PT1812476E

PT1812476E - Anticorpos anti-il-22ra e parceiros de ligação e métodos de utilização no tratamento de inflamações

Info

Publication number: PT1812476E
Application number: PT05816060T
Authority: PT
Inventors: Joyce M Lehner; Stacey R Dillon; Wenfeng Xu; Wayne R Kindsvogel; Yasmin A Chandrasekher; Anthony W Siadak; Pallavur V Sivakumar; Margaret D Moore
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2004-10-22
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2010-11-08
Also published as: MX2007004770A; CA2584157C; HK1110333A1; BRPI0516975A; US8536309B2; US20090220519A1; UA96122C2; CN101198625A; US20130315919A1; KR101238684B1; US7537761B2; DE602005022475D1; US20060141582A1; ATE474856T1; US8124088B2; ES2347672T3; WO2006047249A1; US20120156210A1; AU2005299809B2; EP1812476B1

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPOS ANTI-IL-22RA E PARCEIROS DE LIGAÇÃO E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE INFLAMAÇÕES

Citocinas são pequenas proteínas solúveis, que medeiam uma variedade de efeitos biológicos, incluindo a regulação do crescimento e diferenciação dos vários tipos de células (ver, por exemplo, Arai et al. Annu. Rev. Biochem 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul e Seder, Cell 76:241 (1994)). Proteínas que constituem o grupo de citocinas incluem as interleucinas, interferões, factores estimuladores de colónias, factores de necrose tumoral, e outras moléculas reguladoras. Por exemplo, a interleucina-17 humana é uma citocina que estimula a expressão da interleucina-6, molécula de adesão intracelular 1, interleucina-8, factor estimulante de colónias de granulócitos macrófagos e expressão da prostaglandina E2, e desempenha um papel na maturação preferencial das células CD34+ precursores hematopoiéticos em neutrófilos (Yao et al. Immunol J. 155:5483 (1995); Fossiez et al. J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).

Receptores que ligam normalmente as citocinas são compostos por uma ou mais proteínas integrais da membrana que se ligam a citocina com alta afinidade e transdução para a célula através de porções de citoplasma das subunidades do receptor adequado. Os receptores de citocinas foram agrupados em várias categorias, com base em similaridades nos seus domínios de ligação do ligante extracelular. Por exemplo, as cadeias de receptor responsáveis pela ligação e/ou transdução do efeito de interferões são membros da família de receptores de citocinas classe II, com base em um resíduo 200 característico do domínio extracelular. A WO 2004/085476 e a WO 2004/085475 descrevem anticorpos anti-IL-20 e parceiros de ligação, e anticorpos anti-IL- 1 22RA e parceiros de ligação, e métodos de utilização destes na inflamação. 0 demonstrado nas actividades in vivo de citocinas e seus receptores ilustram o potencial clínico de, e a necessidade de outras citocinas, receptores de citocinas, citocinas agonistas e antagonistas de citocinas. Por exemplo, o demonstrado nas actividades in vivo da família das citocinas pró-inflamatórias ilustram o enorme potencial clinico e a necessidade de antagonistas de moléculas pró-inflamatórias. A presente invenção atende a essas necessidades através de antagonistas de citocinas pró-inflamatórias IL-20 e IL-22, tal como definido nas reivindicações. Tais antagonistas da presente invenção, o que pode bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a actividade da IL-22, IL-20 ou IL-20 e IL-22, incluem anticorpos neutralizantes anti-IL-22RA, tal como definido nas reivindicações. A invenção prevê ainda o uso dos mesmos na doença inflamatória, bem como composições e métodos empregues. 1. Resumo

Entre outras invenções, a presente descrição descreve um novo uso para um receptor solúvel, designado por "Zcytorll" ou "IL-22RA". A presente invenção fornece anticorpos neutralizantes para receptores de citocinas IL-22RA, tal como definido nas reivindicações. A presente descrição descreve fragmentos de polipeptídeo IL-22RA solúveis e proteínas de fusão, para uso em doenças inflamatórias humanas e doenças auto-imunes. Os anticorpos anti-IL-22RA, e os receptores IL-22RA solúveis, incluindo os anticorpos neutralizantes anti-IL-22RA da presente invenção, podem ser utilizado para bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a actividade tanto do IL-22 como do IL-20 ou de ambos IL-20 e IL-22 no tratamento de doenças humanas específicas, tais como psoríase, artrite psoriática, 2 artrite, endotoxemia, doença inflamatória intestinal (DII), colite e outras condições inflamatórias aqui divulgadas.

Uma sequência ilustrativa de nucleotide que codifica Zcytorll humano (IL-22RA) é fornecida pela SEQ ID NO: 1; o polipeptideo codificado é mostrado na SEQ ID NO: 2. IL-22RA é uma subunidade do receptor para IL-20 e IL-22. Zcytorll (IL-22RA) é divulgado na Patente US 5,965,704 de propriedade comum, a publicação da OMPI WO 02/12345 de propriedade comum, e a publicação da OMPI WO 02/072607 de propriedade comum. A análise de um clone humano cADN codificando IL-22RA (SEQ ID NO: 1) revelou um quadro de leitura aberta codificando 574 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que compreende um domínio extracelular ligante de ligação de aproximadamente 211 resíduos de aminoácidos (resíduos 18 - 228 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) , um domínio transmembrana de < cerca de 23 resíduos de aminoácidos (resíduos 229-251 da SEQ ID NO: 2), e um domínio intracelular de cerca de 313 resíduos de aminoácidos (resíduos 252 a 574 da SEQ ID NO: 2) Assim, as moléculas aqui descritas incluem polipepetideos que incluem um domínio de ligação de citocinas compreendendo resíduos de aminoácidos 18-228 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. Numa modalidade, o IL-22R solúvel é fundida à região constante da cadeia pesada (representativamente mostrada na SEQ ID NO: 4) . Os peritos na técnica reconhecerão que esses limites de domínio são aproximados. A eliminação de resíduos desde os confins dos domínios é possível.

Conforme descrito abaixo, a presente descrição descreve polipeptídeos isolados compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou, pelo menos, 90%, ou superior a 95%, como 96%, 97%, 98%, ou superior a 99% ou mais idêntica a uma referência da sequência de aminoácidos 18-228 de SEQ ID NO: 2, que também é indicada como SEQ ID NO: 3, no qual o polipeptideo isolado liga especificamente com um anticorpo que se liga especificamente com um polipeptideo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Polipeptídeos ilustrativos incluem polipeptídeos compreendendo tanto os 3 resíduos de aminoácidos SEQ ID NO: 3 ou resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Além disso, a presente descrição descreve polipeptídeos isolados conforme divulgado anteriormente que se ligam a IL-22 (por exemplo, sequência de olipeptídeo IL-22 humano como mostrado na SEQ ID NO: 6) . A sequência de polinucleotídeo IL-22 humano é mostrada na SEQ ID NO: 5. A sequência polinucleotídeo de IL-22 do rato é mostrada na SEQ ID NO: 10, e o correspondente poliepeptídeo é mostrado na SEQ ID NO: 11. A presente descrição descreve polipeptídeos isolados conforme divulgado anteriormente que se ligam a IL-20 (por exemplo, sequência de polipeptídeo IL-20 humano como mostrado na SEQ ID NO: 8; Publicação da OMPI WO 99/27103) . A sequência de polinucleotídeo IL-20 humano é mostrada na SEQ ID NO: 7. A presente descrição descreve polipeptídeos isolados e epítopos compreendendo pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Polipeptídeos ilustrativos incluem polipeptídeos que tanto incluem, ou consistam em SEQ ID NO: 3, um epítopo antigénico, ou IL-20 funcional ou fragmento de IL-22 de ligação do mesmo. Além disso, a presente descrição descreve polipeptídeos isolados conforme divulgado anteriormente que se ligam a, bloqueiam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam a actividade de IL-22 ou IL-20. A presente descrição descreve polipeptídeos variantes de IL-22RA, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo variante partilha uma identidade com os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 seleccionados do grupo consistindo em pelo menos, 70% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 90% de identidade, pelo menos, 95% de identidade ou superior a 95% de identidade, tais como 96%, 97%, 98%, ou superior a 99% ou mais de identidade, e em que qualquer diferença entre a sequência de aminoácidos do polipeptídeo variante e a correspondente sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 é devido a uma ou substituições de aminoácidos conservadores. São descritas 4 essas substituições de aminoácidos conservadores. Além disso, a presente descrição descreve polipeptideos isolados conforme divulgado anteriormente que se ligam a, bloqueiam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam a actividade de IL-22 ou IL-20. A presente invenção também fornece anticorpos e fragmentos de anticorpos, conforme definido nas reivindicações, que se ligam especificamente com tais polipeptideos. ExemplOS DE anticorpos incluem anticorpos neutralizantes, anticorpos monoclonais murinos, anticorpos humanizados derivados de anticorpos monoclonais murinos e anticorpos monoclonais humanos. Fragmentos de anticorpos ilustrativos compreendem F (ab')2, F (ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv e unidades de reconhecimento mínimo. Anticorpos neutralizantes ligando de preferência IL-22RA de tal forma que a interacção de IL-20 e IL-22 com IL-22RA é bloqueada, inibida, reduzida, antagonizada ou neutralizada; também são descritos anticorpos neutralizantes anti-IL-22RA de tal forma que a ligação de IL-20 ou L-22 para IL-22RA é bloqueada, inibida, reduzida, antagonizada ou neutralizada. Ou seja, anticorpos neutralizantes anti-IL-22RA podem tanto vincular, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar cada um do IL-20 ou IL-22 isoladamente, ou ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar IL-20 e IL-22 em conjunto. A presente invenção também inclui composições compreendendo um transportador e um peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo descritos aqui.

Além disso, a presente descrição descreve composições farmacêuticas compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e pelo menos um de tal expressão de vectores ou vectores de vírus recombinantes que compreende tal expressão. A presente descrição descreve composições farmacêuticas, compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e um polipeptídeo ou anticorpo descritos aqui. 5 A presente descrição descreve anticorpos anti-idiotipo, ou fragmentos de anticorpos anti-idiotipo, que ligam especificamente um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga especificamente um polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou um fragmento da mesma. Um exemplo de anticorpo anti-idiotipo que liga com um anticorpo que liga especificamente um polipeptideo consistindo na SEQ ID NO: 3. A presente descrição descreve proteínas de fusão, que compreendem um polipeptideo IL-22RA e uma molécula de imunoglobulina. Em tais proteínas de fusão, o agrupamento de imunoglobulinas pode ser uma região constante de imunoglobulina de cadeia pesada, como um fragmento de Fc humano. A presente descrição descreve moléculas de ácido nucléico isoladas que codificam tais proteínas de fusão. A presente invenção também fornece anticorpos monoclonais, tal como definido nas reivindicações que se ligam a polipeptídeos compreendendo um domínio extracelular de IL-22RA tais como receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos e multiméricos, incluindo os receptores solúveis. Além disso, esses anticorpos podem ser usados para antagonizar a ligação de ligantes IL-22RA, IL-22 (SEQ ID NO: 6) e IL-20 (SEQ ID NO: 8), individualmente ou em conjunto com o receptor IL-22RA.

Além disso, a sobre expressão ou sobre regulação de IL-22 e IL-20 foi demonstrada em lesões de psoríase humana e amostras de pele humana com dermatite atópica, sugerindo que a IL-22, como a IL-20 também está envolvida na psoríase humana, na dermatite atópica ou em outras doenças inflamatórias da pele e tecidos epiteliais. Além disso, como aqui descrito, a sobre expressão de IL-20 ou IL-22 em ratos transgénicos mostrou espessamento da epiderme e do envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo de psoríase, e adicionalmente a injecção de IL-22 em ratos normais mostrou espessamento da epiderme e do 6 envolvimento de células imunes indicativo de um fenótipo de psoríase, que foi retirado pelo antagonista do receptor solúvel IL-22RA2 (zcytorl6; Publicação da OMPI n° WO 01140467) . Tais dados in vivo sugerem ainda que a IL-22 pró-inflamatória está envolvida na psoríase, dermatite atópica ou outras doenças inflamatórias da pele e tecidos epiteliais. Como tal, os antagonistas da actividade de IL-22 e IL-20, tais como receptores solúveis de IL-22RA e os respectivos anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e neutralizantes de IL-22RA anti-humano da presente invenção são úteis no tratamento terapêutico de doenças inflamatórias, especialmente como antagonistas de IL-22 e IL-20 isoladamente ou em conjunto no tratamento da psoríase. Além disso, os antagonistas da actividade da IL-22, tais como receptores solúveis de IL-22RA e os respectivos anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais e neutralizantes de IL-22RA anti-humano da presente invenção são úteis no tratamento terapêutico de outras doenças inflamatórias, por exemplo, ligando, bloqueando, inibindo, reduzindo, antagonizando ou neutralizando a IL-22 e IL-20 (individual ou conjuntamente) no tratamento de dermatite atópica, IBD, colite, Endotoxemia, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, doença respiratória em adultos (DRA), choque séptico, falência de múltiplos órgãos, lesões inflamatórias pulmonares como asma ou bronquite, pneumonia bacteriana, a psoríase, eczema, dermatite atópica e de contacto, e doença inflamatória intestinal como a colite ulcerativa e a doença de Crohn. 2. Definições

Na descrição que se segue, uma série de termos são usados extensivamente. As definições a seguir são fornecidas para facilitar a compreensão da invenção.

Como usado aqui, "ácido nucléico" ou "molécula de ácido nucléico" refere-se a polinucleotídeos, como o ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucléico (ARN), 7 oligonucleotídeos, fragmentos gerados pela reacção em cadeia da polimerase (RCP), e fragmentos gerados por qualquer ligação, cisão, acção de endonuclease e acção de exonuclease. As moléculas de ácido nucléico podem ser composto de monómeros que são nucleotideos de ocorrência natural (como o ADN e o ARN), ou análogos de nucleotideos de ocorrência natural (por ex., as formas a-enantioméricas de nucleotideos de ocorrência natural), ou uma combinação de ambos. Os nucleotideos modificados podem ter alterações nas metades de açúcar e/ou nas metades de base de pirimidina ou purina. As modificações do açúcar incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais grupos hidroxilo com halogénios, grupos alquilo, aminas, e grupos azido, ou os açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, a metade inteira de açúcar pode ser substituída por estruturas estericamente e eletronicamente semelhantes, como aza-açúcares e açúcares carbocíclicos análogos. Exemplos de modificações numa metade de base incluem purinas alquiladas e pirimidinas, purinas aciladas ou pirimidinas ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos. Os monómeros de ácido nucléico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos destas ligações. Análogos de ligações fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, e assim por diante. 0 termo "molécula de ácido nucléico" inclui também o chamado "péptido de ácido nucléico", que compreende bases de ácidos nucleicos de ocorrência natural ou modificados ligados a uma estrutura de poliamida. Os ácidos nucleicos podem ser de fita simples ou fita dupla. 0 termo "complemento de uma molécula de ácido nucléico" refere-se a uma molécula de ácido nucléico com uma sequência de nucleotideos complementares e orientação inversa em relação a uma sequência de nucleotideos de referência. Por exemplo, a sequência 5'ATGCACGGG 3' é complementar a 5'CCCGTGCAT 3'. 8 0 termo "sequência de nucleotídeos degenerados" denota uma sequência de nucleotídeos, que inclui um ou mais códons degenerados em relação a uma molécula de ácido nucléico de referência que codifica um polipeptídeo. Os códons degenerados contém trios diferentes de nucleotídeos, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (isto é.r trios GAU e GAC codificando cada Asp). 0 termo "gene estrutural" refere-se a uma molécula de ácido nucléico que é transcrita num mensageiro de ARN (mARN), que é traduzido numa sequência de aminoácidos característico de um polipeptídeo específico.

Uma "molécula de ácido nucléico isolada" é uma molécula de ácido nucléico que não é integrada no ADN genómico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de ADN que codifica um factor de crescimento que foi separado do ADN genómico de uma célula é uma molécula de ADN isolada. Outro exemplo de uma molécula de ácido nucléico isolada é uma molécula de ácido nucléico quimicamente sintetizada que não é integrada no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido nucléico que foi isolada a partir de uma determinada espécie é menor do que a molécula de ADN completa de um cromossoma a partir dessa espécie.

Uma "construção de molécula de ácido nucléico" é uma molécula de ácido nucléico, de fita única ou dupla, que foi modificada através da intervenção humana para conter segmentos de ácido nucléico combinados e justapostos numa combinação não existente na natureza. "ADN Linear" denota as moléculas de ADN não-circulares tendo as extremidades 5' e 3' livres. 0 ADN linear pode ser preparado a partir de moléculas de ADN circulares fechadas, como plasmídeos, por digestão enzimática ou ruptura física. 9 "ADN complementar (cADN) é uma molécula de ADN de fita simples que é formada a partir de um modelo de mARN através da transcriptase reversa da enzima. Normalmente, é empregue um substrato complementar às porções de mARN para a iniciação da transcrição reversa. Os peritos na técnica também usar o termo "cADN" para se referirem a uma molécula de ADN de fita dupla constituída por uma molécula de ADN de fita simples e a sua fita de ADN complementar. 0 termo "cADN" também se refere a um clone de uma molécula de cADN sintetizado a partir de um modelo de ARN.

Um "promotor" é uma sequência de nucleotideos que direcciona a transcrição de um gene estrutural. Normalmente, um promotor está localizado na região 5' não codificda do gene, proximal ao sitio de iniciação da transcrição de um gene estrutural. As sequências de elementos em promotores que funcionam no inicio da transcrição são caracterizadas por sequências de nucleotideos de consenso. Esses elementos de promotores incluem sitios de ligação de polimerase de ARN, sequências TATA, sequências CAAT, elementos de diferenciação específicos (DSEs; McGehee et al. Mol. Endocrinol. 7:551 (1,993)), elementos de resposta de AMP cíclico (CREs), elementos de resposta de soro (SREs; Treisman, Seminars in Câncer Biol. 01:47 (1990)), elementos de resposta aos glicocorticóides (GRES) e sítios de ligação para outros factores de transcrição, como o CRE/ATF (0'Reilly et al. J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al. J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, elemento de resposta da ligação da proteína cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) e os fatores octameros (ver, em geral, Watson et al. Eds., Molecular Biology of the Gene, 4a ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), e Lemaigre e Rousseau, Biochem. 303:1 J. (1994)). Se um promotor é um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste, a taxa de transcrição não é regulada por um agente indutor, se o promotor é um promotor constitutivo. Também são conhecidos promotores repressíveis. 10

Um "núcleo promotor" contém sequências de nucleotídeos essenciais para a função de promotor, incluindo a caixa TATA e inicio da transcrição. Por esta definição, um núcleo promotor pode ou não ter a actividade detectável na ausência de sequências especificas que podem aumentar a actividade ou conferir actividade de tecidos especifica.

Um "elemento regulador" é uma sequência de nucleotídeos que modula a actividade de um núcleo promotor. Por exemplo, um elemento regulador pode conter uma sequência de nucleotídeos que se liga com factores celulares que permitem a transcrição exclusiva ou preferencialmente em células particulares, tecidos ou organelas. Estes tipos de elementos reguladores são normalmente associados com genes que são expressos numa "célula específica", "tecido-específico", ou "organela específica".

Um "intensificador" pode aumentar independentemente intensificador em transcrição. é um tipo de elemento regulador que a eficiência da transcrição, da distância ou orientação do relação ao sítio de iniciação da "ADN heterólogo" refere-se a uma molécula de ADN, ou de uma população de moléculas de ADN, que não existe naturalmente dentro de uma dada célula hospedeira. As moléculas de ADN heterólogo de uma célula hospedeira particular podem conter ADN derivado de espécies de células hospedeiras (ou seja, ADN endógeno), enquanto o ADN hospedeiro é combinado com o ADN não-hospedeiro (ou seja, ADN exógeno). Por exemplo, uma molécula de ADN contendo um segmento de ADN não-hospedeiro codifica um polipeptídeo operacionalmente ligado a um segmento de ADN hospedeiro que compreende um promotor de transcrição e é considerado uma molécula de ADN heterólogo. Por outro lado, uma molécula de ADN heterólogo pode incluir um gene endógeno operacionalmente ligado com um promotor exógeno. Como outro exemplo, uma molécula de ADN compreendendo um gene proveniente de uma célula de tipo 11 selvagem é considerada ADN heterólogo, se a molécula de ADN for introduzida numa célula mutante a que falta o gene do tipo selvagem.

Um "polipeptideo" é um polimero de residuos de aminoácidos unido por ligações peptídicas, produzidas natural ou sinteticamente. Polipeptideos de menos de cerca de 10 residuos de aminoácidos são geralmente referidos como "peptídeos".

Uma "proteína" é uma macromolécula compreendendo uma ou mais cadeias polipeptídicas. Uma proteína também pode incluir componentes não-peptídicos, tais como grupos de carboidratos. Os carboidratos e outros substituintes não-peptídicos podem ser adicionados a uma proteína através da célula na qual a proteína é produzida, e irá variar de acordo com o tipo de célula. As proteínas são aqui definidas em termos das suas estruturas de aminoácidos; os substituintes tais como os grupos de carboidratos são geralmente não especificados, mas podem, no entanto estar presentes.

Um peptídeo ou polipeptideo codificado por uma molécula de ADN não-hospedeiro é um peptídeo ou polipeptideo "heterólogo".

Um "vector de clonagem" é uma molécula de ácido nucléico, tal como um plasmídeo, cosmídeo ou bacteriófago, que tem a capacidade de replicar de forma autónoma numa célula hospedeira. Os vectores de clonagem geralmente contêm um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição que permitem a inserção de uma molécula de ácido nucléico numa forma determinável, sem perda da função biológica essencial do vector, bem como sequências de nucleotídeos que codificam um gene marcador que é adequado para a utilização na identificação e 12 selecção de células transformadas com o vector de clonagem. Os genes marcadores geralmente incluem genes que conferem resistência à tetraciclina e resistência à ampicilina.

Um "vector de expressão" é uma molécula de ácido nucléico que codifica um gene que é expresso numa célula hospedeira. Normalmente, um vector de expressão inclui um promotor de transcrição, um gene e um terminador de transcrição. A expressão do gene é geralmente colocada sob o controle de um promotor, e tal gene é dito ser "operacionalmente ligado ao" promotor. Do mesmo modo, um elemento regulador e o núcleo promotor são operacionalmente ligados se o elemento regulador modular a actividade do núcleo promotor.

Um "hospedeiro recombinante" é uma célula que contém uma molécula de ácido nucléico heteróloga, como um vector de clonagem ou um vector de expressão. No contexto actual, um exemplo de um hospedeiro recombinante é uma célula que produz IL-22RA de um vector de expressão. Em contraste, IL-22RA pode ser produzido por uma célula que é uma "fonte natural" de IL-22RA, e que carece de um vector de expressão. "Transformantes integrativos" são células hospedeiras recombinantes, em que o ADN heterólogo está integrado no ADN genómico das células.

Uma "proteina de fusão" é uma proteina hibrida expressa por uma molécula de ácido nucléico compreendendo sequências de nucleotideos de pelo menos dois genes. Por exemplo, uma proteina de fusão pode incluir, pelo menos, parte de um polipeptideo IL-22RA fundido com um polipeptideo que liga uma matriz de afinidade. Tal proteina de fusão proporciona um meio para isolar grandes quantidades de IL-22RA, utilizando cromatografia de afinidade. 13 0 termo "receptor" denota uma proteína associada à célula que se liga a uma molécula bioactiva chamado de "ligante". Essa interação medeia o efeito do ligante na célula. Os receptores podem ser ligados por membrana, citosólicos ou nucleares; monoméricos (por ex., receptores hormonais estimulante da tireoide, receptores beta-adrenérgicos) ou multiméricos (por ex., receptor PDGF, receptor da hormona do crescimento, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor de eritropoietina e receptor IL-6). Os receptores ligados à membrana são caracterizados por uma estrutura de multi-domínio, que inclui um domínio extracelular de ligação do ligante e um domínio efector intracelular que está envolvido na transdução de sinal. Em certos receptores ligados à membrana, o domínio extracelular de ligação do ligante e o domínio efector intracelular estão localizados em polipeptídeos distintos que compõem o receptor funcional completo.

Em geral, a ligação do ligante ao receptor resulta numa mudança conformacional no receptor que provoca uma interacção entre o domínio efector e outra molécula (s) na célula, que por sua vez leva a uma alteração no metabolismo da célula. Os eventos metabólicos que estão muitas vezes ligados às interacções receptor-ligante incluem a transcrição de genes, fosforilação, desfosforilação, o aumento da produção de AMP cíclico, a mobilização de cálcio celular, a mobilização de lipídios de membrana, adesão celular, a hidrólise dos lipídios inositol e hidrólise de fosfolipídios.

Um "receptor solúvel" é um polipeptídeo receptor que não está ligado a uma membrana celular. Os receptores solúveis são mais comummente polipeptídeos receptores de ligação do ligante a que falta domínios transmembrana e citoplasmático, e outras ligações à membrana celular, tais como via glicofosfoinositol (gpi). Os receptores solúveis podem incluir resíduos de aminoácidos adicionais, como a afinidade de marcas que fornecem para a purificação do polipeptídeo ou fornecem sítios para a ligação do polipeptídeo a um substrato, ou sequências da região 14 constante de imunoglobulina. Muitos receptores da superfície celular têm ocorrência natural, contrapartidas solúveis que são produzidas por proteólise ou traduzidas de mARNs alternativamente emendados. Os receptores solúveis pode ser monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos ou multiméricos, com receptores multiméricos geralmente não compreendendo mais de 9 subunidades, de preferência não compreendendo mais de seis subunidades, e mais, de preferência que não incluam mais do que três subunidades. Os receptores de polipeptídeos seriam substancialmente isentos de transmembrana e segmentos de polipeptídeo intracelular quando falta porções suficientes destes segmentos para fornecer ancoragem de membranas ou de transdução de sinal, respectivamente. Os receptores solúveis de classe I e os receptores de citocinas da classe II geralmente compreendem o domínio de ligação extracelular de citocinas livre de um domínio transmsmbrane e de um domínio intracelular. Por exemplo, receptores solúveis representantivos incluem receptores solúveis para CRF2-4 (a.k.a., IL-10RB) (Genbank, n° de adesão Z17227) como mostrado na SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45; um receptor solúvel de IL-10RA (Genbank, n°s de adesão U00672 e NM_001558) como mostrado na SEQ ID NO: 46; um receptor solúvel para pDIRSl (a.k.a., IL-20RB) (Genbank, n° de adesão AY358305) , como mostrado na SEQ ID NO: 47; e um receptor solúvel para IL-22RA (Patente US 5965704), conforme mostrado na SEQ ID NO: 3. É da competência de um perito na técnica delinear que sequências de uma classe I ou sequência de citocinas da classe II conhecidas compreendem o domínio de ligação extracelular de citocinas livre de um domínio transmembrane e domínio intracelular. Além disso, um perito na técnica usando o código genético pode facilmente determinar polinucleotídeos que codificam tais receptores solúveis de polipeptídeos. O termo "sequência de sinal de secreção" denota uma sequência de ADN que codifica um peptídeo (um "peptídeo secretor") que, como um componente de um grande polipeptídeo, direcciona-o por meio de uma via secretória de uma célula na qual é sintetizada. O grande polipeptídeo é comummente clivado para remover o peptídeo secretor durante o trânsito através da via secretora. 15

Um polipeptídeo "isolado" é um polipeptídeo que é essencialmente livre de contaminantes de componentes celulares, tais como carboidratos, lipídios, ou outras impurezas proteicas associadas ao polipeptídeo na natureza. Normalmente, a preparação do polipeptídeo isolado contém o polipeptídeo numa forma altamente purificada, i.e., pelo menos, cerca de 80% puro, pelo menos, cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95%, superior a 95% puro, tal como 96%, 97% ou 98% ou mais de pureza, ou superior a 99% puro. Uma forma de mostrar que uma preparação de proteína particular contém um polipeptídeo isolado é pelo aparecimento de uma única banda após a eletroforese em gel de poliacrilamida do dodecil sulfato de sódio (DSS) da preparação das proteínas e coloração do gel Coomassie Brilliant Blue. No entanto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipeptídeo em formas físicas alternativas, tais como dímeros ou, alternativamente em formas glicosiladas ou derivatizadas.

Os termos " terminal-amino" e "terminal-carboxilo" são aqui usados para designar as posições dentro dos polipeptídeos. Sempre que o contexto permite, estes termos são usados com referência a uma determinada sequência ou parte de um polipeptídeo para indicar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma determinada sequência posicionada como terminal-carboxilo de uma sequência de referência dentro de um polipeptídeo está localizada proximal do terminal carboxilo da sequência de referência, mas não necessariamente no terminal carboxilo do polipeptídeo completo. O termo "expressão" refere-se à biosíntese de um produto de gene. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve a transcrição do gene estrutural para ARN e a tradução do mARN em um ou mais polipeptídeos. O termo "variante de emenda" é aqui utilizado para designar formas altearntivas de ARN transcritos de um gene. A variante de emenda surge naturalmente com o uso de sítios 16 de emenda alternativos dentro de uma molécula de ARN transcrita, ou menos comummente, entre moléculas de ARN transcrito separadas, e pode resultar em vários mARNs transcritos a partir do mesmo gene. Variantes de emenda podem codificar polipeptideos tendo a sequência de aminoácidos alterada. 0 termo variante de emenda também é usado aqui para denotar um polipeptideo codificado por uma variante de emenda de um mARN transcrito de um gene.

Como usado aqui, o termo "imunomodulador" inclui citocinas, células-tronco de factores de crescimento, limfotoxinas, moléculas co-estimulatórias, factores hematopoéticas, e semelhantes e análogos sintéticos destas moléculas. 0 termo "par complemento/anti-complemento" denota metades não-idênticas que formam um par estável não-covalentemente associado sob condições adequadas. Por exemplo, biotina e avidina (ou estreptavidina) são membros protótipo de um par complemento/anti-complemento. Outros exemplos de pares complemento/anti-complemento incluem pares receptor/ligante, pares anticorpo/antigeno (ou hapteno ou epitopo), pares polinucleotideo senso/anti-senso, e assim por diante. Onde a dissociação subsequente do par complemento/anti-complemento é desejável, o par complemento/anti-complemento tem de preferência uma afinidade de ligação inferior a 109 M"1'

Um "anticorpo anti idiotipo" é um anticorpo que se liga com o domínio de uma região variável da imunoglobulina. No contexto actual, um anticorpo anti-idiotipo liga-se com a região variável de um anticorpo anti-IL-22RA e, assim, um anticorpo anti-idiotipo imita um epitopo de IL-22RA.

Um "fragmento de anticorpo" é uma parte de um anticorpo, como F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, e assim por diante.

Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo 17 liga-se com o mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. Por exemplo, um fragmento de anticorpo monoclonal anti-IL-22RA liga-se com um epitopo de IL-22RA. 0 termo "fragmento de anticorpo" inclui também um polipeptideo sintético ou geneticamente modificado que se liga a um antigeno especifico, tais como polipeptídeos consistindo numa região variável da cadeia leve, fragmentos "Fv" consistindo em regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, moléculas de cadeia simples de polipeptídeos recombinante na qual as regiões variáveis leves e pesadas estão ligadas por um ligante peptídeo (proteínas "scFv"), e unidades de reconhecimento mínimo composto dos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável.

Um "anticorpo quimérico" é uma proteína recombinante que contém os domínios variáveis e as regiões complementares determináveis derivadas de um anticorpo de roedores, enquanto o restante da molécula de anticorpo é derivado de um anticorpo humano. "Anticorpos humanizados" são proteínas recombinantes em que a complementaridade murina determinando regiões de um anticorpo monoclonal foi transferida das cadeias variáveis leves e pesadas de imunoglobulina murina num domínio variável humano. A construção de anticorpos humanizados para uso terapêutico em humanos que são derivados de anticorpos murinos, como os que ligam ou neutralizam uma proteína humana, está dentro das competências de um perito na técnica.

Como usado aqui, um "agente terapêutico" é uma molécula ou um átomo que é conjugado com uma metade de anticorpo para produzir um conjugado que é útil para a terapia. Exemplos de agentes terapêuticos incluem medicamentos, toxinas, 18 imunomoduladores, quelantes, compostos de boro, agentes fotoactivos ou corantes e radioisótopos.

Um "rótulo detectável" é uma molécula ou átomo que pode ser conjugada com uma metade de anticorpo para produzir uma molécula útil para o diagnóstico. Exemplos de rótulos detectáveis incluem quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iões paramagnéticos, ou outras metades de marcadores. 0 termo "marca de afinidade" é usada aqui para denotar um segmento de polipeptideo que pode ser conectado a um segundo polipeptideo para fornecer para a purificação ou detecção do segundo polipeptideo ou fornecer sítios para a ligação do segundo polipeptideo a um substrato. Em princípio, qualquer peptídeo ou proteína para a qual um anticorpo ou um agente de ligação específico está disponível pode ser usado como uma marca de afinidade. As marcas de afinidade incluem um tracto de polihistidina, proteína A (Nilsson et al. EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al. Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutationa S transferase (Smith e Johnson, Gene 67:31 (1988)) marca de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7952 (1985)), substância P, peptídeo FLAG (Hopp et al. Biotechnology 6:1204 (1988)), peptídeo de ligação de estreptavidina, ou outros epítopos antigénicos ou domínio de ligação. Ver, em geral, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). As moléculas de ADN codificando marcas de afinidade estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais (por ex.f Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Um "anticorpo nu" é um anticorpo inteiro, ao contrário de um fragmento de anticorpo, que não é conjugado com um agente terapêutico. Os anticorpos nus incluem tanto anticorpos policlonais e monoclonais, bem como certos anticorpos recombinantes, tais como anticorpos quiméricos e humanizados. 19

Como usado aqui, o termo "componente de anticorpos" inclui tanto um anticorpo completo como um fragmento de anticorpo.

Um "imunoconjugado" é um conjugado de um componente de anticorpos com um agente terapêutico ou um marcador detectável.

Como usado aqui, o termo "proteína de fusão de anticorpo" refere-se a uma molécula recombinante que compreende um componente de anticorpos e um componente de polipeptídeo IL-22RA. Exemplos de uma proteína de fusão de anticorpo incluem uma proteína que compreende um domínio extracelular de IL-22RA, e quer um domínio Fc ou uma região de ligação ao antígeno.

Um "polipeptídeo-alvo" ou um "peptídeo alvo" é uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos um epítopo, e que se expressa numa célula-alvo, como uma célula tumoral ou uma célula que carrega um antígeno de um agente infeccioso. As células T reconhecem epítopos peptídicos apresentados por uma molécula de histocompatibilidade complexa principal a um polipeptídio alvo ou um peptídeo alvo e tipicamente lisar a célula de destino ou recrutar outras células imunes para o sítio da célula-alvo, matando, assim, a célula-alvo.

Um "peptídeo antigénico é um peptídeo que ligará uma molécula de histocompatibilidade complexa principal para formar um peptídeo complexo MHC o qual é reconhecido por uma célula T, induzindo a uma resposta de linfócitos citotóxicos mediante a apresentação à células T. Assim, os peptídeos antigénicos são capazes de se ligar a uma molécula de histocompatibilidade complexa principal adequada e induzir uma resposta das células T citotóxicas, tais como a lise celular e a libertação de citocinas específicas contra a célula-alvo que se liga ou expressa o 20 antígeno. 0 peptídeo antigénico pode ser ligado no contexto de uma molécula de histocompatibilidade complexa principal classe I ou classe II, ou numa célula apresentadora de antígeno ou numa célula-alvo.

Em eucariontes, a polimerase II de ARN catalisa a transcrição de um gene estrutural para a produção de mARN. Uma molécula de ácido nucléico pode ser projectada para conter um modelo de polimerase II ARN no qual a transcrição do ARN tem uma sequência que é complementar ao de um mARN específico. A transcrição do ARN é chamada de "ARN anti-senso" e a molécula de ácido nucléico que codifica o ARN anti-senso é denominada um "gene anti-senso". As moléculas de ARN anti-senso são capazes de se ligar a moléculas de mARN, resultando na inibição da tradução do mARN.

Um " oligonucleotídeo anti-senso específico para IL-22RA" ou "oligonucleotide anti-senso para IL-22RA" é um oligonucleotídeo tendo uma sequência (a) capaz de formar um triplex estável, com uma porção do gene IL-22RA, ou (b) capaz de formar um duplex estável, com uma parte da transcrição do mARN do gene IL-22RA.

Um "ribozima" é uma molécula de ácido nucléico que contém um centro catalítico. 0 termo inclui as enzimas do ARN, o ARN de auto emenda, ARNs ade uto-clivagem, e moléculas de ácido nucléico que executam essas funções catalíticas. A molécula de ácido nucléico que codifica uma ribozima é considerada um "gene ribozima".

Uma "sequência de guia externa" é uma molécula de ácido nucléico que dirige a ribozima endógena, ARnse P, a uma espécie particular de mARN intracelular, resultando na clivagem do mARN por ARnse P. Uma molécula de ácido nucléico que codifica uma sequência de guia externa chama-se "gene de sequência de guia externa". 21 0 termo "gene variante de IL-22RA" refere-se a moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptideo tendo uma sequência de aminoácidos que é uma modificação da SEQ ID NO: 3. Tais variações incluem polimorfismos de genes IL-22RA de ocorrência natural, bem como genes sintéticos que contêm substituições de aminoácidos conservadores da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Formas variantes adicionais de genes IL-22RA são moléculas de ácido nucléico que contêm inserções ou exclusões das sequências nucleotidicas aqui descritas. A variante do gene IL-22RA pode ser identificada, por exemplo, pela determinação se o gene hibridiza com uma molécula de ácido nucléico tendo a sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 1, ou o seu complemento, em condições rigorosas.

Alternativamente, a variante de genes IL-22RA pode ser identificada por comparação de sequências. Duas sequências de aminoácidos têm "100% de identidade de sequência de aminoácidos", se os resíduos de aminoácidos das duas sequências de aminoácidos forem os mesmos quando alinhados para a correspondência máxima. Da mesma forma, duas sequências de nucleotideos têm "100% de identidade de sequência de nucleotideos" se os resíduos de nucleotideos das duas sequências de nucleotideos forem os mesmos quando alinhados para a correspondência máxima. A comparação de sequências pode ser feita usando programas de software padrão como os incluídos no sistema de bioinformática LASERGENE, que é produzida por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Outros métodos para comparar duas sequências de nucleotideos ou de aminoácidos determinando o alinhamento ideal são bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Peruski e Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (Eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," em Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), e Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)). Métodos específicos para determinar a identidade da sequência são descritos abaixo. 22

Independentemente do método específico usado para identificar uma variante do gene IL-22RA ou uma variante do polipeptídeo IL-22RA, um gene variante ou um polipeptídeo codificado por um gene variante pode ser funcionalmente caracterizado pela capacidade de se ligar especificamente a um anticorpo anti-IL-22RA. A variante do gene IL-22RA ou a variante do polipeptídeo IL-22RA pode também ser caracterizada funcionalmente pela capacidade de se ligar ao seu ligante, IL-22, utilizando o ensaio biológico ou bioquímico descrito. 0 termo "variante alélica" é aqui utilizada para designar gualguer uma das duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupam o mesmo locus cromossómico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e podem resultar em polimorfismo fenotípico dentro das populações. As mutações do gene podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado), ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. 0 termo variante alélica também é usado aqui para denotar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. 0 termo "ortólogo" denota um polipeptídeo ou proteína obtida a partir de uma espécie que é a contrapartida funcional de um polipeptídeo ou proteína de uma espécie diferente. As diferenças das sequência entre ortólogos são o resultado de especiação. "Paralogos" são distintos, mas estruturalmente relacionadas com as proteínas feita por um organismo. Acredita-se que os paralogos surgem através da duplicação de genes. Por exemplo, a-globina, β-globina, e mioglobina são paralogos uns dos outros. A presente invenção inclui fragmentos funcionais dos genes IL-22RA. No contexto da presente invenção, um "fragmento 23 funcional" de um gene IL-22RA refere-se a uma molécula de ácido nucléico que codifica uma parte de um polipeptídeo IL-22RA que é um domínio aqui descrito, ou pelo menos liga-se especificamente com um anticorpo anti-IL-22RA.

Devido à imprecisão dos métodos analíticos padrão, os pesos moleculares e os comprimentos dos polímeros devem ser entendidos como valores aproximados. Quando esse valor é expresso como "cerca de" X ou "aproximadamente" X, o valor declarado de X será entendido como uma precisão de ± 10%.

3. Produção de Polinucleotídeos ou Genes IL-22RA

Podem ser obtidas moléculas de ácido nucléico que codificam um gene humano IL-22RA através do rastreio do cADN humano ou uma biblioteca genómica utilizando sondas de polinucleotídeo baseadas na SEQ ID NO: 1. Estas técnicas são padrão e estão bem estabelecidas, e podem ser realizadas utilizando kits de clonagem disponíveis nos fornecedores comerciais. Ver, por exemplo, Ausubel et al. (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3a edição, John Wiley & Sons 1995; Wu et al. Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv e Leder, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 69:1408 (1972); Huynh et al. "Constructing and Screening cDNA Libraries in ÀgtlO and Àgtll", em DNA Cloning: A Praticai Approach, Vol. I, Glover (ed.), página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) nas páginas 47-52 .

Moléculas de ácido nucléico que codificam o gene humano IL-22RA podem também ser obtidas usando a reacção em cadeia da polimerase (RCP) com substratos de oligonucleotídeos tendo sequências de nucleotídeos que são baseadas em sequências de nucleotídeos do gene IL-22RA ou cADN. São fornecidos métodos gerais para o rastreio de bibliotecas com RCP, por exemplo, em Yu et al. "Use of the Polymerase Chain Reaction 24 to Screen Phage Libraries", em Methods in Molecular Biology, vol. 15 PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.) Humana Press, Inc., 1993. Além disso, as técnicas para a utilização da RCP para isolar genes relacionados são descritas, por exemplo, em Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members", em Methods in Molecular Biology, vol. 15 PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.) Humana Press, Inc. 1993. Como alternativa, um gene IL-22RA pode ser obtido pela síntese de moléculas de ácido nucléico usando mutuamente substratos de oligonucleotídeos longos e as sequências nucleotídicas descritas aqui (ver, por exemplo, Ausubel (1995)). Técnicas estabelecidas usando a reacção em cadeia da polimerase fornecem a capacidade de sintetizar moléculas de ADN de, pelo menos, dois kilobases de comprimento (Adang et al. Plant. Molec Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al. PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al. "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", em Methods in Molecular Biology, vol. 15, PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), e Holowachuk et al. PCR Methods Appl. 4:299 (1,995)). Para revisões sobre síntese de polinucleotídeos, ver, por exemplo, Glick e Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al. Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), e Climie et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 87:633 (1990).

4. Produção de variantes do gene IL-22RA A presente invenção fornece uma variedade de moléculas de ácido nucléico, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam os polipeptídeos IL-22RA aqui divulgados. Os peritos na técnica reconhecerão facilmente que, tendo em conta a degenerescência do código genético, é possível uma variação considerável de sequência entre essas moléculas polinucleotídicas. Além disso, a presente descrição descreve receptores de polipeptídeos isolados solúveis 25 monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos e multimericos que compreendem pelo menos uma subunidade do receptor IL-22RA que é substancialmente homóloga do polipeptideo receptor de SEQ ID NO: 3. Assim, a presente descrição descreve polipeptideo IL-22RA de codificação de moléculas de ácido nucléico compreendendo nucleotideos degenerados de SEQ ID NO: 1 e os seus equivalentes de ARN. A Tabela 1 apresenta os códigos de uma letra para indicar as posições de nucleotideos degenerados. "Resoluções" são os nucleotideos indicados pelo código de uma letra. "Complemento", indica o código do nucleotideo(s) complementar(s). Por exemplo, o código Y representa C ou T, e o seu complemento R denota A ou G, sendo A complementar a T, e G sendo complementar a C.

Tabela 1

Nucleotideo Resolução Complemento Resolução A A T T C C G G G G C C T T A A R A G Y C T Y C T R A G M A C K G T K G T M A C s C G S C G w A T W A T H A C T D A G T B C G T V A C G V A C G B C G T D A G T H A C T N A C G T N A C G T

Os códons degenerados, englobando todos os codons possíveis para um determinado aminoácido, são mostrados na Tabela 2. 26

Tabela 2

Aminoácido Código de 1 letra Códons Códon degenerado Cys C TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T ACA ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gin Q CAA CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG Ile ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Vai V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TACTAT TAY Trp W TGG TGG Ter TAA TAG TGA TRR Asn Asp B RAY Glu Gin Z SAR Any X NNN

Um perito na técnica apreciará que é introduzida alguma ambiguidade na determinação de um códon degenerado, representativo de todos os possíveis códons codificando um aminoácido. Por exemplo, o códon degenerado para a serina (WSN) pode, em algumas circunstâncias, codificar a arginina (AGR), e os códons degenerados para arginina (MGN) podem, em algumas circunstâncias, codificar a serina (AGY). Uma relação semelhante existe entre códons que codificam a fenilalanina e a leucina. Assim, alguns polinucleotídeos abrangidos pela sequência degenerada podem codificar sequências de aminoácidos variantes, mas um perito na técnica pode facilmente identificar essas sequências 27 variantes em relação às sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. As sequências variantes podem ser facilmente testadas para a funcionalidade aqui descrita.

Diferentes espécies podem exibir " uso de códon preferencial". Em qeral, ver, Grantham et al. Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas et al. Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson et al. Gene 13:355 (1981), Grosjean e Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp e Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995), e Makrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996). Como usado aqui, o termo "uso de códon preferencial" ou "códons preferenciais" é um termo técnico que se refere à proteína da tradução de códons que são mais frequentemente utilizados em células de uma determinada espécie, favorecendo um ou alguns representantes dos codões possíveis que codificam cada aminoácido (ver Tabela 2). Por exemplo, o aminoácido treonina (Thr) pode ser codificado por ACA, ACC, ACG ou ACT, mas em células de mamíferos ACC é o códon mais comummente usado, em outras espécies, por exemplo, células de insectos, leveduras, vírus ou bactérias, diferentes códons Thr podem ser preferenciais. Códons preferenciais para uma espécie em particular podem ser introduzidos nos polinucleotídeos da presente invenção por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A introdução de sequências de códon preferencial em ADN recombinante pode, por exemplo, aumentar a produção da proteína, tornando a tradução da proteína mais eficiente dentro de um tipo particular de célula ou espécie. Portanto, as sequências de códon degenerado aqui divulgadas servem como modelo para optimizar a expressão de polinucleotídeos em vários tipos de células e espécies usadas na técnica e aqui divulgadas. Sequências contendo códons preferenciais podem ser testadas e optimizadas para a expressão de várias espécies, e testadas para a funcionalidade, tal como indicado aqui. IL-22RA codificando cADN pode ser isolado por uma variedade de métodos, como por sondagem com um cADN humano parcial ou 28 completo ou com um ou mais conjuntos de sondas degeneradas baseadas nas sequências divulgadas. 0 cADN também pode ser clonado usando a reacção em cadeia da polimerase com substratos concebidos a partir sequências de IL-22RA humano representativas aqui divulgadas. Além disso, uma biblioteca de cADN pode ser usada para transformar ou transfectar células hospedeiras e a expressão do cADN de interesse pode ser detectado com um anticorpo para o polipeptideo IL-22RA.

Os peritos na técnica reconhecerão que a sequência divulgada na SEQ ID NO: 1 representa um único alelo de IL-22RA humano, e que são esperados ocorrer a variação alélica e a emenda alternativa. Variantes alélicas desta sequência podem ser clonadas por sondagem de cADN ou bibliotecas do genoma de diferentes indivíduos de acordo com procedimentos normalizados. Variantes alélicas de sequências de nucleotídeos aqui divulgadas, incluindo aquelas que contêm mutações silenciosas e aquelas em que as mutações resultam em alterações na sequência de aminoácidos, estão dentro do escopo da presente invenção, uma vez que são proteínas que são variantes alélicas das sequências de aminoácidos aqui divulgadas, moléculas de cADN geradas a partir de mARNs alternativamente emendados, que retêm as propriedades do polipeptideo IL-22RA são descritos a seguir, bem como polipeptídeos codificados por tais cADNs e mARNs. Variantes alélicas e emendas variantes dessas sequências pode ser clonadas por sondagem de cADN ou bibliotecas do genoma de diferentes indivíduos ou tecidos de acordo com procedimentos padrão conhecidas na técnica.

Usando os métodos discutidos acima, um perito na técnica pode preparar uma variedade de polipeptídeos que compreendem uma subunidade do receptor solúvel IL-22RA que é substancialmente homólogo de SEQ ID NO: 1, ou que codifica os aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou variantes alélicas do mesmo e manter as propriedades do ligante de ligação do receptor de tipo selvagem IL-22RA. Tais polipeptídeos também podem incluir segmentos de polipeptideo adicionais como geralmente divulgados aqui. 29

As moléculas de ácido nucléico isoladas podem hibridizar sob condições severas para moléculas de ácido nucléico compreendendo sequências nucleotidicas aqui divulgadas. Por exemplo, tais moléculas de ácido nucléico podem hibridizar em condições severas para moléculas de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 1 ou para as moléculas de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotideos complementares da SEQ ID NO: 1, ou de fragmentos da mesma.

Em geral, as condições restritivas são seleccionadas para ser cerca de 5o C inferior ao ponto de fusão térmica (Tm)

para a sequência especifica de uma força iónica e pH definido. A Tm é a temperatura (sob força iónica e pH definido) em que 50% da sequência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente combinada. Após a hibridização, as moléculas de ácido nucléico podem ser lavadas para retirar as moléculas de ácido nucléico não-hibridizadas sob

condições rigorosas, ou em condições muito rigorosas. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in

Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger e Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc. 1987) e Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). O software de análise de sequência, tais como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) e

Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft Internacional; Paio Alto, CA) , bem como sítios na internet, são ferramentas disponíveis para analisar uma determinada sequência e calcular a Tm com base em critérios definidos pelo utilizador. É bem dentro das capacidades de um perito na técnica adaptar a hibridização e as condições de lavagem para uso com um híbrido polinucleotídeo particular. A presente descrição descreve polipeptídeos isolados IL-22RA que têm uma identidade de sequência substancialmente semelhante aos polipeptídeos da SEQ ID NO: 3, ou seus ortólogos. O termo "identidade de sequência substancialmente similar" é usado aqui para denotar 30 polipeptídeos tendo pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, como 96%, 97%, 98%, ou superior a 95% de identidade de sequência para as sequências mostradas na SEQ ID NO: 3, ou seus ortóloqos. Por exemplo, a variante e os ortólogos dos receptores IL-22RA podem ser usados para gerar uma resposta imune e aumentar os anticorpos de reacção cruzada para IL-22RA humano. Esses anticorpos podem ser humanizados, e modificados conforme descrito a seguir, e usado terauputicamente para tratar a psoriase, artrite psoriática, IBD, colite, endotoxemia, bem como em outras aplicações terapêuticas aqui descritas. A presente descrição descreve variantes de moléculas de ácido nucléico IL-22RA que podem ser identificadas por meio de dois critérios: a determinação da similaridade entre os polipeptídeos codificados com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e um ensaio de hibridação. Tais variantes IL-22RA incluem moléculas de ácido nucléico (1) que permanecem hibridizadas com uma molécula de ácido nucléico tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 (ou seu complemento) , sob condições rigorosas de lavagem, em que o rigor da lavagem é equivalente a 0,lx - 2x SSC com 0,1% SDS a 55-65°C, e (2) que codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, ou superior a 95%, como 96%, 97%, 98% ou 99% ou superior, de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Alternativamente, as variantes IL-22RA podem ser caracterizadas como moléculas de ácido nucléico (1) que permanecem hibridizadas com uma molécula de ácido nucléico tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ NO: 1 (ou seu complemento), sob condições muito rigorosas de lavagem, em que o rigor de lavagem é equivalente a O.lx - 0.2x SSC com 0,1% SDS a 50-65°C, e (2) que codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos, 95% ou superior, como 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. A percentagem de identidade de sequência é determinada por métodos convencionais. Ver, por exemplo, Altschul et al. 31

Buli. Math. Βίο. 48:603 (1986), e Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1992).

Resumidamente, duas sequências de aminoácidos são alinhadas para optimizar as pontuações de alinhamento usando uma penalização de intervalo de abertura de 10, uma penalização de intervalo de extensão de 1, e a matriz de pontuação "BLOSUM62" de Henikoff e Henikoff (ibid.) como mostrado na Tabela 3 (os aminoácidos são indicadas pelos códigos padrão de uma letra). A percentagem de identidade é então calculada como: ([número total de combinações idênticas]/ [comprimento da sequência mais longa mais o número de intervalos introduzidos na sequência mais longa, a fim de alinhar as duas sequências]) (100).

Tabela 3 A R Γ4 D V-' 0 E G H $ L K μ F p S T Â 4 R -ΐ 5 -2 ΰ 6 -2 -2 1 c jh 45 -5 â 0 u 0 Λ V -3 s t. --ξ 0 0 2 -4 n G íi u -2 Q 1 •is -2 6 H 0 1 4 ••3 •5 íi -J? g ! •1 -d 3 •s . •'2 .3 4 3 4 3 •4 • ! 2 ..3 4 £ 4 K 2 0 •1 •3: 1 1 -1 •s •2 5 "1 4 v2 -3 -! C -2 '3 »3 2 -Ί δ P vií 3 ’3 3 -2 "3 45 .3 0 0 <3 0 6 •p '3 -1 -3 1 1 •i; •3 3 -3 4 ...·> A·. 4 ? s 4 1 .1 0 0 0 ,·ϊ 3 2 0 a -j: T vi -1 0 -1 -1 -1 4 "2 -.3 4 .4 '1 -a 5 6 w -3 -3 4 4 >> >v -3 VÍ 4 -3 Ί ‘4 '3 ? V -2 2 -2 1 5 0 * jy 2 4 4 4 3 •-S •2 »2 V yi 3 4 >3 ,*1 '2 '2 4 3 1: '2 4 2 •2 C>·

Os peritos na técnica apreciarão que há muitos algoritmos estabelecidos disponíveis para alinhar duas sequências de aminoácidos. O algoritmo de busca de similaridade "FASTA" de Pearson e Lipman é um método de alinhamento adequado de proteína para examinar o nível de identidade partilhada por uma sequência de aminoácidos divulgada aqui e a sequência de aminoácidos de uma variante de IL-22RA putativa. O algoritmo FASTA é descrito por Pearson e Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), e por Pearson, Meth. 32

Enzymol. 183:63 (1990). Resumidamente, o FASTA primeiro caracteriza a similaridade da sequência, identificando as regiões compartilhadas pela sequência de consulta (por ex., SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3) e uma sequência de teste que tenha a mais elevada densidade de identidade (se a variável ktup é 1) ou pares de identidade (se ktup=2), sem considerar substituições de aminoácidos conservadoras, inserções ou exclusões. As dez regiões com maior densidade de identidades são, então, reorquestradas através da comparação da similaridade de todos os pares de aminoácidos usando uma matriz de substituição do aminoácido, e as extremidades das regiões são "cortadas" para incluir apenas os resíduos que contribuem para a maior pontuação. Se há várias regiões com valores superiores ao "valor limite" (calculado por uma fórmula pré-determinada com base no comprimento da sequência e no valor ktup), as regiões cortadas iniciais são examinados para determinar se as regiões podem ser unidas para formar um alinhamento aproximado com intervalos. Finalmente, as regiões com a pontuação mais alta das duas sequências de aminoácidos são alinhadas usando uma modificação do algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que permite inserções e deleções de aminoácidos paraparâmetros para análise ilustrativa FASTA são: ktup=l, penalização do intervalo de abertura-10, penalização do intervalo de extensão=l, e matriz de substituição=BLOSUM62. Estes parâmetros podem ser introduzidos num programa FASTA, modificando o arquivo da matriz de pontuação ("SMATRIX"), como explicado no Apêndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). 0 FASTA também pode ser usado para determinar a identidade da sequência de moléculas de ácido nucleico usando uma relação como divulgado anteriormente. Para comparações de sequências de nucleotídeos, o valor ktup pode variar entre 1 a 6, preferivelmente de três a seis, mais preferencialmente três, com outros parâmetros definidos como descrito acima. 33 A presente descrição descreve moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptideo com uma mudança do aminoácido conservador, comparado com uma sequência de aminoácidos aqui divulgada. Por exemplo, as variantes podem ser obtidas que contêm uma ou mais substituições de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, no qual um aminoácido alquil é substituído por um aminoácido alquilo numa sequência de aminmoácido IL-22RA, um aminoácido aromático é substituído por um aminoácido aromático numa sequência de aminoácido IL-22RA, um aminoácido contendo enxofre é substituído por um aminoácido conmtendo enxofre numa sequência de aminoácido IL-22RA, um aminoácido contendo hidroxi é substituído por um aminoácido contendo hidroxi numa sequência de aminoácido IL-22RA, um aminoácido acídico é substituída por um aminoácido acídico numa sequência de aminoácido IL-22RA, um aminoácido básico é substituído por um aminoácido básico numa sequência de aminoácido IL-22RA, ou um aminoácido monocarboxílico dibásico é substituído por um aminoácido monocarboxílico dibásico numa sequência de aminoácido IL-22RA. Entre os aminoácidos comuns, por exemplo, a "substituição do ácido aminado conservador" é ilustrada por uma substituição entre os aminoácidos em cada um dos seguintes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, (2), fenilalanina, tirosina e triptofano, (3) serina e treonina, (4) aspartato e glutamato, (5) glutamina e asparagina, e (6) lisina, arginina e histidina. A tabela BLOSUM62 é uma matriz de substituição de aminoácido derivada de cerca de 2.000 locais de alinhamento múltiplo dos segmentos da sequência de proteínas, que representam as regiões altamente conservadas de mais de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff e Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 89:10915 (1992)). Assim, as frequências de substituição BLOSUM62 podem ser usadas para definir substituições de aminoácidos conservadoras que podem ser introduzidos nas sequências de aminoácidos da presente invenção. Embora seja possível conceber substituições de aminoácidos baseadas somente em propriedades químicas (como discutido acima), a linguagem "substituição de aminoácido conservador" refere-se, de preferência, a uma substituição representada por um valor BLOSUM62 superior a -1. Por exemplo, uma substituição do aminoácido é conservadora, caso a substituição seja caracterizada por um valor BLOSUM62 de 0, 1, 2 ou 3. Segundo este sistema, as substituições de aminoácidos 34 conservadoras preferenciais são caracterizadas por um valor BLOSUM62 de pelo menos 1 (por exemplo, 1, 2 ou 3), enquanto as substituições de aminoácidos conservadoras mais preferenciais são caracterizadas por um valor BLOSUM62 de pelo menos 2 (por ex. 2 ou 3) . Variantes particulares de IL-22RA são caracterizadas por terem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos, 95% ou superior a 95%, como 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade de para a sequência de aminoácido correspondente (por ex., SEQ ID NO: 3), onde a variação na sequência de aminoácidos é devida a uma ou mais substituições de aminoácidos conservadores.

Mudanças de aminoácidos conservadores no gene IL-22RA podem ser introduzidas, por exemplo, substituindo, nucleotideos para os nucleotideos referidos na SEQ ID NO: 1. Tais variantes de " aminoácido conservador" podem ser obtidas por mutagénese dirigida a oligonucleotideos, mutagénese de varrimento de ligação, mutagénese usando a reacção em cadeia da polimerase, e assim por diante (ver Ausubel (1995); e McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Praticai Approach (IRL Press 1991)). Um polipeptideo variante IL-22RA pode ser identificado pela capacidade de se ligarem especificamente aos anticorpos anti-IL-22RA.

As proteínas aqui descritas também podem incluir os resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural. Aminoácidos de ocorrência não natural incluem, sem limitação, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteina, hidroxiethilhomocisteina, nitoglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido carboxílico tiazolidina, dehidroprolina, 3-e-4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3- azafenilalanina, 4-azafenilalanina e 4-fluorfenilalanina. Vários métodos são conhecidos na técnica para a incorporação de resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural em proteínas. Por exemplo, num sistema in vitro pode ser utilizado onde mutações aberrantes são suprimidas usando supressor tARNs quimicamente aminoacilatado. 35 Métodos para a síntese de aminoácidos e tARN aminoacilatado são conhecidas na técnica. A transcrição e tradução de plasmideos contendo mutações aberrantes é normalmente realizada num sistema celular livre que compreende um extracto de E. coli S30 enzimas e outros reagentes disponíveis comercialmente. As proteínas são purificadas por cromatografia. Ver, por exemplo, Robertson et al. J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman et al. Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung et al. Science 259:806 (1993), e Chung et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 90:10145 (1993) .

Num segundo método, a tradução é realizada em ovócitos de Xenopus por microinjeção de mARN mutante e supressor tARNs quimicamente aminoacilatado (Turcatti et al. J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)). Dentro de um terceiro método, as células de E. coli são cultivadas na ausência de um aminoácido natural que será substituído (por ex., fenilalanina) e na presença dos aminoácidos não-naturais desejado (s) (por exemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina ou 4-fluorfenilalanina) . Os aminoácidos não-naturais são incorporados nas proteínas no lugar do seu homólogo natural. Ver, Koide et al. Biochem. 33:7470 (1994). Os resíduos de aminoácidos de ocorrência natural podem ser convertidos em espécies não-naturais por modificação química em vitro. A modificação química pode ser combinada com mutagénese dirigida para expandir ainda mais o leque de substituições (Wynn e Richards, Protein Sei. 2:395 (1993)).

Um número limitado de aminoácidos não-conservadores, os aminoácidos que não são codificados pelo código genético, os aminoácidos de ocorrência não-natural e aminoácidos não-naturais podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos IL-22RA.

Aminoácidos essenciais nos polipeptídeos aqui descritos podem ser identificados de acordo com procedimentos 36 conhecidos na técnica, como a mutagénese dirigida ou mutagénese de varrimento de alanina (Cunningham e Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al. Proc. Nat'l Acad.

Sei. USA 88:4498 (1991), Coombs e Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Enginneering", em Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). Nesta última técnica, as mutações de alanina simples são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para a actividade biológica para identificar resíduos de aminoácidos que são essenciais para a catividade da molécula. Ver também Hilton et al. J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).

Embora a análise da sequência possa ser usada para definir melhor a região ligante de IL-22RA, os aminoácidos que desempenham um papel na actividade de ligação de IL-22RA (tais como a ligação de IL-22RA ao ligante IL-22, ou um anticorpo anti-IL- 22RA) também podem ser determinados pela análise da estrutura física, como determinado por meio de técnicas como a ressonância magnética nuclear, cristalografia, difraeção de electrões ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com a mutação do sítio de contacto putativo dos aminoácidos. Ver, por exemplo, de Vos et al. Science 255:306 (1992), Smith et al. J. Mol. Biol. 224:899 (1992), e Wlodaver et al. FEBS Lett. 309:59 (1992).

As substituições múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidas de mutagénese e selecção, tais como aquelas divulgadas por Reidhaar-Olson e Sauer (241:53 Science (1988)) ou Bowie e Sauer (Proc. Nat'l. Acad. USA 86:2152 (1989)). Resumidamente, estes autores divulgam métodos de randomização simultânes de duas ou mais posições num polipeptídeo, seleccionando para o polipeptídeo funcional, e, em seguida, seqenciando os polipeptídeos mutagenizados para determinar o espectro de substituições permitidos em cada posição. Outros métodos que podem ser usados incluem demonstração de bacteriófagos (por exemplo, Lowman et al. Biochem. 30:10832 (1991), 37

Ladner et al. Patente US n° 5223409, Huse, publicação internacional n° WO 92/06204 e E mutagénese dirigida a uma região (Derbyshire et al. Gene 46:145 (1986), e Ner et al. DNA 7:127, (1988)). Além disso, o IL-22RA marcado com biotina ou FITC pode ser usado para clonagem de expressão de ligantes de IL-22RA.

Variantes do nucleotideo IL-22RA divulgado e sequências de polipeptideos também podem ser gerados através do arrastamento de ADN divulgado por Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 91:10747 (1994), e publicação internacional n° WO 97/20078. Resumidamente, as moléculas de ADN são geradas pela variação in vitro de recombinação homóloga, pela fragmentação aleatória do ADN parental seguido por remontagem utilizando PCR, resultando em mutações de ponto introduzidas aleatoriamente: Esta técnica pode ser modificada por meio de uma familia de moléculas de ADN parental, como variantes alélicas ou moléculas de ADN de diferentes espécies, para introduzir variabilidade adicional no processo. A selecção ou triagem para a actividade desejada, seguida de iterações adicionais de mutagénese e análise prevê a "evolução" rápida de sequências por selecção de mutações desejáveis seleccionando simultaneamente contra alterações prejudiciais.

Os métodos de mutagénese conforme divulgados aqui podem ser combinados métodos de triagem automatizada de alto rendimento, para detectar a actividade de polipeptideos mutagenizados clonados, em células hospedeiras. As moléculas de ADN mutagenizado que codificam polipeptideos biologicamente activos, ou polipeptideos que se ligam com anticorpos anti-IL-22RA, podem ser recuperados a partir da célula hospedeira e rapidamente sequenciados utilizando equipamento moderno. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância dos resíduos de aminoácidos individuais num polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados a polipeptideos de estrutura desconhecida. 38 A presente descrição descreve "fragmentos funcionais" de polipeptídeos IL-22RA e moléculas de ácido nucléico codificando tais fragmentos funcionais. As análises de rotina de eliminação de moléculas de ácido nucléico podme ser realizadas para obter fragmentos funcionais de uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptideo IL-22RA. Como ilustração, as moléculas de ADN tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 podem ser digerida com nuclease Bal31 para obter uma série de exclusões aninhadas. Os fragmentos são então inseridas em vectores de expressão num quadro de leitura apropriado, e os polipeptídeos expressos são isolados e testados para a capacidade de ligar os anticorpos anti-IL-22RA. Uma alternativa à digestão exonuclease é a utilização de mutagénese dirigida a oligonucleotídeos para introduzir supressões ou códons de parada para especificar a produção de um fragmento desejado. Alternativamente, os fragmentos particulares de um gene IL-22RA podem ser sintetizados através da reacção em cadeia da polimerase.

Esta abordagem geral é exemplificada pelos estudos sobre o truncamento em um ou ambos os términos de interferões e foram resumidos por Horisberger e Di Marco, Pharmac. Não há. 66:507 (1995). Além disso, técnicas convencionais de análise funcional de proteínas são descritas, por exemplo, em Treuter et al. Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993), Content et al. "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", em Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting of Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman "The EGF Receptor" em Control of Animal Cell Proliferation, vol. 1, Boynton et al., (eds.), páginas 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau et al. J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al. J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al. Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995), e Meisel et al. Plant Molec. Biol. 30:1 (1996).

As análise das sequências particulares aqui divulgadas fornecem um conjunto de fragmentos funcionais ilustrativos 39 apresentados na Tabela 4. Os nucleotídeos codificando domínios funcionais variantes adicionais de IL-22RA humano descritos aqui, não mostrados na Tabela 4, podem ser determinados com referência à SEQ ID NO: 1. Esses fragmentos funcionais incluem, por exemplo, as seguintes sequências de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1: nucleotídeos 85-381, 206-717 e 85-717 da SEQ ID NO: 1 e correspondentes sequências de aminoácidos codificados, como mostrado na SEQ ID NO : 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente.

Tabela 4

Característica IL-22RA Resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO. 2) Nucleotídeos (SEQ ID NO. 1) Primeiro Domínio Ig 18-116 85-381 Segundo Domínio Ig 125-228 206-717 Ambos os Domínios Ig 18-228 85-717 A presente descrição descreve fragmentos funcionais de um gene IL-22RA que têm mudanças de aminoácidos, em comparação com uma sequência de aminoácidos aqui divulgada. A variante do gene IL-22RA pode ser identificada com base na estrutura por determinação do nível de identidade com nucleotídeos divulgados e sequências de aminoácidos, como discutido acima. Uma abordagem alternativa para identificar um gene variante em função da estrutura é determinar se uma molécula de ácido nucléico que codifica uma variante potencial de gene IL-22RA pode hibridizar com uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos, como SEQ ID NO: 1. A presente descrição descreve a partir de fragmentos funcionais dos polipeptídeos IL-22RA, epítopos antigénicos, porções de epítopo de polipeptídeos IL-22RA, e moléculas de ácido nucléico que codificam tais fragmentos funcionais, epítopos antigénicos, porções de epítopo de polipeptídeos IL-22RA. Esses fragmentos são usados para gerar polipeptídeos para uso na geração de anticorpos e parceiros de ligação que ligam, bloqueiam, inibem, reduzem, 40 antagonizam ou neutralizam a actividade de IL-22 ou IL-20 e IL-22. Um polipeptideo "funcional" IL-22RA ou fragmento, tal como definido aqui, é caracterizado pela sua capacidade de bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a actividade inflamatória, proliferativa ou de diferenciação de IL-20 ou IL-22, pela sua capacidade de induzir ou inibir funções especializadas de células, ou pela sua habilidade em ligar especificamente a um anticorpo anti-IL-22RA, uma célula, IL-20 ou IL-22. Como anteriormente descrito, IL-22RA é caracterizado por uma estrutura de classe II de receptores de citocinas e domínios, tal como descrito aqui. Assim, a presente descrição descreve o uso de proteínas de fusão compreendendo: (a) moléculas de polipeptideo compreendendo um ou mais dos domínios descritos acima; e (b) fragmentos funcionais compreendendo um ou mais destes domínios. A outra porção polipeptídica da proteína de fusão pode ser aportada por um outro receptor de citocinas da Classe II, como IL-10R, IL-13R, IL-20RA, IL-20RB, IL-10RB (CRF2-4), IL-22RA2, ou por um peptídeo secretor de sinal não-nativo e/ou independente que facilita a secreção da proteína de fusão. A presente descrição descreve fragmentos de polipeptídeos ou peptídeos compreendendo uma porção de epítopo do polipeptideo IL-22RA aqui descrito. Esses fragmentos ou peptídeos podem incluir um "epítopo imunogénico", que é parte de uma proteína que induz uma resposta de anticorpo quando a proteína inteira é utilizada como imunógeno. As porções de epítopo dos peptídeos imunogénicos podem ser identificadas usando métodos padrão (ver, por exemplo, Geysen et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 81:3998 (1983)) .

Em contraste, os fragmentos de polipeptídeos ou peptídeos podem incluir um "epítopo antigénico", que é uma região de uma molécula de proteína que um anticorpo se pode ligar especificamente. Alguns epítopos consistem num trecho 41 linear ou contíguo de aminoácidos, e a antigenicidade de um tal epítopo não é perturbada por agentes desnaturantes. Sabe-se que na técnica que peptídeos sintéticos relativamente curtos que podem imitar epitopos de uma proteína podem ser usados para estimular a produção de anticorpos contra a proteína (ver, por exemplo, Sutcliffe et al. Science 219:660 (1983)). Assim, epitopos antigénicos de peptídeos, peptídeos antigénicos, epitopos e polipeptídeos são úteis para aumentar os anticorpos que se ligam com os polipeptídeos aqui descritos, bem como para identificar e varrer tela anticorpos monoclonais anti-IL-22RA que são neutralizantes, e que podem ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a actividade da IL-22 e IL-20 (individual ou em conjunto). Estes anticorpos monoclonais neutralizantes da presente invenção podem ligar a um epitopo antigénico IL-22RA. Podem ser usados perfis de hidrofilicidade Hopp/Woods para determinar as regiões que têm o maior potencial antigénico na SEQ ID NO: 3 (Hopp et al. Proc. Natl. Acad. Sei.78 :3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 e Triquier et al. Protein Engineering, 11:153-169, 1998). O perfil é baseado numa janela deslizante de seis resíduos. Os resíduos G, S, T são enterrados e os resíduos expostos Η, Y, W foram ignorados. Em IL-22RA essas regiões podem ser determinadas por um perito na técnica. Além disso, os epitopos antigénicos IL-22RA na SEQ ID NO: 3, como previsto por uma parcela Jameson-Wolf, por exemplo, usando o programa DNASTAR (ADNSTAR, Inc., Madison, WI) , servem como epitopos antigénicos preferidos, e podem ser determinados por um perito na técnica. Tais epitopos antigénicos incluem (1) os resíduos de aminoácidos 1 (Pro) a 6 (Asp) da SEQ ID NO: 3; (2) resíduos de aminoácidos 26 (Ser) a 32 (Pro) de SEQ ID NO: 3; (3) resíduos de aminoácidos 41 (Lys) a 47 (Asp) da SEQ ID NO: 3; (4) resíduos de aminoácidos 49 (Vai) a 62 (Cys) de SEQ ID NO: 3; (5) resíduos de aminoácidos 41 (Lys) a 62 (Cys) de SEQ ID NO: 3; (6) resíduos de aminoácidos 84 (Ala) a 97 (Ser) da SEQ ID NO: 3; (7) resíduos de aminoácidos (103 Thr) a 108 (Asp) de SEQ ID NO: 3; (8) resíduos de aminoácidos 130 (Arg) para 135 (His) de SEQ ID NO: 3; (9) resíduos de aminoácidos 164 (Gly) a 166 (Lys), da SEQ ID NO: 3; (10) resíduos de aminoácidos 175 (Tyr) a 179 (Glu) de SEQ ID NO: 3; (11) resíduos de aminoácidos 193 (Lys) a 196 (Ala), da SEQ ID NO: 3; (12) resíduos de 42 aminoácidos 203 (Lys) a 209 (Thr) de SEQ ID NO: 3. Epítopos adicionais incluindo os peptideos que se seguem são potencialmente gerados a partir de IL-22RA de comprimento total humano não reduzido clivado com CnBr: peptideo 6 (SEQ ID NO: 56); peptideo 7 (SEQ ID NO: 57); peptídeo 8 (SEQ ID NO: 58); peptideo 9 (SEQ ID NO: 59); peptideo 10 (SEQ ID NO: 60); e o peptideo 11 (SEQ ID NO: 61). As cisteinas são ligadas em dissulfeto, o que resulta numa possível ligação entre os peptideos 7 (SEQ ID NO: 57) e 10 (SEQ ID NO: 60) . Especificamente, a SEQ ID NO: 56 corresponde a resíduos de aminoácidos 1 (Pro) a 92 (Met) de SEQ ID NO: 3; a SEQ ID NO: 57 corresponde a resíduos de aminoácidos 93 (Thr) a 120 (Met) de SEQ ID NO: 3; a SEQ ID NO: 58 corresponde a resíduos de aminoácidos 121 (Ile) a 160 (Met) de SEQ ID NO: 3; a SEQ ID NO: 59 corresponde a resíduos de aminoácidos 161 (His) a 185 (Met) de SEQ ID NO: 3; a SEQ ID NO: 60 corresponde a resíduos de aminoácidos 186 (Ile) a 199 (Met) de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 61 corresponde a resíduos de aminoácidos 200 (Cys) a 211 (Thr) de SEQ ID NO: 3. Além disso, os resíduos da SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3) são importantes para o receptor ligante de ligação compreendem Tyr-60, e Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210 e Glu-211 da SEQ ID NO: 2 e (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3). Além disso, resíduos primários da SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3) que são importantes para direccionar o receptor ligante de ligação compreendem Tyr-60, e de Phe-164 de SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3), e os resíduos secundários incluem resíduos Tyr-93, Arg-112, Lys-210 e Glu-211 da SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3). Em modalidades preferidas, os epítopos antigénicos que os anticorpos neutralizantes da presente invenção ligam conterão resíduos de SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3) que são importantes para o receptor ligante de ligação, por exemplo, IL-22RA e IL-20 ou IL-22 (individual ou em conjunto).

Epítopos antigénicos de peptideos e polipeptídeos podem conter pelo menos 4 a 10 aminoácidos, pelo menos dez a quinze aminoácidos, ou cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos de uma sequência de aminoácidos aqui divulgada. 43

Esses epítopos de peptídeos e polipeptídeos podem ser produzidos pela fragmentação de um polipeptídeo IL-22RA, ou por síntese química de peptídeos, como aqui descrito. Além disso, os epítopos podem ser seleccionados por exposição de macrofágos de bibliotecas aleatórias de peptídeos (ver, por exemplo, Lane e Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993), e Cortese et al. Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). Métodos padrão para identificar epítopos e parac a produção de anticorpos a partir de pequenos peptídeos que compõem um epítopo são descritos, por exemplo, em Mole, "Epitope Mapping", em Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinicai Application, Ritter e Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), e Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1-9.3.5 e páginas 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).

Para qualquer polipeptídeo IL-22RA, incluindo as variantes e as proteínas de fusão, um perito na técnica pode facilmente gerar uma sequência de polinucleotídeo totalmente degenerados codificando essa variante com as informações apresentadas nas Tabelas 1 e 2 acima. Além disso, os peritos na técnica podem usar software padrão para desenvolver variantes IL-22RA baseadas em nucleotídeos e sequências de aminoácidos descritos.

5. Produção de Polipeptídeos IL-22RA

Os polipeptídeos aqui descritos, incluindo polipeptídeos de comprimento total; receptores de comprimento total monoméricos solúveis, homodiméricos, heterodiméricos e multiméricos; receptores de comprimento total; fragmentos de receptores (por exemplo, fragmentos de ligação de ligante e epítopos antigénicos), fragmentos funcionais e proteínas de fusão, podem ser produzidos em células 44 hospedeiras recombinantes seguindo técnicas convencionais. Para expressar um gene IL-22RA, uma molécula de ácido nucléico codificando o polipeptidio deve ser operacionalmente ligado a sequências regulatórias que controlam a expressão transcricional num vector de expressão e, em seguida, introduzidas numa célula hospedeira. Além das sequências de transcrição regulatórias, tais como promotores e intensificadores, os vectores de expressão podem incluir sequências regulatórias translacionais e um gene marcador que é adequado para a selecção de células que carregam o vector de expressão.

Os vectores de expressão que são adequados para a produção de uma proteína estranha em células eucarióticas normalmente contêm (1) elementos procarióticos de ADN que codificam para uma origem de replicação bacteriana e um marcador de resistência a antibióticos para assegurar o crescimento e a selecção do vector de expressão num hospedeiro bacteriano; (2) elementos eucarióticos de ADN que controlam a iniciação da transcrição, como um promotor; e (3) elementos de ADN que controlam o processamento de transcritos, como uma terminação da transcrição/sequência de poliadenilação. Como discutido acima, os vectores de expressão também podem incluir sequências de nucleotídeos que codificam uma sequência de secreção que direcciona o polipeptídeo heterólogo para a via secretória de uma célula hospedeira. Por exemplo, um vector de expressão IL-22RA pode compreender um gene IL-22RA e uma sequência de secreção provenientes de qualquer gene segregado.

As proteínas IL-22RA, podem ser expressas em células de mamíferos. Exemplos de células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem células renais do macaco verde africano (Vero; ATCC CRL 1687), as células embrionárias do rim humano (293 HEK; ATCC CRL 1573), células do rim de hamster bebé (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, CRL ATCC 10314), células de rim canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovário de hamster chinês (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al. Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)) células hipofisárias de ratos (GHl; ATCC CCL82), células 45

HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rato (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) células de rim de macaco transformadas SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) e células embrionárias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).

Para um hospedeiro mamífero, os sinais regulatórios de transcrição e tradução podem ser derivadas de fontes virais de mamíferos, por exemplo, adenovírus, vírus do papiloma bovino, vírus de símios ou similares, em que os sinais regulatórios estão associados a um gene particular que tem um alto nível de expressão. Sequências regulatórias de transcrição e tradução também podem ser obtidos a partir de genes de mamíferos, por exemplo, actina, colagénio, miosina, e genes de metalotioneína.

Sequências regulatórias de transcrição incluem uma região promotora suficiente para direccionar o início da síntese de ARN. Os promotores eucarióticos adequados incluem o promotor do gene do rato metalotioneína I (Hamer et al. J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), o promotor TK do vírus do herpes (McKnight, Cell 31:355 (1982)), o promotor precoce SV40 (Benoist et al. Nature 290:304 (1981)), o promotor do vírus do sarcoma Rous (Gorman et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 79:6777 (1982o), o promotor de citomegalovírus (Foecking et al. Gene 45:101 (1980)), e promotor do vírus do tumor mamário do rato (ver, em geral, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", em Protein Engineering: Principies and Practice: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

Alterntivamente, um promotor procariótico, como o promotor de polimerase do bacteriófago ARN T3, pode ser usado para controlar gene de expressão IL-22RA em células de mamíferos se o promotor procariótico é regulado por um promotor eucariótico (Zhou et al. Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990) , e Kaufman et al. Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991) ) . 46

Em certas modalidades, uma sequência de ADN que codifica um receptor solúvel de polipeptideo IL-22RA, ou um fragmento de polipeptideo IL-22RA é operacionalmente ligado a outros elementos genéticos necessários para a sua expressão, em geral, incluindo um promotor de transcrição e um terminador, dentro de um vector de expressão. 0 vector também normalmente contêm um ou mais marcadores de selecção e uma ou mais origens de replicação, embora os peritos na técnica reconhecerão que dentro de certos sistemas os marcadores de selecção podem ser fornecidos em vectores separados, e replicação do exógeno. 0 ADN pode ser fornecido através da integração no genoma da célula hospedeira. A selecção dos promotores, terminadores, marcadores de selecção, vectores e outros elementos é uma questão de concepção de rotina dentro do nível de um perito na técnica. Muitos destes elementos são descritos na literatura e estão disponíveis através de fornecedores comerciais. Vários componentes de um complexo de receptor solúvel podem ser co-transfectados em vectores de expressão individuais ou estar contidos num vector de expressão único. Tais técnicas de expressar múltiplos componentes de complexos protéicos são bem conhecidas na técnica.

Um vetor de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira usando uma variedade de técnicas usuais, incluindo transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por lipossomas, entrega mediada por microprojéctil, electroporação, e assim por diante. As células transfectadas podem ser seleccionadas e propagadas para fornecer células hospedeiras recombinantes que compõem o vector de expressão estavelmente integrado no genoma da célula hospedeira. Técnicas para a introdução de vectores em células eucarióticas e técnicas para a selecção desses transformantes estáveis através de um marcador dominante seleccionável são descritas, por exemplo, em Ausubel (1995) e em Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991).

Por exemplo, um marcador seleccionável adequado é um gene que confere resistência ao antibiótico neomicina. Neste 47 caso, a selecção é realizada na presença de um medicamento do tipo neomicina, tal como o G-418 ou similar. Também podem ser usados sistemas de selecção para aumentar o nivel de expressão do gene de interesse, um processo conhecido como "amplificação". A amplificação é realizada através da cultura de transfectantes na presença de um baixo nivel do agente selectivo e, em seguida, aumentando a quantidade do agente selectivo para seleccionar as células que produzem altos níveis de produtos dos genes introduzidos. Um marcador seleccionável amplificável adequado é o diidrofolato redutase (DHFR), que confere resistência ao metotrexato. Outros genes resistentes a medicamentos (por exemplo, resistência à higromicina, resistência a múltiplos medicamentos, acetiltransferase puromicina) também podem ser usados. Como alternativa, os marcadores que apresentam um fenótipo alterado, tal como a proteína verde fluorescente, ou proteínas da superfície celular como CD4, CD8, MHC Classe I, fosfatase alcalina placentária podem ser usados para classificar as células transfectadas de células não transfectadas, por meio de triagem FACS ou tecnologia de separação de contas magnéticas.

Os polipeptídeos IL-22RA também podem ser produzidos por cultura de células de mamíferos utilizando um sistema de entrega virai. Exemplos de vírus para esse fim incluem adenovírus, retrovírus, herpesvírus, vírus vaccinia e vírus adeno-associado (AAV). 0 adenovírus, um vírus de ADN de dupla fita, é, actualmente o vector de transferência de genes mais estudado para a entrega de ácido nucleico heterólogo (para uma revisão, ver Becker et al. Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), e Douglas e Curiel, Science & Medicine 04:44 (1997)). Vantagens do sistema adenovírus incluem o alojamento de inserções de ADN relativamente grandes, a capacidade de fazer crescer para um título alto, a capacidade de infectar uma ampla variedade de tipos de células de mamíferos, e uma flexibilidade que permite o uso com um grande número de vectores disponíveis contendo diferentes promotores. 48

Ao suprimir partes do genoma do adenovirus, as grandes inserções (até 7 kb) de ADN heterólogo podem ser acomodadas. Essas inserções podem ser incorporadas ao ADN virai por ligação directa ou por recombinação homóloga com um plasmideo co-transfectado. Uma opção é excluir o gene EI essencial do vector virai, o que resulta na incapacidade de replicar a menos que o gene EI seja fornecido pela célula hospedeira. Por exemplo, 293 células de vectores infectados de adenovirus humano (ATCC n°s CRL-1573, 45504, 45505), podem ser cultivadas como células aderentes ou em cultura de suspensão de densidade relativamente alta de células para produzir quantidades significativas de proteínas (ver Garnier et al. Cytotechnol. 15:145 (1994)). IL-22RA também pode ser expresso em outras células eucarióticas superiores, tais como aves, fungos, insectos, leveduras ou células vegetais. O sistema de baculovirus fornece um meio eficiente para introduzir genes clonados 22RA-IL em células de insectos. Vectores de expressão adequados são baseados no vírus da poliedrose nuclear múltipla Autographa californica (AcMNPV), e contém os promotores bem conhecidos, tais como o promotor de proteínas de choque térmico Drosophila (hsp) 70, gene promotor do vírus da poliedrose nuclear imediata Autographa californica (ie-1) e o promotor de início adiado 39K, promotor baculovirus plO, e do promotor Drosophila metalotioneina Um segundo método de fazer baculovirus recombinantes utiliza um sistema baseado em transposons descrito por Luckow (Luckow, et al. Virol J. 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferência, é vendido no kit BAC-to-BAC (Life

Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza um vector de transferência, PFASTBAC (Life Technologies), contendo um transposon Tn7 para mover o ADN que codifica o polipeptídeo IL-22RA num genoma de baculovirus mantido em E. coli como um grande plasmideo chamado "bacmid". Ver, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990),

Bonning, et al. J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), e

Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995).

Além disso, os vectores de transferência podem incluir uma fusão com ADN codificando uma marca epítopo no terminal C ou N do polipeptídeo expressando IL-22RA, por exemplo, uma 49 marca epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al. Proc. Nat'1 Acad. Sei. 82:7952 (1985)). Usando uma técnica conhecida, um vector de transferência contendo um gene IL-22RA é transformado em E. coli, e seleccionado para baemids que contêm um gene lacZ interrompido indicativo de um baculovirus recombinante. 0 ADN baemid contendo o genoma do baculovirus recombinante é então isolado utilizando técnicas comuns. 0 vector pFastBac ilustrativo pode ser modificado num grau considerável. Por exemplo, o promotor polihedrin pode ser removido e substituído com o promotor de proteína básica baculovirus (também conhecido como Pcor, p6.9 ou promotor MP), que é expresso no início da infecção do baculovirus, e tem se mostrado vantajoso para expressar proteínas secretadas (ver, por exemplo, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al. J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Em tais construções de vectores de transferência, uma versão curta ou longa do promotor da proteína básica pode ser usada. Além disso, os vectores de transferência podem ser construídos, que substitui as sequências de sinal de secreção de IL-22RA nativo com sequências de sinal de secreção derivadas de proteínas de insectos. Por exemplo, uma sequência de sinal de secreção de eedisteróide glicosiltransferase (EGT), melitina do mel de abelha (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) , ou baculovirus gp67 (PharMingen: San Diego, CA) podem ser usadas em construções para substituir a sequência de sinal secretora de IL-22RA nativo. O vírus recombinante ou baemid é usado para transfecção das células hospedeiras. Células hospedeiras do insecto adequadas incluem linhas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, a linha celular de ovário de pupa Spodoptera frugiperda, como Sf 9 (ATCC CRL 1711), Sf 21AE, e Sf21 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), como bem como as células Drosophila Schneider-2, e a linhagem celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente US n° 5300435) . Podem ser usados meios livres de soro 50 comercialmente disponíveis para fazer crescer e manter as células. Os meios adequados são Sf900ll™ (Life

Technologies) e FSE 921™ (Expression Systems) para as células Sf9; e Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ou Express FiveO™ (Life Technologies) para as células T. ni. Quando o vírus recombinante é usado, as células são normalmente cultivadas a partir de uma densidade de inoculação de aproximadamente 2-5 x 105 células com uma densidade de 1-2 x 106 células no momento em que um recombinante virai armazenado é adicionado a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 a 10, mais geralmente perto de 3.

As técnicas já estabelecidas para a produção de proteínas recombinantes em sistemas de baculovírus são fornecidos por Bailey et al. "Manipulation of Baculovírus Vectors", em Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991 ), por Patel et al. "The baculovírus expression system," em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) nas páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovírus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), e por Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", em Protein Enginnering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) .

As células fúngicas, incluindo as células de levedura, também podem ser usadas para expressar os genes descritos. Espécies de leveduras de interesse particular, neste domínio, incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Promotores apropriados para expressão em levedura incluem promotores GAL1 (galactose), PGK (fosfoglicerato quinase), ADH (álcool desidrogenase), AOX1 (álcool oxidase), HIS4 (histidinol desidrogenase), e assim por diante. Muitos vectores de clonagem de levedura foram concebidos e estão prontamente disponíveis. Estes vectores incluem vectores baseados em Yip, tais como YIp5, vectores 51 YRp, tais como YRpl7, vectores YEp tais como YEpl3 e vectores YCp, como YCpl9. Métodos para transformar células S. cerevisiae com ADN exógeno e dai produzir polipeptideos recombinantes são divulgados, por exemplo, em Kawasaki, Patente US 4599311, Kawasaki et al., Patente US 4931373, Brake, Patente US 4870008, Welch et al., Patente US 5037743, e Murray et al., Patente US 4845075. As células transformadas são seleccionadas por fenótipo determinado pelo marcador de selecção, geralmente a resistência a medicamentos ou a capacidade de crescer na ausência de um nutriente especifico (por exemplo, leucina) . Um sistema de vector adequado para uso em Saccharomyces cerevisiae é o sistema de vector POT1 divulgado por Kawasaki et al. (Patente US 4931373), que permite que as células transformadas serem seleccionadas pelo crescimento em meios contendo glicose. Promotores e terminadores adicionais adequados para uso em levedura incluem os genes de enzimas glicoliticas (ver, por exemplo, Kawasaki, Patente US 4599311, Kingsman et al., Patente US 4615974 e Bitter, Patente US 4977092) e genes de álcool desidrogenase. Ver também as Patentes US 4990446, 5063154, 5139936 e 4661454.

Sistemas de transformação de outras leveduras, incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gleeson et al. J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986), e Cregg, Patente US 4882279. Células de Aspergillus podem ser utilizadas de acordo com os métodos de McKnight et al., Patente US 4935349. Métodos para transformar Acremonium chrysogenum são divulgados por Sumino et al., Patente US 5162228. Métodos para transformar Neurospora são divulgados por Lambowitz, Patente US 4486533.

Por exemplo, o uso de methanolica Pichia como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é divulgado por Raymond, Patente US 5716808, Raymond, Patente US 5736383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998), e nas publicações 52 internacionais WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 e WO 98/02565. Moléculas de ADN para uso na transformação de P. methanolica serão comummente preparadas como plasmideos circulares de dupla fita, que são de preferência lunearizados antes da transformação. Para a produção de polipeptideo em P. methanolica, o promotor e o terminador no plasmideo pode ser a de um gene P. methanolica, como um gene utilização de álcool P. methanolica (AUG1 ou AUG2). Outros promotores úteis incluem os genes da sintase dihidroxiacetona (DHAS), formato desidrogenase (FMD) e catalase (CAT). Para facilitar a integração do ADN no cromossomo hospedeiro, é preferível ter o segmento de expressão inteiro do plasmideo em ambas as extremidades ladeadas por sequências de ADN do hospedeiro. Um marcador seleccionável adequado para uso em Pichia methanolica é um gene P. methanolica ADE2, que codifica fosforibosil-5-aminoimidazol carboxilase (AIRC; CE 4.1.1.21), e que permite às células hospedeiras ade2 crescer na ausência de adenina. Para grande escala, processos industriais onde é desejável minimizar a utilização do metanol, as células hospedeiras podem ser usadas em que ambos os genes de utilização de metanol (AUG1 e AUG2) são suprimidos. Para a produção de proteínas secretadas, as células hospedeiras podem ser deficientes em genes de protease vacuolar (PEP4 e PRB1). A electroporação é usada para facilitar a introdução de um plasmideo contendo ADN que codifica um polipeptideo de interesse em células P. methanolica. As células P. methanolica podem ser transformadas por electroporação usando um campo eléctrico pulsante decadente exponencial, tendo um campo de força de 2,5 a 4,5 kV/cm, de preferência cerca de 3,75 kV/cm e uma constante de tempo (t) de 1 a 40 milissegundos, mais preferencialmente de cerca de 20 milissegundos.

Os vectores de expressão também podem ser introduzidos em protoplastos de plantas, tecidos intactos de plantas, ou células isoladas de plantas. Métodos para a introdução de vectores de expressão em tecidos vegetais incluem a infecção directa ou co-cultivo de tecidos vegetais com Agrobacterium tumefaciens, entrega microprojéctil mediada, injecção de ADN, electroporação, e assim por diante. Ver, por exemplo, Horsch et al. Science 227:1229 (1985), Klein 53 et al. Biotechnology 10:268 (1992), e Miki et al. "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).

Alternativamente, os genes IL-22RA podem ser expressos em células hospedeiras procarióticas. Promotores apropriados que podem ser usados para expressar polipeptideos IL-22RA em hospedeiros procarióticos são bem conhecidos dos peritos na técnica e incluem promotores capazes de reconhecer as polimerases T4, T3, Sp6 e T7, os promotores do bacteriófago lambda PR e PL, os promotores trp,recA, choque térmico, lacUV5, tac, Ipp-lacSpr, phoA e lacZ de E. coli, os promotores de B. subtilis, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, o promotor de int do bacteriófago lambda, o promotor bla de pBR322, e o promotor CAT do gene acetil transferase cloranfenicol. Os promotores procarióticos foram revistos por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a ed. (Benjamin Cummins 1987), e por Ausubel et al. (1995).

Hospedeiros procarióticos adequados incluem E. coli e Bacillus subtilus. Estirpes adequadas de E. coli incluem BL21 (DE3), BL21 (DE3)pLysS, BL21 (DE3) pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 e ER1647 (ver, por exemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)) . As estirpes apropriadas de Bacillus subtilus incluem BR151, YB886, MI119, MI120 e B170 (ver, por exemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", em DNA Cloning: A Praticai Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).

Ao expressar um polipeptideo IL-22RA em bactérias como o E. coli, o polipeptideo pode ser mantido no citoplasma, geralmente na forma de grânulos insolúveis, ou pode ser direccionado para o espaço periplásmico por uma sequência 54 de secreção bacteriana. No primeiro caso, as células são lisadas, e os grânulos são recuperados e desnaturados, utilizando, por exemplo, o isotiocianato de guanidina ou ureia. 0 polipeptideo desnaturado pode ser reaberto e dimerizado diluindo o desnaturante, como por diálise contra uma solução de ureia e uma combinação de glutationa reduzida e oxidada, seguido por diálise contra uma solução salina. Neste último caso, o polipeptideo pode ser recuperado a partir do espaço periplásmico numa forma solúvel e funcional pelo rompimento das células (como, por exemplo, ultra-som ou um choque osmótico) para libertar o conteúdo do espaço periplásmico e recuperar a proteína, suprimindo assim a necessidade de desnaturação e renaturação. Métodos para a expressão de proteínas em hospedeiros procarióticos são bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Williams et al. "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectores and purification of specific polygonal antibodies," em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al. "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), e Georgiou, "Expression of Proteins in Bactéria," em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), página 101 (John

Wiley & Sons, Inc. 1996)). Métodos padrão para a introdução de vectores de expressão em bactérias, leveduras, insectos e células vegetais são fornecidos, por exemplo, por Ausubel (1995). Métodos gerais de expressão e de recuperação de proteína estranha produzida por um sistema de células de mamíferos são fornecidos, por exemplo, por Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et 55 al. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Técnicas padrão de recuperação de proteina produzida por um sistema bacteriano são fornecidas, por exemplo, por Grisshammer et al. "Purification of overproduced proteins from E. coli cells", em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Métodos estabelecidos para isolar proteínas recombinantes de um sistema de baculovírus são descritos por Richardson (ed.), Baculovírus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).

Como alternativa, os polipeptídeos podem ser sintetizados por síntese exclusiva em fase sólida, métodos de fase sólida parcial, condensação do fragmento ou síntese de solução clássica. Estes métodos de síntese são bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al. "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer e Rapp, Chem. Pept. Prot. 03:03 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Praticai Approach (IRL Press 1989), Fields e Colowick ", "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), e Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). As variações nas estratégias de síntese total de produtos químicos, tais como "ligação química nativa" e "ligação de proteína expressa" também são padrão (ver, por exemplo, Dawson et al. Science 266:776 (1994), Hackeng et al. Proc. Nat'l

Acad. Sei. USA. 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir et al, Proc. Nat'l Acad Sei. USA 95:6705 (1998), e Severinov e Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)).

Os peptídeos e polipeptídeos aqui descritos, contém pelo menos, seis, pelo menos, nove, ou pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 3. Como ilustração, os polipeptídeos podem incluir, pelo menos, seis, pelo menos, nove, ou pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos da de SEQ ID NO: 3. Dentro de algumas modalidades, os 56 polipeptídeos compreendem 20, 30, 40, 50, 100 ou mais resíduos contíguos dessas sequências de aminoácidos.

Moléculas de ácido nucléico codificando tais peptídeos e polipeptídeos são úteis como iniciadores de reacção em cadeia da polimerase e sondas.

Além disso, os polipeptídeos IL-22RA e seus fragmentos podem ser expressos como monómeros, homodímeros, heterodímeros, ou multímeros dentro de células eucarióticas maiores. Essas células podem ser usadas para produzir receptor de polipeptídeos IL-22RA monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos e multiméricos que compreendem pelo menos um polipeptídeo IL-22RA ("compreendendo receptores E-22RA" ou " compreendendo receptores de polipeptídeos IL-22RA "), ou que podem ser usados como teste em sistemas de células de triagem. Dentro de um aspecto, um polipeptídeo que compreende o domínio extracelular de IL-22RA é produzido por células cultivadas, e a célula é usada para triagem de ligantes para o receptor, incluindo o ligante natural, IL-22, bem como agonistas e antagonistas do ligante natural. Para resumir essa abordagem, um cADN ou gene que codifica o receptor é combinado com outros elementos genéticos necessários para a sua expressão (eg., um promotor de transcrição), e o vector de expressão resultante é inserido numa célula hospedeira. Células que expressam o ADN e produzem receptores funcionais são seleccionadas e utilizadas numa variedade de sistemas de triagem. Cada componente do receptor complexo monomérico, homodimérico heterodimérico e multimérico pode ser expresso na mesma célula. Além disso, os componentes do receptor complexo monomérico, homodimérico, heterodimérico e multimérico também podem ser fundidos a um domínio transmembrana ou outra fracção de membranas de fusão que permitem a montagem complexa e triagem de transfectantes como descrito acima.

Para teste os antagonistas de polipeptídeos 11-20 e IL-22 e anticorpos, células de mamíferos adequadas para uso na expressão de IL-22RA, compreendendo os receptores ou outros receptores conhecidos para ligar por exemplo, IL-20 ou IL- 57 22 (e.g. células expressando IL-22RA/CRF2-4; e E-20RA, IL-20RB, IL-22RA/IL-20RB ou IL-20RA/IL-20RB) e fazendo a transdução de sinal mediada por receptores incluindo as células que expressam outras subunidades do receptor que pode formar um complexo funcional com IL-22RA (ou IL-20RA). Essas subunidades podem incluir aqueles da família dos receptores de interferão ou de outros receptores de citocinas da classe II ou classe I, por exemplo, CRF2-4 (Genbank Adesão n° Z17227), IL-10R (Genbank Adesão n°s U00672 e NM_001558), IL- 22RA (geralmente da propriedade da Patente US 5965704), zcytor7 (IL-20RA) (propriedade comum da Patente US 5945511), IL-20RA/IL-20RB (Publicação OMPI WO 01/46232), e IL-9R. Também é preferível usar uma célula da mesma espécie que o receptor para ser expressa. Dentro de uma modalidade preferida, a célula é dependente de um factor de crescimento hematopoiético exógeno para a sua proliferação. Linhagens celulares preferidas deste tipo são a linha celular TF-1 humana (ATCC número CRL-2003) e a linha de células AML-193 (ATCC número CRL-9589), que são linhas de células leucémicas dependentes GM-CSF e BaF3 (Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985)) que é uma linhagem celular dependente murina pré-B IL-3. Outras linhagens de células incluem BHK, células COS-1 e CHO. Células hospedeiras adequadas podem ser projectadas para produzir as subunidades do receptor necessárias ou outro componente celular necessário para a resposta celular desejada. Essa abordagem é vantajosa, porque as linhas de células podem ser projectadas para expressar as subunidades do receptor de qualquer espécie, e, assim, superar as limitações potenciais decorrentes da especificidade das espécies. Espécies ortólogas do do receptor de cADN humano podem ser clonadas e usadas dentro das linhas de células da mesma espécie, tais como cADN do rato na linha celular BaF3. As linhas celulares que dependem de um factor de crescimento hematopoético, como o GM-CSF e IL-3, podem assim ser projectadas para se tornarem dependentes de outra citocina que actua através do receptor IL-22RA, tais como IL-22. Células que expressam receptores funcionais são utilizadas dentro de testes de rastreio. Uma grande variedade de testes adequados é conhecida na técnica. Estes ensaios são 58 baseados na detecção de uma resposta biológica numa célula-alvo. Tal ensaio é um ensaio de proliferação celular. As células são cultivadas na presença ou ausência de um composto de teste e a proliferação celular é detectada, por exemplo, por medição da incorporação de timidina tritiada ou ensaio colorimétrico baseado na degradação metabólica de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, (1983)). Um formato de ensaio alternativo usa células que são depois projectadas para expressar um gene repórter. 0 gene repórter está ligado a um elemento promotor que é sensivel à via receptor ligado, e o ensaio detecta a activação da transcrição do gene repórter. Um elemento promotor preferido neste contexto é um elemento de resposta do soro, ou SRE. Ver, por exemplo, Shaw et al. Cell 56:563-572, (1989). Um gene repórter preferido é um gene da luciferase (de Wet et al. Mol. Cell. Biol. 7:725, (1987)). A expressão do gene da luciferase é detectada por luminescência usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Baumgartner et al. J. Biol. Chem. 269:29094-29101, (1994); Schenborn e Goiffin, Promega_Notes. 41:11, 1993). Kits de ensaio da actividade da luciferase estão comercialmente disponíveis, por exemplo, em Promega Corp, Madison, WI. Linhagens de células-alvo deste tipo podem ser usadas para seleccionar bibliotecas de produtos quimicos, meios de cultura celular condicionados, caldos de fungos, amostras de solo, amostras de água, e assim por diante. Por exemplo, um banco de meios de amostras de células condicionadas pode ser analisado numa célula-alvo para identificar as células que produzem ligante. As células positivas são então usadas para produzir uma biblioteca de cADN num vector de expressão de mamífero, que está dividido em lotes, transfectado em células hospedeiras, e expressa. Meios de amostras das células transfectadas são então analisados, com posterior divisão em lotes, re-transfecção, subcultura e re-teste de células positivas para isolamento de um cADN clonado codificando o ligante. Várias linhagens de células sensíveis IL-20 são conhecidas na técnica, ou podem ser construídas, por exemplo, a linha celular Baf3/DIRSl/cytoRll (Publicação OMPI WO 02/072607). 59

Além disso, várias linhagens de células sensíveis IL-22 são conhecidas (Dumontier et al. Immunol J. 164:1814-1819, 2000; Dumoutier, L et al., Proc. Nat'1. Acad. Sei. 97:10144-10149, 2000; Xie MH et al. J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; Kotenko SV et al. J. Biol. Chem. 276:2725-2732, 2001), bem como aqueles que expressam a subunidade IL-22RA do receptor IL-22. Por exemplo, as células seguintes são de resposta a IL-22: TK-10 (Xie MH et al. Supra.) (carcinoma renal humano); SW480 (ATCC n° CCL-228) (adenocarcinoma do cólon humano); HepG2 (ATCC n° HB-8065) (hepatoma humano); PC12 (ATCC n° CRL-1721) (modelo murino celular neuronal); (feocromocitoma de rato); e MES13 (ATCC n° CRL-1927) (linhagem celular mesangial do rim de murinos). Além disso, algumas linhas de células expressam IL-22RA (receptor IL-22) também são candidatas para as linhas de células sensíveis a IL-22: A549 (ATCC n° CCL-185) (carcinoma do pulmão humano), G-361 (ATCC n° CRL-1424) (melanoma humano) e Caki-1 (ATCC n° HTB-46) (carcinoma renal humano). Além disso, as linhas de células sensíveis a IL-22- podem ser construídas, por exemplo, a linha celular Baf3/cytoRll/CRF2-4 aqui descrita (Publicação OMPI WO 02/12345) . Estas células podem ser usadas em testes para avaliar a funcionalidade de IL-22RA como IL-20 ou antagonista de IL-22 ou factor anti-inflamatório.

Uma abordagem de rastreio adicional aqui descrita inclui a utilização de polipeptídeos de receptor híbrido. Estes polipeptídeos híbridos caem em duas classes gerais. Dentro da primeira classe, o domínio intracelular IL-22RA, está associado ao domínio de ligação do ligante de um segundo receptor. A segunda classe de polipeptídeos de receptor híbrido compreende o domínio (ligação do ligante) extracelular de IL-22RA (SEQ ID NO: 3) com um domínio intracelular de um segundo receptor, de preferência um receptor de citocinas hematopoiéticas, e um domínio transmembrana. Receptores monómeros híbridos IL-22RA, homodímeros, heterodímeros e multímeros desta segunda classe são expressos em células conhecidas por serem capazes de responder aos sinais transducidos pelo segundo receptor. Juntas, essas duas classes de receptores híbridos permitem a identificação de um tipo de célula sensível para o desenvolvimento de um ensaio para a 60 detecção de IL-22 ou IL-20. Além disso, essas células podem ser utilizadas na presença de IL-22 ou IL-20 para ensaio de antagonistas do receptor solúvel num ensaio de tipo de competição. Em tal ensaio, uma diminuição na proliferação ou actividade de transdução de sinal de IL-22 ou IL-20 na presença de um receptor solúvel da presente invenção demonstra actividade antagónica. Além disso o receptor solúvel IL-22RA em ensaios de ligação, ensaios baseados em células, podem também ser usados para avaliar se um receptor solúvel liga, bloqueia, inibe, reduz antagoniza ou neutraliza a actividade de IL-22 ou IL-20. 6. Produção de Proteínas de Fusão 22RA-IL e Conjugados

Uma classe geral de análogos de IL-22RA são variantes tendo uma sequência de aminoácidos que é uma mutação da sequência de aminoácidos aqui divulgada. Outra classe geral de análogos IL-22RA é fornecida por meio de anticorpos anti-idiotipo, e fragmentos dos mesmos, conforme descrito abaixo. Além disso, anticorpos recombinantes compreendendo domínios variáveis anti-idiotipo podem ser utilizados como análogos (ver, por exemplo, Monfardini et al. Proc. Assoe. Am. Physicians 108:420 (1996)). Uma vez que os domínios variáveis de anticorpos anti-idiotipo IL-22RA imitam IL-22RA, esses domínios podem fornecer actividade de ligação de IL-22RA. Métodos de produção de anticorpos catalíticos anti-idiotípicos são conhecidos pelos peritos na técnica (ver, por exemplo, Joron et al. Ann. NY Acad. Sei. 672:216 (1992), Friboulet et al. Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994), e Avalie et al. Ann. NY Acad. Sei. 864:118 (1998)).

Outra abordagem para identificação de análogos IL-22RA é fornecida pelo uso de bibliotecas combinatórias. Métodos para construção e selecção de macrófagos e outras bibliotecas combinatórias são fornecidos, por exemplo, por Kay et al. Phage Display of Peptides and Proteins (Academic 61

Press 1996), Verdine, Patente US 5783384, Kay, et. al. Patent US 5747334 e Kauffman et al., Patent US 5723323.

Polipeptídeos IL-22RA têm utilizações tanto in vivo como in vitro. Como ilustração, uma forma solúvel de IL-22RA pode ser adicionada ao meio de cultura de células para inibir os efeitos do ligante IL-22RA produzido pelas células em cultura.

Proteínas de fusão de IL-22RA podem ser usadas para expressar IL-22RA num hospedeiro recombinante, e isolar o IL-22RA produzido. Conforme descrito abaixo, proteínas de fusão IL-22RA particulares também tem uso no diagnóstico e terapêutica. Um tipo de proteína de fusão compreende um peptídeo que orienta um polipeptídeo IL-22RA a partir de uma célula hospedeira recombinante. Para dirigir um polipeptídeo IL-22RA na via secretória de uma célula hospedeira eucariótica, é fornecida uma sequência de sinais de secreção (também conhecido como um peptídeo de sinal), uma sequência líder uma sequência prepro ou uma sequência pré no vector de expressão 22RA-IL. Embora a sequência de sinal de secreção possa ser derivada de IL-22RA, uma sequência de sinal adequada também pode ser derivada de uma outra proteína secretada ou sintetizadas de novo. A sequência de sinal de secreção é operacionalmente ligada a uma sequência de IL-22RA de codificação de tal forma que as duas sequências estão unidas no quadro de leitura correcto e posicionadas para dirigir o polipeptídeo recém sintetizado na via secretora da célula hospedeira. Sequências de sinais secretoras são comummente posicionadas 5' para a sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídio de interesse, apesar de certas sequências de sinais de secreção poderem ser posicionadas em outro lugar na sequência de nucleótidos de interesse (ver, por exemplo, Welch et al. Patente US 5037743; Holland et al. Patente US 5143830) . 62

Embora a sequência de sinal de secreção de IL-22RA ou outra proteina produzida por células de mamíferos (por exemplo, activador de sequência de sinal de plasminogénio tecidual, como descrito, por exemplo, na Patente US 5641655) é útil para a expressão de IL-22RA em hospedeiros mamíferos recombinantes, uma sequência de sinais de levedura é o preferido para expressão em células de levedura. Exemplos de sequências de sinais de leveduras adequados são aqueles provenientes de α-factor de levedura de feromonas (codificada pelo gene MFal), invertase (codificada pelo gene SUC2), ou fosfatase ácida (codificada pelo gene PH05). Ver, por exemplo, Romano et al. "Expression of Cloned Genes in Yeast" em DNA Cloning 2: A Praticai Approach, 2nd Edition, Glover e Hames (eds.), páginas 123-167 (Oxford University Press 1995) . 0 receptor solúvel de polipeptideos IL-22RA pode ser preparado através da expressão de ADN truncado que codifica o domínio extracelular, por exemplo, um polipeptideo que contém a SEQ ID NO: 3, ou a região correspondente de um receptor não-humano. É preferível que os polipeptideos do domínio extracelular sejam preparados numa forma substancialmente isenta de segmentos de polipeptideos transmembrana e intracelulares. Para dirigir a exportação do domínio do receptor da célula hospedeira, o receptor de ADN está ligado a um segundo segmento de ADN que codifica um peptídeo secretor, como um peptídeo secretor t-PA. Para facilitar a purificação do domínio do receptor secretor, uma extensão C-terminal, como uma marca de polihistidina, substância P, peptídeo FLAG™ (Hopp et al. 6:1204-1210 Biotechnology, (1988), disponível em Eastman Kodak Co., New Haven, CT) ou outro polipeptideo ou proteína para a qual um anticorpo ou um agente de ligação específico estão disponíveis, podem ser fundidas para o polipeptideo receptor. Além disso, os epítopos antigénicos IL-22RA do domínio de ligação extracelular de citocinas também são preparados conforme descrito acima.

Numa abordagem alternativa, um domínio extracelular do receptor IL-22RA ou outro componente receptor de citocinas 63 da classe I ou II pode ser expresso como uma fusão com regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina, normalmente um fragmento Fc, que contém dois domínios de região constante e uma região de dobradiça, mas a que falta a região variável (ver Sledziewski, AZ et al., Patentes US 6018026 e 5750375) . Os polipeptídeos solúveis IL-22RA aqui descritos incluem tais fusões. Uma tal fusão é mostrada na SEQ ID NO: 4. Essas fusões geralmente são secretadas como moléculas multiméricas onde as porções Fc são ligadas por dissulfeto umas às outras e dois receptores de polipeptídeos estão dispostos na proximidade um do outro. Fusões desse tipo podem ser usadas para purificar a afinidade ligante cognato da solução, como uma ferramenta no ensaio in vitro, para bloquear, inibir ou reduzir os sinais in vitro por titulação específica para fora do ligante, e como antagonistas in vivo pela administração parenteral para ligar a circulação ligante e limpá-la da circulação. Para purificar o ligante, uma quimera IL-22RA-Ig é adicionada a uma amostra contendo o ligante (por exemplo, extratos de meios de cultura celular condicionada ou tecidos), em condições que facilitem a ligação do receptor e do ligante (tipicamente a uma temperatura quase fisiológica, pH, e força iónica). O complexo quimera-ligante é então separado por uma mistura com proteínas A, que é imobilizada num suporte sólido (por exemplo, contas de resina insolúvel). O ligante é, então, eluído utilizando técnicas químicas convencionais, como com um sal ou um gradiente de pH. Em alternativa, a quimera, por si só pode ser ligada a um suporte sólido, com ligação e eluição realizada como descrito acima. As quimeras podem ser usadas in vivo para regular respostas inflamatórias, incluindo as respostas de fase aguda, tais como soro amilóide A (SAA), proteína C-reactiva (CRP), e assim por diante. Quimeras com alta afinidade de ligação são administradas por via parenteral (por exemplo, injecção intramuscular, subcutânea ou intravenosa). Moléculas circulantes ligam o ligante e são eliminadas da circulação por processos fisiológicos normais. Para utilização em ensaios, as quimeras são ligadas a um suporte através da região Fc e utilizadas num formato ELISA. 64

Para ajudar a isolar os parceiros anti-IL-22RA e de ligação, um sistema de análise que utiliza um receptor ligante de ligação (ou um anticorpo, um membro de um par complemento/anti-complemento) ou um fragmento de ligação dos mesmos, e um instrumento biosensor comercialmente disponível (Biacore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) , podem ser vantajosamente empregues. Esses receptores, anticorpos, membros de um par complemento/anti-complemento ou fragmento são imobilizados na superfície de um circuito receptor. A utilização deste instrumento é divulgada em Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 e Cunningham e Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Um receptor, anticorpo, membro ou fragmento é ligado covalentemente, usando química amina ou sulfidrila, para fibras de dextrana que acompanham a película de ouro dentro do fluxo da célula. A amostra é passada através da célula. Se um ligante, epítopo ou membro oposto do par complemento/anti-complemento está presente na amostra, que irá ligar ao receptor imobilizado, anticorpo ou membro, respectivamente, causando uma mudança no índice de refracção do meio, que é detectada como uma alteração na superfície de ressonância de plasmon da película de ouro. Este sistema permite a determinação de taxas de ligado-desligado, a partir do qual a afinidade de ligação pode ser calculada, e avaliação da estequiometria da ligação. Alternativamente, o receptor de ligação do ligante pode ser analisado usando SELDI (TM) (Ciphergen, Inc., Paio Alto, CA) . Além disso, a tecnologia Biacore, acima descrita, pode ser usada para ser utilizada em experiências de competição para determinar se anticorpos monoclonais diferentes se ligam aos mesmos epítopos ou a diferentes do polipeptídeo IL-22RA e, como tal, ser utilizados para auxiliar no mapeamento de epítopos de anticorpos neutralizantes da presente invenção que ligam, bloqueiam, inibem, reduzem antagonizam ou neutralizam IL-22 ou IL-20 e IL-22.

Polipeptídeos de receptor ligante de ligação também podem ser usados dentro de outros sistemas de teste conhecidos na técnica. Esses sistemas incluem análise Scatchard para determinação da afinidade de ligação (ver Scatchard, Ann. NY Acad Sei. 51: 660-72, 1949) e ensaios de calorimetria 65 (Cunningham et al. Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al. Science 245:821-25, 1991). A presente descrição descreve uma variedade de outras fusões de polipeptideos e proteínas multiméricas relacionadas compreendendo um ou mais polipeptideos de fusão. Por exemplo, um receptor solúvel IL-22RA pode ser preparado como uma fusão de uma proteína dimerizada conforme divulgado nas Patentes US 5155027 e 5567584. Proteínas dimerizadas preferidas, neste domínio, incluem os domínios de região constante devimunoglobulina, por exemplo, IgGYl, e a cadeia leve κ humana. Imunoglobulina solúvel em fusões IL-22RA pode ser expressa em células geneticamente modificadas para produzir uma variedade de receptores análogos multiméricos de IL-22RA. Domínios auxiliares podem ser fundidos para o receptor de IL-22RA solúvel para os orientar em células específicas, tecidos ou macromoléculas (por exemplo, colagénio, células que expressam os ligantes IL-22RA, IL-22 ou IL-20) . Um polipeptídeo IL-22RA pode ser fundido para duas ou mais metades, como uma marca de afinidade para purificação e um domínio alvo. As fusões de polipeptideos também podem incluir um ou mais sítios de clivagem, principalmente entre os domínios. Ver, Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996.

Em células bacterianas, muitas vezes é desejável para expressar uma proteína heteróloga como uma proteína de fusão reduzir a toxicidade, aumentar a estabilidade e aumentar a recuperação da proteína expressa. Por exemplo, IL-22RA pode ser expressa como uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo de glutationa S-transferase. As proteínas de fusão de glutationa S-transferease são normalmente solúveis e facilmente purificáveis a partir de E. coli lisado em colunas de glutationa imobilizada. Em abordagens semelhantes, uma proteína de fusão IL-22RA compreendendo um polipeptídeo de ligação de proteína de maltose pode ser isolado com uma coluna de resina de amilose, enquanto uma proteína de fusão que compreende uma extremidade C-terminal de um gene de uma proteína A 66 truncada pode ser purificada utilizando IgG-Sefarose. As técnicas já estabelecidas para expressar um polipeptideo heterólogo como uma proteína de fusão numa célula bacteriana são descritas, por exemplo, em Williams et al. "Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies", em DNA Cloning 2: A Praticai Approach, 2nd Edition, Glover e Hames (eds.), páginas 15-58 (Oxford University Press 1995). Além disso, estão comercialmente disponíveis sistemas de expressão. Por exemplo, o sistema de purificação de proteínas PINPOINT Xa (Promega Corporation, Madison, WI) fornece um método para isolar uma proteína de fusão que compreende um polipeptideo que se torna biotinilado durante a expressão com uma resina que compreende avidina.

As marcas de peptídeos que são úteis para isolar polipeptídeos heterólogos expressos tanto por células procarióticas ou eucarióticas incluem marcas de polihistidina (que têm uma afinidade por quelantes de resina de níquel), marcas c-myc, proteína de ligação de calmodulina (isolada por cromatografia de afinidade de calmodulina), substância P, marca RYIRS (que se liga com anticorpos anti-RYIRS), marca Glu-Glu, e marca FLAG (que se liga com anticorpos anti-FLAG). Ver, por exemplo, Luo et al. Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morganti et al. Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996), e Zheng et al. 186:55 Gene (1997). Moléculas de ácido nucléico codificando tais marcas de peptídeos estão disponíveis, por exemplo, em Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO).

Outra forma de proteína de fusão compreende um polipeptideo IL-22RA e uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, normalmente um fragmento Fc, que contém dois ou três domínios de região constante e uma região de dobradiça, mas a que falta a região variável. Como ilustração, Chang et al., Patente US 5723125, descreve uma proteína de fusão compreendendo um interferão humano e um fragmento Fc de imunoglobulina humano. 0 C-terminal do interferão está relacionado com o N-terminal do fragmento 67

Fc por uma metade do ligador do peptídeo. Um exemplo de um ligador de peptídeo é um peptídeo compreendendo basicamente uma sequência inerte de célula T, que é imunologicamente inerte. Um exemplo de ligador de peptídeo tem a sequência de aminoácidos: GGSGG SGGGG SGGGG S (SEQ ID NO: 9). Nesta proteína de fusão, uma metade Fc ilustrativa é uma cadeia γ4 humana, que é estável em solução e tem pouca ou nenhuma actividade complementar de activação. Assim, a presente invenção contempla uma proteína de fusão IL-22RA que compreende uma metade IL-22RA e um fragmento Fc humano, onde o C-terminal da metade IL-22RA está ligado ao N-terminal do fragmento Fc através de um ligador de peptídeo, como um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. A metade IL-22RA pode ser uma molécula IL-22RA ou um fragmento da mesma. Por exemplo, uma proteína de fusão pode incluir o aminoácido de SEQ ID NO: 3, e um fragmento Fc (por ex, um fragmento Fc humano) (SEQ ID NO: 4) .

Em outra variação, uma proteína de fusão IL-22RA compreende uma sequência IgG, uma metade IL-22RA covalentemente ligada à extremidade aminoterminal da sequência IgG, e um peptídeo sinal que é covalentemente ligado ao aminoterminal da metade IL-22RA, onde a sequência IgG é composta pelos seguintes elementos na seguinte ordem: uma região de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Assim, a sequência IgG carece de um domínio CHi. A metade IL-22RA exibe actividade IL-22RA, como aqui descrito, talcomo a capacidade de se ligar com um ligante IL-22RA. Esta abordagem geral para produzir proteínas de fusão que compreendem tanto anticorpos como porções não-anticorpos foi descrita por Larochelle et al., EP 742830 (WO 95/21258) .

Proteínas de fusão compreendendo uma metade IL-22RA e uma metade Fc podem ser usadas, por exemplo, como uma ferramenta de teste in vitro. Por exemplo, a presença de um ligante IL-22RA numa amostra biológica pode ser detectada usando uma proteína de fusão de imunoglobulina IL-22RA, no qual a metade IL-22RA é usada para ligar o ligante, e uma 68 macromolécula, como a proteína A ou anticorpo anti-Fc, é usada para ligar a proteína de fusão a um suporte sólido. Tais sistemas podem ser utilizados para identificar agonistas e antagonistas que interferem com a ligação de um ligante IL-22RA, por exemplo, IL-22 ou IL-20 e IL-22, para o seu receptor.

Outros exemplos de proteínas de fusão de anticorpo incluem polipeptídeos que compõem um domínio de ligação ao antígeno e um fragmento IL-22RA que contém um domínio extracelular IL-22RA. Tais moléculas podem ser usadas para alvejar tecidos específicos para o benefício da actividade de ligação IL-22RA. A presente descrição descreve uma série de outros polipeptídeos de fusão. Por exemplo, parte ou a totalidade de um domínio(s) que confere uma função biológica podem ser trocados entre IL-22RA da presente invenção com o domínio funcionalmente equivalente(s) de outro membro da família de receptores de citocinas. Polipeptídeos de fusão podem ser expressos em células hospedeiras recombinantes para produzir uma variedade de análogos de fusão IL-22RA. Um polipeptídeo IL-22RA pode ser fundido em duas ou mais metades ou domínios, tais como uma marca de afinidade para purificação e um domínio alvo. Polipeptídeos de fusão também podem incluir um ou mais sítios de clivagem, principalmente entre os domínios. Ver, por exemplo, Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1 (1996).

Proteínas de fusão podem ser preparadas por métodos conhecidos pelos peritos na técnica por preparação de cada componente da proteína de fusão e conjugando-os quimicamente. Alternativamente, um polinucleotídeo codificando os componentes da proteína de fusão no quadro de leitura adequada pode ser gerado através de técnicas conhecidas e expresso através dos métodos aqui descritos. Métodos gerais para a clivagem enzimática e química de 69 proteínas de fusão são descritos, por exemplo, em Ausubel (1995), páginas 16-19 para 16-25.

Os domínios de ligação IL-22RA podem ser ainda caracterizados pela análise física da estrutura, como determinado por meio de técnicas como a ressonância magnética nuclear, cristalografia, difracção de electrões ou fotoafinidade, em conjunto com a mutação do sítio de contacto putativo de aminoácidos de agonistas do ligante IL-22RA. Ver, por exemplo, De Vos et al. Science 255:306 (1992), Smith et al. J. Mol. Biol. 224:899 (1992), e

Wlodaver et al. FEBS Lett. 309:59 (1992). A presente descrição descreve composições IL-22RA quimicamente modificadas, no qual um polipeptídeo IL-22RA está relacionado com um polímero. Polipeptídeos IL-22RA ilustrativos são polipeptídeos solúveis a que falta um domínio transmembrana funcional, tais como um polipeptídeo composto de resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Tipicamente, o polímero é solúvel em água de modo que o conjugado IL-22RA não se precipite em meio aquoso, tal como um meio fisiológico. Um exemplo de um polímero adequado é aquele que foi modificado para ter um único grupo reactivo, tal como um éster activo para acilação ou alquilação de um aldeído. Desta forma, o grau de polimerização pode ser controlado. Exemplos de um aldeído reactivo é o polietileno glicol propionaldeído, ou mono-(C10-C1)alcóxi, ou derivados ariloxi (ver, por exemplo, Harris, et al., Patente US 5252714) . O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Além disso, uma mistura de polímeros pode ser usada para produzir conjugados IL-22RA.

Os conjugados IL-22RA utilizado para a terapia podem incluir metades de polímero solúvel em água farmaceuticamente aceitável. Polímeros solúveis em água adequados incluem polietileno glicol (PEG) , monomethoxi-PEG, mono-(C10-Cl alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinil-pirrolidona) PEG, tresil monometoxi PEG, propionaldeído 70 PEG, bis-succinimidil carbonato PEG, homopolímeros de propileno glicol, um co-polímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por ex, glicerol), álcool polivinílico, dextrano, celulose, ou outros polímeros baseados em carboidratos. PEG apropriado pode ter um peso molecular de cerca de 600 a cerca de 60000, incluindo, por exemplo, 5000, 12000, 20000 e 25000. Um conjugado IL-22RA também pode incluir uma mistura de tais polímeros solúveis em água.

Um exemplo de conjugado IL-22RA compreende uma metade IL-22RA e uma metade de óxido polialquilo ligado ao N-terminal da metade IL-22RA. PEG é um óxido polialquilo adequado. Como exemplo, IL-22RA pode ser modificado com PEG, num processo conhecido como "PEGuilação". A PEGuilação de IL-22RA pode ser efectuada por qualquer das reacçóes de PEGuilação conhecidas na técnica (ver, por exemplo, EP 0 154 316, Delgado et al. Criticai Reviews em Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan e Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994), e Francis et al. Int J Hematol 68:1 (1998)). Por exemplo, a PEGuilação pode ser realizada por uma reacção de acilação ou através de uma reacção de alquilação com uma molécula reactiva de polietileno glicol. Numa abordagem alternativa, conjugados IL-22RA são formadas pela condensação de PEG activado, no qual um terminal hidroxi ou um grupo amino de PEG foi substituído por um ligador activado (ver, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente US 5382657). A PEGuilação por acilação normalmente exige reagir um éster activo derivado do PEG com um polipeptídeo IL-22RA. Um exemplo de um éster PEG activado é um PEG esterificado de N-hidroxisuccinimida. Como usado aqui, o termo "acilação" inclui os seguintes tipos de ligações entre IL-22RA e um polímero solúvel em água: amida, carbamato, uretano, e assim por diante. Métodos para a preparação de IL-22RA PEGuilatado por acilação normalmente compreende as etapas de (a) reagir um polipeptídeo IL-22RA com PEG (tal como um éster reactivo de um aldeído derivado de PEG), em condições que permitam a um ou mais grupos PEG anexar-se a IL -22RA, 71 e (b) obtenção do produto de reacção (s) . Geralmente, as condições óptimas da reacção para as reacções de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e os resultados desejados. Por exemplo, a maior proporção de PEG:IL-22RA, quanto maior a percentagem do produto IL-22RA poliPEGuilatado. 0 produto de PEGuilação por acilação é tipicamente um produto IL-22RA poliPEGuilatado, onde os grupos ε-amino da lisina são PEGuilatados através de um grupo de ligação acil. Um exemplo de uma ligação de conexão é uma amida. Normalmente, o resultado IL-22RA será de pelo menos 95% mono-, di ou tri-peguilado, embora algumas espécies com maiores graus de PEGuilação possam ser formadas, dependendo das condições de reacção. As espécies PEGuilatadas podem ser separadas polipeptideos IL-22RA não conjugados utilizando métodos de purificação padrão, tais como a diálise, ultrafiltração, cromatografia de troca iónica cromatografia de afinidade, e assim por diante. A PEGuilação por alquilação envolve geralmente a reacção de um aldeído terminal de derivados de PEG com IL-22RA na presença de um agente redutor. Os grupos PEG podem ser anexados ao polipeptídeo por meio de um grupo CH2-NH.

Além disso, os anticorpos anti-IL-22RA ou fragmentos de anticorpos da presente invenção podem ser PEGuilatados usando métodos da técnica e aqui descritos.

Derivatização via alquilação redutora para produzir um produto monoPEGuilatado aproveita a reactividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários disponíveis para derivatização. Normalmente, a reacção é realizada a um pH que permite tirar partido das diferenças pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e do grupo θ'-amino do N-terminal do resíduo da proteína. Por tal 72 derivatização selectiva, a anexação de um polímero solúvel em água que contém um grupo reactivo talcomo um aldeído, a uma proteína é controlada. A conjugação com o polímero ocorre predominantemente no N-terminal da proteína, sem alteração significativa dos outros grupos reactivos tais como os grupos amino da cadeia lateral de lisina. A presente invenção fornece uma preparação substancialmente homogénea de conjugados monopolímeros de IL-22RA. A alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogénea da molécula de conjugado monopolímero de IL-22RA pode incluir as etapas de: (a) reagir um polipeptídeo IL-22RA com PEG reactivo sob condições de alquilação redutiva a um pH adequado para permitir a modificação selectiva do grupo α-amino no terminal amino de IL-22RA, e (b) a obtenção do produto de reacção (s). 0 agente redutor utilizado para a alquilação redutiva deve ser estável em solução aquosa e capaz de reduzir apenas a base Schiff formada no processo inicial de alquilação redutiva. Agentes de redução ilustrativos incluem o borohidreto de sódio, cianoborohidreto de sódio, borano dimetilamina, trimetilamina borano e borano piridina.

Para uma população substancialmente homogénea de conjugados monopolímero de IL-22RA, as condições de reacção de alquilação redutiva são aquelas que permitem a ligação selectiva da metade de polímero solúvel em água com o N-terminal de IL-22RA. Tais condições de reacção geralmente fornecem para as diferenças pKa entre os grupos amino da lisina e o grupo α-amino no N-terminal. 0 pH também afecta a proporção de polímero para a proteína a ser usado. Em geral, se o pH é mais baixo, maior o excesso de polímero para a proteína será desejado, pois menos reactivo é o a-grupo N-terminal, e mais necessário é o polímero para alcançar as condições ideais. Se o pH é mais elevado, o polímero IL-22RA necessário não precisa ser tão grande, porque mais grupos reactivos estão disponíveis. Normalmente, o pH vai cair dentro do intervalo de 3 a 9, ou 3 a6. Este método pode ser empregue para a feitura de IL- 73 22RA, compreendendo conjugados de receptor solúvel homodiméricos, heterodiméricos ou multiméricos.

Outro factor a considerar é o peso molecular do polímero solúvel em água. Geralmente, quanto maior o peso molecular do polímero, menor o número de moléculas de polímero que podem ser associadas à proteína. Para reacções de PEGuilação, o peso molecular típico é cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa, aproximadamente 5 kDa a cerca de 50 kDa, ou cerca de 12 kDa a 25 kDa. A razão molar de polímero solúvel em água a IL-22RA será geralmente na faixa de 1:1 a 100:1. Normalmente, a razão molar de polímero solúvel em água a IL-22RA será de 1:1 a 20:01 para poliPEGuilação e 1:1 a 5:1 para monoPEGuilação. Métodos gerais para a produção de conjugados compreendendo um polipeptídeo e metades de polímero solúvel em água são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Karasiewicz et al. Patente US 5382657, Greenwald et al., Patente US 5738846, Nieforth et al. Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al. Anal. Biochem. 247:434 (1997)). Este método pode ser empregue para a feitura de IL-22RA, compreendendo conjugados de receptor solúvel homodiméricos, heterodiméricos ou multiméricos. A presente invenção contempla composições compreendendo um anticorpo, tal como definido nas reivindicações. Tais composições podem compreender ainda um transportador. O transportador pode ser um transportador convencional, orgânico ou inorgânico. Exemplos de transportadores incluem a água, solução tampão, álcool propilenoglicol, macrogol, óleo de sésamo, óleo de milho, e assim por diante. 74

7. Isolamento de Polipeptídeos IL-22RA

Os polipeptídeos aqui descritos pode ser purificados, pelo menos, a cerca de 80% de pureza, pelo menos a cerca de 90% de pureza, pelo menos a cerca de 95% de pureza, ou superior a 95%, como 96%, 97%, 98% ou mais do que mais 99% de pureza em relação à contaminação por macromoléculas, especialmente proteínas e ácidos nucléicos outros, e livre de agentes infecciosos e pirogénicos. Os polipeptídeos descritos também podem ser purificados a um estado farmaceuticamente puro, que é superior a 99,9% de pureza. Em algumas preparações, o polipeptídeo purificado é substancialmente isento de outros polipeptídeos, em particular outros polipeptídeos de origem animal. Métodos de fraccionamento e/ou purificação convencional podem ser usados para obtenção de preparações de IL-22RA purificadas a partir de fontes naturais (por exemplo, fontes de tecido humano), polipeptídeos sintéticos IL-22RA, e polipeptídeos recombinantes IL-22RA e polipeptídeos de fusão IL-22RA purificados a partir de células hospedeiras recombinantes. Em geral, a precipitação com sulfato de amónio e a extracção com ácido ou caotrópico podem ser utilizadas para fraccionamento das amostras. Exemplos de etapas de purificação podem incluir hidroxiapatita, exclusão de tamanho, FPLC e fase reversa de cromatografia líquida de elevado desempenho. Todos os meios adequados para cromatografia incluem dextranos derivatizados, agarose, celulose, poliacrilamida, silicones especiais, e assim por diante. Os derivados PEI, DEAE, QAE e Q são adequados. Exemplos de meios cromatográficos incluem os meios derivatizados com grupos fenil, butil, ou octil, tais como a Fenil-Sefarose FF (Pharmacia), Toyopearl 650 butílico (Toso Haas, Montgomeryville, PA) , octil-Sefarose (Pharmacia) e similares; ou resinas poliacrílicas, tais como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) e similares. Suportes sólidos adequados incluem contas de vidro, resinas à base de sílica, resinas de celulose, contas de agarose, contas de agarose cruzadas, esferas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada e afins que são insolúveis nas 75 condições em que estão a ser utilizadas. Esses suportes podem ser modificados com grupos reactivos que permitam a fixação de proteínas por grupos amino, grupos carboxila, grupos sulfidrila, grupos hidroxila e/ou metades de carboidratos.

Exemplos de ligação incluem a activação química com brometo de cianogénio, activação por N-hidroxisuccinimida, activação por epóxido, activação sulfidrila, activação hidrazida, e derivados carboxi e amino para acoplamento carbodiimida química. Estes e outros meios sólidos são bem conhecidos e amplamente utilizados na técnica, e estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais. A selecção de um método específico para o isolamento e purificação do polipeptídeo é uma questão de concepção de rotina e é determinada em parte pelas propriedades do suporte escolhido. Ver, por exemplo, Affinity Chromatography: Principies & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), e Doonan, Protein Purification Protocols (The humana Press 1996).

Variações adicionais no isolamento e purificação de IL-22RA podem ser planeadas pelos peritos na técnica. Por exemplo, os anticorpos anti-IL-22RA, obtidos conforme descrito abaixo, podem ser usados para isolar grandes quantidades de proteína potr purificação de imunoafinidade.

Os polipeptídeos aqui descritos também podem ser isolados por meio de exploração de propriedades particulares. Por exemplo, a cromatografia de adsorção de iões metálicos imobilizados (IMAC) pode ser usada para purificar proteínas ricas em histidina, incluindo as que compreendem marcas de polihistidina. Resumidamente, um gel é primeiro carregado com iões metálicos divalentes para formar um quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 03:01 (1985)). As proteínas ricas em histidina serão adsorvidas à sua matriz com afinidades diferentes, dependendo do ião metálico utilizado, e serão eluídas por eluição competitiva, 76 diminuindo o pH, ou o uso de fortes agentes quelantes. Outros métodos de purificação incluem a purificação de proteínas glicosiladas por cromatografia de afinidade com lectinas e por cromatografia de troca iónica (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). Dentro de modalidades adicionais, uma fusão do polipeptídeo de interesse e uma marca de afinidade (por ex. proteína ligante de maltose, um domínio de imunoglobulina) podem ser construídas para facilitar a purificação. Além disso, as propriedades do ligante de ligação do domínio extracelular de IL-22RA podem ser exploradas para a purificação, por exemplo, receptores solúveis compreendendo IL-22RA; por exemplo, utilizando cromatografia de afinidade, onde IL-22 ligante está ligado a uma coluna e o receptor compreendendo IL-22RA, está ligado e, posteriormente, eluído utilizando métodos cromatográficos.

Polipeptídeos IL-22RA ou fragmentos dos mesmos, podem também ser preparados por síntese química, como descrito acima. Polipeptídeos IL-22RA podem ser monómeros ou multímeros; glicosilados ou não-glicosilados; peguilados ou não peguilados; e podem ou não incluir uma metionina inicial de resíduos de aminoácidos.

8. Produção de anticorpos para proteínas IL-22RA

Anticorpos IL-22RA podem ser obtidos, por exemplo, usando o produto de um vector de expressão IL-22RA ou IL-22RA isolado de uma fonte natural como um antígeno. Particularmente útil anticorpos anti-IL-22RA que "ligam especificamente" com IL-22RA. Os anticorpos são considerados ligar especificamente se os anticorpos exibem pelo menos uma das seguintes duas propriedades: (1) os anticorpos se ligam a IL-22RA com um nível mínimo de actividade de ligação, e (2) os anticorpos não têm uma reacção cruzada significativa com polipeptídeos relacionados com IL-22RA. 77

Com relação à primeira caracteristica, os anticorpos ligam-se especificamente se se ligam a um polipeptídeo IL-22RA, peptideo ou epitopo com uma afinidade de ligação (Ka)f 106 M_1 ou superior, de preferência 107 M_1 ou superior, mais preferencialmente 108 M"1 ou superior, e mais, de preferência 109 M"1 ou superior. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser prontamente determinada por um dos peritos na técnica, por exemplo, pela análise Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 51:660 (1949)). Com relação à segunda caracteristica, os anticorpos não têm reacção cruzada significativa com as moléculas de polipeptideos relacionados, por exemplo, se detectarem IL-22RA, mas não presentemente conhecidos polipeptideos usando um análise de Western blot padrão. Exemplos conhecidos de polipeptideos relacionados incluem conhecidos receptores de citocinas.

Os anticorpos anti-IL-22RA podem ser produzidos usando antigénicos de IL-22RA peptideos de epítopos e polipeptideos. Peptideos antigénicos de epítopos e polipeptideos da presente invenção contêm uma sequência de pelo menos nove, ou entre 15 a 30 aminoácidos contidos na SEQ ID NO: 3 ou outra sequência de aminoácidos aqui divulgada. No entanto, peptideos ou polipeptideos compreendendo uma porção maior de uma sequência de aminoácidos da invenção, contendo de 30 a 50 aminoácidos, ou de qualquer comprimento até e incluindo a sequência de amino ácido inteira de um polipeptídeo da invenção também são úteis para induzir anticorpos que se ligam com IL-22RA. É desejável que a sequência de aminoácidos do peptideo de epitopo seja seleccionada para fornecer substancial solubilidade em solventes aquosos (í.e. a sequência inclui resíduos relativamente hidrofílicos, enquanto os resíduos hidrofóbicos são normalmente evitados). Além disso, sequências de aminoácidos contendo resíduos de prolina podem também ser desejáveis para a produção de anticorpos.

Como ilustração, foram identificados potenciais sítios antigénicos de IL-22RA pelo método de Jameson-Wolf, Jameson e Wolf, CABIOS 4:181, (1988), aplicado pelo 78 programa PROTEAN (versão 3.14) de LASERGENE (DNASTAR, Madison, WI). Os parâmetros padrão foram utilizados nesta análise. 0 método Jameson-Wolf prevê potenciais antigénicos determinantes através da combinação de seis sub-rotinas principais para a previsão de proteina estrutural. Sucintamente, o método HoppWoods, Hopp et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 78:3824 (1981), foi primeiro utilizado para identificar sequências de aminoácidos que representam áreas de maior hidrofilicidade local (parâmetro: sete resíduos de média). Na segunda etapa, o método de Emini, Emini et al. Virology 55:836 J. (1985), foi utilizado para calcular as probabilidades de superfície (parâmetro: limite de decisão de superfície (0,6) =1). Em terceiro lugar, o método Karplus-Schultz, Karplus e Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985), foi utilizado para prever a flexibilidade da cadeia de estrutura (parâmetro: limiar de flexibilidade (0,2)=1). Na quarta e quinta etapas da análise, as previsões da estrutura secundária foram aplicadas aos dados usando os métodos de Chou-Fasman, Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", em Prediction of Protein Structure and the Principies of Protein Conformation, Fasman (ed.), páginas 549-586 (Plenum Press 1990), e Garnier Robson, Garnier et al. J. Mol. Biol. 120:97 (1978) (Parâmetros Chou-Fasman: tabela de conformação=64 proteínas; região limiar α = 103; região limiar β = 105; parâmetros Garnier-Robson: decisão constante α e β = 0) . Na sexta sub-rotina, os parâmetros de flexibilidade e hidropatia/factores de acessibilidade de solvente foram combinados para determinar um valor de contorno de superfície, designado como o "índice antigénico". Finalmente, uma função de alargamento dos picos foi aplicada ao índice antigénico, que amplia os picos principais da superfície, adicionando 20, 40, 60 ou 80% do valor de pico respectivo para a conta ae energia livre adicional derivada da mobilidade das regiões de superfície em relação ao interior das regiões. Este cálculo não foi aplicado, no entanto, a qualquer pico principal residente numa região helicoidal, uma vez que as regiões helicoidais tendem a ser menos flexíveis. 79

Os resultados desta análise indicaram que as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 possibilitariam peptideos antigénicos adequados: os prefis de hidrofilicidade Hopp/Woods podem ser usados para determinar as regiões que têm o maior potencial antigénico na SEQ ID NO: 3 (Hopp et al. Proc. Natl. Acad. Sei.78 :3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 e Triquier et al. Protein Engineering 11:153-169, 1998). 0 perfil é baseado numa janela deslizante de seis resíduos. Os resíduos G, S, T são enterrados, os resíduos Η, Y são expostos e os resíduos W foram ignorados. Além disso, os epítopos antigénicos IL-22RA na SEQ ID NO: 3, como previsto por uma parcela Jameson-Wolf, por exemplo, usando o programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), servem como epítopos antigénicos preferidos, e podem ser determinado por um perito na técnica. Esses epítopos antigénicos incluem (1) os resíduos de aminoácidos 1 (Pro) a 6 (Asp) da SEQ ID NO: 3 (2); resíduos de aminoácidos 26 (Ser) a 32 (Pro) de SEQ ID NO: 3; (3) resíduos de aminoácidos 41 (Lys) a 47 (Asp) da SEQ ID NO: 3; (4) resíduos de aminoácidos 49 (Vai) a 62 (Cis) de SEQ ID NO: 3; (5) resíduos de aminoácidos 41 (Lys) a 62 (Cis) de SEQ ID NO: 3; (6) resíduos de aminoácidos 84 (Ala) a 97 (Ser) da SEQ ID NO: 3; (7) resíduos de aminoácidos 103 (Thr) a 108 (Asp) de SEQ ID NO: 3; (8) resíduos de aminoácidos 130 (Arg) a 135 (His) de SEQ ID NO: 3; (9) resíduos de aminoácidos 164 (Gly) a 166 (Lys), da SEQ ID NO: 3; (10) resíduos de aminoácidos 175 (Tyr) a 179 (Glu) de SEQ ID NO: 3; (11) resíduos de aminoácidos 193 (Lys) a 196 (Ala), da SEQ ID NO: 3; (12) resíduos de aminoácidos 203 (Lys) a 209 (Thr) de SEQ ID NO: 3. A presente descrição descreve o uso de qualquer um dos peptideos antigénicos 1 a 12 para gerar anticorpos para IL-22RA ou como uma ferramenta para a seleccionar ou identificar anticorpos neutralizantes monoclonais da presente invenção. A presente invenção contempla também polipeptídeos compreendendo pelo menos um dos peptideos antigénicos 1 a 10. A presente descrição descreve o uso de quaisquer peptideos antigénicos ou epítopos aqui descritos para gerar anticorpos de IL-22RA, bem como identificar e seleccionar anticorpos monoclonais anti-IL-22RA que são neutralizantes, e que podem ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a actividade de IL-22 e IL-20 (individual ou em conjunto). 80

Além disso, os antígenos adequados também incluem os polipeptideos IL-22RA compreendendo uma citocina de ligação IL-22RA, ou domínio extracelular divulgado acima, em combinação com outro domínio extracelular de citocinas de classe I ou II, tais como aquelas que formam polipeptideos heterodiméricos ou multiméricos solúveis de IL-22RA, como IL-22RA/CRF2-4 solúvel, a IL-22RMzcytorll, IL-22RA/zcytor7, e assim por diante.

Anticorpos policlonais para a proteína IL-22RA recombinante ou a IL-22RA isolada de fontes naturais podem ser preparados através de métodos bem conhecidos dos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Green et al. "Production of Polyclonal Antisera", em Immunochemical Protocols (Manson, ed.), Páginas 1-5 (Humana Press 1992), e Williams et al. "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995). A imunogenicidade de um polipeptídeo IL-22RA pode ser aumentada através da utilização de um adjuvante, tal como alumínio (hidróxido de alumínio) ou um adjuvante completo ou incompleto de Freund. Polipeptideos úteis para a imunização também incluem polipeptideos de fusão, tais como fusões de IL-22RA ou parte deles com um polipeptídeo de imunoglobulina ou com proteína de ligação de maltose. A imunização de polipeptídeo pode ser uma molécula completa ou parte dela. Se a porção polipeptídeo é "do tipo hapteno", tal porção pode ser vantajosamente aderida ou ligada a um transportador de macromoléculas (como limpet hemocianina (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou toxóide tetânico) para a imunização.

Embora os anticorpos policlonais sejam geralmente criados em animais tais como cavalos, vacas, cães, galinhas, ratos, coelhos, cobaias, cabras, ou ovelhas, um anticorpo anti-IL-22RA também podem ser derivado de um anticorpo de primata subumano. Técnicas gerais para a criação de anticorpos para diagnóstico e terapêutica úteis em babuínos podem ser encontradas, por exemplo, em Goldenberg et al. publicação 81 internacional de patente WO 91/11465 e em Losman et al. Int. J. Câncer 46:310 (1990).

Alternativamente, os anticorpos monoclonais anti-IL-22RA podem ser gerados. Anticorpos monoclonais de roedores para antigenos específicos podem ser obtidos pelos métodos conhecidos pelos peritos na técnica (ver, por exemplo, Kohler et al. Nature 256:495 (1975), Coligan et al. (Eds.), Current Protocols in Immunology, vol. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley et al. "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli", em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)).

Resumidamente, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos pela injecção de ratos com uma composição que compreende um produto de gene IL-22RA, verificando a presença de uma produção de anticorpos através da remoção de uma amostra de soro, a remoção do baço para a obtenção dos linfócitos B, fundindo os linfócitos B com células de mieloma para a produção de hibridomas, clonagem de hibridomas, seleccionando os clones positivos que produzem anticorpos para o antígeno, cultivo dos clones que produzem anticorpos para o antígeno, e isolar os anticorpos das culturas de hibridomas.

Além disso, um anticorpo anti-IL-22RA pode ser derivado de um anticorpo monoclonal humano. Os anticorpos monoclonais humanos são obtidos a partir de ratos transgénicos que foram projectados para produzir anticorpos humanos específicos em resposta ao desafio antigénico. Nesta técnica, os elementos do locus humano de cadeia pesada e leve ser são introduzidos em linhagens de ratos provenientes de linhas de células-tronco embrionárias que contêm perturbações específicas do loci endógeno de cadeia pesada e leve. Os ratos transgénicos podem sintetizar anticorpos humanos específicos para antigenos humanos e os 82 ratos podem ser usados para produzir hibridomas secretores de anticorpos humanos. Métodos para a obtenção de anticorpos humanos a partir de ratos transgénicos são descritos, por exemplo, em Green et al. Nature Genet. 07:13 (1994), Lonberg et al. Nature 368:856 (1994), e

Taylor et al. Int. Immun. 6:579 (1994).

Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados a partir de culturas de hibridomas por uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia de afinidade com a proteina-A Sefarose, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia de troca iónica (ver, por exemplo, Coligan em páginas 7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al. "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," em Methods in Molecular Biology, vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)) .

Para usos específicos, pode ser desejável preparar fragmentos de anticorpos anti-IL-22RA. Esses fragmentos de anticorpos podem ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica do anticorpo. Fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por pepsina ou digestão de papaína de todos anticorpos por métodos convencionais. Como ilustração, os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento 5S denotando F(ab')2. Este fragmento pode ser depois clivado usando um agente redutor de tiol para produzir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Opcionalmente, a reacção de clivagem pode ser realizada utilizando um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrílicos que resultam da clivagem das ligações dissulfeto. Como alternativa, uma clivagem enzimática com pepsina produz dois fragmentos monovalentes Fab e um fragmento Fc directamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, em Goldenberg, Patente US 4331647, Nisonoff et al. Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al. em Methods in Enzymology Vol. 1, página 422 (Academic Press 1967), e Coligan nas páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10.-2.10.4. 83

Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como a separação de cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeia leve-pesada, posterior clivagem de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser usadas, contanto que os fragmentos se liguem ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Por exemplo, os fragmentos Fv compreendem uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não-covalente como descrito por Inbar et ai. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 69:2659 (1972). Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfeto intermolecular ou por ligações cruzadas por produtos químicos como o glutaraldeído (ver, por exemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)).

Os fragmentos Fv podem incluir cadeias VH e VL que estão ligadas por um ligador de peptídeo. Estes antigénios de proteínas de cadeia única (scFv) são preparados através da construção de um gene estrutural compreendendo sequências de ADN que codificam os domínios VH e VL que são conectados por um oligonucleotídeo. 0 gene estrutural é inserido num vector de expressão que é depois introduzido numa célula hospedeira, tais como E. Coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma cadeia polipeptidica única com um ligador de peptideo ligando os dois domínios V. Métodos para produzir scFvs são descritos, por exemplo, por Whitlow et al. Mrthods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 Enzimologia (1991) (ver também, Bird et al. Science 242:423 (1988), Ladner et al. Patente US 4946778, Pack et al. Bio/Technology 11:1271 (1993), e Sandhu, supra).

Como ilustração, um scFv pode ser obtido através da exposição de linfócitos a um polipeptídeo IL-22RA in vitro e selecção de bibliotecas de vectores de macrófagos ou similares (por exemplo, através do uso de proteína IL-22RA 84 imobilizada ou rotulada ou peptideo). Os genes que codificam polipeptideos tendo domínios de ligação de polipeptídeo IL-22RA potenciais podem ser obtidos pela selecção aleatória de bibliotecas de peptídeos exibidas em macrófagos (exibição de macrófagos) ou bactérias, como a E. Coli. Sequências de nucleotídeos que codificam os polipeptideos podem ser obtidas por uma série de maneiras, como através de mutagênese aleatória e síntese polinucleotídeo aleatória. Essas bibliotecas de peptídeos aleatórias podem ser usadas para a triagem de peptídeos que interagem com um alvo conhecido que pode ser uma proteína ou um polipeptídeo, como um ligante ou um receptor, uma macromolécula biológica ou sintética, ou substâncias orgânicas ou inorgânicas. Técnicas para a criação e selecção de tais bibliotecas aleatórias de peptídeos são conhecidas na técnica (Ladner et al. Patente US 5223409, Ladner et al. Patente US 4946778, Ladner et al. Patente US 5403484, Ladner et al. Patente US 5571698 e Kay et al. Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) e bibliotecas aleatórias de peptídeos e kits para a triagem de bibliotecas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, em CLONTECH Laboratories, Inc. (Paio Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) e Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . As bibliotecas aleatórias de peptídeos podem ser seleccionadas usando as sequências de IL-22RA aqui divulgadas para identificar proteínas que se ligam a IL-22RA.

Outra forma de um fragmento de anticorpo é um peptideo que codifica para uma única região determinante de complementaridade (CDR). Os peptídeos CDR ("unidades de reconhecimento mínimo") podem ser obtidos através da construção de genes que codificam o CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, por meio da reacção em cadeia da polimerase para sintetizar a região variável de RNA de células produtoras de anticorpos (ver, por exemplo, Larrick et al. Methods: A Companion to

Methods in Ezymology 2:106 (1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", em Monoclonal antibodies: Production, Engineering and Clinicai

Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge 85

University Press 1995), e Ward et al. "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Como alternativa, um anticorpo anti-IL-22RA pode ser derivado a partir de um anticorpo monoclonal "humanizado". Anticorpos monoclonais humanizados são produzidos através da transferência de regiões de determinação complementar do rato das cadeias variáveis leves e pesadas da imunoglobulina do rato num domínio variável humano. Resíduos típicos de anticorpos humanos são, então, substituídos nas regiões das contrapartidas murinas. 0 uso de componentes de anticorpos derivados de anticorpos monoclonais humanizados evita potenciais problemas associados com as regiões constantes de imunogenicidade de murinos. Técnicas de clonagem geral para domínios variáveis da imunoglobulina murina são descritas, por exemplo, em Orlandi et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 86:3833 (1989). Técnicas para a produção de anticorpos monoclonais humanizados são descritas, por exemplo, em Jones et al. Nature 321:522 (1986), Cárter et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992), Singer et al. Immun J.. 150:2844 (1993), Sudhir (ed.), Antibody Engineering Prrotocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), e em Queen et al. Patente US 5693762 (1997) .

Além disso, os anticorpos anti-IL-22RA ou fragmentos de anticorpos da presente invenção podem ser PEGuilados usando métodos da técnica aqui descritos.

Anticorpos policlonais anti-idiotipo podem ser preparados por imunização de animais com anticorpos anti-IL-22RA ou fragmentos de anticorpos, utilizando técnicas 86 convencionais. Ver, por exemplo, Green et al. "Production of Polyclonal Antisera", em Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), páginas 1-12 (Humana Press 1992) . Além disso, ver Coligan nas páginas 2.4.1-2.4.7. Alternativamente, os anticorpos monoclonais anti-idiotipo podem ser preparados usando anticorpos anti-IL-22RA ou fragmentos de anticorpos como imunógenos com as técnicas acima descritas. Como outra alternativa, anticorpos humanizados anti-idiotipo ou anticorpos anti-idiotipo subumanos de primatas podem ser preparados utilizando as técnicas acima descritas. Métodos para a produção de anticorpos anti-idiotipo são descritos, por exemplo,em Irie, Patente US 5208146, Greene, et. al., Patente US 5637677 e Varthakavi e Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996) .

Um anticorpo anti-IL-22RA pode ser conjugado com um rótulo detectável para formar uma imunoconjugado anti-IL-22RA. Rotulagem adequada detectável inclui, por exemplo, um radioisótopo, uma etiqueta fluorescente, um marcador quimioluminescente, um rótulo de enzima, um rótulo bioluminescente ou ouro coloidal. Métodos de produção e detecção de tais rótulos de imunoconjugados detectáveis são bem conhecidas pelos peritos na técnica, e são descritos em mais pormenor abaixo. O rótulo detectável pode ser um radioisótopo que é detectado por autoradiografia. Os isótopos que são particularmente úteis para os fins da presente invenção são 3H, 125I, 131I, 35S e 14C.

Os imunoconjugados anti-IL-22RA também podem ser rotulados com um composto fluorescente. A presença de um anticorpo marcado com fluorescência é determinada pela exposição do imunoconjugado à luz de comprimento de onda adequada e detectada a fluorescência resultante. Compostos de rotulagem fluorescente incluem isotiocianato de 87 fluoresceína, rodamina, ficoeriterina, ficocianina, aloficocianina, ftaldeído e fluorescamina.

Alternativamente, os imunoconjugados anti-IL-22RA podem ser detectáveis rotulados pelo acoplamento de um componente de do anticorpo a um composto quimioluminescente. A presença do imunoconjugado marcado quimioluminescente é determinada pela detecção da presença de luminescência que surge no decurso de uma reacção química. Exemplos de compostos de rotulagem por quimioluminescência incluem luminol, isoluminol, um éster de acridina aromática, um imidazole, um sal de acridina e um éster oxalato.

Da mesma forma, um composto bioluminescente pode ser usado para rotular imunoconjugados anti-IL-22RA da presente invenção. A bioluminescência é um tipo de quimiluminescência encontrada em sistemas biológicos em que a proteína catalítica aumenta a eficiência da reacção quimiluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada pela detecção da presença de luminescência. Compostos bioluminescentes que são úteis para a rotulagem incluem luciferina, luciferase e aequorin.

Alternativamente, os imunoconjugados anti-IL-22RA podem ser detectáveis rotulados ligando um componente de anticorpos anti-IL-22RA a uma enzima. Quando o conjugado anti-IL-22RA-enzima é incubado na presença do substrato adequado, a metade da enzima reage com o substrato para produzir uma metade química que pode ser detectada, por exemplo, por espectrofotometria, e meios fluorométricos ou visuais. Exemplos de enzimas que podem ser usados para detectar imunoconjugados rotulados poliespecíficos incluem β-galactosidase, glicose oxidase, peroxidase e fosfatase alcalina. 88

Os peritos na técnica conhecerão outros rótulos adequados que podem ser utilizados em conformidade com a presente invenção. A ligação de metades marcador aos anticorpos anti-IL-22RA pode ser feita usando técnicas padrão conhecidas na técnica. A metodologia tipica, a este respeito é descrita por Kennedy et al. Clin. Chim. 70:1 Acta (1976), Schurs et al. Clin. Chim. 81:1 Acta (1977), Shih et al. Int'l J. Câncer 46:1101 (1990), Stein et al. Câncer Res. 50:1330 (1990), e, Coligan, supra.

Além disso, a comodidade e a versatilidade da detecção imunoquimica pode ser melhorada usando anticorpos anti-IL-22RA que foram conjugados com avidina, estreptavidina e biotina (ver, por exemplo, Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology," Methods in Enzymology, vol. 184 (Academic Press 1990), e Bayer et al. "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology" em Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (ed.), páginas 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992). Métodos para a realização de imunoensaios estão bem estabelecidos. Ver, por exemplo, Cook e Self "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays" em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinicai Application, Ritter e Ladyman (eds.), páginas 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch e Lennox (eds.), páginas 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), e Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996). A presente descrição descreve kits para a realização de um teste de diagnóstico imunológico para a expressão do gene IL-22RA. Esses kits compreendem pelo menos um recipiente que compreende um anticorpo anti-IL-22RA, ou fragmento de anticorpo. Um kit pode também incluir um segundo recipiente compreendendo um ou mais reagentes capazes de indicar a 89 presença de anticorpos IL-22RA ou fragmentos de anticorpos. Exemplos de tais reagentes indicadores incluem rótulos detectáveis como uma etiqueta radioactiva, uma etiqueta fluorescente, uma etiqueta quimioluminescente, uma etiqueta de enzima, uma etiqueta bioluminescente, ouro coloidal, e assim por diante. Um kit pode também incluir um meio de transporte para o utilizador que os anticorpos IL-22RA ou fragmentos de anticorpos são usados para detectar a proteína IL-22RA. Por exemplo, as instruções escritas podem afirmar que o anticorpo ou fragmento de anticorpo fechado podem ser usados para detectar IL-22RA. 0 material escrito pode ser aplicado directamente a um recipiente ou o material escrito pode ser fornecido sob a forma de uma inserção na embalagem. 9. O uso de anticorpos anti-IL-22RA para antagonizar IL-22RA ligado a IL-22 ou IL-20 e IL-22 Técnicas alternativas para a geração ou selecção de anticorpos úteis incluem exposição in vitro de linfócitos a polipeptídeos de receptor solúvel IL-22RA ou fragmentos dos mesmos, tais como epítopos antigénicos e selecção de bibliotecas de anticorpos em macrófagos ou vectores semelhantes (por exemplo, através da utilização de polipeptídeos de receptor solúvel de IL-22RA imobilizado ou rotulado ou fragmentos dos mesmos, tais como epítopos antigénicos) . Os genes codificando polipeptídeos tendo domínios de ligação potenciais, tais como polipeptídeos de receptor solúvel de IL-22RA ou fragmentos dos mesmos, tais como epítopos antigénicos podem ser obtidos através do rastreio de bibliotecas aleatórias de peptídeos de macrófagos (exibição de macrófagos) ou bactérias, como a E. Coli. Sequências de nucleotídeos que codificam os polipeptídeos podem ser obtidas por uma série de maneiras, como através de mutagénese aleatória e síntese polinucleotídea aleatória. Essas bibliotecas aleatórias de peptídeos podem ser usadas para a triagem de peptídeos que interagem com um alvo conhecido que pode ser uma proteína ou um polipeptídeo, como um ligante ou um receptor, uma macromolécula biológica ou sintética, ou substâncias 90 orgânicas ou inorgânicas. Técnicas para criação e selecção de tais bibliotecas aleatórias de peptídeos são conhecidas na técnica (Ladner et ai. Patente US 5223409; Ladner et al. Patente US 4946778; Ladner et al. Patente US 5403484 e Ladner et al. Patente US 5571698) e bibliotecas aleatórias de peptídeos e kits para a triagem bibliotecas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, em Clontech (Paio Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) e Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Bibliotecas aleatórias de peptídeos podem ser seleccionadas usando os polipeptídeos de receptor solúvel IL-22RA ou fragmentos dos mesmos, tais como sequências de polipeptídeos de epítopos antigénicos, divulgadas aqui para identificar proteínas que se ligam a polipeptídeos compreendendo um receptor de IL-22RA. Estes "polipeptídeos de ligação", que interagem com os polipeptídeos compreendendo um receptor solúvel de IL-22RA, podem ser usados para marcar as células; para isolar polipeptídeos homólogos por purificação de afinidade; podem ser directa ou indirectamente conjugados com medicamentos, toxinas, radionuclídeos e assim por diante. Estes polipeptídeos de ligação também podem ser usados em métodos analíticos, tais como triagem de bibliotecas de expressão e de actividade neutralizante, por exemplo, para ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a interacção entre o ligante e o receptor IL-22, ou a ligação virai ao receptor. Os polipeptídeos de ligação também pode ser utilizados para os testes de diagnóstico para a determinação dos níveis circulantes de polipeptídeos compreendendo um receptor solúvel de IL-22RA; para a detecção ou quantificação de de IL-22RA solúvel ou insolúvel compreendendo receptores como indicadores de patologia ou doença subjacentes. Estes polipeptídeos de ligação também podem actuar como "antagonistas" para bloquear ou inibir IL-22RA solúvel ou ligado à membrana de receptor monomérico ou polipeptídeo ligação de IL-22RA homodimérico, heterodimérica ou multimérico (por exemplo, ao ligante) e transdução de sinal in vitro e in vivo. Novamente, estes polipeptídeos de ligação servem como receptor monomérico de anti-IL-22RA ou polipeptídeos anti-IL-22RA homodiméricos, heterodiméricos ou multiméricos e são úteis para inibir a actividade de IL-22 ou IL-20 e IL-22, bem como como receptor de actividade ou proteína de 91 ligação. Anticorpos produzidos para os receptores complexos naturais da presente invenção, e os anticorpos de epitopos de ligação de IL-22RA, e anticorpos monoclonais neutralizantes anti-IL-22RA podem ser modalidades preferidas, pois podem agir mais especificamente contra o IL-22RA e podem inibir IL-22 ou IL-20 e IL-22. Além disso, a actividade antagonistica e de ligação dos anticorpos da invenção pode ser analisada numa proliferação de IL-20 ou IL-22, armadilha de sinal, luciferase ou ensaios de ligação, na presença de IL-20 ou IL-22, respectivamente, e receptores solúveis compreendendo IL-22RA, e outros ensaios biológicos e bioquímicos descritos.

Anticorpos para os polipeptideos de receptor solúvel de IL-22RA (por exemplo, anticorpos da SEQ ID NO: 3) ou fragmentos dos mesmos, tais como epitopos antigénicos podem ser utilizados para inibir o efeito inflamatório de IL-20, IL-22 ou IL-20 e IL-22 in vivo, para uso terapêutico contra a psoriase, dermatite atópica, doenças de pele inflamatórias, endotoxemia, artrite, asma, IBD, colite, artrite psoriática, artrite reumatóide ou outras condições inflamatórias induzidas por IL-20 e IL-22; células de marcação que expressam receptores IL-22RA; para isolar polipeptideos compreendendo um receptor solúvel de IL-22RA por purificação de afinidade; para os testes de diagnóstico para a determinação dos níveis circulantes de polipeptideos compreendendo um receptor solúvel de IL-22RA; para a detecção ou quantificação de IL-22RA compreendendo receptores solúveis como marcadores de patologia ou doença subjacente; em métodos analíticos empregando FACS; para a selecção de bibliotecas de expressão; para a geração de anticorpos anti-idiotípicos que podem actuar como agonistas de IL-22 ou IL-20; e, como anticorpos neutralizantes ou como antagonistas para ligar, bloquear, inibir, reduzir, ou antagonizar a função de receptor de IL-22RA, ou para ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonir ou neutralizar a actividade de IL-22 e/ou de IL-20 (individual ou em conjunto) in vitro e in vivo. Etiquetas directas ou rótulos adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofactores, biotina, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores de quimioluminescência, partículas magnéticas e similares; etiquetas indirectas ou rótulos podem 92 caracterizar o uso da avidina-biotina ou outro par complemento/anti-complemento como intermediários. Anticorpos também pode ser directa ou indirectamente, conjugados com medicamentos, toxinas, radionuclideos e similares, e estes conjugados utilizados para aplicações terapêuticas de diagnóstico in vivo. Além disso, anticorpos polipeptideos compreendendo receptores solúveis de IL-22RA, ou fragmentos do mesmo podem ser utilizados in vitro para detectar polipeptideos compreendendo um receptor de IL-22RA desnaturado ou não desnaturado ou fragmentos dele nos ensaios, por exemplo, Western Blot ou outros ensaios conhecidos na técnica.

Anticorpos para o receptor solúvel de IL-22RA ou polipeptideos do receptor solúvel de IL-22RA homodimérico, heterodimérico ou multimérico são úteis para marcar as células que expressam receptores correspondentes e ensaiam os seus níveis de expressão, para purificação de afinidade, em ensaios de diagnóstico para a determinação dos níveis circulantes de polipeptideos de receptor, métodos analíticos empregando a fluorescência de separação de células activadas. Além disso, os anticorpos bivalentes, e os anticorpos anti-idiotípicos podem ser usados como agonistas para imitar o efeito do ligante IL-22RA, IL-22 ou IL-20.

Os anticorpos também podem ser directa ou indirectamente, conjugados com medicamentos, toxinas, radionuclideos e similares, e estes conjugados utilizados para aplicações terapêuticas de diagnóstico in vivo. Por exemplo, anticorpos ou polipeptideos de ligação que reconhecem o receptor solúvel de IL-22RA ou os polipeptideos de receptor solúvel de IL-22RA homodimérico, heterodimérico ou multimérico podem ser usados para identificar ou tratar tecidos ou órgãos que expressam uma molécula correspondente anti-complementar (ou seja, IL- 22RA compreendendo um receptor solúvel ou ligado à membrana). Mais especificamente, os anticorpos dos polipeptideos de receptor solúvel de IL-22RA, ou fragmentos bioactivos ou partes dele, podem ser acoplados a moléculas detectáveis ou 93 citotóxicas e entregues a um mamífero tendo células, tecidos ou órgãos que expressam o receptor compreendendo IL-22RA, como IL-22RA expressando cancros.

Moléculas detectáveis adequadas podem ser directa ou indirectamente ligadas a polipeptídeos que se ligam a polipeptídeos compreendendo um receptor de IL-22RA, como "polipeptídeos de ligação" (incluindo a ligação de peptídeos divulgada acima), anticorpos, ou fragmentos bioactivos ou partes deles. Moléculas detectáveis adequadas incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores de quimioluminescência, partículas magnéticas e similares. Moléculas citotóxicas adequadas podem ser directa ou indirectamente ligadas ao polipeptideo ou anticorpo, e incluem toxinas bacterianas ou vegetais (por exemplo, a toxina da difteria, exotoxina Pseudomonas, rícino, abrin e similares), bem como os radionuclídeos terapêuticos, como o iodo-131, rênio-188 ou ítrio-90 (directamente ligados ao polipeptideo ou anticorpos, ou indirectamente ligadps através de uma metade quelante, por exemplo). Polipeptídeos de ligação ou anticorpos também podem ser conjugados com medicamentos citotóxicos, como a adriamicina. Para a fixação indirecta de uma molécula detectável ou citotóxica, a molécula detectável ou citotóxica pode ser conjugada com um membro de um par complementar/anticomplementar, onde o outro membro está ligado ao polipeptideo de ligação ou porção de anticorpo. Para esses fins, a biotina/streptavidina é um exemplo de par complementar/anticomplementar.

Em outra modalidade, a ligação polipeptídio-toxina proteínas de fusão ou anticorpo-toxina proteínas de fusão pode ser utilizada para a célula-alvo ou inibição ou ablação de tecidos (por exemplo, para tratar células cancerosas ou tecidos). Alternativamente, se o polipeptideo de ligação tem vários domínios funcionais (ou seja, um domínio de activação ou um domínio ligante, além de um domínio alvo), uma proteína de fusão, incluindo somente o domínio de segmentação podem ser adequada para dirigir uma 94 molécula detectável, uma molécula citotóxica ou molécula complementar a uma célula ou tecido do tipo de interesse. Nos casos em que a proteína de fusão inclui apenas um único domínio inclui uma molécula complementar, a molécula anti-complementares pode ser conjugada com uma molécula detectável ou citotóxica. Essas proteínas de fusão de domínio complementar representam, portanto, um veículo genérico de segmentação de células/tecidos específicos de entrega de conjugados de molécula citotóxica anti-complementares detectáveis.

Em outra modalidade, o polipeptídeo de ligação de IL-22RA-citocina ou anticorpos-proteínas de fusão de citocinas, podem ser usados para reforçar a morte in vivo de tecidos-alvo (por exemplo, baço, sangue, pâncreas, sangue, linfóide, cólon e cancro da medula óssea), se a ligação polipeptídeo-citocinas ou de anticorpos receptores anti-IL-22RA alvos da célula hiperproliferativa (ver, em geral, Homick et al. Blood 89:4437-47, 1997). As proteínas de fusão descritas permitem a segmentação de uma citocina para um local desejado da acção, proporcionando assim uma elevada concentração local de citocina. Anticorpos anti-IL-22RA monómeros, homodímeros, heterodímeros ou multímeros adequados alvo de uma célula ou tecido indesejáveis (ie, um tumor ou uma leucemia) e a citocina fundida medeia melhora a lise das células alvo pelas células efectoras. Citocinas adequadas para esse fim incluem a interleucina 2 e o factor estimulante da colónia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), por exemplo.

Alternativamente, o receptor de IL-22RA ligando polipeptídeos ou proteínas de fusão de anticorpos aqui descritos podem ser usados para reforçar a morte de tecidos-alvo in vivo, estimulando directamente o receptor de IL-22RA modulado por via de apoptose, resultando na morte das células hiperproliferativas expressando os receptores compreendendo IL-22RA. 95

10. Uso Terapêutico de Polipeptídeos tendo actividade de IL-22RA ou anticorpos de IL-22RA

Sequências de aminoácidos com actividade solúvel de IL-22RA podem ser usadas para modular o sistema imune pela ligação de IL-22RA dos ligantes IL-20 e IL-22 (isoladamente ou em conjunto), e assim, impedindo a ligação do ligante de IL-22RA com o receptor endógeno de IL-22RA. Os antagonistas de IL-22RA, tais como anticorpos anti-IL-22RA, também podem ser usados para modular o sistema imunológico inibindo a ligação do ligante de IL-22RA com o receptor endógeno de IL-22RA. Assim, a presente descrição descreve a utilização de proteínas, polipeptídeos e peptídeos tendo actividade IL-22RA (como polipeptídeos solúveis de IL-22RA, fragmentos de polipeptídeos IL-22RA, análogos de IL-22RA (por ex, anticorpos anti-idiotipo de anti-IL-22RA), proteínas de fusão de IL-22RA) para um sujeito que carece de uma quantidade adequada deste polipeptídeo, ou que produz um excesso de ligante IL-22RA. Os antagonistas IL-22RA (por ex. anticorpos anti-IL-22RA) também podem ser usados para tratar um sujeito que gera um excesso de um ligante IL-22RA ou IL-22RA. Sujeitos adequados incluem mamíferos, tal como humanos. Por exemplo, tais polipeptídeos IL-22RA e anticorpos anti-IL-22RA são úteis na ligação, bloqueando, inibindo, reduzindo, antagonizando ou neutralizando IL-20 e IL-22 (isoladamente ou em conjunto), no tratamento da psoríase, dermatite atópica, condições inflamatórias da pele, artrite psoriática, artrite, endotoxemia, asma, doença inflamatória intestinal (IBD), colite e outras condições inflamatórias aqui divulgadas.

Além disso, mostrámos que o receptor IL-22RA liga um ligante chamado de Factor inducível de célula T (IL-22) (SEQ ID NO: 6; Dumoutier, L. et al. Proc. Nat'1. Acad. Sei. 97:10144-10149, 2000; a sequência IL-22 do rato é mostrada em Dumontier et al. Immunol J. . 164:1814-1819. 2000). Além disso, o zcytorll de propriedade comum (IL-22RA) (Patente US 5965704) e receptor CRF2-4 também se ligam a IL-22 como um heterodímero (Ver, publicação WOOO/24758; Dumontier et al. Immunol J. 164:1814-1819, 96 2000; Spencer, SD et al. J. Exp. Med. 187:571-578, 1998; Gibbs, VC and Pennica Gene 186:97-101, 1997 (CRF2 cADN-4); Xie, MH et al. J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; e Kotenko, SV et al. J. Biol. Chem. 276:2725-2732, 2001). Além disso, o receptor IL-ΙΟβ pode estar envolvido como um receptor de IL-22, e acredita-se possa ser sinónimo de CRF2-4 (Dumoutier, L. et al. Proc. Nat'1. Acad. Sei. 97:10144-10149, 2000; Liu Y et al, J Immunol. 152; 1821— 1829,1994 (IL-10R cADN). Além disso, mostrámos que o receptor de IL-22RA liga um ligante chamado IL-20 (SEQ ID NO: 8; Publicação OMPI WO 99/27103) . Dentro de modalidades preferidas, a forma do receptor solúvel de IL-22RA, (SEQ ID NO: 3) é um monómero, homodímero, heterodímero, ou multímero que se liga a, bloqueia, inibe, reduz, antagoniza ou neutraliza IL-22 e IL-20 in vivo. Anticorpos e polipeptideos de ligação de IL-22RA monómero, homodimero, heterodímero, ou multímeros também servem como antagonistas da actividade de IL-22RA e, como antagonistas de IL-20 e IL-22 (isoladamente ou em conjunto), conforme descrito aqui.

Além disso, descrevemos aqui e demonstrámos que ambos os anticorpos policlonais e monoclonais neutralizantes de anti-IL-22 ligam, bloqueiam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam a actividade de IL-22 e IL-20 em ensaios baseados em neutralização de células. IL-22 tem demonstrado ser induzido na presença de IL-9, e é suspeito de estar envolvido na promoção da resposta imune do tipo Thl e inflamação. IL-9 estimula a proliferação, activação, diferenciação e/ou indução da função imune numa variedade de formas e está implicada na asma, mastocitose pulmonar e outras doenças, bem como activa as vias STAT. Antagonistas de IL-22 ou da função IL-9 podem ter um uso benéfico contra as doenças humanas. A presente descrição descreve estes antagonistas novos de IL-22. 97 IL-22 tem mostrado estar envolvido na ampliação da produção de proteínas de fase aguda, tais como soro amilóide A (SAA), αΐ-antiquimotripsina e haptoglobina, e que a expressão de IL-22 é aumentada após a injecção do lipopolissacarídeo (LPS) in vivo, sugerindo que o IL-22 está envolvido na resposta inflamatória (Dumoutier, L. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sei. 97:10144-10149, 2000). A produção de proteínas de fase aguda, tais como AAS, é considerada um mecanismo de sobrevivência a curto prazo em que a inflamação é benéfica; porém, a manutenção das proteínas de fase aguda, por períodos mais longos contribui para a inflamação crónica e pode ser prejudicial para a saúde humana. Para revisão, ver Uhlar, CM e Whitehead, AS, Eur. Biochem J. . 265:501-523, 1999 e H. Baumann e Gauldie, J. Immunology Today 15:74-80, 1994. Além disso, a proteína de fase aguda SAA está implicada na patogénese de várias doenças inflamatórias crónicas, está implicada na aterosclerose e artrite reumatóide, e é a precursora da proteína amilóide A depositada na amiloidose (Uhlar, CM e Whitehead, supra). Assim, o IL-22 actua como uma molécula pró-inflamatória e induz a produção da SAA, os antagonistas seriam úteis no tratamento de doenças inflamatórias e outras doenças associadas com proteínas de fase aguda de resposta induzida por IL-22. Tais antagonistas são descritos aqui. Por exemplo, o método de redução de IL-22 induzido ou inflamação induzida por IL-9 compreende administrar a um mamífero com inflamação um montante de uma composição de IL-22RA solúvel compreendendo um receptor suficiente para reduzir a inflamação. Além disso, um método de supressão da resposta inflamatória num mamífero com inflamação pode incluir: (1) determinação do nível de proteína amilóide A sérica; (2)administrar uma composição que compreende um polipeptídeo receptor solúvel de citocinas de IL-22RA como aqui descrito num veículo farmaceuticamente aceitável; (3) determinação do nível pós administração de soro de proteína amilóide A; (4), comparação do nível de proteína amilóide A sérica na etapa (1) para o nível de proteína amilóide A sérica na etapa (3), onde a falta de aumento ou uma diminuição no nível de proteína amilóide sérica A é indicativo de uma supressão da resposta inflamatória. A evidência experimental aqui descrita mostra que os antagonistas de vIL-22, tais como receptores solúveis e anticorpos, de facto reduzem os 98 níveis de SAA em modelos in vivo para doenças inflamatórias, mostrando que ligando, bloqueando, inibindo, reduzindo, antagonizando ou neutralizando IL-22 tem efeitos anti-inflamatórios.

As evidências indicam que um papel de IL-20 e seus receptores estão envolvidos na psoríase. Esta doença de pele multigénica é caracterizada por aumento da proliferação de queratinócitos, diferenciação alterada dos queratinócitos e infiltração de células imunes na pele. A primeira linha de evidência para um papel de IL-20 no tratamento da psoríase é que a hiperqueratose observada e a epiderme espessada nos ratos transgénicos se assemelham a anormalidades psoriáticas em humanos. A dimunuição do número de tonofilamentos, que se pensava estar relacionado com a queratinização defeituosa, é uma característica marcante da psoríase humana. Foram encontradas inclusões intramitocondriais em ambas as condições hiperplásticas da pele tanto nas quimicamente induzidas como nas de ocorrência natural em ratos. A causa das inclusões e seus efeitos sobre a função mitocondrial, se houver, são desconhecidas. Os ratos transgénicos IL-20 apresentam muitas das características observadas no tratamento da psoríase humana.

Além disso, o receptor mARN de IL-20 (IL-20RA e IL-20RB mARN) são marcadamente sobre regulados na pele psoriática humana em relação à pele normal sugerindo, ainda, um papel para o IL-20 na psoríase. Ambas as subunidades do receptor IL-20 são expressas em queratinócitos através da epiderme e também são expressos em um subgrupo de células imunes e endoteliais. Propomos que a expressão aumentada de um receptor activado IL-20 pode alterar as interacções entre as células endoteliais, células do sistema imunológico e queratinócitos, levando à desregulação da proliferação dos queratinócitos e diferenciação. Além disso, os dados do rato nocaute aqui descritos, no qual o receptor IL-22RA é nocauteado, mostram que o IL-22RA era necessário para os efeitos inflamatórios de IL-20 induzido na pele de animais transgénicos. Estes resultados forneceram evidências de que 99 a actividade de IL-22RA efectivamente bloqueada, por exemplo através de um nocaute do gene IL-22RA, ou semelhante através de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-22RA da presente invenção, reduzirá os efeitos cutâneos de IL-20 induzido, bem como os efeitos na pele de IL-22 induzido, por exemplo, psoriase, IBD, colite, ou outras doenças inflamatória induzidas por IL-20, e/ou IL-22, incluindo IBD, artrite, asma, artrite psoriática, colite, condições inflamatórias da pele, e dermatite atópica.

Além disso, IL-20 estimula a transdução de sinal na linha celular HaCaT de queratinócitos humanos, apoiando uma acção direta deste novo ligante na pele. Além disso, IL-Ιβ, EGF e TNF-α, proteínas conhecidas por serem activoas em queratinócitos e de estarem envolvidas com sinais proliferativos e pró-inflamatórios na pele, melhoram a resposta a IL-20. Em ambos as células HaCaT e BHK expressam o receptor IL-20, sinais de IL-20 através de STAT3.

Como indicado no tópico acima e os exemplos a seguir, IL-20 está envolvido na patogénese da psoriase. A presente invenção proporciona um uso de anticorpos anti-IL-22RA para o tratamento da psoriase, tal como definido nas reivindicações. Os antagonistas, evitarão, assim, a activação do receptor IL-20. Além disso, como IL-20 e IL-IL-22 partilham IL-22RA como um receptor comum, antagonistas tais como IL-22RA solúvel, ou anticorpos, anticorpos de cadeia única ou fragmentos de anticorpos que se ligam ao receptor IL-22RA podem ser usados para simultaneamente ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar IL-22 ou a actividade de IL-20 e IL-22. A psoriase é uma das doenças dermatológicas mais comuns, afectando até 1 a 2 por cento da população mundial. É uma doença inflamatória crónica da pele caracterizada por 100 pápulas eritematosas, bem demarcadas e placas arredondadas, cobertas por uma escala micácea prateada. As lesões cutâneas da psoríase são variavelmente pruriginosas. As áreas traumatizadas frequentemente desenvolvem lesões de psoriase. Além disso, outros factores externos podem agravar a psoriase, incluindo infecções, stress, e medicamentos, por exemplo, o litio, beta-bloqueadores e anti-maláricos. A variedade mais comum de psoriase é chamada de tipo de placa. Os pacientes com psoriase de tipo placa terão placas estáveis, crescendo lentamente, que permanecem praticamente inalteradas por longos períodos de tempo. As áreas mais comuns para a ocorrência de psoríase em placas são os joelhos, os cotovelos, a prega glútea e o couro cabeludo. 0 envolvimento tende a ser simétrico. A psoríase inversa atinge as regiões intertriginosas incluindo a axila, virilha, região submamária, e o umbigo, e isso também tende a afectar o couro cabeludo, as palmas das mãos e as solas dos pés. As lesões individuais são placas bem demarcadas, mas podem ser húmidas, devido à sua localização. A psoríase em placas geralmente desenvolve-se lentamente e corre num curso indolente. Raramente remite espontaneamente. A psoríase eruptiva (psoríase gutata) é mais comum em crianças e adultos jovens. Desenvolve-se de forma aguda em indivíduos sem psoríase ou em pessoas com psoríase crónica em placas. Os pacientes apresentam muitas pequenas pápulas eritematosas, frequentemente após a infecção do trato respiratório superior com estreptococos beta-hemolíticos. Os pacientes com psoríase também podem desenvolver lesões pustulares. Estas podem ser localizadas nas palmas das mãos e plantas dos pés, ou pode ser generalizada e associada à febre, mal-estar, diarréia e artralgias.

Cerca de metade dos pacientes com psoríase têm envolvimento com as unhas, aparecendo como pintas nas unhas, 101 espessamento da unha ou hiperqueratose subungueal. Cerca de 5 a 10 por cento dos pacientes com psoríase têm queixas articulares associadas, e estas são mais frequentemente encontradas em pacientes com acometimento da unha. Embora alguns tenham a ocorência coincidente clássica de ocorrência de artrite reumatóide clássica, muitos têm doenças articularss, que caem num dos cinco tipos associados com a psoriase: (1) doença limitada a uma única ou poucas articulações (70 por cento dos casos); (2), doença reumatóide soronegativa do tipo da artrite; (3) envolvimento das articulações distais; (4) artrite destrutiva severa com o desenvolvimento de " artrite mutilante"; e (5), doença limitada à coluna. A psoriase pode ser tratada através da administração de agentes que ligam, bloqueiam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam IL-22, IL-20 ou IL-20 e IL-22. Os antagonistas preferidos são tanto um receptor solúvel de IL-20 e IL-22, tais como IL-22RA (SEQ ID NO: 3) ou anticorpos, fragmentos de anticorpos ou anticorpos de cadeia única que se ligam ao receptor de IL-22RA, tais como anticorpos neutralizantes da presente invenção. Tais antagonistas podem ser administrados isoladamente ou em combinação com outras terapias estabelecidas, tais como lubrificantes, queratoliticos, corticosteróides tópicos, derivados tópicos da vitamina D, antralina, antimetabólitos sistémicos, tais como o metotrexato, a terapia de psoraleno com luz ultravioleta (PUVA), etretinato, isotretinoina, ciclosporina e o derivado calcipotriol da vitamina D3 tópica. Além disso, tais antagonistas podem ser administrados por via subcutânea, intravenosa ou transdérmica usando um creme ou um sistema transdérmico que contém o antagonista. Se administrado por via subcutânea, o antagonista pode ser injectado em uma ou mais placas de psoriase. Se administrado via transdérmica, os antagonistas podem ser administrados directamente na placa usando um creme, pomada, pomada ou solução contendo o antagonista.

Antagonistas de IL-20 ou IL-22 podem ser administrados a uma pessoa com asma, bronquite ou a fibrose cística ou 102 outra doença pulmonar inflamatória para tratar a doença. Os antagonistas podem ser administrados por qualquer método adequado, incluindo por via intravenosa, subcutânea, lavagem brônquica, e o uso de inalantes contendo o antagonista. A análise da distribuição do tecido do cADN correspondente mARN IL-22RA mostrou que o nível de mARN foi maior na placenta e no baço e do ligante que se liga a IL-22RA (IL-22) está implicado na indução da resposta inflamatória, incluindo a resposta de indução da fase aguda(Dumoutier, L. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sei. 97:10144-10149, 2000). Assim, modalidades particulares da presente invenção são direccionadas para o uso de IL-22RA solúvel e anticorpos anti-IL-22RA como antagonistas de doenças inflamatórias e imunológicas ou condições, tais como psoríase, artrite psoriática, dermatite atópica, condições inflamatórias da pele, artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, diverticulose, asma, pancreatite, diabetes tipo I (IDDM), cancro pancreático, pancreatite, Doença de Graves, cancro de cólon e do intestino, doença auto-imune, sepsis, transplante de órgão ou medula óssea, inflamação devido à endotoxemia, trauma, tratamento cirúrgico ou infecção; amiloidose, esplenomegalia; doença de enxerto versus hospedeiro; e em que a inibição da inflamação, supressão imunológica, redução da proliferação de células hematopoiéticas, imunológicas, inflamatórias ou linfóides, macrófagos, células T (incluindo células Thl e Th2) , supressão da resposta imune a um patógeno ou antígeno, ou outros casos em que a inibição de citocinas de IL-22 ou IL-20, é desejada.

Além disso, os anticorpos ou polipeptídeos de ligação que ligam polipeptídeos IL-22RA aqui descritos, polipeptídeos IL-22RA são úteis para: 1) Bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar sinalização via receptores IL-20 ou IL-22 no tratamento de inflamação aguda, inflamação como resultado de um trauma, lesão tecidual, cirurgia, septicemia ou infecção e doenças 103 inflamatórias crónicas, tais como asma, doença inflamatória intestinal (IBD), colite crónica, esplenomegalia, episódios agudos inflamatórios recorrentes de artrite reumatóide (por exemplo, tuberculose), e tratamento da amiloidose, e aterosclerose, doença de Castleman, asma e outras doenças associadas com a indução de resposta de fase aguda. 2) Bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar sinalização via receptores de IL-20 ou IL-22 no tratamento de doenças auto-imunes, tais como IDDM, esclerose múltipla (MS), lúpus eritematoso sistémico (LES), miastenia gravis, artrite reumatóide, IBD e para impedir ou inibir a sinalização em células do sistema imune (por exemplo, linfócitos, monócitos, leucócitos) via IL-22RA (Hughes C et al. J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). Alternativamente, anticorpos, como anticorpos monoclonais (MAb) aos receptores IL-22RA, também podem ser usados como um antagonista para esgotar indesejadas células imunes no tratamento de doenças auto-imunes. Asma, alergias e outras doenças atópicas podem ser tratadas com um MAb contra, por exemplo, receptores solúveis de IL-22RA solúvel para inibir a resposta imune ou esgotar as células ofensivas. Bloquear, inibir, reduzir, ou antagonizar a sinalização via IL-22RA, utilizando os polipeptideos e anticorpos da invenção actual, podem também beneficiar as doenças do pâncreas, rim, hipófise e células neuronais. IDDM, NIDDM, pancreatite e carcinoma de pâncreas podem beneficiar. IL-22RA pode servir como um alvo para terapia MAb do cancro onde um antagonista MAb inibe o crescimento do cancro e matando imunomediadas. (Holliger P, e Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Mabs para IL-22RA solúvel também pode ser útil para o tratamento de nefropatias, tais como a glomeruloesclerose, neuropatia membranosa, amiloidose (que também afeta os rins, entre outros tecidos), arteriosclerose renal, glomerulonefrite de origens diversas, doenças fibroproliferativs do rim, assim como na disfunção dos rins associada com SLE, IDDM, diabetes tipo II (NIDDM), tumores renais e outras doenças. 3) Agoniza, melhora, aumenta ou inicia a sinalização via receptores de IL-20 ou IL-22 no tratamento de doenças auto-imunes, tais como IDDM, MS, lúpus eritematoso sistémico, miastenia gravis, artrite reumatóide, e IBD. Anticorpos neutralizantes e monoclonais de anti-IL-22RA pode sinalizar 104 linfócitos ou outras células do sistema imunológico para diferenciar, alterar a proliferação, ou mudar a produção de citocinas ou proteínas da superfície celular que melhoram a auto-imunidade. Especificamente, a modulação de uma resposta das células T-helper, a um padrão alternativo de secreção de citocinas pode desviar uma resposta auto-imune para melhorar a doença (Smith JA et al. Immunol J.. 160:4841-4849, 1998). Da mesma forma, anti-solúvel IL-22RA agonístico; anticorpos monoclonais, heterodímeros e multímeros de anti-solúvelIL-22RA/CRF2-4 podem ser utilizados para sinalizar, empobrecer e afastar as células imunes envolvidas na asma, alergia e doenças atopóicas. A sinalização por via de IL-22RA também pode beneficiar doenças do pâncreas, rim, hipófise e células neuronais. IDDM, NIDDM, pancreatite e carcinoma de pâncreas podem beneficiar. IL-22RA pode servir como um alvo para a terapia MAb do cancro do pâncreas, onde uma sinalização MAb inibe o crescimento do cancro matando imunomediadas (Tutt, AL et al. Immunol, J. 161: 3175-3185, 1998). Da mesma forma o carcinoma de células renais pode ser tratado com anticorpos monoclonais de IL-22RA, compreendendo receptores solúveis da presente invenção.

Os polipeptídeos solúveis de IL-22RA aqui descritos podem ser usados para ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a actividade de IL-22 ou IL-20, isoladamente ou em conjunto, no tratamento de doenças auto-imunes, doença atópica, NIDDM, pancreatite e disfunção renal, como descrito acima. A forma solúvel de IL-22RA pode ser usada para promover uma resposta de anticoprpo mediada por células Th e/ou para promover a produção de IL-4 e outras citocinas pelos linfócitos e outras células do sistema imunológico.

Os receptores solúveis de IL-22RA, aqui descritos são úteis como antagonistas de IL-20 ou citocina IL-22. Tais efeitos antagonistas podem ser alcançados pela neutralização directa ou ligação de IL-20 ou IL-22. Além de usos antagonistas, os receptores solúveis aqui descritos podem ligar IL-22 e agir como proteínas transportadoras de IL-20 105 ou citocina IL-22, para o transporte do ligante para diferentes tecidos, órgãos e células dentro do corpo. Como tal, os receptores solúveis aqui descritos podem ser fundidos ou acoplado a moléculas, polipeptideos ou metades químicas que direccionam o complexo de receptor solúvel do ligante para um sítio específico, como um tecido, células imunes específicas, ou tumor. Por exemplo, nos casos de infecção aguda ou alguns tipos de cancro, o benefício pode resultar da indução da inflamação e resposta de proteínas de fase aguda local pela acção de IL-22. Assim, os receptores solúveis aqui descritos podem ser usados especificamente para a acção direta de IL-20 ou IL-22. Ver, Cosman, D. 5 Cytokine: 95-106,1993 e Botran-Fernandez, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9:497-513, 2000.

Além disso, os receptores solúveis descritos aqui podem ser usados para estabilizar o IL-22 ou IL-20, para aumentar a biodisponibilidade, a longevidade terapêutica e/ou a eficácia do ligante através da estabilização da degradação do ligante ou libertação, ou pela vinculação do ligante para um sítio de acção dentro do corpo. Por exemplo, o IL-β/solúvel e o complexo IL-6R de ocorrência natural que estabiliza IL-6 e pode sinalizar através do receptor gpl30. Ver, Cosman, D. supra. e Fernandez-Botran, R. supra. Além disso, o IL-22RA pode ser combinado com um cognato ligante, como o IL-22 para compreender um complexo ligante e receptor solúvel. Tais complexos podem ser usados para estimular as respostas das células apresentando uma subunidade do receptor companheiro, como, por exemplo, pDIRSI (IL-20RB) ou CRF2-4 (IL-10RB). A especificidade celular dos complexos IL-22RA/ligante pode diferir do observado para o ligante administrado isoladamente. Além disso, os complexos podem ter diferentes propriedades farmacocinéticas, como afectando a meia-vida, dose/ resposta e especificidade do órgão ou tecido. Os complexos IL-22RA/IL-22 ou IL-22RA/IL-20 podem ter, assim, uma actividade agonista para melhorar a resposta imune ou estimular as células mesangiais ou para estimular as células hepáticas. Alternativamente, tecidos apenas expressando uma subunidade da sinalização heterodimeriza com o complexo podem ser afectada análoga à resposta aos complexos IL6/IL6R (Hirota H. et al. Proc. Nat'l. Acad. 106

Sei. 92:4862-4866, 1995; Hirano, T. em Thomason, A. (Ed.), "The Cytokine Handbook", 3a ed., p. 208-209). Complexos de receptor solúveis/citocinas para IL12 e CNTF mostram actividades similares.

Além disso, a inflamação é uma resposta protectora de um organismo para afastar um agente invasor. A inflamação é um evento em cascata que envolve muitos mediadores celulares e humorais. Por um lado, a supressão de resposta inflamatória pode deixar um hospedeiro imuno-comprometido; no entanto, se for deixada por verificar, a inflamação pode levar a complicações graves, incluindo doenças inflamatórias crónicas (por exemplo, psoriase, artrite, artrite reumatóide, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal, etc), choque séptico e falência de múltiplos órgãos. Importante, estes estados patológicos diversos partilham mediadores inflamatórios comuns. As doenças coletivas que são caracterizadas pela inflamação têm um grande impacto na morbidade e mortalidade humana. Por isso, é claro que as proteínas anti-inflamatórias, como IL-22RA, e anticorpos anti-IL-22RA, podem ter um potencial terapêutico crucial para um grande número de doenças humanas e animais, da asma e alergia à auto-imunidade e ao choque séptico. 1. Artrite A artrite, incluindo osteoartrite, artrite reumatóide, articulações artríticas como resultado de uma lesão, e assim por diante, são processos inflamatórios comuns que beneficiam do uso terapêutico de proteínas anti-inflamatórias, como os polipeptídeos de IL-22RA da presente invenção. Por exemplo, a artrite reumatóide (AR) é uma doença sistémica que afecta todo o corpo e é uma das formas mais comuns de artrite. É caracterizada pela inflamação da membrana que reveste as articulações, causando dor, rigidez, calor, vermelhidão e inchaço. As células inflamatórias libertam enzimas que podem digerir ossos e 107 cartilagens. Como resultado da artrite reumatóide, a inflamação do revestimento da articulação, a membrana sinovial, pode invadir e lesar ossos e cartilagens levando à deterioração das articulações e dor intensa entre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder a sua forma e alinhamento, resultando em dor e perda de movimentos. A artrite reumatóide (AR) é uma doença imune-mediada particularmente caracterizada por inflamação e subsequente dano tecidual levando a uma deficiência grave e aumento da mortalidade. Uma variedade de citocinas é produzida localmente nas articulações reumatóides. Numerosos estudos têm demonstrado que a IL-1 e TNF-alfa, duas citocinas pró-inflamatórias prototípicas, desempenham um papel importante nos mecanismos envolvidos na inflamação sinovial e na destruição articular progressiva. Com efeito, a administração de inibidores TNF-alfa e IL-1 em pacientes com AR levou a uma dramática melhoria dos sinais clínicos e biológicos da inflamação e a uma redução de sinais radiológicos de erosão óssea e destruição da cartilagem. No entanto, apesar destes resultados encorajadores, uma percentagem significativa dos pacientes não responde a esses agentes, sugerindo que outros mediadores também estão envolvidos na fisiopatologia da artrite (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2) :135-149, 2002). Um desses mediadores poderia ser IL-20 ou IL-22, e, como tal, uma molécula que se liga ou inibe IL-22 ou a actividade de IL-20, tais como polipeptídeos de IL-22RA, ou anticorpos anti IL-22RA ou parceiros de ligação, podendo servir como uma terapêutica importante para reduzir a inflamação na artrite reumatóide e outras doenças artríticas.

Existem diversos modelos animais de artrite reumatóide conhecidos na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colagénio (CIA), os ratos desenvolvem artrite inflamatória crónica que se assemelha à artrite reumatóide humana. Uma vez que a CIA partilha características imunológicas e patológicas semelhantes com a AR, torna-se um modelo ideal para a selecção de compostos anti- 108 inflamatórios com potencial humano. 0 modelo da CIA é um modelo bem conhecido nos ratos que depende tanto da resposta imune e uma resposta inflamatória, por ordem de ocorrência. A resposta imune compreende a interacção de células B e células T CD4+ em resposta ao colagénio, que é dado como antigeno, e leva à produção de anticorpos anti-colagénio. A fase inflamatória é o resultado das respostas do tecido dos mediadores da inflamação, como consequência da reacção cruzada de alguns destes anticorpos com o colagénio nativo do rato e activação da cascata do complemento. Uma vantagem em utilizar o modelo CIA é que os mecanismos básicos da patogénese são conhecidos. As células T e epitopos de células B relevantes em colágeno do tipo II foram identificadas, e vários parâmetros imunológicos (por exemplo, hipersensibilidade do tipo adiada, e anticorpo anti-colagénio) e inflamatórios (por exemplo, citocinas, quimiocinas e enzimas de degradação da matriz), relacionados com a artrite imunomediada foram determinados, e podem ser usados para avaliar a eficácia do composto de ensaio no modelo CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al. Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al. Life Sei. 61:1861-78, 1997 e Wang et al. Immunol. 92:8955-959, 1995). A administração de IL-22RA2 solúvel compreendendo polipeptideos (zcytorl6), tais como zcytorl6-FC4 ou outros IL-22RA2 solúveis e proteínas de fusão a estes ratos do modelo CIA foi utilizada para avaliar o uso de IL-22RA2 como um antagonista de IL-22 utilizado para aliviar os sintomas e alterar o curso da doença. Além disso, os resultados mostram inibição da IL-22 por IL-22RA2 provando que outros antagonistas de IL-22, tais como IL-22RA ou respectivos anticorpos, também podem ser usados para aliviar os sintomas e alterar o curso da doença. Uma vez que o ligante de IL-22RA2, IL-22, induz a produção de SAA, que está implicado na patogénese da artrite reumatóide, e a administração IL-22RA2, demonstrada a capacidade de inibir IL-22 e a actividade SAA in vitro e in vivo, sistémica ou local de IL-22RA2 compreendendo polipeptideos, como zcytorl6-FC4 ou outros receptores solúveis de IL-22 (por exemplo, IL-22RA; SEQ ID NO: 3) e anticorpos anti-IL-22RA e proteínas de fusão podem potencialmente suprimir a resposta 109 inflamatória na AR. A injecção de 10 ug de zcytorl6-Fc (três vezes por semana durante quatro semanas) reduziu significativamente o nivel da doença (nivel da pata, incidente de inflamação ou doença) . Outras terapêuticas potenciais incluem polipeptideos de IL-22RA, anticorpos anti-IL-22RA, ou anti-IL-22 anticorpos ou parceiros de ligação, e assim por diante.

Um grupo tem mostrado que um anticorpo anti-rato IL-22 pode reduzir os sintomas num modelo CIA de rato en relação aos ratos de controlo, mostrando conceptualmente que os polipeptideos de IL-22RA solúveis e anticorpos neutralizantes para IL-22RA podem ser benéficos no tratamento de doenças humanas. A administração a um único rato de anticorpo monoclonl de IL-22 especifico (P3/1) reduziu os sintomas de artrite nos animais quando introduzido de forma profilática ou após ser induzida no modelo a artrite induzida CIA (publicação OMPI WO02/068476, publicada 9 de Setembro de 2002). Portanto, os anticorpos anti-IL-22RA da presente invenção, incluindo os anticorpos anti-IL-22RA neutralizados anti-humanos da presente invenção, podem ser usados para neutralizar IL-22 e IL-20 no tratamento de doenças humanas especificas, tais como psoriase, artrite psoriática, artrite, endotoxemia, doença inflamatória intestinal (IBD), colite e outras condições inflamatórias aqui divulgadas. 2. Endotoxemia A endotoxemia é uma condição grave geralmente resultante de agentes infecciosos, como bactérias e outros agentes de doenças infecciosas, sepsis, sindrome do choque tóxico, ou em pacientes imunodeprimidos submetidos a infecções oportunistas, e assim por diante. Proteínas anti- ou inflamatórias terapeuticamente úteis, tais como anticorpos IL-22RA da presente invenção, podem auxiliar na prevenção e tratamento da endotoxemia em humanos e animais. Os polipeptideos IL-22RA, anticorpos anti-IL22RA, 110 anticorpos anti-IL-22 ou parceiros de ligação, podem servir como uma terapêutica importante para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos na endotoxemia. A endotoxemia induzida por lipopolissacarídeo (LPS) envolve muitos dos mediadores pró-inflamatórios que produzem efeitos patológicos nas doenças infecciosas e endotoxemia induzida LPS em roedores é amplamente utilizada e é um modelo aceitável para estudar os efeitos farmacológicos de de agentes pró-inflamatórios e imunomoduladores potenciais. LPS, produzida em bactérias gram-negativas, é um agente causal importante na patogénese do choque séptico (Glausner et al. Lancet 338: 732. 1991). Um estado de choque pode realmente ser induzido experimentalmente por uma única injeção de LPS em animais. As moléculas produzidas por células que respondem ao LPS podem direccionar os patógenos directamente, ou indiretamente. Embora estas respostas biológicas protejam o hospedeiro contra patógenos invasores, elas também podem causar danos. Assim, a estimulação maciça da imunidade inata, que ocorre como resultado de uma infecção Gram-negativa bacteriana grave, leva à produção excessiva de citocinas e outras moléculas, bem como ao desenvolvimento de uma sindrome fatal, sindrome do choque séptico, que é caracterizada por febre, hipotensão, coagulação intravascular disseminada e falência de múltiplos órgãos (Dumitru et al. Cell 103:1071-1083, 2000).

Estes efeitos tóxicos do LPS são principalmente relacionados com a activação dos macrófagos, levando à libertação de vários mediadores inflamatórios. Entre esses mediadores, TNF parece desempenhar um papel crucial, como indicado pela prevenção de toxicidade LPS pela administração de anticorpos anti-TNF (Beutler et al. Science 229:869, 1985). Está bem estabelecido que a injecção de E. coli LPS num rato C57B1/6 irá resultar em aumentos significativos no IL-6 circulante, TNF-alfa, IL-1, e proteínas de fase aguda (por exemplo, SAA) , aproximadamente 2 horas após a injecção. A toxicidade de LPS parece ser mediada por essas citocinas como a 111 imunização passiva contra esses mediadores pode resultar em diminuição da mortalidade (Beutler et al. Science 229:869, 1985). 0 potencial de estratégias de imunointervenção para a prevenção e/ou tratamento de choque séptico incluem anti-TNF mAb, antagonista do receptor IL-1, LIF, IL-10 e G-CSF. A administração de IL-22RA2 solúvel compreendendo polipeptideos, como zcytorl6-FC4 ou outros IL-22RA solúveis e proteínas de fusão a esses modelos de LPS induzida foi utilizada para avaliar o uso de IL-22RA2 para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença pela LPS induzida. Além disso, os resultados mostram inibição de IL-22 por IL-22RA2 provando o conceito que outros antagonistas de IL-22, tais como IL-22RA ou respectivos anticorpos, também podem ser usados para aliviar os sintomas no modelo de LPS induzida e alterar o curso da doença. 0 modelo mostrou indução de IL-22 por injecção de LPS e o potencial tratamento da doença por polipeptideos IL-22RA2. Uma vez que a LPS induz a produção de lL-22pró-inflamatório, SAA ou outros factores pró-inflamatórios, possivelmente contribuindo para a patologia da endotoxemia, a neutralização da actividade de IL-22, SAA ou outros factores pró-inflamatórios por um antagonista de polipeptídeo IL-22RA2 podem ser usados para reduzir os sintomas da endotoxemia, como foi visto no choque endotóxico. Outras terapêuticas potenciais incluem polipeptideos IL-22RA, anticorpos anti-IL-22RA, ou anticorpos anti-IL-22 ou parceiros de ligação, e assim por diante.

3. Doença inflamatória intestinal. IBP

Nos Estados Unidos aproximadamente 500.000 pessoas sofrem de Doença Inflamatória Intestinal (IBD) , que podem afectar tanto o cólon como o recto (colite ulcerosa) ou ambos, intestinos delgado e grosso (Doença de Crohn). A patogénese destas doenças não é clara, mas envolvem inflamação crónica dos tecidos afectados. Os polipeptideos IL-22RA, 112 anticorpos anti-IL-22RA, ou anticorpos anti-IL-22 ou parceiros de ligação, poderiam servir como uma terapêutica importante para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos nas doenças inflamatórias intestinais e doenças relacionadas. A colite ulcerosa (UC) é uma doença inflamatória do intestino grosso, comummente chamado de cólon, caracterizada por inflamação e ulceração da mucosa ou revestimento interior do cólon. Esta inflamação causa o esvaziamento do cólon com frequência, resultando em diarréia. Os sintomas incluem a flexibilização das fezes e cólicas abdominais associadas, febre e perda de peso. Embora a causa exacta da UC seja desconhecida, pesquisas recentes sugerem que as defesas naturais do organismo operam contra as proteínas no corpo que o organismo acha que são estranhas (uma "reacção auto-imune"). Talvez porque se assemelham a proteínas bacterianas no intestino, estas proteínas podem instigar ou estimular o processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. Como a mucosa do cólon é destruída, as úlceras formadas libertam muco, pus e sangue. A doença geralmente começa na região rectal, podendo eventualmente estender-se por todo o intestino grosso. Episódios repetidos de inflamação levam ao espessamento da parede do intestino e do recto com tecido cicatricial. A morte do tecido do cólon ou sepsis pode ocorrer com a gravidade da doença. Os sintomas da colite ulcerosa variam em gravidade e o seu início pode ser gradual ou repentino. Os ataques podem ser provocados por diversos factores, incluindo infecções respiratórias ou stress.

Embora não haja actualmente nenhuma cura disponível para a UC, os tratamentos são centrados sobre a supressão do processo de inflamatória anormal no revestimento do cólon. Tratamentos, incluindo corticosteróides imunossupressores (por exemplo, azatioprina, mercaptopurina e methotrexate) e aminosalicitatos estão disponíveis para tratar a doença. No entanto, o uso a longo prazo de imunossupressores, como corticóides e azatioprina pode resultar em efeitos 113 secundários graves, incluindo enfraquecimento dos ossos, cataratas, infecções do fígado e efeitos na medula óssea. Nos pacientes nos quais as terapias actuais não são bem sucedidas, a cirurgia é uma opção. A cirurgia envolve a remoção de todo o cólon e do recto.

Existem diversos modelos animais que podem imitar parcialmente a colite ulcerosa crónica. 0 modelo mais utilizado é o modelo de indução de colite de ácido/etanol 2,4, β-trinitrobenesulfónico (TNBS), que induz a inflamação crónica e a ulceração do cólon. Quando TNBS é introduzido no cólon dos ratos susceptíveis por via de instilação intra-rectal, induz resposta imune das células T mediadas na mucosa do cólon, levando, neste caso, a uma inflamação maciça da mucosa caracterizada pela infiltração densa de células T e macrófagos em toda a parede do intestino grosso. Além disso, esse quadro histopatológico é acompanhado pelo quadro clínico de perda progressiva de peso (perda), diarréia sanguinolenta, prolapso rectal, e espessamento da parede do intestino grosso (Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000).

Outro modelo de colite usa dextrano sulfato de sódio (DSS), que induz uma colite aguda que se manifesta por diarréia com sangue, perda de peso, redução do cólon e ulceração da mucosa, com infiltração de neutrófilos. A colite induzida por DSS é caracterizada histologicamente por infiltração de células inflamatórias na lâmina própria, com hiperplasia linfóide, danos na cripta focal, e ulceração do epitélio. Estas mudanças parecem ser desenvolvidas devido a um efeito tóxico do DSS no epitélio e pela fagocitose de células da lâmina própria e da produção de TNF-alfa e IFN-gama. Apesar do seu uso comum, várias questões sobre os mecanismos de DSS sobre a relevância para a doença humana continuam por resolver. O DSS é considerado como um modelo independente de célula T, porque é observada em células T dos animais com deficiência, tais como ratos SCID. 114 A administração de IL-22RA2solúvel compreendendo polipeptideos, como zcytorl6-FC4 ou outros IL-22RA solúveis e proteínas de fusão destes modelos TNBS ou DSS podem ser usados para avaliar o uso de IL-22RA para aliviar os sintomas e alterar o curso da doença gastrointestinal. Além disso, os resultados mostram inibição de IL-22 por IL-22RA2 provando o conceito que outros antagonistas de IL-22, tais como IL-22RA ou respectivos anticorpos, também podem ser usados para aliviar os sintomas da colite /models IBD e alterar o curso da doença. Observámos a expressão aumentada de IL-22 nos tecidos do cólon dos ratos DSS por RT-PCR, e a actividade sinérgica de IL-22 com IL-lbeta em linhas de células intestinais. Isto indica que IL-22 pode jogar um papel na resposta inflamatória na colite, e a neutralização da actividade de IL-22 pela administrar de polipeptideos IL-22RA2 é uma abordagem terapêutica potencial para IBD. Outras terapêuticas potenciais incluem polipeptideos de IL-22RA, anticorpos anti-IL-22RA, ou anticorpos anti-IL-22 ou parceiros de ligação, e assim por diante. 4. Psoríase A psoríase é uma condição crónica da pele que afecta mais de sete milhões de americanos. A psoríase ocorre quando novas células da pele crescem de forma anormal, resultando em inflamação, inchaço, descamação e manchas na pele, onde a pele velha não tem descamado com rapidez suficiente. A psoríase em placas, a forma mais comum, é caracterizada por manchas inflamadas de pele ("lesões") cobertas com escamas prateadas brancas. A psoríase pode ser limitada a poucas placas ou envolver áreas moderadas ou extensas da pele, aparecendo mais frequentemente no couro cabeludo, joelhos, cotovelos e tronco. Embora seja muito visível, a psoríase não é uma doença contagiosa. A patogénese da doença é a inflamação crónica dos tecidos afectados. Os polipeptideos IL-22RA, anticorpos anti-IL-22RA, ou anticorpos anti-IL-22 e anti-IL-20 ou parceiros de ligação, poderiam servir como uma terapêutica importante para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos da psoríase, outras doenças 115 inflamatórias da pele, alergias da pele e mucosas e doenças relacionadas. A psoriase é uma desordem inflamatória das células T mediadas da pele que pode causar um desconforto considerável. É uma doença para a qual não há cura e afecta pessoas de todas as idades. A psoriase afecta cerca de dois por cento da população da Europa e América do Norte. Embora os indivíduos com psoriase leve muitas vezes possam controlar a doença com medicamentos tópicos, mais de um milhão de pacientes em todo o mundo exigem terapia imunossupressora ultravioleta ou sistémica. Infelizmente, a inconveniência e os riscos da radiação ultravioleta e a toxicidade de muitas terapias limita a sua utilização a longo prazo. Além disso, os pacientes geralmente apresentam recidiva da psoriase e, em alguns casos de repercussão, logo após a interrupção da terapia imunossupressora. IL-20 é um novo homólogo de IL-10 que foi mostrado causar a mortalidade neonatal, com alterações da pele, incluindo diferenciação epidérmica anormal em ratos transgénicos IL-20 (Blumberg H et al. Cell 104:9-19, 2001) em que o receptor IL-20 é dramaticamente sobre regulado na pele psoriática. Uma vez que IL-22 compartilha uma subunidade do receptor (zcytorll) com o receptor IL-20 e os ratos transgénicos IL-22 exibem um fenótipo semelhante, é possível que a IL-22 também está envolvido nas doenças inflamatórias da pele como a psoriase. A administração de polipeptídeo de IL-22RA ou um antagonista do anticorpo anti-IL-22RA, quer por via subcutânea ou tópica, pode reduzir potencialmente a inflamação e os sintomas. Outras terapêuticas potenciais incluem polipeptídeos IL-22RA, polipeptídeos de receptor solúvel zcytorll/CRF2-4, ou anticorpos anti-IL-22 ou parceiros de ligação, e assim por diante.

Além disso, a sobre-expressão de IL-22 e IL-20 foi demonstrada em lesões de psoriase humana, sugerindo que IL- 116 22, como IL-20 também estão envolvidos na psoríase humana. Além disso, como aqui descrito, a sobre-expressão de IL-20 ou IL-22 em ratos transgénicos mostrou espessamento da epiderme e o envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo de psoríase; e na injecção adicional de IL-22 em ratos normais mostrou espessamento da epiderme e envolvimento de células imunes indicativo de um fenótipo de psoríase, que foi retirado pelo antagonista do receptor solúvel IL-22RA2 (zcytorl6; Publicação da OMPI WO 01/40467). Tais dados in vivo sugere ainda que IL-22 pró-inflamatório está envolvido na psoríase. Como tal, os antagonistas de IL-22 e actividade de IL-20, tais como os receptores solúveis IL-22RA, e os anticorpos correspondentes, incluindo os anticorpos monoclonais anti-humanos-IL-22RA e anticorpos neutralizantes da presente invenção são úteis no tratamento terapêutico de doenças inflamatórias, especialmente como antagonistas de IL-22 e IL-20 isoladamente ou em conjunto no tratamento da psoríase. Além disso, os antagonistas da actividade de IL-22, tais como receptores solúveis IL-22RA, e os anticorpos correspondentes, incluindo os anticorpos monoclonais anti-humanos-IL-22RA e anticorpos neutralizantes da presente invenção são úteis no tratamento terapêutico de outras doenças inflamatórias, por exemplo, como agentes que ligam, bloqueam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam IL-22 e IL-20 no tratamento da dermatite atópica, IBD, colite, endotoxemia, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática e doença respiratória em adultos (ARD), choque séptico, falência múltipla de órgãos, lesões inflamatórias pulmonares como asma ou bronquite, pneumonia bacteriana, psoríase, eczema atópico e dermatite de contacto, e doença inflamatória intestinal como colite ulcerativa e doença de Crohn.

Além disso, os anticorpos anti-IL-22RA da presente invenção podem ser usados na prevenção e terapia contra a perda de peso associada a uma série de doenças inflamatórias aqui descritas, bem como para o cancro (por exemplo, quimioterapia e caquexia) e doenças infecciosas. Por exemplo, perda de peso severa é um marcador-chave associado com modelos de septicemia, MS, RA, e modelos de tumor. Além disso, a perda de peso é um parâmetro essencial para 117 muitas doenças humanas, incluindo cancro, doenças infecciosas e doenças inflamatórias. A perda de peso foi demonstrada em ratos injectados com IL-22Adenovirus aqui descrito. Os anticorpos anti-IL-22 e antagonistas IL-22, tais como do receptor solúvel de IL-22RA, e os anticorpos correspondentes da presente invenção, bem como os receptores zcytorl6 (IL-22RA2), podem ser testados pela sua capacidade de prevenir e tratar perda peso em ratos injectados com andenovirus IL-22 aqui descritos. Métodos de determinação de um esquema terapêutico ou profilático para esses antagonistas de IL-22 são conhecidos na técnica e podem ser determinados usando os métodos descritos neste documento.

Polipeptideos de receptor solúvel de IL-22RA e respectivos anticorpos também podem ser utilizados em sistemas de diagnóstico para a detecção de níveis circulantes de IL-22 ou de ligante de IL-20, e na detecção de IL-22 associado com a fase aguda da resposta inflamatória. Dentro de uma modalidade relacionada, anticorpos ou outros agentes que se ligam especificamente a receptores solúveis de IL-22RA descritos aqui podem ser usados para detectar a circulação polipeptideos de receptor; inversamente, receptores solúveis de IL-22RA podem ser usados para detectar a circulação local ou da acção de polipeptideos de IL-22 ou IL-20. Niveis elevados baixos de ligante ou receptor de polipeptideos podem ser um indicativo de condições patológicas, incluindo a inflamação ou cancro. IL-22 é conhecido por induzir resposta inflamatória de fase aguda associada. Além disso, a detecção de proteínas de fase aguda ou moléculas, tais como IL-20 ou IL-22 podem ser indicativas de uma condição inflamatória crónica em alguns estados de doença (por exemplo, psoríase, artrite reumatóide, colite, IBD). A detecção de condições serve como auxílio no diagnóstico da doença, bem como ajuda ao médico na escolha da terapia adequada.

Na administração in utero de anti-IL-22 neutralizante ou anticorpos de IL-20 podem ser usados para mostrar a eficácia in vivo em modelos de doenças, reduzindo ou 118 eliminando o fenótipo de pele encontrados em filhotes transgénicos IL-22 que sobre expressam IL-22 ou filhotes transgénicos IL- 20 que sobre expressam IL-20. Existem precedentes na técnica no tratamento in útero com anticorpos monoclonais neutralizantes (mAbs). Num caso, o desenvolvimento do subconjunto B-l de células B foi drasticamente afectado pelo tratamento de ratos fêmeas grávidas com um mAb especifico para a molécula de células B especificas, CD19 (por exemplo, Krop I. et al. Eur. J. Immunol. 26 (1) :238-42, 1996). Krop et al. injectou intraperitonealmente ratas grávidas de tempo com 500ug de ratos CD19 mAb anti-rato (ou um rato isotipo com controlo de correspondência Ab) em PBS iniciando no dia 9 de gestação, com injecções subsequentes a cada dois dias até ao nascimento. Os filhotes também foram injectados uma vez com 500ug destes anticorpos aos 10 dias de idade. Em outro caso, Tanaka et al., constatou que no tratamento in útero com anticorpo monoclonal para receptor beta-corrente de IL-2 anula completamente o desenvolvimento de células epidérmicas dendriticas Thy-1+. As duas subunidades distintas do receptor IL-2, ou seja, a cadeia alfa (IL-2R alfa) e a cadeia beta (IL-2R beta), são expressas de uma forma quase mutuamente exclusiva ao longo da ontogenia do timo fetal. Bloqueando IL-2R beta, um sinal de transdução componente de IL-2R, pela administração de um mAb neutralizante a IL-2R beta, resultou no desaparecimento completo e selectivo das células dendriticas epidérmicas Thy-1+ da pele. O desenvolvimento de qualquer outro subconjunto de células T não foi comprometido. Isto indica que IL-2 desempenha um papel crucial no desenvolvimento das células V gama 5+ fetais e seus descendentes (ver, Tanaka, T. et al. Immunol, Int. 4(4) :487-9, 1992). Além disso, Schattemann GC et al. revelou que PDGF-A é necessário para o normal desenvolvimento cardiovascular murino, usando um sistema in útero. Diversas linhas de evidência sugerem que as plaquetas derivadas da cadeia de factor de crescimento A (PDGF-A) são necessárias para o desenvolvimento embrionário cardiovascular normal. A introdução de anticorpos neutralizantes anti-PDGF-A em decídua de rato in útero resultaram na interrupção selectiva das interações receptor ligante PDGF-A in vivo por um período de 18-24 horas e permitiu avaliar se PDGF-A é necessário para o desenvolvimento cardiovascular e quando é necessário (ver, 119

Schattemann GC et al. Dev. Biol. 176 (1) :133-42, 1996). Estes resultados, assim como outros descritos na técnica, provam que mAbs neutralizantes podem provocar fortes efeitos in útero. Similarmente, podem ser mostrados os dados quedemonstram a eficácia de IL-20 neutralizante ou IL-22 com anticorpos monoclonais in vivo em modelos de doenças para reduzir ou eliminar o fenótipo de pele encontrado em IL-20 e em filhotes transgénicos IL-22 que sobre expressam IL-20 e IL-22, respectivamente. Estes ratos transgénicos nascem com uma aparência de pele "brilhante", devido pelo menos em parte a um espessamento da epiderme, como descrito aqui. Os filhotes TG IL-20 expressam razoavelmente baixos níveis da citocina transgénica e podem recuperar sobreviver, mas os ratos TG IL-22 morrem logo após o nascimento, geralmente antes dos 5 dias de idade.

Por exemplo, anticorpos neutralizantes para IL-20 incluem anticorpos, tais como anticorpos monoclonais neutralizantes que se podem ligar a epítopos antigénicos IL-20 e neutralizar a actividade de IL-20. Assim, epítopos antigénicos de peptídeos estruturais e polipeptídeos de IL-20 são úteis para aumentar os anticorpos que se ligam com os polipeptídeos de IL-20 aqui descritos, bem como identificar e seleccionar anticorpos monoclonais anti-IL-20 que são neutralizantes, e que podem ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a actividade de IL-20. Essa neutralização de anticorpos monoclonais pode ligar a um epítopo antigénico IL-20. Esses epítopos na SEQ ID NO: 8, como previsto por um lote Jameson-Wolf, por exemplo, usando o programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), serve como epítopos antigénicos preferidos e podem ser determinados por um especialista na técnica. Esses epítopos antigénicos incluem: resíduos de aminoácidos 42 (Ile) para 102 (Asp) da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 42 (Ile) para 60 (Ile)+ da SEQ ID NO: 8;

resíduos de aminoácidos 42 (Ile) para 69 (Glu) da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 42 (Ile) para 81 (Cys) da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 42 (Ile) para 96 (Lys) , da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 42 (Ile) para 102 (Asp) da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 60 (Ile) para 69 (Glu) da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 60 (Ile) para 81 (Cys ) da SEQ ID NO: 8; 120 resíduos de aminoácidos 60 (Ile) para 96 (Lys), da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 60 (Ile) para 102 (Asp) da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 69 (Glu) para 81 (Cys) da SEQ ID NO: 8; 69 resíduos de aminoácidos 69 (Glu) para 96 (Lys), da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 69 (Glu) para 102 (Asp) da SEQ ID NO 8; resíduos de aminoácidos 81 (Cys) para 96 (Lys) da SEQ ID NO: 8; resíduos de aminoácidos 81 (Cys) para 102 (Asp) da SEQ ID NO: 8; e resíduos de aminoácidos 96 (Lys) para 102 (Asp) da SEQ ID NO: 8.

Além de modelos de outras doenças descritas, a actividade de anticorpos de anti-IL-22RA no tecido inflamatório derivado de lesões de psoríase humana podem ser medidos in vivo tilizando uma combinação severa de deficiência imune (SCID) no modelo do rato. Diversos modelos de rato têm sido desenvolvidos em células humanas que são implantadas em ratos imunodeficientes (colectivamente referidos como modelos xenoenxerto); ver, por exemplo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994 e Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996. Como no modelo de xenoenxerto in vivo para a psoríase, o tecido da pele humana psoriática é implantado no modelo de rato SCID, e desafiado com um antagonista adequado. Além disso, outros modelos animais psoríase da técnica podem ser usados para avaliar os antagonistas de IL-20 e IL-22, tais como enxertos de pele humana psoriática implantados em modelos do rato AGR129, e desafiados com um antagonista adequado (por exemplo, ver, Boyman, 0. et al. J. Exp. Med. Publicação on-line #20031482, 2004) . Os anticorpos anti-IL-22RA que se ligam, bloqueam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam a actividade de IL-22 ou IL-20 e IL-22 são antagonistas preferenciais, porém, os anticorpos anti-IL-20 e anti-IL-22 (sós ou em combinação), IL-22RA solúvel, bem como outros antagonistas de IL-20 e IL-22 podem ser utilizados neste modelo. Do mesmo modo, tecidos ou células humanas provenientes de colite, IBD, artrite ou outras lesões inflamatórias podem ser usadas no modelo SCID para avaliar as propriedades anti-inflamatórias dos antagonistas de IL-20 e IL-22 aqui descritos. 121

Terapias destinadas a suprimir, retardar ou reduzir a inflamação usando anticorpos anti-IL-22RA ou seus derivados, agonistas, conjugados ou variantes podem ser testados por administração de anticorpos anti-IL-22RA ou compostos solúveis de IL-22RA a ratos SCID com tecido inflamatório humano (por exemplo, lesões de psoriase e similares), ou outros modelos aqui descritos. A eficácia do tratamento é medida e avaliada estatisticamente como aumento do efeito anti-inflamatório na população tratada ao longo do tempo, utilizando métodos conhecidos na técnica. Alguns métodos exemplares incluem, mas não estão limitados à medição, por exemplo, num modelo de psoriase, da espessura da epiderme, o número de células inflamatórias na derme superior, e os graus de paraqueratose. Tais métodos são conhecidos na técnica e aqui descritos. Por exemplo, ver Zeigler, M. et al. Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner, TM et al. J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. et al. Microbio.l Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, SP et al. Br. J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. H et al. Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. H et al. J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff, BJ et al. Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H et al. Cutan J. . Pathol. 24: 1, 1997; Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sei. 17:85, 1998 e Villadsen LS et al. J. Clin. Invest. 112:1571, 2003. A inflamação pode também ser monitorizada ao longo do tempo através de métodos conhecidos, tais como a citometria de fluxo (ou PCR) para quantificar o número de células inflamatórias ou lesionais presentes numa amostra, o resultado (perda de peso, diarréia, sangramento rectal, comprimento do cólon) para IBD, o resultado da doença na pata e o resultado da inflamação para o modelo CIA RA. Por exemplo, as estratégias terapêuticas adequadas para testes num modelo desse tipo incluem o tratamento directo utilizando anticorpos anti-IL-22RA, com antagonistas IL-20 e IL-22 (isoladamente ou em conjunto), ou conjugados relacionados ou antagonistas baseados na interaeção de ruptura de anticorpos anti-IL-22RA com os seus ligantes IL-20 e IL-22, ou de terapias baseadas em células utilizando anticorpos anti-IL-22RA ou seus derivados, agonistas, conjugados ou variantes. 122

Além disso, a psoríase é uma doença inflamatória crónica da pele que está associada com hiperplasia queratinócita da epiderme e infiltrado de células mononucleares, incluindo células T de memória CD4+, neutrófilos e macrófagos (Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996). Acredita-se actualmente que os antígenos ambientais desempenham um papel importante no início e contribuem para a patologia da doença. No entanto, é a perda da tolerância a auto-antígenos que é pensado para mediar a patologia da psoríase. As células dendríticas e as células T CD4+ são pensadas para jogar um papel importante na apresentação de antígenos e reconhecimento que medeiam a resposta imune que conduz à patologia. Recentemente, desenvolvemos um modelo de psoríase com base no modelo de transferência CD4+ CD45RB (Davenport et al. Internat. Immunopharmacol., 2:653-672). Anti-IL20, anti-IL22 ou anticorpos para IL20R e/ou IL22R, tais como anticorpos anti-IL-22RA da presente invenção, ou IL-22RA solúvel, são administrados aos ratos. A inibição dos resultados da doença (lesões de pele, citocinas inflamatórias) indica a eficácia dos antagonistas IL-20 e IL-22 na psoríase, por exemplo, anticorpos anti-IL-22RA ou receptores solúveis IL-22RA, ou outros antagonistas como anticorpos contra IL20 e/ou IL-22 ou seus receptores.

Dermatite Atópica.

Tanto o IL-20 e IL-22 são sobre regulados em amostras do paciente com dermatite atópica humana (AD). A AD é uma doença inflamatória crónica comum que se caracteriza por citocinas hiperactivadas do subconjunto de células T helper 2 (Th2) . Embora a etiologia exacta da AD seja desconhecida, vários factores têm sido implicados, incluindo as respostas imunes hiperativas Th2, autoimunidade, infecção, alérgenos, e predisposição genética. As principais características da doença incluem xerose (secura da pele), prurido (comichão na pele), conjuntivite, lesões inflamatórias da pele, infecção por Staphylococcus aureus, elevada eosinofilia do sangue, 123 elevação da IgE e IgGl, e dermatite crónica com células T, mastócitos, macrófagos e infiltração de eosinófilos. A colonização ou infecção por S. Aureus tem sido reconhecida como provocando a exacerbação da AD e perpetuação da cronicidade da doença de pele. A AD é frequentemente encontrada em pacientes com asma e rinite alérgica, e é frequentemente a primeira manifestação de doença alérgica. Cerca de 20% da população em países ocidentais sofrem destas doenças alérgicas e a incidência da AD nos países desenvolvidos está a aumentar por razões desconhecidas. A AD normalmente começa na infância e muitas vezes pode persistir até à adolescência e à idade adulta. Os tratamentos actuais para a AD incluem corticosteróides, ciclosporina A oral, imunossupressores não-corticóides tal como tacrolimus (FK506 em forma de pomada) e interferão gama. Apesar da variedade de tratamentos para a AD, os sintomas de muitos pacientes não melhoram, ou têm reacções adversas aos medicamentos, que exigem a busca de outros, mais eficazes agentes terapêuticos. Os anticorpos anti-IL-22RA da presente invenção, incluindo a neutralização de anticorpos humanos anti-IL-22RA da presente invenção, podem ser usados para neutralizar IL-22 e IL-20 no tratamento de doenças humanas específicas, tais como a dermatite atóptica, condições inflamatórias da pele, e outras condições inflamatórias aqui divulgadas.

Para uso farmacêutico, os anticorpos anti-IL-22RA da presente invenção são formulados para entrega parenteral, particularmente por via intravenosa ou subcutânea, de acordo com os métodos convencionais. A administração intravenosa será por injecção em bolus, de libertação controlada, por exemplo, usando mini-bombas ou outras tecnologias apropriadas, ou por perfusão durante um período típico de uma a várias horas. Em geral, as formulações farmacêuticas incluem uma proteína hematopoética em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como soro fisiológico, solução salina, dextrose 5% em água ou algo parecido. As formulações podem ainda incluir um ou 124 mais excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tampão, albumina para prevenir a perda de proteína na superfície do frasco, etc. Quando se utiliza como uma terapia de combinação, as citocinas podem ser combinadas numa única formulação ou podem ser administradas em formulações distintas. Métodos de formulação são bem conhecidos na técnica e são divulgados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co. Easton, PA, 1990. As doses terapêuticas serão geralmente, na faixa de 0,1 a 100 mg/kg de peso do paciente por dia, de preferência de 0,5-20 mg/kg por dia, com a dose exacta determinada pelo médico de acordo com normas aceites, tendo em conta a natureza e severidade da condição a ser tratada, características do paciente, etc. A determinação da dose está dentro do nível de habilidade ordinária na técnica. As proteínas serão comummente administradas durante um período de até 28 dias após a quimioterapia ou transplante de medula óssea, ou até que uma contagem de plaquetas de >20000/mm3, de preferência >50000/mm3, seja alcançada. Mais comummente, as proteínas serão administrados por uma semana ou menos, muitas vezes durante um período de um a três dias. Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpos anti-IL-22RA da presente invenção é uma quantidade suficiente para produzir um aumento clinicamente significativo na proliferação e/ou diferenciação de células progenitoras mielóides ou linfóides, que se manifestará como um aumento dos níveis circulantes de células maduras (por exemplo, neutrófilos ou plaquetas). O tratamento dos transtornos das plaquetas, pode ser continuado, assim, até uma contagem de plaquetas de pelo menos 20000/mm3, de preferência 50000/mm3, seja alcançado. IL-22RA solúvel ou anticorpos anti-IL-22RA da presente invenção também podem ser administrados em combinação com outras citocinas tais como IL-3, -6 e -11, factor de célula-tronco; eritropoietina; G-CSF e GM-CSF. Dentro de esquemas de terapêutica combinada, as doses diárias de outras citocinas em geral devem ser: EPO, 150 U kg; GM-CSF, 5-15 lg/kg; IL-3, 1-5 lg/kg e G-CSF, 1-25 lg/kg. A terapia combinada com EPO, por exemplo, é indicada em pacientes anémicos com baixos níveis de EPO. 125

Geralmente, a dosagem de administração solúvel de IL-22RA (ou análogo de IL-22RA ou proteína de fusão) ou anticorpos anti-IL-22RA irá variar dependendo de factores como a idade do paciente, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médica prévia. Normalmente, é desejável fornecer ao destinatário uma dosagem de IL-22RA solúvel ou anticorpos anti-IL-22RA que esteja na faixa de cerca de 1 pg/kg para 10 mg/kg (quantidade de agente/peso corporal do paciente), embora uma dosagem maior ou menor também possa ser administrada se as circunstâncias o exigirem. A administração de IL-22RA solúvel ou anticorpos anti-IL-22RA a sujeito pode ser por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, por perfusão através de um cateter local, ou por injecção directa intralesional. Ao administrar as proteínas terapêuticas por injecção, a administração pode ser feita por infusão contínua ou bolus únicos ou múltiplos.

As rotas adicionais de administração incluem por via oral, membrano-mucosal, pulmonar e transcutânea. A entrega oral é adequada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinóides, microesferas de policianoacrilato e sistemas baseados em lipídios (ver, por exemplo, DiBase e Morrei, "Oral Delivery of

Microencapsulated Proteins", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). A viabilidade de uma entrega intranasal é exemplificada por um modo de administração de insulina (ver, por exemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). As partículas secas ou líquidas compreendendo IL-22RA podem ser preparadas e inaladas com a ajuda de dispersores de pó seco, geradores de aerossóis líquidos, ou nebulizadores (por ex., Pettit e Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al. Adv. Drug Deliv.

Rev. 35:235 (1999)). Esta abordagem é ilustrada pelo sistema de gestão da diabetes AERX, que é um inalador de mão eletrónico que fornece a insulina em aerossol aos pulmões. Estudos têm demonstrado que as proteínas tão 126 grandes como 48000 kDa foram entregues através da pele em concentrações terapêuticas, com o auxílio de ultra-som de baixa frequência, o que ilustra a viabilidade da administração transcutânea (Mitragotri et al. Science 269:850 (1995)). A entrega transdérmica usando electroporação fornece outra forma de administrar uma molécula tendo actividade de ligação de IL-22RA (Potts et al. Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).

Uma composição farmacêutica compreendendo IL-22RA solúvel ou um anticorpo anti-IL-22RA pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, segundo o qual as proteínas terapêuticas são combinadas numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição é dita ser um "transportador farmaceuticamente aceitável" se a sua administração poder ser tolerada por um paciente receptor. O tampão fosfato salino estéril é um exemplo de um veículo farmaceuticamente aceitável. Outros veículos apropriados são bem conhecidos pelos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a edição (Mack Publishing Company 1995) .

Para fins de terapia, IL-22RA solúvel ou moléculas de anticorpo anti-IL-22RA e um veículo farmaceuticamente aceitável são administrados a um paciente numa quantidade terapeuticamente eficaz. A combinação de uma molécula terapêutica da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável é dito ser administrado numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo, se a sua presença resultar numa mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente usado para tratar a inflamação é fisiologicamente significativo se a sua presença diminuir a resposta inflamatória. 127

Uma composição farmacêutica compreendendo IL-22RA (ou um análogo de IL-22RA ou proteina de fusão) ou anticorpos neutralizantes de anti-IL-22RA pode ser fornecida na forma liquida, num aerossol, ou em forma sólida. As formas liquidas são ilustradas por soluções injectáveis e suspensões orais. Formas sólidas exemplares incluem cápsulas, comprimidos e formas de libertação controlada. Esta última forma é ilustrada por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al. Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al. "Protein Delivery with Infusion Pumps," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al. "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997) ) .

Os lipossomas fornecem um meio para entregar polipeptideos terapêuticos a um sujeito por via intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutânea, ou via administração oral, inalação ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas compostas por uma ou mais bicamadas lipídicas em torno de compartimentos aquosos (ver, em geral, Bakker-Woudenberg et al. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), e Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 24/03 (CRC Press 1995)). Os lipossomas são similares em composição às membranas celulares e, como resultado, os lipossomas podem ser administrados de forma segura e são biodegradáveis. Dependendo do método de preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares, e podem variar em tamanho, com diâmetros variando entre 0,02 pm a mais de 10 pm. Uma variedade de agentes pode ser encapsulada em lipossomas: partição de agentes hidrófobos em bicamadas e partição de agentes hidrofílicos dentro do espaço interno aquoso (s) (ver, por exemplo, Machy et al. Liposomes in Cell Biology and Pharmacology (John Libbey 1987), e Ostro et al. American J. 128

Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Além disso, é possível controlar a disponibilidade do agente terapêutico encapsulado em lipossomas através da variação do tamanho, do número de bicamadas, da composição lipídica, bem como da carga e características de superfície dos lipossomas.

Os lipossomas podem absorver praticamente qualquer tipo de célula e, em seguida, libertar lentamente o agente encapsulado. Alternativamente, um lipossoma absorvido pode ser endocitosado pelas células que são fagocitárias. A endocitose é seguida pela degradação intralisossomal de lipídios lipossomais e libertação de agentes encapsulados (Scherphof et al. Ann. NY Acad. Sei. 446:368 (1985)). Após a administração intravenosa, os lipossomas pequenos (0,1-1,0 pm) são normalmente assimilados pelas células do sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente no fígado e baço, enquanto os lipossomas maiores que 3,0 pm são depositados no pulmão. Esta captação preferencial de lipossomas menores pelas células do sistema reticuloendotelial tem sido usada para entregar agentes quimioterápicos para macrófagos e tumores do fígado. O sistema reticuloendotelial pode ser contornado através de vários métodos, incluindo a saturação com grandes doses de partículas de lipossomas, ou inactivação selectiva de macrófagos por meios farmacológicos (Claassen et al. Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Além disso, a incorporação de fosfolipídios polietileno glicolipídeo ou glicol derivatizados nas membranas dos lipossomas foi mostrado resultar numa captação significativamente reduzida pelo sistema reticuloendotelial (Allen et al. Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al. Biochim. Biophys. 1150:9 Acta (1993)).

Os lipossomas também podem ser preparados para atingir células específicas ou órgãos, variando a composição de fosfolipídeos ou inserindo receptores ou ligantes nos lipossomas. Por exemplo, os lipossomas preparados com um 129 alto conteúdo de um tensoativo não-iónico, têm sido utilizados para direccionar o fígado (Hayakawa et al. Patente JP 04-244,018; Kato et al. Biol. Pharm. Buli. 16:960 (1993)). Estas formulações foram preparadas pela mistura de soja fospatidilcolina, α-tocoferol e óleo de castor hidrogenado etoxilado (HCO-60) em metanol, concentrando-se a mistura sob vácuo e, em seguida, reconstituída com água. A formulação lipossomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), com uma mistura de derivados de soja esterilglucosida (SG) e colesterol (Ch) também tem sido demonstrada direccionar o fígado (Shimizu et al. Biol. Pharm. Buli. 20:881 (1997)).

Alternativamente, vários ligantes alvos podem ser ligados à superfície do lipossoma, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpos, carboidratos, vitaminas e proteínas de transporte. Por exemplo, os lipossomas podem ser modificados com derivados galactosilipíideos do tipo ramificado para direccionar receptores de asialoglcoproteína (galactose), que são exclusivamente expressos na superfície das células do fígado (Kato e Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drugs Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al. Biol. Pharm. Buli. 20: 259 (1997) ). Da mesma forma, Wu et al. Hepatology 27:772 (1998) , demonstrou que a marcação com lipossomas com asialofetuína levou a uma meia-vida do plasma de lipossoma reduzido e muito maior absorção de asialofetuína de lipossomas marcados pelos hepatócitos. Por outro lado, a acumulação hepática de lipossomas compreendendo derivados galactosilipídeos do tipo ramificado pode ser inibida por pré-injecção de asialofetuína (Murahashi et al. Biol. Pharm. Buli.20: 259 (1997)). Lipossomas poliaconitilatados de albumina humana sérica fornecem uma outra abordagem para os lipossomas direccionados para as células do fígado (Kamps et al. Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 94:11681 (1997)). Além disso, Geho, et al. Patente US 4603044, descreve um sistema de entrega de vesículas de lipossomas hepatócitos dirigida, que tem especificidade para os receptores hepatobiliares associados com as células metabólicas especializadas do fígado. 130

Numa abordagem mais geral para o tecido alvo, as células-alvo são pré-marcadas com anticorpos específicos para biotinilação com um ligante expresso pela célula-alvo (Harasym et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).

Após a eliminação do plasma de anticorpo livre, são administrados lipossomas conjugados com estreptavidina. Em outra abordagem, os anticorpos alvos estão directamente ligados aos lipossomas (Harasym et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).

Polipeptídeos e anticorpos podem ser encapsulados em lipossomas usando técnicas padrão de microencapsulação de proteínas (ver, por exemplo, Anderson et al. Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al. Câncer Res. 50:1853 (1990), e Cohen et al. Biochim. Biophys. 1063:95 Acta (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," em Liposome Technology, 2a edição, vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al. Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como mencionado acima, lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem incluir os derivados de lipídios de poli (etileno glicol) (Allen et al. Biochim. Biophys. 1150:9 Acta (1993)).

As microesferas de polímero degradáveis foram concebidas para manter elevados níveis sistémicos de proteínas terapêuticas. As microesferas são preparados a partir de polímeros biodegradáveis, tais como poli (láctico-co-glicólico) (PLG), polianidridos, poli (orto ésteres), polímeros de acetato etilvini não-biodegradáveis, no qual as proteínas são presas ao polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of

Polymers in Drug Delivery", em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz "Degradable Controlled Release Aystems Useful for Protein Delivery", em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al. Science 281:1161 (1998);

Putney e Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); 131

Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Nanoesferas revestidas de polietileno glicol (PEG) também podem fornecer veículos para a administração intravenosa de proteínas terapêuticas (ver, por exemplo, Gref et al. Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)). A presente descrição descreve polipeptídeos modificados quimicamente com actividade de ligação de IL-22RA, tais como receptores solúveis de IL-22RA monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos ou multiméricos e antagonistas de IL-22RA, por exemplo, anticorpos anti-IL-22RA ou polipeptídeos de ligação, ou anticorpos neutralizantes anti-IL-22RA, em que um polipeptídeo está ligado a um polímero, como discutido acima.

Outras formas de dosagem podem ser concebidas por os peritos na técnica, como mostrado, por exemplo, em Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 1 a edição (Mack Publishing Company 1995), e Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996). A presente invenção contempla composições de anticorpos anti-IL-22, e métodos e usos terapêuticos compreendendo um anticorpo, tal como definido nas reivindicações. Tais composições podem compreender ainda um transportador. O transportador pode ser um transportador convencional, orgânico ou inorgânico. Exemplos de transportadores incluem a água, solução tampão, álcool propilenoglicol, macrogol, óleo de sésamo, óleo de milho, e assim por diante. 132 11. Produção de ratos transgênicos

Foi demonstrada a sobre expressão de IL-20 e IL-22 em lesões de psoríase humana, sugerindo que IL-20 e IL-22 estão envolvidos na psoriase humana. Além disso, como aqui descrito, a sobre-expressão de IL-20 e IL-22 em ratos transgênicos mostrou espessamento da epiderme e envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo de psoriase; e em adição na injecção de IL-22 em ratos normais mostrou espessamento da epiderme e o envolvimento de células imunes indicativo de um fenótipo de psoriase, que foi retirado pelo antagonista do receptor solúvel de zcytorl6 (IL-22RA2). Tais dados in vivo sugere ainda que IL-22 pró-inflamatória está envolvida na psoriase. Como tal, os antagonistas da actividade de IL-22, como os anticorpos monoclonais e neutralizantes anti-humano-IL-22RA da presente invenção, bem como receptores solúveis IL-22RA, são úteis no tratamento terapêutico de doenças inflamatórias, especialmente como antagonistas de IL-22 e IL-20 no tratamento da psoriase. Além disso, os agentes que ligam, bloqueam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam IL-22 ou IL-20 e actividade de IL-22, como os anticorpos monoclonais e neutralizantes anti-humano-IL-22RA da presente invenção, bem como os receptores solúveis de IL-22RA, são úteis no tratamento terapêutico de outras doenças inflamatórias, por exemplo, como antagonistas de IL-22 ou IL-20 e IL-22 no tratamento de dermatite atópica, IBD, colite, endotoxemia, artrite, artrite reumatóide, e doença respiratória em adultos com artrite psoriática (ARD), choque séptico, falência de múltiplos órgãos, lesões inflamatórias pulmonares como asma ou bronquite, pneumonia bacteriana, psoriase, eczema atópico e dermatite de contacto, e doença inflamatória intestinal como colite ulcerativa e doença de Crohn, e assim por diante.

Dentro de um aspecto, a presente descrição descreve um método de produzir um anticorpo para um polipeptideo compreendendo: inoculação de um animal com um polipeptideo seleccionado do grupo consistindo em: (a) um polipeptideo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a 133 partir do aminoácido número 1 (Pro), para o aminoácido número 6 (Asp); (b) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 26 (Ser) para o aminoácido número 32 (Pro); (c) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3a partir do aminoácido número 41 (Lys), para o aminoácido número 47 (Asp); (d) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 49 (Vai), para o aminoácido número 62 (Cys); (e) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 41 (Lys) para o aminoácido número 62 (Cys); (f) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3a partir do aminoácido número 84 (Ala) para o aminoácido número 97 (Ser); (g) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 103 (Thr) para o aminoácido número 108 (Asp); (h) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 130 (Arg) para aminoácido número 135 (His); (i) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 164 (Gly) para o aminoácido número 166 (Lys); (j) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3a partir do aminoácido número 175 (Tyr), para o aminoácido número 179 (Glu); (k) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 193 (Lys) para o aminoácido número 196 (Ala); (1) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 203 (Lys) para o aminoácido número 209 (Thr); e (m) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; e (n) um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; em que o polipeptídeo provoca uma resposta imune no animal para produzir os anticorpos; e isolar os anticorpos dos animais; e em que o anticorpo se liga especificamente a um polipeptídeo de IL-22RA (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3); e reduzir a actividade de uma IL-20 (SEQ ID NO: 8) ou IL-22 (SEQ ID NO: 6). Numa modalidade o método é como descrito acima, em que o anticorpo produzido pelo método reduz a actividade pró-inflamatória de IL-20 (SEQ ID NO: 8) ou IL-22 (SEQ ID NO: 6) . Numa outra modalidade o 134 método é como descrito acima, em que o anticorpo produzido pelo método neutraliza a interacção de uma IL-20 (SEQ ID NO: 8) ou IL-22 (SEQ ID NO: 6) com IL-22RA (SEQ ID NO: 2). Numa outra modalidade o método é como descrito acima, em que a neutralização pelos anticorpos é medida mostrando a neutralização de uma IL-20 (SEQ ID NO: 8) ou IL-22 (SEQ ID NO: 6) num ensaio de neutralização baseado em célula in vitro. Numa outra modalidade o método é como descrito acima, em que o anticorpo produzido pelo método reduz a actividade pró-inflamatória de IL-20 (SEQ ID NO: 8) e IL-22 (SEQ ID NO: 6) . Numa outra modalidade o método é como descrito acima, em que o anticorpo produzido pelo método neutraliza a interacção de ambas as IL-20 (SEQ ID NO: 8) e IL-22 (SEQ ID NO: 6) com IL-22RA (SEQ ID NO: 2). Numa outra modalidade o método é como descrito acima, em que a neutralização pelos anticorpos é medida mostrando a neutralização de IL-20 (SEQ ID NO: 8) e IL-22 (SEQ ID NO: 6) num ensaio de neutralização baseado em célula in vitro.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo tal como definido nas reivindicações, que se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. A descrição descreve um anticorpo, em que o anticorpo é (a) um anticorpo policlonal, (b) um anticorpo monoclonal murino, (c) um anticorpo humanizado derivado de (b), (d) um fragmento de anticorpo, ou (e) um anticorpo monoclonal humano. Em outra modalidade, o anticorpo é tal como definido nas reivindicações, em que o anticorpo compreende ainda um radionuclideo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, marcador peptídeo, partículas magnéticas, ou toxina. Em outra modalidade o anticorpo é tal como definido nas reivindicações, em que o anticorpo compreende ainda PEGuilação.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de anticorpo tal como definido nas reivindicações que se liga a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de resíduos de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 3; e reduz a actividade pró-inflamatória quer de 135 IL-20 (SEQ ID NO: 8) ou IL-22 (SEQ ID NO: 6). Numa modalidade, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é tal como definido nas reivindicações, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo reduz a actividade pró-inflamatória de IL-20 (SEQ ID NO: 8) e IL-22 (SEQ ID NO: 6) . Em outra modalidade a descrição descreve um anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que ou o fragmento de anticorpo é (a) um anticorpo policlonal, (b) um anticorpo monoclonal murino, (c) um anticorpo humanizado derivado de (b), (d) um fragmento de anticorpo, ou (e) um anticorpo monoclonal humano. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é como descrito acima, em que o anticorpo compreende ainda um radionuclideo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, marcador peptideo, partículas magnéticas, medicamento ou toxina. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é como descrito acima, em que o anticorpo compreende ainda PEGuilação.

Dentro de um outro aspecto, a especificação descreve um método para redução ou inibição de IL-22 induzido ou proliferação induzida de IL-20 ou diferenciação de células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoéticas de medula óssea de cultura ou células do sangue periférico, com uma composição compreendendo uma quantidade de um anticorpo conforme divulgado suficiente para reduzir a proliferação e diferenciação das células hematopoéticas na medula óssea ou células do sangue periférico em relação à medula óssea ou células do sangue periférico cultivados na ausência do anticorpo. Numa modalidade, o método é como descrito acima, onde as células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoéticas são células linfóides. Em outra modalidade, o método é como descrito acima, em que as células linfóides são macrófagos ou células T.

Dentro de um outro aspecto, a presente descrição descreve um método de redução de IL-22 induzida ou inflamação induzida por IL-20 compreendendo administrar a um mamífero com uma inflamação uma quantidade de uma composição de um 136 anticorpo conforme divulgado suficiente para reduzir a inflamação.

Dentro de um outro aspecto, a presente descrição descreve um método para suprimir uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação compreendendo: (1) determinar um nível de proteína amilóide A sérica; (2) administrar uma composição compreendendo um anticorpo de acordo com um anticorpo ou fragmento de anticorpo aqui descrito num veículo farmaceuticamente aceitável; (3) determinar o nível após a administração da proteína amilóide A sérica; (4), comparar o nível de proteína amilóide A sérica na etapa (1) ao nível de proteína amilóide A sérica na etapa (3), onde a falta de aumento ou uma diminuição nível de proteína do soro amilóide A é indicativo de uma supressão da resposta inflamatória.

Dentro de um outro aspecto, a especificação descreve um método de tratamento de um mamífero sofrendo de uma doença inflamatória em que a IL-22 ou IL-20 desempenha um papel, compreendendo: administrar um antagonista de IL-22 ou IL-20 ao mamífero tal que a inflamação é reduzida, em que o antagonista compreende (i) um anticorpo, fragmentos de anticorpos ou polipeptídeos de ligação que se ligam especificamente a um polipeptídeo ou fragmento polipeptídico de IL-22RA (SEQ ID NO: 3) ou (ii) um polipeptídeo ou um fragmento de polipeptídeo de IL-22RA (SEQ ID NO: 3); em que a actividade inflamatória ou IL-22 (SEQ ID NO: 6) ou IL-20 (SEQ ID NO: 8) é reduzida. Numa modalidade, o método é como descrito acima, em que a doença é uma doença inflamatória crónica. Em outra modalidade, o método é como descrito acima, em que a doença é uma doença inflamatória crónica compreendendo a doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite, dermatite atópica ou psoríase. Em outra modalidade, o método é como descrito acima, em que a doença é uma doença inflamatória aguda. Em outra modalidade, o método é como descrito acima, em que a doença é uma doença inflamatória aguda que inclui endotoxemia, septicemia, síndrome do choque tóxico ou doença infecciosa. Em outra modalidade, o 137 método é como descrito acima, em que o anticorpo, fragmentos de anticorpos ou polipeptídeos de ligação compreendem ainda um radionuclideo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, marcador peptideo, partículas magnéticas, medicamento ou toxina.

Dentro de um outro aspecto, a presente descrição descreve um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um epítopo antigénico humano IL-22RA (SEQ ID NO: 3) seleccionado do grupo consistindo em: (a) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 1 (Pro) para o aminoácido número 6 (Asp); (b) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3a partir do aminoácido número 26 (Ser) para aminoácido número 32 (Pro); (c) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3a partir do aminoácido número 41 (Lys) para o aminoácido número 47 (Asp); (d) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 49 (Vai) para o aminoácido número 62 (Cys); (e) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3a partir do aminoácido número 41 (Lys) para o aminoácido número 62 (Cys); (f) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 84 (Ala) para o aminoácido número 97 (Ser); (g) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3a partir do aminoácido número 103 (Thr) para o aminoácido número 108 (Asp); (h) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 130 (Arg) para o aminoácido número 135 (His) ; (i) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 164 (Gly) para o aminoácido número 166 (Lys); (j) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3a partir do aminoácido número 175 (Tyr) , para o aminoácido número 179 (Glu) ; (k) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir de aminoácido número 193 (Lys) para o aminoácido número 196 (Ala); (1) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 a partir do aminoácido número 203 (Lys) para o aminoácido número 209 138 (Thr) ; e (m) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; e (n) um epítopo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; e em que o anticorpo reduz ou neutraliza a actividade de IL-22 (SEQ ID NO: 6) ou IL-20 (SEQ ID NO: 8) humano. Em outra modalidade, o anticorpo é como descrito acima, em que o anticorpo é seleccionado do qrupo consistindo em: (a) um anticorpo monoclonal, (b) um anticorpo humanizado derivado de (a), (c) um fragmento de anticorpo, e (d) um anticorpo monoclonal humano. Em outra modalidade, o anticorpo é como descrito acima, em que o anticorpo compreende ainda PEGuilaçào.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, tal como definido nas reivindicações, para o tratamento de uma condição patológica num mamífero associado com a actividade da IL-22RA para tratar a referida condição patológica, em que o dito estado patológico é uma doença inflamatória. A dita condição patológica pode ser uma condição inflamatória crónica. Em outra modalidade, a dita condição inflamatória crónica é a doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite, dermatite atópica ou psoríase. Em outra modalidade a dita condição patológica é uma condição inflamatória aguda. Em outra modalidade, a dita a condição inflamatória aguda é endotoxemia, septicemia, síndrome do choque tóxico, ou doença infecciosa. A presente invenção fornece, assim, o uso de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos, conforme definido nas reivindicações, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um mamífero sofrendo de uma doença inflamatória em que a IL-22RA desempenha um papel, de modo que a inflamação é reduzida, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga especificamente a um polipeptídico ou fragmento de polipeptídeo de IL-22RA (SEQ ID NO: 3), e em que a actividade inflamatória é reduzida. Numa modalidade, o uso é como descrito acima, em que a doença é uma doença inflamatória crónica. Em outra 139 modalidade o uso é como descrito acima, em que a doença é uma doença inflamatória crónica que compreende a doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite, dermatite atópica ou psoriase. Em outra modalidade o uso é como descrito acima, em que a doença é uma doença inflamatória aguda. Em outra modalidade o é uso como descrito acima, em que a doença é uma doença inflamatória aguda que inclui endotoxemia, septicemia, sindrome do choque tóxico ou doença infecciosa. Em outra modalidade o uso é como descrito acima, em que o anticorpo, fragmentos de anticorpos, ou polipeptídeo de ligação compreende ainda um radionuclideo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, marcador Peptídeo, partículas magnéticas, medicamento ou toxina. Em outra modalidade o uso é como descrito acima, em que o anticorpo, fragmentos de anticorpos, ou polipeptídeo de ligação inclui ainda, em que o anticorpo compreende ainda PEGuilação.

Dentro de um outro aspecto, a presente descrição descreve um método de reduzir a inflamação, compreendendo a administração a um mamífero com uma inflamação uma quantidade de uma composição de um anticorpo conforme divulgado suficiente para reduzir a inflamação. A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

Purificação de Polipeptídeo IL-22RA2-FC4 de células transfectadas BHK 570

Salvo disposição em contrário, todas as operações foram realizadas a 4°C. O procedimento seguinte foi usado para purificar polipeptídeo IL-22RA2 (polipeptídeo de receptor 140 solúvel maduro de resíduos 23 a 231 da SEQ ID NO: 13; polinucleotídeos, como mostrado na SEQ ID NO: 12) contendo a fusão de C-terminal de Fc4 humano (SEQ ID NO: 14), designado IL-22RA2-Fc4. Cerca de 16500 ml de meios condicionados de células BHK570 transfectadas com IL-22RA2-Fc4 foram filtrados através de um filtro esterilizante de 0,2 um e depois suplementado com uma solução de inibidores de protease, a uma concentração final de 0.001 mM leupeptina (Boerhinger-Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001 mM pepistatina (Boerhinger-Mannheim) e 0,4 mM Pefabloc (Boerhinger-Mannheim). A coluna Poros proteína A50 (20 ml de volume cama, Applied Biosystems) foi embalada e lavada com 400 ml PBS (BRL/Gibco). Os meios condicionados suplementados passaram sobre uma coluna com uma vazão de 15 ml/minuto, seguido de lavagem com 800 ml PBS (BRL/Gibco) . A IL-22RA2-Fc4 foi eluída da coluna com 0,1 M Glicina pH 3,0 e fracções de 5 ml foram colectadas directamente em 0,5 ml 2M Tris pH 7,8, para ajustar o pH final para 7,4 nas fracções. O desempenho da coluna foi caracterizado através de western blotting para reduzir os géis SDS-PAGE dos meios iniciais e passaram através da coluna. O Western blotting usou um anticorpo IgG HRP anti-humano (Amersham), que mostrou uma proteína imunoreactiva a 60000 Da nos meios iniciais, sem nada na passagem, sugerindo uma captura completa. As fracções de proteína A50 eluídas foram caracterizadas por redução do gel SDS PAGE. Este gel mostrou uma banda Coomassie de coloração intensa em 60000 Da nas fracções 3 a 11. As fracções 3 a 11 foram agrupadas. A Proteína A 50 de eluição foi concentrado a partir de 44 ml a 4 ml usando um concentrador de centrifugação Ultrafree Biomax de 30000 Da (15 ml de volume, Millipore) . A coluna de filtração em gel Sephacryl S-300 (175 ml de volume cama; Pharmacia) foi lavada com 350 ml PBS (BRL/Gibco). O volume concentrado foi injectado na coluna com uma vazão de 1,5 ml/min, seguido por lavagem com 225 ml PBS (BRL/Gibco). Os picos eluídos foram colectados em duas frações de 2 ml. 141

As frações eluídas foram caracterizadas por redução e não-redução com géis de prata corada SDS PAGE (Geno Technology) . A redução dos géis de prata corada SDS PAGE mostrou uma banda intensamente corada a 60000 Da em fracções 14-31, enquanto os géis de prata corada não-redutores SDS PAGE mostraram uma banda intensamente corada a 160000 Da em fracções 14-31. As fracções 1-13 mostraram muitas bandas de diversos tamanhos. As fracções 14-31 foram reunidas, concentradas até 22 ml usando um concentrador de centrifugação Ultrafree Biomax de 30000 Da (15 ml, Millipore). Este concentrado foi filtrado através de um filtro esterilizante Acrodisc 0,2 pm (Pall Corporation). A concentração de proteína das fracções agrupadas concentradas foi realizada por análise de BCA (Pierce, Rockford, IL) e o material foi aliquotado e armazenado a -80°C de acordo com os nossos procedimentos padrão. A concentração das fracções agrupadas foi de 1,50 mg/ml.

Exemplo 2

Construção de células BaF3 Expressando o receptor CRF2-4 (células BaF3/CRF2-4) e células BaF3 Expressando o receptor CRF2-4 com o receptor IL-22RA (células BaF3/CRF2-4/IL-22RA)

Foram construídas células BaF3 expressando o receptor de comprimento total CFR2-4, utilizando 30pg de um vector de expressão CFR2-4, descrito abaixo. As células BaF3 que expressam o receptor CFR2-4 foram designadas como BaF3/CFR2-4. Estas células foram utilizadas como controlo, e foram ainda transfectadas com o receptor de comprimento total IL-22RA (Patente US 5965704) e utilizadas para construir uma tela para a actividade da IL-22, conforme descrito abaixo. 142 A. Construção de Células BaF3 Expressando o receptor CRF2-4 A sequência de ADN de comprimento total de CRF2-4 (Genbank Adesão N° Z17227) foi isolada de uma linhagem de células Daudi de uma biblioteca de cADN e, em seguida, clonada num vector de expressão pZP7P.

BaF3, a linha celular pré-linfóide dependente de derivados da medula óssea de ratos interleucina-3 (IL—3) (Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al. Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), foi mantida em meio completo (meio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) , suplementada com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor, 2 ng/ml de IL-3 murina (M1L-3) (R & D, Minneapolis , MN), 2 mM L-glutaMax-1™ (Gibco BRL), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco BRL), e antibióticos PSN (GIBCO BRL)). Antes da electroporação, foi preparada CRF2-4/pZP7P e purificada usando um kit Qiagen Maxi Prep (Qiagen), conforme as instruções do fabricante. Para a electroporação, as células BaF3foram lavadas uma vez em meio RPMI sem soro e, em seguida, ressuspendidas em meio RPMI sem soro com uma densidade celular de 107 células/ml. Um ml de células BaF3ressuspensas foi misturado com 30 yg de plasmideo ADN CRF2-4/pZP7P e transferido para câmaras de electroporação separadas descartáveis (GIBCO BRL). Após uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, foram dados dois choques de série às células (800 lFad/300 V.; 1180 lFad/300 V.) emitidos por um aparelho de electroporação (CELL-PORATOR™; GIBCO BRL). Após um tempo de recuperação de 5 minutos, as células electroporadas foram transferidas para 50 ml de meio completo e colocadas numa incubadora por 15-24 horas (37°C, 5% CO2). As células foram então giradas para baixo e ressuspensas em 50 ml de meio completo contendo 2 yg/ml de puromicina num balão T-162 para isolar o volume resistente à puromicina. Volumes das células transfectadas BaF3, adiante designadas por células BaF3/CRF2-4, foram ensaiadas para a sinalização de capacidades, conforme descrito abaixo. Além disso, essas células foram, ainda, transfectadas com receptor IL-22RA como descrito abaixo. 143

B, Construção de células BaF3 Expressando CRF2-4 e receptores IL-22RA

As células BaF3/CRF2-4 que expressam o receptor de comprimento total IL-22RA foram construídas como acima referido, usando 30pg de um vector de expressão de IL-22RA. Após a recuperação, os transfectantes foram seleccionados usando 200pg/ml de zeocina e 2pg/ml de puromicina. As células BaF3/CRF2-4 expressando o receptor IL-22RA foram designadas como células BaF3/CRF2-4/IL-22RA. Essas células foram usadas para seleccionar a actividade da IL-22, bem como a actividade antagonista de IL-22RA2 aqui descritas.

Exemplo 3

Selecção para a actividade antagonista de IL-22 IL usando células BaF3/CRF2-4/lL-22RA usando um Ensaio de Proliferação Alamar Blue A. Selecção para a actividade de IL-22, utilizando células BaF3/CRF2-4/IL-22RA usando um Ensaio de Proliferação Alamar Blue

Foi utilizada IL-22-CEE purificada (Exemplo 4) para testar a presença de actividade de proliferação, como descrito abaixo. Foi utilizada IL-22RA2-FC4 purificada (Exemplo 1) para antagonizar a resposta proliferativa da IL-22, neste ensaio, como descrito abaixo.

As células BaF3/CRF2-4/IL-22RA foram giradas para baixo e lavadas no meio completo (meio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) , suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor, 2 ng/ml de IL-3 murina (MIL-3) (R & D, Minneapolis, MN) , 2 mM L-glutaMax-1™ (Gibco BRL), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco BRL), e antibióticos PSN (GIBCO BRL) ) , mas sem MIL-3 (a seguir designado " meio livre de 144 MIL-3 de") . As células foram rodadas e lavadas três vezes para garantir a remoção de MIL-3. As células foram então contadas num hemocitómetro. As células foram cultivadas numa placa de formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 μΐ por poço usando o meio livre de MIL-3. A proliferação das células BaF3/CRF2-4/IL-22RA foi avaliada por meio da proteína IL-22-CEE diluída com meio livre MIL-3 a concentrações de 50, 10, 2, 1, 0,5, 0,25, 0, 13, 0,06 ng/ml. Foi adicionada 100 μΐ da proteína diluída às células BaF3/CRF2-4/IL-22RA. O volume total do ensaio é 200 μΐ. As placas de ensaio foram incubadas a 37°C, 5% CO2 por 3 dias, ao que ao tempo foi adicionado Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20pl/poço. As placas foram novamente incubadas a 37°C, 5% C02 por 24 horas. Alamar Blue dá uma leitura fluourométrica com base no número de células vivas, e é assim uma medida directa da proliferação celular em relação ao controlo negativo. As placas foram novamente incubadas a 37°C, 5% C02 por 24 horas. As placas foram lidas no leitor de placas Fmax™ (Molecular Devices Sunnyvale, CA) utilizando o programa SoftMax™ Pro, em comprimentos de onda de 544 (excitação) e 590 (emissão) . Os resultados confirmaram a resposta dose-dependente proliferativa das células BaF3/CRF2-4/IL-22RA a IL-22 CEE. A resposta, como medida, foi de aproximadamente 15 vezes mais funda na parte mais alta de 50ng/ml até a uma indução de 2 vezes na parte inferior de 0.06ng/ml. As células BaF3 de tipo selvagem, e as células BaF3/CRF2-4 não proliferam em resposta a IL-22-CEE mostrando que a IL-22 é específica para o receptor heterodimérico CRF2-4/IL-22RA. A fim de determinar se a IL-22RA2 é capaz de antagonizar a actividade da IL-22, o ensaio descrito acima foi repetido utilizando-se IL-22RA2/Fc4 purificada solúvel. Quando a IL-22 foi combinada com a IL-22RA2 a 10pg/ml, a resposta a IL-22 em todas as concentrações foi levada ao fundo. Uma vez que a presença da IL-22RA2 solúvel retirada dos efeitos proliferativos da IL-22, demonstra que é um antagonista potente do ligante de IL-22. Este ensaio pode ser usado para testar outros antagonistas da actividade da IL-22 aqui descritos, tais como anticorpos anti-IL-22RA. 145

Exemplo 4

Purificação de IL-22-CEE de células BHK 570

Salvo disposição em contrário, todas as operações foram realizadas a 4°C. O procedimento seguinte foi usado para purificar polipeptideo de IL-22 contendo marca de C-terminal GluGlu (EE) (SEQ ID NO: 15; ou SEQ ID NO: 16). Os meios condicionados a partir de células BHK expressando IL-22-CEE foram concentrados com um cartucho de espiral Amicon S10Y3 num A30 ProFlux. Uma solução do inibidor de protease foi adicionada aos meios condicionados concentrados para uma concentração final de 2,5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0,003 mM de leupeptina (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001 mM de pepistatina (Boehringer-Mannheim) e 0,4 mM de Pefabloc (Boehringer Mannheim). As amostras foram retiradas para análise e o volume da amostra foi congelado a -80°C até ser iniciada a purificação. As concentrações de proteina total alvo do meio concentrado condicionado foram determinadas através de SDS-PAGE e análise Western blot com o anticorpo conjugado anti-EE-HRP.

Cerca de 100 ml de coluna de anti-EE G-Sefarose (preparada como descrito abaixo) foi derramada numa coluna de vidro Waters AP-5, 5 cm x 10 cm. A coluna de fluxo foi embalada e equilibrada num BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) com tampão fosfato (PBS) pH 7,4. O meio concentrado condicionado foi descongelado, 0,2 micron foi filtrado estéril, o pH ajustado para 7,4, e em seguida, carregado na coluna durante a noite, com cerca de 1 ml/minuto de vazão. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna (CVs) de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), em seguida, conectada e eluida com 200 ml de PBS (pH 6,0) contendo 0,5 mg/ml de peptideo EE (AnaSpec, San Jose, CA) a 5 ml/minuto. O peptideo EE usado tem a sequência EYMPME (SEQ ID NO: 15) . A coluna foi lavada por 10 CVs com PBS e, em seguida eluida com 5 CVs de glicina 0,2 M, pH 3,0. O pH da coluna de glicina eluida foi ajustado para 7,0 com 2 CVs de 5XPBS, em seguida, 146 equilibrada em PBS (pH 7,4). Fracções de cinco ml foram colectadas durante toda a cromatografia de eluição foram monitorizadas para absorvância a 280 e 215 nM; passaram por uma lavagem e os lotes também foram guardados e analisados. As fracções de pico de polipeptideo EE eluido foram analisadas para a proteína alvo, através de coloração de prata SDS-PAGE e Western Blotting com o anticorpo conjugados anti-EE-HRP. As fracções de polipeptideo eluido de interesse foram reunidas e concentradas a partir de 60 ml a 5,0 ml com um peso molecular de 10.000 Dalton com um concentrador de espiral de membrana de corte (Millipore, Bedford, MA), de acordo com as instruções do fabricante.

Para separar as fracções IL-22-CEE de outras proteínas co-purificadas, as fracções de polipeptideo concentrado eluido foram submetidas a um POROS HQ-50 (resina de troca aniónica forte de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) com pH 8,0. A coluna de 1,0 x 6,0 cm foi derramada e o fluxo embalado num BioCad Sprint. A coluna foi carregada contra-ião depois equibrada em 20mM TRIS pH 8,0 (Tris (aminometano hidroximetil)). A amostra foi diluída 1:13 (para reduzir a força iónica do PBS), em seguida, carregada na coluna Poros HQ a 5 ml/minuto. A coluna foi lavada por 10 CVs com 20mM Tris pH 8,0, em seguida, eluída com um gradiente de 40 CV de 20 mM Tris/1 M de cloreto de sódio (NaCl) a 10 ml/minuto. Fracções de 1,5 ml foram colectadas durante toda a cromatografia e foram monitorizadas para absorvância em 280 e 215 nM. As fracções do pico de eluição foram analisadas através de colaração de prata SDS-PAGE. Fracções de interesse foram reunidas e concentradas para 1,5-2 ml usando um concentrador de espiral de membrana de corte de peso molecular de 10000 Dalton (Millipore, Bedford, MA), de acordo com as instruções do fabricante.

Para separar o polipeptideo de IL-22-CEE do peptídeo EE livre e todas as proteínas contaminantes co-purificadas, as fracções concentrados foram submetidas a cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna equilibrada 1,5 x 90 cm Sephadex S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) e carregadas em PBS, com um caudal de 1,0 ml/min, utilizando um BioCad 147

Sprint. Fracções de 1,5 ml foram colectadas através de toda a cromatografia e foram monitorizadas para a absorvância em 280 e 215 nm. As fracções de pico foram caracterizadas através de coloração de prata SDS-PAGE, e somente as fracções mais puras foram agrupadas. Este material representa o polipeptideo IL-22-CEE purificado.

Este material purificado foi finalmente submetido a uma coluna de 4 ml ActiClean Etox (Sterogene) para eliminar quaisquer endotoxinas remanescentes. A amostra passou por uma coluna de gravidade de PBS equilibrado quatro vezes, de seguida, a coluna foi lavada com um único volume de 3 ml de PBS, que foi combinado com a amostra "limpa". O material foi filtrado estéril a 0,2 micron e armazenado a -80°C até ser aliquotado.

Em géis de Western blotted, Coomassie Blue e prata corada SDS-PAGE, o polipeptideo IL-22-CEE foi uma grande banda. A concentração de proteína purificada do material foi realizada por análise BCA (Pierce, Rockford, IL) e a proteína foi aliquotada e armazenada a -80 C de acordo com procedimentos normalizados.

Para preparar anti-EE Sefarose, um volume cama de 100 ml de proteína G-Sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ) foi lavado 3 vezes com 100 ml de PBS contendo 0,02% de azida de sódio usando 500 ml de uma unidade de filtro Nalgene de 0,45 micron. O gel foi lavado com 6,0 volumes de 200 mM de trietanolamina, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO), e foi acrescentado um volume igual de solução de anticorpo EE contendo 900 mg de anticorpo. Após a incubação durante toda a noite 4°C, o anticorpo não ligado foi removido por lavagem da resina com 5 volumes de 200 mM de TEA, como descrito acima. A resina foi ressuspensa em 2 volumes de chá, transferida para um recipiente adequado, foi adicionada dimetilpimilimidate-2HCl (Pierce, Rockford, IL) dissolvida em TEA, a uma concentração final de 36 mg/ml de proteína de gel G-Sefarose. O gel foi agitado à temperatura 148 ambiente por 45 min e o líquido foi removido utilizando a unidade de filtro, como descrito acima. Sítios não específicos no gel foram bloqueados por incubação durante 10 min, à temperatura ambiente com 5 volumes, de 20 mM de etanolamina em 200 mM TEA. O gel foi lavado com 5 volumes de PBS contendo 0,02% de azida sódica e armazenado nesta solução a 4°C.

Exemplo 5

Efeitos do polipeptídeo IL-22 in vivo

Ratos (fêmeas, C57BL/6N, 8 semanas de idade; Charles Ri ver Labs, Kingston, NY) foram divididos em três grupos. Um adenovírus expressando um polipeptídeo IL-22 (SEQ ID NO: 6), foi anteriormente feito usando métodos padrão. No dia 0, o adenovírus parental ou IL-22 foi administrado ao primeiro (n = 8) e segundo (n = 8) grupos, respectivamente, através da veia caudal, com cada rato recebendo uma dose de aproximadamente 1 x 1011 partículas em ~0,1 ml de volume. O terceiro grupo (n = 8) não recebeu nenhum tratamento. No dia 12, os ratos foram pesados e foi-lhes retirado sangue. As amostras foram analisadas para a contagem de sangue completo (CBC) e a química sérica. Estatisticamente foram detectadas elevações significativas de neutrófilos e plaquetas nas amostras de sangue do grupo a que foi administrado adenovírus IL-22 em relação ao grupo tratado com o adenovírus parental. Além disso, a contagem de linfócitos e eritrócitos foi significativamente reduzida no grupo a que foi administrado adenovírus IL-22 em relação ao grupo tratado com o adenovírus parental. Além disso, os ratos tratados com o adenovírus IL-22 diminuíram o peso corporal, enquanto os tratados com o adenovírus parental ganhram peso. Além disso, o nível de soro IL-22 foi aumentado e o nível de glicose diminui no dia 3. Em resumo, os adeno-ratos IL-22 exibiram uma resposta de fase aguda, que também pode ser iniciada por outras citocinas pró-inflamatórias tais como TNF-alfa, IL-lbeta, e citocinas gpl30. A resposta de fase aguda é o conjunto da resposta inflamatória imediata iniciada por moléculas de 149 reconhecimento de padrões. As proteínas de fase aguda oferecem maior protecção contra microorganismos e modificam a resposta inflamatória por efeitos sobre o tráfico de célula e libertação do mediador. Por exemplo, a SAA uma potento função activadora de leucócitos incluindo a indução da quimiotaxia, melhoria de adesão de leucócitos às células endoteliais, e aumenta da fagocitose. Entender os factores que iniciam e alteram a magnitude e a duração da resposta de fase aguda representa um passo importante no desenvolvimento de novas terapias para doenças infecciosas e inflamatórias.

Os resultados sugerem que a IL-22 afecta a hematopoese, ou seja, a formação de células do sangue in vivo. Como tal, a IL-22 poderia ter actividades biológicas afectando diferentes células-tronco do sangue, resultando, assim, no aumento ou na diminuição de certas células sanguíneas diferenciadas numa linhagem específica. Por exemplo, a IL-22 parece reduzir os linfócitos, o que é provavelmente devido à inibição das células progenitoras cometidas que dão origem a células linfóides. A IL-22 também diminui as células vermelhas do sangue, suportando a noção que a IL-22 poderia desempenhar um papel importante na anemia, infecção, inflamação e/ou doenças imunes influenciando os glóbulos envolvidos neste processo. Antagonistas contra a IL-22, tais como anticorpos ou o seu receptor solúvel de IL-22RA2, poderiam ser usados como reagentes terapêuticos nestas doenças.

Além disso, estas experiências com adenovírus IL-22 em ratos sugerem que a sobre expressão de IL-22 aumenta o nível de neutrófilos e plaquetas in vivo. É possível que existam outros factores (como citocinas e genes modificadores) envolvidos nas respostas da IL-22 em todo o sistema animal. No entanto, estes dados suportam fortemente o envolvimento de IL-22 na hematopoiese. Assim, a IL-22 e os seus receptores são reagentes adequados/alvos para o diagnóstico e tratamento de várias doenças, tais como inflamação, doenças imunológicas, infecção, anemia, cancro hematopoiético e outros, e assim por diante. 150

Exemplo 6 IL-22-Expressando Ratos transqénicos A. Geração de ratos transqénicos expressando IL-22 rato

Fragmentos de ADN de um vector transgénico contendo sequências de acompanhamento 5'e 3' do promotor linfóide especifico EpLCK, rato IL-22 (SEQ ID NO: 10; polipeptideo mostrados na SEQ ID NO: 11), a insulina do rato intron II, IL-22 cADN e a sequência poli A da hormona do crescimento humano foram preparados utilizando métodos padronizados e utilizados para microinjecção de B6C3F1 fertilizado (Taconic, Germantown, NY) em oócitos de ratos, usando um protocolo padrão de microinjecção. Ver, Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.

Vinte e cinco ratos transgénicos para IL-22 do rato com o promotor linfóide especifico EpLCK foram identificados entre os 154 filhotes. Onze dos filhotes transgénicos morreram horas após o nascimento, 9 filhotes transgénicos com uma aparência brilhante foram necropsiados no dia do nascimento, e 2 cresceram até à idade adulta. Os níveis de expressão foram baixos num animal adulto. Os tecidos da autópsia dos filhotes foram preparados e examinados histologicamente como descrito abaixo. O aspecto brilhante dos filhotes recém-nascidos pareceu estar associado ao endurecimento da pele, como se fossem seca, resultando numa redução do cuidado adequado. Os seus movimentos tornaram-se mais rígidos em geral. 151 B, Análise genotípica e Expressão em ratos transgénicos A partir linha transgénica de IL-22 rato conduzida pelo promotor EpLck, acima descrita, os filhotes recém-nascidos foram observados para anomalias no primeiro dia (dia do nascimento) e sacrificados para a colecta de tecidos. Todos os filhotes receberam um número de etiqueta da orelha original, e os designados como tendo um fenótipo de pele brilhante no momento do sacrifício foram anotados. Dos doze filhotes, seis foram observados para ter o fenótipo de pele brilhante, com dois designados como fenótipos "graves". Os fenótipos graves foram definidos como filhotes com pouca mobilidade, cuja pele era especialmente brilhante e muito seca. A pele foi coletacda a partir da lateral esquerda de cada filhote, e congelada em meio de inclusão Tissue-Tek. A genotipagem confirmou que a pele brilhante era um bom indicador do estado transgénico, embora não tenham sido recolhidos dados de expressão. Foram seccionados blocos de pele congelada a 7 microns em criostato e corados para procurar a presença de CD3, CD4 e CD8, macrófagos de rato, células B, CD80 e MHC classe II. 0 protocolo de coloração envolveu ligação de anticorpos disponíveis comercialmente para a detecção de tecido, com um anticorpo secundário peroxidase e reacção de cromógeno DAB para visualizar a coloração.

Os animais transgénicos foram encontrados ser mais elevado em MHC classe II e CD80, o que mancha para células apresentadoras de antígenos e células dendríticas, respectivamente. 0 marcador do macrófago também detectou mais células nos transgénicos graves e não-graves do que nos animais selvagens, embora a distribuição dessas células fosse muito localizada na derme alta. Animais classificados como fenótipos graves tiveram a coloração mais robusta com estes três marcadores, mostrando um aumento dramático em intensidade e número de células quando comparados com o 152 tipo selvagem. Esta variabilidade pode ser devida a uma diferença no nivel de expressão de IL-22 nestes filhotes de transgénicos. As células positivas MHC classe II foram localizadas na derme inferior dispostas em cachos soltos abertos, enquanto as células positivas CD80 foram predominantemente abaixo da derme dentro ou pouco acima do músculo/camada de gordura. Estas duas populações de células não parecem sobrepor-se. Todos os outros marcadores foram equivalentes em coloração em todos os animais. A coloração azul de toluidina para mastócitos revelou ligeira diferença entre o tipo selvagem e os animais transgénicos. C. Avaliação microscópica de tecidos de ratos transgénicos: IL-22 TG com o promotor EuLck tendo uma histologia neonatal letal

No dia do nascimento, os filhotes de ninhadas contendo IL-22 transgénica foram submetidos à eutanásia e à imersão do corpo inteiro fixado em 10% de formol. Seis transgêénicos e dois filhotes não-transgénicos foram submetidos para posterior trabalho. Quatro dos seis transgénicos foram anotados para ter a pele brilhante, no momento da eutanásia. Os tecidos fixados foram cortados em cinco secções (secção longitudinal da cabeça e seções transversais da parte superior e inferior e superior do tórax e abdómen). Os tecidos foram embebidos em parafina, processados, seccionados a 5 um (micrótomo Supercut Jung 2065, Microsystems Leica, Wetzlar, Alemanha) e corados com H&E. Os tecidos manchados foram avaliados sob um microscópio de luz (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) por um patologista veterinário certificado (ACVP).

Ao exame microscópico, a epiderme de dois dos filhotes transgénicos foi observada ser mais espessa do que a epiderme dos outros seis ratos, incluindo os de controlo. Nenhuma outra anomalia foi observada na pele e outros tecidos de qualquer um dos ratos. Áreas representativas da 153 pele das regiões correspondentes do tórax e abdómen foram fotografadas com uma lente de objetiva de 4 0x e com uma câmera digital CoolSnap (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA), que foi acoplado ao microscópio. A espessura da epiderme foi determinada usando um software de histomorfometria (Scion Image for Windows (NIH Image), Scion Corp, Frederick, MD, v. B4.0.2). Os resultados apresentados na Tabela 5 foram os seguintes:

Tabela 5

Genótipo/fenótipo Espessura média do tórax (ym) Espessura média do abdómen (ym) Não-transgénico/normal 5,2 5,4 Transgénico/não brilhante 5, 0 6,7 Transgénico/brilhante 8,2 7,4 Transgénico/todos 7,1 7,1

Havia um número insuficiente de ratos para determinar a significância estatística; porém, os transgénicos, especialmente aqueles com a pele brilhante, tendem a ter uma epiderme mais espessa do que os transgénicos não-brilhantes e os de controlo não-transgénicos. Os transgénicos brilhantes pode ter um maior nível de expressão de IL-22 que os transgénicos não brilhantes; no entanto, os níveis de expressão não foram determinados para estes ratos. Estes sugeriram um papel para a IL-22 no tratamento da psoríase, artrite psoriática, ou outras condições inflamatórias da pele ou outras doenças inflamatórias. 154

Exemplo 7

Efeitos do polipeptídeo IL-22 in vivo

Ratos infectados adenovirus IL-22 mostrando indução de SAA

Ratos (fêmeas, C57BL/6N, 8 semanas de idade; Charles Ri ver Labs, Kingston, NY) foram divididos em três grupos. Um adenovirus expressando um polipeptídeo IL-22 (SEQ ID NO: 6), foi anteriormente feito usando métodos padrão. No dia 0, adenovirus parental ou IL-22 foi administrada ao primeiro (n = 8) e segundo (n = 8) grupos, respectivamente, através da veia caudal, recebendo cada rato uma dose de aproximadamente 1 x 1011 partículas de ~0,1 ml. O terceiro grupo (n = 8) não recebeu nenhum tratamento. No dia 12, os ratos foram pesados e foi-lhes retirado sangue. No dia 20 do estudo, os ratos foram sacrificados, o peso corporal foi registado, e o sangue e tecidos foram colectados para análise.

Todas as amostras de sangue foram analisadas para a contagem de sangue completo (CBC) e química do soro. Em ambos os dias 12 e 20, elevações estatisticamente significativas de neutrófilos e plaquetas foram detectados nas amostras de sangue do grupo a que foi administrado o adenovirus IL-22 em relação ao grupo tratado com o adenovirus parental. Além disso, a contagem de linfócitos foi significativamente reduzida no grupo a que administrado adenovirus IL-22 em relação ao grupo tratado com adenovirus parental no dia 12, mas no dia 20, o efeito oposto foi observado. Além disso, os ratos tratados com adenovirus IL-22 diminuíram o peso corporal, enquanto os ratos tratados com o adenovirus parental ganharam peso. A glicose foi significativamente reduzida em ambos os momentos, nas amostras de soro do grupo a que foi administrado adenovirus IL-22 em relação ao grupo tratado com o adenovirus parental. Os níveis de albumina sérica também foram significativamente reduzidos em ambos os momentos. Os níveis de ureia foram significativamente reduzidos no dia 20. Os níveis de globulina do soro foram aumentados 155 significativamente no grupo a que foi administrado o adenovírus IL-22 em relação ao grupo tratado com adenovirus parental em ambas as ocasiões. Microscopicamente, a mudança histomorfológica atribuída a IL-22 foi de regeneração tubular no rim. Embora não seja incomum em ratos, houve um aumento da incidência e da gravidade nesse grupo de animais. A nefropatia caracteriza-se por áreas multifocais de basofilia tubular cortical de células epiteliais.

Foi realizada uma experiência adicional, idêntica na concepção ao descrito acima, a fim de verificar os resultados e colectar amostras adicionais. Neste estudo, o peso corporal foi registado a cada três dias, foi colhido sangue dos ratos 3 dias após a injecção de adenovírus, e os ratos foram sacrificados para colecta de sangue e de tecidos no dia 10 (n = 4 por grupo) e dia 20 (n = 4 por grupo). Uma contagem elevada de neutrófilos e plaquetas foi novamente detectada em amostras de sangue do grupo a que foi administrado adenovírus IL-22 em relação ao grupo tratado com o adenovírus parental. Esse efeito foi evidente para os neutrófilos no dia 3, mas a contagem de plaquetas não foi significativamente diferente até ao dia 10. Além disso, a contagem de linfócitos foi significativamente reduzida no grupo a que foi administrado adenovírus IL-22 em relação ao grupo tratado com adenovírus parental em 3 e 10, mas não foram eram elevados no dia 20 como no estudo anterior. Novamente, os ratos que receberam adenovírus IL-22 perderam peso durante o curso do estudo, enquanto os ratos tratados e não tratados com o vírus de controlo ganharam peso. Os parâmetros bioquímicos séricos foram consistentes com o estudo anterior. Os achados histológicos de regeneração tubular no rim associados ao tratamento com adenovírus IL-22 também foram confirmados neste estudo. Isto foi consistente com o achado adicional de proteinúria moderada em ratos que receberam adenovírus IL-22 (dia 20).

Os resultados sugerem que IL-22 afecta a hematopoese, ou seja, a formação de células do sangue in vivo. Como tal, a IL-22 poderia ter actividades biológicas afectando 156 diferentes células-tronco do sangue, resultando num aumento ou diminuição de certas células sanguíneas diferenciadas numa linhagem especifica. Por exemplo, a IL-22 parece reduzir os linfócitos, o que é provavelmente devido à inibição das células progenitoras cometidas que dão origem a células linfóides, apoiando a idéia de que a IL-22 poderia desempenhar um papel importante na anemia, infecção, inflamação e/ou doenças auto-imunes, influenciando os glóbulos envolvidos nestes processos. Antagonistas contra a IL-22, tais como anticorpos ou os seus receptores solúveis de IL-22RA2, poderão ser utilizados como reagentes terapêuticos nessas doenças.

Além disso, estas experiências com adenovirus IL-22 em ratos sugerem que a IL-22 aumenta a expressão sobre o nível de neutrófilos e plaquetas in vivo. É possível que existam outros factores (como citocinas e genes modificadores) envolvidos nas respostas IL-22 em todo o sistema animal. No entanto, estes dados suportam fortemente o envolvimento de IL-22 na hematopoiese. Assim, a IL-22, anticorpos anti-IL-22, receptores solúveis de IL-22RA (por exemplo, SEQ ID NO: 3) e anticorpos anti-IL-22RA são reagentes adequados/alvos para o diagnóstico e tratamento de várias doenças, tais como inflamação, doenças imunológicas, infecção, anemia, cancro hematopoiético e outros, e assim por diante. A associação da expressão de IL-22 com a perda de peso, o aparecimento de proteínas de fase aguda SAA, e perturbações metabólicas evidenciada pela diminuição da glicemia, albumina e ureia sugerem que a IL-22 é uma citocina que age no início de certas respostas inflamatórias. Ratos a que foi dados adenovirus IL-22 podem representar um estado de inflamação crónica, como aquela observada em IBD, colite ulcerativa, artrite, psoríase, artrite psoriática, asma, e assim por diante. Alguns processos inflamatórios prejudiciais podem ser inibidos pelo uso de um antagonista de IL-22, como anticorpos anti-IL-22 e seus receptores, tais como receptores solúveis de IL-22RA (por exemplo, SEQ ID NO: 3), e anticorpos anti-IL-22RA e similares. 157 B, IL -22 é uma citocina pró-inflamatória: os níveis séricos de SAA nos ratos adeno-IL-22

Um teste de ELISA foi realizada para determinar o nivel da SAA em ratos IL-22-Adeno, utilizando um Kit de imunoensaio Mouse SAA e protocolo (Biosource International, Califórnia, USA). Normas diluídas e desconhecidas foram cultivadas com HRP-anti-rato SAA em placas de ensaio pré-revestidas com anticorpo anti-rato SAA. As placas foram incubadas durante uma hora a 37°C e, em seguida, lavadas de acordo com as instruções do kit. As placas foram desenvolvidas por 15 minutos à temperatura ambiente usando TMB e paradas com 2M de H2SO4. A absorvância a 4 50 nm foi lida usando um Spectromax 190 (Molecular Devices, Califórnia, USA). Os dados obtidos foram analisados usando SoftMax Pro (Molecular Devices, Califórnia, USA) e Excel (Microsoft Corp, Washington, USA).

Os ratos infectados com adenovírus IL-22 tinham níveis extremamente elevados de MSAA, mais de 10 vezes, em relação aos de controlo com adenovírus parental. C. Citometria de fluxo de ratos infectados com adenovírus IL-22

Para analisar os efeitos da expressão de IL-22 in vivo por adenovírus, foi isolado sangue periférico, baço e medula óssea de ratos C57BL/6N infectados com adenovírus IL-22, no dia 10 e 20 dias após a infecção. Cerca de 100 μΐ de sangue foi colectado em tubos heparinizados, em seguida, esgotado de células vermelhas do sangue por lise hipotónica (as células foram lisadas em 4,5 ml de dH20 -5 segundos antes de adicionar 1,5 ml de 3,6% NaCl). Os baços foram esmagados entre duas lâminas de vidro fosco, e as células libertadas foram passadas ao longo de uma membrana Nytex (coador de células) e peletizadas. A medula óssea foi obtida por 158 trituração um fémur num almofariz e um pilão e passando as células ao longo de um filtro de células (Falcon). As células foram ressuspendidas em tampão de lavagem FACS (WB = HBSS/1% BSA/lOmM hepes), contadas em azul de tripano, e lxlO6 de células viáveis de cada tipo foram aliguotadas em tubos de 5 ml de poliestireno. As células foram lavadas e peletizadas, em seguida, incubadas por 20 min no gelo com coquetéis de anticorpos monoclonais de fluorescentemente marcados (FITC, PE e CyChrome) (PharMingen, San Diego, CA), reconhecendo diversos marcadores celulares de superfície utilizados para identificar determinados grupos de células imunes. Estes marcadores são os seguintes (listados em grupos de três que testámos). Para manchas de sangue: CD3, Grl e B220, para a coloração do baço: CD62L, CD44 e CD3, CD21, CD23, e B220, IgD, IgM e B220; CDllb, Grl e CD8; para a coloração da medula óssea: CDllb, Grl, CD3, IgM IgD, e B220. As células foram lavadas com 1,5 ml WB e peletizadas, então ressuspensas em 0,4 ml de WB e analisadas num FACScan usando software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Descobrimos que a fracção de neutrófilos no sangue dos ratos tratados com IL-22-adeno foi elevada 4-13 vezes no dia 10 e 2 a 3 vezes ao dia 20. No dia 10, essa diferença resultou numa diminuição concomitante na fracção de linfócitos e monócitos no sangue. Na medula óssea, observou-se que o número total de células B, diminuiu 1,5 vezes, enquanto a percentagem de recirculação de células B maduras aumentou e o número total de células B imaturas diminuiu ligeiramente no dia 10. No dia 20, muitas dessas diferenças não foram evidentes, apesar de encontrarmos um ligeiro aumento na fracção de recirculação de células B maduras. No baço, o número total de células B diminuiu ligeiramente (1,5-2 vezes) em ambos os dias testados, enquanto no dia 20, a fracção da zona marginal de células B (CD21+CD23-B220+) aumentou de 2 vezes e os número de células foliculares B (CD21+CD23+B220+) caiu 2 vezes. As células B da zona marginal são consideradas ser a primeira linha de defesa contra patógenos, uma vez que eles são mais sensíveis aos mitógenos das células B (por exemplo, LPS) que as mais comuns células B foliculares, e quando se deparam com o seu antígeno cognato diferenciam-se muito 159 rapidamente em anticorpos de células secretoras. É possível que a IL-22 ou melhora a conversão de foliculares a células B da zona marginal, ou que se esgote selectivamente as células foliculares menos maduras. As mudanças no número de células B encontradas na medula óssea pode refletir uma maior diferenciação de pré/pró e/ou células B imaturas, ou um maior influxo de recirculação de células B no sangue/baço e, talvez, um coincidente aumento na exportação de células B imaturas para a periferia. 0 número real de células maduras BM B não aumenta, assim IL-22 não pode aumentar a sua proliferação. Alternativamente, IL-22 pode bloquear, reduzir ou inibir a diferenciação de células B imaturas e, assim, aumentar a representação relativa de células B maduras. D. IL-Fc4-22RA2 neutraliza a actividade in vivo de IL-22; SAA ELISA mostrando que a expressão SAA induzida por IL-22 é inibida por injecção de IL-22RA2-Fc4

Para avaliar se a IL-22RA2 poderia inibir a indução da SAA, ratos IL-22 (fêmeas, C3H/HeJ, oito semanas de idade, Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram divididos em cinco grupos de três animais cada e tratados com injecção IP de proteínas, como mostrado na Tabela 6 abaixo:

Tabela 6

Grupo # IL-22 IL-22RA2 Grupo 1 - - Grupo 2 - 100 yg Grupo 3 3 yg - Grupo 4 3 yg 20 yg Grupo 5 3yg 100 yg

As injecções de IL-22RA2 precederam a injecção de IL-22 por 15 minutos. Ambos receberam injecções de proteínas por via intraperitoneal. Uma amostra de sangue foi retirada de cada rato, antes do tratamento, e depois em 2 e 6 horas após o tratamento. 0 soro foi preparado a partir de cada uma das amostras para a medição da SAA e IL-22. 160

Um teste de ELISA foi realizado conforme descrito anteriormente para determinar o nível de SAA em ratos tratados com IL-22 e um receptor solúvel de IL-22, IL-Fc4-22RA2 aqui descrito. Os ratos tratados com 3 yg de IL-22 em conjunto com a IL-22RA2-FC4 em concentrações entre 20 e 100 ug mostraram uma redução no nível de SAA induzida pela IL-22 apenas para os níveis de base, demonstrando que a IL-22 RA2 inibiu a actividade de indução SAA de IL-22 in vivo.

Exemplo 8

Expressão de IL-22 no modelo de Doença inflamatória Intestinal no rato A Doença Inflamatória Intestinal (IBD) é uma doença multifactorial, divididos em dois tipos, a colite ulcerosa (UC) e a doença de Crohn (CD). A etiologia destas doenças não é actualmente conhecida e as manifestações clínicas são diferentes. A UC é restrita ao cólon, e os sintomas incluem diarréia sanguinolenta, perda de peso e dor abdominal. As características macroscópicas da UC incluem úlceras pontuadas e cólon reduzido. Em contraste, a doença de Crohn também pode afectar outras partes do intestino. Os sintomas incluem diarréia (que é menos sangrenta do que a muitas vezes vista em UC) , uma febre baixa e dor. As características macroscópicas incluem estenose intestinal e fibrótica com estrangulamento, úlceras profundas, fissuras e fístulas.

Estão disponíveis vários modelos animais, que imitam estas doenças humanas. Três modelos usados de colite para a selecção de novos medicamentos são o modelo de rato induzido de ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfónico (TNBS), o modelo de rato de transferência de célula T, e o modelo de rato de dextrano sulfato de sódio, ou DSS induzido. O modelo DSS foi derivado de um modelo pelo Dr. S. Murthy, utilizando um sistema de pontuação de índice de actividade da doença (SNS Murthy, Treatment of Dextran Sulfate Sodium- 161

Induced Murine Colitis by Intracolonic Cyclosporin, Digestive Diseases and Sciences, vol. 38, n° 9 (Setembro 1993) , pp.1722-1734) .

No presente estudo, uma colite aguda resultou quando os ratos foram alimentados com DSS na água potável por 6 dias. Os animais apresentaram perda de peso e diarréia sanguinolenta, simulando a condição dos pacientes UC. O mecanismo da lesão DSS não está bem caracterizado, mas acredita-se que induz uma resposta inflamatória imune não especifica e imita os efeitos ambientais no intestino. É possivel que H2S seja produzida, o que pode ser tóxica para as células. Além disso, ocorrem alterações na flora bacteriana. Monócitos aActivados, macrófagos e mastócitos têm sido encontrados no cólon. Mediadores para todos os três modelos animais incluem as prostaglandinas inflamatórias, metabolitos leucotrienos e citocinas. A. Método A colite foi induzida por ingestão de DSS em ratos Swiss Webster fêmeas de Charles River Laboratories. Os ratos tinham 10 e 11 semanas de idade no inicio do estudo. Aos ratos foram dados 4% de DSS na água de beber por um período de seis dias (ratos tratados) , ou foi dado apenas água normal (ratos de controlo). Foi usada a pontuação do índice clínico de actividade da doença (DAI), que inclui uma combinação de medidas, incluindo a qualidade das fezes, o sangue oculto e a perda de peso. A DAI foi obtida diariamente, para cada rato, iniciando-se um dia após o tratamento com DSS. Após 6 dias, o DSS foi retirado da água potável dos ratos tratados. Todos os ratos foram monitorizados para o índico clínico DAI até ao sacrifício em cada 2, 7 ou 10 dias a partir do início do estudo. Em cada um dos dias 2 e 7, quatro ratos tratados com DSS e um rato de controlo foram sacrificados. No dia 10, quatro ratos tratados com DSS e dois ratos de controlo foram sacrificados. Para todos os animais após o sacrifício, foi 162 medido o comprimento do cólon. Foram fixadas secções do cólon em 10% de formalina neutra tamponada para análise histológica ou congelados para extracção de mARN. B. Pontuação histológica e índice de Actividade da Doença (DAI), descartada

Os resultados dos índices histológicos foram obtidos com o método da referência 1. Geralmente, as secções do cólon foram marcadas cegamente por um patologista para os resultados das criptas, epitélio hiperplásico, distorção das criptas e inflamação.

Diariamente, cada rato foi classificado como uma pontuação clínica com base na perda de peso, consistência das fezes e sangramento intestinal. Os resultados mais altos foram atribuídos a uma quantidade crescente de perda de peso, diarréia e sangramento. O resultado diária para cada rato foi a nota média obtida a partir dos três resultados/observações. C. Resultados O comprimento do cólon para os ratos tratados com DSS foi um pouco mais curto nos dias 7 e 10 do que os não-tratados de controlo, mas os resultados podem não ter sido significativos (não controlados por uma aplicação estatística). Os resultados clinicos DAI reflectiram um aumento nos sintomas da doença nos ratos tratados com DSS semelhante ao observado em estudos anteriores usando este modelo. O sangue oculto foi maior em cerca dos dias 4 e 5, enquanto As fezes soltas foram mais prevalentes nos dias 6 e 7. Os resultados da histopatologia mostram que os resultados da doença foram diferentes dos controlos em 163 todos os dias do sacrifício, em especial no dia 7 (de pico) e 10. Os resultados da triagem de histopatologia foram: controlos = 0,5, dia 2 ratos tratados com DSS = 8,8, dia 7 ratos tratados com DSS = 21, dia 10 ratos tratados com DSS =18. Os resultados clínicos e histopatológicos mostram que os ratos tratados com DSS tiveram uma doença do cólon significativa em relação aos não tratados de controlo. As amostras de tecido congelado, foram usados mais tarde para as determinações de mARN, como descrito abaixo. D. Expressão tecidual de IL-22 ARN em amostras de cólon IBP murino usando RT-PCR:

Para determinar a expressão relativa do IL-22 ARN rato (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11) num modelo de doença inflamatória intestinal, os cólons distais de ratos tratados com DSS foram colectados e congelados em nitrogénio líquido. Nesta experiência os ratos foram tratados com DSS e as amostras foram feitas nos dias 2, 7 e 10 pós-tratamento. As amostras de ratos normais não tratados foram colectadas também. O ARN foi então isolado das amostras usando o kit padrão RNeasy Midiprep™ (Qiagen, Valência, CA), conforme instruções do fabricante.

As reacções RT-PCR usaram o sistema 'Superscript One-Step with Platinum Taq'. (Life Technologies, Gaithersburg, MD) Cada 25 μΐ de reação consistiu no seguinte: 12,5 μΐ de 2X de tampão de reacção, 0,5ul (20pmol/pl) de ZC39,289 (SEQ ID NO: 17), 0,5 μΐ (20pmol/ul) de ZC39,290 (SEQ ID NO: 18), 0,4 μΐ RT/Taq de mistura de polimerase, lOul de água livre RNase, 1,0 μΐ de ARN total (lOOng/μΙ) . A amplificação foi realizada da seguinte forma: um ciclo a 50° por 30 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°, 30 segundos; 58°, 30 segundos; 12°, 60 segundos; e, depois, terminando com uma extensão final a 12° por 7 minutos. 8 a 10 μΐ do produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose padrão usando 2% de um gel de agarose. O tamanho dos fragmentos do ADN correctamente previstos foi observado conforme o seguinte: 164 havia uma banda fraca em ambas as amostras do dia 2. Duas ou três amostras do dia 7 geraram uma banda forte, enquanto a terceira amostra do dia 7 gerou uma banda muito forte. As três amostras do dia 10 geraram uma banda forte. Finalmente, as duas amostras de controlo 'normais' não geraram qualquer banda. Estes resultados sugerem que pode haver uma sobre regulação de IL-22 em determinados tipos de resposta inflamatória do cólon, incluindo aqueles associados com o IBD, UC, e CD. Os dados são resumidos na Tabela 7 abaixo, onde a expressão relativa foi classificada como segue: 0 = não banda, 1= banda fraca, 2 = banda forte, 3 = banda muito forte.

Tabela 7

Tecido Expressão Relativa (0-3) Cólon normal 0 Cólon normal 0 Dia 2 pós tratamento 1 Dia 2 pós tratamento 1 Dia 7 pós tratamento 3 Dia 7 pós tratamento 2 Dia 7 pós tratamento 2 Dia 10 pós tratamento 2 Dia 10 pós tratamento 2 Dia 10 pós tratamento 2

Exemplo 9

Diminuição dos niveís de IL-22RA2 IL-6 e SAA no modelo de artrite induzida por colagénio do rato (CIA) A. Modelo de artrite induzida por colágeno do rato (CIA)

Ratos machos DBA/1J de dez semanas de idade (Jackson Labs) foram divididos em 3 grupos de 13 ratos/grupo. No dia 21, os animais receberam uma injecção subcutânea de 5-10 μΐ de lmg/ml de colagénio Tipo II formulado em djuvante Complete Freund (preparado por Chondrex, Redmond, WA) , e três semanas depois, no dia 0 foi-lhes dado uma injecção de 100 165 μΐ (25pg) de LPS de E. coli 0111 :B4, preparado como 250 pg/ml a partir de uma alíquota liofilizada (Sigma, St. Louis, MO) . A IL-22RA2 foi administrada por uma injecção intraperitoneal três vezes por semana durante quatro semanas, do dia 0 ao dia 25. Os dois primeiros grupos receberam tanto 100 ou 10 pg de IL-22RA2 por animal por dose, e o terceiro grupo recebeu o veiculo de controlo, PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Os animais começaram a apresentar os sintomas da artrite após a injecção de LPS, com a maioria dos animais a desenvolverem inflamação dentro de 2-3 semanas. A extensão da doença foi avaliada em cada pata, usando um paquímetro para medir a espessura da pata, e pela atribuição de um resultado clínico (0-3) a cada pata: 0 = Normal, 0,5 = dedo do pé inflamado, 1 = inflamação ligeira da pata , 2 = inflamação moderada da pata, e 3 = inflamação severa da pata como detalhado abaixo.

Controlo da doença:

Os animais podem começar a mostrar sinais de inflamação da pata logo após a segunda injecção de colagénio, e alguns animais podem até começar a ter sinais de inflamação do

dedo do pé antes da segunda injecção de colagénio. A maioria dos animais desenvolveu artrite dentro de 2-3 semanas após a injecção de impulso, mas alguns podem exigir um período mais longo de tempo. A incidência da doença neste modelo é tipicamente 95-100%, e 0-2 não-respondedores (determinada após 6 semanas de observação) é tipicamente vista num estudo utilizando 40 animais. Note-se que quando a inflamação começa, pode ocorrer uma ocorrência comum transitória de inflamação da pata ou do dedo do pé. Por este motivo, um animal não é considerado ter a doença estabelecida até desenvolver um edema persistente marcado da pata.

Todos os animais foram observados diariamente para avaliar a situação da doença nas suas patas, o que foi feito 166 através da atribuição de um resultado clinico qualitativo para cada uma das patas. Cada dia, cada animal teve as suas 4 patas pontuadas de acordo com o estado clinico da doença. Para determinar o resultado clinico, a pata foi pensada ter três zonas, os dedos do pé, a pata em si mesma (maõs ou pés), e a articulação do pulso ou tornozelo. A extensão e a gravidade da inflamação em relação a estas zonas foi anotada, incluindo a observação de todos os dedos para qualquer edema das articulações, unhas arrancadas, ou vermelhidão, a notação de qualquer evidência de edema ou vermelhidão em qualquer uma das patas, e a notação de qualquer perda da demarcação anatómica de tendões e ossos, e avaliação do pulso ou do tornozelo para qualquer edema ou vermelhidão, e anotação se a inflamação se estende proximalmente até à perna. A pontuação da pata de 1, 2 ou 3 baseou-se em primeiro lugar na impressão geral da gravidade, e em segundo lugar no número de zonas envolvidas. A escala utilizada para a pontuação clinica é mostrada abaixo.

Pontuação clínica: • 0 = Normal • 0.5 = Um ou mais dedos envolvidos, mas apenas os dedos dos pés estão inflamadas • 1 = inflamação suave envolvendo a pata (1 zona), e pudendo incluir um dedo ou dedos do pé • 2 = inflamação moderada na pata e pode incluir alguns dos dedos dos pés e/ou o punho/tornozelo (2 zonas) • 3 = inflamação severa na pata, punho tornozelo, e alguns ou todos os dedos dos pés (3 zonas) A doença estabelecida é definida como resultado qualitativo da inflamação da pata classificada com 2 ou mais, que persiste durante a noite (dois dias seguidos). Uma vez que a doença estabelecida está presente, a data é gravada e designada como primeiro dia do animal com a "doença estabelecida". 167 0 sangue foi colectado durante a experiência para monitorizar os niveis séricos de anticorpos anti-colagénio. Os animais foram sacrificados no dia 21, e o sangue foi colectado para soro e para o CBC. De cada animal, foi colectada uma pata afetada em 10% NBF para histologia e uma foi congelado em nitrogénio liquido e armazenada a -80°C para a análise de mARN. Além disso, 1/2 baço, 1/2 timo, 1/2 linfonodos mesentéricos, um lobo do fígado e o rim esquerdo foram colectados para análise de ARN em RNAlater e 1/2 baço, 1/2 timo, 1/2 linfonodos mesentéricos, o fígado remanescente e o rim direito foram colectados em 10% NBF para histologia. O soro foi colectado e congelado a -80°C para os ensaios de imunoglobulinas e citocinas. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos quanto às pontuações das patas e os dados das medidas foram analisados, embora tenha havido uma sugestão de que um grupo recebendo tratamento IL-22RA2 pode ter tido um atraso no aparecimento e progressão da inflamação da pata. Não houve diferenças significativas entre os grupos para as mudanças no peso corporal, parâmetros CBC, ou níveis de anticorpos anti-colagénio. Esses resultados iniciais indicam que a IL-22RA2 não afecta negativamente o peso corporal, os glóbulos vermelhos ou brancos, ou a produção de anticorpos, mas pode ser capaz de reduzir a inflamação. Novas investigações em administração, mecanismo de acção e eficácia estão em andamento (por exemplo, Exemplo 10) .

B. Dados elisa de anti-coláqeno no modelo do rato da CIA

Amostras de soro foram colectadas nos dias 0, 7, 14, 21 e 28 em relação à data do desafio LPS (dia 0) , a partir do modelo murino de artrite induzida por colagénio (Exemplo 9A acima). As amostras de soro foram testadas por ELISA para anticorpos anti-colagénio. Não houve efeito estatístico significativo no tratamento de IL-22RA2 nos grupos de tratamento de 100 pg ou 10 pg sobre os níveis de anticorpos 168 anti-colagénio em comparação com os controlos PBS. Abaixo está uma descrição dos métodos ELISA anti-colagénio e materiais.

Os reagentes utilizados para os testes ELISA anti-colagénio microplacas de 96 poços Maxisorp (NUNC, Rochester, NY) , colágénio tipo II (Chondrex, Redmond, WA), Super Block (Pierce, Rockford, IL) , peroxidase de rábano (HRP) conjugado de cabra e anti-rato IgG+A+M (H+L) (Zymed, South San Francisco, CA) e substrato de o-fenilenodiamina dicloridrato (Pierce, Rockford, IL). Os tampões utilizados em todos os ensaios foram tampão diluente ELISA B (PBS + 0,1% BSA + 0,05% Tween (Sigma, St. Louis, MO)), tampão de lavagem ELISA C (PBS + 0,05% Tween) e tampão desenvolvimento NovoD (0,063 m de citrato de sódio, 0,037M ácido citrico), H2O2 (Sigma) e IN H2SO4 (VWR, Tukwilla, WA) .

Aproximadamente 100 μΐ de sangue periférico foi colectado por sangramento retro-orbital em tubos de soro separados (Becton Dickinson). O soro foi colectado por centrifugação (2-3 min, 16, 000 xg, 4-6°C) e armazenado a -20°C até ser analisado. Para determinar os níveis de anticorpos anti-colagénio Ig, foram revestidas placas NUNC com 10 μ/mL de colágénio tipo II (Chondrex, Redmond WA) e incubadas durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas com ELISA C, bloqueadas (5 minutos, à temperatura ambiente) com o Super Block (Pierce, Rockford, IL), e lavadas com ELISA C. Amostras de soro diluído (diluído em ELISA B 5 vezes de 1:5000 a 1:625000) foram adicionadas às placas de ELISA em triplicata e as placas foram incubadas durante a noite a 4°C. Após a incubação, as placas foram lavadas com ELISA C, e foi adicionado etiquetas de peroxidase de cabra anti-rato Ig Fc (Zymed, 1:2000 em ELISA B) . As placas foram incubadas (temperatura ambiente, 90 minutos) , lavadas novamente usando ELISA C e foi desenvolvida a actividade de HRP utilizando substrato de o-fenilenodiamina dicloridrato (10 mL NovoD + 1 comprimido OPD + 10 μΐ de H2O2, Pierce). A reacção foi interrompida com IN H2S04. As medidas de densidade óptica relativa das amostras de soro na diluição 1:25000 foram tomadas em 490 nm usando um Spectra MAX 190, 169 e os dados foram analisados utilizando o software SoftMax Pro (Molecular Devices Corporation, Paio Alto, CA).

C. Análise IL-6 e SAA no modelo do rato CIA

As amostras de soro do dia 0 foram colectadas de ratos CIA (Exemplo 9A acima) 4 h após a administração de 25 yg de LPS intraperitoneal. As amostras foram seleccionadas para concentrações de IL-6 e soro amilóide A (SAA) por kits comerciais ELISA adquiridos em Biosource International (Camarillo, CA), conforme instruções do fabricante.

Os níveis de IL-6 foram 9651 +/- 1563 pg/ml, 10865 +/- 1478 pg/ml e 15006 +/- 2099 pg/ml nos grupos de ratos submetidos a uma dose de 100 yg IL-22RA2, 10 yg IL-22RA2 e PBS de controlo, respectivamente. A concentração de IL-6 no grupo de ratos CIA expostos a doses de 100 yg de IL-22RA2 era significativamente menor em comparação com os ratos de controlo PBS com p = 0351. A significância estatística foi calculada usando PLSD Fisher com um nível de significância de 5% (ABACUS Concepts, INC, Berkeley, CA).

Além disso, as concentrações de SAA foram 381 +/- 40 yg/ml, 348 +/- 37 yg/ml e 490 +/- 50 yg/ml nos grupos de ratos submetidos a 100 yg de IL-22RA2, 10 yg de IL-22RA2 e grupo de controlo PBS, respectivamente. A concentração de SAA no grupo de ratos CIA expostos a doses de 10 yg de IL-22RA2 foi significativamente menor em comparação com os ratos de controlo PBS com p = 00257. A significância estatística foi calculada usando PLSD Fisher com um nível de significância de 5% (ABACUS Concepts, INC Berkeley, CA). 170

Exemplo 10

Anti-IL-22RA mAbs anti ou anti-IL-22 mAbs inibem a gravidade da doença num modelo do rato CIA 0 modelo de artrite induzida por colagénio (CIA) é um modelo do rato para a artrite reumatóide, que reflecte em grande medida a doença observada em humanos. (Moore, Mol Methods. Biol. 225:175-179, 2003: Waksman, Scand. J. Immunol., 56:12-34, 2002). Os ratos são imunizados com 2 doses de colagénio emulsionado em CFA na base da cauda. Isso resulta no inchaço das patas que aumenta ao longo de um período de tempo e pode ser tanto visualmente marcado como medido com paquímetro. Além disso, os anticorpos do soro anti-colagénio correlacionam bem com a gravidade da doença. Com base nos dados mostrando a inflamação induzida IL-20 e IL-22, são administradas anti-IL-22RA e anti-IL-22 mAbs a grupos de ratos imunizados com colagénio, e os efeitos sobre os resultados da doença são avaliados. A diminuição nos resultados da pata e espessura da pata após a administração de anti-IL-22RA mAbs ou anti-IL-22 mAbs sugere que a IL-20 e IL-22 promovem a resposta imune em curso num modelo de auto-imunidade e bloqueam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam a sua função podendo inibir desordens auto-imunes. A inibição de TNFa sérico e anticorpos anti-colagénio também sugere que o bloqueio de IL-22RA pode ser benéfico em doenças auto-imunes.

Assim, para determinar se anti-lL-22RA mAbs ou anti-IL-22 mAbs têm um efeito sobre a auto-imunidade, foram testados num modelo do rato para a artrite reumatóide - artrite induzida por colagénio (CIA). Especificamente, os ratos DBA1J receberam injecções de colagénio para induzir a artrite reumatóide. A inoculação no Dia 0 é uma injecção subcutânea de um homogeneizado consistindo em adjuvante de Freund completo (CFA) e colagénio do tipo II (50-100μ1, preparado como 2mg/ml de colagénio) . A injecção é dada perto da base da cauda. No dia 21, uma segunda inoculação é administrada, a única diferença é que o homogeneizado é preparada com adjuvante incompleto de Freund (IFA), em vez 171 do CFA. Os resultados da pata e a espessura são medidos diariamente. Grupos de ratos recebem PBS, 20-200ug de isótopo de controlo que combina com anticorpo monoclonal ou 2o-200ug anti-IL-22RA mAb ou anti-IL-22mAb i.p. 2X ou 3x/semana por 1-4 semanas começando a partir da segunda injecção de colagénio. Os ratos são monitorizados diariamente até ao dia 30. Os ratos são sacrificados no dia 30, e tomado soro para análise de anticorpos anti-colagénio e análise de citocinas séricas (TNF □). A inibição da pontuação da pata, espessura da pata, soro TNFa e soro de anticorpos anti-colagénio pela administração de anti-IL-22RA ou anti-IL-22 mAbs sugere que o bloqueio de IL-22RA pode ligar, bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar IL-22, e inibem uma resposta imune em curso mum modelo de auto-imunidade e pode inibir desordens auto-imunes .

Exemplo 11

Expressão do receptor IL-22, IL-22RA, no modelo do rato DSS

Foi realizada RT-PCR quantitativa para medir os níveis de expressão de IL-22RA do rato no cólon de ratos com IBD induzida por DSS (Exemplo 8) . O ARN foi isolado do cólon de ratos normais e do cólon distai de ratos tratados com DSS nos dias de tratamento 2, 7 e 10. RT-PCR foi realizada utilizando um instrumento Applied Biosystems 7700 TaqMan e protocolos. Em suma, o software "Primer Express" foi utilizado para substratos concebidos contra a sequência de rato IL-22RA (ZC39776 (SEQ ID NO: 19) e ZC39777 (SEQ ID NO: 20)) e uma sonda FAM/TAMRA TaqMan rotulada (ZC38752 (SEQ ID NO: 21)), de acordo com as directrizes da Applied Biosystems. 25 ng de ARN foi adicionado em cada reacção, juntamente com o PE/Applied Biosystems TaqMan EZ RT-PCR Core Reagentes e os substratos acima mencionados e sonda. As reacções de RT-PCR foram realizadas em duplicado, nas seguintes condições: 50°C por 2 minutos, 60°C por 30 172 minutos, 95°C por 5 minutos, 40 ciclos de 94°C por 20 segundos e 60°C por 1 minuto. Os valores de expressão foram comparados com uma curva padrão de um número conhecido de moléculas sintéticas de um rato IL-22RA ARN transcrito, e a expressão é relatada como o número absoluto de moléculas de rato IL-22RA por reacção. Os dados preliminares sugerem que a expressão de IL-22RA rato pode ser ligeiramente regulada para baixo no cólon distai dos ratos com IBD induzida por DSS no dia 7 e dia 10 quando comparados aos niveis de expressão no cólon do rato normal.

Exemplo 12

IL-22 e indicadores pró-inflamatórios no modelo de endotoxemia leve: modelo do rato com endotoxemia induzida por LPS A. Modelo do rato com endotoxemia induzida por LPS: Avaliação de citocinas pró-inflamatórias e temperatura corporal no modelo de rato com endotoxemia induzida por LPS

Uma experiência in vivo foi concebida para analisar o efeito da IL-22RA2 (IL-22RA2) num modelo de rato com endotoxemia LPS leve. Inicialmente para avaliar o modelo, medimos citocinas pró-inflamatórias e a temperatura do corpo para colectar dados de referência para o modelo.

Resumidamente, ratos fêmeas Balb/c (CRL) com seis meses foram injectados com 25 yg LPS (Sigma) em PBS estéril por via intraperitoneal (IP). As amostras de soro foram colectadas 0, 1, 4, 8, 16, 24, 48 e 72 horas de grupos de oito ratos para cada momento. As amostras de soro foram testadas para niveis de citocinas inflamatórias. Os niveis de IL-lb, IL-6, TNF, IL-10 e proteína amilóide A sérica (SAA), foram medidos através de kits comerciais ELISA comprados em Biosource International (Camarillo, CA). 173

Os níveis de TNFa atingiram 4000pg/ml e os níveis de EL-10 foram 341 pg/ml 1 hora após a injecção de LPS. Às 4 horas após a injecção de LPS, IL-6, IL-lb e IL-10 foram de 6,100 pg/ml, 299 pg/ml e 229 pg/ml, respectivamente. Os níveis séricos de SAA foram 0,405 mg/ml 4 horas após a injecção de LPS. As concentrações de SAA no soro continuaram a aumentar para 3,9 mg/ml 24 horas após LPS, entretanto níveis SAA maiores do que 1 a 2 mg/ml no soro são difíceis de medir com precisão ou reprodutibilidade com o kit de ELISA existente devido às interacções entre SAA e outros componentes do soro. Estes resultados indicam que as citocinas pró-inflamatórias, além de IL-22 (Exemplo 11B) foram realmente produzidas neste modelo. Assim, os critérios foram estabelecidos como marcadores biológicos para o modelo de endotoxemia leve LPS: os níveis séricos de TNFa 1 hr após LPS, níveis séricos de IL-6 4 horas após LPS e os níveis séricos de SAA 4 e 8 hotas após LPS. A temperatura corporal num grupo separado de animais foi monitorizada por dispositivos de telemetria implantados cirurgicamente no decorrer doa experiência de 72 horas. A temperatura corporal nos ratos diminuiu ao máximo de 2°C a partir de 37,07°C a 34,98°C, 30 minutos após a injecção de LPS. A injecção de 100 yg de proteína de fusão IL-22RA2-Fc 30 minutos antes da injeção de LPS reduziu significativamente em cerca de 50% da indução da SAA na 4hr e 8hr, enquanto 10 ug de IL-22RA2-Fc não teve efeito significativo. Não há nenhuma mudança significativa para o TNF-alfa e nível de IL-6. A injecção de IL-22RA2-Fc reduziu o número de neutrófilos em circulação a 1 hr. Mostrou que a administração de IL-22RA2-Fc pode neutralizar a actividade da IL-22 em termos de indução SAA. 174 B. Detecção de Actividade IL-22 no soro de rato num modelo de rato com endotoxemia induzida por LPS usando células BaF3/CRF2-4/lL-22RA em Ensaio de Proliferação AIamar Blue

As células BaF3/CRF2-4/IL-22RA, aqui descritas, foram giradas para baixo e lavadas em PBS duas vezes para garantir a remoção do MIL-3, e depois torcidas uma terceira vez e re-suspensas em meio completo (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Glutamax, 1% piruvato de sódio), mas sem MIL-3 (a seguir designado "meio livre de MIL-3"). As células foram então contadas num hemocitómetro. As células foram cultivadas em placas de formato de 96 poços com 5000 células por poço num volume de 100 μΐ por poço usando o meio livre de MIL-3. O soro dos ratos com endotoxemia induzida por LPS da experiência descrita no Exemplo 11A acima, foi diluído para 2% em meio livre de MIL-3 na linha superior da placa e em seguida, diluído em série 1:02 as restantes sete linhas sobre os 96 poços da placa, deixando um volume de 100 μΐ em cada poço. Isto foi então adicionado a 100 μΐ de células, para concentrações séricas finais de 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,063%, 0,031%, 0,016% e 0,018% num volume total de ensaio de 200 μΐ. As placas de ensaio foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 4 dias ao fim dos quais foi adicionado Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) em 20 μΐ/poço. As placas foram novamente incubadas a 37°C, 5% C02 durante 16 horas. O Alamar Blue dá uma leitura fluourométrica com base no número de células vivas, e é assim uma medida directa da proliferação celular em relação ao controlo negativo. As placas foram lidas no contador Wallac Victor 2 1420 Multilabel (Wallac, Turku, Finlândia) em comprimentos de onda de 530 (excitação) e 590 (emissão).

Os resultados mostraram proliferação não significativa em relação aos níveis de fundo na hora 0, 1 hora, 8 horas, e 16 horas. As amostras de soro a partir da hora 4 mostraram ser quatro vezes superior ao aumento de 10 vezes acima da 175 proliferação de fundo, indicando a presença de IL-22 nas amostras. C. Modelo do rato com endotoxemia induzida por LPS: Experiência para avaliar os efeitos da IL-22RA2

Foi testada a capacidade do tratamento com IL-22RA2 para afectar os indicadores pró-inflamatórios induzidos com uma dose única de 25 pg IP de LPS em ratos. Todas as amostras foram analisadas para a SAA, a IL-22 e número de neutrófilos circulantes. Subconjuntos de cada grupo foram analisados para niveis de citocinas particulares (amostras de uma hora foram seleccionadas para o TNF-alfa, amostras de 4 horas foram analisadas para IL-6). Os animais foram sacrificados em períodos de tempo indicados na Tabela 8 abaixo e o sangue total e o soro foram colectados e aliquotados para análise.

Os ratos fêmeas C57BL/6N 72 (CRL) receberam uma dose única de IL-22RA2 por IP conforme descrito na Tabela 8, abaixo. Os ratos de controlo foram C57BL/6N (CRL). 30 minutos depois, receberam outra injecção IP de 25 pg de LPS (Sigma) em 100 μΐ, para dar início a uma cascata de endotoxemia. Os ratos em cada grupo foram sacrificados no tempo correspondente como indicado na Tabela 8, 50 μΐ de sangue total foi colectado para avaliar o número total de neutrófilos circulantes e os restantes foram girados para soro e aliquotados para vários testes aqui descritos. 176

Tabela δ

Grupo N° Tratamento LPS Sacrificio Amostras A 8 lOOyg IL-22RA2 IP 25yg IP 30 min pós tx 1 hora Aliquotas de soro Sangue para CBC B 8 10yg IL-22RA2 IP 25yg IP 30 min pós tx 1 hora Aliquotas de soro Sangue para CBC C 8 200yg PBS IP 25yg IP 30 min pós tx 1 hora Aliquotas de soro Sangue para CBC D 8 lOOyg IL-22RA2 IP 25yg IP 30 min pós tx 4 horas Aliquotas de soro Sangue para CBC R 8 10yg IL-22RA2 IP 25yg IP 30 min pós tx 4 horas Aliquotas de soro Sangue para CBC F 8 200yg PBS IP 25yg IP 30 min pós tx 4 horas Aliquotas de soro Sangue para CBC G 8 lOOyg IL-22RA2 IP 25yg IP 30 min pós tx 8 horas Aliquotas de soro Sangue para CBC H 8 10yg IL-22RA2 IP 25yg IP 30 min pós tx 8 horas Aliquotas de soro Sangue para CBC J 8 200yg PBS IP 25yg IP 30 min pós tx 8 horas Aliquotas de soro Sangue para CBC K 5 Controlos Nenhum Pré LPS Aliquotas de soro Sangue para CBC 177 D, IL-Fc4-22RA2 neutraliza indução SAA in vivo: SAA ELISA mostrando expressão SAA induzida por LPS no modelo do rato com endotoxemia induzida por LPS é inibida por injecção de IL-22RA2-FC4:

Para avaliar se a IL-22RA2 poderia inibir a indução da SAA no modelo de rato com endotoxemia induzida por LPS, os ratos foram injectados com IL-22RA2, 30 minutos antes da injecção de LPS, como mostra a Tabela 8, Exemplo 11C acima.

Um teste de ELISA para determinar os niveis SAA nas amostras da hora 4 e 8 foi realizado utilizando o kit de imunoensaio Mouse SAA (BioSource Internacional, Califórnia) seguindo as instruções do fabricante. No intervalo de 4 horas, os ratos tratados com 100pg ou 10pg de IL-22RA2 mostraram uma redução estatisticamente significativa nos niveis de SAA em relação aos ratos injectados com PBS. No ponto de tempo de 8 horas, os ratos tratados com 100pg, continuaram a mostrar uma diminuição estatisticamente significativa nos niveis de SAA em relação aos ratos injectados com PBS. Isso indica que a presença da IL-22RA2 é capaz de inibir a indução da SAA pelo LPS in vivo.

Exemplo 13

Efeitos in vivo do polipeptídeo IL-22 na pele A. Acantose induzida por IL-22

Ratos (fêmeas, C3H/HeJ, 8 semanas de idade; Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram divididos em três grupos de seis animais e um grupo de 4. IL-22 produzida por BHK humano foi administrada por infusão continua através de mini-bombas osmóticas, resultando em concentrações séricas no estado estacionário e local proporcional à concentração da IL-22 contido na bomba. As mini-bombas osmóticas Alzet (modelo 178 2002; Alza Corporation Paio Alto, CA) foram carregadas em condições estéreis com a proteina IL-22 (A601F, 0,22 mL) diluído em tampão fosfato (pH 7,0) a uma concentração na bomba de 2 mg/mL para o grupo de ratos 1, 0,2 mg/mL para o grupo de ratos 2, 0,02 mg/mL para o grupo de ratos 3, ou 0 mg/mL (diluente apenas) para o grupo de ratos 4. As bombas foram implantadas subcutaneamente nos ratos através de uma incisão de 1 cm na pele dorsal, e a pele foi fechada com o encerramento da ferida estéril. Estas bombas são projectadas para oferecer o seu conteúdo a uma taxa de 0,5 μΐ/hora durante um período de 14 dias. Usando esta taxa nominal de infusão, as doses foram calculadas para ser de 24 yg/dia, 2,4 yg/dia, 0,24 yg/dia e 0 yg/dia para os grupos 1-4, respectivamente.

No final do período de 14 dias, os ratos foram sacrificados e uma amostra de aproximadamente 1 centímetro quadrado de pele ao redor da área da bomba foi colectada de cada rato. A pele foi fixada em 10% de formalina tamponada neutra. As amostras de pele fixadas em formalina foram embebidas em parafina, processadas, seccionadas a 5 um e coradas com hematoxilina e eosina. Os tecidos foram analisados microscopicamente de forma cega por um patologista veterinário certificado ACVP. As alterações histológicas foram observadas, e a gravidade da acantose (espessamento da epiderme, por exemplo) marcada de forma subjectiva através do sistema de pontuação seguinte: 0-normal, 1-acantose mínima, 2-acantose leve, 3- acantose moderada e 4-acantose grave. Além disso, a pele dos grupos seleccionados foi fotografada com uma câmera digital CoolSnap (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA) e a espessura da epiderme medida utilizando software de histomorfometria (Scion Image for Windows, v. 4.02, Scion Corporation, Frederick, MD). A administração de IL-22 em 2,4 e 24 yg/dia resultou em espessamento da epiderme, como mostrado pelo resultado de acantose média (ver s) consistentemente superior ao observado na pele do grupo de controlo. Além disso, os animais tratados com IL-22 também tiveram infiltrados de 179 células mononucleares na epiderme. Estes infiltrados não foram observados nos animais tratados de controlo.

Resultados de acantose na espessura da epiderme e medidas da espessura da pele (em unidades genéricas de pixels) por dos grupos são apresentados na Tabela 9 abaixo, como segue:

Tabela 9

Grupo # n= Bomba Acantose média Espessura medida 1 6 24 yg IL-22/dia 3,0 ND 2 6 2,4 yg Ε-22/dia 2,4 67,5 3 6 0,24 yg IL-22/dia 2,2 ND 4 4 Infusão PBS 1,8 45,6 B. Efeito da IL-22RA2 na acantose induzida por IL-22

Ratos (fêmeas, C3H/HeJ, 8 semanas de idade; Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram divididos em oito grupos de oito animais cada. IL-22 foi administrada por infusão continua através de mini-bombas osmóticas, como descrito no Exemplo 12A. Mini-bombas osmóticas Alzet (modelo 2001; Alza Corporation Paio Alto, CA) foram carregadas em condições estéreis com a proteína IL-22 (A#601F, 0,22 mL) diluída em tampão fosfato (pH 7,0) a uma concentração na bomba de 0,22 mg/mL para o grupo de 1-2 dos ratos, 0,45 mg/mL para o grupo 3-4 dos ratos, 0,9 mg mL para o grupo de 5-6 dos ratos, ou 0 mg/mL (apenas de diluente) para o grupo de 7-8 dos ratos. Estas bombas são projectadas para oferecer o seu conteúdo a uma taxa de 0,5 μΐ/hora durante um período de 14 dias. Usando esta taxa nominal de infusão, as doses foram calculadas para ser de 10 yg/dia nos grupos 1-2, 5 yg/dia nos grupos 3-4, 2,5 yg/dia nos grupos 5-6 e 0 yg/dia nos grupos 7-8. Para cada par de grupos a uma dose determinada de IL-22, um dos grupos foi injectado três vezes (dias 1, 3 e 5) com 0,1 mg de proteína IL-22RA2 Fc 180 humana (descrita aqui), por via interperitoneal. 0 outro grupo foi injectado na mesma forma com o veiculo (PBS).

No dia 8 de estudo, os ratos foram sacrificados e uma amostra de cerca de um centímetro quadrado de pele ao redor da área da bomba foi colectada de cada rato. A pele foi fixada em 10% de formalina tamponada neutra. As amostras de pele fixadas em formalina foram embebidas em parafina, processadas, seccionadas a 5 um e coradas com hematoxilina e eosina. Os tecidos foram analisados microscopicamente de forma cega por um patologista veterinário certificado ACVP. Este estudo foi marcado de forma diferente do exemplo anterior. Foi determinado o número de camadas na epiderme, da camada basal do estrato granuloso. Com base nos resultados, as secções foram registadas como segue: 0-espessamento normal (2-3 camadas) , 1-espessamento leve (3-4 camadas), 2-espessamento moderado (4-6 camadas) e 3-espessamento grave (> 6 camadas). A administração de IL-22 a 2,5, 5, 10 yg/dia resultou em espessamento da epiderme (ver Tabela 10) . Além disso, os animais tratados com IL-22 também tiveram infiltrados de células mononucleares na epiderme. Estes infiltrados não foram observados nos animais tratados de controlo. A administração concomitante de 100 yg de IL-22RA2 (3 injecções) diminuiu a quantidade de espessamento da epiderme em ratos tratados com 5 yg de IL-22/dia.

Os resultados da acantose na espessura da epidermer por grupos são apresentados na Tabela 10, abaixo, como segue: 181

Tabela 10

Grupo n= Bomba Inj ecção Acantose média 1 8 2,5 pg IL-22/dia 100 pl veículo (3 injecções) 1.1 2 8 2,5 pg IL-22/dia 100 pl IL-22RA2(3 injecções) 0.8 3 8 5 pg Ε-22/dia 100 pl veículo (3 injecções) 2.0 4 8 5 pg Ε-22/dia 100 pl IL-22RA2(3 injecções) 0.6 5 8 10 pg IL-22/dia 100 pl veículo (3 injecções) 2.0 6 8 10 pg IL-22/dia 100 pl IL-22RA2(3 injecções) 1.9 7 8 Veículo 100 pl veículo (3 injecções) 0.0 8 8 Veículo 100 pl IL-22RA2(3 injecções) 0.0 O espessamento da epiderme e infiltrado imunológico também foram observados em peles psoriáticas humanas. O fenótipo de pele observado em injecção de IL-22 por via subcutânea indicou ainda o potencial papel da IL-22 na patogénese da psoriase. 0 facto de que a IL-22RA2-Fc pode neutralizar o fenótipo de pele induzido por IL-22 sugere o uso potencial de outros antagonistas IL-22, tais como anticorpos neutralizantes anti-IL-22 ou o receptor solúvel para o tratamento da psoriase e outras doenças inflamatórias induzidas por IL-22. C. Efeito dos receptores solúveis de IL-22RA e anticorpos de anti-IL-22RA na IL-22 induzida ou acantose induzida por IL-20 A actividade dos receptores solúveis de IL-22RA, ou um anticorpo para IL-22RA, para inibir a actividade in vivo de IL-22 ou IL-20 é avaliada de maneira semelhante, usando o parâmetro histológico da acantose causada por infusão subcutânea de IL -22 ou proteína de IL-20. Num exemplo deste modelo são implantados A ratos C3H/HeJ mini-bombas osmóticas por via subcutânea, conforme descrito nos exemplos 12(A) e 12(B) acima. Durante o período de exposição à IL-22 ou IL-20, os ratos são tratados por injecção com o anticorpo monoclonal purificado a IL-22 ou semelhante injectados com veículo como controlo. No final 182 do período de infusão de IL-22, serão recolhidas amostras na área de bomba para análise histológica. Semelhante ao receptor solúvel IL-22RA2 antagonista IL-22, IL-22 ou antagonista IL-20 receptores solúveis IL-22RA, ou anticorpos anti-IL-22RA da presente invenção é esperado que mostrem a redução do espessamento da epiderme e infiltrado de células imunes causada pela IL-22 ou IL-20 e, portanto, ser útil como antagonistas de IL-22 ou IL-20 como terapêutica para a psoríase e outras doenças inflamatórias induzidas por IL-22 ou IL-20.

Exemplo 14 IL-22 é sobre regulada em amostras de pele humana psoriática

Amostras de ARN:

Foram obtidas amostras de pele normal, assim como a pele de pacientes com psoríase. Esta última inclui a pele de psoríase tipo placa estável e sem envolvimento da pele adjacente. O ARN foi isolado de amostras de pele humana, utilizando métodos convencionais. A integridade e a qualidade das amostras de ARN foram testadas com o nioanalisador de Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn Alemanha).

Substratos e sondas para RT-PCR- quantitativo O quantivo de RT-PCR em tempo real usando a ABI Prism 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) tem sido descrito previamente (ver Heid, CA et al. Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, UEM et al. Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al. Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este método incorpora o uso de uma sonda específica do gene contendo o 183 repórter e corantes fluorescentes calmantes. Quando a sonda está intacta a emissão de corantes repórter é negada devido à proximidade do corante calmante. Durante a extensão PCR usando genes específicos adicionais e substratos para a frente e reversos, a sonda é clivada pela actividade nucleolitica 5' a 3' da polimerase r TTH ADN que liberta o corante repórter da sonda, resultando num aumento na emissão de fluorescência.

Os substratos e sondas utilizadas para análises em tempo real quantitativa de RT-PCR da expressão de IL-22 foram projectadas usando o substrato concebido pelo software Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . Substratos para a IL-22 humana foram projectados abrangendo uma junção intron-exon para eliminar amplificação do ADN genómico. 0 substrato para a frente, ZC42459 (SEQ ID NO: 22) e o substrato reverso, ZC42458 (SEQ ID NO: 23) foram usados na reacção de PCR (abaixo) numa concentração de 800 nM para sintetizar um produto pb 72. A correspondente sonda de IL-22, ZC42460 (SEQ ID NO: 24) foi sintetizada e rotulada em casa pela ZymoGenetics. A sonda IL-22 foi marcada na extremidade 5' com um corante repórter fluorescente (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante fluorescente calmante (β-tetrametil-carboxi-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). C. Quantativo de RT-PCR em tempo real

Os niveis relativos de IL-22 ARNm foram determinados através da análise de amostras de ARN total usando o kit de reagentes TaqMan EZ RT-PCR Core (PE Applied Biosystems). A transcrição rápida da IL-22 foi feita para gerar uma curva padrão para quantificação. A curva consiste em 10 diluições em série variando de cerca de le8 a le3 cópias totais de toda a mensagem para IL-22 em cada ponto da curva padrão analisada em triplicado. As amostras de ARN total da pele também foram analisadas em triplicado para os niveis de 184 transcrição de IL-22 humana e os níveis de hGUS como um controlo endógeno. Num volume total de 25 μΐ, cada amostra de ARN foi submetida à reação TaqMan EZ RT-PCR (PE Applied Biosystems), contendo: cerca de 25 ng de ARN total em água tratada DEPC (Dnase/Rnase livre); substratos apropriados (cerca de 800 nM ZC 42459 (SEQ ID NO: 22) e ZC 42458 (SEQ ID NO: 23); sonda adequada (aproximadamente 100 nM ZC 42460 (SEQ ID NO: 24); lx tampão TaqMan EZ; 3 mM de acetato de manganésio; 300 μΜ de cada d-CTP, d-ATP e GTP-d e 600 μΜ de d-UTP; polimerase r TTH ADN (0,1 U/μΙ) e AmpErase UNG (0,01 U/μΙ) . As condições de termociclagem PCR foram as seguintes: uma primeira fase de tratamento UNG de um ciclo de 50°C por 2 minutos; seguido de uma etapa de transcrição reversa (RT) de um ciclo de 60°C por 30 minutos; seguido por uma etapa de desativação da UNG de um ciclo de 95°C por 5 minutos; seguido de 40 ciclos de amplificação a 94°C por 20 segundos e 60°C por 1 minuto.

Os níveis relativos de IL-22 ARN foram determinados usando o método da curva padrão como descrito pelo fabricante, PE Biosystems (User Bulletin # 2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantification of Gene Expression, 11 de Dezembro de 1997) . As medições hGUS foram usadas para normalizar os níveis de IL-22. Os dados são apresentados na Tabela 11 abaixo.

Tabela 11

Amostra de pele IL-22 Normal 0 Não envolvida 0 Envolvida 1149 A IL-22 mARN foi indetectável em amostras de pele de pacientes normais ou de áreas não envolvidas. Em contrapartida, houve uma sobre regulação dramática para a mensagem de IL-22 na pele envolvente de pacientes com psoríase. Estes dados confirmam uma associação forte da doença para a IL-22 para a psoríase humana. A sobre expressão de IL-22 foi mostrada em lesões de psoríase humana, sugerindo que a IL-22 está envolvida na 185 psoríase humana. Além disso, como aqui descrito, a sobre expressão de IL-22 em ratos transgénicos mostrou espessamento da epiderme e envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo de psoriase e, além a injecção de IL-22 em ratos normais mostrou espessamento da epiderme e envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo psoriático que foi retirado pelo antagonista do receptor solúvel IL-22RA2. Tais dados in vivo sugerem ainda que a IL-22 pró-inflamatória está envolvida na psoriase. Como tal, os antagonistas da actividade da IL-22, como os anticorpos monoclonais anti-humano-IL-22 da presente invenção, bem como os receptores solúveis e os respectivos anticorpos, são úteis no tratamento terapêutico de doenças inflamatórias, especialmente como antagonistas de IL -22 no tratamento da psoriase. Além disso, os antagonistas da actividade da IL-22, como os anticorpos monoclonais anti-humano-IL-22 da presente invenção, bem como osreceptores solúveis e os respectivos anticorpos, são úteis no tratamento terapêutico de outras doenças inflamatórias, por exemplo, como antagonistas de IL-22 no tratamento da dermatite atópica, IBD, colite, endotoxemia, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, doença respiratória do adulto (ARD), choque séptico, falência de múltiplos órgãos, lesões inflamatórias pulmonares como asma ou bronquite, pneumonia bacteriana, psoríase, eczema, dermatite atópica e de contacto, doença intestinal inflamatória, como colite ulcerativa e doença de Crohn.

Exemplo 15 IL-22 é sobre expressa em amostras de pele com dermatite atópica humana

Foram obtidas amostras de pele normal (n = 4), bem como da pele de pacientes com dermatite atópica (n = 4). 0 ARN foi isolado de amostras de pele humana, utilizando métodos convencionais. A integridade e a qualidade das amostras de ARN foram testadas com um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn Alemanha). 186

Substratos e sondas para RT-PCR- quantitativo 0 quantivo de RT-PCR em tempo real usando a ABI Prism 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) tem sido descrito previamente (ver Heid, CA et al. Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, UEM et al. Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al. Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este método incorpora o uso de uma sonda especifica do gene contendo o repórter e corantes fluorescentes calmantes. Quando a sonda está intacta a emissão de corantes repórter é negada devido à proximidade do corante calmante. Durante a extensão PCR usando genes específicos adicionais e substratos para a frente e reversos, a sonda é clivada pela actividade nucleolítica 5' a 3' da polimerase r TTH ADN que liberta o corante repórter da sonda, resultando num aumento na emissão de fluorescência.

Os substratos e sondas utilizadas para análises em tempo real quantitativa de RT-PCR da expressão de IL-22 foram projectadas usando o substrato concebido pelo software Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . Substratos para a IL-22 humana foram projectados abrangendo uma junção intron-exon para eliminar amplificação do ADN genómico. O substrato para a frente, ZC42459 (SEQ ID NO: 22) e o substrato reverso, ZC42458 (SEQ ID NO: 23) foram usados na reacção de PCR (abaixo) numa concentração de 800 nM para sintetizar um produto pb 72. A correspondente sonda de IL-22, ZC42460 (SEQ ID NO: 24) foi sintetizada e rotulada em casa pela ZymoGenetics. A sonda IL-22 foi marcada na extremidade 5' com um corante repórter fluorescente (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante fluorescente calmante (6-tetrametil-carboxi-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). C. Quantativo de RT-PCR em tempo real 187

Os níveis relativos de IL-22 ARNm foram determinados através da análise de amostras de ARN total usando o kit de reagentes TaqMan EZ RT-PCR Core (PE Applied Biosystems). A transcrição rápida da IL-22 foi feita para gerar uma curva padrão para quantificação. A curva consiste em 10 diluições em série variando de cerca de le8 a le3 cópias totais de toda a mensagem para IL-22 em cada ponto da curva padrão analisada em triplicado. As amostras de ARN total da pele também foram analisadas em triplicado para os níveis de transcrição de IL-22 humana e os níveis de hGUS como um controlo endógeno. Num volume total de 25 μΐ, cada amostra de ARN foi submetida à reação TaqMan EZ RT-PCR (PE Applied Biosystems), contendo: cerca de 25 ng de ARN total em água tratada DEPC (Dnase/Rnase livre); substratos apropriados (cerca de 800 nM ZC 42459 (SEQ ID NO: 22) e ZC 42458 (SEQ ID NO: 23); sonda adequada (aproximadamente 100 nM ZC 42460 (SEQ ID NO: 24); lx tampão TaqMan EZ; 3 mM de acetato de manganésio; 300 μΜ de cada d-CTP, d-ATP e GTP-d e 600 μΜ de d-UTP; polimerase r TTH ADN (0,1 U/μΙ) e AmpErase UNG (0,01 U/μΙ) . As condições de termociclagem PCR foram as seguintes: uma primeira fase de tratamento UNG de um ciclo de 50°C por 2 minutos; seguido de uma etapa de transcrição reversa (RT) de um ciclo de 60°C por 30 minutos; seguido por uma etapa de desativação da UNG de um ciclo de 95°C por 5 minutos; seguido de 40 ciclos de amplificação a 94°C por 20 segundos e 60°C por 1 minuto.

Os níveis relativos de IL-22 ARN foram determinados usando o método da curva padrão como descrito pelo fabricante, PE Biosystems (User Bulletin # 2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantification of Gene Expression, 11 de Dezembro de 1997). As medições hGUS foram usadas para normalizar os níveis de IL-22. A IL-22 mARN foi indetectável em amostras de pele de pacientes normais ou de áreas não envolvidas. Em contrapartida, houve uma sobre regulação dramática para a mensagem de IL-22 na pele envolvente de pacientes com 188 dermatite atópica. Estes dados confirmam uma associação forte da doença para a IL-22 para a determatite atópica humana. A sobre expressão de IL-22 foi mostrada em lesões de dermatite atópica humana, sugerindo que a IL-22 está envolvida na demartite atópica humana. Além disso, como aqui descrito, a sobre expressão de IL-22 em ratos transgénicos mostrou espessamento da epiderme e envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo da dermatite atópica e, além a injecção de IL-22 em ratos normais mostrou espessamento da epiderme e envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo da dermatite atópica que foi retirado pelo antagonista do receptor solúvel IL-22RA2. Tais dados in vivo sugerem ainda que a IL-22 pró-inflamatória está envolvida na dematite atópica. Como tal, os antagonistas da actividade da IL-22, como os anticorpos monoclonais anti-humano-IL-22 da presente invenção, bem como os receptores solúveis e os respectivos anticorpos, são úteis no tratamento terapêutico de doenças inflamatórias, especialmente como antagonistas de IL -22 no tratamento da dermatite atópica. Além disso, os antagonistas da actividade da IL-22, como os anticorpos monoclonais anti-humano-IL-22 da presente invenção, bem como osreceptores solúveis e os respectivos anticorpos, são úteis no tratamento terapêutico de outras doenças inflamatórias, por exemplo, como antagonistas de IL-22 no tratamento da dermatite atópica, IBD, colite, endotoxemia, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, doença respiratória do adulto (ARD), choque séptico, falência de múltiplos órgãos, lesões inflamatórias pulmonares como asma ou bronquite, pneumonia bacteriana, dermatite atópica, eczema, dermatite atópica e de contacto, doença intestinal inflamatória, como colite ulcerativa e doença de Crohn. 189

Exemplo 16

Anticorpos policlonais de IL-22 humana

Foram preparados anticorpos policlonais anti-IL-22 através da imunização de duas coelhas fêmeas brancas New Zealand, com o polipeptideo humano recombinante maduro purificado da IL-22 (resíduos de aminoácidos 22 (Ala) a 167 (Ile) da SEQ ID NO: 6), produzido a partir de células BHK (IL-22-BHK) . Aos coelhos foi dada, a cada um, uma injecção intraperitoneal inicial (ip) de 200 yg de proteína purificada em adjuvante de Freund completo, seguido por injecções de reforço IP de 100 yg de peptídeo em adjuvante incompleto de Freund cada três semanas. Sete a dez dias após a administração da segunda injecção de reforço (3 injeções no total), os animais foram sangrados e os soros foram colectados. Os animais foram incentivados e sangrados a cada três semanas.

Os anticorpos policlonais específicos da IL-22 humana foram purificados por afinidade do soro de coelho imune usando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) , que foi preparada com 10 mg do antígeno específico da proteína recombinante purificada de IL-22-BHK humana por grama de CNBr-SEPHAROSE, seguida de diálise em 20X PBS toda a noite. Os anticorpos específicos da IL-22 humana foram caracterizados por ELISA usando 500ng/ml da proteína recombinante purificada IL-22-BHK humana como o alvo do anticorpo. O limite inferior de detecção (LLD) do anticorpo purificado por afinidade do coelho anti-humano IL-22 é 280 pg/ml no seu antígeno recombinante purificado específico IL-22-BHK humana.

Os anticorpos policlonais específicos de IL-22 humana foram caracterizados ainda pela sua capacidade de bloquear a actividade das células proliferativas ("teste de neutralização") das células purificadas recombinantes de IL-22-BHK humana em BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Exemplo Exemplo 2 190 e 3) . Um excesso 50X molar de anticorpos policlonais específicos de IL-22 humana foi suficiente para inibir a proliferação celular.

Exemplo 17

Anticorpos monoclonais de IL-22 anti-humana

Os anticorpos monoclonais foram preparados através da imunização de quatro ratos fêmeas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), com o polipeptídeo recombinante purificado maduro de IL-22 humana (resíduos de aminoácidos 22 (Ala) a 167 (Ile) da SEQ ID NO: 6), produzido a partir de células BHK (IL-22-BHK). Aos ratos foram dadas, a cada um, uma injecção intraperitoneal inicial (IP) de 100 yg da proteína recombinante purificada de IL-22 humana em adjuvante de Freund completo (Pierce, Rockford, IL) , seguido por injecções de reforço IP de 50 yg de proteína recombinante purificada em adjuvante de Freund incompleto a cada duas semanas. Sete a dez dias após a administração da terceira injecção de reforço, os animais foram sangrados e os soros foram colectados.

As amostras de soros de IL-22 específicos humana de ratos foram caracterizados por ELISA utilizando 500 ng/ml de IL-22-BHK biotinilatada humana e 500 ng/ml de IL-22 biotinilatada rato, alvos de anticorpos de biotina muIL-22-E.coli (R+D Systems, Minneapolis, MN). Três amostras de soro de ratos tinham título para o alvo do anticorpo específico biotinilado de IL-22-BHK humana a uma diluição de 1:1E5 para o alvo do anticorpo específico biotinilado muIL-22-Ε.coli na diluição de 1:1E4.

Esplenócitos e células linfáticas foram colhidas de dois ratos de alto título e fundidos para as células de mieloma SP2/0 (rato) com PEG 1500, em dois processos distintos de 191 fusão (4:1 razão de fusão, esplenócitos de células do mieloma "Antibodies A Laboratory Manual, E. Harlow e Lane D. , Cold Spring Harbor Press). Após um crescimento de 10 dias após a fusão, lotes de hibridomas produtores de anticorpos específicos foram identificados por ELISA utilizando a proteína recombinante biotinilatada IL-22-BHK humana e a proteína recombinante biotinilatada muIL-22- E. coli como alvos de anticorpos distintos. Os lotes de hibridomas positivos em ambos os protocolos de ELISA foram analisados também para a sua capacidade de bloquear ou reduzir a actividade das células proliferativas ("teste de neutralização") de células recombinantes purificadas muIL-22-E.coli em BaF3/CRF2-4/IL-22RA ( Exemplo 2 e Exemplo 3).

Os lotes de hibridomas rendendo resultados positivos por ELISA ou apenas por ELISA e o "teste de neutralização" foram clonados pelo menos duas vezes por diluição limitante.

Os anticorpos monoclonais purificados de meios de cultura de tecido foram caracterizados para a sua utilidade em ELISA para a determinação quantitativa de amostras de soro recombinante e nativo de IL-22 humana em ratos e humanos. Os dois anticorpos seleccionados resultaram numa análise quantitativa com um limite inferior de detecção de cerca de 1 ng/ml recombinante huIL-22-Ε.coli em 100% de soro humano. Os anticorpos monoclonais purificados de meios de cultura de tecido foram caracterizados pela sua capacidade de bloquear ou reduzir a actividade das células proliferativas ("teste de neutralização") de células recombinantes purificadas huIL-22-Ε.coli ou muIL-22-Ε.coli em BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Exemplo 2 e Exemplo 3) . Seis anticorpos monoclonais "neutralizantes" foram identificados desta maneira. Os hibridomas expressando os anticorpos monoclonais neutralizantes para IL-22 humana acima descritos foram depositados em American Type Culture Collection Tissue (ATCC; Manassas VA) como depósitos de patentes como depósitos de origem sob o Tratado de Budapeste e foi dada a seguinte ATCC N°s de Adesão: clone 266.16.1.4.4.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA- 192 5035); clone 266.5.1.2.2.3 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-5033); clone 267.17.1.1.4.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-5038); clone 267.4.1.1.4.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-5037); clone 266.12.6.1.3.2.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-5034); clone 266.19.1.10.5.2 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-5036) e clone 267.9.1.1.4.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-5353).

Exemplo 18

Anticorpos monoclonais anti-IL-22RA

Os anticorpos monoclonais foram preparados por imunização de quatro ratos Lewis (Immunochemicals, Rockland, Gilbertsville, PA), com as proteínas recombinantes de fusão clivadas e purificadas, muIL-22RA-Fc (SEQ ID NO: 4) . Aos ratos foi dada, a cada um, injecção inicial intraperitoneal (IP) de 100 yg de proteína de fusão recombinante purificada em adjuvante de Freund completo (Pierce, Rockford, IL) , seguido por injecções de reforço IP de 50 pg de proteína recombinante purificada em adjuvante de Freund incompleto cada duas semanas durante quatro semanas. Após as primeiras quatro semanas de imunização, as injecções de reforço IP de 50ug de proteína recombinante purificada clivada acoplada à proteína transportadora de hemocianina (KLH, Pierce, Rockford, IL) em Freund incompleto foram administradas a cada duas semanas durante quatro semanas. Sete a dez dias após a administração da quarta injecção de reforço, os animais foram sangrados e os soros foram colectados.

As amostras de soro específicas de ratos muIL-22RA foram caracterizadas por ELISA utilizando 500 ng/ml da proteína de fusão recombinante purificada muIL-22RA-Fc como o alvo do anticorpo específico e uma proteína de fusão não relacionada como um alvo do anticorpo não-específico. 193

Esplenócitos foram colhidos a partir de um rato de alta titulação e fundidos para as células de mieloma SP2/0 (rato) por um protocolo de fusão aperfeiçoado mediado por PEG (Rockland Immunochemicals). Após 12 dias de crescimento após a fusão, lotes hibridomas produtores de anticorpos específicos foram identificados por ELISA utilizando 500 ng/ml da proteína de fusão recombinante purificada muIL-22RA-Fc-Bv como o alvo do anticorpo específico e uma proteína da fusão não relacionada como alvo do anticorpo não específico. Lotes de hibridomas positivos para o alvo do anticorpo específico só foram analisados também pela sua capacidade de bloquear ou reduzir a actividade das células proliferativas ("teste de neutralização") de células recombinante purificada muIL-22-Ε.coli em BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Exemplo 2 e Exemplo 3) e uma capacidade de se ligar por via da análise FACS a células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Exemplo 2 e Exemplo 3) como o alvo do anticorpo.

Os lotes de hibridomas rendendo resultados positivos por ELISA ou apenas por FACS e o "teste de neutralização" foram clonados pelo menos duas vezes por diluição limitante.

Os anticorpos monoclonais em meios de cultura de tecido foram caracterizadas pela sua capacidade de bloquear ou reduzir a proliferação de células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Exemplo 2 e Exemplo 3), cultivadas na presença das proteínas recombinantes purificadas muIL-22-Ε. coli ou huIL-22-ΒΗΚ. Foram identificados catorze anticorpos monoclonais "neutralizantes" e foram clonados nove anticorpos monoclonais.

Os hibridomas expressando os anticorpos monoclonais neutralizantes para IL-22 do rato acima descritos foram depositados em American Type Culture Collection Tissue (ATCC; Manassas VA) como depósitos de patentes como depósitos de origem sob o Tratado de Budapeste e foi dada a seguinte ATCC N°s de Adesão: clone R2.1.1 Gll.l (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6035); clone 194 R2.1.5F4.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6024); clone R2.1.5H8.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6025); clone R2.1.12G7.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6036); clone R2.1.13C8.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6037); clone R2.1.15E2.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PAT-6038); clone R2.1.16C11.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6039); clone R2.1.18C8.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6040); e clone R2.1.21G8.2 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6111).

Exemplo 19

Afinidade de ligação de dois rato-anti-Ms-IL-22RA MAb

Anticorpos específicos cabra anti-rato IgG-Fc gama (Jackson) foram imobilizados num chip Biacore CM5. O teste foi optimizado para ligar cada mAb sobre a superfície de captura anti-rato e, em seguida, foi injectada uma série de concentrações de IL-22RA em todo o mAb para ver a associação (Ka) e a dissociação (Kd) . Após os testes preliminares, foi observada a ligação não específica entre a proteína de fusão com a superfície de captura no chip. Um frasco de IL-22RA que tinha a marca FC4 clivada pela trombina foi adquirido e posteriormente testado para não mostram efeitos de fundo. Após cada volta, a superfície foi regenerada de volta para o anticorpo anti-rato com 2 injecções de 20mM de HC1. Os dados foram gerados para cada MAb e foi utilizado software de avaliação (BlAevaluation versão do software 3.2, Biacore Pharmacia, Uppsala, Suécia) para avaliar a cinética de ligação de anticorpos anti-IL-22RA com a proteína IL-22RA, conforme demonstrado na Tabela 12 abaixo : 195

Tabela 12

Clone R2.1.5F4.1** Clone R2.1.15E2.1** ka (M-ls-1) 1.49E+06 ka (M-ls-1) 1.76E+06 kd (s-1) 1.70E-04 kd (s-1) 2.55E-04 KA (M-l) 8.76E+09 KA (M-l) 6.66E+09 KD (M) 1.14E+10 KD (M) 1.504E-10 Chi2 2.08 Chi2 1.5 ** Equilíbrio de associação (Ka) e de dissociação (Kd) constantes de velocidade para cada anti IL-22RA MAB são apresentados e os valores são os limites da máquina. Chi2 refere-se à soma dos quadrados dos resíduos entre as curvas de ligação e da avaliação das curvas de ajuste. Quanto mais próximo de 0, mais a confiança nos dados.

Como mostra a Tabela 12, ambas as anti-IL-22RA MAb ligam fortemente à proteína IL-22RA, como comprova a ligação da concentração de pico-molar para a IL-22RA (trombina clivada pela rótulo Fc4) . Estes dados são mostrados com boa confiança baseada nos valores baixos de Chi2 e mostra mAb Clone R2.1.5F4.1 tendo uma afinidade um pouco mais forte para o receptor IL-22RA.

Exemplo 20

Análise imuno-histoquímica da expressão da proteína IL-22 in vivo em amostras de tecido A. Sumário A análise imuno-histoquímica (IHQ) da expressão da proteína IL-22 e localização foi realizada com anticorpo monoclonal IL-22 anti-humana (anti-hIL-22) (Mab 266.19.1.10.5.2) nas seguintes amostras de tecido: multi-normal humana e tumoral; amostras de pancreatite humana, doença pulmonar e renal; amostras de pele humana psoriática; INS IL-22 TG (expressando o promotor de insulina do rato) e pâncreas do rato WT; muIL-22-EuLCK TG e amostra da pele do rato WT; e amostra do cólon do rato DSS (WT e IL-22 KO) . Além disso, 196 foi comparado o padrão de coloração do anticorpo monoclonal anti-hIL-22 MAB 266.19.1.10.5.2 (Exemplo 17) vs. o anticorpo policlonal (coelho anti-hIL-22) (Exemplo 16).

Os anticorpos monoclonais rato anti-humano IL-22 MAb 266.16.1.4.4.1 e MAb 266.19.1.10.5.2 (Exemplo 17) foram testados e mostraram manchar a maioria do BHK/IL-22 humana (> 50%), mas também algumas células BHK/rato IL-22 (1-5%), e foram utilizados para investigar a distribuição de tecidos e de expressão de IL-22 em ambas as amostras de pacientes humanos e modelo animal e usado para comparar o padrão de coloração com o anticorpo policlonal de coelho para confirmar os resultados. B. Materiais e Métodos

As células e tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina de origem humana e de modelos animais de rato foram seccionadas a 5 pm. As células incluindo as células BHK expressando o tipo humano ou rato IL-22 e selvagem como controlo positivo e negativo, respectivamente. Os tecidos humanos incluindo uma lâmina controle Multi-tecido (NormalGrid™; Biomeda, Foster City, CA), com 50 secções de vários tecidos humanos normais (por exemplo, cérebro, glândula hipófise, glândula adrenal, mama, rim, coração, estômago, intestino delgado, intestino grosso, fígado fetal, fígado, pele, pâncreas, pulmão, amígdala, ovário, testículo, próstata, útero, placenta, tireoide e baço), uma lâmina de controlo Multi-tecido (TumorGrid™; Biomeda, Foster City, CA) com 50 secções de diferentes tumores humanos (por exemplo, adenocarcinoma do pulmão, adeno carcinoma do fígado, adenocarcinoma do rim, adenocarcinoma do cólon, adenocarcinoma da mama, adenocarcinoma da tireoide, adenocarcinoma do estômago, adenocarcinoma da próstata, adenocarcinoma do pâncreas, adenocarcinoma do ovário, linfoma, melanoma, sarcoma de Ewings, sarcoma epitelióide, sarcoma HFM, sarcoma de rabdomiólise, carcinóide, adenocarcinoma não definido, mesotelioma, 197 teretoma e seminoma), carcinoma do pulmão de CHTN (Cooperação Human Tissue Network, Cleveland, Ohio), pâncreas normal, pâncreas com pancreatite crónica, pulmão, com inflamação perivascular crónica, rins com glomeruloesclerose multifocal, glomerulonefrite mesangioproliferative, ou fibrose intersticial glomérulo esclerose de NDRI (National Disease Research Interchange, Philadelphia, PA); e amostras de pele psoriática humana. Os tecidos do rato incluem cólons do modelo animal de doença intestinal inflamatória (modelo DSS divulgado aqui, ratos fêmeas Swiss Webster) e do modelo animal de colite IL-20 WT e KO (ratos DSS, tipo selvagem e ratos fêmeas IL-20 (IL-20)) tratados com veiculo ou 4% DSS em água potável durante 7 dias; e amostras de pele de modelos animais transgénicos (TG) incluindo mIL-22-EuLCK TG e mIL-22-INS de controlo e animais TG. Uma secção por bloco/lâmina foi corada com hematoxilina e eosina (H&E) para exame histológico e da secção posterior por marcação imunoistoquimica para expressão da proteína IL-22 e localização.

Por imunohistoquímica, as secções de células e tecidos foram colocadas em lâminas de microscópio ChemMate™ Capillary Gap Plus (Biotek, Winooski, Vermont), secas em estufa a 60°C por 60 minutos e desparafinados usando condições normais de 3 x 5 minutos em xilol, 4 minutos em 100% EtOH, 3 minutos em 100% EtOH e 2 minutos em 95% EtOH. As secções de tecido foram submetidas a um processo de recuperação de enzima induzida por epítopo 20 minutos a 37°C com pepsina (NeoMarkers Fremont CA), seguida por uma etapa de bloqueio de avidina/biotina feita de acordo com as instruções do fabricante (Zymed, South San Francisco, CA) . TechMate 500 ™ Automated Immunostainer and Immunoperoxidase (IP) protocolo de imuno-histoquímica com sistema de detecção do complexo de avidina-biotina (Biotek Ventana Systems, Tucson, AZ) foram utilizados para a coloração. O TechMate 500™ Automated Immunostainer emprega o princípio da capilaridade e do protocolo IP utilizado um tipo de imunocoloração referido como uma técnica de "sanduíche". As secções foram pré-bloquedas com 5% de soro de cabra normal (Vector, Burlingame CA) em PBS por 10 minutos seguido de IX de tampão 1 de lavagem (Signet, Dedham MA) e 198 então incubadas com um anticorpo primário contra a IL-22 (MAB 266.19.1.10.5.2) (Exemplo 17), PAS purificado a 2.04mg/ml) diluído a 1:800 por 30 minutos à temperatura ambiente, seguido por 5X de tampão 1 de lavagem. O anticorpo primário foi diluído no tampão de diluição de anticorpos TechMate 500™ (Ventana). Biotinilado de cabra anti-rato IgG (Vector) diluído a 1:200 mais 5% de soro de cabra normal e 2,5% de leite desnatado seco em PBS foi utilizado como anticorpos de ligação secundários, por 25 minutos à temperatura ambiente, seguido por IX de tampão 1 de lavagem e IX tampão 2 e 3 de lavagem (Signet) . As secções dos tecidos foram então submetidas a 3x7 minutos a 3% de peróxido de hidrogénio (HP) de bloqueio (Ventana), seguido por 3X de tampão 2 e 3 de lavagem. A marcação por imunoperoxidase foi realizada com um kit de peróxidos DAB (Ventana) , incubada com o complexo de avidina-biotina (ABC) por 30 minutos, seguidos de 5X de tampão 2 e 3 de lavagem e diaminobenzidina (DAB) por 4X4 minutos, seguido por 2X de tampão e 3 de lavagem e IX de lavagem com água (Signet, Cat. No.2340). Os tecidos foram então contra corados com verde de metila (Dako, Cat.No. S1962) por 10 minutos, seguido por 2X de tampão 2 e 3 3X de lavagem e lavagem com água. O controlo incluiu soros não-imunes primários de ratos usando controlo isotípico de anticorpo primário (Zymed) para substituir o anticorpo primário. A imunocoloração foi observada usando um microscópio Olympus BH-2 e as imagens foram capturadas por uma câmera digital CoolSNAP HQ (Roper Scientific, Tucson, AZ). C. Resultado

Linhas celulares de controlo positivas e negativas: MAB 266.19.1.10.5.2, e anticorpo monoclonal anti-hIL-22 demonstraram marcação positiva em ambas IL-22 humana expressando células BHK (+++) e IL-22 murina expressando células BHK ( + ) , e nenhuma mancha nas células do tipo selvagem BHK (-). Todas as linhagens de células positivas 199 e negativas BHK manchadas com isotipo de controlo negativo de rato para substituir o anticorpo primário não mostrou nenhuma mancha (-) indicando que o anticorpo é especifico para o ligante de IL-22. 0 anticorpo tinha imunorreatividade cruzada para IL-22 humana do rato.

Tecidos Humanos: lapa multi-normal humana e tumoral; amostras de doença do pâncreas, pulmão e renal; e amostras de pele humana psoriática foram examinadas. Estes tecidos humanos incluíam 1) . Cérebro, glândula hipófise, glândula adrenal, mama, rim, coração, estômago, fígado, intestino delgao, intestino grosso, fígado fetal, fígado, pele, pâncreas, pulmão, amígdala, ovário, útero, testículos, placenta, tireoide e baço nas lâminas de controlo multi-tecido (NormalGrid™)/tecidos humanos normais, 2). adenocarcinoma do pulmão, adenocarcinoma do fígado, adenocarcinoma do rim, adenocarcinoma da tireoide, adenocarcinoma do estômago, adenocarcinoma da próstata, adenocarcinoma do pâncreas, adenocarcinoma do ovário, linfoma, melanoma, sarcoma de Ewings, sarcoma epitelióide, sarcoma HFM, sarcoma de rabdomiólise, carcinóide, adenocarcinoma não definido, mesotelioma, teratoma e seminoma, nas lâminas de controlo multi-tecido (TumorGrid™)/tecidos humanos anormais/tumor, 3). Pâncreas normal, pâncreas com pancreatite crónica, pulmão com inflamação crónica perivascular, adenocarcinoma do pulmão, rim com glomeruloesclerose multifocal, rim com glomerulonefrite mesangioproliferativa, rim com fibrose intersticial de glomérulos escleróticos de CHTN e/ou NDRI; 4) .

Tecidos do rato: Foram examinados pâncreas de ratos INS IL-22 TG e WT. Células espalhadas pelas ilhotas do pâncreas INS IL-22 TG mostroaram forte coloração positiva (+++)com Mab MAB 266.19.1.10.5.2 e o pâncreas WT não apresentou nenhuma mancha (-). 200

Comparação dos anticorpos monoclonais e policlonais. O anticorpo policlonal anti-IL-22 (Exemplo 16) mostrou ser sensível, ao passo que o anticorpo monoclonal MAB 266.19.1.10.5.2 era específico. O anticorpo policlonal apresentou coloração positiva em IL-22 humana expressando células BHK (+++), na IL-22 murina expressando células BHK ( + ), em várias amostras de tecidos humanos e de rato (+) , e nas ilhotas de INS mIL-22 de ratos TG (+++) . A maior percentagem das ilhotas dos transgénicos (vs. tipo selvagem) continha coloração positiva. A coloração nas ilhotas transgénicas era geralmente distribuída por todo a ilhota (+++), enquanto a coloração nas ilhotas do tipo selvagem era geralmente limitada à periferia das ilhotas ( + ) . No entanto, esse anticorpo mostrou também não ter coloração específica sobre as células de controlo negativo WT BHK (+). MAB 266.19.1.10.5.2 apresentou coloração positiva em IL-22 humana expressando células BHK (+++), IL-22 murina expressando células BHK (+), e nas ilhotas de INC MIL-TG-22 de ratos (+++)- A coloração nas ilhotas transgénicas era geralmente distribuída por toda a ilhota (+++) enquanto as ilhotas de tipo selvagem demonstraram uma mancha negativa (-).

Exemplo 21 IL-20 é sobre regulada nas amostras de pele humana psoriática A. Amostras de ARN:

Foram obtidas amostras de pele normal, assim como a pele de pacientes com psoríase. Estas últimas incluíram pele da psoríase e da pele involvente adjacente. O ARN foi isolado de amostras de pele humana, utilizando métodos convencionais. A integridade e a qualidade das amostras de ARN foi testadapor um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn Alemanha). 201

Subtratos e sondas para RT-PCR quantitativo RT-PCR quantitativo em tempo real usando o sistema de detecção de sequência ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) tem sido descrito previamente (ver Heid, CA et al. Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, UEM et al. Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al. Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este método incorpora o uso de uma sonda especifica do gene contendo o corante repórter e corantes calmantes fluorescentes. Quando a sonda está intacta a emissão de corantes repórter é negada devido à proximidade do corante calmante. Durante a extensão PCR usando genes específicos adicionais para a frente e substratos reversos, a sonda é clivada pela atividade nucleolitica 5' a 3' da polimerase ADN rTth que liberta o corante repórter da sonda, resultando num aumento na emissão de fluorescência.

Os substratos e sondas utilizadas para análises em tempo real de RT-PCR quantitativo da expressão de IL-20 foram projectados usando o software de concepção de substrato Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . O substrato para a frente, ZC40541 (SEQ ID NO: 25) e o substrato reverso, ZC 40542 (SEQ ID NO: 26) foram usados na reacção de PCR (abaixo) numa concentração de 800 nM para sintetizar um produto 71 pb. A sonda TaqMan® correspondente de IL-20, ZC 40544 (SEQ ID NO: 27) foi sintetizada e rotulada pelo PE Applied Biosystems. A sonda IL-20 foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente repórter (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante fluorescente calmante (6-tetrametil-carboxi-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). 202 C, RT-PCR. quantitative em tempo real

Os níveis relativos de IL-20 ARNm foram determinados através da análise de amostras de ARN total usando o kit de reagentes TaqMan EZ RT-PCR Core (PE Applied Biosystems). A transcrição rápida da IL-20 foi feita para gerar uma curva padrão para quantificação. A curva consistiu em 10 diluições em série variando de cerca de le8 para le3 cópias da mensagem total para IL-20 com cada ponto da curva padrão analisado em triplicado. As amostras de ARN total da pele também foram analisadas em triplicado para os níveis de IL-20 humana transcrita e para os níveis de hGUS como um controlo endógeno. Num volume total de 25 μΐ, cada amostra de ARN foi submetida à reacção TaqMan EZ RT-PCR (PE Applied Biosystems), contendo: cerca de 25 ng de ARN total de água tratada DEPC (Dnase/Rnase livre); substratos apropriados (cerca de 800 nM de ZC40541 (SEQ ID NO: 25) e ZC40542 (SEQ ID NO: 26); sonda adequada (aproximadamente 100 nM de ZC40544 (SEQ ID NO: 27); IX de tampão TaqMan EZ IX; 3 mM de acetato de manganésio; 300 μΜ de cada d-CTP, d-ATP e GTP-d e 600 mM de d-UTP; polimerase ADN r Tth (0,1 U/μΙ) e AmpErase UNG (0,01 U/μΙ). As condições de termociclagem de PCR foram as seguintes: uma etapa de tratamento UNG inicial de um ciclo a 50°C por 2 minutos; seguido de uma etapa de transcrição reversa (RT) de um ciclo a 60°C por 30 minutos; seguido por uma etapa de desativação da UNG de um ciclo a 95°C por 5 minutos; seguido por 40 ciclos de amplificação a 94°C por 20 segundos e 60°C por 1 minuto.

Os níveis relativos de IL-20 ARN foram determinados usando o método da curva padrão como descrito pelo fabricante, PE Biosystems (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11 de Dezembro de 1997) . As medições hGUS foram usadas para normalizar os níveis de IL-20. Os dados são apresentados na Tabela 13 abaixo. 203

Tabela 13

Amostra de pele IL-20 Normal 2903 Não envolvida 7233 Envolvida 27,695

Embora a IL-20 mARN fosse detectável em amostras de pele de pacientes normais ou de áreas não envolvidas, houve sobre regulação para a mensagem de IL-20 na pele de pacientes acometidos com psoriase. As subunidades do receptor de IL-20, incluindo IL-20RA, IL-22RA (IL-22RA), e IL-20RB foram expressas em pele humana normal e patológica. Estes dados confirmam uma associação forte entre a IL-20 e a psoriase humana. A sobre expressão de IL-20 foi mostrada em lesões de psoriase humana, sugerindo que a IL-20 está envolvida na psoriase humana. Além disso, como descrito aqui, a sobre-expressão de IL-20 em ratos transgénicos mostrou espessamento da epiderme e envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo psoriático. Tais dados in vivo sugerem ainda que a IL-20 está envolvida na psoriase. Como tal, os antagonistas da actividade da IL-20, como os anticorpos monoclonais anti-humano-IL-22RA da presente invenção, bem como receptores solúveis e os respectivos anticorpos e os anticorpos monoclonais e neutralizantes anti-IL-20, são úteis terapeuticamente como antagonistas de IL-20 no tratamento de doenças inflamatórias, tais como a psoriase, bem como outras indicações como divulgado aqui. 204

Exemplo 22 IL-20 é sobre regulada em amostras de pele com dermatite atópica humana C. Amostras de ARN:

Foram obtidas amostras de pele normal, assim como a pele de pacientes com dermatite atópica. 0 ARN foi isolado das amostras de pele humana, utilizando métodos convencionais. A integridade e a qualidade das amostras de ARN foram testadas por um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn Alemanha). C. Subtratos e sondas para RT-PCR quantitativo RT-PCR quantitativo em tempo real usando o sistema de detecção de sequência ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) tem sido descrito previamente (ver Heid, CA et al. Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, UEM et al. Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al. Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este método incorpora o uso de uma sonda especifica do gene contendo o corante repórter e corantes calmantes fluorescentes. Quando a sonda está intacta a emissão de corantes repórter é negada devido à proximidade do corante calmante. Durante a extensão PCR usando genes específicos adicionais para a frente e substratos reversos, a sonda é clivada pela atividade nucleolítica 5' a 3' da polimerase ADN r Tth que liberta o corante repórter da sonda, resultando num aumento na emissão de fluorescência.

Os substratos e sondas utilizadas para análises em tempo real de RT-PCR quantitativo da expressão de IL-20 foram projectados usando o software de concepção de substrato 205

Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . 0 substrato para a frente, ZC40541 (SEQ ID NO: 25) e o substrato reverso, ZC 40542 (SEQ ID NO: 26) foram usados na reacção de PCR (abaixo) numa concentração de 800 nM para sintetizar um produto 71 pb. A sonda TaqMan® correspondente de IL-20, ZC 40544 (SEQ ID NO: 27) foi sintetizada e rotulada pelo PE Applied Biosystems. A sonda IL-20 foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente repórter (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante fluorescente calmante (6-tetrametil-carboxi-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). C. RT-PCR quantitative em tempo real

Os níveis relativos de IL-20 ARNm foram determinados através da análise de amostras de ARN total usando o kit de reagentes TaqMan EZ RT-PCR Core (PE Applied Biosystems). A transcrição rápida da IL-20 foi feita para gerar uma curva padrão para quantificação. A curva consistiu em 10 diluições em série variando de cerca de le8 para le3 cópias da mensagem total para IL-20 com cada ponto da curva padrão analisado em triplicado. As amostras de ARN total da pele também foram analisadas em triplicado para os níveis de IL-20 humana transcrita e para os níveis de hGUS como um controlo endógeno. Num volume total de 25 μΐ, cada amostra de ARN foi submetida à reacção TaqMan EZ RT-PCR (PE Applied Biosystems), contendo: cerca de 25 ng de ARN total de água tratada DEPC (Dnase/Rnase livre) ; substratos apropriados (cerca de 800 nM de ZC40541 (SEQ ID NO: 25) e ZC40542 (SEQ ID NO: 26); sonda adequada (aproximadamente 100 nM de ZC40544 (SEQ ID NO: 27); IX de tampão TaqMan EZ IX; 3 mM de acetato de manganésio; 300 μΜ de cada d-CTP, d-ATP e GTP-d e 600 mM de d-UTP; polimerase ADN r Tth (0,1 U/μΙ) e AmpErase UNG (0,01 U/μΙ). As condições de termociclagem de PCR foram as seguintes: uma etapa de tratamento UNG inicial de um ciclo a 50°C por 2 minutos; seguido de uma etapa de transcrição reversa (RT) de um ciclo a 60°C por 30 minutos; seguido por uma etapa de desativação da UNG de um ciclo a 206 95°C por 5 minutos; seguido por 40 ciclos de amplificação a 94°C por 20 segundos e 60°C por 1 minuto.

Os níveis relativos de IL-20 ARN foram determinados usando o método da curva padrão como descrito pelo fabricante, PE Biosystems (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11 de Dezembro de 1997). As medições hGUS foram usadas para normalizar os níveis de IL-20.

Embora a IL-20 mARN fosse detectável em amostras de pele de pacientes normais ou de áreas não envolvidas, houve sobre regulação para a mensagem de IL-20 na pele de pacientes acometidos com dermatite atópica. As subunidades do receptor de IL-20, incluindo IL-20RA, IL-22RA (IL-22RA), e IL-20RB foram expressas em pele humana normal e patológica. Estes dados confirmam uma associação forte entre a IL-20 e a dermatite atópica humana. A sobre expressão de IL-20 foi mostrada em lesões de dermatite atópica humana, sugerindo que a IL-20 está envolvida na dermatite atópica humana. Além disso, como descrito aqui, a sobre-expressão de IL-20 em ratos transgénicos mostrou espessamento da epiderme e envolvimento de células imunológicas indicativas de um fenótipo de dermatite atópica. Tais dados in vivo sugerem ainda que a IL-20 está envolvida na dermatite atópica. Como tal, os antagonistas da actividade da IL-20, como os anticorpos monoclonais anti-humano-IL-22RA da presente invenção, bem como receptores solúveis e os respectivos anticorpos e os anticorpos monoclonais e neutralizantes anti-IL-20, são úteis terapeuticamente como antagonistas de IL-20 no tratamento de doenças inflamatórias, tais como a dermatite atópica, bem como outras indicações como divulgado aqui. 207

Exemplo 23

Sobre regulação de IL-8 por IL-20

Queratinócitos humanos normais da epiderme neonatal (NHEK) (de CLONETICS) na passagem 2 foram semeados e cultivados para confluência em placas de cultura de tecido de 12 poços. KGM (meios de cultura de queratinócitos) foi adquirido da CLONETICS. Quando as células atingiram confluência, foram lavadas com meio KGM menos factores de crescimento = KBM (media queratinócito basal). Células de soro foram privadas de alimento em KBM por 72 horas antes da adição dos compostos de teste. Trombina em 1 IU/mL e tripsina em 25nM foram utilizadas como controlos positivos. Um mL de meio KBM/poço foi adicionado. KBM só foi utilizado como controlo negativo. A IL-20 foi feita em meio KBM e acrescentada em concentrações variáveis, de 2.5pg/ml para baixo até 618ng/mL, numa primeira experiência e de 2.5pg/mL até 3 ng/ml numa segunda experiência.

As células foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 48 horas. Os sobrenadantes foram removidos e congelados a -80 °C durante vários dias antes do ensaio para IL-8 e os níveis de GM-CSF. Foram utilizados Kits de imunoensaio para IL-8 humana # D8050 (RandD Systems, Inc.) e kit de imunoensaio para GM-CSF humano # HSGMO (RandD Systems, Inc.) para determinar a produção de citocinas seguindo as instruções do fabricante.

Os resultados indicaram que a expressão de IL-8 e GM-CSF foram induzidas por IL-20. 208

Exemplo 24

Sobre regulação de citocinas inflamatórias por IL-20 A linha celular queratinócita humana, HaCaT foi cultivada a 37°C durante vários dias após a confluência em frascos de cultura de tecidos T-75. Neste ponto, o meio de crescimento normal (DMEM + 10% FBS) foi removido e substituído por soro de meio livre. As células foram então incubadas por dois dias a 37 C. DMEM foi então retirado e quatro frascos por tratamento de células foram tratados com uma de cada uma das seguintes condições, durante quatro horas a 37°C: alfa recombinante humana (rh) IL-1 a 5 ng/mL, alfa rh IL-1 a 20 ng/mL, alfa rh IL-1 a 5 ng/mL + IL-20 a lpg/mL, IL-20 a lpg/mL, ou rh IL-10 a 10 ng/mL.

Após o tratamento de citocinas, o meio foi removido e as células foram lisadas com uma solução de tiocianato guanídico. O ARN total foi isolado do lisado celular por por agitação durante a noite num gradiente de cloreto de césio. No dia seguinte, a partícula de ARN foi ressuspensa numa solução TE/SDS e precipitada em etanol. O ARN foi então quantificado usando um espectrofotómetro, seguido por um tratamento DNase por Secção V.B do Atlas ” Clontech cADN Expression Arrays User Manual (versão PT3140-1/PR9X390, publicada em 11/5/99). A qualidade das amostras de ARN foi verificada através de cálculos baseados em leituras de pureza spec, e pela visualização em gel de agarose. A contaminação genómica das amostras de ARN foi descartada por análise de PCR do gene da beta-actina.

Os protocolos Clontech para o polia+enriquecimento, a síntese de sondas e hibridização de matrizes Atlas” foram seguidos (ver acima, além de Atlas” Pure total ARN labeling system user manual, PT3231-1/PR96157, publicado em 6/22/99). Resumidamente, poliA + ARN foi isolado a partir de 50 mg de ARN total usando esferas magnéticas revestidas por estreptavidina (por Clontech, Paolo Alto, CA) e um 209 separador de partículas magnéticas. Polia + ARN foi então marcado com aipha32p_DA Tp v-j_a rt-pcr. Substratos específicos Clontech CDS para os 268 genes de citocinas humanas Atlas”/matriz receptora (Cat. # 7744-1) foram utilizadas na reacção. A sonda marcada foi isolada por cromatografia de coluna e contada por cintilação em liquido.

As matrizes Atlas” foram pré-hibridizadas com Clontech ExpressHyb e 100 mg/mL de ADN do esperma de salmão desnaturado aquecido, pelo menos, trinta minutos a 68°C com agitação continua. As membranas foram hibridizadas com 1,9 x 101 2 CPM/mL (um total de 1,14 x 107 CPM) durante a noite a 68°C com agitação continua. No dia seguinte, as membranas foram lavadas por trinta minutos x 4 em 2X SSC, 1%SDS a 68°C, mais trinta minutos x 1 em 0.1X SSC, 0,5% SDS a 68°C, seguido de uma lavagem final à temperatura ambiente por cinco minutos em 2X SSC. As membranas matrizes foram então colocadas em bolsas plásticas seladas Kodak e expostas a uma tela de sensor de fósforo durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, as telas de fósforo foram digitalizadas num sensor de fósforo e analisadsas por meio de Clontech Atlaslmage” 1.0.

Genes sobre regulados por IL-20: 1. Factor de necrose tumoral (TNF) foi sobre regulado até 1,9-2,4 vezes por IL-20. 2. Factores de crescimento placentário 1 & 2 (P1GF) foram sobre regulados até 1,9-2,0 vezes por IL-20. 3. Receptor de factor de coagulação II foi sobre regulado até 2,0-2,5 vezes por IL-20. 4. Receptor de calcitonina foi sobre regulada até 2,2-2,3 vezes por IL-20. 210 1

Proteína de ligação de hialuronato induzida por TNF GST- 2 6 foi sobre reguylada até 2,1-2,2 vezes por IL-20. 6. Factor de crescimento vascular endotelial (VEGF), precursor do receptor-1, proteína tirosina-quinase do receptor (FLT-1) (SFLT) foi sobre regulada até 2,1-2,7 vezes por IL-20. 7. MRP-8 (proteína de ligação de cálcio em macrófagos relacionados com MIF) foi sobre regulada até 2,9-4,1 vezes por IL-20. 8. MRP-14 (proteína de ligação de cálcio em macrófagos relacionados com MIF)foi sobre regulada até 3,0-3,8 vezes por IL-20. 9. Relaxina H2 foi sobre regulada até 3,14 vezes por IL-20. 10. Factor beta de transformação do crescimento (TGFp) receptor III kDa 300 foi sobre regulado até 2,4-3,6 vezes por IL-20.

Genes mostrando sinergia com o tratamento de IL-20 + IL-1: 1. Proteína morfogenética óssea 2a foi sobre regulada até 1,8 vezes com o tratamento de IL-20 isoladamente, 2,5 vezes com o tratamento com IL-1 isoladamente, e 8,2 vezes com tratamento em conjunto de IL-20 e IL-1. 2. MRP-8 foi sobre regulado até 2,9 vezes com o tratamento de IL-20 isoladamente, 10,7 vezes com tratamento de IL-1 isoladamente e 18,0 vezes com o tratamento em conjunto de IL-20 e IL-1. 3. Proteína de diferenciação eritróide (FED) foi sobre regulada até 1,9 vezes com o tratamento de IL-20 isoladamente, 9,7 vezes com tratamento de IL-1 sisoladamente e 19,0 vezes com o tratamento em conjunto de IL-20 e IL-1. 4. MRP-14 (proteína de ligação de cálcio em macrófagos relacionados com MIF) foi sobre regulada até 3,0 vezes com o tratamento de IL-20 isoladamente, 12,2 vezes com 211 tratamento de IL-1 isoladamente e 20,3 vezes com o tratamento em conjunto de IL-20 e IL-1. 5. Factor de crescimento de ligação com heparina do tipo EGF foi sobre regulado até 2,0 vezes com o tratamento de IL-20 isoladamente, 14 vezes com tratamento de IL-1 isoladamente e 25,0 vezes com o tratamento em conjunto de IL-20 e IL-1. 6. Proteina do tipo beta-tromboglobulina foi sobre regulada até 1,5 vezes com o tratamento de IL-20 isoladamente, 15 vezes com o tratamento de IL-1 isoladamente e 27 vezes com o tratamento em conjunto de IL-20 e IL-1. 7. Factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), foi sobre regulado até 1,7 vezes com o tratamento de IL-20 isoladamente, 25 vezes com tratamento de IL-1 isoladamente e 48 vezes com o tratamento em conjunto de IL-20 e IL-1. 8. Quimiotáctica de monócitos e factor activador de MCAF foi sobre regulada até 1,3 vezes com o tratamento de IL-20 isoladamente, 32 vezes com o tratamento de IL-1 isoladamente e 56 vezes com o tratamento em conjunto de IL-20 e IL-1.

Exemplo 25

Fenótipo transgénico de IL-20 IL-20 humana e de rato foi sobre expressa em ratos transgênicos com uma variedade de promotores. O promotor de albumina hepática específica do rato, expressão dirigida a IL-20 humana, foi utilizado inicialmente numa tentativa de atingir os níveis circulantes de proteína. Estudos subsequentes foram realizados utilizando o promotor de queratina 14 (K14), que visa primordialmente a expressão da epiderme e outros epitélios escamosos estratificados; um promotor de metalotioneína-1 do rato que dá um amplo padrão de expressão; e o promotor EpLCK, que dirige a expressão em células da linhagem linfóide. Resultados similares foram obtidos em todos os quatro casos, possivelmente porque 212 esses promotores dão origem a todos os níveis circulantes de IL-20.

Em todos os casos, os filhotes transgénicos expressando o transgene IL-20 eram menores do que os filhotes não-transgénicos, tinham uma aparência brilhante com a pele enrugada e apertada, e morreram poucos dias após o nascimento. Os filhotes tinham leite nos seus estômagos, indicando que eles eram capazes de mamar. Estes ratos tinham as extremidades, a cauda, as narinas e regiões da boca inchadas e tinha dificuldades de movimentação. Além disso, os ratos eram frágeis, com falta de tecido adiposo visível e atraso no desenvolvimento da orelha e dedo do pé. Baixos níveis de expressão no fígado (menos de 100 moléculas de mARN/célula) foram suficientes para a letalidade neonatal e anomalias da pele. Os ratos transgénicos sem um fenótipo visível ou não expressavam o transgene, não o expressavam em níveis detectáveis, ou expressavam em mosaico. A análise histológica da pele de ratos transgénicos IL-20 mostrou uma epiderme espessada, hiperqueratose e um estrato córneo compacto em comparação com filhotes não-transgénicos. Foram observadas ocasionalmente crostas serocelulares (escaras) . A análise por microscopia electrónica (EM) da pele de ratos transgénicos mostrou inclusões lipóides intramitocondriais, grânulos queratolínicos manchados, e relativamente poucos tonofilamentos semelhantes ao observado na pele psoriática humaa e em modelos do rato da doença de pele. Além disso, muitos dos ratos transgénicos tinha apoptose de linfócitos do timo. Nenhuma outra anomalia foi detectada pela análise histopatológica. Estes resultados histológicos e EM apoiam e ampliam o observado nas alterações na pele bruta. 213

Exemplo 26

Construção do vector de expressão para a expressão de IL-22RA-MUFC humana solúvel

Um receptor-muFc solúvel de fusão de IL-22RA humana (denotada como IL-22RA-C(mG2a), contendo o domínio extracelular de IL-22RA fundido à região Fc da cadeia pesada 2a gama murina (mG2a), foi preparada. Um plasmídeo de expressão contendo IL-22RA-C (mG2a) foi construído através da recombinação homóloga com dois fragmentos separados de ADN e o vector de expressão pZMP40. Fragmentos da sequência de polinucleotídeo IL-22RA (SEQ NO: 1), e mG2a SEQ ID NO: 39 foram gerados por amplificação PCR utilizando os substratos seguintes: (a) substratos IL-22RA ZC45,593 (SEQ ID NO: 28), e ZC45,592 (SEQ ID NO: 29) e (b) substratos mG2a ZC45,591 (SEQ ID NO: 30), e ZC45, 594 (SEQ ID NO: 31). O primeiro fragmento contido na região codificadora do domínio extracelular IL-22RA, foi feito usando um polinucleotídeo de IL-22RA (por exemplo, SEQ ID NO: 1) como modelo. O primeiro fragmento incluui a sobreposição 5' com uma sequência de vectores parciais pZMP40, o segmento de IL-22RA, e uma sobreposição 3' contendo uma sequência de ligação e uma sequência parcial mG2a. Condições de PCR: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto; seguido de 55°C, 2 minutos, seguido de 72°C, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos. O segundo fragmento incluiu uma sobreposição 5' com uma sequência de ligações e sequência parcial de IL-22RA, o segmento mG2a, e uma sobreposição 3' contendo uma sequência de vectores parcial pZMP40. A região Fc da cadeia pesada 2a gama murine (mG2a) (SEQ ID NO: 39) foi gerada a partir de um clone de murina Ig 2a gama cADN de cadeia pesada. O mG2a contém a dobradiça, os domínios CH2, e CH3 da gama 2a da imunoglobulina murina da região constante de cadeia 214 pesada. Condições de PCR: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido de 55°C, 2 minutos, seguido de 72°C, 3 minnutes; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos.

As misturas de reacção de PCR foram executadas num gel de agarose 1% e uma banda correspondente ao tamanho das inserções foi extraída do gel, usando um QIAguick™ Gel Extraction Kit (Qiagen). O plasmídeo pZMP40, que foi cortado com BglII, foi utilizado numa recombinação de três vias com ambos os fragmentos inseridos PCR. O plasmídeo pZMP40 é um vector de expressão de mamíferos contendo uma cassete de expressão com o promotor MPSV, e vários sítios de restrição para a inserção de sequências codificantes; uma origem de replicação E. Coli; uma unidade de marcador seleccionável de expressão de mamíferos que compreende um promotor SV40, um potenciador e uma origem de replicação, um gene DHFR, e um terminador SV40; e as sequências URA3 e CEN-ARS necessárias para a selecção e reprodução de S. cerevisiae. O plasmídeo pZMP40 foi construído a partir de pZMP21 (depositado na American Type Culture Collection, 10.801 University Boulevard Manassas, VA 20110-2209, e n° designado PTA-5266) através da adição de vários sítios de enzimas de restrição ao poli-ligador.

Cem microlitros de células de fermento adequado (S. cerevisiae), foram independentemente combinados com 10 μΐ do ADN de inserção e lOOng do vector de corte pZMP40, e a mistura foi transferida para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm. O fermento/mistura de ADN foi electropulsada usando uma fonte de alimentação (BioRad Laboratories, Hercules, CA) com as definições de 0,75 kV (5 kV/cm), =° ohms e 25 pF. Seiscentos μΐ de 1,2 M sorbitol foi adicionado à cubeta, e as leveduras foram semeadas numa alíquota de 100 μΐ e 300 μΐ para duas placas URA-D e incubados a 30°C. Após cerca de 72 horas, os transformantes de levedura Ura+ a partir de uma chapa única foram ressuspendidos em 1 ml de H20 e 215 girados rapidamente para agregar as células de levedura. 0 sedimento celular foi ressuspenso em 0,5 ml de tampão de lise (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA). Os quinhentos microlitros da mistura de lise foram adicionados a um tubo Eppendorf contendo 250 μΐ de esferas de vidro lavadas com ácido e 300 μΐ de fenol-clorofórmio, foram centrifugados por 3 minutos, e girados por 5 minutos numa centrífuga Eppendorf em velocidade máxima. Trezentos microlitros da fase aquosa foram transferidos para um tubo novo, e o ADN foi precipitado com 600 μΐ de etanol (EtOH) e 30μ1 3M de acetato de sódio, seguido por centrifugação durante 30 minutos na velocidade máxima. O tubo foi decantado e o sedimento foi lavado com 1 mL de 70% de etanol. O tubo foi decantado e o sedimento de ADN foi ressuspenso em 30 μΐ de TE. A transformação das células hospedeiras electrocompetentes de E. coli (DH12S) foi realizada utilizando 5 ul da preparação do ADN de levedura e 50 ul de células. As células foram electropulsadas a 2,0 kV, 25 pF e 400 ohms. Após a electroporação, 1 ml SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% de extrato de levedura (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCl2( 10 mM MgS04, 20 mM de glicose) foi adicionado e, em seguida, as células foram semeadas em 50 μΐ e 200 μΐ em aliquotas de duas placas LB AMP (caldo LB (Lennox), 1,8% de Agar Bacto™ (Difco), 100 mg/L Ampicilina) .

As inserções de três clones para a construção foram submetidas à análise da sequência e um clone para cada construção, contendo a sequência correcta, foi seleccionado. O plasmídeo de ADN de larga escala foi isolado utilizando um kit comercialmente disponível (QIAGEN Plamid Mega Kit, Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante. 216

Exemplo 27

Expressão e purificação de polipeptídeo de IL-22RA-muFC solúvel humana

Três conjuntos de 200pg de construção de IL-22RA-C (mG2a) (exemplo 22) foram digeridos, cada um, com 200 unidades de Pvu I a 37°C durante três horas e depois foram precipitados com IPA e girados para baixo num tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. O sobrenadante foi decantado fora do sedimento, e o sedimento foi lavado com 1 mL de 70% deetanol e permitida a incubação por 5 minutos à temperatura ambiente. O tubo foi girado numa microcentrifuga por 10 minutos a 14.000 rpm e o sobrenadante foi decantado fora do sedimento. O sedimento foi então ressuspenso em 750 μΐ de meio PF-CHO num ambiente estéril, e permido incubar a 60°C por 30 minutos. As células 5E6 APFDXB11 foram giradas para baixo em cada um dos três tubos e foram ressuspendidas com a solução de meio de ADN. O ADN/misturas de células foram colocados numa tina de 0,4 cm e electroporados utilizando os seguintes parâmetros: 950 pF, capacidade elevada, e 300 V. O conteúdo das tinas foi removido, agrupado, e diluído a 25 mLs com meio PF-CHO e colocada num balão de agitação de 125 mL. O balão foi colocado numa incubadora num agitador a 37°C, 6% CO2, e agitado a 120 RPM. A linhagem de células foi submetida à selecção de nutrientes seguida pelo passo de amplificação para lOOnM de metotrexato (MTX), então a 500nm MTX, e, finalmente, a μΜ MTX. O passo de amplificação foi seguido por um tipo de células CD8. O tipo de células CD8 foi realizado tomando um ΙμΜ MTX amplificado estável e coloração de aproximadamente 5E6 células com anticorpo monoclonal FITC anti-CD8 (BD PharMingen, cat# 30324X), utilizando as concentrações recomendadas pelo fabricante. As células coradas foram processadas e classificadas num citómetro de fluxo FACS Vantage (BD). O top 5% das células foi colectado e superado. A expressão foi confirmada por Western blot, e a linha de celular foi escalada para cima e purificada de proteínas usando métodos padrão. 217

Exemplo 28

Neutralização de huIL-22RA por soro de ratos imunizados com huL2 2 RA-mG2a A. Ensaio de neutralização baseado em célula para testar a inibição de IL-20 e/ou IL-22. 0 factor dependente da linha celular pré-B BaF3 co-transfectadas com IL-22RA e IL-20RB (pDIRSl) (células BAF/IL-22RA/IL-20RB; Exemplo 38) foi utilizado para avaliar o potencial de neutralização de anticorpos anti-IL-anticorpos 22RA por antagonizar IL-20 sobre o receptor IL-22RA/IL-20RB. Da mesma forma, as BaF3 co-transfectadas com IL-22RA e IL-10RB (CRF2-4) (células BAF/IL-22RA/CRF2-4; Exemplo 2) foram utilizadas para avaliar o potencial de neutralização de anticorpos anti-IL 22RA por antagonizar IL-22 no receptor IL-22RA/IL10RB. A proliferação, na presença de IL-20 ou IL-22 na sua linha de células que expressam os respectivos receptores, e inibição de tal proliferação, na presença dos anticorpos antagonista, foi avaliada por meio de um ensaio Alamar blue como descrito no Exemplo 3. A inibição da proliferação destas células é indicativs da actividade de neutralização neste ensaio. B.Soro anti-IL-22RA neutraliza ambas IL-20 e IL-22 num ensaio de neutralização baseado em células

Usando o ensaio descrito no Exemplo 28A, o soro de ratos nocateados para IL-22RA imunizados com huIL-22RA-muG2a (Exemplo 30(A (1)) foi adicionado como uma diluição seriada de 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13% , 0,06%, 0,03%, 0,02% e 0%. As placas de ensaio foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 4 dias após o que Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) foi adicionado a 20Dl/poço. As placas foram novamente incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 16 horas. O Alamar Blue dá uma leitura fluorométrica com base no número de células vivas, e é assim uma medida directa da proliferação celular em 218 relação ao controlo negativo. As placas foram lidas num contador Victor Wallac 2 1420 Multilabel (Wallac, Turku, Finlândia) em comprimentos de onda de 530 (excitação) e 590 (emissão). Os resultados mostraram que o soro de todos os sete animais imunizados poderia neutralizar a sinalização de ambas as huIL-22 e huIL20 através de huIL-22RA. Por exemplo, a 1% de concentração, o soro provenientes de cinco animais (16517, 16518, 16519, 16520 e 16527) neutralizou completamente a proliferação induzida por hul-22, com a inibição da proliferação decrescente de maneira dependente da dose nas concentrações mais baixas. Além disso, na concentração de 1%, o soro de outros dois animais (16471 e 16701) inibiu cerca de 90% da proliferação induzida por huIL-22, com a inibição da proliferação decrescente de maneira dependente da dose nas concentrações mais baixas. Da mesma forma, a 1% e 0,5% das concentrações, o soro provenientes de cinco animais (16517, 16518, 16519, 16520 e 16527) neutralizou completamente a proliferação induzida por huIL-20, com a inibição da proliferação decrescente de maneira dependente da dose nas concentrações mais baixas. Além disso, na concentração de 1%, o soro do animal 16701 neutralizou completamente a proliferação induzida por hull-20, com a inibição da proliferação decrescente de maneira dependente da dose nas concentrações mais baixas. Na concentração de 1%, o soro do animal 16471 neutralizou cerca de 95% da proliferação induzida por hull-20, com a inibição da proliferação decrescente de maneira dependente da dose nas concentrações mais baixas. Assim, soros de todos os sete animais foram capazes de neutralizar a proliferação induzida por IL-20 ou IL-22 através do receptor huIL-22RA. Estes resultados também demonstraram que os anticorpos de IL-22RA poderiam certamente antagonizar a actividade dos ligantes pró-inflamatórios, IL-20 e IL-22 em baixas concentrações.

Estes resultados forneceram evidências adicionais de que a actividade que efectivamente bloqueia IL-22RA ligando, bloqueando, inibindo, reduzir, antagonizando ou neutralizando IL-20 ou a actividade da IL-22 (individualmente ou em conjunto), por exemplo através de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-22RA da presente invenção, pode ser vantajoso na redução dos efeitos da IL- 219 20 e IL-22 (isoladamente ou em conjunto) in vivo e pode reduzir a inflamação induzida pela IL-20 e/ou IL-22, bem como foi visto os efeitos induzidos da pele por IL-20, bem como os efeitos induzidos da pele por IL-22, por exemplo, a psoriase, a IBD, a colite, ou outras doenças inflamatórias induzida pela IL-20, e/ou IL-22, incluindo IBD, artrite, asma, artrite psoriática, colite, condições inflamatórias da pele, e dermatite atópica.

Exemplo 29

Geração de Células P815/hlL-22RA e imunização de ratos A. Geração de células P815/hlL-22RA e injecção em ratos para a produção de anticorpos anti-hIL-22RA: Células WT P815 (ATCC No. TIB-64) foram transfectadas com um vector plasmidial contendo a sequência de hIL-22RA cADN (por exemplo, SEQ ID NO: 1) e um marcador selecionável resistente à puromicina, utilizando o reagente Fugene de acordo com o protocolo do fabricante (Roche, Indianapolis, IN). As células foram colocadas sob a selecção de puromicina 48 horas após a transfecção. Os transfectantes resistentes à puromicina foram clonados por diluição limitante, e seleccionados para o seu nivel de expressão da superfície celular hIL-22RA por citometria de fluxo, utilizando IL-22 biotinilatada humana (biotina huIL-22) . Resumidamente, as células foram incubadas com 5 ug/ml huIL-22-biotina durante 30 minutos em gelo e em seguida lavadas. A ligação do huIL-22-biotina para as células, foi então detectada usando PE marcado de estreptavidina a 1:500. As células foram analisadas num citómetro de fluxo FACScan usando o software Cellquest. (Becton Dickinson, San Jose, CA) . O clone de células seleccionado P815/IL-22RA cresceu e foi colhido para injecção. As células foram colectadas, lavadas três vezes em PBS, contadas, ressuspensas em lxlO8 220 células por mililitro, e irradiadas com 10000 rads. A suspensão de células foi então transferida para uma seringa de lml, e injetada por via intra-peritoneal em ratos DBA/2. Os ratos foram impulsionados de forma idêntica três semanas mais tarde e os soros foram testados para a ligação à linha celular do transfectante hIL-22RA. Brevemente, os soros foram diluidos em tampão Facs 1:100 (HBSS, 2% BSA, 0,02% NaN3)f e em seguida incubados com células de rim humano FC-293 bloqueadas sobre expressando hIL-22RA. A ligação de anticorpos anti-IL-22RA às células foi então detectada utilizando fluoresceina conjugada com IgG de cabra-anti-rato diluída a 1:200. (Southern Biotech, Birmingham, AL) As células foram analisadas conforme descrito anteriormente. Os ratos foram impulsionados novamente um total de 3 vezes mais e os soros foram triados como descrito. Dois ratos foram seleccionados para a fusão do hibridoma, usando métodos padrão da técnica para a produção de anticorpos monoclonais (Exemplo 25), com base no nível da sua ligação do soro com os transfectantes hIL-22RA. O método acima é usado também para a geração de células P815 expressando receptores IL-22RA heterodiméricos, como IL-22RA/CRF2-4 (P815/células IL-22RA/CRF2-4), IL-22RA/pDIRSl (P815/IL-22RA/células pDIRSl), ou IL-22RA/CRF2-4/pDIRSl (P815/lL-22RA/células CRF2-4/pDIRSl), por exemplo, para a imunização de ratos para a produção de anticorpos monoclonais contra IL-22RA e IL-22RA compreendendo receptores heterodiméricos. 221

Exemplo 30

Geração de anti-humano IL-22RA murina (IL-22RA) mftbs A. A imunização para a produção de anticorpos anti-IL-22RA: (1) Usar IL-22RA-muFc solúvel

Ratos nocautedos por IL-22RA de seis a doze semanas de idade (Exemplo 26) foram imunizados por injecção por via intraperitoneal com 25-50 ug de proteína IL-22RA-muFc humana solúvel (Exemplo 23) misturada 1:1 (v: v) com adjuvante Ribi (Sigma) com um calendário quinzenal. Sete a dez dias após a terceira imunização, amostras de sangue foram tomadas através de sangramento retro-orbitária, o soro colhido e avaliado pela sua capacidade de inibir a ligação de IL-22 ou IL-20 e IL-22 e IL-22RA em ensaios de neutralização (por exemplo, aqui descritos) e para manchar IL-22RA transfectada versus 293 células não-transfectadas numa coloração do ensaio FACS. Os ratos continuam a ser imunizados e amostras de sangue colhidas e avaliadas conforme descrito acima, até à neutralização atingir um determinado nível. Nessa altura, os ratos com os níveis mais altos de neutralização foram injectados por via intravenosa com 25-50 ug de proteína IL-22RA-Fc solúvel em PBS. Três dias depois, o baço e os gânglios linfáticos destes ratos foram colhidos e utilizados para a geração de hibridomas, por exemplo, utilizando as células do mieloma do rato (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) ou outras linhas de células apropriadas da técnica, utilizando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, ver Kearney, JF et al. Immunol, J. 123:1548-50, 1979 e Lane, RD J Immunol

Methods 81:223-8, 1985). 222 (2) Usar transfectantes P815 que expressam o receptor de IL-22RA.

Ratos fêmeas de seis a dez semanas de idade DBA/2 são imunizados por injecção intraperitoneal de 1 x 105 ao vivo, as células transfectadas P815, como por exemplo P815/ células IL-22RA, P815/ células IL-22RA/CRF2-4, P815/células IL-22RA/pDIRSl ou P815/células IL-22RA/CRF2-4/pDIRSl (Exemplo 24) (por exemplo, 0,5 ml a uma densidade de células de 2 x 105 células/ml) . Antes da injecção, as células são mantidas em fase de crescimento exponencial. Para a injeção as células são colhidas, lavadas três vezes com PBS e, em seguida ressuspensas em PBS a uma densidade de 2 x 105 células/ml. Neste modelo, os ratos desenvolvem um tumor ascitico dentro de 2-3 semanas que progride até à morte em 4-6 semanas a menos que uma resposta imune ao antigeno alvo transfectado seja montada. Em três semanas, ratos sem aparente inchaço abdominal (indicativo de ascite) são re-imunizados como acima descrito em intervalos de 2-3 semanas. Sete a dez dias após a segunda dose, as amostras de sangue são tomadas através de sangramento retro-orbitário, o soro colhido e avaliado pela sua capacidade de inibir a ligação de IL-22 ou IL-20 e IL-22 e IL-22RA em ensaios de neutralização (por exemplo, aqui descritos) e para manchar IL-22RA transfectada versus 293 células não-transfectadas numa coloração do ensaio FACS. Os ratos continuam a ser imunizados e amostras de sangue colhidas e avaliadas conforme descrito acima, até os titulos de neutralização atingirem um determinado nivel. Nessa altura, os ratos com os níveis mais altos de neutralização são injectados intraperitonealmente com 1 x 105 com células P815 transfectadas ao vivo. Quatro dias depois, o baço e os gânglios linfáticos destes ratos são colhidos e utilizados para a geração de hibridomas, por exemplo, utilizando as células do mieloma do rato (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) ou outras linhas de célula apropriadas da técnica, utilizando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, ver Kearney, JF et al. supra.; e Lane, supra RD). 223

Uma alternativa para o esquema de imunização acima, células P815 transfectadas ao vivo, envolve a injecção intraperitoneal de 1-5 x 106 de células transfectadas irradiadas, a cada 2-3 semanas. Nesta abordagem, os animais não se desenvolvem e morrem de ascite. Em vez disso, os animais são monitorizados para uma resposta imune para neutralizar IL-22RA no soro, conforme descrito acima, começando com um sangramento após a segunda dose. Uma vez que os títulos de neutralização tenham atingido um nível máximo, aos ratos com mais títulos é dada uma injecção intraperitoneal de pré-fusão de 5 x 106 de células irradiadas e quatro dias depois, o baço e os gânglios linfáticos destes ratos são colhidos e utilizadas para a geração de hibridomas utilizando, por exemplo células do mieloma do rato (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) ou outras linhas de células apropriadas da técnica, utilizando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, ver Kearney, JF et al. supra.; e Lane , supra RD). B. Análise de fusões de hibridomas para a detecção de anticorpos que se ligam a IL-22RA e inibem a ligação de IL-22 para IL-22RA:

Duas telas primárias diferentes foram realizadas no sobrenadante de hibridoma 80-10 dias após a fusão. Para o primeiro ensaio, os anticorpos em sobrenadantes foram testados quanto à sua capacidade de ligar a placa ligada à proteína humana solúvel IL-22RA-muFc por ELISA utilizando reagentes do segundo passo de conjugados HRP de cabra anti-rato kappa e de cadeia leve anti-lambda para identificar a ligalão rato anticorpos. Para demonstrar a especificidade para a porção de IL-22RA da proteína IL-22RA-muFc, os sobrenadantes positivos no ensaio inicial, foram avaliados numa proteína de fusão irrelevante para a mesma região Fc murina (mG2a). O anticorpo nos sobrenadantes que ligam a IL-22RA-muFc e não à proteína de fusão irrelevante muFc contendo eram considerados específicos para IL-22RA. Para o segundo ensaio, os anticorpos em todos os sobrenadantes dos hibridomas foram avaliados por ELISA para a sua 224 capacidade de inibir a ligação de biotina humana IL-22 para a placa ligada a IL-22RA-muFc.

Todos os sobrenadantes contendo anticorpos que se ligam especificamente a IL-22RA, em que inibem a ligação de IL-22 e IL-22RA ou não no teste de ELISA, foram posteriormente testados quanto à sua capacidade de inibir a ligação (e efeito pró-proliferativo concomitante) de IL-20 ou IL-22 para células transfectadas Baf3 IL-22RA/IL-20RB e IL-22RA/CRF2-4, respectivamente. Todos os sobrenadantes, que foram neutralizados positivos em ambos os ensaios de inibição da IL-22 ou de ambos os ensaios de inibição de IL-20 e de IL-22 foram posteriormente avaliados quanto à sua capacidade para corar IL-22RA transfectada versus células Baf3 não-transfectadas pela análise FACS. Esta análise foi concebida para confirmar que a inibição da IL-22 para a ligação IL-22RA/CRF2-4, ou IL-20 para a ligação IL-22RA/IL-20RB, era de facto devida a um anticorpo que se liga especificamente ao receptor IL-22RA. Além disso, uma vez que a análise FACS foi realizada com um reagente de segunda etapa anti-IgG, os resultados positivos específicos de FACS indicam que os anticorpos neutralizantes eram susceptíveis de ser da classe IgG. Por estes meios, um dominante foi identificado para ligar IL-22RA na placa ligada por ELISA, inibindo a ligação de IL-22 e IL-22RA no ensaio de inibição baseado de ELISA, bloqueando a interacção da IL-20 e IL-22 com IL-22RA/IL-20RB e células Baf3 transfectadas IL-22RA/CRF2-4 (Exemplo 28), respectivamente, e foi fortemente positivo para a coloração de ambos IL-22RA/IL-20RB e células Baf3 transfectadas IL-22RA/CRF2-4 com um reagente de segunda etapa IgG anti-rato. D. Clonaqem de um anticorpo específico anti-lL-22RA produtor de hibridomas:

Um hibridoma produzindo anti-IL-22RA mAb que neutraliza de forma cruzada a ligação de IL-20 e IL-22 e células BaF3adequadamente transfectadas foi clonado por uma 225 abordagem de diluição padrão de baixa densidade (menos de 1 célula por poço) . Cerca de 5-7 dias após o plaqueamento, os clones foram avaliados por ELISA numa placa de ligação de IL-22RA-muFc humana seguida por um novo teste de poços positivos por ELISA em muFc irrelevante contendo proteina de fusão, como descrito acima. Os clones seleccionados, cujos sobrenadantes ligam a Eel-22RA-muFc e não ao irrelevante muFc contendo a proteína de fusão, foram confirmados para a actividade de anticorpos específicos, repetindo os testes de neutralização, bem como a análise FACS. Todos os clones positivos de anticorpos seleccionados de IL-22RA foram clonados um mínimo de duas vezes para ajudar a segurar a clonalidade e para avaliar a estabilidade da produção de anticorpos. Foram realizadas rondas de clonagem e avaliadas conforme descrito até, de preferência, pelo menos, 95% dos clones obtidos serem positivos para neutralizar a produção de anticorpos anti-IL-22RA. E. Caracterização bioquímica da molécula reconhecida por-Anti-IL-22RA mAbs: A confirmação bioquímica de que a molécula-alvo, IL-22RA, reconhecida pela suposta anti-IL-22RA mAbs é realmente IL-22RA é realizada por imunoprecipitação padrão seguido por análise SDS-PAGE ou procedimentos de Western Blotting, ambos empregando preparações de membranas solúveis de IL-22RA transfectadas versus células Baf3 não-transfectadas. Além disso, preparações de membranas solúveis de linhas de células não-transfectadas que expressam IL-22RA são utilizadas para mostrar que os mAbs reconhecem a cadeia de receptor nativo, bem como a transfectada. Alternativamente, os mAbs são testados para a sua capacidade de especificamente imunoprecipitar ou western blot a proteína solúvel IL-22RA-muFc. 226

Exemplo 31

Neutralização de huL22RA por soro de ratos injectados com células transfectadas P815 com huL22RA

Utilizando o teste de neutralização baseado em células descrito no Exemplo 28, o soro de ratos injetados com células transfectadas P815 huIL 22RA ao vivo (Exemplo 30.A.2) foi adicionado como uma diluição seriada de 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13%, 0,06%, 0,03%, 0,02% e 0%. As placas de ensaio foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 4 dias, altura em que Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) foi adicionado a 20 D/poço. As placas foram novamente incubadas a 37°C, 5% de C02 durante 16 horas. Os resultados mostraram que o soro de quatro dos animais poderia neutralizar a sinalização de ambas as huIL-22 e huIL20 através de huIL-22RA.

Na concentração de 1%, o soro de seis animais (7125, 7127, 7128, 7118, 7124 e 7117) neutralizado entre 50% e 80% da proliferação induzida por huIL-22, com a inibição da proliferação diminuída numa forma dependente da dose em concentrações mais baixas. Além disso, na concentração de 1%, o soro de quatro animais (7125, 7127, 7118 e 7117) neutralizado entre 40% e 70% da proliferação induzida por huIL20, com a inibição da proliferação decrescente de maneira dependente de dose em concentrações mais baixas. Estes resultados também demonstraram que os anticorpos de IL-22RA poderiam certamente antagonizar a actividade dos ligantes pró-inflamatórios, IL-20 e IL-22 em baixas concentrações.

Estes resultados forneceram evidências adicionais de que efectivamente bloqueando a actividade IL-22RA ligando, bloqueando, inibindo, reduzindo, antagonizando ou neutralizando a IL-20 ou a actividade da IL-22 (individualmente ou em conjunto), por exemplo através de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-22RA da presente 227 invenção, pode ser vantajoso na redução dos efeitos da IL-20 e IL-22 (isoladamente ou em conjunto) in vivo e pode reduzir a inflamação induzida pela IL-20 e/ou IL-22, como a foi visto nos efeitos induzidos da pele de IL-20, bem como os efeitos induzidos de pele de IL-22, por exemplo, a psoriase, a IBD, a colite, ou outras doenças inflamatórias induzidas pela IL-20, e/ou IL-22, incluindo IBD, artrite, asma, artrite psoriática, colite, condições inflamatórias da pele, e dermatite atópica.

Exemplo 32

Fenótipo de IL-22RA em ratos nocaute A. Geração de ratos carregando modificações genéticas 1. Geração de ratos transgénicos expressando IL-20 murina com um brilho neonatal a), Construção para expressar IL-20 murina do promotor K14. A fim de investigar a função biológica da IL-20 in vivo, foi feita uma a construção de transgénicos, em que IL-20 murina foi conduzida pelo promotor K14 humano (ver também, Exemplo 21) . Os oligonucleotídeos foram concebidos para gerar um fragmento de PCR contendo uma sequência de consenso Kozak e a região de codificação IL-20 murina. Estes oligonucleotídeos foram concebidos com um sítio Fsel na extremidade 5' e um sítio AscI na extremidade 3' para facilitar a clonagem em pRSK14, um vector padrão transgénico, que contém um promotor de queratinócitos humanos e de células epiteliais específicas.

As reacções de PCR foram realizadas com cerca de 200 ng modelo de IL-20 murina (SEQ ID NO: 33) e oligonucleotídeos concebidos para amplificar o comprimento total da IL-20 (SEQ ID NO: 34) . As condições de reacção de PCR foram 228 determinadas utilizando métodos conhecidos na técnica. Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose e purificados usando um kit de extração de gel QiaQuick™ (Qiagen). 0 fragmento de ADN de tamanho correcto isolado, foi digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim), etanol precipitado e ligados em pRSK14, previamente digerido com Fsel e Asei. 0 plasmideo pRSK14, concebido para expressar um gene de interesse em queratinócitos e epiteliais em ratos transgénicos, contém uma cassete de expressão ladeada por um promotor de queratina especifica humana K14 de 3 Kb.

Cerca de um microlitro da reacção de ligação foi electroporadaem células competentes DH10B ElectroMax™ (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acordo com a orientação do fabricante e semeadas em placas LB contendo 100 yg/ml de ampicilina e incubadas durante a noite. As colónias foram colhidas e cultivadas em meio LB contendo 100 yg/ml de ampicilina. Mini-preparações de ADN foram preparadas a partir de clones escolhidos e seleccionados para a inserção de IL-20 murina por restrição de digestão Fsel e Asei combinado, e posterior eletroforese em gel de agarose. A construção TG com inserções correctas de cADN foi confirmada por análise de sequenciamento. Foram realizadas maxi-preparações de pRSK14 correcto IL-20 murina. b) Geração e caracterização de ratos transgénicos K14 il-20

Um fragmento Notl de cerca de 4 Kb de comprimento, foi isolado a partir de um vector transgénico (TG) contendo sequências de acompanhamento 5' e 3' do promotor queratina específica K14, rato IL-20 (SEQ ID NO: 33; polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 34), o intron Gormon, IL-20 cADN e sequências de sinais da hormona de crescimento humano poliA. Foi utilizado para microinjecção em B6C3Flfertilizado (Taconic, Germantown, NY) oócitos murinos. A microinjecção e produção de ratos transgénicos foram produzidas conforme descrito em Hogan, B. et al. 229

Manipulating the Mouse Embryo, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994. A reacção RT-PCR TaqMan™ foi utilizada para quantificar a expressão do TG ARN usando substratos PCR específicos para a porção de sinal da hormona de crescimento humano poliA do transgene.

Todas as construções TG expressando IL-20 apresentam uma alta taxa de mortalidade paranatal, e os filhotes TG que nasceram geralmente exibem um "fenótipo" brilhante. 0 aspecto brilhante dos filhotes recém-nascidos pareceu estar associado com o endurecimento da pele, como se fosse sujeita a secagem, resultando numa redução de cuidado adequado. Os seus movimentos tornam-se mais rígidos em geral. Histopatologicamente os filhotes brilhantes têm uma epiderme espessa e a camada de queratina é compactada. A maioria destes filhotes brilhantes morreu nos primeiros cinco dias, e os filhotes sobreviventes foram desmamados e, em geral, não expressam o transgene (por análise de transcrição), ou eram quiméricos (transmição baixa do transgene para os descendentes).

Uma linha expressando IL-20 murina, conduzido pelo promotor K14, foi estabelecida. 0 nível de expressão da pele e do timo foi baixa, e todos os recém-nascidos nasceram com um fenótipo brilhante. Em geral, esta linha teve 20% de TG, indicando que 50-60% dos filhotes transgénicos morreram no útero. (Num acasalamento hemizigoto 50% dos filhotes deve ser TG). 230

2. Geração de ratos com expressão de IL-22RA retirada; ratos nocaute IL-22RA a) . Geração de construção de nocaute (KO) para IL-22RA murina

Para aprofundar o estudo da função biológica da IL-22RA in vivo, uma estirpe de rato NOCAUTE (KO) foi criada para retirar a expressão de IL-22RA. Em primeiro lugar, as sondas rato IL-22RA cADN foram utilizadas para seleccionar biblioteca genómica BAC de rato 129/SvJ. Os clones contendo locus genómico IL-22RA foram identificados e caracterizados. 0 polinucleotideo IL-22RA murina é mostrado na SEQ ID NO: 41 e o polipeptideo na SEQ ID NO: 42.

Para criar uma construção nocaute para a ablação de IL-22RA, um foi feito um vector nocaute através da técnica de clonagem ET (Zhang et al. 1998. A new logic for DNA engineering using recombinant in E. coli. Nat. Genet. Vol. 20:123-8. Resumidamente, o vector KO contém um 1,8 kb braço 5' (braço curto), um marcador selecionável IRES-

LacZ/MClneo, e um braço de 10 Kb 3' (braço longo) do gene IL-22RA. No vector KO, os exons 2, 3 e 4, bem como os introns 2 e 3 da sequência genómica de IL-22RA foram substituídos pelo marcador selecionável IRES-LacZ/MClneo de modo que a supressão de cerca de 4,4 Kb foi gerada por recombinação homóloga em células ES.

Após a linearização do vector KO por enzima de restrição Pmel, foi electroporado em células ES 129/SvJ. A selecção de eventos de recombinação homóloga, bem como a identificação dos clones recombinantes ES foram realizadas conforme descrito em Robertson, EJ et al. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Praticai Approach 2 ed., IRL Limited Press, Oxford, 1987. 231 b) , Criação e análise de ratos com expressão de IL-22RA retirada

Clones positivos ES, em que eliminação dos exons 2-4 e dos Introns 2-3 do locus genómico de IL-22RA ocorre, foram ampliados. Eles foram injectados em blastocistos de ratos C57BI/6J. Após breve re-expansão dos blastocistos injectados, foram introduzidos em mães pseudo-grávidas para promover a geração de quimeras. A injecção de blastocisto, transmissão e reprodução da quimera subsequente germinativa de IL-22-RA mutante foram realizadas conforme descrito em Robertson, EJ et al. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Praticai Approach 2 ed., IRL Limited Press, Oxford, 1987.

Os ratos KO mutantes foram identificados por genotipagem estratégia PCR. Três substratos PCR, ZC22901 (SEQ ID NO: 35), ZC45039 ((SEQ ID NO: 36), ZC38573 (SEQ ID NO: 37) foram usados numa reação de PCR multiplex para detecção do alelo de tipo selvagem e do alelo mutante. 0 alelo de tipo selvagem (WT) produz um fragmento de ADN de 229 bp de comprimento, enquanto o alelo mutante gera um fragmento de ADN de 371 bp de comprimento. A dupla de ratos hemizigóticos produzem uma taxa normal de homozigoto (HOM), heterozigoto (Het), e do tipo selvagem (WT), bem como uma taxa sexual normal. Inspecionando os ratos através de uma PhysioScreen (peso corporal, peso do tecido, hemograma completo (CBC), química clínica, observação grosseira, e histopatologia) não revelaram nenhuma diferença aparente entre os animais HOM, Het e WT. 232 B, IL-22RA era necessária para IL-22 induzida por SAA: SAA ELISA mostrando expressão de SAA induzida por IL-22 estava ausente em ratos nocaute IL-22RA:

Para avaliar se a IL-22RA era necessária para a indução da SAA em ratos injectados com IL-22, ratos KO IL-KO 22RA foram injectados com 5ug IL-22 e sangrados 6 horas mais tarde.

Um teste de ELISA para determinar os níveis de SAA nas amostras de soro foi realizada utilizando o kit de imunoensaio Mouse SAA (BioSource Internacional, Califórnia) seguindo as instruções do fabricante, com o soro diluído 1:1000. Quatro dos cinco ratos WT apresentaram níveis elevados de SAA em resposta à injecção de IL-22, enquanto quatro dos cinco ratos HOM KO IL-22RA apresentaram níveis basais de SAA. Ambos os ratos Het KO IL-22RA testados têm níveis elevados de SAA, mas inferiores aos níveis de SAA nos ratos WT elevados. Isso indica, que a IL-22RA era necessária para a indução da SAA por IL-22.

Estes resultados forneceram evidências de que a actividade IL-22RA efectivamente bloqueando, por exemplo através de um nocaute do gene IL-22RA ou semelhante através de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-22RA da presente invenção, reduzirá similarmente a inflamação induzida por IL-22, por exemplo, psoríase, IBD, colite, endotoxemia, ou outras doenças inflamatórias induzidas pela IL-22. 233

C,IL-22RA era necessária para o espessamento epitelial induzido por IL-22: Administração de proteína pura IL-22 via mini-bomba osmótica por implantação sub-cutânea não causa o espessamento da epiderme ratos KO IL-22R

Para avaliar se a IL-22RA era necessário para o espessamento epitelial induzido por IL-22, IL-22 foi administrada por via subcutânea a ratos HOM IL-22RA e WT KO via mini-bombas osmóticas. As bombas entregam IL-22 a uma taxa de 18,4 μΐ por dia durante 7 dias. Quatro HOM e 6 WT KO IL-22RA receberam a proteína IL-22, enquanto três HOM e 1 WT recebeu PBS.

As amostras de soro de ratos tratados com IL-22 foram testadas em ensaio de proliferação BaF3 para confirmar a presença da IL-22. As células transfectadas BaF3 com IL-22RA e CRF2-4 exigem a presença de um IL-22 ou IL3 murina para proliferar. Essas células foram giradas para baixo e lavadas em meio completo, sem mIL-3 (meio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) , suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 2mM L-Glutamax-1™ (Gibco BRL), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco BRL), e antibióticos PSN (GEBCO BRL)) (adiante designado "meio livre de mIL-3") . As células foram rodadas e lavadas três vezes para garantir a remoção de mIL-3. As células foram então contadas num hemocitómetro e colocadas em placas de formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume final de 200 ul por poço usando o meio livre de mIL-3. O soro de rato esteve presente nos poços a 1%, 0,5%, 0,25% ou 0,125%. As placas de ensaio foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 3 dias, ao fim dos quais o Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) foi adicionado a 20pl/poço. As placas foram novamente incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 24 horas. Alamar Blue dá uma leitura fluorométrica com base no número de células vivas, e é assim uma medida directa da proliferação celular em relação ao controlo negativo. As placas foram novamente incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 24 horas. As placas foram lidas num contador Victor Wallac 2 1420 Multilabel (Wallac, Turku, Finlândia) em comprimentos de onda de 530 (excitação) e 590 (emissão) . Os resultados 234 mostraram que nenhum dos animais injectados com PBS apresentaram actividade de IL-22, enquanto a 1 de 1 animais Het, 2 de 4 animais HOM e 3 de 6 animais WT tinham actividade de IL-22 detectável. A proliferação induzida por este soro foi bloqueada pela presença de 1 ug/ml de IL-22BP, provando que era IL-22 especifica.

Amostras de pele de ratos IL-22 tratados e não tratados HOM IL-22RA e Het nocaute (KO) e de controlo WT foram imersos e fixados em 10% de formol. Os tecidos foram cortados e embebidos em parafina, processados, seccionados a 5 pm (micrótomo Jung 2065 Supercut, Microsystems Leica, Wetzlar, Alemanha) e corados com H&E. Os tecidos manchados foram avaliados sob um microscópio de luz (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) por um patologista veterinário certificado ACVP.

Cada amostra de pele foi avaliada numa escala de 0 (nenhum) a 4 (grave) para a gravidade da inflamação nos tecidos vizinhos do local de implantação da bomba na hipoderme, de 0 (nenhum) a 3 (difuso) da escala de medida do espessamento da epiderme (acantose), e o número de camadas epiteliais foram contadas na parte mais espessa da epiderme. Não foi encontrada diferença entre os ratos HOM e os ratos WT a quem tinha sido dado PBS. Os resultados destes dois grupos foram reunidos num grupo PBS. A média e o desvio padrão foram determinados para cada grupo de tratamento e foi mostrado na Tabela 14 abaixo. 235

Tabela 14

Tratamento Controlo PBS HOM KO: IL-22 WT: IL-22 Número de ratos 4 4 6 Espessura epitelial 3,511,0 3,210,5 5,912,3 Extensão da acantose 0,511,0 0,210,5 1,911,3 Inflamação 1,511,0 1,211,0 2,011,0

Os resultados mostraram uma tendência de aumento da espessura epitelial e acantose em ratos WT tratados com IL-22 e menos espessura epitelial e acantose em ratos IL-22RA HOM quando expostos a IL-22.

Esses resultados evidenciam que a actividade que efectivamente bloqueia IL-22RA, por exemplo através de um nocaute do gene IL-22RA ou semelhante através de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-22RA da presente invenção, que similarmente reduz os efeitos na pele da IL-22 induzida, por exemplo na psoriase, IBD, colite, ou outras doenças inflamatórias induzidas pela IL-22. D. IL-22RA era necessária para o brilho da pele de filhotes recém-nascidos induzido por IL-20: cruzamento de ratos transgénicos expressando IL-20 murina com ratos IL-22RA KO para produzir filhotes transgénicos que não brilham

Para avaliar se a IL-22RA era necessário para o brilho induzido por IL-20 em filhotes recém-nascidos TG, o transgene K14 muIL-20 foi cruzado para a linha KO IL-22RA, e os recém-nascidos foram observados para o fenótipo brilhante.

Sessenta e nove filhotes nasceram com uma relação de genótipo mendeliano. Todos os ambientes TG e Het KO foram brilhantes, enquanto nenhum dos não-TG, nem os ambientes no HOM KO eram brilhantes. 236

Um ensaio de proliferação Alamar Blue usando células BaF3 expressando IL-20RA e IL-20RB foi realizado para avaliar a presença de IL-20 no soro de rato. Estas células proliferam em resposta a uma IL-20 ou IL3 murina. 0 procedimento foi o mesmo que o descrito na secção C, acima. Os resultados do ensaio mostraram que todos os ratos TG tinham actividade de IL-20 comparável, e no mesmo nivel de IL-20 TG nos ambientes C57BL/6N. A ausência de fenótipo brilhante indica que o fenótipo brilhante era dependente da presença de IL-22RA. 0 ensaio de proliferação mostrou que todos os ratos TG tiveram atividade de IL-20comparável, e no mesmo nivel como IL-20 TG nos ambientes C57BL/6N. A ausência de fenótipo brilhante indica que o fenótipo brilhante era dependente da presença de IL-22RA.

No terceiro dia pós-parto, os filhotes de ninhadas contendo K14 MUIL TG-20 nos ambientes IL-22RA KO foram sacrificados e todo o corpo imerso e fixado em formol 10%. Os tecidos fixados foram cortados em secções transversais do tórax e abdómen, embebidos em parafina, processados, seccionados a 5 um (micrótomo Jung 2065 Supercut, Microsystems Leica, Wetzlar, Alemanha) e corados com H&E. Os tecidos manchados foram avaliados sob um microscópio de luz (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) de forma cega por um patologista veterinário certificado ACVP. As anormalidades do tecido foram anotadas e o número de camadas epiteliais na epiderme dorsal do tórax anterior contadas.

Tecidos a partir de três ratos IL-20 TG de ambiente HOM IL-22RA KO (IL-20 TG/IL-22RA KO HOM) e três ratos nãO-TG em ambiente IL-22RRA HOM KO (não-TG/IL-22RA KO HOM) foram analisados microscopicamente e encontrados não conter nenhuma anormalidade. Os tecidos de dois ratos IL-20 TG em ambiente Het IL-22RA KO (111. -20 TG/IL-22RA KO Het) também foram examinados. O número de camadas epiteliais da epiderme foi semelhante em todos os animais. No entanto, a epiderme dos dois ratos Eel-20 TG/IL-22RA KO Het foi hipereosinofilica em comparação com os outros animais e exibiu perda de granularidade no estrato granuloso. 237

Nenhuma outra anomalia foi observada na pele ou outros tecidos de qualquer um dos ratos.

Esses resultados evidenciam que a actividade que efectivamente bloqueia IL-22RA, por exemplo através de um nocaute do gene IL-22RA ou semelhante através de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-22RA da presente invenção, similarmente reduz os efeitos da pele IL-20 induzida, bem como os efeitos na pele induzida por IL-22, por exemplo, a psoriase, a IBD, a colite, ou outras doenças inflamatórias induzidas pela IL-20, e/ou IL-22, incluindo IBD, artrite, asma, artrite psoriática, colite, condições inflamatórias da pele, e dermatite atópica.

Exemplo 33

Análise histomorfométrica da imagem de ratos IL-22RA nocaute

Uma linha de ratos transgénicos kl4 IL-20m (TG) foi estabelecida, e os recém-nascidos TG apresentam um fenótipo brilhante. 0 transgene é expresso pelo promotor kl4, que dirige a expressão da queratina produzindo células na pele. A linha de ratos IL-22RA nocaute (KO) também foi estabelecida, e não foram observadas mudanças significativas nos ratos não-desafiados. As duas linhas foram cruzadas entre si e os recém-nascidos foram colectados tendo em conta os seguintes quatro genótipos diferentes: (1) TG/HOM: expressando o transgene kl4 IL-20m sobre um ambiente não expressando IL-22RA; (2) TG/-Het: expressando o transgene kl4 IL-20m sobre um ambiente exprimindo alguma IL-22RA de uma cópia do gene IL-22RA; (3) WT/HOM: não expressando o transgene kl4 IL-20m sobre um ambiente não expressando IL-22RA; e (4) WT/Het: não expressando o transgene kl4 IL-20m sobre um ambiente exprimindo alguma IL-22RA de uma cópia do gene IL-22RA. Trinta e quatro filhotes recém-nascidos destes diferentes 238 genótipos foram sacrificados no dia 3, cerca de 48 horas após o parto (Tabela 15):

Tabela 15 TG/HOM* TG/-Het* WT/HOM* WT/Het* (Grupo 1) (Grupo 2) (Grupo 3) Grupo 4) Total n=10 n=10 n=9 n=5 TG=transgénico; WT= tipo selvagem; HOM=homozigótico; Het=heterozigótico; e n= número de filhotes

Cada filhote foi transversalmente seccionado em três secções (crânio tórax, tórax caudal e abdómem) através do corpo e a cabeça foi descartada. As amostras de tecido, 4.0-5.0mm de espessura, foram fixadas em 10% de formol tamponado neutro, transformadas em blocos de parafina e coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para exame histológico de rotina e análise da imagem histomorfométrica. A epiderme da região dorsal da medula espinhal em cada amostra de tecido foi escolhida para a análise da imagem histomorfométricos usando um microscópio Olympus BH-2, uma câmera de video (Dage-MTI, Michigan City, IN) e software BIOQUANT True Color Windows 98 (R&M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209), com o seguinte conjunto: Parâmetro: mag. IOx, Z off-set 0; Matriz: comprimento: (□ m); manual e aditivo modo de medição. A espessura (□ m) da epiderme e do estrato córneo ou camada córnea de cada amostra de pele foram medidas individualmente 10 vezes, com cerca de 0,1 mm de intervalo entre cada medição, em cada campo microscópico de IOx e o valor médio, SD e SEM foram obtidos por cálculo Excel. Todas as seções foram escolhidos aleatoriamente e medidas de forma cega. Após a medida, as secções foram reveladas e os resultados encontrados para os grupos de tratamento. Os resultados finais por grupo de tratamento foram classificados como segue: 1. Média da espessura da epiderme (□ m) no tórax cranial, tórax caudal e abdómen, e depois sub-classifiçados como (a) a espessura média da epiderme no tórax cranial; (b) a espessura média da epiderme no tórax caudal; e (c) a espessura média da epiderme no abdómem. 2. Espessura média do estrato córneo (□ m) no tórax cranial, tórax caudal e abdómen, e sub- 239 classificados como (a) a espessura média do estrato córneo no tórax cranial; (b) a espessura média do estrato córneo no tórax caudal; e (c), espessura média da camada córnea no abdómen. 3. Espessura média da epiderme mais estrato córneo no tórax cranial, tórax caudal e abdómem. Os dados obtidos foram analisados utilizando o software GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA 92121). Uma forma de análise de variância (ANOVA) foi aplicada para analisar a significância estatística das diferenças dos valores médios de grupo 1 ao grupo 4. 0 teste de comparações múltiplas Tukey-Kramer foi utilizado para a determinação das diferenças significativas nos valores médios entre os dois grupos (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001; ****P <0,0001). Observações de P <0,05 foram consideradas significativos. (1) Resultados histomorfométricos (A) Espessura média da epiderme (mm) no tórax cranial, tórax caudal e abdómem A espessura da epiderme aumentou significativamente em filhotes transgénicos IL-20 sem uma cópia do gene IL-22RA (TG/— Het) versus filhotes transgénicos IL-20 sem expressão de IL-22RA (TG/-HOM, P = 0,001***) e versus os filhotes de controlo (WT/HOM, P = 0,001***, e WT/Het, P = 0,001***), respectivamente (Tabela 16). Os filhotes TG/-Het mostraram aumento da espessura da epiderme não-queratinizada, possivelmente devido a hipertrofia dos queratinócitos. Este aumento pode envolver todas as três camadas não queratinizadas (basal, espinhosa e granulosa) , mas mais frequentemente afecta as células da camada espinhosa. A epiderme do filhote TG/-Het aumentou cerca de 25% na espessura e tornou-se proeminentemente espinhosa. Enquanto a epiderme dos filhotes TG/-HOM era ligeiramente mais grossa do que as dos controlos (WT/HOM e WT/Het) e as estatísticas não indicaram nenhuma diferença significativa entre os grupos (P>0,05). A espessura da epiderme no tórax cranial, tórax caudal e abdómem também foram comparadas. A epiderme normalmente fina do abdómem é mais espessa do a do 240 tórax caudal e a do tórax caudal é mais espessa do que a do tórax cranial (Tabela 16).

Tabela 16 TG/-HOM (N=28) TG/-Het (N=30) WT/HOM (N=27) WT/Het (N=15) Média 32,58+125 41,05+2.04 31,3111,08 30,8311,43 Os resultados representam valores médios ± SEM. N= número de secções medidas 0 epitélio escamoso da pele no tórax cranial de filhotes TG/-Het mostraram aumento na espessura acompanhado por hipertrofia das células epidérmicas (queratinócitos); porém não houve diferença estatística em comparação com outros grupos, o TG/-HOM, WT/HOM e WT/Het (P = 0,1565, Tabela 17). Isto parece ser resultante de qualquer artefacto histológico, por exemplo, a variabilidade da secção a seção, a arquitetura da natureza da epiderme, ou não ter muito efeito na pele fina do tórax cranial. Nota: o processo de histologia ou secção de tecido do tórax cranial pode desqualificar a análise histomorfométrica para obter significância estatística.

Tabela 17 TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N=10) (N=10) (N=9) (N=5) Média 29,18+2,24 33,20+2.24 27,28+0,62 29,3811,77 Os de resultados representam valores secções medidas médios 1 SEM. N= número A IL-20 (TG/-) com uma cópia do gene IL-22RA (Het) apresentaram aumento do valor médio da espessura da epiderme em relação ao TG/- HOM (P <0,05*), WT/HOM (P <0,001***), e WT/Het (P <0,01*), respectivamente (Tabela 18) . As estatísticas indicam extremamente significativa entre os grupos (P <0,0001****). A epiderme TG/-Het aumentou cerca de 29% do que a do WT/Het. O fenótipo dos filhotes IL-20 (TG/-) com ausência de IL-22RA (HOM), em 241 parte parece que a falta nos filhotes de uma cópia do gene IL-22RA (Het) associado com a epiderme mais espessa do que a dos filhotes de controlo (WT/HOM e WT/Het), no entanto, não demonstraram nenhuma diferença estatística em relação aos controlos (P> 0,05). A epiderme TG/- HOM aumentou cerca de 14% do que a do WT/HOM. Ao contrário dos filhotes TG IL-20, os filhotes deficientes no receptor IL-22RAm (WT/HOM e WT/Het) demonstraram relativamente menor espessura da epiderme. Visivelmente, o resultado histomorfométrico da espessura da epiderme no tórax caudal foi uma constatação consistente em correlação com a espessura média da epiderme no tórax cranial, tórax caudal e abdómem (Tabela 15), que indicaram que o procedimento histológico e a secção de tecido do tórax caudal realizaram a melhor qualidade de imagem para análise histomorfométrica.

Tabela 18 TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N=10) (N=10) (N=9) (N=5) Média 35,91+1,37 43,79+2.35 30,83+1,86 30,94+2,83 Os de resultados representam valores secções medidas médios ± SEM. N= número

Os resultados da espessura da média da epiderme no abdómen (Tabela 19) foram semelhantes aos do tórax caudal (Tabela 18), excepto que os TG/- HOM não apresentaram diferenças em relação aos filhotes de controlo (WT/HOM e WT/Het, P> 0.05). Houve algumas variações nas secções de tecido e também duas secções estavam em falta, ou seja, sem epiderme cobrindo a área dorsal no grupo TG/-HOM. 242

Tabela 19 TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N=8) (N=10) (N=9) (N=5) Média 32,35+1,44 46,33+3,10 35,81+1,90 32,16+2,97 Os de resultados representam valores secções medidas médios + SEM. N= número (b) Espessura média (ym) do estrato córneo no tórax, cranial, tórax caudal e abdómem

Apesar do aumento da espessura da epiderme nos filhotes transgênicos IL-20 (TG/-) num ambiente não expressando IL-22RA (HOM) ou expressando uma cópia do gene (Het) , predominando a redução da espessura do estrato córneo ou camada córnea foi observada em peles de TG/-HOM e TG/- Het relação aos filhotes de controlo (WT/HOM e WT/Het) e as estatísticas indicam extremamente significativa entre os grupos (P <0,0001****, Tabela 20). Os filhotes TG/-Het mostraram cerca de 36%, 50% e 49% de diminuição da quantidade de queratina na superfície da epiderme em relação ao TG/-HOM (P <0,01**), WT/HOM (P <0,001***) e WT/Het (P <0,001***), respectivamente. Os filhotes TG/-HOM mostraram cerca de 22% de redução significativa da espessura da camada córnea comparado com o seu controlo (WT/HOM, P <0,05*) e 17% de redução apenas versus os WT/Het que não revelaram significância estatística (P> 0,05). A espessura da camada córnea nos filhotes de controlo, WT/HOM e WT/Het foram praticamente os mesmos. Aparentemente, o estrato córneo no tórax caudal é mais espesso do que no abdómen e no abdómen é mais espesso do que no tórax cranial. 243

Tabela 20 TG/-HOM (N=8) TG/-Het (N=10) WT/HOM (N=9) WT/Het (N=5) Média 33,26+2,69 21,41+1,27 42,54+2,01 40,31+3,82 Os resultados representam valores médios ± SEM. N= número de secções medidas

A espessura média do estrato córneo no tórax cranial (Tabela 21) é semelhante à do tórax cranial, tórax caudal e abdómem (Tabela 20), mas redução significativa do estrato córneo só foi encontrada nos TG/- Het vs TG/- HOM (P

<0,05*) e vs. WT/HOM (P <0,01**), respectivamente. O desvio padrão e o erro padrão da média eram altos, o que pode ser devido às secções mais pobres; amostras de pele ausente; arquitetura da natureza da epiderme, ou não ter muito efeito no tórax cranial. Nota: o processo de histologia ou secção de tecido do tórax cranial, pode desqualificar a análise histomorfométrica, a fim de obter resultados de qualidade.

Tabela 21 TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N=28) (N=30) (N=26) (N=14) Média 34,96+3,53 18,14+3,99 40,47+4,38 32,96+8,11 Os de resultados representam valores secções medidas médios ± SEM. N= número O resultado da espessura média do estrato córneo no tórax caudal (Tabela 22) foi semelhante à do tórax cranial, tórax caudal e abdómen, mas com três excepções: (1) TG/-HOM vs TG - Het e TG/-HOM vs WT/HOM não mostraram nenhuma diferença estatística (P> 0,05); (2)TG/-HOM vs WT/Het mostraram diferença significativa (P <0,01**); (3) O estrato córneo no WT/Het era notavelmente mais espesso o que pode ser a consequência dos artefatos de processamento de tecidos, por exemplo, a queratina fez inchar ou expandir quando colocados em solução hipotónica, ou deixados em banho-maria por muito tempo. 244

Tabela 22 TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N=10) (N=10) (N=8) (N=4) Média 35,64+3,4 24,22+1,54 44,35+3,51 53,77+7,21 Os de resultados representam secções medidas valores médios 1 SEM. N= número

Somente o TG/-HOM vs WT/HOM e TG/-Het vs WT/HOM mostraram diferença estatística significativa, P <0,05* e P <0,001***, respectivamente (Tabela 23). Os filhotes TG/-mostraram uma redução na espessura do estrato córneo no abdómen em comparação com a sua ninhada de controlo (WT/HOM e WT/Het).

Tabela 23 TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N=8) (N=10) (N=9) (N=4) Média 28,84+4,36 21,8611,30 42,4513,15 33,25+3,96 Os de resultados representam valores secções medidas médios 1 SEM. N= número (c) Espessura média (ym) da epiderme mais estrato córneo no tórax crasnial, tórax caudal e abdómem

Os filhotes TG/-Het apresentaram um aumento significativo na espessura da epiderme e uma diminuição significativa na espessura da camada córnea comparada com a ninhada de controlo (WT/HOM e WT/Het) e filhotes TG/- HOM produziu um resultado semelhante, mas com um efeito mínimo (Tabela 24).

Tabela 24 TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N=10) (N=10) (N=9) (N=4) Estrato córneo 32,58 41,05 31,31 30,83 Epiderme 33,26 21,41 42,54 40,31 Os resultados representam valores médios N= número de secções medidas 245

(d) Sinalização de IL-20, tanto através de IL-20RA como de IL-22RA A epiderme é um epitélio estratificado, que se renova continuamente dependente de um equilíbrio entre a proliferação celular, diferenciação e morte por homeostase. Na epiderme normal, uma camada basal mitótica activa dá origem terminal de diferenciação dos queratinócitos que migram para fora e acabam saindo da superfície da pele como escamas enucleadas, a camada de queratina ou camada córnea localizada no estrato córneo. Embora muitas proteínas, sejam conhecidas pela sua função na manutenção da homeostase epidérmica, a coordenação molecular destes eventos é mal compreendida. A IL-20 é uma nova interacção da proteína-receptor e assinala, quer através da IL20RA ou receptores de IL-22RA (IL-22RA), expresso numa camada de pele associada com a proliferação dos queratinócitos. Os recém-nascidos transgénicos IL-20 exibem um fenótipo anormal da pele espessa e brilhante. A deficiência de IL-22RAm (HOM) em ratos não mostrou nenhuma resposta ao tratamento com IL-22, enquanto os ratos de tipo selvagem com o gene IL-22RA e tratados com Eel-22 demonstraram aumento significativo na espessura da epiderme (P <0,001***, ver os resultados da análise de imagem histomorfométrica de IL-22RAm KO/IL-22, PID 59.2). Para investigar se a ausência de IL-22RA tem um efeito sobre o fenótipo brilhante observado nos recém-nascidos TG K14 IL-20M, ratos transgénicos expressando IL-20 ectópica foram acasaladas com IL-22RA homozigóticos (HOM) ou heterozigóticos IL-22RA (Het) deficientes. A análise de imagem quantitativa da espessura da epiderme foi previamente executada num menor número de filhotes no tórax caudal deste estudo (ou seja, 19 filhotes, uma secção por filhote, num total de 19 secções), mas não foi obtida significância estatística devido ao número limitado de animais estudados e à variação dentro dos grupos. O objetivo do presente estudo foi quantificar histomorfometricamente mais amostras da pele do tórax cranial, tórax caudal e abdómem de cada um filhote do mesmo estudo (ou seja, 34 filhotes, três filhotes por secção, para um total de 102 secções) para explorar a biologia da IL-20 e obter resultados quantitativos confiáveis. Para a 246 análise da imagem eficaz, temos a certeza de que a orientação da pele no bloco de parafina foi consistente, e as amostras de pele foram medidas a partir dos mesmos locais respectivos em todos os indivíduos e grupos de filhotes. Foram realizadas dois tipos de medidas: (1) A espessura da epiderme foi medida 10 vezes por campo microscópico de lOx em cada amostra de pele, cada uma no lado dorsal da medula espinhal, para investigar o papel da IL-20 na mediação da proliferação e diferenciação dos queratinócitos; (2) A espessura da camada córnea ou do estrato córneo foi medido da mesma forma para correlacionar os resultados com a aparência da pele brilhante nos recém-nascidos TG IL-20.

Análise histomorfométrica da imagem da espessura da epiderme revelou que os recém nascidos TG/-Het, expressando o transgene kl4 IL-20m num ambiente expressando alguma IL-22RA de uma cópia do gene IL-22RA exibido espessamento da epiderme e os recém nascidos TG/-HOM, expressando o transgene kl4 IL-20m num ambiente fundo não expressando IL-22RA não tiveram alteração significativa. A espessura da epiderme aumentou significativamente em filhotes transgénicos IL-20 sem uma cópia do gene IL-22RA (TG/-Het) versus os 6 filhotes transgénicos IL-20 sem ambas as cópias dos genes IL-22RA (TG/-HOM, P = 0,001***) e versus os filhotes de controlo (WT/HOM, P = 0,001*** e WT/Het, P = 0,001***). Os filhotes TG/-Het mostraram aumento da espessura da epiderme não-queratinizada, principalmente devido à hipertrofia dos queratinócitos da camada espinhosa. A epiderme dos filhotes TG/-Het aumentou cerca de 25% na espessura, enquanto a epiderme dos filhotes TG/-HOM foi apenas um pouco mais grossa, aumentando cerca de 4-5%, do que a dos controlos (WT/HOM e WT/Het) e estatísticas não indicaram nenhuma diferença significativa entre os TG/-HOM e o seu controlo WT/HOM (P> 0,05).

Os resultados histomorfométricos do estrato córneo mostraram que, apesar do espessamento da epiderme nos recém nascidos TG/-Het, predomina a redução da espessura da camada de queratina ou camada cónea observada nas peles 247 TG/-HOM e TG/-Het em relação aos recém nascidos de controlo (WT/HOM e WT/Het) e as estatísticas indicam extrema significância entre os grupos (P <0,0001****). Os filhotes TG/-Het mostraram cerca de 36%, 50% e 49% de diminuição da quantidade de queratina na superfície da epiderme em relação ao TG/-HOM (P <0,01**), WT/HOM (P <0,001***) e WT/Het (P <0,001***), respectivamente. Os filhotes TG/-HOM mostraram cerca de 22% de redução significativa da espessura da camada córnea em relação ao seu controlo (WT/HOM, P <0,05*) e 17% de redução apenas em relação ao WT/Het (P> 0,05). A espessura do estrato córneo nos filhotes de controlo, WT/HOM e WT/Het foi praticamente a mesma. A redução da espessura média do estrato córneo em recém nascidos TG/-HOM e TG/-Het pareceu correlacionar o achado em bruto, no qual, a nível bruto os recém nascidos IL-20 (TG)/>Z-22RA (Het)parecem ter reduzido o brilho (por exemplo, com menos queratina), chamado de lustro, enquanto que os recém-nascidos IL-20 (TG)/IL-22RA (HOM) não brilhavam (por exemplo, com mais queratina). Histologicamente, a queratina no estrato córneo nos filhotes TG/- parece ser mais compacta do que nos filhotes WT. Juntos, o espessamento da epiderme associada com queratinócitos hipertróficos e a fina camada de estrato córneo dos recém-nascidos transgénicos IL-20 poderiam explicar por que o fenótipo apresenta pele brilhante.

Foi observada hipertrofia aumentada e diferenciação terminal dos queratinócitos perturbada nos recém nascidos transgénicos IL-20 com um nocaute orientado de uma cópia do gene IL-22RA (Het). A pele apresentou hipertrofia nos queratinócitos, mas não totalmente diferenciada, ou falta de queratina do estrato córneo. Os recém nascidos transgénicos IL-20 com o rompimento de duas cópias dos genes IL-22RA (HOM) apresentaram um fenótipo que se assemelhava ao da pele TG/-Het mas mostrou mínimo ou menor efeito (Figura 12-15) . Parece que a ausência de IL-22RA (HOM) tem um efeito parcial sobre o fenótipo brilhante observado nos recém nascidos K14 TG IL-20m e na ausência de IL-22RA (Het) tem mínimo ou nenhum efeito sobre o fenótipo brilhante. Em outras palavras, a sinalização de IL-20, uma nova proteína que interage com o receptor que assinala quer através de IL-20RA ou do receptor IL-22RA (IL-22RA) é 248 provavelmente não obstruída por expressão deficiente de uma cópia do gene IL-22RA (Het), mas é parcialmente obstruída por expressão deficiente das duas cópias do gene IL-22RA (HOM).

Esses resultados evidenciam que a actividade que efectivamente bloqueia IL-22RA, por exemplo através de um nocaute do gene IL-22RA ou semelhante através de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-22RA da presente invenção, que da mesma forma reduz os efeitos na pele induzidos por IL-20, bem como os efeitos na pele induzida por IL-22, por exemplo, a psoríase, a IBD, a colite, ou outras doenças inflamatórias induzidas pela IL-20, e/ou IL-22.

Exemplo 34

Efeito da IL-22 em ratos nocaute IL-22RA

Trinta e seis ratos, incluindo 23 IL-22RA KO (HOM) e 13 controlos (WT) foram tratados com IL-22 ou PBS por via subcutânea, através de um implante de uma mini-bomba com tubo ou apenas por uma mini-bomba (Tabela 25):

Tabela 25 HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22 (Grupo 1) (Grupo 2) (Grupo 3) (Grupo 4) Macho n=3 n=10 n=3 n=8 Fêmea n=0 O 1—1 II C n=0 n=2 Total n=3 m=20 n=3 n=10

Amostra de pele, l,5-2,5cm de comprimento e 4,0-5,0 mm de espessura, a partir do sítio da bomba de cada animal foi obtida por exame histológico de rotina e análise de imagem histomorfométrica. Todas as amostras de tecido foram 249 fixadas em 10% de formol tamponado neutro e processadas em blocos de parafina. Seis secções segmentares, 5um de espessura e lOum de intervalo entre as secções adjacentes, com o epitélio cobrindo toda a superfície, a partir de cada amostra de pele por animal foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E). A análise histomorfométrica da imagem das amostras de pele foi realizada usando um microscópio Olympus BH-2, uma câmera de vídeo (Dage-MTI, Michigan City, IN) e software BIOQUANT True Color Windows 98 (R&M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209), com as seguintes condições: Parâmetro: mag. 10X, Z off-set 0; Matriz; comprimento (um); Medida: modo manual e aditivo. A espessura (um) da epiderme foi medida cinco vezes em cada campo microscópico de lOx de um total de 4 campos capturados a partir do centro de 0,4 cm de cada secção da pele (por exemplo, um campo do microscópio de lOx = 0,1 cm e quatro campos microscópicos de lOx = 0,4 cm). Um total de 6 secções de cada animal foram medidas e o valor médio, SD e MEV foram obtidos através de cálculos Excel. Todas as secções foram escolhidos aleatoriamente e medidas de forma cega. Após a medida, as secções foram reagrupadas, e os resultados encontrados para os grupos de tratamento. Os resultados finais por grupo de tratamento foram classificados como segue: 1. Espessura epidermal de ratos machos e fêmeas HOM e WT. 2. Espessura epidermal de ratos machos HOM e WT. Os dados obtidos foram analisados utilizando o software GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA 92121). Uma forma de análise de variância (ANOVA) foi aplicada para analisar a significância estatística das diferenças dos valores médios do grupo 1 ao grupo 4. O teste de comparações múltiplas Tukey-Kramer e o teste T-não pareado foi aplicado para analisar o significado dos valores médios entre os dois grupos. Observações de P <0,05 foram consideradas significativas. 250

III. Resultados histomorfométricos (1) espessura da epiderme (μτη) de ratos machos e fêmeas hom e WT A espessura da epiderme aumentou significativamente nas peles dos ratos WT tratados com IL-22 (WT/IL-22) versus os de controlos WT/PBS (P = 0,0001) . A pele de rato 22RAm KO tratada com IL-IL-22 (HOM/IL-22) apresentou aumento do valor médio da espessura da epiderme em comparação com os dos controlos HOM/PBS, porém as estatísticas não indicaram nenhuma diferença significativa entre os dois grupos (P> 0,05). Foi observada redução da espessura da epiderme predominante nos ratos IL-22RA KO comparada com os ratos WT (por exemplo, HOM/IL-22 vs WT/IL-22: P <0,001) (Tabela 26).

Tabela 26 HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22 (N=3) (N=19) (N=3) (N=10) Média 14,15+0,19 19,01+1,03 23,34+5,49 43,08+1,85 Os de resultados representam valores secções medidas médios + SEM. N= número

(2) Espessura da epiderme (um) de ratos machos HOM e WT A espessura da epiderme aumentou cerca de duas vezes na pele dos ratos machos WT tratados com IL-22 (WT/IL-22) quando comparado com os machos de controlo WT/PBS (P = 0,0001), porém, a epiderme dos ratos machos IL-22RAm KO tratados com IL-22 (HOM/IL-22) só mostrou um ligeiro aumento em comparação com os machos de controlo HOM/PBS (P> 0,05). Visivelmente, os ratos IL-22RAm KO apresentaram acentuada redução da espessura da epiderme, quando comparados com seu controlo, os ratos machos WT (por exemplo, HOM/PBS VS WT/PBS: P <0,05; HOM/IL-22 VS WT/IL.-22: P <0,001) (Tabela 27) . 251

Tabela 27 HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22 (N=3) (N=9) (N=3) (N=8) Média 14,15+0,19 15,86+0,75 23,34+5,49 41,41+1,71 Os resultados representam valores médios ± SEM. (3) Espessura da epiderme (um) de ratos HOM e WT, machos versus fêmeas A epiderme dos ratos fêmeas foi encontrada ser mais espessa que a dos ratos machos (por exemplo, HOM/IL-22/macho VS HOM/IL-22/fêmea: P <0,01; WT/IL-22/macho VS WT/IL-22/ fêmea: P <0,05) (Tabela 28).

Tabela 28 HOM/IL-22 HOM/IL-22 WT/IL-22 WT/IL-22 (Macho N=9) (Fêmea N=10) (Macho N=8) (Fêmea N=2) Média 15,68+0,75 21,85+0,1,3 41,41+1,71 49,75+4,82 Os resultados representam valores médios + SEM. (4) Espessura da epiderme (mm) de ratos HOM, bomba de IL-22 vs bomba IL-22 com tubo A epiderme de ratos IL-22RAm KO (HOM) com bomba de IL-22 e tubo era significativamente mais espessa do que a dos ratos IL-22RAm KO (HOM) apenas com bomba (P <0,0001, por teste T-não pareado) (Tabela 29) . 252

Tabela 29 HOM w/bomba de IL-22 HOM w/bomba de IL-22 com tubo (M=8, F=2 N=10) (M=2, F=8 N=10) Média 15,85+0,65 23,30+1,36 Os resultados representam valores médios + SEM. M: macho; F: fêmea; N: número total de ratos IV. Discussão:

Tomado em conjunto, o objectivo deste estudo é caracterizar os efeitos da epiderme de peles tratadas com IL-22 de ratos IL-22RAm KO e WT e relacionar esses achados com as indicações clinicas. A análise de imagem quantitativa foi realizada para determinar a espessura da epiderme em secções da pele manchada H&E. As amostras de pele de cada animal foram medidas histomorfometricamente 120 vezes (ou seja, 20 vezes/cada secção X 6 secções segmentares de cada rato = 120 medições) e a espessura média da epiderme foi obtida através de cálculos Excel. O estudo histomorfométrico demonstrou que a IL-22 resultou em aumento significativo na espessura da epiderme, especialmente nos ratos WT com a presença do receptor IL-22RA (P <0,0001 por ANOVA, considerado extremamente significativo) e apresentou efeitos menores ou mínimos sobre os ratos IL-22RAm KO, com ausência do receptor IL-22RA (P> 0,05) . A espessura da epiderme nos ratos WT tratados com IL-22 aumentou cerca de 43% do que na dos tratados com PBS (por exemplo, WT/PBS, P <0,001), enquanto na dos ratos IL-22RAm KO (HOM) tratados com a IL-22 mostrou somente 26 % de aumento na espessura da epiderme em relação ao de controlo (HOM/PBS, P> 0,05). Os ratos IL-22RAm KO apresentaram epiderme mais fina quando comparada com os ratos WT (P <0,001). Em geral, os efeitos biológicos da IL-22 na pele dos ratos sugere que este factor pode estar envolvido na regulação da proliferação e crescimento epidérmico. 253

Exemplo 35

Farmacocinética de um anticorpo monoclonal anti-humano IL-20 (clone #262.7.1.3.2.4) 0 anticorpo monoclonal anti-humano IL-20 mAb de teste (clone #262.7.1.3.2.4) foi fornecido em aliquotas de 3x 3 mL com uma concentração de 1,08 mg/mL (determinada por absorbância UV a 280 nm) e foi armazenado a -80°C até ao seu uso. O veiculo foi IX PBS (50mM NaP04, 109mM NaCl), pH 7,3. O mAb foi descongelado à temperatura ambiente antes de usar e as aliquotas 1 e 2 foram utilizadas como fornecidas para os grupos de dose de 100 yg IV e SC, respectivamente. Metade da aliquota 3 foi diluída 1:02 em IX PBS para o grupo de dose de 50 yg SC e a segunda metade da aliquota 3 foi diluída 1:10 em IX PBS para o grupo da dose de 10 yg SC. As fêmeas de ratos SCID (n = 96), foram recebidas de Charles River Labs. Foi verificada a saúde dos animais à chegada e alojados em grupo, (3 animais por gaiola) . Os ratos tinham 12 semanas de idade com peso médio de 22 g no início do estudo. A. Protocolo de Dosagem

As fêmeas de ratos SCID (n = 24/dose grupo) foram aleatoriamente divididas em quatro grupos de dosagem (ver Tabela 30). Ao Grupo 1 foi administrado o anti-huIL-20 mAb via injecção IV de cerca de 93 yL numa veia da cauda e aos Grupos 2, 3 e 4 foram administrados o mAb via injecção SC de cerca de 93 yL na prega do pescoço. B. Reclha de amostras

Antes da colecta de sangue, os ratos foram totalmente anestesiados com halotano ou isoflurano. As amostras de 254 sangue foram colectadas através de bastão cardíaco em todos os momentos, excepto o momento das 168 hr (recolhido através dos sangramento dos olhos e os mesmos animais foram sangrados novamente no momento das 504 hr via bastão cardíaco) . O sangue foi colectado em tubos de separação do soro e deixados coagular por 15 minutos. As amostras foram posteriormente centrifugadas por 3 minutos a 14000 rpm. Após a centrifugação, alíquotas de 125-150uL foram dispensadas em tubos Eppendorf rotuladas e imediatamente armazenadas a -80°C até à análise (Tabela 30).

Tabela 30

Grupo # Dose (ROA) Animais Momentos PK 1 100 yg/(IV) 3 ratos/momento* 0,25, 1,4,8,24,72,168, 336 e 504 hr 2 100 yg/(SC) 3 ratos/momento* 0,25, 1,4,8,24,72,168, 336 e 504 hr 3 50 yg/(SC) 3 ratos/momento* 0,25, 1,4,8,24,72,168, 336 e 504 hr 4 10 yg/(SC) 3 ratos/momento* 0,25, 1,4,8,24,72,168, 336 e 504 hr * Os mesmos animais foram usados para os momentos de 168 e 504 hr.

C. Quantificação das concentrações de soro anti-huIL-20 mAb por ELISA

Um ensaio Enzyme Linked Immunosorbant (ELISA) foi desenvolvido e qualificado para analisar amostras de soro de rato de animais tratados com anti-IL-20 mAb 267.7.1.3.2.4 durante os estudos farmacocinéticos. Este ensaio foi concebido para tirar partido de um anticorpo secundário disponível comercialmente e detecção colorimétrica utilizando TMB. As diluições utilizadas para a curva padrão foram modificadas para melhorar a definição da porção linear da curva padrão. Uma curva padrão na faixa de 100 ng/mL a 0,231 ng/mL, com diluições de 2 vezes permitidas para a quantificação das amostras de soro de rato. As amostras de CQ foram diluídas a 1:100, 1:1000 e 1:10000 em 10% de soro de ratos SCID e voltaram a ser calculados a partir da curva padrão. 255 D. Análise farmacocinética A concentração sérica de dados versus o tempo foi transferida para o software WinNonlin Professional 4.0 (Pharsight, Inc., Cary, NC) para a análise farmacocinética. A análise não-compartimental foi utilizada para determinar os parâmetros farmacocinéticos com base na média dos dados em cada momento. E. Resultados

As concentrações médias do soro anti-humano IL-20 mAb após a administração de 100 yg IV e 100, 50 e 10 yg SC são apresentados na Tabela 31:

Tabela 31

Tempo (hr) 100 pg IV Cone (ug/mL) 10 pg SC Cone (pg/mL) 50 pg SC Cone (pg/mL) 100 pg SC Cone (pg/mL) 0,25 196 (12) LTR 0.101 (0,065) 0,481 (0,485) 1 154 (18) 0,356 (0,146) 1,61 (0,52) 3,48 (1,72) 4 118 (20) 2, 42 (0,53) 10,4 (3,4) 19,7 (4,7) 8 112 (20) 3,41 (0,30) 18,9 (3,6) 40,2 (6,4) 24 103 (13) 4,95 (0,05) 26,3 (0,7) 50,1 (6,2) 72 101 (16) 4,27 (0,79) 21,0 (3,4) 43,4 (2,7) 168 45,6 (15,4) 2, 92 (0,53) 19,6 (2,7) 37,6 (3,4) 336 36,4 (16,6) 3,60 (0,31) 23,5 (3,5) 34,4 (5,8) 504 28,8 (3,8) 2, 74 (0,39) 20,5 (3,6) 25,7 (2,1) LTR: menos que reportável 256

Após a administração IV, a concentração de mAb versus perfil de tempo demonstrou um declínio biexponencial. Após a administração SC, o mAb parecia ter uma fase de absorção lenta, com a eliminação da taxa de absorção limitada. Os parâmetros farmacocinéticos do soro com base na média dos dados em cada momento são apresentados na Tabela 32:

Tabela 32

Parâmetro Unidades 100 pg IV 10 pg SC 50 pg SC 100 pg SC Co (IV); Cmax (SC) pg/mL 212 4,95 26,3 50,1 Tmax hr N/A 24 24 24 tl/2, λζ hr 509 ND ND 612 AUC (o-t) hr*pg/mL 27059 1730 10845 18110 AUC (0-inf) hr*pg/mL 48269 ND ND 41561 AUC(% extrapolada) o O 43,9 ND ND 56,4 Vgs (IV); Vz/F (SC) mL 1,34 ND ND 2,12 Cl (IV); Cl/F (SC) mL/hr 0,002 ND ND 0,002 (F)biodisponibilidade o O N/A ND ND 86,1 ND: não determinável devido a falta de dados na fase de eliminação terminal da concentração versus o perfil de tempo

Após a administração IV, o mAb demonstrou uma muito baixa libertação (IC = 0.002 mL/h) e longa meia-vida de eliminação (ti/2,Àz = 21 dias) . O mAb demonstrou um volume de estado estacionário de distribuição (Vss = 1,3 mL), que é menor que o volume de sangue num rato («1,7 mL), sugerindo que o mAb não distribuiu substancialmente para fora do compartimento vascular. A concentração máxima de cálculo de retorno (Co> foi maior do que o esperado com base na dose injectada e do volume de sangue no rato. Isto, junto com o Vss pequeno, sugere que o mAb pode ser limitado, em grande medida, na fracção do soro do sangue.

Após a administração SC, os valores Cmax aumentaram linearmente com a dose. Na dose de 100 pg SC, o mAb teve uma ti/2, λζ de cerca de 25 dias com libertação e um volume de distribuição aparentemente semelhante ao que da administração IV seguinte. A biodisponibilidade é de 86%. 257

Na parte inferior das duas doses SC, a maioria dos parâmetros farmacocinéticos não pôde ser estimado devido à falta de uma fase de eliminação terminal mensurável, embora as amostras fossem retiradas às 504 horas. A absorção do mAb após administração SC parece atingir um estado estacionário com a eliminação durante todo o período do estudo.

Exemplo 36

Antagonistas IL-20 e IL-22 em CD4+CD45RBhl (CD25~) em modelos de colite e psoríase A. Sumário A transferência de células CD4+ CD45RBhl ou CD4+CD25-T em ratos SCID singénicos resultou em colite. A co-transferência de células T reguladoras (CD4+CD25+ ou CD4+ CD45RB10) inibe esta colite. Após a transferência de células CD4+CD25-T em ratos, se os ratos são adicionalmente injectados com enterotoxina estafilocócica B (SEB), os ratos não só desenvolveram colite, mas também a psoríase. Anticorpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL20R e/ou IL-22R, ou receptores solúveis de IL-22RA são administrados a partir de 0-21 dias após a transferência de células e os sintomas da colite e psoríase são monitorizados. A inibição da pontuação psoriática ou colite (histologia) indica que a IL-21 pode inibir estas doenças auto-imunes. B. Projecto de Estudo

Baço e linfonodos inguinais são isolados de ratos B10.D2. São formadas suspensões de células individuais e contadas. Usando o sistema Bead Miltenyi, as células CD25+ são classificadas por selecção positiva. As células são marcadas com CD25-PE (BD PharMingen) na diluição 1:100 e 258 incubadas por 15 minutos. 0 excesso de anticorpo é lavado e as células são incubadas em lOul de anti-PE contas/106 células por 20 minutos. As células são lavadas com PBS e passadas por uma coluna LS (Miltenyi Biotech). As células que passaram através da coluna (CD25-) são retidas para posterior análise. É adicionado um coquetel de enriquecimento de CD4 (Stem Cell Technologies) (1:100) a estas células CD25- e incubadas por 15 minutos. As células são lavadas com PBS. A diluição de 1:10 de anti-tetrâmero biotina é adicionada às células durante 15 minutos, seguida de um colóide magnético (60ul/106 células) por 15 minutos (todos da Stem Cell Technologies). As células são passadas através de uma coluna de selecção negativa (0,5", Stem Cell Technologies). As células que passaram são as células CD4+CD25. A pureza é analisada por citometria de fluxo. 0,4 X 106 células são injectadas i.v. em ratos CB-17 SCID num volume total de 200 □ 1. Os ratos são injectados i.p. com 10 g de SEB no dia seguinte (dl) . Os sintomas para a psoriase e colite são seguidos 2-5 semanas. Os ratos são marcados para a doença psoriática sob os seguintes critérios. 0-sem lesões, 1-lesões leves no pescoço, 2-lesões graves no pescoço e nas costas (tronco) 3- lesões muito graves no pescoço, costas e barriga. O espessamento da orelha também é medido como uma medida de gravidade da doença. Grupos de ratos são injetados i.p. com PBS, 100 g de anticorpo de controlo ou 10-100 g de anticorpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL-20R ou IL-22R, ou IL-22RA solúvel do dia 1-30 em regime de administração diferente (3x/semana ou 2x/semana). C. Resultados e Conclusão A inibição da psoriase e sintomas de colite em ratos tratados com anticorpos indica que a inibição da IL-20 e/ou função de IL-22 pode inibir os sintomas auto-imunes neste modelo para a psoriase e a colite. 259

Exemplo 37

Antagonistas IL-20 e IL-22 em modelo de transplante de psoríase SCiD-hu A pele humana psoriática enxertada em ratos SCID pode manter as suas características psoriáticas clínicas, em microscopia de luz, e immunohistoquímicas por várias semanas. Este modelo oferece um sistema de avaliação de terapias destinadas a restaurar o tecido lesionai a um fenótipo normal. Uma vez a pele humana enxertada com sucesso, os anticorpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL-20R e/ou IL-22R, ou IL-20 solúvel ou receptores de IL-22 podem ser administrados por várias semanas, e a espessura da epiderme pode ser analisada para avaliar o efeito desses antagonistas na psoríase. B. Concepção do estudo São obtidas biópsias por punção de 6 mm de espessura completa constituídas por toda a epiderme e vários mm de derme de voluntários adultos saudáveis e peles lesionais psoriáticas. Quatro a seis biópsias são obtidas a partir de cada doador. Uma biópsia por punção de cada doador é transplantada para a superfície dorsal do destinatário rato SCID (CB-17, Taconic). Os animais são mantidos num ambiente livre de patógenos. 0 tratamento é iniciado após um enxerto bem sucedido (2-3 semanas após o transplante) da seguinte forma: uma biópsia para o controlo negativo (PBS ou isotipo mAb), uma biópsia para o controlo positivo (ciclosporina A), 2-3 e biópsias para o tratamento com IL-22RA anti-humana, IL-20anti-humana, IL-22 mAb anti-humana ou receptores solúveis de IL-20 ou IL-22 (via intraperitoneal, três vezes por semana durante 2-4 semanas numa programação M-W-F). 260 C, Análise quantitativa:

As observações clínicas e as avaliações serão feitas regularmente durante toda a experiência e serão gravadas. A gravidade das lesões de psoríase é avaliada para escamosidade, endurecimento e eritema de forma cega. Os parâmetros podem ser marcados através da escala de três pontos: 0 = ausência completa de envolvimento cutâneo, 1 = envolvimento ligeiro, 2 = envolvimento moderado, 3 = envolvimento grave. No final do período de administração de cada animal é sacrificado e os tecidos são recolhidos para histologia e IHQ. (1) parte do tecido é fixado em 10% formol e corado com hematoxilina e eosina. A área da epiderme é medida em função de alterações na espessura da epiderme, por unidade de comprimento, utilizando software NIH Image. Várias áreas de cada transplante são quantificadas para fornecer um valor n elevado e área média da epiderme. (2) o número de células inflamatórias mononucleares por campo de grande aumento (0,103 x 0,135 mm) na derme superior; (3) o grau de paraqueratose é avaliado numa escala arbitrária de 0 a 3, onde 0 é sem paraceratose, 1 é uma paraqueratose em menos de um terço da secção, 2 é uma paraqueratose em mais de um terço, mas menos de dois terços da secção, e 3 é uma paraqueratose em mais de dois terços da secção. (4) O tecido restante será manchado para Ki67 (marcador de proliferação de queratinócitos) , para avaliar o número de queratinócitos cíclicos Ki67 por milímetro de comprimento da secção. A redução da gravidade da psoríase medida pela espessura da epiderme indica que a neutralização da IL-20 e da função IL-22 pode ser efectiva no modelo de psoríase. Para quantificar a redução da gravidade da psoríase, podemos medir a espessura da epiderme, o número de células inflamatórias na derme superior, o número de queratinócitos cíclicos Ki67, e os graus de paraqueratose. A redução significata para os quatro parâmetros para os grupos tratados em comparação aos ratos de controlo, indicam o uso potencial terapêutico da IL-20, e antagonistas da IL-22. 261

Exemplo 38

Seleção para actividade antagonista de IL-20 IL utilizando células BaF3/iL-22RA/iL-2QRB usando um Ensaio de Prolioferação Alamar Blue 0 factor dependente da linha pré-célula B BaF3 foi co-transfectado com IL-22RA e IL-20RB (v., método no Exemplo 3) e tratado com IL-20 em diferentes concentrações. A Proliferação foi avaliada utilizando um ensaio Alamar Blue, como descrito no Exemplo 3. A IL-20 estimulou a proliferação de uma forma dependente da dose em concentrações esperadas para uma citocina, demonstrando que a IL-20 se liga e activa o receptor IL-22RA/IL-20RB heterodimérico em concentrações esperadas para uma citocina. Os controlos negativos contendo BaF3 não-transfectadas não proliferaram. A fim de determinar se os anticorpos anti-IL-22RA são capazes de antagonizar a actividade da IL-20, o ensaio acima descrito é realizado utilizando os anticorpos anti-IL-22RA como um antagonista para a actividade da IL-20. Quando a IL-20 é combinada com o antagonista, a resposta à IL-20 é "trazida para níveis de fundo". Que a presença de um antagonista que elimina ou reduz os efeitos proliferativos da IL-20, demonstra que é um antagonista do receptor do ligante da IL -20. Este ensaio pode ser usado para testar outros antagonistas da actividade da IL-20, aqui descritos, tais como os polipeptídeos antagonistas compreendendo um receptor solúvel da IL-22RA. 262

Exemplo 39

Neutralização de IL-20 e actividade da IL-22 por anticorpo monoclonal anti-huL22RA

Utilizando o teste de neutralização, baseado em células descrito no Exemplo 28, um rato purificado de anticorpos monoclonais anti-huIL-22RA (Exemplo 30 (D)) foi adicionado como uma diluição em série, por exemplo, a lOug/ml, 5ug/ml, 2,5ug/ml, l,25ug/ml, 625ng/ml, 313ng/ml, 156ng/ml e 78ng/ml. As placas de ensaio foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 4 dias ao fim dos quais o Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) foi adicionado a 20D/poço. As placas foram novamente incubadas a 37°C, 5% de C02 durante 16 horas. Os resultados mostraram que o anticorpo monoclonal purificado anti-huIL-22RA poderia neutralizar a sinalização de ambas as huIL-22 e huIL-20 através de huIL-22RA. Na concentração de lOug/ml, o anticorpo neutralizou totalmente a proliferalção induzida por huIL-22 ou huIL-20, com a inibição da proliferação decrescente de maneira dependente da dose nas concentrações mais baixas. Um isotipo de correspondência mAb rato de controlo negativo, testado nas concentrações acima descritas, desde que não haja inibição da proliferação ou de uma citocina. Estes resultados demonstram ainda que os anticorpos monoclonais de IL-22RA poderiam certamente antagonizar a actividade dos ligantes pró-inflamatórios, IL-20 e IL-22 em baixas concentrações.

Estes resultados forneceram evidências adicionais de que a actividade que efectivamente bloqueia IL-22RA, por exemplo, através de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-22RA da presente invenção, pode ser vantajosa em bloquear, inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar os efeitos da IL-20 e IL -22 (isoladamente ou em conjunto) in vivo e, talvez, reduzir a IL-20 e/ou a inflamação induzida pela IL-22, como foi visto nos efeitos da pele induzidos por IL-20, bem como os efeitos da pele induzidos por IL-22, para exemplo, a psoriase, a IBD, a colite, ou outras doenças inflamatórias induzidas pela IL-20, e/ou IL-22, incluindo 263 IBD, artrite, asma, artrite psoriática, colite, condições inflamatórias da pele e dermatite atópica.

Exemplo 40

Tratamento de gestantes de ratos transgénicos IL-20 e IL-22 com anticorpo monoclonal neutralizante anti-IL-22RA

Para testar o anticorpo monoclonal (mAb) rato anti-rato IL-22RA para a actividade neutralizante in vivo, ratas transgénicas grávidas IL-20 (Tg) e IL-22 Tg são injectadas intraperitonealmente com anti-rato IL-22RA mAb. Os filhotes recém-nascidos são então avaliados quanto à presença ou ausência do fenótipo de pele "brilhante", que normalmente caracteriza esses tipos de ratos.

Especificamente, ratos machos IL-20 Tg (que são gerados usando a queratina-14) ou IL-22 Tg (com o promotor de insulina) são criados para fêmeas C57BL/6N em estral e as fêmeas são identificados pela presença de uma coagulação vaginal no dia seguinte. Cada fêmea grávida é retirada para uma gaiola separada e monitorizadas diariamente. Os grupos de tratamento incluem, pelo menos, quatro fêmeas grávidas cada, para permitir uma análise estatisticamente significativa de filhotes Tg e não Tg. Com base na experiência prévia com estes ratos Tg, uma ninhada geralmente varia entre cerca de 6-8 filhotes por ninhada, sendo que entre 2 e 3 são Tg+.

Sete a nove dias depois dos ratos serem criados (idade embrionária 7-9; e 7-9), as fêmeas são injectadas intraperitonealmente com 250-500ug do rato anti-mouse IL-22RA mAb (isotipo rato IgG2a) num volume de 200-250ul de PBS. São utilizadas agulhas curtas num ângulo de injecção superficial para evitar injectar directamente no útero. As fêmeas grávidas são injectadas desta forma três dias por 264 semana (segunda, quarta e sexta-feira) para duas semanas (até o nascimento) para acessar com êxito os embriões em desenvolvimento. Os grupos de controlo (não inferior a quatro ratos fêmeas grávidas cada) incluem o seguinte: controlo de isotipo rato IgG2a mAb, anti-humano/rato IL-22 mAb (isotipo rato IgGl), e um rato de controlo isotipico IgGl mAb. Como controlo para a neutralização de IL-20 murina, as fêmeas grávidas são injectadas com uma proteina de fusão solúvel IL-20R-FC4 que pode ligar e neutralizar IL-20 humana e murina ou uma proteina de controlo Fc4 .

Dos dias 1 e 2 após o nascimento, os filhotes são acompanhados de perto para o aparecimento do fenótipo de pele brilhante. No dia 2, os filhotes são sacrificados e uma parte da cauda é colectada para isolamento de ADN para determinar o genótipo (Tg ou não Tg) de cada filhote. Amostras de pele são colectadas para análise histológica, a fim de avaliar se os filhotes apresentam o espessamento da camada de células epidérmicas, que geralmente caracteriza esses ratos Tg. 0 tronco de sangue também é recolhido a partir dos filhotes (e o sagramento ocular das mães um dia após o nascimento) para quantificar, através de ELISA, os niveis de anti-IL-22RA mAb no soro de cada rato. Porque estes mAbs são potentes inibidores de IL-20 e/ou IL-22 in vivo, os filhotes Tg tem a pele normal (ou seja, sem espessamento da epiderme ou aparência "brilhante").

Exemplo 41

Antagonistas de IL-20 e IL-22 no modelo de cultura do órgão da psoríase A placa de pele humana psoriática pode ser mantida em cultura de órgão, e as características histológicas anormais da pele lesionai são mantidas na ausência de factores de crescimento exógenos. Anticorpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL20R e/ou IL-22R, ou IL-20 solúvel ou receptores de IL-22 podem ser administrados, e as 265 características histológicas da pele psoriática lesionai podem ser melhoradas. B. Concepção do estudo

Biópsias por punção de 2 mm de espessura total constituídas por toda a epiderme e vários mm de derme são obtidas a partir de qualquer voluntário adulto saudáveis ou com pele com lesão psoriática. Imediatamente após a biópsia, o tecido é imerso em meio de cultura consistindo em Meio Basal de Queratinócitos (KBM) (Clonetics Inc, Walkersville, MD) . 0 meio de cultura é suplementado com CaC12 para trazer a concentração de Ca2+ final para 1,4 mM (Varani et al, 1993, 1994) . As biópsias são, então, incubadas em poços numa placa de 96 poços contendo 200 ul de Ca2+ suplementado KBM com ou sem tratamentos adicionais de anticorpos contra IL-20, IL-22, IL-22RA humana, ou receptores solúveis de IL-20 ou IL-22. As culturas são incubadas a 37°C numa atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2 por 8 dias. C, Análise quantitativa:

No final do período de incubação, o tecido é fixado em 10% de formol e examinado histologicamente após coloração com hematoxilina e eosina. A aparência do tecido psoriática exposto aos anticorpos ou receptores solúveis poderia ser mais parecida com a de tecidos normais, incluindo a seguinte observação: as células basais epiteliais inicialmente desorganizadas, de formato irregular, desenvolveram uma aparência mais colunar com polaridade restaurada; as cristãs epiteliais epidérmicas regrediram, com poucas áreas de expansão de células epiteliais no espaço dérmico; e houve menor degeneração geral das camadas superiores da epiderme. O modelo de cultura de órgãos, fornece um meio rápido e sensível para determinar se um 266 determinado composto tem potencial como agente anti-hiperproliferativo. A caracteristica histológica anormal pode ser amenizada com a presença de IL-20, antagonista de IL-22, sugerindo a eficácia desse agente no tratamento da psoriase.

Exemplo 42

Mapeamento de regiões de ligação miL22RA (zCytoRllm)a mAbs neutralizantes R2.1.5F4.1 e R2.1.15E2.1 A. Epítopos em IL-22RA murina onde os anticorpos monoclonais neutralizantes se ligam.

As experiências descritas abaixo foram destinadas à identificação de uma região ou regiões da sequência de aminoácidos da proteína do receptor solúvel IL-22RA murino (SEQ ID NO: 62) que foram importantes para a actividade do receptor, ou antagonista, ou anticorpos neutralizantes de ligação. A proteína murina IL-22RA-Fc, que anteriormente era clivada com trombina para remover o Fc, foi então clivada em C-terminal para os resíduos de metionina na sequência de incubação com brometo de cianogénio (CNBr). Os peptídeos CNBr gerados foram fraccionados e as frações foram testadas para actividade de ligação, como detectado por ELISA e reactividade pela análise Western utilizando anticorpos monoclonais com propriedades neutralizantes, clones R2.1.5F4.1 e R2.1.15E2.1.

Após a clivagem com CNBr, os seguintes peptídeos foram potencialmente gerados a partir da não-redução do comprimento total mIL-22RA (Tabela 33). Sob condições não-redutoras, as cisteínas são ligadas por dissulfeto, o que pode resultar numa ligação interna num peptídeo e uma ligação entre os peptídeos 3 e 5. Os resíduos a negrito estão potencialmente envolvidos na ligação do ligante que correspondem aos resíduos IL-22RA humana potencialmente envolvidos na ligação do ligante na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID 267 NO: 3, conforme descrito no Exemplo 42B. Especificamente, a SEQ ID NO: 48 corresponde a resíduos de aminoácidos 16 (His) a 83 (Met) da SEQ ID NO: 42; a SEQ ID NO: 49 corresponde a resíduos de aminoácidos 84 (Glu) a 109 (Met) da SEQ ID NO: 42; a SEQ ID NO: 50 corresponde a resíduos de aminoácidos 110 (Thr) a 137 (Met) da NO SEQ: 42; a SEQ ID NO: 51 corresponde a resíduos de aminoácidos 138 (Leu) a 177 (Met) da SEQ ID NO: 42; e a SEQ ID NO: 52 corresponde a resíduos de aminoácidos 163 (His) a 208 (Pro) da SEQ ID NO: 42, ou 163 (His) a 212 (Arg) de SEQ ID NO: 62.

Tabela 33 Número de peptídeo De Para Sequência Peptídeo CNBr 1 1 68 BTTVBTSGLLQHVK!:QSSNI^Nn;TiVD€GP ASTSBWYSVEYKK¥GERKWLAKACCQR1 TQKFQNLTM (SEQ IDNO; 48) não reduzido: as cisternas no peptídeo 1 são ligadas Peptídeo 2 CNBr 69 94 gTRNHTEFYYAKVTAVSAGSPPVIKM (SEQ Ό mm Peptídeo 3 CNBr 95 122 TDRfSSLQBTTji^PDmaPKVHSiqy (SEQ ID NO: 50} não reduzido: os peptídeos 3-5 são ligados Peptídeo 4 CNBr 123 162 LVHFTLTPVLSEBGHQtTÍJHFfffijíJFYRLE LHVNHTYQM (SEODNG; 51) Peptídeo 5 CNBr 163 212 fEJEGKQReYER.GiJFDTEHGSnilJPflJ KESAPYV£RVK1LPLVPR {SEQ m HO: 52) 1. Clivagem CNBr e isolamento de frações peptídicas foi liofilizado 50 pG De mlL22RA e reconstituído em 180 pL de ácido fórmico (70%) . Foi adicionado 1 pl de 5M CNBr dissolvido em acetonitrila. A amostra foi misturada e deixada para reagir por 18 horas à temperatura ambiente no escuro. 150 pL da mistura de reação foram fraccionados por HPLC de fase reversa, equipado com uma coluna analítica Zorbax SB300-C8. Os picos foram separados usando um gradiente a 25% de acetonitrila (0,085% TFA) e 75% de água 268 (0,1% TFA) e terminando a 95% de acetonitrila (0,085% TFA) e 5% de água (0,1% TFA). A análise UV mostrou três picos principais e dois menores, os quais foram recolhidos. Cada fracção foi dividida ao meio; uma parte foi submetida ao ELISA, a outra parte foi liofilizada e reconstituída em 150 uL de solução de tampão fosfato (PBS) . A análise UV das frações PBS confirmou a recuperação de todos os picos colectados a partir da coluna analítica. As frações de PBS foram submetidas à análise de Western.

2. ELISA

As fracções de HPLC contendo sequências peptídicas de IL-22RA clivada com CNBr foram diluídas a uma concentração igual estimada utilizando tampão HPLC (90% acetonitrila, 10% H20, 0,09% de ácido trifluoroacético). As amostras foram colocadas placas de microtitulação de noventa e seis poços em cada 4 poços em 100 L D/poço e deixa-se secar durante a noite à temperatura ambiente num exaustor. As placas foram lavadas com tampão ELISA C (PBS, 0,05% Tween-20), e, em seguida, bloqueadas com tampão ELISA B (PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20) por 2 horas a 37°C. Dois anticorpos monoclonais (mAb) para IL22RA (Clone R2.1.5F4.1 e Clone R2.1.15E2.1) foram diluídos para 2 g/mL em ELISA B. Cada mAb foi adicionado em cada amostra de sequência do péptido de 100 L/poço e as placas foram incubadas por 60 minutos a 37°C. As placas foram lavadas para remover anticorpos não ligados, e um anticorpo secundário (IgG de cabra anti-rato conjugado com peroxidase (Jackson)) foi diluído a 1 g/mL em tampão ELISA B e adicionado a todos os poços em 100 L/poço. As placas foram incubadas por 1 hora a 37°C. Os poços foram lavados com tampão ELISA C, e em seguida incubadas com TMB1 Component HRP Microwell Substrate (BioFx) por 5 minutos. A reacção foi interrompida pela adição de 4 50 nm de reagente de parada para TMB Microwell (BioFx) e as placas lidas em absorbância de 450 nm num leitor de placas Dynatech ELISA (Molecular Devices). 269

Os resultados indicam que mAb R2.1.5F4.1 reagiu com a fracção HPLC #4 da reacção CNBr mIL22RA, que também produziu uma banda nas experiências de Western blotting. 3. Western

As fracções de HPLC contendo sequências peptidicas de IL22RA clivadas com CNBr foram liofilizadas durante a noite à temperatura ambiente, e reconstituídas em PBS. Amostras foram então misturadas com tampão da amostra não-redutor (Invitrogen) e fervidas por 10 min. As amostras foram carregadas e eletroforese por SDS-PAGE em gel em 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) utilizando lx de tampão corrente MES-SDS (Invitrogen) e transferidas para nitrocelulose (0,2 m; Bio-Rad) em 20% de tampão de transferência de metanol, todos à temperatura ambiente. Os filtros foram deixados secar durante a noite à temperatura ambiente. Os filtros foram bloqueados com 10% de leite em pó sem gordura em tampão A (50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% Igepal CA-630, 150mM NaCl, 0,25% de gelatina) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Um anticorpo monoclonal (mAb) para IL22RA (Clone R2.1.5F4.1) foi diluído a 2 g/mL em tampão A contendo 2,5% de leite em pó sem gordura. As manchas foram incubadas neste anticorpo primário durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as manchas foram lavadas três vezes em tampão A e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, com uma diluição 1:5000 do anticorpo secundário (IgG cabra anti-rato de peroxidase de rábano; Jackson, Inc) em tampão A com 2,5% de leite em pó sem gordura. As manchas foram então lavadas, desenvolvidas com um substrato quimioluminescente (substrato Lumi Light Western Blot, Roche), e expostas através de um sensor luminoso (Boehringer Mannheim Lumi-Imager).

Usando uma exposição de 30 minutos, o gel não-redutor mostrou bandas muito forte para as fracções #4 e #5, junto com uma banda fraca para a fracção #3. A fracção #4 também testou positivo no ELISA. 270

Sequenciamento N-terminal da fracção activa #4

Das cinco fracções peptídicas CNBr colectadas a partir da coluna de fase reversa analítica, a fracção #4 apresentou actividade no ELISA e também foi positiva por Western blotting. Para identificar os peptideos presentes na fracção activa #4, a amostra foi submetida à degradação de Edman usando métodos conhecidos. Três N-terminais foram identificados a partir da fracção activa que foram consistentes com os peptideos 2 (SEQ ID NO: 49), 3 (SEQ ID NO: 50), e 5 (SEQ ID NO: 52). Estes resultados indicam os anticorpos ligados a peptideos 2 (SEQ ID NO: 49), 3 (SEQ ID NO: 50) e 5 (SEQ ID NO: 52).

Tabela 34

Degradação Edman Sequência N-terminal Identificação do peptídeo Primeira sequência obtida da Fracção #4 Sequência de CNBr gerando mIL22RA HLEGK QREYE FLGLT PDTEP HLEOK QREYE R0LT P0TEF LO$Ff ÍLTPI LS.K.1S APYVC EVKTL PLVFR fSBQ ID N0:33)..... CNBr Peptídeo 5 (SEQ ID NO: 52) Segunda sequência obtida da Fracção #4 Sequência de CNBr gerando mIL22RA ETSMÍTEFYY AKVTA VSAGG ETRNHTEFYY ÁK.VTÀ VSAGG FPYTK M (SEQ ÍD NO: 54) CNBr Peptídeo 2 (SEQ ID NO: 49) Terceira sequência obtida da Fracção #4 Sequência de CNBr gerando mIL22RA TDRFS XLQHT XIXPX moirn TDRFS SLQRTTíKPP DVTÇIPKVRS ÍQM (SBQ ID NO:5ã) CNBr Peptídeo 3 (SEQ ID NO: 50)

Discussão

Cinco frações foram isolados a partir de uma mistura de CNBr clivada com peptideos mIL22RA. Destas, apenas uma 271 fração #4 foi activa em ELISA e Western positiva. A degradação de Edman identificou três N-terminais compatíveis com CNBr peptídeos 2 (SEQ ID NO: 49), 3 (SEQ ID NO: 50), e 5 (SEQ ID NO: 52) na fracção #4. Dentro dessas regiões, seis resíduos estão potencialmente envolvidos na ligação do ligante. Estes resíduos são Y93, R112, K210 e E211 da SEQ ID NO: 42, que também correspondem a resíduos Y78, R97, K195, e E196 da SEQ ID NO: 62. Os resíduos Y60 e F164 da SEQ ID NO: 42 também estão envolvidos na ligação do ligante. B. Epitopos em IL-22RA humana onde se ligam anticorpos monoclonais neutralizantes

As experiências descritas a seguir visam identificar uma região ou regiões no domínio extracelular da sequência de aminoácidos da proteína humana IL-22RA (SEQ ID NO: 2) que são importantes para a actividade do receptor, ou liggção do antagonista, ou anticorpos neutralizantes. Um receptor solúvel da proteína IL-22RA humana (por exemplo, compreendendo a SEQ ID NO: 3, tais como IL-22RA-Fc clivada com trombina para remover o Fc) é então clivado em C-terminal para os resíduos de metionina na sequência de incubação com brometo de cianogénio (CNBr), ou outro agente conhecido na técnica que cliva as proteínas humanas em fragmentos definidos. Os peptídeos gerados CNBr são fraccionados e as fracções resultantes serão testadas para a actividade de ligação, como detectado por ELISA e a reactividade pela análise Western utilizando anticorpos monoclonais com propriedades neutralizantes.

Quatro cisteínas estão previstas para ser ligadas por dissulfeto com um padrão de ligação de Cys71-Cys79 e Cys204-Cys217 da SEQ ID NO: 2. Após a clivagem com CNBr, os peptídeos que se seguem são potencialmente gerados a partir de IL-22RA humana de comprimento total de não-redução: peptídeo 6 (SEQ ID NO: 56); peptídeo 7 (SEQ ID NO: 57); peptídeo 8 (SEQ ID NO: 58); peptídeo 9 (SEQ ID NO: 272 59); peptídeo 10 (SEQ ID NO: 60), e peptídeo 11 (SEQ ID NO: 61) (Tabela 35) . As cisteínas são ligadas por dissulfeto, o que resulta numa possível ligação entre os peptídeos 7 (SEQ ID NO: 57) e 10 (SEQ ID NO: 60). Especificamente, a SEQ ID NO: 56 corresponde a resíduos de aminoácidos 1 (Pro) a 92 (Met) da SEQ ID NO: 3, a SEQ ID NO: 57 corresponde a resíduos de aminoácidos 93 (Thr) a 120 (Met) da SEQ ID NO: 3, a SEQ ID NO: 58 corresponde a resíduos de aminoácidos 121 (Ile) a 160 (Met) da SEQ ID NO: 3, a SEQ ID NO: 59 corresponde a resíduos de aminoácidos 161 (His) a 185 (Met) da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 60 corresponde a resíduos de aminoácidos 186 (Ile) a 199 (Met) da SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 61 corresponde a resíduos de aminoácidos 200 (Cys) a 211 (Thr) da SEQ ID NO: 3. 273

Tabela 35

Peptídeo Número De Para Sequência CNBr Peptídeo 6 1 92 Fro Ghi Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gin His Vai Eys Phe Gin Ser Ser Asn Phe Glu Âsn lie Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Vai Tyr Ser Ifc Òlu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Vai Ala Lys Lys Gly Cys Glu Arg l ie Tfcr Arg. Ly$ Ser Cys Aso Leu Thr Vai Glu Thr Gly Ase Lea Thr Glu Leu Tyr Tyr Alâ Arg Vai Thr Ai a Vai Ser Ala Gly Gly Arg. Ser Aí a Thr Lp Meí (SBOÍDMO: 56) CNBr Peptídeo 7 93 120 Thr Aap Arg Phe Ser Sor Leu Gl® His Thr Thr Leu Lys Fro Pro Asp Vai Thr Cys He Ser Lys Vai Arg Ser Be Gin Met (SBQ1D NO:S7) CNBr Peptídeo 8 121 160 1b Vai Mis Fro Thr Pro Thr Pm· lie Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp lie Pfe His Asp Uu Phe Tyr His Leu Glu Léu Gin Vai Am Arg Thr Tyr Gin Meí. (SEQID HO: 58) CNBr Peptídeo 9 161 185 His Leu Gly Gly Lys Gin Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Giy Leu Thr Prd Asp Thr Gin Fhe Leu Gly Thr lie Met (SEQ m NO. 59) CNBr Peptídeo 10 186 199 lie Cys Vai Pm Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ak Pro Tyr Met CSH)fDNO;õ0> CNBr Peptídeo 11 200 211 Cys Arg Vai Lys Thr Leu Pro Âsp Arg Thr Trp Thr {SEQ ID HO: 61) 4. Clivagem de CNBr e isolamento dês fracçõs de peptídeo, Western e ELISA e N-terminal de sequenciamento

Cerca de 50 yg de IL22RA humana é liofilizada e reconstituída, fraccionada, colectada e analisada por Western blot e ELISA, conforme descrito no Exemplo 42A, para identificar as fracções contendo anticorpos monoclonais de anti-IL-22RA, e aqueles que ligam a IL-22RA como mostrado por ELISA e Western blot. As fracções 274 peptidicas CNBr que são colectadas a partir da coluna analítica de fase reversa, são então testadas para a actividade no ELISA e confirmadas como positivos por Western blotting. As fracções positivas, peptídeos são identificadas através da degradação de Edman usando métodos conhecidos.

Discussão 0 peptídeo CNBr #5 rato (SEQ ID NO: 52) corresponde aos peptídeos CNBr humanos #9 e #10 (SEQ ID NO: 59 e SED ID NO: 60); peptídeo CNBr #2 rato (SEQ ID NO: 49) corresponde a CNBr humano #6 (SEQ ID NO: 56); e o peptídeo CNBr #3 rato (SEQ ID NO: 50) corresponde a CNBr humano #7 (SEQ ID NO: 57). Das fracções que são isoladas a partir de uma mistura de peptídos CNBr clivados de IL-22RA humana, seis resíduos nas regiões possíveis são potencialmente envolvidos na ligação do ligante: Resíduos da SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3) que são importantes para a ligação receptor-ligante compreendem Tyr-60, e Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210 e Glu-211 da SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3) . Além disso, os resíduos primários da SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3) que são importantes para direccionar a ligação receptor-ligante compreendem Tyr-60, e Phe-164 da SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3), e os resíduos secundários incluem os resíduos Tyr-93, Arg-112, Lys-210 e Glu-211 da SEQ ID NO: 2 (e resíduos correspondentes da SEQ ID NO: 3). 275

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <1 10s» Zym&GeRôtkss, te e? ai.

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno do mesmo, que é expresso por um hibridoma do grupo de: (a) clone de hibridoma 280.46.3.4 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6284); (b) clone de hibridoma 281.73.49.1.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6285); (c) clone de hibridoma 283.4.1.2 (ATCC Designação de Depósito de Patente pta-6287); (d) clone de hibridoma 283.52.5.4 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6311); e (e) , clone de hibridoma 283.108.2.3 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6286).
2. Anticorpo humanizado derivado do anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo humanizado se liga a um polipeptideo como mostrado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno é peguilado.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno compreende ainda um radionuclídeo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, rótulo peptideo, partículas magnéticas, medicamento ou toxina.
5. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno de acordo com qualquer das reivindicações anteriores.
6. Imunoconjugado compreendendo um anticorpo monoclonal expresso por um hibridoma do grupo de: (a) clone de hibridoma 280.46.3.4 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6284); (b) clone de hibridoma 281.73.49.1.1 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6285); (c) clone de hibridoma 283.4.1.2 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6287); (d) clone de hibridoma 283.52.5.4 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6311); e (e) clone de hibridoma 283.108.2.3 (ATCC Designação de Depósito de Patente PTA-6286).
7. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 6, onde o imunoconjugado é peguilado.
8. Imunocon jugado de acordo com as reivindicações de 6 ou 7, em que o imunoconjugado compreende ainda um radionuclideo, enzima, substrato, cocfator, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, rótulo peptideo, partículas magnéticas, medicamento ou toxina.
9. Composição farmacêutica compreendendo um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-8.
10. Hibridoma do grupo de: (a) clone de hibridoma 280.46.3.4 Depósito de Patente PTA-6284); (ATCC Designação de (b) clone de hibridoma 281.73.49.1.1 Depósito de Patente PTA-6285); (ATCC Designação de (c) clone de hibridoma 283.4.1.2 Depósito de Patente PTA-6287); (ATCC Designação de (d) clone de hibridoma 283.52.5.4 Depósito de Patente PTA-6311); e (ATCC Designação de (e) clone de hibridoma 283.108.2.3 Depósito de Patente PTA-6286). (ATCC Designação de
11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com as reivindicações 1 ou 2 para tratar um mamífero atingido por uma doença inflamatória em que a IL-22RA desempenha um papel, reduzindo a inflamação.
12. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com as reivindicações 1 ou 2 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um mamífero atingido por uma doença inflamatória em que a IL-22RA desempenha um papel, reduzindo a inflamação.
13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno para uso de acordo com a reivindicação 11, ou uso de acordo com a reivindicação 12, em que a doença é uma doença inflamatória crónica.
14. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, ou uso de acordo com a reivindicação 13, em que a doença é uma doença inflamatória crónica do grupo das doenças inflamatórias intestinais; colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite; artrite psoriática, artrite reumatóide e psoriase.
15. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno de acordo com a reivindicação 11, ou uso de acordo com a reivindicação 12, em que a doença é uma doença inflamatória aguda.
16. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, ou uso de acordo com a reivindicação 15, onde a doença é uma doença inflamatória aguda do grupo da endotoxemia, septicemia e sindrome do choque tóxico; e doenças infecciosas.