturlig forekommende human IL-4 i gjær. cDNA som koder for naturlig forekommende human IL-4, ble klonet inn i pMF-alfa8 ved først å innføye baser opp-strøms fra det N-terminale His-kodon, hvorved et Kpnl-restriksjonssete dannes. Etter spalting med Kpnl og behandling med DNA-polymerase I ble den butt-endede IL-4-cDNA innføyd i Stul-setet i pMF-alfa8. Kpnl-setet ble dannet ved bruk av standard sete-spesifikk mutagenese. I korte trekk ble pcD-125 oppløst med BamHI, og fragmentet som inneholdt hele den humane IL-4-cDNA, ble isolert og innføyd i BamHI-setet i Ml3mp8. En-kjedet Ml3mp8 som inneholdt innskuddet, ble isolert og hybridisert til følgende syntetiske oligonucleotid som tjente som en primer:

De innføyde nucleotider er innrammet. Plasmidet som inneholdt den muterte IL-4-cDNA, ble indentifisert ved hjelp av en oligonucleotidsøker, formert, isolert og behandlet med Kpnl og BamHI. Kpnl/BamHI-fragmentet ble isolert, behandlet med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) for å frembringe butte ender, kinasebehandlet og ligert med Stul-oppløst pMF-alfa8. Gjær ble transformert ved hjelp av de resulterende pMF-alfa8-plasmider, betegnet phIL-4-3, slik som beskrevet ovenfor, og supernatanter ble testet med hensyn på TCGF-aktivitet. Supernatantene utviste TCGF-aktivitet som var sammenlignbar med den som iakttas hos supernatanter fra phIL-4-l-transformert gjær.

Eksempel VII. Konstruksjon og ekspresjon av et syntetisk,

humant IL- 4- gen i E. coli

Det ble konstruert et syntetisk, humant IL-4-gen som hovedsakelig omfatter bakterieforetrukne kodoner, deriblant en serie av unike restriksjonsendonucleaseseter (her referert til som "unike restriksjonsseter") og muliggjør hurtig og bekvem ekspresjon av en lang rekke humane IL-4-muteiner. Nucleotidsekvensen til det syntetiske gen er vist i figur 6A. Teknikker for konstruksjon og ekspresjon av det syntetiske gen ifølge dette eksempel er standard innen molekylær-biologien, se spesielt Sproat og Gait, Nucleic Acids Research, vol. 13, s. 2959-2977 (1985) og Ferretti et al., Proe. Nati, Acad. Sei., vol. 83, s. 599-603 (1986); men også Mullenbach et al., J. Biol. Chem., vol. 261, s. 719-722 (1986);

Wells et al., Gene, vol. 34, s. 315-323 (1985) og Estell et al., Science, vol. 233, s. 659-663 (1986). I korte trekk settes det syntetiske, humane IL-4-gen sammen av en rekke kjemisk syntetiserte, dobbeltkjedede DNA-fragmenter. Basesekvenser i det syntetiske gen velges slik at det sammensatte, syntetiske gen inneholder en serie av unike restriksjonsseter .

Serien av unike restriksjonsseter definerer en serie segmenter som lett kan skjæres ut og erstattes med segmenter med endrede basesekvenser. De syntetiske fragmentene inn-føyes enten direkte eller etter ligering med andre fragmenter i en egnet vektor, slik som et pUC-plasmid eller lignende.

De ovenfor nevnte segmenter tilsvarer i grove trekk "kassettene" til Wells et al. (se ovenfor). De syntetiske fragmentene syntetiseres ved å bruke standardteknikker, f.eks. Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984). Fortrinnsvis anvendes det

et automatisert synteseapparat, slik som en modell 380A fra Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA). pUC-plasmider og lignende vektorer er kommersielt tilgjengelige, f.eks. Pharmacia-PL, eller Boehringer-Mannheim. Kloning og ekspresjon kan utføres i standard bakteriesystemer, f.eks.

E. coli K-12 stamme JM101, JM103 eller lignende, beskrevet av Viera og Messing, i Gene, vol. 19, s. 259-268 (1982).

Restriksjonsendonucleaseoppløsninger og ligase-reaksjoner utføres ved å bruke standardfremgangsmåter, se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Den alkaliske metode (Maniatis et al., se ovenfor) brukes til plasmidfremstillinger i liten skala. For fremstilling i stor skala brukes en modifikasjon av den alkaliske metode hvor et like stort volum isopropanol brukes til å utfelle nucleinsyrer fra det klargjorte lysat. Utfelling med kald 2,5 M ammoniumacetat brukes for å fjerne RNA før cesiumklorid-likevektsdensitetsentrifugering og påvisning med ethidiumbromid.

For filterhybridiseringer brukes Whatman 540 filter-sirkler til å løfte kolonier som deretter lyses og fikseres ved hjelp av suksessive behandlinger med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl; 1 M Tris.HCl pH 8,0, 1,5 M NaCl (2 min. hver) og oppvarming ved 80°C (30 minutter). Hybridiseringer skjer i 6xSSPE, 20% formamid, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS),

100 ug/ ml E. coli tRNA, 100 ug/ml "Coomassie Brilliant Blue G-250" (Biorad) ved 42°C i 6 timer under anvendelse av 3 2P-merkede (kinasebehandlede), syntetiske DNA-er. (20xSSPE fremstilles ved å oppløse 174 g NaCl, 27,6 g NaH2P04.H20

og 7,4 g EDTA i 800 ml H20, regulere pH til 7,4 med NaOH, regulere volumet til 1 liter og sterilisere ved hjelp av autoklavering).

Filtere vaskes to ganger (15 minutter ved værelsetemperatur) med lxSSPE, 0,1% SDS• Etter autoradiografi (Fuji RX-film) lokaliseres positive kolonier ved å stille opp mot hverandre de redyrkede kolonier og de blåfargede kolonier på filtrene.

DNA sekvensbestemmes enten ved hjelp av den kjemiske nedbrytningsmetode til Maxam og Gilbert, Methods in Enzymology, vol. 65, s. 499 (1980), eller ved dideoxymetoden til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 74, s. 5463

(1977). Templater for dideoxyreaksjonene er enten énkjedede DNA-er fra relevante områder reklonet inn i M13mp vektorer, f.eks. Messing et al., Nucleic Acids Res., vol. 9, s. 309

(1981), eller dobbeltkjedet DNA fremstilt ved hjelp av den minialkaliske metode og denaturert med 0,2 M NaOH (5 minutter ved værelsetemperatur) og utfelt fra 0,2 M NaOH, 1,43 M ammoniumacetat ved tilsetning av 2 volumdeler ethanol. Dideoxyreaksjonene utføres ved 42°C.

DNA syntetiseres ved hjelp av fosforamidit-kjemi under anvendelse av Applied Biosystems 380A synteseapparater. Syntese, avbeskyttelse, spalting og rensing (7 M urea-PAGE, eluering, DEAE-cellulosekromatografi) utføres som beskrevet i syntesehåndboken for 380A. Komplementære kjeder av syntetiske DNA-er som skal klones (400 ng hver), blandes og fosforyleres med polynucleotidkinase i et reaksjonsvolum på 50 ul. Denne DNA ligeres med 1 ug vektor-DNA oppløst med passende restriksjonsenzymer, og ligeringer utføres i et volum på 50 ul ved værelsetemperatur i 4 til 12 timer. Betingelser for fosforylering, restriksjonsenzymoppløsninger, polymerasereaksjoner og ligering er blitt beskrevet (Maniatis et al., se ovenfor). Kolonier registreres med hensyn til lacZ<+> (om ønsket) ved utplating på L-agar supplert med ampicillin, isopropyl-l-thio-beta-D-galactosid (IPTG)

(0,4 mM) og 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (x-gal) (40 ug/ml).

TAC-RBS-vektoren ble konstruert ved hjelp av en trinnrekkefølge hvor man startet med igjenfylling med DNA-polymerase av det ene BamHI-sete i det tacP-bærende plasmid pDR540 (Pharmacia). Produktet ble så ligert til ufosforyl-erte, syntetiske oligonucleotider (Pharmacia) som danner et dobbeltkjedet fragment som koder for et konsensus-ribosombindende sete (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). Etter ligering ble blandingen fosforylert og religert med Sstl-kobleren ATGAGCTCAT. Det resulterende kompleks ble så spaltet med Sstl og EcoRI og 173 bp fragmentet isolert via polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og klonet inn i EcoRI/Sstl-restriksjonsbehandlet pUC18 (Pharmacia) (som beskrevet nedenunder). Sekvensen til RBS-ATG-polykoblerområdene i sluttkonsentrasjonen (kalt TAC-RBS) er vist i figur 8.

Det syntetiske, humane IL-4-gen settes sammen i et pUC18-plasmid i seks trinn. I hvert trinn kan innskudd fri for fjernelser og/eller innskudd påvises etter kloning ved å beholde lacZ(a)-genet fra pUC18 i ramme med ATG-startkodonet innføyd i trinn 1. Kloner som inneholder endringer ved fjerning og/eller innføyelse, kan filtreres fra ved å bedømme med hensyn på blå kolonier på L-ampicillinplater som inneholder x-gal og IPTG. Alternativt kan i hvert trinn innskuddssekvenser lett bekreftes ved å bruke en universell sekvenseringsprimer på plasmid-DNA-preparatet i liten skala, f.eks. tilgjengelig fra Boehringer-Mannheim.

I trinn 1 oppløses TAC-RBS-vektoren med Sstl, behandles med T4 DNA-polymerase (hvis 3'-exonucleaseaktivitet oppløser de 3'-fremstikkende kjeder i Sstl-kuttene, hvorved det dannes butt-endede fragmenter), og etter deaktivering med T4 DNA-polymerase, behandles med EcoRI, hvorved det dannes et fragment med 173 basepar (bp) som inneholder TAC-RBS-området og har en butt ende i ATG-startkodonet og EcoRI-kuttet i den motsatte ende. Til slutt isoleres TAC-RBS-fragmentet med 173 bp.

I trinn 2 blandes det isolerte TAC-RBS-fragment i trinn 1 med EcoRI/Sstl-oppløst plasmid pUC18, og syntetisk fragment IA/B som er vist i figur 7A, har en butt ende i sin oppstrømsende og en forskjøvet (klebrig) ende som svarer til et Sstl-kutt i sin nedstrømsende. Fragmentene ligeres, hvorved pUC18 dannes i trinn 2.

I trinn 3 blandes de syntetiske fragmenter 2A/B og 3A/B (vist i figur 7B og 7C) med Sstl/BamHI-oppløst pUC18

fra trinn 2 (etter økning av kopiantall og rensing) og ligeres, hvorved pUC18 dannes i trinn 3. Legg merke til at nedstrømsenden i fragment 2A/B inneholder ekstra baser som danner den BamHI-forskjøvede ende. Disse ekstra baser spaltes i trinn 4. Også fragmentene 2A/B og 3A/B har komplementære 9-rest-énkjedede ender som bindes etter blanding og etterlater det oppstrøms Sstl-kutt fra 2A/B og det ned-strøms BamHI-kutt fra 3A/B slik at de ligeres til pUC18.

I trinn 4 renses på nytt MluI/Xbal-oppløst pUCl8 fra trinn 3 (etter økning av kopiantall og rensing), blandes med syntetisk fragment 4A/B (figur 7D) og ligeres, hvorved pUC18 i trinn 4 dannes.

I trinn 5 blandes Xbal/Sall-oppløst pUC18 fra

trinn 4 (etter økning av kopiantall og rensing) med syntetisk fragment fra 5A/B (figur 7E) og ligeres, hvorved pUC18 i trinn 5 dannes.

I trinn 6 blandes Sall/Hindlll-oppløst pUC18 fra trinn 5 (etter økning av kopiantall og rensing) med syntetisk fragment 6A/B (figur 7F) og ligeres, hvorved sluttkonstruk-s j onen danne s.

Figur 6B er et spaltingskart over de unike restriksjonsseter som er til stede i pUC18-konstruksjonen som nettopp er beskrevet. Når det beskrevne, syntetiske, humane IL-4-gen brukes som et innskudd i pUC18, definerer hvert par av unike restriksjonsseter et segment som lett kan skjæres ut og erstattes med endrede, syntetiske segmenter. Settet av unike restriksjonsseter omfatter EcoRI, Hpal, SacI (Sstl), EcoRV, Pstl, Mlul, Bell, Xbal, Nael, Sali, Xhol og Hindlll.

pUC18 som inneholder det syntetiske IL-4-gen, inn-føyes i E. coli K-12 stamme JM101. Etter oppdyrking ekstraheres protein fra JMlOl-celler, og fortynninger av ekstraktene testes med hensyn på biologisk aktivitet.

Eksempel VIII. Konstruksjon og ekspresjon av human IL- 4-52

mutein - Ile i E. coli.

Leu i stilling 52 (i forhold til N-enden i det naturlig forekommende humane IL-4) endres til Ile for å danne human IL-4-mutein-Ile 52. pUC18-plasmidet ifølge eksempel VII som inneholder det syntetiske, humane IL-4-gen ifølge figur 6A, oppløses med Pstl og Mlul og renses. Det ovenfor rensede pUC18 blandes med det syntetiske, dobbeltkjedede fragment som er illustrert nedenunder, og ligeres. Den endrede del av grunnsekvensen er innrammet. Det resulterende pUCl8 transfiseres inn i E. coli K-12 stamme JM101 og lignende og uttrykkes.

Pstl/ Mlul- erstatningsfragment for

52 frembringelse av human IL- 4- mutein- Ile

Etter oppdyrking ekstraheres protein fra JM101-cellene ved å bruke standardteknikker, og. fortynninger av ekstraktene testes med hensyn på biologisk aktivitet.

Eksempel IX. Konstruksjon og ekspresjon av human IL- 4-mutein ( Ile52, Asp111).

Det modifiserte pUC18-plasmid ifølge eksempel VIII (som inneholder den Ile 52-kodende sekvens) oppløses med Sali og Xhol, og det største fragmentet isoleres. Det isolerte fragment blandes med det syntetiske, dobbeltkjedede fragment som er vist nedenunder, i en standard ligeringsopp-løsning. Den endrede del av sekvensen er innrammet. Det resulterende plasmid transfiseres inn i E. coli K-12 stamme JM101 eller lignende, og uttrykkes.

Sali/ Xhol- erstatningsfragment

Etter oppdyrking ekstraheres protein fra JM101-cellene ved å bruke standardteknikker, og fortynninger av ekstraktene testes med hensyn på biologisk aktivitet.

Eksempel X. Sekvens av human IL- 4 renset fra transfeksjonssupernatanter

Human IL-4 ble renset fra kultursupernatanter av celler som var forbigående transfisert med vektorer som inneholder human IL-4-cDNA. Sekvensen til det utskilte, naturlig forekommende, humane IL-4 ble bestemt fra det rensede materiale.

A. Biologisk analyse av rensningsgrad.

TCGF-aktivitet ble brukt til å analysere human IL-4 under separasjonsfremgangsmåtene. Analysen var i det vesentlige den samme som den som er beskrevet i eksempel II. I korte trekk ble det tatt blodprøve fra en frisk donor og plassert i et heparinisert rør og lagt oppå 'Ficolln-HypaquéV f. eks. 5 ml blod pr. 3 ml "Ficoll-Hypaqué® i et 15 ml sentri-fugerør. Etter sentrifugering ved 3000 x g i 20 minutter ble cellene i grenseflaten sugd opp og fortynnet i et dyrk-ningsmedium bestående av RPMI 1640 inneholdende 10% kalvefosterserum, 50 mikromolar 2-mercaptoethanol, 20 mikrogram/ml fytohemagglutinin (PHA) og rekombinant human IL-2. Etter 5-10 dager med inkubasjon ved 37°C ble de PHA-stimulerte lymfocytter fra perifert blod (PBL-er) vasket og brukt i 2-dagers kolorimetriske analyser: Mosmann, J. Immunol. Methods, vol. 65, s. 55-63 (1983). To gangers seriefortynn-inger av IL-4-standarden (supernatanter enten fra pcD-125-eller pEBT-178-transfiserte COS 7 celler) eller fraksjonen som skulle testes, ble utført i 96-brønners brett under anvendelse av dyrkningsmediet beskrevet ovenfor, hvorved man fikk et sluttvolum på 50 mikroliter/brønn. 50 mikroliter av de PHA-stimulerte PBL-er ved ca. 4-8 x 10 celler/ml ble tilsatt til hver brønn, og brettene ble inkubert ved 37°C i 2 dager. Cellevekst ble så målt i henhold til Mosmann (se ovenfor).

Enheter av human IL-4-TCGF-aktivitet er definert når det gjelder supernatanter enten av pcD-125-transfiserte COS 7 celler (eksempel II) eller pEBV-178-transfiserte

COS 7 celler (eksempel III).

For rensing er enheter basert på aktiviteten av pcD-125-transfeksjonssupernatanter som fremstilles på følgende måte. Ca. 1 x 10 COS 7 celler spres ut på 100 mm vev-kulturplater som inneholder Dulbecco's Modified Eagle's medium (DME), 10% kalvefosterserum og 4 mM L-glutamin. Ca.

24 timer etter utspredning suges mediet opp fra platene, og cellene vaskes to ganger med serumfri, bufret (50 mM Tris) DME. Til hver plate tilsettes 4 ml serumfri, bufret DME (med 4 mM L-glutamin), 80 mikroliter DEAE-dextran og 5 mikrogram pcD-125-DNA. Cellene inkuberes i denne blanding 1 4 timer ved 30°C, hvoretter blandingen suges bort, og cellene vaskes en gang med serumfritt, bufret DME. Etter vasking tilsettes 5 ml DME med 4 mM L-glutamin, 100 mikromolar klorkin og 2% kalvefosterserum til hver plate, og cellene inkuberes i 3 timer og vaskes deretter to ganger med serumfritt, bufret DME. Deretter tilsettes 5 ml DME med 4 mM L-glutamin og 4% kalvefosterserum, og cellene inkuberes ved 37°C i 24 timer. Deretter vaskes cellene 1-3 ganger med DME eller PBS, 5 ml serumfritt DME (med 4 mM L-glutamin) tilsettes, og cellene inkuberes ved 37°C inntil kultursupernatantene innhøstes 5 dager senere.

En enhet slik den her er brukt, er den mengde faktor som i én brønn (0,1 ml) stimulerer 50% maksimal formering av 2 x 10 4 PHA-stimulerte PBL-er over en 48-timers periode.

B. Rensing

Rensing ble utført ved hjelp av en sekvensvis anvendelse av kationbytterkromatografi, gelfiltrering og revers-fase-høytrykksvæskekromatografi. Alle operasjoner ble utført ved 4°C.

Etter fjerning av COS 7 cellene ved sentrifugering ble supernatanten oppkonsentrert ca. 10 ganger ved ultrafiltrering og lagret ved -80°C inntil den ble ytterligere bearbeidet. IL-4-titere ble bestemt ved å analysere med hensyn på proteinets evne til å stimulere formering av fytohemagglutinin-induserte lymfocytter fra humant, perifert blod, dvs. ved TCGF-aktivitet under anvendelse av standard-analysen beskrevet ovenfor.

Konsentrert COS 7 supernatant med TCGF-aktivitet på ca. 104-106 enheter/ml og et proteininnhold på ca. 15-20 mg/ml ble dialysert mot 2 endringer i 50 mM natrium-HEPES, pH 7,0

i løpet av et tidsrom på 24 timer (hver endring var omtrent 10-15 ganger volumet av et konsentrat). Dialysatet ble påført en kolonne (1 x 2,5 cm) med S-Sepharose<®> (strømnings-hastighet: 0,2 ml/min) forekvilibrert med 50 mM natrium-HEPES, pH 7,0. Kolonnen ble vasket med 15 kolonnevolumer ekvilibreringsbuffer etterfulgt av eluering med 20 kolonnevolumer av en lineær natriumkloridgradient som strakk seg fra 0 til 0,5 M natriumklorid i 50 mM natrium-HEPES, pH 7,0. Gradienten ble avsluttet ved eluering med 5 kolonnevolumer med enhetlig konsentrasjon: 50 mM natrium-HEPES, 0,5 M NaCl, pH 7,0. 1,5 ml og 1,8 ml fraksjoner ble samlet opp fra de respektive satser. IL-4-titere ble funnet å eluere for begge kromatografiene mellom 300 mM og 500 mM natriumklorid.

Seks fraksjoner fra hver S-Sepharose<®->kolonne som inneholdt IL-4-titere, ble hver for seg slått sammen til totale volumer på 9,0 og 10,8 ml. Begge volumene ble oppkonsentrert til 1,9 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av en "Amicon" YM5-membran (molekylvekt-"cut-off": 5000). Utvinningen av protein fra dette trinnet var ca. 80%. Den konsentrerte IL-4-oppløsning ble tilført en Sephadex<®> G-

100-kolonne (1,1 x 58 cm) forekvilibrert i 50 mM HEPES,

0,4 M NaCl, pH 7,0, og kolonnen ble eluert med den samme buffer ved 0,15 ml/min. I alt 50 fraksjoner (1,0 ml/fraksjon) ble samlet opp og analysert med hensyn på IL-4-titere. En biologisk aktivitetstopp ble iakttatt ved en tilsynelatende molekylvekt på 22.000 dalton. Sephadex<®> G-100 ble kalibrert for bestemmelse av tilsynelatende molekylvekt med bovint serumalbumin (65.000 dalton), carbonsyreanhydrase (30.000 dalton) og cytokrom C (11.700 dalton).

En fraksjon fra Sephadex<®> G-100-kolonnen som inneholdt IL-4-aktivitet, ble oppkonsentrert 3-4 ganger under vakuum og ble injisert i en "Vydac" C-4 "guard"-kolonne (4,6 x 20 mm). En lineær gradient med 0-72% (volum/volum) acetonitril i 0,1% (volum/volum) trifluoreddiksyre (TFA) ble fremstilt 1 løpet av 15 minutter ved en kolonnetemperatur på 35°C

og en strømningshastighet på 1,0 ml/min. Man fikk tre topper som ble påvist ved 214 nm med retensjonstider på 7, 8,2 og 8,7 minutter (hhv. topp 1, 2 og 3 i figur 10). En 40 mikroliter aliquot av topp 2 (8,2 min. elueringstid)

ble lyofilisert og på nytt oppløst i minimalt essensielt medium som inneholdt 10% kalvefosterserum. Denne oppløsning utviste en positiv TCGF-respons. En 300 mikroliter aliquot av topp 2 ble inndampet til tørrhet og på nytt oppløst i 200 ul 0,1% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat (SDS). En 2 ul aliquot ble fortynnet i 200 ul med 1% (volum/volum)

TFA og på nytt kromatografert. HPLC for denne prøve påviste en enkel topp ved 215 nm. Materialet fra topp 2 indikerte

Q

en aktivitet på ca. 7 x 10 enheter/mg.

C. Aminosyresekvensanalyse

Aminosyresekvensbestemmelse ble utført ved hjelp av automatisert gassfase Edman-nedbrytning (Hewick, R.M., Hunkapillar, M.W., Hood, L.E. og Dryer, W.J. (1981), J. Biol. Chem., 256: 7990) under anvendelse av en Applied Biosystems "microsequenator". En 90 mikroliter aliquot av HPLC-fraksjonen fra topp 2 oppløst i 0,1% SDS som beskrevet ovenfor, ble tilført glassfiberfilterpatronen i nærvær av "Polybrene". Aminosyresekvensinformasjon ble oppnådd opp til 35. rest. Den N-terminale sekvens ble bestemt på følgende måte:

hvor de åpne mellomrommene angir mangel på en identifiserbar aminosyre.

De åpne mellomrommene i aminoenden i stillingene 3 og 23 var i overensstemmelse med tilstedeværelsen av cystein som ikke kan påvises i dette systemet. Det åpne mellomrom i stilling 28 som svarer til et threonin i den cDNA-forut-sagte sekvens, kan skyldes enten variabiliteten i fenylthio-hydantoin-threonin-påvisningen eller tilstedeværelsen av 0-bundet glycosylering eller forestring.

En 100 mikroliter aliquot av HPLC-fraksjonen hvor aminoendesekvensen opptrådte, ble inndampet til tørrhet og på nytt oppløst i 70% maursyre. Et 50-gangers molart over-skudd av cyanbromid ble tilsatt, og oppløsningen ble hensatt ved værelsetemperatur i 2,5 timer. Det spaltede protein ble sekvensbestemt på gassfase-sekvensapparatet fra Applied Biosystems som beskrevet ovenfor. To sekvenser var identi-fiserbare:

Sekvens (1) er identisk med sekvensen som ble forutsagt fra cDNA-en å være blitt frigjort etter cyanbromidspalting av methioninresten i stilling 120. De to siste restene i C-enden kan ha vært til stede, men behøver ikke å ha vært påvis-bare på grunn av utilstrekkelig prøve. Sekvens (2) er identisk med aminoendesekvensen erholdt fra det naturlig forekommende IL-4-protein som beskrevet ovenfor. De relative mengder aminoende- og carboxylende-fenylthiohydantoin-aminosyrer frigjort, antydet ekvimolare mengder av begge sekvensene i prøven. Dette resultatet understøtter den konklusjon at den proteinprøven som ble sekvensbestemt, inneholdt hovedsakelig en enkel polypeptidkjede med amino- og carboxylender forutsagt ut fra cDNA-sekvensen til human IL-4.

Eksempel XI. Konstruksjon og ekspresjon av human IL- 4-mutein ( Ile52, A<?1>, IS94( Ala))

Det modifiserte pUC18-plasmid ifølge eksempel VIII

52

(som inneholder den Ile -kodende sekvens) oppløses med

Mlul og Bell, og det største fragmentet isoleres. Det isolerte fragment blandes med det syntetiske, dobbeltkjedede fragment illustrert nedenunder i en standard ligeringsoppløs-ning. Det resulterende plasmid transfiseres inn i E. coli K-12 JM101 eller lignende, og formeres.

Mlul/ Bcll- erstatningsfragment

Det modifiserte plasmid isoleres og oppløses med Xbal og Nael, og det største fragmentet isoleres. Det isolerte fragment blandes med det syntetiske, dobbeltkjedede fragment illustrert nedenunder i en standard ligeringsopp-løsning. Det adderte kodon er innrammet. Det resulterende plasmid transfiseres inn i E. coli K-12 stamme JM101 eller lignende, og uttrykkes.

Xbal/ Nael- erstatningsfragment

Etter dyrking ekstraheres protein fra JMlOl-cellene under anvendelse av standardteknikker, og fortynninger av ekstraktene testes med hensyn på biologisk aktivitet.

Eksempel XII. Induksjon av DR- antigener på celler fra

en pasient som lider av lymfocyttmangelsyndrom

Lymfocyttmangelsyndrom er kjennetegnet ved mangel

på ekspresjon av klasse I og/eller klasse II HLA-antigener på celleoverflater og er ofte forbundet med alvorlig immunsvikt, se f.eks. Touraine, Lancet, s. 319-321 (7. februar 1981); Touraine og Bethel, Human Immunology, vol. 2,

s. 147-153 (1981) og Sullivan et al., J. Clin. Invest.,

vol. 76, s. 75-79 (1985). Det ble oppdaget at human IL-4

var i stand til å indusere ekspresjon av klasse II DR-antigen på overflatene av celler avledet fra en pasient som led at lymfocyttmangelsyndrom.

Lymfocytter fra perifert blod (PBL-er) ble erholdt fra en pasient som led av ikke-ekspresjon av HLA klasse II-antigener. B-celler ble renset fra PBL-er i det vesentlige som beskrevet ovenfor, og en B-cellelinje (betegnet UD31)

ble etablert ved transformasjon med Epstein-Barr-virus (EBV). De EBV-transformerte celler ble dyrket i 48 timer i Yssels definerte medium (beskrevet ovenfor) med 2% kalvefosterserum og en 5% (volum/volum) konsentrasjon av supernatant fra pcD-125-transfiserte COS 7 celler. Cellene ble innhøstet, fiksert, farget med fluorescensmerket anti-DR monoklonalt antistoff (f.eks. Becton Dickinson, L243) og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Figur 9 viser histogrammer over cellehyppighet i forhold til fluorescensstyrke for en

kontrollpopulasjon av de EBV-transformerte celler innhøstet før IL-4-behandling (kurve A), og for populasjonen av. BSV-transformerte celler etter IL-4-behandling (kurve B).

Eksempel XIII. MCGF- aktivitet av Cl. Lyl+ 2~/ 9 ( Cl. l)-supernatanter

Renset IL-3 og supernatant fra COS 7 celler transfisert med en IL-3-cDNA-klon (rekombinant IL-3; IL-3 ) stimulerte formering av mastcellelinjen MC/9 i den samme grad (figur 14A). Dette nivået var imidlertid en tredjedel til en halvpart av det som ble indusert av Cl.l T-celle-supernatant. Nærværet av ConA i T-cellesupernatanten (2 yg/ml) bidrar ikke signifikant til dens MCGC-aktivitet. En forklaring på virkningen angitt ovenfor, er at IL-3 ikke bidrar med all MCGF-aktivitet frembrakt av Cl.l-celler. Alternativt kunne mastcellelinjen som ble brukt til analysene, (teoretisk) være forurenset med en annen faktor-avhengig populasjon av celler. Denne sistnevnte mulighet utelukkes imidlertid ettersom re-kloning av MC/9-cellelinjen ga subkloner som hver gir respons på IL-3 og cellesupernatanten på samme måte som den opprinnelige MC/9-klon.

Ettersom Cl.1-supernatant også inneholder andre lymfokiner enn IL-3, ble disse testet med hensyn på evne til å fremme veksten av MC/9-celler. MC/9-cellene ga imidlertid ikke respons på forskjellige konsentrasjoner av rekombinant IL-2, IFN og GM-CSF, samt på supernatant som inneholdt IL-1 (P388D-l-celler) (figur 14A). Dessuten stimulerte ikke supplering av kulturer som inneholdt varierende konsentrasjoner av rekombinant IL-3, med IL-2, GM-CSF, IFN-7 eller IL-1 formering av MC/9-celler over det nivå som ble erholdt med IL-3 alene. Dette angir at den økte MCGF-aktivitet av T-cellesupernatanten ikke skyldes dens innhold av disse andre kjente faktorer.

Komparative undersøkelser med andre faktor- avhengige celle-linjer.

To andre mastcellelinjer, DX-2 og MM3, ga også sterkere proliferative responser med Cl.1-supernatant enn med IL-3 (representative data for DX-2 vist i figur 14B). Disse cellene ga heller ikke respons på IL-2, IFN-Tf, GM-CSF eller supernatant fra P388D-l-celler. Således kan den for-økte formeringsrespons for MC/9-celler på T-cellesupernatant være typisk for mastceller generelt. Derimot ble granulo-cytt-typeceller (NFS-60) stimulert nesten like mye av IL-3-. og Cl.1-supernatant (fig. 14C). Selv om NFS-60-celler ikke ga respons på IL-2-, I FN-Tf- og P388D-l-supernatant, var det en liten, men reproduserbar stimulering med GM-CSF.

Det faktum at IL-3- og T-cellesupernatanten induserer sammen-lignbare nivåer av formering, antyder at NFS-60-cellelinjen kan være forholdsvis ufølsom for ytterligere faktorer som er til stede i T-cellesupernatanten. NFS-60-cellene ble således brukt til å analysere IL-3 under forsøk på å separere IL-3 fra andre MCGF-aktiviteter ved proteinfraksjonering.

TCGF-aktiviteten av Cl.1-supernatant ble fastslått ved å bruke den IL-2-avhengige T-cellelinje, HT2. Mettende konsentrasjoner av Cl.1-supernatant stimulerte konstant H-thymidin-inkorporering godt under det maksimale nivå som ble oppnådd med rekombinant IL-2 (figur 14D). Lignende resultater ble oppnådd med to andre cellelinjer. Supernatanten inneholder ikke et inhibitorstoff ettersom dens tilsetning til HT2-kulturer som inneholder IL-2, ikke ga noen reduksjon i <3>H-thymidin-inkorporering (figur 14D). Disse resultatene antyder at Cl.1-supernatant inneholder en TCGF-aktivitet som er forskjellig fra IL-2. Biokjemisk bevis som understøtter denne konklusjon, er gjengitt nedenunder.

Preliminær kromatografisk fraksjonering av Cl. 1- supernatant.

Cl.1-supernatant ble fraksjonert ved hjelp av forskjellige kromatografiske metoder med det øyeblikkelige mål å separere IL-3 fra andre MCGF-aktiviteter. Formering av NFS-60-celler ble brukt til å etterspore IL-3 spesifikt mot bakgrunnen av total MCGF-aktivitet avslørt ved hjelp av MC/9-formering. TCGF-aktivitet ble fastslått ved hjelp av HT2-celleformering.

Når Cl.1-supernatant ble fraksjonert ved hjelp av kationbytterkromatografi ved nøytral pH, kom omtrent 98% av det påsatte protein, 97% av IL-3-enhetene (fastslått ved hjelp av NFS-60-formering) og 1% av TCGF-enhetene til syne i gjennomstrømningen (figur 15). Eluering av. bundet protein med en gradient av natriumklorid frigjorde TCGF-aktivitet ved 0,19M NaCl (fraksjon 60). En liten, men reproduserbar topp av TCGF-aktivitet kom også til syne ved IM NaCl. Ingen ytterligere signifikant TCGF-aktivitet kunne elueres ved høyere NaCl-konsentrasjoner (opptil 3M). En liten mengde IL-3 eluerte også i omtrent det samme område som TCGF-toppen (påvisbar NFS-60-respons). Bare fraksjoner som svarte til topp-TCGF-aktivitet (fraksjonene 59-61) og det gjennom-strømmende (fraksjonene 1-20), stimulerte høye nivåer av MC/9-formering, noe som var sammenlignbart med den ufraksjonerte supernatant (piler, figur 15). Ettersom titrer-ingskurver antydet at fraksjonene 59-61 inneholdt mer av høynivå-MCGF-aktiviteten enn gjennomstrømningen gjorde, ble det gjort forsøk på å tappe ut ytterligere av IL-3-aktiviteten som eluerte sammen med TCGF-toppen, og igjen fastslå MC/9-formeringsnivåer. Fraksjonene 59-61 ble derfor på nytt kromatografert to ytterligere ganger under identiske betingelser.

Etter den tredje kolonnepassering eluerte mer enn 95% av TCGF-aktiviteten homogent ved .0,19 M NaCl. Det var ingen målbar IL-3-respons (NFS-60) i gjennomstrømningen eller i noen av kolonnefraksjonene. En MCGF-aktivitet som nå stimulerte et platånivå av MC/9-formering som var signifikant lavere enn det som ble oppnådd med Cl.1-supernatant eller IL-3 (se nedenunder), eluerte imidlertid fortsatt sammen med TCGF-toppen. Ettersom disse fraksjonene manglet målbar IL-3-aktivitet (fravær av NFS-60-respons), var tilsynelatende den nye MCGF i seg selv ute av stand til å stimulere MC/9-celler i den samme grad som den urensede T-celle-supernatant.

For ytterligere å forsøke på separasjon av MCGF fra TCGF, ble det 3X-fraksjonerte materiale (fraksjonene 59-61) fortynnet med 10X med 0,1% TFA i H20 til pH 2 og fylt direkte på en C8 reversfase-kolonne. Figur 16A viser eluerings-profilen for bundet protein frigjort med en gradient av acetonitril, 0,1% i TFA. Ingen MCGF- eller TCGF-aktivitet fremkom i gjennomstrømningen; begge aktivitetene eluerte sammen ved 37% acetonitril (fraksjonene 26-29). Den mettende MCGF-respons var imidlertid nå bare ca. halvparten av den som man fikk med IL-3 alene (figur 17A). Når alle fraksjonene på nytt var analysert i nærvær av mettende nivåer av IL-3, oppviste bare fraksjonene 26-29 en MC/9-formeringsrespons som var høyere enn for IL-3 alene (pil, figur 16A). Størrelsen på responsen var faktisk den samme som for selve den ufraksjonerte supernatant (figur 17A). Videre ble det iakttatt formeringsnivåer som var ekvivalente med nivåene for ufraksjonert supernatant, med fraksjonene 26-29 når de ble analysert i nærvær av IL-3-holdig gjennomstrømning eller IL-3-renset form av WEHI 3. Således stimulerer kom-binasjonen av IL-3 og den unike MCGF/TCGF nivåer av MC/9-formering som er karakteristisk for den opprinnelige T-celle-supernatant.

Selv om reversfase-kromatografering ikke oppløser MCGF fra TCGF, ble TCGF påvist å være forskjellig fra IL-2 ved hjelp av to kriterier. For det første, når rekombinant IL-2 i COS 7 cellesupernatanter (IL-2 ) og supernatant fra en IL-2-produserende (ConA-stimulert) murin T-cellelinje (GF15-1) begge kromatograferes på den samme kolonne under identiske betingelser, eluerer TCGF-aktiviteten ved 45% acetonitril i en skarp topp som ikke overlapper med 37% acetonitrilstillingen som markerer Cl.l-TCGF (figur 16B). For det andre er den mettende respons av HT2-celler på IL-2 svært forskjellig fra den som karakteriserer Cl.l-supernatanten (figur 16B, innskudd). Videre ble det ikke påvist noen opplagt synergi mellom den delvis rensede TCGF og IL-2 (figur 17B).

Det kromatofokuserte mønster for Cl.1-supernatant

er vist i figur 18. IL-3-aktiviteten (NFS-60-respons) ga en svært heterogen profil, deriblant aktivitet med pl-verdier som var høyere enn 7,1, men TCGF-aktiviteten syntes å være

mer homogen, idet hoved-TCGF-artene (fraksjon 12) ga en omtrentlig pl på 6,2. Dette stemmer overens med den maksimale MCGF-aktivitet (MC/9-respons) etter tilsetning av mettende nivåer av IL-3.

SDS- PAGE av Cl. 1- supernatant og delvis renset faktor

Figur 19 sammenlignet de elektroforetiske profiler av ufraksjonert Cl.1-supernatant (figur 19A) og profilene til kationbyttermaterialet, fraksjoner 59-61 (figur 19B). Protein ble eluert direkte fra gelstykker, og aktiviteter ble bestemt ved formering. Både kationbytterfraksjonen og Cl.l-supernatanten ga TCGF-topper: ved 20 kd og 15 kd under ikke-reduserende betingelser, og ved 21 kd og 16 kd under reduserende betingelser. Ettersom kationbyttermaterialet var tømt for IL-3, ble bare lave nivåer av MC/9-formering indusert, og denne MCGF-aktivitet var fortsatt i overensstemmelse med TCGF-topper. Tilsetning av mettende mengder av IL-3 til alle fraksjoner økte MC/9-formeringsresponsen til Cl.1-supernatantnivåer bare i topp-MCGF/TCGF-fraksjonene (piler, figur 19B). IL-3-aktivitet av supernatanten var størst i 24 kd-posisjonen, men fremkom også i brede topper rundt 20 kd-området. Likeledes oppstår MC/9-formeringsnivåer godt over nivået til IL-3 ved 20 kd-posisjonen til elektroforesebehandlet supernatant (pil, figur 19A). En sølvfarget SDS-gel med det mest høyrensede MCGF/TCGF-materiale (fraksjon 28 i reversfase-kolonnen) utviste også fremtred-ende proteinbånd ved 20 kd og 15 kd.

Mikrogrammengder av 20 kd-formen av faktoren er blitt renset til homogenitet ved sukesssiv fraksjonering av ConA-supernatanter fra aktiverte Cl.1-T-celler ved

(1) kationbytterkromatografi, (2) Heparin-Sepharose<®->kromatografi, og (3) c4 reversfase-kromatografi som tidligere beskrevet. Sluttmaterialet utviser bare et enkelt bånd ved 20 kd ved hjelp av sølvfarget SDS-PAGE, noe som tilsvarer en enkel UV-absorberende topp på c4-elueringsprofilen. Biologisk karakterisering av den rensede faktor bekreftet dens evne til å stimulere lave nivåer av T-celle- og mastcelleformering og å øke IL-3-avhengig mastcelleformering.

Som vist i tabell V, innehar faktoren flere B-celle-stimulerende aktiviteter som tilskrives BSFl (Roehm, N.W.

et al., J. Exp. Med., 169; 679-694 (1984); Howard, M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 7_8_: 5788 (1981); Roehm, N.W. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 81: 6149-6153 (1984). For det første induserer den økt ekspresjon av Ia på hvilende B-celler sammenlignet med kontrollpopulasjonen (tabell V). For det andre induserer faktoren sammen med anti-Ig-antistoffer signifikant [ H]-thymidin-inkorporering, noe som indikerer at den virker som en ekstrafaktor ved stimuleringen av B-celleformering.

Disse polypeptidene kan utvise flere biologiske aktiviteter som adskiller seg både med hensyn til den tilsynelatende funksjon som formidles, og celletypen som påvirkes. Som beskrevet ovenfor, omfatter disse aktivitetene synergi ved induksjonen av formering av B-celler og mastcellelinjer, tidlig aktivering av hvilende B-celler, stimulering av formeringen av T-celler og selektiv forøkning av IgG^- og IgE-produksjon av mitogenaktiverte B-celler. Rensing av polypeptidene til ensartethet har klargjort omfanget av disse aktivitetene.

Av det ovenfor nevnte vil det forstås at de rensede <p>olypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen gir fagfolk nye terapeutiske muligheter. Muligheten for å produsere betydelige mengder av disse faktorene vil gi forbedret in vitro dyrking av utvalgte pattedyrcellelinjer, samt en samlet forbedret forståelse av pattedyrimmunrespons.

cDNA-klonene pcD-2A-E3, pcD-46 (pcD-2Fl-13),

pcD-125 og gjærvektoren pMF-alfa8 er blitt deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), under deponeringsnumrene 53330, 53337, 67029 og 40140. Disse deponeringene er gjort under Budapest-konvensjonen

(1977) vedrørende internasjonal anerkjennelse av deponeringen av mikroorganismer for patentformål.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et glycosylert eller ikke-glycosylert polypeptid som utviser human-interleukin-4-aktivitet, og som har en sekvens av aminosyrer definert ved den følgende formel, som kan være enten 1 gang substituert eller 1 gang delert eller 1 gang innskutt: hvor R er Ala-Glu-Phe eller Glu-Asn-Phe-Val-His, eller er fra-værende , og hvor hvert av uttrykkene av typen X("Xaa") representerer aminosyren "Xaa", bortsett fra at den innskutte eller substituerte aminosyre X("Xaa") i de 1 gang substituerte eller 1 gang innskutte polypeptider i de stillinger hvor de er innskutt eller substituert, er definert på følgende måte: X(Ser) er Ser, X(Arg) er gruppen bestående av Arg, His og Lys, X(Leu) er gruppen bestående av Leu, Ile, Phe og Met, X(Pro) er gruppen bestående av Pro og Ala, X(Thr) er Thr, X(Ala) er gruppen bestående av Ala og Pro, X(Val) er gruppen bestående av Val, Met og Ile, X(Gly) er Gly, X(Ile) er gruppen bestående av Ile, Met og Leu, X(Phe) er gruppen bestående av Phe, Met, Tyr, Ile og Leu, X(Tyr) er gruppen bestående av Tyr og Phe, X(His) er gruppen bestående av His, Gin og Arg, X(Gin) er gruppen bestående av Gin, Glu og His, X(Asn) er gruppen bestående av Asn og Asp, X(Lys) er gruppen bestående av Lys og Arg, X(Asp) er gruppen bestående av Asp og Asn, X(Glu) er gruppen bestående av Glu og Gin, X(Met) er gruppen bestående av Met, Ile og Leu, X(Trp) er Trp og X(Cys) er Cys, fortrinnsvis hvor: X(Arg) er Arg, X(Leu) er gruppen som består av Leu, Ile og Met, X(Pro) er Pro, X(Ala) er Ala, X(Val) er Val, X(Ile) er gruppen bestående av Ile, Met og Leu, X(Phe) er Phe, X(Tyr) er Tyr, X(His) er His, X(Gln) er Gin, X(Asn) er Asn, X(Lys) er Lys, X(Asp) er Asp, X(Glu) er Glu og X(Met) er gruppen bestående av Met, Ile og Leu, og uttrykket "1 gang substituert" angir en delmengde av polypeptider hvor de naturlig forekommende aminosyrer er blitt byttet ut med synonyme aminosyrer i 1 stilling, uttrykket "1 gang delert" angir en delmengde av polypeptider hvor de naturlig forekommende aminosyrer er blitt delert i 1 stilling, og uttrykket "1 gang innskutt" angir en delmengde av polypeptider hvor synonyme aminosyrer er blitt innskutt ved siden av de naturlig forekommende aminosyrer i 1 stilling, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter følgende trinn: a) konstruksjon av en vektor som omfatter en nucleotidsekvens som koder for angitte polypeptid, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, slik at nucleotidsekvensen er i stand til å bli uttrykt av en vert som inneholder vektoren, hvor nucleotidsekvensen er minst 75 % homolog med en cDNA-sekvens i innskuddet i vektoren pcD-125 [ATCC 67029], b) inkorporering av vektoren i verten, og c) dyrking av den vektorholdige vert under betingelser som er egnet for ekspresjon av nucleotidsekvensen til polypeptidet, hvoretter d) det uttrykte protein isoleres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en nucleotidsekvens som koder for et polypeptid som er definert ved formelen:

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en nucleotidsekvens som koder for det humane interleukin-4 human-interleukin-4-mutein-IS°( Gly-Asn-Phe-Val-His-Gly), human-interleukin-4-mutein-IS°(Ala-Glu-Phe) eller human-interleukin-4-mutein-A1"4.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at det anvendes en nucleotidsekvens som omfatter en sekvens av kodoner definert ved en sekvens av baser som koder for polypeptidet: og hvor verten er en pattedyrcelle.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes en sekvens av kodoner definert ved en sekvens av baser som koder for det følgende polypeptid som er det som er definert i krav 4 sammen med en ledersekvens:

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at det anvendes en sekvens av kodoner definert ved den følgende formel:

7. Nucleinsyre, karakterisert ved at den omfatter en sekvens av nucleotidbaser som er i stand til å kode for et polypeptid som utviser pattedyr-interleukin-4-aktivitet og minst én ytterligere aktivitet valgt fra gruppen bestående av MHC-antigen-induksjonsaktivitet, Fc-epsilon-reseptor-induksjonsaktivitet, GM-CSF-stimulert granulocyttkolonivekstforsterkende aktivitet, interleukin-2-TCGF-forsterkende aktivitet og IgG^ og IgE-induksjonsaktivitet, som fremstilt ifølge krav 1 og som har en sekvens av nucleotidbaser som er minst 75 % homolog med en sekvens av DNA i cDNA-innskuddet i en vektor valgt fra gruppen bestående av pcD-46 og pcD-125.

8. Vektor, karakterisert ved at den er pcD-46 eller pcD-125 som er deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, under henholdsvis nr. 53337 og 67029.