ES2381650T3

ES2381650T3 - Receptores de citoquinas Zcytor11 solubles

Info

Publication number: ES2381650T3
Application number: ES10153071T
Authority: ES
Inventors: Wayne R. Kindsvogel; Stavros Topouzis
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2000-08-08
Filing date: 2001-08-08
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2021-08-08
Also published as: DE60123998D1; DE60123998T2; US20030157096A1; US20060068471A1; EP2177616B1; AU2001290524A1; WO2002012345A2; US7045498B2; CA2418950A1; EP2177616A1; US20130028894A1; US20110081344A1; WO2002012345A3; JP5015404B2; EP1337636B1; EP1337636A2; ATE342980T1; US20100047168A1; US8287866B2; ATE547525T1

Abstract

Uso de un antagonista de la actividad de IL-TIF para fabricar un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria o inmunitaria en un mamífero, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a un complejo heterodímero de receptores que tiene una primera subunidad de receptor que consiste en un polipéptido zcytoR11 como se muestra en la SEQ ID NO: 3 y una segunda subunidad de receptor que consiste en un receptor CRF2-4 soluble; en el que dicha enfermedad se selecciona de la artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad atópica.

Description

Receptores de citoquinas Zcytor11 solubles.

Descripción

[0001] Las citoquinas son proteínas solubles que influyen en el crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células. Sus receptores están compuestos de una o más proteínas de membrana integrales que se unen a la citoquina con una alta afinidad y transducen este suceso de unión a la célula a través de las partes citoplasmáticas de determinadas subunidades del receptor. Los receptores de citoquinas se han agrupado en varias clases basándose en las similitudes en sus dominios extracelulares de unión al ligando. Por ejemplo, las cadenas de receptores responsables de la unión y/o la transducción del efecto de los interferones (IFN) son miembros de la familia de receptores de citoquinas de tipo II (CRF2), basado en un dominio extracelular de 200 restos característico. Las actividades in vivo demostradas de estos interferones ilustran el enorme potencial clínico de, y la necesidad de, otras citoquinas, agonistas de citoquinas y antagonistas de citoquinas.

[0002] Xie M-H y col., JBC, Vol. 275(4), 29 Junio 2000, páginas 31335-31339, describen IL-22, una nueva citoquina humana que señaliza a través de las proteínas relacionadas con los receptores de interferones CR2-4 y IL22R.

[0003] El documento WO 99/07848 describe el receptor de citoquinas 11 de mamífero.

[0004] La presente memoria descriptiva describe nuevos receptores de citoquinas y composiciones y procedimientos relacionados. En particular, la presente memoria descriptiva describe una región extracelular de unión al ligando de un receptor Zcytor11 de mamífero, que alternativamente, también contiene un dominio transmembrana o tanto un dominio intracelular como un dominio de transmembrana.

[0005] Además, la presente memoria descriptiva describe nuevos receptores de citoquinas solubles que se pueden usar para antagonizar los efectos del factor inducible por linfocitos T (IL-TIF) en determinadas enfermedades humanas. En particular, la presente memoria descriptiva describe una región extracelular de unión al ligando de un receptor de Zcytor11 de mamífero, que es homodímero, heterodímero o multímero.

[0006] En un aspecto, la presente memoria descriptiva describe un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido receptor de citoquinas soluble que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, y en la que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por la secuencia de polinucleótido se une o antagoniza el Il-TIF (SEQ ID NO: 8). En una realización, el polinucleótido es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por el polinucleótido forma un complejo homodímero de receptores.

[0007] En un segundo aspecto, la memoria descriptiva describe un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido receptor de citoquinas soluble que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por el polinucleótido forma un complejo heterodímero o multímero de receptores. En una realización, el polinucleótido es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por el polinucleótido forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que comprende además un receptor de citoquinas de clase I o clase II soluble. En otra realización, el polinucleótido es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por el polinucleótido forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que además comprende un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35). En otra realización, el polinucleótido es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por el polinucleótido forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que además comprende un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35).

[0008] En un tercer aspecto, la memoria descriptiva describe un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido receptor de citoquinas soluble que comprende una secuencia de restos de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, en el que polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por el polinucleótido forma un complejo heterodímero o multímero de receptores. En otra realización, el polipéptido es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por el polinucleótido comprende además un receptor de citoquinas de clase I o clase II soluble. En otra realización, el polinucleótido es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codificado por el polinucleótido forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que además comprende un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35). En otra realización, el polinucleótido es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble codifica además un dominio intracelular. En otra realización, el polinucleótido es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble comprende además un marcador de afinidad.

[0009] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un vector de expresión que comprende los siguientes elementos operativamente unidos: (a) un promotor de transcripción; un primer segmento de ADN que codifica un polipéptido receptor de citoquinas soluble que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, y un terminador de la transcripción; y (b) un segundo promotor de la transcripción; un segundo segmento de ADN que codifica un polipéptido receptor de citoquinas de clase I o clase II soluble; y un terminador de la transcripción; y en el que el primer y segundo segmentos de ADN están contenidos en un solo vector de expresión o están contenidos en vectores de expresión independientes.

[0010] En una realización, el vector de expresión descrito antes comprende además una secuencia señal secretora operativamente unida al primer y segundo segmentos de ADN. En otra realización, el vector de expresión es como se ha descrito antes, en el que el segundo segmento de ADN codifica un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35). .

[0011] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe una célula cultivada que comprende un vector de expresión como se ha descrito antes, en el que la célula expresa los polipéptidos codificados por los segmentos de ADN. En una realización, la célula cultivada comprende un vector de expresión como se ha descrito antes, en el que el primer y segundo segmentos de ADN están localizados en vectores de expresión independientes y son cotransfectados en la célula, y la célula expresa los polipéptidos codificados por los segmentos de ADN. En otra realización, la célula cultivada comprende un vector de expresión como se ha descrito antes, en el que la célula expresa un polipéptido receptor soluble heterodímero o multímero codificado por los segmentos de ADN. En otra realización, la célula cultivada es como se ha descrito antes, en el que la célula secreta un complejo heterodímero o multímero de polipéptidos receptores de citoquinas. En otra realización, la célula cultivada es como se ha descrito antes, en el que la célula secreta un complejo heterodímero o multímero de polipéptidos receptores de citoquinas soluble que se une al IL-TIF o antagoniza la actividad del IL-TIF.

[0012] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe una construcción de ADN que codifica una proteína de fusión que comprende: un primer segmento de ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de restos de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3, y al menos otro segmento de ADN que codifica un polipéptido receptor de citoquinas de clase I o clase II soluble, en el que el primer segmento de ADN y los otros están conectados en el marco; y en el que el primer segmento de ADN y los otros codifican la proteína de fusión.

[0013] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe una construcción de ADN que codifica una proteína de fusión como se ha descrito antes, en el que al menos otro segmento de ADN codifica un polipéptido receptor CRF24 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35).

[0014] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un vector de expresión que comprende los siguientes elementos operativamente unidos: un promotor de la transcripción; una construcción de ADN que codifica una proteína de fusión como se ha descrito antes; y un terminador de la transcripción, en el que el promotor está operativamente unido a la construcción de ADN, y la construcción de ADN está operativamente unida al terminador de la transcripción.

[0015] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe una célula cultivada que comprende un vector de expresión como se ha descrito antes, en el que la célula expresa un polipéptido codificado por la construcción de ADN.

[0016] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un procedimiento para producir una proteína de fusión que comprende: cultivar una célula como se ha descrito antes y aislar el polipéptido producido por la célula.

[0017] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un polipéptido receptor de citoquinas soluble aislado que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3, y en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble se une al IL-TIF o antagoniza la actividad del IL-TIF. En una realización, el polipéptido aislado es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble forma un complejo homodímero de receptores.

[0018] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble forma un complejo heterodímero o multímero de receptores. En una realización, el polipéptido aislado es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que además comprende un receptor de citoquinas de clase I o clase II soluble.

[0019] En otra realización, el polipéptido aislado es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que además comprende un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35). En otra realización, el polipéptido aislado es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que además comprende un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35).

[0020] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un polipéptido receptor de citoquinas soluble aislado que comprende una secuencia de restos de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble forma un complejo heterodímero o multímero de receptores. En otra realización, el polipéptido aislado es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que además comprende un receptor de citoquinas de clase I o clase II soluble. En otra realización, el polipéptido aislado es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble forma un complejo heterodímero o multímero de receptores que comprende un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35). En otra realización, el polipéptido aislado es como se ha descrito antes, en el que el polipéptido receptor de citoquinas soluble además comprende un marcador de afinidad, resto químico, toxina o etiqueta. En otro aspecto, la presente invención proporciona un complejo heterodímero o multímero de receptores soluble aislado que comprende subunidades de receptores solubles, en el que al menos una de las subunidades de receptores solubles comprende un polipéptido receptor de citoquinas soluble que comprende una secuencia de restos de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3. En una realización, el complejo heterodímero o multímero de receptores soluble aislado descrito antes comprende además un polipéptido receptor de citoquinas de clase I o clase II soluble. En una realización, el complejo heterodímero o multímero de receptores soluble aislado descrito antes comprende además un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33) o un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34), o un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 35).

[0021] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un procedimiento para producir un polipéptido receptor de citoquinas soluble que forma un complejo heterodímero o multímero que comprende: cultivar una célula como se ha descrito antes y aislar los polipéptidos receptores solubles producidos por la célula.

[0022] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un procedimiento para producir un anticuerpo contra el polipéptido receptor de citoquinas soluble, que comprende: inocular a un animal un polipéptido receptor de citoquinas soluble seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende un complejo homodímero de receptores de citoquinas soluble; (b) un polipéptido que comprende un complejo de receptores heterodímero o multímero de receptores de citoquinas soluble que comprende un polipéptido receptor de citoquinas de clase I o clase II soluble; (c) un polipéptido que comprende un complejo de receptores heterodímero o multímero de receptores de citoquinas soluble, que comprende un polipéptido receptor CRF2-4 soluble (SEQ ID NO: 33); (d) un polipéptido que comprende un complejo de receptores heterodímero o multímero de receptores de citoquinas soluble, que comprende un polipéptido receptor de IL-10 soluble (SEQ ID NO: 34); (e) un polipéptido que comprende un complejo de receptores heterodímero o multímero de receptores de citoquinas soluble, que comprende un polipéptido receptor DIRS1 soluble (SEQ ID NO: 34); y en el que el polipéptido provoca una respuesta inmunitaria en el animal para producir el anticuerpo; y aislar el anticuerpo del animal.

[0023] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un anticuerpo producido por el procedimiento descrito antes, que se une específicamente a un complejo de receptores homodímero, heterodímero o multímero, que comprende un polipéptido receptor de citoquinas soluble. En una realización, el anticuerpo descrito antes es un anticuerpo monoclonal.

[0024] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un anticuerpo que se une específicamente a un complejo de receptores homodímero, heterodímero o multímero como se ha descrito antes.

[0025] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un procedimiento para inhibir la proliferación inducida por IL-TIF de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas, que comprende cultivar células de la médula ósea o de la sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de receptor de citoquinas soluble suficiente para reducir la proliferación de las células hematopoyéticas en la médula ósea o células de la sangre periférica, comparado con las células de la médula ósea o de la sangre periférica cultivadas en ausencia del receptor de citoquinas soluble. En una realización, el procedimiento es como se ha descrito antes, en el que las células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En una realización, el procedimiento es como se ha descrito antes, en el que las células linfoides son macrófagos o linfocitos T.

[0026] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir la inflamación inducida por IL-TIF o inducida por IL-9, que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de receptor de citoquinas soluble suficiente para reducir la inflamación.

[0027] En otro aspecto, la memoria descriptiva describe un procedimiento para suprimir una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, que comprende: (1) determinar un nivel de anticuerpo específico para el antígeno o patógeno; (2) administrar una composición que comprende un polipéptido receptor de citoquinas soluble en un vehículo farmacéutico aceptable; (3) determinar un nivel después de administración del anticuerpo específico para el antígeno o patógeno; (4) comparar el nivel de anticuerpo de la etapa

(1) con el nivel de anticuerpo de la etapa (3), en el que la ausencia de un aumento o una disminución del nivel de anticuerpo es indicativo de supresión de una respuesta inmunitaria.

[0028] Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y el dibujo adjunto.

[0029] La expresión “variante alélica” se usa en el presente documento para indicar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural por mutación y puede producir polimorfismo fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (no hay cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante alélica también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.

[0030] “Que corresponde a”, cuando se usa en relación a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, indica la posición en una segunda secuencia que se alinea con la posición de referencia cuando dos secuencias se alinean de forma óptima.

[0031] La expresión “vector de expresión” se usa para indicar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés operativamente unido a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Dichos segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras y también pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión en general derivan de un plásmido o ADN vírico, o pueden contener elementos de ambos.

[0032] El término “aislado”, cuando se aplica a un polinucleótido, indica que el polinucleótido se ha sacado de su medio genético natural y por lo tanto carece de otras secuencias codificantes extrañas o no deseadas y está en una forma adecuada para usar en sistemas de producción de proteínas genéticamente modificadas.

[0033] “Operativamente unido”, cuando se refiere a segmentos de ADN, indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan de forma coordinada para los propósitos a los que se dirigen, p. ej., la transcripción se inicia en el promotor y continúa por el segmento codificante hasta el terminador.

[0034] Un “polinucleótido” es un polímero mono o bicatenario de bases desoxirribonucleótidas o ribonucleótidas leídas del extremo 5’ al 3’. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizar in vitro o preparar a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas.

[0035] El término “promotor” se usa en el presente documento para su significado reconocido en la materia para indicar una parte de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran normalmente, pero no siempre, en las regiones 5’ no codificantes de los genes.

[0036] El término “receptor” se usa en el presente documento para indicar una proteína asociada a la célula, o una subunidad de polipéptido de dicha proteína, que se une a una molécula bioactiva (el “ligando”) y media el efecto del ligando en la célula. La unión del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor (y en algunos casos, multimerización del receptor, es decir, la asociación de subunidades de receptores idénticas o diferentes) que produce interacciones entre el o los dominios efectores y otra u otras moléculas en la célula. Estas interacciones a su vez conducen a alteraciones en el metabolismo de la célula. Los sucesos metabólicos que están conectados con las interacciones de receptor-ligando incluyen la transcripción de genes, fosforilación, desfosforilación, proliferación celular, producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. La expresión “polipéptido receptor” se usa para indicar las cadenas de polipéptidos receptores completas y partes de las mismas, incluyendo los dominios funcionales aislados (p. ej., dominios de unión al ligando).

[0037] Una “secuencia de señal secretora” es una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un “péptido secretor”) que, como componente de un polipéptido más largo, dirige el polipéptido más largo a través de una ruta secretora de una célula en la que es sintetizado. El polipéptido más largo normalmente se escinde para separar el péptido secretor durante el tránsito a través de la ruta en secretora.

[0038] Un “receptor soluble” es un polipéptido receptor que no está unido a una membrana celular. Los receptores solubles son, lo más habitualmente, polipéptidos receptores de unión al ligando que carecen de dominios transmembrana y citoplasmático. Los receptores solubles pueden comprender restos de aminoácidos adicionales, tales como marcadores de afinidad que proporcionan la purificación del polipéptido o proporcionan sitios para la unión del polipéptido a un sustrato, o secuencias de la región constante de inmunoglobulina. Muchos receptores de superficie celular tienen homólogos solubles naturales que se producen por proteólisis o se traducen de ARNm cortados y empalmados de forma alternativa. Se dice que los polipéptidos receptores carecen sustancialmente de segmentos de polipéptidos transmembrana e intracelulares, cuando carecen de suficientes partes de estos segmentos para proporcionar el anclaje a la membrana o la transducción de señales, respectivamente.

[0039] La expresión “variante de corte y empalme”, como se usa en el presente documento, indica formas alternativas de ARN transcrito a partir de un gen. La variación por corte y empalme surge de forma natural por el uso de sitios de corte y empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o de forma menos común entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede dar como resultado varios ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. La expresión variante de corte y empalme también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante de corte y empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen.

[0040] Los pesos moleculares y las longitudes de polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos

(p. ej., electroforesis en gel) se entenderá que son valores aproximados. Cuando dicho valor se expresa como “aproximadamente” X, se entenderá que el valor de X expuesto tiene una precisión de ±10 %.

[0041] Las subunidades de receptores de citoquinas se caracterizan por una estructura de múltiples dominios que comprende un dominio de unión al ligando y un dominio efector que está implicado típicamente en la transducción de señales. Los receptores de citoquinas multímeros incluyen homodímeros (p. ej., isoformas aa y 11 del receptor de PDGF, receptor de eritropoyetina, MPL (receptor de trombopoyetina) y receptor de G-CSF), heterodímeros cuyas subunidades tienen cada una dominios de unión al ligando y efectores (p. ej., isoforma a1 del receptor de PDGF), y multímeros que tienen subunidades componentes con funciones dispares (p. ej., receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 y GM-CSF). Algunas subunidades de receptores son comunes a una pluralidad de receptores. Por ejemplo, la subunidad AIC2B, que no puede unir el ligando por sí misma pero incluye un dominio de transducción de señales intracelular, es un componente de los receptores de IL-3 y GM-CSF. Muchos receptores de citoquinas se pueden poner en una de cuatro familias relacionadas basándose en sus estructuras y funciones. Los receptores hematopoyéticos de clase I, por ejemplo, se caracterizan por la presencia de un dominio que contiene restos de cisteína conservados y el patrón WSXWS. En algunos receptores hematopoyéticos están presentes dominios adicionales, que incluyen dominios de proteína quinasa; dominios de fibronectina de tipo III y dominios de inmunoglobulina, que se caracterizan por los bucles unidos por disulfuro. La estructura de los receptores de citoquinas se ha revisado en Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26: 221-228, 1991 y Cosman, Cytokine 5: 95-106, 1993. Se cree en general que bajo una presión selectiva para que los organismos adquieran nuevas funciones biológicas surgen nuevos miembros de las familias de receptores a partir del duplicado de los genes de receptores existentes conduciendo a la existencia de familias de múltiples genes. Por lo tanto, los miembros de las familias contienen vestigios de los genes ancestrales, y estas características se pueden explotar en el aislamiento y la identificación de miembros adicionales de las familias.

[0042] Los receptores de citoquinas de superficie celular se caracterizan además por la presencia de dominios adicionales. Estos receptores están anclados en la membrana celular por un dominio transmembrana caracterizado por una secuencia de restos de aminoácidos hidrófobos (típicamente aproximadamente 21-25 restos), que normalmente está flanqueada por restos con carga positiva (Lys o Arg). En el extremo contrario de la proteína desde el dominio extracelular y separado del mismo por el dominio transmembrana hay un dominio intracelular.

[0043] El receptor Zcytor11 es un receptor de citoquinas de clase II. Estos receptores normalmente se unen a citoquinas de haces de 4 hélices. La interleuquina-10 y los interferones tienen receptores de esta clase (p. ej., cadenas alfa y beta de interferón gamma y las cadenas alfa y beta de receptor de interferón alfa/beta). Los receptores de citoquinas de clase II se caracterizan por la presencia de uno o más módulos de receptores de citoquinas (CRM) en sus dominios extracelulares. Los CRM de los receptores de citoquinas de clase II son algo diferentes de los CRM de los receptores de citoquinas de clase I mejor conocidos. Aunque los CRM de clase II contienen dos dominios de tipo fibronectina de tipo III, difieren en la organización.

[0044] Zcytor11, como todos los receptores de clase II conocidos, excepto la cadena alfa del receptor de interferón alfa/beta, solo tiene un CRM de clase II en su dominio extracelular. Zcytor11 es un receptor para una citoquina helicoidal de la clase interferón/IL-10. Como se ha expuesto antes, Zcytor11 es similar a la cadena a del receptor de interferón a. Uze y col. Cell 60 255-264 (1996), El análisis de un clon de ADNc humano que codifica Zcytor11 (SEQ ID NO: 1) puso de manifiesto un marco de lectura abierto que codifica 574 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que comprende un dominio de unión al ligando extracelular de aproximadamente 211 restos de aminoácidos (restos 18-228 de la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3), un dominio transmembrana de aproximadamente 23 restos de aminoácidos (restos 229-251 de la SEQ ID NO: 2), y un dominio intracelular de aproximadamente 313 restos de aminoácidos (restos 252 a 574 de la SEQ ID NO: 2). Los expertos en la materia reconocerán que estos límites de dominios son aproximados y se basan en los alineamientos con proteínas conocidas y predicciones de plegado de proteínas. Es posible la eliminación de restos de los extremos de los dominios.

[0045] Además, se ha mostrado que el receptor zcytor11 se une a un ligando llamado factor inducible de linfocitos T (TIF o IL-TIF) (véase la publicación WIPO WO 00/24758; Dumontier y col., J. Immunol. 164: 1814-1819, 2000; y Xie y col., J. Biol. Chem. pendiente de publicación M005304200). La secuencia de nucleótidos del IL-TIF humano está representada en la SEQ ID NO: 7 y la correspondiente secuencia del polipéptido se muestra en la SEQ ID NO: 8. Dentro de las realizaciones preferidas, la forma del receptor soluble de zcytor11, restos 18-228 de la SEQ ID NO: 2, (SEQ ID NO: 3), es un homodímero, heterodímero o multímero que antagoniza a los efectos del IL-TIF in vivo. Los anticuerpos contra dicho homodímero, heterodímero o multímero también sirven como antagonistas de la actividad de IL-TIF.

[0046] Se ha mostrado que el IL-TIF es inducido en presencia de IL-9, y se sospecha que está implicado en la promoción de respuestas inmunitarias de tipo Th1. La IL-9 estimula la proliferación, activación, diferenciación y/o inducción de la función inmunitaria en una variedad de formas y está implicada en el asma, mastocitosis pulmonar y otras enfermedades, y también activa las rutas STAT. Los antagonistas de la función de IL-TIF o IL-9 pueden tener un uso beneficioso contra dichas enfermedades humanas. La presente invención proporciona dichos nuevos antagonistas de IL-TIF.

[0047] La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de una nueva proteína heterodímera de receptores soluble, que tiene la estructura de un receptor de citoquinas de clase II y anticuerpos contra la misma. El receptor soluble heterodímero incluye al menos una subunidad del receptor soluble zcytor11, descrita en la patente de EE.UU. de propiedad común 5.965.704. Un segundo polipéptido receptor soluble incluido en el receptor soluble heterodímero pertenece a la subfamilia de receptores que incluyen la interleuquina 10 (Liu Y y col., J Immunol. 152; 1821-1829, 1994 (EL-10R cDNA) (SEQ ID NO: 34)), los interferones (p. ej., cadenas alfa, beta del interferón gamma y cadenas alfa y beta del receptor del interferón alfa/beta), CRF2-4 (Nº de acceso en Genbank Z17227; SEQ ID NO: 33), y DIRS1 (publicación WIPO WO99/46379, Schering Corporation, 1999; SEQ ID NO: 35). Se mostró que el receptor zcytor11 junto con CRF2-4 y el receptor de IL-10 señaliza la ruta JAK-STAT en respuesta al ligando natural para el receptor zcytor11, IL-TIF (Xie y col., véase antes.). Como se describe en el presente documento, un receptor zcytor11 soluble heterodímero, como se ilustra por una realización preferida de un heterodímero de receptor zcytor11 soluble + receptor CRF2-4 (zcytor11/ CRF2-4), puede actuar como un potente antagonista del IL-TIF. Otras realizaciones incluyen el heterodímero soluble zcytor11/IL-10R, zcylor11/IL-9R, y otras subunidades de receptores de clase II, así como receptores multímeros incluyendo pero sin limitar zcytor11/CRF2-4/IL-10R y zcytor11/ CRF2-4/IL-9R.

[0048] El análisis de la distribución tisular del ARNm correspondiente al ADNc de zcytor11 mostró que el nivel de ARNm era más alto en el páncreas, seguido por niveles mucho menores en el timo, colon, hígado, piel, pulmón, riñón e intestino delgado. Por lo tanto, realizaciones particulares de la presente invención se dirigen hacia el uso de heterodímeros de zcytor11 solubles como antagonistas en enfermedades o afecciones inflamatorias e inmunitarias tales como la pancreatitis, diabetes de tipo I (DMDI), cáncer pancreático, pancreatitis, enfermedad de Graves, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad de Crohn, cáncer de colon e intestinal, diverticulosis, enfermedad autoinmunitaria, septicemia, asma, enfermedades renales terminales, psoriasis, trasplante de órgano o médula ósea; y en las que se desee la inhibición de la inflamación, supresión inmunitaria, reducción de la proliferación de células hematopoyéticas, inmunitarias, inflamatorias o linfoides, macrófagos, linfocitos T (incluyendo linfocitos Th1 y Th2), supresión de respuesta inmunitaria contra un patógeno o antígeno o inhibición de la producción de citoquinas IL-TIF o IL-9.

[0049] Además, los anticuerpos que reconocen zcytoR11, heterodímeros y multímeros de zcytoR11/CRF2-4 solubles, descritos en el presente documento y/o los propios heterodímeros y multímeros de zcytoR11/CRF2-4 solubles, son útiles para:

1) antagonizar o bloquear la señalización a través de los receptores de IL-TIF en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la DMDI, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia grave, artritis reumatoide, y EII, para prevenir o inhibir la señalización en células inmunitarias (p. ej., linfocitos, monocitos, leucocitos) a través de zcytoR11 (Hughes C., y col., J. Immunol. 153: 3319-3325, 1994). Alternativamente, se puede usar un anticuerpo monoclonal (Mab) dirigido contra zcytor11 soluble, contra el heterodímero o multímero de zcytoR11/CRF2-4 soluble, como un antagonista para reducir las células inmunitarias no deseadas para tratar la enfermedad autoinmunitaria. El asma, la alergia y otras enfermedades atópicas se pueden tratar con un Mab contra zcytor11 soluble, heterodímeros de zcytoR11/CRF2-4 solubles, para inhibir la respuesta inmunitaria o reducir las células culpables. El bloqueo o la inhibición de la señalización a través de zcytoR11, usando los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención, también puede beneficiar a enfermedades del páncreas, riñón, pituitaria y células neuronales. Se pueden beneficiar la DMDI, DMNDI, pancreatitis y carcinoma pancreático. ZcytoR11 puede servir como diana para la terapia del cáncer con Mab, en la que un Mab antagonizante inhibe el crecimiento del cáncer y dirige la muerte inmunomediada (Holliger P., y Hoogenboom, H.: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Los Mab contra zcytoR11 soluble, y heterodímeros y multímeros de zcytoR11/CRF2-4 solubles, también pueden ser útiles para tratar nefropatías tales como glomeruloesclerosis, nefropatía membranosa, amiloidosis (que también afecta al riñón entre otros tejidos), glomerulonefritis de diferentes orígenes, enfermedades fibroproliferativas del riñón, así como disfunción renal asociada con LES, DMDI, diabetes de tipo II (DMNDI), tumores renales y otras enfermedades.

2) agonizar o iniciar la señalización a través de los receptores de IL-TIF en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la DMDI, LES, miastenia grave, artritis reumatoide y EII. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra zcytor11 soluble, contra heterodímeros y multímeros de zcytoR11/CRF2-4 soluble, pueden señalizar linfocitos u otras células inmunitarias para diferenciar, alterar la proliferación o cambiar la producción de citoquinas o proteínas de la superficie celular que mejoran la autoinmunidad. Específicamente, la modulación de una respuesta de linfocitos T auxiliares a un patrón alternativo de secreción de citoquinas, puede desviar una respuesta autoinmunitaria para mejorar la enfermedad (Smith J.A., y col., J. Immunol. 160: 4841-4849, 1998). Igualmente, se pueden usar anticuerpos monoclonales agonistas dirigidos contra zcytor11 soluble, heterodímeros y multímeros de zcytoR11/CRF2-4 solubles, para señalizar, reducir y desviar las células inmunitarias implicadas en el asma, alergia y enfermedades atópicas. La señalización a través de zcytoR11 también puede beneficiar a enfermedades del páncreas, riñón, pituitaria y células neuronales. Se pueden beneficiar la DMDI, DMNDI, pancreatitis y carcinoma pancreático. ZcytoR11 puede servir como diana para la terapia del cáncer pancreático con Mab, en la que un Mab de señalización inhibe el crecimiento del cáncer y dirige la muerte inmunomediada (Tutt, A.L., y col., J. Immunol.

161: 3175-3185, 1998). Igualmente, el carcinoma de células renales se puede tratar con anticuerpos monoclonales contra receptores solubles que comprenden zcytoR11 de la presente invención.

[0050] Zcytor11 soluble, heterodímeros y multímeros de zcytoR11/CRF2-4 solubles descritos en el presente documento, se pueden usar para neutralizar/bloquear la actividad del IL-TIF en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, enfermedades atópicas, DMNDI, pancreatitis y disfunción renal como se ha descrito antes. Una forma soluble de zcytoR11 se puede usar para promover una respuesta de anticuerpos mediada por linfocitos Th y/o para promover la producción de IL-4 u otras citoquinas, por linfocitos u otras células inmunitarias.

[0051] Los receptores solubles descritos en el presente documento son útiles como antagonistas de la citoquina IL-TIF. Dichos defectos antagonistas se pueden lograr por la neutralización directa o unión del IL-TIF. Además de los usos como antagonistas, los receptores solubles de la presente invención se pueden unir al IL-TIF y actuar como proteínas transportadoras para la citoquina IL-TIF, con el fin de transportar el ligando a diferentes tejidos, órganos y células en el cuerpo. Como tales, los receptores solubles de la presente invención se pueden fusionar o acoplar a moléculas, polipéptidos o restos químicos que dirigen el complejo de receptor soluble-ligando a un sitio específico, tal como un tejido, célula del sistema inmunitario o tumor. Por lo tanto, los receptores solubles descritos en el presente documento se pueden usar para dirigir específicamente la acción del IL-TIF. Véase, Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; y Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513, 2000.

[0052] Además, los receptores solubles descritos en el presente documento se pueden usar para estabilizar el IL-TIF, para aumentar la biodisponibilidad, longevidad terapéutica y/o eficacia del ligando estabilizando al ligando frente a la degradación o eliminación, o dirigiendo al ligando a un sitio de acción en el cuerpo. Por ejemplo, el complejo de IL-6/IL-6R soluble estabiliza la IL-6 y puede señalizar a través del receptor gp130. Véase, Cosman, D. véase antes., y Fernandez-Botran, R., véase antes.

[0053] Los polinucleótidos aislados pueden hibridar con regiones de tamaño similar de los nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 correspondiente a la SEQ ID NO: 3 o una secuencia complementaria de la misma, en condiciones restrictivas. En general, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sea aproximadamente 5 ºC inferior al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidas) a la que 50 % de la secuencia diana hibrida con una sonda con la que se empareja perfectamente. Las condiciones restrictivas típicas son aquellas en las que la concentración de sal es al menos aproximadamente 0,02 M a pH 7 y la temperatura es al menos aproximadamente 60 ºC. Como se ha indicado previamente, los polinucleótidos aislados incluyen ADN y ARN. Los procedimientos para aislar el ADN y ARN son bien conocidos en la materia. En general, se prefiere aislar el ARN de tejido pancreático o prostático, aunque el ADNc también se puede preparar usando ARN de otros tejidos o aislar como ADN genómico. El ARN total se puede preparar usando extracción con guanidina-HCl seguido de aislamiento por centrifugación en un gradiente de CsCl. (Chirgwin y col., Biochemistry 18: 52-94, (1979)). El poli(A) + ARN se prepara a partir del ARN total usando el procedimiento de Aviv y Leder Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412, (1972). El ADN complementario (ADNc) se prepara a partir del poli(A) + ARN usando procedimientos conocidos. Después se identifican y aíslan los polinucleótidos que codifican los polipéptidos Zcytor11, por ejemplo, por hibridación o PCR.

[0054] Los expertos en la materia reconocerán que las secuencias descritas en la SEQ ID NO: 3 y los correspondientes nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 representan los alelos individuales del receptor Zcytor11 humano. Las variantes alélicas de estas secuencias se pueden clonar mediante hibridación con ADNc o bibliotecas genómica de diferentes individuos de acuerdo con procedimientos estándar.

[0055] La memoria descriptiva describe receptores y polinucleótidos homólogos de otras especies (“ortólogos de especies”). Tienen un interés particular los receptores Zcytor11 de otras especies de mamíferos, incluyendo murina, porcina, ovina, bobina, canina, felina, equina y primates no humanos. Los ortólogos de especies del receptor Zcytor11 humano se pueden clonar usando la información y composiciones proporcionadas por la presente invención, en combinación con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, se pueden clonar un ADNc usando el ARNm obtenido de un tejido o tipo de célula que expresa el receptor. Las fuentes adecuadas de ARNm se pueden identificar por hibridación de transferencias Northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas en el presente documento. Después se prepara una biblioteca a partir del ARNm de un tejido o línea celular positiva. Se puede aislar entonces el ADNc que codifica el receptor por una variedad de procedimientos, tal como por hibridación con un ADNc completo o parcial de ser humano y otros primates, o con uno o más grupos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. También se puede clonar un ADNc usando la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Mullis, patente de EE.UU. nº 4.683.202), usando cebadores diseñados a partir de las secuencias descritas en el presente documento. En un procedimiento adicional, se puede usar la biblioteca de ADNc para transformar o transfectar células huésped, y se puede detectar la expresión del ADNc de interés con un anticuerpo contra el receptor. También se pueden aplicar técnicas similares al aislamiento de clones genómicos.

[0056] La memoria descriptiva describe polipéptidos receptores monómeros, homodímeros, heterodímeros y multímeros solubles aislados, que comprenden al menos una subunidad del receptor zcytor11 que es sustancialmente homóloga al polipéptido receptor de la SEQ ID NO: 3. Por “aislado” se entiende una proteína o polipéptido que se encuentra en unas condiciones distintas de su entorno natural, tal como fuera de la sangre y tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado carece sustancialmente de otros polipéptidos, en particular otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, más de 95 % puros, más preferiblemente más de 99 % puros. La expresión “sustancialmente homólogos” se usa en el presente documento para indicar polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de 50 %, preferiblemente 60 %, más preferiblemente al menos 80 % con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3. Dichos polipéptidos preferiblemente serán al menos 90 % idénticos y lo más preferiblemente 95 % o más idénticos a la SEQ ID NO: 3. El porcentaje de identidad de secuencia se determina por procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul y col., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, (1986) y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, (1992). Brevemente, se alinean dos secuencias de aminoácidos para optimizar las puntuaciones de alineamiento usando una penalización de apertura de hueco de 10, una penalización de extensión de hueco de 1 y la matriz de puntuación "blossom 62" de Henikoff y Henikoff (véase antes) como se muestra en la tabla 2 (los aminoácidos se indican por los códigos estándar de una letra). El porcentaje de identidad se calcula entonces como:

5 [0057] La identidad de las moléculas de polinucleótidos se determina por procedimientos similares usando una relación como la descrita antes.

[0058] Los expertos en la materia apreciarán que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitudes “FASTA” de Pearson y Lipman es un

10 procedimiento de alineamiento de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad que comparten una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento y la secuencia de aminoácidos de una variante putativa ztryp1. El algoritmo FASTA se describe en Pearson y Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), y en Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990).

15 [0059] Brevemente, FASTA caracteriza primero la similitud de secuencia identificando regiones compartidas por la secuencia en cuestión (p. ej., SEQ ID NO: 3) y una secuencia de ensayo, que tienen la densidad de

identidades más alta (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup = 2), sin considerar las sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos conservativas. Después las 10 regiones con la mayor densidad de identidades se vuelven a puntuar comparando las similitud de todos los aminoácidos emparejados usando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se “recortan” para incluir solo los restos que 5 contribuyen a la puntuación más alta. Si hay varias regiones con puntuaciones mayores que el valor de “corte” (calculado por una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup), entonces las regiones iniciales recortadas se examinan para determinar si las regiones se pueden unir para formar un alineamiento aproximado con huecos. Finalmente, las regiones con la puntuación más alta de las dos secuencias de aminoácidos se alinean usando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y

10 Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)), que permite inserciones y eliminaciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para el análisis FASTA son: ktup = 1, penalización de apertura de hueco = 10, penalización de extensión de hueco = 1, y matriz de sustitución = BLOSUM62. Estos parámetros se pueden introducir en un programa FASTA modificando la fila de la matriz de puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol., véase antes.

15 [0060] FASTA también se puede usar para determinar la identidad de secuencia de moléculas de ácido nucleico usando una relación como se ha descrito antes. Para comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede estar en el intervalo entre 1 y 6, preferiblemente de 3 a 6, lo más preferiblemente 3, con los otros parámetros del programa FASTA ajustados por defecto.

20 [0061] La tabla de BLOSUM62 (Tabla 2) es una matriz de sustitución de aminoácidos obtenida a partir de aproximadamente 2.000 alineamientos múltiples locales de segmentos de secuencias de proteína, que representan las regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)). Por consiguiente, se pueden usar las frecuencias de sustitución de

25 BLOSUM62 para definir sustituciones de aminoácidos conservativas que se pueden introducir en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque se pueden diseñar sustituciones de aminoácidos basadas solamente en propiedades químicas (como se discute más adelante), la frase “sustitución de aminoácido conservativa” se refiere preferiblemente a una sustitución representada por un valor de BLOSUM62 mayor que -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2 ó 3.

30 De acuerdo con este sistema, las sustituciones de aminoácidos conservativas preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (p. ej., 1, 2 ó 3), mientras que las sustituciones de aminoácidos conservativas más preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (p. ej., 2 ó 3).

[0062] Las proteínas y polipéptidos sustancialmente homólogos se caracterizan por tener una o más

35 sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de naturaleza poco importante, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativas (véase la tabla 3) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegado o la actividad de la proteína o el polipéptido; eliminaciones pequeñas, típicamente de 1 a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones pequeñas amino- o carboxilo-terminales tal como un resto de metionina amino-terminal, un péptido conector pequeño de hasta aproximadamente 20-25 restos,

40 o una extensión pequeña que facilita la purificación (un marcador de afinidad), tal como un segmento de polihistidina, proteína A (Nilsson y col., EMBO J. 4: 1075, (1985); Nilsson y col., Methods Enzymol. 198: 3, (1991)), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67: 31, 1988), u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general Ford y col., Protein Expression and Purification 2: 95-107, (1991). Los ADN que codifican marcadores de afinidad están disponibles en proveedores comerciales (p. ej., Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).

45 Tabla 3

Sustituciones de aminoácidos conservativas

Básicos: arginina lisina histidina

Ácidos: ácido glutámico ácido aspártico

Polares: glutamina asparagina

Hidrófobos: leucina isoleucina valina

Aromáticos: fenilalanina triptófano tirosina

Pequeños: glicina alanina serina treonina metionina

[0063] Los aminoácidos esenciales en polipéptidos receptores se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la materia, tales como mutagénesis de sitio específico dirigida o mutagénesis de barrido con alanina (Cunningham y Wells, Science 244, 1081-1085, (1989); Bass y col., Proc. Natal Acad. Sci. USA

88: 4498-4502, (1991)). En esta última técnica, se introducen mutaciones de alanina individuales en cada resto en la molécula, y se ensaya en las moléculas mutantes resultantes la actividad biológica (por ejemplo, unión al ligando y transducción de señales) para identificar los restos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción de ligando-receptor también se pueden determinar por análisis de la estructura cristalina, determinada por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcaje de fotoafinidad. Véase, por ejemplo, de Vos y col., Science 255: 306-312, (1992); Smith y col., J. Mol. Biol. 224: 899-904, (1992); Wlodaver y col., FEBS Lett 309: 59-64, (1992). Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir a partir del análisis de homologías con receptores relacionados.

[0064] Se pueden hacer múltiples sustituciones de aminoácidos ensayarlas usando procedimientos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, Science 241: 53-57, (1988) o Bowie y Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, (1989). Brevemente, estos autores describen procedimientos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional y después secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones posibles en cada posición. Otros procedimientos que se pueden usar incluyen la presentación en fagos, p. ej. Lowman y col., Biochem. 30: 10832-10837, (1991); Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409; Huse, publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida de la región (Derbyshire y col., Gene 46: 145, (1986); Ner y col. DNA 7: 127, (1988)).

[0065] Los procedimientos de mutagénesis descritos antes, se pueden combinar con procedimientos de cribado de alto rendimiento para detectar la actividad de receptores mutagenizados, clonados en células huésped. Los ensayos preferidos en relación con esto, incluyen ensayos de proliferación celular y ensayos de unión al ligando basados en biosensores, que se describen más adelante. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican receptores activos o partes de los mismos (p. ej., fragmentos de unión al ligando) se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente usando un equipamiento moderno. Estos procedimientos permiten la determinación rápida de la importancia de los restos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

[0066] Usando los procedimientos discutidos antes, un experto en la materia puede preparar una variedad de polipéptidos que comprenden una subunidad del receptor soluble que es sustancialmente homóloga a la SEQ ID NO: 3 o variantes alélicas de la misma, y retener las propiedades de unión al ligando del receptor natural. Dichos polipéptidos pueden incluir aminoácidos adicionales de un dominio de unión al ligando extracelular de un receptor Zcytor11, así como parte o todos los dominios transmembrana e intracelulares. Dichos polipéptidos también pueden incluir segmentos de polipéptidos adicionales como se ha descrito antes en general.

[0067] Los polipéptidos receptores descritos en el presente documento, incluyendo receptores homodímeros, heterodímeros y multímeros solubles, receptores de longitud entera, fragmentos de receptores (p. ej., fragmentos de unión al ligando) y polipéptidos de fusión, se pueden producir en células huésped genéticamente modificadas de acuerdo con técnicas convencionales. Las células huésped adecuadas son aquellos tipos de células que se pueden transformar o transfectar con ADN exógeno y cultivar e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucariotas superiores cultivadas. Se prefieren las células eucariotas, en particular las células cultivadas de organismos pluricelulares. Se describen técnicas para la manipulación de moléculas de ADN clonadas e introducción de ADN exógeno en una variedad de células huésped en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989), y Ausubel y col., citado antes, que se incorporan en el presente documento por referencia.

[0068] En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido receptor soluble Zcytor11, o una secuencia de ADN que codifica una subunidad adicional de un receptor soluble Zcytor11 heterodímero o multímero,

p. ej., polipéptido CRF2-4 o IL10R, está operativamente unida a otros elementos genéticos necesarios para su expresión, que en general incluyen un promotor y terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. Normalmente, el vector también contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la materia reconocerán que en determinados sistemas los marcadores seleccionables se pueden proporcionar en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno se puede proporcionar por integración en el genoma de la célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un problema de diseño rutinario para el experto en la materia. Muchos de dichos elementos están descritos en la bibliografía y están disponibles en proveedores comerciales. Se pueden cotransfectar múltiples componentes de un complejo de receptores soluble en vectores de expresión individuales o pueden estar contenidos en un solo vector de expresión. Dichas técnicas de expresión de múltiples componentes de complejos de proteínas son bien conocidas en la materia.

[0069] Para dirigir un polipéptido receptor Zcytor11 homodímero, heterodímero y multímero a la ruta de secreción de una célula huésped, se proporciona una secuencia de señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o presecuencia) en el vector de expresión. La secuencia de señal secretora puede ser la del receptor, o puede derivar de otra proteína secretada (p. ej., t-PA) o puede ser de síntesis nueva. La secuencia de señal secretora se une a la secuencia de ADN de Zcytor11 en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señales secretoras normalmente se sitúan 5’ respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque algunas secuencias de señales se pueden situar en cualquier otro sitio en la secuencia de ADN de interés (véase, p. ej., Welch y col., patente de EE.UU. nº 5.037.743; Holland y col., patente de EE.UU. nº 5.143.830).

[0070] Las células de mamífero cultivadas son los huéspedes preferidos. Los procedimientos para introducir ADN exógeno en células huésped de mamífero incluyen la transfección mediada por fosfato cálcico (Wigler y col., Cell 14: 725, (1978); Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, (1981): Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, (1973)), electroporación (Neumann y col., EMBO J. 1: 841-845, (1982)), transfección mediada por DEAEdextrano (Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)), y transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson y col., Focus 15: 73, (1993); Ciccarone y col., Focus 15: 80, (1993)), que se incorporan en el presente documento por referencia. La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas se describe, por ejemplo, en Levinson y col., patente de EE.UU. nº 4.713.339; Hagen y col., patente de EE.UU. nº 4.784.950; Palmiter y col., patente de EE.UU. nº 4.579.821; y Ringold, patente de EE.UU. nº 4.656.134. Las células de mamífero cultivadas adecuadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC Nº CRL 1650), COS-7 (ATCC Nº CRL 1651), BHK (ATCC Nº CRL 1632), BHK 570 (ATCC Nº CRL 10314), 293 (ATCC Nº CRL 1573; Graham y col., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) y ovario de hámster chino (p. ej. CHO-K1; ATCC Nº CCL 61). En la materia se conocen líneas celulares adecuadas adicionales, y están disponibles en depósitos públicos tales como la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. En general, se prefieren los promotores de transcripción fuerte, tales como los promotores de SV-40 o citomegalovirus. Véase, p. ej., patente de EE.UU. nº 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen los de los genes de metalotioneína (patentes de EE.UU. nº 4.579.821 y 4.601.978) y el promotor principal tardío de adenovirus.

[0071] La selección con fármacos se usa en general para seleccionar las células de mamífero cultivadas en las que se ha insertado el ADN extraño. Dichas células normalmente se denominan “transfectantes”. Las células que se han cultivado en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie se denominan “transfectantes estables”. Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similar. También se pueden usar sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, procedimiento que se denomina “amplificación”. La amplificación se lleva a cabo cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y después aumentando la cantidad del agente selectivo para seleccionar las células que producen niveles altos de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionables amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. También se pueden usar otros genes de resistencia a fármacos (p. ej., resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa).

[0072] También se pueden usar otras células eucariotas superiores como huéspedes, incluyendo células de insectos, células de plantas y células aviares. La transformación de células de insectos y producción de polipéptidos extraños en las mismas se describe en Guarino y col., patente de EE.UU. nº 5.162.222; Bang y col., patente de EE.UU. nº 4.775.624; y publicación WIPO WO 94/06463, que se incorporan en el presente documento por referencia. El uso de Agrobacterium rhizogenes como vector para expresar genes en células de plantas se ha revisado en Sinkar y col., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, (1987).

[0073] También se pueden usar células fúngicas, incluyendo células de levaduras, y en particular células del genero Saccharomyces, en la presente invención, tal como para producir fusiones de polipéptidos o fragmentos de receptores. Los procedimientos para transformar células de levaduras con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes de las mismas se describe, por ejemplo, en Kawasaki, patente de EE.UU. nº 4.599.311; Kawasaki y col., patente de EE.UU. nº 4.931.373; Brake, patente de EE.UU. nº 4.870.008; Welch y col., patente de EE.UU. nº 5.037.743; y Murray y col., patente de EE.UU. nº 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, normalmente la resistencia a un fármaco o la capacidad para crecer en ausencia de un nutriente particular (p. ej., leucina). Un sistema vector preferido para usar en levaduras es el sistema vector POT1 descrito por Kawasaki y col. (patente de EE.UU. nº 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas por crecimiento en medio que contiene glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para usar en levaduras incluyen los de los genes de enzimas glicolíticas (véase, p. ej., Kawasaki, patente de EE.UU.

nº 4.599.311; Kingsman y col., patente de EE.UU. nº 4.615.974; y Bitter, patente de EE.UU. nº 4.977.092) y genes de la alcohol deshidrogenasa. Véase también las patentes de EE.UU. nº 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 y

4.661.454. Se conocen en la materia sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véase, por ejemplo, Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, (1986) y Cregg, patente de EE.UU. nº 4.882.279. Se pueden usar células de Aspergillus de acuerdo con los procedimientos de McKnight y col., patente de EE.UU. nº 4.935.349. Se describen procedimientos para transformar Acremonium chryswogenum, en Sumino y col., patente de EE.UU. nº 5.162.228. Se describen procedimientos para transformar Neurospora en Lambowitz, patente de EE.UU. nº 4.486.533.

[0074] Las células huésped transformadas o transfectadas se cultivan de acuerdo con procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes necesarios para el crecimiento de las células huésped elegidas. Se conocen en la materia una variedad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, y en general incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, según sea necesario. El medio de crecimiento en general seleccionará las células que contienen el ADN exógeno añadido, por ejemplo, mediante selección con fármaco o deficiencia de un nutriente esencial que es complementado por el marcador seleccionable que lleva el vector de expresión o cotransfectado en la célula huésped.

[0075] En otro aspecto, se produce un nuevo receptor soluble como se describe en el presente documento mediante una célula cultivada, y la célula se usa para cribar los ligandos para el receptor, incluyendo el ligando natural, IL-TIF, así como agonistas y antagonistas del ligando natural. Para resumir este procedimiento, un ADNc o gen que codifica el receptor se combina con otros elementos genéticos necesarios para su expresión (p. ej., un promotor de la transcripción), y el vector de expresión resultante se inserta en una célula huésped. Las células que expresan el ADN y producen el receptor funcional se seleccionan y se usan en una variedad de sistemas de cribado. Cada componente del complejo de receptores homodímero, heterodímero y multímero puede ser expresado en la misma célula.

[0076] Las células de mamífero adecuadas para usar en la expresión de receptores Zcytor11 y transducción de una señal mediada por el receptor, incluyen células que expresan otras subunidades de receptor que pueden formar un complejo funcional con Zcytor11. Estas subunidades pueden incluir las de la familia de receptores de interferones

o de otros receptores de citoquinas de clase I o clase II, p. ej., CRF2-4, IL-10R, y IL-9R. También se prefiere usar una célula de la misma especie que el receptor que se va a expresar. En una realización preferida, la célula depende del factor de crecimiento hematopoyético suministrado de forma exógena para su proliferación. Las líneas celulares preferidas de este tipo son la línea celular TF-1 humana (ATCC nº CRL-2003) y la línea celular AML-193 (ATCC nº CRL-9589), que son líneas celulares leucémicas humanas dependientes del GM-CSF y BaF3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985)) que es una línea de pre-linfocitos B murina dependiente de IL-3. Otras líneas celulares incluyen células BHK, COS-1 y CHO.

[0077] Las células huésped adecuadas se pueden diseñar para producir las subunidades de receptores necesarias u otros componentes celulares necesarios para la respuesta celular deseada. Este procedimiento es ventajoso porque las líneas celulares se pueden diseñar para expresar subunidades de receptores de cualquier especie, superando así las potenciales limitaciones que surgen de la especificidad de especies. Las especies ortólogas del ADNc del receptor humano se pueden clonar y usar en las líneas celulares de la misma especie, tales como un ADNc de ratón en la línea celular BaF3. Las líneas celulares que dependen de un factor de crecimiento hematopoyético, tal como GM-CSF o IL-3, se pueden diseñar así para convertirse en dependientes de IL-TIF.

[0078] Las células que expresan el receptor funcional se usan en ensayos de cribado. En la técnica se conocen una variedad de ensayos adecuados. Estos ensayos se basan en la detección de una respuesta biológica en una célula diana. Uno de dichos ensayos es un ensayo de proliferación celular. Las células se cultivan en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo y se detecta la proliferación, por ejemplo, midiendo la incorporación de timidina tritiada o por un ensayo colorimétrico basado en la rotura metabólica del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil-tetrazolio (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, (1983)). Un formato de ensayo alternativo usa células que se diseñan además para expresar un gen indicador. El gen indicador está unido a un elemento promotor que es sensible a la ruta ligada al receptor, y el ensayo detecta la activación de la transcripción del gen indicador. Un elemento promotor preferido en relación con esto, es un elemento de respuesta al suero, o SRE. Véase, p. ej., Shaw y col., Cell 56: 563-572, (1989). Uno de dichos genes indicadores preferido es un gen de luciferasa (de Wet y col., Mol. Cell. Biol. 7: 725, (1987)). La expresión del gen de luciferasa se detecta por luminiscencia usando procedimientos conocidos en la materia (p. ej., Baumgartner y col., J. Biol. Chem. 269: 29094-29101, (1994); Schenbom y Goiffin, Promega_Notes 41: 11, 1993). Están disponibles kits de ensayo de la actividad de luciferasa, por ejemplo, en Promega Corp., Madison, WI. Las líneas celulares diana de este tipo se pueden usar para cribar bibliotecas de compuestos químicos, medios de cultivo condicionados de células, caldos fúngicos, muestras de suelo, muestras de agua, y similares. Por ejemplo, se puede ensayar en un banco de muestras de medios condicionados de células una célula diana para identificar células que producen el ligando. Las células positivas después se usan para producir una biblioteca de ADNc en un vector de expresión de mamífero, que se divide en grupos, se transfecta en células huésped y se expresa. Las muestras de medio de las células transfectadas después se ensayan con la posterior división de grupos, retransfección, subcultivo, y reensayo de las células positivas para aislar un ADNc clonado que codifica el ligando.

[0079] Un ligando natural para el receptor Zcytor11 también se puede identificar mediante mutagénesis de una línea celular que expresa el receptor de longitud completa y cultivo en condiciones que seleccionan el crecimiento o autocrino. Véase la publicación WIPO WO 95/21930. En un procedimiento típico, se lleva a cabo la mutagénesis de células BaF3 dependientes de IL-3 que expresan Zcytor11 y las subunidades adicionales necesarias, tal como con 2-etilmetanosulfonato (EMS). Después, se deja que las células se recuperen en presencia de IL-3, y después se transfieren a un medio de cultivo que carece de IL-3 e IL-4. Las células que sobreviven se criban de acuerdo con la producción de un IL-TIF, tal como mediante la adición de receptor soluble al medio de cultivo o mediante el ensayo de medios condicionados en las células BaF3 naturales y células BaF3 que expresan el receptor. Usando este procedimiento, se pueden identificar las células y tejidos que expresan IL-TIF.

[0080] Un procedimiento de cribado adicional proporcionado por la presente invención, incluye el uso de polipéptidos receptores híbridos. Estos polipéptidos híbridos son de una de dos clases. En la primera clase, el dominio intracelular de Zcytor11 que comprende aproximadamente los restos de 252 a 574 de la SEQ ID NO: 2, se une al dominio de unión al ligando de un segundo receptor. Se prefiere que el segundo receptor sea un receptor de citoquinas hematopoyético, tal como el receptor mpl (Souyri y col., Cell 63: 1137-1147, (1990)). El receptor híbrido puede comprender además un dominio transmembrana, que se puede obtener de cualquiera de los receptores. Después se inserta una construcción de ADN que codifica el receptor híbrido en una célula huésped. Las células que expresan el receptor híbrido se cultivan en presencia de un ligando para la unión al dominio y se ensaya la respuesta. Este sistema proporciona un medio para analizar la transducción de señales mediada por Zcytor11 usándose ligandos fácilmente disponibles. Este sistema también se puede usar para determinar si líneas celulares particulares son capaces de responder a señales transducidas por heterodímeros y multímeros de Zcytor11 de la presente invención. Una segunda clase de polipéptidos receptores híbridos comprende el dominio extracelular (unión al ligando) de Zcytor11 (aproximadamente los restos 18 a 228 de las SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3) con un dominio intracelular de un segundo receptor, preferiblemente un receptor de citoquinas hematopoyético, y un dominio transmembrana. Los heterodímeros y multímeros de Zcytor11 híbridos de los receptores de la presente invención de esta segunda clase, son expresados en células que se sabe que son capaces de responder a señales transducidas por el segundo receptor. Juntos, estas dos clases de receptores híbridos permiten la identificación de un tipo de célula sensible para el desarrollo de un ensayo para detectar un IL-TIF. Además, dichas células se pueden usar en presencia del IL-TIF para ensayar los antagonistas del receptor solubles de la presente invención en un ensayo de tipo competitivo. En dicho ensayo, una disminución de la proliferación o de la actividad de transducción de señales de IL-TIF en presencia de un receptor soluble de la presente invención demuestra la actividad antagonista. Además los ensayos de unión de receptor soluble-IL-TIF se puede usar para evaluar si un receptor soluble antagoniza la actividad de IL-TIF.

[0081] Las células que se encuentra que expresan el ligando, después se usan para preparar una biblioteca de ADNc a partir de la cual se puede aislar en ADNc que codifica el ligando como se ha descrito antes. Por lo tanto, la presente invención proporciona además de nuevos polipéptidos receptores, procedimientos para clonar ligandos polipeptídicos para los receptores.

[0082] La especificidad de tejido de la expresión de Zcytor11 sugiere una función en el desarrollo del páncreas, intestino delgado, colon y el timo. En vista de la especificidad de tejido observada para este receptor, los agonistas (incluyendo el ligando natural) y antagonistas tienen un enorme potencial en las aplicaciones tanto in vitro como in vivo. Los compuestos identificados como agonistas del receptor son útiles para estimular la proliferación y el desarrollo de células diana in vitro e in vivo. Por ejemplo, los compuestos agonistas son útiles como componentes de medios de cultivo celulares definidos, y se pueden usar solos o en combinación con otras citoquinas y hormonas para sustituir el suero que normalmente se usa en el cultivo celular. Los agonistas o antagonistas pueden ser útiles en la regulación específica del crecimiento y/o desarrollo de células pancreáticas, gastrointestinales o del timo en cultivo. Estos compuestos son útiles como reactivos de investigación para la caracterización de sitios de interacción de ligando-receptor. Los agonistas o antagonistas del receptor pueden encontrar aplicación in vivo en el tratamiento de enfermedades pancreáticas, gastrointestinales o del timo.

[0083] Los agonistas o antagonistas de Zcytor11 pueden incluir familias pequeñas de péptidos. Estos péptidos se pueden identificar usando condiciones de selección de afinidad que son conocidas en la materia, a partir de una población de candidatos presente en una biblioteca de péptidos. Las bibliotecas de péptidos incluyen bibliotecas combinatorias químicamente sintetizadas y presentadas sobre soporte sólido (Lam y col., Nature 354: 82-84 (1991))

o en disolución (Houghten y col., BioTechniques 13: 412-421, (1992)), expresadas entonces unidas a ADN plasmídico (Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869 (1992)) o expresadas y posteriormente presentadas en las superficies de virus o células (Boder y Wittrup, Nature Biotechnology 15: 553-557(1997); Cwirla y col. Science 276: 1696-1699 (1997)).

[0084] Zcytor11 homodímero, heterodímero y multímero también se puede usar en sistemas de diagnóstico para detectar los niveles en la circulación del ligando IL-TIF. En una realización relacionada, se pueden usar anticuerpos u otros agentes que se unen específicamente a receptores solubles Zcytor11 de la presente invención, para detectar polipéptidos receptores en la circulación. Los niveles elevados o reducidos de ligando o polipéptidos receptores pueden ser indicativos de afecciones patológicas, incluyendo el cáncer.

[0085] Los polipéptidos receptores Zcytor11 homodímeros, heterodímeros y multímeros se pueden preparar expresando un ADN truncado que codifica el dominio extracelular, por ejemplo, un polipéptido que contiene la SEQ ID NO: 3 o la región correspondiente de un receptor no humano. Se prefiere que los polipéptidos del dominio extracelular se preparen de una forma que carezca sustancialmente de segmentos de polipéptidos transmembrana e intracelular. Por ejemplo, el extremo C del polipéptido receptor puede estar en el resto 228 de la SEQ ID NO: 2 o la correspondiente región de una variante alélica o un receptor no humano. Para dirigir la exportación del dominio del receptor desde la célula huésped, el ADN del receptor se une a un segundo segmento de ADN que codifica un péptido secretor, tal como un péptido secretor de t-PA. Para facilitar la purificación del dominio de receptor secretado, se puede fusionar al polipéptido receptor una extensión C-terminal, tal como un marcador de polihistidina, sustancia P, péptido FlagTM (Hopp y col., Biotechnology 6: 1204-1210, (1988); disponible en Eastman Kodak Co., New Haven, CT) u otro polipéptido o proteína para el que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico. Además, los dominios de unión de citoquinas extracelulares de la subunidad que no son de Zcytor11 heterodímeros y multímeros también se preparan como antes.

[0086] En un procedimiento alternativo, un dominio extracelular del receptor de Zcytor11 u otro componente de receptor de citoquinas de clase I o II, se pueden expresar o como una fusión con regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento Fc, que contiene dos dominios de región constante y una región bisagra pero que carece de la región variable (véase, Sledziewski, AZ y col., patentes de EE.UU. nº 6.018.026 y 5.750.375). El Zcytor11 soluble o los heterodímeros y multímeros de Zcytor11/CRF2-4 solubles de la presente invención incluyen dichas fusiones. Dichas fusiones, típicamente son secretada as como moléculas multiméricas en las que las partes de Fc están unidas entre sí por disulfuro y dos polipéptidos de receptores están dispuestos muy cerca uno de otro. Las fusiones de este tipo se pueden usar para la purificación por afinidad del ligando cognado de la disolución, como una herramienta de ensayo in vitro, para bloquear señales in vitro mediante valoración específica del ligando, y como agonistas in vivo administrándolos por vía parenteral para la unión al ligando en la circulación y eliminación de la circulación. Para purificar el ligando, se añade una quimera de Zcytor11-Ig a una muestra que contiene el ligando (p. ej., medios de cultivo condicionados de células o extractos tisulares) en condiciones que facilitan la unión de receptor-ligando (típicamente temperatura, pH y fuerza iónica cercanos a los fisiológicos). El complejo de quimera-ligando después se separa mediante la mezcla usando proteína A, que está inmovilizada en un soporte sólido (p. ej., perlas de resina insolubles). Después se eluye el ligando usando técnicas químicas convencionales, tal como con una sal o gradiente de pH. De forma alternativa, la propia quimera se puede unir a un soporte sólido, llegando a cabo la unión y elución como antes. Las quimeras se pueden usar in vivo para regular las funciones gastrointestinales, pancreáticas o del timo. Las quimeras con una alta afinidad de unión se administran por vía parenteral (p. ej., por vía intramuscular, subcutánea o intravenosa). Las moléculas de la circulación se unen al ligando y son eliminadas de la circulación por procesos fisiológicos normales. Para usar en ensayos, las quimeras se unen a un suporte y por la región Fc y se usan en un formato ELISA.

[0087] La presente memoria descriptiva describe una variedad de otras fusiones de polipéptidos y proteínas multímeras relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos. Por ejemplo, se puede preparar un receptor Zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, como una fusión a una proteína que dimeriza como se describe en las patentes de EE.UU. 5.155.027 y 5.567.584. Las proteínas que dimerizan preferidas en relación con esto incluyen dominios de la región constante de inmunoglobulina, p. ej., IgGy1, y la cadena ligera K humana. El inmunoglobulina-receptor zcytor11 soluble o el polipéptido heterodímero inmunoglobulina-zcytor11 soluble, tal como las fusiones de inmunoglobulina-zcytor11-CRF24 solubles se pueden expresar en células genéticamente modificadas para producir una variedad de análogos del receptor zcytor11 multímero. Se pueden fusionar dominios auxiliares a un receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, para dirigirlos a células, tejidos o macromoléculas específicos (por ejemplo, a colágeno o células que expresan el IL-TIF). Un polipéptido zcytor11 se puede fusionar con dos o más restos, tal como un marcador de afinidad para la purificación y un dominio para dirigirlo. Las fusiones de polipéptidos también pueden comprender uno o más sitios de escisión, en particular entre dominios. Véase, Tuan y col., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996.

[0088] Un sistema de ensayo preferido que usa un fragmento de receptor de unión al ligando, usa un instrumento biosensor disponible en el comercio (BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), en el que el fragmento de receptor se inmoviliza sobre la superficie de un chip de receptor. El uso de este instrumento se describe en Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-240, (1991) y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-563, (1993). Se une un fragmento de receptor covalentemente, usando química de aminas o sulfidrilo, a fibras de dextrano que están unidas a una película de oro en la celda de flujo. Se pasa una muestra de ensayo a través de celda. Si hay ligando presente en la muestra, se unirá al polipéptido del receptor inmovilizado, produciendo un cambio en el índice de refracción del medio, lo cual se detecta como un cambio en la resonancia de plasmones de superficie de la película de oro. Este sistema permite determinar las constantes de disociación y asociación, a partir de las cuales se puede calcular la afinidad de unión y evaluar la estequiometría de unión.

[0089] Los polipéptidos receptores de unión al ligando también se pueden usar en otros sistemas de ensayo conocidos en la materia. Dichos sistemas incluyen el análisis de Scatchard para determinar la afinidad de unión. Véase, Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, (1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham y col., Science

253: 545-548, (1991); Cunningham y col., Science 254: 821-825, (1991)).

[0090] Un polipéptido de unión al ligando del receptor también se puede usar para la purificación del ligando IL-TIF. El polipéptido receptor se inmoviliza sobre un soporte sólido, tal como perlas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas basadas en sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada, o materiales similares que son estables en las condiciones de uso. Los procedimientos para la unión de polipéptidos a soportes sólidos se conocen en la materia, e incluyen la química de aminas, activación por bromuro de cianógeno, activación por Nhidroxisuccinimida, activación por epóxido, activación por sulfhidrilo y activación por hidrazida. Los medios resultantes en general se configurarán en forma de una columna, y los fluidos que contienen el ligando se pasan a través de la columna una o más veces, para permitir que el ligando se una al polipéptido receptor. Después el ligando se eluye usando cambios en la concentración salina o pH para alterar la unión de ligando-receptor.

[0091] Además, el receptor zcytor11 soluble o polipéptidos receptores heterodímeros de zcytor11 soluble, tales como zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden usar como un “sumidero de ligando”, es decir, antagonista para unir el ligando in vivo o in vitro en aplicaciones terapéuticas u otras aplicaciones en las que no se desea la presencia del ligando. Por ejemplo, en los cánceres que expresan grandes cantidades de IL-TIF bioactivo, se pueden usar el receptor zcytor11 soluble o polipéptidos receptores heterodímeros y multímeros de zcytor11 solubles, tales como zcytor11/CRK-4 soluble, como un antagonista directo del ligando in vivo, y puede ayudar a reducir el avance y los síntomas asociados con la enfermedad, y se puede usar junto con otras terapias (por ejemplo, quimioterapia) para potenciar el efecto de la terapia en la reducción del avance y los síntomas, y prevenir la recaída. Además, el receptor zcytor11 soluble o polipéptidos receptores heterodímeros de zcytor11 solubles, tales como zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden usar para ralentizar el avance de cánceres que expresan en exceso los receptores zcytor11, por unión del ligando in vivo que de otra forma potenciaría la proliferación de estos cánceres.

[0092] Además, el receptor zcytor11 soluble o polipéptidos receptores heterodímeros de zcytor11 solubles, tales como zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden usar en aplicaciones in vivo o de diagnóstico para detectar los cánceres que expresan IL-TIF in vivo o en muestras de tejidos. Por ejemplo, el receptor zcytor11 soluble o polipéptidos receptores heterodímeros de zcytor11 solubles, tales como zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden conjugar con un radiomarcador o un marcador fluorescente como se describe en el presente documento, y usar para detectar la presencia del IL-TIF en una muestra de tejido, usando un ensayo de unión de tipo ligando-receptor in vitro, o ensayo de generación de imágenes fluorescentes. Además, se puede administrar in vivo un receptor zcytor11 soluble o polipéptidos receptores heterodímeros de zcytor11 solubles, tales como zcytor11/CRF2-4 soluble, radiomarcado, para detectar los tumores sólidos que expresan ligando mediante un procedimiento generación de radioimágenes conocido en la materia.

[0093] El receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden usar también para preparar anticuerpos que se unen a epítopos, péptidos o polipéptidos contenidos en el antígeno. El polipéptido zcytor11 o un fragmento del mismo sirve como un antígeno (inmunógeno) para inocular a un animal y provocar una respuesta inmunitaria. Un experto en la materia reconocerá que los antígenos o epítopos inmunógenos pueden consistir en tramos de aminoácidos de un polipéptido más largo, de aproximadamente 10 aminoácidos y hasta aproximadamente la longitud entera del polipéptido o más largo dependiendo del polipéptido. Los antígenos adecuados incluyen el polipéptido zcytor11 codificado por la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma de aminoácidos contiguos de 9 a 211 aminoácidos. Los péptidos preferidos para usar como antígenos son el dominio de unión a citoquinas, descrito en el presente documento, y péptidos hidrófilos de zcytor11 tales como los previstos por el experto en la materia a partir de una gráfica de hidrofobicidad, determinada por ejemplo, o partir del perfil de hidrofilia de Hopp/Woods basado en una ventana móvil de 6 restos, con restos G, S y T escondidos y restos H, Y y W expuestos ignorados, o a partir de la gráfica de Jameson-Wolf de la SEQ ID NO: 3 usando un programa DNA*STAR. Además, los patrones conservados y las regiones variables entre los patrones conservados del receptor soluble zcytor11 son antígenos adecuados. Los antígenos adecuados también incluyen los polipéptidos zcytor11 descritos antes en combinación con otro dominio extracelular de citoquinas de clase I o II, como los que forman los polipéptidos heterodímeros de zcytor11 solubles, tales como zcytor11/CRF2-4 soluble. Además, se pueden usar las correspondientes regiones del polipéptido receptor zcytor11 soluble de ratón (SEQ ID NO: 3) para generar anticuerpos contra el receptor zcytor11 soluble de ratón. Además, los anticuerpos generados de esta respuesta inmunitaria, se pueden aislar y purificar como se describe en el presente documento. Los procedimientos para preparar y aislar anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Cooligan, y col. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.

[0094] Como será evidente para el experto en la materia, se pueden generar anticuerpos policlonales por la inoculación en una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones y ratas, de un receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, o un fragmento del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido zcytor11 se puede aumentar mediante el uso de un adyuvantes, tal como alumbre (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión tales como las fusiones de zcytor11 o una parte del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con proteína de unión a la maltosa. El polipéptido inmunógeno puede ser una molécula de longitud completa o una parte de la misma. Si la parte del polipéptido es de “tipo hapteno”, dicha parte se puede unir o conectar ventajosamente a un transportador macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o toxoide tetánico) para la inmunización.

[0095] Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpos” incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión al antígeno, tales como los fragmentos proteolíticos F(ab’)2 y Fab. También están incluidos los anticuerpos o fragmentos intactos genéticamente modificados, tales como los anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios y similares, así como péptidos y polipéptidos de unión al antígeno sintéticos. Los anticuerpos no humanos se pueden humanizar mediante injerto de CDR no humanas en las regiones de armazón y constante, o incorporando los dominios variables no humanos enteros (opcionalmente “cubriéndolos” con una superficie de tipo humano por sustitución de los restos expuestos, en el que el resultado es un anticuerpo “revestido”). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener restos no humanos en los dominios de la región de armazón variable humana para potenciar las características de unión adecuadas. Mediante la humanización de los anticuerpos, se puede aumentar la semivida biológica, y se reduce el potencial de reacciones inmunitarias adversas tras la administración a seres humanos.

[0096] Se considera que los anticuerpos se unen específicamente si: 1) presentan un nivel umbral de actividad de unión, y 2) no tienen reacciones cruzadas significativas con moléculas de polipéptidos relacionadas. Se determina un nivel umbral de unión si los anticuerpos dirigidos contra el receptor zcytor11 soluble o dirigidos contra el polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como dirigidos contra zcytor11/CRF2-4 soluble, en el presente documento, se unen a un polipéptido péptido o epítopo del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, con una afinidad al menos 10 veces mayor que la afinidad de unión para controlar el polipéptido (receptor zcytor11 no soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble). Se prefiere que los anticuerpos presenten una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o mayor, preferiblemente 107 M-1 o mayor, más preferiblemente 108 M-1 o mayor y lo más preferiblemente 109 M-1 o mayor. La afinidad de unión de un anticuerpo la puede determinar fácilmente el experto en la materia, por ejemplo, por el análisis de Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

[0097] Si los anticuerpos dirigidos contra el receptor zcytor11 soluble o dirigidos contra el polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como dirigidos contra zcytor11/CRF2-4 soluble, no tienen reacciones cruzadas significativas con moléculas de polipéptidos relacionadas se muestra, por ejemplo, por la detección por el anticuerpo del polipéptido del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, pero no polipéptidos relacionados conocidos usando un análisis de transferencia Western (Ausubel y col., véase antes.). Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos son los descritos en la técnica anterior, tal como ortólogos y parólogos conocidos, y miembros conocidos similares de una familia de proteínas. El cribado también se puede hacer usando el receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, no humano, y polipéptidos mutantes del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble. Además, los anticuerpos se puede “cribar frente a” polipéptidos relacionados conocidos, para aislar una población que se une específicamente a los polipéptidos del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble. Por ejemplo, los anticuerpos producidos contra el receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, se adsorben en polipéptidos relacionados adheridos a la matriz insoluble; los anticuerpos específicos para el receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, fluirán a través de la matriz en las condiciones de tamponamiento adecuadas, El cribado permite aislar los anticuerpos policlonales y monoclonales que no tienen reacciones cruzadas con los polipéptidos estrechamente relacionados conocidos (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, y col. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). El cribado y aislamiento de anticuerpos específicos es bien conocido en la materia. Véase, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff y col., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin y col., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984. La unión específica de anticuerpos dirigidos contra el receptor zcytor11 soluble o dirigidos contra el polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como dirigidos contra zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden detectar por una serie de procedimientos de la materia y descritos a continuación.

[0098] Se puede usar una variedad de ensayos conocidos por el experto en la materia para detectar anticuerpos que se unen a proteínas o polipéptidos del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble. Los ensayos ilustrativos se describen con detalle en “Antibodies: A Laboratory Manual”, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de dichos ensayos incluyen: la inmunoelectroforesis simultánea, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunotransferencia o ensayo de transferencia Western, ensayo de inhibición o competición, y ensayo en sándwich. Además, se pueden cribar los anticuerpos que se unen a proteínas o polipéptidos del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, naturales frente a mutantes.

[0099] Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos útiles en el presente documento incluyen la exposición in vitro de linfocitos a proteína o péptido del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, y selección de bibliotecas de presentación de anticuerpos en fagos o vectores similares (por ejemplo, por el uso de proteína o péptido del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, inmovilizado o marcado). Los genes que codifican polipéptidos que tienen potenciales dominios de unión para el polipéptido del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden obtener mediante el cribado aleatorio de bibliotecas de péptidos presentadas en fagos (presentación en fagos) o en bacterias, tales como E. coli. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos se pueden obtener de una serie de formas, tal como por mutagénesis aleatoria y síntesis de polinucleótidos aleatoria. Estas bibliotecas de presentación de péptidos aleatorias se puede usar para cribar los péptidos que interaccionan con una diana conocida que puede ser una proteína o polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánica o inorgánica. Se conocen en la materia técnicas para crear y cribar dichas bibliotecas de presentación de péptidos aleatorias (Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409; Ladner y col., patente de EE.UU. nº 4.946.778; Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.403.484 y Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.571.698) y las bibliotecas de presentación de péptidos aleatorias y kits para el cribado de dichas bibliotecas están disponibles en el comercio, por ejemplo en Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Las bibliotecas de presentación de péptidos aleatorias se pueden cribar usando secuencias del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, descritas en el presente documento, para identificar proteínas que se unen al receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble. Estos “polipéptidos de unión” que interaccionan con los polipéptidos del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden usar para marcar células; para aislar polipéptidos homólogos por purificación por afinidad; se pueden conjugar directa o indirectamente a fármacos, radionucleidos y similares. Estos polipéptidos de unión también se pueden usar en procedimientos analíticos tal como para cribar bibliotecas de expresión y neutralizar la actividad, p. ej., para bloquear la interacción entre el ligando IL-TIF y el receptor, o unión vírica a un receptor. Los polipéptidos de unión también se pueden usar para ensayos de diagnóstico para determinar los niveles en la circulación de polipéptidos del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble; para detectar o cuantificar los polipéptidos del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, como marcador de patología o enfermedad subyacente. Estos polipéptidos de unión también pueden actuar como “antagonistas” del receptor zcytor11 o polipéptido heterodímero de zcytor11, tal como zcytor11/CRF2-4, para bloquear la unión del receptor zcytor11 o polipéptido heterodímero de zcytor11, tal como zcytor11/CRF2-4, y la transducción de señales in vitro e in vivo. Otra vez, estos polipéptidos de unión dirigidos contra el receptor zcytor11 soluble o contra el polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como contra zcytor11/CRF2-4 soluble, serían útiles para inhibir la actividad de IL-TIF, así como la actividad de receptor o de unión a proteína. Los anticuerpos producidos contra las combinaciones heterodímeras o multímeras de la presente invención son realizaciones preferidas, ya que pueden actuar de forma más específica contra el IL-TIF, o de forma más potente que los anticuerpos producidos contra solo una subunidad. Además, la actividad antagonista y de unión de los anticuerpos de la presente invención se pueden ensayar en los ensayos de proliferación de IL-TIF y otros ensayos biológicos descritos en el presente documento.

[0100] Los anticuerpos contra el receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, se pueden usar para marcar células que expresan el receptor zcytor11 o polipéptidos heterodímeros de zcytor11, tales como zcytor11/CRF2-4; para aislar el polipéptido del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, por purificación de afinidad; para ensayos de diagnóstico para determinar los niveles en la circulación de polipéptidos del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble; para detectar o cuantificar el receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, como marcador de una patología o enfermedad subyacente; en procedimientos analíticos que usan FACS; para cribar bibliotecas de expresión; para generar anticuerpos antiidiotípicos; y como anticuerpos neutralizantes o como antagonistas para bloquear el receptor zcytor11 o polipéptido heterodímero de zcytor11, tal como zcytor11/CRF2-4, o la actividad de IL-TIF in vitro e in vivo. Los marcadores o etiquetas directas adecuadas incluyen radionucleidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares; los marcadores o etiquetas indirectos pueden usar biotinaavidina u otras parejas de complemento/anticomplemento como productos intermedios. Los anticuerpos del presente documento también se pueden conjugar directa o indirectamente a fármacos, toxinas, radionucleidos y similares, y usar estos conjugados para el diagnóstico in vivo o para aplicaciones terapéuticas. Además, los anticuerpos contra el receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, o fragmentos de los mismos se pueden usar in vitro para detectar el receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, desnaturalizado o no desnaturalizado, o fragmentos del mismo, en ensayos, por ejemplo, de transferencias Western u otros ensayos conocidos en la materia.

[0101] Los anticuerpos contra el receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, son útiles para marcar células que expresan los correspondientes receptores y ensayar sus niveles de expresión, para la purificación por afinidad, en ensayos de diagnóstico para determinar los niveles en la circulación de polipéptidos receptores solubles, procedimientos analíticos que usan la separación de células activadas por fluorescencia. Además, se pueden usar anticuerpos divalentes, y anticuerpos antiidiotípicos como agonistas para imitar el efecto del IL-TIF.

[0102] Los anticuerpos del presente documento también se pueden conjugar directa o indirectamente a fármacos, toxinas, radionucleidos y similares, y usar estos conjugados para el diagnóstico in vivo o para aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos o polipéptidos de unión que reconocen polipéptidos del receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, de la presente invención, para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anticomplementaria correspondiente (es decir, un receptor zcytor11 o receptor heterodímero de zcytor11, tal como zcytor11/CRF2-4). Más específicamente, anticuerpos dirigidos contra el receptor zcytor11 soluble o dirigidos contra el polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como dirigido contra zcytor11/CRF2-4 soluble, o fragmentos o porciones bioactivos del mismo, se pueden acoplar a moléculas detectables o citotóxicas y administrar a un mamífero que tenga células, tejidos u órganos que expresan moléculas receptoras del receptor zcytor11 soluble o receptor heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble.

[0103] Las moléculas detectables adecuadas se pueden unir directa o indirectamente a polipéptidos que se unen al receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, (“polipéptidos de unión”, incluyendo péptidos de unión descritos antes), anticuerpos, o fragmentos o porciones bioactivos del mismo. Las moléculas detectables adecuadas incluyen radionucleidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas se pueden unir directa o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, que incluyen toxinas bacterianas o vegetales (por ejemplo, toxina de la difteria, exotoxina de pseudomonas, ricina, abrina y similares), así como radionucleidos terapéuticos, tales como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (unidos directamente al polipéptido o anticuerpo, o unidos indirectamente, por ejemplo por medio de un resto de quelación). Los polipéptidos de unión o anticuerpos también se pueden conjugar con fármacos citotóxicos, tales como adriamicina. Para la unión indirecta a una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica se puede conjugar con un miembro de una pareja complementaria/anticomplementaria, en la que el otro miembro está unido a la parte de polipéptido de unión o anticuerpo. Para estos propósitos, una pareja complementaria/anticomplementaria de ejemplo es la biotina/estreptavidina.

[0104] En otra realización, se pueden usar proteínas de fusión de polipéptido de unión-toxina o proteínas de fusión de anticuerpo-toxina para células marcadas o para la inhibición o ablación de tejido (por ejemplo, para tratar células o tejidos de cáncer). Alternativamente, si el polipéptido de unión tiene múltiples dominios funcionales (es decir, un dominio de activación o un dominio de unión a ligando, más un dominio dirigido), una proteína de fusión que incluye sólo el dominio de marcaje puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo de célula o tejido de interés. En los casos en los que la proteína de fusión que incluye sólo un dominio incluye una molécula complementaria, la molécula anticomplementaria se puede conjugar a una molécula detectable o citotóxica. Las proteínas de fusión de dominio-molécula complementaria representan, por lo tanto, un vehículo dirigido genérico para el suministro específico en células/tejidos de conjugados de molécula anticomplementaria-detectable/citotóxica genérica.

[0105] En otra realización, las proteínas de fusión de polipéptido de unión al receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble-citoquina o anticuerpo-citoquina, se pueden usar para potenciar la muerte in vivo de tejidos diana (por ejemplo, cánceres pancreático, de la sangre, linfoide, colon y médula ósea), si el polipéptido de unión-citoquina o anticuerpo dirigido contra el receptor zcytor11 soluble o dirigido contra el polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como dirigido contra zcytor11/CRF2-4 soluble, se dirige a la célula hiperproliferativa (Véase, en general, Hornick y col., Blood 89: 4437-47, 1997). Las proteínas de fusión descritas permiten dirigir una citoquina a un sitio de acción deseado, proporcionando así una concentración local elevada de citoquina. Los anticuerpos dirigidos contra el homodímero y heterodímero de zcytor11 adecuados se dirigen a una célula o tejido no deseado (es decir un tumor o una leucemia) y la citoquina fusionada media la lisis de la célula diana mejorada por las células efectoras. Las citoquinas adecuadas para este propósito incluyen la interleuquina 2 y el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), por ejemplo.

[0106] Alternativamente, las proteínas de fusión de anticuerpo o polipéptido de unión al receptor zcytor11 soluble o polipéptido heterodímero de zcytor11 soluble, tal como zcytor11/CRF2-4 soluble, descritas en el presente documento, se pueden usar para potenciar la muerte in vivo de tejidos diana mediante la estimulación directamente de una ruta apoptótica modulada por el receptor zcytor11, dando como resultado la muerte celular de células hiperproliferativas que expresan el receptor zcytor11 o un receptor heterodímero de zcytor11, tal como el receptor zcytor11/CRF2-4 soluble.

[0107] La invención se ilustra más mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Construcción de vectores de expresión de mamíferos que expresan zcytor11 soluble

Receptores: zcytor11CEE, zcytor11CFLG, zcytor11CHIS y zcytor11-Fc4

A. Construcción del vector de expresión de mamífero de zcytor11 que contiene zcytor11CEE, zcytor11CFLG y zcytor11CHIS

[0108] Se prepara un vector de expresión para la expresión del dominio extracelular soluble del polipéptido zcytor11 (SEQ ID NO: 3), pC4zcytor11CEE, en el que la construcción se diseña para que exprese un polipéptido zcytor11 compuesto de la metionina de iniciación prevista y truncado adyacente al dominio transmembrana previsto, y con un marcador Glu-Glu C-terminal (SEQ ID NO: 4).

[0109] Se crea un fragmento de ADN de zcytor11 que comprende el dominio de unión de citoquinas extracelular de zcytor11 (SEQ ID NO: 3) usando la PCR y se purifica. El ADN escindido se subclona en un vector de expresión plasmídico que tiene un péptido señal, p. ej., el péptido señal de zcytor11 nativo, y se une a un marcador Glu- Glu (SEQ ID NO: 4) en el extremo C de la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido zcytor11. Dicho vector de expresión de mamífero contiene un casete de expresión que tiene un promotor de mamífero, múltiples sitios de restricción para insertar secuencias codificantes, un codón de parada y un terminador de mamífero. El plásmido también puede tener un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor de SV40, potenciador y origen de replicación, un gen de DHFR y el terminador de SV40.

[0110] El inserto de restricción de zcytor11 digerido y el vector previamente digerido se ligan usando técnicas de biología molecular estándar, y se electroporan en células competentes tales como células competentes DH10B (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cultivan en placas LB que contienen ampicilina 50 mg/ml, y se incuban durante la noche. Las colonias se criban por análisis de restricción del ADN preparado a partir de colonias individuales. La secuencia inserto de clones positivos se verifica por análisis de secuencia. Se hace una preparación de plásmido a gran escala usando el kit QIAGEN® Maxi prep (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0111] Se usa el mismo procedimiento para preparar receptores homodímeros, heterodímeros o multímeros solubles de zcytor11 (que incluyen subunidades que no son de receptor zcytor11 soluble, tales como CRF2-4 o IL10R soluble) con un marcador de his C-terminal, compuesto de 6 restos de His en una fila; y un marcador flag (SEQ ID NO: 5) C-terminal, zcytor11CFAG. Para construir estas construcciones, el vector mencionado antes tiene el marcador HIS o FLAG® en lugar del marcador glu-glu (SEQ ID NO: 4).

B. Construcción de expresión de mamífero del receptor zcytor11 soluble zcytor11-Fc4

[0112] Se construye un plásmido de expresión que contiene todo o parte de un polinucleótido que codifica zcytor11, por recombinación homóloga. Se aisló un fragmento de ADNc de zcytor11 usando la PCR, que incluye la secuencia de polinucleótido del dominio extracelular del receptor zcytor11. Los cebadores usados en la PCR para la producción del fragmento de zcytor11 son del extremo 5’ al 3’: (1) aproximadamente 40 pb de la secuencia flanqueadora del vector (5’ del inserto) y aproximadamente 17 pb correspondientes al extremo 5’ del dominio extracelular de zcytor11; y (2) aproximadamente 40 pb del extremo 5’ de la secuencia de polinucleótido de Fc4 (SEQ ID NO: 6) y aproximadamente 17 pb correspondientes al extremo 3’ del dominio extracelular de zcytor11. El fragmento Fc4 para la fusión con zcytor11 se genera por la PCR de una forma similar. Los dos cebadores usados en la producción del fragmento Fc4 incluyen: (1) un cebador 5’ que consiste en aproximadamente 40 pb de la secuencia desde el extremo 3’ del dominio extracelular de zcytor11 y aproximadamente 17 pb del extremo 5’ de Fc4 (SEQ ID NO: 6); y (2) un cebador 3’ que consiste en aproximadamente 40 pb de la secuencia del vector (3’ del inserto) y aproximadamente 17 pb del extremo 3’ de Fc4 (SEQ ID NO: 6). Después se lleva a cabo la amplificación por la PCR de cada una de las reacciones descritas antes usando condiciones estándar en la técnica.

[0113] Se obtiene un vector de expresión de ejemplo a partir del plásmido pCZR199 (depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, designado con el Nº 98668), que se corta con SmaI (BRL). El vector de expresión se obtuvo del plásmido pCZR199, y es un vector de expresión de mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor inmediato temprano del CMV, un intrón de consenso de la región variable del locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificantes, un codón de parada y un terminador de hormona de crecimiento humana. El vector de expresión también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor, potenciador y origen de replicación de SV40, un gen de DHFR y el terminador de SV40. El vector de expresión usado se construyó a partir de pCZR199 por la sustitución del promotor de metalotioneína por el promotor temprano intermedio del CMV.

[0114] Se combinan células de levadura competentes (S. cerevisiae) con aproximadamente 1 !g de cada uno de los insertos de zcytor11 y Fc4, y 100 ng de vector de expresión digerido con SmaI (BRL) y se electroporan. Las mezclas de levadura/ADN se electropulsan, por ejemplo a 0,75 kV (5 kV/cm), “infinitos” ohmios, 25 !F. Se añaden a cada cubeta 600 !l de sorbitol 1,2 M y la levadura se cultiva en partes alícuotas en placas URA-D y se incuban a 30 ºC.

[0115] Después de aproximadamente 48 h, se recogen los transformantes de levadura Ura + de una sola placa, se aísla el ADN, y se transforma en células de E. coli electrocompetentes (p. ej., DH10B, GibcoBRL), y se cultivan en placa usando procedimientos estándar. Los clones individuales que albergaban la construcción de expresión correcta para zcytor11-Fc4 se identifican por digestión de restricción para verificar la presencia del inserto zcytor11-Fc4 y confirmar que se han unido correctamente entre sí varias secuencias de ADN. El inserto de clones positivos se somete a análisis de secuencia. El ADN de plásmido de escala mayor se aísla usando el kit Qiagen Maxi (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0116] Se usan procedimientos similares para preparar subunidades que no son de zcytor 11 de receptores heterodímeros y multímeros, tales como CRF2-4 y IL-10R marcados con Fc4.

Ejemplo 2

Transfección y expresión de polipéptidos receptores solubles

[0117] Se cultivan células BHK 570 (ATCC Nº CRL-10314), DG-44 CHO, u otras células de mamífero, con aproximadamente 1,2X106 células/pocillo (placa de 6 pocillos) en 800 !l del medio exento de suero (SF) adecuado

(p. ej., DMEM, Gibco/BRL alto contenido en glucosa) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Las células se transfectan con plásmidos de expresión que contienen zcytor11CEE, zcytor11CFLG, zcytor11CHIS o zcytor11-Fc4 (Ejemplo 1), o subunidades que no son de zcytor11 de receptores heterodímeros y multímeros, tales como CRF2-4 y IL-10R marcados con -CEE, - CFLG, -CHIS, o -Fc4, usando Lipofectina™ (Gibco BRL), en medio exento de suero (SF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se aíslan clones individuales que expresan los receptores solubles, se criban y se cultivan en medio de cultivo celular, y se purifican usando técnicas estándar.

Ejemplo 3

Expresión del receptor soluble zcytor 11 en E. coli

A. Construcción del vector de expresión pCZR225 que expresa el polipéptido de fusión huzcytor11/MBP-6H [0118] Se construye un plásmido de expresión que contiene un polinucleótido que codifica un receptor zcytor11 soluble fusionado en el extremo C a proteína de unión a maltosa (MBP), por recombinación homóloga. El polipéptido de fusión contiene una parte de MBP N-terminal de aproximadamente 388 aminoácidos fusionada al receptor zcytor11 soluble (SEQ ID NO: 3). Se aísla un fragmento de ADNc de zcytor11 (SEQ ID NO: 1) usando la PCR como se describe en el presente documento. Se usan dos cebadores en la producción del fragmento de zcytor11 en una reacción de la PCR estándar: (1) uno contiene aproximadamente 40 pb de la secuencia flanqueadora del vector y aproximadamente 25 pb que corresponden al extremo amino de zcytor11, y (2) otro que contiene aproximadamente 40 pb del extremo 3’ que corresponde a la secuencia del vector flanqueador y aproximadamente 25 pb que corresponden al extremo carboxilo de zcytor11. Se llevan 2 !l de la reacción de PCR de 100 !l a un gel de agarosa al 1,0 % con 1 x tampón de TBE para el análisis, y se observa el fragmento aproximado esperado. El resto de la reacción de PCR se combina con el segundo tubo de PCR y se hace precipitar con 400 !l de etanol absoluto. El ADN precipitado se usa para la recombinación en el vector receptor cortado con Sma1 pTAP98 para producir la construcción que codifica la fusión MBP-zcytor11, como se describe a continuación.

[0119] El plásmido pTAP98 se obtiene a partir de los plásmidos pRS316 y pMAL-c2. El plásmido pRS316 es un vector lanzadera de Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. y Sikorski, R., Genetics 122: 19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) es un plásmido de expresión de E. coli. Lleva el promotor tac que dirige MalE (gen que codifica la MBP) seguido de un marcador His, un sitio de escisión de trombina, un sitio de clonación y el terminador rrnB. El vector pTAP98 se construye usando recombinación homóloga en levaduras. Se recombinan 100 ng de pMAL-c2 cortado con EcoR1 con 1 !g de pRS316 cortado con Pvul, 1 !l de conector y 1 !g de pRS316 cortado con Sca1/EcoR1, en una reacción de PCR. Los productos de la PCR se concentran por precipitación con etanol al 100 %.

[0120] Se combinan células de levadura competentes (S. cerevisiae) con aproximadamente 10 !l de una mezcla que contiene aproximadamente 1 !g del producto de la PCR anterior el receptor zcytor11, y 100 ng de vector pTAP98 digerido con SmaI, y se electroporan usando procedimientos estándar y se cultivan en placas URA-D y se incuban a 30 ºC.

[0121] Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de levadura Ura + de una sola placa se recogen, se aísla el ADN y se transforman en células de E. coli electrocompetentes (p. ej., MC1061, Casadaban y col., J. Mol. Biol. 138, 179-207), y se cultivan en placas MM/CA + AMP 100 mg/l (Pryor y Leiting, Protein Expression and Prurification 10: 309-319, 1997), usando procedimientos estándar. Las células se cultivan en MM/CA con ampicilina 100 !g/ml durante 2 horas, agitando, a 37°C. Se induce 1 ml de cultivo con IPTG 1 mM. 2-4 horas más tarde se mezclan 250 !l de cada cultivo con 250 !l de perlas de vidrio lavadas con ácido y 250 !l de tampón de Thorner con 1ME al 5 % y colorante (urea 8 M, Tris 100 mM pH 7,0, glicerol al 10 %, EDTA 2 mM, SDS al 5 %). Las muestras se mezclan con flujo vortical durante 1 min y se calientan a 65 ºC durante 10 min. Se cargan 20 !l por fila en un gel PAGE al 4 %-12 % (NOVEX). Los geles se desarrollan en 1Xtampón de MES. Los clones positivos se denominan pCZR225 y se someten a análisis de secuencia.

[0122] Se usa 1 !l de ADN de secuenciación para transformar la cepa BL21. Las células se electropulsan a 2,0 kV, 25 !F y 400 ohms. Después de electroporación, 0,6 ml de MMICA con ampicilina 100 mg/l. Las células se cultivan en MM/CA y se inducen con ITPG como se ha descrito antes. Los clones positivos se usan para cultivarlos para la purificación de proteínas de la proteína de fusión huzcytor11/MBP-6H.

Ejemplo 4

Anticuerpos policlonales contra el receptor zcytor11 soluble

[0123] Se preparan anticuerpos policlonales por inmunización de conejos blancos de Nueva Zelanda hembras con el polipéptido huzcytor11/MBP-6H purificado (Ejemplo 3), o el receptor soluble zcytor11CEE recombinante purificado (Ejemplo 1). Se da a cada uno de los conejos una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 200 mg de proteína purificada en adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguida de inyecciones IP de refuerzo de 100 mg de proteína purificada en adyuvante incompleto de Freund cada 3 semanas. De 7 a 10 días después de la administración de la tercera inyección de refuerzo, se saca sangre a los animales y se recoge el suero. Después se administra refuerzo y se saca sangre a los conejos cada 3 semanas.

[0124] Los anticuerpos policlonales específicos para zcytor11 se purifican por afinidad a partir del suero de conejo usando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se prepara usando aproximadamente 10 mg del polipéptido huzcytor11/MBP-6H purificado por gramo de CNBr-SEPHAROSE, seguido de 20X diálisis en PBS durante la noche. Los anticuerpos específicos de zcytor11 se caracterizan por un control de valoración ELISA usando 1 mg/ml del antígeno de proteína adecuado como diana para el anticuerpo. El límite de detección inferior (LDI) de los anticuerpos de conejo dirigidos contra zcytor11 purificados por afinidad se determina usando procedimientos estándar.

Ejemplo 5

Anticuerpos monoclonales contra el receptor zcytor11

[0125] Los anticuerpos monoclonales contra el receptor zcytor11 soluble se preparan inmunizando ratones BalbC macho (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) con las proteínas zcytor11 solubles recombinantes purificadas descritas en el presente documento. Se administra a cada uno de los ratones una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 20 mg de proteína purificada en adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguida de inyecciones IP de refuerzo de 10 mg de proteína purificada en adyuvante incompleto de Freund cada 2 semanas. De 7 a 10 días después de la administración de la tercera inyección de refuerzo, se saca sangre a los animales y se recoge el suero, y se evalúa la titulación de anticuerpos.

[0126] Se recogen los esplenocitos de ratones con titulación alta y se fusionan con células de mieloma SP2/0 murinas usando PEG 1500 (Boerhinger Mannheim, Reino Unido) en dos procedimientos de fusión separados usando una relación de fusión de esplenocitos a células de mieloma 4: 1 (Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Press). Después de 10 días de crecimiento después de la fusión, se identifican los hibridomas que producen anticuerpo por ELISA usando proteína receptora zcytor11 soluble recombinante purificada (Ejemplo 6C) como una diana para el anticuerpo y por FACS usando células Baf3 que expresan la secuencia de zcytor11 (Ejemplo 8) como una diana para el anticuerpo. Los hibridomas positivos resultantes por ambos procedimientos se clonan tres veces limitando la dilución.

Ejemplo 6

Evaluación de la heterodimerización del receptor zcytor11 usando el ensayo ORIGEN

[0127] El receptor zcytor11 soluble zcytor11CFLAG (Ejemplo 1) o gp130 (Hibi, M. y col., Cell 63: 1149-1157, 1990) se biotinilan por reacción con un exceso molar de 5 veces de sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Inc., Rockford, IL) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El receptor zcytor11 soluble y otra subunidad de receptor soluble, por ejemplo el receptor IL- 10R (sIL-10R) o CRF2-4 (CRF2-4) soluble (R&D Systems, Minneapolis, MN), o el receptor zcytor11 soluble (patente de EE.UU. nº 5.965.704) se marcan con un exceso molar de 5 veces de Ru-BPY-NHS (Igen, Inc., Gaithersburg, MD) de acuerdo con el protocolo del fabricante, Las formas biotinilada y marcada con Ru-BPY-NHS del receptor zcytor11 soluble se pueden designar respectivamente receptor Bio-zcytor11 y Ru-zcytor11; las formas biotinilada y marcada con Ru-BPY-NHS de la otra subunidad de receptor soluble se pueden designar de forma similar. Los ensayos se pueden llevar a cabo usando medios condicionados de células que expresan un ligando, tal como IL-TIF, que se une a los receptores heterodímeros de zcytor11, o usando IL-TIF purificado.

[0128] Para la caracterización de la unión al receptor inicial, se ensaya un panel de citoquinas o medio condicionado para determinar si pueden mediar la homodimerización del receptor zcytor11 y si pueden mediar la heterodimerización del receptor zcytor11 con las subunidades de receptores solubles descritas antes. Para hacer esto, se combinan 50 !l de medio condicionado o TBS-B que contiene citoquina purificada, con 50 !l de TBS-B (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, BSA 1 mg/ml, pH 7,2) que contiene p. ej., 400 ng/ml de receptor Ru-zcytor11 y Bio-zcytor11,

o 400 ng/ml de receptor Ru-zcytor11 y p. ej., Biogp130, o 400 ng/ml de p. ej., Ru-CRF2-4 y Bio-zcytor11. Después de incubación durante 1 h a temperatura ambiente, se añaden 30 !g de perlas magnéticas de 2,8 mm revestidas con estreptavidina (Dynal, Inc., Oslo, Noruega) y la reacción se incuba durante una hora adicional a temperatura ambiente. Después se añaden 200 !l de tampón de ensayo ORIGEN (Igen, Inc., Gaithersburg, MD) y se mide la extensión de la asociación del receptor usando un analizador M8 ORIGEN (Igen, Inc.).

Ejemplo 7

Construcción para generar un heterodímero de receptores zcytor11

[0129] Se construyó un vector que expresaba un heterodímero de zcytor11 humano secretado. En esta construcción, el dominio extracelular de unión a citoquinas de zcytor11 se fusionó con la cadena pesada de la IgG gamma 1 (IgGy1) con un marcador Glu-Glu (SEQ ID NO: 4) en el extremo C, mientras se fusionaba la parte extracelular de la subunidad del receptor de citoquinas heterómero (p. ej., un componente del receptor de CRF2-4, IL-9, IL-10 IL-4) con la cadena pesada de la IgG gamma 1 (IgCy1) con un marcador His en el extremo C.

A. Construcción de vectores de fusión de IgG gamma 1 6-His e IgG gamma 1 Glu-Glu

[0130] La cadena pesada de la IgGy1 con un marcador 6-His C-terminal (SEQ ID NO: 13) se clonó en el vector de expresión de mamífero pZP-9 (depósito en ATCC nº 98668) de modo que se puede clonar en el mismo cualquier dominio extracelular de receptor de citoquinas deseado que tenga un sitio 5’ EcoRI y 3’ BamHI, dando como resultado una fusión del dominio extracelular N-terminal-IgGy1 C-terminal. El fragmento de IgGy1 usado en esta construcción se hizo usando la PCR para aislar la IgGy1 usando los cebadores oligonucleótidos ZC29.239 (SEQ ID NO: 14) y ZC29.232 (SEQ ID NO: 15). Los productos de la PCR se purificaron usando procedimientos descritos en el presente documento y se digirieron con XhoI y BamHI (Boerhinger-Mannheim) y posteriormente se purificaron en gel. La parte extracelular de CRF2-4 (SEQ ID NO: 18) se amplificó usando la PCR, usando los cebadores oligonucleótidos ZC39.319 (SEQ ID NO: 16) y ZC39.325 (SEQ ID NO: 17). Los productos de la PCR se purificaron usando procedimientos descritos en el presente documento y se digirieron con EcoRI y BamHI (Boerhinger-Mannheim) y posteriormente se purificaron en gel. El fragmento de IgGy1 BamHI/XhoI y el fragmento de CRF2-4 EcoRI/BamHI obtenidos antes, después se ligaron entre sí en pZP-9 previamente digerido con EcoRI y XhoI para dar una construcción que tenía la parte extracelular del dominio de unión de citoquinas extracelular de CRF2-4 fusionado con la IgGy1 con un marcador 6-HIS en el extremo C. Esta construcción posteriormente se modificó para introducir un sitio de escisión de trombina 3’ de CRF2-4 y 5’ del marcador 6-HIS. Esto se hizo usando la construcción anterior como molde en la PCR con los cebadores oligonucleótidos ZC38.981 (SEQ ID NO: 20) y ZC39.042 (SEQ ID NO: 21). Los productos de la PCR se purificaron usando procedimientos descritos en el presente documento y se digirieron con SacII y XhoI. Este fragmento SacII/XhoI se ligó en la construcción descrita antes que se había digerido previamente con SacII y XhoI. La secuencia del polinucleótido del dominio de unión de citoquinas extracelular de CRF2-4 fusionado con IgGy1 con un marcador 6-HIS se muestra en la SEQ ID NO: 22 y la correspondiente secuencia del polipéptido se muestra en la SEQ ID NO: 23.

[0131] La cadena pesada de la IgGy1 con un marcador Glu-Glu C-terminal (SEQ ID NO: 4) se clonó en el vector de expresión de mamífero Zem228R (depósito en ATCC nº 69446) de modo que se puede clonar en el mismo cualquier dominio extracelular de receptor de citoquinas deseado que tenga un sitio 5’ EcoRI y 3’ BamHI, dando como resultado una fusión del dominio extracelular de citoquinas N-terminal-IgGy1 C-terminal. El fragmento de IgGy1 usado en esta construcción se hizo usando la PCR para aislar la secuencia de IgGy1 usando los cebadores oligonucleótidos ZC29238 (SEQ ID NO: 24) y ZC29231 (SEQ ID NO: 25). Los productos de la PCR se purificaron usando procedimientos descritos en el presente documento y se digirieron con XhoI y EcoRI (Boerhinger-Mannheim) y posteriormente se purificaron en gel. La parte extracelular de hzcytor11 (SEQ ID NO: 1) se amplificó usando la PCR, usando los cebadores oligonucleótidos ZC39335 (SEQ ID NO: 26) y ZC28981 (SEQ ID NO: 27). Los productos de la PCR se purificaron usando procedimientos descritos en el presente documento y se digirieron con EcoRI y BamHI (Boerhinger-Mannheim) y posteriormente se purificaron en gel. El fragmento de IgGy1 BamHI/XhoI y los fragmentos de hzcytor11 EcoRI/BamHI obtenidos antes, después se ligaron entre sí en Zem228R previamente digerido con EcoRI y XhoI para dar una construcción que tenía el dominio extracelular de hzcytor11 fusionado con la IgGy1 con un marcador de epítopo Glu-Glu en el extremo C. Esta construcción posteriormente se modificó para introducir un sitio de escisión de trombina 3’ de CRF2-4 y 5’ del marcador 6-HIS. Esto se hizo usando la construcción anterior como molde en la PCR con los cebadores oligonucleótidos ZC38981 (SEQ ID NO: 27) y ZC39043 (SEQ ID NO: 28). Los productos de la PCR se purificaron usando procedimientos descritos en el presente documento y se digirieron con SacII y XhoI. Este fragmento SacII/XhoI se ligó en la construcción descrita antes que se había digerido previamente con SacII y XhoI. La secuencia del polinucleótido del dominio de unión de citoquinas extracelular de hzcytor11 fusionado con IgGy1 con un marcador Glu-Glu se muestra en la SEQ ID NO: 29 y la correspondiente secuencia del polipéptido se muestra en la SEQ ID NO: 30.

B. Coexpresión de zcytor11 y el dominio extracelular de la subunidad del receptor de citoquinas heterodímero

[0132] Se cotransfectaron 16 !g de cada uno de los vectores anteriores en células de mamífero, p. ej., células BHK-570 (ATCC Nº CRL-10314) usando el reactivo LipofectaminePlus™ (Gibco/BRL), según las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron durante 10 días en DMEM + FBS al 5 % (Gibco/BRL) que contenía metotrexato 1 !M (MTX) (Sigma, St. Louis, MO) y G418 0,5 mg/ml (Gibco/BRL) durante 10 días. La mezcla resultante de transfectantes se seleccionó otra vez en MTX 10 !M y G418 0,5 mg/ml durante 10 días.

[0133] La mezcla resultante de células doblemente seleccionadas se usó para generar la proteína receptora soluble zcytor11/CRF2-4. Se usaron 3 depósitos (Nunc, Dinamarca) de esta mezcla para generar 10 litros de medio condicionado exento de suero. Estos medios condicionados se pasaron por una columna de níquel seguido de una columna de Glu-Glu para purificar los heterodímeros de los homodímeros.

Ejemplo 8

Determinación de las subunidades de receptores que heterodimerizan o multimerizan con el receptor zcytor11

[0134] Usando procedimientos estándar descritos en el presente documento, las células quiméricas BaF3/MPL-zcytor11 se transfectan con una subunidad de receptor de citoquinas heterodímera adicional y sirven como una línea celular de bioensayo para medir la respuesta de transducción de señales de complejos heterodímeros de receptores zcytor11, al indicador luciferasa en presencia de TPO. En presencia de TPO, las células BaF3/MPL-zcytor11 no producen señal, lo que sugiere que el receptor zcytor11 debe heterodimerizar para producir la señal. La transfección de la línea celular BaF3/MPL-zcytor11 y fusión adicional de MLP-receptor de citoquinas de clase I que produce señal en presencia del ligando TPO, determina qué subunidades de receptores de citoquinas heterodímeras son necesarias para la señalización del receptor zcytor11. El uso de las fusiones de MPLreceptor para este propósito alivia el requisito de la presencia de un ligando natural para el receptor zcytor11.

[0135] Las fusiones de MLP-receptor de citoquinas de clase I se hacen de acuerdo con el ejemplo 5, usando el dominio extracelular y dominios transmembrana del receptor MPL y el dominio de señalización intracelular del receptor de citoquinas de clase I. La línea celular de bioensayo BaF3/MPL-zcytor11 cotransfectada con una fusión individual de MLP-receptor de citoquinas de clase I de acuerdo con el ejemplo 6, forma una línea celular BaF3/MPLzcytor11/MLP-receptor de citoquinas de clase I. Los complejos de receptores incluyen, pero sin limitar, el receptor zcytor11 en combinación con una fusión de MPL-receptor de citoquinas que comprende uno o más de, por ejemplo, un componente del receptor CRF2-4, IL-9, IL-10 IL-4. Después se ensaya cada línea celular de complejo de receptores independiente en presencia de TPO y se mide la proliferación usando procedimientos rutinarios (p. ej., ensayo de azul Alamar). La línea celular de bioensayo BaF3/MPL-zcytor11 sirve como control para la actividad de fondo de la luciferasa, y por lo tanto se usa como un valor base para comparar la señalización por diferentes combinaciones de complejos de receptores. Además, la línea celular de BaF3/MPL-receptor de citoquinas de clase I se puede construir para controlar los efectos de la homodimerización de MLP-receptor de citoquinas de clase I para aquellos receptores de citoquinas de clase I que se sabe que producen señal tras la homodimerización. Se espera que la TPO en presencia del complejo de receptores correcto, aumente la proliferación de la línea celular BaF3/MPLzcytor11/MLP-receptor de citoquinas de clase I en aproximadamente 5 veces respecto al valor base o más en presencia de TPO.

[0136] Ensayos de proliferación similares usan zcytor11 de longitud completa (SEQ ID NO: 2) para cribar subunidades que no son de zcytor11 adicionales que señalizan complejos heterodímeros y multímeros. Se transfectan células que expresan zcytor11 de longitud completa (SEQ ID NO: 2) con una subunidad que no es de zcytor11 y se ensaya la proliferación en presencia del ligando IL-TIF. Las células que expresan los componentes de los receptores zcytor11 heterodímeros y multímeros deben proliferar en presencia de IL-TIF.

Ejemplo 9

Reconstitución del receptor zcytor11 in vitro

[0137] Para identificar los componentes implicados en el complejo de señalización de zcytor11, se llevan a cabo estudios de reconstitución del receptor como sigue. Las células BHK 570 (ATCC Nº CRL-10314) transfectadas, usando procedimientos estándar descritos en el presente documento, con un plásmido de vector de expresión de mamífero con indicador de luciferasa, sirven de línea celular de bioensayo para medir la respuesta de transducción de señal de un complejo de receptor zcytor11 transfectado, al indicador luciferasa en presencia de IL-TIF. Las células BHK no expresan de forma endógena el receptor zcytor11. Un vector de expresión de mamífero con el indicador luciferasa ilustrativo es el plásmido KZ134 que se construyó con oligonucleótidos complementarios que contienen los elementos de unión al factor de transcripción STAT de 4 genes. Un elemento inducible c-fos Sis modificado (m67SIE, o hSIE) (Sadowski, H. y col., Science 261: 1739-1744, 1993), p21 SIE1 del gen p21 WAF1 (Chin, Y. y col., Science 272: 719-722, 1996), el elemento de respuesta de la glándula mamaria del gen de 1-caseína (Schmitt-Ney, M. y col., Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755, 1991), y un elemento inducible STAT del gen Fcg RI (Seidel,

H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3041-3045, 1995). Estos oligonucleótidos contienen extremos compatibles con Asp718-XhoI y se ligaron usando procedimientos estándar, en un vector receptor con el indicador luciferasa de luciérnaga con un promotor c-fos (Poulsen, L.K. y col., J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998) digerido con las mismas enzimas y que contenía un marcador seleccionable de neomicina. El plásmido KZ134 se usa para la transfección estable de células BHK o BaF3, usando procedimientos de transfección y selección estándar para hacer una línea celular BHK/KZ134 o BaF3/KZ134, respectivamente.

[0138] La línea celular de bioensayo se transfecta solo con el receptor zcytor11, o se cotransfecta con el receptor zcytor11 junto con una de una variedad de otras subunidades de receptores conocidas. Los complejos de receptores incluyen, pero sin limitar, el receptor zcytor11 solo, diferentes combinaciones del receptor zcytor11 con uno o más componentes de los receptores CRF2-4, IL-9, IL-10 IL-4, subunidades de receptores de citoquinas de clase II, o componentes del receptor de IL-2 (IL-2Ra, IL-2R1, IL-2Ry), receptor de zcytor11 con uno o más componentes de receptores de la familia de receptores de IL-4/IL-13 (IL-4Ra, IL-13Ra, IL-13Ra’), así como otros receptores de interleuquina (p. ej., IL-15 Ra, IL-7Ra, IL-9Ra, IL-21R (zcytor11)). Después se ensaya cada línea celular de complejo de receptores independiente en presencia de medio condicionado de citoquinas o citoquinas purificadas y se mide la actividad de la luciferasa usando procedimientos rutinarios. La línea celular de bioensayo no transfectada sirve de control para la actividad de fondo de la luciferasa, y por lo tanto se usa como un valor base para comparar la señalización por las diferentes combinaciones de complejos de receptores. Se espera que el medio condicionado de citoquinas o las citoquinas que se unen al receptor zcytor11 en presencia del complejo de receptores correcto produzca una lectura de la luciferasa de aproximadamente 5 veces frente al valor de fondo o mayor.

[0139] Como alternativa, se puede llevar a cabo un ensayo similar en el que las líneas celulares Baf3/zcytor11mpl y Baf3/zeytor11 se cotransfectan como se ha descrito antes y se mide la proliferación.

Ejemplo 10

Construcción para generar IL-TIF marcado con CEE

[0140] Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento por PCR que contenía la secuencia Kozak y la región codificante de IL-TIF, sin su codón de parada. Estos oligonucleótidos se diseñaron con un sitio KpnI en el extremo 5’ y un sitio BamHI en el extremo 3’ para facilitar la clonación en pHZ200-CEE, el vector de referencia para la expresión de mamífero de las proteínas marcadas con Glu-Glu en el C-terminal (SEQ ID NO: 4). El vector pHZ200 contiene un promotor MT-1.

[0141] Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo usando la polimerasa Turbo Pfu (Stratagene) para amplificar un fragmento de ADNc de IL-TIF. En la reacción de la PCR se usaron aproximadamente 20 ng de molde de polinucleótido de IL-TIF humano (SEQ ID NO: 7), y los oligonucleótidos ZC28590 (SEQ ID NO: 9) y ZC28580 (SEQ ID NO: 10). Las condiciones de reacción de la PCR eran las siguientes: 95°C durante 5 minutos; 30 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 55°C durante 60 segundos, y 72°C durante 60 segundos; y 72°C durante 10 minutos; seguido de mantenimiento a 4°C. Los productos de la PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando un kit de extracción en gel de QiaQuick™ (Qiagen). El fragmento de ADN aislado, aproximadamente 600 pb, se digirió con Kpnl y BamHI (Boerhinger- Mannheim), se purificó en gel como antes y se ligó en pHZ200-CEE que se había digerido previamente con Kpnl y BamHI.

[0142] Se electroporó aproximadamente 1 !l de la reacción de ligación en células competentes DH10B ElectroMaxTM (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cultivaron en placas LB que contenían ampicilina 100 !g/ml, y se incubaron durante la noche. Se recogieron las colonias y se cribaron por PCR usando los oligonucleótidos ZC28590 (SEQ ID NO: 9) y ZC28580 (SEQ ID NO: 10), con las condiciones de la PCR descritas antes. Después se secuenciaron los clones que contenía insertos para confirmar los insertos de IL-TIF sin error. Se llevaron a cabo Maxipreps de la construcción pHZ200-IL-TIF-CEE correcta, verificada por análisis de secuencia.

Ejemplo 11

Transfección y expresión de polipéptidos de IL-TIF

[0143] Se cultivaron células BHK 570 (ATCC Nº CRL-10314), con aproximadamente 1,2X106 células/pocillo (placa de 6 pocillos) en 800 !l de medio DMEM exento de suero (SF) (DMEM, Gibco/BRL con alto contenido de glucosa) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Las células se transfectaron con un plásmido de expresión que contenía el IL-TIF’-CEE descrito antes (Ejemplo 10), usando Lipofectina™ (Gibco BRL), en medio DMEM exento de suero (SF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0144] Las células se incubaron a 37 ºC durante aproximadamente 5 horas, después se transfirieron a placas MAXI separadas 150 mm en un volumen final de 30 ml de DMEM/suero bovino fetal al 5 % (FBS) (Hyclone, Logan, UT). Las placas se incubaron a 37°C, CO2 al 5 %, durante la noche, y la mezcla de ADN: Lipofectina™ se sustituyó por medio de selección (FBS al 5 %/DMEM con metotrexato 1 !M (MTX)) al día siguiente.

[0145] Aproximadamente 10-12 días después de la transfección, las colonias se recogieron mecánicamente en placas de 12 pocillos en 1 ml de FCS al 5 %/DMEM con MTX 5 !M, y después se cultivaron hasta confluencia. Después se ensayaron los niveles de expresión en las muestras de colonias de clones con expresión positiva en medio condicionado por SDS-PAGE y análisis Western. Se seleccionó un clon con expresión alta y se expandió para la generación extensa de medio condicionado para la purificación del IL-TIF-CEE expresado por las células (Ejemplo 12).

Ejemplo 12

Purificación del polipéptido de IL-TIF-CEE de células BHK 570

[0146] Salvo que se indique otra cosa, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4 ºC. El siguiente procedimiento se usó para purificar el polipéptido de IL-TIF que contenía el marcador GluGlu C-terminal (EE) (SEQ ID NO: 4). Se concentró el medio condicionado de células BHK que expresaban IL-TIF-CEE (Ejemplo 11) con un cartucho espiral Amicon S10Y3 en un ProFlux A30. Se añadió una disolución de inhibidor de proteasa al medio condicionado concentrado hasta concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético 2,5 mM (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), leupeptina 0,003 mM (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), pepstatina 0,001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0,4 mM (Boehringer-Mannheim). Se sacaron muestras para el análisis y el volumen aparente se congeló a -80 ºC hasta empezar la purificación. Las concentraciones totales de proteína diana del medio condicionado concentrado se determinaron por SDS-PAGE y análisis de transferencia Western con el anticuerpo dirigido contra EE conjugado con HRP.

[0147] Se vertió una columna de aproximadamente 100 ml de G-Sepharose con anticuerpo contra EE (preparada como se describe a continuación) en una columna de vidrio Waters AP-5 de 5 cm x 10 cm. La columna se empaquetó con flujo y se equilibró en un sistema BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. El medio condicionado concentrado se descongeló, se esterilizó por filtración a través de 0,2 !m, se ajustó el pH a 7,4, y después se cargó en la columna durante la noche con un caudal de aproximadamente 1 ml/min. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna (VC) de disolución salina taponada con fosfato (PBS, pH 7,4), el tapón se eluyó con 200 ml de PBS (pH 6,0) que contenía el péptido EE 0,5 mg/ml (Anaspec, San Jose, CA) a 5 ml/min. El péptido EE usado tiene la secuencia EYMPME (SEQ ID NO: 4). La columna se lavó con 10 VC de PBS, después se eluyó con 5 VC de glicina 0,2 M, pH 3,0. El pH de la columna eluida con glicina se ajustó a 7,0 con 2 VC de 5X PBS, después se equilibró en PBS (pH 7,4). Se recogieron fracciones de 5 ml a lo largo de toda la cromatografía por elución y se siguió la absorbancia a 280 y 215 nm; las mezclas del paso y del lavado también se guardaron y se analizaron. Se analizó en las fracciones con pico de elución del polipéptido EE la proteína diana por SDS-PAGE con tinción con plata y transferencia Western con el anticuerpo dirigido contra EE conjugado con HRP. Las fracciones de elución del polipéptido de interés se mezclaron y se concentraron de 60 ml a 5,0 ml usando un concentrador de centrifugación de membrana con corte de exclusión de peso molecular de 10.000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0148] Para separar el IL-TIF-CEE de otras proteínas que purifican conjuntamente, las fracciones de elución mezcladas del polipéptido concentradas se sometieron a una columna POROS HQ-50 (resina de intercambio aniónico fuerte de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) a pH 8,0. Se vertió una columna de 1,0 x 6,0 cm y se empaquetó con fluido en un sistema BioCad Sprint. La columna se cargó con el contraión y después se equilibró en TRIS 20 mM pH 8,0 (Tris(Hidroximetil-aminometano)). La muestra se diluyó 1: 13 (para reducir la fuerza iónica de la PBS) y después se cargó en una columna Poros HQ a 5 ml/min. La columna se lavó con 10 VC con Tris 20 mM pH 8,0 y después se eluyó con 40 VC de gradiente de Tris 20 mM/cloruro sódico 1 M (NaCl) a 10 ml/min. Se recogieron fracciones de 1,5 ml a lo largo de toda la cromatografía y se siguió la absorbancia a 280 y 215 nm. Las fracciones de picos de elución se analizaron por SDS-PAGE con tinción con plata. Las fracciones de interés se mezclaron y se concentraron hasta 1,5-2 ml usando un concentrador de centrifugación de membrana con corte de exclusión de peso molecular de 10.000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0149] Para separar el polipéptido IL-TIF-CEE del péptido EE libre y cualquier proteína que purifica conjuntamente contaminante, las fracciones mezcladas concentradas se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño molecular en una columna Sephadex S200 de 1,5 x 90 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada y cargada con PBS con un caudal de 1,0 ml/min usando un sistema BioCad Sprint. Se recogieron fracciones de 1,5 ml a lo largo de toda la cromatografía y se siguió la absorbancia a 280 y 215 nm. Las fracciones de picos se caracterizaron por SDS-PAGE con tinción con plata y solo se mezclaron las fracciones más puras. Este material representaba el polipéptido IL-TIF-CEE purificado.

[0150] Este material purificado se sometió finalmente a una columna de 4 ml ActiClean Etox (Sterogene) para separar cualquier endotoxina restante. La muestra se pasó por la columna de gravedad equilibrada con PBS 4 veces, y después la columna se lavó con un solo volumen de 3 ml de PBS, que se mezcló con la muestra “limpiada”. Después el material se esterilizó por filtración a través de 0,2 !m y se conservó a -80 ºC hasta que se dividió en partes alícuotas.

[0151] En los geles de SDS-PAGE con tinción con plata y azul Coomassie y sometidos a transferencia Western, el polipéptido IL-TIF-CEE era una banda principal. La concentración de proteína del material purificado se llevó a cabo por análisis de BCA (Pierce, Rockford, IL) y la proteína se dividió en partes alícuotas y se conservó a 80 ºC de acuerdo con procedimientos estándar.

[0152] Para preparar la Sepharosa con anticuerpo dirigido contra EE, un volumen de lecho de 100 ml de G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) se lavó 3 veces con 100 ml de PBS que contenía azida sódica al 0,02 % usando una unidad de filtración de 0,45 !m de 500 ml Nalgene. El gel se lavó con 6,0 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO), y se añadió un volumen igual de disolución de anticuerpo contra EE que contenía 900 mg de anticuerpo. Después de incubación durante una noche a 4 ºC, se separó el anticuerpo no unido lavando la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM como se ha descrito antes. La resina se volvió a suspender en 2 volúmenes de TEA, se transfirió a un envase adecuado y se añadió dimetilpimilimidato-2HCl (Pierce, Rockford, IL) disuelto en TEA hasta una concentración final de 36 mg/ml de gel de proteína G-Sepharose. El gel se sacudió a temperatura ambiente durante 45 min y el líquido se separó usando la unidad de filtración descrita antes. Después los sitios no específicos del gel se bloquearon por incubación durante 10 min, a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM en TEA 200 mM. Después el gel se lavó con 5 volúmenes de PBS que contenía azida sódica al 0,02 % y esta disolución se conservó a 4 ºC.

Ejemplo 13

Efectos in vivo del polipéptido IL-TIF

[0153] Los ratones (hembra, C57B1, 8 semanas de edad; Charles River Labs, Kingston, NY) se dividieron en 3 grupos. Previamente se hizo un adenovirus que expresaba el polipéptido IL-TIF (SEQ ID NO: 8) usando procedimientos estándar. El día 0, se administró adenovirus parental o con IL-TIF al primer (n = 8) y segundo (n = 8) grupos, respectivamente, por la vena de la cola, recibiendo cada ratón una dosis de �1x1011 partículas en 0,1 ml de volumen. El tercer grupo (n = 8) no recibió tratamiento. El día 12, los ratones se pesaron y se extrajo sangre de los ratones. Se analizó en las muestras el recuento sanguíneo completo (CBC) y la química del suero. Se detectaron en las muestra de sangre aumentos estadísticamente significativos de los recuentos de neutrófilos y plaquetas en las muestras de sangre del grupo al que se administró el adenovirus con IL-TIF con respecto al grupo tratado con el adenovirus parental. También, los recuentos de linfocitos y glóbulos rojos eran significativamente menores en el grupo al que se administró el adenovirus con IL-TIF con respecto al grupo tratado con el adenovirus parental. Además, los ratones tratados con el adenovirus con IL-TIF redujeron el peso corporal, mientras que los ratones tratados con el adenovirus parental ganaron peso. El nivel de SAA y globulina había aumentado y el nivel de glucosa había disminuido. Los ratones con adeno-zcyto18 presentaron síndrome de desgaste. En resumen, zcyto18 produce respuesta de fase aguda (APR) que refleja la actividad proinflamatoria de las citoquinas TNF-a, IL-1, y gp130.

[0154] Los resultados sugerían que el IL-TIF es un factor proinflamatorio que está implicado en la respuesta inmunitaria e inflamatoria in vivo. La distribución tisular del receptor de IL-TIF (zcytor11) indicaba que la expresión elevada del IL-TIF en la circulación o tejidos específicos puede conducir a determinadas enfermedades inflamatorias agudas/crónicas, tales como la pancreatitis, EII (enfermedad de Chron, colitis), asma, ESRD (enfermedad renal en etapa terminal), artritis reumatoide, psoriasis y enfermedades autoinmunitarias (GVHD, lupus, septicemia).

[0155] Los resultados sugerían que el IL-TIF afecta a la hematopoyesis, es decir, la formación de células sanguíneas in vivo. Como tal, el IL-TIF podría tener actividades biológicas que afectan a diferentes hemocitoblastos, dando como resultado el aumento o disminución de determinadas células sanguíneas diferenciadas en un linaje específico. Por ejemplo, parece que el IL-TIF reduce los linfocitos, lo cual se debe probablemente a la inhibición de las células progenitoras implicadas que dan lugar a células linfoides. El IL-TIF también disminuye los glóbulos rojos. Estos descubrimientos están de acuerdo con los efectos inhibidores del IL-TIF en la proliferación y/o el crecimiento de mielohemocitoblastos (Ejemplo 13), apoyando la idea de que el IL-TIF podría tener una función en la anemia, infección, inflamación y/o enfermedades inmunitarias al influir en las células sanguíneas implicadas en ese proceso. Los antagonistas contra el IL-TIF, tales como los anticuerpos o receptores solubles zcytor11 de la presente invención, se podrían usar como reactivos terapéuticos en estas enfermedades.

[0156] Además, estos experimentos que usan el adenovirus con IL-TIF en ratones sugieren que el exceso de expresión de IL-TIF aumenta el nivel de neutrófilos y plaquetas in vivo. Se puede imaginar que haya otros factores (tales como citoquinas y genes modificadores) implicados en las respuestas al IL-TIF en el sistema entero del animal. Sin embargo, estos datos apoyan firmemente la implicación del IL-TIF en la hematopoyesis. Por lo tanto, el IL-TIF y sus receptores son reactivos/dianas adecuados para el diagnóstico y tratamiento de una variedad de trastornos, tales como la inflamación, trastornos inmunitarios, infección, anemia, cánceres heamtopoyéticos y otros cánceres, y similares.

Ejemplo 14

Identificación de células que expresan zcytor11 usando hibridación in situ [0157] Se aislaron tejidos humanos específicos y se cribó la expresión de zcytor11 por hibridación in situ. Los diferentes tejidos humanos preparados, seccionados y sometidos a hibridación in situ, incluían apéndice, cerebro, cartílago, colon, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglios linfáticos, linfoma, ovario, páncreas, placenta, próstata, piel, bazo y timo. Los tejidos se fijaron en formalina tamponada al 10 % y se bloquearon en parafina usando técnicas estándar. Los tejidos se seccionaron en 4 a 8 micrómetros. Los tejidos se prepararon usando un protocolo estándar ("Development of non-isotopic in situ hybridization" at The Laboratory of Experimental Pathology (LEP), NIEHS, Research Triangle Park, NC; dirección web http: //dir.niehs.nih.gov/dirlep/ish.html). Brevemente, las secciones de tejidos se desparafinaron con HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) y después se deshidrataron con etanol. Al día siguiente se digirieron con proteinasa K (50 !g/ml) (Boehringer Diagnostics, Indianapolis, IN) a 37°C durante 2 a 7 minutos. A esta etapa le siguió la acetilación y rehidratación de los tejidos.

[0158] Se diseñó una sonda in situ contra la secuencia de zcytor11 humano (nucleótidos 234-1105 en la SEQ ID NO: 1), y se aisló de un plásmido que contenía la SEQ ID NO: 1 usando procedimientos estándar. Se usó la ARN polimerasa T7 para generar una sonda de sentido contrario. La sonda se marcó con digoxigenina (Boehringer) usando un sistema de transcripción In vitro (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0159] La hibridación in situ se llevó a cabo con una sonda de zcytor11 marcado con digoxigenina (anterior). La sonda se añadió a los portaobjetos en una concentración de 1 a 5 pmol/ml durante 12 a 16 horas a 60 ºC. Posteriormente los portaobjetos se lavaron en 2XSSC y 0,1XSSC a 55 ºC. Las señales se amplificaron usando la amplificación de señal con tiramida (TSA) (TSA, kit indirecto in situ; NEN) y se visualizaron con el kit de sustrato Vector Red (Vector Lab) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

[0160] Se observaron señales en varios tejidos ensayados: los ganglios linfáticos que contienen células en la paracorteza de los folículos eran fuertemente positivos. En las muestras de linfoma, hay poca o no hay señal en las muestras ensayadas. En el bazo, se vieron señales positivas en células mononucleares dispersas en la periferia de folículos que eran positivas. En el timo, se vieron señales positivas en células mononucleares dispersas tanto en la corteza como en la médula que eran positivos. En el hígado fetal, se observó una señal fuerte en una población mixta de células mononucleares en espacios sinusoides. Algunas células mononucleares de la circulación también eran positivas. Los hepatocitos eran negativos. En el apéndice inflamado, las células mononucleares en las placas de Peyer y los sitios de infiltración eran positivos. En el intestino, las células en la lámina propia y placas de Peyer eran fuertemente positivas. Las células de los ganglios nerviosos en los músculos eran positivos. En el pulmón normal, zcytor11 era expresado en el epitelio alveolar y las células mononucleares en el tejido intersticial y la circulación. En el tejido del carcinoma de pulmón, se observaba una señal débil en las células de carcinoma y las células mononucleares en la periferia de los sitios de carcinoma. En el carcinoma de ovario, las células del epitelio eran fuertemente positivas. Algunas células intersticiales, con mayor probabilidad las células mononucleares, también eran positivas. No se observaba señal en el ovario normal. En el riñón, los podocitos y las células epiteliales simples en la capa parietal de la cápsula de Bowman en los corpúsculos renales eran positivos. Las células epiteliales cúbicas de los túbulos convolutos distales también eran positivos. En las muestras de páncreas tanto normales como con pancreatitis, las células acinares y algunas células mononucleares en el mesenterio eran positivas. También pude haber señal débil en un subconjunto de células en los islotes pancreáticos. En el primer periodo de la placenta (8 semanas), se observó señal en los trofoblastos. En la piel, se observó señal fuerte en los queratinocitos y células mononucleares en los infiltrados inflamados en la dermis superficial. En el cerebro, la mayoría de las neuronas en el lóbulo temporal eran positivas, sin embargo, el lóbulo frontal aparece negativo. En el cartílago articular, los condrocitos eran positivos. Otros tejidos ensayados incluyendo el ovario normal, melanoma de piel, carcinoma de próstata y BPH eran negativos.

[0161] En resumen, los datos in situ estaban de acuerdo con los datos de expresión descritos antes para zcytor11. Se observó la expresión de zcytor11 de forma predominante y consistente por una población mixta de células mononucleares. Un subconjunto del epitelio también era positivo. Estos resultados confirmaban la presencia de expresión de zcytor11 en células inmunitarias y señalaba una función en la inflamación, enfermedad autoinmunitaria, u otra función inmunitaria, por ejemplo, en la unión de citoquinas proinflamatorias, incluyendo, pero sin limitar, IL-TIF. Además, la detección de la expresión de zcytor11 se puede usar, por ejemplo, como marcador para células mononucleares en muestras histológicas.

[0162] Zcytor11 es expresado en células mononucleares, incluyendo tejidos normales (ganglios linfáticos, bazo, timo, páncreas, riñón, hígado y pulmón), y tejidos anormales (apéndice inflamado, carcinoma de pulmón, carcinoma de ovario, pancreatitis, piel inflamada y carcinoma de próstata). Es notable que las células plasmáticas en los ganglios linfáticos, intestino y carcinoma de pulmón son positivas para zcytor11. Las células plasmáticas son linfocitos inmunológicamente activados responsables de la síntesis de anticuerpos. Además IL-TIF es expresado en linfocitos T activados y la expresión de zcytor11 se detecta solo en células CD19 + en reposo (pero no en activadas) (Ejemplo 13). Por lo tanto, zcytor11 se puede usar como marcador o como diana para aislar determinados linfocitos, tales como leucocitos mononucleares y un tipo limitado de leucocitos activados, tales como CD19 + en reposo.

[0163] Además, la presencia de expresión de zcytor11 en células inmunitarias tales como linfocitos T CD8 + y linfocitos B CD19 + mostró que zcytor11 puede estar implicado en las reacciones de defensa inmunitarias del cuerpo contra invasores extraños: tales como microorganismos o restos celulares, y podría tener una función en las respuestas inmunitarias durante la inflamación y formación de cáncer. La activación del receptor zcytor11 puede producir enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias tales como GVHD, septicemia y lupus.

[0164] Además, como se describe en el presente documento, el epitelio de diferentes tejidos era positivo para la expresión de zcytor11, tales como la piel, riñón, intestino, hepatocitos (epitelios derivados del endodermo), epitelio alveolar pulmonar (epitelios derivados de endodermo) y epitelio de carcinoma de ovario (epitelio derivado de mesodermo). La respuesta inflamatoria en esos tejidos puede producir enfermedades inflamatorias agudas/crónicas, tales como psoriasis (piel), enfermedad renal en la etapa terminal ESRD (riñón), EII (enfermedad de Chron, colitis) (intestino), y asma/alergia respiratoria/bronquitis crónica (pulmón). La expresión en el epitelio de zcytor11 podría estar alterada en respuestas inflamatorias y/o cánceres en el hígado y el pulmón. Por lo tanto, el ligando para zcytor11, tal como el IL-TIF, o un fragmento del mismo de unión al receptor, se podría usar como marcador para seguir los cambios en estos tejidos como resultado de una inflamación o cáncer. Además, el análisis de la expresión de zcytor11 in situ muestra que el epitelio de ovario normal es negativo para la expresión de zcytor11, mientras que es fuertemente positivo en el epitelio del carcinoma de ovario, proporcionando pruebas adicionales de que los polipéptidos IL-TIF, o un fragmento de los mismos de unión al receptor, se pueden usar como un marcador de diagnóstico y/o diana terapéutica para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres de ovario, y carcinoma de ovario, como se describe en el presente documento.

[0165] También se detectó zcytor11 en otros tejidos, tal como en células acinares en el páncreas (tejidos normal y pancreatitis), trofoblastos en placenta (derivados de ectodermo), condrocitos en cartílago (derivados de mesodermo), y células de los ganglios en el intestino (derivadas de ectodermo). Como tal, zcytor11 puede estar implicado en la diferenciación y/o funciones normales de las células correspondientes en estos órganos. Como tal, las potenciales utilidades de zcytor11 incluyen el mantenimiento del metabolismo normal y embarazo, formación ósea/homeostasis y función fisiológica del intestino, y similares. Además, la regulación positiva de IL-TIF puede causar potencialmente la respuesta inflamatoria en esos tejidos que conduce a determinadas enfermedades inflamatorias como la pancreatitis, artritis reumatoide, EII (colitis y enfermedad de Chron).

Ejemplo 15

Distribución tisular de zcytor11 humano en paneles de tejidos usando transferencia Northern y PCR

A. Distribución tisular de zcytor11 humano en paneles de tejidos usando la PCR

[0166] Se cribó en un panel de ADNc de tejidos humanos la expresión de zcytor11 usando la PCR. El panel se hizo en el propio laboratorio y contenía 94 ADNc Marathon y las muestras de ADNc de diferentes tejidos y líneas celulares humanas normales y cancerosos se muestran a continuación en la tabla 4. Además de la reacción de la PCR, el procedimiento usado fue como el mostrado en el ejemplo 12. Las reacciones de la PCR se ajustaron usando los oligonucleótidos ZC14.666 (SEQ ID NO: 11) y ZC14.742 (SEQ ID NO: 12), mezcla de ADNc polimerasas Advantage 2 (Clontech, Palo Alto, CA), y colorante Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). La amplificación se llevó a cabo como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos, 40 ciclos a 94°C durante 15 segundos, 51°C durante 30 segundos y 72°C durante 30 segundos, seguido de 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos. El tamaño de fragmento de ADN previsto correcto se observó en la vejiga, cerebro, cuello uterino, colon, cerebro fetal, corazón fetal, riñón fetal, hígado fetal, pulmón fetal, piel fetal, corazón, riñón, hígado, pulmón, melanoma, ovario, páncreas, placenta, próstata, recto, glándula salival, intestino delgado, testículos, timo, tráquea, medula espinal, tiroides, tumor pulmonar, tumor ovárico, tumor rectal, y tumor de estómago. La expresión de zcytor11 no se observó en otros tejidos y líneas celulares en este panel.

[0167] También se ensayó como antes un panel de la 1ª cadena del ADNc (Human Blood Fractions MTC Panel, Clontech, Palo Alto, CA). El panel contenía las siguientes muestras: células mononucleares, células mononucleares activadas, células CD4 + en reposo, células CD4 + activadas, células CD8 + en reposo, células CD8

+ activadas, células CD14 + en reposo, células CD19 + en reposo y células CD19 + activadas. Todas las muestras excepto las de CD8 + activadas y CD19 + activadas mostraban expresión de zcytor11.

Tabla 4

Tejido: nº de muestras Tejido nº de muestras

glándula suprarrenal: 1 vejiga 1

médula ósea: 3 cerebro 2

cuello uterino: 1 colon 1

cerebro fetal: 3 corazón fetal 2

riñón fetal: 1 hígado fetal 2

pulmón fetal: 1 piel fetal 1

corazón: 2 músculo fetal 1

riñón: 2 hígado 1

pulmón: 1 ganglios linfáticos 1

glándula mamaria: 1 melanoma 1

ovario: 1 páncreas 1

pituitaria: 2 placenta 3

próstata: 3 recto 1

glándula salival: 2 músculo esquelético 1

intestino delgado: 1 médula espinal 2

bazo: 1 útero 1

estómago: 1 biblioteca de adipocitos 1

testículos: 5 islotes 1

timo: 1 próstata SMC 1

tiroides: 2 RPMI 1788 1

tráquea: 1 WI37 1

tumor esofágico: 1 tumor pulmonar 1

tumor hepático: 1 tumor ovárico 1

tumor rectal: 1 tumor estomacal 1

tumor uterino: 2 biblioteca de CD3 + 1

biblioteca de HeCAT: 1 biblioteca de HPV 1

biblioteca de HPVS: 1 biblioteca de MG63 1

K562: 1

5 B. Distribución tisular de zcytor11 humano en paneles de tejidos y líneas celulares humanas usando la RT-PCR

[0168] Se cribó en un panel de ARN de líneas celulares humanas la expresión de zcytor11 usando la RT-PCR. Los paneles se hicieron en el propio laboratorio y contenían 84 ARN de diferentes tejidos y líneas celulares humanas normales y cancerosos como se muestra a continuación en las tablas 5-8. Los ARN se prepararon a partir de tejidos 10 y líneas celulares del laboratorio o adquiridas usando el kit RNAeasy Midi o Mini (Qiagen, Valencia, CA). El panel se preparó en un formato de 96 pocillos con 100 ng de ARN por muestra. Las reacciones de la RT-PCR se llevaron a cabo usando los oligonucleótidos ZC14.666 (SEQ ID NO: 11) y ZC14.742 (SEQ ID NO: 12), colorante Rediload y el sistema SUPERSCRIPT One Step RT-PCR (Life Technologies, Gaithersburg, MD). La amplificación se llevó a cabo como sigue: un ciclo a 50° durante 30 minutos seguido de 45 ciclos a 94°, 15 segundos; 52°, 30 segundos; 72°, 30 15 segundos; y después se terminó con una extensión final a 72° durante 7 minutos. De 8 a 10 !l del producto de reacción de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa usando un gel de agarosa al 4 %. El tamaño de fragmento de ADNc previsto correcto se observó en la glándula suprarrenal, vejiga, mama, bronquio, colon normal, cáncer de colon, duodeno, endometrio, esófago, cáncer gástrico, cáncer gastroesofágico, ventrículo del corazón, íleo, riñón normal, cáncer renal, hígado, pulmón, ganglios linfáticos, páncreas, parótidas, piel, intestino delgado, 20 estómago, tiroides, y útero. Las líneas celulares que mostraban expresión de zcytor11 eran A-431, CaCO2 diferenciadas, DLD-1, HBL-100, HCT-15, HepG2, HepG2 + IL6, HuH7, y NHEK nº1-4. No se observó expresión de zcytor11 en los otros tejidos y líneas celulares ensayados en este panel. El patrón de expresión de zcytor11 muestra expresión en tejidos específicos y tumores específicos de tejidos. Un experto en la materia reconocerá que los polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos y parejas de unión de la presente invención se pueden usar como un

25 diagnóstico para detectar cáncer o tejido canceroso en una biopsia, tejido, o muestra histológica, en particular en tejidos en los que se expresa zcytor11. Dichos usos de diagnóstico para las moléculas de la presente invención se conocen en la materia y se describen en el presente documento.

[0169] Además, debido a que el patrón de expresión de zcytor11, uno de los receptores de IL-TIF, muestra

30 expresión en determinados tejidos específicos, también se pueden usar parejas de unión incluyendo el ligando natural, IL-TIF, como diagnóstico para detectar tejidos específicos (normales o anormales), cáncer o tejido canceroso en una biopsia, tejido u otras muestras histológicas, en particular tejidos en los que se expresan los receptores de IL-TIF. IL-TIF también se puede usar para localizar otros tejidos en los que se expresan sus receptores, p. ej., zcytor11 y CRF2-4. Además, dichas parejas de unión se podrían conjugar con agentes quimioterapéuticos, restos tóxicos y similares, para dirigir la terapia al sitio del tumor o tejido enfermo. Dicho diagnóstico y terapia dirigida se conocen en la materia y se describen en el presente documento.

5 [0170] Los patrones de expresión de zcytor11 (antes) indicaban tejidos diana y tipos de células para la acción del IL-TIF, y por lo tanto, antagonistas del IL-TIF, tal como los receptores zcytor11 solubles de la presente invención. El zcytor11 en general se expresa en tres sistemas fisiológicos: sistema digestivo, sistema reproductivo femenino, y sistema inmunitario. Además, el patrón de expresión del receptor (zcytor11) indicaba que un antagonista de IL-TIF

10 de los receptores zcytor11 solubles de la presente invención tendría aplicación terapéutica para enfermedades humanas en dos áreas: la inflamación (p. ej., EII, enfermedad de Chron, pancreatitis) y cáncer (p. ej., ovario, colon). Es decir, los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar para antagonizar los efectos inflamatorios y otros efectos inducidos por citoquinas de la interacción de IL-TIF con células que expresan el receptor zcytor11.

15 [0171] Además, la expresión de zcytor11 aparecían con regulación negativa o ausente en un tejido de colitis ulcerativa, línea celular hepática HepG2 inducida por IL-6, linfocitos T CD8 + activados y linfocitos B CD19 + . Estos experimentos de RT-PCR demuestran que las células de sangre periférica CD19 + , linfocitos B, expresan receptores para IL-TIF, en concreto zcytor11. Los receptores zcytor11 solubles de la presente invención actuarían

20 como un antagonista para neutralizar los efectos de IL-TIF en los linfocitos B. Esto sería beneficioso en enfermedades en las que los linfocitos B son los jugadores clave: enfermedades autoinmunitarias incluyendo lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia grave, enfermedad compleja inmunitaria, y cánceres de linfocitos B que son exacerbados por el IL-TIF. Las enfermedades autoinmunitarias en las que los linfocitos B contribuyen a la patología de la enfermedad serían dianas para la terapia con el receptor soluble zcytor11: esclerosos múltiple, enfermedad

25 inflamatoria del intestino (EII) y artritis reumatoide como ejemplos. La terapia con el receptor soluble zcytor11 sería beneficiosa para suprimir o inhibir linfocitos B que producen IgE en enfermedades atópicas incluyendo el asma, alergia y dermatitis atópica en la que la producción de IgE contribuye a la patogénesis de la enfermedad.

[0172] Los tumores malignos de linfocitos B pueden presentar una pérdida de regulación de citoquinas, tales

30 como IL-TIF. La administración de los receptores zcytor11 solubles de la presente invención después de la extirpación quirúrgica o quimioterapia, pueden ser útiles para tratar la enfermedad residual mínima en pacientes con tumores malignos de linfocitos B. La pérdida de regulación puede conducir a mantener o aumentar la expresión de zcytoR11. Creando así una diana para los anticuerpos monoclonales terapéuticos dirigidos a zcytoR11 que comprenden receptores, tales como los descritos en el presente documento.

35 Tabla 5

Tejido: nº de muestras Tejido nº de muestras

glándula suprarrenal: 6 duodeno 1

vejiga: 3 endometrio 5

cerebro: 2 endometrio canceroso 1

meningioma cerebral: 1 cáncer gástrico 1

mama: 1 esófago 7

mama canceroso: 4 gastroesofágico 1

mama normal adyacente a cáncer: 5 aorta del corazón 1

bronquio: 3 ventrículo izquierdo del corazón 4

colon: 15 ventrículo derecho del corazón 2

colon canceroso: 1 ventrículo del corazón 1

colon normal adyacente a cáncer: 1 íleo 3

colon colitis ulcerativa: 1 riñón 15

riñón canceroso: 1

Tabla 6 Tabla 7

Tejido: nº de muestras Tejido nº de muestras

293: 1 HBL-100 1

C32: 1 Hs-294T 1

HaCat 1: 1 Molt4 1

HaCat 2: 1 RPMI 1

HaCat 3: 1 U-937 1

HaCat 4: 1 A-375 1

WI-38: 1 HCT-15 1

WI-38 + 2 um ionomicina 1: 1 HT-29 1

WI-38 + 2 um ionomicina 2: 1 MRC-5 1

WI-38 + 5 um ionomicina 1: 1 RPT-1 1

WI-38 + 5 um ionomicina 2: 1 RPT-2 1

Caco-2,: 1 WM-115 1

Caco-2, diferenciadas: 1 A-431 1

DLD-1: 1 WERI-Rb-1 1

HRE: 1 HEL-92.1.7 1

HRCE: 1 HuH-7 1

MCF7: 1 MV-4-11 1

PC-3: 1 U-138 1

TF-1: 1 CCRF-CEM 1

5637: 1 Y-79 1

143B: 1 A-549 1

ME-180: 1 EL-4 1

epitelio prostático: 1 HeLa 229 1

U-2 OS: 1 HUT 78 1

T-47D: 1 NCI-H69 1

Mg-63: 1 SaOS2 1

Raji: 1 USMC 1

U-373 MG: 1 UASMC

A-172: 1 AoSMC 1

CRL-1964: 1 UtSMC 1

CRL-1964 + ácido butírico: 1 HepG2 1

HUVEC: 1 HepG2- IL6 1

SK-Hep-1: 1 NHEK L 1

SK-Lu-1: 1 NHEK 2 1

Sk-MEL-2: 1 NHEK 3 1

K562: 1 NHEK 4 1

BeWo: 1 ARPE-19 1

FHS74.Int: 1 G-361 1

HL-60: 1 HISM 1

Malme 3M: 1 3AsubE 1

FHC: 1 INT407 1

HREC: 1

Tejido: nº de muestras Tejido nº de muestras

hígado: 10 pulmón 13

ganglios linfáticos: 1 pulmón canceroso 2

linfoma: 4 pulmón normal adyacente a cáncer 1

adenoma mamario: 1 músculo 3

glándula mamaria: 3 neuroblastoma 1

melinorioma: 1 epiplón 2

sarcoma osteogénico: 2 ovario 6

páncreas: 4 ovario canceroso 2

piel: 5 parótida 7

sarcoma: 2 glándula salival 4

Tabla 8

Tejido: nº de muestras Tejido nº de muestras

intestino delgado: 10 útero 11

bazo: 3 cáncer uterino 1

linfoma de bazo: 1 tiroides 9

estómago: 13

cáncer estomacal: 1

C. Distribución tisular de zcytor11 en tejido OrigeneTM humano y paneles MTC de fracciones de sangre humana usando la RT-PCR

10 [0173] Se cribó en un panel de ARN de tejidos humanos, tejido humano Origene™ y paneles MTC de fracciones de sangre humana (Origene Technologies, Rockville, MD; and Clontech, Palo Alto, CA) la expresión de zcytor11 usando la RT-PCR. Los paneles contenía 24 ARN de diferentes tejidos humanos normales en concentraciones crecientes como se muestra en las siguientes tablas 9-10. Las reacciones de RT-PCR se llevaron a

15 cabo usando los oligonucleótidos ZC37693 (SEQ ID NO: 31) y ZC37449 (SEQ ID NO: 32), usando el kit de PCR Advantage (Clontech). La amplificación se llevó a cabo como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 2 min; 35 ciclos a 94°C durante 15 se, 72°C durante 1,5 min; después 72°C durante 2 min; seguido de mantenimiento a 4°C. De 8 a 10 !l de producto de reacción de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa estándar usando un gel de agarosa al 4 %.

20 [0174] Usando el panel Origene, como se muestra en la tabla 9, se observó el tamaño de fragmento de ADNc (440 pb) previsto correcto en todos los tejidos excepto de bazo, músculo, placenta, PBL, médula ósea y cerebro fetal. Sin embargo, había específicamente expresión alta en el intestino delgado, colon, riñón, piel, pulmón, páncreas e hígado. También se observó expresión débil de zcytor 11 en ovario, útero, próstata, cerebro, corazón, testículos,

25 estómago y tiroides. No se observó expresión de zcytor11 en los otros tejidos y líneas celulares ensayadas en este panel. El patrón de expresión de zcytor11 muestra expresión en tejidos específicos. Un experto en la materia reconocerá que los polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos y parejas de unión de la presente invención se pueden usar como un diagnóstico para detectar tejidos, cáncer o tejido canceroso en una biopsia, tejido, o muestra histológica, en particular en tejidos en los que se expresa zcytor11. Dichos usos de diagnóstico para las moléculas

30 de la presente invención se conocen en la materia y se describen en el presente documento.

[0175] Usando el panel MTC de fracciones de sangre humanas, como se muestra en la tabla 10, se observó el tamaño de fragmento de ADNc (440 pb) previsto correcto en células mononucleares, células CD8 + en reposo, células CD19 + en reposo y placenta. No se observó la expresión de zcytor11 en los otros tejidos y líneas celulares

35 ensayadas en este panel, incluyendo las células CD8 + y CD19 + activadas. El patrón de expresión de zcytor11 muestra expresión en tejidos específicos. Un experto en la materia reconocerá que los polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos y parejas de unión de la presente invención se pueden usar como un diagnóstico para detectar tejidos, cáncer o tejido canceroso en una biopsia, tejido, o muestra histológica, en particular en tejidos en los que se expresa zcytor11. Dichos usos de diagnóstico para las moléculas de la presente invención se conocen en la materia y se

40 describen en el presente documento.

Tabla 9

Tejido: 1 pg ADNc 10 pg ADNc 100 pg ADNc 1 ng ADNc

Cerebro: X

Corazón: X

Riñón: X X

Bazo

Hígado: X X

Colon: X X

Pulmón: X X

Intestino delgado: X X X

Músculo

Estómago: X X

Testículos: X X X

Placenta: X

Glándula salival: X

Glándula tiroidea: X X

Glándula suprarrenal: X X

Páncreas: X X X X

Ovario: X

Útero: X

Próstata: X

Piel: X X

PBL

Médula ósea

Cerebro fetal

Hígado fetal: X X X

Tabla 10

1 ng ADNc: Expresión

Células mononucleares: X

Células CD8 + en reposo: X

Células CD4 + en reposo

Células CD14 + en reposo

Células CD19 + en reposo: X

Células CD19 + activadas

Células mononucleares activadas

Células CD4 + activadas

Células CD8 + activadas

Placenta humana: X

Control sin patrón

ADNc de zcytor11: X

D. Distribución tisular de zcytor11 en células inmunitarias primarias humanas y líneas celulares inmunitarias usando la RT-PCR

10 [0176] Se cribó la expresión de zcytor11 en un panel de ARN de poblaciones de células inmunitarias humanas primarias y líneas celulares inmunitarias humanas, usando la RT-PCR. Los paneles se hicieron en el laboratorio y contenían 24 ARN de diferentes poblaciones de células y líneas celulares en reposo y activadas como se muestra en la siguiente tabla 11. Todas las poblaciones de células inmunitarias primarias se aislaron de la sangre de varios

15 donantes anónimos. Después se aislaron diferentes subconjuntos de células inmunitarias (CD4 + , CD8 + , CD14 + , CD19 + , y CD56 + ) usando microperlas y el sistema de separación celular magnético de Miltenyi Biotec. Los ARN se prepararon a partir de poblaciones de CD19 + y CD56 + en su estado de reposo usando un kit RNeasy Midiprep™ (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las poblaciones de CD4 + y CD8

+ se activaron usando anticuerpo dirigido contra CD3 unido a placa 200 ng/ml y anticuerpo dirigido contra CD28

20 soluble 5 !g/ml y se recogieron las células para aislar el ARN a las 0, 4 y 16 h. Las muestras de CD19 + se aislaron de amígdala humana y se activaron con ionomicina 0,5 !g/ml y PMA 10 ng/ml. Después, se recogieron células a las 0, 4 h y 24 h y se aisló el ARN. Los monocitos CD14 + humanos se activaron con LPS 0,1 !g/ml o LPS 1,0 !g/ml

durante 20 h. Después se recogieron las células en reposo y activadas y se aisló el ARN. Además, se aisló el ARN de las líneas celulares de monocitos humanos en reposo y activados (LPS 10,0 !g/ml) HL-60, THP-1 y U937. También se ensayaron los ARN de Raji, Ramos, Daudi, y Jurkat en reposo.

5 [0177] Las reacciones de la RT-PCR usaron el sistema Superscript One-Step RT-PCR con Platinum Taq. Cada 25 !l de reacción consistían en lo siguiente: 12,5 !l de 2X tampón de reacción, 0,5 !l (20 pmol.!l) de ZC14.666 (SEQ ID NO: 11), 0,5 !l (20 pmol/ !l) de ZC14.742 (SEQ ID NO: 12), 0,4 !l de mezcla de RT/Taq polimerasa, 10 !l de RNasa exenta de agua, 1,0 !l de ARN molde (100 ng/!l). (Life Technologies, Gaithersburg, MD). La amplificación se llevó a cabo como sigue: 1 ciclo a 50° durante 30 minutos seguido de 35 ciclos a 94°, 30 segundos; 52°, 30

10 segundos; 72°, 60 segundos; después se terminó con una extensión final a 72° durante 7 minutos. De 8 a 10 !l de producto de reacción de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa estándar usando un gel de agarosa al 2 %. Se observó el tamaño de fragmento de ADNc previsto correcto en linfocitos B CD19 + en reposo y mucho menos en linfocitos B CD19 + activados, linfocitos T CD8 + en reposo, células NK CD56 + y monocitos CD14 + activados. Las líneas celulares que mostraban expresión de zcytor11 eran Jurkat, THP-1 activadas y HL-60

15 activadas. No se observó expresión de zcytor11 en los otros tejidos y líneas celulares en este panel. Estos resultados demuestran la expresión de zcytor11 en varias poblaciones de células inmunitarias y líneas celulares inmunitarias.

Tabla 11 20

Tejido: nº de muestras Tejido nº de muestras

CD19 + de CMSP en reposo: 1 CD14 + LPS 0,1 !g/ml 1

CD19 + en reposo de amígdala: 1 CD 14 + LPS 1,0 !g/ml 1

CD19 + de amígdala -- 4 h de activación: 1 Raji 1

CD19 + de amígdala -16 h de activación: 1 Ramos 1

CD4 + en reposo: 1 Daudi 1

CD4 + 4 h de activación: 1 Jurkat 1

CD4 + 16 h de activación: 1 U937 1

CD8 + en reposo: 1 U937 activadas 1

CD8 + 4 h de activación: 1 THP-1 1

CD8 + 16 h de activación: 1 THP-1 activadas 1

CD56 + en reposo: 1 HL-60 1

CD14 + en reposo: 1 HL-60 activadas 1

Ejemplo 16

Construcción de células BaF3 que expresan el receptor CRF2-4 (células BaF3/CRF2-4) y células BaF3 que 25 expresan el receptor CRF2-4 con el receptor zcytor11 (células BaF3/CRF2-4/zcytor11)

[0178] Se construyeron células BaF3 que expresaban el receptor CFR2-4 de longitud completa, usando 30 !g de un vector de expresión con CFR2-4, descrito a continuación. Las células BaF3 que expresaban el receptor CFR24 se designaron BaF3/CFR2-4. Estas células se usaron como control, y después se transfectaron con el receptor

30 zcytor11 de longitud completa (patente de EE.UU. nº 5.965.704) y se usaron para construir un cribado de la actividad de IL-TIF, como se describe a continuación.

A. Construcción de células BaF3 que expresan el receptor CRF2-4

35 [0179] La secuencia de ADNc de longitud completa de CRF2-4 (nº de acceso en Genbank Z17227) se aisló de una biblioteca de ADNc de la línea celular Daudi, y después se clonó en un vector de expresión pZP7P.

[0180] BaF3, una línea celular prelinfoide dependiente de interleuquina 3 (IL-3) se obtuvo de médula ósea murina (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot y col., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), se 40 mantuvo en medio completo (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) complementado con suero de ternero fetal inactivado con calor al 10 %, IL-3 murina (mIL-3) 2 ng/ml (R & D, Minneapolis, MN), L-glutaMax-1™ 2 mM (Gibco BRL), piruvato sódico 1 mM (Gibco BRL), y antibióticos PSN (GIBCO BRL)). Antes de la electroporación, se preparó CRF2-4/pZP7P y se purificó usando el kit Qiagen Maxi Prep (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la electroporación, las células BaF3 se lavaron una vez en medio RPMI exento de suero y después 45 se volvieron a suspender en medio RPMI exento de suero con una densidad celular de 107 células/ml. Se mezcló 1 ml de las células BaF3 resuspendidas con 30 !g del ADN plasmídico de CRF2-4/pZP7P y se transfirieron a cámaras de electroporación desechables separadas (GIBCO BRL). Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente se administró a las células dos choques en serie (800 IFad/300 V; 1180 IFad/300 V) suministrados con un

aparato de electroporación (CELL-PORATOR™; GIBCO BRL). Después de un tiempo de recuperación de 5 min, las células electroporadas se transfirieron a 50 ml de medio completo y se pusieron en un incubador durante 15-24 horas (37°C, CO2 al 5 %). Después las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en 50 ml de medio completo que contenía puromicina 2 !g/ml en un matraz T-162 para aislar la mezcla resistente a la puromicina. Se ensayó en las mezclas de las células BaF3 transfectadas, en lo sucesivo denominadas células BaF3/CRF2-4, la capacidad de señalización descrita a continuación. Además, estas células se transfectaron adicionalmente con el receptor zcytor11 como se describe a continuación.

B. Construcción de células BaF3 que expresan los receptores CRF2-4 y zcytor11

[0181] Se construyeron células BaF3/CRF2-4 que expresaban el receptor zcytor11 de longitud completa de acuerdo con el ejemplo 5A anterior, usando 30 !g de vector de expresión de zcytor11, descrito en el ejemplo 6 anterior. Después de la recuperación, los transfectantes se seleccionaron usando zeocina 200 !g/ml y puromicina 2 !g/ml. Las células BaF3/CRF2-4 que expresaban el receptor zcytor11 se designaron células BaF3/CRF2-4/zcytor11. Esas células se usaron para cribar la actividad de IL-TIF así como la actividad antagonista descrita en el Ejemplo 17.

Ejemplo 17

Cribado de la actividad de CRF2-4-zytor11-Fc usando células BaF3/CRF2-4/zcytor11 en un ensayo de proliferación de azul Alamar

[0182] Las células BaF3/CRF2-4/zcytor11 (Ejemplo 16) se centrifugaron y se lavaron en PBS 2 veces para asegurar la eliminación de la mIL-3, y después se centrifugaron una tercera vez y se volvieron a suspender en medio completo (RPMI 1640, FBS al 10 %, GlutaMAX al 1 %, piruvato sódico al 1 %) descrito en el ejemplo 16 anterior, pero sin mIL-3 (en lo sucesivo denominado “medio exento de mIL-3”). Después se contaron las células en un hemocitómetro. Las células se cultivaron en un formato de 96 pocillos con 5000 células por pocillo en un volumen de 50 !l por pocillo usando el medio exento de mIL-3.

[0183] La proteína IL-TIF se diluyó hasta 200 pg/ml en medio exento de mIL-3 y también en medio condicionado de CRF2-4/zcytor11 en una concentración de aproximadamente 0,4 !g/ml que se hizo a partir de células BHK transfectadas (Ejemplo 7). El CM de CRF2-4/zcytor11 se diluyó en el medio exento de mIL-3/IL-TIF mediante diluciones seriadas 1: 2 hacia abajo en las 8 filas en la placa de 96 pocillos, dejando un volumen de 50 !l en cada pocillo. Después este se añadió a los 50 !l de células, para una concentración final de IL-TIF de 100 pg/ml en todos los pocillos, y concentraciones finales de CRF2-4/zcytor11-Fc de aproximadamente 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,1 y 1,6 ng/ml, y un volumen total de ensayo de 100 !l. Las placas de ensayo se incubaron a 37°C, CO2 al 5 % durante 4 días, momento en el que se añadió azul Alamar (Accumed, Chicago, IL) con 20 !l/pocillo. Las placas se incubaron otra vez a 37 ºC, CO2 al 5 % durante 24 horas. El azul Alamar da una lectura fluorométrica basada en el número de células vivas, y por lo tanto es una medición directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Las placas se leyeron en un contador Wallac Victor 2 1420 Multilabel (Wallac, Turku, Finlandia) a las longitudes de onda de 530 (excitación) y 590 (emisión). Los resultados confirmaron una inhibición dependiente de la dosis de CRF2-4/zcytor11-Fc del efecto proliferativo de IL-TIF en células BaF3/CRF2-4/zcytor11. El IL-TIF solo, estimulaba las células 30 veces frente al valor de fondo. CRF2-4/zcytor11-Fc inhibían completamente esta proliferación en concentraciones de 25-200 ng/ml, inhibían parcialmente la proliferación a 3,1-12,5 ng/ml, y la inhibición casi no se detectaba a 1,6 ng/ml. Se hizo la misma configuración con mIL-TIF, y se generaron resultados similares.

Ejemplo 18

Análisis por citometría de flujo de transfectantes BaF3 que expresan zcytor11 solo, CRF2-4 solo, zcytor11/CRF2-4 o zcytor11/pDIRS1

[0184] Se generaron células BaF3 transfectadas con zcytor11 solo, CRF2-4 solo, zcytor11/CRF2-4 o zcytor11/pDIRS1 con cada receptor de citoquinas respectivo, como se ha descrito (Ejemplo 16). Brevemente, se transfectaron 30 !g de zcytor11/pZP7Z en células BaF3 usando electroporación, y se seleccionaron los transfectantes estables (BaF3/zcytor11) con zeocina 200 !g/ml. De forma similar las células BaF3 transfectadas con CRF2-4/pZP7P (BaF3/CRF2-4) se seleccionaron con puromicina 2 !g/ml. Posteriormente, se transfectaron 30 ug de CRF2-4/pZP7P en células BaF3/zcytorl usando electroporación, y se seleccionó la línea celular estable (BaF3/zcytor11/CRF2-4) con zeocina 200 !g/ml y puromicina 2 !g/ml. Igualmente, se transfectaron 30 ug de pDIRS1/pZP7P en células BaF3/zcytor11 usando electroporación, y se seleccionó la línea celular estable (BaF3/zcytor11/pDIRS1) con zeocina 200 !g/ml y puromicina 2 !g/ml. Los transfectantes BHK se generaron usando los mismos vectores de expresión zcytor11, CRF2-4, o pDIRS1 para los transfectantes BaF3. Se transfectó ADN en células BHK usando Lipofectamina™ (Gibco BRL, Gaitersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, la selección empezó 48 h después de la transfección seguido del mismo protocolo para la selección de BaF3.

[0185] La biotinilación de la proteína IL-TIF-CEE humana (Ejemplo 12) se hace como sigue: se añadieron 1,6 ul de Tween20 al 10 %, 50 ul de ácido bórico 1 M (pH 8,5), y 42 ul de EZ-unido a Sulfo-NHS-LC-biotina 0,9 mg/ml (Pierce, Rockford, IL) disuelto en DMSO a 100 ul de IL-TIF-CEE 2,2 mg/ml. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, la reacción se inactivó con 10 ul de glicina 2 M durante 10 minutos.

[0186] Para ensayar las propiedades de unión del ligando IL-TIF a varios componentes de receptores potenciales, las células BaF3 y BHK se transfectaron con plásmidos de expresión que incluían zcytoR11 solo, CRF24 solo (nº de acceso en Genbank Z17227), zcytoR11 (SEQ ID NO: 1) y CRF2-4, o zcytoR11 y pDIRS1 (publicación WIPO WO99/46379, Schering Corporation, 1999), como se ha descrito antes. Se incluyeron células BaF3 y BHK no transfectadas como controles. Las células se volvieron a suspender en tampón de lavado de FACS (WB: PBS/BSA al 1 % complementado con UltraSerum humano al 3 % (Gemini BioProducts, Calabasas, CA)) se contaron y se dividieron en partes alícuotas 1x106 de cada tipo en tubos de poliestireno de 5 ml. Las células se lavaron y sedimentaron, después se incubaron durante 20 min en hielo con 100 !l de WB solo, o WB más proteína zcyto10 biotinilada 10 !g/ml o 1 !g/ml. Las células se lavaron con 1,5 ml de WB y se sedimentaron, y después se incubaron con 100 !l de estreptavidina conjugada con ficoeritrina 2,5 !g/ml (PE-SA, PharMingen, San Diego, CA) durante otros 20 min en hielo. Las células se volvieron a lavar como antes, se volvieron a suspender en 0,4 ml de WB y se analizaron en un FACScan usando el software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

[0187] El biotina-IL-TIF se unió de una forma dependiente de la dosis a las 3 líneas celulares BaF3 transfectadas que contenían zcytor11 (es decir, transfectadas solo con zcytor11 o en combinación con CRF2-4 o DIRS 1), pero no a la línea parental o al transfectante BaF3 x CRF2-4. Se obtuvieron los mismos resultados con los correspondientes transfectantes de BHK

LISTA DE SECUENCIAS

[0188]

<: 110 > ZymoGenetics, Inc.

<: 120 > RECEPTORES DE CITOQUINAS ZCYTOR11 SOLUBLES

<: 130 > P25267EP-D2-PCT-DRM/PJG

<: 140 > EP 06017328.3

<: 141 > 2001-08-08

<: 150 > US 60/223.827

<: 151 > 2000-08-08

<: 150 > US 60/250.876

<: 151 > 2000-12-01

<: 160 > 35

<: 170 > FastSEQ para Windows Versión 3.0

<: 210 > 1

<: 211 > 2831

<: 212 > ADN

<: 213 > Homo sapien

<: 220 >

<: 221 > CDS

<: 222 > (39)...(1755)

<: 400 > 1

<: 211 > 574 5 < 212 > PRT

<: 213 > Homo sapien

<: 400 > 2

<: 211 > 211 5 < 212 > PRT

<: 213 > Homo sapiens

5

< 210 > 4

< 211 > 6

< 212 > PRT

< 213 > Secuencia artificial

10: < 220 >

< 223 > marcador peptídico Glu-Glu

< 400 > 4

15

< 210 > 5

< 211 > 8

< 212 > PRT

< 213 > Secuencia artificial

20: < 220 >

< 223 > péptido marcado con Flag

< 400 > 5

< 210 > 6

<: 211 > 699 5 < 212 > ADN

<: 213 > Homo sapiens

<: 210 > 7

<: 211 > 1116

<: 212 > ADN

<: 213 > homo sapiens 15 < 220 >

<: 221 > CDS

<: 222 > (21)...(557)

<: 400 > 7

<: 210 > 10

<: 211 > 33

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC28580

<: 400 > 10

<: 210 > 11

<: 211 > 18

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC14666

<: 400 > 11

<: 210 > 12

<: 211 > 22

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC14742

<: 400 > 12

<: 210 > 13

<: 211 > 6

<: 212 > PRT

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > marcador His

<: 400 > 13

<: 210 > 14

<: 211 > 63

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC29239

<: 400 > 14

<: 210 > 15

<: 211 > 65

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC29232

<: 400 > 15

<: 210 > 16

<: 211 > 37

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC39319

<: 400 > 16

<: 210 > 17

<: 211 > 28

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC39325

<: 400 > 17

<: 210 > 18

<: 211 > 660 10 < 212 > ADN

<: 213 > Homo sapiens

<: 220 >

<: 221 > CDS

<: 222 > (1)...(660) 15 < 400 > 18

<: 212 > PRT

<: 213 > homo sapiens

<: 400 > 8

<: 211 > 36

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC28590

<: 400 > 9

<: 210 > 19

<: 211 > 220

<: 212 > PRT5 < 213 > Homo sapiens

10 < 210 > 20

<: 211 > 18

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >15 < 223 > Cebador oligonucleótido ZC38931

<: 400 > 20

20 < 210 > 21

<: 211 > 82

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >25 < 223 > Cebador oligonucleótido ZC39042

<: 400 > 21

<: 210 > 25

<: 211 > 65 15 < 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC29231

<: 400 > 25

<: 210 > 26 5 < 211 > 70

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC39335 10 < 400 > 26

<: 210 > 27 15 < 211 > 26

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC28981 20 < 400 > 27

<: 210 > 28 25 < 211 > 80

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC39043 30 < 400 > 28

<: 210 > 29 35 < 211 > 1452

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > dominio extracelular de unión a citoquinas de hzcytor11 fusionado con IgGg1 con un marcador Glu-Glu40 < 221 > CDS

<: 222 > (1)...(1452)

<: 400 > 29

<: 211 > 484 5 < 212 > PRT

<: 213 > Secuencia artificial

<: 400 > 30

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC37693

<: 400 > 31

<: 210 > 32

<: 211 > 23

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC37449

<: 400 > 32

<: 210 > 33

<: 211 > 199

<: 212 > PRT

<: 213 > Homo sapiens

<: 400 > 33

<: 210 > 22

<: 211 > 1428

<: 212 > ADN 5 < 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 221 > CDS

<: 222 > (1)...(1928)

<: 211 > 476 5 < 212 > PRT

<: 213 > Homo sapiens

<: 400 > 23

<: 211 > 63 5 < 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador oligonucleótido ZC29328

<: 400 > 24 10

<: 211 > 22

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 211 > 211 5 < 212 > PRT

<: 213 > Homo sapiens

<: 400 > 34

<: 211 > 201 5 < 212 > PRT

<: 213 > Homo sapiens

<: 400 > 35

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de un antagonista de la actividad de IL-TIF para fabricar un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria o inmunitaria en un mamífero, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a un complejo heterodímero de receptores que tiene una primera subunidad de receptor que consiste en un polipéptido zcytoR11 como se muestra en la SEQ ID NO: 3 y una segunda subunidad de receptor que consiste en un receptor CRF2-4 soluble; en el que dicha enfermedad se selecciona de la artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad atópica.
2.

Uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad atópica es el asma.
3.

El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4.

El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo genéticamente modificado.
5.

El uso de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo genéticamente modificado se selecciona de un anticuerpo quimérico, un fragmento Fv y un anticuerpo de una cadena.
6.

El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
7.

Un antagonista de la actividad de IL-TIF para usar en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o inmunitaria en un mamífero, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a un complejo heterodímero de receptores que tiene una primera subunidad de receptor que consiste en un polipéptido zcytoR11 como se muestra en la SEQ ID NO: 3 y una segunda subunidad de receptor que consiste en un receptor CRF2-4 soluble; en el que dicha enfermedad se selecciona de la artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad atópica.
8.

Un antagonista para usar según la reivindicación 7, en el que la enfermedad atópica es el asma.
9.

Un antagonista para usar según la reivindicación 7 u 8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
10.

Un antagonista para usar según la reivindicación 7 u 8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo intacto

o fragmento de anticuerpo genéticamente modificado.
11.

Un antagonista para usar según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo intacto o fragmento de anticuerpo genéticamente modificado se selecciona de un anticuerpo quimérico, un fragmento Fv y un anticuerpo de una cadena.
12.

Un antagonista para usar de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.