JP4271850B2 - Ｉｌ−１８受容体 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーであるタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、高親和性ＩＬ−１８結合および活性を媒介し、更には、ＩＬ−１８に媒介される活性を阻害するＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ受容体複合体に関する。
【０００２】
関連技術の説明
Ｉ型インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１ＲＩ）は、前炎症性サイトカインであるインターロイキン−１の生物学的作用を媒介する（Ｓｉｍｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５８５−５８９，１９８８；Ｃｕｒｔｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３０４５−３０４９，１９８９）。もう一つのインターロイキン−１受容体（ＩＩ型ＩＬ−１ＲまたはＩＬ−１ＲＩＩと称される）はＩＬ−１を結合するが、シグナル伝達を媒介しているとは考えられない（ＭｃＭａｈａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１；Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６１５５−６１５９，１９９３）。ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩはそれぞれ、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを結合する。ＩＬ−１は、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患に関与している。ＩＬ−１が骨粗鬆症においてある役割を果たしていることは益々明らかである。これら活性は全て、Ｉ型ＩＬ−１Ｒの細胞質部分のシグナリング機能によって開始される。ＩＬ−１ｒａは、Ｉ型ＩＬ−１受容体に結合することによってＩＬ−１の活性を阻害し、それによってＩＬ−１αおよびＩＬ−１βへの接近を阻止するが、それ自体の生物学的応答を導くことはない。
【０００３】
ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩは、有意の配列相同性を示すタンパク質のファミリーに属する。一つのこのようなタンパク質は、Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３７５７−１３７６５，１９９５）に記載のＩＬ−１Ｒ補助タンパク質（ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰ）である。このタンパク質だけではＩＬ−１を結合できないが、ＩＬ−１ＲＩとＩＬ−１αおよびＩＬ−１βと一緒に複合体を形成する。ＩＬ−１ＲＩと一緒に同時発現された場合、組換え体ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰは、ＩＬ−１βへのＩＬ−１ＲＩの結合親和性を増加させる（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら，上記）。
【０００４】
ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩファミリーに配列相同性を示すもう一つのタンパク質は、ＩＬ−１受容体関連タンパク質Ｉ（ＩＬ−１ＲｒｐＩ）である（Ｐａｒｎｅｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：３９６７，１９９６およびＴｏｒｉｇｏｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２５７３７，１９９７を参照されたい）。尚もう一つのこのようなタンパク質はＡｃＰＬである。
【０００５】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの同族体であり、ＩＬ−１によって活性化される同様の応答の多くを活性化することが知られている。例えば、ＩＬ−１８を用いて刺激された細胞は、ＮＦκＢを活性化し、既知の炎症メディエーターを生じる。ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞の成長および分化の刺激薬として作用し、Ｔｈ１細胞からのγインターフェロン生産の強力な誘導物質である。ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞は、炎症反応を媒介することが知られている。ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞致死活性を増大させ、敗血症性ショック、肝臓破壊、炎症性腸疾患および糖尿病に関与している。
【０００６】
最近、ＩＬ−１ＲｒｐＩはＩＬ−１８に結合し、トランスフェクションされた細胞中でのＩＬ−１８シグナリングを媒介することが示された。しかしながら、ＩＬ−１８へのＩＬ−１ＲｒｐＩ結合親和性は極めて低いので、１種類またはそれ以上の追加の受容体または受容体サブユニットはＩＬ−１８の結合およびシグナリングに関与すると考えられる。
【０００７】
したがって、ＩＬ−１８の追加の受容体の識別が望まれる。このような受容体タンパク質を研究して、それらがＩＬ−１８を結合するか否か、そして結合するならば、それら受容体がシグナル伝達の媒介においてある役割を果たしているかどうか確認することができる。更に、このような受容体の可溶性の形を用いて、ＩＬ−１８活性を阻害し、そしてＩＬ−１８シグナリングに起因する炎症性および／または自己免疫疾患をいずれも改善することができる。ＩＬ−１８に関して可能性のある更に別の親和性変換サブユニットの存在も探求することができる。
【０００８】
発明の概要
本発明は、本明細書中においてＩＬ−１８受容体複合体と称される受容体ポリペプチドを提供する。より詳しくは、本発明は、ＡｃＰＬポリペプチドまたはそのフラグメントおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを含むマルチマー受容体ポリペプチドを提供する。そのＡｃＰＬポリペプチドは、任意の適当な手段によってＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドに共有結合していてよいしまたは非共有結合していてよい。このような手段には、架橋試薬、ポリペプチドリンカーによる、およびジスルフィド結合によるまたはロイシンジッパーの使用によるような結合が含まれる。本発明の一つの実施態様において、受容体は、組換えＤＮＡ技術によって生産される融合タンパク質である。本発明のこのマルチマー受容体は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独の場合より大きい親和性でＩＬ−１８を結合する。ＩＬ−１８によって媒介される障害は、このような障害に苦しむ患者に治療的有効量の本発明の受容体を投与することによって治療することができる。
【０００９】
発明の詳細な記述
本発明は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の同時発現が、ＩＬ−１８を用いて刺激された細胞中においてＮＦκＢ活性を劇的に増大させるという知見に基づいている。ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独ではＩＬ−１８を弱くしか結合しないし、ＡｃＰＬはＩＬ−１８を結合しないので、同時発現されたＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１によるＮＦκＢ活性の増大は、これらポリペプチドがＩＬ−１８受容体複合体のサブユニットであることを示している。本発明により、ＩＬ−１８受容体複合体と称される新規ポリペプチドを提供する。好都合には、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬまたはそれらのフラグメントを含むこのようなダイマーＩＬ−１８受容体複合体は、ＩＬ−１８の前炎症作用を含めたＩＬ−１８活性を阻害するのに有用であり、同一細胞中で同時発現されるタンパク質として、または受容体サブユニットとしてのＡｃＰＬに結合したＩＬ−１Ｒｒｐ１としてＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬを含むことができる。好ましくは、それらサブユニットは共有結合によって結合している。それらサブユニットは、架橋試薬またはポリペプチドリンカーなどによる任意の適当な手段によって共有結合していてよい。
【００１０】
本発明の一つの実施態様において、受容体は、組換えＤＮＡ技術によって生産される融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１：Ｆｃ融合タンパク質をコードしているＤＮＡおよびＡｃＰＬ：Ｆｃ融合タンパク質をコードしているＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクションし、同一細胞中でそれらダイマーを同時発現させることによって製造することができる。
【００１１】
或いは、ＡｃＰＬ／ＩＬ−１Ｒｒｐ１ダイマーは、受容体サブユニットの一方を免疫グロブリン重鎖の定常領域に融合し、もう一方の受容体サブユニットを免疫グロブリン軽鎖の定常領域に融合することによって製造することができる。例えば、ＡｃＰＬタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ1−ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3領域に融合することができ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質は、Ｉｇκ軽鎖のＣκ領域に融合させることができ、逆の場合も同じである。免疫グロブリン軽鎖融合タンパク質および免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードしているＤＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞は、ＡｃＰＬ融合タンパク質およびＩＬ−１Ｒｒｐ１融合タンパク質を含有する重鎖／軽鎖ヘテロダイマーを発現する。重鎖間のジスルフィド結合により、それらヘテロダイマーは、マルチマー、主にテトラマーを与えるように更に結合する。好都合には、２個のホモダイマーの場合、重鎖または軽鎖融合が発現され、このようなホモダイマーはヘテロダイマーから容易に分離することができる。
【００１２】
ＩＬ−１８受容体タンパク質複合体に加えて、本発明は、ヘテロマーポリペプチドをコードしている単離されたＤＮＡ、ヘテロマーポリペプチドをコードしているＤＮＡを含有する発現ベクター、およびこのような発現ベクターを用いてトランスフェクションされた宿主細胞を包含する。可溶性の形のタンパク質を含めた組換え体ＩＬ−１８受容体の製造方法も開示する。新規ポリペプチドと免疫反応性の抗体も、本明細書中において提供する。
【００１３】
本発明の一つの実施態様において、ヘテロマーＩＬ−１８受容体のポリペプチドサブユニットには、配列番号：２または配列番号：６に記載の少なくとも１個のＡｃＰＬサブユニット、および配列番号：４または配列番号：８に記載の少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１サブユニットが含まれる。これらポリペプチドをコードしているＤＮＡは、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：３および配列番号：７にそれぞれ示される。配列番号：１によってコードされるＡｃＰＬサブユニットタンパク質には、１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：２の残基１−１４）を含む３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：２のＮ末端からＣ末端への残基１−３５６）；２５アミノ酸の膜貫通領域（残基３５７−３８１）および２１８アミノ酸の細胞質ドメイン（残基３８２−５９９）が含まれる。配列番号：５によってコードされるＡｃＰＬサブユニットタンパク質には、１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：６の残基１−１４）を含む３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：６の残基１−３５６）；２４アミノ酸の膜貫通領域（残基３５７−３８０）およびアミノ酸残基３８１−６１４の細胞質ドメインが含まれる。配列番号：３によってコードされるＩＬ−１Ｒｒｐ１サブユニットタンパク質には、１９アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：４の残基１−１９）を含む３２９アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：４の残基１−３２９）；２１アミノ酸の膜貫通領域（配列番号：４の残基３３０−３５０）；およびアミノ酸残基３５１−５４１の細胞質ドメインが含まれる。配列番号：７によってコードされるＩＬ−１Ｒｒｐ１サブユニットタンパク質には、１８アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：８の残基１−１８）を含む３２２アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：８の残基１−３２２）；２５アミノ酸の膜貫通領域（配列番号：８の残基３２３−３４７）；およびアミノ酸残基３４８−５３７の細胞質ドメインが含まれる。更に、ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、米国特許第５，７７６，７３１号に記載されているし、ＡｃＰＬは、本明細書中に援用される同時係属出願Ｓ／Ｎ６０／０７８，８３５号およびＳ／Ｎ６０／０７２，３０１号に記載されている。
【００１４】
好ましくは、ダイマーＩＬ−１８受容体のポリペプチドサブユニットは、所望の活性を有するヘテロマー複合体を一緒に形成するＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬポリペプチドの可溶性フラグメントである。このようなポリペプチドには、タンパク質の膜貫通領域および細胞質ドメインの全部または一部分を欠いたものが含まれる。したがって、例えば、本発明のヘテロマー受容体複合体には、配列番号：２または配列番号：６の細胞外ドメインである少なくとも１個のサブユニットおよび配列番号：４または配列番号：８の細胞外ドメインである少なくとも１個のサブユニットが含まれうる。ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のこれら可溶性細胞外ドメインは、それらのシグナルペプチドを含むことができるしまたは除外することができる。したがって、もう一つの実施態様において、ヘテロマーＩＬ−１８受容体には、配列番号：２または配列番号：６のアミノ酸残基１−３５６または残基１５−３５６、および配列番号：４のアミノ酸残基１−３２９または残基２０−３２９または配列番号：８のアミノ酸残基１−３２５または残基１９−３２２が含まれる。シグナル配列を含むことの妥当性は、融合タンパク中のＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１の位置および組換えＤＮＡ技術によって受容体が生産される予定の宿主細胞のような因子に依る。好ましい実施態様において、可溶性ＡｃＰＬまたは可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントの一方をコードしているＤＮＡ構築物を、免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードしているＤＮＡに融合し、可溶性ＡｃＰＬまたは可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントのもう一方をコードしているＤＮＡ構築物を、免疫グロブリン軽鎖の定常領域をコードしているＤＮＡに融合する。
【００１５】
或いは、ＩＬ−１８受容体は、ＡｃＰＬまたは可溶性ＡｃＰＬフラグメントと一緒に非共有結合によって複合体を形成したＩＬ−１Ｒｒｐ１または可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントを含んでいてよい。ＩＬ−１Ｒｒｐ１のＡｃＰＬへの非共有結合は、ＩＬ−１８を結合する受容体の能力を妨げない任意の適当な手段によって得ることができる。一つのアプローチにおいて、最初の化合物をＩＬ−１Ｒｒｐ１に結合し、その最初の化合物に非共有結合するであろうもう一つの化合物をＡｃＰＬに結合する。このような化合物の例は、ビオチンおよびアビジンである。例えば、ビオチンとアビジンとの非共有結合相互作用によって受容体が形成される。本発明の一つの実施態様において、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは組換え体ポリペプチドであり、それぞれ組換え体細胞から精製された後、互いに非共有結合して受容体を形成する。宿主細胞は、二つの異なった発現ベクターを用いて形質転換することができるので、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは両方とも、組換え体宿主細胞によって生産される。このような形質転換された宿主細胞によって生産されるＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは、非共有結合相互作用によって複合体を形成するように結合することができる。このような形質転換された細胞が、膜に結合した形のタンパク質を発現する場合、このような細胞は、競合検定を含めた種々の検定で有用である。
【００１６】
実施例１に記載の結合検定は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独、ＡｃＰＬ単独、およびＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの組合せを用いてトランスフェクションされた細胞からの上澄みによるＩＬ−１８の結合を比較する。ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬを同時発現する細胞からの上澄みは、高レベルのＩＬ−１８結合を示し；ＩＬ−１Ｒｒｐ１だけを発現する細胞からの上澄みは、低レベルのＩＬ−１８結合を示し；そしてＡｃＰＬだけを用いてトランスフェクションされた細胞からの上澄みは、ＩＬ−１８を結合しない。実施例２に記載のＮＦκＢ誘導検定は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独でトランスフェクションされた細胞およびＡｃＰＬ単独でトランスフェクションされた細胞が、ＩＬ−１８刺激に応答しないことを示している。しかしながら、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ両方を用いて同時トランスフェクションされ且つＩＬ−１８を用いて刺激された細胞は、ＮＦκＢ誘導を大きく増大させた。
【００１７】
本明細書で用いられる用語ＩＬ−１Ｒｒｐ１及びＡｃＰＬは、所望の生物学的活性を有する天然のタンパク質の変異体及び短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）を含む。天然の配列の１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換又は削除によって産生される変異体は、後ほどより詳細に論ずる。
【００１８】
上述したように、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１および可溶性ＡｃＰＬポリペプチドは、いくつかの用途に好適である。本発明の文脈中で用いられる“可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１”とは、天然のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドの細胞外領域の全部または一部分とアミノ酸配列がほぼ同様であり、しかも細胞膜上にポリペプチドを保持させると考えられる膜貫通領域を欠いているために、発現時に分泌されるポリペプチドを意味する。適当な可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、所望の生物学的活性を保持する。可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、その可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１が分泌されうるという条件ならば、膜貫通領域の一部分または細胞質ドメインの一部分または他の配列も含んでいてよい。
【００１９】
同様に、本明細書中で用いられる“可溶性ＡｃＰＬ” という用語は、天然のＡｃＰＬポリペプチドの細胞外領域の全部または一部分とアミノ酸配列がほぼ同様であり、しかも発現時に分泌されるが、所望の生物学的活性を保持しているタンパク質を意味する。可溶性ＡｃＰＬは、そのポリペプチドが分泌されるのであれば、膜貫通領域、細胞質ドメイン、または他の配列の一部分を含んでいてよい。
【００２０】
一つの実施態様において、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬポリペプチドには、細胞外ドメイン全体が含まれる。分泌されるためには、それら可溶性ポリペプチドは、天然のシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドを含む。したがって、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドの例は、配列番号：４のアミノ酸１−３２９（ヒトＩＬ−１Ｒｒｐ１）および配列番号：８のアミノ酸１−３２２（ネズミＩＬ−１Ｒｒｐ１）を含む。可溶性ＡｃＰＬポリペプチドの例は、配列番号：２のアミノ酸１−３５６（ヒトＡｃＰＬ）および配列番号：６のアミノ酸１−３５６（ネズミＡｃＰＬ）を含む。
【００２１】
抗体Ｆｃ領域ポリペプチドに融合した配列番号：４のＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメインおよびＦｃ領域ポリペプチドに融合したＡｃＰＬの細胞外ドメインを含む可溶性融合タンパク質を実施例１に記載する。
【００２２】
可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、所望のタンパク質を発現するそのままの細胞を、例えば遠心分離によって培地から分離し、所望のタンパク質の存在についてその培地（上澄み）を検定することによって確認する（そして、その非可溶性膜結合対応物と識別する）ことができる。その培地は、以下の実施例に記載されたのと同様または同一である手順を用いて検定することができる。培地中のＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１の存在は、そのタンパク質が細胞から分泌されたこと、したがって、可溶性の形の所望のタンパク質であることを示している。可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、これらタンパク質の天然に存在する形であってよい。或いは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質の可溶性フラグメントは、以下に記載のように、組換えＤＮＡ技術によって製造することができるしまたはそれ以外の場合は単離することができる。
【００２３】
可溶性の形のＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの使用は、いくつかの用途に好都合である。組換え体宿主細胞からのタンパク質の精製は、可溶性タンパク質がそれら細胞から分泌されるので容易になる。更に、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬタンパク質を含む本発明の受容体は、概して、静脈内投与に一層適している。
【００２４】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬタンパク質のいろいろなドメインおよびシグナルペプチドについての前述の考察に関して、当業者は、タンパク質のこのような領域の上記境界がおおよそのものであることを認識するであろう。例えば、シグナルペプチドの切断部位を予測する計算機プログラムが利用可能であるが、予測される部位以外の部位で切断が起こることがありうる。更に、タンパク質標品は、２ヶ所以上の部位でのシグナルペプチドの切断のために、異なったＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含むことがありうるということが確認されている。したがって、細胞外ドメインを含む可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬポリペプチドには、細胞外ドメインのＣ末端として上で確認されるものとは異なることがありうるＣ末端アミノ酸を有するものが含まれる。更に、用いられる特定の発現系によって異なることがありうる翻訳後プロセシングは、異なったＮ末端を有するタンパク質を生じるかもしれない。所望の生物学的活性を保持しているこのような変異体は、本明細書中で用いられる“ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチド” および“ＡｃＰＬポリペプチド”という用語によって包含される。
【００２５】
可溶性ポリペプチドを含めて切断されたＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは、多数の慣用的な技術のいずれによっても製造することができる。組換え体タンパク質の場合、所望のフラグメントをコードしているＤＮＡフラグメントは、発現ベクター中にサブクローン化することができる。或いは、所望のＤＮＡ配列は、既知の技術を用いて化学的に合成することができる。ＤＮＡフラグメントは、完全長さのクローン化されたＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によって製造され、そしてアガロースゲル上の電気泳動によって単離することができる。１ヶ所または複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有するリンカーは、所望のＤＮＡフラグメントを発現ベクター中に挿入するのに用いることができるし、またはそこに天然に存在する切断部位でそのフラグメントを消化することができる。ＤＮＡフラグメントのＮ−またはＣ末端を所望の地点まで再構築するオリゴヌクレオチドを合成することができる。そのオリゴヌクレオチドは、所望のコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有し且つそのコーディング配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を置くことができる。
【００２６】
周知のポリメラーゼ連鎖反応手順を用いて、所望のタンパク質フラグメントをコードしているＤＮＡ配列を単離することもできる。そのフラグメントの所望の末端を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、このようなポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。いずれの適当なＰＣＲ手順も用いてよい。一つのこのような手順は、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）に記載されている。もう一つは、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｗｕら監修，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，サン・ディエゴ（１９８９），１８９−１９６頁に記載されている。概して、ＰＣＲ反応は、適当な緩衝化溶液中において、５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型ＤＮＡ（この場合、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬ ＤＮＡ）および４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸それぞれと結合することを行う。その溶液を加熱し（例えば、９５℃−１００℃）、二本鎖ＤＮＡ鋳型を変性させた後、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を加える前に冷却する。所望のＤＮＡフラグメントを増幅させるために、多数の反応サイクルを行う。
【００２７】
ＡｃＰＬポリペプチドを、共有結合または非共有結合によってＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドに結合する。共有結合は、非共有結合とは反対に、概して共有結合によって与えられる増大した安定性を考えると、いくつかの用途に、例えば、in vivo 使用に好適である。本発明の受容体を構築する場合、共有結合は、架橋試薬、ペプチドリンカーまたは任意の他の適当な技法によって得ることができる。
【００２８】
一つのタンパク質分子をもう一つに架橋するのに有用な多数の試薬が知られている。ヘテロ二官能性およびホモ二官能性リンカーは、この目的のために、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ロックフォード，イリノイ州から入手可能である。このようなリンカーは、アミノ酸側鎖上のいくつかの官能基と反応するであろう２種類の官能基（例えば、エステルおよび／またはマレイミド）を含有するので、一つのポリペプチドをもう一つに結合する。
【００２９】
本発明において用いることができるペプチドリンカーの一つの種類は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ドメインを、それぞれのドメインが適当に折りたたまれ、所望の生物学的活性に必要な二次および三次構造を確実にする充分な距離まで隔てる。そのリンカーは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメインに適当な空間的配向をとらせて、ＩＬ−１８の結合部位も形成させるはずである。
【００３０】
適当なペプチドリンカーは、当業者に知られており、慣用的な技法によって用いることができる。適当なペプチドリンカーの中には、本明細書中に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されたものがある。ペプチドリンカーは、一つのポリペプチドをもう一つのポリペプチドに結合させるのに用いられる慣用法のいずれによっても結合させることができる。上記のＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な架橋試薬は、用いることができるものに含まれる。このような試薬と反応性の側鎖を有するアミノ酸は、ペプチドリンカー中に、例えばその末端に含まれていてよい。好ましくは、ペプチドリンカーによってＩＬ−１Ｒｒｐ１に結合したＡｃＰＬを含む融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって製造される。
【００３１】
本発明の一つの実施態様において、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を、免疫グロブリンに由来するポリペプチドによって結合させる。抗体由来ポリペプチドのいろいろな部分（Ｆｃドメインを含めた）に融合した異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の製造は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）およびＢｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）によって記載されている。一つの例として、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１のＣ末端に結合することができる。別のＦｃポリペプチドをＡｃＰＬのＣ末端に結合する。ジスルフィド結合は、それら二つのＦｃポリペプチド間に（例えば、鎖間ジスルフィド結合が、通常は抗体分子中に存在している、いわゆるヒンジ領域中に）形成して、ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ融合タンパク質に結合したＡｃＰＬ／Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロダイマーが生じる。好都合には、二つの異なった発現ベクター、すなわち、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃをコードしている一つおよび可溶性ＡｃＰＬ／Ｆｃをコードしているもう一つを用いて宿主細胞を同時トランスフェクションする。そのヘテロダイマーは、細胞内にまたは分泌中に形成すると考えられる。
【００３２】
本明細書中で用いられる“Ｆｃポリペプチド”という用語には、天然のおよび突然変異タンパク質の形、更には、ダイマー化を促進するヒンジ領域を含有して切断されたＦｃポリペプチドが含まれる。ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に由来する単鎖ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（登録商標）クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ラホヤ，ＣＡ）中にクローン化されて、ｈＩｇＧ１Ｆｃと称する組換え体ベクターを生じることができる。独特のＢｇＩＩＩ部位は、挿入されたＦｃをコードしている配列の５’末端付近に位置している。ＳｐｅＩ部位は、停止コドンのすぐ下流である。ｃＤＮＡによってコードされているＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域から天然のＣ末端まで伸長している、すなわち、完全長さ抗体Ｆｃ領域である。このＦｃポリペプチドの一つの適当な突然変異タンパク質は、本明細書中に援用される米国特許出願第０８／０９７，８２７号に記載されている。その突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に関して減少した親和性を示す。
【００３３】
ジスルフィド結合によって結合した２個のＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃポリペプチドまたは２個のＡｃＰＬ／Ｆｃポリペプチドを含むホモダイマーも、本明細書中に開示されたトランスフェクションされた宿主細胞のいくつかによって生産される。それらホモダイマーは、寸法の違いによって（例えば、ゲル電気泳動によって）互いにおよびヘテロダイマーから分離することができる。ヘテロダイマーも、逐次イムノアフィニティークロマトグラフィー（以下に記載される）によって精製することができる。
【００３４】
本発明のＩＬ−１８受容体複合体には、抗体軽鎖の定常領域（またはそのフラグメント）および抗体重鎖の定常領域（またはそのフラグメント）の融合タンパク質が含まれる。重鎖の定常領域には、軽鎖と結合するＣＨ1、ヒンジ領域、および重鎖分子のダイマー化に関与するＣＨ2およびＣＨ3ドメインを含めたその定常領域ドメインの４種類全部またはそれらドメインの一部分が含まれうる。前述の融合タンパク質の範囲内にあるのは、重鎖／軽鎖ダイマーをそれぞれの重鎖領域間のジスルフィド結合によって結合する二つのダイマーによって形成されるテトラマーがある。
【００３５】
免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドに関して、κファミリーおよびλファミリーのポリペプチドは、本発明の実施に適している。したがって、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含めた免疫グロブリンダイマーまたはテトラマーのいずれの種類も、本発明のヘテロマー分子の基準でありうる。
【００３６】
本発明により、機能性ヘテロマーポリペプチドは、通常は互いに結合する多数の重鎖および多数の軽鎖の分子間の結合によって製造することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１の定常領域は、ヒト軽鎖κの定常領域（Ｃκと称される）と結合するであろう。ｈＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列は報告されている（Ｅｌｌｉｓｏｎ，ＪＷ，Ｂｅｒｓｏｎ，ＢＪおよびＨｏｏｄ，ＬＥ １９８２）。ヒト免疫グロブリンＣγ１遺伝子のヌクレオチド配列は報告されている（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１およびＷａｌｌｓ，ＭＡ，Ｈｓｉａｏ，ＫＣおよびＨａｒｒｉｓ，ＬＪ １９９３）。ヒト定常領域を含むＰＣＲ増幅免疫グロブリン可変ドメインの発現のためのベクターは開示されている（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２９２１）。ヒト軽鎖ｃκの配列も報告されている（Ｓｈｕｆｏｒｄ，Ｗ，Ｒａｆｆ，ＨＶ，Ｆｉｎｌｅｙ，ＪＷ，Ｅｓｓｅｌｓｔｙｎ，ＪおよびＨａｒｒｉｓ，ＬＪ．１９９１）。ＩｇＧオリゴマー化への軽鎖Ｖ領域重複の作用および in vivo 効力。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７２４およびＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ，Ｋｒａｆｔ，ＤおよびＶａｌｅｎｔａ，Ｒ（１９９６）。アレルギー患者からの組合せＩｇＥライブラリーの構築。主要チモシー草花粉アレルゲンに関して特異性を有するヒトＩｇＥ Ｆａｂの単離および特性決定。Ｐｈ１ ｐ５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１０９７２）。
【００３７】
重鎖および軽鎖の抗体領域を含むＩＬ−１８受容体実施態様は、式
Ｒ1−Ｌ1：Ｒ2−Ｌ2またはＲ2−Ｌ2：Ｒ1−Ｌ1または
Ｒ1−Ｌ2：Ｒ2−Ｌ1またはＲ2−Ｌ1：Ｒ1−Ｌ2
Ｒ1−Ｌ1：Ｒ2−Ｌ2／Ｒ2−Ｌ2：Ｒ1−Ｌ1または
Ｒ1−Ｌ2：Ｒ2−Ｌ1／Ｒ2−Ｌ1：Ｒ1−Ｌ2
（式中、Ｌ1は免疫グロブリン重鎖フラグメントであり、そのＮ末端は、少なくともＣH１領域によって伸長し；Ｌ2は免疫グロブリン軽鎖フラグメントであり；Ｒ1はＡｃＰＬまたはＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ2はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；：は重鎖および軽鎖の抗体領域間の結合であり、そして／は重鎖および重鎖の抗体領域間の結合である）
によって示される融合タンパク質である。ダイマーの場合、得られた融合ポリペプチドは、重鎖／軽鎖によって結合した二つの受容体サブユニットを含む。テトラマーの場合、その融合タンパク質は、４個の受容体サブユニットを含み、構造が抗体に似ていて、ＩＬ−１８結合部位を二価で示す。
【００３８】
前述の融合ポリペプチドを得るために、ヒトＩｇＧ１抗体に由来する抗体重鎖ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ（ＣＨ1−Ｈ−ＣＨ2−ＣＨ3）を、ｐＤＣ４０９発現ベクター中にクローン化して、ｈＩｇＧ１と称される組換え体ベクターを生じることができる。独特のＢｇＩＩＩ部位は、挿入された重鎖をコードしている配列の５’末端付近に位置している。ＮｏｔＩ部位は、停止コドンのすぐ下流である。ｃＤＮＡによってコードされている重鎖ポリペプチドは、ＣＨ1領域のＮ末端から天然のＣ末端まで伸長している。抗体軽鎖を得るためには、ヒトκ鎖定常領域に由来する単鎖ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡをｐＤＣ４０９発現ベクター中にクローン化して、ｈＩｇκと称される組換え体ベクターを生じることができる。この配列は、５’末端で独特のＢｇＩＩＩ部位までおよび３’末端で独特のＮｏｔＩ部位まで隣接している。このような抗体ポリペプチドを包含する本発明の実施態様には、抗体軽鎖（またはそのフラグメント）の定常領域の上流にＡｃＰＬ（またはそのフラグメント）を含む第一融合ポリペプチドおよび抗体重鎖（または重鎖フラグメント）の定常領域の上流にＩＬ−１Ｒｒｐ１を含む第二融合ポリペプチドが含まれ、そのＮ末端は、少なくともＣH１領域によって伸長している。ＡｃＰＬ軽鎖融合ポリペプチドとＩＬ−１Ｒｒｐ１−重鎖融合ポリペプチドとの間に１個または複数のジスルフィド結合が形成され、したがって、本発明の受容体が生じる。更に代わるものとして、ＩＬ−１Ｒｒｐ１−抗体軽鎖融合ポリペプチドを製造し、そしてＡｃＰＬ−抗体重鎖融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと結合させる（にジスルフィド結合させる）。前述のジスルフィド結合した分子の二つを結合する場合、追加のジスルフィド結合がそれら二つの抗体領域間に形成される。４個の融合ポリペプチドを含む得られた本発明の受容体は、構造が抗体に似ていて、ＩＬ−１８結合部位を二価で示す。
【００３９】
ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、細胞源から別々に精製された後、互いに結合させることができる。或いは、組換えＤＮＡ技術を用いて、本発明の受容体を製造することができる。ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、別々に製造され、そして引き続き共有結合させるために、形質転換された宿主細胞から精製することができる。本発明の一つの実施態様において、宿主細胞は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を別々のポリペプチドとしてコードする異種ＤＮＡを用いて形質転換／トランスフェクションされる。それら二つのポリペプチドは、二つの遺伝子それぞれの開始および停止コドンを含む同じ発現ベクターによってコードされていてよいし、または組換え体細胞は、二つの別々の発現ベクターを用いて同時トランスフェクションされてよい。もう一つの実施態様において、受容体は、組換え体細胞中において融合タンパク質として生産される。
【００４０】
本発明の一つの実施態様において、受容体タンパク質は、式
Ｒ1−Ｌ−Ｒ2またはＲ2−Ｌ−Ｒ1
（式中、Ｒ1はＡｃＰＬまたはＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ2はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；そしてＬはペプチドリンカーである）
を有する組換え体融合タンパク質である。
【００４１】
本発明の融合タンパク質には、ＡｃＰＬのＣ末端部分がリンカーに融合し、それがＩＬ−１Ｒｒｐ１のＮ末端部分に融合している構築物、およびＩＬ−１Ｒｒｐ１のＣ末端部分がリンカーに融合し、それがＡｃＰＬのＮ末端部分に融合している構築物も含まれる。ＡｃＰＬは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の所望の生物学的活性を保持している単一タンパク質を生じるような方法で、ＩＬ−１Ｒｒｐ１に共有結合している。融合タンパク質の成分を、それらが存在する順に挙げる（すなわち、Ｎ末端ポリペプチドを最初に挙げ、続いてリンカー、そして次に、Ｃ末端ポリペプチド）。
【００４２】
融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしている別々のＤＮＡフラグメントを適当な発現ベクター中に挿入するように構築される。ＡｃＰＬをコードしているＤＮＡフラグメントの３’末端は、ｍＲＮＡを単一の生物学的に活性な融合タンパク質に翻訳させる段階のそれら配列の読み枠を用いて、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡフラグメントの５’末端に（リンカーによって）連結される。或いは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡフラグメントの３’末端は、ｍＲＮＡを単一の生物学的に活性な融合タンパク質に翻訳させる段階のそれら配列の読み枠を用いて、ＡｃＰＬをコードしているＤＮＡフラグメントの５’末端に（リンカーによって）連結される。Ｎ末端シグナル配列をコードしているＤＮＡ配列は、Ｎ末端ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列上で保持されうるが、次の（Ｃ末端）ＤＮＡ配列まで通読するのを妨げると考えられる停止コドンは排除される。逆に、翻訳を終結させるのに必要な停止コドンは、次のＤＮＡ配列上で保持されている。シグナル配列をコードしているＤＮＡは、好ましくは、Ｃ末端ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列から除去される。
【００４３】
所望のポリペプチドリンカーをコードしているＤＮＡ配列は、任意の適当な慣用的な技法を用いて、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡ配列の間におよびそれらと同様の読み枠中に挿入することができる。例えば、リンカーをコードしていて且つ適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する化学合成オリゴヌクレオチドは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしている配列の間に連結することができる。
【００４４】
或いは、化学合成されたＤＮＡ配列は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のどちらかの３’末端（停止コドンを含まない）に相補的な配列、続いてリンカーをコードしている配列、その後に、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のもう一方の５’末端に相補的な配列を含有しうる。次に、オリゴヌクレオチドに支配される突然変異誘発を用いて、そのリンカーをコードしている配列を、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の直接融合を含有するベクター中に挿入する。
【００４５】
本発明は、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびペプチドリンカーを含む上記融合タンパク質をコードしている単離されたＤＮＡ配列を提供する。本明細書中に開示されたＡｃＰＬポリペプチドをコードしているＤＮＡも提供するが、それは、免疫グロブリン由来ポリペプチドに融合したＡｃＰＬポリペプチドをコードしているＤＮＡである。本発明によって包含されるＡｃＰＬをコードしているＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそれらの組合せが含まれる。
【００４６】
本明細書中で更に提供されるのは、単離されたＤＮＡ配列を含有する組換え体発現ベクターである。“発現ベクター”とは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡであって、しかも（１）遺伝子発現において調節の役割を有する１種類または複数の遺伝因子、例えば、以下の（２）に機能的に結合したプロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される所望のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列、および（３）適当な転写および翻訳の開始および終結配列の集合を含む転写単位を含むＤＮＡを発現させるのに用いられる複製可能なＤＮＡ構築物を意味する。プロモーターおよび他の調節因子の選択は、概して、予定の宿主細胞によって変化する。
【００４７】
それら発現ベクターにおいて、転写または翻訳を制御する調節因子は、概して、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来する。通常は、複製起点、および形質転換細胞の認識を容易にする選択遺伝子によって与えられる、宿主中で複製する能力は、追加的に包含されうる。レトロウイルスに由来するベクターも用いることができる。
【００４８】
ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連している場合、機能的に結合される。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードしているＤＮＡは、宿主細胞膜によって分泌される前駆物質としてポリペプチドが発現される場合、そのポリペプチドのＤＮＡに機能的に結合され；プロモーターは、コーディング配列の転写を制御している場合、当該コーディング配列に機能的に結合され；そしてリボソーム結合部位は、翻訳を可能にするようにコーディング配列が配置されている場合、それに機能的に結合される。概して、“機能的に結合される”とは、隣接している、分泌リーダーの場合、隣接しているおよび読み枠中を意味する。
【００４９】
形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用い、異種ＤＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクションされている細胞である。本発明の文脈中の異種ＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしている配列を含む。宿主細胞は、その異種ＤＮＡをクローン化するまたは増幅する目的で形質転換されてよいし、またはタンパク質の生産のために発現ベクターを用いて形質転換されてよい。適当な宿主細胞には、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物の細胞宿主と一緒に用いるのに適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，エルセビア，ニューヨーク，１９８５）に記載されており、その関連性のある開示は本明細書中に援用される。
【００５０】
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス属が含まれる。原核生物発現ベクターは、概して、１種類またはそれ以上の表現型選択性マーカー、例えば、抗生物質耐性を与えるまたは独立栄養要求を与えるタンパク質をコードしている遺伝子、および宿主内で確実に増幅させるための宿主によって認識される複製起点を含む。形質転換に適した原核生物宿主の例には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属内の様々な種が含まれるが、選択の問題として、他のものを用いてもよい。
【００５１】
細菌用途に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子を含む商業的に入手可能なプラスミドに由来する選択性マーカーおよび細菌複製起点を含むことができる。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ウプサラ，スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，マディソン，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。これらｐＢＲ３２２“主鎖”部分を、適当なプロモーターおよび発現される構造配列と結合する。大腸菌は、典型的には、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ ２：９５，１９７７）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、これが、形質転換された細胞を識別するための簡単な手段を提供する。
【００５２】
組換え体微生物発現ベクターにおいて一般的に用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；およびＥＰＡ ３６，７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，４１２頁，１９８２）が含まれる。特に有用な細菌発現系は、ファージλＰLプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱誘導性リプレッサーを用いる。λＰLプロモーターの誘導体を組み込む、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なプラスミドベクターには、大腸菌株ＪＭＢ９に内在するプラスミドｐＨＵＢ２（ＡＴＣＣ３７０９２）および大腸菌株ＲＲ１に内在するｐＰＬｃ２８（ＡＴＣＣ５３０８２）が含まれる。
【００５３】
組換え体受容体タンパク質は、酵母宿主において、好ましくは、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から発現させてもよい。ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の属の酵母を用いてもよい。酵母ベクターは、概して、２μｍ酵母プラスミドからの複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、受容体融合タンパクをコードしているＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、および選択遺伝子を含有するであろう。好ましくは、酵母ベクターは、例えば、酵母および大腸菌両方の形質転換を可能にする複製起点および選択性マーカー、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、およびトリプトファン中で成長する能力を欠いた酵母の突然変異菌株に関する選択マーカーを与えるビール酵母菌ｔｒｐ１遺伝子、および構造配列下流の転写を誘導する高発現された酵母遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう。次に、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの不存在下の成長によって形質転換を検出するのに有効な環境を与える。
【００５４】
酵母ベクター中の適当なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９０００，１９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適したベクターおよびプロモーターは、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら，ＥＰＡ７３，６５７号に更に記載されている。
【００５５】
好ましい酵母ベクターは、大腸菌中の選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子および複製起点）、およびグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターおよびα因子分泌リーダーを含めた酵母ＤＮＡ配列を用いて組み立てることができる。そのＡＤＨ２プロモーターは、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４，１９８２）によって記載されている。酵母α因子リーダーは、異種タンパクの分泌を支配し、発現されるプロモーターと構造遺伝子との間に挿入されうる。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，Ｃｅｌｌ ３０：９２２，１９８２；およびＢｉｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５３３０，１９８４を参照されたい。リーダー配列は、その３’末端付近に１ヶ所またはそれ以上の有用な制限部位を含有するように修飾されて、そのリーダー配列の異種遺伝子への融合を容易にすることができる。
【００５６】
適当な酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られている。典型的な技法は、Ｈｉｎｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９，（１９７８）に記載されており、０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地中でＴｒｐ+形質転換細胞について選択することである。
【００５７】
ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主菌株は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補足した１％酵母エキス、２％ペプトンおよび１％グルコースからなる富裕培地中において発現のために成長させることができる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地グルコースの消耗で起こる。粗製酵母上澄みを濾過によって集め、更に精製する前に４℃で保持する。
【００５８】
種々の哺乳動物または昆虫の細胞培養系を用いて、組換え体タンパクを発現させることができる。昆虫細胞中における異種タンパクの生産のためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によって概説されている。適当な哺乳動物宿主細胞系の例には、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒーラおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。更に別の適当な哺乳動物宿主細胞には、両方ともサル腎に由来するＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）およびＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１；Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１によって記載されている）が含まれる。もう一つのサル腎細胞系であるＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８）は、エプスタイン・バールウイルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードしている遺伝子およびＣＭＶ調節配列を含有するベクターを用いたＣＶ−１細胞系のトランスフェクションによって誘導された（ＭｃＭａｈａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１）。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ＥＢＶ複製起点を含有するＨＡＶ−ＥＯまたはｐＤＣ４０６のような発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。
【００５９】
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に結合した適当なプロモーターおよびエンハンサー、および他の５’または３’フランキング非転写配列などの非転写因子、および必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容体部位などの５’または３’非翻訳配列、および転写終結配列を含んでいてよい。脊椎動物細胞を形質転換する場合に用いられる発現ベクター中の転写および翻訳調節配列は、ウイルス源によって提供されうる。例えば、一般的に用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供するのに用いることができる。初期および後期プロモーターは、両方とも、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２７：１１３，１９７８）。より小さいまたはより大きいＳＶ４０フラグメントも、ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位の方へ伸長した、ウイルス複製起点に位置する約２５０ｂｐ配列が含まれるならば用いることができる。
【００６０】
典型的なベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）によって開示されたように構築することができる。Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞中での哺乳動物受容体ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な一つの系は、実質的には、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）によって記載のように構築することができる。レトロウイルスに由来するベクターを用いてもよい。
【００６１】
ＡｃＰＬおよび／またはＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパクの宿主細胞からの分泌が望まれる場合、発現ベクターは、シグナルまたはリーダーペプチドをコードしているＤＮＡを含んでいてよい。天然のシグナル配列の代わりに、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６号に記載のインターロイキン−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ４６０，８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドなどの異種シグナル配列を加えることができる。
【００６２】
本発明は、本発明の組換え体タンパク質を製造する方法であって、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養することを含む方法を提供する。次に、所望のタンパク質を培地または細胞抽出物から精製する。所望のタンパク質は、例えば、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはそのヘテロダイマー受容体であってよい。細胞不含翻訳系も、本発明の新規ＤＮＡに由来するＲＮＡを用いて所望のタンパク質を製造するのに用いることができると考えられる。
【００６３】
一つの実施例として、組換え体タンパク質を培地中に分泌する発現系からの上澄みを、最初に、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮することができる。濃縮工程後、その濃厚物を適当な精製マトリックスに適用することができる。例えば、適当なアフィニティーマトリックスは、ＩＬ−１８を含むことができる。ＩＬ−１８アフィニティーマトリックスは、臭化シアンで活性化されたセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＨｙｄｒａｚｉｄｅ Ａｆｆｉｇｅｌ（Ｂｉｏｒａｄ）に、製造者の推奨規格にしたがって、組換え体ヒトＩＬ−１８をカップリングさせることによって製造することができる。適当な支持体に結合した抗体を用いる逐次的免疫精製が好適である。ＡｃＰＬに特異的な抗体に結合したタンパク質を回収し、不溶性支持体上のＩＬ−１Ｒｒｐ１に特異的な抗体と接触させる。このように、両抗体と免疫反応性のタンパク質を識別し且つ単離することができる。
【００６４】
或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側基を有するマトリックスまたは基質を用いることができる。それらマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に一般的に用いられる他の種類でありうる。或いは、陽イオン交換工程を用いることができる。適当な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好適である。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地、例えば、メチル側基または他の脂肪族側基を有するシリカゲルを用いて１回またはそれ以上行って、融合タンパク質を更に精製することができる。
【００６５】
前述の精製工程のいくつかまたは全部をいろいろな組合せで行って、本質的に均一な組換え体タンパク質を提供することができる。組換え体細胞培養物は、タンパク質それぞれの由来の種において、例えば、いくつかの細胞種類の表面上で実際に見出されるような、通常はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬと結合しうるタンパク質を混入したものを含まない融合タンパク質の製造を可能にする。
【００６６】
前述の精製手順は、本発明の非組換え受容体を精製するのにも用いることができるものの中にある。ホモダイマー（ＩＬ−１Ｒｒｐ１−リンカー−ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ−リンカー−ＡｃＰＬ）を生じることができる結合手順を用いる場合、このようなホモダイマーからヘテロダイマーを分離する精製手順を用いる。このような手順の一例は、上で考察されたような逐次的免疫精製である。一つの実施態様において、ＡｃＰＬ（組換え体または非組換え体）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって他の（混入した）タンパク質に該当するバンドが検出されないように精製する。
【００６７】
細菌培養物中で生産される組換え体タンパク質は、通常、最初に細胞ペレットからの抽出後、１回またはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーの工程によって単離される。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製工程に用いることができる。組換え体融合タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結・融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含めたいずれの慣用法によっても破壊することができる。
【００６８】
融合タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製を極めて簡単にする。大規模発酵から得られる分泌された組換え体タンパク質は、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）によって開示されたのと類似した方法により、分離用ＨＰＬＣカラム上での組換え体タンパク質の精製に２回の逐次的逆相ＨＰＬＣ工程を行って精製することができる。
【００６９】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬのＤＮＡ配列またはアミノ酸配列は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５および配列番号：７に示されるものとは異なることがありうる。既知の遺伝暗号縮重のために、同様のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列には、かなりの変異がありうる。更に、中程度ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下において、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の天然のＤＮＡ配列にハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列であって、生物学的に活性なＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配列も、本発明の文脈中において、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているまたはＡｃＰＬをコードしているＤＮＡ配列であると考えられる。このようなハイブリッド形成性配列には、以下に記載のもの、および他の哺乳動物種に由来するＤＮＡなどの変異型配列が含まれるが、それらに制限されるわけではない。
【００７０】
中程度ストリンジェント条件には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１巻，１．１０１−１０４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の条件が含まれる。Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって定義される中程度ストリンジェンシーの条件には、５Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予洗溶液の使用および約５５℃、５Ｘ ＳＳＣ、一晩中のハイブリダイゼーション条件が含まれる。高ストリンジェント条件には、高温でのハイブリダイゼーションおよび洗浄が含まれる。当業者は、温度および洗浄溶液塩類濃度を、プローブの長さなどの因子によって必要に応じて調整してよいことを理解するであろうが、それら条件には、６８℃でのハイブリダイゼーション後、０．１Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において６３−６８℃での洗浄が含まれる。もう一つの実施態様において、本発明は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含むヘテロダイマー受容体であって、そのＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１が、中程度または高ストリンジェント条件下において、配列番号：１または配列番号：５、または配列番号：３または配列番号：７それぞれのＤＮＡにハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされているヘテロダイマー受容体を提供する。
【００７１】
更に、ＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードするヌクレオチド配列におけるいくつかの突然変異は、最終タンパク質産物中において発現されないであろう。例えば、ヌクレオチド置換は、発現を促進して、主に、転写されるｍＲＮＡ中の二次構造ループを避けるように行うことができる（ＥＰ７５，４４４Ａ号を参照されたい）。ヌクレオチド配列の他の変更は、選択された宿主によって一層容易に翻訳されるコドン、例えば、大腸菌発現に周知の大腸菌選択コドンを提供するように行うことができる。
【００７２】
天然のＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬのアミノ酸配列は、１個またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入することによって変更されて、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬ変異体を生じることができる。天然のＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬタンパク質の所望の生物学的活性を有する変異体は、本発明の受容体中で用いることができる。変異タンパク質の生物学的活性を分析することができる検定を、以下の実施例に記載する。生物学的に活性なＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、ＩＬ−１８を結合することができる。本明細書中に開示されたＡｃＰＬポリペプチドの所望の生物学的活性は、ＡｃＰＬがＩＬ−１Ｒｒｐ１に結合した場合のＩＬ−１８の結合を、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独へのＩＬ−１８結合レベルと比較して増大させる能力である。
【００７３】
天然のアミノ酸配列への変更は、多数の既知の技法のいずれによっても行うことができる。例えば、突然変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位に隣接した、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。連結反応後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する類似体をコードしている。
【００７４】
或いは、オリゴヌクレオチドに支配される部位特異的突然変異誘発手順を用いて、必要な置換、欠失または挿入によって変更された特定のコドンを有する変更された遺伝子を提供することができる。上記の変更を行う典型的な方法は、本明細書中に援用されるＷａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｇ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；米国特許第４，５１８，５８４号および米国特許第４，７３７，４６２号によって開示されている。
【００７５】
ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の生物学的等価変異体は、例えば、アミノ酸残基のいろいろな置換を行うこと、または生物学的活性に必要でない末端または内部のアミノ酸を欠失することによって構築することができる。本発明の一つの実施態様において、変異アミノ酸配列は、天然の配列と少なくとも８０％同一、好ましくは、少なくとも９０％同一である。類似性％は、例えば、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰ計算機プログラム６．０バージョンを用いて配列情報を比較することによって決定することができる。そのＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）によって変更されたような、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の整列法を用いる。簡単にいうと、そのＧＡＰプログラムは、整列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の類似している数を、二つの配列の短い方の記号の全数で割ったものとして類似性を定義している。ＧＡＰプログラムの好ましい暗黙値パラメーターには、（１）ヌクレオチドについてのユナリー比較マトリックス（同一性に１および非同一性に０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３−３５８頁，１９７９によって記載のような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Reｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）それぞれのギャップに３．０のペナルティーおよびそれぞれのギャップの記号それぞれに追加の０．１０ペナルティー；および（３）末端のギャップにペナルティー無しが含まれる。
【００７６】
概して、置換は保存的に行われるはずであり、すなわち、最も好ましい代わりのアミノ酸は、置換される残基に似た物理化学的特性を有するものである。保存的置換の例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａを互いにのような、一つの脂肪族残基を別のものへの置換、またはＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間のような一つの極性残基を別のものへの置換が含まれる。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性を有する領域全体の置換は周知である。
【００７７】
システイン残基は、再生の際、不必要なまたは不正確な分子内ジスルフィド橋の形成を妨げるように欠失することができるしまたは他のアミノ酸と置き換えることができる。親水性アミノ酸を、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの膜貫通領域および／または細胞内ドメイン中の疎水性アミノ酸の代わりに置き換えて、タンパクの水への溶解性を増大させることができる。
【００７８】
隣接した二塩基アミノ酸残基は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系において発現を増大させるように修飾することができる。ＥＰ２１２，９１４号には、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を失活させる部位特異的突然変異誘発の使用が開示されている。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ａｒｇの対を変更するように残基を欠失、付加または置換することによって失活して、これら隣接した塩基性残基を生じさせない。これらアミノ酸対は、ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を構成し、配列番号：２のＡｃＰＬタンパク質の残基９８−９９、３２３−３３３、３３３−３３４、４７２−４７３および４７５−４７６で見出される。これらＫＥＸ２部位は、配列番号：４のＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質の１１３−１１４、３１４−３１５、３６４−３６５、４３７−４３８および４６５−４６６位で見出される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断への感受性がかなり小さく、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、不活性ＫＥＸ２部位への保存的且つ好ましいアプローチである。
【００７９】
本発明は、関連した天然パターングリコシル化を伴うまたは伴わないタンパク質も包含する。大腸菌などの細菌中における融合タンパク質をコードしているＤＮＡの発現は、非グリコシル化分子を提供する。失活したＮ−グリコシル化部位を有する機能性突然変異類似体は、オリゴヌクレオチド合成および連結によってまたは部位特異的突然変異誘発技術によって製造することができる。これら類似のタンパク質は、酵母発現系を用いて、均一な還元炭水化物の形で充分な収率で製造することができる。真核生物タンパク質中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ａ1−Ｚ（但し、Ａ１はＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。この配列において、アスパラギンは、炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を与える。
【００８０】
配列番号：２のＡｃＰＬアミノ酸配列は、アミノ酸２１−２３、１１９−１２１、１５２−２５４および３４５−３４７のところに、全て細胞外ドメイン中で見出される４個のこのようなＮ−グリコシル化部位を含有する。ＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメインは、配列番号：４の９１−９３、１０２−１０４、１５０−１５３、１６８−１７０、１９７−１９９、２０３−２０５、２３６−２３８および２９７−２９９位にＮ−グリコシル化部位を含む。このような部位は、別のアミノ酸をＡｓｎの代わりにまたは残基Ｚの代わりに置換する、ＡｓｎまたはＺを欠失する、または非Ｚアミノ酸をＡ1およびＺ間にまたはＡｓｎ以外のアミノ酸をＡｓｎおよびＡ1間に挿入することによって除去することができる。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を失活させる既知の手順には、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ２７６，８４６号に記載されたものが含まれる。
【００８１】
本発明の受容体タンパク質の変異体には、生物学的活性を保持する一次タンパク質の種々の構造体も含まれる。イオン化しうるアミノ基およびカルボキシル基の存在のために、例えば、受容体タンパク質は、酸性または塩基性の塩の形であってよいし、または中性の形であってよい。個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾することもできる。
【００８２】
一次アミノ酸構造も、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基等のような他の化学残基と一緒に共有結合または凝集結合を形成することによって修飾されうる。共有結合誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖にまたはＮ−若しくはＣ末端に結合することによって製造される。本発明の範囲内の受容体タンパク質の他の誘導体には、Ｎ−またはＣ末端融合のように組換え体培養物中での合成などによる他のタンパク質またはポリペプチドと受容体タンパク質の共有結合または凝集結合が含まれる。例えば、結合したポリペプチドは、タンパク質の転移を細胞膜または壁の内側または外側の合成部位から機能部位まで同時翻訳によってまたは翻訳後に支配するタンパク質のＮ末端領域にあるシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列であってよい（例えば、酵母α−因子リーダー）。
【００８３】
ペプチドは、所望のタンパク質に（例えば、組換えＤＮＡ技術によって）融合して、精製または識別を容易にすることができる。例には、ポリ−ＨｉｓまたはＦｌａｇ（登録商標）ペプチド（Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８および米国特許第５，０１１，９１２号）が含まれる。そのＦｌａｇ（登録商標）ペプチドは、極めて抗原性であり、特異的単クローン性抗体によって可逆的に結合したエピトープを与え、発現された組換え体タンパク質の迅速な検定および容易な精製を可能にする。ある与えられたタンパク質のＮ−またはＣ末端にＦｌａｇ（登録商標）オクタペプチドを融合するのに有用な発現系は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ニューヘブン，ＣＴから入手可能であり、それはそのオクタペプチドを結合する単クローン性抗体である。
【００８４】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの天然の存在する変異体を含むダイマーＩＬ−１８受容体複合体も、本発明によって包含される。このような変異体の例は、別のｍＲＮＡスプライシング現象によってまたはＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質のタンパク質分解切断によって生じるタンパク質であり、この場合、所望の生物学的活性は保持される。ｍＲＮＡの別のスプライシングは、天然に存在する可溶性の形のタンパク質のような、切断されているが生物学的に活性なＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質を生じることができる。タンパク質分解に起因する変異には、例えば、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質からの１個またはそれ以上の末端アミノ酸（概して、１−５個の末端アミノ酸）のタンパク質分解除去による、異なった種類の宿主細胞中の発現におけるＮ−またはＣ末端の相違が含まれる。
【００８５】
本発明は、本発明の受容体タンパク質を生理学的に許容しうる担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物も提供する。このような担体および希釈剤は、用いられる用量および濃度において受容者に無毒性であろう。このような組成物は、例えば、緩衝化溶液中にその受容体を含んでいてよく、それに、アスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストランを含めた炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、グルタチオン、および他の安定化剤および賦形剤を加えることができる。本発明の受容体は、静脈内注射、局所投与、連続注入、植込錠からの徐放のような、指標に適するように任意の適当な方法によって投与することができる。
【００８６】
本発明のヘテロダイマー受容体は、ＩＬ−１８結合試薬として有用である。この受容体は、好ましくは、可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１を含み、in vitro および in vivo 両方で使用される。それら受容体は、in vitro 検定において、例えば、細胞上のこの受容体へのＩＬ−１８の結合によって開始される生物学的シグナルの伝達機序の研究で用いることができる。このような受容体は、いろいろな in vitro 検定または in vivo 操作においてＩＬ−１８の生物学的活性を阻害するのにも用いることができると考えられる。本発明の一つの実施態様においては、本発明の受容体を投与してＩＬ−１８を結合させ、それによって、内因性細胞表面受容体へのＩＬ−１８の結合を阻害する。したがって、このようなＩＬ−１８の細胞への結合によって媒介される生物学的活性も阻害される。
【００８７】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独では、比較的低い親和性だけでＩＬ−１８を結合する（Ｔｏｒｉｇｏｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５７３，１９９７）。本発明の受容体は、例えば、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡを用いて同時トランスフェクションされた細胞によって生産され、高親和性でＩＬ−１８を結合する。このような本発明の受容体は、ＩＬ−１８に媒介される活性の阻害が望まれる場合に用いることができる。更に、in vitro 検定における本発明の受容体の使用は、その検定結果がＩＬ−１８の結合に起因することを確認させる利点を与える。
【００８８】
本発明の一つの実施態様においては、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含むヘテロダイマー受容体を in vivo 投与して、ＩＬ−１８の生物学的活性を阻害する。ＩＬ−１８は、ＮＦκＢ活性を媒介することが知られており、Ｔｈ１細胞の成長および分化の刺激薬として作用し、そしてＴｈ１細胞からのγインターフェロン生産の強力な誘導物質である。ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞致死活性も増大させ、敗血症性ショック、肝臓破壊および糖尿病に関与している。ＩＬ−１８のこれらまたは他の生物学的作用が望ましくない場合、本発明の受容体を投与してＩＬ−１８を結合し且つＩＬ−１８活性の作用を改善することができる。
【００８９】
本発明の受容体は、ＩＬ−１８によって媒介される障害を治療する治療的有効量で患者に投与することができる。障害は、ＩＬ−１８がその障害を（直接的にまたは間接的に）引き起こすまたは悪化させる場合、ＩＬ−１８によって媒介されるといわれる。可溶性受容体タンパク質は、ＩＬ−１８に競合的に結合させ、それによって、内因性細胞表面受容体へのＩＬ−１８の結合を阻害するのに用いることができる。
【００９０】
ＩＬ−１ＲｒｐＩに結合したＡｃＰＬを含むヘテロダイマー受容体も、ＩＬ−１８タンパク質の生物学的活性に関する検定で用いられ、その生物学的活性は、受容体への結合親和性によって測定される。詳しく説明すると、その受容体は、結合検定において、ＩＬ−１８フラグメント、変異体または突然変異タンパク質の生物学的活性を測定するのに用いることができる。その受容体は、ＩＬ−１８タンパク質の修飾（例えば、化学的修飾、突然変異等）後に、ＩＬ−１８の生物学的活性が保持されているかどうか確認するのに有用である。修飾されたＩＬ−１８タンパク質の受容体への結合親和性を未修飾ＩＬ−１８タンパク質の場合と比較して、生物学的活性へのその修飾の何らかの悪影響を検出する。したがって、その修飾タンパク質を研究実験または検定で用いる前に、生物学的活性を評価することができる。
【００９１】
それらヘテロダイマー受容体は、例えば、異なった条件下でのＩＬ−１８タンパク質の有効期間および安定性を監視する“品質保証”実験の実施者が用いることができる試薬としても使用される。それら受容体は、異なった温度で異なった期間貯蔵された、または例えば、異なった種類の組換え体発現系で製造されたＩＬ−１８タンパク質の生物学的活性（受容体の結合親和性に関して）を確認するのに用いることができる。
【００９２】
次の実施例は、本発明のいくつかの実施態様を詳しく説明するために与えられており、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
実施例
実施例１
in vitro 沈降実験
ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはそれら二つのポリペプチドの組合せがＩＬ−１８を結合するかどうか確認するために、いくつかのＦｃ融合タンパク質を製造し、次のように試験した。可溶性ＡｃＰＬ／Ｆｃ融合タンパク質をコードしている発現ベクターは、抗体に由来するＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合したＡｃＰＬの切断された細胞外ドメインを含み、それを次のように構築した。ベクターｐＤＣ３０４中にＡｃＰＬ ＤＮＡを含む組換え体発現ベクターを、所望のインフレーム制限部位を５’および３’末端に含有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。得られたフラグメントは、ＡｃＰＬ ＤＮＡの５’末端を含み、配列番号：１のヌクレオチド１５５１で終結し、導入されたＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位を５’および３’末端それぞれに含み、それを慣用的な技法によって単離した。
【００９３】
ｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃと称される組換え体ベクターは、ＦｃポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ（−Ｈ−ＣＨ2−ＣＨ3のみ）を含む。ベクターｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃを、ベクターのポリリンカー領域内で切断する制限酵素ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩを用いて、ＦｃポリペプチドをコードしているｃＤＮＡの上流で消化した。
【００９４】
上で単離されたＡｃＰＬをコードしているＤＮＡを、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃ中に連結して、ＦｃポリペプチドＤＮＡがＡｃＰＬ ＤＮＡの３’末端に融合するようにした。得られた発現ベクターは、配列番号：２のＡｃＰＬ配列のアミノ酸１−３６５の後にｈＩｇＧ１ＦｃのＨ−ＣＨ2−ＣＨ3領域を含む融合タンパク質をコードしていた。
【００９５】
可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ融合タンパク質をコードしている発現ベクターを次のように構築した。ＩＬ−１Ｒｒｐ１ ＤＮＡを含む組換え体ベクターを、所望の制限部位を含有する遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。得られたフラグメントは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の５’末端を含み、それを慣用的な技法によって単離した。Ａｓｐ７１８およびＢｇｌＩＩを用いて消化されたこのＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントを、上記のｈＩｇＧ１Ｆｃフラグメントと結合し、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。得られた消化物フラグメントを、Ａｓｐ７１８およびＮｏｔＩを用いて消化されたｐＤＣ３０４に連結した。組換え体ベクターによってコードされる得られたＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号：４の（Ｎ末端からＣ末端への）アミノ酸１−３２９の後にｈＩｇＧ１／ＦｃのＨ−ＣＨ2−ＣＨ3領域を含む。
【００９６】
一つの試料セットにおいて、ＣＯＳ−７細胞を、ｐＤＣ２０６対照またはｐＤＣ２０６−ＩＬ−１８ベクターを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞のもう一つの試料セットにおいて、上記のＦｃ融合ベクターをトランスフェクションした。全試料セットは次の通りであった。
【００９７】
試料 細胞のトランスフェクションに用いたベクターにコードされるもの
Ａ 空ｐＤＣ２０６発現ベクター（対照）
Ｂ ｐＤＣ２０６ｈＩＬ−１８
１ ｐＤＣ４０９（対照）
２ ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ
３ ＡｃＰＬ／Ｆｃ
４ ＡｃＰＬ／ＦｃおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ
トランスフェクションから２日後、試料ＡおよびＢをｃｙｓ／ｍｅｔ不含培地中で１時間飢餓状態にした後、［35Ｓ−ｃｙｓ］［35Ｓ−ｍｅｔ］含有培地を用いて６時間標識した。上澄みを取り出し、遠心分離を行い、プロテアーゼインヒビターの存在下で０．４Ｍ ＮａＣｌ／１．０％トリトンＸ−１００に調整した。試料１−４のＦｃ融合タンパク質を用いてトランスフェクションされた細胞からの上澄みを、トランスフェクションから２日後に取り出し、遠心分離した。それぞれのＦｃ融合上澄みを、（ａ）ベクターでトランスフェクションされた；かまたは（ｂ）ＩＬ−１８でトランスフェクションされた35Ｓ標識上澄みと混合した。精製ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ受容体タンパク質を、対照としてのもう一つの放射性標識された上澄み部分に加えた。プロテインＧ−セファロースを各実験試料に加え、４℃で一晩沈降させた。次に、それら試料を、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＳＤＳ、１．０％ＮＰ−４０緩衝液中で充分に洗浄し、４−２０％トリス−グリシンゲル中の電気泳動によって分離した。そのゲルを固定し、増幅させ、乾燥させ、フィルムに露出させた。タンパク質の全レベルを評価し、未標識Ｆｃ融合タンパク質を考慮するために、それぞれの沈降の一部分を、別の４−２０％トリス−グリシンゲル上で分析し且つ銀染色した。
【００９８】
細胞試料１−４の上澄みは、対照上澄み（試料Ａ）からの１０−３０Ｋｄ範囲内にタンパク質をほとんど沈降させなかった。ＩＬ−１８（試料Ｂ）は、細胞試料２（ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ）からの上澄みによって沈降したが、細胞試料１（対照）または細胞試料３（ＡｃＰＬ／Ｆｃ）からの上澄みによって沈降しなかった。有意に多量のＩＬ−１８は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１／ＦｃおよびＡｃＰＬ／Ｆｃの同時トランスフェクションから得られた試料４全ての上澄みによって沈降した。
【００９９】
したがって、ＩＬ−１Ｒｒｐ１はＩＬ−１８を結合できるが；ＡｃＰＬはＩＬ−１８を結合できないし；そして同時発現されたＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬはＩＬ−１８を結合することができ、それら同時発現されたタンパク質は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独より高レベルのＩＬ−１８結合を示す。銀染色されたゲルは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独でトランスフェクションされた上澄みと比較して、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬでトランスフェクションされた上澄み中のＩＬ−１Ｒｒｐ１が多くないことを示している。これは、これら試料中で発現されるＩＬ−１Ｒｒｐ１がより多いという可能性を排除する。それら結果は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１／ＡｃＰＬダイマーのＩＬ−１８結合親和性が、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独の親和性より大きいことを示している。
【０１００】
実施例２
ＮＦκＢ活性の誘導
ＩＬ−１８シグナリングにおけるＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの役割を確認するために、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１、およびＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの組合せを、ＣＯＳ細胞およびＳ４９．１細胞中で過発現させ、ＩＬ−１８刺激のＮＦκＢ活性への作用を評価した。
【０１０１】
ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ／デキストラン法によって１２ウェルフォーマットでトランスフェクションした。各ウェルを、合計２００ｎｇの１種類または複数の適当な発現ベクター、およびルシフェラーゼ発現を媒介する３ヶ所のＮＦκＢ部位を含有する８００ｎｇのＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いてトランスフェクションした。約１０7個のＳ４９．１細胞を、０．７ｍＬ中において４０μｇのＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミドおよび合計２００ｎｇの１種類または複数の適当な発現ベクターを用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクションした。エレクトロポレーションは、９６０μＦおよび３２０Ｖで行った。
【０１０２】
それら細胞を２日間インキュベート後、４０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入された）を用いて４時間刺激した。細胞を洗浄し、溶解させ、ルシフェラーゼ活性についてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から購入された）を製造者の指示にしたがって用いて検定した。
【０１０３】
対照ベクター単独、ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１だけをコードしているベクター、またはｍＡｃＰＬだけをコードしているベクターを用いてトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞またはＳ４９．１細胞は、ｍＩＬ−１８刺激に応答しなかった。更に、ｍＡｃＰＬでトランスフェクションされたＳ４９．１細胞は、そのトランスフェクションを、ｍＩＬ−１Ｒ Ｉ型またはｍＩＬ−１ＲＡｃＰをコードしている発現ベクターと組み合わせた場合、ｍＩＬ−１８刺激に応答しなかった。しかしながら、ｍＡｃＰＬおよびｍＩＬ−１Ｒｒｐ１で同時トランスフェクションされ且つｍＩＬ−１８で刺激された細胞は、ＮＦκＢ ＤＮＡ結合活性の増加を示し、それは、ＣＯＳ細胞で１０倍およびＳ４９．１細胞で３００倍であった。hＩＬ−１Ｒｒｐ１でトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞は、ｈＩＬ−１８刺激への応答を示さなかったが、ｈＡｃＰＬ単独でトランスフェクションされ且つｈＩＬ−１８で刺激されたＣＯＳ７細胞は、ＮＦκＢ活性の８倍増加を示した。これは、ＣＯＳ７細胞に内因的なサルＩＬ−１Ｒｒｐ１とｈＡｃＰＬの結合に起因している。ｈＡｃＰＬを含むhＩＬ−１Ｒｒｐ１の過発現は、ｈＩＬ−１８に応答したＮＦκＢ活性の刺激を、ｈＡｃＰＬだけを過発現する細胞中で見られる場合を越えて増大させることはなかった。ＮＦκＢ活性のこの劇的な増大は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１がＩＬ−１８受容体のサブユニットであり、ＩＬ−１８刺激に応答したＮＦκＢシグナリングを誘導するように協同する。
【０１０４】
実施例３
ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１抗体重鎖および軽鎖融合タンパク質の製造
次に、抗体重鎖および抗体軽鎖ポリペプチドに融合したＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含む融合タンパク質の製造を記載する。
【０１０５】
最初に、上流にリンカー領域を含むヒトＩｇＧ１の定常領域全体をコードしている発現ベクターを構築する。このような発現ベクターは、融合タンパク質をコードしているプラスミドの生成を容易にする。ＰＣＲ技術を用い、上流のＢｇｌＩＩ部位および下流のＮｏｔＩ部位を含有するプライマーを用いて、上述のＩｇＧ１定常領域を増幅させる。得られたＰＣＲ生産フラグメントを消化し、精製し、そしてＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化されているｐＤＣ４１２に連結させる。次に、ｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１発現ベクターをＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化する。
【０１０６】
次に、リンカー領域の前にＩｇκ定常ドメイン、そして続いてリンカー領域およびポリ−Ｈｉｓドメインを含有する発現ベクターを製造する。そのポリ−Ｈｉｓドメインは、好都合に、タンパク質精製処理を助ける。ＰＣＲ技術を用い、ＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを含有するプライマーを用いて、定常領域を増幅させる。得られたＰＣＲ生産フラグメントを消化し、精製し、そしてｐＤＣ４１２に連結させる。目的の可溶性受容体は、独特のＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位を用いることによって上流にクローン化することができる。
【０１０７】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｃκ発現ベクターを製造するために、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメインを、ＳａｌＩ（５’）およびＢｇｌＩＩ（３’）制限部位を含有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させる。この精製され且つ消化されたＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＤＣ４１２−Ｉｇκ発現ベクターに連結して、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の可溶性部分をＣκの定常領域に結合する融合タンパク質をコードするインフレーム構築物を生成する。
【０１０８】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１−ｈＩｇＧ１発現ベクターを製造するために、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントをＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｃκから取り出し、同じ制限酵素で消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１に連結する。両方のベクターが同じ読み枠中にＢｇｌＩＩ部位を有するので、これは、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびｈＩｇＧ１間の融合を容易に生じさせるであろう。
【０１０９】
ＡｃＰＬ−Ｃκ発現ベクターを製造するために、ＡｃＰＬの細胞外ドメインを、ＳａｌＩ（５’）およびＢｇｌＩＩ（３’）制限部位を含有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させる。次に、この精製され且つ消化されたＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＤＣ４１２−Ｃκに連結して、ＡｃＰＬの可溶性部分をＣκの定常領域に結合するインフレーム融合タンパク質を生成する。
【０１１０】
ＡｃＰＬ−ｈＩｇＧ１発現ベクターを製造するために、可溶性ＡｃＰＬをコードしているＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントをＡｃＰＬ−ｃκから取り出し、同じ制限酵素で消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１に連結する。両方のベクターが同じ読み枠中にＢｇｌＩＩ部位を含有するので、これは、可溶性ＡｃＰＬおよびｈＩｇＧ１間の融合を容易に生じさせるであろう。
【０１１１】
ＣＯＳ−７細胞を、上記の融合ベクターを用いてトランスフェクションする。実施例１に記載のように細胞を培養し、融合タンパク質を集める。
実施例４
ＩＬ−１８に誘導されたＮＦκＢ活性の阻害
ＣＯＳ７細胞を、１２ウェルプレート中において、ウェル当たり各１０ｎｇのｍＩＬ−１Ｒｒｐ１およびｍＡｃＰＬ発現ベクターおよび５０ｎｇの３ＸＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入された）を用いて増加する量のいろいろなレポーターＦｃ融合タンパク質の存在下で刺激した。ｍＩＬ−１８は、それらタンパク質と一緒に室温で２０分間プレインキュベート後、細胞に加えられた。Ｆｃタンパク質の量は、１ｕｇ／ｍｌ−５０ｕｇ／ｍｌまで滴定された。細胞を４時間刺激後、溶解させ、そしてＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてルシフェラーゼ活性を評価した。
【０１１２】
ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ、ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−ＦｌａｇｐｏｌｙＨｉｓまたはｍＡｃＰＬ−Ｆｃを用いたＩＬ−１８のプレインキュベーションは、試験されたいずれの濃度においても、ＮＦκＢの誘導にほとんど影響しなかった。対照的に、異種ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ＋ｍＡｃＰＬ−Ｆｃタンパク質混合物（ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃのホモダイマー、ｍＡｃＰＬ−ＦｃのホモダイマーおよびヘテロダイマーｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ／ｍＡｃＰＬ−Ｆｃ分子から成る）を用いたＩＬ−１８のインキュベーションは、ＮＦκＢ誘導の用量依存性阻害を引き起こした。誘導されない細胞は、３Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを示し、いずれの受容体-Fｃタンパク質も不存在下でｍＩＬ−１８を用いて刺激された細胞は、２５Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを示した。ＮＦκＢ誘導の最大阻害は、２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌのｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ＋ｍＡｃＰＬ−Ｆｃタンパク質混合物について認められ、それは６Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを生じ、ＩＬ−１８活性の８７％阻害を示した。
【配列表】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーであるタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、高親和性ＩＬ−１８結合および活性を媒介し、更には、ＩＬ−１８に媒介される活性を阻害するＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ受容体複合体に関する。
【０００２】
関連技術の説明
Ｉ型インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１ＲＩ）は、前炎症性サイトカインであるインターロイキン−１の生物学的作用を媒介する（Ｓｉｍｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５８５−５８９，１９８８；Ｃｕｒｔｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３０４５−３０４９，１９８９）。もう一つのインターロイキン−１受容体（ＩＩ型ＩＬ−１ＲまたはＩＬ−１ＲＩＩと称される）はＩＬ−１を結合するが、シグナル伝達を媒介しているとは考えられない（ＭｃＭａｈａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１；Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６１５５−６１５９，１９９３）。ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩはそれぞれ、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを結合する。ＩＬ−１は、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患に関与している。ＩＬ−１が骨粗鬆症においてある役割を果たしていることは益々明らかである。これら活性は全て、Ｉ型ＩＬ−１Ｒの細胞質部分のシグナリング機能によって開始される。ＩＬ−１ｒａは、Ｉ型ＩＬ−１受容体に結合することによってＩＬ−１の活性を阻害し、それによってＩＬ−１αおよびＩＬ−１βへの接近を阻止するが、それ自体の生物学的応答を導くことはない。
【０００３】
ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩは、有意の配列相同性を示すタンパク質のファミリーに属する。一つのこのようなタンパク質は、Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３７５７−１３７６５，１９９５）に記載のＩＬ−１Ｒ補助タンパク質（ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰ）である。このタンパク質だけではＩＬ−１を結合できないが、ＩＬ−１ＲＩとＩＬ−１αおよびＩＬ−１βと一緒に複合体を形成する。ＩＬ−１ＲＩと一緒に同時発現された場合、組換え体ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰは、ＩＬ−１βへのＩＬ−１ＲＩの結合親和性を増加させる（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら，上記）。
【０００４】
ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩファミリーに配列相同性を示すもう一つのタンパク質は、ＩＬ−１受容体関連タンパク質Ｉ（ＩＬ−１ＲｒｐＩ）である（Ｐａｒｎｅｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：３９６７，１９９６およびＴｏｒｉｇｏｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２５７３７，１９９７を参照されたい）。尚もう一つのこのようなタンパク質はＡｃＰＬである。
【０００５】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの同族体であり、ＩＬ−１によって活性化される同様の応答の多くを活性化することが知られている。例えば、ＩＬ−１８を用いて刺激された細胞は、ＮＦκＢを活性化し、既知の炎症メディエーターを生じる。ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞の成長および分化の刺激薬として作用し、Ｔｈ１細胞からのγインターフェロン生産の強力な誘導物質である。ヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞は、炎症反応を媒介することが知られている。ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞致死活性を増大させ、敗血症性ショック、肝臓破壊、炎症性腸疾患および糖尿病に関与している。
【０００６】
最近、ＩＬ−１ＲｒｐＩはＩＬ−１８に結合し、トランスフェクションされた細胞中でのＩＬ−１８シグナリングを媒介することが示された。しかしながら、ＩＬ−１８へのＩＬ−１ＲｒｐＩ結合親和性は極めて低いので、１種類またはそれ以上の追加の受容体または受容体サブユニットはＩＬ−１８の結合およびシグナリングに関与すると考えられる。
【０００７】
したがって、ＩＬ−１８の追加の受容体の識別が望まれる。このような受容体タンパク質を研究して、それらがＩＬ−１８を結合するか否か、そして結合するならば、それら受容体がシグナル伝達の媒介においてある役割を果たしているかどうか確認することができる。更に、このような受容体の可溶性の形を用いて、ＩＬ−１８活性を阻害し、そしてＩＬ−１８シグナリングに起因する炎症性および／または自己免疫疾患をいずれも改善することができる。ＩＬ−１８に関して可能性のある更に別の親和性変換サブユニットの存在も探求することができる。
【０００８】
発明の概要
本発明は、本明細書中においてＩＬ−１８受容体複合体と称される受容体ポリペプチドを提供する。より詳しくは、本発明は、ＡｃＰＬポリペプチドまたはそのフラグメントおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを含むマルチマー受容体ポリペプチドを提供する。そのＡｃＰＬポリペプチドは、任意の適当な手段によってＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドに共有結合していてよいしまたは非共有結合していてよい。このような手段には、架橋試薬、ポリペプチドリンカーによる、およびジスルフィド結合によるまたはロイシンジッパーの使用によるような結合が含まれる。本発明の一つの実施態様において、受容体は、組換えＤＮＡ技術によって生産される融合タンパク質である。本発明のこのマルチマー受容体は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独の場合より大きい親和性でＩＬ−１８を結合する。ＩＬ−１８によって媒介される障害は、このような障害に苦しむ患者に治療的有効量の本発明の受容体を投与することによって治療することができる。
【０００９】
発明の詳細な記述
本発明は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の同時発現が、ＩＬ−１８を用いて刺激された細胞中においてＮＦκＢ活性を劇的に増大させるという知見に基づいている。ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独ではＩＬ−１８を弱くしか結合しないし、ＡｃＰＬはＩＬ−１８を結合しないので、同時発現されたＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１によるＮＦκＢ活性の増大は、これらポリペプチドがＩＬ−１８受容体複合体のサブユニットであることを示している。本発明により、ＩＬ−１８受容体複合体と称される新規ポリペプチドを提供する。好都合には、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬまたはそれらのフラグメントを含むこのようなダイマーＩＬ−１８受容体複合体は、ＩＬ−１８の前炎症作用を含めたＩＬ−１８活性を阻害するのに有用であり、同一細胞中で同時発現されるタンパク質として、または受容体サブユニットとしてのＡｃＰＬに結合したＩＬ−１Ｒｒｐ１としてＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬを含むことができる。好ましくは、それらサブユニットは共有結合によって結合している。それらサブユニットは、架橋試薬またはポリペプチドリンカーなどによる任意の適当な手段によって共有結合していてよい。
【００１０】
本発明の一つの実施態様において、受容体は、組換えＤＮＡ技術によって生産される融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１：Ｆｃ融合タンパク質をコードしているＤＮＡおよびＡｃＰＬ：Ｆｃ融合タンパク質をコードしているＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクションし、同一細胞中でそれらダイマーを同時発現させることによって製造することができる。
【００１１】
或いは、ＡｃＰＬ／ＩＬ−１Ｒｒｐ１ダイマーは、受容体サブユニットの一方を免疫グロブリン重鎖の定常領域に融合し、もう一方の受容体サブユニットを免疫グロブリン軽鎖の定常領域に融合することによって製造することができる。例えば、ＡｃＰＬタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ1−ヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3領域に融合することができ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質は、Ｉｇκ軽鎖のＣκ領域に融合させることができ、逆の場合も同じである。免疫グロブリン軽鎖融合タンパク質および免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードしているＤＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞は、ＡｃＰＬ融合タンパク質およびＩＬ−１Ｒｒｐ１融合タンパク質を含有する重鎖／軽鎖ヘテロダイマーを発現する。重鎖間のジスルフィド結合により、それらヘテロダイマーは、マルチマー、主にテトラマーを与えるように更に結合する。好都合には、２個のホモダイマーの場合、重鎖または軽鎖融合が発現され、このようなホモダイマーはヘテロダイマーから容易に分離することができる。
【００１２】
ＩＬ−１８受容体タンパク質複合体に加えて、本発明は、ヘテロマーポリペプチドをコードしている単離されたＤＮＡ、ヘテロマーポリペプチドをコードしているＤＮＡを含有する発現ベクター、およびこのような発現ベクターを用いてトランスフェクションされた宿主細胞を包含する。可溶性の形のタンパク質を含めた組換え体ＩＬ−１８受容体の製造方法も開示する。新規ポリペプチドと免疫反応性の抗体も、本明細書中において提供する。
【００１３】
本発明の一つの実施態様において、ヘテロマーＩＬ−１８受容体のポリペプチドサブユニットには、配列番号：２または配列番号：６に記載の少なくとも１個のＡｃＰＬサブユニット、および配列番号：４または配列番号：８に記載の少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１サブユニットが含まれる。これらポリペプチドをコードしているＤＮＡは、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：３および配列番号：７にそれぞれ示される。配列番号：１によってコードされるＡｃＰＬサブユニットタンパク質には、１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：２の残基１−１４）を含む３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：２のＮ末端からＣ末端への残基１−３５６）；２５アミノ酸の膜貫通領域（残基３５７−３８１）および２１８アミノ酸の細胞質ドメイン（残基３８２−５９９）が含まれる。配列番号：５によってコードされるＡｃＰＬサブユニットタンパク質には、１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：６の残基１−１４）を含む３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：６の残基１−３５６）；２４アミノ酸の膜貫通領域（残基３５７−３８０）およびアミノ酸残基３８１−６１４の細胞質ドメインが含まれる。配列番号：３によってコードされるＩＬ−１Ｒｒｐ１サブユニットタンパク質には、１９アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：４の残基１−１９）を含む３２９アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：４の残基１−３２９）；２１アミノ酸の膜貫通領域（配列番号：４の残基３３０−３５０）；およびアミノ酸残基３５１−５４１の細胞質ドメインが含まれる。配列番号：７によってコードされるＩＬ−１Ｒｒｐ１サブユニットタンパク質には、１８アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：８の残基１−１８）を含む３２２アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：８の残基１−３２２）；２５アミノ酸の膜貫通領域（配列番号：８の残基３２３−３４７）；およびアミノ酸残基３４８−５３７の細胞質ドメインが含まれる。更に、ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、米国特許第５，７７６，７３１号に記載されているし、ＡｃＰＬは、本明細書中に援用される同時係属出願Ｓ／Ｎ６０／０７８，８３５号およびＳ／Ｎ６０／０７２，３０１号に記載されている。
【００１４】
好ましくは、ダイマーＩＬ−１８受容体のポリペプチドサブユニットは、所望の活性を有するヘテロマー複合体を一緒に形成するＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬポリペプチドの可溶性フラグメントである。このようなポリペプチドには、タンパク質の膜貫通領域および細胞質ドメインの全部または一部分を欠いたものが含まれる。したがって、例えば、本発明のヘテロマー受容体複合体には、配列番号：２または配列番号：６の細胞外ドメインである少なくとも１個のサブユニットおよび配列番号：４または配列番号：８の細胞外ドメインである少なくとも１個のサブユニットが含まれうる。ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のこれら可溶性細胞外ドメインは、それらのシグナルペプチドを含むことができるしまたは除外することができる。したがって、もう一つの実施態様において、ヘテロマーＩＬ−１８受容体には、配列番号：２または配列番号：６のアミノ酸残基１−３５６または残基１５−３５６、および配列番号：４のアミノ酸残基１−３２９または残基２０−３２９または配列番号：８のアミノ酸残基１−３２５または残基１９−３２２が含まれる。シグナル配列を含むことの妥当性は、融合タンパク中のＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１の位置および組換えＤＮＡ技術によって受容体が生産される予定の宿主細胞のような因子に依る。好ましい実施態様において、可溶性ＡｃＰＬまたは可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントの一方をコードしているＤＮＡ構築物を、免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードしているＤＮＡに融合し、可溶性ＡｃＰＬまたは可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントのもう一方をコードしているＤＮＡ構築物を、免疫グロブリン軽鎖の定常領域をコードしているＤＮＡに融合する。
【００１５】
或いは、ＩＬ−１８受容体は、ＡｃＰＬまたは可溶性ＡｃＰＬフラグメントと一緒に非共有結合によって複合体を形成したＩＬ−１Ｒｒｐ１または可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントを含んでいてよい。ＩＬ−１Ｒｒｐ１のＡｃＰＬへの非共有結合は、ＩＬ−１８を結合する受容体の能力を妨げない任意の適当な手段によって得ることができる。一つのアプローチにおいて、最初の化合物をＩＬ−１Ｒｒｐ１に結合し、その最初の化合物に非共有結合するであろうもう一つの化合物をＡｃＰＬに結合する。このような化合物の例は、ビオチンおよびアビジンである。例えば、ビオチンとアビジンとの非共有結合相互作用によって受容体が形成される。本発明の一つの実施態様において、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは組換え体ポリペプチドであり、それぞれ組換え体細胞から精製された後、互いに非共有結合して受容体を形成する。宿主細胞は、二つの異なった発現ベクターを用いて形質転換することができるので、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは両方とも、組換え体宿主細胞によって生産される。このような形質転換された宿主細胞によって生産されるＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは、非共有結合相互作用によって複合体を形成するように結合することができる。このような形質転換された細胞が、膜に結合した形のタンパク質を発現する場合、このような細胞は、競合検定を含めた種々の検定で有用である。
【００１６】
実施例１に記載の結合検定は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独、ＡｃＰＬ単独、およびＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの組合せを用いてトランスフェクションされた細胞からの上澄みによるＩＬ−１８の結合を比較する。ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬを同時発現する細胞からの上澄みは、高レベルのＩＬ−１８結合を示し；ＩＬ−１Ｒｒｐ１だけを発現する細胞からの上澄みは、低レベルのＩＬ−１８結合を示し；そしてＡｃＰＬだけを用いてトランスフェクションされた細胞からの上澄みは、ＩＬ−１８を結合しない。実施例２に記載のＮＦκＢ誘導検定は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独でトランスフェクションされた細胞およびＡｃＰＬ単独でトランスフェクションされた細胞が、ＩＬ−１８刺激に応答しないことを示している。しかしながら、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ両方を用いて同時トランスフェクションされ且つＩＬ−１８を用いて刺激された細胞は、ＮＦκＢ誘導を大きく増大させた。
【００１７】
本明細書で用いられる用語ＩＬ−１Ｒｒｐ１及びＡｃＰＬは、所望の生物学的活性を有する天然のタンパク質の変異体及び短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）を含む。天然の配列の１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換又は削除によって産生される変異体は、後ほどより詳細に論ずる。
【００１８】
上述したように、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１および可溶性ＡｃＰＬポリペプチドは、いくつかの用途に好適である。本発明の文脈中で用いられる“可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１”とは、天然のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドの細胞外領域の全部または一部分とアミノ酸配列がほぼ同様であり、しかも細胞膜上にポリペプチドを保持させると考えられる膜貫通領域を欠いているために、発現時に分泌されるポリペプチドを意味する。適当な可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、所望の生物学的活性を保持する。可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、その可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１が分泌されうるという条件ならば、膜貫通領域の一部分または細胞質ドメインの一部分または他の配列も含んでいてよい。
【００１９】
同様に、本明細書中で用いられる“可溶性ＡｃＰＬ” という用語は、天然のＡｃＰＬポリペプチドの細胞外領域の全部または一部分とアミノ酸配列がほぼ同様であり、しかも発現時に分泌されるが、所望の生物学的活性を保持しているタンパク質を意味する。可溶性ＡｃＰＬは、そのポリペプチドが分泌されるのであれば、膜貫通領域、細胞質ドメイン、または他の配列の一部分を含んでいてよい。
【００２０】
一つの実施態様において、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬポリペプチドには、細胞外ドメイン全体が含まれる。分泌されるためには、それら可溶性ポリペプチドは、天然のシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドを含む。したがって、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドの例は、配列番号：４のアミノ酸１−３２９（ヒトＩＬ−１Ｒｒｐ１）および配列番号：８のアミノ酸１−３２２（ネズミＩＬ−１Ｒｒｐ１）を含む。可溶性ＡｃＰＬポリペプチドの例は、配列番号：２のアミノ酸１−３５６（ヒトＡｃＰＬ）および配列番号：６のアミノ酸１−３５６（ネズミＡｃＰＬ）を含む。
【００２１】
抗体Ｆｃ領域ポリペプチドに融合した配列番号：４のＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメインおよびＦｃ領域ポリペプチドに融合したＡｃＰＬの細胞外ドメインを含む可溶性融合タンパク質を実施例１に記載する。
【００２２】
可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、所望のタンパク質を発現するそのままの細胞を、例えば遠心分離によって培地から分離し、所望のタンパク質の存在についてその培地（上澄み）を検定することによって確認する（そして、その非可溶性膜結合対応物と識別する）ことができる。その培地は、以下の実施例に記載されたのと同様または同一である手順を用いて検定することができる。培地中のＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１の存在は、そのタンパク質が細胞から分泌されたこと、したがって、可溶性の形の所望のタンパク質であることを示している。可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、これらタンパク質の天然に存在する形であってよい。或いは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質の可溶性フラグメントは、以下に記載のように、組換えＤＮＡ技術によって製造することができるしまたはそれ以外の場合は単離することができる。
【００２３】
可溶性の形のＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの使用は、いくつかの用途に好都合である。組換え体宿主細胞からのタンパク質の精製は、可溶性タンパク質がそれら細胞から分泌されるので容易になる。更に、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬタンパク質を含む本発明の受容体は、概して、静脈内投与に一層適している。
【００２４】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬタンパク質のいろいろなドメインおよびシグナルペプチドについての前述の考察に関して、当業者は、タンパク質のこのような領域の上記境界がおおよそのものであることを認識するであろう。例えば、シグナルペプチドの切断部位を予測する計算機プログラムが利用可能であるが、予測される部位以外の部位で切断が起こることがありうる。更に、タンパク質標品は、２ヶ所以上の部位でのシグナルペプチドの切断のために、異なったＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含むことがありうるということが確認されている。したがって、細胞外ドメインを含む可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬポリペプチドには、細胞外ドメインのＣ末端として上で確認されるものとは異なることがありうるＣ末端アミノ酸を有するものが含まれる。更に、用いられる特定の発現系によって異なることがありうる翻訳後プロセシングは、異なったＮ末端を有するタンパク質を生じるかもしれない。所望の生物学的活性を保持しているこのような変異体は、本明細書中で用いられる“ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチド” および“ＡｃＰＬポリペプチド”という用語によって包含される。
【００２５】
可溶性ポリペプチドを含めて切断されたＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは、多数の慣用的な技術のいずれによっても製造することができる。組換え体タンパク質の場合、所望のフラグメントをコードしているＤＮＡフラグメントは、発現ベクター中にサブクローン化することができる。或いは、所望のＤＮＡ配列は、既知の技術を用いて化学的に合成することができる。ＤＮＡフラグメントは、完全長さのクローン化されたＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によって製造され、そしてアガロースゲル上の電気泳動によって単離することができる。１ヶ所または複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有するリンカーは、所望のＤＮＡフラグメントを発現ベクター中に挿入するのに用いることができるし、またはそこに天然に存在する切断部位でそのフラグメントを消化することができる。ＤＮＡフラグメントのＮ−またはＣ末端を所望の地点まで再構築するオリゴヌクレオチドを合成することができる。そのオリゴヌクレオチドは、所望のコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有し且つそのコーディング配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を置くことができる。
【００２６】
周知のポリメラーゼ連鎖反応手順を用いて、所望のタンパク質フラグメントをコードしているＤＮＡ配列を単離することもできる。そのフラグメントの所望の末端を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、このようなポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。いずれの適当なＰＣＲ手順も用いてよい。一つのこのような手順は、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）に記載されている。もう一つは、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｗｕら監修，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，サン・ディエゴ（１９８９），１８９−１９６頁に記載されている。概して、ＰＣＲ反応は、適当な緩衝化溶液中において、５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型ＤＮＡ（この場合、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬ ＤＮＡ）および４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸それぞれと結合することを行う。その溶液を加熱し（例えば、９５℃−１００℃）、二本鎖ＤＮＡ鋳型を変性させた後、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を加える前に冷却する。所望のＤＮＡフラグメントを増幅させるために、多数の反応サイクルを行う。
【００２７】
ＡｃＰＬポリペプチドを、共有結合または非共有結合によってＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドに結合する。共有結合は、非共有結合とは反対に、概して共有結合によって与えられる増大した安定性を考えると、いくつかの用途に、例えば、in vivo 使用に好適である。本発明の受容体を構築する場合、共有結合は、架橋試薬、ペプチドリンカーまたは任意の他の適当な技法によって得ることができる。
【００２８】
一つのタンパク質分子をもう一つに架橋するのに有用な多数の試薬が知られている。ヘテロ二官能性およびホモ二官能性リンカーは、この目的のために、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ロックフォード，イリノイ州から入手可能である。このようなリンカーは、アミノ酸側鎖上のいくつかの官能基と反応するであろう２種類の官能基（例えば、エステルおよび／またはマレイミド）を含有するので、一つのポリペプチドをもう一つに結合する。
【００２９】
本発明において用いることができるペプチドリンカーの一つの種類は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ドメインを、それぞれのドメインが適当に折りたたまれ、所望の生物学的活性に必要な二次および三次構造を確実にする充分な距離まで隔てる。そのリンカーは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメインに適当な空間的配向をとらせて、ＩＬ−１８の結合部位も形成させるはずである。
【００３０】
適当なペプチドリンカーは、当業者に知られており、慣用的な技法によって用いることができる。適当なペプチドリンカーの中には、本明細書中に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されたものがある。ペプチドリンカーは、一つのポリペプチドをもう一つのポリペプチドに結合させるのに用いられる慣用法のいずれによっても結合させることができる。上記のＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な架橋試薬は、用いることができるものに含まれる。このような試薬と反応性の側鎖を有するアミノ酸は、ペプチドリンカー中に、例えばその末端に含まれていてよい。好ましくは、ペプチドリンカーによってＩＬ−１Ｒｒｐ１に結合したＡｃＰＬを含む融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって製造される。
【００３１】
本発明の一つの実施態様において、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を、免疫グロブリンに由来するポリペプチドによって結合させる。抗体由来ポリペプチドのいろいろな部分（Ｆｃドメインを含めた）に融合した異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の製造は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）およびＢｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）によって記載されている。一つの例として、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１のＣ末端に結合することができる。別のＦｃポリペプチドをＡｃＰＬのＣ末端に結合する。ジスルフィド結合は、それら二つのＦｃポリペプチド間に（例えば、鎖間ジスルフィド結合が、通常は抗体分子中に存在している、いわゆるヒンジ領域中に）形成して、ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ融合タンパク質に結合したＡｃＰＬ／Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロダイマーが生じる。好都合には、二つの異なった発現ベクター、すなわち、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃをコードしている一つおよび可溶性ＡｃＰＬ／Ｆｃをコードしているもう一つを用いて宿主細胞を同時トランスフェクションする。そのヘテロダイマーは、細胞内にまたは分泌中に形成すると考えられる。
【００３２】
本明細書中で用いられる“Ｆｃポリペプチド”という用語には、天然のおよび突然変異タンパク質の形、更には、ダイマー化を促進するヒンジ領域を含有して切断されたＦｃポリペプチドが含まれる。ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に由来する単鎖ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（登録商標）クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ラホヤ，ＣＡ）中にクローン化されて、ｈＩｇＧ１Ｆｃと称する組換え体ベクターを生じることができる。独特のＢｇＩＩＩ部位は、挿入されたＦｃをコードしている配列の５’末端付近に位置している。ＳｐｅＩ部位は、停止コドンのすぐ下流である。ｃＤＮＡによってコードされているＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域から天然のＣ末端まで伸長している、すなわち、完全長さ抗体Ｆｃ領域である。このＦｃポリペプチドの一つの適当な突然変異タンパク質は、本明細書中に援用される米国特許出願第０８／０９７，８２７号に記載されている。その突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に関して減少した親和性を示す。
【００３３】
ジスルフィド結合によって結合した２個のＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃポリペプチドまたは２個のＡｃＰＬ／Ｆｃポリペプチドを含むホモダイマーも、本明細書中に開示されたトランスフェクションされた宿主細胞のいくつかによって生産される。それらホモダイマーは、寸法の違いによって（例えば、ゲル電気泳動によって）互いにおよびヘテロダイマーから分離することができる。ヘテロダイマーも、逐次イムノアフィニティークロマトグラフィー（以下に記載される）によって精製することができる。
【００３４】
本発明のＩＬ−１８受容体複合体には、抗体軽鎖の定常領域（またはそのフラグメント）および抗体重鎖の定常領域（またはそのフラグメント）の融合タンパク質が含まれる。重鎖の定常領域には、軽鎖と結合するＣＨ1、ヒンジ領域、および重鎖分子のダイマー化に関与するＣＨ2およびＣＨ3ドメインを含めたその定常領域ドメインの４種類全部またはそれらドメインの一部分が含まれうる。前述の融合タンパク質の範囲内にあるのは、重鎖／軽鎖ダイマーをそれぞれの重鎖領域間のジスルフィド結合によって結合する二つのダイマーによって形成されるテトラマーがある。
【００３５】
免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドに関して、κファミリーおよびλファミリーのポリペプチドは、本発明の実施に適している。したがって、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含めた免疫グロブリンダイマーまたはテトラマーのいずれの種類も、本発明のヘテロマー分子の基準でありうる。
【００３６】
本発明により、機能性ヘテロマーポリペプチドは、通常は互いに結合する多数の重鎖および多数の軽鎖の分子間の結合によって製造することができる。例えば、ヒトＩｇＧ１の定常領域は、ヒト軽鎖κの定常領域（Ｃκと称される）と結合するであろう。ｈＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列は報告されている（Ｅｌｌｉｓｏｎ，ＪＷ，Ｂｅｒｓｏｎ，ＢＪおよびＨｏｏｄ，ＬＥ １９８２）。ヒト免疫グロブリンＣγ１遺伝子のヌクレオチド配列は報告されている（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１およびＷａｌｌｓ，ＭＡ，Ｈｓｉａｏ，ＫＣおよびＨａｒｒｉｓ，ＬＪ １９９３）。ヒト定常領域を含むＰＣＲ増幅免疫グロブリン可変ドメインの発現のためのベクターは開示されている（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２９２１）。ヒト軽鎖ｃκの配列も報告されている（Ｓｈｕｆｏｒｄ，Ｗ，Ｒａｆｆ，ＨＶ，Ｆｉｎｌｅｙ，ＪＷ，Ｅｓｓｅｌｓｔｙｎ，ＪおよびＨａｒｒｉｓ，ＬＪ．１９９１）。ＩｇＧオリゴマー化への軽鎖Ｖ領域重複の作用および in vivo 効力。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７２４およびＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ，Ｋｒａｆｔ，ＤおよびＶａｌｅｎｔａ，Ｒ（１９９６）。アレルギー患者からの組合せＩｇＥライブラリーの構築。主要チモシー草花粉アレルゲンに関して特異性を有するヒトＩｇＥ Ｆａｂの単離および特性決定。Ｐｈ１ ｐ５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１０９７２）。
【００３７】
重鎖および軽鎖の抗体領域を含むＩＬ−１８受容体実施態様は、式
Ｒ1−Ｌ1：Ｒ2−Ｌ2またはＲ2−Ｌ2：Ｒ1−Ｌ1または
Ｒ1−Ｌ2：Ｒ2−Ｌ1またはＲ2−Ｌ1：Ｒ1−Ｌ2
Ｒ1−Ｌ1：Ｒ2−Ｌ2／Ｒ2−Ｌ2：Ｒ1−Ｌ1または
Ｒ1−Ｌ2：Ｒ2−Ｌ1／Ｒ2−Ｌ1：Ｒ1−Ｌ2
（式中、Ｌ1は免疫グロブリン重鎖フラグメントであり、そのＮ末端は、少なくともＣH１領域によって伸長し；Ｌ2は免疫グロブリン軽鎖フラグメントであり；Ｒ1はＡｃＰＬまたはＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ2はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；：は重鎖および軽鎖の抗体領域間の結合であり、そして／は重鎖および重鎖の抗体領域間の結合である）
によって示される融合タンパク質である。ダイマーの場合、得られた融合ポリペプチドは、重鎖／軽鎖によって結合した二つの受容体サブユニットを含む。テトラマーの場合、その融合タンパク質は、４個の受容体サブユニットを含み、構造が抗体に似ていて、ＩＬ−１８結合部位を二価で示す。
【００３８】
前述の融合ポリペプチドを得るために、ヒトＩｇＧ１抗体に由来する抗体重鎖ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ（ＣＨ1−Ｈ−ＣＨ2−ＣＨ3）を、ｐＤＣ４０９発現ベクター中にクローン化して、ｈＩｇＧ１と称される組換え体ベクターを生じることができる。独特のＢｇＩＩＩ部位は、挿入された重鎖をコードしている配列の５’末端付近に位置している。ＮｏｔＩ部位は、停止コドンのすぐ下流である。ｃＤＮＡによってコードされている重鎖ポリペプチドは、ＣＨ1領域のＮ末端から天然のＣ末端まで伸長している。抗体軽鎖を得るためには、ヒトκ鎖定常領域に由来する単鎖ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡをｐＤＣ４０９発現ベクター中にクローン化して、ｈＩｇκと称される組換え体ベクターを生じることができる。この配列は、５’末端で独特のＢｇＩＩＩ部位までおよび３’末端で独特のＮｏｔＩ部位まで隣接している。このような抗体ポリペプチドを包含する本発明の実施態様には、抗体軽鎖（またはそのフラグメント）の定常領域の上流にＡｃＰＬ（またはそのフラグメント）を含む第一融合ポリペプチドおよび抗体重鎖（または重鎖フラグメント）の定常領域の上流にＩＬ−１Ｒｒｐ１を含む第二融合ポリペプチドが含まれ、そのＮ末端は、少なくともＣH１領域によって伸長している。ＡｃＰＬ軽鎖融合ポリペプチドとＩＬ−１Ｒｒｐ１−重鎖融合ポリペプチドとの間に１個または複数のジスルフィド結合が形成され、したがって、本発明の受容体が生じる。更に代わるものとして、ＩＬ−１Ｒｒｐ１−抗体軽鎖融合ポリペプチドを製造し、そしてＡｃＰＬ−抗体重鎖融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと結合させる（にジスルフィド結合させる）。前述のジスルフィド結合した分子の二つを結合する場合、追加のジスルフィド結合がそれら二つの抗体領域間に形成される。４個の融合ポリペプチドを含む得られた本発明の受容体は、構造が抗体に似ていて、ＩＬ−１８結合部位を二価で示す。
【００３９】
ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、細胞源から別々に精製された後、互いに結合させることができる。或いは、組換えＤＮＡ技術を用いて、本発明の受容体を製造することができる。ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、別々に製造され、そして引き続き共有結合させるために、形質転換された宿主細胞から精製することができる。本発明の一つの実施態様において、宿主細胞は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を別々のポリペプチドとしてコードする異種ＤＮＡを用いて形質転換／トランスフェクションされる。それら二つのポリペプチドは、二つの遺伝子それぞれの開始および停止コドンを含む同じ発現ベクターによってコードされていてよいし、または組換え体細胞は、二つの別々の発現ベクターを用いて同時トランスフェクションされてよい。もう一つの実施態様において、受容体は、組換え体細胞中において融合タンパク質として生産される。
【００４０】
本発明の一つの実施態様において、受容体タンパク質は、式
Ｒ1−Ｌ−Ｒ2またはＲ2−Ｌ−Ｒ1
（式中、Ｒ1はＡｃＰＬまたはＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ2はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；そしてＬはペプチドリンカーである）
を有する組換え体融合タンパク質である。
【００４１】
本発明の融合タンパク質には、ＡｃＰＬのＣ末端部分がリンカーに融合し、それがＩＬ−１Ｒｒｐ１のＮ末端部分に融合している構築物、およびＩＬ−１Ｒｒｐ１のＣ末端部分がリンカーに融合し、それがＡｃＰＬのＮ末端部分に融合している構築物も含まれる。ＡｃＰＬは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の所望の生物学的活性を保持している単一タンパク質を生じるような方法で、ＩＬ−１Ｒｒｐ１に共有結合している。融合タンパク質の成分を、それらが存在する順に挙げる（すなわち、Ｎ末端ポリペプチドを最初に挙げ、続いてリンカー、そして次に、Ｃ末端ポリペプチド）。
【００４２】
融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしている別々のＤＮＡフラグメントを適当な発現ベクター中に挿入するように構築される。ＡｃＰＬをコードしているＤＮＡフラグメントの３’末端は、ｍＲＮＡを単一の生物学的に活性な融合タンパク質に翻訳させる段階のそれら配列の読み枠を用いて、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡフラグメントの５’末端に（リンカーによって）連結される。或いは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡフラグメントの３’末端は、ｍＲＮＡを単一の生物学的に活性な融合タンパク質に翻訳させる段階のそれら配列の読み枠を用いて、ＡｃＰＬをコードしているＤＮＡフラグメントの５’末端に（リンカーによって）連結される。Ｎ末端シグナル配列をコードしているＤＮＡ配列は、Ｎ末端ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列上で保持されうるが、次の（Ｃ末端）ＤＮＡ配列まで通読するのを妨げると考えられる停止コドンは排除される。逆に、翻訳を終結させるのに必要な停止コドンは、次のＤＮＡ配列上で保持されている。シグナル配列をコードしているＤＮＡは、好ましくは、Ｃ末端ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列から除去される。
【００４３】
所望のポリペプチドリンカーをコードしているＤＮＡ配列は、任意の適当な慣用的な技法を用いて、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡ配列の間におよびそれらと同様の読み枠中に挿入することができる。例えば、リンカーをコードしていて且つ適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する化学合成オリゴヌクレオチドは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしている配列の間に連結することができる。
【００４４】
或いは、化学合成されたＤＮＡ配列は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のどちらかの３’末端（停止コドンを含まない）に相補的な配列、続いてリンカーをコードしている配列、その後に、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のもう一方の５’末端に相補的な配列を含有しうる。次に、オリゴヌクレオチドに支配される突然変異誘発を用いて、そのリンカーをコードしている配列を、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の直接融合を含有するベクター中に挿入する。
【００４５】
本発明は、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびペプチドリンカーを含む上記融合タンパク質をコードしている単離されたＤＮＡ配列を提供する。本明細書中に開示されたＡｃＰＬポリペプチドをコードしているＤＮＡも提供するが、それは、免疫グロブリン由来ポリペプチドに融合したＡｃＰＬポリペプチドをコードしているＤＮＡである。本発明によって包含されるＡｃＰＬをコードしているＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそれらの組合せが含まれる。
【００４６】
本明細書中で更に提供されるのは、単離されたＤＮＡ配列を含有する組換え体発現ベクターである。“発現ベクター”とは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡであって、しかも（１）遺伝子発現において調節の役割を有する１種類または複数の遺伝因子、例えば、以下の（２）に機能的に結合したプロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される所望のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列、および（３）適当な転写および翻訳の開始および終結配列の集合を含む転写単位を含むＤＮＡを発現させるのに用いられる複製可能なＤＮＡ構築物を意味する。プロモーターおよび他の調節因子の選択は、概して、予定の宿主細胞によって変化する。
【００４７】
それら発現ベクターにおいて、転写または翻訳を制御する調節因子は、概して、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来する。通常は、複製起点、および形質転換細胞の認識を容易にする選択遺伝子によって与えられる、宿主中で複製する能力は、追加的に包含されうる。レトロウイルスに由来するベクターも用いることができる。
【００４８】
ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連している場合、機能的に結合される。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードしているＤＮＡは、宿主細胞膜によって分泌される前駆物質としてポリペプチドが発現される場合、そのポリペプチドのＤＮＡに機能的に結合され；プロモーターは、コーディング配列の転写を制御している場合、当該コーディング配列に機能的に結合され；そしてリボソーム結合部位は、翻訳を可能にするようにコーディング配列が配置されている場合、それに機能的に結合される。概して、“機能的に結合される”とは、隣接している、分泌リーダーの場合、隣接しているおよび読み枠中を意味する。
【００４９】
形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用い、異種ＤＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクションされている細胞である。本発明の文脈中の異種ＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしている配列を含む。宿主細胞は、その異種ＤＮＡをクローン化するまたは増幅する目的で形質転換されてよいし、またはタンパク質の生産のために発現ベクターを用いて形質転換されてよい。適当な宿主細胞には、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物の細胞宿主と一緒に用いるのに適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，エルセビア，ニューヨーク，１９８５）に記載されており、その関連性のある開示は本明細書中に援用される。
【００５０】
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス属が含まれる。原核生物発現ベクターは、概して、１種類またはそれ以上の表現型選択性マーカー、例えば、抗生物質耐性を与えるまたは独立栄養要求を与えるタンパク質をコードしている遺伝子、および宿主内で確実に増幅させるための宿主によって認識される複製起点を含む。形質転換に適した原核生物宿主の例には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属内の様々な種が含まれるが、選択の問題として、他のものを用いてもよい。
【００５１】
細菌用途に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子を含む商業的に入手可能なプラスミドに由来する選択性マーカーおよび細菌複製起点を含むことができる。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ウプサラ，スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，マディソン，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。これらｐＢＲ３２２“主鎖”部分を、適当なプロモーターおよび発現される構造配列と結合する。大腸菌は、典型的には、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ ２：９５，１９７７）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、これが、形質転換された細胞を識別するための簡単な手段を提供する。
【００５２】
組換え体微生物発現ベクターにおいて一般的に用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；およびＥＰＡ ３６，７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，４１２頁，１９８２）が含まれる。特に有用な細菌発現系は、ファージλＰLプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱誘導性リプレッサーを用いる。λＰLプロモーターの誘導体を組み込む、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なプラスミドベクターには、大腸菌株ＪＭＢ９に内在するプラスミドｐＨＵＢ２（ＡＴＣＣ３７０９２）および大腸菌株ＲＲ１に内在するｐＰＬｃ２８（ＡＴＣＣ５３０８２）が含まれる。
【００５３】
組換え体受容体タンパク質は、酵母宿主において、好ましくは、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から発現させてもよい。ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の属の酵母を用いてもよい。酵母ベクターは、概して、２μｍ酵母プラスミドからの複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、受容体融合タンパクをコードしているＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、および選択遺伝子を含有するであろう。好ましくは、酵母ベクターは、例えば、酵母および大腸菌両方の形質転換を可能にする複製起点および選択性マーカー、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、およびトリプトファン中で成長する能力を欠いた酵母の突然変異菌株に関する選択マーカーを与えるビール酵母菌ｔｒｐ１遺伝子、および構造配列下流の転写を誘導する高発現された酵母遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう。次に、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの不存在下の成長によって形質転換を検出するのに有効な環境を与える。
【００５４】
酵母ベクター中の適当なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９０００，１９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適したベクターおよびプロモーターは、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら，ＥＰＡ７３，６５７号に更に記載されている。
【００５５】
好ましい酵母ベクターは、大腸菌中の選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子および複製起点）、およびグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターおよびα因子分泌リーダーを含めた酵母ＤＮＡ配列を用いて組み立てることができる。そのＡＤＨ２プロモーターは、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４，１９８２）によって記載されている。酵母α因子リーダーは、異種タンパクの分泌を支配し、発現されるプロモーターと構造遺伝子との間に挿入されうる。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，Ｃｅｌｌ ３０：９２２，１９８２；およびＢｉｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５３３０，１９８４を参照されたい。リーダー配列は、その３’末端付近に１ヶ所またはそれ以上の有用な制限部位を含有するように修飾されて、そのリーダー配列の異種遺伝子への融合を容易にすることができる。
【００５６】
適当な酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られている。典型的な技法は、Ｈｉｎｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９，（１９７８）に記載されており、０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地中でＴｒｐ+形質転換細胞について選択することである。
【００５７】
ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主菌株は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補足した１％酵母エキス、２％ペプトンおよび１％グルコースからなる富裕培地中において発現のために成長させることができる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地グルコースの消耗で起こる。粗製酵母上澄みを濾過によって集め、更に精製する前に４℃で保持する。
【００５８】
種々の哺乳動物または昆虫の細胞培養系を用いて、組換え体タンパクを発現させることができる。昆虫細胞中における異種タンパクの生産のためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によって概説されている。適当な哺乳動物宿主細胞系の例には、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒーラおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。更に別の適当な哺乳動物宿主細胞には、両方ともサル腎に由来するＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）およびＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１；Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１によって記載されている）が含まれる。もう一つのサル腎細胞系であるＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８）は、エプスタイン・バールウイルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードしている遺伝子およびＣＭＶ調節配列を含有するベクターを用いたＣＶ−１細胞系のトランスフェクションによって誘導された（ＭｃＭａｈａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１）。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ＥＢＶ複製起点を含有するＨＡＶ−ＥＯまたはｐＤＣ４０６のような発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。
【００５９】
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に結合した適当なプロモーターおよびエンハンサー、および他の５’または３’フランキング非転写配列などの非転写因子、および必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容体部位などの５’または３’非翻訳配列、および転写終結配列を含んでいてよい。脊椎動物細胞を形質転換する場合に用いられる発現ベクター中の転写および翻訳調節配列は、ウイルス源によって提供されうる。例えば、一般的に用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供するのに用いることができる。初期および後期プロモーターは、両方とも、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２７：１１３，１９７８）。より小さいまたはより大きいＳＶ４０フラグメントも、ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位の方へ伸長した、ウイルス複製起点に位置する約２５０ｂｐ配列が含まれるならば用いることができる。
【００６０】
典型的なベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）によって開示されたように構築することができる。Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞中での哺乳動物受容体ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な一つの系は、実質的には、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）によって記載のように構築することができる。レトロウイルスに由来するベクターを用いてもよい。
【００６１】
ＡｃＰＬおよび／またはＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパクの宿主細胞からの分泌が望まれる場合、発現ベクターは、シグナルまたはリーダーペプチドをコードしているＤＮＡを含んでいてよい。天然のシグナル配列の代わりに、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６号に記載のインターロイキン−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ４６０，８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドなどの異種シグナル配列を加えることができる。
【００６２】
本発明は、本発明の組換え体タンパク質を製造する方法であって、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養することを含む方法を提供する。次に、所望のタンパク質を培地または細胞抽出物から精製する。所望のタンパク質は、例えば、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはそのヘテロダイマー受容体であってよい。細胞不含翻訳系も、本発明の新規ＤＮＡに由来するＲＮＡを用いて所望のタンパク質を製造するのに用いることができると考えられる。
【００６３】
一つの実施例として、組換え体タンパク質を培地中に分泌する発現系からの上澄みを、最初に、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮することができる。濃縮工程後、その濃厚物を適当な精製マトリックスに適用することができる。例えば、適当なアフィニティーマトリックスは、ＩＬ−１８を含むことができる。ＩＬ−１８アフィニティーマトリックスは、臭化シアンで活性化されたセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＨｙｄｒａｚｉｄｅ Ａｆｆｉｇｅｌ（Ｂｉｏｒａｄ）に、製造者の推奨規格にしたがって、組換え体ヒトＩＬ−１８をカップリングさせることによって製造することができる。適当な支持体に結合した抗体を用いる逐次的免疫精製が好適である。ＡｃＰＬに特異的な抗体に結合したタンパク質を回収し、不溶性支持体上のＩＬ−１Ｒｒｐ１に特異的な抗体と接触させる。このように、両抗体と免疫反応性のタンパク質を識別し且つ単離することができる。
【００６４】
或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側基を有するマトリックスまたは基質を用いることができる。それらマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に一般的に用いられる他の種類でありうる。或いは、陽イオン交換工程を用いることができる。適当な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好適である。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地、例えば、メチル側基または他の脂肪族側基を有するシリカゲルを用いて１回またはそれ以上行って、融合タンパク質を更に精製することができる。
【００６５】
前述の精製工程のいくつかまたは全部をいろいろな組合せで行って、本質的に均一な組換え体タンパク質を提供することができる。組換え体細胞培養物は、タンパク質それぞれの由来の種において、例えば、いくつかの細胞種類の表面上で実際に見出されるような、通常はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬと結合しうるタンパク質を混入したものを含まない融合タンパク質の製造を可能にする。
【００６６】
前述の精製手順は、本発明の非組換え受容体を精製するのにも用いることができるものの中にある。ホモダイマー（ＩＬ−１Ｒｒｐ１−リンカー−ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ−リンカー−ＡｃＰＬ）を生じることができる結合手順を用いる場合、このようなホモダイマーからヘテロダイマーを分離する精製手順を用いる。このような手順の一例は、上で考察されたような逐次的免疫精製である。一つの実施態様において、ＡｃＰＬ（組換え体または非組換え体）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって他の（混入した）タンパク質に該当するバンドが検出されないように精製する。
【００６７】
細菌培養物中で生産される組換え体タンパク質は、通常、最初に細胞ペレットからの抽出後、１回またはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーの工程によって単離される。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製工程に用いることができる。組換え体融合タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結・融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含めたいずれの慣用法によっても破壊することができる。
【００６８】
融合タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製を極めて簡単にする。大規模発酵から得られる分泌された組換え体タンパク質は、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）によって開示されたのと類似した方法により、分離用ＨＰＬＣカラム上での組換え体タンパク質の精製に２回の逐次的逆相ＨＰＬＣ工程を行って精製することができる。
【００６９】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬのＤＮＡ配列またはアミノ酸配列は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５および配列番号：７に示されるものとは異なることがありうる。既知の遺伝暗号縮重のために、同様のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列には、かなりの変異がありうる。更に、中程度ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下において、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７の天然のＤＮＡ配列にハイブリッド形成しうるＤＮＡ配列であって、生物学的に活性なＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配列も、本発明の文脈中において、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているまたはＡｃＰＬをコードしているＤＮＡ配列であると考えられる。このようなハイブリッド形成性配列には、以下に記載のもの、および他の哺乳動物種に由来するＤＮＡなどの変異型配列が含まれるが、それらに制限されるわけではない。
【００７０】
中程度ストリンジェント条件には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１巻，１．１０１−１０４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の条件が含まれる。Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって定義される中程度ストリンジェンシーの条件には、５Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予洗溶液の使用および約５５℃、５Ｘ ＳＳＣ、一晩中のハイブリダイゼーション条件が含まれる。高ストリンジェント条件には、高温でのハイブリダイゼーションおよび洗浄が含まれる。当業者は、温度および洗浄溶液塩類濃度を、プローブの長さなどの因子によって必要に応じて調整してよいことを理解するであろうが、それら条件には、６８℃でのハイブリダイゼーション後、０．１Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において６３−６８℃での洗浄が含まれる。もう一つの実施態様において、本発明は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含むヘテロダイマー受容体であって、そのＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１が、中程度または高ストリンジェント条件下において、配列番号：１または配列番号：５、または配列番号：３または配列番号：７それぞれのＤＮＡにハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされているヘテロダイマー受容体を提供する。
【００７１】
更に、ＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードするヌクレオチド配列におけるいくつかの突然変異は、最終タンパク質産物中において発現されないであろう。例えば、ヌクレオチド置換は、発現を促進して、主に、転写されるｍＲＮＡ中の二次構造ループを避けるように行うことができる（ＥＰ７５，４４４Ａ号を参照されたい）。ヌクレオチド配列の他の変更は、選択された宿主によって一層容易に翻訳されるコドン、例えば、大腸菌発現に周知の大腸菌選択コドンを提供するように行うことができる。
【００７２】
天然のＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬのアミノ酸配列は、１個またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入することによって変更されて、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬ変異体を生じることができる。天然のＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬタンパク質の所望の生物学的活性を有する変異体は、本発明の受容体中で用いることができる。変異タンパク質の生物学的活性を分析することができる検定を、以下の実施例に記載する。生物学的に活性なＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、ＩＬ−１８を結合することができる。本明細書中に開示されたＡｃＰＬポリペプチドの所望の生物学的活性は、ＡｃＰＬがＩＬ−１Ｒｒｐ１に結合した場合のＩＬ−１８の結合を、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独へのＩＬ−１８結合レベルと比較して増大させる能力である。
【００７３】
天然のアミノ酸配列への変更は、多数の既知の技法のいずれによっても行うことができる。例えば、突然変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位に隣接した、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。連結反応後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する類似体をコードしている。
【００７４】
或いは、オリゴヌクレオチドに支配される部位特異的突然変異誘発手順を用いて、必要な置換、欠失または挿入によって変更された特定のコドンを有する変更された遺伝子を提供することができる。上記の変更を行う典型的な方法は、本明細書中に援用されるＷａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｇ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；米国特許第４，５１８，５８４号および米国特許第４，７３７，４６２号によって開示されている。
【００７５】
ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の生物学的等価変異体は、例えば、アミノ酸残基のいろいろな置換を行うこと、または生物学的活性に必要でない末端または内部のアミノ酸を欠失することによって構築することができる。本発明の一つの実施態様において、変異アミノ酸配列は、天然の配列と少なくとも８０％同一、好ましくは、少なくとも９０％同一である。類似性％は、例えば、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰ計算機プログラム６．０バージョンを用いて配列情報を比較することによって決定することができる。そのＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）によって変更されたような、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の整列法を用いる。簡単にいうと、そのＧＡＰプログラムは、整列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の類似している数を、二つの配列の短い方の記号の全数で割ったものとして類似性を定義している。ＧＡＰプログラムの好ましい暗黙値パラメーターには、（１）ヌクレオチドについてのユナリー比較マトリックス（同一性に１および非同一性に０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３−３５８頁，１９７９によって記載のような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Reｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）それぞれのギャップに３．０のペナルティーおよびそれぞれのギャップの記号それぞれに追加の０．１０ペナルティー；および（３）末端のギャップにペナルティー無しが含まれる。
【００７６】
概して、置換は保存的に行われるはずであり、すなわち、最も好ましい代わりのアミノ酸は、置換される残基に似た物理化学的特性を有するものである。保存的置換の例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａを互いにのような、一つの脂肪族残基を別のものへの置換、またはＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間のような一つの極性残基を別のものへの置換が含まれる。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性を有する領域全体の置換は周知である。
【００７７】
システイン残基は、再生の際、不必要なまたは不正確な分子内ジスルフィド橋の形成を妨げるように欠失することができるしまたは他のアミノ酸と置き換えることができる。親水性アミノ酸を、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの膜貫通領域および／または細胞内ドメイン中の疎水性アミノ酸の代わりに置き換えて、タンパクの水への溶解性を増大させることができる。
【００７８】
隣接した二塩基アミノ酸残基は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系において発現を増大させるように修飾することができる。ＥＰ２１２，９１４号には、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を失活させる部位特異的突然変異誘発の使用が開示されている。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ａｒｇの対を変更するように残基を欠失、付加または置換することによって失活して、これら隣接した塩基性残基を生じさせない。これらアミノ酸対は、ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を構成し、配列番号：２のＡｃＰＬタンパク質の残基９８−９９、３２３−３３３、３３３−３３４、４７２−４７３および４７５−４７６で見出される。これらＫＥＸ２部位は、配列番号：４のＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質の１１３−１１４、３１４−３１５、３６４−３６５、４３７−４３８および４６５−４６６位で見出される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断への感受性がかなり小さく、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、不活性ＫＥＸ２部位への保存的且つ好ましいアプローチである。
【００７９】
本発明は、関連した天然パターングリコシル化を伴うまたは伴わないタンパク質も包含する。大腸菌などの細菌中における融合タンパク質をコードしているＤＮＡの発現は、非グリコシル化分子を提供する。失活したＮ−グリコシル化部位を有する機能性突然変異類似体は、オリゴヌクレオチド合成および連結によってまたは部位特異的突然変異誘発技術によって製造することができる。これら類似のタンパク質は、酵母発現系を用いて、均一な還元炭水化物の形で充分な収率で製造することができる。真核生物タンパク質中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ａ1−Ｚ（但し、Ａ１はＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。この配列において、アスパラギンは、炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を与える。
【００８０】
配列番号：２のＡｃＰＬアミノ酸配列は、アミノ酸２１−２３、１１９−１２１、１５２−２５４および３４５−３４７のところに、全て細胞外ドメイン中で見出される４個のこのようなＮ−グリコシル化部位を含有する。ＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメインは、配列番号：４の９１−９３、１０２−１０４、１５０−１５３、１６８−１７０、１９７−１９９、２０３−２０５、２３６−２３８および２９７−２９９位にＮ−グリコシル化部位を含む。このような部位は、別のアミノ酸をＡｓｎの代わりにまたは残基Ｚの代わりに置換する、ＡｓｎまたはＺを欠失する、または非Ｚアミノ酸をＡ1およびＺ間にまたはＡｓｎ以外のアミノ酸をＡｓｎおよびＡ1間に挿入することによって除去することができる。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を失活させる既知の手順には、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ２７６，８４６号に記載されたものが含まれる。
【００８１】
本発明の受容体タンパク質の変異体には、生物学的活性を保持する一次タンパク質の種々の構造体も含まれる。イオン化しうるアミノ基およびカルボキシル基の存在のために、例えば、受容体タンパク質は、酸性または塩基性の塩の形であってよいし、または中性の形であってよい。個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾することもできる。
【００８２】
一次アミノ酸構造も、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基等のような他の化学残基と一緒に共有結合または凝集結合を形成することによって修飾されうる。共有結合誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖にまたはＮ−若しくはＣ末端に結合することによって製造される。本発明の範囲内の受容体タンパク質の他の誘導体には、Ｎ−またはＣ末端融合のように組換え体培養物中での合成などによる他のタンパク質またはポリペプチドと受容体タンパク質の共有結合または凝集結合が含まれる。例えば、結合したポリペプチドは、タンパク質の転移を細胞膜または壁の内側または外側の合成部位から機能部位まで同時翻訳によってまたは翻訳後に支配するタンパク質のＮ末端領域にあるシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列であってよい（例えば、酵母α−因子リーダー）。
【００８３】
ペプチドは、所望のタンパク質に（例えば、組換えＤＮＡ技術によって）融合して、精製または識別を容易にすることができる。例には、ポリ−ＨｉｓまたはＦｌａｇ（登録商標）ペプチド（Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８および米国特許第５，０１１，９１２号）が含まれる。そのＦｌａｇ（登録商標）ペプチドは、極めて抗原性であり、特異的単クローン性抗体によって可逆的に結合したエピトープを与え、発現された組換え体タンパク質の迅速な検定および容易な精製を可能にする。ある与えられたタンパク質のＮ−またはＣ末端にＦｌａｇ（登録商標）オクタペプチドを融合するのに有用な発現系は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ニューヘブン，ＣＴから入手可能であり、それはそのオクタペプチドを結合する単クローン性抗体である。
【００８４】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの天然の存在する変異体を含むダイマーＩＬ−１８受容体複合体も、本発明によって包含される。このような変異体の例は、別のｍＲＮＡスプライシング現象によってまたはＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質のタンパク質分解切断によって生じるタンパク質であり、この場合、所望の生物学的活性は保持される。ｍＲＮＡの別のスプライシングは、天然に存在する可溶性の形のタンパク質のような、切断されているが生物学的に活性なＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質を生じることができる。タンパク質分解に起因する変異には、例えば、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質からの１個またはそれ以上の末端アミノ酸（概して、１−５個の末端アミノ酸）のタンパク質分解除去による、異なった種類の宿主細胞中の発現におけるＮ−またはＣ末端の相違が含まれる。
【００８５】
本発明は、本発明の受容体タンパク質を生理学的に許容しうる担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物も提供する。このような担体および希釈剤は、用いられる用量および濃度において受容者に無毒性であろう。このような組成物は、例えば、緩衝化溶液中にその受容体を含んでいてよく、それに、アスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストランを含めた炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、グルタチオン、および他の安定化剤および賦形剤を加えることができる。本発明の受容体は、静脈内注射、局所投与、連続注入、植込錠からの徐放のような、指標に適するように任意の適当な方法によって投与することができる。
【００８６】
本発明のヘテロダイマー受容体は、ＩＬ−１８結合試薬として有用である。この受容体は、好ましくは、可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１を含み、in vitro および in vivo 両方で使用される。それら受容体は、in vitro 検定において、例えば、細胞上のこの受容体へのＩＬ−１８の結合によって開始される生物学的シグナルの伝達機序の研究で用いることができる。このような受容体は、いろいろな in vitro 検定または in vivo 操作においてＩＬ−１８の生物学的活性を阻害するのにも用いることができると考えられる。本発明の一つの実施態様においては、本発明の受容体を投与してＩＬ−１８を結合させ、それによって、内因性細胞表面受容体へのＩＬ−１８の結合を阻害する。したがって、このようなＩＬ−１８の細胞への結合によって媒介される生物学的活性も阻害される。
【００８７】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独では、比較的低い親和性だけでＩＬ−１８を結合する（Ｔｏｒｉｇｏｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５７３，１９９７）。本発明の受容体は、例えば、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡを用いて同時トランスフェクションされた細胞によって生産され、高親和性でＩＬ−１８を結合する。このような本発明の受容体は、ＩＬ−１８に媒介される活性の阻害が望まれる場合に用いることができる。更に、in vitro 検定における本発明の受容体の使用は、その検定結果がＩＬ−１８の結合に起因することを確認させる利点を与える。
【００８８】
本発明の一つの実施態様においては、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含むヘテロダイマー受容体を in vivo 投与して、ＩＬ−１８の生物学的活性を阻害する。ＩＬ−１８は、ＮＦκＢ活性を媒介することが知られており、Ｔｈ１細胞の成長および分化の刺激薬として作用し、そしてＴｈ１細胞からのγインターフェロン生産の強力な誘導物質である。ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞致死活性も増大させ、敗血症性ショック、肝臓破壊および糖尿病に関与している。ＩＬ−１８のこれらまたは他の生物学的作用が望ましくない場合、本発明の受容体を投与してＩＬ−１８を結合し且つＩＬ−１８活性の作用を改善することができる。
【００８９】
本発明の受容体は、ＩＬ−１８によって媒介される障害を治療する治療的有効量で患者に投与することができる。障害は、ＩＬ−１８がその障害を（直接的にまたは間接的に）引き起こすまたは悪化させる場合、ＩＬ−１８によって媒介されるといわれる。可溶性受容体タンパク質は、ＩＬ−１８に競合的に結合させ、それによって、内因性細胞表面受容体へのＩＬ−１８の結合を阻害するのに用いることができる。
【００９０】
ＩＬ−１ＲｒｐＩに結合したＡｃＰＬを含むヘテロダイマー受容体も、ＩＬ−１８タンパク質の生物学的活性に関する検定で用いられ、その生物学的活性は、受容体への結合親和性によって測定される。詳しく説明すると、その受容体は、結合検定において、ＩＬ−１８フラグメント、変異体または突然変異タンパク質の生物学的活性を測定するのに用いることができる。その受容体は、ＩＬ−１８タンパク質の修飾（例えば、化学的修飾、突然変異等）後に、ＩＬ−１８の生物学的活性が保持されているかどうか確認するのに有用である。修飾されたＩＬ−１８タンパク質の受容体への結合親和性を未修飾ＩＬ−１８タンパク質の場合と比較して、生物学的活性へのその修飾の何らかの悪影響を検出する。したがって、その修飾タンパク質を研究実験または検定で用いる前に、生物学的活性を評価することができる。
【００９１】
それらヘテロダイマー受容体は、例えば、異なった条件下でのＩＬ−１８タンパク質の有効期間および安定性を監視する“品質保証”実験の実施者が用いることができる試薬としても使用される。それら受容体は、異なった温度で異なった期間貯蔵された、または例えば、異なった種類の組換え体発現系で製造されたＩＬ−１８タンパク質の生物学的活性（受容体の結合親和性に関して）を確認するのに用いることができる。
【００９２】
次の実施例は、本発明のいくつかの実施態様を詳しく説明するために与えられており、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
実施例
実施例１
in vitro 沈降実験
ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはそれら二つのポリペプチドの組合せがＩＬ−１８を結合するかどうか確認するために、いくつかのＦｃ融合タンパク質を製造し、次のように試験した。可溶性ＡｃＰＬ／Ｆｃ融合タンパク質をコードしている発現ベクターは、抗体に由来するＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合したＡｃＰＬの切断された細胞外ドメインを含み、それを次のように構築した。ベクターｐＤＣ３０４中にＡｃＰＬ ＤＮＡを含む組換え体発現ベクターを、所望のインフレーム制限部位を５’および３’末端に含有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。得られたフラグメントは、ＡｃＰＬ ＤＮＡの５’末端を含み、配列番号：１のヌクレオチド１５５１で終結し、導入されたＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位を５’および３’末端それぞれに含み、それを慣用的な技法によって単離した。
【００９３】
ｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃと称される組換え体ベクターは、ＦｃポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ（−Ｈ−ＣＨ2−ＣＨ3のみ）を含む。ベクターｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃを、ベクターのポリリンカー領域内で切断する制限酵素ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩを用いて、ＦｃポリペプチドをコードしているｃＤＮＡの上流で消化した。
【００９４】
上で単離されたＡｃＰＬをコードしているＤＮＡを、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃ中に連結して、ＦｃポリペプチドＤＮＡがＡｃＰＬ ＤＮＡの３’末端に融合するようにした。得られた発現ベクターは、配列番号：２のＡｃＰＬ配列のアミノ酸１−３６５の後にｈＩｇＧ１ＦｃのＨ−ＣＨ2−ＣＨ3領域を含む融合タンパク質をコードしていた。
【００９５】
可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ融合タンパク質をコードしている発現ベクターを次のように構築した。ＩＬ−１Ｒｒｐ１ ＤＮＡを含む組換え体ベクターを、所望の制限部位を含有する遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。得られたフラグメントは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の５’末端を含み、それを慣用的な技法によって単離した。Ａｓｐ７１８およびＢｇｌＩＩを用いて消化されたこのＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントを、上記のｈＩｇＧ１Ｆｃフラグメントと結合し、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。得られた消化物フラグメントを、Ａｓｐ７１８およびＮｏｔＩを用いて消化されたｐＤＣ３０４に連結した。組換え体ベクターによってコードされる得られたＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号：４の（Ｎ末端からＣ末端への）アミノ酸１−３２９の後にｈＩｇＧ１／ＦｃのＨ−ＣＨ2−ＣＨ3領域を含む。
【００９６】
一つの試料セットにおいて、ＣＯＳ−７細胞を、ｐＤＣ２０６対照またはｐＤＣ２０６−ＩＬ−１８ベクターを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞のもう一つの試料セットにおいて、上記のＦｃ融合ベクターをトランスフェクションした。全試料セットは次の通りであった。
【００９７】
試料 細胞のトランスフェクションに用いたベクターにコードされるもの
Ａ 空ｐＤＣ２０６発現ベクター（対照）
Ｂ ｐＤＣ２０６ｈＩＬ−１８
１ ｐＤＣ４０９（対照）
２ ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ
３ ＡｃＰＬ／Ｆｃ
４ ＡｃＰＬ／ＦｃおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ
トランスフェクションから２日後、試料ＡおよびＢをｃｙｓ／ｍｅｔ不含培地中で１時間飢餓状態にした後、［35Ｓ−ｃｙｓ］［35Ｓ−ｍｅｔ］含有培地を用いて６時間標識した。上澄みを取り出し、遠心分離を行い、プロテアーゼインヒビターの存在下で０．４Ｍ ＮａＣｌ／１．０％トリトンＸ−１００に調整した。試料１−４のＦｃ融合タンパク質を用いてトランスフェクションされた細胞からの上澄みを、トランスフェクションから２日後に取り出し、遠心分離した。それぞれのＦｃ融合上澄みを、（ａ）ベクターでトランスフェクションされた；かまたは（ｂ）ＩＬ−１８でトランスフェクションされた35Ｓ標識上澄みと混合した。精製ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ受容体タンパク質を、対照としてのもう一つの放射性標識された上澄み部分に加えた。プロテインＧ−セファロースを各実験試料に加え、４℃で一晩沈降させた。次に、それら試料を、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＳＤＳ、１．０％ＮＰ−４０緩衝液中で充分に洗浄し、４−２０％トリス−グリシンゲル中の電気泳動によって分離した。そのゲルを固定し、増幅させ、乾燥させ、フィルムに露出させた。タンパク質の全レベルを評価し、未標識Ｆｃ融合タンパク質を考慮するために、それぞれの沈降の一部分を、別の４−２０％トリス−グリシンゲル上で分析し且つ銀染色した。
【００９８】
細胞試料１−４の上澄みは、対照上澄み（試料Ａ）からの１０−３０Ｋｄ範囲内にタンパク質をほとんど沈降させなかった。ＩＬ−１８（試料Ｂ）は、細胞試料２（ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ）からの上澄みによって沈降したが、細胞試料１（対照）または細胞試料３（ＡｃＰＬ／Ｆｃ）からの上澄みによって沈降しなかった。有意に多量のＩＬ−１８は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１／ＦｃおよびＡｃＰＬ／Ｆｃの同時トランスフェクションから得られた試料４全ての上澄みによって沈降した。
【００９９】
したがって、ＩＬ−１Ｒｒｐ１はＩＬ−１８を結合できるが；ＡｃＰＬはＩＬ−１８を結合できないし；そして同時発現されたＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬはＩＬ−１８を結合することができ、それら同時発現されたタンパク質は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独より高レベルのＩＬ−１８結合を示す。銀染色されたゲルは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独でトランスフェクションされた上澄みと比較して、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬでトランスフェクションされた上澄み中のＩＬ−１Ｒｒｐ１が多くないことを示している。これは、これら試料中で発現されるＩＬ−１Ｒｒｐ１がより多いという可能性を排除する。それら結果は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１／ＡｃＰＬダイマーのＩＬ−１８結合親和性が、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独の親和性より大きいことを示している。
【０１００】
実施例２
ＮＦκＢ活性の誘導
ＩＬ−１８シグナリングにおけるＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの役割を確認するために、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１、およびＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの組合せを、ＣＯＳ細胞およびＳ４９．１細胞中で過発現させ、ＩＬ−１８刺激のＮＦκＢ活性への作用を評価した。
【０１０１】
ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ／デキストラン法によって１２ウェルフォーマットでトランスフェクションした。各ウェルを、合計２００ｎｇの１種類または複数の適当な発現ベクター、およびルシフェラーゼ発現を媒介する３ヶ所のＮＦκＢ部位を含有する８００ｎｇのＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いてトランスフェクションした。約１０7個のＳ４９．１細胞を、０．７ｍＬ中において４０μｇのＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミドおよび合計２００ｎｇの１種類または複数の適当な発現ベクターを用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクションした。エレクトロポレーションは、９６０μＦおよび３２０Ｖで行った。
【０１０２】
それら細胞を２日間インキュベート後、４０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入された）を用いて４時間刺激した。細胞を洗浄し、溶解させ、ルシフェラーゼ活性についてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から購入された）を製造者の指示にしたがって用いて検定した。
【０１０３】
対照ベクター単独、ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１だけをコードしているベクター、またはｍＡｃＰＬだけをコードしているベクターを用いてトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞またはＳ４９．１細胞は、ｍＩＬ−１８刺激に応答しなかった。更に、ｍＡｃＰＬでトランスフェクションされたＳ４９．１細胞は、そのトランスフェクションを、ｍＩＬ−１Ｒ Ｉ型またはｍＩＬ−１ＲＡｃＰをコードしている発現ベクターと組み合わせた場合、ｍＩＬ−１８刺激に応答しなかった。しかしながら、ｍＡｃＰＬおよびｍＩＬ−１Ｒｒｐ１で同時トランスフェクションされ且つｍＩＬ−１８で刺激された細胞は、ＮＦκＢ ＤＮＡ結合活性の増加を示し、それは、ＣＯＳ細胞で１０倍およびＳ４９．１細胞で３００倍であった。hＩＬ−１Ｒｒｐ１でトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞は、ｈＩＬ−１８刺激への応答を示さなかったが、ｈＡｃＰＬ単独でトランスフェクションされ且つｈＩＬ−１８で刺激されたＣＯＳ７細胞は、ＮＦκＢ活性の８倍増加を示した。これは、ＣＯＳ７細胞に内因的なサルＩＬ−１Ｒｒｐ１とｈＡｃＰＬの結合に起因している。ｈＡｃＰＬを含むhＩＬ−１Ｒｒｐ１の過発現は、ｈＩＬ−１８に応答したＮＦκＢ活性の刺激を、ｈＡｃＰＬだけを過発現する細胞中で見られる場合を越えて増大させることはなかった。ＮＦκＢ活性のこの劇的な増大は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１がＩＬ−１８受容体のサブユニットであり、ＩＬ−１８刺激に応答したＮＦκＢシグナリングを誘導するように協同する。
【０１０４】
実施例３
ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１抗体重鎖および軽鎖融合タンパク質の製造
次に、抗体重鎖および抗体軽鎖ポリペプチドに融合したＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含む融合タンパク質の製造を記載する。
【０１０５】
最初に、上流にリンカー領域を含むヒトＩｇＧ１の定常領域全体をコードしている発現ベクターを構築する。このような発現ベクターは、融合タンパク質をコードしているプラスミドの生成を容易にする。ＰＣＲ技術を用い、上流のＢｇｌＩＩ部位および下流のＮｏｔＩ部位を含有するプライマーを用いて、上述のＩｇＧ１定常領域を増幅させる。得られたＰＣＲ生産フラグメントを消化し、精製し、そしてＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化されているｐＤＣ４１２に連結させる。次に、ｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１発現ベクターをＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで消化する。
【０１０６】
次に、リンカー領域の前にＩｇκ定常ドメイン、そして続いてリンカー領域およびポリ−Ｈｉｓドメインを含有する発現ベクターを製造する。そのポリ−Ｈｉｓドメインは、好都合に、タンパク質精製処理を助ける。ＰＣＲ技術を用い、ＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを含有するプライマーを用いて、定常領域を増幅させる。得られたＰＣＲ生産フラグメントを消化し、精製し、そしてｐＤＣ４１２に連結させる。目的の可溶性受容体は、独特のＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位を用いることによって上流にクローン化することができる。
【０１０７】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｃκ発現ベクターを製造するために、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメインを、ＳａｌＩ（５’）およびＢｇｌＩＩ（３’）制限部位を含有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させる。この精製され且つ消化されたＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＤＣ４１２−Ｉｇκ発現ベクターに連結して、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の可溶性部分をＣκの定常領域に結合する融合タンパク質をコードするインフレーム構築物を生成する。
【０１０８】
ＩＬ−１Ｒｒｐ１−ｈＩｇＧ１発現ベクターを製造するために、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントをＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｃκから取り出し、同じ制限酵素で消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１に連結する。両方のベクターが同じ読み枠中にＢｇｌＩＩ部位を有するので、これは、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびｈＩｇＧ１間の融合を容易に生じさせるであろう。
【０１０９】
ＡｃＰＬ−Ｃκ発現ベクターを製造するために、ＡｃＰＬの細胞外ドメインを、ＳａｌＩ（５’）およびＢｇｌＩＩ（３’）制限部位を含有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させる。次に、この精製され且つ消化されたＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＤＣ４１２−Ｃκに連結して、ＡｃＰＬの可溶性部分をＣκの定常領域に結合するインフレーム融合タンパク質を生成する。
【０１１０】
ＡｃＰＬ−ｈＩｇＧ１発現ベクターを製造するために、可溶性ＡｃＰＬをコードしているＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントをＡｃＰＬ−ｃκから取り出し、同じ制限酵素で消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１に連結する。両方のベクターが同じ読み枠中にＢｇｌＩＩ部位を含有するので、これは、可溶性ＡｃＰＬおよびｈＩｇＧ１間の融合を容易に生じさせるであろう。
【０１１１】
ＣＯＳ−７細胞を、上記の融合ベクターを用いてトランスフェクションする。実施例１に記載のように細胞を培養し、融合タンパク質を集める。
実施例４
ＩＬ−１８に誘導されたＮＦκＢ活性の阻害
ＣＯＳ７細胞を、１２ウェルプレート中において、ウェル当たり各１０ｎｇのｍＩＬ−１Ｒｒｐ１およびｍＡｃＰＬ発現ベクターおよび５０ｎｇの３ＸＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入された）を用いて増加する量のいろいろなレポーターＦｃ融合タンパク質の存在下で刺激した。ｍＩＬ−１８は、それらタンパク質と一緒に室温で２０分間プレインキュベート後、細胞に加えられた。Ｆｃタンパク質の量は、１ｕｇ／ｍｌ−５０ｕｇ／ｍｌまで滴定された。細胞を４時間刺激後、溶解させ、そしてＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてルシフェラーゼ活性を評価した。
【０１１２】
ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ、ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−ＦｌａｇｐｏｌｙＨｉｓまたはｍＡｃＰＬ−Ｆｃを用いたＩＬ−１８のプレインキュベーションは、試験されたいずれの濃度においても、ＮＦκＢの誘導にほとんど影響しなかった。対照的に、異種ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ＋ｍＡｃＰＬ−Ｆｃタンパク質混合物（ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃのホモダイマー、ｍＡｃＰＬ−ＦｃのホモダイマーおよびヘテロダイマーｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ／ｍＡｃＰＬ−Ｆｃ分子から成る）を用いたＩＬ−１８のインキュベーションは、ＮＦκＢ誘導の用量依存性阻害を引き起こした。誘導されない細胞は、３Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを示し、いずれの受容体-Fｃタンパク質も不存在下でｍＩＬ−１８を用いて刺激された細胞は、２５Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを示した。ＮＦκＢ誘導の最大阻害は、２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌのｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ＋ｍＡｃＰＬ−Ｆｃタンパク質混合物について認められ、それは６Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを生じ、ＩＬ−１８活性の８７％阻害を示した。
【配列表】
Claims (16)
- 少なくとも１個のＡｃＰＬポリペプチドに結合した少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドを含むポリペプチドであって、該ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドが、
（ａ）配列番号：３に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域および配列番号：７に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）（ａ）のＤＮＡにハイブリッド形成しうるＤＮＡに相補的なＤＮＡ、ここでハイブリッド形成条件は高ストリンジェント条件である；および
（ｃ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび配列番号：８に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡから成る群より選択されるＤＮＡ；
から成る群より選択されるＤＮＡによってコードされていて；
そしてここにおいて、該ＡｃＰＬポリペプチドが、
（ａ’）配列番号：１に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域および配列番号：５に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
（ｂ’）（ａ’）のＤＮＡにハイブリッド形成しうるＤＮＡに相補的なＤＮＡ、ここでハイブリッド形成条件は高ストリンジェント条件である；および
（ｃ’）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡから成る群より選択されるＤＮＡ；
から成る群より選択されるＤＮＡによってコードされる生物学的に活性なポリペプチドであり、
そして、当該少なくとも１個のＡｃＰＬポリペプチドに結合した少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドを含むポリペプチドは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチド単独の場合よりもＩＬ−１８に対する高い親和性を有する、
上記ポリペプチド。 - 少なくとも１個の第二ポリペプチドに結合した少なくとも１個の第一ポリペプチドを含むポリペプチドであって、該第一ポリペプチドが、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸ｙ−３２９を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ、ここでｙは１または２０である整数を表す；
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸ｙ’−３２２を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ、ここでｙ’は１または１９である整数を表す；および、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリッド形成しうるＤＮＡ相補的なＤＮＡ、ここでハイブリッド形成条件は高ストリンジェント条件である；
から成る群より選択されるＤＮＡによってコードされ、
そしてここにおいて、該第二ポリペプチドが、
（ａ’）配列番号：２のアミノ酸ｘ−３５６を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ、ここでｘは１および１５の間およびそれらを含む整数を表す；
（ｂ’）配列番号：６のアミノ酸ｘ’−３５６を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ、ここでｘ’は１および１５の間およびそれらを含む整数を表す；
（ｃ’）（ａ’）または（ｂ’）のＤＮＡにハイブリッド形成しうるＤＮＡ相補的なＤＮＡ、ここでハイブリッド形成条件は高ストリンジェント条件である；
から成る群より選択されるＤＮＡによってコードされ、
そして、当該少なくとも１個の第二ポリペプチドに結合した少なくとも１個の第一ポリペプチドを含むポリペプチドは、第一ポリペプチド単独の場合よりもＩＬ−１８に対する高い親和性を有する、
前記ポリペプチド。 - 少なくとも１個のＡｃＰＬポリペプチドに結合した少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドを含むポリペプチドであって、該ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドが配列番号：４のポリペプチドを含み、そして該ＡｃＰＬポリペプチドが配列番号：２のポリペプチドを含む、前記ポリペプチド。
- ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドおよびＡｃＰＬポリペプチドがペプチドリンカーを介して結合した、請求項３に記載のポリペプチド。
- 少なくとも１個のＡｃＰＬポリペプチドに結合した少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドを含むポリペプチドであって、該ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドが配列番号：４のアミノ酸ｙ−３２９、ここでｙは１または２０である整数を表す；および配列番号：４；を有するポリペプチドを含み、そして該ＡｃＰＬポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸ｘ−３５６、ここでｘは１および１５の間およびそれらを含む整数を表す、を有するポリペプチドを含む、前記ポリペプチド。
- 少なくとも１個のＡｃＰＬポリペプチドに結合した少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドを含むポリペプチドであって、該ＡｃＰＬポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸ｘ−３５６、ここでｘは１および１５の間およびそれらを含む整数を表す、を有するポリペプチドと少なくとも９０％同一のポリペプチドを含み；そして該ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸ｙ−３２９、ここでｙは１または２０である整数を表す、を有するポリペプチドと少なくとも９０％同一のポリペプチドを含み；そしてここにおいて、同一性％はＧＡＰプログラムを用いて決定される、
そして、当該少なくとも１個のＡｃＰＬポリペプチドに結合した少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドを含むポリペプチドは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチド単独の場合よりもＩＬ−１８に対する高い親和性を有する、
前記ポリペプチド。 - Ｒ１−Ｌ１：Ｒ２−Ｌ２、Ｒ２−Ｌ２：Ｒ１−Ｌ１、Ｒ１−Ｌ２：Ｒ２−Ｌ１、Ｒ２−Ｌ１：Ｒ１−Ｌ２、Ｒ１−Ｌ１：Ｒ２−Ｌ２／Ｒ２−Ｌ２：Ｒ１−Ｌ１およびＲ１−Ｌ２：Ｒ２−Ｌ１／Ｒ２−Ｌ１：Ｒ１−Ｌ２
（式中、Ｌ１は免疫グロブリン重鎖フラグメントであり；Ｌ２は免疫グロブリン軽鎖フラグメントであり；Ｒ１はＡｃＰＬまたはＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ２はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；：は重鎖および軽鎖の抗体領域間の結合であり、そして／は重鎖および重鎖の抗体領域間の結合である；そして
Ｒ２が、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸ｙ−３２９（但し、ｙは１または２０である整数を表す）；および
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸ｙ’−３２２（但し、ｙ’は１または１９である整数を表す）；
から成る群より選択され；
そして、前記Ｒ１が、
（ａ’）配列番号：２のアミノ酸ｘ−３５６（但し、ｘは１または１５である整数を表す）；および
（ｂ’）配列番号：６のアミノ酸ｘ’−３５６（但し、ｘは１または１５である整数を表す）；
から成る群より選択される）
から成る群より選択される式を有するポリペプチド。 - 可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１または可溶性ＡｃＰＬのＣ末端に結合した抗体軽鎖ポリペプチドを含む第一融合ポリペプチド、および可溶性ＡｃＰＬまたは可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１のＣ末端に結合した抗体重鎖ポリペプチドを含む第二融合ポリペプチドを含むポリペプチドであって、ここにおいて当該第一融合ポリペプチドは当該第二融合ポリペプチドに重鎖および軽鎖ポリペプチドの間のジスルフィド結合を介して結合し、そして、
ここで当該可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１が、
（ｃ）配列番号：４のアミノ酸ｙ−３２９を含むポリペプチド、ここでｙは１または２０である整数を表す；および
（ｄ）配列番号：８のアミノ酸ｙ’−３２２を含むポリペプチド、ここでｙ’は１または１９である整数を表す；
から成る群より選択され、
そして当該可溶性ＡｃＰＬが、
（ａ’）配列番号：２のアミノ酸ｘ−３５６を含むポリペプチド、ここでｘは１または１５である整数を表す；および
（ｂ’）配列番号：６のアミノ酸ｘ’−３５６を含むポリペプチド、ここでｘ’は１または１５である整数を表す；
からなる群より選択される、前記ポリペプチド。 - Ｒ１−Ｌ１：Ｒ２−Ｌ２、Ｒ２−Ｌ２：Ｒ１−Ｌ１、Ｒ１−Ｌ２：Ｒ２−Ｌ１、Ｒ２−Ｌ１：Ｒ１−Ｌ２、Ｒ１−Ｌ１：Ｒ２−Ｌ２／Ｒ２−Ｌ２：Ｒ１−Ｌ１およびＲ１−Ｌ２：Ｒ２−Ｌ１／Ｒ２−Ｌ１：Ｒ１−Ｌ２
から成る群より選択される式を有する第一ポリペプチドであって、
式中、Ｌ１は免疫グロブリン重鎖フラグメントであり；Ｌ２は免疫グロブリン軽鎖フラグメントであり；Ｒ１はＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ２はＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；：は重鎖および軽鎖の抗体領域間の結合であり、そして／は重鎖および重鎖の抗体領域間の結合である；ここにおいて当該ＡｃＰＬフラグメントは配列番号：６のアミノ酸１−３５６を有する可溶性ポリペプチドの一部であり、そして当該ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントは配列番号：４のアミノ酸１−３２９を有する可溶性ポリペプチドの一部であり、そして、当該第一ポリペプチドはＩＬ−１Ｒｒｐ１単独よりも高い親和性でＩＬ−１８に結合する、
前記第一ポリペプチド。 - （ａ）請求項１、２、３、４、５、６、７、８、または９に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ；および、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡにハイブリッド形成しうるＤＮＡに相補的なＤＮＡ、ここでハイブリッド形成条件は高ストリンジェント条件である；
から成る群より選択される単離されたＤＮＡ。 - 請求項１０に記載のＤＮＡ分子のいずれかを含む組換え体発現ベクター。
- ポリペプチドを製造する方法であって、請求項１１に記載の発現ベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養することを含む前記方法。
- 請求項８に記載のポリペプチドを製造する方法であって、前記第一融合ポリペプチドをコードしている第一発現ベクターおよび前記第二融合ポリペプチドをコードしている第二発現ベクターを用いて同時トランスフェクションされた宿主細胞を、該第一および第二融合ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養することを含む、前記方法。
- 請求項１、２、３、４、５、６、７、または８に記載のポリペプチドおよび適当な希釈剤または担体を含む組成物。
- ＩＬ−１８の作用を阻害するための、請求項１４に記載の組成物。
- 少なくとも１個の第二ポリペプチドに結合した少なくとも１個の第一ポリペプチドを含むポリペプチドであって、当該第一ポリペプチドが配列番号：４のアミノ酸１−３２９のフラグメントを含み、そして当該第二ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸１−３５６のフラグメントを含み、ここにおいて当該ポリペプチドは当該第一ポリペプチド単独よりも大きい親和性でＩＬ−１８に結合する、前記ポリペプチド。
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