ES2226335T3 - Receooctires de uk.18. - Google Patents

Abstract

Un receptor que comprende al menos un polipeptido IL- 1Rrp1 unido a al menos un polipéptido AcPL, en el que dicho polipéptido IL-1Rrp1 está codificado por un ADN elegido del grupo constituido por: a) ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionado del grupo constituido por la región que codifica para la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID Nº 3 y la región que codifica para la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID Nº 7; b) ADN que es complementario de un ADN capaz de hibridar con el ADN de (a), en el que las condiciones de hibridación incluyen un prelavado con 5 X SSC, SDS al 0, 5%, EDTA 1, 0 mM (pH 8, 0) y una hibridación a 55ºC y 5 X SSC hasta el día siguiente; y c) ADN seleccionado del grupo constituido por: ADN que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº 4 y ADN que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID nº 8; y en el que dicho polipéptidoAcPL está codificado por un ADN seleccionado del grupo constituido por: a¿) ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionado del grupo constituido por la región que codifica para la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID Nº 1 y la región que codifica para la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID Nº 5; b¿) ADN que es complementario de un ADN capaz de hibridar con el ADN de (a¿), en el que las condiciones de hibridación incluyen un prelavado con 5 X SSC, SDS al 0, 5%, EDTA 1, 0 mM (pH 8, 0) y una hibridación a 55ºC y 5 X SSC hasta el día siguiente; y c¿) ADN seleccionado del grupo constituido por: ADN que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº 2 y ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID nº 6.

Description

Receptores de IL-18.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención trata de proteínas que son miembros de la familia de los receptores de la IL-1. Más particularmente, la presente invención trata de complejos receptores IL-1Rrp1 y AcPL que median la unión de alta afinidad y la actividad de la IL-18, e inhiben la actividad mediada por la IL-18.

Descripción de la técnica relacionada

El receptor de tipo I de la interleucina-1 (IL-1RI) media en los efectos biológicos de la interleucina-1, una citocina proinflamatoria (Sims y col., Science 241: 585-589, 1988; Curtis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3045-3049, 1989). Un segundo receptor de la interleucina-1 (denominado IL-1R de tipo II o IL-1RII) se une a la IL-1, pero no parece mediar en la transducción de señales (McMahan y col., EMBO J. 10: 2821, 1991; Sims y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6155-6159, 1993). Cada IL-1RI e IL-1RII se une a IL-1\alpha e IL-1\beta. La IL-1 se ha relacionado con enfermedades inflamatorias crónicas, tales como la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria del intestino. Existen evidencias cada vez mayores de que la IL-1 juega un papel en la osteoporosis. Todas estas actividades están iniciadas por la función de señalización de la porción citoplasmática del IL-1R de tipo I. La IL-1ra inhibe las actividades de la IL-1 uniéndose al receptor de tipo I de la IL-1, bloqueando así el acceso a IL-1\alpha e IL-1\beta a la vez que no produce ninguna respuesta biológica por sí misma.

Los IL-1RI e IL-1RII pertenecen a una familia de proteínas que muestran homologías significativas en la secuencia. Una de tales proteínas es la proteína accesoria IL-1R (IL-1R AcP), descrita en Greenfeder y col. (J. Biol.. Chem. 270: 13757-13765, 1995). Esta proteína, por sí misma, no es capaz de unir la IL-1, pero forma un complejo con IL-1RI y con IL-1\alpha e IL-1\beta. Cuando se coexpresa con IL-1RI, la IL-1R Acp recombinante aumenta la afinidad de unión de IL-1RI por la IL-1\beta (Greenfeder y col., supra).

Otra proteína que muestra homologías en la secuencia con la familia de IL-1RI e IL-1RII es la proteína I relacionada con el receptor de la IL-1 (IL-1Rrp1) (véase Parnet y col.,J. Biol.. Chem. 271: 3967, 1996, y Torigoe y col., J. Biol.. Chem. 272: 25737, 1997). Otra proteína más de este tipo es AcPL.

La IL-18 es un homólogo de IL-1\alpha e IL-1\beta, y se sabe que activa muchas de las mismas respuestas activadas por la IL-1. Por ejemplo, las células estimuladas por la IL-18 activan NF\kappaB y producen mediadores inflamatorios conocidos. La IL-18 actúa como un estimulador del crecimiento y la diferenciación de las células Th1, y es un potente inductor de la producción de interferón \gamma por parte de las células Th1. Se sabe que la clase Th1 de células T colaboradoras media en reacciones inflamatorias. La IL-18 incrementa la actividad de eliminación celular de las NK, y se ha implicado en el choque séptico, la destrucción hepática, la enfermedad inflamatoria del intestino y la diabetes.

Recientemente se ha demostrado que el IL-1Rrp1 se une a la IL-18 y media en la señalización de la IL-18 en células transfectadas. Sin embargo, la afinidad de unión del IL-1Rrp1 por la IL-18 es muy baja, y es probable que haya uno o más receptores o subunidades de receptores adicionales implicados en la unión y la señalización de la IL-18.

Por tanto, es deseable la identificación de receptores adicionales para la IL-18. Dichos receptores proteicos pueden estudiarse para determinar si se unen o no a la IL-18, y si lo hacen, si los receptores juegan algún papel en la mediación de la transducción de señales. Adicionalmente, las formas solubles de dichos receptores pueden usarse para inhibir la actividad de la IL-18 y mejorar cualquier enfermedad inflamatoria y/o autoinmune atribuible a la señalización de la IL-18. Asimismo, puede explorarse la posible existencia de subunidades adicionales de conversión de la afinidad para la IL-18.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona polipéptidos receptores denominados en esta invención complejos receptores de la IL-18. Más particularmente, la presente invención proporciona polipéptidos receptores multiméricos que incluyen un polipéptido AcPL, o fragmentos del mismo, y un polipéptido IL-1Rrp1, o fragmentos del mismo. El polipéptido AcPL puede estar unido covalente o no covalentemente al polipéptido IL-1Rrp1 mediante cualquier medio adecuado. Dicho medio incluye la mediación de un reactivo de encadenamiento cruzado, un conector polipeptídico y asociaciones tales como mediante puentes de disulfuro o mediante el uso de cremalleras de leucina. En una forma de realización de la invención, el receptor es una proteína de fusión producida mediante la tecnología del ADN recombinante. Este receptor multimérico de la presente invención se une a la IL-18 con una afinidad mayor que la del IL-1Rrp1 aislado. Las patologías mediadas por la IL-18 pueden ser tratadas mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de este receptor inventivo a un paciente afectado por dicha patología.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la coexpresión de AcPL e IL-1Rrp1 da como resultado un asombroso incremento de la actividad de NF\kappaB en las células estimuladas por la IL-18. Como el IL-1Rrp1 aislado une la IL-18 sólo débilmente, y AcPL no une la IL-18, el incremento de la actividad de NF\kappaB mediante AcPL e IL-1Rrp1 coexpresados indica que estos polipéptidos son subunidades de un complejo receptor de la IL-18. Según la presente invención, se proporcionan nuevos polipéptidos, denominados complejos receptores de la IL-18.

Ventajosamente, dichos complejos receptores diméricos de IL-18 que comprenden IL-1Rrp1 y AcPL, o fragmentos de los mismos, son útiles para inhibir la actividad de la IL-18, incluyendo los efectos proinflamatorios de la IL-18, y pueden incluir IL-1Rrp1 y AcPL como proteínas coexpresadas en la misma célula, o como IL-1Rrp1 unido a AcPL como subunidades de un receptor. Preferiblemente, las subunidades están unidas mediante enlaces covalentes. Las subunidades pueden estar unidas covalentemente mediante cualquier medio adecuado, tal como mediante un reactivo de encadenamiento cruzado o un conector polipeptídico.

En una forma de realización de la presente invención, el receptor es una proteína de fusión producida mediante la tecnología del ADN recombinante. Dichas proteínas de fusión pueden prepararse transfectando células con el ADN que codifica para la proteína de fusión IL-1Rrp1:Fc y el ADN que codifica para la proteína de fusión AcPL:Fc, y que coexpresa los dímeros en las mismas células.

Alternativamente, los dímeros AcPL/IL-1Rrp1 pueden prepararse fusionando una de las subunidades del receptor a la región constante de una cadena pesada de una inmunoglobulina, y fusionando la otra subunidad del receptor a la región constante de una cadena ligera de una inmunoglobulina. Por ejemplo, puede fusionarse una proteína AcPL a la región CH_{1}-bisagra-CH_{2} -CH_{3} de la IgG1 humana, y la proteína IL-1Rrp1 puede fusionarse a la región kappa C de la cadena ligera de la Ig kappa, o viceversa. Las células transfectadas con el ADN que codifica para la proteína de fusión de la cadena ligera de la inmunoglobulina y la proteína de fusión de la cadena pesada de la inmunoglobulina expresan heterodímeros cadena pesada/cadena ligera que contienen la proteína de fusión AcPL y la proteína de fusión IL-1Rrp1. Mediante puentes de disulfuro entre las cadenas pesadas, los heterodímeros se combinan adicionalmente para proporcionar multímeros, en su mayoría tetrámeros. Ventajosamente, en el caso de que se expresen homodímeros de fusión de dos cadenas pesadas o dos cadenas ligeras, dichos homodímeros pueden separarse fácilmente de los heterodímeros.

Además de los complejos proteicos receptores de la IL-18, la presente invención incluye ADN aislado que codifica para polipéptidos heterómeros, vectores de expresión que contienen ADN que codifica para polipéptidos heterómeros y células hospedadoras transformadas con dichos vectores de expresión. También se describen los procedimientos para la producción del receptor recombinante de la IL-18, incluyendo las formas solubles de la proteína. Asimismo, en esta invención se proporcionan anticuerpos inmunorreactivos frente al nuevo polipéptido.

En una forma de realización de la presente invención, las subunidades polipeptídicas de los receptores heterómeros de la IL-18 incluyen al menos una subunidad de AcPL según se describe en la SEC ID Nº 2 o en la SEC ID Nº 6, y al menos una subunidad de IL-1Rrp1 según se describe en la SEC ID Nº 4 o en la SEC ID Nº 8. El ADN que codifica para estas subunidades polipeptídicas se presenta en las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 7, respectivamente. La proteína de la subunidad AcPL codificada por la SEC ID Nº 1 incluye un dominio extracelular de 356 aminoácidos (residuos 1-356 desde el N terminal al C terminal de la SEC ID Nº 2) que incluye un péptido de señalización de 14 aminoácidos (residuos 1-14 de la SEC ID Nº 2), una región transmembrana de 25 aminoácidos (residuos 357-381) y un dominio citoplasmático de 218 aminoácidos (residuos 382-599). La proteína de la subunidad AcPL codificada por la SEC ID Nº 5 incluye un dominio extracelular de 356 aminoácidos (residuos 1-356 de la SEC ID Nº 6) que incluye un péptido de señalización de 14 aminoácidos (residuos 1-14 de la SEC ID Nº 6), una región transmembrana de 24 aminoácidos (residuos 357-380) y un dominio citoplasmático de los residuos aminoácidos 381-614. La proteína de la subunidad IL-1Rrp1 codificada por la SEC ID Nº 3 incluye un dominio extracelular de 329 aminoácidos (residuos 1-329 de la SEC ID Nº 4) que incluye un péptido de señalización de 19 aminoácidos (residuos 1-19 de la SEC ID Nº 4), una región transmembrana de 21 aminoácidos (residuos 330 a 350 de la SEC ID Nº 4) y un dominio citoplasmático desde los residuos aminoacídicos 351 a 541. La proteína de la subunidad IL-1Rrp1 codificada por la SEC ID Nº 7 incluye un dominio extracelular de 322 aminoácidos (residuos 1-322 de la SEC ID Nº 8) que incluye un péptido de señalización de 18 aminoácidos (residuos 1-18 de la SEC ID Nº 8), una región transmembrana de 25 aminoácidos (residuos 323 a 347 de la SEC ID Nº 8) y un dominio citoplasmático desde los residuos aminoacídicos 348 a 537. Adicionalmente, el IL-1Rrp1 se describe en la patente de EE.UU. nº 5.776.731, y el AcPL se describe en las solicitudes copendientes de tramitación S/N 60/078.835 y S/N 60/072.301, incorporadas a esta invención por referencia.

Preferiblemente, las subunidades polipeptídicas de los receptores diméricos de la IL-18 son fragmentos solubles de los polipéptidos IL-1Rrp1 y AcPL, que juntos forman complejos heterómeros con la actividad deseada. Dichos polipéptidos incluyen aquellos que carecen de toda o parte de la región transmembrana y del dominio citoplasmático de la proteína. Así, por ejemplo, un complejo receptor heterómero de la presente invención puede incluir al menos una subunidad que es el dominio extracelular de la SEC ID Nº 2 o de la SEC ID Nº 6, y al menos una subunidad que es el dominio extracelular de la SEC ID Nº 4 o de la SEC ID Nº 8. Estos dominios extracelulares solubles de AcPL e IL-1Rrp1 pueden incluir o excluir su péptido de señalización. Así, en otra forma de realización, un receptor heterómero de la IL-18 incluye los residuos aminoacídicos 1-356 o los residuos 15-356 de la SEC ID Nº 2 o de la SEC ID Nº 6, y los residuos aminoacídicos 1-329 o los residuos 20-329 de la SEC ID Nº 4, o los residuos aminoacídicos 1-325 o los residuos 19-322 de la SEC ID Nº 8. El deseo de incluir la secuencia de señalización depende de factores tales como la posición del AcPL o del IL-1Rrp1 en la proteína de fusión y de las células hospedadoras pretendidas cuando el receptor se va a producir mediante la tecnología del ADN recombinante. En las formas de realización preferibles, se fusiona un constructo de ADN que codifica para uno de los fragmentos solubles de AcPL o de IL-1Rrp1 con un constructo de ADN que codifica para la región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina, y un constructo de ADN que codifica para el otro fragmento soluble de AcPL o IL-1Rrp1 se fusiona con el ADN que codifica para la región constante de la cadena ligera de una inmunoglobulina.

Alternativamente, el receptor de la IL-18 puede comprender IL-1Rrp1 o fragmentos solubles de IL-1Rrp1 complejados no covalentemente con AcPL o fragmentos solubles de AcPL. La unión no covalente de IL-1Rrp1 a AcPL puede conseguirse mediante cualquier medio adecuado que no interfiera con la capacidad del receptor de unirse a la IL-18. En una metodología, se une un primer compuesto a IL-1Rrp1, y un segundo compuesto, que se unirá no covalentemente al primer compuesto, se une a AcPL. Algunos ejemplos de tales compuestos son la biotina y la avidina. Así, el receptor se forma a través de las interacciones no covalentes de la biotina con la avidina. En una forma de realización de la invención, IL-1Rrp1 y AcPL son polipéptidos recombinantes, cada uno purificado a partir de células recombinantes y después unidos entre sí no covalentemente para formar el receptor. Una célula hospedadora puede ser transformada con dos vectores de expresión diferentes, de forma tal que tanto IL-1Rrp1 como AcPL sean producidos por la célula hospedadora recombinante. Los IL-1Rrp1 y AcPL producidos por dichas células hospedadoras transformadas pueden asociarse para formar un complejo a través de interacciones no covalentes. Cuando dichas células transformadas expresan las formas unidas a la membrana de las proteínas, tales células son útiles en diversos ensayos, incluyendo ensayos de competición.

El ensayo de unión descrito en el ejemplo 1 compara la unión de la IL-18 mediante el sobrenadante de células transfectadas con IL-1Rrp1 aislado, AcPL aislado y una combinación de IL-1Rrp1 y AcPL. Los sobrenadantes de las células que coexpresan IL-1Rrp1 y AcPL mostraron altos niveles de unión a la IL-18; los sobrenadantes de las células que expresan IL-1Rrp1 aislado mostraron bajos niveles de unión a la IL-18; y los sobrenadantes de las células transfectadas con AcPL aislado no se unen a la IL-18. El ensayo de inducción de NF\kappaB descrito en el ejemplo 2 demuestra que las células transfectadas con IL-1Rrp1 aislado y las células transfectadas con AcPL aislado no son sensibles a la estimulación por la IL-18. Sin embargo, las células cotransfectadas tanto con IL-1Rrp1 como con AcPL y estimuladas con IL-18 incrementaron en gran medida la inducción de NF\kappaB.

Según se usa en esta invención, los términos IL-1Rrp1 y AcPL incluyen variantes y formas truncadas de las proteínas naturales que poseen la actividad biológica deseada. Las variantes producidas por la adición, sustitución o eliminación de aminoácido(s) en la secuencia natural se discuten con más detalle a continuación.

Según se describe anteriormente, para ciertas aplicaciones son preferibles los polipéptidos solubles IL-1Rrp1 y AcPL. "IL-1Rrp1 soluble", según se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a polipéptidos que son sustancialmente similares en su secuencia de aminoácidos a toda o parte de la región extracelular de un polipéptido IL-1Rrp1 natural, y que, debido a la ausencia de una región transmembrana que provocaría la retención del polipéptido en una membrana celular, son secretados tras su expresión. Los polipéptidos solubles IL-1Rrp1 adecuados conservan la actividad biológica deseada. El IL-1Rrp1 soluble también puede incluir parte de la región transmembrana o parte del dominio citoplasmático u otras secuencias, siempre que la proteína soluble IL-1Rrp1 sea capaz de ser
secretada.

Asimismo, el término "AcPL soluble", según se usa en esta invención, se refiere a proteínas que son sustancialmente similares en su secuencia de aminoácidos a toda o parte de la región extracelular de un polipéptido AcPL natural, y que son secretadas tras su expresión pero conservan la actividad biológica deseada. El AcPL soluble puede incluir parte de la región transmembrana, del dominio citoplasmático u otras secuencias, siempre que el polipéptido sea secretado.

En una forma de realización, los polipéptidos IL-1Rrp1 y AcPL solubles incluyen el dominio extracelular completo. Para efectuar la secreción, los polipéptidos solubles comprenden el péptido de señalización natural o un péptido de señalización heterólogo. Así, algunos ejemplos de polipéptidos IL-1Rrp1 solubles comprenden los aminoácidos 1-329 de la SEC ID Nº 4 (IL-1Rrp1 humano) y los aminoácidos 1-322 de la SEC ID Nº 8 (IL-1Rrp1 murino). Algunos ejemplos de polipéptidos AcPL solubles comprenden los aminoácidos 1-356 de la SEC ID Nº 2 (AcPL humano) y los aminoácidos 1-356 de la SEC ID Nº 6 (AcPL murino).

En el ejemplo 1 se describe una proteína de fusión soluble que comprende el dominio extracelular del IL-1Rrp1 de la SEC ID Nº 4 fusionada con un polipéptido de la región Fc de un anticuerpo, y el dominio extracelular de AcPL fusionado con un polipéptido de la región Fc.

Los AcPL e IL-1Rrp1 solubles pueden identificarse (y distinguirse de sus equivalentes no solubles unidos a la membrana) separando células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, y analizando el medio (sobrenadante) para comprobar la presencia de la proteína deseada. El medio de cultivo puede analizarse usando unos procedimientos que son similares o idénticos a los descritos en los ejemplos, a continuación. La presencia de AcPL o IL-1Rrp1 en el medio indica que la proteína fue secretada desde las células, y así es una forma soluble de la proteína deseada. Los AcPL e IL-1Rrp1 solubles pueden ser formas naturales de estas proteínas. Alternativamente, pueden producirse fragmentos solubles de proteínas AcPL e IL-1Rrp1 mediante tecnología del ADN recombinante o aislarse de otra forma, según se describe a continuación.

El uso de las formas solubles de IL-1Rrp1 y AcPL es ventajoso para ciertas aplicaciones. Se facilita la purificación de proteínas a partir de células hospedadoras recombinantes, dado que las proteínas solubles son secretadas desde las células. Además, un receptor de la presente invención que comprende proteínas IL-1Rrp1 y AcPL solubles es generalmente más adecuado para su administración intravenosa.

Con respecto a la anterior discusión sobre los péptidos de señalización y los diversos dominios de las proteínas IL-1Rrp1 y AcPL, el artesano experto reconocerá que los entornos anteriormente descritos de dichas regiones de las proteínas son aproximados. Por ejemplo, aunque hay disponibles programas informáticos que predicen el sitio de escisión de un péptido de señalización, la escisión puede producirse en sitios diferentes a los predichos. Además, se ha reconocido que una preparación proteica puede comprender una mezcla de moléculas proteicas con diferentes aminoácidos N terminales, debido a la escisión del péptido de señalización en más de un sitio. Así, los polipéptidos solubles IL-1Rrp1 y AcPL que comprenden el dominio extracelular incluyen a aquellos que tienen un aminoácido C terminal, que puede diferir de los identificados anteriormente como el C terminal del dominio extracelular. Además, el tratamiento post-tranduccional, que puede variar según el sistema de expresión en particular empleado, puede rendir proteínas con diferentes N terminales. Dichas variantes que conservan las actividades biológicas deseadas están comprendidas en los términos "polipéptidos IL-1Rrp1" y "polipéptidos AcPL", según se usa en esta invención.

Pueden prepararse IL-1Rrp1 y AcPL truncados, incluyendo los polipéptidos solubles, mediante cualquiera de las numerosas técnicas convencionales. En el caso de proteínas recombinantes, puede subclonarse un fragmento de ADN, que codifica un fragmento deseado, en un vector de expresión. Alternativamente, puede sintetizarse químicamente una secuencia de ADN deseada, usando técnicas conocidas. También pueden producirse fragmentos de ADN mediante digestión con endonucleasas de restricción de una secuencia de ADN clonada completa, y aislarse mediante electroforesis en geles de agarosa. Pueden emplearse conectores que contienen sitio(s) de escisión de endonucleasas de restricción para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión, o el fragmento puede ser digerido por los sitios de escisión presentes de forma natural en el mismo. Pueden sintetizarse los oligonucleótidos que reconstruyen el N o C terminal de un fragmento de ADN hasta un punto deseado. El oligonucleótido puede contener un sitio de escisión de una endonucleasa de restricción secuencia arriba de la secuencia codificante deseada, y colocar un codón de inicio (ATG) en el N terminal de la secuencia codificante.

También puede emplearse el bien conocido procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa para aislar una secuencia de ADN que codifica para un fragmento proteico deseado. En dicha reacción en cadena de la polimerasa se emplean cebadores oligonucleótidos que comprenden los términos deseados del fragmento. Puede emplearse cualquier procedimiento de PCR adecuado. Uno de dichos procedimientos se describe en Saiki y col., Science 239: 487 (1988). Otro se describe en Recombinant DNA Methodology, Wu y col., eds. Academic Press Inc., San Diego (1989), págs. 189-196. En general, las reacciones de PCR implican la combinación de cebadores oligonucleótidos 5' y 3' con un ADN molde (en este caso, ADN de IL-1Rrp1 o de AcPL), y cada uno de los cuatro desoxinucleósidos trifosfato, en una disolución tamponada adecuada. La disolución se calienta (por ejemplo, desde 95ºC hasta 100ºC) para desnaturalizar el ADN molde bicatenario, y después se enfría antes de añadir la enzima ADN polimerasa. Se llevan a cabo múltiples ciclos de las reacciones, con objeto de amplificar el fragmento de ADN deseado.

El polipéptido AcPL está unido al polipéptido IL-1Rrp1 a través de un enlace covalente o no covalente. Para ciertas aplicaciones, es preferible el enlace covalente, por ejemplo, su uso in vivo, en vista de la estabilidad aumentada generalmente conferida por el enlace covalente, al contrario que los enlaces no covalentes. Para construir el receptor de la presente invención, el enlace covalente puede conseguirse mediante reactivos de encadenamiento cruzado, conectores peptídicos o cualquier otra técnica adecuada.

Se conocen numerosos reactivos útiles para el encadenamiento cruzado de una molécula proteica con otra. Para este propósito hay disponibles conectores heterobifuncionales y homobifuncionales en, por ejemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois. Dichos conectores contienen dos grupos funcionales (por ejemplo, ésteres y/o maleimidas) que reaccionarán con ciertos grupos funcionales de las cadenas laterales de los aminoácidos, uniendo así un polipéptido con otro.

Un tipo de conector peptídico que puede emplearse en la presente invención separa los dominios de AcPL y de IL-1Rrp1 a una distancia suficiente para asegurar que cada dominio se pliega adecuadamente en las estructuras secundaria y terciaria necesarias para la actividad biológica deseada. El conector también debería permitir que los dominios extracelulares de AcPL y de IL-1Rrp1 adopten la orientación espacial adecuada para formar el sitio de unión para la IL-18.

Los conectores peptídicos adecuados son conocidos en la técnica, y pueden emplearse según las técnicas convencionales. Entre los conectores peptídicos adecuados están los descritos en las patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233, que se incorporan al presente documento como referencia. Un conector peptídico puede unirse mediante cualquiera de los procedimientos convencionales para enlazar un polipéptido con otro. Los reactivos de encadenamiento cruzado disponibles en Pierce Chemical Company, según se ha descrito anteriormente, están entre los que pueden ser empleados. En el conector peptídico pueden incluirse aminoácidos con cadenas laterales reactivas con dichos reactivos, por ejemplo, en los terminales de los mismos. Preferiblemente, se prepara, mediante tecnología de ADN recombinante, una proteína de fusión que comprende AcPL unido a IL-1Rrp1 mediante un conector peptídico.

En una forma de realización de la invención, AcPL e IL-1Rrp1 están unidos mediante polipéptidos procedentes de inmunoglobulinas. La preparación de las proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados con varias porciones de polipéptidos procedentes de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc) se ha descrito por, por ejemplo, Ashkenazi y col (PNAS USA 88: 10535, 1991) y Byrn y col. (Nature 344: 677, 1990). A modo de ejemplo, puede unirse un polipéptido procedente de la región Fc de un anticuerpo al C terminal de IL-1Rrp1. Un polipéptido aparte Fc se une al C terminal de AcPL. Se forman puentes de disulfuro entre las dos Fc de los polipéptidos (por ejemplo, en la denominada región bisagra, donde normalmente hay presentes puentes de disulfuro intercatenarios en las moléculas de anticuerpos), produciendo un heterodímero que comprende la proteína de fusión AcPL/Fc unida a la proteína de fusión IL-1Rrp1/Fc. Ventajosamente, las células hospedadoras son cotransfectadas con dos vectores de expresión diferentes, uno que codifica para la IL-1Rrp1/Fc soluble y otro que codifica para la AcPL/Fc soluble. Se cree que el heterodímero se forma intracelularmente o durante la secreción.

El término "polipéptido Fc", según se usa en esta invención, incluye formas naturales y mutadas, así como polipéptidos Fc truncados que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Puede clonarse un ADNc que codifica para un polipéptido de cadena simple procedente de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano en el vector de clonación pBluescript SK® (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) para producir un vector recombinante denominado hIgG1Fc. Se coloca un único sitio BgIII cerca del extremo 5' de la secuencia codificante de Fc insertada. Hay un sitio SpeI inmediatamente secuencia abajo del codón de terminación. El polipéptido Fc codificado por el ADNc se extiende desde la región bisagra N terminal hasta el C terminal natural, es decir, es una región de anticuerpo Fc esencialmente completa. Una muteína adecuada de este polipéptido Fc se describe en la patente de EE.UU. con nº de serie 08/097.827, incorporada al presente documento como referencia. La muteína muestra una afinidad reducida por los receptores Fc.

También pueden producirse homodímeros que comprenden dos polipéptidos IL-1Rrp1/Fc o dos polipéptidos AcPL/Fc unidos mediante puentes de disulfuro, mediante algunas de las células hospedadoras transfectadas descritas en esta invención. Los homodímeros pueden separase entre sí y del heterodímero en virtud de sus diferencias de tamaño (por ejemplo, mediante electroforesis en gel). El heterodímero también puede purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad secuencial (descrita a continuación).

Los complejos receptores de la IL-18 de la presente invención incluyen proteínas de fusión de la cadena ligera de la región constante de un anticuerpo (o un fragmento de la misma) y de la cadena pesada de la región constante de un anticuerpo (o un fragmento de la misma). La cadena pesada de la región constante puede incluir los cuatro dominios de su región constante o una porción de los dominios, incluyendo CH_{1}, que se asocia con la cadena ligera, la región bisagra H, y los dominios CH_{2} y CH_{3}, que son responsables de la dimerización de las moléculas de las cadenas pesadas. Dentro del ámbito de las anteriores proteínas de fusión están los tetrámeros, que se forman mediante dos dímeros que unen las cadena pesada/cadena ligera mediante puentes de disulfuro entre sus respectivas regiones de las cadenas pesadas.

Con respecto a los polipéptidos de la cadena ligera de la inmunoglobulina, en la práctica de esta invención son adecuados los polipéptidos de la familia \kappa y de la familia \lambda. Así, cualquier tipo de dímero o tetrámero de inmunoglobulina, incluyendo IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, puede ser la base de las moléculas heterómeras de la presente invención.

Según la presente invención, pueden prepararse polipéptidos heterómeros funcionales mediante la asociación entre moléculas de múltiples cadenas pesadas y múltiples cadenas ligeras, que normalmente se asocian entre sí. Por ejemplo, la región constante de la IgG1 humana se asociará con la región constante de la cadena ligera \kappa (denominada C\kappa). Se ha descrito la secuencia de aminoácidos de la región constante de hIgG1 (Ellison, J. W., Berson, B. J. y Hood, L. E., 1982). Se ha descrito la secuencia de nucleótidos del gen de una inmunoglobulina C gamma 1 humana (Nuc. Acids Res. 10: 4071, y Walls, M. A., Hsiao, K. C. y Harris, L. J., 1993). Se describen los vectores para la expresión de los dominios variables de una inmunoglobulina amplificada mediante PCR con regiones constantes humanas (Nuc. Acids Res. 21: 2921). También se ha descrito la secuencia de la cadena ligera humana C\kappa (Shuford, W., Raff, H. V., Finley, J. W., Esselstyn, J. y Harris, L. J., 1991), Effect of light chain V-region duplication on IgG oligomerization and in vivo efficacy, Science 252: 724, y Steinberger, P., Kraft, D. y Valenta, R. (1996), Construction of combinatorial IgE library from an allergic patient. Isolation and characterization of human IgE Fabs with specificity for the major timothy grass pollen allergen, Ph1, pág. 5, J. Biol. Chem., 271: 10972).

Las formas de realización del receptor de la IL-18 que incluyen cadenas pesadas y ligeras de regiones de anticuerpos son proteínas de fusión representadas por las fórmulas:

R_{1}-L_{1}:R_{2}-L_{2} o R_{2}-L_{2}:R_{1}-L_{1} o R_{1}-L_{2}:R_{2}-L_{1} o R_{2}-L_{1}:R_{1}-L_{2} R_{1}-L_{1}:R_{2}-L_{2}

R_{1}-L_{1}:R_{2}-L_{2}/ R_{2}-L_{2}:R_{1}-L_{1} o R_{1}-L_{2}:R_{2}-L_{1}/R_{2}-L_{1}:R_{1}-L_{2}

en las que L_{1} es un fragmento de una cadena pesada de una inmunoglobulina, cuyo N terminal se extiende al menos a través de la región CH_{1}; L_{2} es un fragmento de una cadena ligera de una inmunoglobulina; R_{1} es AcPL o un fragmento de AcPL; R_{2} es IL-1Rrp1 o un fragmento de IL-1Rrp1; los : designan enlaces entre una cadena pesada y una región de anticuerpo de cadena ligera, y la / designa enlaces entre una cadena pesada y una región de anticuerpo de cadena pesada. En el caso de un dímero, el polipéptido de fusión resultante incluye dos subunidades de receptores unidas mediante una cadena pesada/cadena ligera. En el caso del tetrámero, la proteína de fusión incluye cuatro subunidades de receptores, y se parece al anticuerpo en su estructura, mostrando el sitio de unión de la IL-18 bivalentemente.

Para obtener los anteriores polipéptidos de fusión puede clonarse el ADNc que codifica para un polipéptido de cadena pesada de un anticuerpo procedente del anticuerpo IgG1 humano (CH_{1}-H-CH_{2}-CH_{3}) en el vector de expresión pDC409, para producir un vector recombinante denominado hIgG1. Se coloca un único sitio BgIII cerca del extremo 5' de la secuencia codificante de la cadena pesada insertada. Hay un sitio NotI inmediatamente secuencia abajo del codón de terminación. El polipéptido de la cadena pesada codificado por el ADNc se extiende desde el N terminal de la región CH_{1} hasta el C terminal natural. Para obtener una cadena ligera de un anticuerpo, puede clonarse el ADNc que codifica para un polipéptido de cadena simple procedente de las regiones constantes de la cadena kappa humana en el vector de expresión pDC409, para producir un vector recombinante denominado hIg\kappa. Esta secuencia está flanqueada en el extremo 5' por un único sitio BgIII, y en el extremo 3' por un único sitio NotI. Las formas de realización de la presente invención que incorporan dichos polipéptidos de anticuerpos incluyen un primer polipéptido de fusión que comprende AcPL (o un fragmento del mismo) secuencia arriba de la región constante de la cadena ligera de un anticuerpo (o un fragmento de la misma) y un segundo polipéptido de fusión que comprende IL-1Rrp1 secuencia arriba de la región constante de la cadena pesada de un anticuerpo (o un fragmento de la cadena pesada), cuyo N terminal se extiende al menos a través de la región CH_{1}. Se forma(n) un(os) puente(s) de disulfuro entre la cadena ligera del polipéptido de fusión AcPL y la cadena pesada del polipéptido de fusión IL-1Rrp1, produciendo así un receptor de la presente invención. Como alternativa adicional, se prepara un polipéptido de fusión IL-1Rrp1-cadena ligera de anticuerpo y se combina (o se une por puentes de disulfuro) con un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de fusión AcPL-cadena pesada de anticuerpo. Cuando se combinan dos de las anteriores moléculas unidas por puentes de disulfuro, se forman puentes de disulfuro adicionales entre las dos regiones de anticuerpo. El receptor resultante de la presente invención, que comprende cuatro polipéptidos de fusión, se parece al anticuerpo en su estructura y muestra el sitio de unión de la IL-18 bivalentemente.

Los polipéptidos AcPL e IL-1Rrp1 pueden purificarse por separado a partir de fuentes celulares, y después unirse entre sí. Alternativamente, el receptor de la presente invención puede producirse usando la tecnología del ADN recombinante. Los polipéptidos AcPL e IL-1Rrp1 pueden producirse por separado y purificarse a partir de células hospedadoras transformadas para una subsiguiente unión covalente. En una forma de realización de la presente invención, una célula hospedadora es transformada/transfectada con ADN foráneo que codifica para AcPL e IL-1Rrp1 como polipéptidos separados. Los dos polipéptidos pueden ser codificados por el mismo vector de expresión con codones de inicio y de terminación para cada uno de los dos genes, o pueden cotransfectarse las células recombinantes con dos vectores de expresión por separado. En otra forma de realización, el receptor se produce como una proteína de fusión en células recombinantes.

En una forma de realización de la presente invención, la proteína del receptor es una proteína de fusión recombinante con la fórmula:

R_{1}-L-R_{2} o R_{2}-L-R_{1}

en la que R_{1} representa AcPL o un fragmento de AcPL; R_{2} representa IL-1Rrp1 o un fragmento de IL-1Rrp1; y L representa un conector peptídico.

Las proteínas de fusión de la presente invención incluyen constructos en los que la porción C terminal de AcPL está fusionada con el conector, que está fusionado con la porción N terminal de IL-1Rrp1, y también constructos en los que la porción C terminal de IL-1Rrp1 está fusionada con el conector, que está fusionado con la porción N terminal de AcPL. AcPL está unido covalentemente a IL-1Rrp1 de una forma tal que se produce una única proteína que conserva las actividades biológicas deseadas de AcPL y de IL-1Rrp1. Los componentes de la proteína de fusión están enumerados por su orden de aparición (es decir, primero está el polipéptido N terminal, seguido del conector, y después el polipéptido C terminal).

Se construye una secuencia de ADN que codifica para una proteína de fusión usando técnicas de ADN recombinante para insertar fragmentos de ADN aislado que codifica para AcPL e IL-1Rrp1 en un vector de expresión adecuado. El extremo 3' de un fragmento de ADN que codifica para AcPL se une (mediante el conector) al extremo 5' del fragmento de ADN que codifica para IL-1Rrp1, con los marcos de lectura de las secuencias en fase para permitir la transducción del ARNm en una única proteína de fusión biológicamente activa. Alternativamente, el extremo 3' de un fragmento de ADN que codifica para IL-1Rrp1 puede unirse (mediante el conector) al extremo 5' del fragmento de ADN que codifica para AcPL, con los marcos de lectura de las secuencias en fase para permitir la transducción del ARNm en una única proteína de fusión biológicamente activa. Una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de señalización N terminal puede ser conservada en la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido N terminal, mientras que los codones de terminación, que evitarían una ultralectura de la segunda secuencia de ADN (C terminal), son eliminados. Por el contrario, un codón de terminación requerido para finalizar la transducción es conservado en la segunda secuencia de ADN. Preferiblemente, el ADN que codifica para la secuencia de señalización se elimina de la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido C terminal.

Puede insertarse una secuencia de ADN que codifica para un conector polipeptídico deseado entre y en el mismo marco de lectura que las secuencias de ADN que codifican para AcPL e IL-1Rrp1, usando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, entre las secuencias que codifican para AcPL e IL-1Rrp1 puede unirse un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica para el conector y que contiene los sitios de escisión de la endonucleasa de restricción adecuados.

Alternativamente, una secuencia de ADN sintetizada químicamente puede contener una secuencia complementaria del 3' terminal (sin el codón de terminación) tanto de AcPL como de IL-1Rrp1, seguida de una secuencia que codifica para el conector, que está seguida por una secuencia complementaria del 5' terminal del otro AcPL o IL-1Rrp1. Entonces se emplea una mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para insertar la secuencia que codifica para el conector en un vector que contiene una fusión directa de AcPL e IL-1Rrp1.

La presente invención proporciona secuencias de ADN aislado que codifican para las proteínas de fusión anteriormente mencionadas, que comprenden AcPL, IL-1Rrp1 y un conector peptídico. También se proporciona el ADN que codifica para los polipéptidos AcPL descritos en esta invención, dado que es ADN que codifica para los polipéptidos AcPL fusionado con polipéptidos procedentes de inmunoglobulinas. El ADN que codifica para el AcPL abarcado por la presente invención incluye, por ejemplo, ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN aislado mediante PCR, ADN genómico y combinaciones de los mismos.

En esta invención también se proporcionan vectores de expresión recombinantes que contienen las secuencias de ADN aislado. "Vector de expresión" se refiere a constructos de ADN replicable usados para expresar ADN que codifica para la proteína deseada, y que incluye una unidad de transcripción que comprende un ensamblaje de (1) elemento(s) genético(s) con un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores, operadores o incrementadores, unidos operativamente a (2) una secuencia de ADN que codifica para una proteína deseada, que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias de inicio y de terminación de la transcripción y de la transducción adecuadas. La elección del promotor y de los otros elementos reguladores varía generalmente según la célula hospedadora pretendida.

En los vectores de expresión, los elementos reguladores que controlan la transcripción o la transducción proceden generalmente de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Adicionalmente se pueden incorporar la capacidad para replicarse en un hospedador, generalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes. También pueden emplearse vectores procedentes de retrovirus.

Las regiones de ADN están unidas operativamente cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN que codifica para un péptido de señalización (líder secretor) está operativamente unido al ADN para un polipéptido, si el polipéptido es expresado como un precursor que es secretado a través de la membrana de la célula hospedadora; un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; y un sitio de fijación de los ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está posicionado de forma que permita la transducción. Generalmente, "unido operativamente" significa contiguo, y en el caso de los líderes secretores, contiguo y en marco de lectura.

Las células hospedadoras transformadas son células que han sido transformadas o transfectadas con ADN foráneo usando técnicas de ADN recombinante. En el contexto de la presente invención, el ADN foráneo incluye una secuencia que codifica para las proteínas inventivas. Las células hospedadoras pueden ser transformadas para propósitos de clonación o de amplificación del ADN foráneo, o pueden ser transformadas con un vector de expresión para la producción de la proteína. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas, levaduras o eucariotas superiores. Los vectores de clonación y de expresión adecuados para su uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamíferos son descritos por Pouwels y col (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985), cuya descripción relevante se incorpora al presente documento como referencia.

Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Los vectores de expresión procariotas comprenden generalmente uno o más marcadores fenotípicos seleccionables, por ejemplo, un gen que codifica para proteínas que confieren resistencia a antibióticos o suministran un requerimiento autótrofo, y un origen de replicación reconocido por el hospedador para asegurar la amplificación dentro del hospedador. Algunos ejemplos de hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros según la elección.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano procedente de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones de "esqueleto" de pBR322 se combinan con un promotor adecuado y la secuencia estructural a expresar. E. coli es típicamente transformada usando derivados de pBR322, un plásmido procedente de una especie de E. coli (Bolívar y col., Gene 2: 95, 1977). El pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina, y esto proporciona una forma simple de identificar a las células transformadas.

Algunos promotores usados habitualmente en vectores de expresión recombinantes microbianos incluyen el sistema promotor de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (Chang y col., Nature 275: 615, 1978; y Goeddel y col., Nature 281: 544, 1979), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; y el documento EPA 36.776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil emplea el promotor P_{L} del fago \lambda y el represor termoinducible cI857ts. Los vectores de plásmidos disponibles de la American Type Culture Collection, que incorporan derivados del promotor P_{L} \lambda incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092) y pPLc28, residente en RR1 de E. coli (ATCC 53082).

La proteína del receptor recombinante también puede expresarse en hospedadores de levaduras, preferiblemente en especies de Saccharomyces tales como S. cerevisiae. También pueden emplearse levaduras de otros géneros tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras contendrán generalmente un origen de replicación del plásmido de 2 \mum de la levadura o una secuencia de replicación autónoma (ARS), un promotor, un ADN que codifica para la proteína de fusión del receptor, secuencias para la poliadenilación y la terminación de la transcripción y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levaduras incluirán un origen de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación tanto de la levadura como de E. coli, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S.cerevisiae, que proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, y un promotor procedente de un gen de levadura altamente expresado, para inducir la transcripción de una secuencia estructural secuencia abajo. La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano.

Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levaduras incluyen los promotores de metalotionenína, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman y col., J. Biol.. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland y col., Biochem 17: 4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en R. Hitzeman y col., documento EPA 73.657.

Los vectores de levaduras preferibles pueden ensamblarse usando secuencias de ADN del pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen y origen de replicación Amp^{r}) y secuencias de ADN de levadura, incluyendo un promotor ADH2 reprimible por glucosa y factor de secreción líder \alpha. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell y col. (J. Biol.. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier y col (Nature 300: 724, 1982). El factor líder \alpha de levadura, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, puede ser insertado entre el promotor y el gen estructural a expresar. Véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell 30: 922, 1982; y Bitter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. La secuencia líder puede modificarse para contener, junto a su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder con los genes foráneos.

Los protocolos de transformación de levaduras adecuados son conocidos por los expertos en la materia. Un ejemplo de técnica lo describen Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978), seleccionando los transformantes Trp+ en un medio selectivo formado por un 0,67% de base nitrogenada de levadura, un 0,5% de aminoácidos, un 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Las cepas de hospedadores transformados por los vectores que comprenden el promotor ADH2 pueden hacerse crecer para su expresión en un medio rico formado por un 1% de extracto de levadura, un 2% de peptona y un 1% de glucosa, complementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 se produce al agotarse la glucosa del medio. Los sobrenadantes de la levadura en bruto se recogen mediante filtración y se mantienen a 4ºC antes de su purificación adicional.

Pueden emplearse varios sistemas de cultivo celulares de mamíferos o insectos para expresar la proteína recombinante. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos son reseñados por Luckuw y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). Algunos ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen líneas celulares de células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Algunas células hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen células CV-1 (ATCC CCL70) y células COS-7 (ATCC CRL 1651; descritas por Gluzman, Cell 23: 175, 1981), ambas procedentes de riñón de mono. Otra línea celular de riñón de mono, la CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) se derivó mediante transfección de la línea celular CV-1 con un gen que codifica el antígeno 1 nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) y con un vector que contiene secuencias reguladoras CMV (McMahan y col., EMBO J. 10: 2821, 1991). El gen EBNA-1 permite la replicación episomal de los vectores de expresión, tales como HAV-EO o pDC406, que contienen el origen de replicación EBV.

Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y un incrementador, unidos al gen a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueando 5' o 3', y secuencias 5' o 3' no transcritas, tales como los necesarios sitios de fijación de los ribosomas, un sitio de poliadenilación, sitios de empalme del donante y del aceptor y secuencias de terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción y de la transducción en los vectores de expresión a usar en células transformantes de vertebrados pueden proceder de fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores y los incrementadores usados habitualmente proceden del polioma, del adenovirus 2, del virus simio 40 (SV40) y del citomegalovirus humano. Pueden usarse las secuencias de ADN procedentes del genoma vírico del SV40, por ejemplo, los sitios del origen SV40, del promotor temprano y tardío, del incrementador, del empalme y de poliadenilación, para proporcionar los otros elementos genéticos requeridos para la expresión de una secuencia de ADN heterólogo. Los promotores tempranos y tardíos son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente del virus como fragmentos que también contienen el origen de replicación vírico SV40 (Fiers y col., Nature 273: 113, 1978). También pueden usarse fragmentos menores o mayores de SV40, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio BglI localizado en el origen de replicación vírico.

Algunos ejemplos de vectores pueden construirse según describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983). Un sistema útil para un alto nivel de expresión estable de los ADNc receptores de mamíferos en células epiteliales mamarias CI27 murinas puede construirse sustancialmente según describen Cosman y col., (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). También pueden emplearse vectores procedentes de retrovirus.

Cuando se desea la secreción de la proteína AcPL y/o IL-1Rrp1 desde la célula hospedadora, el vector de expresión puede comprender ADN que codifica para un péptido de señalización o líder. En lugar de la secuencia de señalización natural puede añadirse una secuencia de señalización heteróloga, tal como la secuencia de señalización para la interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia de señalización para el receptor de la interleucina-2 descrita en Cosman y col., Nature 312: 768 (1984); el péptido de señalización de la interleucina-4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido de señalización del receptor de tipo I de la interleucina-1 descrito en la patente de EE.UU. 4.968.607; y el péptido de señalización para el receptor de tipo II de la interleucina-1 descrito en el documento EP 460.846.

La presente invención proporciona un procedimiento para preparar las proteínas recombinantes de la presente invención que comprende cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica para dicha proteína en condiciones que promuevan la expresión. Entonces la proteína deseada se purifica a partir del medio de cultivo o de extractos celulares. La proteína deseada puede ser AcPL, IL-1Rrp1 o el receptor heterodimérico, por ejemplo. También podrían emplearse los sistemas de transducción sin células para producir la proteína deseada usando ARN procedente del nuevo ADN de la presente invención.

Como un ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante al medio de cultivo pueden ser inicialmente concentrados usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse sobre una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender IL-18. Una matriz de afinidad de IL-18 puede prepararse acoplando IL-18 humana recombinante a Sepharosa activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia) o Affigel Hydrazide (Biorad), según las recomendaciones del fabricante. Es preferible la inmunopurificación secuencial usando anticuerpos unidos a un soporte adecuado. Las proteínas que se unen a un anticuerpo específico para AcPL se recuperan y se ponen en contacto con anticuerpos específicos para IL-1Rrp1 sobre un soporte insoluble. Así pueden identificarse y aislarse las proteínas inmunorreactivas con ambos anticuerpos.

Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o un sustrato adecuado con radicales dietilaminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa o de otros tipos empleados habitualmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Son preferibles los grupos sulfopropilo. Para una purificación adicional de la proteína de fusión puede emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) empleando medio EP-HPLC hidrófobo, por ejemplo, gel de sílice con radicales metilo u otros grupos alifáticos.

Pueden emplearse algunas o todas de las anteriores etapas de purificación, en varias combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante esencialmente homogénea. El cultivo de células recombinantes permite la producción de las proteínas de fusión libres de las proteínas contaminantes que normalmente están asociadas con IL-1Rrp1 o AcPL, dado que se encuentran de forma natural en sus respectivas especies de origen, por ejemplo, en la superficie de ciertos tipos celulares.

Los anteriores procedimientos de purificación están entre los que también pueden emplearse para purificar receptores no recombinantes de la presente invención. Cuando se emplean procedimientos de unión que pueden producir homodímeros (IL-1Rrp1-conector-IL-1Rrp1 y AcPL-conector-AcPL), se emplean los procedimientos de purificación que separan el heterodímero de dichos homodímeros. Un ejemplo de dicho procedimiento es la inmunopurificación secuencial discutida anteriormente. En una forma de realización, la AcPL (recombinante o no recombinante) se purifica de tal forma que mediante SDS-PAGE no se detectan bandas correspondientes a las otras proteínas (contaminantes).

La proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano se aísla generalmente mediante una extracción inicial a partir de sedimentos celulares, seguida de una o más etapas de concentración, precipitación salina, cromatografía de intercambio iónico acuoso o de exclusión por tamaños. Finalmente, puede emplearse una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas de purificación finales. Las células microbianas empleadas para la expresión de las proteínas de fusión recombinantes pueden desorganizarse mediante cualquier procedimiento conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, tratamiento con ultrasonidos, desorganización mecánica o el uso de agentes de lisis celular.

La fermentación de la levadura que expresa la proteína de fusión como una proteína secretada simplifica enormemente la purificación. La proteína recombinante secretada resultante de una fermentación a gran escala puede purificarse mediante procedimientos análogos a los descritos por Urdal y col., (J. Chromatog. 296: 171, 1984), que implican dos etapas secuenciales de HPLC en fase inversa para la purificación de una proteína recombinante en una columna preparatoria de HPLC.

El ADN o las secuencias de aminoácidos de IL-1Rrp1 o AcPL pueden diferir de los presentados en SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 7. Debido a la conocida degeneración del código genético, puede haber una considerable variación en las secuencias de nucleótidos que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Además, las secuencias de ADN capaces de hibridar con la secuencia natural de ADN de SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 7 en condiciones moderadamente severas o altamente severas, y que codifican para un polipéptido IL-1Rrp1 o AcPL biológicamente activo, también se consideran como secuencias codificantes del ADN de IL-1Rrp1 o del AcPL, en el contexto de la presente invención. Dichas secuencias hibridantes incluyen, pero no se limitan a, secuencias variantes tales como las descritas a continuación, y ADN procedente de otras especies de mamíferos.

Las condiciones moderadamente severas incluyen las condiciones descritas en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1, págs. 1, 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Las condiciones de severidad moderada, según definen Sambrook y col., incluyen el uso de una disolución de prelavado de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y unas condiciones de hibridación de aproximadamente 55ºC, 5 X SSC, hasta el día siguiente. Las condiciones altamente severas incluyen temperaturas de hibridación y lavado mayores. El artesano experto reconocerá que la temperatura y la concentración de la disolución salina de lavado pueden ajustarse según sea necesario, según factores tales como la longitud de la sonda, en el que dichas condiciones incluyen una hibridación a 68ºC seguida de un lavado en 0,1 X SSC/SDS al 0,1% a 63-68ºC. En otra forma de realización, la presente invención proporciona un receptor heterodimérico que comprende AcPL e IL-1Rrp1, en el que los AcPL e IL-1Rrp1 están codificados por un ADN que hibrida con el ADN de SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 5 o SEC ID Nº 3 o SEC ID Nº 7, respectivamente, en condiciones moderadamente o altamente severas.

Además, ciertas mutaciones en una secuencia de nucleótidos que codifica para AcPL o IL-1Rrp1 no serán expresadas en el producto proteico final. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos pueden realizarse para aumentar la expresión, fundamentalmente para evitar bucles en la estructura secundaria del ARNm transcrito (véase el documento EP 75.444 A). Pueden realizarse otras alteraciones en la secuencia de nucleótidos para proporcionar codones que sean más fácilmente traducidos por el hospedador elegido, por ejemplo, la bien conocida preferencia de E. coli por codones para su expresión en E. coli.

La secuencia de aminoácidos de IL-1Rrp1 o AcPL naturales puede modificarse mediante la sustitución, eliminación, adición o inserción de uno o más aminoácidos, para producir una variante de IL-1Rrp1 o de AcPL. La variante que posee la actividad biológica deseada de las proteínas IL-1Rrp1 y AcPL naturales puede emplearse en el receptor de la presente invención. Los ensayos mediante los cuales puede analizarse la actividad biológica de las variantes de las proteínas se describen en los ejemplos, a continuación. Los polipéptidos IL-1Rrp1 biológicamente activos son capaces de unirse a la IL-18. La actividad biológica deseada de los polipéptidos AcPL descritos en esta invención es la capacidad para incrementar la unión de la IL-18 cuando el AcPL está unido a IL-1Rrp1, comparada con el nivel de unión de la IL-18 al IL-1Rrp1 aislado.

Las alteraciones en la secuencia de aminoácidos natural pueden producirse mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones en unos loci en particular sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante flanqueada por sitios de restricción que permiten la unión de fragmentos de la secuencia natural. Tras la unión, la secuencia reconstruida resultante codifica para un análogo con la deseada inserción, sustitución o eliminación de aminoácidos.

Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos, para proporcionar un gen alterado con unos codones particulares alterados, según la sustitución, eliminación o inserción requeridas. Algunos ejemplos de procedimientos para conseguir las alteraciones descritas anteriormente los describen Walder y col., (Gene 42: 133, 1986); Bauer y col., (Gene 37: 73, 1985); Craig (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith y col., (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); la patente de EE.UU. nº 4.518.584 y la patente de EE.UU. nº 4.737.462, que se incorporan al presente documento como referencia.

Las variantes bioequivalentes de AcPL e IL-1Rrp1 pueden construirse mediante, por ejemplo, la realización de varias sustituciones de residuos de aminoácidos o eliminando los aminoácidos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. En una forma de realización de la invención, la variante de la secuencia de aminoácidos es al menos idéntica en un 80%, preferiblemente al menos idéntica en un 90%, a la secuencia natural. El porcentaje de similitud puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de la secuencia usando el programa informático GAP, versión 6.0, disponible en University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), revisada por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos de la secuencia más corta de las dos. Los parámetros preferibles por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las no identidades) de nucleótidos, y la matriz de comparación cargada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, según describen Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Séquense and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para los huecos finales.

Generalmente, las sustituciones se deberían realizar conservadoramente, es decir, los aminoácidos sustitutos más preferibles son los que tienen unas características fisicoquímicas que se parezcan a las de los residuos a remplazar. Algunos ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tales como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tales como entre Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y Asn. Son bien conocidas otras sustituciones conservadoras, por ejemplo, las sustituciones de regiones completas con unas características de hidrofobicidad similares.

Los residuos de cisteína pueden eliminarse o remplazarse por otros aminoácidos para evitar la formación de puentes de disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. Para incrementar la solubilidad en agua de las proteínas, los aminoácidos hidrófilos pueden ser sustituidos por aminoácidos hidrófobos en la región transmembrana y/o el dominio extracelular e IL-1Rrp1 y AcPL.

Los residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes pueden modificarse para incrementar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad de proteasa KEX2. El documento EP 212.914 describe el uso de mutagénesis dirigida para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 se inactivan mediante la eliminación, adición o sustitución de residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg, para eliminar la aparición de estos residuos básicos adyacentes. Estos pares de aminoácidos, que constituyen los sitios de procesamiento de las proteasas KEX2, se encuentran en los residuos 98-99, 323-333, 333-334, 472-473 y 475-476 de la SEC ID Nº 2 de la proteína AcPL. Estos sitios KEX2 se encuentran en las posiciones 113-114, 314-315, 364-365, 437-438 y 465-466 de la SEC ID Nº 4 de la proteína IL-1Rrp1. Los apareamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles de la escisión por KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa una metodología conservadora y preferible para inactivar los sitios de KEX2.

La presente invención también incluye proteínas con o sin un patrón natural de glucosilación asociado. La expresión de los ADN que codifican para las proteínas de fusión en bacterias tales como E. coli proporciona moléculas no glucosiladas. Los análogos mutantes funcionales con sitios de N-glucosilación inactivados pueden producirse mediante síntesis y unión de oligonucleótidos o mediante técnicas de mutagénesis dirigida. Estas proteínas análogas pueden producirse en una forma homogénea, reducida por carbohidratos, con un buen rendimiento, usando sistemas de expresión de levaduras. Los sitios de N-glucosilación en proteínas eucariotas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A_{1}-Z, donde A_{1} es cualquier aminoácido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. En esta secuencia la asparragina proporciona un grupo lateral amino en la cadena para la unión covalente del carbohidrato.

La secuencia de aminoácidos de AcPL en la SEC ID Nº 2 contiene 4 de tales sitios de N-glucosilación, todos en el dominio extracelular, en los aminoácidos 21-23, 119-121, 152-254 y 345-347. El dominio extracelular de IL-1Rrp1 comprende los sitios de N-glucosilación en las posiciones 91-93, 102-104, 150-153, 168-170, 197-199, 203-205, 236-238 y 297-299 de la SEC ID Nº 4. Dicho sitio puede ser eliminado sustituyendo otro aminoácido por Asn o por el residuo Z, eliminando Asn o Z o insertando un aminoácido no Z entre A_{1} y Z, o un aminoácido distinto a Asn entre Asn y A_{1}. Algunos de los procedimientos conocidos para inactivar los sitios de N-glucosilación en proteínas incluyen los descritos en la patente de EE.UU. 5.071.972 y en el documento EP 276.846.

Las variantes de las proteínas del receptor de la presente invención también incluyen varias formas estructurales de la proteína primaria que conservan actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína del receptor puede estar en forma de sales ácidas o básicas, o puede estar en una forma neutra. Los residuos de aminoácidos individuales también pueden modificarse mediante oxidación o reducción.

La estructura aminoacídica primaria también puede modificarse formando conjugados agregados o covalentes con otras fracciones químicas, tales como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes se preparan uniendo grupos funcionales particulares a cadenas laterales de aminoácidos o en los N o C terminales. Otros derivados de la proteína del receptor dentro del ámbito de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregados de la proteína del receptor con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante la síntesis en cultivo recombinante como fusiones N o C terminales. Por ejemplo, el polipéptido conjugado puede ser una secuencia polipeptídica de señalización (o líder) en la región N terminal de la proteína, que dirige cotranslacionalmente o cotraduccionalmente la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis hasta su sitio de función dentro o fuera de la membrana o la pared celular (por ejemplo, el factor líder \alpha de levaduras).

Los péptidos pueden fusionarse con la proteína deseada (por ejemplo, mediante técnicas de ADN recombinante) para facilitar la purificación o la identificación. Algunos ejemplos incluyen poli-His o el péptido Flag® (Hopp y col., Bio/Technology 6: 1204, 1988, y la patente de EE.UU. 5.011.912). El péptido Flag® es altamente antigénico, y proporciona un epítopo unido reversiblemente mediante un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo un ensayo rápido y una fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Los sistemas de expresión útiles para fusionar el octapéptido Flag® al N o C terminal de una proteína dada están disponibles en Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, CT, así como los anticuerpos monoclonales que se unen al octapéptido.

Los complejos receptores dimérico de la IL-18 que incluyen variantes naturales de IL-1Rrp1 y AcPL también están abarcados por la presente invención. Algunos ejemplos de dichas variantes son proteínas que resultan de eventos de empalme alternativo del ARNm o de la escisión proteolítica de la proteína de AcPL e IL-1Rrp1, en los que se conserva la actividad biológica deseada. Un empalme alternativo del ARNm puede dar lugar a una proteína AcPL o IL-1Rrp1 truncada pero biológicamente activa, tal como la forma soluble natural de la proteína. Las variaciones atribuibles a una proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los N o C terminales tras la expresión en diferentes tipos de células hospedadoras, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína AcPL o IL-1Rrp1 (generalmente entre 1-5 aminoácidos terminales).

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína del receptor de la presente invención con un vehículo o diluyente farmacológicamente aceptable. Dichos vehículos y diluyentes no serán tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Dichas composiciones pueden comprender, por ejemplo, la proteína del receptor en una disolución tamponada, a la cual se pueden añadir antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos, incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes, tales como EDTA, glutatión, y otros estabilizantes y excipientes. El receptor de la presente invención se puede administrar mediante cualquier procedimiento adecuado de una forma adecuada según la indiciación, tal como inyección intravenosa, administración local, infusión continua, liberación prolongada desde implantes, etc.

Los receptores heterodiméricos de la presente invención son útiles como un reactivo de unión de la IL-18. Este receptor, que comprende preferiblemente AcPL e IL-1Rrp1 solubles, tiene aplicaciones tanto in vitro como in vivo. Los receptores pueden emplearse en ensayos in vitro, por ejemplo, en estudios sobre el mecanismo de transducción de la señal biológica que se inicia mediante la unión de la IL-18 a su receptor en una célula. Dichos receptores también podrían usarse para inhibir la actividad biológica de la IL-18 en diversos ensayos in vitro o procedimientos in vivo. En una forma de realización de la invención, el receptor inventivo se administra para unirse a la IL-18, inhibiendo así la unión de la IL-18 a sus receptores de superficie celulares endógenos. La actividad biológica mediada por dicha unión de la IL-18 a las células se ve así también inhibida.

El IL-1Rrp1 aislado se une a la IL-18, pero con una afinidad relativamente baja (Torigoe y col., J. Biol.. Chem. 272: 2573, 1997). Los receptores de la presente invención, producidos por células cotransfectadas con ADN que codifica para AcPL e IL-1Rrp1, por ejemplo, se unen a la IL-18 con alta afinidad. Dichos receptores de la presente invención pueden emplearse cuando se desea una inhibición de una actividad mediada por la IL-18. Además, el uso de los receptores de la presente invención en ensayos in vitro ofrece la ventaja de permitirle a uno determinar que los resultados del ensayo son atribuibles a la unión de la IL-18.

En una forma de realización de la invención, se administra in vivo un receptor heterodimérico que comprende AcPL e IL-1Rrp1 para inhibir una actividad biológica de la IL-18. Se sabe que la IL-18 media en la actividad de NF\kappaB, y actúa como un estimulante del crecimiento y diferenciación de las células Th1, y es un potente inductor de la producción de interferón \gamma en las células Th1. La IL-18 también incrementa la actividad de eliminación de las células NK, y se ha implicado en el choque séptico, la destrucción hepática y la diabetes. Cuando estos u otros efectos biológicos de la IL-18 no son deseables, puede administrarse un receptor de la presente invención para que se una a la IL-18 y mejore los efectos de la actividad de la IL-18.

El receptor inventivo puede administrarse a un paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva para tratar una patología mediada por la IL-18. Se dice que una patología está mediada por la IL-18 cuando la IL-18 provoca (directa o indirectamente) o exacerba la patología. Pueden usarse las proteínas solubles del receptor para unir competitivamente la IL-18, inhibiendo así la unión de la IL-18 a los receptores de superficie celulares endógenos.

Los receptores heterodiméricos que comprende AcPL unida a IL-1Rrp1 también hallan un uso en ensayos de evaluación de la actividad biológica de las proteínas IL-18, cuya actividad biológica se mide en términos de afinidad de unión por el receptor. Para ilustrar, el receptor puede emplearse en un ensayo de unión para medir la actividad biológica de un fragmento, variante o muteína de IL-18. El receptor es útil para determinar si la actividad biológica de la IL-18 es conservada tras la modificación de una proteína de la IL-18 (por ejemplo, modificación química, mutación, etc.). La afinidad de unión por el receptor de la proteína IL-18 modificada se compara con la de una proteína IL-18 no modificada, para detectar cualquier impacto negativo de la modificación sobre la actividad biológica. Así, se puede evaluar la actividad biológica antes de que la proteína modificada se use en un estudio o ensayo de investigación, por ejemplo.

Los receptores heterodiméricos también hallan un uso como reactivos que pueden ser empleados por los que realizan estudios de "seguridad en la calidad", por ejemplo, para controlar la vida y estabilidad de almacenamiento de las proteínas IL-18 en diferentes condiciones. Los receptores pueden usarse para confirmar la actividad biológica (en términos de afinidad de unión por el receptor) en proteínas IL-18 que han sido almacenadas a diferentes temperaturas, durante diferentes periodos de tiempo, o que han sido producidas en diferentes tipos de sistemas de expresión recombinante, por ejemplo.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas formas de realización de la invención, y no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Experimentos de precipitación in vitro

Con objeto de determinar si los AcPL, IL-1Rrp1 o combinaciones de ambos polipéptidos se unen a la IL-18, se prepararon varias proteínas de fusión Fc y se ensayaron como sigue. Se construyó como sigue un vector de expresión que codifica para una proteína de fusión AcPL/Fc soluble, que comprendía un dominio extracelular truncado de AcPL fusionado con el N terminal de un polipéptido de la región Fc procedente de un anticuerpo. Se amplificó mediante PCR un vector de expresión recombinante que comprende ADN de AcPL en el vector pDC304, utilizando cebadores que contienen los sitios de restricción deseados en el marco en los extremos 3' y 5'. El fragmento resultante, que incluye el extremo 5' del ADN del AcPL, que termina en el nucleótido 1551 de la SEC ID Nº 1, con sitios SaII y BgIII introducidos en los extremos 5' y 3', respectivamente, se aisló mediante técnicas convencionales.

Un vector recombinante denominado pDC412-hIgG1Fc comprende el ADNc que codifica para el polipéptido Fc (-H-CH_{2}-CH_{3} únicamente). El vector pDC412-hIgG1Fc se digirió con las enzimas de restricción SaII y BaIII, que escinden en la región del policonector del vector, secuencia arriba del ADNc que codifica para el polipéptido Fc.

El fragmento de ADN que codifica para AcPL aislado anteriormente se unió al pDC412-hIgG1Fc digerido con SaII/BaIII, de forma que el ADN del polipéptido Fc se fusionó con el extremo 3' del ADN del AcPL. El vector de expresión resultante codificaba para una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 1-356 de la secuencia de AcPL de la SEC ID Nº 2, seguidos de la región H-CH_{2}-CH_{3} de hIgG1Fc.

Se construyó como sigue un vector de expresión que codifica para una proteína de fusión IL-1Rrp1/Fc soluble humana. Se amplificó mediante PCR un vector recombinante que incluye ADNc de IL-1Rrp1 con cebadores específicos de genes que contenían los sitios de restricción deseados. El fragmento resultante, que incluye el extremo 5' de IL-1Rrp1, se aisló mediante técnicas convencionales. Este fragmento de IL-1Rrp1, digerido con Asp718 y BgIII, se combinó con el fragmento hIgG1Fc descrito anteriormente y se digirió con BgIII y NotI. Los fragmentos digeridos resultantes se unieron a pDC304 digerido con Asp718 y Not I. La proteína de fusión IL-1Rrp1/Fc resultante codificada por el vector recombinante comprende (desde el N hacia el C terminal) los aminoácidos 1-329 de la SEC ID Nº 4, seguidos de la región H-CH_{2}-CH_{3} de hIgG1/Fc.

En un conjunto muestras, las células COS-7 se transfectaron con un pDC206 de control o un vector pDC206-IL-18. En otro conjunto de muestras de células COS-7 transfectadas, se transfectaron los vectores de fusión Fc descritos anteriormente. El conjunto total de muestras fue el siguiente:

Muestra	Células transfectadas con el (los) vector(es) que codifican para:
A	Vector de expresión pDC206 vacío (control)
B	pDC206hIL-18
1	pDC409 (control)
2	IL-1Rrp1/Fc
3	AcPL/Fc
4	AcPL/Fc y IL-1Rrp1/Fc

Dos días después de la transfección, las muestras A y B se cultivaron durante 1 hora en medio carente de cys/met y después se marcaron con medio que contenía [^{35}S-cys][^{35}S-met] durante 6 horas. Los sobrenadantes se extrajeron, se sometieron a una centrifugación y se ajustaron a NaCl 0,4 M/Triton X-100 al 1,0% en presencia de inhibidores de proteasas. Los sobrenadantes de las células transfectadas con las proteínas de fusión Fc de las muestras 1-4 se extrajeron 2 días después de la transfección y se centrifugaron. Cada sobrenadante de fusión Fc se combinó con sobrenadantes marcados con ^{35}S a) transfectados con un vector, o b) transfectados con IL-18. La proteína del receptor IL-1Rrp1/Fc se añadió a otra porción del sobrenadante radiomarcado, como control. Se añadió proteína en G-Sefarosa a cada muestra experimental, y las precipitaciones se llevaron a cabo hasta el día siguiente a 4ºC. Entonces las muestras se lavaron abundantemente con un tampón de NaCl 0,4 M, SDS al 0,05% y NP-40 al 1,0%, y se separaron mediante electroforesis en gel de Tris-glicina al 4-20%. El gel se fijó, se amplificó, se secó y se autorradiografió. Con objeto de evaluar el nivel de proteína total y tener en cuenta las proteínas de fusión Fc no marcadas, se analizó una porción de cada precipitado en un gel de Tris-glicina al 4-20% por separado y se tiñó con plata.

Los sobrenadantes de las muestras celulares 1-4 no precipitaron apreciablemente ninguna proteína en el intervalo de 10-30 kDa del sobrenadante de control (muestra A). La IL-18 (muestra B) se precipitó del sobrenadante de la muestra celular 2 (IL-1Rrp1Fc), pero no del sobrenadante de la muestra celular 1 (control) ni de la muestra celular 3 (AcPL/Fc). Significativamente más IL-18 precipitó del sobrenadante de toda la muestra 4 que se obtuvo a partir de la cotransfección de IL-1Rrp1/Fc y AcPL/Fc.

Así, el IL-1Rrp1 es capaz de unir la IL-18; el AcPL no es capaz de unir la IL-18; y los IL-1Rrp1 y AcPL coexpresados son capaces de unir la IL-18, y las proteínas coexpresadas muestran unos niveles mayores de unión a la IL-18 que el IL-1Rrp1 aislado. El gel teñido con plata muestra que no hay más IL-1Rrp1 en los sobrenadantes transfectados con IL-1Rrp1 y AcPL, comparado con los sobrenadantes transfectados únicamente con IL-1Rrp1. Esto elimina la posibilidad de que haya más IL-1Rrp1 expresado en estas muestras. Los resultados indican que la afinidad de unión por la IL-18 de un dímero IL-1Rrp1/AcPL es mayor que la afinidad del IL-1Rrp1 aislado.

Ejemplo 2 Inducción de la actividad de NF\kappaB

Con objeto de determinar los papeles de IL-1Rrp1 y AcPL en la señalización de la IL-18, AcPL, IL-1Rrp1 y una combinación de IL-1Rrp1 y AcPL se sobreexpresaron en células COS y células S49.1, y se evaluó el efecto de la estimulación por la IL-18 sobre la activación de NF\kappaB.

Las células COS-7 se transfectaron mediante el método del DEAE/Dextrano en un formato de 12 pocillos. Cada pocillo se transfectó con un total de 200 ng del (los) vector(es) de expresión adecuado(s) y 800 ng de un plásmido indicador NF\kappaB-Luc, que contiene 3 sitios NF\kappaB que median la expresión de la luciferasa. Se transfectaron aproximadamente 10^{7} células S49.1 mediante electroporación en 0,7 ml con 40 \mug del plásmido indicador NF\kappaB-Luc, y un total de 20 \mug del (los) vector(es) de expresión adecuado(s). Las electroporaciones se realizaron a 960 \muF y 320 V.

Las células se incubaron durante 2 días y después se estimularon con 40 ng/ml de IL-18 (adquirida en PeproTech) durante 4 horas. Las células se lavaron, se lisaron y se ensayaron para evaluar la actividad luciferasa usando Reactivos de Ensayo de Luciferasa (adquiridos en Promega Corp.), según las instrucciones del fabricante.

Las células COS-7 o S49.1 que fueron transfectadas únicamente con el vector de control, con el vector que codificaba sólo para m-IL-1Rrp1 o con el vector que codificaba sólo para mAcPL no fueron sensibles a la estimulación por IL-18. Adicionalmente, las células S49.1 transfectadas con mAcPL no fueron sensibles a la señalización de la mIL-18 cuando la transfección estaba combinada con un vector de expresión que codificaba para mIL-1R de tipo I o mIL-1RAcP. Sin embargo, las células cotransfectadas con mAcPL y mIL-1Rrp1 y estimuladas con mIL-18 mostraron un aumento en la actividad de unión del ADN de NF\kappaB que fue de 10 veces en las células COS y de 300 veces en las células S49.1. Las células COS-7 transfectadas con h IL-1Rrp1 no mostraron respuesta alguna a la estimulación por hIL-18, mientras que las células COS-7 transfectadas únicamente con hAcPL y estimuladas con hIL-18 mostraron un aumento de 8 veces en la actividad de NF\kappaB. Esto se atribuye a la asociación de hAcPL con IL-1Rrp1 de mono endógena de las células COS7. La sobreexpresión de hIL-1Rrp1 con hAcPL no aumentó la estimulación de la actividad de NF\kappaB en respuesta a la hIL-18 con respecto a la observada en células que sobreexpresan únicamente hAcPL. Este espectacular incremento de la actividad de NF\kappaB indica que AcPL y IL-1Rrp1 son subunidades del receptor de la IL-18, y cooperan para inducir la señalización de NF\kappaB en respuesta a la estimulación por IL-18.

Ejemplo 3 Preparación de las proteínas de fusión de las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos AcPL e IL-1Rrp1

A continuación se describe la preparación de las proteínas de fusión que incluyen AcPL e IL-1Rrp1 fusionadas con un polipéptido de una cadena pesada de un anticuerpo y de una cadena ligera de un anticuerpo.

En primer lugar, se construye un vector de expresión que codifica para la región constante completa de la IgG1 humana con una región conectora secuencia arriba. Dicho vector de expresión facilita la creación de plásmidos que codifican para proteínas de fusión. Se utilizan técnicas de PCR para amplificar la región constante de IgG1 anteriormente mencionada con cebadores que contienen un sitio BgIII secuencia arriba y un sitio NotI secuencia abajo. El fragmento generado por PCR resultante se digiere, se purifica y se une a pDC412, que es digerido con BgIII y NotI. El vector de expresión pDC412-hIgG1 se digiere entonces con SaII y BgIII.

A continuación se prepara un vector de expresión que contiene el dominio constante \kappa de una Ig precedido por una región conectora y seguido de una región conectora y un dominio poli-His. El dominio poli-His ayuda ventajosamente en el procedimiento de purificación de la proteína. Se utilizan técnicas de PCR para amplificar la región constante con cebadores que contienen un fragmento BgIII-NotI. El fragmento de PCR generado resultante se digiere, se purifica y se une a pDC412. Los receptores solubles de interés pueden clonarse secuencia arriba utilizando los sitios únicos SaII y BgIII.

Para preparar un vector de expresión IL-1Rrp1-C\kappa se amplifica el dominio extracelular de IL-1Rrp1 mediante PCR usando cebadores que contienen sitios de restricción SaII (5') y BgIII (3'). Este producto de la PCR, purificado y digerido, se une al vector de expresión pDC412-Ig\kappa digerido con SaII/BgIII para crear un constructo en el marco que codifica para una proteína de fusión que une la porción soluble de IL-1Rrp1 con la región constante de C\kappa.

Para preparar un vector de expresión IL-1Rrp1-hIgG1 se elimina de IL-1Rrp1-C\kappa el fragmento de restricción SaII/BgIII que codifica para IL-1Rrp1 soluble, y se une a pDC412-hIgG1, que se ha digerido con las mismas enzimas de restricción. Dado que ambos vectores contienen el sitio BgIII en el mismo marco de lectura, esto producirá fácilmente una fusión entre IL-1Rrp1 soluble y hIgG1.

Para preparar un vector de expresión AcPL-C\kappa, el dominio extracelular de AcPL se amplifica mediante PCR usando cebadores que contienen los sitios de restricción SaII (5') y BgIII (3'). Este producto de PCR purificado y digerido se une entonces a pDC412-C\kappa digerido con SaII/BgIII para crear una proteína de fusión en el marco que une la porción soluble de AcPL con la región constante de C\kappa.

Para preparar un vector de expresión AcPL-hIgG1 se elimina de AcPL-C\kappa el fragmento de restricción SaII/BgIII que codifica para la AcPL soluble, y se une a pDC412-hIgG1, que se ha digerido con las mismas enzimas de restricción. Dado que ambos vectores contienen el sitio BgIII en el mismo marco de lectura, esto producirá fácilmente una fusión entre AcPL soluble y hIgG1.

Se transfectan células COS-7 con los vectores de fusión descritos anteriormente. Las células se cultivan y las proteínas de fusión se recogen según se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 4 Inhibición de la actividad de NF\kappaB inducida por la IL-18

Se transfectaron temporalmente células COS-7 en placas de 12 pocillos con 10 ng cada uno de los vectores de expresión mIL-1Rrp1 y mAcPL, y 50 ng por pocillo de un plásmido indicador 3XNF\kappaB-luciferasa. Dos días después de la transfección, las células se estimularon con 10 ng/ml de mIL-18 (adquirida en Peprotech) en presencia de cantidades crecientes de varias proteínas de fusión receptor-Fc. La mIL-18 se preincubó con las proteínas durante 20 min a temperatura ambiente antes de su adición a las células. La cantidad de proteína Fc se valoró desde 1 \mug/ml hasta 50 \mug/ml. Las células se estimularon 4 horas y después se lisaron, y se evaluó la actividad luciferasa usando los Reactivos del Ensayo de Luciferasa Promega.

La preincubación de la IL-18 con mIL-1Rrp1-Fc, mIL-1Rrp1-FlagpoliHis o mAcPL-Fc no tuvo un efecto significativo sobre la inducción de NF\kappaB a ninguna de las concentraciones ensayadas. Por el contrario, la incubación de la IL-18 con una mezcla heterogénea de proteínas mIL-1Rrp1-Fc + mAcPL-Fc (formado por homodímeros de mIL-1Rrp1-Fc, homodímeros de mAcPL-Fc y moléculas heterodiméricas mIL-1Rrp1-Fc/mAcPL-Fc) dio como resultado una inhibición dependiente de la dosis de la inducción de NF\kappaB. Las células no inducidas mostraron 3 X 10^{3} RLU, y las células estimuladas con la mIL-18 en ausencia de cualquier proteína receptor-Fc mostraron 25 X 10^{3} RLU. La inhibición máxima de la inducción de NF\kappaB se observó con 20 \mug/ml y 50 \mug/ml de la mezcla de proteínas mIL-1Rrp1-Fc + mAcPL-Fc, que dio como resultado 6 X 10^{3} RLU, lo que representa un 87% de inhibición de la actividad de la IL-18.

<110> Immunex Corporation, Sims, John E., Born, Teresa L.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Receptores de la IL-18

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 2638-WO

\vskip0.400000\baselineskip

<140> - - a asignar - -

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 22-01-1999

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn ver. 2.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2681

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> AcPL humana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (484)..(2283)

\vskip0.400000\baselineskip

<440> 1

1

2

3

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 599

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> AcPL humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1626

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> IL-1Rrp1 humana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1626)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

7

8

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 541

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> IL-1Rrp1 humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2481

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> AcPL murina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (428)..(2272)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

12

13

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 614

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> AcPL murina

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

16

17

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2830

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> IL-1Rrp1 murina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (381)..(1994)

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

19

20

21

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 537

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> IL-1Rrp1 murina

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

23

24

Claims (16)

1. Un receptor que comprende al menos un polipéptido IL-1Rrp1 unido a al menos un polipéptido AcPL, en el que dicho polipéptido IL-1Rrp1 está codificado por un ADN elegido del grupo constituido por:

a)

ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionado del grupo constituido por la región que codifica para la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID Nº 3 y la región que codifica para la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID Nº 7;

b)

ADN que es complementario de un ADN capaz de hibridar con el ADN de (a), en el que las condiciones de hibridación incluyen un prelavado con 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y una hibridación a 55ºC y 5 X SSC hasta el día siguiente; y

c)

ADN seleccionado del grupo constituido por: ADN que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº 4 y ADN que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID nº 8; y

en el que dicho polipéptido AcPL está codificado por un ADN seleccionado del grupo constituido por:

a')

ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionado del grupo constituido por la región que codifica para la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID Nº 1 y la región que codifica para la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID Nº 5;

b')

ADN que es complementario de un ADN capaz de hibridar con el ADN de (a'), en el que las condiciones de hibridación incluyen un prelavado con 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y una hibridación a 55ºC y 5 X SSC hasta el día siguiente; y

c')

ADN seleccionado del grupo constituido por: ADN que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº 2 y ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID nº 6.

2. Un receptor que comprende al menos un primer polipéptido unido a al menos un segundo polipéptido, en el que dicho primer polipéptido está codificado por un ADN seleccionado del grupo constituido por:

a)

ADN que codifica para un polipéptido que comprende los aminoácidos y-329 de la SEC ID Nº 4, en el que y representa un número entero que es 1 ó 20; y

b)

ADN que codifica para un polipéptido que comprende los aminoácidos y'-322 de la SEC ID Nº 8, en el que y' representa un número entero que es 1 ó 19; y

c)

ADN que es complementario de un ADN capaz de hibridar con el ADN de a) o b), en el que las condiciones de hibridación incluyen un prelavado con 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y una hibridación a 55ºC y 5 X SSC hasta el día siguiente;

y en el que dicho segundo polipéptido está codificado por un ADN seleccionado del grupo que comprende:

a')

ADN que codifica para un polipéptido que comprende los aminoácidos x-356 de la SEC ID Nº 2, en el que x es un número entero entre 1 y 15, ambos inclusive; y

b')

ADN que codifica para un polipéptido que comprende los aminoácidos x'-356 de la SEC ID Nº 6, en el que x' es un número entero que es 1 ó 15; y

c')

ADN que es complementario de un ADN capaz de hibridar con el ADN de a') o b'), en el que las condiciones de hibridación incluyen un prelavado con 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y una hibridación a 55ºC y 5 X SSC hasta el día siguiente.

3. Un polipéptido que comprende al menos un polipéptido IL-1Rrp1 unido a al menos un polipéptido AcPL, en el que el polipéptido IL-1Rrp1 comprende el polipéptido de la SEC ID Nº 4, y el polipéptido AcPL comprende el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

4. El polipéptido según la reivindicación 3, en el que el polipéptido IL-1Rrp1 y el polipéptido AcPL están unidos mediante un conector peptídico.

5. Un polipéptido que comprende al menos un polipéptido IL-1Rrp1 unido a al menos un polipéptido AcPL, en el que el polipéptido IL-1Rrp1 comprende un polipéptido con los aminoácidos y-329 de la SEC ID Nº 4, en el que y representa un número entero que es 1 ó 20; y SEC ID Nº 4; y el polipéptido AcPL comprende un polipéptido con los aminoácidos x-356 de la SEC ID Nº 2, en el que x es un número entero entre 1 y 15, ambos inclusive.

6. Un polipéptido que comprende al menos un polipéptido IL-1Rrp1 unido a al menos un polipéptido AcPL, en el que el polipéptido AcPL comprende un polipéptido que es idéntico en al menos el 80% a un polipéptido con los aminoácidos x-356 de la SEC ID Nº 2, en el que x es un número entero entre 1 y 15, ambos inclusive; y en el que el polipéptido IL-1Rrp1 comprende un polipéptido que es idéntico en al menos el 80% a un polipéptido IL-1Rrp1, polipéptido que comprende un polipéptido con los aminoácidos y-329 de la SEC ID Nº 4, en el que y representa un número entero que es 1 ó 20; y en el que el % de identidad se determina usando el programa GAP.

7. Un polipéptido con una fórmula seleccionada del grupo constituido por:

R_{1}-L_{1}:R_{2}-L_{2}, R_{2}-L_{2}:R_{1}-L_{1}, R_{1}-L_{2}:R_{2}-L_{1}, R_{2}-L_{1}:R_{1}-L_{2} R_{1}-L_{1}:R_{2}-L_{2}

R_{1}-L_{1}:R_{2}-L_{2}/ R_{2}-L_{2}:R_{1}-L_{1} y R_{1}-L_{2}:R_{2}-L_{1}/R_{2}-L_{1}:R_{1}-L_{2}

en las que L_{1} es un fragmento de una cadena pesada de una inmunoglobulina; L_{2} es un fragmento de una cadena ligera de una inmunoglobulina; R_{1} es AcPL o un fragmento de AcPL; R_{2} es IL-1Rrp1 o un fragmento de IL-1Rrp1; los : son un enlace entre una cadena pesada y una región de anticuerpo de cadena ligera, y / es un enlace entre una cadena pesada y una región de anticuerpo de cadena pesada; y

en el que R_{2} se elige del grupo formado por:

a)

polipéptidos que comprenden los aminoácidos y-329 de la SEC ID Nº 4, en el que y representa un número entero que es 1 ó 20; y

b)

polipéptidos que comprenden los aminoácidos y'-322 de la SEC ID Nº 8, en el que y' representa un número entero que es 1 ó 19;

y en el que dicho R_{1} se elige del grupo formado por:

a')

polipéptidos que comprenden los aminoácidos x-356 de la SEC ID Nº 2, en el que x es un número entero que es 1 ó 15; y

b')

polipéptidos que comprenden los aminoácidos x'-356 de la SEC ID Nº 6, en el que x' es un número entero que es 1 ó 15.

8. Un polipéptido que comprende un primer polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de una cadena ligera de un anticuerpo unido al C terminal de un IL-1Rrp1 soluble o de un AcPL soluble, y un segundo polipéptido de fusión que comprende un polipéptido de una cadena pesada de un anticuerpo unido al C terminal de un AcPL soluble o de un IL-1Rrp1 soluble, en el que dicho primer polipéptido de fusión está unido a dicho segundo polipéptido de fusión mediante puentes de disulfuro entre los polipéptidos de cadena pesada y de cadena ligera; y

en el que el IL-1Rrp1 soluble se selecciona del grupo constituido por:

c)

polipéptidos que comprenden los aminoácidos y-329 de la SEC ID Nº 4, en el que y representa un número entero que es 1 ó 20; y

d)

polipéptidos que comprenden los aminoácidos y'-322 de la SEC ID Nº 8, en el que y' representa un número entero que es 1 ó 19;

y en el que AcPL soluble se elige del grupo formado por:

a')

polipéptidos que comprenden los aminoácidos x-356 de la SEC ID Nº 2, en el que x es un número entero que es 1 ó 15; y

b')

polipéptidos que comprenden los aminoácidos x'-356 de la SEC ID Nº 6, en el que x' es un número entero que es 1 ó 15.

9. Un primer polipéptido con una fórmula seleccionada del grupo constituido por:

R_{1}-L_{1}:R_{2}-L_{2}, R_{2}-L_{2}:R_{1}-L_{1}, R_{1}-L_{2}:R_{2}-L_{1}, R_{2}-L_{1}:R_{1}-L_{2},

R_{1}-L_{1}:R_{2}-L_{2}/ R_{2}-L_{2}:R_{1}-L_{1} y R_{1}-L_{2}:R_{2}-L_{1}/R_{2}-L_{1}:R_{1}-L_{2}

en las que L_{1} es un fragmento de una cadena pesada de una inmunoglobulina; L_{2} es un fragmento de una cadena ligera de una inmunoglobulina; R_{1} es un fragmento de AcPL; R_{2} es un fragmento de IL-1Rrp1; los : son un enlace entre una cadena pesada y una región de anticuerpo de cadena ligera, y / es un enlace entre una cadena pesada y una región de anticuerpo de cadena pesada, en el que el fragmento AcPL es una parte de la región extracelular de un polipéptido AcPL natural con los aminoácidos 1-356 de la SEC ID Nº 6; y el fragmento IL-1Rrp1 es una parte de la región extracelular de un polipéptido IL-1Rrp1 natural con los aminoácidos 1-329 de la SEC ID Nº 4, en la que el primer polipéptido se une a la IL-18 con una afinidad mayor que el IL-1Rrp1 aislado.

10. Una molécula de ADN aislado seleccionado entre:

a)

ADN que codifica para el polipéptido de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9; y

b)

ADN que es complementario de un ADN capaz de hibridar con el ADN de a), en el que las condiciones de hibridación incluyen un prelavado con 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y una hibridación a 55ºC y 5 X SSC hasta el día siguiente

11. Un vector de expresión recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ADN de la reivindicación 10.

12. Un procedimiento para preparar un polipéptido, procedimiento que comprende cultivar una célula hospedadora transformada con cualquiera de los vectores de expresión de la reivindicación 11 en condiciones que promuevan la expresión del polipéptido.

13. Un procedimiento para preparar un polipéptido de la reivindicación 8, procedimiento que comprende cultivar una célula hospedadora cotransfectada con un primer vector de expresión que codifica para dicho primer polipéptido de fusión y con un segundo vector de expresión que codifica para dicho segundo polipéptido de fusión en condiciones que promuevan la expresión de dichos primer y segundo polipéptidos de fusión.

14. Una composición que comprende un polipéptido de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 y un diluyente o vehículo adecuado.

15. La composición de la reivindicación 14 para su uso en la inhibición de los efectos de la IL-18 para el tratamiento de patologías inflamatorias y/o autoinmunes atribuibles a la señalización de la IL-18.

16. Un polipéptido que comprende al menos un primer polipéptido unido a al menos un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende una parte de la región extracelular de un polipéptido IL-Rrp 1 natural con los aminoácidos 1-329 de la SEC ID Nº 4, y el segundo polipéptido comprende una parte de la región extracelular de un polipéptido AcPL natural con los aminoácidos 1-356 de la SEC ID Nº 2, en el que el polipéptido se une a la IL-18 con una afinidad mayor que el primer polipéptido aislado.