JP2002500886A - Ｉｌ−１８受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＩＬ−１８受容体として機能するポリペプチドを開示する。該受容体はマルチマーであり、少なくとも１個のＡｃＰＬポリペプチドまたはそのフラグメントおよび少なくとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。該受容体はＩＬ−１８を結合し、ＩＬ−１８によって媒介される生物学的活性を阻害する場合に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、ＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーであるタンパク質に関する。
より詳しくは、本発明は、高親和性ＩＬ−１８結合および活性を媒介し、更には
、ＩＬ−１８に媒介される活性を阻害するＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ受容
体複合体に関する。

【０００２】 関連技術の説明 Ｉ型インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１ＲＩ）は、前炎症性サイトカイン
であるインターロイキン−１の生物学的作用を媒介する（Ｓｉｍｓら，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４１：５８５−５８９，１９８８；Ｃｕｒｔｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３０４５−３０４９，１９８９）。も
う一つのインターロイキン−１受容体（ＩＩ型ＩＬ−１ＲまたはＩＬ−１ＲＩＩ
と称される）はＩＬ−１を結合するが、シグナル伝達を媒介しているとは考えら
れない（ＭｃＭａｈａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１；Ｓｉｍ
ｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６１５５−６１
５９，１９９３）。ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩはそれぞれ、ＩＬ−１α
およびＩＬ−１βを結合する。ＩＬ−１は、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾
患などの慢性炎症性疾患に関与している。ＩＬ−１が骨粗鬆症においてある役割
を果たしていることは益々明らかである。これら活性は全て、Ｉ型ＩＬ−１Ｒの
細胞質部分のシグナリング機能によって開始される。ＩＬ−１ｒａは、Ｉ型ＩＬ
−１受容体に結合することによってＩＬ−１の活性を阻害し、それによってＩＬ
−１αおよびＩＬ−１βへの接近を阻止するが、それ自体の生物学的応答を導く
ことはない。

【０００３】 ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩは、有意の配列相同性を示すタンパク質の
ファミリーに属する。一つのこのようなタンパク質は、Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３７５７−１３７６５，１９９５）に記
載のＩＬ−１Ｒ補助タンパク質（ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰ）である。このタンパク質
だけではＩＬ−１を結合できないが、ＩＬ−１ＲＩとＩＬ−１αおよびＩＬ−１
βと一緒に複合体を形成する。ＩＬ−１ＲＩと一緒に同時発現された場合、組換
え体ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰは、ＩＬ−１βへのＩＬ−１ＲＩの結合親和性を増加さ
せる（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒら，上記）。

【０００４】 ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１ＲＩＩファミリーに配列相同性を示すもう一つの
タンパク質は、ＩＬ−１受容体関連タンパク質Ｉ（ＩＬ−１ＲｒｐＩ）である（
Ｐａｒｎｅｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：３９６７，１９９６および
Ｔｏｒｉｇｏｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２：２５７３７，１９９７を
参照されたい）。尚もう一つのこのようなタンパク質はＡｃＰＬである。

【０００５】 ＩＬ−１８は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの同族体であり、ＩＬ−１によっ
て活性化される同様の応答の多くを活性化することが知られている。例えば、Ｉ
Ｌ−１８を用いて刺激された細胞は、ＮＦκＢを活性化し、既知の炎症メディエ
ーターを生じる。ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞の成長および分化の刺激薬として作
用し、Ｔｈ１細胞からのγインターフェロン生産の強力な誘導物質である。ヘル
パーＴ細胞のＴｈ１細胞は、炎症反応を媒介することが知られている。ＩＬ−１
８は、ＮＫ細胞致死活性を増大させ、敗血症性ショック、肝臓破壊、炎症性腸疾
患および糖尿病に関与している。

【０００６】 最近、ＩＬ−１ＲｒｐＩはＩＬ−１８に結合し、トランスフェクションされた
細胞中でのＩＬ−１８シグナリングを媒介することが示された。しかしながら、
ＩＬ−１８へのＩＬ−１ＲｒｐＩ結合親和性は極めて低いので、１種類またはそ
れ以上の追加の受容体または受容体サブユニットはＩＬ−１８の結合およびシグ
ナリングに関与すると考えられる。

【０００７】 したがって、ＩＬ−１８の追加の受容体の識別が望まれる。このような受容体
タンパク質を研究して、それらがＩＬ−１８を結合するか否か、そして結合する
ならば、それら受容体がシグナル伝達の媒介においてある役割を果たしているか
どうか確認することができる。更に、このような受容体の可溶性の形を用いて、
ＩＬ−１８活性を阻害し、そしてＩＬ−１８シグナリングに起因する炎症性およ
び／または自己免疫疾患をいずれも改善することができる。ＩＬ−１８に関して
可能性のある更に別の親和性変換サブユニットの存在も探求することができる。

【０００８】 発明の概要 本発明は、本明細書中においてＩＬ−１８受容体複合体と称される受容体ポリ
ペプチドを提供する。より詳しくは、本発明は、ＡｃＰＬポリペプチドまたはそ
のフラグメントおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを
含むマルチマー受容体ポリペプチドを提供する。そのＡｃＰＬポリペプチドは、
任意の適当な手段によってＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドに共有結合していてよ
いしまたは非共有結合していてよい。このような手段には、架橋試薬、ポリペプ
チドリンカーによる、およびジスルフィド結合によるまたはロイシンジッパーの
使用によるような結合が含まれる。本発明の一つの実施態様において、受容体は
、組換えＤＮＡ技術によって生産される融合タンパク質である。本発明のこのマ
ルチマー受容体は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独の場合より大きい親和性でＩＬ−１８
を結合する。ＩＬ−１８によって媒介される障害は、このような障害に苦しむ患
者に治療的有効量の本発明の受容体を投与することによって治療することができ
る。

【０００９】 発明の詳細な記述 本発明は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の同時発現が、ＩＬ−１８を用い
て刺激された細胞中においてＮＦκＢ活性を劇的に増大させるという知見に基づ
いている。ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独ではＩＬ−１８を弱くしか結合しないし、Ａｃ
ＰＬはＩＬ−１８を結合しないので、同時発現されたＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒ
ｒｐ１によるＮＦκＢ活性の増大は、これらポリペプチドがＩＬ−１８受容体複
合体のサブユニットであることを示している。本発明により、ＩＬ−１８受容体
複合体と称される新規ポリペプチドを提供する。好都合には、ＩＬ−１Ｒｒｐ１
およびＡｃＰＬまたはそれらのフラグメントを含むこのようなダイマーＩＬ−１
８受容体複合体は、ＩＬ−１８の前炎症作用を含めたＩＬ−１８活性を阻害する
のに有用であり、同一細胞中で同時発現されるタンパク質として、または受容体
サブユニットとしてのＡｃＰＬに結合したＩＬ−１Ｒｒｐ１としてＩＬ−１Ｒｒ
ｐ１およびＡｃＰＬを含むことができる。好ましくは、それらサブユニットは共
有結合によって結合している。それらサブユニットは、架橋試薬またはポリペプ
チドリンカーなどによる任意の適当な手段によって共有結合していてよい。

【００１０】 本発明の一つの実施態様において、受容体は、組換えＤＮＡ技術によって生産
される融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１
：Ｆｃ融合タンパク質をコードしているＤＮＡおよびＡｃＰＬ：Ｆｃ融合タンパ
ク質をコードしているＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクションし、同一細胞
中でそれらダイマーを同時発現させることによって製造することができる。

【００１１】 或いは、ＡｃＰＬ／ＩＬ−１Ｒｒｐ１ダイマーは、受容体サブユニットの一方
を免疫グロブリン重鎖の定常領域に融合し、もう一方の受容体サブユニットを免
疫グロブリン軽鎖の定常領域に融合することによって製造することができる。例
えば、ＡｃＰＬタンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ₁−ヒンジ−ＣＨ₂−ＣＨ₃領 域に融合することができ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質は、Ｉｇκ軽鎖のＣκ領
域に融合させることができ、逆の場合も同じである。免疫グロブリン軽鎖融合タ
ンパク質および免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードしているＤＮＡを用
いてトランスフェクションされた細胞は、ＡｃＰＬ融合タンパク質およびＩＬ−
１Ｒｒｐ１融合タンパク質を含有する重鎖／軽鎖ヘテロダイマーを発現する。重
鎖間のジスルフィド結合により、それらヘテロダイマーは、マルチマー、主にテ
トラマーを与えるように更に結合する。好都合には、２個のホモダイマーの場合
、重鎖または軽鎖融合が発現され、このようなホモダイマーはヘテロダイマーか
ら容易に分離することができる。

【００１２】 ＩＬ−１８受容体タンパク質複合体に加えて、本発明は、ヘテロマーポリペプ
チドをコードしている単離されたＤＮＡ、ヘテロマーポリペプチドをコードして
いるＤＮＡを含有する発現ベクター、およびこのような発現ベクターを用いてト
ランスフェクションされた宿主細胞を包含する。可溶性の形のタンパク質を含め
た組換え体ＩＬ−１８受容体の製造方法も開示する。新規ポリペプチドと免疫反
応性の抗体も、本明細書中において提供する。

【００１３】 本発明の一つの実施態様において、ヘテロマーＩＬ−１８受容体のポリペプチ
ドサブユニットには、配列番号：２または配列番号：６に記載の少なくとも１個
のＡｃＰＬサブユニット、および配列番号：４または配列番号：８に記載の少な
くとも１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１サブユニットが含まれる。これらポリペプチドを
コードしているＤＮＡは、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：３および配
列番号：７にそれぞれ示される。配列番号：１によってコードされるＡｃＰＬサ
ブユニットタンパク質には、１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：２の
残基１−１４）を含む３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：２のＮ末端
からＣ末端への残基１−３５６）；２５アミノ酸の膜貫通領域（残基３５７−３
８１）および２１８アミノ酸の細胞質ドメイン（残基３８２−５９９）が含まれ
る。配列番号：５によってコードされるＡｃＰＬサブユニットタンパク質には、
１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：６の残基１−１４）を含む３５６
アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：６の残基１−３５６）；２４アミノ酸の
膜貫通領域（残基３５７−３８０）およびアミノ酸残基３８１−６１４の細胞質
ドメインが含まれる。配列番号：３によってコードされるＩＬ−１Ｒｒｐ１サブ
ユニットタンパク質には、１９アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号：４の残
基１−１９）を含む３２９アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号：４の残基１−
３２９）；２１アミノ酸の膜貫通領域（配列番号：４の残基３３０−３５０）；
およびアミノ酸残基３５１−５４１の細胞質ドメインが含まれる。配列番号：７
によってコードされるＩＬ−１Ｒｒｐ１サブユニットタンパク質には、１８アミ
ノ酸のシグナルペプチド（配列番号：８の残基１−１８）を含む３２２アミノ酸
の細胞外ドメイン（配列番号：８の残基１−３２２）；２５アミノ酸の膜貫通領
域（配列番号：８の残基３２３−３４７）；およびアミノ酸残基３４８−５３７
の細胞質ドメインが含まれる。更に、ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、米国特許第５，７７
６，７３１号に記載されているし、ＡｃＰＬは、本明細書中に援用される同時係
属出願Ｓ／Ｎ６０／０７８，８３５号およびＳ／Ｎ６０／０７２，３０１号に記
載されている。

【００１４】 好ましくは、ダイマーＩＬ−１８受容体のポリペプチドサブユニットは、所望
の活性を有するヘテロマー複合体を一緒に形成するＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃ
ＰＬポリペプチドの可溶性フラグメントである。このようなポリペプチドには、
タンパク質の膜貫通領域および細胞質ドメインの全部または一部分を欠いたもの
が含まれる。したがって、例えば、本発明のヘテロマー受容体複合体には、配列
番号：２または配列番号：６の細胞外ドメインである少なくとも１個のサブユニ
ットおよび配列番号：４または配列番号：８の細胞外ドメインである少なくとも
１個のサブユニットが含まれうる。ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のこれら可
溶性細胞外ドメインは、それらのシグナルペプチドを含むことができるしまたは
除外することができる。したがって、もう一つの実施態様において、ヘテロマー
ＩＬ−１８受容体には、配列番号：２または配列番号：６のアミノ酸残基１−３
５６または残基１５−３５６、および配列番号：４のアミノ酸残基１−３２９ま
たは残基２０−３２９または配列番号：８のアミノ酸残基１−３２５または残基
１９−３２２が含まれる。シグナル配列を含むことの妥当性は、融合タンパク中
のＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１の位置および組換えＤＮＡ技術によって受容
体が生産される予定の宿主細胞のような因子に依る。好ましい実施態様において
、可溶性ＡｃＰＬまたは可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントの一方をコードし
ているＤＮＡ構築物を、免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードしているＤＮＡ
に融合し、可溶性ＡｃＰＬまたは可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントのもう一
方をコードしているＤＮＡ構築物を、免疫グロブリン軽鎖の定常領域をコードし
ているＤＮＡに融合する。

【００１５】 或いは、ＩＬ−１８受容体は、ＡｃＰＬまたは可溶性ＡｃＰＬフラグメントと
一緒に非共有結合によって複合体を形成したＩＬ−１Ｒｒｐ１または可溶性ＩＬ
−１Ｒｒｐ１フラグメントを含んでいてよい。ＩＬ−１Ｒｒｐ１のＡｃＰＬへの
非共有結合は、ＩＬ−１８を結合する受容体の能力を妨げない任意の適当な手段
によって得ることができる。一つのアプローチにおいて、最初の化合物をＩＬ−
１Ｒｒｐ１に結合し、その最初の化合物に非共有結合するであろうもう一つの化
合物をＡｃＰＬに結合する。このような化合物の例は、ビオチンおよびアビジン
である。例えば、ビオチンとアビジンとの非共有結合相互作用によって受容体が
形成される。本発明の一つの実施態様において、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰ
Ｌは組換え体ポリペプチドであり、それぞれ組換え体細胞から精製された後、互
いに非共有結合して受容体を形成する。宿主細胞は、二つの異なった発現ベクタ
ーを用いて形質転換することができるので、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは
両方とも、組換え体宿主細胞によって生産される。このような形質転換された宿
主細胞によって生産されるＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは、非共有結合相互
作用によって複合体を形成するように結合することができる。このような形質転
換された細胞が、膜に結合した形のタンパク質を発現する場合、このような細胞
は、競合検定を含めた種々の検定で有用である。

【００１６】 実施例１に記載の結合検定は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独、ＡｃＰＬ単独、および
ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの組合せを用いてトランスフェクションされた
細胞からの上澄みによるＩＬ−１８の結合を比較する。ＩＬ−１Ｒｒｐ１および
ＡｃＰＬを同時発現する細胞からの上澄みは、高レベルのＩＬ−１８結合を示し
；ＩＬ−１Ｒｒｐ１だけを発現する細胞からの上澄みは、低レベルのＩＬ−１８
結合を示し；そしてＡｃＰＬだけを用いてトランスフェクションされた細胞から
の上澄みは、ＩＬ−１８を結合しない。実施例２に記載のＮＦκＢ誘導検定は、
ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独でトランスフェクションされた細胞およびＡｃＰＬ単独で
トランスフェクションされた細胞が、ＩＬ−１８刺激に応答しないことを示して
いる。しかしながら、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬ両方を用いて同時トラン
スフェクションされ且つＩＬ−１８を用いて刺激された細胞は、ＮＦκＢ誘導を
大きく増大させた。

【００１７】 本明細書で用いられる用語ＩＬ−１Ｒｒｐ１及びＡｃＰＬは、所望の生物学的
活性を有する天然のタンパク質の変異体及び短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏ
ｒｍ）を含む。天然の配列の１つ又は複数のアミノ酸の付加、置換又は削除によ
って産生される変異体は、後ほどより詳細に論ずる。

【００１８】 上述したように、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１および可溶性ＡｃＰＬポリペプチド
は、いくつかの用途に好適である。本発明の文脈中で用いられる“可溶性ＩＬ−
１Ｒｒｐ１”とは、天然のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドの細胞外領域の全部ま
たは一部分とアミノ酸配列がほぼ同様であり、しかも細胞膜上にポリペプチドを
保持させると考えられる膜貫通領域を欠いているために、発現時に分泌されるポ
リペプチドを意味する。適当な可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、所望の
生物学的活性を保持する。可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、その可溶性ＩＬ−１Ｒｒ
ｐ１が分泌されうるという条件ならば、膜貫通領域の一部分または細胞質ドメイ
ンの一部分または他の配列も含んでいてよい。

【００１９】 同様に、本明細書中で用いられる“可溶性ＡｃＰＬ” という用語は、天然の ＡｃＰＬポリペプチドの細胞外領域の全部または一部分とアミノ酸配列がほぼ同
様であり、しかも発現時に分泌されるが、所望の生物学的活性を保持しているタ
ンパク質を意味する。可溶性ＡｃＰＬは、そのポリペプチドが分泌されるのであ
れば、膜貫通領域、細胞質ドメイン、または他の配列の一部分を含んでいてよい
。

【００２０】 一つの実施態様において、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬポリペプチ
ドには、細胞外ドメイン全体が含まれる。分泌されるためには、それら可溶性ポ
リペプチドは、天然のシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドを含む。し
たがって、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドの例は、配列番号：４のアミノ
酸１−３２９（ヒトＩＬ−１Ｒｒｐ１）および配列番号：８のアミノ酸１−３２
２（ネズミＩＬ−１Ｒｒｐ１）を含む。可溶性ＡｃＰＬポリペプチドの例は、配
列番号：２のアミノ酸１−３５６（ヒトＡｃＰＬ）および配列番号：６のアミノ
酸１−３５６（ネズミＡｃＰＬ）を含む。

【００２１】 抗体Ｆｃ領域ポリペプチドに融合した配列番号：４のＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞
外ドメインおよびＦｃ領域ポリペプチドに融合したＡｃＰＬの細胞外ドメインを
含む可溶性融合タンパク質を実施例１に記載する。

【００２２】 可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、所望のタンパク質を発現す
るそのままの細胞を、例えば遠心分離によって培地から分離し、所望のタンパク
質の存在についてその培地（上澄み）を検定することによって確認する（そして
、その非可溶性膜結合対応物と識別する）ことができる。その培地は、以下の実
施例に記載されたのと同様または同一である手順を用いて検定することができる
。培地中のＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１の存在は、そのタンパク質が細胞か
ら分泌されたこと、したがって、可溶性の形の所望のタンパク質であることを示
している。可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１は、これらタンパク質
の天然に存在する形であってよい。或いは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タ
ンパク質の可溶性フラグメントは、以下に記載のように、組換えＤＮＡ技術によ
って製造することができるしまたはそれ以外の場合は単離することができる。

【００２３】 可溶性の形のＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの使用は、いくつかの用途に好
都合である。組換え体宿主細胞からのタンパク質の精製は、可溶性タンパク質が
それら細胞から分泌されるので容易になる。更に、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およ
びＡｃＰＬタンパク質を含む本発明の受容体は、概して、静脈内投与に一層適し
ている。

【００２４】 ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬタンパク質のいろいろなドメインおよびシグ
ナルペプチドについての前述の考察に関して、当業者は、タンパク質のこのよう
な領域の上記境界がおおよそのものであることを認識するであろう。例えば、シ
グナルペプチドの切断部位を予測する計算機プログラムが利用可能であるが、予
測される部位以外の部位で切断が起こることがありうる。更に、タンパク質標品
は、２ヶ所以上の部位でのシグナルペプチドの切断のために、異なったＮ末端ア
ミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含むことがありうるということが確認
されている。したがって、細胞外ドメインを含む可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１および
ＡｃＰＬポリペプチドには、細胞外ドメインのＣ末端として上で確認されるもの
とは異なることがありうるＣ末端アミノ酸を有するものが含まれる。更に、用い
られる特定の発現系によって異なることがありうる翻訳後プロセシングは、異な
ったＮ末端を有するタンパク質を生じるかもしれない。所望の生物学的活性を保
持しているこのような変異体は、本明細書中で用いられる“ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポ
リペプチド” および“ＡｃＰＬポリペプチド”という用語によって包含される 。

【００２５】 可溶性ポリペプチドを含めて切断されたＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬは、
多数の慣用的な技術のいずれによっても製造することができる。組換え体タンパ
ク質の場合、所望のフラグメントをコードしているＤＮＡフラグメントは、発現
ベクター中にサブクローン化することができる。或いは、所望のＤＮＡ配列は、
既知の技術を用いて化学的に合成することができる。ＤＮＡフラグメントは、完
全長さのクローン化されたＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によって製
造され、そしてアガロースゲル上の電気泳動によって単離することができる。１
ヶ所または複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有するリンカーは、所望
のＤＮＡフラグメントを発現ベクター中に挿入するのに用いることができるし、
またはそこに天然に存在する切断部位でそのフラグメントを消化することができ
る。ＤＮＡフラグメントのＮ−またはＣ末端を所望の地点まで再構築するオリゴ
ヌクレオチドを合成することができる。そのオリゴヌクレオチドは、所望のコー
ディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有し且つそのコーデ
ィング配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を置くことができる。

【００２６】 周知のポリメラーゼ連鎖反応手順を用いて、所望のタンパク質フラグメントを
コードしているＤＮＡ配列を単離することもできる。そのフラグメントの所望の
末端を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、このようなポリメラーゼ連鎖反応
において用いられる。いずれの適当なＰＣＲ手順も用いてよい。一つのこのよう
な手順は、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）に記載
されている。もう一つは、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌ
ｏｇｙ，Ｗｕら監修，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，サン・ディエ
ゴ（１９８９），１８９−１９６頁に記載されている。概して、ＰＣＲ反応は、
適当な緩衝化溶液中において、５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを
鋳型ＤＮＡ（この場合、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬ ＤＮＡ）および４種
類のデオキシヌクレオチド三リン酸それぞれと結合することを行う。その溶液を
加熱し（例えば、９５℃−１００℃）、二本鎖ＤＮＡ鋳型を変性させた後、ＤＮ
Ａポリメラーゼ酵素を加える前に冷却する。所望のＤＮＡフラグメントを増幅さ
せるために、多数の反応サイクルを行う。

【００２７】 ＡｃＰＬポリペプチドを、共有結合または非共有結合によってＩＬ−１Ｒｒｐ
１ポリペプチドに結合する。共有結合は、非共有結合とは反対に、概して共有結
合によって与えられる増大した安定性を考えると、いくつかの用途に、例えば、
in vivo 使用に好適である。本発明の受容体を構築する場合、共有結合は、架橋
試薬、ペプチドリンカーまたは任意の他の適当な技法によって得ることができる
。

【００２８】 一つのタンパク質分子をもう一つに架橋するのに有用な多数の試薬が知られて
いる。ヘテロ二官能性およびホモ二官能性リンカーは、この目的のために、例え
ば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ロックフォード，イリ
ノイ州から入手可能である。このようなリンカーは、アミノ酸側鎖上のいくつか
の官能基と反応するであろう２種類の官能基（例えば、エステルおよび／または
マレイミド）を含有するので、一つのポリペプチドをもう一つに結合する。

【００２９】 本発明において用いることができるペプチドリンカーの一つの種類は、ＡｃＰ
ＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ドメインを、それぞれのドメインが適当に折りたたま
れ、所望の生物学的活性に必要な二次および三次構造を確実にする充分な距離ま
で隔てる。そのリンカーは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の細胞外ドメイン
に適当な空間的配向をとらせて、ＩＬ−１８の結合部位も形成させるはずである
。

【００３０】 適当なペプチドリンカーは、当業者に知られており、慣用的な技法によって用
いることができる。適当なペプチドリンカーの中には、本明細書中に援用される
米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されたも
のがある。ペプチドリンカーは、一つのポリペプチドをもう一つのポリペプチド
に結合させるのに用いられる慣用法のいずれによっても結合させることができる
。上記のＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能な架橋
試薬は、用いることができるものに含まれる。このような試薬と反応性の側鎖を
有するアミノ酸は、ペプチドリンカー中に、例えばその末端に含まれていてよい
。好ましくは、ペプチドリンカーによってＩＬ−１Ｒｒｐ１に結合したＡｃＰＬ
を含む融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって製造される。

【００３１】 本発明の一つの実施態様において、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を、免疫
グロブリンに由来するポリペプチドによって結合させる。抗体由来ポリペプチド
のいろいろな部分（Ｆｃドメインを含めた）に融合した異種ポリペプチドを含む
融合タンパク質の製造は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ
８８：１０５３５，１９９１）およびＢｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７
７，１９９０）によって記載されている。一つの例として、抗体のＦｃ領域に由
来するポリペプチドは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１のＣ末端に結合することができる。別
のＦｃポリペプチドをＡｃＰＬのＣ末端に結合する。ジスルフィド結合は、それ
ら二つのＦｃポリペプチド間に（例えば、鎖間ジスルフィド結合が、通常は抗体
分子中に存在している、いわゆるヒンジ領域中に）形成して、ＩＬ−１Ｒｒｐ１
／Ｆｃ融合タンパク質に結合したＡｃＰＬ／Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロダ
イマーが生じる。好都合には、二つの異なった発現ベクター、すなわち、可溶性
ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃをコードしている一つおよび可溶性ＡｃＰＬ／Ｆｃをコ
ードしているもう一つを用いて宿主細胞を同時トランスフェクションする。その
ヘテロダイマーは、細胞内にまたは分泌中に形成すると考えられる。

【００３２】 本明細書中で用いられる“Ｆｃポリペプチド”という用語には、天然のおよび
突然変異タンパク質の形、更には、ダイマー化を促進するヒンジ領域を含有して
切断されたＦｃポリペプチドが含まれる。ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に由来す
る単鎖ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ（登録商標）クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，ラホヤ，ＣＡ）中にクローン化されて、ｈＩｇＧ１Ｆｃと称
する組換え体ベクターを生じることができる。独特のＢｇＩＩＩ部位は、挿入さ
れたＦｃをコードしている配列の５’末端付近に位置している。ＳｐｅＩ部位は
、停止コドンのすぐ下流である。ｃＤＮＡによってコードされているＦｃポリペ
プチドは、Ｎ末端ヒンジ領域から天然のＣ末端まで伸長している、すなわち、完
全長さ抗体Ｆｃ領域である。このＦｃポリペプチドの一つの適当な突然変異タン
パク質は、本明細書中に援用される米国特許出願第０８／０９７，８２７号に記
載されている。その突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に関して減少した親和性
を示す。

【００３３】 ジスルフィド結合によって結合した２個のＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃポリペプチ
ドまたは２個のＡｃＰＬ／Ｆｃポリペプチドを含むホモダイマーも、本明細書中
に開示されたトランスフェクションされた宿主細胞のいくつかによって生産され
る。それらホモダイマーは、寸法の違いによって（例えば、ゲル電気泳動によっ
て）互いにおよびヘテロダイマーから分離することができる。ヘテロダイマーも
、逐次イムノアフィニティークロマトグラフィー（以下に記載される）によって
精製することができる。

【００３４】 本発明のＩＬ−１８受容体複合体には、抗体軽鎖の定常領域（またはそのフラ
グメント）および抗体重鎖の定常領域（またはそのフラグメント）の融合タンパ
ク質が含まれる。重鎖の定常領域には、軽鎖と結合するＣＨ₁、ヒンジ領域、お よび重鎖分子のダイマー化に関与するＣＨ₂およびＣＨ₃ドメインを含めたその定
常領域ドメインの４種類全部またはそれらドメインの一部分が含まれうる。前述
の融合タンパク質の範囲内にあるのは、重鎖／軽鎖ダイマーをそれぞれの重鎖領
域間のジスルフィド結合によって結合する二つのダイマーによって形成されるテ
トラマーがある。

【００３５】 免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドに関して、κファミリーおよびλファミリー
のポリペプチドは、本発明の実施に適している。したがって、ＩｇＭ、ＩｇＤ、
ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含めた免疫グロブリンダイマーまたはテトラマー
のいずれの種類も、本発明のヘテロマー分子の基準でありうる。

【００３６】 本発明により、機能性ヘテロマーポリペプチドは、通常は互いに結合する多数
の重鎖および多数の軽鎖の分子間の結合によって製造することができる。例えば
、ヒトＩｇＧ１の定常領域は、ヒト軽鎖κの定常領域（Ｃκと称される）と結合
するであろう。ｈＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列は報告されている（Ｅｌｌｉ
ｓｏｎ，ＪＷ，Ｂｅｒｓｏｎ，ＢＪおよびＨｏｏｄ，ＬＥ １９８２）。ヒト免
疫グロブリンＣγ１遺伝子のヌクレオチド配列は報告されている（Ｎｕｃ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１およびＷａｌｌｓ，ＭＡ，Ｈｓｉａｏ，ＫＣお
よびＨａｒｒｉｓ，ＬＪ １９９３）。ヒト定常領域を含むＰＣＲ増幅免疫グロ
ブリン可変ドメインの発現のためのベクターは開示されている（Ｎｕｃ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２１：２９２１）。ヒト軽鎖ｃκの配列も報告されている（Ｓｈ
ｕｆｏｒｄ，Ｗ，Ｒａｆｆ，ＨＶ，Ｆｉｎｌｅｙ，ＪＷ，Ｅｓｓｅｌｓｔｙｎ，
ＪおよびＨａｒｒｉｓ，ＬＪ．１９９１）。ＩｇＧオリゴマー化への軽鎖Ｖ領域
重複の作用および in vivo 効力。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７２４およびＳｔ ｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ，Ｋｒａｆｔ，ＤおよびＶａｌｅｎｔａ，Ｒ（１９９６
）。アレルギー患者からの組合せＩｇＥライブラリーの構築。主要チモシー草花
粉アレルゲンに関して特異性を有するヒトＩｇＥ Ｆａｂの単離および特性決定
。Ｐｈ１ ｐ５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１０９７２）。

【００３７】 重鎖および軽鎖の抗体領域を含むＩＬ−１８受容体実施態様は、式 Ｒ₁−Ｌ₁：Ｒ₂−Ｌ₂またはＲ₂−Ｌ₂：Ｒ₁−Ｌ₁または Ｒ₁−Ｌ₂：Ｒ₂−Ｌ₁またはＲ₂−Ｌ₁：Ｒ₁−Ｌ₂ Ｒ₁−Ｌ₁：Ｒ₂−Ｌ₂／Ｒ₂−Ｌ₂：Ｒ₁−Ｌ₁または Ｒ₁−Ｌ₂：Ｒ₂−Ｌ₁／Ｒ₂−Ｌ₁：Ｒ₁−Ｌ₂ （式中、Ｌ₁は免疫グロブリン重鎖フラグメントであり、そのＮ末端は、少なく ともＣ_H１領域によって伸長し；Ｌ₂は免疫グロブリン軽鎖フラグメントであり；
Ｒ₁はＡｃＰＬまたはＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ₂はＩＬ−１Ｒｒｐ１また
はＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；：は重鎖および軽鎖の抗体領域間の結
合であり、そして／は重鎖および重鎖の抗体領域間の結合である） によって示される融合タンパク質である。ダイマーの場合、得られた融合ポリペ
プチドは、重鎖／軽鎖によって結合した二つの受容体サブユニットを含む。テト
ラマーの場合、その融合タンパク質は、４個の受容体サブユニットを含み、構造
が抗体に似ていて、ＩＬ−１８結合部位を二価で示す。

【００３８】 前述の融合ポリペプチドを得るために、ヒトＩｇＧ１抗体に由来する抗体重鎖
ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ（ＣＨ₁−Ｈ−ＣＨ₂−ＣＨ₃）を、ｐＤ Ｃ４０９発現ベクター中にクローン化して、ｈＩｇＧ１と称される組換え体ベク
ターを生じることができる。独特のＢｇＩＩＩ部位は、挿入された重鎖をコード
している配列の５’末端付近に位置している。ＮｏｔＩ部位は、停止コドンのす
ぐ下流である。ｃＤＮＡによってコードされている重鎖ポリペプチドは、ＣＨ₁ 領域のＮ末端から天然のＣ末端まで伸長している。抗体軽鎖を得るためには、ヒ
トκ鎖定常領域に由来する単鎖ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡをｐＤＣ
４０９発現ベクター中にクローン化して、ｈＩｇκと称される組換え体ベクター
を生じることができる。この配列は、５’末端で独特のＢｇＩＩＩ部位までおよ
び３’末端で独特のＮｏｔＩ部位まで隣接している。このような抗体ポリペプチ
ドを包含する本発明の実施態様には、抗体軽鎖（またはそのフラグメント）の定
常領域の上流にＡｃＰＬ（またはそのフラグメント）を含む第一融合ポリペプチ
ドおよび抗体重鎖（または重鎖フラグメント）の定常領域の上流にＩＬ−１Ｒｒ
ｐ１を含む第二融合ポリペプチドが含まれ、そのＮ末端は、少なくともＣ_H１領 域によって伸長している。ＡｃＰＬ軽鎖融合ポリペプチドとＩＬ−１Ｒｒｐ１−
重鎖融合ポリペプチドとの間に１個または複数のジスルフィド結合が形成され、
したがって、本発明の受容体が生じる。更に代わるものとして、ＩＬ−１Ｒｒｐ
１−抗体軽鎖融合ポリペプチドを製造し、そしてＡｃＰＬ−抗体重鎖融合ポリペ
プチドを含む融合ポリペプチドと結合させる（にジスルフィド結合させる）。前
述のジスルフィド結合した分子の二つを結合する場合、追加のジスルフィド結合
がそれら二つの抗体領域間に形成される。４個の融合ポリペプチドを含む得られ
た本発明の受容体は、構造が抗体に似ていて、ＩＬ−１８結合部位を二価で示す
。

【００３９】 ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドは、細胞源から別々に精製され
た後、互いに結合させることができる。或いは、組換えＤＮＡ技術を用いて、本
発明の受容体を製造することができる。ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペ
プチドは、別々に製造され、そして引き続き共有結合させるために、形質転換さ
れた宿主細胞から精製することができる。本発明の一つの実施態様において、宿
主細胞は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を別々のポリペプチドとしてコード
する異種ＤＮＡを用いて形質転換／トランスフェクションされる。それら二つの
ポリペプチドは、二つの遺伝子それぞれの開始および停止コドンを含む同じ発現
ベクターによってコードされていてよいし、または組換え体細胞は、二つの別々
の発現ベクターを用いて同時トランスフェクションされてよい。もう一つの実施
態様において、受容体は、組換え体細胞中において融合タンパク質として生産さ
れる。

【００４０】 本発明の一つの実施態様において、受容体タンパク質は、式 Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₂またはＲ₂−Ｌ−Ｒ₁ （式中、Ｒ₁はＡｃＰＬまたはＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ₂はＩＬ−１Ｒｒ
ｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；そしてＬはペプチドリンカー
である） を有する組換え体融合タンパク質である。

【００４１】 本発明の融合タンパク質には、ＡｃＰＬのＣ末端部分がリンカーに融合し、そ
れがＩＬ−１Ｒｒｐ１のＮ末端部分に融合している構築物、およびＩＬ−１Ｒｒ
ｐ１のＣ末端部分がリンカーに融合し、それがＡｃＰＬのＮ末端部分に融合して
いる構築物も含まれる。ＡｃＰＬは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の所望の
生物学的活性を保持している単一タンパク質を生じるような方法で、ＩＬ−１Ｒ
ｒｐ１に共有結合している。融合タンパク質の成分を、それらが存在する順に挙
げる（すなわち、Ｎ末端ポリペプチドを最初に挙げ、続いてリンカー、そして次
に、Ｃ末端ポリペプチド）。

【００４２】 融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、
ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしている別々のＤＮＡフラグメントを
適当な発現ベクター中に挿入するように構築される。ＡｃＰＬをコードしている
ＤＮＡフラグメントの３’末端は、ｍＲＮＡを単一の生物学的に活性な融合タン
パク質に翻訳させる段階のそれら配列の読み枠を用いて、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコ
ードしているＤＮＡフラグメントの５’末端に（リンカーによって）連結される
。或いは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡフラグメントの３’末端は
、ｍＲＮＡを単一の生物学的に活性な融合タンパク質に翻訳させる段階のそれら
配列の読み枠を用いて、ＡｃＰＬをコードしているＤＮＡフラグメントの５’末
端に（リンカーによって）連結される。Ｎ末端シグナル配列をコードしているＤ
ＮＡ配列は、Ｎ末端ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列上で保持されうる
が、次の（Ｃ末端）ＤＮＡ配列まで通読するのを妨げると考えられる停止コドン
は排除される。逆に、翻訳を終結させるのに必要な停止コドンは、次のＤＮＡ配
列上で保持されている。シグナル配列をコードしているＤＮＡは、好ましくは、
Ｃ末端ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列から除去される。

【００４３】 所望のポリペプチドリンカーをコードしているＤＮＡ配列は、任意の適当な慣
用的な技法を用いて、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしているＤＮＡ
配列の間におよびそれらと同様の読み枠中に挿入することができる。例えば、リ
ンカーをコードしていて且つ適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する
化学合成オリゴヌクレオチドは、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードして
いる配列の間に連結することができる。

【００４４】 或いは、化学合成されたＤＮＡ配列は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のど
ちらかの３’末端（停止コドンを含まない）に相補的な配列、続いてリンカーを
コードしている配列、その後に、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１のもう一方の
５’末端に相補的な配列を含有しうる。次に、オリゴヌクレオチドに支配される
突然変異誘発を用いて、そのリンカーをコードしている配列を、ＡｃＰＬおよび
ＩＬ−１Ｒｒｐ１の直接融合を含有するベクター中に挿入する。

【００４５】 本発明は、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびペプチドリンカーを含む上記融
合タンパク質をコードしている単離されたＤＮＡ配列を提供する。本明細書中に
開示されたＡｃＰＬポリペプチドをコードしているＤＮＡも提供するが、それは
、免疫グロブリン由来ポリペプチドに融合したＡｃＰＬポリペプチドをコードし
ているＤＮＡである。本発明によって包含されるＡｃＰＬをコードしているＤＮ
Ａには、例えば、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ
、ゲノムＤＮＡおよびそれらの組合せが含まれる。

【００４６】 本明細書中で更に提供されるのは、単離されたＤＮＡ配列を含有する組換え体
発現ベクターである。“発現ベクター”とは、所望のタンパク質をコードするＤ
ＮＡであって、しかも（１）遺伝子発現において調節の役割を有する１種類また
は複数の遺伝因子、例えば、以下の（２）に機能的に結合したプロモーター、オ
ペレーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻
訳される所望のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列、および（３）適当な転
写および翻訳の開始および終結配列の集合を含む転写単位を含むＤＮＡを発現さ
せるのに用いられる複製可能なＤＮＡ構築物を意味する。プロモーターおよび他
の調節因子の選択は、概して、予定の宿主細胞によって変化する。

【００４７】 それら発現ベクターにおいて、転写または翻訳を制御する調節因子は、概して
、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来する。通常は、複製起
点、および形質転換細胞の認識を容易にする選択遺伝子によって与えられる、宿
主中で複製する能力は、追加的に包含されうる。レトロウイルスに由来するベク
ターも用いることができる。

【００４８】 ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連している場合、機能的に結合され
る。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードしているＤＮＡは、宿
主細胞膜によって分泌される前駆物質としてポリペプチドが発現される場合、そ
のポリペプチドのＤＮＡに機能的に結合され；プロモーターは、コーディング配
列の転写を制御している場合、当該コーディング配列に機能的に結合され；そし
てリボソーム結合部位は、翻訳を可能にするようにコーディング配列が配置され
ている場合、それに機能的に結合される。概して、“機能的に結合される”とは
、隣接している、分泌リーダーの場合、隣接しているおよび読み枠中を意味する
。

【００４９】 形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用い、異種ＤＮＡを用いて形
質転換またはトランスフェクションされている細胞である。本発明の文脈中の異
種ＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしている配列を含む。宿主細胞は、そ
の異種ＤＮＡをクローン化するまたは増幅する目的で形質転換されてよいし、ま
たはタンパク質の生産のために発現ベクターを用いて形質転換されてよい。適当
な宿主細胞には、原核生物、酵母または高等真核生物の細胞が含まれる。細菌、
真菌、酵母および哺乳動物の細胞宿主と一緒に用いるのに適当なクローニングベ
クターおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏ
ｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，エルセビア，ニューヨーク，
１９８５）に記載されており、その関連性のある開示は本明細書中に援用される
。

【００５０】 原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）またはバチルス属が含まれる。原核生物発現ベクターは、概して、１
種類またはそれ以上の表現型選択性マーカー、例えば、抗生物質耐性を与えるま
たは独立栄養要求を与えるタンパク質をコードしている遺伝子、および宿主内で
確実に増幅させるための宿主によって認識される複製起点を含む。形質転換に適
した原核生物宿主の例には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、
並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
）の属内の様々な種が含まれるが、選択の問題として、他のものを用いてもよい
。

【００５１】 細菌用途に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子を含む商業的に入手可能なプラスミドに由来
する選択性マーカーおよび細菌複製起点を含むことができる。このような市販の
ベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，ウプサラ，スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｂｉｏｔｅｃ，マディソン，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。これらｐＢＲ３２
２“主鎖”部分を、適当なプロモーターおよび発現される構造配列と結合する。
大腸菌は、典型的には、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘
導体を用いて形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ ２：９５，１９７
７）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含
有し、これが、形質転換された細胞を識別するための簡単な手段を提供する。

【００５２】 組換え体微生物発現ベクターにおいて一般的に用いられるプロモーターには、
β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａ
ｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら，
Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモ
ーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７，
１９８０；およびＥＰＡ ３６，７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
，４１２頁，１９８２）が含まれる。特に有用な細菌発現系は、ファージλＰ_L プロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱誘導性リプレッサーを用いる。λＰ_Lプロ モーターの誘導体を組み込む、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なプラスミドベクターには、大腸菌株ＪＭＢ
９に内在するプラスミドｐＨＵＢ２（ＡＴＣＣ３７０９２）および大腸菌株ＲＲ
１に内在するｐＰＬｃ２８（ＡＴＣＣ５３０８２）が含まれる。

【００５３】 組換え体受容体タンパク質は、酵母宿主において、好ましくは、ビール酵母菌
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ）から発現させてもよい。ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）またはクルイベ
ロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の属の酵母を用いてもよ
い。酵母ベクターは、概して、２μｍ酵母プラスミドからの複製起点または自律
複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、受容体融合タンパクをコードしているＤＮ
Ａ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、および選択遺伝子を含有する
であろう。好ましくは、酵母ベクターは、例えば、酵母および大腸菌両方の形質
転換を可能にする複製起点および選択性マーカー、大腸菌のアンピシリン耐性遺
伝子、およびトリプトファン中で成長する能力を欠いた酵母の突然変異菌株に関
する選択マーカーを与えるビール酵母菌ｔｒｐ１遺伝子、および構造配列下流の
転写を誘導する高発現された酵母遺伝子に由来するプロモーターを含むであろう
。次に、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの不存
在下の成長によって形質転換を検出するのに有効な環境を与える。

【００５４】 酵母ベクター中の適当なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホス
ホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
５：２０７３，１９８０）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリ
ン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら
，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；およびＨｏｌｌ
ａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９０００，１９７８）のプロモーターが含
まれる。酵母発現に用いるのに適したベクターおよびプロモーターは、Ｒ．Ｈｉ
ｔｚｅｍａｎら，ＥＰＡ７３，６５７号に更に記載されている。

【００５５】 好ましい酵母ベクターは、大腸菌中の選択および複製のためのｐＢＲ３２２か
らのＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）、およびグルコース抑制性Ａ ＤＨ２プロモーターおよびα因子分泌リーダーを含めた酵母ＤＮＡ配列を用いて
組み立てることができる。そのＡＤＨ２プロモーターは、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３００：７２４，１９８２）によって記載されている。酵母α因子
リーダーは、異種タンパクの分泌を支配し、発現されるプロモーターと構造遺伝
子との間に挿入されうる。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，Ｃｅｌｌ ３０：９２２，
１９８２；およびＢｉｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８１：５３３０，１９８４を参照されたい。リーダー配列は、その３’末
端付近に１ヶ所またはそれ以上の有用な制限部位を含有するように修飾されて、
そのリーダー配列の異種遺伝子への融合を容易にすることができる。

【００５６】 適当な酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られている。典型的な技法は
、Ｈｉｎｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１
９２９，（１９７８）に記載されており、０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カ
ザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラ
シルからなる選択培地中でＴｒｐ⁺形質転換細胞について選択することである。

【００５７】 ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主菌株は、８
０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補足した１％酵母エキス
、２％ペプトンおよび１％グルコースからなる富裕培地中において発現のために
成長させることができる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地グルコース
の消耗で起こる。粗製酵母上澄みを濾過によって集め、更に精製する前に４℃で
保持する。

【００５８】 種々の哺乳動物または昆虫の細胞培養系を用いて、組換え体タンパクを発現さ
せることができる。昆虫細胞中における異種タンパクの生産のためのバキュロウ
イルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ６：４７（１９８８）によって概説されている。適当な哺乳動物宿主細胞系
の例には、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
、ヒーラおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。更に別の適当な哺乳動物宿主細胞には
、両方ともサル腎に由来するＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）およびＣＯ
Ｓ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１；Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１
７５，１９８１によって記載されている）が含まれる。もう一つのサル腎細胞系
であるＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８）は、エプスタイン・
バールウイルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードしている遺伝子およびＣＭ
Ｖ調節配列を含有するベクターを用いたＣＶ−１細胞系のトランスフェクション
によって誘導された（ＭｃＭａｈａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９
９１）。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ＥＢＶ複製起点を含有するＨＡＶ−ＥＯまたは
ｐＤＣ４０６のような発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。

【００５９】 哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に結合した適当なプロ
モーターおよびエンハンサー、および他の５’または３’フランキング非転写配
列などの非転写因子、および必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、
スプライスドナーおよび受容体部位などの５’または３’非翻訳配列、および転
写終結配列を含んでいてよい。脊椎動物細胞を形質転換する場合に用いられる発
現ベクター中の転写および翻訳調節配列は、ウイルス源によって提供されうる。
例えば、一般的に用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、
アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロ
ウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、
ＳＶ４０複製起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスお
よびポリアデニル化部位は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供
するのに用いることができる。初期および後期プロモーターは、両方とも、ＳＶ
４０ウイルス複製起点も含有するフラグメントとしてウイルスから容易に得られ
るので、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２７：１１３，１９７
８）。より小さいまたはより大きいＳＶ４０フラグメントも、ＨｉｎｄＩＩＩ部
位からＢｇｌＩ部位の方へ伸長した、ウイルス複製起点に位置する約２５０ｂｐ
配列が含まれるならば用いることができる。

【００６０】 典型的なベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．３：２８０，１９８３）によって開示されたように構築することができ
る。Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞中での哺乳動物受容体ｃＤＮＡの安定した高レ
ベル発現に有用な一つの系は、実質的には、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）によって記載のように構築することができる
。レトロウイルスに由来するベクターを用いてもよい。

【００６１】 ＡｃＰＬおよび／またはＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパクの宿主細胞からの分泌が望
まれる場合、発現ベクターは、シグナルまたはリーダーペプチドをコードしてい
るＤＮＡを含んでいてよい。天然のシグナル配列の代わりに、米国特許第４，９
６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃ
ｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載のインターロ
イキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６号に記載のインターロイ
キン−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型イン
ターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ４６０，８４６号に記載
のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドなどの異種シグナル配列
を加えることができる。

【００６２】 本発明は、本発明の組換え体タンパク質を製造する方法であって、そのタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細
胞を、発現を促進する条件下で培養することを含む方法を提供する。次に、所望
のタンパク質を培地または細胞抽出物から精製する。所望のタンパク質は、例え
ば、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはそのヘテロダイマー受容体であってよい
。細胞不含翻訳系も、本発明の新規ＤＮＡに由来するＲＮＡを用いて所望のタン
パク質を製造するのに用いることができると考えられる。

【００６３】 一つの実施例として、組換え体タンパク質を培地中に分泌する発現系からの上
澄みを、最初に、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍ
ｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃
縮することができる。濃縮工程後、その濃厚物を適当な精製マトリックスに適用
することができる。例えば、適当なアフィニティーマトリックスは、ＩＬ−１８
を含むことができる。ＩＬ−１８アフィニティーマトリックスは、臭化シアンで
活性化されたセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＨｙｄｒａｚｉｄｅ
Ａｆｆｉｇｅｌ（Ｂｉｏｒａｄ）に、製造者の推奨規格にしたがって、組換え体
ヒトＩＬ−１８をカップリングさせることによって製造することができる。適当
な支持体に結合した抗体を用いる逐次的免疫精製が好適である。ＡｃＰＬに特異
的な抗体に結合したタンパク質を回収し、不溶性支持体上のＩＬ−１Ｒｒｐ１に
特異的な抗体と接触させる。このように、両抗体と免疫反応性のタンパク質を識
別し且つ単離することができる。

【００６４】 或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側基
を有するマトリックスまたは基質を用いることができる。それらマトリックスは
、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質
精製に一般的に用いられる他の種類でありうる。或いは、陽イオン交換工程を用
いることができる。適当な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボ
キシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が
好適である。逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を、疎
水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地、例えば、メチル側基または他の脂肪族側基を有するシ
リカゲルを用いて１回またはそれ以上行って、融合タンパク質を更に精製するこ
とができる。

【００６５】 前述の精製工程のいくつかまたは全部をいろいろな組合せで行って、本質的に
均一な組換え体タンパク質を提供することができる。組換え体細胞培養物は、タ
ンパク質それぞれの由来の種において、例えば、いくつかの細胞種類の表面上で
実際に見出されるような、通常はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬと結合しうる
タンパク質を混入したものを含まない融合タンパク質の製造を可能にする。

【００６６】 前述の精製手順は、本発明の非組換え受容体を精製するのにも用いることがで
きるものの中にある。ホモダイマー（ＩＬ−１Ｒｒｐ１−リンカー−ＩＬ−１Ｒ
ｒｐ１およびＡｃＰＬ−リンカー−ＡｃＰＬ）を生じることができる結合手順を
用いる場合、このようなホモダイマーからヘテロダイマーを分離する精製手順を
用いる。このような手順の一例は、上で考察されたような逐次的免疫精製である
。一つの実施態様において、ＡｃＰＬ（組換え体または非組換え体）を、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって他の（混入した）タンパク質に該当するバンドが検出されな
いように精製する。

【００６７】 細菌培養物中で生産される組換え体タンパク質は、通常、最初に細胞ペレット
からの抽出後、１回またはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ
排除クロマトグラフィーの工程によって単離される。最後に、高性能液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製工程に用いることができる。組換え体融
合タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結・融解サイクル、音
波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含めたいずれの慣用法によっても
破壊することができる。

【００６８】 融合タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製を極めて
簡単にする。大規模発酵から得られる分泌された組換え体タンパク質は、Ｕｒｄ
ａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）によって開示さ
れたのと類似した方法により、分離用ＨＰＬＣカラム上での組換え体タンパク質
の精製に２回の逐次的逆相ＨＰＬＣ工程を行って精製することができる。

【００６９】 ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬのＤＮＡ配列またはアミノ酸配列は、配列番
号：１、配列番号：３、配列番号：５および配列番号：７に示されるものとは異
なることがありうる。既知の遺伝暗号縮重のために、同様のアミノ酸配列をコー
ドしているヌクレオチド配列には、かなりの変異がありうる。更に、中程度スト
リンジェントまたは高ストリンジェント条件下において、配列番号：１、配列番
号：３、配列番号：５または配列番号：７の天然のＤＮＡ配列にハイブリッド形
成しうるＤＮＡ配列であって、生物学的に活性なＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰ
ＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配列も、本発明の文脈中において、ＩＬ−１
Ｒｒｐ１をコードしているまたはＡｃＰＬをコードしているＤＮＡ配列であると
考えられる。このようなハイブリッド形成性配列には、以下に記載のもの、およ
び他の哺乳動物種に由来するＤＮＡなどの変異型配列が含まれるが、それらに制
限されるわけではない。

【００７０】 中程度ストリンジェント条件には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版
，１巻，１．１０１−１０４頁，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の条件が含まれる。Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋらによって定義される中程度ストリンジェンシーの条件には、５Ｘ ＳＳ
Ｃ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予洗溶液の使用お
よび約５５℃、５Ｘ ＳＳＣ、一晩中のハイブリダイゼーション条件が含まれる
。高ストリンジェント条件には、高温でのハイブリダイゼーションおよび洗浄が
含まれる。当業者は、温度および洗浄溶液塩類濃度を、プローブの長さなどの因
子によって必要に応じて調整してよいことを理解するであろうが、それら条件に
は、６８℃でのハイブリダイゼーション後、０．１Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
中において６３−６８℃での洗浄が含まれる。もう一つの実施態様において、本
発明は、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含むヘテロダイマー受容体であって
、そのＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１が、中程度または高ストリンジェント条
件下において、配列番号：１または配列番号：５、または配列番号：３または配
列番号：７それぞれのＤＮＡにハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされ
ているヘテロダイマー受容体を提供する。

【００７１】 更に、ＡｃＰＬまたはＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードするヌクレオチド配列におけ
るいくつかの突然変異は、最終タンパク質産物中において発現されないであろう
。例えば、ヌクレオチド置換は、発現を促進して、主に、転写されるｍＲＮＡ中
の二次構造ループを避けるように行うことができる（ＥＰ７５，４４４Ａ号を参
照されたい）。ヌクレオチド配列の他の変更は、選択された宿主によって一層容
易に翻訳されるコドン、例えば、大腸菌発現に周知の大腸菌選択コドンを提供す
るように行うことができる。

【００７２】 天然のＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬのアミノ酸配列は、１個またはそれ以
上のアミノ酸を置換、欠失、付加または挿入することによって変更されて、ＩＬ
−１Ｒｒｐ１またはＡｃＰＬ変異体を生じることができる。天然のＩＬ−１Ｒｒ
ｐ１およびＡｃＰＬタンパク質の所望の生物学的活性を有する変異体は、本発明
の受容体中で用いることができる。変異タンパク質の生物学的活性を分析するこ
とができる検定を、以下の実施例に記載する。生物学的に活性なＩＬ−１Ｒｒｐ
１ポリペプチドは、ＩＬ−１８を結合することができる。本明細書中に開示され
たＡｃＰＬポリペプチドの所望の生物学的活性は、ＡｃＰＬがＩＬ−１Ｒｒｐ１
に結合した場合のＩＬ−１８の結合を、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独へのＩＬ−１８結
合レベルと比較して増大させる能力である。

【００７３】 天然のアミノ酸配列への変更は、多数の既知の技法のいずれによっても行うこ
とができる。例えば、突然変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能に
する制限部位に隣接した、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成す
ることにより、特定の遺伝子座に導入することができる。連結反応後、得られる
再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する類似体を
コードしている。

【００７４】 或いは、オリゴヌクレオチドに支配される部位特異的突然変異誘発手順を用い
て、必要な置換、欠失または挿入によって変更された特定のコドンを有する変更
された遺伝子を提供することができる。上記の変更を行う典型的な方法は、本明
細書中に援用されるＷａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂ
ａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｇ（ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐ
ｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；米国特許第４，５１８，５８４号および
米国特許第４，７３７，４６２号によって開示されている。

【００７５】 ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の生物学的等価変異体は、例えば、アミノ酸
残基のいろいろな置換を行うこと、または生物学的活性に必要でない末端または
内部のアミノ酸を欠失することによって構築することができる。本発明の一つの
実施態様において、変異アミノ酸配列は、天然の配列と少なくとも８０％同一、
好ましくは、少なくとも９０％同一である。類似性％は、例えば、ウィスコンシ
ン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰ計算
機プログラム６．０バージョンを用いて配列情報を比較することによって決定す
ることができる。そのＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ
（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）によって変更されたよ
うな、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：
４４３，１９７０）の整列法を用いる。簡単にいうと、そのＧＡＰプログラムは
、整列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の類似している数
を、二つの配列の短い方の記号の全数で割ったものとして類似性を定義している
。ＧＡＰプログラムの好ましい暗黙値パラメーターには、（１）ヌクレオチドに
ついてのユナリー比較マトリックス（同一性に１および非同一性に０の値を含む
）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５
３−３５８頁，１９７９によって記載のような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒ
ｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Reｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較
マトリックス；（２）それぞれのギャップに３．０のペナルティーおよびそれぞ
れのギャップの記号それぞれに追加の０．１０ペナルティー；および（３）末端
のギャップにペナルティー無しが含まれる。

【００７６】 概して、置換は保存的に行われるはずであり、すなわち、最も好ましい代わり
のアミノ酸は、置換される残基に似た物理化学的特性を有するものである。保存
的置換の例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａを互いにのような、一つ
の脂肪族残基を別のものへの置換、またはＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡ
ｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間のような一つの極性残基を別のものへの置換
が含まれる。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性を有する領域全
体の置換は周知である。

【００７７】 システイン残基は、再生の際、不必要なまたは不正確な分子内ジスルフィド橋
の形成を妨げるように欠失することができるしまたは他のアミノ酸と置き換える
ことができる。親水性アミノ酸を、ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの膜貫通領
域および／または細胞内ドメイン中の疎水性アミノ酸の代わりに置き換えて、タ
ンパクの水への溶解性を増大させることができる。

【００７８】 隣接した二塩基アミノ酸残基は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系
において発現を増大させるように修飾することができる。ＥＰ２１２，９１４号
には、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を失活させる部位
特異的突然変異誘発の使用が開示されている。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシン
グ部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ａｒｇの対を変更す
るように残基を欠失、付加または置換することによって失活して、これら隣接し
た塩基性残基を生じさせない。これらアミノ酸対は、ＫＥＸ２プロテアーゼプロ
セシング部位を構成し、配列番号：２のＡｃＰＬタンパク質の残基９８−９９、
３２３−３３３、３３３−３３４、４７２−４７３および４７５−４７６で見出
される。これらＫＥＸ２部位は、配列番号：４のＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質の
１１３−１１４、３１４−３１５、３６４−３６５、４３７−４３８および４６
５−４６６位で見出される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断への感受性が
かなり小さく、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換
は、不活性ＫＥＸ２部位への保存的且つ好ましいアプローチである。

【００７９】 本発明は、関連した天然パターングリコシル化を伴うまたは伴わないタンパク
質も包含する。大腸菌などの細菌中における融合タンパク質をコードしているＤ
ＮＡの発現は、非グリコシル化分子を提供する。失活したＮ−グリコシル化部位
を有する機能性突然変異類似体は、オリゴヌクレオチド合成および連結によって
または部位特異的突然変異誘発技術によって製造することができる。これら類似
のタンパク質は、酵母発現系を用いて、均一な還元炭水化物の形で充分な収率で
製造することができる。真核生物タンパク質中のＮ−グリコシル化部位は、アミ
ノ酸トリプレットＡｓｎ−Ａ₁−Ｚ（但し、Ａ１はＰｒｏを除く任意のアミノ酸 であり、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。この配列において、ア
スパラギンは、炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を与える。

【００８０】 配列番号：２のＡｃＰＬアミノ酸配列は、アミノ酸２１−２３、１１９−１２
１、１５２−２５４および３４５−３４７のところに、全て細胞外ドメイン中で
見出される４個のこのようなＮ−グリコシル化部位を含有する。ＩＬ−１Ｒｒｐ
１の細胞外ドメインは、配列番号：４の９１−９３、１０２−１０４、１５０−
１５３、１６８−１７０、１９７−１９９、２０３−２０５、２３６−２３８お
よび２９７−２９９位にＮ−グリコシル化部位を含む。このような部位は、別の
アミノ酸をＡｓｎの代わりにまたは残基Ｚの代わりに置換する、ＡｓｎまたはＺ
を欠失する、または非Ｚアミノ酸をＡ₁およびＺ間にまたはＡｓｎ以外のアミノ 酸をＡｓｎおよびＡ₁間に挿入することによって除去することができる。タンパ ク質中のＮ−グリコシル化部位を失活させる既知の手順には、米国特許第５，０
７１，９７２号およびＥＰ２７６，８４６号に記載されたものが含まれる。

【００８１】 本発明の受容体タンパク質の変異体には、生物学的活性を保持する一次タンパ
ク質の種々の構造体も含まれる。イオン化しうるアミノ基およびカルボキシル基
の存在のために、例えば、受容体タンパク質は、酸性または塩基性の塩の形であ
ってよいし、または中性の形であってよい。個々のアミノ酸残基は、酸化または
還元によって修飾することもできる。

【００８２】 一次アミノ酸構造も、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基等のような
他の化学残基と一緒に共有結合または凝集結合を形成することによって修飾され
うる。共有結合誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖にまたはＮ−若しくはＣ
末端に結合することによって製造される。本発明の範囲内の受容体タンパク質の
他の誘導体には、Ｎ−またはＣ末端融合のように組換え体培養物中での合成など
による他のタンパク質またはポリペプチドと受容体タンパク質の共有結合または
凝集結合が含まれる。例えば、結合したポリペプチドは、タンパク質の転移を細
胞膜または壁の内側または外側の合成部位から機能部位まで同時翻訳によってま
たは翻訳後に支配するタンパク質のＮ末端領域にあるシグナル（またはリーダー
）ポリペプチド配列であってよい（例えば、酵母α−因子リーダー）。

【００８３】 ペプチドは、所望のタンパク質に（例えば、組換えＤＮＡ技術によって）融合
して、精製または識別を容易にすることができる。例には、ポリ−Ｈｉｓまたは
Ｆｌａｇ（登録商標）ペプチド（Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：１２０４，１９８８および米国特許第５，０１１，９１２号）が含まれる。
そのＦｌａｇ（登録商標）ペプチドは、極めて抗原性であり、特異的単クローン
性抗体によって可逆的に結合したエピトープを与え、発現された組換え体タンパ
ク質の迅速な検定および容易な精製を可能にする。ある与えられたタンパク質の
Ｎ−またはＣ末端にＦｌａｇ（登録商標）オクタペプチドを融合するのに有用な
発現系は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍ
ａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ニューヘブン，ＣＴから入手
可能であり、それはそのオクタペプチドを結合する単クローン性抗体である。

【００８４】 ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの天然の存在する変異体を含むダイマーＩＬ
−１８受容体複合体も、本発明によって包含される。このような変異体の例は、
別のｍＲＮＡスプライシング現象によってまたはＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ
１タンパク質のタンパク質分解切断によって生じるタンパク質であり、この場合
、所望の生物学的活性は保持される。ｍＲＮＡの別のスプライシングは、天然に
存在する可溶性の形のタンパク質のような、切断されているが生物学的に活性な
ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質を生じることができる。タンパク質
分解に起因する変異には、例えば、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１タンパク質
からの１個またはそれ以上の末端アミノ酸（概して、１−５個の末端アミノ酸）
のタンパク質分解除去による、異なった種類の宿主細胞中の発現におけるＮ−ま
たはＣ末端の相違が含まれる。

【００８５】 本発明は、本発明の受容体タンパク質を生理学的に許容しうる担体または希釈
剤と一緒に含む医薬組成物も提供する。このような担体および希釈剤は、用いら
れる用量および濃度において受容者に無毒性であろう。このような組成物は、例
えば、緩衝化溶液中にその受容体を含んでいてよく、それに、アスコルビン酸の
ような酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、ア
ミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストランを含めた炭水化物、ＥＤＴ
Ａのようなキレート化剤、グルタチオン、および他の安定化剤および賦形剤を加
えることができる。本発明の受容体は、静脈内注射、局所投与、連続注入、植込
錠からの徐放のような、指標に適するように任意の適当な方法によって投与する
ことができる。

【００８６】 本発明のヘテロダイマー受容体は、ＩＬ−１８結合試薬として有用である。こ
の受容体は、好ましくは、可溶性ＡｃＰＬおよび可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１を含み
、in vitro および in vivo 両方で使用される。それら受容体は、in vitro 検 定において、例えば、細胞上のこの受容体へのＩＬ−１８の結合によって開始さ
れる生物学的シグナルの伝達機序の研究で用いることができる。このような受容
体は、いろいろな in vitro 検定または in vivo 操作においてＩＬ−１８の生 物学的活性を阻害するのにも用いることができると考えられる。本発明の一つの
実施態様においては、本発明の受容体を投与してＩＬ−１８を結合させ、それに
よって、内因性細胞表面受容体へのＩＬ−１８の結合を阻害する。したがって、
このようなＩＬ−１８の細胞への結合によって媒介される生物学的活性も阻害さ
れる。

【００８７】 ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独では、比較的低い親和性だけでＩＬ−１８を結合する（
Ｔｏｒｉｇｏｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５７３，１９９７）。
本発明の受容体は、例えば、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードしている
ＤＮＡを用いて同時トランスフェクションされた細胞によって生産され、高親和
性でＩＬ−１８を結合する。このような本発明の受容体は、ＩＬ−１８に媒介さ
れる活性の阻害が望まれる場合に用いることができる。更に、in vitro 検定に おける本発明の受容体の使用は、その検定結果がＩＬ−１８の結合に起因するこ
とを確認させる利点を与える。

【００８８】 本発明の一つの実施態様においては、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含む
ヘテロダイマー受容体を in vivo 投与して、ＩＬ−１８の生物学的活性を阻害 する。ＩＬ−１８は、ＮＦκＢ活性を媒介することが知られており、Ｔｈ１細胞
の成長および分化の刺激薬として作用し、そしてＴｈ１細胞からのγインターフ
ェロン生産の強力な誘導物質である。ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞致死活性も増大さ
せ、敗血症性ショック、肝臓破壊および糖尿病に関与している。ＩＬ−１８のこ
れらまたは他の生物学的作用が望ましくない場合、本発明の受容体を投与してＩ
Ｌ−１８を結合し且つＩＬ−１８活性の作用を改善することができる。

【００８９】 本発明の受容体は、ＩＬ−１８によって媒介される障害を治療する治療的有効
量で患者に投与することができる。障害は、ＩＬ−１８がその障害を（直接的に
または間接的に）引き起こすまたは悪化させる場合、ＩＬ−１８によって媒介さ
れるといわれる。可溶性受容体タンパク質は、ＩＬ−１８に競合的に結合させ、
それによって、内因性細胞表面受容体へのＩＬ−１８の結合を阻害するのに用い
ることができる。

【００９０】 ＩＬ−１ＲｒｐＩに結合したＡｃＰＬを含むヘテロダイマー受容体も、ＩＬ−
１８タンパク質の生物学的活性に関する検定で用いられ、その生物学的活性は、
受容体への結合親和性によって測定される。詳しく説明すると、その受容体は、
結合検定において、ＩＬ−１８フラグメント、変異体または突然変異タンパク質
の生物学的活性を測定するのに用いることができる。その受容体は、ＩＬ−１８
タンパク質の修飾（例えば、化学的修飾、突然変異等）後に、ＩＬ−１８の生物
学的活性が保持されているかどうか確認するのに有用である。修飾されたＩＬ−
１８タンパク質の受容体への結合親和性を未修飾ＩＬ−１８タンパク質の場合と
比較して、生物学的活性へのその修飾の何らかの悪影響を検出する。したがって
、その修飾タンパク質を研究実験または検定で用いる前に、生物学的活性を評価
することができる。

【００９１】 それらヘテロダイマー受容体は、例えば、異なった条件下でのＩＬ−１８タン
パク質の有効期間および安定性を監視する“品質保証”実験の実施者が用いるこ
とができる試薬としても使用される。それら受容体は、異なった温度で異なった
期間貯蔵された、または例えば、異なった種類の組換え体発現系で製造されたＩ
Ｌ−１８タンパク質の生物学的活性（受容体の結合親和性に関して）を確認する
のに用いることができる。

【００９２】 次の実施例は、本発明のいくつかの実施態様を詳しく説明するために与えられ
ており、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。 実施例 実施例１ in vitro 沈降実験 ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１またはそれら二つのポリペプチドの組合せがＩＬ
−１８を結合するかどうか確認するために、いくつかのＦｃ融合タンパク質を製
造し、次のように試験した。可溶性ＡｃＰＬ／Ｆｃ融合タンパク質をコードして
いる発現ベクターは、抗体に由来するＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合した
ＡｃＰＬの切断された細胞外ドメインを含み、それを次のように構築した。ベク
ターｐＤＣ３０４中にＡｃＰＬ ＤＮＡを含む組換え体発現ベクターを、所望の
インフレーム制限部位を５’および３’末端に含有するプライマーを用いてＰＣ
Ｒ増幅させた。得られたフラグメントは、ＡｃＰＬ ＤＮＡの５’末端を含み、
配列番号：１のヌクレオチド１５５１で終結し、導入されたＳａｌＩおよびＢｇ
ｌＩＩ部位を５’および３’末端それぞれに含み、それを慣用的な技法によって
単離した。

【００９３】 ｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃと称される組換え体ベクターは、Ｆｃポリペプ
チドをコードしているｃＤＮＡ（−Ｈ−ＣＨ₂−ＣＨ₃のみ）を含む。ベクターｐ
ＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃを、ベクターのポリリンカー領域内で切断する制限
酵素ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩを用いて、Ｆｃポリペプチドをコードしているｃ
ＤＮＡの上流で消化した。

【００９４】 上で単離されたＡｃＰＬをコードしているＤＮＡを、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで
消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１Ｆｃ中に連結して、ＦｃポリペプチドＤＮ
ＡがＡｃＰＬ ＤＮＡの３’末端に融合するようにした。得られた発現ベクター
は、配列番号：２のＡｃＰＬ配列のアミノ酸１−３６５の後にｈＩｇＧ１Ｆｃの
Ｈ−ＣＨ₂−ＣＨ₃領域を含む融合タンパク質をコードしていた。

【００９５】 可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ融合タンパク質をコードしている発現ベクター
を次のように構築した。ＩＬ−１Ｒｒｐ１ ＤＮＡを含む組換え体ベクターを、
所望の制限部位を含有する遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。
得られたフラグメントは、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の５’末端を含み、それを慣用的な
技法によって単離した。Ａｓｐ７１８およびＢｇｌＩＩを用いて消化されたこの
ＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントを、上記のｈＩｇＧ１Ｆｃフラグメントと結合し
、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。得られた消化物フラグメントを
、Ａｓｐ７１８およびＮｏｔＩを用いて消化されたｐＤＣ３０４に連結した。組
換え体ベクターによってコードされる得られたＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ融合タン
パク質は、配列番号：４の（Ｎ末端からＣ末端への）アミノ酸１−３２９の後に
ｈＩｇＧ１／ＦｃのＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₃領域を含む。

【００９６】 一つの試料セットにおいて、ＣＯＳ−７細胞を、ｐＤＣ２０６対照またはｐＤ
Ｃ２０６−ＩＬ−１８ベクターを用いてトランスフェクションした。トランスフ
ェクションされたＣＯＳ−７細胞のもう一つの試料セットにおいて、上記のＦｃ
融合ベクターをトランスフェクションした。全試料セットは次の通りであった。

【００９７】 試料 細胞のトランスフェクションに用いたベクターにコードされるもの Ａ 空ｐＤＣ２０６発現ベクター（対照） Ｂ ｐＤＣ２０６ｈＩＬ−１８ １ ｐＤＣ４０９（対照） ２ ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ ３ ＡｃＰＬ／Ｆｃ ４ ＡｃＰＬ／ＦｃおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ トランスフェクションから２日後、試料ＡおよびＢをｃｙｓ／ｍｅｔ不含培地中
で１時間飢餓状態にした後、［³⁵Ｓ−ｃｙｓ］［³⁵Ｓ−ｍｅｔ］含有培地を用い
て６時間標識した。上澄みを取り出し、遠心分離を行い、プロテアーゼインヒビ
ターの存在下で０．４Ｍ ＮａＣｌ／１．０％トリトンＸ−１００に調整した。
試料１−４のＦｃ融合タンパク質を用いてトランスフェクションされた細胞から
の上澄みを、トランスフェクションから２日後に取り出し、遠心分離した。それ
ぞれのＦｃ融合上澄みを、（ａ）ベクターでトランスフェクションされた；かま
たは（ｂ）ＩＬ−１８でトランスフェクションされた³⁵Ｓ標識上澄みと混合した
。精製ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ受容体タンパク質を、対照としてのもう一つの放
射性標識された上澄み部分に加えた。プロテインＧ−セファロースを各実験試料
に加え、４℃で一晩沈降させた。次に、それら試料を、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０
．０５％ＳＤＳ、１．０％ＮＰ−４０緩衝液中で充分に洗浄し、４−２０％トリ
ス−グリシンゲル中の電気泳動によって分離した。そのゲルを固定し、増幅させ
、乾燥させ、フィルムに露出させた。タンパク質の全レベルを評価し、未標識Ｆ
ｃ融合タンパク質を考慮するために、それぞれの沈降の一部分を、別の４−２０
％トリス−グリシンゲル上で分析し且つ銀染色した。

【００９８】 細胞試料１−４の上澄みは、対照上澄み（試料Ａ）からの１０−３０Ｋｄ範囲
内にタンパク質をほとんど沈降させなかった。ＩＬ−１８（試料Ｂ）は、細胞試
料２（ＩＬ−１Ｒｒｐ１／Ｆｃ）からの上澄みによって沈降したが、細胞試料１
（対照）または細胞試料３（ＡｃＰＬ／Ｆｃ）からの上澄みによって沈降しなか
った。有意に多量のＩＬ−１８は、ＩＬ−１Ｒｒｐ１／ＦｃおよびＡｃＰＬ／Ｆ
ｃの同時トランスフェクションから得られた試料４全ての上澄みによって沈降し
た。

【００９９】 したがって、ＩＬ−１Ｒｒｐ１はＩＬ−１８を結合できるが；ＡｃＰＬはＩＬ
−１８を結合できないし；そして同時発現されたＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰ
ＬはＩＬ−１８を結合することができ、それら同時発現されたタンパク質は、Ｉ
Ｌ−１Ｒｒｐ１単独より高レベルのＩＬ−１８結合を示す。銀染色されたゲルは
、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独でトランスフェクションされた上澄みと比較して、ＩＬ
−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬでトランスフェクションされた上澄み中のＩＬ−１
Ｒｒｐ１が多くないことを示している。これは、これら試料中で発現されるＩＬ
−１Ｒｒｐ１がより多いという可能性を排除する。それら結果は、ＩＬ−１Ｒｒ
ｐ１／ＡｃＰＬダイマーのＩＬ−１８結合親和性が、ＩＬ−１Ｒｒｐ１単独の親
和性より大きいことを示している。

【０１００】 実施例２ ＮＦκＢ活性の誘導 ＩＬ−１８シグナリングにおけるＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡｃＰＬの役割を確
認するために、ＡｃＰＬ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１、およびＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＡ
ｃＰＬの組合せを、ＣＯＳ細胞およびＳ４９．１細胞中で過発現させ、ＩＬ−１
８刺激のＮＦκＢ活性への作用を評価した。

【０１０１】 ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ／デキストラン法によって１２ウェルフォーマッ
トでトランスフェクションした。各ウェルを、合計２００ｎｇの１種類または複
数の適当な発現ベクター、およびルシフェラーゼ発現を媒介する３ヶ所のＮＦκ
Ｂ部位を含有する８００ｎｇのＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミドを用いて
トランスフェクションした。約１０⁷個のＳ４９．１細胞を、０．７ｍＬ中にお いて４０μｇのＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミドおよび合計２００ｎｇの
１種類または複数の適当な発現ベクターを用いてエレクトロポレーションによっ
てトランスフェクションした。エレクトロポレーションは、９６０μＦおよび３
２０Ｖで行った。

【０１０２】 それら細胞を２日間インキュベート後、４０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１８（Ｐｅｐ
ｒｏＴｅｃｈから購入された）を用いて４時間刺激した。細胞を洗浄し、溶解さ
せ、ルシフェラーゼ活性についてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇ
ｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から購入された）を製造者の指示にしたが
って用いて検定した。

【０１０３】 対照ベクター単独、ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１だけをコードしているベクター、また
はｍＡｃＰＬだけをコードしているベクターを用いてトランスフェクションされ
たＣＯＳ７細胞またはＳ４９．１細胞は、ｍＩＬ−１８刺激に応答しなかった。
更に、ｍＡｃＰＬでトランスフェクションされたＳ４９．１細胞は、そのトラン
スフェクションを、ｍＩＬ−１Ｒ Ｉ型またはｍＩＬ−１ＲＡｃＰをコードして
いる発現ベクターと組み合わせた場合、ｍＩＬ−１８刺激に応答しなかった。し
かしながら、ｍＡｃＰＬおよびｍＩＬ−１Ｒｒｐ１で同時トランスフェクション
され且つｍＩＬ−１８で刺激された細胞は、ＮＦκＢ ＤＮＡ結合活性の増加を
示し、それは、ＣＯＳ細胞で１０倍およびＳ４９．１細胞で３００倍であった。
hＩＬ−１Ｒｒｐ１でトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞は、ｈＩＬ−１ ８刺激への応答を示さなかったが、ｈＡｃＰＬ単独でトランスフェクションされ
且つｈＩＬ−１８で刺激されたＣＯＳ７細胞は、ＮＦκＢ活性の８倍増加を示し
た。これは、ＣＯＳ７細胞に内因的なサルＩＬ−１Ｒｒｐ１とｈＡｃＰＬの結合
に起因している。ｈＡｃＰＬを含むhＩＬ−１Ｒｒｐ１の過発現は、ｈＩＬ−１ ８に応答したＮＦκＢ活性の刺激を、ｈＡｃＰＬだけを過発現する細胞中で見ら
れる場合を越えて増大させることはなかった。ＮＦκＢ活性のこの劇的な増大は
、ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１がＩＬ−１８受容体のサブユニットであり、
ＩＬ−１８刺激に応答したＮＦκＢシグナリングを誘導するように協同する。

【０１０４】 実施例３ ＡｃＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１抗体重鎖および軽鎖融合タンパク質の製造 次に、抗体重鎖および抗体軽鎖ポリペプチドに融合したＡｃＰＬおよびＩＬ−
１Ｒｒｐ１を含む融合タンパク質の製造を記載する。

【０１０５】 最初に、上流にリンカー領域を含むヒトＩｇＧ１の定常領域全体をコードして
いる発現ベクターを構築する。このような発現ベクターは、融合タンパク質をコ
ードしているプラスミドの生成を容易にする。ＰＣＲ技術を用い、上流のＢｇｌ
ＩＩ部位および下流のＮｏｔＩ部位を含有するプライマーを用いて、上述のＩｇ
Ｇ１定常領域を増幅させる。得られたＰＣＲ生産フラグメントを消化し、精製し
、そしてＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化されているｐＤＣ４１２に連結させる
。次に、ｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１発現ベクターをＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで
消化する。

【０１０６】 次に、リンカー領域の前にＩｇκ定常ドメイン、そして続いてリンカー領域お
よびポリ−Ｈｉｓドメインを含有する発現ベクターを製造する。そのポリ−Ｈｉ
ｓドメインは、好都合に、タンパク質精製処理を助ける。ＰＣＲ技術を用い、Ｂ
ｇｌＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを含有するプライマーを用いて、定常領域を増
幅させる。得られたＰＣＲ生産フラグメントを消化し、精製し、そしてｐＤＣ４
１２に連結させる。目的の可溶性受容体は、独特のＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部
位を用いることによって上流にクローン化することができる。

【０１０７】 ＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｃκ発現ベクターを製造するために、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の
細胞外ドメインを、ＳａｌＩ（５’）およびＢｇｌＩＩ（３’）制限部位を含有
するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させる。この精製され且つ消化されたＰＣＲ
産物を、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＤＣ４１２−Ｉｇκ発現ベクター
に連結して、ＩＬ−１Ｒｒｐ１の可溶性部分をＣκの定常領域に結合する融合タ
ンパク質をコードするインフレーム構築物を生成する。

【０１０８】 ＩＬ−１Ｒｒｐ１−ｈＩｇＧ１発現ベクターを製造するために、可溶性ＩＬ−
１Ｒｒｐ１をコードしているＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントをＩＬ−１
Ｒｒｐ１−Ｃκから取り出し、同じ制限酵素で消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇ
Ｇ１に連結する。両方のベクターが同じ読み枠中にＢｇｌＩＩ部位を有するので
、これは、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１およびｈＩｇＧ１間の融合を容易に生じさせ
るであろう。

【０１０９】 ＡｃＰＬ−Ｃκ発現ベクターを製造するために、ＡｃＰＬの細胞外ドメインを
、ＳａｌＩ（５’）およびＢｇｌＩＩ（３’）制限部位を含有するプライマーを
用いてＰＣＲ増幅させる。次に、この精製され且つ消化されたＰＣＲ産物を、Ｓ
ａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＤＣ４１２−Ｃκに連結して、ＡｃＰＬの可
溶性部分をＣκの定常領域に結合するインフレーム融合タンパク質を生成する。

【０１１０】 ＡｃＰＬ−ｈＩｇＧ１発現ベクターを製造するために、可溶性ＡｃＰＬをコー
ドしているＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ制限フラグメントをＡｃＰＬ−ｃκから取り出
し、同じ制限酵素で消化されたｐＤＣ４１２−ｈＩｇＧ１に連結する。両方のベ
クターが同じ読み枠中にＢｇｌＩＩ部位を含有するので、これは、可溶性ＡｃＰ
ＬおよびｈＩｇＧ１間の融合を容易に生じさせるであろう。

【０１１１】 ＣＯＳ−７細胞を、上記の融合ベクターを用いてトランスフェクションする。
実施例１に記載のように細胞を培養し、融合タンパク質を集める。 実施例４ ＩＬ−１８に誘導されたＮＦκＢ活性の阻害 ＣＯＳ７細胞を、１２ウェルプレート中において、ウェル当たり各１０ｎｇの
ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１およびｍＡｃＰＬ発現ベクターおよび５０ｎｇの３ＸＮＦκ
Ｂ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて一時的にトランスフェクショ
ンした。トランスフェクションから２日後、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−
１８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入された）を用いて増加する量のいろいろなレ
ポーターＦｃ融合タンパク質の存在下で刺激した。ｍＩＬ−１８は、それらタン
パク質と一緒に室温で２０分間プレインキュベート後、細胞に加えられた。Ｆｃ
タンパク質の量は、１ｕｇ／ｍｌ−５０ｕｇ／ｍｌまで滴定された。細胞を４時
間刺激後、溶解させ、そしてＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａ
ｙ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてルシフェラーゼ活性を評価した。

【０１１２】 ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ、ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−ＦｌａｇｐｏｌｙＨｉｓ
またはｍＡｃＰＬ−Ｆｃを用いたＩＬ−１８のプレインキュベーションは、試験
されたいずれの濃度においても、ＮＦκＢの誘導にほとんど影響しなかった。対
照的に、異種ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ＋ｍＡｃＰＬ−Ｆｃタンパク質混合物（
ｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃのホモダイマー、ｍＡｃＰＬ−Ｆｃのホモダイマーお
よびヘテロダイマーｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ／ｍＡｃＰＬ−Ｆｃ分子から成る
）を用いたＩＬ−１８のインキュベーションは、ＮＦκＢ誘導の用量依存性阻害
を引き起こした。誘導されない細胞は、３Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを示し、いずれの
受容体-Fｃタンパク質も不存在下でｍＩＬ−１８を用いて刺激された細胞は、２
５Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを示した。ＮＦκＢ誘導の最大阻害は、２０μｇ／ｍｌお
よび５０μｇ／ｍｌのｍＩＬ−１Ｒｒｐ１−Ｆｃ＋ｍＡｃＰＬ−Ｆｃタンパク質
混合物について認められ、それは６Ｘ １０ｅ３ＲＬＵを生じ、ＩＬ−１８活性
の８７％阻害を示した。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／０９４，４６９ (32)優先日 平成10年７月28日(1998．7．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA07 EA04 GA11 4B064 AG20 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 4C084 AA02 AA07 BA01 BA22 DA47 NA14 ZA972 ZB082 ZB112 ZB152 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA51 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１個のＡｃＰＬポリペプチドに結合した少なくと
   も１個のＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドを含む受容体であって、該ＩＬ−１Ｒｒ
   ｐ１ポリペプチドが、 （ａ）配列番号：３に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域および配
   列番号：７に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域から成る群より選択
   されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ； （ｂ）高ストリンジェント条件下において（ａ）のＤＮＡにハイブリッド形成
   しうるＤＮＡ；および （ｃ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび配列番
   号：８に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡから成る群より選択されるＤ
   ＮＡ から成る群より選択されるＤＮＡによってコードされていて；そしてここにおい
   て、該ＡｃＰＬポリペプチドが、 （ａ’）配列番号：１に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域および
   配列番号：５に示されるヌクレオチド配列のコーディング領域から成る群より選
   択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ； （ｂ’）高ストリンジェント条件下において（ａ’）のＤＮＡにハイブリッド
   形成しうるＤＮＡ；および （ｃ’）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび配列
   番号：６に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡから成る群より選択される
   ＤＮＡ から成る群より選択されるＤＮＡによってコードされる生物学的に活性なポリペ
   プチドである上記受容体。
2. 【請求項２】 前記受容体が、可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１ポリペプチドに共有
   結合した可溶性ＡｃＰＬポリペプチドを含む請求項１に記載の受容体。
3. 【請求項３】 前記受容体が、ペプチドリンカーによってＡｃＰＬに共有結
   合したＩＬ−１Ｒｒｐ１を含む請求項１に記載の受容体。
4. 【請求項４】 前記受容体が、式 Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₂またはＲ₂−Ｌ−Ｒ₁ （式中、Ｒ₁は可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１であり；Ｒ₂は可溶性ＡｃＰＬであり、そ
   してＬはペプチドリンカーである） を有する組換え体融合タンパク質である請求項３に記載の受容体。
5. 【請求項５】 前記可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１が、 （ａ）配列番号：４のアミノ酸ｙ−３２９（但し、ｙは１−２０までの整数で
   ある）；および （ｂ）配列番号：８のアミノ酸ｙ’−３２２（但し、ｙ’は１−１９までの整
   数である） から成る群より選択され；そして前記可溶性ＡｃＰＬが、 （ａ’）配列番号：２のアミノ酸ｘ−３５６（但し、ｘは１−１５までの整数
   である）；および （ｂ’）配列番号：６のアミノ酸ｘ’−３５６（但し、ｘ’は１−１５までの
   整数である） から成るアミノ酸配列より選択される請求項４に記載の受容体。
6. 【請求項６】 Ｒ₁−Ｌ₁：Ｒ₂−Ｌ₂、Ｒ₂−Ｌ₂：Ｒ₁−Ｌ₁、Ｒ₁−Ｌ₂：Ｒ₂ −Ｌ₁、Ｒ₂−Ｌ₁：Ｒ₁−Ｌ₂、Ｒ₁−Ｌ₁：Ｒ₂−Ｌ₂／Ｒ₂−Ｌ₂：Ｒ₁−Ｌ₁および Ｒ₁−Ｌ₂：Ｒ₂−Ｌ₁／Ｒ₂−Ｌ₁：Ｒ₁−Ｌ₂ （式中、Ｌ₁は免疫グロブリン重鎖フラグメントであり；Ｌ₂は免疫グロブリン軽
   鎖フラグメントであり；Ｒ₁はＡｃＰＬまたはＡｃＰＬフラグメントであり；Ｒ₂ はＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１フラグメントであり；：は重鎖およ
   び軽鎖の抗体領域間の結合であり、そして／は重鎖および重鎖の抗体領域間の結
   合である） から成る群より選択される式を有する受容体。
7. 【請求項７】 前記ＩＬ−１Ｒｒｐ１が、 （ａ）配列番号：４のアミノ酸ｙ−３２９（但し、ｙは１−２０までの整数で
   ある）；および （ｂ）配列番号：８のアミノ酸ｙ’−３２２（但し、ｙ’は１−１９までの整
   数である） から成るアミノ酸配列の群より選択される可溶性フラグメントであり；そして前
   記ＡｃＰＬが、 （ａ’）配列番号：２のアミノ酸ｘ−３５６（但し、ｘは１−１５までの整数
   である）；および （ｂ’）配列番号：６のアミノ酸ｘ’−３５６（但し、ｘ’は１−１５までの
   整数である） から成るアミノ酸配列より選択される可溶性フラグメントである請求項６に記載
   の受容体。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の受容体をコードしている単離されたＤＮＡ
   配列。
9. 【請求項９】 請求項８に記載のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター。
   。
10. 【請求項１０】 請求項６に記載の受容体を製造する方法であって、前記融
    合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを用いて形質転換され
    た宿主細胞を、該融合タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、そして該融
    合タンパク質を回収することを含む上記方法。
11. 【請求項１１】 可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１または可溶性ＡｃＰＬのＣ末端に
    結合した抗体軽鎖ポリペプチドを含む第一融合ポリペプチド、および可溶性Ａｃ
    ＰＬまたは可溶性ＩＬ−１Ｒｒｐ１のＣ末端に結合した抗体重鎖ポリペプチドを
    含む第二融合ポリペプチドを含む受容体であって、該第一融合ポリペプチドが、
    該重鎖および軽鎖ポリペプチド間のジスルフィド結合によって該第二融合ポリペ
    プチドに結合している上記受容体。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の受容体を製造する方法であって、前記
    第一融合ポリペプチドをコードしている第一発現ベクターおよび前記第二融合ポ
    リペプチドをコードしている第二発現ベクターを用いて同時トランスフェクショ
    ンされた宿主細胞を、該第一および第二融合ポリペプチドの発現を促進する条件
    下で培養し、そして該受容体を回収することを含む上記方法。
13. 【請求項１３】 前記ＩＬ−１Ｒｒｐ１が、 （ａ）配列番号：４のアミノ酸ｙ−３２９（但し、ｙは１−２０までの整数で
    ある）；および （ｂ）配列番号：８のアミノ酸ｙ’−３２２（但し、ｙ’は１−１９までの整
    数である） から成るアミノ酸配列の群より選択される可溶性フラグメントであり；そして前
    記ＡｃＰＬが、 （ａ’）配列番号：２のアミノ酸ｘ−３５６（但し、ｘは１−１５までの整数
    である）；および （ｂ’）配列番号：６のアミノ酸ｘ’−３５６（但し、ｘ’は１−１５までの
    整数である） から成るアミノ酸配列より選択される可溶性フラグメントである請求項１１に記
    載の受容体。
14. 【請求項１４】 請求項２に記載の受容体および適当な希釈剤または担体を
    含む組成物。
15. 【請求項１５】 請求項１１に記載の受容体を含む組成物。
16. 【請求項１６】 ＩＬ−１８の作用を阻害する方法であって、請求項２に記
    載の受容体を哺乳動物に投与することを含む上記方法。