KR19990063653A - 케모킨 억제제 - Google Patents

Abstract

p35로 불리우는 단백질은 케모킨으로서 알려진 복수의 화학주성 자극 시토킨에 결합한다. p35는 염증과 같은, 케모킨에 의해 매개되는 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. p35는 특정 바이러스로 감염된 세포의 배양 상등액으로부터 정제되거나 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 형성될 수 있는 분비 단백질이다. p35를 코딩하는 단리된 DNA 서열은 p35 DNA로 이루어진 발현 벡터 및 정제된 p35 단백질과 함께 제공된다.

Description

케모킨 억제제

케모킨은 급성 및 만성 염증의 매개체로서 영향을 미쳐온 비교적 작은 단백질 과(family)이다. 다른 면역 조절 과정에서의 특정 케모킨의 역할에 대해서도 보고된 바 있다.

케모킨 과의 한 종류는 4개의 보존된 시스테인 중 처음 2개 사이에 존재하는 아미노산에 의해 특징지워지는 반면, 두번째 종류는 2개의 시스테인 잔기 사이에 아미노산이 없다는 것이 특징이다. 첫번째 종류는 C-X-C 분류 또는 α 아과(subfamily)로서 불리우며, 두번째는 C-C 분류 또는 β 아과로서 알려져 있다(Michiel, Bio/Technology 11:739, June 1993 참조).

케모킨은 조직 손상 및 감염 부위로 면역계의 특정 세포를 끌어당기는 화학 주성을 갖는다. 대부분의 α 아과 성분은 호중구를 유인하고 활성화시키며, β 아과 성분은 단핵세포를 유인한다. 특정 β 아과 성분은 또한 호염기성 세포, 호산구 또는 임파구를 보충시키는 것으로 보고되었다.

각종 질환에서의 케모킨의 역할은 문헌(Baggiolini et al. (Advances in Immunology 55:97-179, 1994)에 논의되었다. 1가지 이상의 케모킨에 의해 매개되거나 또는 악화되는 것으로 생각되는 질환 중에는 폐(알레르기 또는 천식과 관련된 염증을 포함함) 및 피부(예를 들면, 건선)의 염증성 질환이 있다. 특정 케모킨은 류머티스성 관절염 및 골관절염 환자의 염증 있는 관절의 활액에서 고 농도로 검출되었다.

케모킨 대식세포 염증성 단백질 1-α(MIP-1α)는 말라리아 환자의 빈혈의 한 원인으로 나타난 조혈 간세포 증식을 억제한다(Burgmann et al., Clinical Immunology and Immunopathology 76:32-36, 1995 참조). 인터루킨-8(IL-8)의 염증전 활성은 패혈증에 대한 유해한 숙주 반응에 역할을 할 수 있다(Marty et al., Crit. Care Med. 22:673-679, 1994 참조). 단핵세포 화학유인성 단백질-1(MCP-1) 및 다른 C-C 케모킨이, 아테롬성 동맥경화증 면으로의 단핵세포의 보충을 통해, 심장혈관 질환에 관련될 가능성에 대해 여러 연구가 행해졌다(Baggiolini et al., 상기 참조, page 146).

케모킨의 억제제는 상기 논의한 질환의 치료에 유용할 것이다. 1가지를 넘는 케모킨을 억제하는 화합물은 특히 바람직한 치료제일 것이다.

발명의 요약

본 발명은 케모킨에 결합할 수 있는 p35로 불리우는 단백질을 제공한다. 케모킨에 의해 매개된 질환을 치료하는 방법은 그러한 질환을 앓고 있는 포유 동물에게 유효량의 p35를 투여하는 것으로 이루어진다.

p35를 코딩하는 단리된 DNA 서열은 p35 DNA로 이루어진 발현 벡터와 함께 본 발명에 제공된다. 재조합 p35 폴리펩티드의 제조 방법은 p35의 발현에 적절한 조건하에서 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양액으로부터 발현된 p35를 회수하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 태양은 우두 바이러스로부터 유래된 p35 DNA, 그것으로 코딩되는 p35 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.

도 1은 실시예 3에 기재된 결합 분석의 결과를 나타낸다. 그 분석은 복수의 다른 케모킨에 대한 p35/Fc 융합 단백질의 결합 능력을 시험하였다. + 부호는 결합 상태가 검출되었음을 나타낸다.

복수의 케모킨에 대한 p35로 명시된 단백질의 결합 능력을 본 발명에서 개시하였다. 본 발명은 케모킨을 p35 폴리펩티드와 접촉시킴으로써 케모킨의 생물학적 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 케모킨에 의해 매개된 질환은 그러한 질환을 앓고 있는 포유 동물에게 유효량의 p35를 투여함으로써 치료된다.

본 발명은 정제된 p35 폴리펩티드 및 그러한 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. p35를 코딩하는 단리된 DNA 서열은 p35 DNA로 이루어진 발현 벡터와 함께 본 발명에 제공된다. 재조합 p35 폴리펩티드의 제조 방법은 p35의 발현에 적절한 조건하에서 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양액으로부터 발현된 p35를 회수하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 태양은 p35 DNA 및 폴리펩티드, 및 그의 용도에 관한 것이다.

우두 p35에 대한 DNA 및 코딩된 아미노산은 각각 서열 1 및 서열 2로 나타내었다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 p35 단백질은 종두 바이러스의 리스터(Lister) 균주의 게놈 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 이 종두 바이러스 p35 단백질에 대한 DNA 및 아미노산 서열은 파텔(Patel) 등의 문헌(J. Gen. Virol. 71:2013-2021, 1990; 본 명세서에 참고로 인용함; 도 4 참조)에 제시되어 있다. 상기한 파텔 등에 의해 기재된 뉴클레오티드 및 코딩된 아미노산 서열은 본 발명에 각각 서열 3 및 서열 4로 나타내었다. 서열 2의 우두 p35 아미노산 서열은 서열 4에 나타낸 종두 바이러스 p35 아미노산 서열과 86% 동일하다.

다른 적합한 p35 단백질은 천연두(두창) 바이러스의 게놈 내의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 이 천연두 p35 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 서열 5에 나타내었다. 그 아미노산 서열(서열 6에 나타냄)은 서열 2의 우두 p35의 것과 82% 동일하며, 서열 4의 종두 p35의 것과 95% 동일하다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 p35 단백질은 서열 2, 4 또는 6의 p35 단백질과 실질적으로 상동성이며, 목적하는 케모킨 결합 특성을 나타내는 폴리펩티드 속을 포함한다. 그러한 p35 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 2 또는 서열 4 또는 서열 6의 서열과 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 동일하다. 본 발명에 제공된 p35 폴리펩티드는 서열 2, 4 및 6의 천연 p35 단백질의 단편 및 변이체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러한 동족체는 다음에 더욱 상세히 논의된다.

특정 바이러스 단백질의 동족체는 포유 동물 세포원으로부터 분리되었다. 따라서, 본 발명은 포유 동물 세포를 비롯한 고등 생물로부터 유래된, 바이러스 p35 단백질의 동족체를 포함한다. 우두 p35 DNA는 다른 바이러스 균주의 게놈 또는 고등 생물의 세포로부터 유래된 핵산 내의 p35 DNA를 검출하기 위해, 교차종 혼성화 방법에서 방사표지되어 프로브로서 사용될 수 있다.

상기 p35 단백질은 분비된 단백질이다. 그 단백질의 N-말단에 있는 소수성 영역은 시그날 펩티드로서 기능하는 것으로 생각된다. 종두 바이러스 리스터 균주 p35의 처음 17 아미노산(서열 4의 -17 내지 -1)은 우두 p35 및 천연두 p35의 처음 16 아미노산(각각 서열 2 및 6의 -16 내지 -1) 처럼, 시그날 서열(상기 파텔 등의 문헌 참조)을 구성하는 것으로 예측되었다. 따라서, 숙성 p35 단백질은 서열 2의 아미노산 1 내지 230, 서열 4의 아미노산 1 내지 241 및 서열 6의 아미노산 1 내지 236으로 이루어진 것을 포함한다.

수개의 p35 단백질의 아미노산 서열의 배열은 오르소폭스 바이러스 p35 단백질에 대한 일치 서열과 함께 마티네쯔-포마레스(Martinez-Pomares) 등의 문헌(Virology 206:591, 1995; 도 3 참조)에 제시되어 있다. 배열된 서열 중 하나는 종두 바이러스의 코펜하겐 균주(VV-Copenhagen)의 오픈 리딩 프레임에 해당한다. VV-Copenhagen 서열은 서열 4의 아미노산 1 내지 241과 동일한 잔기에 의해 이어지는 Met-His-Val이다. VV-Copenhagen p35 단백질은 서열 4의 종두 바이러스 리스터 균주 p35의 시그날 펩티드를 갖고 있지 않지만, 서열 4의 숙성 단백질에 해당하는 잔기를 포함한다.

상기 논의된 시그날 펩티드 및 숙성 p35 단백질에 관하여 당업계의 숙련인은 단백질의 그러한 영역의 경계가 인접하여 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 시그날 펩티드의 분해 부위를 예측하는 컴퓨터 프로그램이 시판되긴 하지만, 분해는 예측된 것과 다른 부위에서 일어날 수 있다. 또한, 단백질 제조가, 1가지를 넘는 부위에서의 시그날 펩티드 분해로 인해 다른 N-말단 아미노산을 갖는 단백질 분자의 혼합물로 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 번역후 과정은 이용된 특별한 발현계에 따라 변화될 수 있다. 따라서, 숙성 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단 아미노산은 예를 들면, 단백질이 발현되는 숙주 세포 유형에 따라 변화될 수 있다.

비-재조합 p35는 하기하는 바와 같이, p35 코딩 바이러스로 감염된 세포의 배양 상등액으로부터 정제될 수 있다. 재조합 p35의 발현 및 정제에 관해서는 아래에 더 설명된다.

케모킨 MCP-1, MCP-3, 란테스(RANTES), 에오탁신(Eotaxin), MIP-1α, MIP-1β 및 C10에 대한 p35의 결합 능력은 실시예 3 및 도 1에 보고되어 있다.

이들 케모킨은 케모킨의 C-C 분류(β아과)의 성분이다. 몇몇 다른 케모킨에 대한 p35의 결합 능력은 유리한 특성이다. 염증 또는 다른 질환이 이러한 하나 이상의 케모킨에 의해 매개될 때, 그 질환은 p35 만을 투여함으로써 치료될 수 있다.

p35에 결합하는 다른 케모킨은 통상의 결합 분석 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 하나의 대안으로서, p35 또는 p35/Fc 단백질을 바이오센서 장치의 칩 상에 고정시킬 수 있다. 그후에, 고정된 p35으로의 케모킨의 결합은 실시예 3에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다.

케모킨의 목록, 그의 아미노산 서열 및 이들 단백질을 더욱 상세히 설명하는 인용문은 본 명세서에 참고로 삽입한 마이클의 문헌(Bio/Technology 11:739, 1993. 6.)에 제시되어 있다. 본 명세서에 참고로 삽입한 바기올리니(Baggiolini) 등의 문헌(Advances in Immunology 55:97-179, 1994)은 케모킨의 공급원, 활성 및 구조적 특징을 포함하여 다수의 케모킨을 설명한다. 다수의 케모킨 단백질은 예를 들면, 케미콘 인터내셔날, 인크.(Chemicon International, Inc.)(Temecula, CA 소재), 펩프로테크, 인크.(PeproTech, Inc.)(Rocky Hill, NJ 소재) 및 겐자임 다이아그노스틱스(Genzyme Diagnostics)(Cambridge, MA 소재)로부터 시판된다.

다른 케모킨은 1가지를 넘는 세포 유형에 대해 화학주성 효과를 발휘한다. 대부분의 C-X-C 아과 성분은 호중구를 유인하고 활성화시키는 반면, C-C 아과 성분은 단핵세포를 유인하지만 일반적으로 호중구에 대한 화학주성 효과를 갖지 않는다. 어떤 C-C 아과 성분은 또한 호염기성 세포, 호산구 또는 임파구를 보충시키는 것으로 보고되었다.

다수의 케모킨 수용체가 확인되었다(Baggiolini et al., 상기 참조, 122-142 참조). 이들 수용체의 분명한 하나의 구조적 특징은 그들이 7개의 트랜스멤브레인 도메인을 함유한다는 것이다.

p35 폴리펩티드의 케모킨 결합 단편은 본 발명에 이용될 수 있다. 케모킨에 대한 p35 단편의 결합 능력은 실시예 3에 기재된 것과 같은 결합 분석을 이용하여 확인할 수 있다. p35 단편은 여러 통상의 기술 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 목적하는 DNA 서열은 예를 들면 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 단편은 또한 전체 길이 클로닝된 DNA 서열의 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 형성되고 아가로스겔 상에서의 전기이동에 의해 분리될 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제 분해 부위(들)를 함유하는 링커는 발현 벡터에 목적하는 DNA 단편을 삽입하는데 이용될 수 있거나 또는 그 단편은 그안에 자연적으로 존재하는 분해 부위에서 분해될 수 있다. 잘 알려진 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)은 또한 원하는 단백질 단편을 코딩하는 DNA 서열을 분리하는데 이용될 수도 있다. 원하는 단편의 경계를 한정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로서 이용된다. 또다른 대안으로서, 공지된 돌연변이 유발 기술은 원하는 지점, 예를 들면 원하는 단편의 최종 아미노산에 대한 코돈의 바로 인접한 다운스트림에서 정지 코돈을 삽입하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 재조합 및 비-재조합의 정제된 p35 폴리펩티드를 제공한다. 원하는 생물학적 활성(예를 들면, 하나 이상의 케모킨에 대한 결합 능력)을 보유하는 천연 p35 단백질의 변이체 및 유도체도 또한 본 발명의 영역 내에 포함된다. p35 변이체는 예를 들면 천연 p35 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 변이에 의해 얻어질 수 있다. 본 명세서에 언급된 p35 변이체는 천연 p35와 실질적으로 상동성이지만, 삭제, 삽입 또는 치환 1가지 이상 때문에 천연 p35의 것과 다른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.

변이 아미노산 서열은 천연 p35 아미노산 서열(예, 서열 2, 4 또는 6의 서열)과 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 동일하다. 본 명세서에 제공된 변이 DNA 서열은 천연 p35 DNA 서열(예, 서열 1, 3 또는 5의 서열)과 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 동일하다. 본 발명의 한 태양에서, p35 DNA 및 아미노산 서열은 서열 1의 DNA 서열 또는 서열 2에 나타낸 아미노산 서열과 80% 이상(바람직하게는 90% 이상) 동일하다. 본 발명의 다른 태양에서, p35 DNA의 아미노산 서열은 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 나타낸 아미노산 서열과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하다.

DNA 또는 아미노산 서열의 일치율은 예를 들면 적당한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 측정될 수 있다. 한 예는 문헌(Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)에 기재된 GAP 컴퓨터 프로그램, 버전 6.0이며 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹(University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG))으로부터 시판된다. GAP 프로그램은 스미쓰(Smith)와 워터맨(Waterman)(Adv. Appl. Math 2:482, 1981)에 의해 변형된, 니들맨(Needleman) 과 운쉬(Wunsch)(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)의 배열 방법을 이용한다. GAP 프로그램에 대한 바람직한 생략성 파라메터로는 (1) 뉴클레오티드에 대해 1진법 비교 매트릭스(동일함에 대해 1 및 비동일함에 대해 0의 값을 가짐), 및 쉬워쯔와 데이호프의 문헌(Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, 353-358, 1979)에 기재된 그리브스코브와 부르게스(Gribskov and Burgess)의 가중 비교 매트릭스(Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986 참조); (2) 각 갭에 대해 3.0의 패널티 및 각 갭에서 각 심볼에 대해 추가의 0.10의 패널티 및 (3) 말단 갭에 대한 0의 패널티를 들 수가 있다.

천연 아미노산 서열의 변화는 많은 공지 기술 중 하나에 의해 이루어질 수 있다. 돌연변이는 천연 서열의 단편에 연결을 가능하게 하는 제한 부위에 의해 플랭킹된, 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특별한 위치에서 도입될 수 있다. 연결에 이어서, 형성된 재작제된 서열은 원하는 아미노산이 삽입, 치환 또는 삭제된 동족체를 코딩한다.

또한, 올리고뉴클레오티드 지시된 부위 특이적 돌연변이 유발 방법은 필요한 치환, 삭제 또는 삽입에 따라 변화된 특별한 코돈을 갖는 변화된 유전자를 제공하는데 이용될 수 있다. 상기 변화 방법은 문헌(Walder et al., Gene 42: 133, 1986; Bauer et al., Gene 37:73, 1985; Craik, BioTechniques, 1985. 1, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985; Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154: 367, 1987; 및 미국 특허 제4,518,584호 및 동 제4,737,462호)에 기재되어 있다.

변이체는 주어진 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기에 의해 대체되는 것을 의미하는, 보존적으로 치환된 서열로 이루어질 수 있다. 보존적 치환의 예로는 하나의 지방족 잔기를 Ile, Val, Leu 또는 Ala과 같은 서로 다른 것으로 치환하는 것, 또는 하나의 극성 잔기를 Lys과 Arg; Glu과 Asp; 또는 Gln과 Asn 사이와 같은 다른 것으로 치환하는 것이 있다. 그러한 다른 보존적 치환, 예를 들면 유사한 소수성 특징을 갖는 전체 영역의 치환이 잘 알려져 있다. 본 발명에 포함되는 보존적으로 치환된 p35 폴리펩티드는 케모킨에 결합하는 능력을 유지하는 것이다. p35 단백질의 특정 태양은 1 내지 10개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 하나의 태양은 서열 2에 나타낸 아미노산 서열 중에 보존적 치환(들)을 포함하는 p35 폴리펩티드에 관한 것이며, 그 보존적으로 치환된 폴리펩티드는 서열 2의 천연 단백질의 것과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다.

또한, p35를 변형시켜 글리코실기, 지질, 인산염, 아세틸기 등과 같은 다른 화학적 잔기를 갖는 공유 결합 또는 집합 콘쥬게이트를 형성함으로써 유도체를 얻을 수 있다. p35의 공유 결합 유도체는 p35 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 또는 p35 아미노산 측쇄 상의 관능기에 화학 잔기를 연결함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 범위내의 p35의 다른 유도체는 예를 들면 N-말단 또는 C-말단 융합물과 같은 재조합 배양액에서의 합성에 의한, p35 또는 그의 단편과 다른 단백질 또는 폴리펩티드의 공유 결합 또는 집합 콘쥬게이트를 포함한다.

p35 단백질은 그의 면역원성 및 항원성을 감소시키도록 처리되거나 또는 유도체화될 수 있다. 그러한 변형은 p35가 개체에게 반복적으로, 예를 들면 만성 질환을 치료하기 위해 투여되는 경우에 바람직할 수 있다. 한가지 방법은 폴리머 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 p35 단백질에 부착시키는 것이다. PEG에 의한 화학적 변형은 많은 단백질의 면역원성 및 항원성을 감소시켰다(Katre, N., J. Immunol. 144:209, 1990; and Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9: 249, 1992 참조). PEG에 의한 변형은 특정 단백질의 혈청 반감기 및 가용성을 증가시키는 것으로 보고되었다. PEG는 예를 들면 리신 잔기에, 글리코실화된 단백질 상의 탄수화물 잔기에, 또는 예를 들면 단백질의 N-말단에 선택적으로 공유 결합될 수도 있다. 소정의 케모킨 결합 특성이 유지되는 것을 확인하기 위해 변형된 p35 단백질을 적당한 결합 분석으로 시험할 수 있다.

p35의 단편은 해당하는 완전 길이 단백질 보다 덜 면역원성일 수 있다. 글리코실화 패턴은 단백질의 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 상기한 바와 같이, 재조합 단백질의 글리코실화는 숙주 세포의 선택에 따라 변화될 수 있다.

p35 폴리펩티드 융합물은 p35의 정제 및 확인을 용이하게 하기 위해 첨가된 펩티드를 포함할 수 있다. 그러한 펩티드로는 예를 들면, 미국 특허 제5,011,912호 및 호프(Hopp) 등의 문헌(Bio/Technology 6: 1204, 1988)에 기재된 폴리-His 또는 항원성 확인 펩티드를 들 수가 있다. 그러한 펩티드는 고항원성이며 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능하게 하는 특정 모노클로날 항체에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하는, FLAG(등록상표) 펩티드, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)(서열 7)이다. 이 서열은 또한 Asp-Lys 쌍에 바로 이어지는 잔기에서 소 점막 엔테로키나아제에 의해 특이적으로 분해된다. 이 펩티드로 캡핑된 융합 단백질은 이. 콜리에서의 세포내 분해에 저항성이 있을 수도 있다. 4E11로 불리우는 마우스 하이브리도마는 특정 이가 금속 양이온의 존재하에 펩티드 DYKDDDDK(서열 7)에 결합하는 모노클로날 항체를 형성하며(미국 특허 제5,011,912호에 기재됨), 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 수탁번호 HB 9259로 기탁되었다.

본 발명은 또한 조합된 천연 패턴 글리코실화되거나 또는 되지 않은 p35 폴리펩티드를 포함한다. 효모 또는 포유 동물 발현계(예를 들면, COS-7 세포)에서 발현된 p35는 발현계의 선택에 따라서 천연 p35 폴리펩티드와 분자량 및 글리코실화 패턴이 유사하거나 또는 약간 상이할 수 있다. 이. 콜리와 같은 박테리아 발현계에서의 p35 폴리펩티드의 발현은 비글리코실화 분자를 제공한다.

아미노산 잔기 또는 서열의 각종 추가 또는 치환, 또는 생물학적 활성 또는 결합에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열의 삭제를 코딩하는 DNA 작제물을 제조할 수 있다. 예를 들면, p35 세포외 도메인내의 N-글리코실화 부위를 변형시켜 글리코실화를 막으면, 포유 동물 및 효모 발현계 내에서의 더욱 상동성이고, 환원된 탄수화물 동족체의 발현이 이루어진다. 진핵 생물 폴리펩티드내의 N-글리코실화 부위는 아미노산 삼중체 Asn-X-Y(여기서, X는 Pro을 제외한 아미노산이고, Y는 Ser 또는 Thr임)에 의해 특징지워진다. 서열 2의 p35 단백질은 아미노산 156-158에서 그러한 하나의 삼중체를 함유한다. 서열 4의 p35 단백질은 아미노산 167-169에서 N-글리코실화 부위를 함유하며, 서열 6의 p35 단백질에서 아미노산 162-164는 N-글리코실화 부위를 구성한다. 이 삼중체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 적절한 변형 결과 Asn 측쇄에 있는 탄수화물 잔기의 부착을 방지하는 치환, 추가 또는 삭제가 일어날 것이다. 예를 들면, Asn이 다른 아미노산에 의해 대체되도록 선택된 단일 뉴클레오티드의 변화는 N-글리코실화 부위를 불활성화시키는데 충분하다. 단백질 중의 N-글리코실화 부위를 불활성화시키는 공지된 기술은 본 명세서에 참고로 인용한 미국 특허 제5,071,972호 및 유럽 특허 제276,846호에 기재된 것을 들 수가 있다.

다른 예에서, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 Cys 잔기에 대한 코돈은 Cys 잔기가 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 대체되도록 변화될 수 있다. 따라서, 재본질화시에 적당하지 않은 분자내 이황화 다리 결합의 형성이 방지된다.

본 발명은 비천연 발생 및 천연 발생 생물학적 활성 p35 변이체 모두를 제공한다. 천연 발생 변이체의 예는 케모킨 결합 특성이 유지된, p35 단백질의 단백질 가수분해로부터 형성되는 단백질이다. 단백질 가수분해에 기인한 변이는 p35 단백질로부터 하나 이상의 말단 아미노산(일반적으로 1-5 말단 아미노산)의 단백질 가수분해 제거로 인한, 다른 유형의 숙주 세포에서의 발현시의 N- 또는 C-말단의 차이를 포함한다. DNA 서열내의 천연 발생 변이는 침묵 돌연변이, 또는 리딩 프레임 내의 이동을 일으키지 않는 결실을 포함할 수 있다.

1개를 초과하는 코돈이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있는 유전자 코드의 공지된 축퇴(degeneracy)로 인해, DNA 서열은 서열 1에 나타낸 것과 다를 수 있고, 여전히 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 p35 단백질을 코딩한다. 그러한 변이 DNA 서열은 침묵 돌연변이(예를 들면, PCR 증폭 중에 일어남)로부터 형성될 수 있고, 천연 서열의 계획적인 돌연변이 유발 생성물일 수 있다.

p35 코딩 DNA의 특별한 태양은 서열 1의 뉴클레오티드 18 내지 758 또는 66 내지 758로 이루어진 단리된 DNA이다. 서열 1의 뉴클레오티드 18 내지 758을 포함하는 DNA는 천연 시그날 펩티드를 포함하는 우두 p35 단백질을 코딩하는 반면, 뉴클레오티드 66 내지 758의 서열을 갖는 DNA는 숙성 형태의 단백질을 코딩한다. 본 발명은 서열 2의 잔기 -16 내지 230 또는 1 내지 230의 아미노산 서열을 포함하는 p35 단백질을 코딩하는 단리된 DNA를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 3의 뉴클레오티드 1 내지 777 또는 52 내지 777을 포함하는 단리된 DNA 뿐만 아니라 서열 5의 뉴클레오티드 1 내지 762 또는 49 내지 762를 포함하는 단리된 DNA를 제공한다.

본 명세서에는 (a) 서열 1, 3 또는 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열, (b) 적당한 또는 아주 엄격한 조건하에서 (a)의 뉴클레오티드 서열에 혼성화를 일으킬 수 있고 생물학상 활성인 p35를 코딩하는 DNA 및 (c) (a) 또는 (b)에 정의된 뉴클레오티드 서열에 대한 유전자 코드의 결과로서 축퇴되는 DNA로부터 선택된, 생물학적 활성 p35를 코딩하는 단리된 DNA 서열이 기재되어 있다. 그러한 DNA 서열에 의해 코딩된 p35 단백질은 본 발명에 포함된다.

본 명세서에 기재된 핵산 서열은 적당히 또는 아주 엄격한 조건하에서 천연 p35 뉴클레오티드 서열에 혼성화를 일으키고 생물학적 활성 p35를 코딩하는 단리된 DNA 및 RNA 서열을 포함한다. 본 발명의 치료 방법에서 사용할 때에, 코딩된 p35의 필요한 생물학적 활성은 케모킨에 결합하는 능력이다. 적당히 엄격한 혼성화 조건은 예를 들면 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기재된 조건을 의미한다. 샘브룩 등에 의해 정의된 적당히 엄격한 조건은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 예비세척액의 사용 및 약 55 ℃, 5 X SSC에서 하룻밤의 혼성화를 포함하며, 50-55 ℃, 2 X SSC, 0.1% SDS에서의 세척에 의해 이어진다. 아주 엄격한 조건은 더욱 고온의 혼성화 및 세척 온도를 포함한다. 당업계의 숙련인은 온도 및 세척액 염 농도가 프로브의 길이와 같은 요인에 따라 필요한 만큼 조정될 수 있다는 것을 알 것이다. p35 코딩 DNA 서열의 예로는 63-68 ℃, 0.1 X SSC/0.1% SDS에서의 세척에 의해 이어지는 68 ℃에서의 혼성화를 포함한 아주 엄격한 조건하에서, 서열 1, 3 또는 5의 뉴클레오티드 서열에 혼성화를 일으킬 것을 들 수가 있다.

적당히 또는 아주 엄격한 조건하에서 천연 DNA 서열에 혼성화를 일으킬, 서열 1, 3 또는 5의 천연 DNA 서열과 다른 변이 DNA에 의해 코딩된 p35 단백질의 예로는 상기한 바와 같은, 불활성화된 N-글리코실화 부위(들)를 포함하는 p35 단편 및 p35 단백질 또는 보존적 아미노산 치환(들)을 들 수가 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 서열 1의 DNA에 혼성화를 일으킬, 우두 바이러스 이외의 생물로부터 유래된 DNA에 의해 코딩된 p35 단백질도 또한 본 발명에 포함된다.

필수적인 케모킨 결합 능력을 가진 변이체는 임의의 적당한 분석에 의해 확인될 수 있다. 바이오센서 장치는 실시예 2에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 또한, p35 변이체의 생물학적 활성은 제공된 케모킨에 결합하기 위해 천연 p35(예를 들면, 서열 2의 p35)와 경쟁하는 것으로 측정할 수 있다(즉, 경쟁적 결합 분석). 경쟁적 결합 분석 중 한가지 유형은 고체 상에 부착된 단백질 A 또는 단백질 G와 Fc 잔기와의 상호 작용을 통해 고체 상에 결합된 p35/Fc 융합 단백질을 이용한다. 고정된 p35/Fc에 대한 표지된 케모킨의 결합을 억제하는 p35 변이체의 능력은 통상의 기술에 의해 분석된다. 적어도 한 종류의 케모킨에 결합할 수 있는 변이체는 예를 들면 그 케모킨에 결합할 수 있거나 또는 그 케모킨에 의해 매개된 질환을 치료할 수 있다.

p35 폴리펩티드는 시험관내 분석시에 시약으로서 이용될 수 있다. 일례로는 생물학적 샘플 또는 세포 배양액 중의 케모킨을 검출하거나 또는 분리하기 위해 스크리닝 분석시에 p35를 사용하는 것을 들 수가 있다.

발현계

본 발명은 p35의 발현을 위한 재조합 발현 벡터, 및 그 발현 벡터로 형질변환된 숙주 세포를 제공한다. 임의의 적당한 발현계가 이용될 수 있다. 그 벡터로는 포유 동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 것과 같은 적당한 전사 또는 번역 조절 뉴클레오티드 서열에 조작가능하게 연결된 p35 DNA 서열을 포함한다. 조절 서열의 예로는 전사 프로모터, 오퍼레이터 또는 인핸서, mRNA 리보좀 결합 부위, 및 전사 및 번역 개시 및 종결을 조절하는 적당한 서열을 들 수 있다. 조절 서열이 p35 DNA 서열과 기능적으로 관련이 있을 때 뉴클레오티드 서열은 조작가능하게 연결된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오티드 서열은 프로모터 뉴클레오티드 서열이 p35 DNA 서열의 전사를 조절하는 경우 p35 DNA 서열에 조작가능하게 연결된다. 일반적으로 복제원에 의해 부여되는, 원하는 숙주 세포에서 복제하는 능력, 및 형질전환체를 확인하게 하는 선택 유전자가 발현 벡터에 추가로 포함될 수도 있다.

필요시에, 천연 시그날 서열은 이종의 시그날 서열로 대체될 수 있다. 예를 들면, 특별한 유형의 숙주 세포로부터 천연 시그날 펩티드 보다 더 고농도의 분비를 촉진시키는 시그날 펩티드가 선택될 수 있다. 이종의 시그날 펩티드(분비 리더)를 코딩하는 DNA 서열은 p35가 시그날 펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 초기에 번역되도록 p35 서열에 프레임으로 융합된다. 그 시그날 펩티드는 세포로부터의 p35의 분비시에 p35 폴리펩티드로부터 분해된다.

p35 폴리펩티드의 발현에 적당한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 세균, 곰팡이, 효모 및 포유 동물 세포 숙주와 함께 이용하기에 적당한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들면 문헌(Pouwels 등, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985))에 기재되어 있다. 본 발명에 설명된 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 p35 폴리펩티드를 생산하는데 무세포 번역 시스템을 이용할 수도 있다.

원핵 세포는 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들면 이. 콜리 또는 바실러스를 포함한다. 형질변환을 위한 적당한 원핵 숙주 세포는 예를 들면 이. 콜리, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속에 속하는 여러가지 다른 종을 포함한다. 이. 콜리와 같은 원핵 숙주 세포에서, p35 폴리펩티드는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하여 원핵 숙주 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 발현을 용이하게 할 수 있다. N-말단 Met는 발현된 재조합 p35 폴리펩티드로부터 분해될 수 있다.

원핵 숙주 세포에 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로 1개 이상의 표현형의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 표현형의 선택가능한 마커 유전자는 예를 들면 항생물질 내성을 부여하거나 또는 독립영양(autotrophic) 요건을 제공하는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 원핵 숙주 세포에 대해 유용한 발현 벡터의 예로는 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)와 같은 시판 플라스미드로부터 유래된 것을 들 수가 있다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 함유하므로, 형질변환된 세포의 확인을 위한 간단한 수단을 제공한다. 적당한 프로모터 및 p35 DNA 서열은 pBR322 벡터에 삽입된다. 다른 시판 벡터로는 예를 들면 pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 pGEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)을 들 수가 있다.

재조합 원핵 숙주 세포 발현 벡터에 통상적으로 사용되는 프로모터로는 β-락타마제(페닐실리나제) 및 락토스 프로모터계 (Chang 등, Nature 275:615, 1978; 및 Goeddel 등, Nature 281:544, 1979), 트립토판(trp) 프로모터계(Goeddel 등, Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; 및 유럽 특허 공개 제36,776호) 및 tac 프로모터 (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982)를 들 수가 있다. 특히 유용한 원핵 숙주 세포 발현계는 파지 λP_L프로모터 및 cI857ts 열불안정성 리프레서 서열을 이용한다. λP_L프로모터의 유도체를 혼입시킨, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수 가능한 플라스미드 벡터는 플라스미드 pHUB2(이. 콜리. 균주 JMB9 (ATCC 37092) 내에 존재함) 및 pPLc28(이. 콜리 RR1 (ATCC 53082) 내에 존재함)을 포함한다.

p35는 또한 효모 숙주 세포로서, 바람직하게는 사카로마이세스 속(예를 들면, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae))로부터 발현될 수 있다. 피치아(Pichia) 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)와 같은 다른 효모 속도 사용될 수 있다. 효모 벡터는 종종 2μ 효모 플라스미드로부터의 복제 서열원, 자율적 복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열 및 선택 마커 유전자를 함유할 것이다. 효모 벡터에 대한 적당한 프로모터 서열로는 특히 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나아제 (Hitzeman 등, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) 또는 다른 글리콜 분해 효소 (Hess 등, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; 및 Holland 등, Biochem. 17:4900, 1978), 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 들 수가 있다. 효모 발현에 사용하기 위한 다른 적당한 벡터 및 프로모터에 대해서는 문헌(Hitzeman, 유럽 특허 공개 제73,657호)에 더 상세히 기재되어 있다. 또다른 대안은 문헌 (Russell 등, J. Biol. Chem. 258:2674, 1982; 및 Beier 등, Nature 300:724, 1982)에 기재된 글루코스 억제성 ADH2 프로모터이다. 효모 및 이. 콜리 모두에서 복제가능한 셔틀 벡터는 이. 콜리에서의 선택 및 복제를 위해 pBR322로부터의 DNA 서열(Amp^r유전자 및 복제원)을 상기 효모 벡터에 삽입함으로써 작제될 수 있다.

효모 α-인자 리더 서열은 p35 폴리펩티드의 분비를 지시하는데 이용될 수 있다(Kurjan 등, Cell 30:933, 1982; 및 Bitter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; 미국 특허 제4,546,082호 및 유럽 특허 제324,274호 참조). 효모 숙주로부터의 재조합 폴리펩티드의 분비를 촉진시키기에 적합한 다른 리더 서열은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다.

효모 형질변환 프로토콜은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 이러한 프로토콜 중의 하나는 문헌 (Hinnen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978)에 기재되어 있다. 힌넨 등의 프로토콜은 0.67% 효모 질소 기질, 0.5% 카스아미노산, 2% 글루코스, 10 ㎍/ml 아데닌 및 20 ㎍/ml 우라실로 이루어진 선택 배지에서 Trp⁺형질변환체를 선택한다.

ADH2 프로모터 서열을 함유하는 벡터에 의해 형질변환된 효모 숙주 세포는 "풍부" 배지에서의 발현을 유도하기 위해 성장될 수 있다. 풍부 배지의 예는 1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 80 ㎍/ml 아데닌 및 80 ㎍/ml 우라실이 보충된 1% 글루코스로 이루어진 것이다. 글루코스가 배지에서 고갈될 때 ADH2 프로모터의 억제 해제가 일어난다.

재조합 p35 폴리펩티드를 발현하는데는 포유 동물 또는 곤충 숙주 세포 배양계도 사용할 수 있다. 해충 세포에서의 이종 단백질의 생성을 위한 바큘로바이러스계는 문헌(Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988))에 기재되어 있다. 포유 동물 기원의 형성된 세포주도 이용될 수 있다. 적당한 포유 동물 숙주 세포주의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7주(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CRL 163), 챠이니스 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포 및 BHK(ATCC CRL 10) 세포주 및 맥마한(McMahan) 등의 문헌(EMBO J. 10: 2821, 1991)에 기재된 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CVI(ATCC CCL 70)로부터 유래된 CV-1/EBNA-1 세포주를 들 수가 있다.

포유 동물 숙주 세포 발현 벡터에 대한 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스 게놈으로부터 삭제될 수 있다. 통상적으로 사용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리오마(Polyoma) 바이러스, 아데노바이러스(Adenovirus) 2, 유인원 바이러스 40(SV 40), 및 사람 사이토메갈로바이러스로부터 유래된다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들면 SV40원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 포유 동물 숙주 세포 내의 구조 유전자 서열의 발현에 요구되는 다른 유전 요소를 제공할 수 있다. 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 이들 둘다를 바이러스 복제원을 함유할 수도 있는 단편으로서 바이러스 게놈으로부터 쉽게 얻을 수 있기 때문에 특히 유용하다(Fiers 등, Nature 273:113, 1978). SV40 바이러스 복제원에 위치한 Hind III 부위부터 Bgl I 부위까지 연장되는 약 250 bp 서열이 포함되는 한, 더 작거나 또는 더 큰 SV40 단편도 사용될 수 있다.

포유 동물 숙주 세포에 사용하기 위한 발현 벡터는 문헌(Okayama and Berg, Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983)에 기재된 바와 같이 작제될 수 있다. C127 마우스 유방 상피 세포 내에서의 포유 동물 cDNA의 안정한 고도의 발현에 유용한 계는 코스만 등의 문헌(Cosman et al., Mol. Immunol. 23:935, 1986)에 기개된 것이다. 코스만 등의 문헌(Nature 312:768, 1984)에 기재된, 고 발현 벡터인 PMLSV N1/N4는 ATCC 39890으로 기탁되었다. 추가의 적당한 포유 동물 발현 벡터는 유럽 특허 공개 제0367566호, 및 PCT 출원 WO91/18982호에 기재되어 있다. 한 태양에서, 벡터는 레트로바이러스로부터 유래된다.

천연 p35 시그날 펩티드는 실시예 1에 기재된 발현계에서 이용된다. 또한, 이종 시그날 서열을 코딩하는 DNA(예를 들면, 포유 동물 단백질로부터 유래됨)가 첨가될 수 있다. 그 예로는 미국 특허 제4,965,195호에 기재된 인터루킨-7(IL-7)에 대한 시그날 서열; 코스만 등의 문헌(Nature 312:768 (1984))에 기재된 인터루킨-2 수용체에 대한 시그날 서열; 유럽 특허 제367,566호에 기재된 인터루킨-4 수용체 시그날 펩티드; 미국 특허 제4,968,607호에 기재된 타입 I 인터루킨-1 수용체 시그날 펩티드; 및 유럽 특허 제460,846호에 기재된 타입 II 인터루킨-1 수용체 시그날 펩티드를 들 수가 있다.

p35 단백질 및 그의 용도

본 발명은 상기한 바와 같은 재조합 발현계에 의해 생산되거나 또는 천연 발생 세포로부터 정제될 수 있는, 정제된 p35 폴리펩티드를 제공한다. 일정한 순도는 단백질의 용도에 좌우된다. 예를 들면, 단백질이 생체 내에서 투여될 때에는 비교적 고도의 순도가 필요하다.

p35는 다른 단백질에 해당하는 단백질 밴드가 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기이동(SDS-PAGE)에 의해 검출될 수 없도록 정제되는 것이 유리하다. 당 업계의 숙련인은 시차 글리코실화, 번역후 과정의 변화 등으로 인해 p35 단백질에 해당하는 복수의 밴드가 SDS-PAGE에 의해 검출될 수 있다는 것을 알 것이다. p35 단백질의 제조는 다른 (비-p35) 단백질에 해당하는 밴드가 가시화되지 않는 한 정제된 것으로 간주한다. p35는 가장 바람직하게는 SDS-PAGE에 의한 분석 시에 단일 단백질 밴드에 의해 나타나는 바와 같이 실질적인 동종으로 정제된다. 단백질 밴드는 은 염색, 쿠마시 블루 염색에 의해, 또는 (단백질이 방사표지된 경우) 자동방사선 사진술에 의해 가시화될 수 있다.

p35의 제조하는 한 과정은 p35가 발현되는 조건하에서 p35를 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 발현 벡터로 형질변환된 숙주 세포를 배양하는 것으로 이루어진다. 그후에, p35 단백질은 표준 방법을 이용하여 세포 배양액으로부터 회수된다. 발현 벡터는, p35가 숙주 세포로부터 분비되고 배지로부터 회수될 수 있도록, p35의 N-말단에 융합된 시그날 펩티드를 코딩하는 것이 유리하다.

예를 들면, 배지는 먼저 시판 단백질 농축 필터, 예를 들면 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계 이후에는, 농축물을 겔 여과 배지와 같은 정제 매트릭스에 가할 수 있다. 별법으로, 음이온 교환 수지, 예를 들면 펜던트 디에틸아미노에틸(DEAE)기를 갖는 매트릭스 또는 기질이 이용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 종류일 수 있다. 별법으로, 양이온 교환 단계가 이용될 수도 있다. 적당한 양이온 교환기는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 각종 불용성 매트릭스를 포함한다. 술포프로필기가 바람직하다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 배지(예를 들면, 펜던트 메틸 또는 다른 지방족기를 갖는 실리카겔)을 사용하는 1회 이상의 역상 고속 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 p35의 추가 정제에 사용할 수 있다. 실질적으로 상동성인 재조합 단백질을 제공하는데 상기 정제 단계의 일부 또는 전부를 다양하게 조합하여 사용할 수도 있다.

p35에 결합하는 항체를 함유하는 면역친화성 칼럼을 이용할 수도 있다. 실시예 4는 p35 단백질과 반응성인 모노클로날 항체를 형성하기 위해 p35 단백질을 이용하는 절차를 기재하고 있다.

세균 배양액에서 생산된 재조합 단백질은 일반적으로 숙주 세포의 초기 분열, 원심분리, 불용성 폴리펩티드인 경우 세포 펠릿으로부터의 추출 또는 가용성 폴리펩티드인 경우 상등액으로부터의 추출에 이어서 1회 이상의 농축, 염석, 이온 교환, 친화성 정제 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 분리된다. 마지막으로, 최종 정제 단계에는 RP-HPLC를 사용할 수 있다. 미생물 세포는 냉동-해동 사이클, 음파분해, 기계적 분열 또는 세포 용해제의 이용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 파괴할 수 있다.

형질변환된 효모 숙주 세포는 분비된 폴리펩티드로서 p35 폴리펩티드를 발현하는데 바람직하게 이용된다. 이것은 정제를 간단하게 한다. 효모 숙주 세포 발효로부터 얻은 분비된 재조합 폴리펩티드는 문헌(Urdal et al., J. Chromatog. 296:171, 1984)에 기재된 바와 유사한 방법으로 정제될 수 있다. 우르달 등은 예비 HPLC 칼럼 상에서 재조합 인간 IL-2를 정제하기 위한 2회 연속의 역상 HPLC 단계를 설명하고 있다.

본 발명의 한 태양에서, 비재조합 p35는 본 명세서에 참고로 인용한 파텔 등의 문헌(Patel et al., J. Gen. Virol. 71:2013-2021, 1990, 특히 page 2014, column one)에 기재된 것과 유사한 절차에 의해 정제된다. 간단하게 설명하면, 적합한 세포(예를 들면, 토끼 신장 세포 또는 CV1 세포)를 우두 바이러스 또는 종두 바이러스 균주 리스터로 감염시키고, 인큐베이션시켜 세포로부터 p35가 분비되도록 하였다. 배양 상등액을 모으고, 세포를 (예를 들면, 원심분리시켜) 제거하고, 상등액을 이온 교환 칼럼에 넣었다. 단백질을 칼럼으로부터 선형 염 구배로 용출시키고 원하는 p35 단백질을 함유하는 분획물을 회수하였다.

p35 폴리펩티드의 특정 용도는 그의 케모킨 결합성으로부터 얻게 된 것이다. p35의 용도 중 하나는 단백질 정제 절차에서 시약으로서 사용되는 것이다. p35 또는 p35/Fc 융합 단백질을 통상의 기술에 의해 고상 지지체 물질에 부착시키고 그것을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 케모킨을 정제할 수 있다. 이 용도는 실시예 2에 예시되어 있다.

p35는 또한 케모킨의 생물학적 활성을 억제하는데 사용되기도 한다. 이 용도는 실시예 3에 보고된 바와 같이 p35가 케모킨에 결합한다는 예상치 못한 발견으로부터 생겨난 것이다. 몇 개의 다른 케모킨에 결합하는 p35의 능력은 특히 유리한 특성이다.

케모킨은 조직 손상 및 감염 부위에 면역계의 특정 세포를 유인하는 화학주성을 갖는다. 대부분의 α(CXC) 아과 성분은 호중구를 유인하고 활성화시키는 반면, β(C-C) 아과 성분은 일반적으로 단핵세포를 유인한다. 특정 β 아과 성분은 또한 호염기성 세포, 호산구 또는 임파구를 보충시키는 것으로 보고되었다.

케모킨은 만성 및 급성 염증의 매개체로서 알려져 있다. 케모킨의 각종 질환에서의 역할에 대한 연구는 본 발명에 참고로 인용한 문헌(Baggiolini et al. (Advances in Immunology 55:97-179, 1994, 특히 142-147 pages)에 보고되어 있다. 하나 이상의 케모킨에 의해 적어도 일부는 매개되는 것으로 생각되는 질환 중에는 폐 및 피부의 염증성 질환 및 관절염과 관련된 염증이 있다. 그 예로는 알레르기 또는 천식과 관련된 폐렴이 있다. 인터루킨-8(IL-8), C-X-C 케모킨은 특발증 폐동맥 섬유증에서 중성호성 폐포염을 일으키는데 역할을 하는 것으로 생각된다(Baggiolini et al., 상기 참조, 144-45 pages). 단핵세포 화학유인성 단백질-1(MCP-1), C-C 케모킨은 또한 폐섬유증과 관련되어 있다(Baggiolini et al., 상기 참조, 144-45 pages). 인간 MCP-1은 종종 단핵세포 화학주성 및 활성화 인자(MCAF)로서 불리우며, 마우스 MCP-1에 대한 별칭은 JE이다.

IL-8의 과도생성은 피부의 염증성 질환인 건선에 관련된다(Baggiolini et al., 상기 참조, 144 pages). 특정 케모킨은 류머티스성 관절염 및 골관절염 환자의 염증 있는 관절의 활액에서 고농도로 검출되었다(Baggiolini et al., 상기 참조, 143-44 pages).

C-C 케모킨 대식세포 염증성 단백질-1α(MIP-1α)는 말라리아 환자의 빈혈을 일으키는 것으로 나타난 조혈 간세포 증식을 억제한다(Burgmann et al., Clinical Immunology and Immunopathology 76:32-36, 1995 참조). 케모킨은 바이러스 감염과 관련된 특정 질환에 역할을 하는 것으로 생각된다. 동형접합체 MIP-1α 돌연변이(-/-) 마우스에 대한 연구 결과 MIP-1α가 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 및 콕삭키바이러스(coxsackievirus) B3(CVB3)인 바이러스에 의해 유도된 염증의 매개체라는 것이 밝혀졌다(Cook et al., Science, 269:1583, 1995 참조). CVB3 감염은 젊은 성인층에서 심근염을 일으킨다. 이 연구는 심근염과 관련된 심장 손상이 (적어도 부분적으로, 아마도 대부분) 보충된 염증성 세포의 작용으로부터 얻은 결과 대신에 단지 바이러스 매개된 세포붕해 탓만이 아니라는 것을 밝혀냈다(Cook et al., 상기 참조, 1585 pages, column 1). 저자는 MIP-1α (-/-) 마우스에서의 심근염이 일어나지 않는 것은 아마도 감염된 심장내의 단핵 세포를 보충하거나 또는 유지하는 능력이 없기 때문일 것이라고 발표하였다(Cook et al., 상기 참조, 1584 pages, column 3). 인플루엔자 감염된 MIP-1α (-/-) 돌연변이 마우스에서는 T-세포 의존성 바이러스 제거가 지연되긴 하였지만, 폐렴 증상 감소가 관찰되었다(Cook et al., 상기 참조). 저자는 MIP-1α가 인플루엔자 바이러스 유도된 폐렴의 한 원인이 된다고 결론지었다.

MIP-1α는 또한 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 중추 신경계의 CD4⁺T-세포 매개된 염증성 탈수(脫髓) 질환의 병인에 역할을 하는 것으로 생각된다(Karpus et al., J. Immunol., 155:5003, 1995 참조). EAE는 인간 질환 다발성 경화증의 모델로 인정된다.

IL-8의 염증전 활성은 패혈증에 대한 유해한 숙주 반응에 역할을 할 수 있다(Marty et al., Crit. Care Med. 22:673-679, 1994 참조). MCP-1 및 다른 C-C 케모킨이, 아테롬성 동맥경화증 면으로의 단핵세포의 보충을 통해, 심장혈관 질환에 관련될 가능성에 대해 여러 연구가 행해졌다(Baggiolini et al., 상기 참조, page 146).

C-C 아과의 성분인 에오탁신은 호산구에 특이적인 것으로 보고된 화학유인제이다. 호산구에 의해 발생되는 인자는 과감작 반응의 한 원인이 된다. 알레르기 천식 개체의 폐에서는, 호산구가 축적되고 과립감소되었다. 세포독성 과립 단백질의 방출은 폐 조직 손상을 악화시킨다. 에오탁신을 코딩하는 DNA의 클로닝 및 그 단백질의 툭정 기능성은 문헌(Ponath et al., J. Clin. Invest., 97:604, 1996)에 기재되어 있다.

RANTES는 호산구, 단핵세포 및 CD45RO⁺메모리 T 임파구에 대해 화학 유인제로서 기능한다(Schall et al., Nature, 347:669, 1990; Stellato et al., J. Immunol., 155:410, 1995 참조). RANTES는 염증 상태 중에 기관내의 세포 보충에 기여함으로써 천식, 비염 및 용종과 같은 질환의 병인에 역할을 할 수 있다(Stellato et al., 상기 참조).

본 발명은 케모킨에 의해 매개된 질환을 앓는 포유 동물에게 유효량의 p35 폴리펩티드를 투여하는 것으로 이루어진, 케모킨에 의해 매개된 질환의 치료 방법을 제공한다. 제한되는 것은 아니지만 천연 p35 단백질 및 변이체, 유도체, 올리고머 및 그의 생물학적 활성 단편 뿐만 아니라 p35로 이루어진 융합 단백질을 비롯한 본 명세서에 기재된 임의 형태의 p35 폴리펩티드를 이용할 수 있다. 본 발명의 특별한 태양에서, 서열 2의 우두 p35의 숙성 형태, 서열 4의 종두 바이러스 p35 또는 서열 6의 천연두(두창) p35의 숙성 형태가 이용될 수 있다.

케모킨이 질환을 적어도 부분적으로 야기시키거나 또는 촉진시키거나, 또는 악화시킨다면 그 질환은 케모킨에 의해 매개된 것이라 한다. 케모킨은 생체내의 특별한 부위에 세포를 보충시킴으로써 또는 다른 생물학적 활성 분자에 대한 케모킨의 효과를 통해 간접적으로 질환을 야기시킬 수 있다. 본 발명의 특정 태양에서, 그 질환은 실시예 3의 분석에서 p35에 결합하는 것으로 입증된 1가지 이상의 케모킨에 의해 매개된다.

본 발명의 방법의 특정 태양에서, p35는 세포, 특히 염증 또는 자가면역 반응에 관계된 세포의 케모킨 매개된 보충을 억제하기 위해 투여된다. 따라서, p35는 예를 들면, 염증 또는 조직 손상 부위에서 그러한 세포의 유입으로부터 생긴 질환을 완화시키는데 이용된다. 예증하기 위해, p35는 폐 조직 손상 또는 염증 부위에 호산구의 유입을 억제하기 위해 투여될 수 있다. p35 단백질은 케모킨이 역할을 하는 활성화된 T-세포 매개 또는 단핵세포 매개 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.

p35는 바람직하게는 제약 조성물의 형태로 투여된다. p35 단백질은 제약학적으로 유용한 조성물을 제조하는데 사용된 공지 방법에 따라 제형화될 수 있다. 제약 제제에 통상적으로 이용되는 성분은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Company]에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 유효량의 정제된 p35 폴리펩티드 및 적합한 (예를 들면 제약학상 허용되는) 희석제, 부형제 또는 담체로 이루어진다. 그러한 담체는 이용된 투약량 및 농도에서 환자에 대해 비독성이어야 한다. 조성물은 또한 적합한 유화제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 통상적으로, 그러한 조성물의 제조는 p35 폴리펩티드와 완충액, 항산화제, 예를 들면 아스코르브산, 저분자량(약 10 잔기 미만) 펩티드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란을 포함한 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들면 EDTA, 글루타티온 또는 다른 안정화제 및 부형제와의 배합을 필요로 할 수 있다. 중성 완충 염수는 적절한 희석제의 하나이다. 본 발명에서 예상된 조성물 중에는 흡입에 적합한 제약 조성물이 있다.

p35는 중합성 화합물(예를 들면, 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 히드로겔, 덱스트란 등)에 혼입되거나, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 미셀, 유니라멜 또는 멀티라멜 비히클, 진핵 환영 세포 또는 구아세포에 혼입될 수 있다. 그러한 조성물은 p35의 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 정화 속도에 영향을 미칠 것이며, 사용 용도에 따라 선택된다.

치료 용도를 위해서, 조성물은 징후 및 환자에게 적합한 방법 및 투약량으로 투여된다. 투여량은 케모킨의 생체내 활성을 억제함으로써 질환을 개선시키는데 효과적일 것이다. 당업계의 숙련인이 주지하고 있는 바와 같이, 치료학적으로 유효한 투약량은 질환의 특성 및 심도, 신체내의 환부 조직(예를 들면, 염증 부위)의 위치, 환자의 연령, 상태 및 체격과 같은 인자에 따라 변화될 것이다. 제한되는 것은 아니지만 정맥내 또는 국소 주사, 흡입, 지속 주입, 수술 중의 국소 주입 또는 이식물(예를 들면, 겔, 멤브레인 등)로부터의 지연 방출을 포함한 질환의 특성에 따라 적당한 경로로 투여될 수 있다.

p35의 올리고머 형태

본 발명은 이량체, 삼량체 또는 고 올리고머와 같은 올리고머 형태의 p35 폴리펩티드를 포함한다. 올리고머는 다른 p35 폴리펩티드 상의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 형성될 수 있다. 다른 태양에서, p35 폴리펩티드에 융합된 펩티드 잔기 사이의 공유 또는 비공유 결합 상호작용에 의해 연결된 2 내지 4개의 p35 폴리펩티드로 이루어진다. 그러한 펩티드 잔기는 펩티드 링커(스페이서) 또는 올리고머화를 촉진시키는 특성을 갖는 펩티드일 수 있다. 부착된 p35 폴리펩티드의 올리고머화를 촉진시킬 수 있는 펩티드 중에는 항체로부터 유래된 로이신 지퍼 및 특정 폴리펩티드가 있다. 본 발명에는 p35 올리고머를 코딩하는 DNA 서열 또는 그러한 올리고머의 성분인 융합 단백질이 제공된다.

항체 유도된 폴리펩티드(Fc 도메인을 포함)의 여러 부분에 융합된 이종 폴리펩티드로 이루어진 융합 단백질의 제조는 본 명세서에 참고로 인용한 문헌(Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991), Byrn et al. (Nature 344:667, 1990), and Hollenbaugh and Aruffo("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19-11, 1992))에 기재되어 있다. 본 발명의 한 태양에서, p35 이량체는 당해 케모킨의 p35의 결합을 간섭하지 않도록 항체로부터 유래된 Fc 영역 폴리펩티드에 p35를 융합시킴으로써 형성된다. p35/Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합물은 적절한 발현 벡터로 삽입된다. p35/Fc 융합 단백질은 항체 분자와 같이 집합되고, 그 결과 Fc 폴리펩티드 사이에 쇄간 이황화 결합이 형성되고, 이가 p35가 형성된다.

적절한 Fc 폴리펩티드 중의 하나는 본 명세서에 참고로 인용한 PCT 출원 WO93/10151호에 기재된 인간 IgG1로부터 유래된 천연 Fc 영역 폴리펩티드이다. 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 제5,457,035호에 기재된 Fc 뮤테인이다. 뮤테인의 아미노산 서열은, 아미노산 19가 Leu에서 Ala로 변화되고, 아미노산 20이 Leu에서 Glu로 변화되고, 아미노산 22가 Gly에서 Ala로 변화된 것을 제외하고는 WO93/10151호에 기재된 천연 Fc 서열의 것과 동일하다. 이 뮤테인 Fc는 면역글로불린 수용체에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.

다른 태양에서, p35는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 부분에 대해 치환될 수 있다. 융합 단백질이 항체의 중쇄 및 경쇄 모두로 만들어진다면, 4개의 p35 폴리펩티드를 갖는 p35 올리고머를 형성할 수 있다.

또한, 올리고머 p35는 펩티드 링커를 통해 연결된 2개 이상의 p35 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 그 예로는 미국 특허 제5,073,627호(본 명세서에 참고로 인용함)에 기재된 펩티드 링커를 포함한다. 펩티드 링커에 의해 분리된 복수의 p35 폴리펩티드로 이루어진 융합 단백질은 통상의 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

p35 올리고머의 다른 제조 방법은 로이신 지퍼의 사용을 포함한다. 로이신 지퍼 도메인은 그들이 발견된 단백질의 올리고머화를 촉진시키는 펩티드이다. 로이신 지퍼는 원래는 수개의 DNA-결합 단백질에서 확인되었고(Landschulz et al., Science 240:1759, 1988) 이후에는 여러 다른 단백질에서 발견되었다. 알려진 로이신 지퍼 중에는 천연 발생 펩티드 및 이량체화하거나 또는 삼량체화한 그의 유도체가 있다. p35 올리고머의 제조에 적합한 로이신 지퍼 도메인의 예는 본 명세서에 참고로 인용한 PCT 출원 WO 94/10308에 기재되어 있다. 용액 중에서 이량체화하거나 또는 삼량체화한 펩티드에 융합된 p35 폴리펩티드로 이루어진 재조합 융합 단백질은 적당한 숙주 세포에서 발현되고, 형성된 가용성 올리고머 p35는 배양 상등액으로부터 회수된다.

항체

p35 폴리펩티드는 통상의 절차에 의해 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 비롯한 항체를 형성하기 위한 면역원으로서 이용될 수 있다(예를 들면, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al., eds., Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988) 참조). p35에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 형성하기 위한 방법 중 하나를 실시예 4에 기재하였다.

항원 결합 항체 단편 및 유도체는 통상의 기술에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, F(ab') 및 F(ab')₂단편이다. 유도체의 한 유형은 마우스 항체로부터 얻은 가변성 (또는 항원-결합) 영역, 및 인간 항체의 일정 영역으로 이루어진 키메릭 항체이다. 키메릭 및 추가 처리된 항체의 제조 과정은 문헌(Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS USA 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989), and Winter and Harris (TIPS 14:139, 1993. 5))에 기재되어 있다.

p35와 면역반응성인 항체는 예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 p35를 정제하는데 이용될 수 있다. 항체는 또한 예를 들면, 시험관내 분석에서 p35를 검출하는데 이용될 수도 있다.

핵산 단편

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 p35 뉴클레오티드 서열의 단편을 제공한다. 그러한 단편은 바람직하게는 서열 1, 3 또는 5에 나타낸 서열의 약 17 이상 연속 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 30 이상 연속 뉴클레오티드로 이루어진다. 상기 단편의 DNA 및 RNA 보체는 p35 DNA의 단일 가닥 및 이중 가닥 형태와 함께 본 발명에 제공된다.

그러한 p35 핵산 단편의 용도 중에서는 프로브로서 사용되는 것이 있다. 그러한 프로브는 추가의 바이러스 균주로부터 p35 DNA를 분리하기 위한 교차종 혼성화 절차에 이용될 수 있다. 그 프로브는 또한 시험관내 분석 및 노던 및 써던 블롯과 같은 방법에서 p35 핵산의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다. 그러한 절차는 잘 알려져 있으며, 당업계의 숙련인은 특별한 용도에 따라서 적당한 길이의 프로브를 선택할 수 있다. 프로브는 통상의 기술에 의해 표지(예를 들면,³²P로)될 수 있다.

p35 핵산 단편은 또한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머로서 사용될 수 있다. 원하는 p35 DNA 서열의 말단에 대응하는 5' 및 3' 프라이머는 통상의 PCR 기술을 이용하여 DNA를 분리하고 증폭시키는데 이용된다.

다음 실시예는 특별한 태양을 예시하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 영역을 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: p35/Fc 융합 단백질의 제조

이 실시예는 항체로부터 유래된 Fc 영역 폴리펩티드에 융합된 p35로 이루어진 융합 단백질의 제조를 기재하고 있다. p35/Fc 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 다음과 같이 작제하였다.

서열 2(아미노산 -16 내지 230)의 p35 단백질을 코딩하는 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 분리하였다. PCR에서 5' 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 DNA 서열의 뉴클레오티드 1 내지 24를 포함하였고 Not I 제한 부위 업스트림을 첨가한 추가 서열을 함유하였다. 3' 프라이머는 서열 1의 DNA 서열(종결 코돈을 포함하지 않음)의 뉴클레오티드 733 내지 755에 상보적인 뉴클레오티드, Fc 폴리펩티드의 처음 2개의 아미노산을 코딩하는 다운스트림 서열 및 p35 및 Fc 서열의 Bgl II 제한 부위 다운스트림을 첨가한 서열을 포함하였다.

p35 오픈 리딩 프레임을 포함한 우두 DNA를 함유한 재조합 벡터를 통상의 절차에 따라 실시한 PCR에서 주형으로 이용하였다. 증폭된 DNA를 Not I 및 Bgl II로 분해하였고, 원하는 단편을 아가로스 겔 상의 전기이동에 의해 정제하였다.

인간 IgG1 항체의 Fc 영역을 코딩하는 DNA 단편을, 클로닝된 Fc-코딩 DNA를 함유하는 벡터를 Bgl II 및 Not I로 분해시켜 분리하였다. Bgl II는 Bgl II 부위가 Fc 폴리펩티드의 아미노산 3개 및 4개에 대한 코돈을 포함하도록 Fc 코딩 서열의 5' 말단 부근에 도입된 독특한 Bgl II 부위에서 분해시킨다. Not I은 Fc 코딩 서열의 다운스트림을 분해시킨다. Fc 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 코딩된 아미노산 서열과 함께 본 명세서에 참고로 인용한 PCT 출원 공개 WO93/10151호에 기재되어 있다.

삼방향 연결에서, 상기 p35 코딩 DNA 및 Fc 코딩 DNA를 Not I로 분해하고 포스파타아제로 처리한 발현 벡터에 삽입하여 삽입물 없는 임의의 벡터 DNA의 재순환을 최소화하였다. 벡터 pDC406(McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991에 기재됨)은 이. 콜리에서 복제할 수도 있는 포유 동물 발현 벡터이다.

이. 콜리 세포를 연결 혼합물로 트랜스펙션시키고 원하는 재조합 벡터를 분리하였다. 그 벡터는 Fc 폴리펩티드의 N-말단에 융합된, 서열 2의 p35 서열의 아미노산 -16 내지 230을 코딩한다. 코딩된 Fc 폴리펩티드는 N-말단 힌지 영역에서부터 천연 C-말단까지 연장되어 있다. 즉, 거의 완전 길이 항체 Fc 영역이다.

CV-1/EBNA-1 세포 (ATCC CRL 10478)를 통상의 절차에 의해 재조합 벡터로 트랜스펙션시켰다. CV1-EBNA-1 세포주는 맥마한(McMahan) 등의 문헌(EMBO J. 10: 2821, 1991)에 기재된 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV-1(ATCC CCL 70)로부터 유래되었다. 트랜스펙션된 세포를 배양시켜 배지로 분비된 p35/Fc 융합 단백질의 순간 발현이 일어나도록 하였다. 분비된 단백질은 Fc 폴리펩티드에 융합된, p35의 숙성 형태를 함유한다. p35/Fc 단백질은 이량체를 형성하는 것으로 생각되며, 그러한 2가지의 융합 단백질은 그의 Fc 잔기 사이를 형성하는 이황화 결합에 의해 연결된다. p35/Fc 단백질을 단백질 A 보유 크로마토그래피 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 배지로부터 회수하였다.

실시예 2: p35를 결합시키는 인자의 확인

실시예 1에 기재된 p35/Fc 융합 단백질을 결합시키는 능력에 대해 수타의 세포주를 시험하였다. 제한되는 것은 아니지만, B-세포 및 T-세포(활성화 및 비활성화됨), 대식 세포, 상피 세포 및 섬유아세포를 비롯한 각종 유형의 정상 및 종양 세포를 시험하였다. p35/Fc에 결합한 세포주는 없었다.

임의의 분비된 단백질이 p35/Fc에 결합할 것인지를 확인하기 위하여 세포주의 표시 패널로부터 얻은 상등액을 시험하였다. p35/Fc 단백질을 다음과 같이 바이오센서 장치의 칩 상에 고정시켰다. Fc 영역에 대한 염소 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania)를 표준 기술에 의해 비아코어 프로세싱 유닛(BIAcore Processing Unit(Pharmacia Biosensor))의 칩에 화학적으로 결합시켰다. 그후에, p35/Fc 단백질을 융합 단백질의 Fc 잔기와 항체와의 상호작용을 통해 고정된 염소 항-인간 IgG에 결합시켰다.

세포주의 배양액으로부터 얻은 상등액을 칩을 가로질러 흐르도록 하였다. 한 세포주, TE71로 불리우는 마우스 흉선 상피 세포주로부터 얻은 배지는 p35/Fc에 결합한 단백질을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 결합은 바이오센서 상의 암시적인 공명 이동으로 표시되었다.

그후에, TE71을³⁵S로 변형 표지시켜 그 세포에 의해 생산된 단백질이 가시화 될 수 있도록 하였다. p35/Fc는 TE71 배양 상등액으로부터 얻은 확산 25 kD 단백질을 면역침전시키는 것으로 밝혀졌다. 25 kD 단백질을 p35/Fc를 함유하는 칼럼을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 아미노산 서열의 확인 결과 25 kD 단백질이 JE 또는 마우스 단핵세포 화학유인성 단백질-1(MCP-1)(Rollins, PNAS 85:3738, 1988)로 알려진 케모킨인 것으로 밝혀졌다.

실시예 3: p35에 결합하는 케모킨

JE는 p35/Fc에 결합하였으므로, 다른 케모킨에 대해 바이오센서 상에 고정된 우두 p35/Fc에 결합하는 능력을 시험하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었으며, 여기서 +는 결합을 나타내는 것이다.

실시예 4: p35에 대한 모노클로날 항체

이 실시예는 p35에 대한 모노클로날 항체의 제조를 예시하는것이다. 정제된 p35(또는 그의 면역원성 단편)를 이용하여 미국 특허 제4,411,993호에 기재된 바와 같은 통상의 기술을 이용하여 모노클로날 항체를 생산하였다. 간단하게 설명하면, 마우스를 완전 프로인트 보조액에 유화된 면역원으로서의 p35로 면역화시키고 10-100 ㎍의 양으로 피하 또는 복강내 주입하였다. 10일 내지 12일 후에, 면역화된 동물을 불완전 프로인트(Freund's) 보조액에 유화된 추가의 p35로 추가로 면역화시켰다. 그후에, 마우스를 1주일 내지 2주일 마다의 면역화 스케쥴로 정기적으로 추가로 면역화시켰다. 혈청 시료를 도트 블롯 분석 또는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에 의해 p35를 시험하기 위해 안와(眼窩) 뒤 (retro-orbital) 출혈 또는 꼬리 끝(tail-tip) 절제에 의해 정기적으로 취하였다.

적절한 항체 타이터의 검측에 이어서, 양성 동물에게 염수 중의 p35를 추가로 정맥내 주사하였다. 3 내지 4일 후에, 동물을 희생시키고, 비장 세포를 수거하고, 비장 세포를 마우스의 골수종 세포주, 예를 들면 NS1 또는 바람직하게는 P3x63Ag8.653(ATCC CRL 1580)에 융합시켰다. 융합물은 하이브리도마 세포를 형성시켰고, 이것을 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 선택 배지 중의 다중 마이크로타이터 플레이트에 놓아서 비융합된 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제하였다.

하이브리도마 세포를 문헌(Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971; 및 미국 특허 제4,703,004호)에 기재된 기술에 따라 정제된 p35에 대한 반응성에 대해 ELISA법으로 스크리닝하였다. 바람직한 스크리닝 기술은 벡크만(Beckmann) 등의 문헌(J. Immunol. 144: 4212, 1990)에 기재된 항체 포획 기술이다. 양성 하이브리도마 세포는 공통 유전형 Balb/c 마우스에 복강내 주입하여 고농도의 항-p35 모노클로날 항체를 함유하는 복수증을 유발할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 각종 기술에 의해 플라스크 또는 롤러 병 중에서 시험관내 성장시킬 수 있다. 복수증 마우스에서 형성된 모노클로날 항체는 암모늄 설페이트 침전에 이어서 겔 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 별법으로, p35에 대한 결합을 기초로 한 친화성 크로마토그래피와 같은, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합을 기초로 한 친화성 크로마토그래피가 사용될 수도 있다.

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인: 스미쓰, 크레이그 에이.

(ii) 발명의 명칭: 케모킨 억제제

(iii) 서열수: 7

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 임뮤넥스 코포레이션

(B) 거리: 유니버시티 스트리트 51

(C) 도시: 시애틀

(D) 주: 워싱톤

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 98101

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: 애플 파워 맥킨토쉬

(C) 작동 시스템: 애플 시스템 7.5.3

(D) 소프트웨어: 마이크로소프트 워드, 버전 6.0.1

(vi) 현출원 데이타:

(A) 출원번호: -미정-

(B) 출원일: 1996. 9. 26

(C) 분류:

(vii) 선행 출원 데이타:

(A) 출원번호: US 08/575,715

(B) 출원일: 1995. 12. 20

(vii) 선행 출원 데이타:

(A) 출원번호: US 08/537,324

(B) 출원일: 1995. 9. 29

(viii) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 앤더슨, 캐서린 에이.

(B) 등록 번호: 32,172

(C) 참조/사건 번호: 2620-WO

(ix) 통신 정보:

(A) 전화: 206-587-0430

(B) 팩스: 206-233-0644

(C) 텔렉스: 756822

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 758 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가상: 아님

(iv) 안티센스: 아님

(vii) 직접 공급원:

(B) 클론: 우두 p35

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: CDS

(B) 위치: 18..758

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: 매트 펩티드

(B) 위치: 66..755

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: 시그 펩티드

(B) 위치: 18..65

(xi) 서열 설명: 서열 1:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 247 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명: 서열 2:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 777 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(iii) 가상: 아님

(iv) 안티센스: 아님

(vii) 직접 공급원:

(B) 클론: 종두 p35

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: CDS

(B) 위치: 1..777

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: 매트 펩티드

(B) 위치: 52..774

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: 시그 펩티드

(B) 위치: 1..51

(xi) 서열 설명: 서열 3:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 259 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명: 서열 4:

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 762 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA

(iii) 가상: 아님

(iv) 안티센스: 아님

(vii) 직접 공급원:

(B) 클론: 천연두 p5

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: CDS

(B) 위치: 1..762

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: 매트 펩티드

(B) 위치: 49..759

(ix) 특징:

(A) 명칭/기호: 시그 펩티드

(B) 위치: 1..48

(xi) 서열 설명: 서열 5:

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 254 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 설명: 서열 6:

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 8 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 펩티드

(iii) 가상: 아님

(iv) 안티센스: 아님

(vii) 직접 공급원:

(B) 클론: FLAG 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 7:

Claims (36)

1. 케모킨을 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230으로 이루어진 폴리펩티드, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241로 이루어진 폴리펩티드, c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 폴리펩티드, 및 d) 케모킨에 결합할 수 있는, (a), (b) 또는 (c)의 p35 폴리펩티드의 단편 또는 동족체로 이루어진 군으로부터 선택된 p35 폴리펩티드와 접촉시키는 것으로 이루어지는 케모킨 결합 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 동족체가 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 동족체가 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 서열 2의 잔기 1 내지 230의 서열로 이루어진 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 서열 4의 잔기 1 내지 241의 서열로 이루어진 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 서열 6의 잔기 1 내지 237의 서열로 이루어진 것인 방법.
7. a) 서열 2의 잔기 1 내지 230으로 이루어진 폴리펩티드, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241로 이루어진 폴리펩티드, c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 폴리펩티드 및 d) 케모킨에 결합할 수 있는, (a), (b) 또는 (c)의 p35 폴리펩티드의 단편 또는 동족체로 이루어진 군으로부터 선택된, 인간 또는 수의학 용도의 p35 폴리펩티드.
8. 제7항에 있어서, 상기 용도가 포유 동물의 케모킨 매개 질환의 치료 용도인 p35 폴리펩티드.
9. 제8항에 있어서, 상기 동족체가 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 것인 p35 폴리펩티드.
10. 제8항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인 p35 폴리펩티드.
11. 제10항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 서열 2의 잔기 1 내지 230의 아미노산 서열로 이루어진 것인 p35 폴리펩티드.
12. 제8항에 있어서, 상기 케모킨이 케모킨의 β 아과의 성분인 p35 폴리펩티드.
13. 제8항에 있어서, 상기 질환이 염증인 p35 폴리펩티드.
14. 제8항에 있어서, 상기 포유 동물이 인간인 p35 폴리펩티드.
15. a) 서열 2의 잔기 1 내지 230으로 이루어진 폴리펩티드, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241로 이루어진 폴리펩티드, c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 폴리펩티드 및 d) 케모킨에 결합할 수 있는, (a), (b) 또는 (c)의 p35 폴리펩티드의 단편 또는 동족체로 이루어진 군으로부터 선택된 유효량의 p35 폴리펩티드 및 제약학상 허용되는 희석제 또는 담체로 이루어진, 포유 동물의 케모킨 매개 질환 치료용 제약 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 동족체가 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 것인 조성물.
17. 제15항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 서열 2의 잔기 1 내지 230의 아미노산 서열로 이루어진 것인 조성물.
19. 제15항에 있어서, 상기 케모킨이 케모킨의 β 아과의 성분인 조성물.
20. 제15항에 있어서, 상기 질환이 염증인 조성물.
21. 제15항에 있어서, 상기 포유 동물이 인간인 조성물.
22. a) 서열 2의 잔기 1 내지 230으로 이루어진 폴리펩티드, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241로 이루어진 폴리펩티드, c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 폴리펩티드 및 d) 케모킨에 결합할 수 있는, (a), (b) 또는 (c)의 p35 폴리펩티드의 단편 또는 동족체로 이루어진 군으로부터 선택된 p35 폴리펩티드의, 포유 동물의 케모킨 매개 질환 치료용 의약을 제조하는데 있어서의 용도.
23. 제22항에 있어서, 상기 동족체가 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 용도.
24. 제22항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 용도.
25. 제24항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 서열 2의 잔기 1 내지 230의 아미노산 서열로 이루어진 용도.
26. 제22항에 있어서, 상기 케모킨이 케모킨의 β 아과의 성분인 용도.
27. 제26항에 있어서, 상기 케모킨이 단핵세포 화학주성 단백질-1, 단핵세포 화학주성 단백질-3, 란테스(Rantes), 에오탁신(Eotaxin), 대식세포 염증성 단백질-1α 및 대식세포 염증성 단백질-1β로 이루어진 군으로부터 선택된 용도.
28. 제22항에 있어서, 상기 질환이 염증인 용도.
29. 제28항에 있어서, 상기 질환이 폐렴인 용도.
30. 제22항에 있어서, 상기 포유 동물이 인간인 용도.
31. 제22항에 있어서, 상기 p35 폴리펩티드가 2 내지 4개의 p35 폴리펩티드로 이루어진 올리고머 형태이고, p35 폴리펩티드 각각이 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 용도.
32. p35 폴리펩티드 각각이 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진, 케모킨에 결합할 수 있는 2 내지 4개의 p35 폴리펩티드로 이루어진 정제된 올리고머.
33. 제32항에 있어서, p35 폴리펩티드 각각이 a) 서열 2의 잔기 1 내지 230, b) 서열 4의 잔기 1 내지 241 및 c) 서열 6의 잔기 1 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 올리고머.
34. 제32항 또는 33항에 있어서, 상기 올리고머가 2개의 p35/Fc 융합 단백질로 이루어진 이량체인 올리고머.
35. 제32항의 올리고머 및 제약학상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체로 이루어진 제약 조성물.
36. 케모킨에 대한 결합 또는 케모킨과 p35의 상호작용을 검출하는 분석에 있어서의 p35 폴리펩티드의 용도.